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DFG-SP-3 / Biotechnologies et Biopharmacie

Biopharmacie

Protéines à usage thérapeutique

Généralités – Rappels - Stabilité

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1. Généralités

Évolution du nombre de nouveaux biomédicaments sur le marché

Biomédicaments commercialisés en France

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180 164 168 173

160

140

120

100

80

60

140

115

58

40 23 20

0 3 10

1984 1989 1994 1999 2004 Années

2008 2011 2012 2013

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Des molécules très variées:

20/04/2012

France leader mondial vaccin

Au 31 mai 2014, 173 Biomédicaments commercialisés en France, 9 classes majeures

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Classification par aire thérapeutique :

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Evolution de la part des biomédicaments:

Part des biomédicaments parmi les nouvelles molécules approuvées par la FDA

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Biomédicaments en développement:

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Positionnement des biosimilaires:

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Macromolécule non synthétisable par voie chimique ou extraite en quantité insuffisante Exemple de l’érythropoïétine (EPO):

– Glycoprotéine de 165 AA synthétisée par le rein – Trace dans les urines: trop peu pour extraire – Production insuffisante chez l’IRC ! Anémie

Alternative thérapeutique / Sécurité virale Exemple de la somatropine (GH):

– Protéine de 191 AA synthétisée par l’hypophyse – Avant : extraite de cadavre humain ! maladie de Creutzfeld-Jakob

Protéine chimère

Exemple immunoglobuline « humanisée » – Création de novo d’Ac monoclonaux – Fab murin / Fc humain

INTÉRÊTS DES PROTÉINES RECOMBINANTES EN THÉRAPEUTIQUE

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• molécules de haute MM et instables

• Structure basée sur interactions faibles

• facilement détruites par des conditions douces de stockage

• difficulté de production à grande échelle

• techniques de fabrication et réglementations spécifiques

(provient du monde vivant)

insuline

Hb

EPO

IFN-γ IgG

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ue Rappels sur la structure des protéines

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Termes : interactions « locales » et des interaction « non locales»

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Caractéristiques structurales des deux états principaux

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- proviennent de l’association non covalente entre des molécules électriquement neutre.

- Ces forces agissent à très faible distance - Ces forces sont individuellement faibles

- étant donné leur nombre important, elles sont susceptibles de contribuer de façon importante à la stabilité des protéines.

Les interactions de Van der Waals

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Liaisons hydrogènes

- nombre de liaisons hydrogènes observées dans les protéines (~ 1.1/aa) - donc : un rôle prépondérant.

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Autres effets à prendre en compte Ponts salins Interactions entre aromatiques Liaisons des métaux Ponts disulfures

Interaction entre deux charges opposées

Interaction π−π

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Les structures locales (motifs, turns, etc …) sont souvent stabilisées par une combinaison complexe

des différents facteurs mentionnés

Exemple: Dissection d’un motif de verrou d’hélice, le « hydrophobic staple motif »

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Contributions majeures L’entropie conformationnelle de la protéine L’effet hydrophobe Les interactions van der Waals Les liaisons hydrogènes

Autres effets à prendre en compte

Ponts salins Interactions entre aromatiques Liaisons des métaux Ponts disulfures …

Facteurs contribuant à la stabilité des protéines

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ue Problèmes liés au comportement in vivo des protéines thérapeutiques

Inactives par voie orale

Si MM importante, Capture hépatique

Petites MM et peptides Clairance rénale rapide

Taux plasmatique élevé après i.v.

Réaction immunitaire : Clairance rapide Réactions adverses

Dégradation en sous-cutané

2. Distribution, élimination et relations PK/PD

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2. Distribution, élimination et relations PK/PD

PK et PD (pharmacocinétique et pharmacodymamie) : impact important sur le développement d’un médicament Compréhension de la relation dose-effet : source de du rationnel en clinique (dose, application clinique) Illustration : ICH E4 Dose Response Information to Support Drug Registration Problèmes spécifiques aux produits biotech:

- Manque de spécificité et de sensibilité des dosages - faible biodisponibilité - élimination rapide

Importance de ces aspects :

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Volume de distribution : faible car MM élevées Généralement réduit à l’espace extracellulaire Largement limité du fait de l’incapacité au passage membranaire Peut être plus important si: - Capture active par les tissus - Liaisons fortes aux protéines intra- et extravasculaires

Après administration i.v.: - Profil bi-exponentiel :

- compartiment central : espace vasculaire et interstitiel des organes très perfusés (foie, reins) - compartiment périphérique : espace interstitiel des organes faiblement perfusés

2. Distribution, élimination et relations PK/PD

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Biodistribution : en + des facteurs physicochimiques : - capture par site spécifique - capture par liaison à des récepteurs

- peut être un avantage si exploitée : Ex: DDS ciblé par la transférrine Permet la capture par endocytose via les récepteurs par des cellules cancéreuse qui surexpriment ces récepteurs

Elimination : - Peptides : souvent activité hormonale et T1/2 court : participe à une régulation de leur taux endogène et leur action. - Protéines : élimination très longue (plusieurs jours) - Métabolisme par les mêmes voies

2. Distribution, élimination et relations PK/PD

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Protéolyse : - Protéases, peptidases (localisation générale) - Activité métabolique intense : foie, reins, TGI (liquide et tissus), sang - Présence démontrée d’ endo-oligopeptidase dans le tissu nerveux, dans le sang (lymphocyte T, leucocyte)

Elimination rénale : a) La filtration glomérulaire : - cas des peptides et petites protéines :

- filtration glomérulaire suivie de la réabsorption dans des vésicules d’ endocytose dans le tube proximal - suivie d’une hydrolyse générant des petits fragments de peptides et AA libres

- difficulté de cerner les seuils de filtration en terme de MM, voire de charge

2. Distribution, élimination et relations PK/PD

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b) Hydrolyse par les enzymes de la bordure en brosse - Localisation sur la membrane luminale - suivie de la réabsorption des métabolites - concerne des petits peptides (angiotensine, glucagon, …) - protéines plus complexe ou de MM élevée: endocytose et dégradation intralysosomiale - Implique de transporteurs spécifiques de type PEPT1 et PEPT2 : rôle dans le transport des di- et tripeptides

2. Distribution, élimination et relations PK/PD

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c) Extraction par les capillaires postglomérulaires et métabolisme intracellulaire

Elimination hépatique - Endopeptidase/cathepsine B et D - Transport via récepteurs puis métabolisme Endocytose via les récepteurs - Capture par ce mécanisme lié à leur caractère endogène - Organes possédant ces récepteurs = lieu de capture puis

métabolisme - Comprend organes en plus du foie, y compris tissu cible - Haute affinité mais faible capacité de liaison (nb de récepteurs

faible!) donc saturables! ne suit pas PK de superposition dose-dépendante

2. Distribution, élimination et relations PK/PD

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Stratégies :

Polymères Carbohydrates

Protéine thérapeutique

Conjugaison Conjugaison Modification fusion

Conjugaison Modification

liaison

Conjugaison Modification

liaison

Polymères recomb.

mimétiques

Fcγ Albumine

mutagénèse

mutagénèse

Rh

Réduction de la clairance via les récepteurs

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Formulation Stockage

Biodisponibilité

La problématique pharmaceutique :

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3. Aspects chimiques et physicochimiques de l’instabilité

des protéines

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ue La stabilité « paradoxale » des protéines

Etudes de stabilité des protéines: • Nécessité d’une approche méthodologique différente de celle des médicaments conventionnels • structure complexe, très sensible aux process de fabrication • Activité biologique étroitement corrélée aux différentes conformations • Nombreuses voies de dégradation • Instabilité physique et notamment l’agrégation des protéines: cause majeure d’instabilité • Parmi les conséquences potentielles de l’instabilité : immunogénicité et induction d’anticorps MAIS : Globalement des stabilités étendues dans le temps, jusque 3 mois à 4°C et 22°C pour un grand nombre d’anticorps monoclonaux ….

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Protéine native et fonctionnelle

Protéine partiellement ou totalement dépliée

Changements Non covalents

Changements covalents

- agrégation - adsorption de surface - précipitation

- déamidation - racémisation - oxydation - hydrolyse (pep, glyc) - échange pont S-S - …

= dégradations irréversibles

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ue 3.1. Instabilité chimique :

déstabilisation covalente

3.1.1. Déamidation

- hydrolyse de la chaîne latérale de l’asn et gln

- Influence du pH, de la température et de la force ionique

- conduit à des impuretés, produits de dégradation et entraine des réactions immunogènes

- ex: hormone de croissance, insuline, hémoglobine, γ-globulines

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3.1. Instabilité chimique : déstabilisation covalente

3.1.1. Déamidation

Hydrolyse directe en condition acide Libère l’AA correspondant Rarement observé car à pH 3

En conditions neutre ou basique : - réaction de cyclisation intramoléculaire - attaque nucléophile de l’azote n+1 de la chaine principale sur le groupe carboxylique de la ch. latérale de l’asn - concerne plus l’asn que gln du fait de la meilleure stabilité de l’hétérocycle à 5 atomes vs 6 pour la gln

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3.1. Instabilité chimique : déstabilisation covalente

3.1.1. Déamidation

Effet de la séquence sur la déamidation: - AA à chaine courte après l’asn facilite la déamidation car peu d’effet stérique - AA donneur de liaison hydrogène : accélère la réaction par interaction avec l’O du carbonyl de l’asn le rendant plus électrophile donc sensible à l’attaque nucléophile

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3.1. Instabilité chimique : déstabilisation covalente

3.1.1. Déamidation

Effet de la séquence sur la déamidation: - AA à chaine courte après l’asn facilite la déamidation car peu d’effet stérique - AA donneur de liaison hydrogène : accélère la réaction par interaction avec l’O du carbonyl de l’asn le rendant plus électrophile donc sensible à l’attaque nucléophile Effet de la structure: - effet de la flexibilité de la chaine - effet du placement de l’asn dans une structure secondaire (α-helices, feuillets β, et β –turns)

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ue Réaction de déamidation : cas des anticorps monoclonaux

Ex du LA 298 (Ig1 humanisée)

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3.1. Instabilité chimique : déstabilisation covalente

3.1.2. Isomérisation de l’Asp

= interconversion asp-isoasp Contrôlé par la formation du cycle intermédiaire Implique la forme protonée de l’asp : contrôle par le pH (réaction limitée à pH 5) Effet stérique: taille de la partie C-terminale; si importante, limite l’isomérisation Affecte les Mabs, NGF

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3.1. Instabilité chimique : déstabilisation covalente

3.1.3. Hydrolyse de l’Asp

3.1.4. Hydrolyse du Trp

associée avec la dégradation de l’Asp = hydrolyse de la chaîne peptidique (= hydrolyse)

- Chaîne latérale du Trp sensible à l’hydrolyse - produit de dégradation = kynurénine (λem = 450 nm) - Kynurénine et dérivés formés aussi lors de l’oxydation du Trp

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3.1. Instabilité chimique : déstabilisation covalente

3.1.5. Hydrolyse de la chaine principale

- possible même sans présence d’Asp - affecte la région charnière - possible à l’interface CH2-CH3 - concerne principalement les Ig1 - influence de la flexibilité de la chaîne - vitesse dépendante du pH ( courbe en V; min pH = 6)

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ue 3.1.6. Racémisation et β-élimination

- étape initiale : déprotonation du C en α - la liaison C-H d’un AA possède un caractère acide - processus de racémisation: très lent (permet de dater!) - se produit sur le résidu Asp - dès la protonation, la recombinaison évolue vers la racémisation

- le carbanion se réarrange et éjecte un groupement à partir du C en β, créant une double-liaison entre le Cα et le Cβ = β élimination

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3.1.6. Racémisation et β-élimination

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3.1.7. Formation de dikétopiperazine (DKP)

- = autre exemple de cyclisation N-terminale

- groupe NH2 terminal = nucléophile potentiel, surtout à pH 8 - si attaque du 2ième groupe carbonyle un cycle dikétopipérazine est formé Phénomène connu en synthèse peptidique Stockage à long terme Favorisé si séquence terminale NH2-Gly-Pro

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3.1.8. Formation de pyroGlu

- attaque nucléophile sur amine N-ter de Glu ou Gln - obtention d’un cycle à 5 atomes

- concerne Mabs car Glu fréquent en position N-ter sur la chaîne légère, parfois sur chaîne lourde - observé sur stockage long terme -Réaction dépendante du pH, tampon (phosphate)

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3.1.9. Réaction de Maillard

- réaction en présence d’un sucre réducteur - implique une base (typiquement ch. latérale de la Lys et groupe carbonyle du sucre) - Formation d’une base de Schiff, puis évolution en produits plus stables

- Possible en solution comme en état solide - In vitro et in vivo - ex: glycation de l’Hb comme marqueur du diabète!

- Affecte la stabilité - attention aux excipients sucrés (glucose, lactose, fructose, maltose); voire dégradation du sucrose par hydrolyse

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3.1.10. Oxydation

- Réaction d’importance autre que l’hydrolyse - toute protéine contenant : His, Met, Cys, Tyr, Trp = peut être oxydée par des ROS - à tout stade : production, purification, formulation et stockage - facteurs extrinsèques : pH, tampon

et intrinsèques : flexibilité de la chaine, structure globale

Deux catégories: - site-spécifique - non site-spécifique

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- Oxydation de la méthionine: formation d’un sulfoxyde - Oxydation catalysée par des métaux : liaison d’un métal à une protéine via Gly, Asp, His et Cys

- oxydation d’un Trp : formation de kinurénine

- photo-oxydation : reflétée dans les ICH comme test (Tyr, Phe, Trp) - Oxydation de la cystéine : formation de ponts disulfures

Mécanismes impliqués :

3.1.10. Oxydation

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3.1.11. Echange de ponts disulfure

Capacité de la Cys à former des ponts disulfures Rôle dans l’agrégation Affecte la conformation

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Structure d’un anticorps de type Ig4

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= perturbation des forces de liaison faible Facteurs : - Physico-chimiques pH T° f.i. et nature des ions - Physiques pression cisaillement agitation Importance de la formulation et des procédés

3.2. Instabilité physique : déstabilisation non-covalente

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3.2. Instabilité physique : déstabilisation non-covalente

3.2.1. Phénomènes de dénaturation

- Traduisent la perte de la conformation 3D native

- changement d’ordre physique et non chimique

- peut affecter structure Iaire et/ou IIIaire

- effet de la température (élevée, basse)

- effet de l’environnement chimique

- effet de la pression

- dénaturation à l’état solide

- protéines intrinsèquement dénaturées

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3.2.1. Phénomènes de dénaturation

Dénaturation thermique

- T° vs fraction de protéine dénaturée : forme sigmoïde - point d’inflexion = T°m (température de « fusion ») - une augmentation traduit une meilleure stabilité

- mais étude de réversibilité = meilleur indicateur de stabilité

- le +souvent = irréversible car conduit à des agrégats - observable en DSC

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3.2.1. Phénomènes de dénaturation

Dénaturation thermique

Pharm Res. 1998;15:200–8

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3.2.1. Phénomènes de dénaturation

Dénaturation au froid

- domaine peu exploré - car dénaturation à la congélation

- température de transition : souvent <-20°C car présence de stabilisants donc protéines dans un état similaire à l’état fluide!

- donc à ne pas négliger

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3.2.1. Phénomènes de dénaturation

Dénaturation par agent chimique - détermination de l’énergie libre de dénaturation par utilisation d’agents chaotropes - mécanisme complexe :effet mal compris (interaction avec liaison peptidique ? Solubilisation des molécules hydrophobes ?) SCN-, ClO4

-, I- Ba2+, Ca2+ Urée Ion guanidinium Dénaturation sous pression

- généralement réversible - possible mais à très haute pression (2000 bars) - peut être utilisé pour dissocier des agrégats (100-1500 bars)

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ue 3.2. Instabilité physique :

déstabilisation non-covalente

3.2.2. Phénomènes d’agrégation

Largement cité lors des étapes de fabrication Point clé relevant même des agences règlementaires Conséquences: -immunogénicité, toxicité -Perte d’efficacité -Peut conduire à des états réversibles comme irréversibles -Apparition de turbidité en solution

-Origine très diverses : covalentes, non covalentes

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3.2. Instabilité physique : déstabilisation non-covalente

3.2.2. Phénomènes d’agrégation

Les causes sont multiples et très variées : - repliement non correct durant la synthèse - purification - formulation - congélation-décongélation - lyophilisation - séparation (ultrafiltration, diafiltration) - remplissage des flacons, des seringues - pompage, transfert - stockage

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ou

Monomère natif Oligomérisation réversible

Oligomères de haute MM (possibilité d’irréversibilité)

Mécanisme 1 : ASSOCIATION REVERSIBLE D’UN MONOMERE NATIF

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Monomère natif Changement de

conformation ou dépliement

partiel

Oligomérisation de la protéine non native

Oligomères de haute MM (irréversibilité)

Mécanisme 2 : ASSOCIATION DE MONOMERES ALTERES

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Mécanisme 3 : ASSOCIATION DE PRODUITS ISSUS DE DEGRADATION CHIMIQUE

Monomère natif Protéines modifiés

(oxydation,…)

Oligomérisation de la protéine modifiée

Oligomères de haute MM (irréversibilité)

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Monomère natif

Nucleus critique (agrégats ou contaminant)

Ajout de protéines sur la surface du nucleus

(souvent avec dépliement partiel)

Particules visibles voire

précipités

Mécanisme 4 : AGREGATION PAR NUCLEATION

+

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Mécanisme 5 : AGGREGATION INDUITE PAR UNE SURFACE

Monomère natif

+

Contenant: Surface

+ Interface liquide-air

Adsorption de monomères sur la surface :

provoque le dépliement partiel

Agrégation des protéines altérées cf. Mécanisme 2

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3.2. Instabilité physique : déstabilisation non-covalente

3.2.3. Phénomènes de précipitation

- Phénomène d’agrégation aboutit à des agrégats de très large Taille -limite de solubilité atteinte pour ceux-ci - entraîne la précipitation

- protéines partiellement ou compétemment dépliées - phénomène irréversible - impact règlementaire USP 788 : 10 à 25 µm mais insuffisant! - recommandation ICHQ6B: garantir la sécurité et efficacité

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3.2.4. Phénomènes d’adsorption de surface

- Nombreuses interfaces disponibles durant le procédé de fabrication jusqu’au conditionnement - ne pas sous-estimer le phénomène

- interaction de la protéine native voire préférentiellement de la protéine partiellement dépliée (énergétiquement plus favorable) - favorisée par exposition de résidus hydrophobes normalement enfouis dans la protéine - forces de tension de surface responsables (air-liquide, solide-liquide) : conduisent à l’agrégation - si désorption: communication de ce phénomène en solution

3.2. Instabilité physique : déstabilisation non-covalente

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3.2. Instabilité physique : déstabilisation non-covalente

3.2.4. Phénomènes d’adsorption de surface

Origines du phénomène multiples:

- Interactions avec des membranes - présence de particules étrangères/ verre, métal, caoutchouc - huiles de silicone

Interfaces mise en cause :

- liquide-air : la plus problématique; liée à l’agitation (mélange); production: remplissage; manutention, transport - solide-air : glace-air; durant les cycles de congélation-décongélation