fixation sélective in vitro d'une forme modifiée du composant c3 du complément sur des...

Ann. Immunol. (Inst. Pasteur) 1983, 134 C, 237-253

F I X A T I O N Sl~LECTIVE I N V I T R O

D ' U N E FORME M O D I F I E E

DU COMPOSANT C3 DU COMPLEMENT

SUR DES E R Y T H R O C Y T E S HUMAINS

par C. Micouin Q), E. Hudry-Clergeon Q), B. Roussel Q), N. Battail Q), A. Tournoud (z) et M. G. Colomb (z)

(1) Laboraloire d'Immunologie, CDTS Grenoble (Dir. : Pr R. Magnin), 38700 La Tronche (France), and

(2) Laboraloire de l'H6pilal Sud, CHRU Grenoble, 38130 Echirolles (France)

SUMMARY

B I N D I N G OF M O D I F I E D C O M P L E M E N T C O M P O N E N T C 3

TO H U M A N E R Y T H R O C Y T E S (( IN VITRO ))

C3 was bound to human erythrocytes from autologous plasma or from serum brought to low ionic strength (t~ ~ 0.03) and pH between 4.0 and 5.0, then subsequently incubated with erythrocytes (50/1, v/v) for 20 min at 0 o C. This capacity was preserved up to 72 h by prolonged incubation at 20, 25 or 37 o C, whereas it was quickly lost by incubation at 0o C.

C3 binding did not require complement activation and was not observed with neuraminidase-treated erythrocytes.

Crossed immunoelectrophoretic analysis of the pretreated serum or plasma revealed tha t a fraction having more cathodal migration than that of native C3 was generated upon incubation in the above-mentioned conditions. This fraction appeared able to selectively bind to the erythrocytes.

Cell-bound C3 reacted positively to antisera against C3a, C3c, C3d or native C3; they rosetted positively with EAC3b, clearly showing that this C3 binding was not dependent on the proteolysis of C3 and that it concerned the acceptor sites on the cells, since C3b receptors were free.

The functional significance of this C3 binding was also investigated: EC3 were not able to lyse through the alternative pathway, whereas lysis clearly increased when C3 was found to AET-treated erythrocytes. This finding, together with the modulation in the capacity of EC3 or E(AET)C3 to form an alternative pathway convertase by antibodies to C3c or C3d, strongly suggests a contribution of bound C3 to such a convertase.

Manuscr i t re~u le 21 d~cembre 1982, accept6 le 5 avr i l 1983.

238 C. MICOUIN ET COLL.

In contrast to (c C3b-like ~ C3, this modified C3 was able to bind to acceptor sites on erythrocytes but, like the former, it retained the capacity to form an alternative pathway convertase. In this light, it may represent an intermediate between C3 and (( C3b-like ~ C3.

KEY-WORDS: Complement, Erythrocyte-bound C3, Antiglobulin test; Selective fixation.

INTRODUCTION

On sait que des composants du compldment humain peuvent ~tre fixds in vitro, en l'absence d'anticorps spdcifiques, sur des 6rythrocytes humains, aprds activation ~ leur contact ~ 37 ~ C des composants C1 ou C3 presents dans le sdrum humain normal compatible frais (SF). L'act ivat ion de C1 est obtenue par abaissement de la force ionique du sdrum [8, 9, 13] ; l 'activation de C3 est obtenue par addition de sdrum faiblement acidifi6

des 6rythrocytes rendus artificiellement c( aetivateurs ~ de la voie alterne [10, 19].

Or, r@emment Petz et Garratty ont ddcrit une technique ddrivde des travaux de Fruitstone et Chaplin [4, 5, 15] qui leur ont permis de former in vitro des complexes EC particuliers - - dits EC3b - - par mdlange 0 ~ C pendant 1 h de 1 ml de sang ACD ou CPD ~ 19 ml d'une solution de sucrose 0,27 M, E D T A 4,25 mM, phosphates 5 raM, pH = 5,1, et addition immddiate de MgCI~ 2 raM. Le mdcanisme de cette sensibilisation est demeur6 inexpliqu6 pour ces auteurs.

L'util isation de ce proeddd, lors de eontr61es d'immunsdrums de Coombs, nous a rapidement conduits ~ eonstater que les complexes ainsi obtenus 6taient agglutinds non seulement par des immunsdrums anti-C3c et anti-C3d mais aussi par des immuns~rums anti-C3a et anti-$1c (dit anti-C3 natif)

A C D = acide citrique, citrate tr isodique, dextrose.

A E T = 2-aminodthy l i so th iouron ium (bromure) . A G H = ant i -g lobul ine humaine . C P D = citrate trisodique, acide c i tr ique, phos-

phate , dextrose . E ~ d r y t h r o c y t e . E D T A - - dthyl~nediamine tdtraacdtate. E G T A = d t h y l d n e g l y c o l - b i s - (amino-2-dthyl -

dther) tdtraacdtate. F I T C - - i so th iocyanate de fluorescdine ( c o n j u -

g u d ~ . . . ) .

I A = immunoadh~rence . I E C = immunodlectrophor~se croisde. I F = immunof luorescence . I H V A = i m m u n o h d m o l y s e par vo le alterne. P B S -- (( phosphate-buffered saline ,,. P B S - H C 1 ~ P B S + H C 1 q . s . p , p H ddtermind. P F = plasma h u m a i n normal compat ib l e frais.

P F - c i t r a t d - P F contenant du citrate tr isodique 2 5 r a M ,

P F - E D T A = P F c o n t e n a n t de I ' E D T A 10 r a M . R C = rdaction de Coombs. S F = sdrum h u m a i n normal cornpatible frais. S F - E D T A = S F c o n t e u a n t de I ' E D T A 10 r a M . S F - E G T A = S F c o n t e n a n t de r E G T A 6 r a M ,

MgCI~ 2 m M . S C h = S F c h a u f f d (56o C, 30 rain). S F C = so lut ion de Frui t s tone et Chaplin modi -

fide (sucrose 0 , 2 7 M ; E D T A 4 , 2 5 m M ; phosphates 5 m M ; MgC12 4 , 8 r a M , p H ~ 4 ,8 ) .

Sucrose = sucrose 0 , 3 M. Sucrose-HCl = sucrose + HC1 q . s . p , p H ddter-

mind. T R I T C = i so th iocyanate de tdtramdthylrhoda-

mine ( c o n j u g u d ~ . . . ) . V B S ~+ = ~, veronal buffered saline ~, CaClo

0 , 1 5 m M ; MgC12 0 ,5 r a M .

FIXATION D'UNE FORME MODIFII~E DU C3 239

(en l ' absence de t o u t e r6action d6tectable avec des immuns6rums ant i - IgG, ant i-C4 et anti-C5) ; de plus la subs t i t u t ion au sang ACD ou CPD du sang coagul6 reconst i tu6/~ 45 % d 'h6matocr i t e avec du s6rum au to logue chauff6 (56 ~ C, 30 rain) a condu i t exac t emen t au marne r6sultat .

D~s lors nous avons pens6 qu' i l ne p o u v a i t pas s 'agir d 'une ac t iva t ion du compl6ment , et il nous est apparu in t6ressant d'61aborer une m6thode de sensibil isation en deux temps , d6riv6e du proc~d6 original, qui pe rme t t e de reproduire ces complexes et d 'en ana lyse r les condi t ions de fo rma t ion et les propri6t6s.

Les r6sultats de not re 6tude ont mon t r6 qu ' i l s 'agissai t d ' u n e f ixat ion 6 ry th rocy ta i re s61ective d 'une forme modifi6e du composan t C3 e t non pas du f r agmen t C3b. Cet te f ixat ion qui a pu, dans certaines circonstances, en t ra iner la lyse des h6mat ies acceptrices, n ' a 6t6 condi t ionn6e que par les basses forces ioniques (t~ ~< 0,03) l 'acidi t6 (4 ~< p H ~< 5) du mil ieu et la t emp6ra tu re de sensibi l isat ion des 6 ry th rocy tes (0o C).

M A T I ~ R I E L E T MI~THODES

1) Plasmas el sdrums sanguins.

Nous avons employ6 des pools de 20/~ 100 plasmas frais (PF) ou s6rums frais (SF) provenant de donneurs de sang, ne eontenant pas d'auto- ou alloanticorps anti- 6rythrocytes irr6guliers, congelds frais ~ -- 80 ~ C. Les vari6t6s suivantes ont 6t6 utilisdes : PF eitrat6, PF-EDTA, SF, SF-EDTA, SF-EGTA et SCh (s6rum frais chauff6) ; leurs forces ioniques ont 6t6 assimil6es ~ celle d'une solution de NaC1 0,15 M. Dans un cas particulier le PF-EDTA a 6td trait6 par l 'hydrazine 15 mM, pH 7,3.

2) Preparations plasmaliques el sdriques.

Ces diff6rentes vari6tds de plasmas ou s6rums ont 6t~ dilutes (plasma ou sdrum : 3 vol, diluant : 50 vol)/~ 20-25 o C dans les solutions isotoniques suivantes, de force ionique et de pH vari6s : PBS, PBS-HC1, sucrose, sucrose-HC1 et SFC. Lorsque des pr6cipit6s sont apparus, ils ont dt6 dliminds par centrifugation (20 000 g, 15 min).

3) l~rglhrocytes.

Nous avons employ6 les drythrocytes et pr6parations drythrocytaires suivants :

- - E : pool d'drythrocytes humains de groupe O, lards, utilis6s gdndralement en culot ;

- - E(Try) : E trait6s par trypsine : E (1 vol) § Trypsine (Flow) 1%o en PBS (2 vol), 37 ~ C, 30 min, lavages ;

- - EC(Try) : E rev~tus de compldment, traitds par trypsine dans les m6mes conditions mais pendant des temps variant de 5 min ~ 2 h ;

- - E(AET) : E trait6s par I'AET (Merck) selon Sirchia et coll. [19] pendant 5 rain seulement.

- - E(Neu) : trait6s par la neuraminidase : E (1 vol) § neuraminidase (Beh- ringwerke) 0,1 U/ml, PBS (10 vol), 37 ~ C, 30 min, lavages [17] ; les 6rythrocytes ainsi traitds sont devenus ,, T-polyagglutinables ~ [6] ;

- - Em : 6rythrocytes de mouton (Bio-Mdrieux) ; - - EmA : Em 5 ~/o (1 vol) ~- s~rum h6molytique anti-mouton (Insti tut Pasteur)

1/1 000 (1 vol), 37 ~ C, 30 min, lavages ;


- - EmAC : EmA 2,5 % (1 vol) + SF h 1/100 absorb~ h 0 o C sur Em (1 vol), 37 ~ C, 30 rain, lavages.

Pour ces trois derniers rdactifs : suspensions, dilutions, lavages en VBS ~+.

4) Sensibilisations ~rllthrocytaires.

Elles ont toujours dt6 effectudes selon le protocole suivant : prd-ineubation des r6actifs ~ 0 o C ; addition de 1 vol d'drythrocytes (de nature varide) ~ 50 vol de prd- paration plasmatique ou sdrique (de composition vari6e) ; ineubation pendant 20 min

0 ~ C (avec agitation ~ plusieurs reprises du m61ange) ; lavages en solutions isotoniques varides. Dans quelques eas (pr6cis6s) on a fait varier la tempdrature et le temps de sensibilisation.

5) Rdaclions de Coombs (RC).

Elles ont ~td faites toujours apr~s lavages 6rythrocytaires en NaCl 0,15 M, en tubes, avec centrifugation (200 g, 1 min) et lecture de l'hdmagglutination au miroir concave. Les r6sultats ont 6t6 exprimds de 0 ~ 4~-. Les principaux immunsdrums anti-globulines humaines (AGH) utilis6s ont 6t6 les suivants (les spdcificit~s mentionn6es sont celles indiqudes par les fabricants) : anti-IgG, anti-compl~ment (-C3b, -C3d, -C4) et anti-C3d (Ortho Diagnostic Systems); anti-~lE(C4), anti- ~IC/A (C3) et anti-~2D (C3d) (General Diagnostics) ; anti-C3 (~1C), anti-C3e (~IA) et anti-C5 (~IF) (Organon Teknika) ; anti-Clq et anti-C3a (Behringwerke). Leur r6activit6 et leur sp6cificit6 pour l'h~magglutination [7] ont 6t6 contrbl6es - -apr~s absorption systdmatique sur 6rythrocytes normaux ou traitds et dilution appropride (1/5 h 1/20) - - s u i v a n t les proc6dds conventionnels [17], en particulier ~ l'aide de complexes EC ou EIgGC form6s in vivo ou in vitro [7, 15].

6) Immunofluorescence (IF).

Elle a ~t~ pratiqu~e en tubes avee des suspensions ~rythroeytaires diverses. Elle a ~t~ effectu~e en tours de sensibilisations hypoioniques utilisant des solutions de lavages et des diluants de r~actifs anticorps de force ionique et de pH identiques ceux des preparations sensibilisantes. Elle a ~t~ utilis~e aussi en milieu isoionique neutre (PBS) avec des ~rythrocytes d~jh sensibilis~s pour la comparaison micro- scopique de la distribution et de l'intensit~ des fluorescences obtenues avec des antieorps anti-C3a et anti-C3c, indirectement ou directement marquis par des fluoro- chromes diff~rents. Les r~actifs antieorps suivants ont ~t~ utilis~s : FITC-globulines de lapin anti-Clq, FITC-F(ab')2 de lapin anti-Ig (Behringwerke)immuns~rum de lapin anti-C3a (Behringwerke), TRITC-globnlines de cheval anti-Ig de lapin (Organon-Teknika) FITC-globulines de lapin anti-C3/C3c (Behringwerke). Pour le double marquage de C3a et C3c les trois derniers r~aetifs ont ~t~ ntilis~s dans l'ordre indiqu~ ci-dessus (avee des lavages interm~diaires). Ces r~actifs anticorps ont 6t~ absorb~s et eontr61~s dans les m~mes conditions que pour les RC; ils ont ~t~ v~rifi~s aussi en mieroseopie de fluorescence avec des EC en suspensions ou d'autres supports antig~niques. Par exemple, il a ~t~ v~rifi~ que le r~aetif anti-Clq se fixait bien sur Clq purifi~ [1], natif ou ehauff~ (56 ~ C, 30 min), d~pos~ sur lame, s~ch~ et fix~ (acetone, - - 2 0 ~ C, 10 rain).

7) Examens immunochimiques.

Ils ont port~ sur les preparations plasmatiques ou s~riques pr~cit~es :

- - IEC-anti-C3c : immuno~lectrophor~se crois~e (bidimensionnelle) du composant C3 et de ses produits de clivage C3b et C3e ~ l'aide d 'un immuns~rum anti-C3c (Behringwerke), adapt~e de Laurell et coll. [12] ;


- - IE-anti-composant B : immuno61ectrophor6se du facteur B e t de son produit de clivage Bb h I aide d 'un immunsdrum anti-facteur B (Behringwerke) [18].

8) ImmunoadMrence (IA).

Elle a 6t6 adaptde de Laehmann et Hobart [11] avec, eomme (c indicateurs )), 0,1 ml de E ou de EC (h 1 % en VBS ~+) et, comme complexes porteurs de C3b, 0,1 ml de EmAC ou de EC simples ou trypsinds (h 0,25 ~o en VBS~+). L'h6maggluti- nation, r6alisde en plaque de microtitrage h cupules en V, a 6t6 lue apr6s 2 et 6 h de sddimentation h 20-25 ~ C.

9) Immunohdmolyse par t~oie allerne (IHVA ).

Elle a 6t6 adaptde de Dacie et Lewis [3] : on utilise 0,1 ml de E (h 50 % en PBS) ou de E(AET) (h 50 % en PBS) sensibilisds par C3 et complex6s ou non h des anticorps anti-C3a ou anti-C3d ou anti-C3c, en prdsence de 1 ml de SF-EGTA fi pH 8 ou 6,6 et on mesure l'h6molyse apr6s des temps de rdaction variables.

RI~SULTATS

1) Influence de la force ionique, du pH, des prdparalions plasmaliques ou sdriques utilisdes el de la tempdrature des rdactions de sensibilisation.

a) Pour des va leurs fixes de la t e m p 6 r a t u r e (0o C) et du p H (4,5) nous avons obtenu des f ixat ions s61ectives de C3 seulement pour des valeurs faibles de la force ionique (tz ~< 0,03) ( tab leau I).

b) Pour des va leurs fixes de la t e m p 6 r a t u r e (0 o C) et de la force ionique (~ ---- 0,01) nous avons ob tenu des f ixat ions s61ectives et ne t t es de C3 seu lement pour des va leurs du p H comprises entre 4,4 et 4,9 ( tableau II).

TABLEAU I. - - Infuence de la force ionique sur la fixation de C3, i pH fixe (4, 5).

Pr6para t ions p l a sma t ique s I I I I I I IV u V I

- - Compos i t ion : - - P F - E D T A 3 vol 3 vol 3 vol 3 vol 3 vo l 3 vol - - N a C 1 0,15 M-4-HC1 20 vol 10 vol 7,5 vol 5 vol 2,5 vol 0

q.s .p, p H 2,43 - - Sucrose 0,3 M-[-I-IC1 30 vol 40 vol 42,5 vol 45 vol 47 ,5 vo l 50 vol

q.s .p, p H 2,43 - - iz (6valu6e pa r di lut ion) 0,068 0,038 0,030 0,023 0,016 0,008

R6ac t ions de Coombs (*) ant i-C4 0 0 0 0 0 0 an t i -C3a 0 1 -4- 2 ~- 3 -4- 3 -4- 3 -4- an t i -C3d 0 0,5 + 1 + 2 + 2 + 2 d- ant i -C3c 0,5 -4- 2 -4- 3 + 4 -4- 4 -t- 4 A-

(*) RC effectu6es apr~s l avages isoioniques des 6 ry th rocy t e s sensibilis6s selon le protocole s u i v a n t : E (1 vol), p r6pa ra t i ons p l a sma t i ques I h u (50 vol), 0 o C, 20 min .


TABLEAU II. - - Influence du pH sur la fixation de C3, basse force ionique (tz = 0,01).

Prdpara t ions p lasmat iques I I I I I I IV V VI V I I V I I I IX

p H final des prepara t ions 7,9 6,3 6,0 5,5 4,9 4,6 4,4 2,7 4,9 p lasmat iques

F ixa t ion de C3 (*) 0 0 0 0 2,5 + 4 + 2,5 A- 0 4 -[- (RC anti-C3c)

I h V I I I : P F - E D T A (3 vol), sucrose-HC1 de p H var ian t en t re 5,9 et 2 (50 vol) ; IX : P F - E D T A (3 vol), SFC de pI-I = 4,8 (50 vol). (*) RC effectudes dans les condi t ions d@rites au tableau I.

Lorsqu'6tai t apparu un t rouble dans la pr6paration fi examiner (surtout pour les valeurs du pH comprises entre 4,9 et 6,3), son 61imination par centrifugation n'a pas diminu6 la capacit6 de fixer C3 du surnageant, et le pr6cipit~ correspondant repris dans le diluant d'origine n'a pas pr6sent~ cette propri6t6.

c) Pour des valeurs fixes de la force ionique (~ = 0,02) et du pH (4,5) nous avons obtenu des fixations s61ectives et nettes de C3 seulement pour des valeurs de la t empera ture proches de 0o C. A 37o C la fixation de C3 a 6t6 tr~s faible - - C3a (0,5-4-) - - et non s61ective : de l 'antig~ne C4 ( 2 + ) a 6t6 retrouv6 associ6. Cela nous a incit6s h rechercher la fixation 6ven- tuelle d 'autres consti tuants plasmatiques ou s6riques en fonction h la lois de la temp6ra ture de sensibilisation (00 C ou 370 C) et de la nature de la pr6paration sensibilisante (PF-EDTA, SF, SCh dilu6s en milieu hypoionique acide ~ pH final 4,5, ou neutre ~ pH final 8) (tableau I I I ) : par IF (en milieu hypoionique), des Ig ont 6t6 observ6es dans tous les cas ; du Clq a 6t6 observ6 associ6 sauf avec les pr6parations contenant du SCh. Lors des lavages en milieu isoionique (NaC1 0,15 M), ces Ig et Clq ont 6t6 ~lu6s et n 'ont plus ~t6 retrouv6s par RC (en milieu isoionique). Par contre, d 'autres consti tuants ont 6t6 d6cel6s dans ces conditions : C4 a 6t6 iden- tifi6 seulement apr~s r6action ~ 370 C, trbs ne t t ement apr~s action du SF en solution hypoionique neutre, plus faiblement apr~s action du PF- EDTA ou du SF en solution hypoionique ac ide; il n 'a pas ~t6 d6cel6 apr~s action du SCh. C3a a 6t6 identifi6 (toujours associ6 ~ C3c et C3d) seulement apr6s utilisation des pr6parations hypoioniques et acides, essentiellement apr~s r6action ~ 0o C et quelle que soit la vari6t6 plasma- t ique ou s6rique utilis6e.

2) Influence de la source de compldment el du lype d'drythrocytes utilis~s.

Dans les conditions optimales que nous avons observ6es, ~ savoir, pr6paration sensibilisante hypoionique (~ ~< 0,02) acide (pH = 4,5) 50 vol et 6rythrocytes 1 vol, 0 o C, 20 rain, routes les vari6t6s plasmatiques ou


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s6riques employ6es (PF-citrat6, PF-EDTA, SF, SF-EDTA, SCh) ont 6t6 capables de fixer s61ectivement C3.

Par ailleurs, cette fixation de C3 a 6t6 possible non seulement sur E mais aussi sur E(Try) et E(AET) ; par contre, elle n'a pas 6t6 possible sur E(Neu).

3) Analyses immuno~lectrophordliques de diffdrentes prdparations plasmatiques ou sdriques.

La fixation de C3 ~ partir de diff6rentes pr6parations a 6t6 analys6e par 6tude des trac6s obtenus apr~s IEC-anti-C3c de ces m6mes pr6para- tions (fig. 1) : les pr6parations d et f hypoioniques et acides et capables de fixer C3 ont pr6sent6 un trac6 partieulier, analogue ~ celui donn6 par la pr6paration g trait6e par l 'hydrazine (fraction de mobilit6 plus cathodique que C3). Apr6s absorption de la pr6paration d sur E ~ 0 o C, il n'a plus 6t6 d6cel6 de fixation de C3 et on a observ6 la disparition de la fraction eatho- dique (e).

Des pr6parations plasmatiques ou s6riques hypoioniques et acides qui avaient 6t6 capables de fixer C3 ne Font plus 6t6 aprbs dialyse isoionique neutre & 20-250 C en pr6senee comme en l'absence de Mg2+; parall~lement, l'IEC-anti-C3 et l 'IE-anti-facteur B ont d6cel6 dans ces pr6parations, lorsque la dialyse avail 6t6 faite en pr6sence de Mg ~+, des produits de clivage C3c et Bb (fig. 2 b e t 3 a' et b').

4) Influence de la temp~ralure de conservation des prdparalions sensibilisantes sur leur capacitd de fixer C3.

A 20-25 ~ C ou 37 ~ C, cette capacit6 a persist6 pratiquement inchang6e pendant 72 h ; h 0 o C, elle a diminu6 progressivement pour disparaitre an bout de 6 ~ 8 h ; elle est r6apparue trbs nette apr~s r6chauffement des pr6parations pendant plusieurs heures ~ 37 ~ C.

5) Caractdristiques el propridlds des drythrocytes ayanl fixd C3.

Par RC (en milieu isoionique) il n'a pas 6t6 observ~ d'agglutination avec les AGH anti-IgG, anti-$1E (C4) et anti-C5 ($1F) ; l'agglutination a 6t6 nette avec les AGH anti-$1C/A (C3) (4+), anti-C3d (2+), et aussi anti-C3a (3+) et anti-C3 ($1C) (3+). Par IF, en milieu isoionique, avec double marquage de C3a et C3c, des fluorescences granit6es rouges et vertes exac- tement superpos6es ont 6t6 obtenues. Aussi ces complexes ont-ils 6t6 d~sign~s ~ EC3 ~. L'antig6nicit6 globale observ6e, C3a (3+), C3d (2+), C3c (4+),

FIG. 1. - - Immunodlectrophor~se croisde anti-C3c de diffdrentes prdparations plasmatiques el rdactions de Coombs correspondantes (anti-C3c).

= f o r c e i o n i q u e e x p r i m 6 e e n c o n c e n t r a t i o n s a l i ne r e l a t i v e d ' a p r ~ s d e s m e s u r e s d e c o n d u c t i v i t 6 . P F - E D T A - H y = P F - E D T A c o n t e n a n t H y d r a z i n e 15 m M .

IPr~parations plasmatiques

I __ Profil immuno-

Nature ~lectrophor4tique

RC

a)

PF-EDTA +

PBS

b)

PF-EDTA

PBS-HCI

c)

PF-EDTA +

Sucrose

d)

PF-EDTA +

u c r o s e - H C 1

e)

PF-EDTA +

4 , 4

8 , 0

4 , 4

0

4+

0

lqG. 1

FIG. 2. - - Immunodlectrophor~se croisde anti-C3c de prdparations plasmatiques ( P F - E D T A ~b SFC).

a) A v a n t dialyse. b) Aprbs dia lyse cont re P B S - E D T A 10 mM, MgC12 4,8 mM, h 20-25 o C. c) Apr~s dia lyse cont re P B S - E D T A 10 mM.

FIG, 3. - - Immunodlectrophor~se croisde anli-C3c el immunodlectrophor~se anti-[acteur B de pr~paralibns sgriques.

a) IEC-ant i -C3c de (SF A- YBS2+)- a ') IEC-an t i -C3c de (SF -k SFC) dialys6 seeonda i r emen t eon t re u ~+ a 20-25 o C. b) IE -an t i - f ac t eu r B de (SF -b VBS2+). b') IF,~anti-faeteur B de (SF ~ SFC) dialys6 seeonda i r emen t eont re VBS 2+ ~ 20-25 ~ C.

FIG. 2

FIG. 3


est demeur6e pra t iquement inchang6e apr~s lavages r6p6t6s, conservation h + 4oC ( ~ 72 h) ou action d'une solution acide dissociante [16]; elle a 6t6 modifi6e progressivement par la t rypsine ou les prot6ases s6riques fi 37 ~ C ; avec la trypsine, ont 6t6 obtenues, au bout de 5 rain, une antig6ni- cit6 C3a (0), C3d (2+) , C3c (3+) et, au bout de 1 h ou de 2 h, une antig6ni- cit6 C3a (0), C3d (2,5§ C3c (0).

L ' IA recherch6e avec des EC3 (comme (( indicateurs ))) a 6t6 positive (4+) et durable avec des complexes EmAC ; recherch6e avec des E (comme (c indicateurs ))) (tableau IV), elle a 6t6 n6gative avec des (( EC3 )~, positive (2+) transitoire avec des (( EC3 )) trypsin6s pendant 5 min, n6gative avec des (( EC3 ), trypsin6s pendant 2 h. L ' IHVA (tableau V) recherch6e en SF- EGTA, 37 ~ C, a 6t6 n6gative avec des (( EC3 )., des (( EC3 ))-anti-C3a, des (( EC3 ,,-anti-C3c, et positive avec des (( EC3 ))-anti-C3d (surtout h pH 6,6) ; recherch6e en SF-EGTA, pH----8, 37 ~ C, elle a 6t6 rapidement positive avec des (( E(AET)C3 )) et, comparat ivement , augment6e avec des (c E(AET)C3 ))-anti-C3d et diminu6e avec des (( E(AET)C3 ),-anti-C3c. L' IF avec double marquage anti-C3a et anti-C3c des complexes (( E(AET)C3 )) intacts et des m6mes complexes lys6s par le SF-EGTA, pH ---- 8, 37 ~ C, a r6v616 sur ces derniers la persistance du marquage de C3a et l 'augmen- rat ion du marquage de C3c.

TABLEAU IV. - - Immunoadh6rence de EC3 et de EC3(Try).

Complexes

Ant ig6nici t6 des complexes (par RC)

IA C3a C3d C3c ( ind ica teur s : E)

EC3 EC3(Try) 5 min EC3(Try) 2 h

T~moins : - - EmAC - - EC4b3b (*) - - EC4b3b(Try) 30 mi n

3 § 2 + 4 -k N6gat ive 0 2 q- 3 q- Posi t ive (2 ~ ) t rans i to i re 0 2,5 q- 0 N6gat ive

0 1,5 ~ 4 d- Pos i t ive (4 d-) durable 0 2 ~- 3 ~ Pos i t ive (2 + ) t rans i to i re 0 3 d- 0 N~gat ive

(*) O b t e n u s avee du SF hypo ion ique neu t r e 37 ~ C [15].

DISCUSSION

La pr6paration des complexes dits (( EC3 ,, n6cessite :

- - u n e source plasmatique ou s6rique de C3 non d6grad6 (le SCh convient aussi bien que le SF) dilu6e en milieu isotonique h la fois hypoionique et acide (pr6paration finale : ~ < 0,02 ; 4,4 ~< pH ~ 4,9) ;

- - d e s 6rythrocytes non appauvris en acide sialique E, E(Try) ou E(AET) ;


TABLEAU V. - - Immunoh~molyse par voie alterne de E(AET)C3 et de EC3.

H~molyse (%) apr~s 5 min h 37 ~ C Complexes avec SF-EGTA (pH = 8)

Tdmoin E(AET) 0 E(AET)C3 60 E(AET)C3-anti-C3d 90 E(AET)C3-anti-C3c 10

H~molyse (%) apr~s 45 min h 37 ~ C avec SF-EGTA ( p H = 8) avec SF-EGTA (pH = 6,6)

Tdmoin E 0 0 EC3 0 0 EC3-anti-C3a 0 0 EC3-anti-C3c 0 0 EC3-anti-C3d 20 60 EC3d (*)-anti-C3d 0 0 EC3d (*) 0 0

(*) EC3 trypsinds 2 h : C3a (0), C3d (2,5 + ) , C3e (0). Pour complexer C3 aux ant ieorps, on a m~lang~ EC3 ou EC3d (0,5 ml) aux diff~rents immun-

s~rums purs (General Diagnostics, Behringwerke) (1,5 ml) pendant 15 min ~ 20-25 ~ C ; apr~s 1 lavage, les ~rythroeytes ainsi trait~s ont ~t~ utilis~s ~ 50 % en NaC1 0,15 M.

- - le m~lange de la preparat ion sensibilisante et des ~rythrocytes dans des proport ions appropri~es (dans les pr~sentes conditions : 50 vol/1 vol)

0 o C durant 20 rain environ (la sensibilisation ~rythrocytaire d~butant au bou t de 5 rain et plafonnant au-del~ de 20 rain).

A 0 ~ C, on favorise au max imum la fixation associ~e des antig~nes C3a, C3d et C3c - - c'est-~-dire du composant C3 entier - - et on ~vite route sensibilisation surajout~e par C4b, C3b, d~tectable h 37 ~ C, et due vraisem- b lablement ~ l 'activation, ~ cet te temperature (m~me en SF-EDTA p H 4,5, car ~ ce p H le r61e ch~lateur de I 'EDTA ne semble plus rempli), de la voie classique au contact des ~rythrocytes rev~tus au d~part, en milieu hypoionique, de quantit~s impor tantes d'Ig.

Pa r lavages isoioniques (NaC1 0,15 M) les Ig fix~es sont 61u~es, mais le composant C3 reste fix~ aux ~rythrocYtes et il est d~tect6 par RC en l 'absence de tou te trace de C4 ou C5. La liaison de C3 aux membranes fixatrices s 'av~re forte (r~sistance aux lavages, ~ la conservation, ~ Faction d 'une solution acide dissociante ; d6gradation progressive en C3b et C3d par la t rypsine). De ce fait, elle ne peu t concerner les sites r~cepteurs de C3b (CR1) qui, par ailleurs, apparaissent fonctionnellement libres en permet tan t I'IA des (( EC3 ~ (comme (( indicatears ~) avec des EmAC. Cette liaison pourra i t r~sulter d 'une combinaison de C3 ~ des sites accepteurs, comparable ~ la fixation (c active ~ du f ragment C3b natif. Ainsi fix~ ce composant permet , en effet, apr~s amputa t ion t rypsinique de C3a, I'IA (faible) avec des E (comme c( indicateurs )~) ; de plus, en SF-EGTA ~ 37 ~ C, il induit spontan6- ment la lyse d'~,rythrocytes trait~s par I 'AET, et, dans les m~mes conditions de milieu, apr~s complexat ion ~ des anticorps anti-C3d il induit aussi

FIXATION D'UNE FORME MODIFIt~E DU C3 251

la lyse d '~rythrocytes normaux. Cette aetivit~ h~molytique apparem- ment modul6e par l '~tat physique des surfaces acceptrices - - E(AET) - - et par l'accessibilit~ du composant C3 aux prot6ines H e t B [2, 20] permet de supposer que le composant C3 ainsi fix~ puisse servir, comme le C3b fix~, d'~l~ment de nucleation d 'une C3-convertase alterne.

En phase fluide, si l 'on compare les earact~res physiques (0, ~, pH) des preparations sensibilisantes 6tudiSes avec d 'une par t leur propri~t~ de fixer C3 ou non sur E et d 'autre par t le profil immunochimique de leurs const i tuants C3 et B, il est possible de sugg~rer les t ransformations mol6cu- laires suivantes.

1) En milieu hypoionique et acide, apparai t rai t une forme modifi6e de C3 qui, apr~s IEC anti-C3c, est r~v61~e en position identique h celle de C3(NH~-NH2) contenu dans le P F - E D T A trait~ par rhydraz ine (I 'IEC des preparations hypoioniques et acides effectu6e en milieu isoionique 16g~re- ment alcalin met t ra i t en ~vidence, en fair, une forme hydrolys~e du composant C3 modifi~, C3(H20)). Cette forme modifi~e de C3 disparaitrai t des pr6parations hypoioniques acides apr~s leur contact avec des E ~ 0 o C (disparition du trac~ particulier, fi I ' IEC anti-C3c), et ainsi semblerait responsable de la sensibilisation s~lective de type EC3 observ~e.

2) Remise en milieu isoionique neutre, cette forme modifi6e de C3 s 'hy- drolyserait et ne r~agirait plus sur E fi 0 o C ; par contre, ~ 37 ~ C, en pr6sence de Mg ~+, elle induirai t l 'act ivat ion en phase fluide de C3 par la voie alterne (presence des produits de clivage C3c et Bb), ce qui sugg~re, dans ces nouvelles conditions, une t ransformation de cette forme modifi6e particu- li~re en C3(H~O) de t y p e (~ C3b-like )) C3.

Ainsi, sous l 'influence conjugu6e de l 'abaissement de la force ionique et du pH, le composant C3 natif se tranformerait- i l part iel lement en une forme modifi6e (avec ext6riorisation du site thioester ?) - - stable ~ 37 ~ C, instable h 0 ~ C - - susceptible d'6voluer selon deux voies distinctes mais comparables :

- - en l 'absence d '6rythrocytes et sous l 'effet d 'une normalisation du p H et de ~, cette forme de C3 modifi6e pourra i t s 'hydrolyser rap idement pour former C3(H~O) correspondant h du (( C3b-like )) C3 fonctionnel [14] ;

- - en pr6sence d '~rythrocytes, fi 0 o C, cette mfime forme modifi6e de C3 r6agirait (principalement par son site thioester ext6rioris6 ?) avec des sites accepteurs presents h leur surface pour former des complexes de t ype EC3 ou plus pr6cis6ment E (( C3b-like )) C3 6galement fonctionnels.

RI~SUMI~

Nous avons analys~ les caract~res antig6niques et fonetionnels des complexes dits (( EC3b )) obtenus selon la m~thode propos~e par Petz et Garra t ty en 1980, ainsi que les conditions de leur preparation.

Le rev~tement 6rythrocytaire ainsi r6alis6 est constitu6 exclusivement

Ann. lmmunol. (Inst. Pasteur), 134 C, n ~ 2, 1 9 8 3 . 1 7


de C3 antig~niquement complet : C3a, C3d, C3e, stable, non ~luable et progressivement d~gradable par la t rypsine ou les prot~ases s~riques en d~riv~s C3b (C3d, C3c) et C3d r~siduel. Pour preparer ces complexes d~sign~s de faqon inappropri~e EC3b - - en r~alit5 EC3 - - il n'est pas n~cessaire d'op~rer en un temps ni en presence d 'EDTA et de MgC12. I1 sufflt de t ra i ter du plasma (ou du s~rum) humain normal compatible par dilution isotonique hypoionique acide (dilution terminale : ~ ~< 0,03 ; 4,0 ~< p H ~< 5,0) et de m~langer cette derni~re (50 vol) ~ un culot d '~rythrocytes (1 vol) h 0 o C pendant 20 min. Le rev~tement peut ~tre obtenu avec des ~rythrocytes normaux, trait~s par la t ryps ine ou par I 'AET - - E(AET) - - mais non pas avec des ~rythrocytes trait~s par la neuraminidase. Form~ sur E(AET), ce rev~tement induit leur lyse en presence de sSrum humain normal compatible frais, ~ 37 ~ C. Corr~lativement, le plasma (ou le s~rum) trait~ par dilution isotonique hypoionique acide, puis dialys~ h 20-25 ~ C contre une solu- t ion isotonique isoionique neutre, perd la propri~tfi de former des complexes EC3 h 0 o C et acquiert, en presence de Mg ~+, celle d 'act iver la vole alterne du compl~ment en phase fluide.

Pour rendre compte de ces fairs, nous supposons qu'en solution hypoionique et acide le composant C3 plasmatique ou sfirique est modifi~ en une forme interm~diaire entre C3 natif et (( C3b-like )) C3, relat ivement stable dans ces conditions et ~ 20-37 o C. Mise en prSsence d'firythrocytes, suffi- samment charges en acide sialique, cette forme modifi~e de C3 r~agirait (essentiellement fi 0 o C) avec des sites acceptears ~rythrocytaires pour former du (( C3b-like )) C3 partieulaire fonctionnel. En milieu isotonique isoionique neutre, cet te forme modifi~e de C3 s 'hydrolyserai t pour former du (( C3b- like )) C3 soluble ~galement fonctionnel.

MOTS-CL~S : Compl~ment, t~rythrocyte-C3, Rfiaction de Coombs ; Fixat ion s~lective.

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fixation sélective in vitro d'une forme modifiée du composant c3 du complément sur des...

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