génomique structurale et fonctionnelle chez les animaux de...

10/10/2008

Génomique structurale et fonctionnelle chez les animaux de rente

Laurence FLORIGénétique Animale et Biologie Intégrative

INRA, Jouy-en-Josas

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Plan de l’exposéIntroduction et définitions

La génomique structurale1. La cartographie des génomes animaux2. L’amélioration génétique

- Principes

- Exemples de détections de QTLs

- Sélection assistée par marqueurs (SAM)

La génomique fonctionnelle1. Transcriptome et protéome2. Etude du transcriptome

- Techniques bas et haut-débit

- Vers le séquençage du transcriptome

- Exemples d’étude du transcriptome

La génomique génétique

Conclusion

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Introduction et définitions

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Les animaux domestiquesUne ressource pour comprendre les bases moléculaires

de la variation phénotypique

• L’élevage des animaux domestiques a abouti à une grande diversité intra-spécifique (races)

• Comprendre la base génétique de la diversité phénotypique inter et intra-spécifique est un des enjeux majeurs de la biologie moderne.

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Les animaux de rente

� Mammifères:Bos taurus Ovis aries Capra hircus

Sus scrofa Equus caballus Orytolagus cuniculus

� Volailles:

Gallus gallus Anas platyrhyncos

� Poissons:

Onchoryncus mykiss

Une vingtaine d’espèces domestiquées il y a plus de 8000 ans (pour la plupart).

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Une vision formelle de l’élevage…

• L’élevage des animaux de rente est basée sur «

maîtrise de la génération animale » (Aristote)

• Les trois éléments de la génération animale (Vissac, 2002)

� Contexte : pratiques d’élevage (nutrition)

� Contenant : techniques de reproduction (I.A.,OPU/FIV)

� Contenu : la génétique (Amélioration génétique)

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Quelques exemples de caractères d’intérêt zootechnique …

• Porc– Composition de la carcasse– Pathologie tumorale (Mélanome)

• Poulet– Résistance aux maladies– Modèle d’épilepsie

• Cheval– Diverses pathologies

• Espèces aquacoles– Caractéristique de la chair et

des carcasses– Résistance aux maladies virales

et bactériennes

• Mouton– Tremblante– Résistance aux salmonelles

• Lapin– Caractère Rex (pelage)

• Chèvre– Débit de traite

• Bovin– Caractères de production– Caractères fonctionnels

• Fertilité des vaches laitières• Résistance aux mammites

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L’amélioration génétique basée sur la sélection sur indice

• L’Amélioration Génétique s’appuie sur un choix rationalisé des

candidats à la reproduction

• Très efficace durant les dernières décennies

– Explique de 1/2 à 2/3 de l’amélioration des performances en production laitière (x4 depuis 1950)

• Les méthodes classiques sont basées sur :

– Collecte d’informations de performances individuelles

– Compilation des observations avec des informations généalogiques

– Généalogie VS Performance ⇒⇒⇒⇒ « Indice de sélection » pour chaque candidat à la reproduction

– Diffusion du progrès génétique (I.A.)

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Amélioration génétique et génomique

• Quelques limites de la sélection classique sur indice

– Certains caractères sont difficiles à mesurer (résistance aux maladies)

– Certains caractères ont une héritabilité faible (fertilité)

– Certains caractères sont antagonistes (QL & fert)

– Coût de l’évaluation des candidats à la reproduction (40k€/taureau d’IA)

• Apport de la dissection moléculaire des caractères d’intérêt

– Sélection directe des individus sur la base de leur génotype

– Compréhension du déterminisme moléculaire et des mécanismes physiologiques

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Atouts/Limites des animaux de rente

• Les Atouts :– Très bon suivis et beaucoup d’informations sur les populations exploitées

(pour les besoins de la sélection) :

• Information généalogique (Livres généalogiques)

• Information phénotypique

• Facilités pour l’obtention d’échantillons

– Possibilité de réaliser des accouplements dirigés : croisement entre 2 races (variabilité génétique !)

• Les Limites : des dispositifs expérimentaux optimaux impossibles (ou difficiles) à réaliser

– Il n’existe pas de lignées pures (=! souris, rat)

– Temps de génération souvent importants

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Le programme de l’INRA

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Génomenucléaire

Génomique structuraleGénomique structurale

ARNmARNmTraductionTraduction

DégradationDégradation

Génomique fonctionnelleGénomique fonctionnelle

ProtéomeTranscriptome

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La génomique structurale

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1. La cartographie des génomes animaux

2. Application: l’amélioration génétique des animaux

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La génomique structurale• C’est d’abord … avoir les outils pour baliser et étudier la

structure du génome– Marqueurs génétiques (microsatellites et SNP)

• Balises du génome et traceurs de l’information génétique

– Cartes génomiques

• « Charpente » et « articulation » du génome

– Collections représentatives du génome

(Banques de grands fragments d’ADN)

• BAC (Bacterial Artificial Chromosome)

• Intérêts– Connaissance fondamentale

– Amélioration génétique

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Cartographie génomique

• Cartographie génétique

– Loci polymorphes et familles de référence

• Cartographie physique chromosomique

– Hybrides somatiques

– Hybridation In Situ

– Hybrides d’irradiation

• Cartographie physique moléculaire

– Contig du génome

– Séquence complète de l ’ADN

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Cartographie génétique• Objectif: mesurer la distance entre 2 marqueurs par recombinaison méiotique et déterminer l’ordre des marqueurs le long du chromosome

• Principe: – Etude de la co-ségrégation des marqueurs au cours de la méiose– Estimation de leur ordre sur le chromosome– Calculer la distance génétique:

d=F(R) d en cM (centimorgan), R=taux de recombinaison

La mesure de la distance génétique est la fraction de recombinaison

(cM)

• Nécessite le développement de marqueurs génétiques et la collecte de familles

• Deux approches générales

– cartographie par marqueur-caractère : localiser des gènes d ’intérêt– cartographie par marqueur-marqueur : construire une charpente de cartes grâce à des marqueurs

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Les marqueurs moléculaires� Intérêt en cartographie :

� suivi de la transmission de segments chromosomiques au sein du pedigree

� Les 4 qualités nécessaires des marqueurs � Polymorphisme : suivi des évènements de recombinaisons au fil des générations

� Homogénéité dans la répartition génomique

� Neutralité (pas de biais de ségrégation)

� Tous les génotypes peuvent être identifiables (homozygotes et hétérozygotes)

� Types de marqueurs :

� VNTR: Mini et microsatellites

� Mutations ponctuelles: SNP (Single Nucleotide Polymorphism)

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CCACCTCTCCCCCTA(CA)CCACCTCTCCCCCTA(CA)2525GGTTGAAACGCACCAGGGTTGAAACGCACCAG

Exemple de microsatellite…

..GAATCTTATGCTATACATAATTATATACTAATCGGGTATTGTTCTTAT..

..CTTAGAATACGATATGTATTAATATATGATTAGCCCATAACAAGAATA..

..GAATCTTATGCTATACATAATTATATACTAATAGGGTATTGTTCTTAT..

..CTTAGAATACGATATGTATTAATATATGATTATCCCATAACAAGAATA..

Ind 1

SNPSNPSNPSNP

Ind 2

Exemple de SNP…

Les marqueurs moléculaires

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Cartographie génétique

• Programmes développés par l’INRA

Programmes internationaux

PIGMAP

BOVMAP

SALMAP

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Cartographie génomique • Cartographie génétique





– Cartographie comparée




BTA7

BTA20

BTA10

BTA7

BTA20

BTA10

FISH

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• Objectifs

– Tirer profit des programmes génomes, en particulier humain et murin

– La séquence du génome humain est disponible depuis avril 2003 (+ souris et le rat)

– Construire des passerelles entre les génomes humain, murin et les génomes de nos espèces domestiques permettant l’extrapolation de données

• Développement de cartes comparées haute densité

– Facilité pour la cartographie de gènes : développement de cartes comparées

– Ancrage des cartes génétiques sur la carte comparée

Cartographie génomiqueCartographie comparée

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T441F4 (PPP2R1B)

NCAM1MS (ADCY2MS)

BB712 (IL18)

T935F11 (PAX6)SP935F11 (PAX6)

X570335(KCNA4)

T608B5 (CAT)SP608B5 (CAT)

BB1539 (MYOD1)

MMP1MMP3

MGTG13B

BR3510BMS2533DIK102

BMS1004FDX1

SP441F4

SDHD

DRD2INRA224

APOC3APOA1

PAFAH1B2

JAB1JAB8EST1471CD3D

ORP150CD3G

HBBMSDIK36

HSPA8

NUCB2

IDVGA60

NOR04INRA50

HEL1BMS1782

EST1456

ABS011BMS2684ADM

PHRET1

TRPC2NUMA1PDE2AINRA46KIAA0769

UCP3UCP2

IDVGA10ARRB1IDVGA32IDVGA28

RCN1

ILSTS61

FSHBMSFSHB

BMS2812

CD44

ILSTS27BMS812TGLA75BMS540BM4439RM4BMS2076IOBT395BL1095IDVGA23BM686BM848KAI1BMS820EXT2F2CHST1

GLYAT

SSRP1SERPING1

LPXNEST1093BMS429

APBB1SMPD1

PTH

SORL1

CRTAM

RRM1

MYO7ABY1520 (BDNF)

NAP1L4RRM1IGF2

HBBADM

LDHA

NUCB2

KCNA4FSHBPAX6RCN1CATCD44

EXT2

CHST1

KAI1F2

AHNAK

SSRP1SERPING1LPXNGLYATCD5FEN1ROM1COX8PLCB3SIPA1CTSFGSTP1GALKRN1NUMA1PDE2AKIAA0769

UCP3UCP2ARRB1

TYR

MMP1MMP3

FDX1PPP2R1BIL18SDHDNCAM1DRD2APOA1APOC3PAFAH1B2CD3DCD3GORP150

HSPA8KCNJ1

SMPD1APBB1

PTH

MYOD1

BDNF

PHRET1

MYO7A

CRTAMSOLR1

60

75

90

105

120

135

143.4

15

30

45

S2(319 cR3000)

S1(810 cR3000)

S3(160 cR3000)

S1(23.7 Mb)

S2(13.9 Mb)

S3(5.6 Mb)

S4(19.9 Mb)

S4’(2.1 Mb)

250

500

1000

2000

2128

1250

750

1750

1500

S4’(98.7 cR3000)

S4(514 cR3000)

λ=43.6

λ=38.7λ=21.3

λ=35.0

λ=2

9.2

Human

Humanchromosome 11

chromosome 11

Bovine chromosome 15

Bovine chromosome 15

Gautier & al.Gautier & al.20022002

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Cartographie génomique

• Cartographie génétique



– Hybrides somatiques






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Construction de banques génomiques� Principes généraux

� Digestion du génome en fragments de petite taille

� Clonage des fragments (intégration dans un génome bactérien hôte): Banques de BACs

� Intérêts

� Facilité de manipulation car obtention d’ADN en grande quantité de la région clonée

� Préalable à la cartographie physique d’une région : reconstituer le puzzle en recouvrant la région avec des clones chevauchants =

CONTIG

� Essentiel pour les études génétiques : recherche de polymorphismes, séquençage,

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ADN purifié Fragmentation

1

Copies incomplètes partant d'un

point fixe

Sens de la copie -->

Fragment d'ADN à séquencer (matrice)2a

Sen

s de

la m

igra

tion

élec

trop

horé

tique

3

Détection du signal de fluorescence à la sortie

du séquenceur

Séquence reconstituée

4

Le séquençage des génomesWhole genome shotgun

Méthode de Sanger

Clonage des fragments d’ADN (5, 50 et 150 kb)

2b

D’après Dujon

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5 assemblage

contig

contig 1 contig 2 contig 3 0

0.2

0.4

0.6

0.8

0 2 4 6 8 10 12Nombre de séquences (c = NL/G)

Nom

bre

de c

ontig

s(G

/L)

3X: exploratoire

6X: ébauche

12X: qualité"finale"

Type de séquence Caractéristiques Utilisation

Exploratoire Très nombreux contigs, petite taille Variations polymorphiques, biodiversitéEbauche (draft) Nombreux contigs, taille variable Premières analyses globalesFinale Peu de contigs, grands Analyse génomique fonctionnelle

Le séquençage des génomes (suite)

D’après Dujon

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6 Finition (supercontigs)

Ossature de supercontigs (scaffolds)

8 Annotation: ensemble de procédures informatiques qui:1- prédisent (± efficacement) les limites des gènes, des éléments de contrôle et de tout autre élément du génome2- suggèrent les fonctions des gènes à partir des comparaisons avec ce qui est déjà connu

7 Finition (remplissage des trous et zones de basse qualitévérification des assemblages, examen des séquences répétées, … )

Séquence finie, complète et de haute qualité

Le séquençage des génomes (fin)

D’après Dujon

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Le séquençage complet du génome bovin

• Consortium international pour la construction d’une carte physique du génome bovin

– Production de profils de restriction

• 340 000 BAC (Genome Sequencing Center, Canada)

• 100 000 BAC (INRA, LGbC)

– Séquençage d’extrémités de BAC (Nb de séquences)

• 312 000 BES (USA, Brésil, N. Zélande, Australie)

• 53 560 BES (INRA-Génoscope)

• Séquençage du génome bovin financé (50 M $) par le NIH, l’USDA, le Texas, le Canada, les Pays Bas

• Whole Genome Shot Gun Sequencing

– Couverture 7X sur un individu

– Couverture 1X à partir de plusieurs individus de différentes races : production de

marqueurs

• Actuellement (09/2007) un assemblage 7X est disponible

• La séquence du génome représente l’aboutissement de tous les efforts de cartographie

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Le séquençage complet du génome porcin

Consortium pour le séquençage du porcEtats-Unis, Chine, Japon, Corée, Royaume-Uni, France (INRA), Danemark, Allemagne

•Séquençage 2-3 x de BAC (MTP)

•Séquencage « whole genome shotgun » de 3-5 x

(1 x déjà fait Chine - Danemark)

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CompletedBCM-HGSC

Draft Assembly(7x)

MammalBos taurusCow

In progressBCM-HGSC

Draft AssemblyMammalOvis ariesSheep

In ProcessSangerDraft Assembly(BAC to BAC)

MammalSus scrofaPig

CompletedBI/MIT Draft Assembly

(7x)MammalEquus caballasHorse

CompletedWUGSC Draft AssemblyMammalFelis catusCat

CompletedBI/MIT Low Coverage WGS

(~2X)Mammal

Oryctolaguscuniculus

Rabbit

CompletedBI/MIT Draft AssemblyMammalCanis familiarisDog

CompletedWUGSC Draft Assembly

(6,6x)Non-Mammalian

VertebrateGallus gallusChicken

Genomes animaux domestiques séquencés (2008)

D’après A.Eggen

- L'ensemble des données est dans le domaine public- ”Genome Browsers” online:

ENSEMBL: http://www.ensembl.orgUCSC: http://genome.ucsc.edu/

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La séquence du génome : Intérêts

• Pour les efforts d’identification de gènes d’intérêt– Un nombre quasi illimités de marqueurs (microsatellites, SNP…)

– Des passerelles immédiates avec les autres génomes séquencés

– Identification des séquences codantes, des séquences régulatrices

• De manière plus générale

– Implication pour la compréhension de la dynamique de l’évolutionchez les mammifères (ex.: mise en évidence de régions conservées)

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2001

2008

Le séquençage haut débit

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YESYESYESExpression studies

YESYESYESResequencing

NOYESNOde novo Sequencing

35 pb(2 x 25 pb)

200-300 pb(400 pb)

36 pb(50 -70 bp)

Size

1-1,5 Gb(1,5-2 Gb)

0,1 Gb1,5 Gb(3 Gb)

Volume of sequence

5-10 µg?100 ng-1µgAmount of DNA

AppliedBiosystems

SOLiD Analyzer

Roche NimbleGen454 FLX system

IlluminaGenome Analyzer

D’après A.Eggen

Plusieurs séquenceurs haut-débit

Coût <1000 $ pour un génome de la taille du génome humain

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La détection de SNPs:valeur ajoutée du séquençage du génome

• Séquence référence (couverture 6-12x)

• Plusieurs animaux appartenant à des races différentes

• Alignement des séquences pour identifier plusieurs millers de

SNPs

• Validation des SNPs sur un nombre restreint d‘animaux de races

différentes

• Construction d‘une puce de SNPs pan-génomique (International Consortium)

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Digestion “in silico”

In silico estimates

135

92

70

Van Tassel et al., 2008Nature Methods 5, 247-252

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L’identification des SNPs

CCACGTAATCGGCACCTTAGGATCTGCaaacct….cactggATGAAGGCTC AATTGGCCATCATCGG

CCACGTAATCGGCACCTTAGGATCTGC


CCACGTAATC CGCACCTTAGGATCTGCaaacct….cactggATGAAGGCTCAATTGGCCATC ATCGG

CCACGTAATCGGCACCTTAGGATCTGC

CCACGTAATC CGCACCTTAGGATCTGCaaacct….cactggATGA GGGCTCAATTGGCCATCATCGG




CCACGTAATCGGCACCTTAGGATCTGCaaacct….cactggATGA GGGCTCAATTGGCCATCATCGG



GGCCACGTAATCGGCACCTTAGGATCTGCaaacct….cactggATGAAGGC TCAATTGGCCATCATCGGCCReference sequence

Holstein

Angus

BEEF

HaeIII HaeIII

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L’identification des SNPs bovins

• Analyse de 49 millions de lectures

– 5 022 143 tags uniques

• 62 042 SNPs putatifs identifiés avec une haute stringence

• 1 SNP / 1780 bp

• 25 125 SNPs validés et intégrés à la puce bovine: «Bovine

SNP50 genotyping BeadChip» (ILLUMINA) contenant plus

de 54 000 SNPs

Van Tassel et al., 2008Nature Methods 5, 247-252

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L’amélioration génétique des animaux

Etude de caractères ayant un contrôle génétique simpledéterminisme mendélien

Phénotype qualitatifMonogénique

Etude de caractères ayant un contrôle génétique complexePhénotype qualitatifPhénotype quantitatif

=>Cartographie de QTLs (Quantitative Trait Locus)

- Gènes majeurs- Autres

=> stratégie: clonage positionnel

Sélection assistée par marqueurs (SAM)

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Détection de gènes majeurs

• Porcs gène RN

• Bovins gène sans corne, anomalie Mulefoot

• Ovins OAR : gène Boroola

• Caprins CHI : gène PIS

• Lapins OCU : gène Rex

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Phénotype

Du caractèreà la fonction

ClonageClonagepositionnel positionnel

Gènes/Allèles

• Génomiquecomparative

• Carte physique• Séquençage

des génomes

Stratégies d’identification de gènes d’intérêt

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Etapes

Résolution

ATGCATCGTACG

Validation du polymorphisme causal

Méthodes statistiques fines (DL)Méthodes moléculaires (analyse d’expression, transgénèse…)

›Nouveaux polymorphismes

(microsatellites, SNPs)Identification de gènes candidats

Caractérisation Physiquede la région

BACs150 kb

Carte comparéeCarte physique

›

Conditions: Disposer de marqueurs génétiques (Microsatellites, SNP)Disposer de familles informatives

Le clonage positionnel

20-50 cM(20 - 50 Mb)

PrimolocalisationGenome Scan

B

C

**

A

*

* D

Analyses de liaison

Localisation Fine

B

A

D

C

5-10 cM(5 - 10 Mb)

Typages additionnels

›

Analyses d’association

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Analyses de liaison Analyses d’association

Rappelsanalyses de liaison et analyses d’association

PopulationsCas/contrôles

FamillesIntervalles: 10-20cMCaractères: Qualitatifs

QuantitatifContrôle génétique: Simple

Complexe

Familles

Intervalles: 2-5cMCaractères: Qualitatifs

QuantitatifsContrôle génétique: Simple

Complexe

Caractères: QualitatifsSimpleComplexe

Courtin et al, Infect Genet Evol. 2008 8(3):229-38.

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a) Identification de gènes majeurs

Exemple 1: clonage positionnel de la mutation RN- chez le porc

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Clonage positionnel chez le porcLa mutation RN-

Clonage positionnel d'un gène influençant la qualité de la viande (rendement technologique du jambon cuit, tendreté & jutosité)

Identification d’un gène régulant la quantité de glycogène musculaire, et donc le pH post-mortem de la viande

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La mutation RN-

• Phénotype RN-: chez les porcs Hampshire

• Mutation dominante

• Effet:• favorable: croissance• défavorable: taux de glycogène élevé dans les muscles squelettiques

Effet négatif sur la qualité de la viande et la transformation (pH)

Pertes économiques importantes

• Objectif:

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Localisation de la mutation RN-

• Mutation détectée par analyse de liaison (1000 méioses informatives)

• Première analyse de liaison: localisation sur le chromosome 15 => région de 2,5Mb

• Construction d’un contig de BAC de 2,5Mb– But: identifier de nouveaux marqueurs microsatellites et de nouveaux marqueurs SNP

• Nouvelles analyses de liaison

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•Nouvelles analyses de liaison: exclusion de la région proximale de SLC11A1 et de la région distale SNP S1010

Carte génétique

Carte RH

Contig de BAC

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• Cartographie comparée:homme (2q), souris (chr1) =>pas de gènes candidats évidents

• Analyse de déséquilibre de liaison:association complète entre les allèles des marqueurs S1006, S1007 (BAC 127G6) et RN-


DL sur 91 porcs Hampshire

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Carte génétique

Carte RH

Contig de BAC


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• Séquençage shotgun du BAC 127G6 (1000 individus)3 séquences codantes

-KIAA173-CYP27A1-3e gènes

• KIAA173 et CYP27A1 ne sont pas des gènes candidats

• 3e gène: similarité avec la sous-unité γ de l’AMP activated proteinkinase

• Rôle des AMPK: Rôle clef dans la régulation du métabolisme énergétique de la cellule eucaryote

Augmentation du ratio AMP/ATP => activation AMPK=>production ATP et inhibition de la consommation d’ATP=>inactivation de la glycogen synthase (Enzyme régulant la synthèse du

glycogène).

Bon candidat positionnel et fonctionnel


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• Détermination de la séquence du gène par RT-PCR et amplification rapide des extrémités de cDNA

Chez le porc (RN+/RN+) et chez l’homme

=> gène différent des autres isoformes et orthologue du gène humain (BLAST)

=> PRKAG3

• Expression (Northern blot)=> uniquement dans le muscle

Localisation de la mutation RN- dans le gène PKARG3

• Comparaison de la séquence de PRKAG3 d’individus RN-/RN- et individus RN+/RN+

=> Différence de 7 nucléotides dont 4 substitutions non synonymes

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•Animaux: Hampshire+ autres PC (15 races)

•Phénotype: mesure du taux de glycogène des muscles squelettiques

•Génotype: mutation R200Q du gène PRKAG3

Localisation de la mutation RN- dans le gène PKARG3

Analyse d’association des mutations avec le phénotype RN-

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Caractérisation fonctionnelle de la mutation RN-

•Mesure de l’activité de l’AMPK dans des extraits musculaires:

l’activité est 3 fois supérieure chez les porcs RN+ que chez les porcs RN- (en présence et en absence d’AMP)

•La mutation semble inhiber l’activation de l’AMPK et la dégradation du glycogène

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Exemple 2: chez le moutonLes brebis callipyges

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La Mutation CALLIPYGE chez le mouton

•Initialement observée au début des années 80

•Augmentation de la proportion et du diamètre des fibres musculaires de type rapide

•Convoitée initialement mais tendreté moindre de la viande

Cockett et al. (Science, 1996)Charlier et al. (Nature Genetics, 2001)Freking et al. (Genome Research, 2002)

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Un mode de transmission original

• Observé pour la première fois: ~15% de descendants d’un bélier

(Solid Gold) atteints

• Après croisement 50% de descendants issus d’un mâle callipyge

(CLPG) atteints

• Mais…

– 0% des descendants issus d’une femelle CLPG atteints

– 25% des descendants d’un croisement Femelle CLPG x Mâle CLPG (au lieu de 50% sous l’hypothèse de l’implication d’un gène soumis à une empreinte paternelle)

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La surdominance polaire…

CLPGPAT

clpgMAT

clpgPAT CLPGPAT

CLPGMATCLPGMAT

Mode de transmission non mendélien.Seuls les hétérozygotes ayant hérité la mutation de leur père expriment

le phénotype…

CLPG: allèle mutéclpg: allèle non muté

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Le locus impliqué…Etudes de liaison=>400kb sur OAR18=>200Kb

(orthologue du domaine à empreinte situé sur HSA14, MMU12)

Gènes codant pour des protéines à expression paternelle

ARN non codants à expression maternelle

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Expression des gènes selon le génotype de la mutation

Profil d’expression unique dans le génotype affectéPas de perturbations de l’empreinte parentale. Mutation active la transcription des gènes en cis

DLK1:- Gène à expression paternelle- Effecteur de l’hypertrophie musculaire

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Découverte de la mutation

184 kb

Substitution

A to G

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Recherche de la mutation causale

Solid Goldanimal fondateur

Recherche d’un fragmentIBD

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Effet de la mutation

GGACCACCTGTC clpgGGGCCACCTGTC CLPG

Mutation régulatrice de 4 gènes « éparpillés » sur 200 kb(LCR)

Facteur inhibiteur qui ne se fixe plus

10/10/2008

L’empreinte génétique : rappels

• Forme de régulation génique dépendante de l’origine parentale

=>expression monoallélique de certains gènes nucléaires

– Décrite dans plusieurs espèces de mammifères placentaires

– Soit la copie de l’allèle paternel (ex IGF2R) soit la copie de l’allèle

maternel (ex IGF2) est transcriptionnellement active

– Nb= environ 80 . Les gènes soumis à empreinte sont organisés en

grappe + ICE = élément régulateur commun

– Région contenant systématiquement des ARN non codants

– En général conservés entre espèces

• Variation des empreintes au cours du développement

10/10/2008

Effacement et établissement des empreintes génétiques au cours du développement

Exemple souris13e jour du devtembryonnaire

10/10/2008

L’empreinte et la théorie du conflit…

• Paradoxe

– L’expression mono-allélique augmente la vulnérabilité aux mutations

délétères

• La théorie du conflit (Wilkins et Haig, Nature Review Genetics, 2003)

– Intérêts génétiques parfois conflictuels entre la mère et le père

chez les espèces polygames (majorité des mammifères). Pour

augmenter la propagation de ses gènes

• Le mâle transmet à sa descendance des gènes qui vont favoriser la croissance fœtale

(au détriment de l’avenir reproductif de la mère)

• La femelle transmet à sa descendance des gènes qui vont favoriser une économie de

ressources et une augmentation du nombre de portée.

– La plupart des gènes soumis à empreinte interviennent dans des

mécanismes de transfert de ressources maternelles à la descendance(favorisés par les gènes à expression paternelle, inhibés par ceux à expression maternelle)

10/10/2008





b) Cartographie de QTLs

Exemple 1: chez les bovins

10/10/2008

La primolocalisation :Dispositif animal (exemple français chez les bovins laitiers)

20-50 cM(20 - 50 Mb)

Etapes

Résolution

Utilisation en sélection

PrimolocalisationGenome Scan

B

C**

A

*

* D

….

….

� 26 familles de demi-frères Prim’Holstein: 2138 fils

….

….

� 9 familles Normandes: 548 fils

….

….

� 6 familles Montbéliardes: 370 fils

Prim'Holstein Normande Montbéliarde

10/10/2008

Pourquoi un tel dispositif « petite-fille » ?

�Le dispositif existe déjà (coût réduit au seul génotypage)

•Les taureaux d ’IA sont les descendants d’un nombre limité de pères

•Les taureaux sont évalués en routine par testage sur descendance

�Le phénotype des fils est similaire à la moyenne des D performances (petite-filles)

•Haute précision dans l’évaluation (variance résiduelle réduite)

•Puissance de détection augmentée pour un nombre donné de génotypes

�Détection de QTL ségrégeant dans les populations exploitées

10/10/2008

Cartographie de QTLs chez les bovins laitiers

• 6 QTL sur 3 chromosomes

– Caractères de production• Quantité de matière protéique (BTA7 & BTA26)

• Quantité de matière grasse (BTA26)

– Caractères fonctionnels• Numération cellulaire (BTA15)

• Fertilité femelle (BTA7)

– Caractères morphologiques• Epaisseur du talon (BTA15)

10/10/2008





b) Cartographie de QTL

Exemple 2: chez les porcs

10/10/2008

Détection de QTLs chez le porc

• Caractères de productionCroissance

Epaisseur lard dorsal

Quantité de lipides intramusculaires

…

• Santé et résistance aux maladiesCaractères immunologiques (en cours)

Infection par le PrV

Développement et régression des mélanomes cutanés

10/10/2008

QTL “muscle et epaisseur de gras” chez le porc

Nezer et al., 1999, Nature Genetics 21 : 155-156.

Van Laere et al., 2003, Nature 425 : 832-836.

LWxPietrain (1032 F2)

Performance de croissancesupérieure

Musculature exceptionnelle peu de gras

21 phénotypes mesurant les performances de croissance, les proportions corporelles, la musculature, le dépôt de graisse, la qualité de la viande

Objectif: Localiser des QTLs responsables des différences génétiques entre les deux races

10/10/2008

QTL sur chromosome 2 soumis à l’empreinteparentale : seul l’allèle paternel a un effet

H2: QTL soumis à empreinte paternelle

HSA11p : IGF2 MYOD1

Log10(H1/H0)

Log10(H2/H0)

Log10(H3/H0)

H3: QTL soumis à empreinte maternelle

10/10/2008

Gène IGF2 : structure et expression

Expression de l’allèle paternel uniquement10 gènes soumis à l’empreinte dans cette région chez l’homme et la souris. Seuls IGF2 et INS2 sont paternellement exprimés.

10/10/2008

Découverte de la mutation causale

Substitution dans une région non-codante (intron 3)

10/10/2008

10/10/2008


Substitution A/G

•Empêche la fixation d’un facteur inhibiteur de l’expression d’IGF2 dans le muscle squelettique et le muscle cardiaque,et uniquementaprès la naissance.

•Ne perturbe pas l’empreinte parentale

•Augmente la masse musculaire de 3 à 4 %

10/10/2008





b) Cartographie de QTLs

Exemple 3: chez le mouton

10/10/2008

Le dogme central et les ARN non codants

ARN Non Codants :- miRNA- siRNA

10/10/2008

Les micro-ARN : quelques éléments

• Ce sont des ARNs non codants (20-23 nt)

– Décrits pour la première fois chez C.elegans : Lee et al. (Cell, 1992)

– Interviennent dans la régulation post-transcriptionnelle de gènes cibles

(plantes et animaux)

– Impliqués dans une multitude de fonctions biologiques (développement,

prolifération cellulaire, apoptose, réponse au stress, tumorigénèse)

– Hautement conservés entre espèces

10/10/2008

Biosynthèse, structure et action

Pre-miRNA

Wienholds and Plasterk, FEBS Letters, 2005

22 nt

70-80 nt

Riboonucleoproteincomplex

10/10/2008

Abondance des miRNAs

– 1-5% des gènes prédits (analyse de la séquence des génomes).• 1 000 chez l’homme• 250 chez C. elegans

– > 1/3 de l’ensemble des gènes ont des miRNA-bindingsequences.

– Cela suggère que les miRNA sont impliqués dans de nombreuses fonctions cellulaires.

– Octobre 2008 : 8619 miRNA

Base de données http://microrna.sanger.ac.uk/

10/10/2008

Juillet 2006

Exemple de cartographie de QTL chez le mouton

10/10/2008

Introduction…

• Mouton Texel

– race à viande, hypertrophie musculaire.

• Programme de recherche de QTL

– Romanov X Texel, F2, 258 petits

• 37 mesures : muscle, dépôt graisse, composition…

• 153 marqueurs pour le criblage total du génome

10/10/2008

Identification d’un QTL avec un effet majeur sur la musculature

– Localisé sur OAR02h2=0,05-0,25Explique 1/5 à 1/3 des différences entre les 2 races

– Après cartographie fine : région comprenant le gène Myostatine (GDF8)…

10/10/2008

Myostatine : un gène candidat positionnel et fonctionnel « évident »

• Superfamille des TGF-β : – facteur de croissance et de différenciation.

• Perte de fonction– augmentation de la musculature chez souris, bovin, humain.

WT

mutant

WT

WT mutant

mutant

Bleu belge homozygotemutation myostatine

10/10/2008

• Séquençage région codante du gène :

– 3 Texel F0

– 7 contrôles (5 Romanov F0, 1 Dorset, 1Tarasconnais)

• Aucun polymorphisme identifié…

Mais…

10/10/2008

• Northern blot

-Transcrit de taille attendue chez Texel / contrôle

- Même intensité des bandes.

Transcrit GDF8

Ld : longissimus dorsi; St : semitendinosusTx : Texel; Rv : Romanov

Les transcrits de GDF8 (myostatine)

• ARN provenant muscle Texel/contrôleAmplification de l’ORF : RT-PCR, séquençage

ARN messager normal chez animaux Texel – niveau séquence

10/10/2008

3 Texel et 7 contrôles– 20 SNPs dans 10,2 kb– Aucun dans des éléments conservés

Génotypage de tous les SNPs– 42 Texel et 90 contrôles (11 races, 4

Texel/Romanov)– « monomorphisme virtuel des Texel»

– 18 SNPs éliminés : au moins 1 des 4 T/Rhomozygotes

– SNP g-2449C-G éliminé :

• à 2,5kb en amont site d’initiation de la transcription

• 1 Texel hétérozygote pour cet SNP et homozygotes pour tous les autres SNPs

Un seul SNP candidat : g+6723G-A

Recherche de SNPs : région non codante

10/10/2008

Étude du SNP g+6723G-A

• En 3’UTR

• Allèle A: crée un motif octamérique –cible de microARN

– décrit par Xie et al (Nature, 2005)

– miR-1 (.1 et .2), miR-206, miR122a reconnaissent cette cible

– miR-1 : très exprimé dans muscle et coeur souris– Les gènes de ces 4 miARN retrouvés chez le mouton

– Expression chez le mouton

Zhao et al., Nature, 2005

10/10/2008


myostatine

myostatine

T : texel; W : contrôle

Immunoprécipitation : chez les Texel, la bande est 3 fois moins intense

La mutation entraîne une instabilité des transcrits

• Hypothèse : La mutation provoque un création d’un site cible de miRNA

• Test de l’hypothèse : diminution de la myostatine circulante?

• Résultats

10/10/2008

Démonstration de l’effet de la mutation

Mutant

WT

•Construction :

•Gène de la Luciferase

•3’UTR mutant vs WT

Analyse de la luminescence produite dans les clones

Réduction de 70% du signal en présence de miRNA avec un promoteur présentant la mutation

10/10/2008

Conclusions de l’étude

• Une mutation en 3’ du gène de la myostatine crée une cible pour au moins 2 miRNA exprimé dans les muscles squelettiques.

• Diminution de la quantité de Myostatine (limitant la croissance des tissus musculaire) dans le muscle =>Hypertrophie musculaire

10/10/2008

Développement d’une base de donnée Patrocles (http://www.patrocles.org)

Liaison SNPs/site cible miARN

– Chez l’homme• 73 497 SNPs dans 3’UTR de 13 621 gènes– Crée ou détruit 1 octamer décrit par Xie, Nature, 2005– 2 490 SNPs putatifs crée un site– 2 597 SNPs putatifs détruit un site– Dont 483 affectent un octamère conservé entre 4 espèces mammifères

– Chez Souris• 77 283 SNPs dans 3’UTR de 10 200 gènes– 1 183 SNPs putatifs crée un site– 1 321 SNPs putatifs détruit un site» Dont 234 conservés au cours de l’évolution

10/10/2008

Base de données de QTLs chez les animaux (http://www.animalgenome.org/QTLdb/)

10/10/2008




c) La sélection assistée par marqueur (SAM)

10/10/2008

Amélioration génétique

• Exemple bovins/porcs

• Très efficace durant les dernières décennies par exemple performances de croissance et efficacité alimentaire

• Méthodes classiques basées sur :– Collecte d’informations de performances individuelles (paramètres

de production)

– Compilation des observations avec des informations généalogiques

– « Index de sélection » pour identifier les meilleurs candidats à la

sélection

10/10/2008

Quelques limites …

• Efficacité diminue si le :

– Phénotype difficile à mesurer

– Caractère possède une faible héritabilité

• Se limitent aux caractères mesurables dans un grand

nombre d’animaux

• Nouveaux critères de sélection :

– Adéquation aux « produits finis »

– Qualité et acceptabilité pour les consommateurs

– Bien être animal, résistance aux maladies …

10/10/2008

20-50 cM(20 - 50 Mb)

Primolocalisation

Genome Scan

Localisation Fine

B

A

D

C

5-10 cM(5 - 10 Mb)


›Etapes

Résolution


SAM1 SAM2 SAM3

B

C

**

A

*

* D

ATGCATCGTACG


Méthodes statistiques fines (DL)Méthodes moléculaires (analyse

d’expression, transgénèse…)



BACs150 kb



›

La SAM

10/10/2008

La SAM chez les bovins

10/10/2008

1 1

22

3 3

44

55

66

77

99

88

NOM : INRA83

POS : chrm1 - 15

•Les Marqueurs : bornes du génome


10/10/2008

MELKIOR LEHOUX


10/10/2008

BELLWOOD

MELKIOR LEHOUX

La SAM

10/10/2008

BELLWOOD

1er groupe des fils de BELLWOOD

2eme groupe des fils de BELLWOOD

La SAM

10/10/2008

1er groupe des fils de BELLWOOD

Moyenne = 29

2eme groupe des fils de BELLWOOD

Moyenne = 13>

Il est donc plus intéressant d’avoir reçu que .

Comparaison des performances• Groupe de fils de BELLWOOD pour la MG


10/10/2008

JOCKO

Fille de JOCKO

BESNE

...

...

•Informations marqueurs

On peut avoir de

l’information pour

toutes les familles

typées


10/10/2008

La SAM permet de lire la carte d’identité d’animaux sans performance (candidats).

MELKIORLEHOUX

...

BELLWOOD

Veau 1 Veau 2 Veau 3 Veau 4

JOCKO

Fille de JOCKO

BESNE

...

...

La SAM

10/10/2008

Chez les BV laitiers:

• Génotypage des jeunes taureaux et génisses laitiers pour > 40 marqueurs pour 12 régions QTLdifférentes soit 10.000 animaux typés / an.


10/10/2008

20-50 cM(20 - 50 Mb)

Primolocalisation

Genome Scan

Localisation Fine

B

A

D

C

5-10 cM(5 - 10 Mb)


›Etapes

Résolution


SAM1 SAM2 SAM3

B

C

**

A

*

* D

ATGCATCGTACG


Méthodes statistiques fines (DL)Méthodes moléculaires (analyse

d’expression, transgénèse…)



BACs150 kb



›

La SAM

10/10/2008

Sélection: perspectives

• SAM deuxième et troisième génération

• Introduction de paramètres immunologiques dans les schémas de sélection

– Etude en cours chez le porc pour estimer la faisabilité et déterminer les meilleurs paramètres (projet IMMOPIG)

– Suite: études QTL sur ces paramètressélection divergente

10/10/2008

La génomique fonctionnelle

1. Transcriptome et protéome

2. Etude du transcriptome

a) Méthodes bas-débitb) Méthodes haut-débitc) Le séquençage du

transcriptomed) Exemples d’études

du transcriptome à l’aide des puces à ADN

10/10/2008

Génomenucléaire

Génomique structuraleGénomique structurale

ARNmARNmTraductionTraduction

DégradationDégradation

Génomique fonctionnelleGénomique fonctionnelle

ProtéomeTranscriptome

10/10/2008

Génome, transcriptome et protéome

10/10/2008

Etude du protéome

Approches utilisées: Après extraction de protéines- Electrophorèse sur gel 2D:Séparation des protéines et recherche des protéines par analyse d’image

- Spectrométrie de masseIdentification de protéines à partir de leur empreinte peptidique massique.

Ex: MS MALDI-TOF

-Protein arrays (intéractions protéine-protéine)

-Séquençage

10/10/2008

Etude du transcriptome

• Etude d’un nombre limité de gènes

� Western blot

� PCR quantitative en temps reel (qRT-PCR)

• Techniques “haut-débit” :

• Nécessitant de connaître les sondes spécifiques de gènes: puces à ADN

globales & différentielles

ADNc ou oligonucléotides

– Approche réseau dédié (CREA exhaustif pour une région donnée, d’une fonction donnée)

– Approche pan-génomique

• Méthodes exhaustives: ne nécessitant pas de connaître les séquences ADN à étudier

– Banques d’hybridation soustractive (SSH)

– Serial Analysis for Gene Expression (SAGE)

– Le séquençage du transcriptome

10/10/2008

RT-PCR quantitative en temps réel:Principes

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

3,000

3,500

4,000

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40 42 44

Latency phase

Screening step

Exponential phase

Plateau5 cycles

maxi

Ct

Objectif : utiliser la pcr pour quantifier des transcrits (cDNA)

N = N0 x (1+E)n

=2nN0

N = quantité d’ADN amplifié après n cycles

N0 = quantité initiale d’ADN cibleE = efficacité de la PCR

= quantifier N0

10/10/2008

N = N0 x (1+E)n

Quantite (dilutions)Log (ng)

Ct

Log N = LogN0 + n Log(1+E)

Si n = Ct

LogN = LogN0 + Ct Log(1+E)

Ct = [LogN –LogN0] / Log (1+E)

Ct = -1/Log(1+E) x LogN0 + cte

Ct = a N0 + b avec a = -1/Log(1+E) = pente de la droite

100% d’ efficacit é => E = 1 et α = -1/Log(1+1) = -1/Log2 = - 3,32

α

RT-PCR quantitative en temps réel:Vérification de l’efficacité de la pcr

10/10/2008

1) Normalisation avec le gène de référence

∆ Ct = CTGcible – CT Gref

2) Quantification relative des données normalisées entre une condition et un calibrateur

∆∆ Ct = (CTGcible – CT Gref)cond1 – (CTGcible – CT Gref) calibrator

Formule de quantification relative 2 –∆∆∆∆∆∆∆∆Ct

RT-PCR quantitative en temps réel:Quantification relative

qRT-PCR utilisée pour confirmer les résultats obtenus à l’aide des puces à ADN

10/10/2008


1. Etude du protéome


a) Techniques bas-débit

b) Techniques haut-débit

c) Exemples d’études du transcriptome à l’aide des puces à ADN

10/10/2008

Etude du transcriptome

• Etude d’un nombre limité de gènes

� Western blot

� PCR quantitative en temps reel (qRT-PCR)

• Techniques “haut-débit” :

• Nécessitant de connaître les sondes spécifiques de gènes: puces à ADN

globales & différentielles

ADNc ou oligonucléotides

– Approche réseau dédié (CREA exhaustif pour une région donnée, d’une fonction donnée)

– Approche pan-génomique

• Méthodes exhaustives: ne nécessitant pas de connaître les séquences ADN à étudier

– Serial Analysis for Gene Expression (SAGE)

– Le séquençage du transcriptome

10/10/2008

Puces à ADN Serial Analysis of Gene ExpressionQuelques principes

Courtin et al, 2007

10/10/2008

Analyse et validation des résultats

• Importance du traitement statistique des données

• Validation des résultats au niveau des transcrits (qRT-PCR) et au

niveau protéique (immunohistochimie, Cytométrie en flux…)

• Analyse bioinformatiques

-Gene Ontology (GO):(biological process, cellular component, molecular function)

ex: DAVID, PANTHER…

-Réseaux de gènes, voie biologiques et canoniques

Ex: INGENUITY

10/10/2008

Puces à ADN et réseaux dédiés:approche région candidate

Objectif 1: Localiser finement un gène et une mutation responsable du contrôle d’un phénotype

- Tous les BAC ou plasmides ou oligonucléotides (ciblant des régions codantes et non codantes) d’une région

chromosomique candidate (QTL) sont déposés sur membrane ou lame de verre

- Hybridation d’ARN sain/ ARN malade

- Identification des BACs, plasmides ou oligonucléotides qui présentent une expression différentielle

- Identification des gènes candidats

Objectif 2: étudier l’expression d’une région chromosomique contenant des gènes d’intérêts dans plusieurs conditions

- Co-régulation des gènes

- cDNA ou oligonucléotides spécifiques de tous les gènes de la région

- Expression différentielle

Objectif 3: étude des régions codantes et non codantes d’une portion chromosomique

- Tiling array (oligonucléotides)

- Chip on chip:étude de la transcription

10/10/2008

Puces à ADN et réseaux pan-génomiques

Puce de gènes• « Maison » INRA-CRB (centre de ressources biologiques)

– Membranes (cDNA) Truite, Porcs– Lames de verre (oligos) Bovin, Porc, Poulet

• « Commerciaux »– Set d’oligos commerciaux (Qiagen, Opéron)– Puces affymetrix– Puces Agilent– Puces Nimblgen

Tiling arrays• « Maison »• « Commerciaux » en développement pour les animaux de rente

CHip on chipObjectif: détecter si une proteine donnée se fixe spécifiquement sur une séquence d’ADN

10/10/2008

Le séquençage du transcriptome

Exemple: séquenceur haut débit 454 Roche

10/10/2008


1. Etude du protéome


a) Techniques bas-débit

b) Techniques haut-débit

c) Exemples d’études du transcriptome à l’aide des puces à ADN

10/10/2008

2007

EXEMPLE 1: Aide à la cartographie chez les bovins

10/10/2008

Aide à la cartographie de QTLS

Arbilly et al, Animal Genetics, 2006

10/10/2008

• Point de départ: Etudes QTL sur les caractères de production laitière dans différentes race de bovins

Identification de plusieurs QTL contenant quelques centaines de gènes

Identification d’un QTN: mutation de DGAT1 le gène causal affectant la quantité de matière grasse du lait sur BTA14

• Objectif : étudier l’expression des gènes dans la glande mammaire de souris à différents stades (puberté, gestation, lactation, involution) et combiner ces données avec les résultats des études QTL chez les bovins pour proposer des gènes candidats à tester.

• Outil: Puce Affymetrix: 12488 sondesTissu: glande mammaire souris C57BL/6J


10/10/2008


• Analyse différentielle (ANOVA) et comparaison avec d’autres études d’expression

249 sondes en commun correspondant à 212 gènes bovins

10/10/2008


• 212 gènes différentiellement exprimés en fonction du stade

K-means-clustering

10/10/2008


• Comparaison avec les données de cartographiePbl: beaucoup de gènes ont des fonctions inconnues

DGAT1 est surexpriméUtilisation de la base de donnée cgQTL pour proposer des gènes candidats

clusters

BTA6

http://cowry.agri.huji.ac.il/QTLMAP/qtlmap.htm

10/10/2008

EXEMPLE 2: Réseau ciblant une fonctionEtude de l’infection par Mycobacterium bovis chez les bovins

Meade et al, 2007, BMC Genomics

• Objectif : comparaison des niveaux de transcrits de PBMC provenant de 6 bovins infectés par Mycobacterium bovis/ 6 bovins non infectés

• Outil: Puce cDNA dédiée immunospécifique: 1391 gènes (spots)

• Analyse PBMCAnimaux infectés Contrôles

10/10/2008

378 gènes diff exprimés (p=0.05) dont 244 réprimés chez les animaux infectés (65%)

Signature transcriptionnelle: les profils de transcription permettent de classer les animaux suivant leur statut (infecté/ non infecté)

Gènes RI innée TLR2, TLR4Bola class I et Bola class II (DRA)

Confirmation par RT-PCR quantitative

EXEMPLE 2: Réseau ciblant une fonctionEtude de l’infection par Mycobacterium bovis chez les bovins

10/10/2008

EXEMPLE 3: Approche combinée région candidate et pan-génomique

Etude de l’interaction cellule épithéliale porcine-virus de la Pseudorage

PrVPrV• pathogène bien connu du porc• responsable de la Maladie d’Aujeszky ou Pseudorage• alpha-herpesvirus

• genome ADN (140Kb, 70 gènes)• sequence (Klupp et al, 2004)

• bon modèle expérimental pour étudier la biologiedes alpha-herpesvirus

propagation aisée dans les cellules de plusieurs espèces de mammifèresinocuité pour le personnel de laboratoire

CELLULES EPITHELIALES PORCINESCELLULES EPITHELIALES PORCINES

• Réplication viral primaire• Forte production virale

Flori et al, 2008, BMC Genomics

10/10/2008

Etude des intéractions cellule hôte –pathogène: approches transcriptomiques

• Puces à ADN: outils efficaces pour analyser les interactions cellule hôte-pathogèneHossein H et al, 2006, Curr. Opin. Immunol.

• Etudes transcriptomiques:- Analyse du transcriptome de la cellule OU du pathogène

-Peu d’études simulatanées des transcriptomes de la cellule et du pathogène

P.berghei ANKA et souris (brain) Lovegrove FE et al, 2006, BMC GenomicsEBV et NK/T cells Zhang YJH et al, 2005, Br. J. Cancer

� Etudes transcriptomiques des intéraction PrV-cellule- Analyse du transcriptome cellulaire

- Etudes cinétiques

- Modèles hétérologues REF cells / rat chip Ray and Enquist. 2004. J. Virol.

Brukman and Enquist. 2006. J. Virol.

HEK-293 cells / human chip Blanchard et al, 2006. Vet. Res.

10/10/2008

Objectifs

Analyser in vitro le dialogue entre les cellules épithéliales porcines et le PrVEtablir un lien temporel direct entre l’expression des gènes viraux et cellulaires.

- Analyse simultanée des modifications du transcriptome viral et cellulaire- Etude cinétique- Système homologue (PrV/cellules porcines / puces porcines)

Suivre la mock-infection et l’infection par le PrV des cellules épithéliales porcines PK15

Détecter les gènes viraux et cellulaires différentiellement exprimés durant l’infection entre les cellules infectées (I) et mock-infected (MI) à différents temps

10/10/2008

Couverture ~ 72.5% de la région SLA(Swine Leucocyte Antigen)

70 gènes du PrV

1515 genesMicroarray dédié SLA/PrVconstruit au laboratoire (CRB-GADIE/LREG)

Microarray générique Qiagen-NRSP8 8541 gènes

⇒ADNcs et exons sous-clonés

⇒GEO GPL5622

=> oligonucleotides

Outils et méthodes

1.5 % gènes impliqués dans la réponse immunitaire

• Microarrays

• PCR quantitative en temps réél

Zhao et al, 2005, Genomics

10/10/2008

Cellules PK15

I

MI

I

MI

I

MI

I

MI

Schéma expérimental

I = Infection par le PrVMI = Mock-infection

T0 T1 T2 T4 T8 T12Cy3Cy5

Cy5Cy3

Cy3Cy5

Cy3Cy5

Cy3Cy5

Cy5Cy3

Cy5Cy3

Cy5Cy3

Cy3Cy5

Cy3Cy5

Cy5Cy3

Cy5Cy3

Cy3Cy5

Cy5Cy3

Cy3Cy5

Cy3Cy5

Cy3Cy5

Cy5Cy3

Cy5Cy3

Cy5Cy3

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Cy5Cy3

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Cy3Cy5

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Cy3Cy5

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Cy3Cy5

Cy3Cy5

Cy3Cy5

Cy5Cy3

Cy5Cy3

Cy5Cy3

Cy3Cy5

Cy3Cy5

Cy5Cy3

Cy5Cy3

h piSLA/Immuno/prVQiagen-NRSP8

Une lame

R1

R3

R4

R2

PrV (souche NIA3)

10/10/2008

Acquisition des données, normalisation et analyse statistique

1/ Acquisition des données

AA AA

MM

BlocsBlocs

MM

BlocsBlocs

• Soustraction de la médiane de chaque bloc

M = Log2(Cy5/Cy3)

A = 0.5*Log2(Cy5*Cy3)

MM MM• Transformation Log2• Locally weighted polynomial regression

=> Lowess (f=0.3)

2/ Normalisation

• Scan des lames Scanarray (LCE,CEA) and Virtek (PICT, INRA)

• Quantification Imagene software

• Stockage des données BASE (Sigenae)

3/ Selection des gènes différentiellement exprimés• Modèle linéaire Ycfnds = µc + ααααf + ββββn + δδδδd + Ecflje• Comparaisons Student t test - MI vs I à chaque temps => 1 pvalue pour chaque gène

• Correction pour tests multiples : False Discovery Rate (FDR) =0,05

• Hierarchical clustering : HCL et k-means (TmeV software)4/ Exploration des données

10/10/2008

* Gènes différentiellementexprimés

Cluster 1

Cluster 2

Cluster 3

T8MI T0 T1 T4 T12T2

UL49

GP50GDEP02

UL38UL362

ORF1UL48

UL40UL51

UL37UL3

UL46UL54

LLTE21ORF2NIA3

ICP18.5UL30

LLTE1IEP2

UL2UL3.5

UL13UL4

UL34EP01

UL17UL32

UL361UL43

UL18IL15EX12

UL8UL20NIA3

UL191UL10

ORF1NIA3PKNIA3

UL21NIA3GP63GI

UL11GII

TKNIA3UL92

UL1UL41

UL142UL14

UL31UL39

UL12UL33

UL52GIGE

UL8.5IEP1

UL50LLTI2

UL16UL47

UL25NIA3

GIIINIA3Ba5

UL42UL24NIA3

LLTE222UL26NIA3

11K228KNIA3

UL29UL35

UL49.5RSP40

UL6UL5

GXGGUL7

GHNIA3UL192

UL53UL15EX2

Une image globale de la transcription du PrV

T8MI T0 T1 T4 T12T2

I IK-means(n=3, euclidian distance, averagelink)

Toutes les sondes PrV

10/10/2008

0 313

52 58

34

0

20

40

60

80

T0 T1 T2 T4 T8 T12Time

PrV

US1UL29UL49.5

IE180

UL9UL28UL36US8

UL41US3

Nom

bre

de g

ènes

diff

éren

tielle

men

texp

rimas

1 0 2 5 19 140 0

1262

3184

4 47

1494

3509

0 938831134270

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

4000

T0 T1 T2 T4 T8 T12

SLA/PRV up-regulated

SLA/PrV down-regulatedNRSP8 up-regulated

NRSP8 down-regulated

PK150

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

0 10

log (titer)

Courbe de croissance du PrV

shutoff

Une image globale de la transcription du PrV et des PK15

10/10/2008

• Augmentation du nombre de gènes différentiellement exprimés au cours du temps à partir de 2h pi parallèlement au nombre de gènes viraux.

• Beaucoup de gènes cellulaires sont réprimés. Cette down-régulationeest détéctée à partir de 4h pi et augmente à 8 et 12h pi.

�� Pas de shutoff précocemais shutoff plus précoce dans les cellules porcines que dans les autres cellules (8h pi)

• Le gène viral UL41 codant pour la virion host shutoff protein (vhs) est détectée 8h pi

�� shutoff probablement induit par les protéines vhsnéosynthétisées

PrV et shutoff cellulaire

10/10/2008

L’infection par le PrV altère de multiples processus biologiques et fonctions cellulaires

Ingenuity Pathways analysisGene number/Top function

T1

T2

T4

T8

SLA-IaTAP1TAP2Calnexine

IRFsTLR8 PPIA

Gene ExpressionMolecularTransport

CellCycle

CellDeath

Cellular Movment

Cellular Assembly

andOrganization

Immune Response

DNA Replicationand Repair

Cellsignalling

Gene Expression

MolecularTransport

DrugMetabolism

Nucleic acidmetabolism

BCl-2FAIM2Caspase1Caspase 3Caspase 7NF-KB2

US3 8h piUS1 1h pi

F-actinB-actinMyosin

US3 8h pi

HIST1H2ALHISTAH4JHISTAH2BK

HDAC2HDAC10HDAC3HDAC6HDAC7AHDAC9

US3 8h pi

Up-regulatedDown-regulated

10/10/2008

Résultats de qRT-PCRQuantification relative

2-∆∆∆∆∆∆∆∆Ct-1

SLA Ia TAP2

Gène référence: RPL32Calibrateur: MI T0

Rel

ativ

e qu

antit

y

TAP1 PSMB9 PSMB8

Samples

10/10/2008

Diminution de SLA Ia à la surface des PK15 Cytométrie en flux

10/10/2008

Rupert Abele, Robert Tampe´FEBS Letters 580 (2006) 1156–1163

Stratégie du PrV pour se soustraire à la voie de présentation antigénique du CMH de classe I

Inhibition de l’activité du transporteur TAPAmbagala et al, 2000, J. Immunol.

/interaction avec la protéine gN codée par le gène UL49.5Koppers-Lalic et al, 2005, PNASUL49.5 (gN)1h pi

UL41 (vhs)8h pi

PrV

Diminution des niveaux de transcrits dans les cellules infectées

SLA-IaTAP1TAP2PSMB8 (LMP7)PSMB9 (LMP2)

PK15

Le PrV developpe differentes strategies pour échapper à la voie de présentation antigénique du CMH de classe I: -arrêter la pompe à peptides

-diminuer la transcription de molécules clefs

Diminution de l’expression des molécules du CMH Cl I à la surface des cellulesMellencamp et al, 1991, J. Virol.

10/10/2008

Conclusions et perspectives

Perspectives• Analyse des intéractions PrV-cellules porcines dans d’autres cellules cibles comme

les cellules dendritiques immatures

• Etude de l’expression des gènes viraux et cellules en utilisant des virus mutants

Conclusions• L’expression des gènes du PrV et des cellules porcines peut être analysée

conjointement avec des puces à ADN

• Chronologie de la transcription des gènes du PrV jusqu’alors jamais décrite

• Image globale de la transcription avec un lien temporel direct entre l’expressiondes gènes viraux et cellulaires

• Nouvelles données sur les stratégies virale d’échappement à la réponse immunitaire(voie de présentation antigénique par les molécules de classe I du CMH)

10/10/2008

Bilan études du transcriptome chez le porc Puces à ADN

Tuggle et al, Int.J.Biol.Sci., 2007, 3(3):132-152

• Muscle: 5 études

•Appareil reproducteur (utérus, ovaire, testis): 9 études

•Réponse immunitaire: 12 études

10/10/2008

La génomique génétique

10/10/2008

� Intégrer des génotypes et des données d’expression

– Objectif: identifier des régions du génome intervenant dans la variabilité de l’expression des gènes

– Principe: Etudier la quantité de transcrits produits pour beaucoup (tous) de gènes comme autant de caractères quantitatifs

analyse de liaison et d’association

La génomique génétique (« Genetical Genomics »)

Schadt et al, Nature, 2003, 422:297-302

� Article pionnier

10/10/2008

� Cartographie de QTL d’expression (eQTL)

2 types d’eQTL� Cis-acting eQTL: le gène codant pour le transcrit est situé dans l’intervalle de confiance de l’eQTL

� Trans-acting eQTL: l’intervalle de localisation est situé dans une région distante du gène codant pour le transcrit considéré

Cis et trans-régulation de l’abondance des transcrits

Drake et al, 2006, Mammalian Genome


10/10/2008


10/10/2008

� Proposer et classer les gènes candidats

� Définir des sous-types moléculaires à l’intérieur de la population

pour un phénotype donné

� Identifier des voies métaboliques et cellulaires, impliquées dans

l’apparition du phénotype

� Identifier des facteurs causaux impliqués dans une variation

phénotypique

La génomique génétiqueIntérêts

10/10/2008CONCLUSION

10/10/2008

• Les animaux de rente– Possibilité de croisements dirigés

– Des espèces modèles pour des mécanismes parfois originaux

– Des mutations régulatrices importantes dans le contrôle des

variations phénotypiques

• La sélection– L’information moléculaire acquise peut être valorisée (Sélection

assistée par marqueurs)

– Ajout de nouveaux paramètres immunologiques dans les critères

de sélection

– Utilisation des données d’expression

10/10/2008

Merci de votre attention…

génomique structurale et fonctionnelle chez les animaux de...

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