FML 13-12-04

PCR Quantitative

F Martin-Laurent et D Bru

UMR Microbiologie et Géochimie des Sols, INRA/Université de Bourgogne, 17 Rue Sully, BP 86510, 21065 DIJON CEDEX, Email

fmartin@dijon.inra.fr et david.bru@dijon.inra.fr

Démonstration de PCR quantitative

1. Principe de la PCR quantitative (F Martin-Laurent)

2. Exemple d’applications de la PCR quantitative (F Martin-Laurent)

3. Démonstration de l’utilisation du logiciel SDS (F Martin-Laurent)

4. Démonstration de l’utilisation de l’ABI7900 (D Bru

Principe de la PCR conventionnelle

Dénaturation du double brin d’ADN et hybridation des amorces

Elongation

Amorces, ADN, dNTPs, Taq Pol

72°C

55°C

95°C

72°C

x 35 cycles

Séparation électrophorétique

FML 13-12-04

PCR conventionnelle versus PCR quantitative

Analyse en point final sur gel d’agarose

Phase exponentielle

Phase linéaire

Phase plateau

Analyse dynamique de la PCR quantitative

-haute précision pendant la phase exponentielle

-variabilité importante à la phase plateau

FML 13-12-04

PCR quantitative avec une sonde TaqMan®

Cette méthode repose sur deux principes :-la technologie FRET (fluorescence resonance energy transfer)-l’activité 5’-exonucléase de la Taq Pol

5’

5’

3’

3’

FP

RP

Reporter Quencher

FAM, VIC TAMRA

-Spécificité l’amorce pour la PCR-Spécificité de l’hybridation de la sonde TaqMan

FML 13-12-04

5’

5’

3’

3’

FP

RP

R Q

-FRET (fluorescence resonance energy transfer) depuis le reporteur (haute énergie) vers le quencher (faible énergie),

pas de signal fluorescent émis par le reporteur quand la sonde est intacte

Fluorescence

Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan®

FML 13-12-04

Essais 5’ nucléase avec la sonde TaqMan®

-au cours de l’élongation catalysée par la Taq Pol l’activité 5’ nucléase déplace la sonde

5’

5’

3’

3’

FP

RP

R

Q

5’

5’

3’

3’

FP

RP

RQ

-lorsque la polymérisation est complétée, pour chaque molécule d’ADN synthétisée un reporteur émet de la fluorescence. FML 13-12-04

nm

Abs

orbt

ion Fluorescence

475 550

FAM

nm550 600

Abs

orbt

ion Fluorescence

TAMRA

-Le spectre d’emission du Reporteur recouvre le spectre d’absorption du Quencher

-FRET

Mécanisme de quenching

Excitation

Émission

FR

ET

FML 13-12-04

TaqMan® MGB probes

NFQ non fluorescent quencherNouvelle innovation

MGB minor groove binderstabilise les 5 à 6 dernières bases de la sonde (à son extrémité 3’)sonde plus courte et plus spécifique (pour un Tm donné)

NFQR

MGB

FML 13-12-04

PCR quantitative SYBR ®Green

Mesure de fluorescence en fin d’élongation

FML 13-12-04

TaqMan ® versus SYBR ® Green

TaqMan ® SYBR ® Green

Spécificité -fixation des amorces,-hybridation de la sonde,-conditions PCR

-fixation des amorces,--conditions PCR

Flexibilité -multiplexe,-détection de SNP,-

---utilisation d’amorces dégénérées

Optimisation -standardisée -dépend du gène ciblé-vérifier la formation de dimère d’amorces

FML 13-12-04

ROX™ comme référence passive

Le marqueur fluorescent ROX ™ permet de normalisé les variations de fluorescence non reliées à la PCR (fluorescence des plaques ou tubes, contamination du bloc PCR,…)

ROX

Echantillon 2

FAM

ROX

Echantillon 1

FAM

Flu

ores

cenc

e

Flu

ores

cenc

eRn

Rn

Rn= Reporter / Passive référence

FML 13-12-04

Détermination du Ct (cycle seuil)

Bruit de fond

cycle

Rn

10 2O 3O 4O 5O

1

2

3

4

Ligne de base

Ct

La valeur de Ct est déterminée dans la phase exponentielle, à l’intersection de la ligne de bruit de fond avec la courbe de fluorescence

FML 13-12-04

Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents

Courbe de calibration : comparer les valeurs de Ct

0

50

100

150

200

250

0 10 20 30 40

Nombre de cycles

Flu

ores

cen

ce é

mis

e (U

A)

101106 105 104 103 102

Nom

bre

de

cop

ies

(log

)

1

2

3

4

5

6

18 23 28 33 38

Cycle seuil - Ct

Log N = -0,26 Ct + 10,85R2= 0,998

Ct

FML 13-12-04

Quantification absolue

0

50

100

150

200

250

0 10 20 30 40

Nom

bre

de

cop

ies

(log

)

1

2

3

4

5

6

18 23 28 33 38

Cycle seuil - Ct

Log N = -0,26 Ct + 10,85R2= 0,998

Nombre de cycles

Flu

ores

cen

ce é

mis

e (U

A)

101106 105 104 103 102Ct

Résultat : l’échantillon d’ADN (ex: 25 ng) contient 10000 copies du gène cible

FML 13-12-04

Efficacité de la PCR quantitative

Nom

bre

de

cop

ies

(log

)

1

2

3

4

5

6

18 23 28 33 38

Cycle seuil - Ct

Log N = -0,26Ct + 10,85R2= 0,998

Efficacité = 10(-pente) -1

Exemplepente = -0.26E = 10(0.26) –1 = 1.82 – 1 = 0.82 soit 82 %

atzA

Si la pente est égale à 0.301 alors l’efficacité de la PCR quantitative est de 100 %

FML 13-12-04

PCR efficace à 100%

y = x (1 + E)n

cas spécifique E = 1 alorsy = x 2n

y=nombre de copie du gène cible

x=nombre de copie initiale

E=efficacité

n=nombre de cycle PCR

Quand E = 1 alors :

Ct = + 1 augmentation x2

Ct= + 3.32 augmentation x10

FML 13-12-04

Quantification relative

o pas besoin de courbe de standardo calcul des résultats pas comparaisons des Cto nécessité de définir :

- un gène cible servant de contrôle endogène,- un gène cible servant de standard.

le contrôle endogène :

- donne une image de la quantité de matrice apportée (ADN ou ADNc),

- est présent en quantité constante dans tous les échantillons,

- normalise :

- les biais d’extraction et de contaminations par des inhibiteurs (ADN)

- les variations d’éfficacité de transcription inverse

FML 13-12-04

Standard

t=0 t=2 t=4 t=7 t=14 t=21

-t0 ajout d’atrazine à des mésocosmes de sol,-t0 sera utilisé comme valeur standard

FML 13-12-04

Contrôle endogène

Gène cible

Ct = 22 – 16 = 6

Ct=16 Ct=22 Cycle

Rn

Comparaison du gène cible avec le contrôle endogène

Ct=16 Ct=22 Cycle

Rn

Ct=21Ct=15

Contrôle endogène

Gène cible

Ct = 21 – 15 = 6

Si 2 x plus de matrice ?

FML 13-12-04

Comparaison de Ct

Ct=16 Ct=26 Cycle

Rnt2

Ct=12 Ct=22 Cycle

Rnt4

Ct=15 Ct=31 Cycle

Rnt7

Ct=16 Ct=32 Cycle

Rnt0

Contrôle endogène Gène cible FML 13-12-04

Comparaison de Ct

Etape 1: normalisation par rapport au contrôle endogène

Ct gène cible – Ct contrôle endogène = Ct

Etape 2: normalisation par rapport au standard

Ct échantillon - Ct standard = Ct

Etape 3: détermination de la variation du nombre de copie du gène cible

2-Ct

FML 13-12-04

Quantification relative des résultats

64 64

1 1

standard

Au

gmen

tati

on p

ar x

t0

t2

t4

t7

FML 13-12-04

Exercice (1/4)

Contrôle

16S rRNA Ct 14

atzA Ct 32

Atrazine

16S rRNA Ct 16

atzA Ct29

Quel échantillon d’ADN est le plus concentré et de combien de fois ?

16S rRNA étant utilisé comme contrôle endogène….

FML 13-12-04

Contrôle

16S rRNA Ct 14

atzA Ct 32

Atrazine

16S rRNA Ct 16

atzA Ct29

Ct 16SrRNA = 16 –14 = 2

2Ct 16SrRNA = 22 = 4

La concentration d’ADN de l’échantillon contrôle est 4 x plus élevée que celle de l’échantillon atrazine.

Exercice (2/4)

FML 13-12-04

Exercice (3/4)

Contrôle

16S rRNA Ct 14

atzA Ct 32

Atrazine

16S rRNA Ct 16

atzA Ct29

Quel échantillon d’ADN contient le plus grand nombre de copie de

la séquence atzA ?

FML 13-12-04

Exercice (4/4)

Contrôle

16S rRNA Ct 14

atzA Ct 32

Atrazine

16S rRNA Ct 16

atzA Ct29

Ct contrôle= 32 – 14 = 18

Ct atrazine= 29 – 16 = 13

Ct = 18 – 13 = 5

2Ct = 25 = 32

Le nombre de copie du gène atzA est 32 fois plus élevé dans l’échantillon de sol traité avec l’atrazine que dans le contrôle

FML 13-12-04

Analyse de la structure des communautés microbiennes

RISA :

Ribosomal Intergenic Spacer Analysis

Amplification PCR

Amorces universelles : 38f et 72r

IGS

3’

5’

A 16 S 23 S

5’

3’

IGS

B 16 S 23 S

12 14 15 16 17 18 20 21 22 25 26 44 45 46 47 48 49 50

0.404

1.114

MM

MM

MM

MM

0.900

0.124

0.147

0.190

0.242

kpb

• Profils de bandes complexes

• numérisation du gel et analyse statistique (présence/absence, intensité des bandes)

FML 13-12-04

LP FP HPU LDSS LDCSS

LDCSS-HAP

SS100SS10FMU

IA

900

692

501484

404

320

L

La BouzulePierrelayeCouhins

Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.

U : contrôleFM : fumier 10t/h/anSS10 : boue 10t/h/anSS100 : boue 100t/h/an

LP : pollution faibleFP : pollution moyenneHP : pollution élevée

U : contrôleLDSS : boue deshydratéeLDCSS : boue deshydratée compostéeLDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP

FML 13-12-04

-0.15

0.25-0.25 0.15

HP

FP

LP

PC1 30%

PC2

21%

Pierrelaye

-0.2

0.16-0.16 0.35

FM

U

SS10

SS100

PC2

15.2

%

PC1 45.3%

Couhins

Analyse des communautés microbiennes du sol de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.

La Bouzule

-0.15

0.16-0.16 0.16

U

LDSS

LDCSS

LDCSS-HAP

PC1 30%

PC2

20%

U : contrôleFM : fumier 10t/h/anSS10 : boue 10t/h/anSS100 : boue 100t/h/an

LP : pollution faibleFP : pollution moyenneHP : pollution élevée

U : contrôleLDSS : boue deshydratéeLDCSS : boue deshydratée compostéeLDCSS+HAP : boue deshydratée compostée amendée avec des HAP

FML 13-12-04

Cinétique de minéralisation de l ’atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.

0

20

40

60

80

0 20 40 60 80

Time (day)

%cu

mu

lati

ve

14C

O2

HP

FP

LP

0

20

40

60

80

0 20 40 60 80

Time (day)

% c

um

ula

tive

14

CO

2

U

SS10

SS100

FM

0

20

40

60

80

0 20 40 60 80

Time (day)

% c

um

ula

tive

14C

O2

U

LDSS

LDCSS

LDCSS+HAP

La Bouzule

PierrelayeCouhins

FML 13-12-04

Potentiel génétique de minéralisation de l ’atrazine des sols de Couhins, Pierrelaye et La Bouzule.

0,0E+00

2,0E+04

4,0E+04

6,0E+04

8,0E+04

1,0E+05

atzA atzB atzC

Gene target

atz

(co

py

nu

mb

er.

g-1

of

soil

)

U

FM

SS10

SS100

a aa a

a

babab

ab ba

ab

0,0E+00

2,0E+04

4,0E+04

6,0E+04

8,0E+04

1,0E+05

atzA atzB atzC

Gene target

atz

(co

py

nu

mb

er.

g-1

of

soil

)

LP

FP

HP

a

b

b

bb

bb

a

a

0,0E+00

2,0E+04

4,0E+04

6,0E+04

8,0E+04

1,0E+05

atzA atzB atzC

Gene target

atz

(co

py

nu

mb

er.

g-1

of

soil

)

U

LDSS

LDCSS

LDCSS-Hap

a a aa

abab

bb

b baa

FML 13-12-04

1. Transcription inverse d’ARNm cibles en ADNc

Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre une fluorescence donnée (phase log-linéaire) est fonction du nombre d’ADN cibles initialement présents

2. Quantification des ADNc par PCR quantitative en temps réel - qPCR

0

50

100

150

200

250

0 10 20 30 40

Nombre de cycles

Flu

ores

cen

ce é

mis

e (U

A)

101106 105 104 103 102

Nom

bre

de

cop

ies

(log

)

1

2

3

4

5

6

18 23 28 33 38

Cycle seuil - Ct

Log N = -0,26 Ct + 10,85R2= 0,998

PRINCIPE DE LA RT-qPCR

1 ARNm = 1 ADNc

Ct

FML 13-12-04

NN

N NHCH2CH3(CH3)2CH2HN

Cl

atrazine

OH

NN

N NHCH2CH3(CH3)2CH2HN

Hydroxyatrazine

atzA

Acide cyanurique

N-isopropylammélide

NN

N OH(CH3)2CH2HN

OH

atzB

HO

NN

N OH

OH

atzC

CO2 + NH4+

atzF

NH

OO

Biuret

NH2

atzD

atzE

O

NH

OO

H2N

Allophanate

-

VOIE DE MINÉRALISATION DE L’ATRAZINE

H2N

FML 13-12-04

P .ADP

0

2 000 000

4 000 000

6 000 000

8 000 000

0 100 200 300

C. heintzi i

0

200 000

400 000

600 000

800 000

0 100 200 300

Niveau d’expression de l’ADNr 16S

la quantité d’ARNr 16S est stable pendant l’expérience

L’ARNr 16S = référence interne pour la mesure de l’expression des gènes atz au cours du temps

Temps (min) Temps (min)

ARNr 16S / ng d’ARN extrait

FML 13-12-04

Niveau d’expression des gènes atzA, B et C

L’EXPRESSION DES GÈNES ATZ EST FONCTION DE LA SOUCHE BACTÉRIENNE CONSIDÉRÉE

P.ADP• - ATRAZINE :Expression basale des gènes atz• + ATRAZINE : Augmentation transitoire de l’expression des gènes atz

0

200

400

600

800

1 000

0 100 200 300 400

0

50

100 150

200

250

300

0 200 400

0

200

400

600

800

0 200 400

Temps (min)

Temps (min)

Temps (min)

AR

Nm

/106 A

RN

r 16

SA

RN

m /1

06 AR

Nr

16S

AR

Nm

/106 A

RN

r 16

S atzA

atzB

atzC

P.ADP

C. heintzii• - ATRAZINE :seul atzA s’exprime • + ATRAZINE :Augmentation de l’expression des gènes atzA et BPas d’expression d’atzC

0

10 000

20 000

30 000

40 000

0 200 400

0

2 000

4 000

6 000

8 000

10 000

12 000

0 200 400

0

1

0 200 400Temps (min)

Temps (min)

Temps (min)

AR

Nm

/106 A

RN

r 16

SA

RN

m /1

06 AR

Nr

16S

AR

Nm

/106 A

RN

r 16

S atzA

atzB

atzC

C. heintzii

FML 13-12-04

atzD

0

500

1 000

1 500

2 000

0 100 200 300 400

Time (min)

Rel

ativ

e n

um

ber

of

mR

NA

b bb

b b

ab

ab

a

a

aa

a

atzF

0

50

100

150

200

250

300

350

400

0 100 200 300 400

Time (min)

Rel

ativ

e n

um

ber

of

mR

NA

atzE

0

20

40

60

80

100

120

140

160

0 100 200 300 400

Time (min)

Rel

ativ

e n

um

ber

of

mR

NA

a a

a

a

abab b

bbb

Temps (min)

Niveau d’expression des gènes atzD, E et F

En absence d’atrazine, atzD, E et F s’expriment de façon basale

L’expression d’atzD et atzE augmentent 300 min après l’ajout d’atrazine

x 20

x 150

L’expression d’atzF n’est pas affectée par l’ajout d’atrazine

Augmentation de l’expression des gènes de l’opéron atzDEF selon un gradient

FML 13-12-04