Tél. +221 33 825 24 36 / +221 77 649 43 39 - Site web: www.microcsb.net - www.cismed-inov.org

PROTOCOLE TECHNIQUEIl s'agit d'une méthode miniaturisée standardiséepermettant la mise en évidence d'activitésenzymatiques et de fermentations sucrées. Avecses 15 tests biochimiques, elle permet de faireun diagnostic d'espèces des Staphylocoquescoagulase négative.

PRINCIPEIl consiste à ensemencer des plaquesprésentant des cupules qui renferment dessubstrats déshydratés destinés à la mise enévidence d'activités enzymatiques oud'assimilation de substrats carbonés. Ces puitssont ensemencés avec un inoculum quireconstitue le milieu. Après incubation, la lecturedes réactions est effectuée directement (viragede l'indicateur coloré utilisé) ou après additionde réactifs de révélation.

CONSERVATIONLes microplaques se conservent à 2-8 °C.La date limite d'utilisation est imprimée surl'emballage.

COMPOSITION DU COFFRETLe coffret Micro CSB staph est composé de :• 20 galeries Micro CSB Staphylocoques• 20 milieux MEVAG Staphylocoque• 20 fiches de lecture• 1 fiche techniqueMatériel non fourni :• Pipettes Pasteur• Huile de paraffine• Spectromètre• KOH 40 %• Alpha-naphtol 6 %• Acide sulfanilique 0,8 %• Alpha-naphtylamine 0,8 %• Créatinine 1 %

TESTS DE PRE-IDENTIFICATION• A partir d’une culture pure sur Muller-Hinton

• Noter la pigmentation des colonies et faire lacatalase et le Gram.

• Si colonies dorées, cocci en amas ou engrappes de raisin et catalase positive.

• Ensemencement d’un milieu Chapman et re-cherche de la coagulase et la sensibilité à lanovobiocine (5!g).

Si : • Chapman +• Mannitol +• Coagulase +• Novobiocine sensibledonc Staphylococcus aureus

Si : • Chapman +• Mannitol -• Novobiocine S ou Rdonc Staphylococcus sppFaire la microgalerie d’identification

MODE OPERATOIRE• Préparer une suspension bactérienne de

turbidité égale à 2,3. 106 UFC dans 1 ml d'eaudistillée stérile avec quelques colonies d'uneculture de 24 heures sur gélose au sang ousur MH.

• Distribuer 3 à 4 gouttes d'inoculum bactérien(remplissant la moitié de la cupule, environ100µl) par cupule, de URE à NIT.

• Verser le reste de la suspension bactériennedans 1 ml de MEVAG Staph et homogénéiser.

• Ensemencer les cupules de GLU à RAF avecle MEVAG ainsi inoculé, 3 à 4 gouttes (100µl)par cupule.

• Fermer les cupules URE, ADH, ODC et tousles sucres avec 2 gouttes d'huile de paraffine.

• Incuber à 37 °C pendant 2-4 heures sur unplateau recouvert de papier buvard imbibéd'eau.

IDENTIFICATION DES STAPHYLOCOQUES

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PRINCIPE• L’étude de la sensibilité aux antibiotiques va

consister à ajouter au milieu (inoculum) deuxconcentrations critiques d’un antibiotiquedonné. Après une incubation de 18 à 24heures, la croissance bactérienne estdécelée grâce au virage de l’indicateur coloré(rouge de phénol).

PREPARATION DES SOLUTIONSD’ANTIBIOTIQUE

• EIle est basée sur la préparation d’unesolution mère 200 fois plus concentrée que laconcentration critique supérieure del’antibiotique dans le solvant considéré.

• Pour la préparation, les masses à peserdépendent de l’activité des antibiotiques.

• La masse d’antibiotique requise est dissoutedans le volume exigé de solvant stérile pourobtenir la concentration de la solution mèrequi est ensuite conditionnée en cryotubes etconservée à – 70°C, cette solution mère est100 fois plus concentrée que la ST CCS. Ilfaut diluer donc la solution mère au 1/100èmepour obtenir les ST CCS et les ST CCI.

ST : solution de travail : diluer les SM au1/100ème pour réaliser les concentrations dessolutions de travail pour CCS et CCI.100µl du double de la CCS des antibiotiqueset 100µl de la CCI des antibiotiques donnésont été respectivement distribuées dans lescupules supérieures (C) et inférieures (c) ouopposées (c) correspondantes selon un ordrebien établi.

PRÉPARATION DE L’INOCULUMIl faut un bouillon MH supplémenté en Ca2+ etMg2+.Préparer une suspension dans de l’eaudistillée stérile, ajusté à une opacitééquivalente à l’étalon 0,5 McFARLAND. Cette suspension a été diluée à1/100ème.

INOCULATION DE LA PLAQUE• 80µl de l’inoculum bactérien sont distribués

dans chaque cupule.

• Recouvrir la plaque de papier adhésif etincuber pendant 18 à 24 heures sous papierbuvard imbibé d’eau pour éviter ladéshydratation du milieu.

LECTUREL’interprétation se fera en fonction de la CMIde l’antibiotique. Elle est encadrée par deux valeurs qui sont :la concentration critique supérieure (C) et laconcentration critique inférieure (c).Trois catégories cliniques ont été retenues

Les souches S : Les concentrations utiliséessont inférieures ou égales à la concentrationcritique inférieure (c).

Les souches R : Les concentrations utiliséessont supérieures à la concentration critiquesupérieure (C).

Les souches I : La CMI de l’antibiotiquetesté est comprise entre les deuxconcentrations critiques.

PEN AMX ERY DOX 0.25 16 4 32 0.5 1 4 32

8 32 4 32 1 2 CMP AMK CIP TC

ABG Staph / N°

Micro

CSB SystemCMI CMI CMI

! c (mg/ml)

Souche sensible Souche intermédiaire Souche résistante

> C (mg/ml)

ABG DES STAPHYLOCOQUES

Tests Substrats Réactions / Enzymes Réactifs à ajouter Résultats Positifs Résultats NégatifsURE Urée Uréase Rose framboiseADH Arginine Arginine dihydrolase Rouge OrangeODC Ornithine Ornithine décarboxylase Rouge Jaune-Vert

VP Glucose + Pyruvate Production d’acétoïne1 goutte de KOH

1 goutte de créatinine1 goutte de ! naphtol

Rose-Rouge Jaune-Vert

ONPG ONPG ß galactosidase Jaune Incolore

NIT Nitrate de potassium Nitrate réductase1 goutte d’acide

sulfanilique1 goutte a

naphlylamineRouge Incolore

GLU Glucose

Fermentation Jaune

IncoloreTRE Tréhalose

Rouge

MAN MannitolXYL XyloseSAC SaccharoseGLY GlycérolMNE MannoseLAC LactoseRAF Raffi nose

TABLEAU DE LECTURE

IDENTIFICATION DES PRINCIPALES ESPECES DE STAPHYLOCOQUES

GLU-GLY

Novobiocine

-

Xylose

Saccharose

Raffinose

Urée

+

-

-

- +

+

+

+

Dnase -

+

-

Coagulase

- - +

+ -

+

S

+

+ VP

Mannitol Lactose Saccharose

+ -

Mannitol Saccharose

+

Tréhalose -

ONPG

- + - + Urée

-

+

Manni- Urée

- Mannitol

Tréhalose

-

+

- + Manitol

Micrococcus spp

S. xylosus

S. saprophyticus

S. cohnii urealyticum S . cohnii cohnii

S. lentus

S. aureus S. schleiferi schleiferi . lugdunen-

S. simulans

S. intermedius

S. aureus S. schleiferi schleiferi

S. auricularis S. epidermidis

S. hominis ou S. warneri

S. haemolyticusS. capitis capitis

S. capitis urealyticum S. epidermidis

- - ODC

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