© Blandine Bulot, 2019

Identification de gènes impliqués dans la synthèse des apocaroténoïdes chez la tomate et la violette odorante

Mémoire

Blandine Bulot

Maîtrise en biologie végétale - avec mémoire

Maître ès sciences (M. Sc.)

Québec, Canada

Identification de gènes impliqués dans la synthèse des apocaroténoïdes chez la tomate et la violette odorante

Mémoire

Blandine Bulot

Sous la direction de :

Charles Goulet, directeur de recherche

iii

Résumé

Les apocaroténoïdes volatils sont des composés à l’arôme fruité qui contribuent de

façon positive à la flaveur des fruits et à la fragrance des fleurs. La régulation de la

production de ces composés dans les plantes est encore peu comprise. Ce projet visait à

identifier des gènes clés impliqués dans le sentier de production des apocaroténoïdes,

dans le but ultime d’améliorer l’arôme des fruits. Chez les tomates, SlCCD1 (Carotenoid

Cleavage Dioxygenase 1), malgré sa localisation cytosolique, était considérée comme

l’enzyme responsable d’effectuer le clivage oxydatif des caroténoïdes situés dans les

plastes afin de libérer des apocaroténoïdes. Cependant, l’étude de lignées de tomates

transgéniques et de fleurs de Viola odorata démontre que CCD1 n’est pas une enzyme clé

dans la synthèse des apocaroténoïdes chez les fleurs et les fruits et que la présence

d’enzymes capables d’accéder aux caroténoïdes est nécessaire. Ces enzymes peuvent

être des CCDs localisées dans les plastes, comme VoCCD4 et VoCCD1-like chez V.

odorata, ou des lipoxygénases comme TomloxC chez la tomate, capables de co-oxyder

les caroténoïdes lors de l’oxydation des acides gras. L’accumulation des caroténoïdes

dans les plastes ayant un impact important sur la nature des apocaroténoïdes produits, la

synthèse de ces précurseurs a également été étudiée. L’analyse génétique de tomates qui

présentent une accumulation anormale du lycopène a mis en évidence l’importance du

gène de la phytoène synthase 1 (PSY1) dans le sentier et la façon dont différentes

variations structurelles dans ses séquences promotrices et codantes peuvent affecter la

couleur des fruits. Le phénotype des cultivars bicolores est notamment causé par une

baisse vraisemblable de l’efficacité de la traduction de PSY1 due à une délétion dans sa

région 5’UTR, tandis que les cultivars jaunes ry sont le résultat d’une perte de fonction de

PSY1 suite à réarrangement complexe en aval du gène. Ces connaissances sur la

synthèse des caroténoïdes et des apocaroténoïdes seront utiles afin d’améliorer l’arôme

des tomates et de nombreuses autres espèces cultivées.

iv

Abstract

Volatile apocarotenoids are molecules with a fruity aroma that have a significant

impact on the flavor of fruits and the fragrance of flowers. Despite their importance, the

regulation of their synthesis in plants in still not fully understood. The main objective of this

thesis was to identify key genes involved in the apocarotenoid pathway in order to

ultimately improve the aroma of fruits. In tomatoes, SlCCD1 (Carotenoid Cleavage

Dioxygenase 1), even if localized in cytosol, was considered the enzyme responsible for

the oxidative cleavage of plastid-localized carotenoids. Analyses of transgenic tomato lines

and Viola odorata flowers demonstrate that CCD1 is not a key enzyme in apocarotenoid

synthesis in flowers and fruits, and that plastidial enzymes are associated with the

production of apocarotenoid volatiles. In tomato, the lipoxygenase C co-oxidizes

carotenoids while performing fatty acid oxidation. In V. odorata flowers, the considerable

production of ionones correlates with the high expression of plastid-localized CCDs such

as VoCCD4 and VoCCD1-like. Since carotenoid accumulation in plastid has an important

impact on the nature of the apocarotenoids produced, our attention was also drawn to their

synthesis. Genetic analysis of tomatoes that show unusual lycopene accumulation

demonstrated the importance of the phytoene synthase 1 (PSY1) gene in the pathway,

and the way different structural variation in its promoter or coding sequences can affect

fruits color. Bicolor cultivars phenotype is notably due to a likely decrease of PSY1

translation efficiency caused by a deletion in the PSY1 5’UTR region. Similarly, yellow

cultivars are the result of structural variations in the first or last exon of PSY1. This

knowledge on carotenoid and apocarotenoid synthesis will be useful in order to improve

the flavor of tomatoes and many other cultivated species.

v

Table des matières

Résumé ............................................................................................................................ iii

Abstract ........................................................................................................................... iv

Table des matières........................................................................................................... v

Liste des tableaux .......................................................................................................... vii

Liste des figures ........................................................................................................... viii

Remerciements ............................................................................................................... ix

Avant-propos ................................................................................................................... x

Introduction générale ...................................................................................................... 1

Chapitre 1 : Revue de littérature ..................................................................................... 3 1.1 Les caroténoïdes .................................................................................................... 3

1.1.1 Synthèse des caroténoïdes ................................................................................ 3 Sentier du MEP ....................................................................................................... 3 Synthèse des carotènes .......................................................................................... 3 Synthèse des xanthophylles .................................................................................... 4

1.1.2 Rôle des caroténoïdes ....................................................................................... 5 Dans les tissus photosynthétiques .......................................................................... 5 Dans les tissus non-photosynthétiques ................................................................... 6

1.1.3. Régulation de la synthèse des caroténoïdes ..................................................... 7 Régulation au début du sentier du MEP .................................................................. 7 Régulation au niveau de PSY1 ................................................................................ 8 Facteurs de transcriptions impliqués dans le mûrissement et éthylène.................... 9 Formation des chromoplastes ............................................................................... 10 Dégradation .......................................................................................................... 10

1.2. Les composés volatils ........................................................................................ 11

1.2.1 Description générale ........................................................................................ 11 1.2.2 Les apocaroténoïdes ....................................................................................... 12

Origine et odeur des apocaroténoïdes................................................................... 12 Synthèse des apocaroténoïdes ............................................................................. 13

1.2.3 Les composés volatils dérivés des acides gras ................................................ 17 Origine et odeur .................................................................................................... 17 Synthèse des composés volatils dérivés des acides gras...................................... 18

1.3. Objectifs et hypothèses ...................................................................................... 19

Chapitre 2 : Synthesis of apocarotenoid volatiles in flower and fruits, reassessing the importance of cytosolic Carotenoid Cleavage Dioxygenases .............................. 22

2.1 Résumé ................................................................................................................. 22 2.2 Abstract ................................................................................................................. 23 2.3 Introduction .......................................................................................................... 24 2.4 Materials and Methods ......................................................................................... 27

Growth of transgenic tomatoes ................................................................................. 27 Flowers harvesting .................................................................................................... 28 Volatile compounds analysis ..................................................................................... 28 Quantitative PCR ...................................................................................................... 29

vi

Transcriptome sequencing and analysis ................................................................... 29 2.5 Results .................................................................................................................. 30

Silencing of SlCCD1 and TomloxC in Tomato ........................................................... 30 Apocarotenoid volatiles emission in Viola flowers ..................................................... 34 Sequencing and transcriptome assembly of V. odorata and V. septentrionalis ......... 35 Differential gene expression analysis between V. odorata and V. septentrionalis ..... 36

2.6 Discussion and Conclusion ................................................................................. 41 2.7 References ............................................................................................................ 45

Chapitre 3 : Structural variations in the phytoene synthase 1 gene affect carotenoid accumulation in tomato fruits and result in bicolor and yellow phenotypes............. 50

3. 1. Résumé ............................................................................................................... 50 3.2 Abstract ................................................................................................................. 51 3.3 Introduction .......................................................................................................... 51 3.4 Materials and Methods ......................................................................................... 54

Growth of plant materials .......................................................................................... 54 Volatile compounds analysis ..................................................................................... 54 Genetic markers design ............................................................................................ 55 Quantitative PCR ...................................................................................................... 55 Transcriptome sequencing and analysis ................................................................... 56

3.5 Results .................................................................................................................. 57 Mapping of a QTL for bicolored fruits ........................................................................ 57 Apocarotenoid volatiles emission in bicolor fruits ...................................................... 58 Phytoene synthase expression in the bicolor introgression line ................................. 60 Structural variation in bicolor cultivars ....................................................................... 61 Genomic rearrangement in yellow tomato cultivars ................................................... 63

3.6 Discussion and Conclusion ................................................................................. 68 3.7 References ............................................................................................................ 73

Discussion et conclusion .............................................................................................. 77

Bibliographie .................................................................................................................. 87

Annexe 1 : Figures supplémentaires (Chapitre 2) ....................................................... 93

Annexe 2 : Tableaux supplémentaires (Chapitre 2) ..................................................... 97

Annexe 3 : Figures supplémentaires (Chapitre 3) ..................................................... 115

Annexe 3 : Tableaux supplémentaires (Chapitre 3) ................................................... 133

vii

Liste des tableaux

Table 2.1. Apocarotenoid volatiles emission of V. odorata and V. septentrionalis flowers.34

Table 2.2. Statistics of V. odorata and V. septentrionalis sequencing data. .................... 36

Table 2.3. Statistics of de novo transcriptome assembly quality for V. odorata and V.

septentrionalis. ......................................................................................................... 36

Table 2.4. Differential analysis expression of genes of the MEP pathway between V.

odorata and V. septentrionalis. ................................................................................. 38

Table 2.5. Differential analysis expression of genes of the carotenoid pathway between V.

odorata and V. septentrionalis. ................................................................................. 38

Table 2.6. Differential analysis expression of genes suspected to be involved in

apocarotenoid synthesis between V. odorata and V. septentrionalis. ........................ 39

viii

Liste des figures

Figure 1.1. Sentier de synthèse des caroténoïdes............................................................. 5

Figure 1.2. Synthèse des apocaroténoïdes volatils chez les plantes à partir du clivage

oxydatif des caroténoïdes ......................................................................................... 15

Figure 1.3. Fleurs des violettes Viola odorata et Viola septentrionalis ............................. 21

Figure 2.1. Expression of SlCCD1 and TomloxC in the transgenic lines. SlCCD1a (A),

SlCCD1b (B) and TomloxC (C) transcript levels in ripe fruits of the control line M82

and the transgenic lines for SlCCD1 (9528_CCD1, 9530_CCD1) and TomloxC

(0966_LoxC) ............................................................................................................. 32

Figure 2.2. Apocarotenoid volatiles emission from the fruit of the transgenic lines.

Emission of the apocarotenoid volatiles 6-methyl-5-hepten-2-one (A) and

geranylacetone (B) in the ripe fruits of the control line M82, the transgenic lines for

SlCCD1 (9528_CCD1, 9530_CCD1), TomloxC (0966_LoxC), and the crosses

CCD1+LoxC 1 (9528_CCD1 x 0966_LoxC, n=6) and CCD1+LoxC 2 (9530_CCD1 x

0966_LoxC) .............................................................................................................. 33

Figure 2.3. Phylogenetic analysis of the viola Carotenoid Cleavage Dioxygenases......... 40

Figure 3.1. Apocarotenoid volatiles emission from fruits of bicolor introgression line.

Emission of the apocarotenoids geranylacetone (A) and 6-methyl-5-hepten-2-one (B)

................................................................................................................................. 59

Figure 3.2. PSY1 gene expression is reduced in the bicolor introgression line. (A)

Representative fruits of the red introgression line 3923-locus 2 and the bicolor

introgression line 3923-locus 3. (B) Transcript levels of PSY1 in the parental line 4024

and the introgressed lines 3923-locus 2 and 3923-locus 3a ...................................... 60

Figure 3.3. Top, bottom and cross section of the bicolor cultivars Striped German (A),

Mortage Lifter bicolor (B) and Grapefruit (C) at ripe stage......................................... 62

Figure 3.4. Transcripts level of PSY1 in ripe fruits of red, yellow and bicolor tomato

cultivars. ................................................................................................................... 63

Figure 3.5. A structural variation in the bicolor cultivars changes the 5’UTR transcripts

profile of PSY1 .......................................................................................................... 64

Figure 3.6. Yellow r and ry cultivars PSY1 transcripts alignment on S. lycopersicum

reference genome ..................................................................................................... 67

Figure 3.7 Influence of the bicolor and ry allele of PSY1 on the fruit phenotype .............. 68

ix

Remerciements

Je tiens tout d’abord à remercier mon directeur de recherche, Charles Goulet, pour

sa confiance, et la chance qu’il m’a donné de réaliser cette maîtrise. Son dévouement, ses

conseils, et sa passion pour la science ont été d’une aide précieuse durant ces deux

années.

Un grand merci également à Roberto Montoya, Sébastien Isabelle, Jérémie

Ghironzi, Louis-Félix Nadeau, Maxime Bastien et Isabelle Clermont, qui n’ont jamais

hésité à m’apporter leur aide, que ce soit au champ ou au laboratoire. Leur présence a été

très motivante, et je n’aurais pas pu avoir mieux comme équipe de travail !

Merci aussi à mes amies, mes biologistes préférées, qui m’ont accueillie à mon

arrivée au Québec, et m’ont depuis accompagnée dans toutes les étapes de mes études,

et de ma vie.

Finalement, merci à mon amoureux Jonathan, ainsi qu’à ma sœur Diane et mes

parents. Leur soutien et leurs encouragements ont été tellement importants. C’est grâce à

eux que j’en suis là aujourd’hui.

x

Avant-propos

Ce mémoire est constitué d’une introduction générale, suivie de trois chapitres. Le

premier chapitre intègre une revue de littérature portant d’abord sur la synthèse et

l’accumulation des caroténoïdes dans les fleurs et les fruits, et plus particulièrement les

tomates, puis sur les composés volatils, molécules ayant un impact significatif sur leur

arôme. Dans le cadre de ce projet, nous nous sommes davantage concentrés sur les

apocaroténoïdes, composés volatils dérivés des caroténoïdes.

Le deuxième chapitre est un article scientifique, rédigé en anglais, qui s’intitule

« Synthesis of apocarotenoid volatiles in flower and fruits, reassessing the importance of

cytosolic Carotenoid Cleavage Dioxygenases ».

Le troisième chapitre est également présenté sous la forme d’un article

scientifique, rédigé en anglais, dont le titre est « Structural variations in the phytoene

synthase 1 gene affect carotenoid accumulation in tomato fruits and result in bicolor and

yellow phenotypes ».

En tant qu’auteure principale de ces deux articles, j’ai contribué à la majorité des

expériences décrites, à l’analyse des résultats, ainsi qu’à la rédaction des manuscrits.

Louis-Félix Nadeau est co-auteur du premier article pour sa participation aux croisements

des lignées de tomates transgéniques. Sébastien Isabelle a participé à la préparation de

librairies d’ARN et est co-auteur du deuxième article. Mon directeur de recherche Charles

Goulet a dirigé l’ensemble des travaux de recherche, de l’élaboration des dispositifs

expérimentaux à la rédaction des articles et est donc également un co-auteur des deux

articles. Ces deux articles seront soumis à un journal scientifique au cours de l’année

2019.

Ce mémoire s’achève sur une discussion générale et une conclusion qui résument

les chapitres 2 et 3, et ouvrent la porte à de prochaines recherches. Afin d’alléger le

mémoire et d’en faciliter la consultation, les références bibliographiques citées dans

l’Introduction générale, le premier Chapitre ainsi que la partie Discussion générale et

Conclusion ont été regroupées dans la section Bibliographie, située à la fin du mémoire.

1

Introduction générale

La tomate (Solanum lycopersicum), originaire d’Amérique du Sud et importée en

Europe au 16ème siècle, fait partie de la famille des Solanacées qui regroupe plus de

3000 espèces, dont certaines sont très importantes du point de vue économique, telles

que la pomme de terre, le tabac et l’aubergine. La production mondiale de tomate a

considérablement augmenté au cours des 50 dernières années. C’est aujourd’hui la

deuxième culture maraîchère la plus consommée, derrière la pomme de terre. Sa

production est passée de 31 millions de tonnes en 1966 à plus de 177 millions de tonnes

en 2016. En 2017 seulement, le Canada a cultivé et récolté plus de 277000 tonnes de

tomates en serre pour une valeur à la ferme de 556 millions de dollars (CA$) (FAO 2016,

Statistique Canada 2018).

L’intensification de la production depuis une cinquantaine d’années, liée à la forte

demande, a nécessité une sélection de cultivars possédant des caractéristiques bien

précises, telles que la rapidité de croissance, la résistance aux maladies, le rendement,

ainsi que la taille des fruits. Cependant, la sélection génétique pour certains de ces traits a

eu des effets inattendus sur la flaveur des tomates. Cette caractéristique, considérée

comme accessoire, n’a ainsi pas été prise en compte dans les plans d’amélioration

génétique, et de plus en plus, les consommateurs se plaignent de l’arôme des tomates

dans leur assiette (Klee et Tieman 2013). Un exemple bien connu de cette perte de saveur

au profit l’apparence des fruits est le phénotype uniforme (u). La majorité des cultivars

modernes ont été sélectionnés pour leur faculté à produire des fruits qui murissent de

façon uniforme, sans « épaules vertes » persistantes à maturité au niveau du pédicelle.

Cette caractéristique, qui plaît davantage visuellement aux consommateurs, provient d’une

mutation inactivant le facteur de transcription GLK2 qui se traduit par un moins bon

développement des chloroplastes dans les fruits, qui accumulent peu de thylakoïdes et de

chlorophylle, d’où l’absence des « épaules vertes » (Waters et al. 2009). Cette sélection

pour un caractère intéressant au niveau de l’apparence a cependant eu des

conséquences insoupçonnées sur le goût des fruits. Il a été observé dans certains cas que

les tomates possédant moins de chloroplastes réalisent la photosynthèse de façon moins

efficace. Cela résulte en une accumulation moins importante de sucre dans les tissus, et

donc une saveur moins appréciée (Powell et al. 2012).

2

Sur les 400 composés volatils synthétisés par la tomate, une trentaine ont été

identifiés pour leur rôle dans son arôme (Baldwin et al. 2000). Cependant, une partie des

gènes et des enzymes impliqués dans leur synthèse reste inconnue. De plus, les

mécanismes de régulation dirigeant la production de ces composés volatils, ainsi que des

caroténoïdes, des pigments importants pour la couleur des fruits, sont nombreux,

complexes et souvent encore incompris. Malgré cette complexité, la tomate constitue

néanmoins un excellent modèle pour la recherche appliquée sur les fruits climactériques.

Son génome diploïde relativement petit (950Mb), séquencé en 2012, est disponible sur

des bases de données en ligne (Klee et Giovannoni 2011, Fernandez-Pozo et al. 2015).

De plus, les grandes collections de cultivars phénotypiquement variés, de lignées

d’introgression, de mutants, ainsi que de plants transgéniques, associées à de nouvelles

technologies comme le séquençage d’ARN à haut débit, rendent possible l’étude des

mécanismes génétiques et moléculaires régulant le métabolisme secondaire des tomates,

et du même fait la synthèse de leurs composés volatils (Monforte et Tanksley 2000).

Une meilleure compréhension des sentiers métaboliques de production des

caroténoïdes et des apocaroténoïdes volatils, molécules aromatiques dérivées du clivage

oxydatif des caroténoïdes, permettra à terme de créer des marqueurs génétiques

spécifiques. Ceux-ci pourront alors être utilisés par les hybrideurs afin de les aider à

sélectionner des cultivars produisant des arômes qui donneront à nouveau un meilleur

goût aux tomates. De plus, les connaissances acquises sur la tomate pourront être utiles

pour d’autres cultures maraîchères et fruitières. Ainsi, les producteurs pourront davantage

répondre aux exigences gustatives des consommateurs qui demandent de plus en plus

des produits de qualité.

3

Chapitre 1 : Revue de littérature

1.1 Les caroténoïdes

Les caroténoïdes constituent un groupe de pigments très diversifié et répandu dans la

nature qui peuvent être synthétisés par les plantes, les algues, les champignons et les bactéries

(Bartley et al. 1994). Les caroténoïdes sont des molécules de la famille des terpènes. Ce sont

plus précisément des isoprénoïdes à 40 carbones, possédant des doubles liaisons dans leur

chaine hydrocarbonée. Ils peuvent également être munis d’un ou plusieurs anneaux à leurs

extrémités (Hirschberg 2001).

1.1.1 Synthèse des caroténoïdes

Sentier du MEP

Dans les plantes, la majorité des isoprénoïdes, dont les caroténoïdes, sont synthétisés

dans les chloroplastes et les chromoplastes par des enzymes codées par des gènes nucléaires

(Hirschberg 2001). Ces isoprénoïdes dérivent de la condensation de trois molécules

d’isopentenyl diphosphate (IPP) avec une molécule de dimethylallyl diphosphate (DMAPP), tous

deux issus du sentier du 2-C-méthyl-D-érythritol-4-phosphate, aussi appelé sentier non-

mévalonique, ou MEP. La condensation de l’IPP et du DMAPP est catalysée par l’enzyme

géranyl géranyl pyrophosphate synthase (GGPS) et résulte en une molécule de diphosphate de

géranyl géranyl (GGPP) (Hunter 2007, Phillips et al. 2008). Il existe deux isoformes de l’enzyme

GGPPS chez la tomate. GGPS1 s’exprime dans les feuilles, tandis que GGPS2 agit dans les

plastes des fleurs et des fruits (Ament et al. 2006). Le GGPP est une molécule très importante,

qui peut servir de précurseur pour la synthèse de molécules essentielles pour la plante, telles

que les chlorophylles, les gibbérellines, les tocophérols, les plastoquinones ainsi que les

caroténoïdes (Bouvier et al. 2005).

Synthèse des carotènes

Le sentier de production des caroténoïdes débute par la condensation de deux

molécules de GGPP, sous l’action de l’enzyme phytoène synthase (PSY). Cela génère le

premier caroténoïde, le 15-cis-phytoène, qui est incolore (Bartley et al. 1992). Le 15-cis-

phytoène est par la suite transformé en 15-9’-di-cis-phytofluène, puis en 9,15,9’-tri-cis-ζ-

4

carotène par deux réactions de désaturation successives catalysées par l’enzyme phytoène

désaturase (PDS) (Pecker et al. 1992). L’enzyme ζ-carotène isomérase (Z-ISO) convertit alors

la 9,15,9’-tri-cis-ζ-carotène en 9,9’-di-cis-ζ-carotène, qui subit une nouvelle réaction de

désaturation, catalysée cette fois par l’enzyme ζ-carotène désaturase (ZDS). La molécule de

7,9,9’-tri-cis-neurosporène qui en résulte est également désaturée par ZDS pour donner du

7,9,7,9’-tetra-cis-lycopène, aussi appelé prolycopène (Hirschberg 2001, Bouvier et al. 2005).

L’enzyme caroténoïde isomérase (CRTISO) convertit alors la configuration cis du prolycopène,

en configuration trans, afin de générer le fameux caroténoïde all-trans-lycopène, ou lycopène,

connu pour être à l’origine la couleur rouge caractéristique des tomates (Isaacson et al. 2002).

La cyclisation du lycopène marque un embranchement du sentier. Une branche, via la lycopène

β-cyclase (LCYB), ajoute un ou deux anneaux β (présence d’un double lien entre les carbones 5

et 6 de l’anneau) au lycopène ce qui donne respectivement le γ-carotène et le β-carotène. Dans

l’autre branche, la lycopène ε-cyclase (LCYE) ajoute un anneau ε (présence d’un double lien

entre les carbones 4 et 5 de l’anneau) au lycopène afin de générer le δ-carotène. Par la suite, la

LCYB peut ajouter un anneau β au δ-carotène, ce qui résulte en la synthèse d’α-carotène. Tous

ces caroténoïdes hydrocarbonés, synthétisés depuis le 15-cis-phytoène, appartiennent à la

sous-famille des carotènes (Fantini et al. 2013, Pecker et al. 1996).

Synthèse des xanthophylles

Un groupement fonctionnel oxygéné peut être ajouté aux anneaux de l’α-carotène et du

β-carotène par des réactions d’hydroxylation catalysées par des hydroxylases et le cytochrome

P450. L’enzyme caroténoïde β-hydroxylase non-hème-di-iron mono-oxygénase (CHYB)

transforme la β-carotène pour générer entre autres les xanthophylles β-cryptoxanthine,

zéaxanthine et violaxanthine. La violaxanthine est ensuite modifiée par l’enzyme néoxanthine

synthase (NSY), ce qui donne la néoxanthine. Le phytochrome P450, quant à lui, modifie l’α-

carotène qui devient la lutéine. Ces caroténoïdes oxygénés appartiennent à la sous-famille des

xanthophylles (Hirschberg 2001, Bouvier et al. 2005). Le sentier de production des caroténoïdes

est résumé à la Figure 1.1.

5

Figure 1.1 Sentier de synthèse des caroténoïdes. La couleur de chaque caroténoïde est représentée

par la couleur de l’encadré dans lequel son nom est écrit. Les caroténoïdes présents dans les encadrés

gris sont incolores. CHYB : caroténoïde β-hydroxylase non-hème-di-iron mono-oxygénase.

1.1.2 Rôle des caroténoïdes

Dans les tissus photosynthétiques

Les propriétés chimiques des caroténoïdes font de ceux-ci des composés essentiels

chez tous les organismes photosynthétiques. Dans les photosystèmes I et II des chloroplastes,

ils augmentent l’efficacité de la photosynthèse en assurant le transfert à la chlorophylle de

6

l’énergie lumineuse qu’ils absorbent entre 400 et 600 nm. Les caroténoïdes, et plus

particulièrement les xanthophylles, protègent également les cellules des formes réactives

dangereuses de l’oxygène qui peuvent être générées lors de la photosynthèse. Les

caroténoïdes jouent, enfin, un rôle important dans la régulation de la fluidité des membranes

cellulaires (Young 1991, Horton et Ruban 2004).

Dans les tissus non-photosynthétiques

Dans les tissus non-photosynthétiques, les caroténoïdes s’accumulent dans les

chromoplastes, organites dont la formation dérive des chloroplastes. Ils peuvent être contenus

dans différentes structures telles que les plastoglobules, les membranes internes des

chromoplastes, les cristaux et les tubules (Ljubesić et al. 1991). Les caroténoïdes sont des

pigments, c’est-à-dire des molécules qui confèrent une couleur particulière aux tissus dans

lesquels ils se trouvent. La couleur attrayante des fleurs et des fruits, allant du jaune au rouge

en passant par le orange, provient en effet majoritairement des caroténoïdes (Klee et

Giovannoni 2011). Ainsi, les insectes et les animaux sont attirés par ces couleurs et participent à

la pollinisation ou à la dissémination des graines, ce qui est très important pour la propagation

des plantes (Dicke et Baldwin 2010). Les tomates dont les chloroplastes n’effectuent pas une

transition normale vers les chromoplastes, en raison des mutations « green-flesh » ou « never

ripe » par exemple, ne peuvent donc pas accumuler de caroténoïdes et restent de couleur verte,

même à maturité (Lanahan et al. 1994, Powell et al. 2012). La fine régulation de la transcription

des gènes codant pour des enzymes essentielles à la biosynthèse des caroténoïdes est

extrêmement importante pour que survienne l’accumulation des caroténoïdes souhaités (Klee et

Giovannoni 2011). Par exemple, la fleur des tomates arbore une couleur jaune-orange éclatant,

à cause de l’accumulation des caroténoïdes néoxanthine, violaxanthine et lutéine dans ses

chromoplastes (Galpaz et al. 2006). Les fruits, quant à eux, deviennent rouges au cours de leur

maturation car ils accumulent dans leurs chromoplastes d’importantes quantités du caroténoïde

lycopène, qui est un pigment rosé. Au cours de ce processus, il est également nécessaire que la

chlorophylle, responsable de la couleur verte aux premiers stades de maturité, soit dégradée (Li

et Yuan 2013). C’est l’addition du pigment flavonoïde jaune naringenine chalcone au lycopène

qui confère aux tomates leur couleur rouge caractéristique (Gady et al. 2012). Afin de parvenir à

une telle accumulation de lycopène, il y a augmentation de la transcription des gènes PSY1,

PDS, CRTISO et DXS, dont l’action est située en amont de la synthèse du lycopène. Au

contraire, les gènes qui participent à la transformation du lycopène, tels que LCYB, LCYE et

CHYB, montrent une transcription régulée à la baisse (Giuliano et al. 1993). Ainsi, des lignées

7

de tomates possédant des mutations au niveau des gènes régulant la biosynthèse des

caroténoïdes n’accumulent pas de lycopène de façon normale et produisent alors des fruits de

couleurs variées. Par exemple, l’hypothèse de la mutation récessive yellow-flesh (r) a été émise

afin d’expliquer pourquoi certains cultivars de tomates produisent des fruits de couleur jaune.

Dans ce cas, il a été proposé que la mutation rend la protéine PSY1 non-fonctionnelle, ce qui

bloque le sentier de biosynthèse du lycopène dès sa première étape et empêche donc

l’accumulation de lycopène (Fray et Grierson 1993). Les fruits ne synthétisent alors que le

flavonoïde naringenine chalcone et arborent une couleur jaune (Gady et al. 2012). Par ailleurs,

dans les lignées de tomates mutantes Delta et Bêta, la transcription des gènes LCYE et LCYB

est respectivement augmentée par rapport à des tomates non mutées. Cela résulte en la

transformation rapide du lycopène qui ne peut plus s’accumuler dans les chromoplastes, en δ-

carotène ou en β-carotène selon la lignée mutante. Les tomates produites, en accumulant peu

de lycopène mais d’importantes quantités de δ- et β-carotène, présentent alors une couleur

orange, caractéristique de ces formes de carotène (Pecker et al. 1996, Ronen et al. 1999). Les

lignées de tomates possédant la mutation tangerine produisent aussi des fruits de couleur

orange. Dans ce cas, la mutation inhibe l’expression du gène CRTISO, le prolycopène de

couleur orange n’est alors jamais isomérisé en lycopène et la tomate accumule donc

d’importantes quantités de prolycopène lui conférant sa couleur orange (Isaacson et al. 2002).

Ainsi, la régulation différentielle des gènes impliqués dans la synthèse des caroténoïdes est à

l’origine d’une impressionnante collection de tomates de couleurs variées. En plus plus des

multiples teintes de vert, de rouge, de jaune, d’orange, de roses ou de brun, les tomates

peuvent porter des rayures ou même exhiber un phénotype bicolore. Une meilleure

compréhension de ces mécanismes de régulation permettra de contrôler davantage

l’accumulation des caroténoïdes dans les fruits.

1.1.3. Régulation de la synthèse des caroténoïdes

Même si le sentier de production des caroténoïdes paraît simple, les mécanismes de

régulation sont nombreux et complexes.

Régulation au début du sentier du MEP

L’étape initiale du sentier du MEP, qui consiste en la transformation du pyruvate et du

glycéraldéhyde-3-phosphate (G3P) par l’enzyme 1-deoxy-d-xylulose 5-phosphate synthase 2

(DXS2) pour donner les précurseurs des caroténoïdes, est considérée comme la première étape

8

déterminante de régulation du sentier des caroténoïdes. L’expression du gène DXS2 est

directement corrélée avec l’augmentation de la production de caroténoïdes dans les fruits (Lois

et al. 2000, Walter et al. 2002).

Régulation au niveau de l’enzyme PSY1

La synthèse de phytoène, catalysée par l’enzyme PSY1, est également considérée

comme une étape clé dans la production des caroténoïdes. Trois isoformes du gène de la

phytoène synthase, ayant chacun des rôles bien définis, ont été identifiés chez la tomate. Le

gène PSY3 s’exprime essentiellement dans les racines, et joue un rôle essentiel de réponse aux

stress abiotiques, tels que la sécheresse (Li et al. 2008, Welsch et al. 2008). PSY1 est un gène

paralogue de PSY2 qui serait apparu suite à un évènement de duplication. Les deux isoformes

auraient par la suite persisté dans le génome par fonctionnalisation (Zhang 2003). Les

séquences protéiques des deux isoformes montrent 78% d’homologie et contiennent toutes

deux un peptide de transit (Giorio et al. 2008). Solanum lycopersicum produit des fleurs jaunes

et des fruits de couleur rouge. Sur les douze espèces sauvages fortement apparentées à

Solanum lycopersicum, toutes produisent des fleurs jaunes, mais seulement trois produisent des

fruits colorés. Par exemple, S. pimpinefollium produit des fruits rouges, S. cheesmaniae des

fruits de couleur jaune-orangé et S. galapagense des fruits orange, tandis que les autres

espèces telles que S. habrochaites et S. pennellii produisent des fruits verts. (Peralta et Spooner

2007). Cela laisse supposer que des évènements de spécialisation des isoformes de PSY dans

différents tissus, et particulièrement de PSY1 dans les fruits, auraient permis la production de

tomates colorées (Zhang 2003). Tandis que PSY2 s’exprime dans les feuilles et les fleurs, PSY1

s’exprime principalement dans les fruits en cours de mûrissement. Son expression commence

au stade « mature green », lorsque les graines sont arrivées à maturité, puis augmente de façon

très importante jusqu’au stade « pink », avant de diminuer progressivement jusqu’au stade « red

ripe ». L’expression de PSY1 dans les fruits au cours de la maturation est donc essentielle à la

synthèse de phytoène, et par conséquent de tous les autres caroténoïdes. Il n’y a pas de moyen

alternatif pour le fruit d’accumuler des caroténoïdes, plusieurs lignées différentes de tomates

possédant une mutation au niveau du gène PSY1 ayant permis de démontrer comment l’activité

de l’enzyme influençait l’accumulation des caroténoïdes dans le fruit. Par exemple, le mutant

W180* possède un codon stop prématuré qui cause une perte de fonction de l’enzyme PSY1 qui

ne peut alors pas convertir le diphosphate de géranyl géranyl en phytoène; les fruits, par

conséquent restent jaunes, même à maturité, comme chez le mutant yellow flesh (Fray et

Grierson 1993, Gady et al. 2012). En revanche, le mutant P192L possède seulement une

9

mutation de substitution au sein de la séquence de PSY1. La protéine reste en partie

fonctionnelle malgré cette mutation et les tomates accumulent quand même du lycopène, mais

de façon ralentie et en concentration deux fois moins abondante par rapport aux fruits témoins.

Le mutant P192L produit donc des fruits qui restent jaunes jusqu’à trois jours après le stade

post-breaker, alors qu’à ce stade les tomates non mutantes sont déjà oranges, en raison de

l’accumulation de lycopène. Il faut attendre sept jours après le stade post-breaker pour que les

fruits mutants P192L aient accumulé assez de lycopène pour arborer une couleur rouge (Gady

et al. 2012). Au contraire, lorsque PSY1 est surexprimée, les caroténoïdes s’accumulent dans

les fruits de façon beaucoup plus importante (Fraser et al. 2007).

Facteurs de transcriptions impliqués dans le mûrissement et la synthèse de l’éthylène

De nombreux facteurs de transcription sont également impliqués dans la synthèse des

caroténoïdes. Les facteurs de transcription les plus connus chez la tomate en mûrissement sont

RIN (Ripening Inhibitor), SGC (Stay-Green), NOR (Non-Ripening), CNR (Colorless Non

Ripening), TAGL1 (Agamous-Like 1), HB-1 (HD-ZIP Homeobox protein 1), Apetala2a (AP2a),

ERF6 (Ethylene Response Factor), ainsi que TDR4 et MBP7 (Fruitfull) (Fujisawa et al. 2013). Le

facteur de transcription RIN appartient à la famille des facteurs de transcription Mad-Box. De par

sa capacité à interagir avec les promoteurs de nombreux gènes impliqués dans le mûrissement

des tomates, il est considéré comme décisif pour le bon fonctionnement de ce processus, et

donc pour la synthèse des caroténoïdes. Le facteur RIN interagit directement avec le promoteur

du gène PSY1, pour activer sa transcription (Martel et al. 2011). Il peut aussi, conjointement

avec les facteurs de transcription TDR4 et MBP7 intervenir sur l’expression de gènes impliqués

dans la synthèse de l’éthylène, une phytohormone essentielle dans le mûrissement des fruits

climactériques comme la tomate (Li et al. 2011). L’augmentation du niveau d’éthylène dans les

fruits régule en effet à la hausse l’expression de PSY1 et PDS et donc la production des

caroténoïdes (Fujisawa et al. 2013). Les plants portant la mutation « never ripe » (Nr) abordée

précédemment produisent des fruits qui restent verts car présentant justement une insensibilité

à l’éthylène (Lanahan et al. 1994). Le facteur RIN joue également un rôle dans la régulation du

métabolisme des parois cellulaires, très important lors de la maturation des fruits (Martel et al.

2011). Enfin, il peut également agir sur d’autres facteurs de transcriptions impliqués dans la

maturation des fruits. Par exemple, le facteur de transcription SGR (stay-green) inhibe

l’expression de PSY1, donc la synthèse des caroténoïdes. Cependant, lorsque le facteur RIN

réprime le facteur SGR, la synthèse de phytoène, et par conséquent l’accumulation de

caroténoïdes devient possible. Les plants mutants pour le gène RIN (rin) présentent

10

évidemment de sérieux retards de maturation, ainsi qu’une baisse significative d’accumulation

de caroténoïdes dans leurs fruits, par rapport à des plants témoins (Fujisawa et al. 2013, Luo et

al. 2013, Ito et al. 2017).

Formation des chromoplastes

La formation des chromoplastes à partir des chloroplastes au cours de la maturation des

fruits joue également un rôle important dans la synthèse et l’accumulation des caroténoïdes. Par

exemple, des tomates avec des chloroplastes plus efficaces à réaliser la photosynthèse au

stade « mature green » seront à l’origine de chromoplastes qui accumuleront davantage de

caroténoïdes au stade mature (Nashilevitz et al. 2010). De plus, la quantité et la taille des

chromoplastes dans les fruits à maturité influencent grandement la synthèse des caroténoïdes.

Les mutants hp-1 et hp-2 (high pigment) produisent respectivement des chromoplastes en plus

grande quantité, et plus volumineux. Ces changements favorisent à maturité une accumulation

plus importante de caroténoïdes dans le fruit (Liu et al. 2004, Kolotilin et al. 2007).

Dégradation

Les enzymes CCDs (Carotenoid Cleavage Dioxygenase) et NCEDs (9-Cis

Epoxycarotenoid Dioxygenase) catalysent le clivage oxydatif des caroténoïdes à des positions

précises dans leur chaine hydrocarbonée, pour générer des molécules appelées

apocaroténoïdes. L’accumulation des caroténoïdes dans les fruits est donc également régulée

par leur dégradation via ces enzymes (Auldridge et al. 2006).

Une bonne compréhension des mécanismes de régulation de synthèse des caroténoïdes

est essentielle afin de comprendre les patrons de coloration variés pouvant survenir dans les

fruits. Les caroténoïdes étant également à l’origine de composés volatils essentiels à l’arôme

des tomates, les connaissances acquises sur le sujet sont d’une grande utilité pour l’étude de

leur flaveur.

11

1.2. Les composés volatils

1.2.1 Description générale

Les caroténoïdes, une fois synthétisés dans les fleurs et les fruits, peuvent servir

de précurseurs à la production de molécules volatiles appelées apocaroténoïdes qui ont

impact significatif sur la flaveur des fleurs et des fruits.

Toutes les plantes sont capables, grâce à leur métabolisme secondaire, de

synthétiser, stocker, et émettre dans l’air une importante quantité de composés volatils. Un

cinquième du CO2 atmosphérique fixé chaque jour par les plantes terrestres est relâché

dans l’air sous forme de composés volatils. La majorité de ces composés sont dérivés de

quatre grandes classes biosynthétiques dérivées du métabolisme secondaire : les

terpènes, les acides gras, les composés aromatiques et les produits dérivés des acides

aminés (Baldwin 2010). Ils constituent un groupe hétérogène de molécules variées :

saturées ou insaturées, à chaînes branchées ou non, qui peuvent porter des structures

cycliques possédant des groupements fonctionnels tels que des alcools, des aldéhydes,

des cétones, des esters et des éthers, remplissant diverses fonctions (Schwab et al.

2008). Les composés volatils peuvent être synthétisés dans les cellules de l’épiderme. Les

résidus hydrophiles de ces composés volatils doivent être enlevés ou modifiés par des

réactions de réduction, de méthylation ou d’acylation afin qu’ils puissent traverser les

membranes plasmiques de ces cellules et diffuser dans l’air. Ils peuvent également être

synthétisés dans d’autres structures, comme les trichomes (des structures dérivées des

cellules épidermiques), les osmophores, ou les cellules épidermiques crénelées

spécialisées dans la production et le relâchement de composés volatils dans les fleurs. Ils

peuvent finalement sortir des tiges et des feuilles par les stomates. Certains volatils sont

même stockés sous certaines formes dans des vacuoles à l’intérieur des cellules (Baldwin

et al. 2010).

Les composés volatils peuvent être synthétisés par les plantes dans le but de se

protéger contre différents stress biotiques et abiotiques, leur procurant ainsi des solutions

face au défi de devoir vivre immobiles (Pare et Tumlinson 1999). Les feuilles relâchent en

temps normal peu de composés volatils mais des hormones de stress comme l’acide

jasmonique, l’acide salicylique et l’éthylène stimulent la production de ces composés

12

lorsque la plante est considérée en danger (Scala et al. 2013). Par exemple, des terpènes

à cinq carbones produits en réponse à l’action de ces hormones protègent la plante contre

la chaleur, en stabilisant les interactions hydrophobes au sein des membranes. De plus,

les terpènes peuvent réagir avec les formes réactives de l’oxygène et ainsi les empêcher

d’endommager les cellules (Vickers et al. 2009). Par ailleurs, un mélange complexe de

composés volatils dérivés des acides gras émis par les feuilles permet aux plantes de se

défendre contre les herbivores, les insectes et les microorganismes pathogènes. La nature

des composés émis varie avec l’espèce de la plante, mais aussi avec le type d’herbivore.

Les volatils produits confèrent à la plante un goût repoussant l’herbivore, attirant aussi ses

prédateurs naturels et lui permettant de prévenir les plantes des dangers qui les entourent

afin qu’elles induisent une réaction de défense (Pare et Tumlinson 1999). Les composés

volatils émis par les fruits servent pour leur part à signaler aux animaux et insectes

disséminateurs de graines que le fruit est de bonne qualité. Ceux-ci vont donc le manger

et ainsi disséminer efficacement les graines (Baldwin et al. 2010).

Chez les humains, les composés volatils sont détectés par deux mécanismes

complémentaires de la perception olfactive : la rétro-olfaction et l’ortho-olfaction. L’ortho-

olfaction consiste à détecter les composés en humant directement l’aliment ou la plante,

sans l’ingérer : c’est la notion d’odeur. La rétro-olfaction, en revanche, est le mécanisme

physiologique permettant de percevoir à partir du système olfactif les caractéristiques

aromatiques, aussi appelées flaveurs, des aliments une fois retrouvés dans la bouche. Les

molécules ingérées passent alors à l’arrière du palais pour atteindre l’épithélium olfactif

derrière les fosses nasales : c’est la notion d’arôme (Tieman et al. 2012). Certains volatils

très abondants dans les fruits ne contribuent pas à former une saveur appréciée par le

consommateur, alors que d’autres, beaucoup moins abondants, y contribuent. Sur les 400

composés volatils synthétisés par la tomate, une trentaine ont été identifiés pour leur rôle

déterminant dans son arôme (Baldwin et al. 2000). Dans le cadre de ce projet, seuls les

composés volatils dérivés des terpènes et des acides gras seront abordés plus en détail.

1.2.2 Les apocaroténoïdes

Origine et odeur des apocaroténoïdes

Certains apocaroténoïdes volatils, synthétisés à partir du clivage oxydatif des

caroténoïdes, dégagent des arômes particuliers et agréables afin d’attirer les insectes

pollinisateurs et les animaux disséminateurs de graines. Ils sont également d’une grande

13

importance pour la qualité gustative des fruits et des légumes que nous consommons

(Baldwin et al. 2010). Les principaux apocaroténoïdes qui participent à la flaveur des

tomates sont la β-ionone, le 6-méthyl-5-hepten-2-one, le géranylacétone, l’α-ionone et la

pseudoionone. La β-ionone (C13) est issue du clivage de la β-carotène aux liens 9,10

(9’,10’). Ce composé volatil possède une odeur de type floral, plus particulièrement une

odeur de rose. Il dégage également des touches de boisé, de fruité, de sucré et de baies.

Le clivage de la delta-carotène aux liaisons 9,10 (9’,10’) entraine la formation de l’α-ionone

(C13), qui a une odeur caractéristique de violette (Viola odorata), et joue également un rôle

très important dans l’arôme de la framboise. Le 6-méthyl-5-hepten-2-one (C8) est un

apocaroténoïde possédant un arôme citronné. Il peut être synthétisé par le clivage du

lycopène au niveau des doubles liaisons 5,6 (5’,6’), ou bien au niveau de la double liaison

5’,6’ de la δ-carotène. L’apocaroténoïde pseudoionone (C13) résulte du clivage du

lycopène aux liaisons doubles 9,10 (9’,10’), ou du clivage de la δ-carotène au niveau de la

double liaison 9’,10’ émettant alors un arôme sucré. Le géranylacétone (C13), qui dégage

un arôme fruité et frais, est synthétisé lors du clivage de la ζ-carotène aux doubles liaisons

9,10 (9’,10’). (Simkin et al. 2004, Ohmiya 2009). D’autres composés volatils, moins

importants pour l’arôme de la tomate peuvent être synthétisés à partir du clivage oxydatif

des caroténoïdes. Par exemple, la β-damascenone (C13) dérive du clivage de la

néoxanthine à la liaison 9,10. Dégageant un arôme floral, elle est un des principaux

composés volatils responsables de l’odeur des roses. Le composé volatil 3-hydroxy-β-

ionone (C13) résulte du clivage de la zéaxanthine aux doubles liens 9,10 (9’,10’). Cet

apocaroténoïde possède un arôme floral mais ne semble pas très impliqué dans la flaveur

de la tomate (Auldridge et al. 2006). Dans les racines mycorhizées, la β-carotène peut

également subir un clivage oxydatif au niveau des liens 9,10 (9’,10’). Cela relâche les

apocaroténoïdes mycorradicine (C14) et cyclohexenone (C13), essentiels pour assurer une

bonne communication entre les racines et les microorganismes du sol (Floss et al. 2008).

La Figure 1.2 résume les différents composés volatils générés à partir des caroténoïdes,

ainsi que les caractéristiques olfactives de chaque molécule produite.

Synthèse des apocaroténoïdes

Ce sont des enzymes de type CCD (Carotenoid Cleavage Dioxygenase) qui

catalysent le clivage oxydatif des caroténoïdes pour générer les apocaroténoïdes, dont

une grande partie sont des composés volatils. Les enzymes de la famille des CCDs

partagent plusieurs propriétés. Elles requièrent toutes un ion Fe2+, nécessaire à leur

14

activité catalytique et contiennent 8 histidines afin de coordonner la fixation de cet ion

ferreux. Elles possèdent en outre une séquence peptidique particulière et spécifique à leur

extrémité carboxy-terminale. Il existe neuf classes de dioxygénases, recensées d’abord

chez l’espèce Arabidopsis thaliana puis identifiées chez d’autres plantes, dont la

tomate. Cinq de ces enzymes sont des 9-cis epoxycaroténoïdes dioxygénases (NCED2,

NCED3, NCED5, NCED6 et NCED9), qui acceptent seulement comme substrat, des

caroténoïdes à 40 carbones en configuration cis (Ohmiya 2009). Ces enzymes sont

impliquées dans la biosynthèse de l’hormone acide abscissique, à partir de néoxanthine et

de violaxanthine. Cette hormone est très importante chez les plantes, puisqu’elle joue des

rôles primordiaux dans la régulation de la tolérance au stress hydrique et le

développement de la graine. Les quatre autres classes de CCD, CCD1, CCD4, CCD7 et

CCD8, dont les séquences nucléotidiques sont éloignées de celles des 9-cis

epoxycaroténoïdes dioxygénases, jouent pour leur part des rôles différents dans la plante

(Tan et al. 2003, Kloer et Schulz 2006).

Les gènes CCD7 et CCD8 s’expriment principalement dans les racines. L’enzyme

CCD7 clive la 9-cis-β-carotène de façon asymétrique, au niveau du double lien entre les

carbones 9 et 10, afin de produire un composé à 13 carbones, la β-ionone, ainsi qu’un

aldéhyde à 27 carbones, le 10’-apo-β-carotenal. L’enzyme CCD8 coupe alors le 10’-apo-β-

carotenal par deux réactions de clivage oxydatif consécutives, pour générer

l’apocaroténoïde carlactone (C18) (McQuinn et al. 2015). Ce dernier composé est ensuite

converti en 5-deoxystrigol, une molécule de type strigolactone, précurseure d’autres

strigolactones. Les strigolactones sont des phytohormones très importantes pour le

développement de la plante. En plus d’être responsables d’inhiber le bourgeonnement des

tiges latérales, elles sont impliquées dans la formation des racines latérales et adventives,

le développement des poils racinaires, la germination des graines, la photomorphogenèse

et la réponse à différents stress (Goulet et Klee 2010). Les enzymes CCD7 et CCD8 ne

sont pas impliquées dans la formation d’arômes (Auldridge et al. 2006). Chez la tomate,

les gènes codant pour ces deux enzymes sont respectivement appelés SlCCD7

(Solyc01g090660) et SlCCD8 (Solyc08g066650) (Wei et al. 2016).

15

Figure 1.2. Synthèse des apocaroténoïdes volatils chez les plantes à partir du clivage

oxydatif des caroténoïdes. La figure illustre les principaux apocaroténoïdes volatils (en gras) émis

par les plantes, les sites de clivage des CCDs au niveau de leurs précurseurs (lignes pointillées)

ainsi que leurs arômes respectifs (en italique).

L’enzyme CCD4 est connue pour jouer un rôle dans le clivage oxydatif des

caroténoïdes dans les fleurs. De par son action oxydative sur les caroténoïdes, cette

enzyme est à l’origine de leur dégradation, et donc de la couleur blanche des pétales de

certaines fleurs comme par exemple celles du chrysanthème (Chrysanthemum

morifolium). Au contraire, lorsque l’expression de CCD4 est inhibée, les fleurs de

chrysanthèmes arborent une couleur jaune due aux caroténoïdes qui s’y accumulent

(Kishimoto et Ohmiya 2006). La même observation a été faite sur les graines

d’Arabidopsis thaliana, et sur les tubercules de pomme de terre (Solanum tuberosum)

(Campbell et al. 2010, Gonzalez-Jorge et al. 2013). Dans les stigmates du safran (Crocus

sativus), CCD4 est impliquée dans la production d’apocaroténoïdes jaunes, tels que la

bixine, la crocetine et le safranal à partir du clivage de la zéaxanthine. Ce sont ces

pigments qui donnent à l’épice sa couleur et son arôme si caractéristiques. Chez certaines

16

plantes comme le chrysanthème et le pommier, l’enzyme CCD4 semble impliquée dans la

synthèse de composés volatils dérivés des caroténoïdes, notamment de β-ionone (Huang

et al. 2009). Dépendamment des espèces, CCD4 peut effectuer le clivage oxydatif des

caroténoïdes au niveau des doubles liens 9,10 (9’,10’) et 7,8 (7’,8’) (Huang et al. 2009, Ma

et al. 2013). Cependant, comme CCD4 ne s’exprime presque pas dans les fruits de

Solanum lycopersicum, elle n’y est pas impliquée dans la synthèse de composés volatils.

Deux isoformes de CCD4, appelés SlCCD4a (Solyc08g075480) et SlCCD4b

(Solyc08g075490) existent chez la tomate. SlCCD4a s’exprime surtout dans les fleurs,

tandis que SlCCD4b est principalement actif dans les feuilles, et plus modérément dans

les fleurs (Fernandez-Pozo et al. 2015, Wei et al. 2016).

En théorie, l’enzyme capable de cliver les doubles liens 9,10 (9’,10’), 5,6 (5’,6’) et

7,8 (7’,8’) des caroténoïdes linéaires et cycliques pour générer dans les fruits la variété

d’apocaroténoïdes mentionnés plus haut est CCD1. Il existe deux isoformes de l’enzyme

CCD1 chez la tomate, SlCCD1a (Solyc01g087250) et SlCCD1b (Solyc01g087260). Les

gènes codant pour ces deux enzymes sont situés sur le chromosome 1 et possèdent 83%

d’homologie. Bien que les deux isoformes soient capables de cliver les mêmes substrats,

ils présentent in vitro des affinités distinctes pour certains liens et certains caroténoïdes.

SlCCD1a s’exprime surtout dans les racines, tandis que SlCCD1b s’exprime fortement

dans les fruits, des stades « mature green » à « red ripe » (Ilg et al. 2014, Wei et al. 2016).

Lorsque l’expression des gènes SlCCD1a et SlCCD1b est inhibée, la quantité

d’apocaroténoïdes émise par les tomates est réduite par rapport à des tomates témoins

(Simkin et al. 2004). Une baisse de 37 à 45% de la β-ionone et de 56 à 61% du

géranylacétone ont en l’occurrence été observés dans les fruits où l’expression des

SlCCD1 avait été supprimée. Cette réduction, bien que significative, n’était cependant pas

totale et les tomates continuaient d’émettre des quantités non négligeables

d’apocaroténoïdes. SlCCD1a et SlCCD1b étant les seules enzymes de la famille des

CCDs ne possédant pas de peptide de signalisation spécifique aux plastes, elles sont

donc situées dans le cytosol alors que les caroténoïdes s’accumulent dans des structures

situées à l’intérieur des chromoplastes. SlCCD1a et SlCCD1b ne peuvent donc, en

théorie, n’accéder qu’aux caroténoïdes à 40 carbones qui se seraient « échappés » de

chromoplastes dont la membrane externe aurait subi des dommages ou bien à ceux qui

se retrouvent sur les membranes externes (Walter et al. 2010, Wei et al. 2016). Ces

observations laissent supposer que, même si SlCCD1 semble essentielle dans la

17

synthèse d’apocaroténoïdes chez la tomate, elle doit nécessiter l’assistance d’une autre

enzyme ou d’un autre intermédiaire afin de remplir ses fonctions. Cette idée est appuyée

par le fait que dans les racines de Medicago truncatula, lorsque l’expression de MtCCD1

est inhibée, en plus d’une baisse importante de mycorradicine et de cyclohexone, des

apocaroténoïdes à 14 et 13 carbones, une accumulation de composés non pas à 40

carbones, mais à 27 carbones est observée. Cela suggère que, dans les racines, une

première enzyme assurerait le clivage oxydatif des caroténoïdes à 40 carbones en

apocaroténoïdes à 27 carbones, qui seraient ensuite pris en charge par CCD1. De plus,

des études ont démontré in vitro et chez A. thaliana que l’enzyme CCD1 semble avoir 12 à

16 fois plus d’affinité pour les apocaroténoïdes à 27 carbones tels que le β-apo-10’-

carotenal, un dérivé de la β-carotène, plutôt que pour les caroténoïdes à 40 carbones plus

courants (Schmidt et al. 2006). L’enzyme CCD7 est de plus en plus considérée comme la

candidate capable de fournir des substrats à 27 carbones à l’enzyme CCD1 dans les

racines. Dans les fleurs, c’est l’enzyme CCD4 qui pourrait jouer ce rôle. Cependant,

SlCCD7, SlCCD4a et SlCCD4b ne s’exprimant pas dans les fruits, elles ne peuvent

qu’expliquer la synthèse des apocaroténoïdes dans les racines et les fleurs, mais pas

dans les tomates (Floss et al. 2008).

1.2.3 Les composés volatils dérivés d’acides gras

Origine et odeur

Les composés volatils retrouvés dans les plantes proviennent en majorité de la

dégradation des acides gras saturés et insaturés (Klee et Tieman 2013), qui constituent la

deuxième classe de composés volatils pertinente à étudier pour ce projet, en plus des

apocaroténoïdes. Ces composés dérivés des acides gras peuvent être des alcools, des

aldéhydes, des cétones, des acides ou des esters. Ils sont retrouvés dans toutes les

plantes, et à de grandes concentrations. Ils sont produits dans les tissus végétatifs de la

plante en réponse à des blessures physiques, ainsi que pour se défendre contre l’attaque

d’insectes et de microorganismes pathogènes (Scala et al. 2013). De plus, l’arôme de

verdure et d’herbe fraichement coupée qu’ils dégagent est très importante pour la flaveur

des fruits (Schwab et al. 2008). Parmi les composés dérivés d’acides gras, ce sont ceux à

6 carbones (hexanal, cis-3-hexenal, l’hexanol, et cis-3-hexenol) et ceux à 5 carbones (1-

penten-3-one, cis-2-pentenal, 3-pentanone, 1-pentanol, 1-penten-3-ol, éthylvinylcétone)

18

qui sont considérés comme les plus importants pour l’arôme de la tomate (Tieman et al.

2012).

Synthèse des composés volatils dérivés d’acides gras

Au cours de la maturation des fruits, la transformation des chloroplastes en

chromoplastes implique la dégradation des membranes des thylakoïdes par des lipases,

ce qui relâche alors des acides gras polyinsaturés à 18 carbones tels que l’acide

linolénique et l’acide linoléique (Chen et al. 2004). L’enzyme 13-lipoxygénase (13-LOX)

est une dioxygénase catalysant l’incorporation d’un atome d’oxygène au niveau du

carbone en position 13 des acides gras linoléiques et linoléniques afin de les convertir en

acides gras hydroperoxydés en position C13 (13-HPOs) (Schwab et al. 2008). Afin de

générer des composés volatils à 6 carbones, l’enzyme hydroperoxyde lyase (HPL)

transforme ensuite ces acides gras hydroperoxydés en aldéhydes volatils, comme

l’hexanal et le cis-3-hexenal (Shen et al. 2014). L’enzyme alcool déshydrogénase 2

(ADH2) peut alors convertir l’hexanal et le cis-3-hexenal en alcool pour créer,

respectivement, les composés volatils hexanol et cis-3-hexenol (Speirs et al. 1998). Les

13-HPOs peuvent également être modifiés une deuxième fois par la 13-LOX avant d’être

pris en charge par d’autres enzymes pour générer les différents composés volatils dérivés

des acides gras à 5 carbones énumérés précédemment (Shen et al. 2014). Chez S.

lycopersicum, la 13-LOX responsable de la synthèse des composés volatils dérivés des

acides gras dans les fruits est connue sous le nom de TomloxC (Solyc01g006540).

TomloxC se situe dans les chloroplastes, et son niveau d’expression augmente

considérablement au cours de la maturation des fruits. Il existe deux autres 13-LOX

chloroplastiques chez la tomate (Chen et al. 2004). TomloxD, dont l’expression est

distribuée dans les racines, les fleurs, les feuilles et les fruits, est impliquée dans la

synthèse de la phytohormone acide jasmonique (Hu et al. 2011, 2013). TomloxF s’exprime

très peu en temps normal dans les fruits en comparaison avec TomloxC et TomloxD, son

expression étant stimulée lors d’une infection par des agents pathogènes (Shen et al.

2014). Cet isoforme de la 13-LOX est impliqué dans la synthèse d’acide 13-hydroxy-

octadécatrienoïque, qui a des propriétés antifongiques. Son rôle dans la synthèse des

composés volatils C6 n’a pas été caractérisé (Mariutto et al. 2011).

Trois 9-lipoxygénases, TomloxA, TomloxB et TomloxE, ont également été

identifiées chez S. lycopersicum. Ces trois isoformes utilisent les mêmes substrats que les

13-LOX afin de générer des acides gras hydroperoxydés en position C9, les 9-HPOs (Hu

19

et al. 2014). Ces composés peuvent ensuite être transformés en diverses molécules

impliquées dans la défense des plantes, telles que l’acide colnelénique et l’acide 9-oxo-

nonanoique (Fammartino et al. 2007, Mita et al. 2005). Bien que très exprimées dans les

fruits en maturation, ces trois 9-LOX ne sont pas impliqués dans la synthèse de composés

volatils des acides gras (Griffiths et al. 1999). Si la 13-LOX est particulièrement importante

pour ce projet, c’est parce qu’en catalysant l’oxydation des acides gras, elle pourrait

également entrainer l’oxydation des caroténoïdes présents dans les plastes. En effet, les

radicaux peroxyl provisoirement générés lors de l’hydroperoxydation des acides gras

peuvent, de par leur caractère très réactif, provoquer l’oxydation aléatoire des

caroténoïdes (Wu and Robinson, 1999). Ce processus de co-oxydation est connu in vitro

et dans la farine depuis plusieurs années (Leenhardt et al. 2006).

1.3. Objectifs et hypothèses

En résumé, l’accumulation des caroténoïdes dans les tomates au cours de leur

maturation est essentielle afin de leur donner aussi bien leur couleur caractéristique que

leur flaveur. La synthèse des apocaroténoïdes, des composés volatils réputés pour avoir

un impact significatif sur l’arôme des fruits, dérive directement du clivage oxydatif des

caroténoïdes. La nature et la concentration respective des différents caroténoïdes qui sont

à l’origine des multiples patrons de coloration des tomates à maturité, apparaît par

conséquent déterminant sur le mélange d’apocaroténoïdes produits, et donc sur la flaveur

du fruit. Les processus d’accumulation et de clivage des caroténoïdes doivent donc être

compris afin de pouvoir contrôler et améliorer l’arôme des fruits. Dans cet optique,

l’objectif principal de ce projet de maîtrise était d’étudier les processus génétiques et

moléculaires impliqués dans l’arôme de la tomate, et plus particulièrement le sentier de

synthèse des apocaroténoïdes. Afin d’identifier de nouveaux gènes impliqués dans ce

sentier et ainsi mieux en comprendre certaines étapes clés, trois axes de recherche ont

été définis.

Axe 1. Le premier axe de recherche s’est concentré sur l’étape de clivage des

caroténoïdes associés à la libération des apocaroténoïdes volatils. La manière dont

l’enzyme CCD1, située dans le cytosol, accède à ses substrats, les caroténoïdes,

20

enfermés dans les chromoplastes demeurait inconnue. Une première hypothèse pour le

projet était donc qu’une ou plusieurs autres enzymes accompagnent CCD1 dans son rôle

de clivage, en lui permettant au préalable de se retrouver en contact avec ses substrats.

Plus précisément, l’enzyme Lipoxygénase C (TomloxC), en assurant sa fonction originelle

d’oxydation des acides gras dans les plastes des tomates, pourrait entrainer la co-

oxydation aléatoire des caroténoïdes, par l’entremise de radicaux peroxyles très réactifs.

Ainsi, la co-oxydation des caroténoïdes dans les plastes par TomloxC constituerait une

étape préalable à leur clivage oxydatif par CCD1 dans le cytosol.

Axe 2. Comme la tomate est un modèle d’étude complexe qui émet de multiples

composés volatils, la deuxième partie du projet s’est basée sur l’espèce Viola odorata, ou

violette odorante, une petite fleur printanière de couleur violette. Même si les pétales de

ses fleurs ne semblent pas accumuler de caroténoïdes, Viola odorata émet de grandes

quantités d’apocaroténoïdes, et plus particulièrement d’α-ionone, de β-ionone et de

dihydro-β-ionone (Gautschi et al. 2001). L’objectif ici était de comparer les données

transcriptomiques des pétales de V. odorata, avec celles de V. septentrionalis, une espèce

apparentée peu odorante (Figure 1.3), afin d’identifier les gènes impliqués dans la

synthèse des apocaroténoïdes. Cette expérience a été réalisée dans le but de pouvoir

transposer les connaissances acquises sur les violettes, à la tomate. La deuxième

hypothèse ayant été posée était donc que des gènes fortement exprimés chez V. odorata

par rapport à V. septentrionalis sont impliqués dans la synthèse des apocaroténoïdes.

Selon notre hypothèse, les gènes du sentier de production des apocaroténoïdes devraient

être très exprimés chez V. odorata afin d’expliquer les importantes quantités

d’apocaroténoïdes émises par ses pétales. Au contraire, ces mêmes gènes devraient être

peu exprimés chez V. septentrionalis, qui n’émet pas l’odeur caractéristique des

apocaroténoïdes.

Axe 3. En complément aux deux premiers axes, nous nous sommes davantage

intéressés à comprendre, dans le troisième axe, l’importance des réactions qui se

déroulent en amont du clivage présumé des caroténoïdes par l’enzyme CCD1, soit

l’accumulation des caroténoïdes dans les tomates en maturation. Il avait été observé au

préalable que des tomates appelées « bicolores » à cause de leur coloration particulière

comportant un mélange de jaune et de rouge présentaient une baisse d’émission

d’apocaroténoïdes par rapport à des tomates rouges standard (Mathieu et al. 2009). Ces

21

observations suggéraient que les caroténoïdes accumulés dans les fruits ont un impact

direct sur le profil d’émission des apocaroténoïdes. Sur cette base, la troisième hypothèse

de ce projet était que l’identification d’un gène impliqué dans la synthèse du lycopène

permettrait d’expliquer le phénotype particulier de ces tomates « bicolores » qui ne

rougissent pas uniformément. De manière plus spécifique, le profil particulier

d’apocaroténoïdes émis par les tomates bicolores pourrait être causé par un défaut dans

la structure ou l’expression d’un gène régulant la synthèse du lycopène, un caroténoïde

responsable de la couleur rouge des fruits chez la tomate.

Figure 1.3. Fleurs des violettes Viola odorata et Viola septentrionalis

22

Chapitre 2 : Synthesis of apocarotenoid volatiles in

flower and fruits: Reassessing the importance of

cytosolic carotenoid cleavage dioxygenases

Bulot, B., Nadeau, L-F., and Goulet, C.

Département de Phytologie, Faculté des Sciences de l’Agriculture et de l’Alimentation,

Université Laval. Pavillon Envirotron, 2480 boulevard Hochelaga, Québec QC, G1V0A6,

Canada

2.1 Résumé

Chez les tomates, SlCCD1 (Carotenoid Cleavage Dioxygenase 1) est considérée

comme l’enzyme responsable du clivage oxydatif des caroténoïdes pour la libération des

apocaroténoïdes volatils responsables des arômes fruités et sucrés. Les tomates

accumulent de grandes quantités de caroténoïdes dans leurs tissus mais seulement une

petite fraction est convertie en apocaroténoïdes, qui contribuent néanmoins de façon

significative à leur flaveur. SlCCD1 étant située dans le cytosol, la manière dont elle

accède à ses substrats localisés dans les plastes demeure inconnue. L’objectif de cette

étude était d’identifier d’autres enzymes qui pourraient, conjointement à CCD1, être

impliquées dans le sentier de production des apocaroténoïdes. Les lipoxygénases, qui

catalysent la co-oxydation aléatoire des caroténoïdes par l’oxydation des acides gras in

vitro, constituaient à cet égard des candidates intéressantes. Des lignées de tomates

transgéniques dont l’expression de SlCCD1 et de la lipoxygénase C (TomloxC) sont

inhibées, ont permis de démontrer que l’absence de SlCCD1 ne cause aucun changement

dans l’émission de composés volatils tandis que l’absence de TomloxC entraine une

diminution d’apocaroténoïdes. Ces observations suggéraient que SlCCD1 n’est pas une

enzyme clé dans la synthèse des apocaroténoïdes alors que TomloxC y jouerait un rôle

déterminant. Les fleurs de la violette odorante (Viola odorata), au contraire des tomates,

accumulent peu de précurseurs, mais produisent beaucoup d’ionones. Afin d’évaluer le

rôle des lipoxygénases et des CCDs chez V. odorata, une analyse transcriptomique a été

réalisée pour comparer ses fleurs et celles d’une espèce inodore apparentée, V.

septentrionalis. L’expression élevée chez V. odorata de gènes codant pour les enzymes

23

plastidiques, CCD4 et CCD1-like, une CCD n’ayant pas encore été caractérisée, ainsi que

deux 13-lipoxygénases, suggère qu’ils jouent un rôle dans la synthèse des

apocaroténoïdes. Chez les fleurs et les fruits, la présence d’enzymes capables d’accéder

aux caroténoïdes serait ainsi nécessaire pour la production d’apocaroténoïdes. Ces

enzymes peuvent être soit des CCDs localisées dans les plastes comme VoCCD4 et

VoCCD1-like, soit des lipoxygénases capables de fournir des substrats aux CCDs ou de

synthétiser des apocaroténoïdes de manière indépendante.

2.2 Abstract

Volatile apocarotenoids are perceived as fruity and contribute to the distinctive

aroma of several fruits and flowers. In tomatoes, SlCCD1 (Carotenoid Cleavage

Dioxygenase) is recognized as the key enzyme responsible for the synthesis of volatile

apocarotenoids. While tomatoes accumulate large amounts of carotenoids, only a small

fraction is converted into apocarotenoids, which nevertheless significantly contribute to

their typical flavor. Since CCD1 is cytosolic and carotenoids are confined to plastids, the

way the enzyme accesses its substrates is still unknown. The objective of this study was to

evaluate the role of other enzymes that could be involved along with CCD1 in the

apocarotenoid synthesis pathway. Lipoxygenases that catalyze the dioxygenation of fatty

acids, are also known to co-oxidize carotenoids in vitro and in flour. Transgenic tomato

lines targeting the lipoxygenase TomloxC and SlCCD1 revealed that the reduction of

SlCCD1 expression doesn’t change apocarotenoid accumulation while TomloxC reduction

of transcripts causes a significant decrease in apocarotenoids emission. These results

demonstrate that SlCCD1 is not a key enzyme in apocarotenoid synthesis whereas

TomloxC plays a determinant role in the pathway. In contrast to tomatoes, sweet violet

flowers (Viola odorata) emit large quantities of ionones but accumulate low level of

carotenoids. To evaluate the role of lipoxygenases and CCDs in V. odorata, a

transcriptomic study was performed on petals of the fragrant species and petals of the

odorless V. septentrionalis. In V. odorata, the high expression of the plastid-localized

enzymes CCD4, CCD1-like as well as two 13-lipoxygenases suggests that they play a role

in apocarotenoid synthesis. In flowers and fruits, plastid-localized enzymes able to access

more easily carotenoids are therefore necessary to release apocarotenoid volatiles. The

enzymes can be either plastid-localized CCDs like VoCCD4 and VoCCD1-like, or

24

lipoxygenases providing substrates to CCDs, or producing apocarotenoids in an

independent way.

2.3 Introduction

Carotenoids are a group of pigments very important for photosynthesis efficiency,

photoprotection and other mechanisms essential for plants development (Siefermann-

Harms 1985, Krinsky 1989). In higher plants, they can accumulate in flowers and fruits

chromoplasts where they participate to their bright colour, from yellow to red (Bartley and

Scolnik 1995, Lancaster et al. 1997). Carotenoids can also be the precursors of molecules

called apocarotenoids when fragments of their carbon backbone are cleaved by a

molecular oxygen at specific conjugated double bonds (Winterhalter 1996, Marasco et al.

2006). This reaction is usually catalyzed by CCDs (Carotenoid Cleavage Dioxygenase)

enzymes (Giuliano et al. 2003, Bouvier et al. 2003). For example, geranylacetone is

produced by the cleavage of ζ-carotene at the bonds 9,10 (9’, 10’). In the same way, the

cleavage of lycopene at the bonds 5,6 (5’, 6’) and 9,10 (9’ 10’) leads, respectively, to the

release of 6-methyl-5-hepten-2-one (MHO) and pseudoionone (Simkin et al. 2004, Vogel

et al. 2008).

Apocarotenoids play different roles in plants’ development and survival, notably as

phytohormones (Taylor et al. 2005, Goulet and Klee 2010) and as volatiles important for

plant defense, pollination and seed dispersion (Dicke and Baldwin 2010). Apocarotenoid

volatiles possess a floral and tropical scent. They are an important constituent of several

flowers aroma like sweet violet (Viola odorata) (Gautschi et al. 2001) or sweet osmanthus

(Osmanthus fragans) (Baldermann et al. 2010), and the flavour of many fruits like tomato

(Solanum lycopersicum) (Rambla et al. 2014), peach (Prunus persica) (Aubert et al. 2003),

mango (Mangifera indica) (Pino and Mesa 2006) or raspberry (Rubus idaeus) (Beekwilder

et al. 2008). In some of those species, apocarotenoid emission is linked to a large

accumulation of carotenoids while in other species the carotenoids do not accumulate and

are therefore directed quickly to apocarotenoid production. Tomato fruits are rich in

carotenoids and release a relatively small amount of geranylacetone and MHO that are

significantly involved in their typical aroma (Ohmiya 2009, Vogel et al. 2010). In contrast,

V. odorata accumulates a limited range of carotenoid precursors in its violet flowers, but

25

has the capacity of releasing high amounts of ionones that make the flower highly fragrant.

More than 75% of the volatiles emitted by the flower are derived from carotenoids

(Werkhoff et al. 1991, Gautschi et al.. 2001, Brenna et al. 2002).

Nine enzyme members of the CCD enzyme family have been identified in

Arabidopsis thaliana, and their orthologs have subsequently been found in other species

including tomato. Five members, named 9-cis-epoxycarotenoid dioxygenases (NCED2,

NCED3, NCED5, NCED6 and NCED9) given their cleavage affinity for 9-cis-

epoxycarotenoids drive synthesis of the phytohormone abscisic acid (ABA) from

neoxanthin and violaxanthin (Ohmiya 2009). The other four other enzymes, named CCD1,

CCD4, CCD7 and CCD8, direct the cleavage of carotenoids (Tan et al. 2003, Kloer and

Schulz 2006). CCD7 and CCD8 are involved in the biosynthesis of strigolactones, a class

of hormones in plants that control shoot branching, from 9-cis-β-carotene (Schwartz 2004,

Vogel 2010, Goulet and Klee 2010). CCD7 and CCD8 do not seem to be involved in

aroma apocarotenoid synthesis in fruits and flowers (Auldridge et al. 2006). Depending on

the species, the enzyme CCD4 can catalyze carotenoid cleavage at 9, 10 (9’, 10’) and 7,8

(7’, 8’) and more rarely at 5, 6 (5’, 6’) double bonds (Huang et al. 2009, Ma et al. 2013,

Lashbrooke et al. 2013). CCD4 is mostly expressed in flowers and is responsible for the

white color of some cultivars of chrysanthemum (Chrysanthemum morifolium) by

degrading the carotenoids accumulating in the petals (Kishimoto and Ohmiya 2006). In

saffron stigma, CCD4 takes part in production of bixin, crocetin and safranal from

zeaxanthin. These apocarotenoids are responsible of the color and aroma of saffron spice

(Bouvier et al. 2003, Rubio-Moraga et al. 2014). SlCCD4a and SlCCD4b, the two CCD4

isoforms identified in tomatoes are expressed in flowers and leaves, but not in fruits

(Tomato Genome Consortium 2012). The enzyme SlCCD1 has been characterized to

catalyze the cleavage of carotenoids at 9, 10 (9’, 10’), as well as 5, 6 (5’, 6’) and 7, 8 (7’,

8’) double bonds to produce various volatile apocarotenoids (Vogel et al. 2008). The two

isoforms of SlCCD1 that have been identified in tomato, SlCCD1a and SlCCD1b, are

expressed in most plant tissues. In the fruits, SlCCD1b is more expressed than SlCCD1a

(Tomato Genome Consortium 2012). SlCCD1 enzymes are the only ones of the CCD

family that don’t possess a plastid transit peptide and are thus localized in the cytosol

(Simkin et al. 2004, Wei et al. 2016). Some studies suggest that the CCDs hydrophobic

residues that form the “hydrophobic patch” could ensure SlCCD1 association with

chloroplast outer membranes (Behrendt et al. 2011). However, CCD1-GFP fusions

26

transiently expressed in tobacco protoplasts showed that CCD1 enzymes are located in

cytosol and not specifically bound to plastid membranes (Aulridge et al. 2006). This means

that even if there is a possible chemical bound between CCD1 and chloroplasts

membranes, their association is not strong enough to assure CCD1 a permanent access

to the carotenoid located in chloroplast membranes. This hydrophobic patch of the CCDs

seems to be more involved in the association with the hydrophobic carotenoid substrates

than with the membranes. The way SlCCD1 enzymes can access to their substrates, the

carotenoids, stored in the chromoplasts is therefore unresolved yet. Furthermore, when

SlCCD1a and SlCCD1b expression is reduced, geranylacetone and β-ionone emission

only show a partial decrease compared with control tomatoes (Simkin et al. 2004).

Considering these results, we hypothesize that another enzyme participates in

apocarotenoid synthesis and helps SlCCD1 to overcome its compartmentalization issues.

This idea was supported by the fact that in vitro and in Medicago truncatula roots, SlCCD1

seems to have from 12 to 16 times more affinity for 27 carbons apocarotenoids like β-apo-

10’-carotenal derived from β-carotene than for the original 40 carbon carotenoid (Floss and

Walter 2009, Ilg et al. 2014).

Lipoxygenases are enzymes known to participate in the synthesis of volatile

compounds derived from fatty acids. In tomato fruits, the ripening dependant plastid 13-

lipoxygenase TomloxC is responsible for the conversion of linolenic and linoleic acids to

13-hydroperoxy fatty acids that will be further processed in volatile compounds (Chen et al.

2004, Shen et al. 2014, Heitz et al. 1997., Griffiths et al. 1999a, 1999b). Peroxyl radicals

temporarily generated during this fatty hydro peroxidation step are very reactive and can

thus produce random oxidation of carotenoids (Wu et al. 1999). This co-oxidation

phenomenon has been observed in vitro and in flour during bread fabrication processes

(Leenhardt et al. 2006, Wu et al. 1999, Chedea and Jisaka 2013). This information

suggests that lipoxygenases may be involved, along with CCD1, in the apocarotenoid

production pathway. There are two other plastid targeted 13-lipoxygenases (TomloxD and

TomloxF), as well as three cytosolic 9-lipoxygenases (TomloxA, TomloxB and TomloxE)

that have been identified in tomatoes. TomloxD is involved in the phytohormone jasmonic

acid in roots, flowers, leaves and fruits, but do not participate in C6 volatile compounds

synthesis (Hu et al. 2011, Hu et al. 2013). TomloxF expression is induced by pathogen

infection in order to synthetize antifungals molecules like 13-hydroxy-octadecatrienoic

acid. It’s role in volatile emission in fruits has not been characterized yet (Mariutto et al.

27

2011). The 9-lipoxygenases generate 9-hydroperoxy fatty acids by the oxidization of the

same substrates as 13-lipoxygenases, but at the C9 position (Hu et al. 2014). 9-

lipoxygenases take part in plant defense by producing molecules like colnelenic and 9-

oxo-nonanoic acids (Fammartino et al. 2007, Mita et al. 2005). TomloxC is thus considered

as the more important tomato lipoxygenase in fruits aroma by being involved in C6 and C5

volatile compound analysis (Chen et al. 2004, Shen et al. 2014).

In order to study the impact of CCDs and lipoxygenases activity in the

apocarotenoid production pathway, two species with different carotenoid accumulation and

apocarotenoid emission profiles, tomatoes and sweet violet, were investigated.

2.4 Materials and Methods

Growth of transgenic tomatoes

Seeds from transgenic tomato lines 9528_CCD1, 9530_CCD1 and 0966_LoxC

were kindly provided by Prof. Harry Klee (University of Florida, Gainesville FL). They

developed the transgenic line PLOXCAs-0966-2-1 (0966_LoxC) from M82 cultivar that

they modified with a TomloxC-antisense construction to suppress TomloxC expression.

The transgenic lines PLC1Bi-9528-3 (9528_CCD1) and PLC1Bi-9530-1 (9530_CCD1) in

which SlCCD1a and SlCCD1b genes expression have been blocked were also developed

from M82 cultivar but with an SlCCD1b-hairpin construction. The isoforms SlCCD1a and

SlCCD1b having a 83% sequence homology, a single SlCCD1b-hairpin transgenic

construction inserted in the lines 9528_CCD1 and 9530_CCD1 was able to significantly

block both of their expression, even if it performed better on the repression of SlCCD1b

isoform. Since SlCCD1b is considered as the isoform responsible of carotenoid oxidative

cleavage in fruits, we considered that the transgenic plants were suitable for the evaluation

of apocarotenoids emission analysis. Genetic crosses between 0966_LoxC line and

9528_CCD1 or 9530_CCD1 lines have been performed in our laboratory to create two

new transgenic lines, CCD1+LoxC 1 and CCD1+LoxC 2, in which the expression of

TomloxC as well as the two isoforms of SlCCD1 were all repressed. Six plants of the

control M82 and the transgenic lines 0966_LoxC, 9528_CCD1 and 9530_CCD1, as well

as twelve plants of each of the two crosses lines CCD1+LoxC 1 and CCD1+LoxC 2 were

28

then grow in greenhouse in Laval University (autumn 2015) in a randomized design until

they produced ripe fruits. DNA of each plant was extracted to perform a PCR with specific

primers (nptII) for the kanamycin gene resistance in order to be sure that they all carried

their respective transgenic construction. See Supplementary Table 2.6 for primers

sequences.

Flowers harvesting

Viola odorata flowers were collected in Roger-Van den Hende botanical garden of

Laval University in the first week of May 2017. Viola septentrionalis flowers were picked up

in wooded area near Laval University in mid-May 2017.

Volatile compounds analysis

Ripe tomato fruits from M82, 9528_CCD1, 9530_CCD1, 0966_LoxC, CCD1+LoxC

1 and CCD1+LoxC plants were harvested, pooled and chopped before 100g were placed

in glass tubes as described by Schmelz et al. 2003. During 1 hour, hydrocarbon filtered air

(Agilent, www.agilent.com) arrived at one extremity of the tube, harvested volatiles

compounds released by tomatoes and flowers and led them to be trapped by a

divinylbenzene resin column (HayeSep Q) placed at the other extremity of the tube.

Volatiles trapped on the HayeSep Q column were eluted by a solution composed of

methylene chloride to unbind volatiles from the column, and the internal standard nonyl

acetate. Volatile samples were then taken to an Agilent gas chromatograph (Agilent 6890),

which DB-5MS UI column (30m, 0.250nm diam., Agilent, www.agilent.com) separated

volatiles according to their chemical proprieties. Each volatile compound, represented by a

peak by the ChemStation software (Agilent, www.agilent.com) was identified by known

standards as well as retention times previously defined thanks to an Agilent gas

chromatograph-mass spectrometer (GC-MS, Agilent 5977B) (Agilent, www.agilent.com).

Volatile levels were calculated by integration of the peaks and then standardized to obtain

ng.gFW -1.h-1 values. For each volatile compound, one-way ANOVA followed by Tukey

tests were performed in order to assess which lines were significantly different from the

others. For Viola volatiles analysis, 30 opened flowers were placed in the glass tubes.

Volatile compound extraction was then performed with the same protocol as for tomatoes.

Volatile levels were calculated by integration of the peaks and then standardized to obtain

29

ng.g 30 flowers-1.h-1 values. For each volatile compound, t-test was performed to compare

the two Viola species.

Quantitative PCR

The same ripe fruits of M82, 9528_CCD1, 9530_CCD1, 0966_LoxC, CCD1+LoxC

1 and CCD1+LoxC 2 plants used for volatile analysis were frozen in liquid nitrogen and

store at -80°C. Total RNA was extracted following the EZ-10 Spin Column Plant RNA

Miniprep Kit protocol (Biobasic, www.biobasic.com). Possible genomic DNA contamination

was removed by DNAse treatment step (Qiagen, www.qiagen.com) before purifying total

RNA with a second run of the EZ-10 Spin Column Plant RNA Miniprep Kit protocol.

Quantification of total RNA was evaluated on NanoDrop (ThermoFisher,

www.thermofisher.com). Quantitative PCR was executed with the qScript One-Step qRT-

PCR Kit (QuantaBio, www.quantabio.com) from 100ng of total RNA. Primers were

designed for SlCCD1a (CCD1a-1_qpcr), SlCCD1b (CCD1b-1_qpcr) and TomloxC (LoxC-

1_qprc) amplification. See Supplementary Table 2.6 for primers sequences. The

quantification of SlCCD1a, SlCCD1b and TomloxC transcripts was determined with a

standard curve. For each gene, expression levels have been compared with Tukey tests.

Transcriptome sequencing and analysis

V. odorata and V. septentrionalis flowers total RNA was extracted from 200mg of

petals frozen in liquid nitrogen and store at -80°C with the same protocol used with

tomatoes. Three RNA-Seq libraries for each of the two Viola species were prepared

following the Zhong et al. 2011 protocol that has been modified and adapted for paired-

end 125 bp RNA-Seq (Supplementary Figure 2.4). The libraries were sent to CHUL

sequencing platform (www.crchudequebec.ulaval.ca) to be analyzed on a Bioanalyzer

(Agilent, www.agilent.com) and sequenced paired-end 125 bp with HiSeq 2500 Illumina

technology (Illumina, www.illumina.com). The quality of the sequencing data was then

evaluated with FastQC program. The bad qualities reads and Illumina adapters were

removed with Trimmomatic (Bolger et al. 2014). For each species, the three libraries were

grouped and transcriptomes were assembled de novo using Trinity program (Grabherr et

al. 2011) with default parameters. Assembled contigs above 400bp were retained and

searched against the UniProtKB/SwissProt database to be functionally annotated following

the Trinotate pipeline. Orthologous transcripts between the two species were identified

30

using the Transcriptologs program (Ambrosino and Chiusano 2017). Gene expression in

TPM normalized with TMM method to correct for library size variation was achieved with

RSEM (Li and Dewey 2011, Robinson and Oshlack 2010). The package limma-voom

(Ritchie et al. 2015) from the Bioconductor repertory of R (Bionconductor,

www.bioconductor.org) was then used to perform the differential gene expression analysis.

Cellular localization of transcripts was estimated with TargetP (Emanuelsson et al. 2000).

Homology between Viola transcripts and sequences from other plant species (available at

NCBI database, see Supplementary Table 2.2) was evaluated with Clustal Omega

(Larkin et al. 2007). Phylogenetic trees were constructed with MEGA 7 software using the

maximum likelihood method (Kumar et al. 2016). A bootstrap of 1000 replicates has been

used to assess the support of each group in the tree.

2.5 Results

Silencing of SlCCD1 and TomloxC in Tomato

In order to assess if TomloxC is involved in apocarotenoid synthesis, transgenic

lines developed for SlCCD1b (lines 9528_CCD1 and 9530_CCD1) and TomloxC (line

0966_LoxC) gene silencing were employed (Simkin et al. 2004, Shen et al. 2014). Volatile

analysis was performed on ripe fruits harvested from the wild-type control line M82, the

transgenic lines, as well as two hybrid stacked lines CCD1+LoxC 1 (9528_CCD1 x

0966_LoxC) and CCD1+LoxC 2 (9530_CCD1 x 0966_LoxC). Since SlCCD1b is more

expressed than SlCCD1a in fruits, the transgenic construction was developed to suppress

SlCCD1b expression. However, due to high sequence homology between SlCCD1a and

SlCCD1b, the transgenic construction also resulted in SlCCD1a expression reduction. In

the line 9528_CCD1, the expression of SlCCD1a and SlCCD1b is respectively 69% and

95% lower than the control line M82 while in the line 9530_CCD1 the expression of the

two isoforms is respectively 49% and 93% lower (Fig. 2.1A-B). In the line 9530_CCD1,

TomloxC expression is similar to the parental line M82 whereas in the line 9528_CCD1,

the gene is 2 times more expressed than in M82 (Fig. 2.1C). Contrary to expected results,

there was no reduction of apocarotenoid volatile emission in the lines 9528_CCD1 and

9530_CCD1. The line 9530_CCD1 indeed accumulates as much MHO and

geranylacetone as the control line M82 while the line 9528_CCD1 emits 2 times more

31

MHO and geranylacetone than M82 (Fig. 2.2). In comparison with the control line M82, the

TomloxC transgenic line shows a 97% reduction of TomloxC expression,

32

Figure 2.1. Expression of SlCCD1 and TomloxC in the transgenic lines. SlCCD1a (A), SlCCD1b (B) and TomloxC (C) transcript levels in ripe

fruits of the control line M82 and the transgenic lines for SlCCD1 (9528_CCD1, 9530_CCD1) and TomloxC (0966_LoxC) (n=4). The crosses

between the two constructs are identified as follows: CCD1+LoxC 1 (9528_CCD1 x 0966_LoxC) and CCD1+LoxC 2 (9530_CCD1 x 0966_LoxC)

(n=6). Significant differences between the different lines are indicated with letters (±SE, p<0.05).

33

while the expression of SlCCD1a and SlCCD1b remains unchanged (Fig. 2.1A-B-C). The

hybrid lines SlCCD1+LoxC 1 and SlCCD1+LoxC that possess the transgenic constructions

for SlCCD1 and TomloxC shows a significantly expression level reduction for all the

targeted genes (Fig. 2.1A-B-C). In the lines 0966_LoxC, CCD1+LoxC 1 and CCD1+LoxC

2, reduction of LoxC expression led to a significant decrease of fatty acid-derived volatiles

emission. The C6 volatiles (cis-3-hexenal, hexanal, trans-2-hexenal, cis-3-hexen-1-ol, and

hexyl alcohol) show the most important reduction with a decrease of more than 98% in the

three transgenic lines. The 70% emission decrease of C5 volatiles (ethyl vinyl ketone, and

1-penten-3-ol) is less severe but nevertheless significant (Supplementary Figure 2.1).

For the apocarotenoid volatiles, the LoxC transgenic line shows a decrease of 55% of 6-

methyl-5-hepten-2-one and 80% of geranylacetone in comparison to the control line M82

(Fig. 2.2). The hybrid lines CCD1+LoxC 1 and CCD1+LoxC 2 have also a reduction in

apocarotenoid volatiles in opposition to the parental CCD1 lines (Fig. 2.2). However, no

additional decrease of apocarotenoid volatiles was detected by stacking the two constructs

(Fig. 2.2). Since the same decrease is observed in the TomloxC transgenic line than in the

hybrid lines, the reduction of the lipoxygenase expression is the only one responsible for

the phenotype.

Figure 2.2. Apocarotenoid volatiles emission from the fruit of the transgenic lines. Emission

of the apocarotenoid volatiles 6-methyl-5-hepten-2-one (A) and geranylacetone (B) in the ripe fruits

of the control line M82, the transgenic lines for SlCCD1 (9528_CCD1, 9530_CCD1), TomloxC

(0966_LoxC), and the crosses CCD1+LoxC 1 (9528_CCD1 x 0966_LoxC, n=6) and CCD1+LoxC 2

(9530_CCD1 x 0966_LoxC) (±SE, p<0.05).

34

Apocarotenoid volatiles emission in Viola flowers

Unlike tomatoes that accumulate large quantities of carotenoids and release

relatively low levels of apocarotenoids, V. odorata flowers emit a strong scent

characteristic of ionones while showing no visible sign of carotenoid accumulation. V.

odorata was thus chosen as a model to investigate apocarotenoid production. One of its

related species, Viola septentrionalis, which presents the same petal coloration but doesn’t

possess the V. odorata characteristic smell, was selected as a negative control to compare

the impact of genes expression on the apocarotenoid pathway. Volatiles emission and

gene expression comparison of V. odorata and V. septentrionalis were performed to get

new insights on CCDs and lipoxygenases roles in the apocarotenoid pathway, and to find

which genes are necessary to produce high amounts of apocarotenoids.

The volatile analysis showed that V. odorata flowers emits large quantities of α-

ionone and β-ionone. Other forms of ionones like dihydro-β-ionone, 7,8-dihydro-α-ionone

and pseudoionone were also detected in small quantities. V. odorata flowers also release

small amounts of the apocarotenoids geranylacetone (0,528 ng/30 flowers/h) and MHO

(Table 2.1).

Table 2.1. Apocarotenoid volatiles emission of V. odorata and V. septentrionalis flowers

(±SE, n=4). Volatile emission is expressed in nanogram per 30 flowers per hour (ng/30 flowers/h).

Significant differences between the different lines are indicated with

letters (p<0.05).

Although apocarotenoids are the major volatiles emitted by V. odorata flowers, low levels

of fatty acid-derived volatile compounds like hexanal, cis-3-hexanal, trans-2-hexenal, cis-3-

hexen-1-ol and hexyl alcohol were also detected (Supplementary Figure 2.2). Ionones

were detected in V. septentrionalis but at a much lower level. V. odorata produces 4034

times more α-ionone,1611 times more β-ionone, and 194 times more dihydro-β-ionone

Apocarotenoids V. odorata

(ng/30 flowers/h)

V. septentrionalis

(ng/30 flowers/h)

Fold Change

α-ionone 84,710 ±6,738a 0,021 ±0,002b 4033.8

β-ionone 88,620 ±8,575a 0,055 ±0,006b 1611.3

dihydro-β-ionone 4,466 ±0,408 a 0,023 ±0,003 b 194.2

7,8-dihydro-α-ionone 0,374 ±0,068 - -

pseudoionone 0,149 ±0,024 - -

geranylacetone 0,528 ±0,086a 0,049 ±0,006b 11.8

6-Methyl-5-hepten-2-one 0,184 ±0,018a 0,091 ±0,008b 2.0

35

than V. septentrionalis. Pseudoionone and 7,8-dihydro-α-ionone were not detected in V.

septentrionalis. Differences were less important for MHO and geranylacetone that are

respectively 2 and 12 times more emitted in V. odorata (Table 2.1). V. septentrionalis

petals also emit fatty acid-derived volatiles. While hexanal, cis-3-hexenal and trans-2-

hexenal are respectively 7, 11 and 3 times more abundant in V. odorata than in V.

septentrionalis, there is no difference between the two species for cis-3-hexen-1-ol and

hexyl alcohol (Supplementary Figure 2.2).

Sequencing and transcriptome assembly of V. odorata and V. septentrionalis

Three cDNA libraries of V. odorata and V. septentrionalis petals were sequenced.

A total of 122,875,567 and 142,745,170 raw reads were generated for V. odorata and V.

septentrionalis respectively. The reads were cleaned to remove residual Illumina adapters,

and filtered to keep only reads with a Phred quality score higher than 20. After this

cleaning step, a total of 120,897,218 (98%) and 140,918,049 (99%) high quality reads for

V. odorata and V. septentrionalis were respectively kept for transcriptomes de novo

assembly (Table 2.2). The Trinity program was used to assemble one transcriptome for

each Viola species, using the combined high-quality reads of their three replicates.

In the case of V. odorata, it generated 66,819 contigs with a minimal size of 400bp,

an average size of 1399bp and an N50 of 1892bp. After sequence clustering, a total of

35,507 genes were obtained and kept for further analysis. For V. septentrionalis, 107,792

contigs, with a minimal size of 400bp, an average size of 1173pb and an N50 of 1516bp

were generated. The clustering step retained 49,474 genes. V. septentrionalis

transcriptome seemed to have been more difficult to assemble as suggested by quality

indicators. The fact that V. septentrionalis contigs and N50 sizes were smaller than for V.

odorata assembly could explain why its transcriptome assembly contains more contigs

than V. odorata’s assembly. Quality of both transcriptomes was however adequate to

perform further analyses. Assembly contigs of the two transcriptomes were then searched

against the UniProtKB/SwissProt database and functionally annotated following the

Trinotate pipeline. A total of 18,312 and 23,227 genes were successfully annotated for V.

odorata and V. septentrionalis transcriptomes respectively (Table 2.3). Then, orthologous

genes between V. odorata and V. septentrionalis were identified with Transcriptologs

program in order to process the gene differential expression analysis.

36

Table 2.2. Statistics of V. odorata and V. septentrionalis sequencing data

Table 2.3. Statistics of de novo transcriptome assembly quality for V. odorata and V. septentrionalis

V. odorata V. septentrionalis

Contigs number 66,819 107,792

Contigs average length (bp) 1,399 1,173

Contigs N50 (bp) 1,892 1,516

Genes number 35,507 49,474

Genes annotated 18,312 23,227

Differential gene expression analysis between V. odorata and V. septentrionalis

Five out of the ten most significantly differentially expressed genes between petals

of the two viola species are in the carotenoid pathway. More precisely the genes 1-deoxy-

D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS), phytoene synthase (PSY), ζ-carotene

desaturase (ZDS), carotenoid cleavage dioxygenase 4 (CCD4b) and a gene we identified

as a CCD1-like were all more expressed in V. odorata. All the genes of the methylerythritol

4-phosphate (MEP) pathway, which leads to the production of geranyl geranyl

diphosphate, the precursor of all carotenoids, are significantly more expressed (p<0,01) in

V. odorata, than in V. septentrionalis (Table 2.4). The expression difference for the first

gene of the pathway, DXS, is especially important with a 1161 fold change. In the same

way, all the genes belonging directly to the carotenoid production pathway have higher

expression levels in V. odorata petals (Table 2.5). One isoform of PSY, a key gene that

catalyze the condensation of two molecules of geranyl geranyl diphosphate, is about 150

times more expressed in V. odorata. Other genes of the pathway follow a similar increase,

notably ZDS with a ~50 fold change increase and lycopene-ε-cyclase (LCYE) with a ~2000

fold increase (Table 2.5). The latter is responsible for the isomerization of lycopene to δ-

carotene, the precursor of alpha-ionone (Fantini et al. 2013).

Species Samples Raw reads Clean reads

V. odorata

1 37,681,007 36,956,020

2 41,600,841 40,975,840

3 43,593,719 42,965,358

V. septentrionalis

1 51,173,130 50,471,986

2 53,453,077 52,812,764

3 38,108,963 37,633,299

37

Three isoforms of CCD4 were identified in V. odorata, and were named CCD4a,

CCD4b and CCD4c. For each of them, an orthologous gene in V. septentrionalis was

found. Orthologous proteins share a sequence homology of 97,01% (CCD4a), 84,59%

(CCD4b) and 90,91% (CCD4c) respectively (Supplementary Table 2.1). CCD4b is the

most expressed isoforms in the petals of both species and it is also the isoform with the

biggest expression difference (Table 2.6). CCD4b is 33 times more expressed in V.

odorata than in V. septentrionalis. CCD4a and CCD4c are respectively 4 and 3 times more

expressed in V. odorata. All these isoforms of CCD4 possess a plastid target peptide like

the CCD4 characterized in other species. One isoform of CCD1 was identified in V.

odorata and V. septentrionalis and the protein was highly homolog between both species

(Supplementary Table 2.1). As for the CCD1 in other species, no transit peptide was

detected and the localization is predicted to be in the cytosol. CCD1 is more expressed in

V. odorata but with a 1.7 fold change, the difference is not as pronounced as for the other

CCDs (Table 2.6).

Beside CCD1 and CCD4, another CCD-family gene was highly expressed in V.

odorata. The gene belongs to a new group of CCD genes closer to the CCD1 group but

that have never been fully characterized before, maybe in part because they are not found

in several species like A. thaliana. Because of their homology to CCD1, they are call here

CCD1-like but should likely be renamed based on their specificity. The protein VoCCD1-

like is only 26% homolog to VoCCD1 (Supplementary Table 2.1). A CCD1-like was also

identified in V. septentrionalis with a sequence homology of 96% with VoCCD1-like

(Supplementary Table 2.1). The nucleotide sequence of VoCCD1-like contains 2487bp,

including a 5’UTR of 204bp and a 3’UTR of 501bp. The complete ORF contains 1789bp

that codes for 594 amino acids. The first 15 amino acids are predicted to code for a plastid

transit peptide (prediction score = 0.769). This would indicate that VoCCD1-like is located

in the chloroplast in opposition to VoCCD1 that is located in the cytosol, like all the other

CCD1s. It should be noted that several related species like Populus trichocarpa, Jatropha

curcas, Hevea brasiliensis and Manihot esculenta have CCD1-like with a predicted transit

peptide. A phylogenetic tree was built using sequences of Solanum lycopersicum,

Arabidopsis thaliana, Osmanthus fragans, Chrysanthemum x morifolium, Rosa x

damascena and Crocus sativa to characterize the viola CCDs (Supplementary Table

2.2).

38

Table 2.4. Differential analysis expression of genes of the MEP pathway between V. odorata and V. septentrionalis.

Table 2.5. Differential analysis expression of genes of the carotenoid pathway between V. odorata and V. septentrionalis.

Gene expression

(TPM)

Genes V. odorata V. septentrionalis Fold Change

1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase 4699.741 ±128.171 4.046 ±0.611 1161.6

1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase 311.538 ±9.005 71.254 ±1.353 4.4

2-C-methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidyltransferase 69.478 ±1.668 15.191 ±0.669 4.6

4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase 99.382 ±5.672 29.786 ±1.193 3.3

2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase 197.016 ±1.777 59.532 ±1.321 3.3

4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase 932.100 ±10.121 201.702 ±9.655 4.6

4-hydroxy-3-methylbut-2-enyl diphosphate reductase 154.674 ±37.008 403.177 ±26.861 3.8

Geranylgeranyl pyrophosphate synthase 573.674 ±20.028 236.989 ±13.667 2.4

Gene expression

(TPM)

Genes V. odorata V. septentrionalis Fold Change

Phytoene synthase 1 1584.865 ±24.520 10.781 ±0.175 147.0

Phytoene synthase 2 166.619 ±4.620 21.596 ±0.540 7.7

Phytoene desaturase 1486.667 ±69.736 293.79 ±15.867 5.1

ζ-carotene isomerase 677.738 ±21.468 33.292 ±1.204 20.4

ζ-carotene desaturase 2477.324 ±38.123 46.635 ±1.822 53.1

Carotenoid isomerase 1 20.143 ±0.992 14.529 ±0.438 1.4

Carotenoid isomerase 2 471.745 ±21.403 72.869 ±4.167 6.5

Lycopene β-cyclase 18.230 ±1.588 1.004 ±0.593 18.2

Lycopene ε-cyclase 5987.658 ±159.450 3.144 ±0.781 1904.5

39

Table 2.6. Differential analysis expression of genes suspected to be involved in apocarotenoid synthesis between V. odorata and V.

septentrionalis.

Gene expression

(TPM)

Genes V. odorata V. septentrionalis Fold Change

CCD4a 615.579 ±33.729 143.278 ± 9.490 4.3

CCD4b 9865.147 ± 370.651 302.898 ±18.059 32.6

CCD4c 140.134 ± 5.941 47.944 ± 6.049 2.9

CCD1 303.540 ± 0.855 177.142 ± 5.658 1.7

CCD1-like 5760.006 ± 244.610 72.748 ± 2.186 79.2

13S-lipoxygenase 2 92.135 ± 13.700 2.453 ± 0.252 37.6

13S-lipoxygenase 1 225.616 ± 9.208 1.825 ± 0.039 123.6

40

As expected, the CCDs clustered according to the usual classification (CCD1, CCD4,

CCD7 and CCD8). The Viola CCD1-like clustered near the CCD1 group with a CCD1-like

from tomato (Fig. 2.3). Of all CCDs identified in V. odorata and V. septentrionalis, it is the

CCD1-like that shows the most significant difference between the two species. Its

expression is 80 times more important in V. odorata than in V. septentrionalis (Table 2.6).

Figure 2.3. Phylogenetic analysis of the viola Carotenoid Cleavage Dioxygenases. The tree

was constructed using the maximum likelihood method. A bootstrap of 1000 replicates has been

used to assess the support of each group in the tree. The number next to the branches represents

the percentage of trees in which the associated taxa are clustered together. At (Arabidopsis

thaliana), Cm (Chrysanthemum x morifolium), Cs (Crocus sativus), Of (Osmanthus fragans), Rd

(Rosa x damascena), Sl (Solanum lycopersicum), Vo (Viola odorata) and Vs (Viola septentrionalis).

SlCCD4a

SlCCD4b

OfCCD4

CmCCD4a

CmCCD4b

RdCCD4

AtCCD4

VoCCD4a

VsCCD4a

VoCCD4b

VsCCD4b

VoCCD4c

VsCCD4c

CsCCD4a

CsCCD4b

VoCCD1-like

VsCCD1-like

SlCCD-like

AtCCD1

SlCCD1a

SlCCD1b

VoCCD1

VsCCD1

CsCCD1

OfCCD1

RdCCD1

SlCCD7

AtCCD7

SlCCD8

AtCCD8

100

100

100

100

100

100

40

27

71

52

100

40

79

59

99

88

99

100

99

99

97

98

85

62

38

20

17

0.20

41

The amino acid sequences used for the phylogenetic tree construction are available in

Supplementary Table 2.2.

The differential gene analysis also pointed out the fact that two plastid-localized

13S-lipoxygenase genes were more expressed in V. odorata than in V. septentrionalis.

They were named LOX1 and LOX2. VoLOX1 is closer to TomloxC (64,20%) while

VoLOX2 is closer to TomLoxD (70,46%) (Supplementary Table 2.3, Supplementary

Figure 2.3). LOX1 and LOX2 are significantly more expressed in V. odorata than V.

septentrionalis, with a respective fold change of 38 and 124 (Table 2.6).

2.6 Discussion and Conclusion

The nature of carotenoids that accumulate in plant tissues has an important impact

on their apocarotenoid volatile profile. For example, Osmanthus fragans produces orange

flowers because their petals mostly accumulate the orange pigments α-carotene and β-

carotene. They therefore release the apocarotenoids α-ionone and β-ionone that originate

from the cleavage of α-carotene and β-carotene at 9,10 (9’,10’) double bonds (Baldermann

et al. 2010). Watermelons constitute another good example of the impact of carotenoid

content on apocarotenoid production. Red-fleshed melons, which contain high levels of

lycopene, mainly release 6-methyl-5-hepten-2-one. Watermelons that have an orange

flesh due to the accumulation of prolycopene release high levels of geranylacetone and 6-

methyl-5-hepten-2-one while those with an orange coloration that comes from β-carotene

mostly release β-ionone (Tadmor et al. 2005). In mature tomatoes, the genes of the

carotenoid pathway leading to lycopene synthesis are all highly expressed. In contrast, the

lycopene cyclase genes are lowly expressed, which allows the accumulation of high

amounts of lycopene (Supplementary Table 2.4) (Liu et al. 2015, Tomato Genome

Consortium 2012). Like in the red-fleshed melons, tomatoes mostly release the non-cyclic

apocarotenoids MHO and geranylacetone that are respectively produced from the

cleavage of ζ-carotene and lycopene (Simkin et al. 2004, Vogel et al. 2008). In V.

odorata’s petals, the carotenoid production pathway is also very active, but unlike what

can be seen in the tomatoes, the lycopene cyclases are highly expressed, which means

that lycopene doesn’t accumulate and is converted in δ-carotene or β-carotene

respectively. However, expression levels suggest that the β,ε branch of the carotenoid

pathway is preferred to the β,β branch (Ohmiya 2011) and that the pathway is directed

towards lycopene cyclization in δ-carotene by LCYE. The enzyme LCYB can then perform

δ-carotene cyclization to form α-carotene. This regulation of the pathway that leads to δ-

42

carotene and α-carotene explains why V. odorata’s petals release important amounts of

ionones. α-Ionone can originate from the cleavage of both δ-carotene and α-carotene at

the 9,10 double bonds. The most known precursor of β-ionone is β-carotene (Simkin et al.

2004), but we believe that in V. odorata’s flowers, β-ionone is produced by the cleavage of

the second extremity of α-carotene, at the double bonds 9’,10’. Therefore, like in O.

fragans petals, the important amounts of both α-ionone and β-ionone released are mainly

coming from the cleavage of the same precursor, α-carotene. V. septentrionalis petals

don’t seem to accumulate carotenoids as suggested by the low expression levels of all the

genes of the pathway. This lack of precursors explains the low amounts of ionones that

they release.

Another factor known to have an impact on apocarotenoid release is the presence

of CCDs enzymes responsible for the oxidative cleavage of carotenoids double bonds. In

tomato fruits, SlCCD1 was considered as the best candidate to catalyze these reactions

despite its localization in the cytosol (Supplementary Table 2.5) (Simkin et al. 2004). The

two isoforms SlCCD1a and SlCCD1b were characterized as enzymatically efficient to

cleave specific carotenoid double bonds in vitro, and were also coded by the only CCDs

highly expressed in fruits. (Vogel et al. 2008, Ilg et al. 2014). However, in transgenic plants

in which the expression of SlCCD1b and SlCCD1a was reduced, the expected decrease of

apocarotenoid emission was not observed. One could argue that the residual expression

of SlCCD1a and SlCCD1b would provide enough enzymes to perform the cleavage, but

given the abundance of carotenoids, it is more likely that CCD1 is a non-essential step for

apocarotenoid synthesis in tomatoes. This result is in accordance with transcriptomic

analysis of V. odorata’s petals, in which VoCCD1 was the less expressed of the CCDs

genes identified. Furthermore, CCD1 expression level was only slightly higher in V.

odorata than in the odorless V. septentrionalis. It is therefore unlikely that VoCCD1 play a

significant role in the production of ionones in the petals of V. odorata. These results

suggest that the cytosol localized CCD1s are not key enzymes in the apocarotenoid

volatile synthesis of several fruits and flowers.

One of the CCD4 isoforms, CCD4b, is particularly expressed in V. odorata

compared to V. septentrionalis. Although VsCCD4b and VoCCD4b are orthologous,

sequence homology shared by the two proteins is not as high as for other orthologs

between the two species. This is not unusual in polyploid species as the contribution of

43

ancestral genomes can vary considerably between species (Hodálová et al. 2008, Chen

and Ni 2006, Madlung 2013). Since CCD4 is localized in plastids, it has a more direct

access to its substrates. In V. odorata, the higher expression of CCD4b is combined to a

strong expression of the entire carotenoid pathway, likely promoting an efficient conversion

of a large amount of α-carotene into ionones.

Besides CCD4b, CCD1-like, which codes for a protein that possesses a plastid

transit peptide, is also more expressed in V. odorata than in V. septentrionalis. Sequences

for CCD1-like proteins, all with predicted plastid transit peptides, can be found in several

plant species, but none have been fully characterized. They seem to cluster together, in a

phylogenetic group that is closer to CCD1 that any other CCD-family gene. This could

suggest that CCD1-like shares substrate and cleavage specificity with CCD1. Even if all

CCDs can cleave carotenoids, they have different affinity for carotenoid specific double

bonds. The combined action of CCD1-like and CCD4, with a possible complementary

cleavage capacity, could be at the origin of the efficient cleavage of carotenoids in V.

odorata. Future work will be needed to characterize the distinct affinity of VoCCD4 and

VoCCD1-like for carotenoids and to better understand their distinct functions in V.

odorata’s flowers.

While V. odorata express plastidial CCDs with an easy access to carotenoids, only

the cytosolic CCDs are highly expressed in the tomato fruits. Since SlCCD1 doesn’t seem

to be essential to apocarotenoid synthesis, another enzyme has to perform this role in

tomato fruits. Our results showed that instead of SlCCD1, the lipoxygenase TomloxC

should be considered as a key enzyme of the pathway. In the transgenic lines in which

TomloxC expression has been blocked, a significant decrease in MHO and

geranylacetone emission was observed. This means that TomloxC is not only involved in

the apocarotenoid production pathway, but is also more critical than SlCCD1. The random

co-oxidative cleavage event of carotenoids led by lipoxygenases and their peroxyl radical

products that have been previously observed in vitro and in wheat flour could also happen

in fruits and flowers (Leenhardt and al. 2006, Wu et al. 1999b, Chedea and Jisaka 2013).

By performing carotenoid co-oxidation, TomloxC could be performing the first step in the

synthesis of volatile apocarotenoids. This lipoxygenase carotenoid pre-cleavage step is in

accordance with the fact that CCD1 shows more cleavage affinity for C27 carotenoids like

for example 10’-apo-β-carotenal than for the C40 original carotenoid β-carotene (Floss and

44

Walter 2009). Carotenoids randomly cleaved by TomloxC co-oxidation, smaller than the

C40 original carotenoids, could be in a chemical configuration that allows them to cross

chromoplasts membranes and find CCD1 in the cytosol. Volatile compounds are indeed

known to be able to go through plasma membranes of epidermal cells without needing

tissues to be wounded in order to diffuse in the air and be scent (Baldwin 2010). These

randomly cleaved carotenoids could also be moved to the cytosol by specific transporters.

ATP-binding cassette (ABC) transporters have indeed been found to play a major role in

the transport of the apocarotenoid phytohormones strigolactones and ABA (Kretzschmar

et al. 2012, Borghi et al. 2015). The carotenoids that have been oxidized under TomloxC

action may be in a new configuration that provides them affinity for specific transporters.

Another explanation could be that in tomato fruits, carotenoid co-oxidation by peroxyl

radicals is enough to produce volatile apocarotenoids and that no further cleavage by

CCDs is necessary. In V. odorata’s petals, two plastid-localized gene that encode for 13-

lipoxygenases and share high sequence homology with TomloxC and TomloxD are very

expressed in comparison with V. septentrionalis. This differential expression could explain

why V. odorata’s petals produce more C6 aldehyde volatile compounds than V.

septentrionalis. However, the amounts of fatty acid-derived compound are not high in

petals, even in V. odorata, which means that 13-lipoxygenases could play other roles in

Violas flowers. This supports our hypothesis whereby 13-lipoxygenases are also involved

in apocarotenoid formation by random cleavage of carotenoids. In V. odorata, the role of

plastid 13-lipoxygenases in ionone synthesis cannot, however, be evaluated with certitude

since plastid localized CCDs are able to easily access the carotenoids. It is possible that

the lipoxygenase action further increase the speed or efficiency of the carotenoids

cleavage by the CCDs.

The results of this study demonstrate that cytosolic CCDs are not key enzymes in

the apocarotenoid volatiles pathway of tomatoes and violas, and most likely in other fruits

and flowers. Even if carotenoid accumulation in plastids has an important impact on the

nature of apocarotenoids that are produced, presence of enzymes that are able to access

their substrates to cleave them is necessary. Those enzymes can be CCDs that are

located in plastids, like VoCCD4 and VoCCD1-like in V. odorata. They can also be

lipoxygenases, as demonstrated with tomatoes, either by providing substrates to CCDs or

by releasing apocarotenoids in an independent way.

45

2.7 References

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50

Chapitre 3 : Structural variations in the phytoene

synthase 1 gene affect carotenoid accumulation in

tomato fruits and result in bicolor and yellow

phenotypes

Bulot, B., Isabelle, S., and Goulet, C.

Département de Phytologie, Faculté des Sciences de l’Agriculture et de l’Alimentation,

Université Laval. Pavillon Envirotron, 2480 boulevard Hochelaga, Québec QC, G1V0A6,

Canada

3. 1. Résumé

Les caroténoïdes sont des pigments qui peuvent s’accumuler dans les plastes des

fleurs et des fruits et ainsi contribuer à leur couleur caractéristique. Le lycopène est par

exemple le caroténoïde responsable de la couleur rouge des tomates. Cependant,

certains cultivars, appelés « bicolores », accumulent le lycopène de façon localisée et ne

deviennent jamais totalement rouges. Nous démontrons dans cette étude que le gène de

la phytoène synthase 1 (PSY1), premier gène du sentier de production des caroténoïdes,

est responsable de ce patron de coloration. Solanum habrochaites est une espèce

sauvage apparentée à la tomate qui produit des fruits verts. Nous avons déterminé, pour

la lignée LA3923, que l’introgression du génome de S. habrochaites au niveau du locus

contenant PSY1 est responsable d’une baisse de l’expression de PSY1 et donc du

phénotype bicolore des fruits. Dans le cas des cultivars bicolores de S. lycopersicum, le

phénotype des fruits est causé une délétion de 3787 pb en amont du gène PSY1. Cette

délétion élimine une partie de la région 5’UTR du gène, ce qui affecte vraisemblablement

l’efficacité de sa traduction et empêche la production de caroténoïdes de façon normale.

Nous avons pu également déterminer que la mutation ry, située à l’extrémité 3’ du gène

PSY1, est le résultat d’un réarrangement chromosomique complexe entre le dernier exon

du gène PSY1 et le début du gène retrouvé en aval. Les fruits jaunes portant cette

mutation, au contraire des cultivars jaunes caractérisés par l’insertion d’un LTR du

rétrotransposon Rider au niveau de l’exon 1 de PSY1 (mutation r), peuvent dans certaines

conditions accumuler du lycopène, bien qu’en très faible quantité par rapport aux cultivars

bicolores. Ces informations témoignent de l’importance du gène PSY1 dans le sentier de

51

production des caroténoïdes, et de la façon dont différentes variations structurelles dans

ses séquences promotrices et codantes peuvent affecter la couleur des fruits.

3.2 Abstract

Carotenoids are pigments that can accumulate in flowers and fruits plastids to

contribute to their characteristic colors. For example, lycopene is the carotenoid that gives

tomatoes their red color. Some tomato cultivars however present a particular phenotype

called « bicolor ». They produce yellow tomatoes with red sections, especially at the

blossom-end of the fruit. In this study, we show that phytoene synthase 1 gene (PSY1),

the first gene of carotenoid production pathway is responsible for bicolor phenotype.

Solanum habrochaites is a tomato wild related species that produces green fruits. In the

line LA3923, the introgression of S. habrochaites genome at PSY1 locus is responsible for

the down-regulation of the gene, and thus the bicolor phenotype of the fruits. In S.

lycopersicum bicolor cultivars, a 3787 bp deletion in PSY1 promoter causes the same

coloration pattern. Since the deletion contains a part of the 5’UTR region of PSY1,

translation efficiency is likely decreased. Furthermore, we identified that PSY1 ry mutation

is caused by a genomic rearrangement between PSY1 last exon and the first exons of the

downstream gene. Since in yellow ry tomatoes the mutation happens at the end of the

gene, fruits are still able in certain conditions to accumulate lycopene, though to a lesser

extent than in bicolor cultivars. In contrast, yellow fruits with the r mutation, which consists

of the insertion in PSY1 exon 1 of one LTR of the Rider transposon, have a totally non-

functional protein. These results attest of PSY1 importance in carotenoid production

pathway, and the way different structural variations in the promoter or coding sequences of

the gene can affect fruits colors.

3.3 Introduction

Carotenoids, a very diversified and important group of pigments in life, are naturally

synthesized by plants, algae, fungi and bacteria (Bartley et al. 1994). Carotenoids can be

found in chloroplasts, where they play a role in photoprotection and light harvesting for

photosynthesis (Young 1991, Horton and Ruban 2004). Carotenoids also accumulate in

52

chromoplasts, in specialized structures like plastoglobules, crystals, tubules, and inner

membrane, where they are responsible of the color, from yellow to red that can be

displayed by flowers and fruits (Klee and Giovannoni 2011, Ljubesić et al. 1991). These

bright colors help plants to attract pollinators or frugivorous animals for seed dissemination

(Dicke and Baldwin 2010). Tomatoes are known to accumulate important quantities of

carotenoids in their chromoplasts and more specifically lycopene which confers to the

fruits their red color (Li and Yuan 2013).

Carotenoids can also be the precursors of important molecules like phytohormones

ABA and strigolactones, as well as several volatile compounds involved in many fruits

aroma (North et al. 2007, López-Ráez et al. 2008, Ohmiya 2009). These molecules are

called apocarotenoids because they are formed by the oxidative cleavage of carotenoids.

In plants, CCDs enzymes (Carotenoid Cleavage Dioxygenase) are known to catalyze this

oxidative cleavage. For example, CCDs can use lycopene as a substrate to produce the

volatile 6-methyl-5-hepten-2-one (MHO) with a citrus-like aroma. The same enzymes can

cleave ζ-carotene to form geranylacetone, a volatile with a fruity and fresh aroma.

Apocarotenoid volatiles are known to have a positive impact on tomato flavor and increase

the sweetness perception (Vogel et al. 2010, Tieman et al. 2012, Bartoshuk and Klee

2013). In addition to the apocarotenoids, about 30 volatile compounds derived from fatty

acids and amino acids are thought to be essential to the distinct flavour of tomatoes

(Ohmiya 2009, Ilg et al. 2014).

The significant color change of tomatoes during ripening, as well as the availability

of a large population of colored mutants make the species particularly valuable for

researches on the carotenoid production pathway, which has been extensively studied.

Carotenoid synthesis starts with the condensation of two molecules of geranyl geranyl

diphosphate by the enzyme phytoene synthase (PSY). This reaction generates the first

carotenoid, 15-cis-phytoene which is also colorless (Bartley et al. 1992). In tomatoes, three

isoforms of phytoene synthase have been identified with different spatio-temporal

expression patterns. The isoform PSY1 is expressed in the ripening fruits, while PSY2 and

PSY3 are respectively present in leaves and roots (Giorio et al. 2008). This phytoene

synthase reaction is considered as one of most important regulatory step of the carotenoid

pathway (Fraser et al. 2007). The carotenoid 15-cis-phytoene is then modified by a

phytoene desaturase (PDS), yielding successively 15-9’-di-cis-phytofluene and 9,15,9’-tri-

53

cis-ζ-carotene (Pecker et al. 1992). Subsequently, the ζ-carotene isomerase enzyme

(ZISO) converts 9,15,9’-tri-cis-ζ-carotene in 9,9’-di-cis-ζ-carotene, which goes through two

other desaturation reactions, managed by a ζ-carotene desaturase (ZDS) (Hirschberg

2001, Bouvier et al. 2005). The resulting molecule, 7,9,7,9’-tetra-cis-lycopene

(prolycopene), has its configuration transformed from cis to trans by a carotenoid

isomerase (CRTISO) in order to generate the carotenoid all-trans-lycopene, also called

lycopene (Isaacson et al. 2002). At this point, the pathway can take two directions

depending of the type of rings formed. The lycopene-β-cyclase (LYCB) catalyses one or

two cyclisation to yield γ-carotene and β-carotene respectively. Alternatively, the lycopene

can modified by the lycopene-ε-cyclase (LYCE) to produce δ-carotene, who can then

become α-carotene by the subsequent addition of one β-ring by the lycopene-β-cyclase

(Fantini et al. 2013).

A few tomato cultivars produce bicolored fruits that are mostly yellow at maturity

but with contrasted red flesh sections. In some cultivars, these red zones are limited to the

blossom end of the fruit and only appear occasionally, while other cultivars show a more

consistent coloration with red streaks that can be observed in every fruits. MacArthur and

Young described the first group as yellow tomatoes showing pink colors in hot summer

weather (Young and MacArthur 1947). This type of coloration was suggested to be linked

to the same locus as the yellow fruits (locus r) and the locus was named ry (Young 1956).

Phytoene synthase 1 (PSY1) was later on identified as the gene responsible for the yellow

phenotype, and the color originates from the absence of carotenoid synthesis during the

ripening of the fruit (Fray and Grierson 1993). The PSY1 loss of function causes a

reduction of more than 99% of lycopene content in fruit, that passes from 107,5 mg.g FW-1

in red fruits to 0,7 mg.g FW-1 in yellow fruits (Rêgo et al. 1999). The r mutant was

described has having a shorter transcript and the ry mutant was lacking the last 25 amino

acids that were replaced by an unrelated sequence of 23 amino acids (Fray and Grierson

1993). In contrast to the ry locus that was well studied, little is known about the second

group of bicolor tomatoes with a stronger phenotype. In this study, we investigate further

the genetic basis for bicolored fruits in tomato using heirlooms cultivars and introgression

lines derived the wild related species S. habrochaites.

54

3.4 Materials and Methods

Growth of plant materials

All tomato introgression lines and cultivars were grown in University Laval, Québec.

Tomato seeds were first planted in greenhouse for germination. Plants selected were then

grown in greenhouse or in the field until they produced ripe fruits. The bicolor introgression

line 3923 is derived from a cross between S. lycopersicum (cultivar E6203, accession

LA4024) and S. habrochaites (LA1777) (Monforte and Tanksley 2000). A new

introgression population was then developed between S. lycopersicum (cultivar E6203,

accession 4024) and LA3923. The two parents and the F1 generation were grown in the

field (summer 2014). The F2 and F3 generations of this new introgression population were

respectively grown in greenhouse (autumn 2015) and in the field (summer 2016). F1 and

F2 generations of LA3923 previously selected for possessing a fragment of S.

habrochaites (LA1777) genome at the top of chromosome 3 (3923-locus 3 and 3923-locus

3a lines) or at the bottom of chromosome 2 (3923-locus 2 line) were respectively grown in

greenhouse (winter 2016) and in the field (summer 2017). Plants in greenhouse were

grown in an entirely random design. In the field, plants were placed following randomized

replicated plots with three plots of three to five plants. The S. lycopersicum parent (4024)

was present in all designs as a control. Bicolor cultivars (Granada, Grapefruit, Isis Candy,

Mom’s, Mortgage Lifter bicolor, Mr. Stripey and Striped German), red cultivars (Ailsa Craig,

Ballada, Gigantesque, Gregori’s Altai, Homer’s German Oxheart, Mexico Midget, Pruden’s

Purple, Vendor and LA4024) and yellow cultivars (Barry Crazy Cherry, Butter Apple,

Gallina’s Yellow, Gold Currant, Lemon Drop, Mirabelle, Poma Amoris Minora Lutea and

Téton de Vénus jaune) were grown in the field over 3 summers (2015-2017) in randomized

replicated plots of two plots of five plants. The F2 population derived from the cross

between Granada (bicolor) and Azoychka (yellow ry) was grown in greenhouse (winter

2017).

Volatile compounds analysis

Ripe fruits of LA4024, 3923-locus 3a and 3923-locus 2 lines were harvested,

pooled and chopped before 100g were placed in glass tubes as described by Schmelz et

al. 2003. During 1 hour, hydrocarbon filtered air (Agilent, www.agilent.com) arrived at one

extremity of the tube, carried volatiles released by tomatoes and led them to be trapped by

55

a divinylbenzene resin column (HayeSep Q) placed at the other extremity of the tube.

Volatiles trapped on the HayeSep Q column were eluted by a solution composed of

methylene chloride and the internal standard nonyl acetate. Volatile samples were then

analyzed by a gas chromatograph (Agilent 6890) with a DB-5MS UI column (30m,

0.250nm diam., Agilent, www.agilent.com). Each volatile compound (Agilent,

www.agilent.com) was identified by known standards and using a gas chromatograph

coupled to a mass spectrometer (GC-MS, Agilent 5977B) (Agilent, www.agilent.com). For

each volatile compound, one-way ANOVA followed by Tukey tests were performed in

order to assess which lines or cultivars were significantly different from the others. When

necessary, statistical analyses were carried out on log10 transformed data to correct for

variance homogeneity.

Genetic markers design

InDel and HRM markers were designed by comparing the genome sequences of S.

lycopersicum (version SL3.0 of the Heinz genome assembly (Fernandez-Pozo et al.

2015)), and S. habrochaites (cv. LYC4) (SAMEA3138934, Tomato Genome Consortium

2012). Homologous sequences were aligned with MAFFT program (Katoh and Standley

2013) to find an insertion or a deletion (InDel marker), or a SNP (HRM marker) . The

mutation had to be flanked by conserved sequences between the two species to insure

proper amplification by PCR. The primers were designed with Primer3 (Rozen and

Skaletsky 2000). The sequences of the primers are available on Supplementary Table

3.10. For the F2 population derived from Granada x Azoychka crosses, the A to G

substitution mutation presents in PSY1 intron 4 of r yellow cultivars was used to predict the

F2 segregation ratio with genetic markers (Supplementary Figure 3.11, Supplementary

Table 3.10).

Quantitative PCR

Ripe fruits of LA4024, 3923-locus 3a and 3923-locus 2 lines were frozen in liquid

nitrogen and store at -80°C. Total RNA was extracted following the EZ-10 Spin Column

Plant RNA Miniprep Kit protocol (Biobasic, www.biobasic.com). Possible genomic DNA

contamination was removed by DNAse treatment step (Qiagen, www.qiagen.com) before

purifying total RNA with a second run of the EZ-10 Spin Column Plant RNA Miniprep Kit

protocol. Quantification of total RNA was evaluated on NanoDrop (ThermoFisher,

www.thermofisher.com). Quantitative PCR (qPCR) was executed with the qScript One-

56

Step qRT-PCR Kit (QuantaBio, www.quantabio.com) from 100ng of total RNA. The

primers were designed for the amplification of PSY1 mRNA. In order to be sure to only

amplify mRNA and not genomic DNA, the forward primer was designed to begin at the end

of exon 4 and finish at the beginning of exon 5, while the reverse primer was located at the

beginning of exon 6. The sequences and positions of the primers are available in

Supplementary Figure 3.10. The quantification of PSY1 transcripts was determined with

a standard curve. Expression levels have been compared with Tukey test. Significant

differences are indicated with letters (p<0.05).

Transcriptome sequencing and analysis

Total RNA was extracted from ripe fruits of on ripe fruits of LA4024, 3923-locus 3a,

red, bicolor and yellow cultivars with the same protocol as for qPCR. The RNA-Seq

libraries were prepared following the Zhong et al. 2011 protocol that has been modified

and adapted for paired-end 125 pb RNA-Seq (Supplementary Figure 3.12). The libraries

were sent to McGill University sequencing platform (www.gqinnovationcenter.com) to be

analyzed on a Bioanalyzer (Agilent, www.agilent.com) and sequenced paired-end 125 bp

with HiSeq 4000 Illumina technology (Illumina, www.illumina.com). The quality of the

sequencing data was then evaluated with FastQC program. The bad qualities reads and

Illumina adapters were removed with Trimmomatic (Bolger et al. 2014). The reads were

then aligned to the Solanum lycopersicum reference genome (version SL3.0) available at

Sol Genomics Network (Fernandez-Pozo et al. 2015) with Hisat2 (Kim et al. 2015) and

gene expression (FPKM) was assessed with Stringtie (Pertea et al. 2015). The packages

edgeR (Robinson et al. 2010), DESeq2 (Love et al. 2014) and Limma-voom (Ritchie et al.

2015) from the Bioconductor repertory of R (Bionconductor, www.bioconductor.org) were

then used to perform the differential gene expression analysis. PSY1 expression levels

have been compared with Tukey test. SNPs calling in 4024 and 3923-locus 3a lines was

performed with SAMtools and bcftools (Li et al. 2009), and SNP density was evaluated

with Sniplay (Dereeper et al. 2011). The program regtools was used in order to extract the

splicing variants that can be present in each samples, and visualization was performed

thanks to the IGV software (Robinson et al. 2011). Yellow cultivars PSY1 sequences were

compared with r (X67143.1) and ry (X67144.1) mutant sequences available on NCBI. SRA

data of yellow cultivars from project PRJNA353161 (Tieman et al. 2017) were analyzed to

study the two versions of PSY1 reads in the ry mutation.

57

3.5 Results

Mapping of a QTL for bicolored fruits

Fruits of the tomato related wild species Solanum habrochaites do not accumulate

lycopene and stay green even at maturity (Grumet et al. 1981). This particularity makes

introgression lines derived from S. habrochaites very useful to identify QTL involved in

carotenoid synthesis. All the lines of S. habrochaites introgression populations possess

small regions of S. habrochaites genome in a Solanum lycopersicum background, and a

phenotypic difference between an introgression line and the tomato parent can be

attributed to genes that are located in the wild species introgressed region. In the

introgression population between S. lycopersicum (cultivar E-6203, accession LA4024)

and the related wild species S. habrochaites (accession LA1777) developed by Monforte

and Tanksley (2000), the lines 3922 and 3923 have been characterized to produce bicolor

fruits that accumulate 88% less lycopene than the 4024 red parent. They also are the only

lines that possess one introgression of S. habrochaites genome at the end of the

chromosome 2, and it’s the only introgressed locus that they possess (Monforte and

Tanksley 2000, Mathieu et al. 2009). Since in S. habrochaites fruits, the lycopene

production pathway isn’t active, it has been hypothesized that this specific chromosome 2

locus contains a potential QTL involved in lycopene synthesis in fruits (Mathieu et al.

2008). The line LA3923 possesses a shorter S. habrochaites introgression segment than

the line LA3922 and was selected to reduce furthers the region responsible for the

bicolored phenotype. The heterozygous F1 plants resulting from the cross between

LA4024 and LA3923 produced red tomatoes confirming that the red allele is dominant over

the bicolor allele. New smaller introgression lines between LA4024 and LA3923 bicolor line

were selected using InDel markers. One line showed a phenotype that was incongruous

with the recessive nature of the bicolor alleles and we quickly conclude that the phenotype

was not linked to the introgression on chromosome 2 (Supplementary Table 3.1). The

initial map of the introgression lines was done with a relatively small number of markers for

each chromosome and small-undetected introgressions likely persisted in some of the

lines. Since alleles of PSY1 are responsible for the yellow phenotypes, a high resolution-

melting (HRM) marker was designed in the first exon of PSY1 to detect if LA3923 is having

one of those undetected introgressions on chromosome 3. The genotyping results at the

PSY1 markers showed that plants producing red tomatoes were either homozygous for S.

58

lycopersicum genome or heterozygous, while plants with bicolor fruits were all

homozygous for S. habrochaites genome (Supplementary Table 3.2). These results

suggested that the QTL is linked to PSY1 or located near the gene on chromosome 3.

New introgression lines were selected from the cross between LA4024 and LA3923 to

isolate the introgression on chromosome 2 (LA3923-locus 2) and chromosome 3 (LA3923-

locus 3). The introgression line on chromosome 3 has bicolored fruits while the

introgression line on chromosome 2 has red fruits. The line 3923-locus 3 has a small S.

habrochaites introgression on top of chromosome 3 between 4,006,743 and 8,455,278 bp.

The locus was further reduced by using a smaller introgression (LA3923-locus 3a)

(Supplementary Table 3.3). The RNA sequencing results of the parental line LA4024 and

the line LA3923-locus3a were used to perform a SNP density analysis. Thanks to the high

level of SNPs existing between S. lycopersicum and S. habrochaites, the size of the

lycopene related QTL was reduced to about 690 kbp between position 4,074,672 bp and

4,764,329 bp. Less than 75 genes are present on this locus (Supplementary Table 3.4)

and only PSY1 seems related to the carotenoid pathway. SNP density analysis was also

used to verify if other small-undetected introgression were present on other chromosomes.

No introgression other than the one on chromosome 3 was identified by the analysis.

Apocarotenoid volatiles emission in bicolor fruits

In order to determine the impact of carotenoid accumulation on apocarotenoid

volatiles emission, volatile analysis was performed on ripe fruits from LA4024, 3923-locus

2 and 3923-locus 3a plants. The bicolor line 3923-locus 3a showed a 93% and 98%

decrease in 6-methyl-5-hepten-2-one and geranylacetone respectively compared to the

parental line LA4024 (Fig. 3.1). The red-fruited line 3923-locus 2 shows a smaller but

significant reduction of both volatiles (30% and 39% respectively). It is likely that the locus

on chromosome 2 contains a gene influencing the production of apocarotenoid volatiles.

59

Figure 3.1. Apocarotenoid volatiles emission from fruits of bicolor introgression line.

Emission of the apocarotenoids geranylacetone (A) and 6-methyl-5-hepten-2-one (B) (±SE, n=6).

The parental line LA4024 has red fruits while the introgression line LA3923 derived from S.

habrochaites has bicolor fruits. A subset of lines was developed to isolate each of the wild species

segments from LA3923; 3923 locus 2 have a segment at the bottom of chromosome 2 while 3923

locus 3a have a small fragment at the top of chromosome 3. The segment on chromosome 3 is

responsible for the bicolor phenotype. Yellow and red sections of fruits from 3923-locus 3a plants

have been isolated to be analyzed separately (±SE, n=4). Significant differences between the

different lines are indicated with letters (p<0.05).

60

To determine if there is a difference in the emission of apocarotenoids in the red and

yellow tissues, bicolored fruits of 3923-locus 3a were cut into small red or yellow sections.

Volatiles were extracted from the respective tissues. Red tissues emit significantly more

apocarotenoids than the yellow tissues. More precisely, there was 92% more

geranylacetone and 6-methyl-5-hepten-2-one in the red sections than in the yellow

sections (Fig. 3.1).

Phytoene synthase expression in the bicolor introgression line

PSY1 gene expression was evaluated by quantitative PCR (qPCR) on ripe fruits of

LA4024, 3923-locus 3a and 3923-locus 2. Transcript levels of PSY1 in the red-fruited lines

3923-locus 2 and LA4024 were both high while the bicolor line 3923-locus 3a shows a 49

fold reduction compared to the control (Fig. 3.2).

Figure 3.2. PSY1 gene expression is reduced in the bicolor introgression line. (A)

Representative fruits of the red introgression line 3923-locus 2 and the bicolor introgression line

3923-locus 3. (B) Transcript levels of PSY1 in the parental line 4024 and the introgressed lines

3923-locus 2 and 3923-locus 3a (±SE, n=6). Yellow and red sections of bicolor fruits from 3923-

locus 3a plants have also been isolated to be analyzed separately (±SE, n=4). Significant

differences between the different lines are indicated with letters (p<0.05).

61

The results were confirmed by a transcriptomic analysis (RNASeq) of ripe fruits from the

lines 3923-locus 3a and LA4024. In the bicolor line 3923-locus 3a, the expression level of

PSY1 gene was 68 times lower (FPKM: 30.30) than in the red parental line LA4024

(FPKM: 2060.10) (Supplementary Table 3.5). These results suggest that the low

expression of PSY1 is responsible for a decrease in lycopene accumulation in the bicolor-

fruited introgression line. Yellow and red tissues from the bicolor 3923-locus3 fruits were

also separated to estimate the expression of PSY1 in the different sections of the

tomatoes. The qPCR analysis showed no difference in PSY1 expression between the

different tissues of which suggests that the reduction of PSY1 expression happens in a

global way in the fruits even if there is localized accumulation of lycopene (Fig. 3.2). The

PSY1 protein sequence from S. habrochaites is the same as the one from tomato except

for one substitution at the end of the protein (A438V) (Supplementary Fig. 3.1). However,

in the promoter region, many deletions, insertions and SNPs were detected between the

genome of two species (Supplementary Fig. 3.2). Those modifications are likely

responsible for the change in PSY1 expression observed in the line 3923-locus3a.

Structural variation in bicolor cultivars

A transcriptomic analysis was performed to verify if a reduction in PSY1 expression

is responsible for the bicolor phenotype of some heirloom and modern tomato cultivars

(Fig. 3.3). Ripe fruits harvested from bicolor, red and yellow cultivars were used to prepare

RNA-Seq libraries following a protocol modified from Zhong et al. (2011). In the region

identified with the introgression line, 3 genes were significantly different between the group

of bicolor, and red cultivars; PSY1 (Solyc03g031860), an auxin responsive factor

(Solyc03g031970), and a phosphoenolpyruvate carboxylase (Solyc03g032100)

(Supplementary Table 3.6). Among then, only PSY1 was also less expressed in the

yellow group. PSY1 was 3 times more expressed in the red group than in the bicolor and

yellow groups (Fig. 3.4). Given the variation inside each group, this reduction is unlikely to

explain by itself the clear color distinction between the red group and the bicolor group. In

comparison, PSY1 was 50 times more expressed the control line than in bicolor

introgression line 3923-locus3a.

62

Figure 3.3. Top, bottom and cross section of the bicolor cultivars Striped German (A),

Mortage Lifter bicolor (B) and Grapefruit (C) at ripe stage. Red tissues accumulate near the

epidermis, in the columella, and in the septa.

An analysis of the transcripts was performed to find if variations in the sequence of

PSY1 sequence could play a role in the bicolor phenotype of the cultivars. While the

coding sequence of both alleles is the same, (Supplementary Fig. 3.3) there is a major

difference in the 5’ untranslated region (UTR). In the red cultivars, the 5’UTR of PSY1 is

characterized by several splicing site with a few variants (Fig. 3.5, Supplementary Table

3.7, Supplementary Fig. 3.4). The form that seems the most abundant is about 426 bp

and starts 1605 bp before the start codon. In the bicolor cultivars, there is a major

rearrangement of the 5’UTR region caused by a deletion of 3811 nucleotide that starts

4858 bp before the start codon and finishes in the longest 5’UTR intron (Fig. 3.5,

Supplementary Table 3.8, Supplementary Fig. 3.5). This deletion caused a major shift in

the start of the UTR and results in less splicing in the 5’UTR. The main variant for the

63

5’UTR of the bicolor cultivars is about 2127 bp and share only the last 244 bp with the

5’UTR of the red cultivars.

Figure 3.4. Transcripts level of PSY1 in ripe fruits of red, yellow and bicolor tomato cultivars.

Yellow cultivars were separated in 2 groups depending of their PSY1 mutation; r and ry. (±SE,

p<0,05, red n=9, bicolor n=7, yellow r n=3, yellow ry n=4 ).

Genomic rearrangement in yellow tomato cultivars

In yellow cultivars, PSY1 expression and splicing variants showed two patterns

distinct from the bicolor cultivars. Among the eight yellow cultivars analyzed in the

transcriptomic analysis, three have the r mutation (Barry Crazy Cherry, Lemon Drop and

Butter Apple) while Téton de Vénus, Poma Amoris, Galina’s Yellow, Mirabelle and Gold

Currant have the ry mutation. While both groups show a decrease in the expression of

PSY1, the cultivars in the r group have less transcripts than the cultivars in the ry group.

The yellow cultivars in the r group have a 90% reduction in PSY1 transcripts while the

ones in the ry group have a reduction of around 60% (Fig. 3.4).

PSY1 gene sequence analysis shows that the cultivars in the r group have an

insertion of a 403bp in the first coding exon (Fig. 3.6, Supplementary Fig. 3.6).

64

Splicing site Start (bp) End (bp)

a 4,350,905 4,350,990

b 4,351,184 4,352,127

Figure 3.5. A structural variation in the bicolor cultivars changes the 5’UTR transcripts profile of PSY1. Transcripts alignment of PSY1 for

red and bicolor cultivars on the Solanum lycopersicum reference genome (SL3.0). Grey areas represent the count numbers for each position in the

transcriptomic analysis and show clearly the 6 coding exons. Major splicing sites in the 5’UTR region of red cultivars are represented by black

arrows (a, b) and described in the table. Bicolor cultivars are characterized by a 3811bp sequence deletion upstream of PSY1 gene (red line). The

deletion causes major changes in the 5’UTR region of the bicolor cultivars.

65

Because of this insertion, only the first 107 amino acids are conserved followed by 71

amino acids and a premature stop codon transcribed from the insertion (Supplementary

Fig. 3.7). The PSY1 protein of the r group thus possesses only 178 amino acids, in

contrast with the functional PSY1 protein that have 412 amino acids. In these yellow

cultivars, PSY1 amino acid sequence is thus modified and interrupted at the first coding

exon, which consequently leads to an inactive protein. Of the 403 bp insertion, 398 bp is a

single long terminal repeat (LTR) normally found in Rider retrotransposons. No internal

region was detected. The insertion sequence is identical to Rider LTR found in the fruit

shape-related sun locus but has a few differences from the r cDNA sequence published by

Fray and Grierson in 1993 (Jiang et al. 2009, Fray and Grierson 1993). Since all the yellow

cultivars of the r group have the same sequence, the original cDNA sequence had most

likely mistakes linked to the cloning or sequencing process. Based on the splicing counts

between each exon, only 16.4 % (± 2.9, SE) of the transcripts with the insertion continue to

the second exon, meaning that PSY1 transcription frequently ends with the 403bp

insertion. Interestingly, a significant portion of the transcripts is directly spliced from the

largest 5’ UTR intron to the second exon (Supplementary Table 3.9, Supplementary Fig.

3.4). This alternative splicing that remove the end of the 5’UTR and the first coding exon

was not detected in the red, bicolor and ry-yellow cultivars. The transcripts derived from

this unusual splicing is unlikely to result in a functional sequence based on translation

initiation predictions. In all the alternative splicing analyzed from the r group, none resulted

in a full amino acid sequence needed for a phytoene synthase activity, explaining the lack

of lycopene in the fruits of these cultivars (Supplementary Fig. 3.7).

In contrast to the yellow cultivars from the r group, the transcripts from the ry

cultivars have no insertion in the first coding exon but lack the last 76bp of the coding

sequence (Fig. 3.6). These missing nucleotides are replaced by a sequence coming from

the gene downstream of PSY1, an Acyl-CoA synthetase (Solyc03g031870). This results in

a longer coding sequence with a segment of 43 amino acids not found in the original

protein sequence (Supplementary Fig. 3.8). The transcript sequence is identical to the

cDNA sequence of the ry mutant published by Fray and Grierson (1993). As they

suspected, the sequence is the result of a complex genomic rearrangement. An analysis of

the genomic sequence indicates an inversion from the last coding exon of PSY1 to the

second exon of Solyc03g031870 located normally 6202 bp further. The inverted sequence

begins 166 bp from the start of the second exon of Solyc03g031870 and continues toward

66

the 5’UTR of the gene and the intergenic region. The transcripts show a splicing site that

starts inside the second exon and finish inside the first exon at a different position from the

non-inverted sequence (Supplementary Fig. 3.9). The stop codon resulting from this

structural variation is located inside the first exon of Solyc03g031870 as illustrated in

Figure 3.6 (Supplementary Fig. 3.10).

Since the cultivars from the ry group can show red tissues under some conditions,

crosses were made between a cultivar from the bicolor group (Granada) and a cultivar

from the ry group (Azoychka). Using molecular markers, F2 homozygous plants for each

allele were selected and grown for phenotyping. The plants with the ry allele were yellow

with occasional red section near the blossom end, similarly to the yellow parent Azoychka.

In contrast, the plants with the bicolor allele had more red tissues, especially near the

epidermis, in the columella, and in the septa (Fig. 3.7). There was variation in the intensity

of the coloration in each group indicating that genes outside of the locus can influence the

accumulation of lycopene for both alleles.

Analysis of SRA data from PRJNA353161 (Tieman et al. 2017) showed that half of

the yellow group 2 cultivars PSY1 reads possess this chromosomic rearrangement, while

the other half are complete and not interrupted at exon 6. Those results are confirmed by

studies that describe the PSY1 ry mutation and found two version of PSY1 mRNA

identified as PSY1 and “chimeric PSY/Unknown” (Fray and Grierson 1993, Kang et al.

2014).

67

Figure 3.6. Yellow r and ry cultivars PSY1 transcripts alignment on S. lycopersicum reference genome. Grey areas represent the transcripts

mapping to S. lycopersicum genome (SL3.0). In the yellow r cultivars, an insertion of 403pb on exon 1 (red arrow) causes the premature end of the

PSY1 protein. In yellow ry cultivars, the sixth exon of PSY1 exon is interrupted (red arrow) by the insertion of an inverted genomic region

downstream of PSY1. The inversion creates PSY1 transcripts that lack the end of the 6th exon but contain inverted part of Solyc03g031870 exon 2

(orange box 4), exon 1 (orange box 3), 5’UTR (orange box 2), and intergenic region (orange box 1). The transcripts splice between the middle of

Solyc03g031870 exon 2 and exon 1(black arrow identified with the r letter).

68

Figure 3.7 Influence of the bicolor and ry allele of PSY1 on the fruit phenotype. Yellow (A) and

bicolor (B) fruits of a F2 population resulting from the cross between the cultivar Azoychka (yellow

ry) and the cultivar Granada (bicolor). The lines homozygous for the ry allele are mostly yellow with

occasional red tissues near the blossom end of the fruit. In contrast, the lines homozygous for the

bicolor allele show more red sections, especially near the epidermis, in the columella and in the

septa.

3.6 Discussion and Conclusion

Lycopene accumulation in chromoplasts is essential for the bright red color of

tomatoes. The carotenoid production pathway in fruits has been well studied, and the

majority of the genes involved have been identified and characterized. However, the

genetic factors responsible of some unusual fruit colorations, like bicolor tomatoes that

present a yellow phenotype with red sections, are not well understood. In this project, we

studied how structural variation of one gene of the carotenoid production pathway, PSY1,

can lead to a diversity of fruit colorations, from yellow to bicolor.

Wild related species of S. lycopersicum that produce green mature fruits have

been useful to identify QTL involved in fruits color and to study genes of the carotenoid

69

production pathway (Liu et al. 2003). For example, introgressions of S. pennellii with

orange fruits were used to identify and characterize two lycopene cyclases, LCYE (Delta)

(Ronen et al. 1999) and LCYB (Beta) (Ronen et al. 2000). The same population was used

to better understand the r locus, where the introgression of a segment of S. pennellii

containing PSY1 resulted in a strong decrease of carotenoids accumulation (Liu et al.

2003). In this study, we used introgression lines derived from the green-fruited S.

habrochaites to fine-map a QTL resulting in bicolored fruits. The phenotype was linked to a

small region on chromosome 3 where PSY1 is located. The S. habrochaites introgression

causes an important reduction in PSY1 expression resulting in less accumulation of

carotenoids. This reduction is likely the result of differences in the promoter of ShPSY1

influencing transcription. Several single nucleotide polymorphisms, small deletions, and

small insertions were detected in the promoter ShPSY1 disturbing many potential binding

sites for transcription factors. In tomato, several ripening-related transcription factors

including RIN and FUL-1 are associated with an increase in PSY1 expression (Martel et al.

2011, Fujisawa et al. 2014, Shima et al. 2013). It is also possible that sequence variations

between the promoter of SlPSY1 and ShPSY1 change the methylation pattern during the

ripening. Silencing of a demethylase (SlDML2) in tomato results in a hypermethylation in

the promoter of PSY1 and a reduction of its expression, illustrating the importance of

methylation in the control of the carotenoid pathway during the fruit ripening (Liu et al.

2015). In the bicolor introgression line, the decrease of PSY1 expression is associated

with a reduction in lycopene synthesis but also a more localized accumulation of the red

pigment. Interestingly, PSY1 is not more expressed in the red sections of the fruit than in

the yellow sections. This suggests either a spatial-dependent post-transcriptional

regulation of PSY1 or differences in the flux inside the carotenoid pathway between

sections of the fruit.

A volatile analysis showed that in the bicolor introgression line, the significant

diminution of PSY1 expression, and thus of lycopene accumulation, was correlated with a

proportional decrease of apocarotenoid related compounds, especially MHO and

geranylacetone. These aroma molecules derived from carotenoid are part of a set of about

30 diverse volatile compounds that participate to tomato flavour. Apocarotenoids have a

fruity and tropical like aroma that is known to enhance sweetness perception of the fruits

(Vogel et al. 2010). Panel experimentations showed that some cultivars that contain fewer

sugars are perceived as sweeter than others because they produce more of these fruity

70

aroma volatile compounds (Bartoshuk and Klee 2013). Sweetness being often correlated

with consumer better appreciation, yellow and bicolor tomatoes that produce less

apocarotenoid should be less liked than red fruits (Bartoshuk and Klee 2013, Baldwin et al.

2008). However, consumers ability to perceive the different volatile compounds often differ

and can impact their appreciation (Reed et al. 2006). It is therefore possible that

subgroups of consumers react positively to the volatiles profile of bicolor fruits.

In contrast to the bicolor introgression lines derived from S. habrochaites, bicolor

cultivars do not present a drastic reduction of PSY1 expression. It seems unlikely that the

measured reduction in PSY1 transcripts could alone explain the phenotype. Bicolor

cultivars show structural variation in the promoter region of PSY1 that result in a modified

5’ UTR. The transcripts of bicolor cultivars lack the first part of the 5’ UTR of red cultivars

and are spliced differently resulting in a longer 5’ UTR. The sequences of 5’UTR regions

are critical for gene translation efficiency by influencing, among other things, the mRNA

secondary structures and the content of upstream open reading frames (Bailey-Serres

1999, Wilkie et al. 2003). In Arabidopsis thaliana, it has been demonstrated that the 5’UTR

region context can make gene translation vary over 200-fold (Kim et al. 2014). The

presence of a longer PSY1 5’UTR sequence in the bicolor cultivars could result in a

decrease of PSY1 translation and less production of carotenoids in the fruit. In plants,

most of the genes have a 5’UTR of less than 500 bp and only a small percentage have

long 5’UTR of more than 1,000 bp. In A. thaliana, only 0.02% of genes have a 5’UTR of

more than 2,000 bp (Srivastava et al. 2018). Given their low abundance, it is likely that

longer UTR are reducing the efficiency of the translation. This can be illustrated with the

two 5’UTR splicing variants for A. thaliana PSY. The longer variant forms an inhibitory

structure that decreases the translation efficiency of PSY while the shorter variant allows a

quick production of the protein. Analysis of truncated versions of the longer variant allowed

the identification of a hairpin loop responsible for the difference between the two variant

(Álvarez et al. 2016). With more than 2000 nucleotide in length, the 5’ UTR of tomato

bicolor cultivars is likely to form complex secondary structures that could decrease PSY1

translation and results in the low accumulation of lycopene.

As for bicolor cultivars, structural variations are responsible for yellow tomatoes. In

the group of yellow r cultivars, an insertion interrupts the first exon of PSY1 resulting in a

truncated and non-functional PSY1 protein (Fray and Grierson, 1993). The carotenoid

71

production pathway is blocked at the first step of the pathway and the tomatoes do not

accumulate carotenoids during the ripening process. This inserted sequence consists of

one of the two long terminal repeats (LTR) that flank the Rider Ty1-copia-like

retrotransposon. About 1900 copies of the Rider retrotransposon are predicted to be

present in S. lycopersicum and some of them are still active, which means that they

continue to bring major changes to its genome. For example, one Rider transposon is

known to be responsible of the duplication and transposition of the Sun gene from

chromosome 10 to a new locus in chromosome 7. A mutation in the Rider LTR2 induced

an error during the transcription termination that usually occurs in the 3’LTR, which led to

read-through transcription and the relocation of the sun gene along with the transposon. In

this new locus, the promoter of a defensin gene disrupted by the transposition enhanced

sun gene expression. This structural chromosomic rearrangement had an important impact

on tomato shape diversity since it resulted in the apparition of oval and elongated fruits. In

PSY1 however, the sequences of the second LTR and internal coding region that are

usually characteristic of retrotransposons are absent. Such solo-LTRs are not rare and

constitute almost half of Rider retrotransposon that exist in the tomato genome (Jiang et al.

2009). For example, a solo-LTR is present in the sun locus of chromosome 7, upstream

the sun gene. Solo-LTRs originate by excision from the genome of one LTR and the

internal coding sequence due to a recombination between the 3’ and 5’ LTRs. This special

recombination is often a regulation mechanism in order to prevent insertion of too many

retrotransposons and slow down genomes size expansion (King Jordan and McDonald

1999). Transposable elements are very abundant in plants genome and their insertion in

gene exons often results in protein major changes or loss-of-function (Zeng and Cheng

2014, Dubin et al. 2018). Transposons have already been identified to cause color

changes in fruits. For example, a Copia-like retrotransposon (Tcs1) is responsible of the

purple color of blood oranges pulp (Butelli et al. 2012). Tcs1 insertion near the

transcription factor Ruby leads to activation the anthocyanin pathway in the blood oranges

(Butelli et al. 2012). Another example is found in several cultivars of white-skinned grapes.

The insertion of the transposon Gret1 in the promoter region of the transcription factor

VvmybA1 prevents its expression and the activation of the anthocyanin pathway. In maize,

events of transposable elements that insert in genes involved in anthocyanin pathway and

affect kernels color are various. One of the better-known examples is the insertion of the

non-autonomous Ds transposon in an UDP-glucose flavonoid 3-O-glucosyl transferase

gene (bz locus). The insertion results in no anthocyanin accumulation in the kernel. In the

72

presence of the autonomous Ac transposon, the Ds transposon can move and restore the

gene function causing an unstable phenotype from kernel to kernel (McClintock 1950,

Fedoroff 1984).

In r group of yellow cultivars, the lack of PSY1 activity comes from the insertion of a

Rider LTR sequence, but also from an unusual alternative splicing from the largest 5’UTR

intron to the second PSY1 exon. In this splicing variant, the first exon is completely

removed and the transcripts don’t have the Rider solo-LTR sequence. Without the first

exon, the transcripts are unlikely to result in a PSY1 functional protein. Since we didn’t

detect this unusual splicing in the red, bicolor or yellow ry cultivars, we can postulate that

the LTR insertion is responsible for the alternative splicing. Since both splicing variants

code for a non-functional phytoene synthase, the r cultivars cannot perform the first step of

the carotenoid pathway and the fruits remain yellow.

The ry yellow flesh mutation also affects PSY1 amino acid sequence, but this time

only at the end of the protein. Genomic data of PSY1 ry cultivars confirmed that a

chromosomic rearrangement happened, creating a complex structural variant. The

inversion of a sequence between the last exon of PSY1 and the second exon of the

following genes altered the end of PSY1 coding sequence. The ry cultivars have the

capacity in certain conditions to accumulate low levels of lycopene at the blossom end of

the fruits, which means that their PSY1 protein sequence is not completely non-functional

in contrast to the r cultivars. This is consistent with the results of Kang et al. 2014. When

expressed in bacteria, the PSY1 of ry cultivars was able to successfully produce carotenoid

but to a lesser extent than the wild type PSY1 (Kang et al. 2014). Crosses between the ry

cultivar Azoychka and the bicolor cultivar Granada confirmed that the ry fruits can present

red sections, but at a very low intensity compared to bicolor cultivars that possess a

complete and functional version of PSY1.

This study draws attention on the many structural variations that happened near a

single gene, PSY1, and how those variations may lead to a diversity of colors in tomato.

While bicolored tomato fruits have been described early on, the genetic basis for this

unusual phenotype was still unknown. An important deletion, combined with the

chromosomal rearrangement observed in ry yellow cultivars and the transposon insertion in

73

the r yellow cultivars, here provides a good example of multiple phenotypes that can arise

from structural variations in key steps of secondary metabolism pathways.

3.7 References

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77

Discussion et conclusion

En raison du nombre et de la complexité des sentiers métaboliques impliqués dans

la synthèse de composés volatils aromatiques, la flaveur des fruits est une caractéristique

encore peu maitrisée et donc peu prise en compte dans les programmes d’amélioration

génétique. Afin d’améliorer la qualité aromatique des fruits, il est essentiel de comprendre

les mécanismes régulant la production et l’émission de ces composés volatils. Dans le

cadre de ce projet, nous nous sommes concentrés sur l’étude de la synthèse des

apocaroténoïdes, des composés volatils à l’arôme fruité et « sucré » montrant un impact

très important sur la flaveur des tomates. Puisque les apocaroténoïdes sont formés lors du

clivage oxydatif des caroténoïdes, nous avons considéré important de nous pencher

également sur le sentier de production de ces précurseurs. Bien que le sentier de

production des caroténoïdes ait été très étudié chez la tomate, certains mécanismes

régulant leur accumulation dans les fruits sont encore inconnus.

Le premier objectif du projet était d’acquérir de nouvelles connaissances sur l’étape

clé de clivage oxydatif des caroténoïdes liés à la production apocaroténoïdes volatils. De

précédents travaux avaient identifié l’enzyme SlCCD1 comme responsable, dans les fruits,

du clivage oxydatif de doubles liens spécifiques des caroténoïdes dans le but de libérer

des apocaroténoïdes volatils précis. Cependant, le fait que l’enzyme SlCCD1 ne possède

pas de peptide de signalisation et se retrouve dans le cytosol, séparée de ses substrats

stockés dans les plastes, laissait planer une zone d’ombre sur cette étape essentielle de

clivage oxydatif (Simkin et al. 2004, Wei et al. 2016). Des études antérieures suggéraient

que certains résidus hydrophobes de SlCCD1 responsables d’assurer son association

avec les caroténoïdes pourraient également permettre à l’enzyme de se lier à la

membrane externe des chloroplastes (Behrendt et al. 2011). Des peptides de fusion

CCD1-GFP exprimés de manière transitoire dans des protoplastes de tabac indiquaient

toutefois que CCD1 est localisée dans le cytosol, et qu’elle ne semblait pas être

spécifiquement liée aux membranes des plastes (Auldridge et al. 2006). Ainsi, même si

une association chimique entre SlCCD1 et la membrane externe des chloroplastes était

possible dans une certaine mesure, un accès permanent aux caroténoïdes retrouvés dans

les chloroplastes demeurait peu probable.

78

Nous avons donc émis l’hypothèse qu’une, ou plusieurs autres enzymes encore

non identifiées accompagnaient CCD1 dans son rôle de clivage, en lui permettant au

préalable de se retrouver en contact avec ses substrats. Les enzymes de type

lipoxygénase, responsables de l’oxydation des acides gras pour la synthèse des

composés volatils dérivés d’acides gras avaient attiré notre attention. La capacité de ces

enzymes à entrainer une co-oxydation aléatoire des caroténoïdes, par l’entremise de

radicaux peroxyles très réactifs, nous semblait pertinente à étudier et à caractériser chez

la tomate (Wu et al. 1999). Dans un premier temps, l’analyse des composés volatils émis

par différentes lignées de tomates transgéniques dans lesquelles l’expression de SlCCD1

et TomloxC ont été supprimées, séparément ou de manière simultanée, nous a apporté de

nouvelles informations sur le rôle de ces deux enzymes dans le sentier de synthèse des

apocaroténoïdes. Ces travaux nous ont permis de mettre en évidence le fait que SlCCD1,

bien que considérée comme l’enzyme clé du sentier, et capable d’effectuer le clivage

oxydatif des caroténoïdes in vitro, n’a pas semblé être essentielle à la synthèse des

apocaroténoïdes en conditions in vivo. Son absence dans les deux lignées transgéniques

9528_CCD1 et 9530_CCD1 n’a en effet causé aucune altération à la baisse dans le profil

d’émission des apocaroténoïdes, ce qui était contraire aux résultats attendus. En

revanche, notre hypothèse selon laquelle l’isoforme TomloxC, en plus d’être impliqué dans

l’émission de composés volatils des acides gras, participe au sentier de synthèse des

apocaroténoïdes a été validée. Ainsi, les lignées transgéniques où le gène ne s’exprimait

pas présentaient une baisse significative d’émission de 6-méthyl-5-hepten-2-one et de

géranylacétone, témoignant du rôle essentiel de TomloxC, au contraire de SlCCD1, dans

la synthèse des apocaroténoïdes. Nous concluons donc, sur cette base, que la co-

oxydation des caroténoïdes générée par l’action de l’isoforme LoxC est une réaction

survenant de manière non négligeable dans les plastes. Cette idée est supportée par le

fait que CCD1 montre plus d’affinité de clivage pour des caroténoïdes à 27 carbones

comme le 10’-apo-β-carotenal que pour des caroténoïdes à 40 carbones comme la β-

carotène (Floss and Walter 2008) Ces caroténoïdes clivés, plus petits, possèderaient alors

une nouvelle configuration chimique qui leur permettrait de traverser la membrane des

plastes et retrouver CCD1 dans le cytosol. Ce passage pourrait se faire soit par diffusion

directe comme les composés volatils sont capables de le faire avec les membranes

cellulaires pour se propager dans l’air (Baldwin 2010), soit via des transporteurs

spécifiques ayant une affinité pour ces nouveaux caroténoïdes clivés. Des transporteurs

ABC sont notamment connus pour leur rôle dans le transport des strigolactones et de

79

l’ABA qui sont également des apocaroténoïdes (Kretzschmar et al. 2012). Comme

alternative, considérant le fait que les tomates émettent peu d’apocaroténoïdes, le 6-

méthyl-5-hepten-2-one et le géranylacétone, produits de manière aléatoire lors de la co-

oxydation respective du lycopène et de la ζ-carotène par TomloxC, pourraient être

générés en assez grande quantité pour qu’un clivage subséquent par SlCCD1 ne soit pas

nécessaire. Cette possibilité impliquerait, par contre, la détection en quantités non

négligeables d’apocaroténoïdes volatils autres que le MHO et le géranylacétone, qui

seraient générés lors du clivage à des doubles liens aléatoires du lycopène et de la ζ-

carotène. Il sera important dans le futur d’effectuer des recherches sur la nature des

composés générés par co-oxydation par l’action de l’enzyme LoxC. Nous posons alors

comme hypothèse que la co-oxydation totalement aléatoire des caroténoïdes observée in

vitro ne serait pas aussi imprévisible dans un contexte cellulaire in vivo et se ferait plutôt à

certains liens de prédilection et qu’ainsi seuls certains caroténoïdes oxydés seraient

générés. Il importe toutefois de noter que, bien que TomloxC semble jouer un rôle

important dans la synthèse des apocaroténoïdes, son absence dans les lignées

transgéniques n’inhibe pas totalement l’émission de ces composés. Nos résultats laissent

penser que d’autres enzymes sont impliqués dans la synthèse des apocaroténoïdes.

TomloxC est la seule lipoxygénase impliquée dans la synthèse des composés volatils

dérivés des acides gras chez la tomate, mais d’autres lipoxygénases plastidiques

s’expriment dans les fruits. Ces enzymes ont le même mode d’action d’oxydation des

acides gras que TomloxC, qui génère des radicaux peroxyles intermédiaires. Il sera donc

intéressant de vérifier si seule TomloxC est responsable de la co-oxydation des

caroténoïdes afin de générer les apocaroténoïdes volatils, ou si d’autres lipoxygénases

peuvent aussi être impliquées dans le processus.

De nombreuses questions ayant été soulevées par cette première expérience,

nous avons décidé, dans la deuxième partie du projet, d’adopter un modèle alternatif à

celui des tomates, peut-être trop complexe au présent stade de nos connaissances. Les

faibles quantités d’apocaroténoïdes émises par le fruit des tomates font partie d’un

mélange complexe d’environ 400 composés volatils différents impliquant

vraisemblablement plusieurs sentiers métaboliques. L’espèce Viola odorata, ou violette

odorante, a été sélectionnée ici parce que ses pétales dégagent une forte odeur,

caractéristique des apocaroténoïdes, plus particulièrement des ionones (Werkhoff et al.

80

1991, Gautschi et al.. 2001, Brenna et al. 2002). Cette petite fleur violette émet

d’importantes quantités d’apocaroténoïdes, même si, au contraire de la tomate, elle ne

présente pas de signe visible d’accumulation de caroténoïdes dans ses tissus. Le

deuxième objectif du projet consistait à comparer le transcriptome des pétales de V.

odorata à celui de V. septentrionalis, une espèce apparentée d’apparence semblable mais

inodore, dans le but d’identifier des gènes clés impliqués dans la synthèse des

apocaroténoïdes, non seulement chez la violette mais aussi éventuellement chez la

tomate. Nous avons, au départ, posé comme hypothèse que des gènes à la fois très

exprimés chez V. odorata et peu exprimés chez V. septentrionalis sont potentiellement

impliqués dans la synthèse des apocaroténoïdes. Dans un premier temps, une analyse

des composés volatils émis par les deux espèces de violettes nous a permis de confirmer

que V. odorata émet presque exclusivement d’importantes quantités d’ionones et plus

particulièrement d’α-ionone et de β-ionone, tandis que V. septentrionalis n’en produit

presque pas. Une analyse différentielle de l’expression des gènes chez V. odorata et sa

parente inodore nous a ensuite permis d’identifier des gènes clés nécessaires à la

synthèse efficace d’apocaroténoïdes volatils chez les fleurs. Le sentier du MEP,

responsable de générer le diphosphate de géranyl géranyl, précurseur de tous les

caroténoïdes, était par exemple très actif chez V. odorata par rapport à V. septentrionalis.

Bien que tous les gènes du sentier soient plus exprimés chez V. odorata, c’est le gène qui

code pour le 1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase (DXS) qui présentait la différence

d’expression la plus importante entre les deux espèces. Cette forte expression du gène

DXS chez V. odorata suggère que la première étape du sentier du MEP, considérée

comme régulatrice, n’est pas limitante chez cette espèce pour la production en grande

quantité des précurseurs de caroténoïdes (Lois et al. 2000, Walter et al. 2002). De la

même façon, la très forte activité du sentier de production des caroténoïdes chez V.

odorata, par rapport à V. septentrionalis semblait être assurée par une forte expression de

la phytoène synthase (PSY), première enzyme du sentier, également considérée comme

un joueur clé dans la régulation de la synthèse des caroténoïdes (Gady et al. 2012). C’est

cependant le gène qui code pour la lycopène ε-cyclase (LCYE) qui présentait la plus

grande différence, étant exprimé environ 1900 fois plus chez V. odorata que chez V.

septentrionalis. La LCYE assure donc que tout le lycopène produit soit efficacement

transformé en δ-carotène, un précurseur de l’α-ionone. Par la suite, la lycopène-β-cyclase

(LCYB) transforme le δ-carotène en α-carotène, un précurseur de l’α-ionone et de la β-

ionone (Ohmiya 2009, Fantini et al. 2013, Baldermann et al. 2010). Cela expliquerait donc

81

pourquoi V. odorata émet d’importantes quantités d’α-ionone et de β-ionone, et non de

géranylacétone et de MHO comme chez la tomate, qui dérivent respectivement de la ζ-

carotène et du lycopène. Chez V. septentrionalis, la faible expression de l’enzyme LCYE

n’est pas favorable à la cyclisation du lycopène, déjà peu synthétisé, en δ-carotène. Ce

manque de précurseurs est à l’origine du peu d’α-ionone émis. Dans le cas de V.

septentrionalis, les faibles quantités de β-ionone synthétisées ne proviennent peut-être

pas de l’α-carotène, mais plutôt de la β-carotène issue directement de la cyclisation des

faibles quantités de lycopène disponible par l’action l’enzyme LCYB. Ensembles, ces

résultats suggèrent que la première étape permettant de synthétiser beaucoup

d’apocaroténoïdes est de diriger les sentiers du MEP et de production des caroténoïdes

afin de générer de grandes quantités de caroténoïdes spécifiques. Si les pétales de V.

odorata n’arborent pas une couleur orange caractéristique de la δ-carotène qu’elles

produisent en grande quantité, c’est parce que ceux-ci doivent être immédiatement clivés

sous l’action de CCDs. Un des 3 isoformes de CCD4 identifiés chez les deux espèces de

violettes était en particulier fortement exprimé chez V. odorata par rapport à V.

septentrionalis. Cette enzyme de la famille des CCDs surtout connue pour son activité de

clivage des caroténoïdes dans les fleurs n’est pas exprimée dans les tomates. Comme

CCD4 est située dans les plastes, au contraire de CCD1, elle n’a aucun problème pour

accéder à ses substrats et constitue donc une bonne candidate pour le clivage oxydatif

des caroténoïdes (Kishimoto et Ohmiya 2006, Wei et al. 2016). Le gène CCD1, identifié

chez V. odorata et V. septentrionalis et localisé dans le cytoplasme comme SlCCD1, ne

présentait pas d’importante différence d’expression entre les deux espèces. Ce résultat a

confirmé les observations réalisées sur les tomates transgéniques, à savoir que les

enzymes CCD1 cytosoliques ne sont pas essentielles à la synthèse des apocaroténoïdes.

Par contre, un nouveau gène identifié chez les deux espèces de Viola et appartenant à la

famille des CCDs était beaucoup plus exprimé chez V. odorata que chez V.

septentrionalis. Ce gène, que nous avons baptisé CCD1-like en raison de son homologie

avec des CCD1 déjà caractérisés chez d’autres espèces, s’avère posséder un signal de

transit dirigé vers les plastes, au contraire des CCD1 qui restent dans le cytosol. De toutes

les CCDs testées, c’est avec SlCCD-like, membre plastidique de la famille des CCDs

identifiée récemment chez la tomate, que la CCD1-like des violettes partage le plus fort

taux d’homologie. Par contre, cette SlCCD-like n’a jamais été caractérisée, et son rôle

n’est pas connu. D’autres gènes de type CCD1-like possédant tous des peptides de transit

ont été déjà identifiés chez plusieurs espèces, comme le peuplier (Populus sp.), le manioc

82

(Manihot esculenta) ou l’hévéa (Hevea brasiliensis), mais jamais caractérisés en détail. En

plus d’une CCD4, V. odorata bénéficie donc également de la présence d’une enzyme de

type CCD1, elle aussi située dans les plastes et potentiellement capable d’effectuer le

clivage oxydatif des caroténoïdes. L’action combinée de CCD1-like et de CCD4, qui

possèdent possiblement des sites de clivage des caroténoïdes complémentaires, pourrait

être à l’origine de la synthèse abondante d’apocaroténoïdes chez V. odorata. Il sera

essentiel dans les prochaines recherches d’évaluer les rôles distincts de CCD4 et CCD1-

like, afin de déterminer comment leur action conjointe est organisée. Tandis que toutes les

lipoxygénases cytoplasmiques identifiées ne présentaient pas de différence d’expression

significative entre les deux espèces, deux 13-lipoxygénases plastidiques partageant une

forte homologie de séquence avec les 13-lipoxygénases TomloxC et TomloxD, se sont

avérées être plus exprimées chez V. odorata que V. septentrionalis. Ces observations

laissent penser que chez les fleurs, les lipoxygénases jouent également un rôle dans la

production des apocaroténoïdes. Ces lipoxygénases plastidiques pourraient effectuer une

co-oxydation préalable des caroténoïdes afin de fournir des substrats aux CCDs

plastidiques. Il a déjà été démontré que l’enzyme CCD1 de Medicago truncatula possède

plus d’affinité pour les caroténoïdes à 27 carbones que pour ceux à 40 carbones (Floss et

al. 2008). Si cela est aussi le cas de VoCCD4 et VoCCD1-like, les lipoxygénases, en

générant des caroténoïdes déjà oxydés et plus courts, pourraient augmenter l’affinité des

CCDs plastidiques pour leurs substrats, et donc leur efficacité de clivage. Cette analyse

transcriptomique aura ainsi fourni des informations pertinentes sur l’expression des gènes

responsables de la différence entre V. odorata et V. septentrionalis concernant leur

production d’apocaroténoïdes. Cependant, de plus amples analyses de l’activité

enzymatique codée par chacun de ces gènes seront nécessaires afin de mieux

comprendre le sentier de production des apocaroténoïdes chez ces fleurs. Nous espérons

que les connaissances acquises sur la violette seront par la suite utiles afin d’élucider ce

même sentier chez d’autres espèces.

L’analyse transcriptomique des pétales de V. odorata a démontré que

l’accumulation en quantité suffisante de caroténoïdes dans les tissus est nécessaire afin

d’assurer l’émission subséquente d’apocaroténoïdes volatils, et que la nature des

caroténoïdes produits a un impact direct sur la variété des apocaroténoïdes émis. Dans le

cadre de ce troisième objectif, nous nous sommes donc concentrés à étudier la synthèse

83

de ces précurseurs, c’est-à-dire aux étapes qui se déroulent en amont de l’intervention

présumée des lipoxygénases et des CCDs. Plus particulièrement, nous nous sommes

intéressés aux facteurs génétiques responsables de la couleur particulière de certains

cultivars de tomates bicolores, dont les fruits matures sont jaunes avec seulement

quelques sections rouges. Notre hypothèse était que l’identification d’un gène impliqué

dans la synthèse du lycopène permettrait d’expliquer le phénotype part iculier de ces

tomates « bicolores » qui ne rougissent pas uniformément. Puisque les fruits des cultivars

bicolores testés présentaient une baisse significative d’émission d’apocaroténoïdes par

rapport aux fruits rouges, nous avions de bonnes raisons de penser que l’identification des

mécanismes impliqués dans ce phénotype nous apporterait de nouvelles connaissances

sur la régulation du sentier d’émission des apocaroténoïdes.

La lignée d’introgression bicolore 3923, issue d’un croisement entre Solanum

lycopersicum (cultivar E-6203, accession LA4024) et Solanum habrochaites (accession

LA1777), une espèce sauvage apparentée dont les fruits verts ne synthétisent pas de

lycopène (Monforte et Tanksley 2000) a été sélectionnée afin d’identifier un QTL impliqué

dans le phénotype bicolore et donc la synthèse des caroténoïdes. Des populations

d’introgression entre la tomate et des espèces sauvages apparentées ne produisant pas

de caroténoïdes ont déjà démontré l’efficacité de cette méthode afin d’identifier des QTLs

impliqués dans la couleur des fruits, et ainsi d’étudier la fonction des gènes du sentier de

production des caroténoïdes (Liu et al. 2003). Par exemple, des lignées d’introgression

issues de croisements entre la tomate et S. pennelli ont servi à la caractérisation des

enzymes lycopène cyclases LCYE (mutant Delta) (Ronen et al. 1999) et LCYB (mutant

Beta) (Ronen et al. 2000), ainsi qu’à la mise en évidence de l’importance du rôle de PSY1

dans l’accumulation des caroténoïdes (Liu et al. 2003). Dans la présente étude, la lignée

bicolore 3923 a de la même manière permis de mettre en évidence le fait que le QTL

recherché se situe sur le chromosome 3, au niveau d’un locus possédant une

introgression du génome S. habrochaites et qui contient justement le gène SlPSY1. La

baisse d’expression de SlPSY1 mesurée dans les fruits de la lignée 3923 serait à l’origine

de leur phénotype bicolore. Cette baisse d’expression pourrait être causée par la présence

de SNPs, d’insertions ou de délétions dans la séquence du promoteur du gène ShPSY1.

Ces variations par rapport au promoteur de SlPSY1 seraient à l’origine de la modification

de certains sites nécessaires à la liaison de facteurs de transcription (Martel et al. 2011,

Fujisawa et al. 2014, Shima et al. 2013) ou bien à des changements de méthylation du

84

promoteur (Liu et al. 2015) qui entraineraient un dérèglement à la baisse de l’expression

de SlPSY1. SlPSY1 est un gène clé dans la régulation de la synthèse des caroténoïdes

dans les fruits (Fraser et al. 2007) qui code pour l’enzyme catalysant la première étape du

sentier de production des caroténoïdes (Bartley et al. 1992). Nous avons également

démontré chez V. odorata que son niveau d’expression est important afin de permettre

une accumulation optimale de caroténoïdes dans les tissus, et de constituer ainsi un pool

de précurseurs suffisant pour la synthèse d’apocaroténoïdes. Dans les fruits bicolores de

la lignée 3923, nous avons également démontré que cette diminution de l’expression de

SlPSY1, et donc d’accumulation de lycopène, était directement corrélée avec la réduction

d’émission des apocaroténoïdes volatils 6-méthyl-5-hepten-2-one et géranylacétone,

respectivement dérivés du clivage du lycopène et de la ζ-carotène. L’accumulation de

lycopène dans certaines sections du fruit n’était pas corrélée avec une plus forte

expression de PSY1 par rapport aux parties qui restent jaunes. Cependant, ces parties

jaunes émettent moins d’apocaroténoïdes par rapport aux parties rouges, témoignant de

l’importance de la disponibilité des précurseurs pour la synthèse des apocaroténoïdes.

Par contre, dans le cas des cultivars bicolores, la couleur des fruits ne s’expliquait

pas par une baisse drastique de l’expression de SlPSY1, mais plutôt par une délétion

dans le promoteur du gène. Cette variation structurale était à l’origine d’un épissage

différentiel de la région 5’UTR, dont la séquence est plus longue que pour les cultivars

rouges. Les régions 5’UTR des gènes contiennent des motifs essentiels afin d’assurer une

bonne efficacité de traduction de l’ARNm en protéines, tels que des structures

secondaires, ou des sites de liaison aux ribosomes (Bailey-Serres 1999, Wilkie et al.

2003). La séquence anormalement longue de la région 5’UTR du gène SlPSY1 des

cultivars bicolores pourrait former des structures secondaires complexes qui nuiraient à la

traduction de PSY1 et donc à la synthèse de caroténoïdes (Álvarez et al. 2016). Ainsi, une

régulation précise de la transcription et de la traduction de PSY1 serait essentielle pour

contrôler l’accumulation des caroténoïdes dans le fruit, une étape préalable à la synthèse

des apocaroténoïdes volatils.

Nous avons démontré que SlPSY1 était un gène clé dans la synthèse des

caroténoïdes, dont des perturbations au niveau de la transcription et la traduction sont à

l’origine du phénotype bicolore. SlPSY1 était déjà connu pour jouer un rôle déterminant

dans la synthèse des caroténoïdes dans les fruits, des variations structurelles dans sa

85

séquence codante étant notamment responsables de la couleur jaune des tomates. Afin

de dresser un portrait complet de l’importance de SlPSY1 dans le sentier de production

des caroténoïdes, nous avons étudié plus en profondeur ces variations structurales qui

empêchent l’accumulation normale de caroténoïdes dans les fruits jaunes et nuisent

ultérieurement à l’émission d’apocaroténoïdes.

Certains cultivars de tomates produisent des fruits jaunes parce qu’ils portent la

mutation r, qui consiste en l’insertion dans l’exon 1 de SlPSY1, de la séquence d’un LTR

solitaire du rétrotransposon Rider (Jiang et al. 2009). Cette insertion cause d’une part une

protéine PSY1 tronquée à l’exon 1 et donc non fonctionnelle (Fray and Grierson, 1993).

D’autre part, nous pensons que ce LTR peut être à l’origine dans certains cas d’un

épissage alternatif allant de la région 5’UTR de SlPSY1, directement au second exon du

gène. Ces transcrits ne possèdent pas la séquence du LTR solitaire du rétrotransposon

Rider puisque l’exon 1 est épissé. Dans les deux cas cependant, les transcrits engendrent

une protéine PSY1 non-fonctionnelle, ce qui bloque le sentier de production des

caroténoïdes dès la première étape du sentier. Certains cultivars peuvent être jaunes à

cause d’une autre mutation, ry, qui affecte encore une fois SlPSY1, mais cette fois à la fin

de la séquence d’acides aminés (Fray and Grierson, 1993). Un réarrangement

chromosomique cause en effet une inversion de séquence entre le dernier exon de

SlPSY1 et le second exon du gène situé directement en aval de SlPSY1. Puisque la

mutation ry n’intervient qu’à la fin de la séquence codante, la protéine qui en résulte, bien

que tronquée, conserve une part d’activité, au contraire de la mutation r qui affecte la

séquence d’acides aminés dès le début et engendre une protéine PSY1 totalement non-

fonctionnelle. Les cultivars de couleur jaune ry peuvent ainsi, dans certaines conditions,

synthétiser de faibles quantités de lycopène qui s’accumulent dans le bas du fruit (Young

and MacArthur 1947). L’intensité de ces sections rouges est cependant très faible en

comparaison avec les fruits produits par les cultivars bicolores qui possèdent une version

complète et fonctionnelle de PSY1.

Les apocaroténoïdes volatils possèdent un arôme fruité et tropical, responsable de

la perception sucrée du fruit (Vogel et al. 2010). Ainsi, des expériences menées sur des

panels de goûteurs ont en effet montré que si certains cultivars sont perçus comme plus

sucrés que d’autres, ce n’est pas parce qu’ils contiennent plus de sucres, mais bien parce

qu’ils produisent davantage d’apocaroténoïdes (Bartoshuk and Klee 2013). Considérant

86

qu’un goût sucré est souvent corrélé avec une meilleure appréciation du fruit, des fruits

bicolores ou jaunes, qui produisent moins d’apocaroténoïdes, devraient être moins

appréciés que des tomates rouges par les consommateurs (Bartoshuk and Klee 2013,

Baldwin et al. 2008). Cependant, la capacité des consommateurs à percevoir

différemment les composés volatils, a un impact direct sur leur appréciation (Reed et al.

2006), et il reste possible que certains apprécient le profil de composés volatils émis par

les fruits bicolores ou jaunes.

En conclusion, les résultats de ce mémoire ont confirmé que la régulation de la

synthèse des caroténoïdes dans les fleurs et les fruits est une première étape nécessaire

à l’émission ultérieure des quantités désirées d’apocaroténoïdes. Les connaissances

acquises grâce aux tomates jaunes et bicolores sur les variations structurales de SlPSY1,

qui peuvent affecter non seulement sa séquence protéique mais aussi son expression et

sa traduction, permettent à présent de cibler un gène clé pour gérer l’accumulation de

caroténoïdes dans les tomates et ainsi mieux contrôler leur flaveur. Bien que la présence

de caroténoïdes précurseurs soit essentielle, la synthèse d’apocaroténoïdes ne peut se

faire sans la présence d’enzymes capables d’effectuer leur clivage oxydatif. Les enzymes

plastidiques de la famille des CCDs (CCD4 et CCD1-like) semblent contribuer

efficacement à tâche essentielle chez V. odorata. Cependant, les expériences sur les

tomates transgéniques ont démontré que l’enzyme SlCCD1 cytosolique n’est pas

essentielle in vivo à la synthèse des apocaroténoïdes et que l’intervention d’enzymes

lipoxygénases capables de diriger la co-oxydation aléatoire des caroténoïdes constitue,

chez la tomate, une étape importante pour la synthèse de ces apocaroténoïdes. Des

études futures seront nécessaires afin d’affiner la compréhension du sentier de synthèse

des apocaroténoïdes, particulièrement la manière dont les lipoxygénases et les différentes

CCDs plastidiques et cytoplasmiques se distribuent les rôles d’oxydation des caroténoïdes

dans les fleurs et les fruits.

87

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Annexe 1 : Figures supplémentaires (Chapitre 2)

Supplementary Figure 2.1. Silencing TomloxC decreases the emission of C6 and C5 fatty acid-derived volatiles in ripe tomatoes. Emission of C6 (cis-3-hexenal, hexanal, trans-2-hexenal, cis-hexen-1-ol, and hexyl alcohol) and C5 (ethylvinylketone and 1-penten-3-ol) fatty acid-derived volatiles in the ripe fruits of the control line M82 and the transgenic lines for SlCCD1 (9528_CCD1, 9530_CCD1) and TomloxC (0966_LoxC) (n=4). Crosses between the two constructions reduce the transcript level of both gene; CCD1+LoxC 1 (9528_CCD1 x 0966_LoxC) and CCD1+LoxC 2 (9530_CCD1 x 0966_LoxC) (n=6). The compound 2-isobutylthiazole is a leucine-derived volatile chosen as a control for non-fatty acid derived volatiles emission and fruit maturity. (±SE, p<0.05).

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Supplementary Figure 2.2. Emission of fatty acid-derived volatiles between flowers of V. odorata and V. septentrionalis. (±SE, n=4, p<0.05).

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Supplementary Figure 2.3. Phylogenetic tree of lipoxygenase proteins from Solanum lycopersicum, Viola odorata and Viola septentrionalis. The tree was constructed using the maximum likelihood method. A bootstrap of 1000 replicates has been used to assess the support of each group in the tree. The number next to the branches represents the percentage of trees in which the associated taxa are clustered together. Tom (Solanum lycopersicum), Vo (Viola odorata), Vs (Viola septentrionalis). The amino acid sequences used for the phylogenetic tree construction are available in Supplementary Table 2.2.

96

Supplementary Figure 2.4. Modification to the RNA-Seq library preparation protocol of Zhong

et al. 2011. The numbering of the steps is the same as in the original protocol.

1-7. The 1 to 7 steps of the Zhong et al. 2011 protocol are replaced by the 1 to 36 steps of the NEBNExt Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (NEB, www.neb.com). 10. Incubate at 85°C for exactly 6 min to fragment mRNA and immediately place on ice 14. Perform the RT reaction: i. 25°C for 10min ii. 50°C for 50min iii. 70°C for 15min 28. Perform a dilution 1:3 in Tris-HCl 10mM and NaCl 10mM of the Illumina TruSeq DNA adapter (Illumina, www.illumina.com). Add 1μl of the desired diluted barcode Illumina TruSeq DNA adapter to each sample. 29-30. Prepare the master buffer mix on ice as follows: - 2 μl T4 DNA ligase HC buffer (NEB, www.neb.com) - 6.5 μl H2O - 1.5 μl polyethylene glycol (Biobasic, www.biobasic.com) Add 8.5 μl of the master buffer mix and 2 μl of the T4 DNA ligase (NEB, www.neb.com) to each well. Mix by pipetting up and down. Incubate a 16°C overnight (16h). 31. Purify using 1 volume (19.5 μl) of AMPure XP beads. 34. To perform size selection, add exactly 0.65 volume of AMPure XP beads (13 μl) to the eluted DNA and incubate at room temperature for 5 min. 35. Pull the beads to the side of the plate/tube on a magnetic stand. Carefully pipette the supernatant into a tube with 2 μl of AMPure XP beads. 39. Digest the second strand DNA with 1 μl UNG (ThermoFisher, www.thermofisher.com) and 2 μl Phusion HF Buffer at 37°C for 15min. 40. Prepare PCR reaction as follows: - 6.5 μl UNG-digested DNA - 0.4 μl primer mix Kappa (20 μM) (Kappa, www.kapabiosystems.com) - 7 μl Phusion HF Buffer 5x - 0.4 μl dNTPs [10mM] - 19.8 μl H2O - 1 μl Phusion II 41. Initial denaturation at 98°C for 30sec Repeat the next cycle 14 times - 98°C for 10 seconds - 65°C for 30 seconds - 72°C for 15 seconds Hold at 72°C for 5 minutes. 43. Purify using 1.4 volumes (49μl) of AMPure XP beads. Elute with 20μl of TE buffer.

97

Annexe 2 : Tableaux supplémentaires (Chapitre 2)

Supplementary Table 2.1. Matrix of homology between CCDs of V. odorata and V. septentrionalis. Proteins alignment and homology score (%) have been calculated with Clustal Omega 2.1.

VoCCD1-

like

VsCCD1-

like

VoCCD1 VsCCD1 VoCCD4a VsCCD4a VoCCD4c VsCCD4c VoCCD4b VsCCD4b

VoCCD1-

like

100 96.0 26.6 26.6 26.3 26.5 25.4 24.9 23.9 23.3

VsCCD1-

like

96.0 100 25.2 25.2 24.7 24.7 24.1 22.7 22.4 21.8

VoCCD1 26.6 25.2 100 99.5 36.8 36.6 38.0 39.3 36.9 35.6

VsCCD1 26.6 25.2 99.5 100 36.8 36.6 37.8 39.1 36.7 35.4

VoCCD4a 26.3 24.7 36.8 36.8 100 97.0 62.9 68.4 63.6 62.9

VsCCD4a 26.5 24.7 36.6 36.6 97.0 100 63.6 69.4 63.9 63.5

VoCCD4c 25.4 24.1 38.0 37.8 62.9 63.6 100 90.9 79.4 75.1

VsCCD4c 24.9 22.7 39.3 39.1 68.4 69.4 90.9 100 81.6 74.9

VoCCD4b 23.9 22.4 36.9 36.7 63.6 63.9 79.4 81.6 100 84.6

VsCCD4b 23.3 21.8 35.6 35.4 62.9 63.5 75.1 74.9 84.6 100

98

Supplementary Table 2.2. Amino acid sequences of the CCDs and lipoxygenases used to construct the phylogenetic tree.

Solanum

lycopersicum

SlCCD1a

Solyc01g087250

MGRKEDDGVERIEGGVVVVNPKPRRGITAKAIDLLEWGIVKLMHDSSKPLHYLQGNFAPTDETPPLNDL

VVQGHLPECLNGEFVRVGPNPKFAPVAGYHWFDGDGMIHGLRIKDGKATYVSRYVRTSRLKQEEFFGGA

KFMKVGDLKGLFGLFTVYMQMLRTKLKVLDISYGNSTANTALVYHHGKLLALSEADKPYALKVLEDGDL

QTLGMLDYDKRLTHSFTAHPKVDAVTGEMFTFGYAHTPPYITYRVISKDGIMQDPVPITIPEPIMMHDF

AITENYAIMMDLPLCFRPKEMVKKNKLAFTFDATKKARFGVLPRYANNEALIRWFELPNCFIFHNANAW

EEGDEVVLITCRLVNPDLDMVNGAVKEKLENFCNELYEMRFNMKSGAASQKKLSESAVDFPRINENYTG

RKQRYVYGTTLNSIAKVTGVIKFDLHAEPETGKSQLEVGGNVQGIFDLGPGRFGSEAVFVPSRPGTERE

EDDGYLIFFVHDENTGKSAVNVIDAKTMSAEPVAVVELPKRVPYGFHAFFVTEEQIQEQAKL

SlCCD1b

Solyc01g087260

MGMNEEDGVARIEGVVVVDPKPQNGVAAKAIDWVEWAIIKLMNDSTKPLPFLQGNFAPTDETPPLKNLP

VIGHLPECLNGEFVRVGPNPKFAPVAGYHWFDGDGMIHGLQIKDGKATYVSRFVRTSRLKQEEFFGGAK

FMKIGDLKGLFGLFSVYIYMLREKLKVLDTSYGNGTANTAMIYHHGKLLALHEGDKPYVVKILEDGDLQ

TLGMLDYDKRLQHSFTAHPKVDPVTGEMFTFGYSQTPPFATYRVISKDGVMQDPVPITIPASVMMHDFA

ITENYAIMMDLPLYFRPKEMVKNKQLAYSFDPTKKARFGVLPRYAKNESLIKWFELPNCFIFHNANAWE

EGDDVVLITSRLQNPDLDAIKGTEKEEQRDGFTNELYEMRFNMKNGVASQKKLSEAAVDFPRINENYTG

RKQRYVYGTILNNVAQITGVVKFDLHAEPETGKTKLEVGGNVPGIFDLGPGRFGSEAIFVPRQPGTECE

EDDGYLILFVHDENTGKSSVNVIDAKTMSAEPVAVVELPKRVPFGFHAFFVTEEQIQEQAKM

SlCCD4a

Solyc08g075480

MNALSSTFLSTLPQHPKSILSFNNNNYYYYSRNTSSFTLKVFSIGDEKSIPSPPKRAQIPSRKPSLPSN

IFNAFDDFVNTYIDPPRKSYVDPKYVLSNNFAPVDELPPTECEVVEGSLPPCLDGAYIRNGPNPQYLPR

GPYHLFDGDGMLHSIKISQGKATFCSRFVKTYKYNIENEAGFQIIPNVFSGFNGIIPSVTRGAITLARI

ITRQFNPADGIGLANTSLALFGGKLFALGESDLPYAVKITSDGDIITLGRHNFNGKLVWGMTAHPKIDP

DTNEAFAYRYGPFPPFLIYFRVDPNGIKTADVPIFSIKRPTLFHDIAITKKYAIFSDIQIGMNPIKFIL

AGGSPVGINSRKISRLGVIPRYAKGESEMRWFDVPGFNNLHAINAWEEDGGDTIVLIAPNILSVEHTLE

RMDMIHGCVEKVKINLNSGVVSRHPISTRNLDFGVINPTYVGKKNKYVYAAIGYPPPKLSGIVKLDVSI

AEVDRRDCIVACRTFGEGCFCGEPFFVAKNNLGANEDDGYVMLYVHNEKTEESNFLVMDATSPNLDIVA

NVKLPRRVPYGFHGIFVRESDLNML

SlCCD4b

Solyc08g075490

MDALSSTFLSTLSQNPKSLLSPYNNNNNNYHYYSPTLKVFSVRIEERPQTTTTITKPQEKSTPSPPKPS

PKREPIPSRKPIEPSFPSFIFNAFDDFVNTFIDPPRKSSVDPRYVLSNNFAPVDELPPTECEVVEGSLP

PCLDGAYIRNGPNPQYLPRGPYHLFDGDGMLHSIKISQGKATLCSRFVKTYKYNIENEAGSPIIPNVFS

99

GFNGLTASAARGALTAARAIAGQFNPANGIGLANTSLALFGGKLFALGESDLPYEVKIAPNGDIFTLGR

HDFNGKLSMSMTAHPKIDHETNEAFAFRYGPIPPFITYFRVNPDGTKTQDVPIFSMTRPSFLHDFAITK

KYAIFSDIQIGMNPIDLLTGGSPVGTDSGKIPRIGVIPRYAKDESEMRWFDVSGFNIVHAINAWDEDGG

DTIVLIAPNILSVEHTLERMDMIHASVEKVKINLKTGMVSRHPISTRNLDFGVINPAYVGKKNKYVYAA

IGGPMPKVIGIAKLDVSVAEIDRRDCIVACRIFGKDCYGGEPFFVPKNPSIDEDDGYVVSYVHNEKTGE

SNFLVMDATSPNLDIVANVKLPRRVPYGFHGLFVSENDLMKL

SlCCD7

Solyc01g090660

MDLQFVSLPPNSKTKAKMQAKACHNINNIPPKLLPPAKLPSTVAMSPSQLTLPSHVARAITITTSPTHE

VYTPEIDDTVTAYWDYQFLFVSQRSEATEPVSLRVVEGSIPSDFPSGTYYLTGPGLFADDHGSTVHPLD

GHGYLRTFEIDGSTGQVKFMARYIETEAQTEERDPVSGKWRFTHRGPFSVLKGGKMVGNTKVMKNVANT

SVLQWGGRLFCLWEGGDPYEIDSKTLNTLGKFELIKNSDQVLEDKKISHSDFLDVAAQLLKPILYGVFK

MSPKRLLSHYKIDTRRNRLLIMSCNAEDMLLPRSNFTFYEFDSNFQLLQSQEFEIPDHLMIHDWAFTDT

HYILFGNRIKLDIPGSMTAVCGLSPMISALSVNPSKPTSPIYLLPRFRNNNVERDWRKPIEAPSQMWVL

HVGNAFEEIDEQNGNLNIQIQASGCSYQWFNFQKMFGYDWQSGKLDPSMMNVEEGEEKLLPHLVQVCIN

LDKKGNCTKCSVNDLNPEWNKAADFPAMNPEFSGRKNRYIYAATCTGSRQALPHFPFDAVVKLNAVDKS

VQKWSAGRRRFIGEPVFIPRGTNKEDDGYLLVVEYAVSTQRCYLVILDAQKIGEKNEVVARLEVPRHLN

FPLGFHGFWAPTNSSLANLQKIESKCKNSWSMMKDNMVKLGQ

SlCCD8

Solyc08g066650

MASLASSTTKIYCNKILPDMFDHGKHESHLGSKLKNNEKNKKKLDLKLVTKVASQLPVIVPPPDQEVIS

KEKKLAAWTSVRQERWEGELVVEGELPLWLNGTYLRNGPGQWHIGDYNFRHLFDGYATLVRLHFENGRL

IMGHRQIESDAYKAAKISKKICYREFSEVPKVDNFLSYIGDMAKLLSGASLTDNANTGVVKLGDGRVVC

LTETIKGSIVIDPNTLDTIGKFEYSDSLGGLIHSAHPVVTDSEFITLIPDLMNPGYTVVRMEAGTNERK

YIGRVSCRGGPAPGWVHSFPVTENYVIVPEMSLRYCAKNLLKAEPTPLYKFEWHPDSKAFVHVMCKASG

NIVASVEVPLYVTFHFINGYEEKDEDGRVTAVIADCCEHSADTTILDKLRLENLRSFNGKDVLPDARVG

RFRIPLDGSPYGELEAALDPNEHGKGMDMCSMNPAYLGKKYRYAYACGAKRPCNFPNTLTKIDLFDKKA

KNWYDEGAVPSEPFFVARPGATEEDDGVVISMISDKNGEGYALILDGSTFEEIARAKFPYGLPYGLHGC

WVPKI

SlCCD-like

Solyc08g066720

MAFCSYTCKVNCFFQRPSVPSKVEDLKDSISSALKPFSRDLVHFSIVADIPKAVKETSIKLLDAFVDSV

FEFVDQPLLPSQSNFAPVDEIGEAVVVTTVEGKIPDDFPEGVYIRNGSNPLFGGLKSTKSIFGKSSHVW

IEGEGMLHALYFTREKGRGTWNIFYNNKHVQTDTFKMEIHRKKPGFLPAIEGDSPAILMAYILNVLRFG

VENKYLSNTNIFEHSKKYYSIAENHLPQEIDIYSLETLGNWNVNGAWNRPFTSHPKKAPGASELVIMGI

YPRKPYFEIGVISADGKKMVHKVDLKFNRCSLCHDMGVTERYNVIMDFPLTIDINRLIRGDSLIKYDKD

100

GYARIGVMPRYGDANSVRWFDVQPSCVFHLINCFEDNDEVVVRGCRARESVLPRPGSKDEKYKRFFEES

EETSSTKINNESLEESFFYRVCEWRLIMRTGEVKEKNVITNFFMEFPMINEKFIGLKNKFCYLQVVDIE

ASSISDGLVKYGGLAKFQFEDDMELIKVEYHMLAEGNFCSGTTFVPKPQGVDEDDGWLVTFLHNENTNV

SHVYIVDA KKFATHPITTITLPSRVPYGFHGAFMPL

Arabidopsis

thaliana

AtCCD1

AT3G63520

MAEKLSDGSSIISVHPRPSKGFSSKLLDLLERLVVKLMHDASLPLHYLSGNFAPIRDETPPVKDLPVHG

FLPECLNGEFVRVGPNPKFDAVAGYHWFDGDGMIHGVRIKDGKATYVSRYVKTSRLKQEEFFGAAKFMK

IGDLKGFFGLLMVNVQQLRTKLKILDNTYGNGTANTALVYHHGKLLALQEADKPYVIKVLEDGDLQTLG

IIDYDKRLTHSFTAHPKVDPVTGEMFTFGYSHTPPYLTYRVISKDGIMHDPVPITISEPIMMHDFAITE

TYAIFMDLPMHFRPKEMVKEKKMIYSFDPTKKARFGVLPRYAKDELMIRWFELPNCFIFHNANAWEEED

EVVLITCRLENPDLDMVSGKVKEKLENFGNELYEMRFNMKTGSASQKKLSASAVDFPRINECYTGKKQR

YVYGTILDSIAKVTGIIKFDLHAEAETGKRMLEVGGNIKGIYDLGEGRYGSEAIYVPRETAEEDDGYLI

FFVHDENTGKSCVTVIDAKTMSAEPVAVVELPHRVPYGFHALFVTEEQLQEQTLI

AtCCD4

AT4G19170

MDSVSSSSFLSSTFSLHHSLLRRRSSSPTLLRINSAVVEERSPITNPSDNNDRRNKPKTLHNRTNHTLV

SSPPKLRPEMTLATALFTTVEDVINTFIDPPSRPSVDPKHVLSDNFAPVLDELPPTDCEIIHGTLPLSL

NGAYIRNGPNPQFLPRGPYHLFDGDGMLHAIKIHNGKATLCSRYVKTYKYNVEKQTGAPVMPNVFSGFN

GVTASVARGALTAARVLTGQYNPVNGIGLANTSLAFFSNRLFALGESDLPYAVRLTESGDIETIGRYDF

DGKLAMSMTAHPKTDPITGETFAFRYGPVPPFLTYFRFDSAGKKQRDVPIFSMTSPSFLHDFAITKRHA

IFAEIQLGMRMNMLDLVLEGGSPVGTDNGKTPRLGVIPKYAGDESEMKWFEVPGFNIIHAINAWDEDDG

NSVVLIAPNIMSIEHTLERMDLVHALVEKVKIDLVTGIVRRHPISARNLDFAVINPAFLGRCSRYVYAA

IGDPMPKISGVVKLDVSKGDRDDCTVARRMYGSGCYGGEPFFVARDPGNPEAEEDDGYVVTYVHDEVTG

ESKFLVMDAKSPELEIVAAVRLPRRVPYGFHGLFVKESDLNKL

AtCCD7

AT2G44990

MSLPIPPKFLPPLKSPPIHHHQTPPPLAPPRAAISISIPDTGLGRTGTILDESTSSAFRDYQSLFVSQR

SETIEPVVIKPIEGSIPVNFPSGTYYLAGPGLFTDDHGSTVHPLDGHGYLRAFHIDGNKRKATFTAKYV

KTEAKKEEHDPVTDTWRFTHRGPFSVLKGGKRFGNTKVMKNVANTSVLKWAGRLLCLWEGGEPYEIESG

SLDTVGRFNVENNGCESCDDDDSSDRDLSGHDIWDTAADLLKPILQGVFKMPPKRFLSHYKVDGRRKRL

LTVTCNAEDMLLPRSNFTFCEYDSEFKLIQTKEFKIDDHMMIHDWAFTDTHYILFANRVKLNPIGSIAA

MCGMSPMVSALSLNPSNESSPIYILPRFSDKYSRGGRDWRVPVEVSSQLWLIHSGNAYETREDNGDLKI

QIQASACSYRWFDFQKMFGYDWQSNKLDPSVMNLNRGDDKLLPHLVKVSMTLDSTGNCNSCDVEPLNGW

NKPSDFPVINSSWSGKKNKYMYSAASSGTRSELPHFPFDMVVKFDLDSNLVRTWSTGARRFVGEPMFVP

101

KNSVEEGEEEDDGYIVVVEYAVSVERCYLVILDAKKIGESDAVVSSVNKVYIAKINYIICVHSFYFDRN

IAFHLSHK

AtCCD8

AT4G32810

MASLITTKAMMSHHHVLSSTRITTLYSDNSIGDQQIKTKPQVPHRLFARRIFGVTRAVINSAAPSPLPE

KEKVEGERRCHVAWTSVQQENWEGELTVQGKIPTWLNGTYLRNGPGLWNIGDHDFRHLFDGYSTLVKLQ

FDGGRIFAAHRLLESDAYKAAKKHNRLCYREFSETPKSVIINKNPFSGIGEIVRLFSGESLTDNANTGV

IKLGDGRVMCLTETQKGSILVDHETLETIGKFEYDDVLSDHMIQSAHPIVTETEMWTLIPDLVKPGYRV

VRMEAGSNKREVVGRVRCRSGSWGPGWVHSFAVTENYVVIPEMPLRYSVKNLLRAEPTPLYKFEWCPQD

GAFIHVMSKLTGEVVASVEVPAYVTFHFINAYEEDKNGDGKATVIIADCCEHNADTRILDMLRLDTLRS

SHGHDVLPDARIGRFRIPLDGSKYGKLETAVEAEKHGRAMDMCSINPLYLGQKYRYVYACGAQRPCNFP

NALSKVDIVEKKVKNWHEHGMIPSEPFFVPRPGATHEDDGVVISIVSEENGGSFAILLDGSSFEEIARA

KFPYGLPYGLHGCWIPKD

Osmanthus

fragans

OfCCD1

BAJ05401

MGMQGEDAQRTGNIVAVKPKPSQGLTSKAIDWLEWLFVKMMHDSKQPLHYLSGNFAPVDETPPLKDLPV

TGHLPECLNGEFVRVGPNPKFASIAGYHWFDGDGMIHGMRIKDGKATYVSRYVQTSRLKQEEFFGRAMF

MKIGDLKGMFGLLMVNMQMLRAKLKVLDISYGIGTANTALVYHHGKLLALSEADKPYAIKVLEDGDLQT

IGLLDYDKRLAHSFTAHPKVDPFTGEMFTFGYSHTPPYVTYRVISKDGAMNDPVPITVSGPIMMHDFAI

TENYAIFMDLPLYFKPKEMVKDKKFIFSFDATQKARFGILPRYAKNELLIKWFELPNCFIFHNANAWEE

GDEVVLITCRLENPDLDMVNSTVKERLDNFKNELYEMRFNLQNGLASQKKLSVSAVDFPRVNESYTTRK

QRYVYGTTLDKIAKVTGIIKFDLHAEPETGKEKLELGGNVKGIFDLGPGRFGSEAVFVPRHPGITSEED

DGYLIFFVHDENTGKSAVNVIDAKTMSPDPVAVVELPKRVPYGFHAFFVTEDQLQEQAKV

OfCCD4

ABY60887

MDTLSSSFLPKLHPKYIFSPIPLSPPRTSPHPQPNSLNISSVRIEDKPQTTTTTTTTSRRAAPQPVKKQ

TPPPSPQQTNTRKRPSTPKTRPTEPVSLPTTIFNVVDGFINTFVDPPLRPSVDPRYVLSDNFAPVDELP

PTLCQVVEGSLPTCLNGAYIRNGPNPQFLPRGPYHLFDGDGMLHSIRISDGKATLCSRYVKTYKYKVEN

KNGFSVVPNVFSGFNGLTASAARGALAAARMVAGQFNPVNGIGLANTSLALIGGKLYALGESDLPYAVE

VAQNGDIYTEGRNDFDGKLFMSMTAHPKVDPDTGEAFAFRYGPMRPFLTFFRFNADGTKQPDVPIFSMT

SPSFLHDFAITKKYAIFPEIQIGMNPMEMMAGGSPVGANPGKVPRLGVIPRYAKDESEMKWFDVPGFNI

IHAINGWDEDDGDTIVLVAPNILSVEHTLERMDLIHASVEKVKIDLKTGIVSRHPVSSRNLDFAVINPA

YVGKKNKYVYAAIGDPMPKISGVVKLDVSVSDSDRCDCIVASRLYGESCFGGEPFFVAKEPNNPSAEED

DGYVVSYVHNEKTGESRFLVMDAKSPNLDIVAAVKLPRRVPYGFHGLFVSENDLNKL

Chrysanthemum

x morifolium

CmCCD4a

ABY60885

MGSFPTSLLSTFLRPNSIPFQHQPPRRPLAPPPSLPQPSACHVFSARIEENQPTVTTTRRPKRKWPKKL

ISSTRKHRTKSVKEDQPLPSVIFKVFDDFINNFIDPPLRVSVDPKHVLSHNFSPVNELPPTECEIIEGI

102

LPSCLDGAYFRNGPNPQYLPRGPYHLFDGDGMLHAIRISKGKATFCRRYVKTYKYQTEKDAGSPIFPNV

FSGFNGMTASIARLAVSTGRILMGQFDPTKGIGVANTSIAYFGNKLYALGESDLPYAIKFATNSDIITI

GRDDFDGKLLTNMTAHPKIDPVTKETFAFRYGPGPPFVTFFWFNENGKKQDDVPIFSVISPSFIHDFAI

TKNYAIFPENQIEMSLMGMIGGGSPIRADPRKVARLGVIPRYAKDDSEMKWFEVPGLNVVHCINAWEED

NGDTIVMVAPNILSVEHALERMDLVHASVEKVTMDLKSGMVSRYPLSTWNLDFAVINPAFVSVKNRYIY

CGVGDPMPKISGVVKLDISLSEVDRRECIVASRMFGHGCFGGEPFFVAKEPENPYAGEDDGYIVSYVHN

EITDVSRFVVMDAKSPTLEIVAAVKLPHRVPYGFHGLFVREKDLTTL

CmCCD4b

BAF36656

MDCLSSSFLSTFSPTNSYSSSPPLPTSQPSSSFRVFSVRTEDKLQTVTTTTKRPSDEQVKKHTTPSFNI

EKRSRSVVVDQSLPSTFLNAFDNIINNFIDPPLRVSVDPKHVLSDNFSPVDELPPTECQVIEGTLPSCL

DGAYFRNGPNPQFLPRGPYHLFDGDGMLHAIRISNGKATFCSRYVKTYKYNIEKDAGFPIIPNVLAGFN

GMTASAARMAVLAGRFLAGQYDPTKGIGLANTSLAYFGNKLYALGESDLPYAVKLAPNGDIITTGRHDF

DGKLFMSMTAHPKIDPETKEAFSFRYGPMPPFLTFFRFDQNGEKQPDVPIFSMTSPSFLHDLAITKNYA

IFPEIQIGMSPMEMIGGGSPVSADSGKIPRLGLIPRYAKDESEMKWFEVPGFNVIHCINAWEEDGGDTV

VLVAPNILSVEHTLERMDLIHASIEKVTINLKTGMVSRHPLSTRNLDFAVLNPAFIAVKNRYIYCGVGD

PMPKISGVVKLDVSLSEVDRRECIVASRMFGPGCFGGEPFFVAREPDNPEADEDDGYVISYVHNENTGE

SRFVVMDAKSPTLEIVAAVKLPRRVPYGFHGLFVKESDINKL

Rosa x

damascena

RdCCD1

ABY47994

MAEVVEKRHDDDVKEKLKSNGIVVPNPKPSKGVTSTLVDTVEKLIVKLMYDSSQPHHYLAGNFAPVIEE

TPPTKDLHVIGHLPDCLNGEFVRVGPNPKFAPVAGYHWFDGDGMIHGMRIKDGKATYVSRYVKTSRLKQ

EEYFGGAKFMKVGDLKGLFGLLMVYMQQLRAKLKVLDLSYGHGTGNTAFVYHHGKLLALSEGDKPYVLK

VLEDGDLQTVGLLDYDKRLKHSFTAHPKVDPFTGEMFTFGYSHDPPYVTYRVISKDGFMHDPIPITVPA

PVMMHDFAITENYAIFMDLPLYFRPKEMVKEGKLIFSFDETKKARFGVLPRYAKDDLLIRWFELPNCFI

FHNANAWEEEDEVVLMTCRLENPDLDMVNGPIKKKLDNFKNELYEMRFNLKTGLATQKKLSESAVDFPR

VNESYTGRKQRYVYGTTLDSIAKVTGIVKFDLHAAPEIGKTKIEVGGNVQGLYDLGPGRFGSEAIFVPR

VPGITSEEDDGYLIFFVHDENTGKSAIHVLDAKTMSGDPVAIVELPHRVPYGFHAFFVTEEQLQEQAKF

RdCCD4

ABY60886

MDALSSSFLSTLPTRSSTTAAPKLTPTKSLNISSVRIEERPTTQTPPKTTTPQPPPKQTPPPPPPSYSS

PPPTKPNAPALPAVIFNLFDDFINNFVDPPVRSSVDPKQALSGNFAPVTELPPTECQVIKGSLPSALDG

AYIRNGPNPQYLPRGPYHLFDGDGMLHSIRISQGRAVLCSRFVKTYKYTVERDAGFPLLPNVFSGFNGL

TASATRGALSAARVASGLYNPANGIGNANTSLAFFGDRLYALAESDLPYAVRLTADGDVETVGRNDFNG

ELFISMTAHPKIDPDTGETFAFRYGPVPPFLTYFRFDPTGAKQPDVPVFSLTSPSMLHDFAITKKYAVF

ADIQIGMNPMEMIGGGSPVGLDASKVSRIGIIPKYAKDDSEMRWFEVPGFNIMHAVNAWDEDDAVVMVA

103

PNILSAEHTLERMELVHALVEKVRIDLKTGIVSRQPISTRNLDFAVINPAYQGKKNRFVYAGVGDPMPK

ISGVVKLDVSGDEHKESIVASRMYGQGCFGGEPFFVARDPENPEAEEDDGYVVSYVHDEKTGESRFLVM

DAKSSELETVAEVKLPRRVPYGFHGLFVRESDLKKL

Crocus sativus CsCCD1

Q84KG5

MGEVAKEEVEERRSIVAVNPQPSKGLVSSAVDLIEKAVVYLFHDKSKPCHYLSGNFAPVVDETPPCPDL

PVRGHLPECLNGEFVRVGPNPKFMPVAGYHWFDGDGMIHGMRIKDGKATYASRYVKTSRLKQEEYFEGP

KFMKIGDLKGFFGLFMVQMQLLRAKLKVIDVSYGVGTGNTALIYHHGKLLALSEADKPYVVKVLEDGDL

QTLGLLDYDKRLSHSFTAHPKVDPFTDEMFTFGYAHTPPYVTYRVISKDGVMRDPVPITIPASVMMHDF

AITENYSIFMDLPLYFQPKEMVKGGKLIFSFDATKKARFGVLPRYAKDDSLIRWFELPNCFIFHNANAW

EEGDEVVLITCRLENPDLDMVNGAVKEKLENFKNELYEMRFNMKTGAASQKQLSVSAVDFPRINESYTT

RKQRYVYGTILDNITKVKGIIKFDLHAEPEAGKKKLEVGGNVQGIFDLGPGRYGSEAVFVPRERGIKSE

EDDGYLIFFVHDENTGKSEVNVIDAKTMSAEPVAVVELPNRVPYGFHAFFVNEEQLQWQQTDV

CsCCD4a

ACD62476

DYRLSSSSLFHFPSPGNRIFLKQSQVLAFQNQPSHQDHPTTKKKSISINKGGSISRNRSLAAVFCDALD

DLITRHSFDPDALHPSVDPHRVLRGNFAPVSELPPTPCRVVRGTIPSALAGGAYIRNGPNPNPQYLPSG

AHHLFEGDGMLHSLLLPSSEGGRAAIFSSRFVETYKYLVTAKSRQAIFLSVFSGLCGFTGIARALVFFF

RFLTMQVDPTKGIGLANTSLQFSNGRLHALCEYDLPYVVRLSPEDGDISTVGRIENNVSTKSTTAHPKT

DPVTGETFSFSYGPIQPYVTYSRYDCDGKKSGPDVPIFSFKEPSFVHDFAITEHYAVFPDIQIVMKPAE

IVRGRRMIGPDLEKVPRLGLLPRYATSDSEMRWFDVPGFNMVHVVNAWEEEGGEVVVIVAPNVSPIENA

IDRFDLLHVSVEMARIELKSGSVSRTLLSAENLDFGLIHRGYSGRKSRYAYLGVGDPMPKIRGVVKVDF

ELAGRGECVVARREFGVGCFGGEPFFVPASEGSGGEEDDGYVVSYLHDEGKGESSFVVMDARSPELEVV

AEVVLPRRVPYGFHGLIVTEAELLSQQ

CsCCD4b

ACD62477

MEYRLSSSLFHFPSPGNRIFLKHYPSHQDHPITKKKSISINKGGSISRNRSLAAVFCDALDDLITRHSF

DPDALHPSVDPHRVLRDNFAPVSELPPTPCRVVRGTIPSALAGGAYIRNGPNPNHLPSGAHHLFEGDGM

LHSLLLPSSEGGRAAIFSSRFVETYKYLVTAKSRQAIFLSVFSGLCGFTGIARALVFFFRFLTMQVDPT

KGIGLANTSLQFSNGRLHALCEYDLPYVVRLSPEDGDISTVGRIENNVSTKSTTAHPKTDPVTGETFSF

SYGPIQPYVTYSRYDCDGKKSGPDVPIFSFKEPSFVHDFAITEHYAVFPDIQIVMKPAEIVRGRRMIGP

DLEKVPRLGLLPRYATSDSEMRWFDVPGFNMVHVVNAWEEEGGEVVVIVAPNVSPIENAIDRFDLLHVS

VEMARIELKSGSVSRTLLSAENLDFGLIHRGYSGRKSRYAYLGVGDPMPKIRGVVKVDFELAGRGECVV

ARREFGVGCFGGEPFFVPASEGSGGEEDDGYVVSYLHDEGKGESSFVVMDARSPELEVVAEVVLPRRVP

YGFHGLIVTEAELLSQQ

104

Viola odorata VoCCD4a MVMVMDTLSSSFLSATPPSSNLLSSTSSTTASHSSSRLPLLRISSVRVEEKPTNPSPPKPTTSKTPLIS

PPTKPAPPKITAKNGRRRTDPPSITTSIFSALDDVINNFVDPPLRPSVDPKYILADNFAPVDELPPTPC

EVVQGNLPPCLDGAYIRNGPNPQYLPRGPYHLFDGDGMLHSIRISQGEATLCSRYVKTYKYETELRAGV

PIFPNVFSGFSGLTASAARGAVTAARVLAGEFNPVNGIGLANTSLAFLGNRLYALGESDLPYQIRLTPN

GDIETLGRDDFDAKLTMSMTAHPKIDPKTGEAFAFRYGPIPPFLTYFRFDSNGKKQQDVPIFSMTSPSF

LHDFAITEKYAIFTDIQIGMNPLEMIFRGGSPVATNPAKVPRIGVIPKYATDESAMKWFDVSGFNVIHA

INAWDEEDAIVLLAPNILSVEHTLERMELVHALVEKVRIDFKTGLVTRNPVSARNLDFAVINPSFLGKK

NSFVYAAVGDPMPKITGVVKLDVSGGARRECTVASRMYGPRCYGGEPFFVAREPENPEAEEDDGYLVSY

VHDEINGESKFLVMDAKSPKLEIVAAVKLPRRVPYGFHGLFVRESDLRKL

VoCCD4b MAMPKYIGALPHSLPSVRLPIRSAHSSSCSSTKFNGIGGAKPPIRQTLPMLALNALDAFTNKYIDSPSQ

PSMDPEHVLRDNFAPVDELPPTECELIEGSLPPCLDGAYIRNGPNPQHVIPERPYHLFDGDGMLHSIRI

SKGKATLCSRYVKTYKYNMERRAGVPIIPSVLCGFNSPIVSVTRITLLLARILAGHFNLANGIGVANTS

LAFVGNHLYALGESDLPHTVRLTSNGDIETLGRETFGGKLVTCMTAHPKHDTESGEVFAFRYSRIYPFI

TYFRFDADGNKQPDVPIHTFARPPFSHDFAITSKFALFMDVQISVNPLKMILGRGSAITYDLDRVSRLG

LIPRYATDDSGMKWFDMPGFNPVHTINAWDEEDSIVMLAPNVHPIQHSLERMELIHNSLNKVRIDLKTG

KATRHTVSTRNLDFAIINPAYLGKKNRFVYAAIGDPMPMMSGVVKLDVSKGQNQDCTVGCRMYGPRCYG

GEPFFVAREPDNPDSEEDDGYLLSYVHDEIAGESRFLVMDAKSEELDIVAVVKLPRRVPYGFHGLFVRE

SDLKKL

VoCCD4c MAISKYIGALQHSLPSSFGAPPFHLLSISNSIQEKVPLASPLKPTHSAYSSSSSAEASKYNATGGSKQL

GRQTLPMLVLNALDDLTNMYIERPPRRAVDPEHVLQDNFAPVDELPPTECELIEGSLPPCLDGVYIRNG

PNPQHIIPQRPYHLFDGDGMLHSIRISRGKATLCSRYVKTNKYNMERHAGVPIIPSVFCGFNGLAVTIT

RIALLLARILVGHYSPANGIGTANTSLALFGNRLYALGESDLPYAVRLTANGDIETLGRQNFGGKLVNC

MTAHPKRDVETGEVFAYRFSPMPPFLTYFHFDADGDKQPDVPIFSIARPSLLHDFAITNKYAVFTATQI

GINPLKMFGRGSAACFDSTKVPKLGLIPRYAADESEMKWFDMPGFNPLHTVNAWDEEEGIVVLAPNVKP

IQHSLERMELLQNSLDEVRIDLKTGKATRHPVSTRNLDFAVINPAYLGKKNRFVYAAIGDPMPKMSGVV

KLDVSKGQNQDSTIGCRMYGPRCYGGEPFFVAREPDNPDSEEDDGYLLSYVHDEMAGESRFLVMDAKSE

NLDIVAVVKLPRRVPYGFHGLFVRESDLKRL

VoCCD1 MAEKSEMEKKQANGGEGGPAVVEVKPKPNKGLTSKLIDYLEKLIVKLMYDTSQAQHYLSGNFAPVPDEA

APIKDLPVKGHLPECLNGEFVRVGPNPKFSPVAGYHWFDGDGMIHGLRIKDGKATYVRRYVRTSRLKQE

EFFGGAKFMKVGDLKGFFGLFMVNMQILRAKFKVLDMSYGHGTGNTNLIYHHGKLLALQEADKPYVVKV

MEDGDLQTIGLLDYDKRLNHSFTAHPKVDPFTGEMFTFGYSHEPPYITYRVVSKDGFMHDPVPITISGP

105

IMMHDFAITENYAIFLDLPMYFKPKEMVKEKKLIFSFDETKKARFGVLPRYAKDELMIRWFELPNCFIF

HNANAWEEGDEIVLITCRLNKPDLDMVSGAIKEKLESFTNELYEMRFNMKTGEASQKQLSASTIDFPRV

NESYTGRKQRYVYGTILDSITKVVGVAKFDLHAEPEPGKTKVEVGGNVKGVFDLGPGRFGSEAVFVPRE

PGITSEEDDGYLIFFAHDENTGKSSVNVIDAKTMSPDPVAVVELPHRVPFGFHAFFVTEEQLQEQAK

VoCCD1-like MASSIPMHKGFQLTCCMKRSSILKTTEQSTKFKPLMRRLQEFNVGISKSMKNTSIKLLDAVADSMFQFV

DQPLLPGQENLAPVDELKEAVVLSSIEGEIPNHFPTGVYIRNGPNPIFGGLKSAVSIFGRTNTIWVEGD

GMLHALYFIKSDGGAGWSLVYKNKQVESETLTIEKQRNKPSFIPAAEGNTAATIAAVFLNLLRYGRVTK

FISNTNVFEHAGKFYSIAENEIPQEIDILTLKTFGNWDINGNWKRPFTSHPKKAPETGELVIIGVRIIK

PFLELGIISADGKRLVHKVDLKLNRCTLSHEIGLTQRYNVIIDFPLTLDVFRVLMGGPLFKYKKEEYAR

IGIMPRYGDAESIQWFDVKTCCSFHFVNFFEDGNEVVVRGCRAHDSIIPGPEVGDDKVEWFRRRSKPVL

ESDEENENTLHQSLFTRCYEWRLNMETGEVKERYLTGTDFSLDFPMINDDFASVRNKYGYTMVVDFDSS

CSAAAGKFGGLAKLHFEEQDTDNTNLIKVEYHKFEKNTFCSGATFVPKPGGIEEDDGWIITYVHNEDTD

ISKAYIIDTKKFCSEPVAEIGLPCRVPYGFHGTFMPIPLSKL

Viola

septentrionalis

VsCCD4a MQACKIHSLKPRKVTVNHLFPPVVPVLSSPLLLQGSKLQQKTPLIMVMVMVMDTLSSSFLSATSPSSNL

LSSTSTTTASHSSSRLPLLRISSVRIEEKPKNPSPPKPTTSKTPLISPRIKPTPPKITAKNGRRRTDPP

SITTSIFSALDDVINNFVDPPLRPSVDPKYILADNFAPVDELPPTPCEVVQGNLPPCLDGAYIRNGPNP

QYLPRGPYHLFDGDGMLHSIRISQGEATLCSRYVKTYKYETELRAGVPIFPNVFSGFSGLTASAARGAV

TAARVLAGEYNPVNGIGLANTSLAFLGNRLYALGESDLPYQIRLTPNGDIETLGRDDFDAKLTMSMTAH

PKIDPKTGEAFAFRYGPIPPFLTYFRFDSNGKKQPDVSIFSMISPSFLHDFAITEKYAIFTDIQIGMNP

LEMIFGGGSPVAANPAKVPRIGVIPKYATDESAMKWFDVSGFNVIHVINAWDEEDAIVMLAPNILSVEH

TLERMELVHALVEKVRIDLKTGLVTRNPVSARNLDFAVINPSFLGKKNRFVYAAVGDPMPKITGVVKLD

VSGGARRECTVASRMYGPKCYGGEPFFVAREPENPEAEEDDGYLVSYVHDEINGESKFLVMDAKSPKLE

IVAAVKLPRRVPYGFHGLFVRESDLRKL

VsCCD4b MAMPKYIGASPLSLPSISNSIQDKVPLASPVRPIHSARSSSCFSLSSSKINEAGPPTRQTLPMLLLNAL

DAFTNKYIDSPSQPSMDPEHVLSDNFAPVDELPPTECELIEGSLPPCLDGAYIGNGPNPQHVIPERPYH

LFDGDGMLHSIRISKGKATLCSRYVKTYKYNMESRAGVPIIPSVFCGFNGPFVSITRVTLLLARILASH

YNLTNGIGVANTSLAFFGNHLYALWESDLPYTVRLTSNGYIETLGRETFGGKLVTSMTAHPKHITETGE

VFAFRTSCMYPFITYFRFDSDGNKQPDVPIHTFGHPPLSHDFAITRKFALFMDAQISINPLKMILGQGS

AISYDLGRVSRLGVIPCYAKDDSKMKWFDMPGFNSIHIINAWDEEEGIVVLASNVLQIHHGLERMELSH

MLMEKVRIELKTGIITRHPFSTQNLDFAVINPAYLGKKNRFVYAALGDPMPRISGVVKLDVSKGKNQEC

106

TVATRMYGPRCYGGEPFFVAREPDNPDSSEDDGYLMSYVHDEIAGESRFLVMDAKSENLDIVAVVKLPR

RVPYGFHGLFVRESDLKKL

VsCCD4c MLHSIRISRGKVTLCSRYVKTNKYIMECRAGVPIIPSVFCGFNGLAVSITRIALLLARLLVGHYSPADG

IGTANTSLALFGNHLYALGESDLPYAVRLTSHGDIDTLGRQNFGGKLEKCMTAHPKQDVETGEVFAFRF

SPMRPFLTYFRFDADGNKLPDVPIFSIARPSFLHDFAITNKYAVFTATQLGINPLKMFGRGSAACFDST

KVPKLGLIPRYAVDESEMKWFDMPGFNPLHTINAWDEEDGIVMLAPNVHPIQHSLEQMELLENSLDKVR

IDLKTGKATRHPISTRNLDFAMINPAYLGKKNRFVYAAIGDPMPKMAGVVKLDVSKGQNQDCTVGCRIY

GPRCYGGEPFFVAREPDNPDSEEDDGYLLSYVHDEKTGESRFLVMDAKSEELDIVAVVKLPRRVPYGFH

GLFV

VsCCD1 MAEKSEMEKKQANGGEGGPAVVEVKPKPNKGLTSKLIDYLEKLIVKLMYDTSQAQHYLSGNFAPVPDEA

APIKDLPVKGHLPECLNGEFVRVGPNPKFSPVAGYHWFDGDGMIHGLRIKDGKATYVRRYVRTSRLKQE

EFFGGAKFMKVGDLKGFFGLFMVNMQILRAKFKVLDMSYGHGTGNTNLIYHHGKLLALQEADKPYVVKV

MEDGDLQTIGLLDYDKRLNHSFTAHPKVDPFTGEMFTFGYSHDPPYITYRVVSKDGFMHDPVPITISGP

IMMHDFAITENYAIFLDLPMYFKPKEMVKEKKMIFSFDETKKARFGVLPRYAKDELMIRWFELPNCFIF

HNANAWEEGDEIVLITCRLNKPDLDMVSGAIKEKLESFTNELYEMRFNMKTGEASQKQLSASTIDFPRV

NESYTGRKQRYVYGTILDSITKVVGVAKFDLHAEPEPGKTKVEVGGNVKGVFDLGPGRFGSEAVFVPRE

PGITSEEDDGYLIFFAHDENTGKSSVNVIDAKTMSPDPVAIVELPHRVPFGFHAFFVTEEQLQEQAKL

VsCCD1-like MASSIPMHKGFQLTCCMQRPSILKTTEQSTNFKPLLRRLQEFNVGIGLDSISKSMKNTSIKLLDAVADS

MFQFVDQPLLPGQENLAPVDELKEAVVLTSIEGEIPHDFPTGVYIRNGPNPTFGGLKSAVSIFGSTSTI

WVEGDGMLHALYFIKSDGGAGWSLVYKNKQVESETLTIEKQRNKPSFIPAAEGNTAATIAAAFLNLLRY

GRVTKFISNTNVFEHAGKFYSIAENEIPQEIDILTLKTLGNWDINGNWKRPFTSHPKKAPETGELVIIG

VRIIKPFLELGIISADGKRLVHKVDLKLNRCTLSHEVGLTQRYNVIIDFPLTLDVYRVLMGGPLFKYKK

EDYSRIGIMPRYGDAESIQWFDVKTCCSLHFVNFFEDGNEVVVRGCRAHDSIIPGPEVGDDKVEWFRRR

SKPVLESDEENENTRHESLFTRCYEWRLNMETGEVKERYLTGTDFSMDFPMINDDFTSVANKYGYTMVV

DFDSSCSAAAGKFGGLAKLHFEEQDTDNTNLIKVEYHKFEKNTFCSGATFVPKPGGIEEDDGWII

Solanum

lycopersicum

TomloxA

Solyc08g014000

NC_015445.3

MLGQLVGGLIGGHHDSKKVKGTVVMMKKNALDFTDLAGSLTDKIFEALGQKVSFQLISSVQSDPANGLQ

GKHSNPAYLENFLLTLTPLAAGETAFGVTFDWNEEFGVPGAFVIKNMHINEFFLKSLTLEDVPNHGKVH

FVCNSWVYPSFRYKSDRIFFANQPYLPSETPELLRKYRENELVTLRGDGTGKREAWDRIYDYDVYNDLG

NPDQGKENVRTTLGGSADYPYPRRGRTGRPPTRTDPKSESRIPLILSLDIYVPRDERFGHLKMSDFLTY

ALKSIVQFILPELHALFDGTPNEFDSFEDVLRLYEGGIKLPQGPLFKALTDAIPLEMIRELLRTDGEGI

107

LRFPTPLVIKDSKTAWRTDEEFAREMLAGVNPVIISRLEEFPPKSKLDPELYGNQNSTITAEHIEGKLD

GLTIDEAINSNKLFILNHHDVLIPYLRRINTTTTKTYASRTLLFLQDNGSLKPLAIELSLPHPDGDQFG

VTSKVYTPSDQGVEGSIWQLAKAYVAVNDSGVHQLISHWLNTHAVIEPFVIATNRQLSVLHPIHKLLYP

HFRDTMNINALARQILINAGGVLESTVFPSKFAMEMSAVVYKDWVFPDQALPADLVKRGVAVEDSSSPH

GVRLLIDDYPYAVDGLEIWSAIKSWVTDYCSFYYGSNEEILKDNELQAWWKEVREVGHGDKKNEPWWAE

METPQELIDSCTTIIWIASALHAAVNFGQY

PYAGYLPNRPTVSRKFMPEPGTPEYEELKKNPDKAFLKTITAQLQTLLGVSLIEILSRHTTDEIYLGQR

ESPEWTKDKEPLAAFERFGNKLTDIEKQIMQRNGNNILTNRTGPVNAPYTLLFPTSEGGLTGKGIPNSV

SI

TomloxB

Solyc01g099190

NC_015438.3

MSLGGIVDAILGKDDRPKVKGRVILMKKNVLDFINIGASVVDGISDLLGQKVSIQLISGSVNSDGLEGK

LSNPAYLESWLTDITPITAGESTFSVTFDWDDEFGVPGAFIIKNFHLNEFFLKSLTLEDVPNYGKIHFV

CNSWVYPAFRYKSDRIFFANQAYLPSETPQPLRKYRENELVALRGDGTGKLEEWDRVYDYACYNDLGDP

DKGEEYARPILGGSSEYPYPRRGRTGREPTKADPNCESRNPLPMSLDIYVPRDERFGHVKKSDFLTSSL

KSSLQTLLPAFKALCDNTPNEFNSFADVLNLYEGGIKLPEGPWLKAITDNISSEILKDILQTDGQGLLK

YPTPQVIQGDKTAWRTDEEFGREMLAGSNPVLISRLQEFPPKSKLDPTIYGNQNSTITTEHVQDKLNGL

TVNEAIKSNRLFILNHHDIVMPLLRKINMSANTKAYASRTLLFLQDDRTLKPLAIELSLPHPDGDQFGT

VSKVYTPADQGVEGSIWQFAKAYVAVNDMGIHQLISHWLNTHAVIEPFVIATNRHLSVLHPIHKLLHPH

FRNTMNINALARETLTYDGGFETSLFPTKYSMEMSAAAYKDWVFPEQALPADLLKRGVAVEDLSSPHGI

RLLILDYPYAVDGLEIWAAIKSWVTEYCKFYYKSDETVEKDTELQAWWKELREEGHGDKKDEAWWPKLQ

TRQELRDCCTIIIWIASALHAALHFGLYSY

AGYLPNRPTLSCNLMPEPGSVEYEELKTNPDKVFLKTFVPQLQSLLEISIFEVSSRHASDEVYLGQRDS

IEWTKDKEPLVAFERFGKMLSDIENRIMIMNSHKSWKNRSGPVNVPYTLLFPTSEEGLTGKGIPNSVSI

TomloxC

Solyc01g006540

NC_015438.3

MLKPQFQQSTKTLIPSWNTNTLFLASFPINILNKNFILKKKNNFRVHHNYNGANTIKAVLNSTQKSIGV

KAVVTVQKQVNLNLLRGLDGIGDLLGKSLILWIVAAELDHKTGLEKPSIRSYAHRGLDVDGDTYYEAVF

EIPEDFGEVGAILVENEHHKEMYVKNIVIDGFVHGKVEITCNSWVHSKFANPDKRIFFTNKSYLPSQTP

SGVIRLREEELVTLRGDGVGERKVFERIYDYDVYNDLGEVDSNNDDAKRPILGGKKLPYPRRCRTGRQR

SKKDPLYETRSTFVYVPRDEAFSAVKSLTFSGNTVYSALHAVVPALESVVSDPDLGFPHFPAIDSLFNV

GVDLSGLSDKKSSLFNIVPRLIKSISETGKDVLLFESPQLVQRDKFSWFRDVEFARQTLAGLNPYSIRL

VTEWPLRSNLDPKVYGPPESEITKELIENEIGNNMTVEQAVQQKKLFILDYHDLLLPYVNKVNELKGSV

LYGSRTIFFLTPHGTLKPLAIELTRPPIDDKPQWKEVYSPNNWNATGAWLWKLAKAHVLSHDSGYHQLV

108

SHWLRTHCCTEPYIIATNRQLSAMHPIYRLLHPHFRYTMEINALAREALINANGIIESSFFPGKYSVEL

SSIAYGAEWRFDQEALPQNLISRGLAEEDPNEPHGLKLAIEDYPFANDGLVLWDILKQWVTNYVNHYYP

QTNLIESDKELQAWWSEIKNVGHGDKKDEPWWPELKTPNDLIGIITTIVWVTSGHHAAVNFGQYSYGGY

FPNRPTTARSKMPTEDPTAEEWEWFLNKPEEALLRCFPSQIQATKVMTILDVLSNHSPDEEYIGEKIEP

YWAEDPVINAAFEVFSGKLKELEGIIDARNNDSKLNNRNGAGVMPYELLKPYSEPGVTGKGVPYSISI

TomloxD

Solyc03g122340

NM_001320292.1

MALAKEIMGISLLEKSSSMALLNPNNYHKENHLWFNQQFQGRRNLSRRKAYRQSTMAAISENLVKVVPE

KAVKFKVRAVVTVRNKNKEDLKETIVKHLDAFTDKIGRNVALELISTDIDPDTKGPKKSNQAVLKDWSK

KSNLKTERVNYTAEFIVDSNFGNPGAITVTNKHQQEFFLESITIEGFACGPVHFPCNSWVQPKKDHPGK

RIFFSNQPYLPDETPAGLKSLRERELRELRGDGKGVRKLSDRIYDYDIYNDLGNPDRGIDFARPKLGGE

GNVAYPRRCRSGRVPTDTDISAESRVEKPNPTYVPRDEQFEESKMNTFSTSRLKATLHNLIPSLMASIS

SNNHDFKGFSDIDSLYSKGLLLKLGLQDEVLKKLPLPKVVSTIKEGDLLKYDTPKILSKDKFAWLRDDE

FARQAIAGVNPVSIEKLQVFPPVSKLDPEIYGPQESALKEEHILGHLNGMTVQEALDANKLFILDHHDV

YLPFLDRINALDGRKAYATRTIYFLSDVGTLKPIAIELSLPQTGPSSRSKRVVTPPVCATGNWMWQIAK

AHVCANDAGVHQLVNHWLRTHASLEPFILAAHRQLSAMHPIYKLLDPHMRYTLEINGLARQSLINADGV

IEACFTPGRYCMEISAAAYKNWRFDLEGLPADLIRRGMAVPDATQPYGLKLLIEDYPYAADGLMIWGAI

EGWVRDYVDHYYPSSAQVCSDRELQAWYTETINVGHVDLRNEDWWPTLATPEDLISILTTLIWLASAQH

AALNFGQYPYSGYVPNRPPLMRRLIPDENDPEYAVFLADPQKYFFSALPSLLQATKFMAVVDTLSTHSP

DEEYIGERQQPSTWTGDAEIVEAFYKFSAEIGRIEKEIDERNADTNLKNRCGAGVLPYELLAPSSGPGV

TCRGVPNSVSI

TomloxE

Solyc01g099160

AY008278

MILNKIVDSITGKDDGEKVKGTVVLMKKNVLDFTDVTASIVDGALEFLGRRVSFQLISNSVHDANGLEG

KLSNPAYLENWITNITPVVAGESTFSVTFDWDDDEFGVPGAFIIKNLHFSEFFLKSLTLEHVPNHGKVH

FVCNSWVYPASKYKSDRIFFANQAYLPSETPELLRKYRENELVALRGDGTGKLEEWDRVYDYAYYNDLG

DPDKGQEYARPVLGGSSQYPYPRRGRTGRKPTKTDPNTESRIPLLMSLDIYVPRDERFGHVKMSDFLTF

ALKSISQLLLPEFKALFDSTPNEFDSFADVLKIYEGGIKLPQGPLFKAIVDAIPLEILKQLLSTDGEGL

LKYPTPQVIQEDKSAWRTDEEFGREMLAGINPVIISRLQEFPPKSKLDPKIYGNQTSTITREQIEDKLD

GLTVDEAVKTNRLFILNHHDILMPYVRRINTTTNTKMYATRTLLFLQDDGTLKPLAIELSLPHPDGDQF

GAVSEVFTPSDQGVEGSIWQLAKAYAAVNDSGVHQLVSHWLNTHTVIEPFVIATNRQLSVLHPIHKLLL

PHFRDTMNINALARQILINGGGLLELTVFPAKYSMELSSVIYKDWIFPEQALPADLIKRGVAVEDSNSP

HGVRLLIQDYPYAVDGLEIWSAIKSWVTEYCNYYYKSDDAVQKDAELQAWWKELREEGHGDKKDEPWWP

KMQSVQELIDSCTITIWIASALHAAVNFGQYPYAGYLPNRPTLSRKFMPEPGSAEYEELKRNPDNVFLK

109

TITPQLQTLVGISLIELLSRHASDTLYLGQRDSPEWTKDQEPLSAFERFGKKLGEIEDRIIQMNGDNQK

WKNRSGPVKVPYTLLFPTSEEGLTGKGIPNSVSI

Viola odorata VoLOX1 MLINSQAVVIQASSSSGINHQRSLFFHVSSGGATPRFQQSNLLLVNSIRGRNLVNSNSNSNKHFYNYNY

NNNNIKAAAAAATDLLSGGSGEEETEKYFGVTAVVTVKLPVDMGIWQGVLDDVTDLLGKSLLLELVSTQ

LDPMTGLEKAKISGYAHKKAQKGTDVLYEAKFTVPVDFGDIGAVLVENEHHKEMFLQDIVIDGLASPVH

FTCGSWVHSVHDNKHKRIFFHNKESYLPSETPNGLKRLRDEELETLRGNGQGLRKKGERIYDYDVYNDL

GDPDKPGGESARPVLGGKENPYPRRIRTGRPRCKKDPMSETRGTYFYVPRNEEFADVKQATFSAKTVYS

VLHALVPQLSSAVVNPDLGFPYFAAIDGLFNEGIHVPPHAHGFWRDLLPNLFKAVTDSTRNVLRFKTPH

TMERDRFFWFNDQEFSRQALAGLNPCCIQLVTEWPLRSELDPAIYGPPESAITTEMVEEQIKGFCGTVK

EAVKQKKLFILDYHDLLLPFVSQVRELKDTSFYGSRTLFFLTPTGTLMPLAIELTRPPIDGKPQWKEVF

RPHWHSSGIWLWRLAKAHVLSHDSGYHQLISHWLRTHCCTEPYIIAARRQLSAMHPIFRLLHPHFRYTM

EINSLARQALINADGIIETCFSPGKYSLQFSSFIYDKVWRFDNEALPKDLINRGLAVEDPSAPHGLKLT

IEDYPYANDGLVLWDAIKEWISAYVNHYYPDPNVVVSDTEIQAWWSEVRNVGHGDKKDEPWWPDLKTPE

DLIGIITTIVWVTSGHHAAVNFGQYTYAGYFPNRPTIARTKMPVEDPTEEGMKLFHTRPEAVLLSTFPT

KIQATRVMAVLDVLSTHSPDEEYLGQEMEAAWVEVPAIKAAYEKFSGKMMELEGIIDERNADEMLRNRN

GAGIVPYELLKPTSKPGVTGKGVPNSISI

VoLOX2 MALAKEIMGCSLINLSTSKMLVSDMSLVPRPVLVMPLQKRRMQGRRMAMKGPVAAISEDIIRTNRHSSS

NSDTSKCLVGQDQRGRGVFKARAVLTVKNKSKEDFQETLLKQLDAFADRIGRNVVLELISTEIDPKTKE

PKRSREAVLKDWSKKSNVKAERVHYTAEFTIGSDFGEVGAIAVRNKHQKEFFLETITLESEGFPSGPVH

FPCNSWIQSTKDLPGKRIFFSNKPYLPSETPAGLRALRENELKELRGDGQGFRKLSDRVYDYDVYNDLG

NPDKSLDLTRPILGGKAIPYPRRCRTGRLPSHTDINVESRVEKPLPVYVPRDEQFEEIKRKTFLSGRFK

AVLHNLIPALRTRISAENQDFNTFSDIDLLYKEGLIVKVGLQDEIWKKLPLPRVVTKLEDSSESLLKYD

IPKIVEKDRFSWFRDEEFARQFLAGINPATIERVTVFPPKSSLDPEVYGSLESGLKEEHILGHLNGMSV

QQAIEENKLYMVDYHDVYLPFLDKINALDGRKSYATRTLFFLTPMGTLKPIAIELSLPAVGPSSRSRRV

VTPPLDATTSWVWLLAKAHVMSNDAGAHQLVHHWLRTHASVEPFIIAAHRQLSAMHPIFKLLDPHTRYT

MEINALARQNLINADGVIENCFTPGRYNMEISAAAYKSLWRFDKESLPEDLIRRGMAVRDPTQPLGVKL

VFEDYPYAQDGLLIWQEIENWVSSYVNHYYPDSSIICNDKELQSWYSESVNVGHADLRDADWWPTLANA

DDLVSILTTIIWLASAQHAALNFGQYPYGGYVPNRPALMRRLIPEENDPEYANFQADPQKFFLSSLPSL

LQATKLMAVIDTLSTHSADEEYLGEQKHPLTWTGDAEMIQEFYNFSAGIRQVEKEIDRRNADPTLKNRC

GAGVLPYELLAPSSGPGVTCRGIPNSVTI

110

Viola

septentrionalis

VsLOX1 KKEVHKKVIKMLINSQAVVIQATSSSGINHQRPLFFHVSSGGTTPRFQQSNLLLVNSISWRNVVNNNIN

KHFYNYNYNNNNIKAAAAAEATDLLSTGREGETDEHEVTALVTVRLPVSMGIGQGLDLVADLLGKSVLL

ELISAHFDSKTGLEKGKITGYGHKKQHKGQEVQYEAKFTIPADFGAIGAIRVENEHHKEMFFQDIVLAG

FPTGSVHFTCNSWVHSVHDNNHKRIFFSDKSYLPSETPEGLVRLREEALLQLRGNGQGVRKKGDRVYDY

DVYNDLGDPDKQGGRLARPVLGGKENPYPRRIRTGRPRCKKDPMSETRSTYSYVPRNEEFADVKQATFS

AKTVYSVLHALVPQLSTAVVDPDLGFPYFSDIDTLYNEGIHVPPHAHGFWRDLLPNLFKAVTDSTRDVL

RFKTPHTMERDRFFWFNDQEFSRQALAGLNPCCIQLVTEWPLRSELDPAIYGPPESAITTEMVEEQIKG

FCGTVKEAVKQKKLFLLDYHDLLLPFVSQVRKLKDTTLYGSRTLFFLTPSGTLMPLAIELTCPPIDGKP

QWKEVFRPHWHSTGIWLWRLAKAHVLSHDSGYHQLISHWLRTHCCTEPYIIAARRQLSAMHPIFRLLHP

HFRYTMEINSLARQALINADGIIETCFSPGKYSLQFSSFIYDKVWRFDNEALPKDLINRGLAVEDPSAP

HGLKLTIEDYPYANDGLVLWDAIKEWISAYVNHYYPDPNVVVSDTEIQAWWSEVRNVGHGDKKDEPWWP

DLKTPEDLIGIITTIVWVTSGHHAAVNFGQYTYAGYFPNRPTIARTKMPVEDPTEEDLKLFHTRPEAVL

LSTFPTKIQATRVMAVLDVLSSHSPDEEYLGQEMEEAWVEVPAIKAAYEKFSGKMMELEGIVDERNADE

MLRNRNGAGIVPYELLKPTSKPGVTGRGVPNSISI

VsLOX2 MALAKEMMGCSLINLSTSKMLVSDLSLVARPVLAMPLQKWRMQGRRMAIKGPVAAISEDIIRTNSSSSN

IDSSKFLVGQDQKSGGVFKARAVLTVKNKSKEDFQETLIKHLDAFADRIGRNVVLELISTEIDPKTKAP

KRSREAVLKDWSRKSNVKAERVHYTAEFTIGSDFGEVGAIAVRNKHQKEFFLETITLESEGFPTGPVHF

PCNSWVQSTKDLSGKRIFFSNKPYLPSETPAGLRALREKELKELRGDGKGVRKLSDRVYDYDVYNDLGN

PDKSLDLTRPILGGKAIPYPRRCRTGRHPSDTDINVESRVEKPLPVYVPRDEQFEEIKRKTFLSGRFKA

VLHNLIPALRTRISAENQDFNTFSDIDLLYKEGLIVKVGLQDEIWKKLPLPRVVTKLEESSESLLKYDI

PKIVEKDRFSWLRDDEFARQFLAGVNPATIERVTVFPPKSSLDPEIYGPLDSALKEEHILGHLNGMSVQ

QAIEENKLYMVDYHDVYLPFLDKINALDGRKSYGTRTLFFLTPMGTLKPIAIELSLPGPSSRSKRVVTP

PLDATTNWVWLLAKAHVMSNDAGAHQLVHHWLRTHASVEPFIIAAHRQLSAMHPIFKLLDPHTRYTMEI

NALARQNLINADGVIENCFTPGRYNMEISAAAYKSLWRFDKESLPEDLIRRGMAVRDPTQPLGVKLILE

DYPYAQDGLLIWHEIENWVRSYVNHYYPDSSIICNDKELQSWYSESVNVGHADLRDADWWPTLADADDL

VSILTTIIWLGSAQHAALNFGQYPYGGYVPNRPTLMRRLIPEENDPEYANFHADPQKFFLSSLPSLLQA

TKLMAVIDTLSTHSADEEYLGERKHPSTWTGDAEMIQGFYNFSAGVRQVEKEIDRRNADPTLKNRCGAG

VLPYELLAPSSGPGVTCRGIPNSVTI

111

Supplementary Table 2.3. Matrix of homology between lipoxygenases of S. lycopersicum, V. odorata and V. septentrionalis. Alignment and homology score (%) have been calculated with Clustal Omega 2.1.

TomloxB TomloxA TomloxE TomloxD VoLox1 VsLox1 TomloxC VoLox2 VsLox2

TomloxB 100 72.4 75.7 44.6 42.5 42.6 42.0 42.0 42.3

TomloxA 72.4 100 78.3 46.6 43.9 44.0 43.4 42.1 42.4

TomloxE 79.3 77.3 100 45.5 43.2 43.1 42.7 42.6 43.2

TomloxD 44.6 46.6 45.6 100 70.5 71.6 46.5 47.2 47.2

VoLOX2 42.5 43.9 44.2 70.5 100 94.7 47.0 46.2 48.0

VsLOX2 42.6 44.0 44.6 71.6 94.7 100 47.4 46.8 48.6

TomloxC 42.0 43.4 43.7 46.5 47.0 47.4 100 64.2 63.1

VoLOX1 42.0 42.1 42.6 47.2 46.2 46.8 64.2 100 90.3

VsLOX1 42.3 42.4 43.5 47.2 48.0 48.6 63.1 90.3 100

112

Supplementary Table 2.4. Expression levels (RPKM) of genes of the MEP and carotenoid production pathways in tomatoes. Transcriptomic analysis (Illumina) has been performed on S. lycopersicum (cv. M82) ripe fruits (Tomato Functional Genomics Database, experiment D003).

Gene Name Gene

Abbreviation Gene Number

Gene

expression

(RPKM)

MEP pathway

1-D-deoxyxylulose 5-phosphate synthase DXS Solyc01g067890 191.58

1-deoxy-D-xylulose-5-phosphate reductoisomerase DXR Solyc03g114340 23.00

2-C-methyl-D-erythritol 4-phosphate cytidyltransferase ISPD Solyc01g102820 10.19

4-diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritol kinase ISPE Solyc01g009010 53.82

2-C-methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase ISPF Solyc08g081570 15.57

4-hydroxy-3-methylbut-2-en-1-yl diphosphate synthase ISPG Solyc11g069380 71.35

(E)-4-Hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate reductase ISPH Solyc01g109300 234.97

Geranylgeranyl pyrophosphate synthetase GGPP Solyc02g085700 57.49

Carotenoid production pathway

Phytoene synthase 1 PSY1 Solyc03g031860 2024.49

Phytoene desaturase 1 PDS Solyc03g123760 53.77

Zeta carotene isomerase ZISO Solyc12g098710 1710.14

Zeta carotene desaturase ZDS Solyc01g097810 54.48

Carotenoid isomerase CRTISO Solyc10g081650 1710.14

Lycopene epsilon-cyclase LCYE Solyc12g008980 0.02

Lycopene beta-cyclase LCYB Solyc04g040190 3.4

113

Supplementary Table 2.5. Expression levels (RPKM) of carotenoid cleavage dioxygenase and lipoxygenase genes characterized in tomatoes. Transcriptomic analysis (Illumina) has been performed on S. lycopersicum (cv. M82) ripe fruits (Tomato Functional Genomics Database, experiment D003).

Gene Name Gene

Abbreviation Gene Number

Gene

expression

(RPKM)

Carotenoid cleavage dioxygenases

Carotenoid cleavage dioxygenase 1a CCD1a Solyc01g087250 8.02

Carotenoid cleavage dioxygenase 1b CCD1b Solyc01g087260 48.27

Carotenoid cleavage dioxygenase 4a CCD4a Solyc08g075480 0.00

Carotenoid cleavage dioxygenase 4b CCD4b Solyc08g075490 0.11

Carotenoid cleavage dioxygenase 7 CCD7 Solyc01g090660 0.00

Carotenoid cleavage dioxygenase 8 CCD8 Solyc08g066650 0.00

Carotenoid cleavage dioxygenase like CCD-like Solyc08g066720 0.00

Lipoxygenases

9S-lipoxygenase A TomloxA Solyc08g014000 76.75

9S-lipoxygenase B TomloxB Solyc01g099190 1526.01

13S-lipoxygenase C TomloxC Solyc01g006540 127.37

13S-lipoxygenase D TomloxD Solyc03g122340 10.93

9S-lipoxygenase E TomloxE Solyc01g099160 67.79

114

Supplementary Table 2.6. List of primers used.

Name primer Left primer Right primer

CCD1a-1_qpcr CTCCGTCAATGGTGAATGGT TATTCCTCTCCGTGGCTTTG

CCD1b-1_qpcr TGGAACTGATGTAGAGAGAAAGAA GACTCCATTTTGTGGTTTTGG

LoxC-1_qpcr CCTGGAGTTACTGGAAAAGGTG TCAACATCAACGAGCATTTG

nptII GAACAAGATGGATTGCACGC GAAGAACTCGTCAAGAAGGC

115

Annexe 3 : Figures supplémentaires (Chapitre 3)

Supplementary Figure 3.1. Alignment of S. habrochaites and S. lycopersicum PSY1 protein sequences.

S. lycopersicum MSVALLWVVSPCDVSNGTSFMESVREGNRFFDSSRHRNLVSNERINRGGGKQTNNGRKFS

S. habrochaites MSVALLWVVSPCDVSNGTSFMESVREGNRFFDSSRHRNLVSNERINRGGGKQTNNGRKFS

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S. lycopersicum VRSAILATPSGERTMTSEQMVYDVVLRQAALVKRQLRSTNELEVKPDIPIPGNLGLLSEA

S. habrochaites VRSAILATPSGERTMTSEQMVYDVVLRQAALVKRQLRSTNELEVKPDIPIPGNLGLLSEA

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S. lycopersicum YDRCGEVCAEYAKTFNLGTMLMTPERRRAIWAIYVWCRRTDELVDGPNASYITPAALDRW

S. habrochaites YDRCGEVCAEYAKTFNLGTMLMTPERRRAIWAIYVWCRRTDELVDGPNASYITPAALDRW

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S. lycopersicum ENRLEDVFNGRPFDMLDGALSDTVSNFPVDIQPFRDMIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYC

S. habrochaites ENRLEDVFNGRPFDMLDGALSDTVSNFPVDIQPFRDMIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYC

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S. lycopersicum YYVAGTVGLMSVPIMGIAPESKATTESVYNAALALGIANQLTNILRDVGEDARRGRVYLP

S. habrochaites YYVAGTVGLMSVPIMGIAPESKATTESVYNAALALGIANQLTNILRDVGEDARRGRVYLP

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S. lycopersicum QDELAQAGLSDEDIFAGRVTDKWRIFMKKQIHRARKFFDEAEKGVTELSSASRFPVWASL

S. habrochaites QDELAQAGLSDEDIFAGRVTDKWRIFMKKQIHRARKFFDEAEKGVTELSSASRFPVWASL

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S. lycopersicum VLYRKILDEIEANDYNNFTKRAYVSKSKKLIALPIAYAKSLVPPTKTASLQR

S. habrochaites VLYRKILDEIEANDYNNFTKRAYVSKSKKLIALPIAYAKSLVPPTKTVSLQR

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116

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117

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122

Supplementary Figure 3.2. Alignment of S. habrochaites (hab) and S. lycopersicum (tom) PSY1 promoter and 5’UTR region. The sequences that are unique to S. habrochaites genome are in orange and those that are only present in S. lycopersicum’s are in red. The sequences aligned are located between the position 4,346,398 pb and 4,352,373 bp (start codon of PSY1 gene) on chromosome 3.

hab cttgaggtcattataggagctcaaaaacttctaattttgaatcaatgtctggttatactt

tom cttgaggtcactataggagctcaaaaacttctaattttgaatcaatgtctggttatactt

**********.*************************************************

hab tttttgtcagaactgtatctcaaatgtggtgtttggtttgtctcattttgcagaagtcaa

tom tttttgtcataactgtatctcaaatgtggtgtttggtttatctcattttgcagaagtcaa

********* *****************************.********************

hab caaacaggttattcctgtttgagtgaggaaaagttggtttgcctgtctgtggtcttttta

tom gaaacaggttactcctgtttgagtgaggaaaagttggtttgcctgtctgtggtcttttta

**********.************************************************

hab taatctttttctacagaagagaaagtgggtaattttgtttgagagtggaaatattctcta

tom taatctttttctacagaagagaaagtgggtaattttgtttgagagtggaaatattctcta

************************************************************

hab gtgggaatctactaggagtaatata---tctataaactaagcgaagtttggaaggtgaca

tom gtgggaatctactaggagtaatttattttctataaactaagtaaagtttggaaggtgaca

********************** ** *************..*****************

hab aaaagaaggacaaaaatcttggaattgttttagacaaccaaggttttcttgctcagaatg

tom aaaagaaagacaaaaatcttggaattgttttagacaaccaaggttttcttgctcagaatg

*******.****************************************************

123

Supplementary Figure 3.3. PSY1 protein sequences of red and bicolor cultivars.

red MSVALLWVVSPCDVSNGTSFMESVREGNRFFDSSRHRNLVSNERINRGGGKQTNNGRKFS

bicolor MSVALLWVVSPCDVSNGTSFMESVREGNRFFDSSRHRNLVSNERINRGGGKQTNNGRKFS

************************************************************

red VRSAILATPSGERTMTSEQMVYDVVLRQAALVKRQLRSTNELEVKPDIPIPGNLGLLSEA

bicolor VRSAILATPSGERTMTSEQMVYDVVLRQAALVKRQLRSTNELEVKPDIPIPGNLGLLSEA

************************************************************

red YDRCGEVCAEYAKTFNLGTMLMTPERRRAIWAIYVWCRRTDELVDGPNASYITPAALDRW

bicolor YDRCGEVCAEYAKTFNLGTMLMTPERRRAIWAIYVWCRRTDELVDGPNASYITPAALDRW

************************************************************

red ENRLEDVFNGRPFDMLDGALSDTVSNFPVDIQPFRDMIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYC

bicolor ENRLEDVFNGRPFDMLDGALSDTVSNFPVDIQPFRDMIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYC

************************************************************

red YYVAGTVGLMSVPIMGIAPESKATTESVYNAALALGIANQLTNILRDVGEDARRGRVYLP

bicolor YYVAGTVGLMSVPIMGIAPESKATTESVYNAALALGIANQLTNILRDVGEDARRGRVYLP

************************************************************

red QDELAQAGLSDEDIFAGRVTDKWRIFMKKQIHRARKFFDEAEKGVTELSSASRFPVWASL

bicolor QDELAQAGLSDEDIFAGRVTDKWRIFMKKQIHRARKFFDEAEKGVTELSSASRFPVWASL

************************************************************

red VLYRKILDEIEANDYNNFTKRAYVSKSKKLIALPIAYAKSLVPPTKTASLQR

bicolor VLYRKILDEIEANDYNNFTKRAYVSKSKKLIALPIAYAKSLVPPTKTASLQR

****************************************************

124

Supplementary Figure 3.4. Principal splicing sites of PSY1. Grey areas represent the transcripts that map to S. lycopersicum genome (SL3.0). Frequency and exact position of each splicing for the different cultivars are available in Supplementary Table 3.7, 3.8 and 3.9. Splicings are represented by colored arrows and named by letters. The red arrows represent splicings that happen in red, yellow r and yellow ry cultivars in the 5’UTR region. Green arrows are splicings unique to yellow r cultivars. Bicolor cultivars 5’UTR splicings are represented in Supplementary Figure 3.5. Coding exons are numbered from 1 to 6 (in white) and are separated by introns. Blue arrows mark the beginning of the fourth 5’UTR exon and position of the start codon. The area in the dashed box is enlarged to show the splicing in the first 5’UTR exons.

Start End

a 4,350,905 end 5'UTR exon 1 4,351,143 start 5'UTR exon 3

c 4,350,905 end 5'UTR exon 1 4,350,990 middle 5'UTR exon 2

k 4,350,905 end 5'UTR exon 1 4,352,903 start exon 2

d 4,350,905 end 5'UTR exon 1 4,352,127 start 5'UTR exon 4

f 4,351,005 middle 5'UTR exon 2 4,351,143 start 5'UTR exon 3

e 4,351,054 end 5'UTR exon 2 4,351,143 start 5'UTR exon 3

b 4,351,184 end 5'UTR exon 3 4,352,127 start 5'UTR exon 4

l 4,351,184 end 5'UTR exon 3 4,352,903 start exon 2

m 4,352,782 end PSY1 exon 1 4,352,903 start PSY1 exon 2

n 4,352,953 end PSY1 exon 2 4,353,377 start PSY1 exon 3

o 4,353,549 end PSY1 exon 3 4,353,863 start PSY1 exon 4

p 4,354,098 end PSY1 exon 4 4,354,617 start PSY1 exon 5

q 4,354,809 end PSY1 exon 5 4,355,499 start PSY1 exon 6

125

Supplementary figure 3.5. Deletion and principal splicing sites of PSY1 for the bicolor cultivars. Grey areas represent the transcripts that map to S. lycopersicum genome (SL3.0). Splicings are represented by orange arrows and named by letters. The red arrow shows the deletion position in the bicolor cultivars. Coding exons are numbered from 1 to 6 (in white) and are separated by introns. Blue arrows mark the position of the start codon and the beginning of the fourth 5’UTR exon in the red cultivars. The area in the dashed box is enlarged to show the 5’UTR splicing sites.

Start End

g 4,347,513 start deletion bicolor 4,351,300 end deletion bicolor

h 4,351,490 5'UTR 4,352,127 start 5'UTR exon 4

i 4,351,513 5'UTR 4,352,127 start 5'UTR exon 4

j 4,351,590 5'UTR 4,352,127 start 5'UTR exon 4

126

Supplementary Figure 3.6. First exon of PSY1 in red and yellow r cultivars. In r yellow cultivars, there is the insertion of a 403bp sequence (in purple) after the 318th bp of PSY1 exon 1 (PSY1 start codon is in blue). The inserted sequence is a single long terminal repeat (LTR) found in Rider retrotransposons.

red aatcttggaattgttttagacaaccaaggttttcttgctcagaatgtctgttgccttgtt

yellow group r aatcttggaattgttttagacaaccaaggttttcttgctcagaatgtctgttgccttgtt

************************************************************

red atgggttgtttctccttgtgacgtctcaaatgggacaagtttcatggaatcagtccggga

yellow group r atgggttgtttctccttgtgacgtctcaaatgggacaagtttcatggaatcagtccggga

************************************************************

red gggaaaccgtttttttgattcatcgaggcataggaatttggtgtccaatgagagaatcaa

yellow group r gggaaaccgtttttttgattcatcgaggcataggaatttggtgtccaatgagagaatcaa

************************************************************

red tagaggtggtggaaagcaaactaataatggacggaaattttctgtacggtctgctatttt

yellow group r tagaggtggtggaaagcaaactaataatggacggaaattttctgtacggtctgctatttt

************************************************************

red ggctactccatctggagaacggacgatgacatcggaacagatggtctatgatgtggtttt

yellow group r ggctactccatctggagaacggacgatgacatcggaacagatggtctatgatgtggtttt

************************************************************

red gaggcaggcagccttggtgaagaggcaactgagatctaccaatgagttagaagtgaag--

yellow group r gaggcaggcagccttggtgaagaggcaactgagatctaccaatgagttagaagtgaagcc

**********************************************************

red ------------------------------------------------------------

yellow group r ggatgttgaatgccttgaatcggacccgctacaaacagaaaggacgggggtctcgctgcc

red ------------------------------------------------------------

yellow group r cggtcagcgagtcggggggtccaggggggcgacgcgccccctggcctgggggtccggggg

red ------------------------------------------------------------

yellow group r ggcggagacgcccccgggccgacggtatacaatgttgttgtattgggcccttaattttct

red ------------------------------------------------------------

yellow group r gttgattctgtatgttgggcccaagcctgttagggcgtagcttagcactatatatagacg

red ------------------------------------------------------------

yellow group r ctatgggaaaccctattctgtaattctgtttttgcctctccataataaaactgctccctc

red ------------------------------------------------------------

yellow group r tcttcccgtggacgtagccaatttgttggtgaaccacgtaaatctgttgtcttatttttc

red -----------------------------------------ccggatatacctattccgg

yellow group r gcgtttatattttctcgtattatctcaaattccgcacaacaccggatatacctattccgg

*******************

red ggaatttgggcttgttgagtgaagcatatgataggtgtggtgaagtatgtgcagagtatg

yellow group r ggaatttgggcttgttgagtgaagcatatgataggtgtggtgaagtatgtgcagagtatg

************************************************************

red caaagacgtttaactt

yellow group r caaagacgtttaactt

****************

127

Supplementary Figure 3.7. PSY1 protein sequence in red and yellow r cultivars. Because of the 403 bp insertion in r PSY1 exon 1 (Supplementary Figure 3.6), only the first 107 amino acids are conserved (in blue) followed by 71 amino acids and a premature stop codon.

red MSVALLWVVSPCDVSNGTSFMESVREGNRFFDSSRHRNLVSNERINRGGGKQTNNGRKFS

yellow group r MSVALLWVVSPCDVSNGTSFMESVREGNRFFDSSRHRNLVSNERINRGGGKQTNNGRKFS

************************************************************

red VRSAILATPSGERTMTSEQMVYDVVLRQAALVKRQLRSTNELEVKPDIPIPGNLGLLSEA

yellow group r VRSAILATPSGERTMTSEQMVYDVVLRQAALVKRQLRSTNELEVKPDVECLESDPLQTER

***********************************************

red YDRCGEVCAEYAKTFNLGTMLMTPERRRAIWAIYVWCRRTDELVDGPNASYITPAALDRW

yellow group r TGVSLPGQRVGGSRGATRPLAWGSGGAETPPGRRYTMLLYWALNFLLILYVGPKPVRA--

red ENRLEDVFNGRPFDMLDGALSDTVSNFPVDIQPFRDMIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYC

yellow group r ------------------------------------------------------------

red YYVAGTVGLMSVPIMGIAPESKATTESVYNAALALGIANQLTNILRDVGEDARRGRVYLP

yellow group r ------------------------------------------------------------

red QDELAQAGLSDEDIFAGRVTDKWRIFMKKQIHRARKFFDEAEKGVTELSSASRFPVWASL

yellow group r ------------------------------------------------------------

red VLYRKILDEIEANDYNNFTKRAYVSKSKKLIALPIAYAKSLVPPTKTASLQR

yellow group r ----------------------------------------------------

128

Supplementary Figure 3.8. PSY1 protein sequence in red and yellow ry cultivars. The part of the protein that is identical between yellow and red cultivars is shown in blue. The nucleotide sequence inversion in the last exon of PSY1 (see Supplementary Figure 3.10) changes the end of protein sequence in the yellow ry cultivars.

red MSVALLWVVSPCDVSNGTSFMESVREGNRFFDSSRHRNLVSNERINRGGGKQTNNGRKFS

yellow group ry MSVALLWVVSPCDVSNGTSFMESVREGNRFFDSSRHRNLVSNERINRGGGKQTNNGRKFS

************************************************************

red VRSAILATPSGERTMTSEQMVYDVVLRQAALVKRQLRSTNELEVKPDIPIPGNLGLLSEA

yellow group ry VRSAILATPSGERTMTSEQMVYDVVLRQAALVKRQLRSTNELEVKPDIPIPGNLGLLSEA

************************************************************

red YDRCGEVCAEYAKTFNLGTMLMTPERRRAIWAIYVWCRRTDELVDGPNASYITPAALDRW

yellow group ry YDRCGEVCAEYAKTFNLGTMLMTPERRRAIWAIYVWCRRTDELVDGPNASYITPAALDRW

************************************************************

red ENRLEDVFNGRPFDMLDGALSDTVSNFPVDIQPFRDMIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYC

yellow group ry ENRLEDVFNGRPFDMLDGALSDTVSNFPVDIQPFRDMIEGMRMDLRKSRYKNFDELYLYC

************************************************************

red YYVAGTVGLMSVPIMGIAPESKATTESVYNAALALGIANQLTNILRDVGEDARRGRVYLP

yellow group ry YYVAGTVGLMSVPIMGIAPESKATTESVYNAALALGIANQLTNILRDVGEDARRGRVYLP

************************************************************

red QDELAQAGLSDEDIFAGRVTDKWRIFMKKQIHRARKFFDEAEKGVTELSSASRFPVWASL

yellow group ry QDELAQAGLSDEDIFAGRVTDKWRIFMKKQIHRARKFFDEAEKGVTELSSASRFPVWASL

************************************************************

red VLYRKILDEIEANDYNNFTKRAYVSKSKKLIALPIAYAKSLVPPTKTASLQR--------

yellow group ry VLYRKILDEIEANDYNNFTKRAYVSKSNMLKGLFSNFKGSKRGSNATTTLVGLAPCETYI

***************************

red ------------

yellow group ry AIDDRGPIGITF

129

Supplementary Figure 3.9. Splicing site in the inverted sequence of PSY1 ry. The inverted sequence starts in the second exon of Solyc03g031870, the gene downstream of PSY1. Grey areas represent the transcripts that map to S. lycopersicum genome (SL3.0). The splicing starts in the second exon of the inverted Solyc03g031870 and finishes in the first exon. Frequencies of the splicing for the different cultivars are available in Supplementary Tables 3.7, 3.8 and 3.9.

Start End

r 4,361,338 Solyc03g031870 exon 1 4,361,798 Solyc03g031870 exon 2

130

Supplementary Figure 3.10. Bicolor ry cultivars PSY1 transcript sequence. PSY1 start codon is in red. The beginning of exon 6 is in purple (4,355,499-4,355,596 bp). The structural rearrangement location is indicated by the slashes (//). The green sequence doesn’t belong to PSY1 or Solyc03g031870. The reverse sequence of Solyc03g031870 exon 2 is in blue and exon 1 in pink. The underlined codon in the pink region is the new stop codon of PSY1 in the yellow ry cultivars.

AATAAAATAAAATAAAATTTAAAAAATAATAATAAATGCTATAAAATGACCAAAATGTGT

GGAGCAAAAAGTGCAGAAAAAACCAACAAATTGCATTCTCCATTCTTGGAAGTGGCCATT

CTTGATTTCTTGAAACAAAGAAGTCAAGAAACAGGTTACTCCTGTTTGAGTGAGGAAAAG

TTGGTTTGCCTGTCTGTGGTCTTTTTATAATCTTTTTCTACAGAAGAGAAAGTGGGTAAT

TTTGTTTGAGAGTGGAAATATTCTCTAGTGGGAATCTACTAGGAGTAATTTATTTTCTAT

AAACTAAGTAAAGTTTGGAAGGTGACAAAAAGAAAGACAAAAATCTTGGAATTGTTTTAG

ACAACCAAGGTTTTCTTGCTCAGAATGTCTGTTGCCTTGTTATGGGTTGTTTCTCCTTGT

GACGTCTCAAATGGGACAAGTTTCATGGAATCAGTCCGGGAGGGAAACCGTTTTTTTGAT

TCATCGAGGCATAGGAATTTGGTGTCCAATGAGAGAATCAATAGAGGTGGTGGAAAGCAA

ACTAATAATGGACGGAAATTTTCTGTACGGTCTGCTATTTTGGCTACTCCATCTGGAGAA

CGGACGATGACATCGGAACAGATGGTCTATGATGTGGTTTTGAGGCAGGCAGCCTTGGTG

AAGAGGCAACTGAGATCTACCAATGAGTTAGAAGTGAAGCCGGATATACCTATTCCGGGG

AATTTGGGCTTGTTGAGTGAAGCATATGATAGGTGTGGTGAAGTATGTGCAGAGTATGCA

AAGACGTTTAACTTAGGAACTATGCTAATGACTCCCGAGAGAAGAAGGGCTATCTGGGCA

ATATATGTATGGTGCAGAAGAACAGATGAACTTGTTGATGGCCCAAACGCATCATATATT

ACCCCGGCAGCCTTAGATAGGTGGGAAAATAGGCTAGAAGATGTTTTCAATGGGCGGCCA

TTTGACATGCTCGATGGTGCTTTGTCCGATACAGTTTCTAACTTTCCAGTTGATATTCAG

CCATTCAGAGATATGATTGAAGGAATGCGTATGGACTTGAGAAAATCGAGATACAAAAAC

TTCGACGAACTATACCTTTATTGTTATTATGTTGCTGGTACGGTTGGGTTGATGAGTGTT

CCAATTATGGGTATCGCCCCTGAATCAAAGGCAACAACAGAGAGCGTATATAATGCTGCT

TTGGCTCTGGGGATCGCAAATCAATTAACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAAGATGCC

AGAAGAGGAAGAGTCTACTTGCCTCAAGATGAATTAGCACAGGCAGGTCTATCCGATGAA

GATATATTTGCTGGAAGGGTGACCGATAAATGGAGAATCTTTATGAAGAAACAAATACAT

AGGGCAAGAAAGTTCTTTGATGAGGCAGAGAAAGGCGTGACAGAATTGAGCTCAGCTAGT

AGATTCCCTGTATGGGCATCTTTGGTCTTGTACCGCAAAATACTAGATGAGATTGAAGCC

AATGACTACAACAACTTCACAAAGAGAGCATATGTGAGCAAATCAAA/TATGC/TCAAGG

GACTTTTTAGCAATTTCAAGGGATCGAAGAGAGGAAGCAACGCGACAACAACGCTCGTAG

GTTTGGCTCCATGTGAAACGTACATTGCCATAGATGATAGAGGTCCTATTGGCATAACAT

TTTGAGGCTCTTGTTAAGAAGGTAAGAGGAGTTAAAGACACATAATTTGCTCCACATTTT

GGTAAATTATCCATAGGATTATTAAAGTAAAAAGTTGTGTTTTTTTTAAAAAGAAGTATA

AGGTATTAAAATTTGTTGGAGAGGAAAATATAGTGAGGTAACTTAGAATTTGTATGCAAA

AGATGCAAACTAAGATGGAAAATTTATAGTGAAAAAACTAAGTGTGGAGTCAAGACTAAT

GTGGCCCATTATGGGTCCCTAAATGGTTGTTTAGGTGGAAATCATAGTGAAGTTGCAATG

ACTATGTATAGTCATGTCGTAATTTACATGGCATAATTAAATTTTGAGATATAAATTTTT

AAATTTTGATGGTAAATTATAATAGTTAACAATTTTAAATAGGTAAATGATATATATAAA

AAGAGTAATAAAAAGAATTTAATTGATTCTCATAATAATGTGTCATGTAAAATAAAACGG

AAGAAATAATAATAGTAAATTCCACCATATTTCACAGTTCAATTCCAACTAATAAGACCA

CTGACCCTTGAAAATGGAGAGTAATAATTAATTGAATTATTAATTATTAATTATTAATAA

CTTTTGGCTGCTTTGACCTTACCACTTCATCCTGGGCTGCCCTAACCAAACTCTCCCTCG

CTGAATTAAATTTAAATTTTTAGCGGTAATTGAGTTAATATAATTGAATTTTATTGGAAA

GAAAATTTAATATTATTTATATGAAGTGTTGGTTATAAATATTTATGTTTATTTGCTGCT

AAATATAATATAGCGATGTTGCTAATAATTTATCGTAAAATTTTTTATTTGTTTGTGTAC

ATAAATATTCAAACATAGGGCGTATGTAGGTCATTTCGGCTCGGTTTTGTATATTATTAA

TATGATTTATCGATTTTTTATTTTTAAATATGTTAAATTAATAAAACACTTTATCGATTT

TTGATTTATTGAATTTGACTTTTAATTCGTTTTCGGTTTAATCAATAAGAAAATACTTAT

AATTCAAATATATGACTTCTCCAATAATTTGACGCGATAAGACAATAATGTAACTCTACA

GATCGCTCGTCAAATGAAAACAATGACAACTAGGATGAAAACACTATAAAGTACAAGACA

AAGAAAACTTAAGAGGAATGATGCTCTTACTTTTGATTTTGACATGTTGTATGGTATAAA

ATTGTGAATTCAAAATTATTATAAAGTATGAATTGAACCGTAAAAAAAATGATAGTAACT

GGTAAAGTTCTGAAGTTAATATTTAAGATTTATATAGGGATAAAGTAGTACACTACTATC

AATTTAATCAATTATCGATCTACCTAGTAGTCTAACATTAAATATCAAAATCAAATCGAT

AATCGAATAATTCTTTTTCACAAGCATACCTAGAGTCAAAATCTTTTCTTATACGTCTGT

ATTATCAACATCCAAACATTTTCTCGAAGAACATAAATTTTTTTTTCTTCATTTGGTAGT

TAAGCCATATATATATATATATATATATAT

131

Supplementary Figure 3.11. Genomic sequence of PSY1. Exons are in blue and introns in black. The A->G SNP in intron 4 is represented in red. The left qPCR primer used to determine PSY1 gene expression primer is in green and the right is in purple.

>PSY1_Solyc03g031860 SL3.0ch03:4351990…4355983

GATTTCACTATATTGTAATATTAACTTGAGGTCACTATAGGAGCTCAAAAACTTCTAATTTTGAATCAATGTCTGGTTAT

ACTTTTTTTGTCATAACTGTATCTCAAATGTGGTGTTTGGTTTATCTCATTTTGCAGAAGTCAAGAAACAGGTTACTCCT

GTTTGAGTGAGGAAAAGTTGGTTTGCCTGTCTGTGGTCTTTTTATAATCTTTTTCTACAGAAGAGAAAGTGGGTAATTTT

GTTTGAGAGTGGAAATATTCTCTAGTGGGAATCTACTAGGAGTAATTTATTTTCTATAAACTAAGTAAAGTTTGGAAGGT

GACAAAAAGAAAGACAAAAATCTTGGAATTGTTTTAGACAACCAAGGTTTTCTTGCTCAGAATGTCTGTTGCCTTGTTAT

GGGTTGTTTCTCCTTGTGACGTCTCAAATGGGACAAGTTTCATGGAATCAGTCCGGGAGGGAAACCGTTTTTTTGATTCA

TCGAGGCATAGGAATTTGGTGTCCAATGAGAGAATCAATAGAGGTGGTGGAAAGCAAACTAATAATGGACGGAAATTTTC

TGTACGGTCTGCTATTTTGGCTACTCCATCTGGAGAACGGACGATGACATCGGAACAGATGGTCTATGATGTGGTTTTGA

GGCAGGCAGCCTTGGTGAAGAGGCAACTGAGATCTACCAATGAGTTAGAAGTGAAGCCGGATATACCTATTCCGGGGAAT

TTGGGCTTGTTGAGTGAAGCATATGATAGGTGTGGTGAAGTATGTGCAGAGTATGCAAAGACGTTTAACTTAGGTTAGCT

TCTTCAATCTATTCATTCGTTTACCAAATATTATTTGGTAAGCACTAATTATGAATATATATATGTTCATGTTATTGATG

AAGACAAAATTTGATCTTTGTTTGTTTATTCAGGAACTATGCTAATGACTCCCGAGAGAAGAAGGGCTATCTGGGCAATA

TATGGTGAGGTTTCTAGCCATTTAATAACAGTTACGCGCACAAACACATATGATTAATCGGGGACGAGAAAAAAAGAAAT

GAAGTTTGAGTTTTGAGGGTCATATGTAATAGGTAAATCCGAGCTTGACTAGCTTGAGATGTTTATTGTCATATCATGCT

CAATACTAACCAAAACACTGAAAAAGAACTTGATTATATTTACATACTAATATTTTCATTTGCGTTGCTGTTCACATTTT

TACCTATGGAACTGGTTTTTGTGATTTGTTATACTTCATATTCGATGTTAATAAAATATATCATTCCTCCCTTTTTCTCC

ACTTCAAGCTTTACTGTAGTGTTGAAAGGGGAAACTCCTTTTAATGATTGCATATATAAACGAACTTCTTGAGTTGAATA

GTTTCTCATTATGATCTGTTTAAACAGTATGGTGCAGAAGAACAGATGAACTTGTTGATGGCCCAAACGCATCATATATT

ACCCCGGCAGCCTTAGATAGGTGGGAAAATAGGCTAGAAGATGTTTTCAATGGGCGGCCATTTGACATGCTCGATGGTGC

TTTGTCCGATACAGTTTCTAACTTTCCAGTTGATATTCAGGTTAGTCTACCAATTCTATGGTCTTTATATTTGTTCAATT

TGCGTTTGATGTCACTTTTGCTGAGGGCTTTTCTAATAGCTTACTTCAGCCTAGCGGAAATGTTTGTAGTTGAATCTCTA

GTTCTGTCTCCTATATCTGTTTCTCTCGTCCTAGATACTACACATACTTCATTTCTGTTTTAACATTTTATTCGTCTTTT

GGTGTTGTTTTGTATGTGAATCATATATTTGGAACAGAATCATTATTAGTTCACATGATTTCATTTGCTTTCTTCAATAG

CGTAATTGTCTAACCTTCCAATATATGTTGCAGCCATTCAGAGATATGATTGAAGGAATGCGTATGGACTTGAGAAAATC

GAGATACAAAAACTTCGACGAACTATACCTTTATTGTTATTATGTTGCTGGTACGGTTGGGTTGATGAGTGTTCCAATTA

TGGGTATCGCCCCTGAATCAAAGGCAACAACAGAGAGCGTATATAATGCTGCTTTGGCTCTGGGGATCGCAAATCAATTA

ACTAACATACTCAGAGATGTTGGAGAAGAGTAAGTACAAAGCTGTGTTTTACGCACATAATTTTTTTTGCTAATATTTAC

ATATCAAAATATAGGAAAATGAGCTCTTCGGTTATCCGGTTTATATTTTTTTTATGTCAACATAATAGTATAAAGTAATT

AGTATCAGTCGTTCTGGGAATAAAATTGCAGAACTCAATTTAGCCGTGTTGTGAAATCCTGCTTGTTTTGAGAGCTTAAA

GCTCATTAGTTAGTCGTTAGAGACGAAGAAATTCTTCGTTGTCCATCTTTATTCCACCTTA/GAAGTTGTGATATTTTCA

TTATTGGTACATTTGGCAAAAACACCTGAACAAATTTATGACGGATGCCTTTTGAAAGTCACTATACCTGTCTAGTCGGC

GTTTATCACATTTCTTTGACATATTGAACTTTGAAACATGATATCAGCTCTAGACAGTGACGAGCCATGATCAATTTCTT

TCCTTTATTCTTTCTTTGGAAGTGCCGTATTTAGGCTTCCGTTGTTCTTATATATTGCTTTCCCTGCAGTGCCAGAAGAG

GAAGAGTCTACTTGCCTCAAGATGAATTAGCACAGGCAGGTCTATCCGATGAAGATATATTTGCTGGAAGGGTGACCGAT

AAATGGAGAATCTTTATGAAGAAACAAATACATAGGGCAAGAAAGTTCTTTGATGAGGCAGAGAAAGGCGTGACAGAATT

GAGCTCAGCTAGTAGATTCCCTGTAAGCATTCGTAAACTCTTTAGTTTTATGAAATGATTCTTTTTTCGCGTTATTAGAT

GAATATGGTTGCTTGTGTTGAGTATTTCTAGGTCGATGAAGTTGAGACAAGGGTTTTTAAGTTTTAACGACTTTTACGGG

GTGCCATGTTATCTGCTACCTAATCTTAGGTAGTTGACCGGAAGGGCTAGAATTTTAACCTCATGTTCACCCTACCAACC

AAGAAATGAACCTCGCATAGAGCTCGTAGTTATGAATATTTGCTTTGGCATGACATTGTGCGGATCATGAAATGTCTTAG

ATTATATGGAAAAATCATTCTATTACATCGAATAGATACATTAGATCTAAGAAGCACGCCGTGTTGTAAATGAGAAATTC

TATAGCTCAGATCTTTAGTTTTCTCTGAACGACCTACAAACCAACGGATAACCTTGTATTGAGCTTGTCGTTCTCAGTAT

TTGCACTAACATTACGTCGTGTGGATCCTGAAATGGCTTGGATTGCTATTATTCTGGATATGGCAAAACCATTTTATTAG

TACTAGATATCGAATAACTACATTTGACCCTACAAGTACCCTGGGTTGGAGTTACAATATCCCATACCTCGTATCTTTAG

TGTTCTCTTATTTATCACCTTTGTCTACTATTCTGGCAAAATAACCTCACTCGTTACTCGGTGTTTTCCAGGTATGGGCA

TCTTTGGTCTTGTACCGCAAAATACTAGATGAGATTGAAGCCAATGACTACAACAACTTCACAAAGAGAGCATATGTGAG

CAAATCAAAGAAGTTGATTGCATTACCTATTGCATATGCAAAATCTCTTGTGCCTCCTACAAAAACTGCCTCTCTTCAAA

GATAAAGCATGAAATGAAGATATATATATATATATATATAGCAATATACATTAGAAGAAAAAAAGGAAGAAGAAATGTTG

TTGTATTGATATAAATGTATATCATAAATATTAGGTTGTAGTAACATTCAATATAATTATCTCTTGTAGTTGTTGTATCT

TCACTTTATCTCAACTCCTTTGAGAGAACTTTCCGTAGTTATCTGCTTTGCACTTGGTTACTCAGAATTTTACTGTGGGC

ATGATAATTGATATACCAAATTCAGTTTTGATTCTATCGAAAAATTTGTTATTACATTTTTTTGGGGGGAAAGGAA

132

Supplementary Figure 3.12. Modification to the RNA-Seq library preparation protocol of Zhong et al. 2011. The numbering of the steps is the same as in the original protocol.

1-7. The 1 to 7 steps of the Zhong et al. 2011 protocol are replaced by the 1 to 36 steps of the NEBNExt Poly(A) mRNA Magnetic Isolation Module (NEB, www.neb.com). 10. Incubate at 85°C for exactly 6 min to fragment mRNA and immediately place on ice 14. Perform the RT reaction: i. 25°C for 10min ii. 50°C for 50min iii. 70°C for 15min 28. Perform a dilution 1:3 in Tris-HCl 10mM and NaCl 10mM of the Illumina TruSeq DNA adapter (Illumina, www.illumina.com). Add 1μl of the desired diluted barcode Illumina TruSeq DNA adapter to each sample. 29-30. Prepare the master buffer mix on ice as follows: - 2 μl T4 DNA ligase HC buffer (NEB, www.neb.com) - 6.5 μl H2O - 1.5 μl polyethylene glycol (Biobasic, www.biobasic.com) Add 8.5 μl of the master buffer mix and 2 μl of the T4 DNA ligase (NEB, www.neb.com) to each well. Mix by pipetting up and down. Incubate a 16°C overnight (16h). 31. Purify using 1 volume (19.5 μl) of AMPure XP beads. 34. To perform size selection, add exactly 0.65 volume of AMPure XP beads (13 μl) to the eluted DNA and incubate at room temperature for 5 min. 35. Pull the beads to the side of the plate/tube on a magnetic stand. Carefully pipette the supernatant into a tube with 2 μl of AMPure XP beads. 39. Digest the second strand DNA with 1 μl UNG (ThermoFisher, www.thermofisher.com) and 2 μl Phusion HF Buffer at 37°C for 15min. 40. Prepare PCR reaction as follows: - 6.5 μl UNG-digested DNA - 0.4 μl primer mix Kappa (20 μM) (Kappa, www.kapabiosystems.com) - 7 μl Phusion HF Buffer 5x - 0.4 μl dNTPs [10mM] - 19.8 μl H2O - 1 μl Phusion II 41. Initial denaturation at 98°C for 30sec Repeat the next cycle 14 times - 98°C for 10 seconds - 65°C for 30 seconds - 72°C for 15 seconds Hold at 72°C for 5 minutes. 43. Purify using 1.4 volumes (49μl) of AMPure XP beads. Elute with 20μl of TE buffer.

133

Annexe 3 : Tableaux supplémentaires (Chapitre 3)

Supplementary Table 3.1. Genotype of recombinant lines (F2) derived from a cross between LA4024 and the bicolor LA3923. The InDel markers are located on chromosome 2 (version SL3.0 of the Heinz genome assembly (Fernandez-Pozo and al. 2015)). The red allele is dominant over the bicolor allele. Line 113 showed a phenotype incongruous with the recessive nature of the bicolor allele. (T: S. lycopersicum, A: S. habrochaites, H: heterozygous)

Line

Markers/ position (bp)

Phenotype cg_pen-2-2 cg_pen-2-13 cg_pen-2-3 cg_pen-2-6 cg_pen-2-5

52 289 531 52 755 298 53 452 992 54 739 502 55 842 530

LA4024 T T T T T Red

LA3923 A A A A A Bicolor

F1 H H H H H Red

228 A H H H H Red

203 A A A H H Red

199 T T H H H Red

81 H H A A A Red

169 H H A A A Bicolor

225 H H H A A Bicolor

235 H H H A A Red

217 H H H H T Red

113 T T H H H Bicolor

134

Supplementary Table 3.2. Genotype and phenotype of recombinant lines (F2) and their progeny (F3) derived from a cross between LA4024 and the bicolor LA3923. The InDel and HRM markers are located on chromosome 2 and chromosome 3 (version SL3.0 of the Heinz genome assembly. All the lines present a phenotype in accordance with the genotype on chromosome 3. (T: S. lycopersicum, A: S. habrochaites, H: heterozygous)

Markers/ position (bp)

Lines chromosome 2 chromosome 3

Phenotype

F2

F3

cg_pen-2-2 cg_pen-2-13 cg_pen-2-3 cg_pen-2-6 cg_pen-2-5 PSY1_hrm bb_uni-3-5 bb_uni_3-4

52 289 531 52 755 298 53 452 992 54 739 502 55 842 530 4 352 655 4 718 677 5 170 521

LA4024 T T T T T T T T Red

LA3923 A A A A A A A A Bicolor

F1 H H H H H H H H Red

228

A H H H H T T T Red

709 A T T T T A A A Bicolor

710 A T T T T H H H Red

725 A T T T T A A A Bicolor

203 A A A H H T T T Red

639 A A A T T H H H Red

199 T T H H H T T T Red

619 T T A A A H H H Red

623 T T A A A A A A Bicolor

625 T T A A A H H H Red

633 T T A A A T T T Red

81 H H A A A T T T Red

314 T T A A A T T T Red

318 T T A A A T T T Red

327 T T A A A H H H Red

135

Supplementary Table 3.2 (suite)

Markers/ position (bp)

Lines chromosome 2 chromosome 3

Phenotype

F2

F3

cg_pen-2-2 cg_pen-2-13 cg_pen-2-3 cg_pen-2-6 cg_pen-2-5 PSY1_hrm bb_uni-3-5 bb_uni_3-4

52 289 531 52 755 298 53 452 992 54 739 502 55 842 530 4 352 655 4 718 677 5 170 521

169 H H A A A A A A Bicolor

789 T T A A A A A A Bicolor

791 T T A A A A A A Bicolor

225 H H H A A A A A Bicolor

705 T T T A A A A A Bicolor

706 T T T A A A A A Bicolor

708 T T T A A A A A Bicolor

235 H H H A A T T T Red

734 T T T A A T T T Red

738 T T T A A H H H Red

741 T T T A A A A A Bicolor

744 T T T A A H H H Red

217 H H H H T T T T Red

678 A A A A T T T T Red

682 A A A A T T T T Red

113 T T H H H A A A Bicolor

607 T T A A A A A A Bicolor

608 T T A A A A A A Bicolor

610 T T A A A A A A Bicolor

613 T T A A A A A A Bicolor

616 T T A A A A A A Bicolor

617 T T A A A A A A Bicolor

136

Supplementary Table 3.3. Genotype of recombinant lines derived from a cross between LA4024 and the bicolor line LA3923. The line 3923-locus 2 has been selected to possess only an introgression of S. habrochaites on chromosome 2, while the lines 3923-locus 3 and 3923-locus 3a only possess S. habrochaites introgression on chromosome 3. A chromosome recombination between the markers bb_uni_3-9 and bb_uni_3-4 on 3923-locus 3a line reduced the size of S. habrochaites introgression. The InDel and HRM markers are located on chromosome 2 and chromosome 3 (version SL3.0 of the Heinz genome assembly. (T: S. lycopersicum, A: S. habrochaites, H: heterozygous)

Markers/ position (bp)

Line

chromosome 2 chromosome 3

Phenotype cg_pen-2-2 cg_pen-2-5 bb_uni_3-7 PSY1_hrm bb_uni_3-9 bb_uni_3-4

52 289 531 55 842 530 4 258 076 4 352 655 4 493 429 5 170 521

3923-locus 2 A A T T T T Red

3923-locus 3 T T A A A A Bicolor

3923-locus 3a T T A A A T Bicolor

137

Supplementary Table 3.4. List of genes found on chromosome 3 locus of LA3923-locus 3a. Gene ID Gene name

Solyc03g031560.2.1 UDP-3-O- (AHRD V1 ***- B9RXS8_RICCO); contains Interpro domain(s) IPR011004 Trimeric LpxA-like

Solyc03g031570.2.1 Dopamine beta-monooxygenase (AHRD V1 **-- B6SK92_MAIZE); contains Interpro domain(s) IPR006593 Cytochrome b561/ferric reductase transmembrane

Solyc03g031580.1.1 Stig1 (Fragment) (AHRD V1 *-*- Q9SBR0_PETHY); contains Interpro domain(s) IPR006969 Stigma-specific protein Stig1

Solyc03g031590.2.1 C4-dicarboxylate transporter/malic acid transport family protein (AHRD V1 ***- D7KUS7_ARALY); contains Interpro domain(s) IPR004695 C4-dicarboxylate transporter/malic acid transport protein

Solyc03g031600.2.1 Peroxisomal membrane protein PMP22 (AHRD V1 ***- B6TFH7_MAIZE); contains Interpro domain(s) IPR007248 Mpv17/PMP22

Solyc03g031610.1.1 Unknown Protein (AHRD V1)

Solyc03g031620.2.1 Phosphoadenosine phosphosulfate reductase (AHRD V1 *-** B7I7M3_ACIB5); contains Interpro domain(s) IPR004508 Thioredoxin-independent 5'-adenylylsulphate reductase

Solyc03g031630.2.1 Calcium-binding EF-hand family protein-like (AHRD V1 ***- Q6ZFI7_ORYSJ); contains Interpro domain(s) IPR011992 EF-Hand type

Solyc03g031640.1.1 Unknown Protein (AHRD V1)

Solyc03g031650.2.1 Autophagy-related protein 8 (AHRD V1 **-- C1EJ88_9CHLO); contains Interpro domain(s) IPR004241 Light chain 3 (LC3)

Solyc03g031660.1.1 Unknown Protein (AHRD V1)

Solyc03g031670.2.1 Calcium-dependent protein kinase (AHRD V1 **** Q8RW36_SOLLC); contains Interpro domain(s) IPR002290 Serine/threonine protein kinase

Solyc03g031680.2.1 Uncharacterized GPI-anchored protein At1g61900 (AHRD V1 ***- UGPI6_ARATH)

Solyc03g031690.2.1 DNA-directed RNA polymerases I II and III subunit RPABC3 (AHRD V1 ***- B9EM78_SALSA); contains Interpro domain(s) IPR005570 RNA polymerase, Rpb8

Solyc03g031700.2.1 ABC transporter FeS assembly protein SufB (AHRD V1 ***- C7JBP7_ACEP3); contains Interpro domain(s) IPR010231 SUF system FeS cluster assembly, SufB

Solyc03g031710.1.1 Genomic DNA chromosome 5 P1 clone MBG8 (AHRD V1 *--- Q9FFT7_ARATH)

Solyc03g031720.2.1 RNA Binding Protein 45 (AHRD V1 **** Q9LEB4_NICPL); contains Interpro domain(s) IPR000504 RNA recognition motif, RNP-1

138

Supplementary Table 3.4 (suite)

Gene ID Gene name

Solyc03g031730.2.1 Beta-glucosidase 47 (AHRD V1 **** D7MEP5_ARALY); contains Interpro domain(s) IPR001360 Glycoside hydrolase, family 1

Solyc03g031740.1.1 Glucose-6-phosphate/phosphate translocator 2 (AHRD V1 **** D7KVF2_ARALY); contains Interpro domain(s) IPR004696 Tpt phosphate/phosphoenolpyruvate translocator

Solyc03g031750.1.1 Vacuolar protein sorting-associated protein 28 family protein (AHRD V1 ***- D7MES4_ARALY); contains Interpro domain(s) IPR007143 Vacuolar protein sorting-associated, VPS28

Solyc03g031760.2.1 Homeobox-leucine zipper protein ATHB-14 (AHRD V1 *-*- ATB14_ARATH); contains Interpro domain(s) IPR002913 Lipid-binding START

Solyc03g031770.2.1 Rop-interactive crib motif-containing protein 1 (AHRD V1 *--- D7LGA6_ARALY); contains Interpro domain(s) IPR000095 PAK-box/P21-Rho-binding

Solyc03g031780.2.1 Unknown Protein (AHRD V1)

Solyc03g031790.1.1 Magnesium transporter protein 1 (AHRD V1 **-* C1BXI2_ESOLU); contains Interpro domain(s) IPR006844 OST3/OST6

Solyc03g031800.2.1 Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase 1 (AHRD V1 **** C0IRG0_9ERIC); contains Interpro domain(s) IPR016455 Xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase

Solyc03g031810.2.1 Translation initiation factor SUI1 (AHRD V1 **** Q7RQ93_PLAYO); contains Interpro domain(s) IPR005874 Eukaryotic translation initiation factor SUI1

Solyc03g031820.2.1 Tyrosyl-DNA phosphodiesterase 1 (AHRD V1 **** B8JJC1_MOUSE); contains Interpro domain(s) IPR010347 Tyrosyl-DNA phosphodiesterase

Solyc03g031830.1.1 Zinc finger family protein (AHRD V1 *-*- D7MVE2_ARALY); contains Interpro domain(s) IPR001841 Zinc finger, RING-type

Solyc03g031840.2.1 Expansin (AHRD V1 ***- Q9ZP33_SOLLC); contains Interpro domain(s) IPR007112 Expansin 45, endoglucanase-like IPR007117 Pollen allergen/expansin, C-terminal

Solyc03g031850.1.1 Unknown Protein (AHRD V1)

Solyc03g031860.2.1 Phytoene synthase 1

Solyc03g031870.1.1 Acyl-CoA synthetase/AMP-acid ligase (AHRD V1 **** A4SMQ8_AERS4); contains Interpro domain(s) IPR000873 AMP-dependent synthetase and ligase

Solyc03g031880.2.1 Amine oxidase family protein (AHRD V1 **** Q1EPI3_MUSAC); contains Interpro domain(s) IPR002937 Amine oxidase

Solyc03g031890.2.1 Cold induced protein-like (AHRD V1 *--- Q94JH8_ORYSJ)

139

Supplementary Table 3.4 (suite)

Gene ID Gene name

Solyc03g031900.1.1 Helicase sen1 (AHRD V1 *--- A8NRR5_COPC7)

Solyc03g031910.2.1 Helicase sen1 (AHRD V1 *--- A8NRR5_COPC7)

Solyc03g031920.2.1 Yellow stripe-like protein 2.1 (Fragment) (AHRD V1 ***- B4ZYE4_BRAJU); contains Interpro domain(s) IPR004813 Oligopeptide transporter OPT superfamily

Solyc03g031930.1.1 Unknown Protein (AHRD V1)

Solyc03g031940.2.1 Acyl-CoA synthetase/AMP-acid ligase II (AHRD V1 **** D0C359_9GAMM); contains Interpro domain(s) IPR000873 AMP-dependent synthetase and ligase

Solyc03g031950.1.1 Unknown Protein (AHRD V1)

Solyc03g031960.1.1 Unknown Protein (AHRD V1)

Solyc03g031970.2.1 Auxin response factor 8-1 (AHRD V1 **** E0A8P3_SOLLC); contains Interpro domain(s) IPR010525 Auxin response factor

Solyc03g031980.2.1 Receptor-like kinase (AHRD V1 ***- A7VM32_MARPO); contains Interpro domain(s) IPR002290 Serine/threonine protein kinase

Solyc03g031990.2.1 Auxin efflux carrier family protein (AHRD V1 **** D7KJ74_ARALY); contains Interpro domain(s) IPR004776 Auxin efflux carrier

Solyc03g032000.2.1 Thioredoxin reductase (AHRD V1 **** B9SRA3_RICCO); contains Interpro domain(s) IPR005982 Thioredoxin reductase

Solyc03g032010.2.1 Hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A reductase (AHRD V1 **** O48624_TOBAC); contains Interpro domain(s) IPR002202 Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, class I/II, catalytic

Solyc03g032020.2.1 Hydroxy-methylglutaryl-coenzyme A reductase (AHRD V1 **** O48624_TOBAC); contains Interpro domain(s) IPR002202 Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase, class I/II, catalytic

Solyc03g032030.2.1 Mitochondrial phosphate carrier protein (AHRD V1 **** B9H646_POPTR); contains Interpro domain(s) IPR001993 Mitochondrial substrate carrier

Solyc03g032040.2.1 MFS family major facilitator transporter D-xylose cation symporter (AHRD V1 *-** D4E1S5_SEROD); contains Interpro domain(s) IPR016196 Major facilitator superfamily, general substrate transporter

Solyc03g032050.2.1 Genomic DNA chromosome 5 TAC clone K2A18 (AHRD V1 **-- Q9FKY6_ARATH); contains Interpro domain(s) IPR019341 Alpha- and gamma-adaptin-binding protein p34

Solyc03g032060.1.1 Ring finger protein (AHRD V1 *-*- O49869_HORVU); contains Interpro domain(s) IPR018957 Zinc finger, C3HC4 RING-type

140

Supplementary Table 3.4 (suite)

Gene ID Gene name

Solyc03g032070.2.1 Holliday junction ATP-dependent DNA helicase ruvB (AHRD V1 **** D0N0A1_PHYIN); contains Interpro domain(s) IPR010339 TIP49, C-terminal

Solyc03g032080.2.1 Auxin efflux carrier family protein (AHRD V1 **** D7L9F0_ARALY); contains Interpro domain(s) IPR004776 Auxin efflux carrier

Solyc03g032090.1.1 Amino acid transporter family protein (AHRD V1 **** D7LI10_ARALY); contains Interpro domain(s) IPR013057 Amino acid transporter, transmembrane

Solyc03g032100.1.1 Unknown Protein (AHRD V1)

Solyc03g032110.1.1 Unknown Protein (AHRD V1)

Solyc03g032120.2.1 Nucleoside-triphosphatase THEP1 (AHRD V1 ***- NTPTH_THEMA); contains Interpro domain(s) IPR004948 Protein of unknown function DUF265

Solyc03g032130.2.1 High mobility group protein (AHRD V1 *--- O49948_SOLTU); contains Interpro domain(s) IPR000910 High mobility group, HMG1/HMG2

Solyc03g032140.2.1 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein H1 (AHRD V1 **-- Q6P0V0_DANRE); contains Interpro domain(s) IPR012677 Nucleotide-binding, alpha-beta plait

Solyc03g032150.2.1 Serine/threonine kinase-like protein ABC1063 (AHRD V1 **** Q1KMP8_HORVD); contains Interpro domain(s) IPR002290 Serine/threonine protein kinase

Solyc03g032160.2.1 Ubiquilin-1 (AHRD V1 *--- B6T584_MAIZE); contains Interpro domain(s) IPR015496 Ubiquilin

Solyc03g032170.1.1 Unknown Protein (AHRD V1)

Solyc03g032180.2.1 CCA-adding enzyme (AHRD V1 *--- CCA_STAES); contains Interpro domain(s) IPR002646 Polynucleotide adenylyltransferase region

Solyc03g032190.2.1 Cyclin B2 (AHRD V1 **** Q9XGI1_SOLLC); contains Interpro domain(s) IPR014400 Cyclin, A/B/D/E

Solyc03g032200.1.1 Unknown Protein (AHRD V1)

141

Supplementary Table 3.5. Expression of genes (FPKM) located in the bicolor locus of LA3923-locus 3a (4,074,672-4,764,329 bp).

Gene Name LA4024 LA3923-locus 3a

Solyc03g031560.3 0,93 0,76

Solyc03g031570.3 0,00 0,00

Solyc03g031580.2 0,00 0,00

Solyc03g031590.3 0,00 0,00

Solyc03g031600.3 5,73 0,56

Solyc03g031610.1 0,00 0,00

Solyc03g031620.3 14,85 23,23

Solyc03g031630.3 0,00 0,17

Solyc03g031640.1 0,00 0,00

Solyc03g031650.3 4,16 1,29

Solyc03g031655.1 0,00 0,00

Solyc03g031660.1 0,03 0,01

Solyc03g031670.3 24,89 11,10

Solyc03g031680.3 1,38 0,35

Solyc03g031690.3 57,60 64,03

Solyc03g031700.3 0,02 0,16

Solyc03g031710.2 0,00 0,00

Solyc03g031720.3 110,77 93,50

Solyc03g031730.3 0,00 0,00

Solyc03g031740.2 0,02 0,02

Solyc03g031750.2 11,19 86,31

Solyc03g031755.1 4,73 0,02

Solyc03g031760.3 0,60 1,11

Solyc03g031770.3 0,00 0,04

Solyc03g031780.3 0,16 0,06

Solyc03g031790.1 0,00 0,00

Solyc03g031800.3 0,00 0,11

Solyc03g031810.3 0,00 0,00

Solyc03g031820.3 5,11 5,70

Solyc03g031830.1 0,00 0,00

Solyc03g031840.3 12,48 2,13

Solyc03g031850.1 0,00 0,00

Solyc03g031860.3 2060,10 30,31

Solyc03g031870.2 0,00 0,00

142

Supplementary Table 3.5 (suite)

Gene Name LA4024 LA3923-locus 3a

Solyc03g031880.3 0,65 0,13

Solyc03g031890.3 12,95 12,01

Solyc03g031900.2 0,01 0,04

Solyc03g031910.3 1,11 0,32

Solyc03g031920.3 100,98 16,67

Solyc03g031940.3 0,00 0,20

Solyc03g031950.2 352,98 507,65

Solyc03g031960.1 0,00 0,00

Solyc03g031970.3 18,07 9,24

Solyc03g031980.3 0,01 0,35

Solyc03g031990.3 0,00 0,07

Solyc03g032000.3 0,00 0,07

Solyc03g032010.3 19,75 23,95

Solyc03g032020.3 22,55 10,12

Solyc03g032025.1 0,02 0,02

Solyc03g032030.3 5,35 3,51

Solyc03g032035.1 0,62 0,00

Solyc03g032040.3 3,21 0,14

Solyc03g032050.3 15,03 7,85

Solyc03g032055.1 0,02 0,00

Solyc03g032060.1 0,00 0,00

Solyc03g032070.3 24,57 12,24

Solyc03g032080.3 0,04 0,64

Solyc03g032090.1 0,00 0,00

Solyc03g032100.2 5,75 4,90

Solyc03g032110.2 0,00 0,14

Solyc03g032120.3 5,38 10,10

Solyc03g032130.3 266,22 223,22

Solyc03g032140.3 10,92 8,70

Solyc03g032150.3 39,35 19,61

Solyc03g032160.3 48,89 39,47

Solyc03g032170.2 0,53 0,57

Solyc03g032180.3 6,76 2,87

Solyc03g032190.3 0,00 0,00

Solyc03g032200.2 0,00 0,00

Solyc03g032210.3 0,00 1,10

Solyc03g032220.3 0,23 0,13

143

Supplementary Table 3.6. Differentially expressed genes in chromosome 3 locus (4,074,672-4,764,329 bp) between red, yellow and bicolor fruits (±SE).

Gene Bicolor Red Yellow

Solyc03g031860 Phytoene synthase 1 1027,33 ± 62,07b 3132,44 ± 341,73a 818,32 ± 162,77b

Solyc03g031970 Auxin response factor 8-1 9,74 ± 0,70b 15,80 ± 1,01a 12,27 ± 1,43a

Solyc03g032100 Phosphoenolpyruvate carboxylase 1 4,36 ± 0,40b 5,60 ± 0,28a 4,67 ± 0,28a

144

Supplementary Table 3.7. Principal splicing sites in red tomato cultivars. The number of reads that perform each splicing in the cultivars analyzed are given in order to evaluate their frequency. Splicing positions are described in Supplementary Figures 3.4, 3.5 and 3.9.

Red

Start End 4024 Vendor

Mexico

Midget Gigantesque

Ailsa

Craig Ballada

Homer's

German

Oxheart

Pruden's

Purple

Gregori's

Altai

g 4,347,513 4,351,300 - - - - - - - - -

h 4,351,490 4,352,127 - - - - - - - - -

i 4,351,513 4,352,127 - - - - - - - - -

j 4,351,590 4,352,127 - - - - - - - - -

a 4,350,905 4,351,143 6120 14936 7079 8101 9412 5233 17634 6504 16290

c 4,350,905 4,350,990 697 858 429 1364 1819 536 2417 1072 2426

k 4,350,905 4,352,903 - - 68 - - 61 - - -

d 4,350,905 4,352,127 908 1266 1369 127 1014 1441 2176 3299 2996

f 4,351,005 4,351,143 396 600 122 619 592 658 1487 726 1230

e 4,351,054 4,351,143 4888 7542 4138 16878 13872 8974 22423 14366 24287

b 4,351,184 4,352,127 17895 33887 16953 39708 34058 27769 61451 30970 54570

l 4,351,184 4,352,903 - - - - - - - - -

m 4,352,782 4,352,903 27300 54246 29707 60946 49530 24858 91737 51839 57542

n 4,352,953 4,353,377 26664 46331 26861 52228 43113 38497 77127 45901 49552

o 4,353,549 4,353,863 22633 33238 21391 40472 30796 29795 55974 34088 28127

p 4,354,098 4,354,617 24793 48244 22704 43507 36093 37709 69672 40066 48490

q 4,354,809 4,355,499 16800 39322 16905 36497 28408 31085 52057 30000 34115

r 4,361,338 4,361,798 - - - - - - - - -

145

Supplementary Table 3.8. Principal splicing sites in bicolor tomato cultivars. The number of reads that perform each splicing in the cultivars analyzed are given in order to evaluate their frequency. Splicing positions are described in Supplementary Figures 3.4, 3.5 and 3.9.

Bicolor

Start End Grapefruit

Striped

German Mr Stripey

Mortage

Lifter

bicolor

Granada Mom's Isis

Candy

g 4,347,513 4,351,300 2812 5533 3805 3666 2706 2453 3473

h 4,351,490 4,352,127 914 1490 937 1037 944 995 622

i 4,351,513 4,352,127 1324 2498 1930 1583 1496 1688 928

j 4,351,590 4,352,127 782 531 332 541 347 662 354

a 4,350,905 4,351,143 - - - - - - -

c 4,350,905 4,350,990 - - - - - - -

k 4,350,905 4,352,903 - - - - - - -

d 4,350,905 4,352,127 - - - - - - -

f 4,351,005 4,351,143 - - - - - - -

e 4,351,054 4,351,143 - - - - - - -

b 4,351,184 4,352,127 - - - - - - -

l 4,351,184 4,352,903 - - - - - - -

m 4,352,782 4,352,903 15692 25920 18350 18007 13747 15172 16323

n 4,352,953 4,353,377 13110 25240 18102 16047 12679 13747 13488

o 4,353,549 4,353,863 11667 22358 14594 13411 11441 11485 9676

p 4,354,098 4,354,617 13329 23166 15711 14795 12379 12927 11930

q 4,354,809 4,355,499 9292 17302 11998 10919 9542 9865 8816

r 4,361,338 4,361,798 - - - - - - -

146

Supplementary Table 3.9. Principal splicing sites in yellow tomato cultivars. The number of reads that perform each splicing in the cultivars analyzed are given in order to evaluate their frequency. Splicing positions are described in Supplementary Figures 3.4, 3.5 and 3.9.

Yellow r Yellow ry

Start End

Lemon

Drop

Barry's

Crazy

Cherry

Butter

Apple

Téton de

Vénus

Poma

Amoris

Galina's

Yellow Mirabelle

Gold

Currant

g 4,347,513 4,351,300 - - - - - - - -

h 4,351,490 4,352,127 - - - - - - - -

i 4,351,513 4,352,127 - - - - - - - -

j 4,351,590 4,352,127 - - - - - - - -

a 4,350,905 4,351,143 2802 1168 2118 3734 4604 3972 4157 3751

c 4,350,905 4,350,990 483 215 448 884 757 657 358 373

k 4,350,905 4,352,903 332 140 471 71 - - - -

d 4,350,905 4,352,127 128 455 179 1267 1150 374 354 618

f 4,351,005 4,351,143 135 122 123 322 338 240 180 157

e 4,351,054 4,351,143 2224 2823 3588 9766 7197 4319 2835 2170

b 4,351,184 4,352,127 3286 5393 5450 17960 17111 12816 10206 9856

l 4,351,184 4,352,903 4184 353 3250 - - - - -

m 4,352,782 4,352,903 706 886 627 24611 22118 18751 16283 15881

n 4,352,953 4,353,377 4926 1373 4395 21740 19385 15324 15198 1869

o 4,353,549 4,353,863 4713 1243 4291 16681 14650 11412 12902 10417

p 4,354,098 4,354,617 4744 1348 4663 21238 17721 12831 13829 11716

q 4,354,809 4,355,499 4101 1067 3870 20339 17273 14468 16216 12457

r 4,361,338 4,361,798 - - - 38421 5267 4424 5350 3784

147

Supplementary Table 3.10. Primer sequences of the markers

Name primer Left primer Right primer

cg_pen_2-2 GCACAAGCGAAAACAGCA GGTCCATTCCCAACCAA

cg_pen_2-3 GCGGCAACAACTACAGGAC TTACGCCCAAACCACTGA

cg_pen_2-5 CAAACTGCTGGCAGAAAGG TCTCCACTTGAGCCACTTCA

cg_pen_2-6 GACTCCGGTAAGCACTTTCA ACGGGATATCTACAGGTGCAGT

cg_pen_2-13 CTCCAGAAGTGGATGGGAAG CCAAACAGGTCAAACACCAA

bb_uni_3-4 TGAGTGTGCTTGGTTCTTTG ATAGGAGGGGTTAGGCTTGG

bb_uni_3-5 TCAGGAGATTGAGATGGAGGA CAACTACCATGTGAAACACAG

bb_uni_3-7 AACGTGCTCGATCCATGTAA GGGCTGTTGTTGATGTCTCC

bb_uni_3-9 CCGCGAAATGCCAGTACTAT CTCATGTGTCCAATACAATCCAA

PSY1_hrm_1 TCGGAACAGATGGTCTATGATG TCCGGCTTCACTTCTAACTC

PSY1_hrm_2 CGTTGTCCATCTTTATTCCAC TATGACGGATGCCTTTTGAA