Exploration des réponsesimmunitaires

ED L3Février 2015

Tissus

MicrobesBactéries, virusparasites, champignons

AgressionPlaie, effractionInflammation

Macrophage

Polynucléaire N

Lymphocytes T

NK

Immunité Innée Immunité adaptative

Périphérie Organes lymphoïdesGanglion

Monocyte

Lymphocyte B

Plasmocyte

CD4 CD8

Réponse immunitaire

Cellulaire

HumoraleCellule Dendritique

Phagocytose Migration

Complément

Immunité Innée/adaptative

Leucocytes

Polynucléaires neutrophilesPolynucléaires éosinophilesPolynucléaires basophiles

Lymphocytes

Monocytes

Hémogramme

4 000 - 10 000/mm3

1 700 - 7 00050 - 5000 – 50

1 500 - 4 000

100 - 1000

Immunitéinnée

Immunitéinnée

Immunitéadaptative

Leucocytes

Polynucléaires neutrophilesPolynucléaires éosinophilesPolynucléaires basophiles

Lymphocytes

Monocytes

4 000 - 10 000/mm3

1 700 - 7 00050 - 5000 – 50

1 500 - 4 000

100 - 1000

Barrière cutanéo-muqueuseSubstance bactéricide, pH

Phagocytes: PNN, monocyte

Cellules NK

Cellules dendritiques

Système du complément

Cytokines (interféron)

Immunité innée

NFS

Immunophénotypage

Exploration du complément

Immunité Innée: exploration du complément

Voie classique Voie alterne

Voie des lectines

Complexed’attaque

membranaire

Mesure fonctionnelle: CH50

Mesure protéine du complément:- C3- C4

Immunité Innée: exploration du complément

GR de mouton+ Ac anti GR de mouton+ Sérum du sujet

Voie classique

Activation du complexe terminal

GR de lapin+ Sérum du sujet

Voie Alterne

DO50%

Mesure fonctionnelle: CH50

Lyse du GRMesure de l’Hb libérée

Augmentation: processus inflammatoireDiminution: consommation, déficit

Cellule NK

CD2 CD16CD56

RécepteursInhibiteurs

Récepteursactivateurs+

<

Cellule NK

CMH I

NK activée

CMH II

CD25

CelluleTumorale

Ouinfectée

CMH I

Cellule modifiéetuée

Exploration numérique (cytométrie en flux à l’aide d’Ac spécifique des molécules distribuées sélectivement sur les NK).

Exploration fonctionnelle (cytolyse).

Immunité innée: cellules NK

Etude en cytométrie en flux: CD3- CD56+ (quantitative)

Immunité innée: cellules NK

Etude fonctionnelleMesure de la cytotoxicité par relargage de Cr radioactif

Marquer les cellules ciblesavec du Na251CrO4

Ajouter les cellules NK (ou T cytotoxiques) aux cellules cibles marquées

Les cellules tuées libèrentDu chrome radioactif

Radioactivité libérée proportionnelle au nombre de cellules détruites

Ontogenèse lymphocytes T et B

Immunité adaptative

Immunité adaptative

Lymphocyte Bproduction Ac

Lymphocyte Tproliférationcytotoxicité

• NFS

• Cytométrie en flux– Phénotypage lymphocytaire T et B– Marqueurs d’activation lymphocytaire– Marqueurs cellules naïves/cellules

mémoires

• Tests fonctionnels– Prolifération– Production de cytokines– Test de cytotoxicité– Production d’anticorps

Immunité adaptative: cytométrie en flux

Immunité adaptative: cytométrie en flux

• Lymphocytes T: CD3+: 50 - 80%900 – 3000/mm3

• Ly T4: CD3+ CD4+: 32 - 52%450 – 1500/mm3

• Ly T8: CD3+ CD8+: 20 – 40%300 – 1000/mm3

• Lymphocytes B: CD19+: 5 – 20%100 – 450/mm3

Isolement des lymphocytes

- gradient de densité- récupération d’un anneau cellulaire contenant lymphocytes et monocytes

Centrifugation sur unmilieu de séparation de densité Ficoll-Hypaque

Cellules mononuclées

GR, PNN

Exploration immunité humorale

• Cytométrie en flux: • nombre de LB• marqueur de différenciation

• LB naïfs: CD27-/ IgM+/ IgD+• LB mémoire avant commutation: CD27+/IgM+/IgD+• LB mémoire après commutation: CD27+/IgM-/IgD-

• Prolifération

• Etude production d’anticorps• EPP• Dosage des Ig

• Réponse vaccinale

In vitro

In vivo

Exploration immunité humorale in vitro

Dosage des gammaglobulines

Dosage des classes d’Ig:- IgG 6.6-12.8- IgA 0.7-3.4- IgM 0.5-2.1

Dosage des sous-classes d’Ig:- IgG1 3-12.8- IgG2 0.4-6.3- IgG3 0.12-1.14- IgG4

Exploration immunité humorale in vivo

Réponse vaccinale: Sérologies pré et post vaccinales

• Diphtérie• Tétanos• Pneumocoque• Haemophilus

Immunité adaptative: cellulaire

• Cytométrie en flux: • phénotypage lymphocytaire T: CD3, CD4, CD8• marqueurs d’activation lymphocytaire: HLA-DR• marqueur de différenciation

• LT naïfs: CD45RA+/CD62L+• LT central mémoire: CD45RA- ou RO+/CD62L+• LT effecteur mémoire: CD45RA- ou RO+/CD62L-• LT revertant: CD45RA+ ou RO-/CD62L-

• Prolifération

• Production de cytokine• Elisa• Elispot

• Test de cytotoxicité

•Test d’hypersensibilité retardée

In vitro

In vivo

Exploration immunité cellulaire: prolifération

• Activateurs non spécifiques: mitogènes polyclonaux

• phytohémagglutinine ou PHA: lymphocytes T• Concanavaline ou ConA: lymphocytes T• pokeweed mitogen ou PWM: lymphocytes T (et B)

Induisent la mitose de beaucoup de Ly de spécificité différente= prolifération polyclonale

• Activateurs spécifiques

• Antigène de vaccination: tuberculine, anatoxine tétanique• Antigène de l’environnement: streptocoque, CMV

Exploration immunité cellulaire: prolifération

Mesure de la prolifération par incorporation de thymidine tritiée 3TH (radioactive)

Expression en cpm et en index de stimulation (cpm test/cpm control négatif)par rapport à sujets sains témoins

Exploration immunité cellulaire: prolifération

CFSE: marqueur fluorescent, rentre dans le cytoplasmeA chaque division cellulaire, la fluorescence diminue de moitié dans chaque cellule fille

Mesure de la prolifération en cytométrie en flux après marquage au CFSE

Immunité Innée

Orientation de la réponse immunitaire

Cytokines: orientation de la réponse immunitairecellulaire

T CD4Naïf

GATA-3STAT-6

T-betSTAT-4

RORgTSTAT-3

FoxP3

IFNγ

IL4

IL17

TGFβ1

Cellulaire(pathogènes à xIntracellulaire

Humorale(pathogènes à xExtracellulaire

Neutrophile(pathogènes à xExtracellulaire

Régulation Négative

TH1

TH2

TH17

Treg

IL12

IL4

TGFβ1

TGFβ1IL6

Thymocyte

Polarisation de la réponse T

Cytokines: orientation de la réponse immunitairecellulaire

Activation des cellules en culturenon spécifique / spécifique

Récolte du surnageant de culture après 24 à 48 h

- Dosage Immunoenzymatique- Dosage Cytométrie en flux

Quantification des cellulesCD4+/CD8+ productrices- Cytométrie en flux- ELISPOT

Mesure production de cytokines par cellules immunitaires

Exploration immunité cellulaire

Exploration immunité cellulaire

Production de cytokines

Activation de cellules en culture (non spécifique ou spécifique)

Récolte du surnageant de culture après 24-48h

Dosage ELISA ou en CMF

Exploration immunité cellulaire

Production de cytokine: ELISPOT

YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y

IFNγ

Peptidesou antigène

YY Y Y Y Y Y Y Y Y Y

Y Y

PAL PAL

substratjaune

violet

Quantification des cellules T productrices d’IFNγ après stimulation- par des peptides de 9 aa ⌦ réponse des LT CD8+ spécifiques- par des Ag ou des peptides de 20 aa ⌦ réponse des LT CD4+ spécifiques

Exemple du Quantiféron

Exploration immunité cellulaire

Hypersensibilité retardéeExemple du test à la tuberculine

Injection intra-dermique de tuberculine (extrait de Mycobactérium tuberculosis)

Immunité à médiation cellulaire

Réponse locale (papule rouge indurée) à lire 72h après:5mm: réaction positive: contact antérieurphlycténulaire ou nécrotique: suspicion d’infection

Histologie: lymphocytes T et nombreux monocytes/macrophages

Immunité adaptative: cellulaire

Hypersensibilité retardéeExemple du test à la tuberculine

Traduction histologique: granulomeprésence de lymphocytes T et de nombreux monocytes/macrophages

Exploration des réponses�immunitairesDiapositive numéro 2Diapositive numéro 3Diapositive numéro 4Diapositive numéro 5Diapositive numéro 6Diapositive numéro 7Diapositive numéro 8Diapositive numéro 9Diapositive numéro 10Diapositive numéro 11Diapositive numéro 12Diapositive numéro 13Diapositive numéro 14Diapositive numéro 15Diapositive numéro 16Diapositive numéro 17Diapositive numéro 18Diapositive numéro 19Diapositive numéro 20Diapositive numéro 21Diapositive numéro 22Diapositive numéro 23Diapositive numéro 24Diapositive numéro 25Diapositive numéro 26Diapositive numéro 27Diapositive numéro 28Diapositive numéro 29Diapositive numéro 30