fabian gross chef de projet biothérapies cic bt/dri chu de toulouse

Projets de thérapie cellulaire et génique : études précliniques et

conduite de l’essai cliniqueFabian GROSS

Chef de projet BiothérapiesCIC BT/DRI CHU de Toulouse

Laboratoire de recherche et promoteur

Approches in vitro et in vivo relevant de la pathologie visée

par le protocole clinique.

Développement du « médicament expérimental »

Laboratoire de recherche

Intérêt d’une cible ou d’une

approche expérimentale (in vitro et in

vivo)

Développement d’un médicament

Etudes Pré Cliniques : le contexte

• Etudes Pharmacologiques : activité du produit

• Etudes Pharmacocinétiques : devenir et intéractions du médicament dans l’organisme (homme ou animal)

• Etudes Toxicologiques : effets adverses d’un produit• Toxicité aigüe • Toxicologie chronique• Toxicologie de la fonction de reproduction• Etudes de mutagénèse• Etudes de cancérogénèse

Déterminent la valeur thérapeutique et les investigations chez l’homme (paramètres cliniques à surveiller)

Etudes Pré cliniques : Stratégie Adoptée

Principales lignes directives : International Conference of Harmonization Nature des études selon le stade de développement du produit : ICH M3 (CPMP/ICH/286/95) Produits biotechnologiques: ICH S6 (CPMP/ICH/302/95) Application: Thérapie anticancéreuse : ICH S9 (CPMP/SWP/997/96)

Préambule : - Produit ou Médicament identique ou comparable a celui de l’essai clinique

- Méthodes et techniques validées (in vitro et in vivo)

Dossier de Pharmacologie

Etudes pharmacologiques

PharmacodynamieDonnées in vivo et in vitro de l’activité du produit liée ou non a l’effet thérapeutique attendu

Pharmacologie de sécuritéEffets sur système respiratoire, nerveux et cardiovasculaire => voir études de toxicologie

Etudes pharmacocinétiques

Données sur l’absorption, le métabolisme, la distribution, la fixation des protéines plasmatiques, l’excrétion et le bilan de radioactivité

Si étude in vitro => matériel d’origine humaine

La toxicologie conditionne la première dose à administrer à l’homme

Seuil d’efficacité MABEL (Minimal Anticipated

Biological Effect Level )

Seuil de toléranceAucun effet : pharmacologique

(NOEL : No Effect Level)Secondaire (NOAEL : No Adverse

Effect Level)

Dose Maximale ToléréeMTD

Toxicologie Générale

Objectifs : Détermination de la 1ère dose injectée à l’homme (Phase 1) Identification des effets adverses et d’organes cibles (NOEL et NOAEL) Reversibilité des effets adverses Relation effets du produit et de ses métabolites Influence du sexe, de la dose, du temps d’exposition ou d’autres facteurs

Design : Groupes : Control (véhicule seul), faible dose (NOEL), forte dose (MTD)

et dose moyenne Animaux : 2 espèces (un non rongeur), ♂ et ♀ Durée : 24h à 2 ans Voie et régime administration : IV et voie clinique envisagée

Etudes BPL (directives 2004/10/CE et guidelines applicables EMEA Guideline EMEA/CHMP/410869/2006 du 31/07/2007)

Etude de Biodistribution et de Toxicité par administration unique

• Injection :• IV puis voie clinique, suivi pendant 2 à 5 semaines• Escalade de doses selon un processus séquentiel

• Suivi : • Observations cliniques sur les 1ères 24h puis 1 à 2 fois par

semaine• Analyses biologiques et biochimiques

• Sacrifice et Autopsie :• Examens anatomo-pathologiques d’une 12aine d’organes• Etude du potentiel immunotoxique• Dosage du médicament expérimental ou des cellules dans

les organes

Exemple du CYL-02

Injection IV du CYL-02 (1er lot pré-GMP) chez la souris de 250µg/kg à 7500µg/kg

Suivi : Observations cliniques et analyses bio et bioch (sang, urine)

Autopsie : Examens anatomo-pathologiques de 12 organes + tumeurDosage du transgène (organes, sang et urines)

Définition de la NOAEL à 1500µg/kg

Gro

up

e

-

+

+

+

++

+

++

++

Limite designificativité

Détection PTG sexe/organes/doses confondus

Gro

up

e

-

+

+

+

++

+

++

++


Gro

up

e

-

+

+

+

++

+

++

++

Gro

up

e

-

+

+

+

++

+

++

++


Détection PTG sexe/organes/doses confondus

18%

10%

2%

13%

12%7%7%

5%2%

12%0%

12%

poumon

rein

intestin

cœur

muscle

cerveau

péritoine

pancréas

rate

foie

vessie

gonades

Répartition de la positivité sexe/organes/doses confondus

Biodistribution : Poumon, foie, rein, muscle et gonades

Quantification des transgènes par qPCR

Pic de détection à 6h post injection

Toxicité et biodistribution par voie « clinique »

Conduit sur un 2ème modèle animal

OBJECTIFS

Calculer la première dose à administrer à l’homme suivant le mode d’administration prévu en clinique

METHODES Modèle animal pathologie ou du modèle d’étude si non disponible Injection du ME par la voie clinique, suivi des animaux sur les jours

suivant et 1 à 2 fois par semaines (biologie et biochimie). Traitement de l’animal par les traitements concomitants de l’étude Entre 2 et 5 semaines, sacrifice des animaux et prélèvement des organes

pour anapath et dosage du médicament expérimental

Toxicité intratumorale du CYL-02

J0 queue du

pancréas par mini-

laparotomie gauche

(allogreffe orthotopique)

J7Contrôle de

l’évolution de la tumeur par laparotomie

médiane exploratrice.Injection et

suivi des animaux.

J9, 11 et 13Injections intrapéritonéales de

Gemcitabine (80 mg/kg).

J15Sacrifice des animaux et prélèvement des organes.

4 groupes :Glucosé 5% (véhicule) avec ou sans traitement GemcitabineCYL-02 (900µg/kg) avec ou sans traitement Gemcitabine

Aucune létalité dans l’ensemble des groupes ayant reçu le CYL-02 seul ou associé à la gemcitabine.

Résultats de la biodistribution après injection intra tumorale

CYL-02+ NaCl

CYL-02 + Gemcitabine

Tumeur ++ +++

Rate +/- +

Foie ++ +++

Rein et intestins - +/-

Poumons, muscles et gonades

- -

Biodistribution : Présence du transgène dans la tumeur 8 jours après une injection intra-tumorale. « CYL-02 + gemcitabine », faible positivité au niveau rénale et intestinal alors que

positif au niveau splénique

Suivi pondéral : Aucune anomalie pondérale et clinique dans le groupe CYL-02, Amaigrissement significatif (15% en moyenne) avec la gemcitabine, Aucune différence significative entre « gemcitabine seule » versus « CYL-02 +

gemcitabine».

Examen anatomopathologique macroscopique :Aucune lésion pancréatique, péritonéale, ou hépatique

Témoins gemzar PTG PTG + gemzar

1 200

1 000

800

600

400

200

0

% de progression

- 50 ± 3 %

OBJECTIFSSimulation du protocole proposé chez l’homme Accumulation Sensibilisation Cerner la Pharmacologie de Sécurité Calculer la première dose à administrer à l’homme

Etude de Toxicité à dose répétée du Cyl-02

Calcul de la 1ère dose injectable à l’hommeHED (Dose équivalente chez l’Homme) = NOAEL (Animal)/ Facteur de sécurité/ fact clearance (Homme/Animal)

Soit : 900µg/Kg/60/7,4 = 2µg/kg

Poids moyen d’un patient ACP de 63kg => 125µg

Injection de 2.106 CSM dans l’organe considéré sur le modèle animal Nude de la pathologie visée par l’étude clinique sur des 10x♂ et 10x♀: vehicule seul (CTRL –) et CSM

Surveillance des signes cliniques des animaux (poids, sociabilité) 1 à 2 x / semaine

Sacrifice à 3 semaines (toxicité aigüe) et 12 semaines (toxicité chronique), observation macroscopique sur 8 organes (ganglions, foie, cerveau, reins, rate, peau, gonades et poumons) + organe injecté

Résultat : Evolution du poids, morbidité, mortalité et signes de toxicité, anatomopathologie

Recherche de cellules humaines par qPCR (ALU)

Exemple d’étude de biodistribution

Aucune altération des organesAucune cellule humaine à 3 et 12 semaines

GénotoxicitéOBJECTIFS :

Recherche de toute modification du matériel génétique induite par le ME

Recherche d’une potentialité mutagène

MODALITE :

Etudes normalisées in vitro et in vivo, comprenant :

1. Test de mutation génique in vitro sur bactéries (test de Ames)

2. Test d’aberrations chromosomiques in vitro sur cellules de mammifères

3. Optionnel : Test d’aberration chromosomique in vivo sur cellules hématopoïétiques de rongeur (test du micro noyau)

Thérapie Génique : Mutagénèse insertionnelle des vecteurs virauxThérapie Cellulaire : Tumorigénicité des cultures cellulaires

Injection intramusculaire ou sous cutanée chez la souris Nude (5 animaux/grpe) de 10.106 CSM : HT29 (CTRL+) ; véhicule seul (CTRL –) et CSM

Surveillance des signes cliniques des animaux (poids, sociabilité) 1 à 2 x / semaine

Mesure des nodules 1 a 2 fois par semaine pendant 12 semaines

Sacrifice à 90 J et observation macroscopique sur le site d’injection et 6 organes (en général : ganglions, foie, cerveau, reins, rate et poumons)

Si apparition de tumeurs, qPCR pour recherche de cellules humaines (ALU)

Résultats : Suivi des animaux, poids, anatomopathologie et volume des tumeurs

Exemple d’étude de tumorogénicité

Résorption au point d’injection en 3 à 6 jours Pas de développement de tumeur

Aucune altération des organes à 90J

Promoteur

Protocole clinique sur des volontaires (sains ou patients)

suivant des modalités d’inclusion et de suivi prédéfinies

Développement d’un médicament

Laboratoire de recherche et promoteur

Approches in vitro et in vivo relevant de la pathologie visée

par le protocole clinique.

Développement du « médicament expérimental »

Laboratoire de recherche

Intérêt d’une cible ou d’une

approche expérimentale (in vitro et in

vivo)

Documents spécifiques à la TG

• Annexe 2 : Principes applicables a l’évaluation du risque pour l’environnement.

• Annexe 3A : Informations devant figurer dans la notification concernant la dissémination des OGM autres que les plantes supérieurs.

• Formulaire de synthèse de la notification concernant la dissémination volontaire d’OGM dans l’environnement à d’autres fins que leur mise sur la marché.

• Fiche d’information destinée au Public : date limite de réponse de 30 jours après sa publication sur le site internet de l’ANSM

1. Demande de classement initial et d’agrément CERFA 1674*02Intégrer dans la demande l’utilisation pour essai clinique (addendum demande initiale)

2. Demande d’agrément des sites hospitaliers CERFA 12536*02 Confinement doit être en adéquation avec le classement de l’OGM. Une demande d’agrément d’utilisation confinée d’OGM par site (pharmacie, chambre

hospitalière, laboratoire, local d’administration…). numéro de dossier identique à celui du classement établit initialement par le HCB.

Ponction de MO

Circuit du médicament

Prélèvement de TA

• Sérologies patient (HIV 1&2, HTLV 1&2, HBC et HCV, Syphilis)

• Autorisation du lieu de prélèvement (bloc opératoire, anesthésie et praticien)

• Cahier navetteAutorisation de site

Ponction de MO


Congélation ou Mise en

culturePrélèvement de

TA

Autorisation de site

Société spécialisée et autorisée

• Transport avec respect des T° (ambiant, froid ou congelé) et des délais

• Règlementation transport matières vivantes (directive européenne 2004/23/CE)

Expansion cellulaire ou transfert de gène

Ponction de MO




TA

Cellules : SA



Autorisation de production

• Etablissement autorisé (établissement pharmaceutique ou non, classement pour OGM)

• Contrôles in process (stérilité)• Délivrance d’un certificat de conformité

Libération, congélation de la

SA


Ponction de MO



SA



TA

Cellules : SA

Mise en forme SA = PF




Préparation et dispensation

pharmaceutique

Préparation pharmaceutique, stockage, décongélation, mise en forme, dispensation +/- confinement (double ou triple emballage)

Retour et destruction des UT, pb de l’inactivation des OGM :

solides a autoclaver (20 mn à 121°C) liquides a neutraliser à la Javel (12h 2% final

extemporané)


Ponction de MO



SA



TA

Cellules : SA

Mise en forme SA = PF




Préparation de type pharmaceutiqueInjection au volontaire

Conclusions

Produit grade recherche : Preuve de concept et compréhension du mode d’action (Pharmacologie) Développement et validation des techniques : caractérisation, identité,

activité et fonctionnalité Test in vivo : validation du modèle animal, efficacité et effets secondaires

(pré toxicologie)

Produit grade Pré-GMP : Pharmacologie essentiellement in vitro sinon a intégrer aux études de

toxicologie in vivo Tumorogénicité des MTI de TC et TG ex vivo, mutagénèse insertionnelle

en TG Biodistribution des vecteurs et des cellules Toxicologie des vecteurs ou du transgène

Produit grade Clinique : Circuit du médicament : confinement, délivrance, stabilité courte Circuit du patient : prélèvement, injection, hospitalisation Suivi des patients : effets adverses, confinement, fluides biologiques,

destruction