etudes physico-chimique de capteurs à base de...
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N°d‟ordre : 2009-ISAL- 0052 Année 2009
Thèse
Etudes physico-chimique de capteurs à base de
nanomatériaux pour des applications biomédicales
Pour obtenir
Le grade de docteur
Discipline : Electronique, Electrotechnique et Automatique
Spécialité : nanomatériau
Par
Hafaid Imen
Soutenue le 26 juin 2009 devant la Commission d‟examen
Jury
Examinateur : M. Dédier LEONARD, Professeur, LSA, Université Claude Bernard
Lyon .
M. Adnane ABDELGHANI, MC, HDR, INSAT, Tunisie.
.
Rapporteurs: Mme Hafsa KORRI-YOUSSOUFI, Directeur de recherche CNRS, Université
Paris-Sud.
M. Francis VOCANSON, Professeur, Laboratoire Hubert Curien Saint-Etienne.
Directeurs de thèse : Mme Zina SASSI, MC, HDR, AMPERE, INSA de Lyon.
Mme Nicole JAFFREZIC-RENAULT, Directeur de recherche CNRS,
LSA, Université Claude Bernard Lyon.
J’offre ce travail en témoignage de l’amour, de l’amitié et de
la reconnaissance que je porte à :
Mes parents : Mhamed et Henda
Mon mari Chaker
Mes sœurs : Sana et Safa
es frères : Brahim et Ahmed
A tous ceux qui me sont chers…
Remerciements
Ce travail a été effectué au sein du Laboratoire des Sciences Analytiques (LSA) à l‟Université Claude
Bernard Lyon 1 dirigé par Monsieur le Professeur Dédier LEONARD, qui me fait l'honneur de présider cette
commission d'examen. Je l'en remercie sincèrement.
Je tiens à remercier en premier lieu, Madame Zina Sassi, directrice de thèse, pour son écoute, pour ses
conseils fructueux et ses remarques pertinentes, pour sa gentillesse, sa générosité et son soutien perpétuel.
Que Madame Nicole JAFFREZIC-RENAULT, Directeur de Recherche CNRS au LSA, de m‟avoir
accueilli au sein de son équipe de recherche. Je tiens à la remercier très sincèrement pour son aide constante
durant ces années de travail. Je remercie aussi de l‟opportunité et la confiance qui m‟a été donnée de travailler
sur un projet européen, DVT-IMP. Merci encore.
Je remercie tous particulièrement Monsieur Francis VOCANSON, professeur au Laboratoire Hubert
Curien de Saint Etienne, ainsi que, Madame Hafsa KORRI-YOUSSOUFI, Directeur de recherche CNRS à
l'Université Paris-Sud, de l‟Equipe de Chimie Bioorganique et Bioinorganique, qui ont accepté de juger ce
travail et d'en être les rapporteurs.
Je veux adresser tous mes remerciements à Monsieur Adnane ABDELGHANI Maître de conférence en
capteur et instrumentation à l‟INSAT, pour sa participation à cette commission d'examen.
Mes remerciements vont également à tous les membres de l‟équipe du projet DVT-IMP.
Je remercie également tout les membres du laboratoire LSA.
Pour mes chers parents, qui m‟ont toujours soutenue, toujours encouragée à aller plus loin, qui ont
toujours cru en moi, aucun mot n‟exprime l‟immense reconnaissance qui m‟anime.
A mes chères sœurs, chers frères un grand merci pour leur bonne humeur et leurs signes
d‟encouragement.
Je souhaite enfin remercier mon cher mari, pour sa patience durant toute la période de ma thèse.
Sommaire
Introduction Générale .......................................................................................................................................... 1
Etat de l’art sur les biocapteurs ........................................................................................................................... 5
Chapitre I .............................................................................................................................................................. 5
I. Introduction ................................................................................................................................................ 6
II. Généralités sur les capteurs........................................................................................................................ 6
II.1. Définition ............................................................................................................................................ 6
II.2. Structure d’un capteur ........................................................................................................................ 7
II.3. Différents types d’un capteur ............................................................................................................. 8
II.4. Caractéristiques métrologiques d’un capteur .................................................................................... 9
III. Les biocapteurs ..................................................................................................................................... 13
III.1. Historique.......................................................................................................................................... 13
III.2. Définition .......................................................................................................................................... 13
III.3. Description du biocapteur ................................................................................................................ 14
IV. Techniques d’immobilisations des biomolécules ................................................................................. 35
IV.1. Introduction ...................................................................................................................................... 35
IV.2. Greffage covalent .............................................................................................................................. 37
V. La nanotechnologie et les biocapteurs ..................................................................................................... 37
VI. Conclusion ............................................................................................................................................. 44
Principes Physiques ............................................................................................................................................ 50
I. Introduction ............................................................................................................................................... 51
II. Techniques expérimentales ....................................................................................................................... 51
II.1. Techniques électrochimiques ................................................................................................................ 51
II.1.1.1. Principe de la spectroscopie d’impédance ................................................................................... 52
II.1.1.2. Théorie du calcul de l’impédance ................................................................................................. 53
Sommaire
5
II.1.1.3. Impédance de différents phénomènes électrochimiques ............................................................ 57
II.1.1.4. Etude de l’impédance pour un système électrochimique ............................................................ 60
II.2. Techniques optiques .............................................................................................................................. 66
II.2.1. Résonance plasmonique de surface (SPR) ......................................................................................... 66
II.3. Technique d’analyse de surface ............................................................................................................. 72
II.3.1. Spectroscopie Infrarouge FTIR ........................................................................................................... 72
II.3.2. Microscopie à Force Atomique (AFM) ............................................................................................... 75
III. Physique des polymères conducteur ..................................................................................................... 78
IV. Auto assemblage moléculaire ................................................................................................................ 86
V. Conclusion .................................................................................................................................................. 91
Matériels & Méthodes ....................................................................................................................................... 95
Résultats & discussion ...................................................................................................................................... 110
Partie A. Conditions électriques de fonctionnement optimales pour un immunocapteur impédimètrique
basé sur un polymère conducteur modifié: le polypyrrole ............................................................................. 112
I. Introduction ............................................................................................................................................ 112
II. Caractérisation du film copolymère ....................................................................................................... 112
III. Caractérisation du biofilm .................................................................................................................. 117
IV. Réponse de l’immunocapteur à différents potentiels ........................................................................ 126
V. Conclusion ............................................................................................................................................... 132
Partie B. Mise au point d’un immunocapteur impédimètrique à base de polymère conducteur : détection
d’antigène dans le plasma humain et dans le sang pour le diagnostique de la thrombose veineuse profonde
(DVT). 134
Partie C. Mise en application d’un immunocapteur impédimètrique à base d’un co-polymère conducteur:
détection du D-dimer dans des prélèvements de plasma sanguin de patients atteints de la DVT sur des
microélectrodes d’or........................................................................................................................................ 150
Partie D. Nouveau concept d’Immunocapteur Impédimètrique à base de nanoparticules d’or
fonctionnalisées. .............................................................................................................................................. 168
Conclusion Générale ........................................................................................................................................ 190
Sommaire
6
Introduction Générale
Introduction générale
2
La détection des antigènes est d‟une importance fondamentale pour le diagnostic médical. Les
immuno-essais classiques sont sélectifs et sensibles mais nécessitent plusieurs étapes successives et se
font grâce à des marqueurs enzymatiques. Ils sont donc inadaptés à la demande croissante du
diagnostic médical. On développe actuellement des capteurs immunologiques basé sur l‟interaction et
la reconnaissance d‟un anticorps et d‟un antigène. Lorsque l'anticorps se fixe sur l'antigène, ou
inversement, il se produit des variations de charge électrique, de masse et des propriétés optiques, que
l'on peut détecter directement par les divers transducteurs utilisés.
Le développement récent de la nanotechnologie a ouvert des nouvelles frontières
fondamentales appliquées à la science des matériaux et la technologie. En effet, à l‟échelle
nanométrique, les propriétés des électrons à l'intérieur du matériau ainsi que les interactions atomiques
sont influencées par la taille du matériau. Par conséquence, le changement de la taille amène au
changement des propriétés spécifiques (magnétique, optique, électronique…) sans changement de la
composition. En raison du rapport élevé surface-volume lié à l‟échelle nanométrique dans les
matériaux, une amélioration énorme au niveau des propriétés chimiques est également réalisable par
une réduction de taille. Alors, en créant des nanostructures, il est possible de contrôler les propriétés
fondamentales des matériaux à travers l‟effet de la surface et de la taille.
Dans le domaine des biocapteurs, des nouveaux nanomatériaux, apparaissent, tels que les
polymères conducteurs, les nanoparticules comme outils très prometteurs pour l‟amélioration des
performances du biocapteur. Les polymères conducteurs sont considérés comme des matériaux
efficaces pour l‟immobilisation des biomolécules et la transduction/amplification du signal électrique
au sein de l‟immunocapteur. Les nanoparticules en métal ou semi- conducteur, de dimensions
comparables aux dimensions des biomolécules (par exemple : enzymes, antigènes/anticorps ou ADN),
permettent d‟augmenter la surface de contact avec le milieu environnant ainsi que la densité de
greffage des biomolécules et de maintenir la stabilité et l‟activité de la biomolécule. En terme
d‟amélioration des performances des biocapteurs, grâce au comportement quasi moléculaire en raison
de leur petite taille, les nanoparticules fonctionnalisées permettent d‟augmenter la sensibilité et
d‟abaisser le seuil de détection.
Introduction générale
3
Dans cette perspective, cette thèse est consacrée au développement de deux immunocapteurs
impédimétriques à base de nanomatériaux. Dans le cadre du projet européen DVT-IMP, le premier
immunocapteur basé sur un polymère conducteur modifié a été développé et mis en application pour le
diagnostic de la thrombose veineuse profonde (DVT). En effet le co-polypyrrole est utilisé en tant que
matériau pour l‟immobilisation des anticorps permettant une bonne orientation par l‟intermédiaire de
l‟agent NTA coordonné avec un métal (le cuivre Cu2+
). Dans le cadre de la coopération avec le
Laboratoire Hubert Curien de l‟université de Saint-Etienne, des nanoparticules d‟or nanometrique ont
été synthétisées et fonctionnalisées successivement par un thiol-disulfure et un agent d‟activation tel
que l‟EDC et le PFP, permettent de fixer l‟anticorps biotinylé anti-E.Coli sur la surface du substrat par
l‟intermédiaire de la neutravidine, pour la détection de la bactérie pathogénique E.Coli.
Le premier chapitre présente des généralités sur les capteurs et particulièrement sur les
biocapteurs. Dans ce chapitre, nous présentons les principes de fonctionnement et les applications de
quelques biocapteurs. Ensuite, nous décrivons des matériaux utilisés récemment pour le
développement des biocapteurs dans le domaine de la nanotechnologie tout en précisant leur intérêt
pour l‟amélioration de tels dispositifs.
Le deuxième chapitre contient, d‟une part, la présentation du principe physique des différentes
techniques expérimentales utilisées pour le développement des différents biocapteurs étudiés dans le
cadre de cette thèse : les techniques électrochimiques tels que la spectroscopie d‟impédance (EIS), la
voltammétrie cyclique et la chronoampérométrie, ainsi que la technique optique, la résonance
plasmonique de surface (SPR) de manière à souligner leur intérêt dans le développement des
biocapteurs. Nous présentons également les techniques d‟analyse chimique et de topographie de
surface utilisées telles que la spectroscopie infrarouge à transformée de Fourier (FTIR) et la
microscopie à force atomique (AFM) afin de permettre l‟obtention d‟informations souvent
complémentaires nécessaires pour l‟interprétation des résultats obtenus par les techniques de
caractérisation électrochimique et optique. D‟autre part, nous décrivons la physique des polymères
conducteurs et l‟autoassemblage moléculaire.
Le troisième chapitre est consacré, dans une première partie, à présenter l‟ensemble des
dispositifs expérimentaux permettant l‟étude et la caractérisation des différents biocapteurs développés
au cours cette thèse. Dans une deuxième partie, nous présentons les protocoles de fabrication de
l‟élément sensible (biorécepteur) ainsi que leur mise en œuvre pour le développement des biocapteurs.
Introduction générale
4
Le quatrième chapitre présente quatre parties : la première partie est consacrée à l‟étude des conditions
électriques de fonctionnement optimales pour le développement d‟un immunocapteur impédimètrique
basé sur un polymère conducteur modifié, le pyrrole. Puis, en se basant sur les conditions optimisées
de cet immunocapteur, la détection d‟un antigène modèle dans le plasma humain et dans le sang d‟un
rat sont présentées dans la deuxième partie. L‟amélioration et la mise au point de l‟immunocapteur,
l‟utilisation de microélectrodes pour la détection d‟antigène D-dimer marqueur de la thrombose
veineuse profonde (DVT) ainsi que l‟utilisation des prélèvements de patients atteints de cette maladie
pour mettre en œuvre la détection sont présentés puis discutés dans la troisième partie. La quatrième
partie présente l‟étude et le développement d‟un immunocapteur impédimètrique à base des
nanoparticules d‟or fonctionnalisées.
En conclusion, après avoir discuté les résultats, nous tenterons de préciser l‟utilité des
nouveaux nanomatériaux, tels que les polymères conducteurs et les nanoparticules, comme outils très
prometteurs pour l‟amélioration des performances des biocapteurs.
Etat de l’art sur les biocapteurs
Chapitre I
Etat de l’art
Chapitre I
6
I. Introduction
Les recherches sur les biocapteurs contribuent à la révolution des soins dans le domaine de la
santé. Ils améliorent l‟efficacité et diminuent les coûts des diagnostics et des traitements médicaux.
Différentes stratégies ont été suivies pour le développement de ces biocapteurs afin d‟obtenir un
dispositif fiable et performant spécifique à la cible. Dans ce contexte, ce chapitre est une synthèse des
nombreuses informations sur les biocapteurs que l‟on peut trouver dans la littérature. Il aura pour but
de présenter le contexte et les enjeux des biocapteurs afin de positionner le travail qui a été réalisé au
cours de cette thèse.
Dans un premier temps, des généralités sur le capteur seront présentées. Dans un second temps,
nous présenterons les principes de fonctionnement et les applications de quelques biocapteurs qui sont
étudiés. Enfin, nous achèverons avec une description des matériaux utilisés récemment pour le
développement des biocapteurs dans le domaine de la nanotechnologie tout en précisant leur intérêt
pour l‟amélioration de tels dispositifs.
II. Généralités sur les capteurs
II.1. Définition
Par définition, un capteur est un dispositif électronique capable de transformer une grandeur
physique, chimique, biologique… (mesurande) en une grandeur électrique, généralement une
tension ou un courant (la figure I.1 présente le principe d‟un capteur) [1].
Figure I.1: Principe d’un capteur.
Etat de l’art
Chapitre I
7
II.2. Structure d’un capteur
Les différentes parties constitutives d‟un capteur sont décrites ci-dessous (figure I.2) :
Figure I.2: Structure d’un capteur.
II.2.1. Le corps d’épreuve
Le corps d‟épreuve est un élément sensible qui réagit à la grandeur à mesurer. Il a pour rôle de
transformer la grandeur à mesurer en une autre grandeur physique dite mesurable.
II.2.2. Transducteur
Le transducteur est un élément sensible lié au corps d‟épreuve. Il traduit les réactions du corps
d‟épreuve en une grandeur électrique constituant le signal de sortie.
II.2.3. Le boîtier
Le boîtier est un élément mécanique de protection, de maintien et de fixation du capteur.
II.2.4. L’électronique de conditionnement
C‟est un dispositif qui convertit le signal de sortie du capteur en un signal de mesure standard. Il
fait le lien entre le capteur et le système de contrôle commande. Il a pour rôle d‟amplifier et de faire le
traitement du signal électrique.
Etat de l’art
Chapitre I
8
II.3. Différents types d’un capteur
Suivant l‟origine du signal électrique de sortie, on peut classer les capteurs en deux types :
II.3.1. Capteurs actifs
Ce type de capteurs fonctionne en générateur, dont une partie de l‟énergie physique prélevée
sur la mesurande est transformée directement en énergie électrique qui constitue le signal de sortie
(tension ou courant). Les principes physiques mis en jeu sont présentés ci-dessous (tableau I.1).
Grandeur Physique à mesurer Effet utilisé Grandeur de sortie
Température thermoélectricité Tension
Température pyroélectricité Charge
Flux de rayonnement optique Photoémission courant
Flux de rayonnement optique Effet photovoltaïque Tension
Flux de rayonnement optique Effet photoélectrique Tension
Force ou pression Piézoélectricité Charge
Accélération ou vitesse Induction électromagnétique Tension
Position (aimant) ou courant Effet Hall Tension
Tableau I.1 : Exemples de capteurs actifs.
II.3.2. Capteurs passifs
Ils sont constitués d‟un matériau spécifique dont l‟impédance (résistance, capacité ou
inductance) est sensible au mesurande. Le tableau I.2 résume, en fonction du mesurande, les
matériaux et les effets utilisés pour réaliser la mesure.
Etat de l’art
Chapitre I
9
Grandeur Physique à
mesurer
Caractéristique sensible Matériaux utilisé
Température résistivité Métaux : platine, Nickel, cuivre…
Très basse température Constante diélectrique Verre
Flux de rayonnement optique résistivité Semi-conducteur
Déformation résistivité Alliage de Nickel, silicium dopé
Déformation Perméabilité magnétique Alliage ferromagnétique
Position résistivité Matériaux magnéto résistant
Humidité résistivité Chlorure de lithium
Tableau I.2 : Exemples de capteurs passifs.
II.4. Caractéristiques métrologiques d’un capteur
Les caractéristiques métrologiques d‟un capteur constituent les liens effectifs entre le
capteur et la grandeur qu‟il mesure.
II.4.1. Etalonnage
L‟étalonnage permet d‟ajuster et de déterminer, sous forme graphique, la relation entre le
mesurande et la grandeur électrique de sortie (figure I.3). Très souvent l‟étalonnage n‟est valable
que pour une seule situation d‟utilisation du capteur.
Etat de l’art
Chapitre I
10
Figure I.3 : Courbe d’étalonnage d’un capteur.
II.4.2. Étendue de mesure
L'étendue de mesure est définie sur la courbe d'étalonnage du capteur (figure I.3). A l'extérieur
de cette zone se trouvent deux valeurs particulières: le seuil et la saturation.
Le phénomène de saturation est fréquemment rencontré en physique. Même si la valeur du
mesurande augmente, la grandeur de sortie ne peut dépasser une valeur maximale Smax : pour m>mmax,
S=Smax. On ne peut donc pas effectuer de mesurage pour des valeurs au dessus de mmax.
Le seuil ou limite de détection correspond à la valeur minimale du mesurande nécessaire pour
obtenir une grandeur de sortie non nulle : pour m=m0, S correspond au bruit de fond de la mesure.
S=LOD=3.3* SD / s Eq.I. 1
Avec SD : l‟écart type de la réponse.
s : la pente.
En résumé, on ne peut mesurer que des mesurandes compris entre m0 et mmax.
Etat de l’art
Chapitre I
11
II.4.3. Domaine de linéarité
Dans ce domaine de linéarité, la variation de la grandeur de sortie est proportionnelle à la
variation du mesurande.
II.4.4. Sensibilité
La sensibilité (s) est une caractéristique importante pour l‟exploitation et l‟interprétation des
mesures. Elle est définie comme étant la variation du signal de sortie (S) par rapport à la variation du
mesurande (m) (pente de la portion linéaire de la courbe d‟étalonnage) et s‟écrit :
Eq.I. 2
II.4.5. Temps de réponse
La rapidité est caractérisée par le temps que met le capteur à réagir à une variation brusque du
mesurande. Cependant la valeur finale étant le plus souvent atteinte de manière asymptotique, elle
correspond au temps nécessaire pour que le capteur délivre une certaine portion α de la pleine
amplitude du signal. Le temps de réponse noté tα est tel que α vaut généralement 90%.
La connaissance du temps de réponse d'un capteur est un élément essentiel lors de la réalisation
de mesures.
II.4.6. Résolution - Précision
C'est la plus petite variation de mesurande que peut détecter le capteur.
II.4.7. Reproductibilité ou répétabilité
Ce paramètre est probablement le plus important, tant pour les capteurs physiques que
chimiques. C'est l'aptitude d'un capteur à donner, dans des conditions définies, des réponses très
voisines lors de la mesure répétée d‟une même valeur du mesurande. Pour une fabrication de capteurs,
on définit la reproductibilité d‟un capteur à l‟autre.
Toute mesure sera entachée d'une erreur qu'il est important de connaître.
Etat de l’art
Chapitre I
12
- L'erreur systématique. Elle est toujours dans le même sens et de la même amplitude. On peut la
détecter en effectuant des mesures avec un autre appareillage.
- L'erreur accidentelle possède une amplitude et un sens aléatoires. Ses causes peuvent être variées.
Les outils mathématiques qui permettent de déterminer l‟erreur sont :
la valeur moyenne de n mesures est :
Eq.I. 3
L'amplitude de la dispersion est donnée par l'écart type :
Loi de Gauss : La probabilité d'obtenir comme résultat d'une mesure une valeur comprise entre
m1 et m2 est :
Eq.I. 4
Où p(m) est la densité de probabilité
Eq.I. 5
II.3.3. Sélectivité
Un capteur est dit sélectif, si la variation du signal de sortie est due uniquement à la seule
grandeur (physique, chimique, biologique…) qu‟on veut mesurer.
II.3.4. Grandeurs d’influence
Les grandeurs d'influence sont les paramètres qui influent sur le signal de sortie du capteur. On
retrouve les grandeurs de type mécanique (variations de pression, les forces qui provoquent des
n
m
m
n
i
i
1
1
)(1
2
n
mmn
i
i
2
1
)()( 21
m
mdmmpmmp
22
)(exp
2
1)(
2
mmmp i
Etat de l’art
Chapitre I
13
déformations...) ou thermique (variation de température qui engendre la dilatation des corps et la
modification des propriétés électriques tels que le changement de conductibilité et de caractéristiques
diélectriques) mais aussi des grandeurs électriques (paramètres électriques, tels que courant, tension,
fréquence, des circuits d'alimentation du capteur).
Dans le cas des capteurs chimiques et des biocapteurs, la présence d‟espèces différentes de
l‟espèce cible peuvent influer su le signal de sortie du capteur.
III. Les biocapteurs
III.1. Historique
Vers 1950, Leland Clark a commencé le développement du premier capteur pour la mesure de la
concentration d‟oxygène dissout dans le sang. Sa collaboration avec Lyon en 1962, a permit la mise au
point de ce biocapteur associant une membrane enzymatique renfermant la glucose oxydase et une
électrode à oxygène en vue de l‟adapter à la mesure de la concentration en glucose dans le sang [2].
Cinq années plus tard, Updike et Hickson ont élaboré une électrode enzymatique permettant de doser
le glucose dans des solutions biologiques [3]. A la fin des années 70 (1969), George Guilbault a crée
un dispositif pour doser l'urée dans le sang et l'urine [4,5].
Depuis ces premières ébauches, les biocapteurs ne cessent de susciter l‟intérêt des chercheurs
et deviennent de plus en plus employés dans des domaines très variés. Citons par exemple l‟industrie
agroalimentaire, pharmaceutique ou pétrochimique, ou bien encore le domaine biomédical,
l‟environnement, l‟agriculture.
III.2. Définition
Un biocapteur est un outil ou système analytique conçu pour transformer une réponse biologique
en un signal électrique [6]. Ce dispositif est basé sur l'accouplement spatial direct d'un composé
biologiquement actif immobilisé, appelé "biorécepteur" ou "élément de reconnaissance biologique",
avec un transducteur qui agit en tant que détecteur et un amplificateur électronique [7]. Le biocapteur
emploie les systèmes biologiques à différents niveaux d'intégration pour identifier spécifiquement la
substance à déterminer. La première étape de cette interaction est la formation d‟un complexe
spécifique de la substance active immobilisée avec l'analyte.
La figure I.4 représente le principe de fonctionnement d‟un biocapteur permettant d‟obtenir, à
partir de l‟espèce à détecter dans l‟échantillon, toute information utile à son évaluation.
Etat de l’art
Chapitre I
14
Figure I.4 : Schéma de principe d’un biocapteur.
III.3. Description du biocapteur
III.3.1. Les transducteurs
Le transducteur représente l‟élément physique du biocapteur. Il sert à exploiter la modification
biochimique issue d‟une interaction entre un analyte et le biorécepteur pour la transformer en signal
électrique. Suivant le type de modification biochimique, on choisira le type de transducteur approprié
pour exploiter au mieux l‟effet créé par le biorécepteur en presence de l‟espèce cible et obtenir un
signal sensible, facilement exploitable et avec un minimum de bruit de fond. Un faible bruit de fond
au niveau du transducteur assurera un seuil de détection plus bas et améliorera les performances du
biocapteur [8].
Différents systèmes de transduction, basés sur des principes différents, sont généralement utilisés
afin de convertir la reconnaissance moléculaire en un signal électrique exploitable. D'une part, des
transducteurs non spécifiques et applicables peuvent être employés, indiquant des paramètres généraux
tels que l'enthalpie de réaction (thermistance), le changement de la masse (cristal piézoélectrique), ou
l‟épaisseur de couche (réflectométrie). D' autre part, une indication spécifique peut être réalisée avec
les électrodes potentiomètriques ou ampérométriques pour des espèces comme H+, OH
-, NH3, CO2 ou
H2O2.
Etat de l’art
Chapitre I
15
III.3.1.1. Transducteur optique
Une large variété de méthodes optiques a été utilisée en tant que système de détection des
biocapteurs. Ces transducteurs sont basés sur certains phénomènes : l'effet des molécules biologiques
sur l'absorption de la lumière, la fluorescence, la variation de l‟indice de réfraction, ou d'autres
paramètres optiques. Ces transducteurs sont devenus de plus en plus populaires au cours de ces
dernières années avec beaucoup de dispositifs commercialement disponibles. Un des principaux
avantages des transducteurs optiques est leur capacité à sonder des surfaces et des films de façon non
destructive. Ils possèdent une bonne sensibilité, une robustesse et des faibles temps de réponse, de plus
ils permettent des mesures in situ et en temps réel. Une autre particularité est leur possibilité de
miniaturisation et leur capacité de détection simultanée de plusieurs analytes. Parmi les techniques de
transduction optique on distingue l‟ellipsométrie, la résonance plasmonique de surface, les guides
d‟ondes optiques, la fluorescence, le radiomarquage et les ondes évanescentes. Dans ce qui suit,
quelques méthodes de transduction optique sont présentées.
a. Capteur à fibre optique
Une fibre optique est un guide d‟onde classiquement constitué d‟un cœur en silice d‟indice
optique n1, entourée d‟une gaine d‟indice légèrement inférieur n2, le milieu ambiant ayant un indice
n0. Les conditions de guidage de la lumière sont définies par :
Eq.I. 6
Où ϴ0 est l‟ouverture numérique de la fibre ou l‟angle d‟injection limite du rayon incident.
A l‟interface cœur-gaine, une faible partie de la puissance lumineuse est perdue dans la gaine,
c‟est l‟onde évanescente. La puissance perdue dépend en particulier de l‟indice de la gaine. Donc
n‟importe quel changement effectué soit sur la surface ou au bout de la fibre provoque un changement
au niveau de l‟intensité de la lumière mesurée par un détecteur photoélectrique.
En se basant sur ce principe, les biocapteurs à fibres optiques sont présentés en deux types (Figure
I.5) :
Les capteurs extrinsèques le matériau spécifique se trouve en bout de fibre, c‟est en général
une substance dont l‟absorption est modifiée en présence de l‟espèce à détecter ou qui présente
des propriétés de fluorescence qui sont modifiées en présence de l‟espèce à détecter. Une fibre
Etat de l’art
Chapitre I
16
conduit la lumière excitatrice, une seconde fibre transporte le signal émis par le matériau
spécifique jusqu'à un détecteur [9].
Les capteurs intrinsèques mettent en jeu les caractéristiques propres de la fibre et en
particulier la modulation du champ évanescent à l‟interface cœur/gaine en présence de l‟espèce
à détecter. Ce sont, par exemples, des capteurs interférométriques qui exploitent les
changements de phase de la lumière transmise. Dans le cas d‟un biocapteur, une partie de la
fibre dénudée constitue l‟élément sensible du biocapteur. La surface de cette partie est
fonctionnalisée par des molécules spécifiques d‟intérêt. Lorsque la fibre est polarisée par une
source de lumière, la couche sensible causera un changement d'indice de réfraction en présence
de l‟espèce à détecter, d‟où la variation de l‟intensité de la lumière mesurée. Ce type de capteur
peut être utilisé aussi détecter les variations de pression, de température ou de champ
magnétique, mais aussi la composition d‟une atmosphère gazeuse [10
,1112
].
(A)
(B)
Figure 5 : Principe des capteurs à fibre optique, (A) : capteur extrinsèque, (B) capteur intrinsèque.
Etat de l’art
Chapitre I
17
Les biocapteurs à fibre optique offrent de nombreux avantages; ils ne sont pas influencés par le
champ électrique, ils sont utilisables pour les mesures en continu, et ils maintiennent les propriétés
chimiques des échantillons pendant la mesure, ils ne demandent ni signal de référence ni armature
électrique. De plus, leur sensibilité est facilement adaptable à la gamme de mesure désirée. Mais ils
sont perturbés par la lumière naturelle, ils sont alors normalement mis en œuvre à l‟obscurité.
b. Interféromètre Mach- Zender
Ce type de capteur repose sur le principe de changement de l'indice de réfraction. Quand une
lumière se propage dans un guide d'onde optique par l'intermédiaire de la réflexion interne totale, un
champ évanescent s'établit à l'interface cœur/gaine et se prolonge jusqu‟au bout du guide. Si la surface
du guide d'onde est fonctionnalisée par des molécules spécifiques d‟intérêt, la couche sensible causera
un changement d'indice de réfraction et la vitesse de phase du mode guidé diminue. Dans une
configuration typique de l‟interféromètre Mach-Zehnder, la lumière de guidage est divisé en deux
branches par l'intermédiaire d‟une jonction Y. Une branche fonctionnalisée, est utilisée comme bras
sensible, alors que l'autre est une branche de référence (cf. figure I.6). A la sortie, la lumière propagée
dans les deux branches est réunie dans une deuxième jonction Y, et il en résulte une interférence.
L‟intensité de la lumière obtenue sera mesurée par un détecteur photoélectrique. Un changement au
niveau de la surface du capteur provoque un changement de l‟indice de réfraction de la branche
contenant l‟élément sensible, il en résulte alors un changement de l‟intensité de la lumière détectée
I( ne), qui est décrit par la relation suivante :
Eq.I. 7
Avec : ne la variation de l‟indice de réfraction, k0 l‟amplitude du vecteur d‟onde et L la
longueur de la région sensible.
Etat de l’art
Chapitre I
18
Figure I.6 : schéma de principe d’un capteur à base d’Interféromètre Mach- Zender.
Le premier biocapteur basé sur l‟Interféromètre Mach-Zender a été réalisé pour le
développement d‟un immunocapteur pour la gonadotrophine chorionique [13
]. Récemment,
l‟interféromètre Mach-Zender a été employé pour le développement de systèmes microfluidiques en
utilisant la technologie CMOS avec les polymères intégrée dans un système polymère [14
].
c. Capteur à Résonance plasmonique de surface (SPR)
Un biocapteur optique à base SPR (commercialisé sous le nom de système BIACORE®) est un
biocapteur utilisant le principe physique de la résonance de plasmon de surface en se basant sur la
configuration de Kretschmann, dont le principe sera défini dans le chapitre suivant. Dans une telle
configuration l‟élément sensible du biocapteur est déposé sur une surface métallique recouvrant un
support solide en verre. Ce dernier est fixé à la base d‟un prisme (figure 10).
Ce capteur permet de mesurer en temps réel, et sans marquage spécifique, les caractéristiques
d‟interaction entre deux molécules. Pour cela une des molécules (sonde) sont immobilisées sur la
surface du biocapteur et l‟autre molécule (cible) est injectée. Le principe de détection par SPR repose
sur la quantification des changements de l‟indice de réfraction près de la surface, reliées à la variation
de densité à la surface du biocapteur, due à la formation et à la dissociation des complexes
moléculaires.
Etat de l’art
Chapitre I
19
Figure I.7 : Principe de fonctionnement d’un capteur à résonnance plasmonique de surface (SPR).
En effet la mesure est basée sur la courbe de plasmon qui représente la variation de la
réflectivité en fonction de l‟angle d‟incidence (cf. figure I.8.A). L‟optimum de résonance des plasmons
est au voisinage d‟un angle d‟incidence donnant le minimum de réflectivité. Les variations des
propriétés de ce pic d‟adsorption vont permettre de quantifier les perturbations se produisant prés de
l‟interface métal/solution dues aux variations de l‟indice de réfraction du milieu couvrant,
de l‟épaisseur de la couche formée lors de la variation de la concentration de la molécule cible. Ainsi
pour un état (1) la courbe de plasmons présentera un angle de résonance (ϴ1), la fixation d‟une entité
sur la surface (état 2), la courbe se déplace présentant alors un angle de résonnance (ϴ2). En physique,
cela se traduit par le fait que lorsque la lumière monochromatique et polarisée arrive l‟interface entre
deux milieux d‟indice de réfraction différent. Cette interface est recouverte d‟une fine couche
métallique, l‟intensité de la lumière réfléchie est nettement réduite pour un angle d‟incidence
particulier. La composante électromagnétique de la lumière, l‟onde évanescente, se propage
perpendiculairement à l‟interface, jusqu‟à une certaine épaisseur dans la couche métallique. L‟angle de
résonnance vari notamment en fonction de l‟indice de réfraction, donc en fonction de la masse des
molécules situées au voisinage de la surface.
Par conséquence, un suivi de l‟angle SPR en fonction du temps permet de suivre en temps réel
l‟association et la dissociation entre la sonde et la cible. Le signal obtenu est un sensorgramme (cf.
figure I.8.B). Il permet de donner des informations sur la cinétique des interactions, l‟épaisseur et la
masse de la couche déposée sur la surface donc sur le nombre de molécules fixées.
Etat de l’art
Chapitre I
20
Figure I.8 : Réponses d’un capteur à résonance plasmonique de surface : (A) réflectivité en fonction de l’angle
d’incidence de la source par rapport à la surface, (B) suivi de l’angle de résonance en fonction du temps.
Dans le cas où la cinétique résulterait d‟une interaction entre deux entités biologiques
(anticorps/antigène, ADN/ADN…) dont l‟une est ancrée sur la surface, le nombre de molécules
déposées représente le nombre de molécules ayant réagi. En effet, les variations d‟indice et les
variations d‟épaisseur sont liées à la densité déposée à la surface par la relation suivante :
Eq.I. 8
Avec :
Γ: le taux de recouvrement exprimé en g/cm²;
dn/dc : l‟incrément de l‟indice de réfraction (0,188 cm3/g pour tous les protéines [15
]) ;
θ : la variation de l‟angle de résonance (en seconde d‟arc, 1 seconde d‟arc vaut 1/3600
degré) ;
et K : la constante de conversion (5300 seconde d‟arc/ nm).
Grâce à leur grande sensibilité, leur réponse en temps réel et leur grande précision, les capteurs
à résonance des plasmons de surface sont intensivement utilisés pour l‟étude des interactions antigène-
anticorps [ 16
,17
].
Pendant la dernière décennie, les biocapteurs optique à base SPR été évolué dans le même sens
que la nanotechnologie. Le NanoSPR est un nouveau biocapteur à base SPR utilisée pour les
Etat de l’art
Chapitre I
21
nanostructures dans l‟objectif de la miniaturisation des biocapteurs. Le NanoSPR permet la détection
en temps réel des interactions biomoléculaires sur des nanoparticules métalliques [18
,19
].
Dans l'ensemble, les biocapteurs optiques présentent une bonne implantation dans le monde
industriel. En effet, des systèmes basés sur des mesures SPR (Biacore) sont devenus des instruments
privilégiés pour la mesure en temps réel de toute interaction biomoléculaire. La tendance actuelle est à
la conception de biocapteurs miniaturisés, multiparamé- triques et portables.
III.3.1.2. Transducteur Mécanique
Différentes méthodes mécaniques ont été utilisées en tant que systèmes de détection de
biocapteurs. Ces transducteurs sont devenus de plus en plus populaires au cours des dernières années.
a. Transducteur basé sur l’effet piézoélectrique
Ce type de transducteur repose sur le phénomène piézoélectrique. Ce phénomène intervient du fait
de l‟apparition d‟un potentiel électrique à la surface d‟un cristal si celui-ci subit la moindre
déformation mécanique. De même, ce cristal placé dans un champ électrique oscillant, acquiert une
fréquence de vibration identique. Tout changement de masse (Δm) intervenu à la surface du cristal
entraîne une diminution proportionnelle de sa fréquence de vibration (ΔF). Cette relation linéaire
s'exprime quantitativement par l'équation de Sauerbrey (Eq .I.10).
Eq.I. 9
F0 représente la fréquence fondamentale, A la surface géométrique, μQ et ρQ respectivement, le mode
de cisaillement et la densité du cristal piézoélectrique.
L‟équation de Sauerbrey n‟est applicable que pour des couches suffisamment fines et rigides et
elle perd son utilité dans le cas de films viscoélastiques, en particulier de films de polymères ou des
polyélectrolytes.
Etat de l’art
Chapitre I
22
Figure I.9 : Illustration du comportement d’une pastille piézoélectrique : la contrainte appliquée crée un potentiel.
Microbalance à quartz
Le biocapteur à effet piézoélectrique le plus utilisé est connu sous le nom de microbalance à
quartz (QCM). Il est basé sur la mesure de l‟oscillation d‟un cristal de quartz sur lequel est immobilisé
le composé biologique. Un cristal de quartz peut osciller quand il est immergé partiellement ou
complètement dans un liquide. Si les propriétés physicochimiques du liquide sont connues, un
changement de masse à la surface du cristal va entraîner un changement quantifiable de la fréquence
de résonance.
Le capteur à effet piézoélectrique a été mis au point vers 1972 [20
]. Plusieurs études ont depuis été
consacrées à son utilisation dans des domaines très variés. Citons par exemple l‟environnement (la
détection des hydrocarbures, des polluants,…), la biologie (la réalisation d‟immunocapteurs [21
], la
suivi de l‟hybridation d‟ADN [22
], l‟adsorption de protéines [23
], l‟adhésion de cellules [24
] …) et la
médecine [25
].
b. Transducteur à Poutre AFM
Le microscope à Force Atomique (AFM) permet non seulement d‟observer les atomes à la
surface de l‟échantillon sous vide ou dans l‟air mais aussi de manipuler d‟une façon très précise la
surface de l‟échantillon. Ce dispositif est constitué d‟une pointe fine placée à l‟extrémité d‟une lame
ressort très sensible appelée levier, d‟un détecteur optique de déflection du levier et d‟un système de
positionnement piézoélectrique permettant les déplacements dans les 3 directions de l‟espace (cf.
figure I.10). Lorsqu‟on déplace horizontalement, dans les directions x et y, à hauteur constante le
dispositif au-dessus de l‟élément sensible à analyser, la pointe va bouger verticalement pour suivre les
très faibles variations sur la surface. Les forces agissant entre la pointe et la surface, provoquent des
Etat de l’art
Chapitre I
23
déflexions du levier supportant la pointe dans la direction z, qui sont enregistrées en fonction de la
position en x et y. La détection des déflexions du levier est assurée par une méthode optique. En effet,
un faisceau laser est focalisé sur la face arrière du levier et réfléchi vers un détecteur composé d‟une
photodiode à deux ou quatre cadrans. Chaque cadran délivre une tension proportionnelle à sa surface
éclairée, on peut ainsi suivre les mouvements verticaux et horizontaux du faisceau laser associés
respectivement aux déflections et aux torsions du levier. Ce système permet d‟obtenir une résolution
verticale inférieure à l‟Å.
Figure I.10 : principe de mesure de l’AFM.
Initialement, la technique a été utilisée pour caractériser les surfaces solides, puis son champ
d‟application s‟est étendu à la biologie. En effet la mesure de la force d‟interaction entre la pointe et
l‟échantillon, sur laquelle repose l‟imagerie par microscopie à force atomique, a servi également à
déterminer les forces de liaison entre deux molécules. Les premières expériences ont été réalisées sur
l‟interaction avidine-biotine [26
]. Par la suite de nombreux travaux ont porté sur la mesure des forces
d‟interaction inter- et intramoléculaire, incluant les interactions ADN-ADN [27
], anticorps-antigène
[28
], ainsi que sur la mesure des forces d‟adhérence entre cellules vivantes [29
] ou sur des
caractérisations structurales des membranes [30
].
c. BioMEMS
Etat de l’art
Chapitre I
24
Les bioMEMS (Micro-Electro-Mechanical-Systems), ou microsystèmes électromécaniques, sont
des systèmes mécaniques de taille nanométrique. Ce dispositif permet la traduction des interactions
biomoléculaires par une donnée mécanique suite à une déflexion d‟un micro levier. En effet, une
biomembrane, à l‟échelle micrométrique, constitue l‟élément sensible du bioMEMS fixée dans une
plate-forme de silicium. Cette membrane, fonctionnalisée par des molécules spécifiques d‟intérêt
(sonde), est entraînée en vibration sur son mode fondamental grâce à l‟action d‟une pastille
piézoélectrique. Lorsque la biomembrane est en contact avec une solution aqueuse contenant des
espèces à détecter (cible), celles-ci sont captées par la sonde et la membrane sera alors alourdie. En
détectant les vibrations de cette biomembrane, on peut mesurer la variation de fréquence de résonance
qui s‟ensuit et ainsi estimer la quantité de biomolécule présente dans le liquide. Ce bioMEMS permet
de détecter, de façon automatique et autonome, la présence d‟une molécule donnée contenue dans une
solution aqueuse.
Le BioMEMS offre énormément d‟avantages : une vitesse accrue des réactions chimiques à
l‟échelle nanométrique, une grande sensibilité, la possibilité de mesurer en temps réel, un rapport
signal sur bruit élevé, une intégration aisée de plusieurs capteurs sur une surface réduite. Ce
BioMEMS est utilisé dans différents domaines, mécanique, électronique, optique…. De nos jours ce
dispositif révèle un grand potentiel d‟application notamment dans le développement des capteurs
physiques, chimiques et biologiques [31
]. Dans le domaine de la biologie, grâce à sa miniaturisation, ce
type de capteur peut être implanté dans le corps humain pour un suivi précis de certaines parties
inaccessibles.
III.3.1.3. Transducteur électrochimique
Les capteurs électrochimiques sont classés selon leur mode de transduction : potentiomètrique,
ampérométrique, conductimètrique ou impédimètrique [32
]. Le principe de base d‟une mesure
électrochimique repose sur le fait que certaines substances électroactives en solution (molécules ou
ions) peuvent échanger des électrons avec une électrode, ceci dans des conditions analytiques bien
définies en particulier par le potentiel auquel cet échange a lieu. Les différents principes exigent
toujours une conception spécifique de la cellule électrochimique.
a. Capteur potentiomètrique
Le principe de ce type de capteur électrochimique repose sur la mesure de l‟accumulation de
charges électriques à la surface d‟une électrode. Pratiquement, cela se traduit par une détermination de
Etat de l’art
Chapitre I
25
la différence de potentiel qui s‟établit entre une électrode de référence, dont le potentiel est constant et
reproductible, et l‟électrode indicatrice, sans polariser la cellule électrochimique (c.à.d. l‟intensité de
courant est nulle). L'électrode indicatrice développe un potentiel variable proportionnel à l'activité ou
la concentration d‟un analyte spécifique dans solution. Dans ce type de système, un équilibre local est
établi à la surface du capteur et conduit à la génération d‟un potentiel proportionnel au logarithme de
la concentration (activité) de l‟échantillon selon la loi de Nernst (cf. Eq.I.11), dans le cas d‟un capteur
redox.
d
Ox
dOxa
a
nF
RTEEp
Re
0
Re/ ln*
Eq.I. 10
Où Ep représente le potentiel du couple redox ; 0
Re/ dOxE le potentiel normal standard du couple
redox ; R la constante des gaz parfaits (8,314 K-1.mol-1) ; aOx/aRed le rapport de l‟activité de l‟espèce
déterminant le potentiel à l‟état oxydé et à l‟état réduit ; T la température absolue en Kelvin et F =
constante de Faraday = 96500 C.mol-1
.
Le potentiel rédox permet de caractériser la composition de la solution contenant oxydant et
réducteur conjugués dissous, en particulier il permet de suivre l‟évolution de la composition de la
solution au cours d‟un titrage. Un schéma de ce capteur redox est présenté sur la figure I.11.
Figure I.11 : Schéma d’un capteur redox.
Dans le cas d‟une électrode spécifique la loi de Nernst est la suivante :
2ln*0
Aa
nF
RTEEp
Où E0 représente le potentiel normal.
2Aa : Activité de l‟ion spécifique.
Etat de l’art
Chapitre I
26
Figure I.12 : Principe de mesure potentiomètrique : accumulation de charges électriques à la surface de
l’électrode indicatrice.
Parmi les capteurs potentiomètrique, il existe aussi les transistors à effet de champ (ISFET : Ion
Sensitive Field Effect Transistor). Le principe a été proposé pour la première fois par P. Bergveld en
1970. Il s‟agit d‟une combinaison de deux techniques : le transistor MOSFET (metal oxide
semiconductor field effect transistor) basé sur un semi-conducteur, et l‟électrochimie, par la présence
d‟un électrolyte solide, échangeur d‟ions.
Pour un transistor MOSFET, dans un substrat silicium de dopage p, sont implantées deux zones
de dopage n formant le drain et la source, auxquelles sont appliquées des électrodes métalliques. La
zone située entre le drain et la source est le canal. Elle est recouverte d‟une fine couche isolante de
silice (isolant de grille) qui porte une métallisation constituant l‟électrode grille. L‟application entre la
grille et la source d‟une tension VG positive tend à repousser les trous majoritaires du substrat et à
attirer sous la grille, les électrons porteurs minoritaires du substrat. Lorsque VG devient supérieure à
une tension de seuil VD, la densité d‟électrons sous la grille devient supérieure à la densité de trous et
un canal de type n se forme, assurant la continuité entre le drain et la source : la circulation d‟un
courant entre source et drain devient possible.
La structure de l‟ISFET est comparable à celle du MOSFET, mais la métallisation de la surface de
l‟isolant (la grille) est remplacée par une membrane chimiquement sensible, en contact avec le milieu
Etat de l’art
Chapitre I
27
à étudier. La tension de grille est appliquée entre l‟ISFET et une électrode de référence (cf. figure
I.12). Ce type de capteur est utilisé en milieu liquide.
Figure I.13 : Schéma représentant le principe de fonctionnement d’un ISFET.
Les premiers ISFETs commercialisés étaient des électrodes solides de pH. Mais comme capteur
les ISFETs sont utilisés pour la détection des métaux lourds [33
], en tant qu‟immunocapteurs [34
] et en
tant que capteurs génétiques [35
].
b. Capteurs conductimètriques
La conductimétrie est une technique électrochimique alternative à l‟ampérométrie et à la
potentiométrie. Son principe repose sur la mesure de la conductivité électrique d‟une solution
électrolytique contenant des charges électriques mobiles, constituées par l‟ensemble des ions.
Pratiquement la mesure de la conductance d‟un électrolyte s‟effectue en immergeant dans la solution
une cellule de mesure comprenant deux électrodes soumises à un signal électrique, généralement
alternatif et de fréquence choisie pour minimiser les effets dus aux polarisations. La surface S et la
longueur l des électrodes sont déterminées par étalonnage dans une solution de conductivité connue
(figure I.13).
La conductance électrique G, inverse de sa résistance, est proportionnelle à la surface S de la
section perpendiculaire à la direction du courant et inversement proportionnelle à sa longueur. Elle est
donnée par l‟équation suivante :
Etat de l’art
Chapitre I
28
l
SG
*
Eq.I. 11
Avec G conductance (S), γ conductance spécifique ou conductivité, caractéristique du corps ;
elle est exprimée en siemens par centimètre et S la surface en cm2 et la l longueur en cm.
En première approximation, pour des solutions de concentration faible, la conductivité est
proportionnelle à la concentration de l‟électrolyte. Ces capteurs conductimètriques détectent toutes les
espèces ioniques présentes dans la solution, leur utilisation demande de bien connaître la composition
ionique des solutions puisqu‟ils n‟ont aucune sélectivité intrinsèque.
Figure I.14 : Schéma de principe des mesures conductimètrique : Transfert d’électron, migration d’ions.
Ce type de capteur suscite un intérêt croissant du fait de sa relative simplicité de fabrication. De
ce fait, il est utilisé dans le domaine biomédical et le domaine environnemental. On peut citer par
exemple le système développé par G.A. Zhylyak et S. Dzyadevych qui permet de détecter des métaux
lourds avec une gamme de détection très intéressante (Hg2+ :1µM ; Cu2
+ : 2µM ; Cd2
+ : 5µM ; Co2
+ :
10µM ; Pb2+ : 20µM ; Sr2
+ : 100µM) en utilisant l'enzyme uréase immobilisée sur des électrodes
interdigitées [36
]. La sélectivité de détection est assurée par l‟enzyme.
c. Capteur impédimètrique
Le principe de ce type de capteur électrochimique repose sur la mesure de l‟impédance d‟une
cellule électrochimique par la technique de spectroscopie d‟impédance, dont le principe est détaillé
dans le chapitre suivant. Cette technique permet de contrôler le processus de transfert de charge à
l‟interface électrode / électrolyte. Pratiquement, la mesure de l‟impédance s‟effectue dans une cellule à
trois électrode, une électrode indicatrice sur la quelle est déposé l‟élément sensible (biorécepteur), une
Etat de l’art
Chapitre I
29
électrode de référence et une électrode auxiliaire (cf. figure I.14). En effet, un potentiel imposé avec
une perturbation sinusoïdale de faible amplitude, entre l‟électrode de référence et l‟électrode
indicatrice, permet la mesure d‟un courant, de la même forme, généré entre l‟électrode indicatrice et
l‟électrode auxiliaire. Le rapport de la tension appliquée à l‟intensité du courant mesuré définit
l‟impédance du système électrochimique. Cette impédance peut être représentée par un circuit
électrique équivalent selon le type du système (système faradique ou système non faradique). Ce
circuit permet d‟exprimer les paramètres électriques qui définissent le phénomène de transfert de
charge qui se produit à l‟interface électrode/ électrolyte. Dans un système de biocapteur ces paramètres
varient lorsqu‟il y aura des changements interfaciaux provenant des interactions biomoléculaires à la
surface de l‟électrode indicatrice.
Figure I.15 : Schéma de principe des mesures impédimètrique.
Les biocapteurs impédimétriques s‟appliquent avantageusement aux réactions mettant en jeu
des phénomènes d‟affinité moléculaire de type antigène-anticorps ou chémorécepteurs membranaires
car de faibles variations de conductance et de capacitance peuvent être décelées à l‟interface entre
l‟électrode et le substrat immobilisé.
Pour des applications immunologiques, selon la nature du signal de mesure, l‟impédance des
immunocapteur peut être classifiée en deux catégories principales :
Etat de l’art
Chapitre I
30
Impédance Capacitive où la surface de l'électrode est complètement couverte par une couche
diélectrique et l'électrode entière se comporte comme isolant plus ou moins parfait. Dans ce
type de capteur, aucun couple redox n'est présent dans la solution de mesure. Dans ce cas les
interactions antigène-anticorps causent une diminution de la capacité selon l‟équation
suivante :
Eq.I. 12
Avec ε la permittivité relative du diélectrique, ε0 la permittivité diélectrique du vide, A l‟aire de
l‟electrode et d est l'épaisseur de la couche isolante.
Impédance faradique où la surface de l‟électrode, qui est partiellement ou complètement
couverte par une couche non isolante, ou partiellement couverte par une couche isolante
capable de réagir avec les couple redox, qui existent dans la solution de mesure. Dans ce cas-
ci, le paramètre mesuré est la résistance de transfert de charge, les interactions antigène-
anticorps causent une augmentation de sa valeur. En général, les immunocapteurs
impédimétriques faradiques montrent une sensibilité plus élevée à l‟interaction antigène-
anticorps. Cependant, l'espèce redox peut avoir un effet sur la stabilité et l'activité de
l'électrode assemblée.
Comme application, ce type de capteur a été employé pour les capteurs de gaz [37
], et dans le
domaine biologique, il a été largement appliquée dans les immunocapteurs et les capteurs génétiques.
Dans le domaine immunologique, on trouve par exemple des immunocapteurs, basés sur des
électrodes de niobium, pour la détection de l'atrazine [38
]. Récemment, des immunocapteurs ont été
développés pour la détection de l‟aflatoxine B [39
].
III.3.2. Le biorécepteur
Le biorécepteur constitue le premier maillon du biocapteur. Il permet l'identification de l'espèce
à détecter grâce à son site particulièrement sélectif. Le biorécepteur assure ainsi la reconnaissance
moléculaire, associée ou non à la transformation de l‟espèce à mesurer. Cette modification, très
localisée, de l‟espèce présente dans l‟échantillon, se fait généralement par l‟intermédiaire d‟une
molécule active (par exemple : enzyme, anticorps, ADN, cellule entière, micro-organisme)
immobilisée qui transforme ce substrat en un produit détectable par le transducteur. Dans un
Etat de l’art
Chapitre I
31
biocapteur, le biorécepteur offre une spécificité et une sensibilité élevée pour un groupe particulier
d'analyte, ainsi qu‟une réponse rapide. Plusieurs types de biorécepteurs ont été utilisés comme moyen
de reconnaissances moléculaires pour le développement de biocapteurs (cf. figure I.15). Parmi ces
biorécepteurs on cite par exemple les biocapteurs à enzymes qui utilisent généralement des enzymes
spécifiques pour la capture et la génération catalytique d‟un produit qui est alors directement mesuré
grâce à une large gamme de transducteurs (électrochimiques, optiques, thermiques, acoustiques…). Ce
type de biocapteurs a été souvent utilisé pour la quantification de contaminants tels que les pesticides,
herbicides ou antibiotiques…. Le biorécepteur microorganisme est utilisé comme biocapteur pour la
synthèse pharmaceutique, le traitement des eaux usées et l‟industrie alimentaire.
Figure I.16 : Représentation schématique des différents biorécepteurs.
Dans ce qui suit, nous nous intéresserons à définir les anticorps (immunoglobulines) qui seront
utilisés comme biorécepteurs dans les biocapteurs développés au cours de ce travail.
III.3.2.1. Les immunoglobulines
a. Structure des immunoglobulines
Les anticorps ou immunoglobulines (Ig) sont les protéines du système immunitaire. Elles se
forment généralement en réponse à l‟agression d‟un organisme par un toxique, une protéine étrangère
ou une bactérie. Il existe cinq catégories différentes d‟Ig: IgG, IgA, IgM, IgD et IgE. Malgré cette
variabilité, elles sont toutes construites à partir d'un même modèle de base, celui d'une protéine
possédant une structure quaternaire. La molécule élémentaire d'Ig comporte quatre chaînes
polypeptidiques, deux chaînes lourdes et deux chaînes légères, identiques deux à deux et donc codées
Etat de l’art
Chapitre I
32
par deux gènes différents. Sa structure est symétrique (cf. figure I.16) et la cohésion de la molécule est
assurée par des ponts disulfures reliant les chaînes.
Figure I.17 : Structure schématique d’une immunoglobuline :V= partie variable ; C= partie constante.
Le fragment Fc est le support des propriétés biologiques de l'immunoglobuline, en particulier
sa capacité à être reconnu par des effecteurs de l'immunité ou à activer le complément. Il est constitué
des fragments constants des chaînes lourdes. Il ne reconnait pas l‟antigène.
Le fragment Fab. a la même affinité pour l'antigène que l'anticorps complet. Le fragment Fab
est formé de la chaîne légère en entier et d'une partie de la chaîne lourde.
En outre, pour chacune des catégories citées préalablement, il existe des anticorps polyclonaux
et des anticorps monoclonaux. Les anticorps polyclononaux sont constitués de protéines dirigées
contre le même antigène mais peuvent cibler des sites différents (épitopes différents), alors que les
anticorps monoclonaux, ne contenant qu‟un seul paratope, sont dirigés contre un seul et même épitope
de l‟antigène.
III.3.2.2. Formation du complexe anticorps-antigène
Les mesures thermodynamiques montrent que la combinaison antigène - anticorps est
réversible et implique une énergie de liaison d‟environ 34 à 65 kJ/mole. Ces données éliminent
d‟emblée les liaisons covalentes dont l‟énergie varie de 210 à 500 kJ/mole. La liaison antigène -
anticorps fait intervenir alors des interactions de type hydrogène, électrostatiques, Van der Waals et
hydrophobes. Toutes les forces non covalentes agissent à des distances interatomiques très faibles.
Elles sont d‟autant plus fortes (attraction) que la distance entre les groupes réagissant est plus courte
jusqu‟à la limite où des forces de répulsion entrent en jeu à l‟approche du rayon de Van der Waals en
raison de l‟interpénétration des couches électroniques externes des atomes en contact.
Etat de l’art
Chapitre I
33
L‟équilibre de formation du complexe anticorps-antigène s‟écrit ainsi comme suit :
Avec ka la constante d‟affinité est :
Eq.I. 13
Le développement d‟un biocapteur immunologique (immunocapteur) s‟appuie sur la
reconnaissance moléculaire anticorps-antigène. La réaction de couplage antigène-anticorps peut alors
être suivie par différentes techniques de détection. Un grand nombre de travaux ont eu recours au
marquage de l‟anticorps ou de l‟antigène par une enzyme ou un fluorochrome qui permet de suivre
facilement la réaction de reconnaissance moléculaire par la technique ELISA. Dans la dernière
décennie, des approches récentes utilisent la détection sans marquage soit par résonance plasmonique
de surface (SPR), soit par mesure d‟impédance électrochimique (EIS), en ayant, au préalable, fixé de
façon covalente les anticorps sur une surface d‟un support.
III.3.2.3. Les différentes méthodes d’immobilisation de l’anticorps sur la surface du transducteur
Selon le type de fonctionnalisation de la surface du transducteur, la partie constante du
fragment (Fab) (cf. figure I.16) d‟un anticorps peut être modifié à fin d‟interagir avec cette surface.
Différents types d‟interactions existent tels que : biotine/ avidine (liaison d‟affinité), acide aminé/métal
(liaison de coordination), acide carboxylique activé et amine (liaison peptidique: liaison covalente)….
Nous présentons dans ce qui suit le principe des interactions biotine/ avidine et le complexe Histidine/
métal qui sont utilisées pour l‟élaboration des biocapteurs développés dans ce travail.
a. Interaction biotine/avidine
L‟utilisation du système biotine-avidine (cf. figure I.7) est intéressante à cause de la constante
d‟affinité de l‟avidine pour la biotine (1015
M) qui est l‟une des plus élevées dans la nature. Cette
affinité élevée, et la facilité de fonctionnalisation des diverses biomolécules avec de la biotine rendent
ce système utile pour un éventail d‟applications nano-biotechnologiques. La synthèse de diverses
molécules portant un groupement biotine telles que les alkyl-thiols ou les monomères de pyrrole a
Etat de l’art
Chapitre I
34
augmenté les applications du système biotine-avidine pour l'étude des interactions biomoléculaires qui
est une étape importante pour le développement des biocapteurs.
Figure I.18 : structure de la streptavidine en interaction avec des biotines.
En effet, dans un biocapteur, les biomolécules peuvent être facilement immobilisées par
interaction d‟affinité sur un film biotinylé via par exemple l‟assemblage sandwich film-
biotine/avidine/biomolécule biotinylé. Cette stratégie de fonctionnalisation permet d‟avoir un
biocapteur stable, les biomolécules étant bien ordonnées sur le film. Elle permet également d‟avoir un
biocapteur régénérable, puisque le cœur biotine/avidine/biotine peut être désassemblé par un
surfactant.
b. Liaison métal/protéine
La liaison d‟une protéine avec un métal est caractérisée par la coordination des atomes du
métal par des acides aminés. Donc le métal n‟interagit pas directement avec la protéine, un élément
structurel, par exemple l‟histidine, en tant que marqueur pour qu‟elle puisse reconnaître
spécifiquement le métal.
La propriété de fixation des ions métalliques par l'histidine est à la base d'une technologie de
purification des protéines recombinantes appelée chromatographie d'affinité pour ions métalliques
immobilisés. Le principe de cette méthode est le suivant : on ajoute à la protéine une séquence
contenant au moins six histidines consécutives (étiquette poly-histidine). Cette étiquette est capable
d'interagir fortement avec des ions métalliques (Cu2+
, Zn2+
, Co2+
, Fe2+
,Ni2+
,...). On utilise cette
Etat de l’art
Chapitre I
35
propriété pour fixer la protéine ainsi étiquetée sur une résine chromatographique sur laquelle est
chélatée un ion métallique.
Pour les biocapteurs les protéines possédant une étiquette histidine peuvent interagir avec le
métal par liaison de coordination. Du côté du transducteur, le métal est chelaté avec un ligand NTA
(d'acide de nitrilotriacetique) qui se fixe sur la surface du transducteur par liaison covalente [40
].
L‟avantage de ce type de liaison, est qu‟elle peut être rompue de façon contrôlée : cette rupture
peut se faire de deux manières différentes, soit en condition dénaturantes (élution en baissant le pH ce
qui déstabilise l‟interaction nickel-histidine), soit en condition native (la protéine est éluée en rajoutant
de fortes concentrations d‟un analogue de l‟histidine, l‟imidazole).
IV. Techniques d’immobilisations des biomolécules
IV.1. Introduction
Un point essentiel pour la fabrication d‟un biocapteur est le greffage des biomolécules actives
(enzymes, anticorps, cellules ou tissus…) sur la surface du transducteur. Différentes procédures
d‟immobilisation du biorécepteur ont été développées dans le but d‟avoir une immobilisation efficace
et stable des biomolécules actives sur la surface du transducteur, de maintenir complètement les
propriétés biologiques des biomolécules actives et de garantir une accessibilité et une réactivité
maximales du biorécepteur [41
,42
,43
]. La sélection d‟une méthode d‟immobilisation appropriée dépend
de la nature de la molécule biologique, du type de transducteur utilisé, des propriétés physico-
chimiques de l‟analyte et des conditions opératoires du biocapteur [6]. Il existe plusieurs techniques
d‟immobilisation que l‟on peut subdiviser en procédés physiques et en procédés chimiques (cf. figure
I.18).
Etat de l’art
Chapitre I
36
Figure I.19 : Représentation schématique des différentes méthodes d’immobilisation de l’élément biologique.
Préalablement, l‟immobilisation physique laisse le biorécepteur intact, mais la faiblesse de la
liaison (forces de Van der Waals) peut entraîner une perte du biorécepteur et une sensibilité élevée aux
paramètres physico-chimiques (t°, pH,…). Ce type de rétention exploite la grande différence de taille
entre la molécule sonde et la cible, d‟où l‟idée de créer une barrière semi-perméable pour retenir la
molécule. Parmi les immobilisations qui appartiennent à cette catégorie on site : l‟immobilisation par
adsorption qui est basée sur l‟établissement d‟interactions de faible énergie de type ionique, polaire ou
hydrophobe, ou encore des liaisons hydrogènes et des forces de Van der Waals, entre les groupes
fonctionnels de la molécule active (biorécepteur) et la surface de support (le transducteur).
L‟immobilisation par piégeage consiste à incorporer la molécule biologiquement active dans une
matrice organique (polymère) ou inorganique (argiles). Nous trouvons aussi la rétention par une
membrane qui consiste en une technique d‟immobilisation connue sous le nom Langmuir–Blodget
(LB). Elle repose sur l‟adsorption de biomolécule sur une monocouche de tensio-actif, comme
l‟octodécylamine (ODA) grâce à la force électrostatique. On obtient un film LB dans lequel la
biomolécule est emprisonnée entre deux couches d‟ODA. Une fois déposé sur les transducteurs, ces
films sont traités avec des vapeurs de glutaraldehyde pour améliorer leur stabilité.
Tandis que l‟immobilisation chimique implique la formation d'une liaison chimique entre la
molécule active et un groupe réactif d'un agent d'immobilisation ou du support. La liaison se réalise,
soit par création d‟une vraie liaison covalente (fixation covalente sur support activé) soit par
coréticulation qui est basée sur l‟interaction entre une protéine de charge (comme l‟albumine) et un
Etat de l’art
Chapitre I
37
agent bifonctionnel, pour la formation d‟un réseau [44
]. L‟immobilisation chimique présente souvent
l‟avantage de stabiliser la protéine et de permettre une utilisation prolongée [45
].
Le développement des biocapteurs réalisé dans ce travail se base sur le greffage des molécules
par des liaisons covalentes. Ainsi, on s‟intéresse, dans ce qui suit, à définir ce type de liaison.
IV.2. Greffage covalent
L‟utilisation des liaisons covalentes permet d‟obtenir une bonne stabilité de vie de la biomolécule
active greffée sur l‟électrode. Elle permet également d‟avoir des fortes liaisons qui assurent une
meilleure fixation de la biomolécule sur la surface du transducteur. Cette technique est basée sur la
réaction entre un groupement fonctionnel de la molécule active et un groupement fonctionnel du
support préalablement activé. Les groupements fonctionnels disponibles pour les enzymes ou les
protéines proviennent des chaînes latérales des acides aminés, notamment les groupements ε-amine de
la lysine, carboxyle de l‟aspartate et du glutamate, sulfhydryles de la cystéine et hydroxyphénolique de
la tyrosine. Des réactifs bifonctionnels, tels que le glutaraldéhyde et le carbodiimide sont aussi très
utilisés pour l‟immobilisation de protéines. D‟autres stratégies utilisent des interactions d‟affinité
spécifique entre les molécules préalablement fixées aux supports et les molécules sondes à
immobiliser.
Pour assurer des liaisons covalentes, généralement, des surfaces métalliques telles que l‟or et
l‟argent peuvent être fonctionnalisées avec des groupements amines, hydroxyles ou carboxyles en
réagissant avec des aminoalcanethiols, hydroxyalcanethiols et carboxyalcanethiols simultanément.
Plus récemment, des électrodes métalliques sur lesquelles sont déposés, par voie électrochimique, des
films de polymère conducteur fonctionnalisé permettent l‟immobilisation des biomolécules actives par
liaison covalente.
V. La nanotechnologie et les biocapteurs
Le développement récent de la nanotechnologie a ouvert des nouvelles frontières
fondamentales appliquées à la science des matériaux et à la technologie. En effet, à l‟échelle
nanométrique, les propriétés des électrons à l'intérieur du matériau ainsi que les interactions atomiques
sont influencées par la taille du matériau. Par conséquent, le changement de la taille amène au
changement des propriétés spécifiques (magnétique, optique, électronique…) sans changement de la
composition. En raison du rapport élevé surface-volume lié à l‟échelle nanométrique dans les
Etat de l’art
Chapitre I
38
matériaux, une amélioration énorme au niveau des propriétés chimiques est également réalisable par
une réduction de taille. Alors, en créant des nanostructures, il est possible de contrôler les propriétés
fondamentales des matériaux à travers l‟effet de la surface et de la taille. Ceci va permettre de
développer de nouveaux matériaux et dispositifs avancés, adaptés aux besoins récents de la
microélectronique, pour de nombreuses applications dans plusieurs domaines.
Dans le domaine des biocapteurs, de nouveaux matériaux apparaissent, tel que les polymères
conducteurs, les nanoparticules, les nanotubes de carbone…, comme outils très prometteurs pour
l‟amélioration des performances des biocapteurs. Dans ce qui suit, nous nous intéresserons à définir
les polymères conducteurs et les nanoparticules en tant que nanomatériaux utilisés pour la fabrication
des biocapteurs développés au cours de cette thèse.
V.1. Les polymères conducteurs
V.1.1. Historique
Traditionnellement les polymères ont été employés en tant que matériaux d‟isolation
électrique. Vers la fin des années 1970, A.J. Heeger, A.G. Mac Diarmid et H.Shirakawa, lauréats du
prix Nobel de chimie de l‟année 2000 [46
], ont découvert qu‟après certaines modifications, un
polymère utilisé comme isolant (polyacétylène) peut devenir conducteur de l‟électricité, « métal
synthétique » [47
]. Cette découverte a attiré l‟attention de nombreux autres scientifiques sur le
polyacétylène, puis progressivement sur le polyaniline, le polypyrrole de même que sur les
polythiophènes, qui présentent l‟avantage d‟être chimiquement plus stables que le polyacétylène au
contact de l‟air.
V.1.2. Caractéristiques et applications
Les polymères organiques π conjugués (polymères conducteurs) constitués d'enchaînements de
simples et doubles liaisons sont caractérisés par des propriétés électroniques et/ou optiques
remarquables [48
]. De plus, ces polymères sont connus par leur flexibilité, leur résistance, l'élasticité et
la facilité de leur production. Parmi ces polymères conducteurs on trouve le polyacétylène, le
polypyrrole, le polythiophène, le polyterthiophène, le polyaniline, le polynaphtalène,…
La figure I.19 représente les structures moléculaires de quelques polymères conducteurs.
Etat de l’art
Chapitre I
39
Figure I.20 : Structure moléculaire de différents polymères conducteurs.
Grâce à toutes les propriétés qu‟ils offrent, les polymères conducteurs ont attiré l‟attention des
centres de recherche académique ainsi que des laboratoires industriels dans le monde entier. Depuis,
différentes applications dans divers domaines technologiques ont été développées : des panneaux
solaires ont été fabriqués par le dépôt électrochimique de polypyrrole sur le n-silicium [49
] ; Des
polymères tels que le polyacétylène, polythiophène, polyindole, polypyrrole, polyaniline etc… ont été
utilisés comme matériaux pour les batteries rechargeables [50
]. Des films de polypyrrole ont été
employés en tant que système de dégagement de drogue dans le cerveau [51
]. Dans le secteur de
l'électronique et de la photoniques (système optique non-linéaires) les polymères conducteurs ont
énormément été employés pour la fabrication des diodes, condensateurs, transistors (field-effect
Transistor FET). Dans le domaine de la médecine, les polymères sont utilisés dans certains procédés
chirurgicaux notamment oculaires, comme implants artificiels, prothèses ou bien dans les systèmes de
distribution automatique de médicaments [52
]….
Les polymères conducteurs sont également utilisés pour le développement des biocapteurs
grâce à leurs caractéristiques intrinsèques ainsi que leur biocompatibilité [53
]. Dans la littérature, on
trouve différents capteurs à base de polymère conducteur qui ont été développés [54
,55
].
Récemment, dans ce domaine, la recherche sur les polymères conducteurs a visé à optimiser
d‟autres propriétés en vue d‟améliorer les performances des biocapteurs. Pour de nombreuses
applications, les propriétés intrinsèques de ces matériaux ne suffisent plus et il faut y joindre des
Etat de l’art
Chapitre I
40
propriétés supplémentaires. Ceci est réalisé par la fonctionnalisation des polymères conjugués, dont le
principe consiste à greffer des molécules présentant une fonctionnalité spécifique afin de conférer une
nouvelle caractéristique au polymère en vue d‟une application dans le domaine des biocapteurs. Dans
ce qui suit on va citer les différentes méthodes d‟immobilisation des biomolécules actives sur ou dans
les polymères conducteurs tout en précisant les avantages d‟utilisation des polymères conducteurs
fonctionnalisés.
V.1.3. Intégration des polymères conducteurs dans les biocapteurs
L‟immobilisation stable des protéines à la surface d‟un transducteur avec rétention totale de
leurs propriétés biologiques demeure un problème crucial pour le développement commercial des
biocapteurs. En effet, la majorité des méthodes d‟immobilisation de protéines souffre d‟une faible
reproductibilité, d‟une mauvaise résolution spatiale et engendre une forte perte d‟activité biologique.
Dans ce contexte, l‟immobilisation de protéines sur des films de polymères constitue une alternative
extrêmement prometteuse.
Dans le domaine des biocapteurs les polymères conducteurs sont utilisés en tant qu‟outil
d‟amplification de signal (optique, électrique, électrochimique…) qui permet d‟améliorer les
caractéristiques et les performances des biocapteurs en termes de sensibilité, stabilité, limite de
détection … [56
]. Une autre approche montre que ces polymères sont aussi utilisés en tant que matériau
prometteur pour le maintien de la stabilité des biomolécules actives.
Ainsi, l‟immobilisation des biomolécules actives dans ou sur les polymères conducteurs a été
intensivement explorée en s‟efforçant d‟obtenir le meilleur contact entre ces deux éléments [57
].
L‟immobilisation des biomolécules actives sur le polymère conducteur peut être réalisée suivant trois
méthodes [58
,59
]:
L‟incorporation des biomolécules dans un film électropolymérisé formé par un mélange des
monomères et des biomolécules : Cette méthode présente l‟avantage de la facilité de la
procédure et le contrôle de la distribution spatiale des biomolécules. Cependant, la dénaturation
des molécules est un inconvénient possible;
L‟attachement électrostatique des biomolécules directement sur les groupes spécifiques
produits sur la surface du polymère, qui constitue une méthode commode pour immobiliser des
protéines; cependant, l'inconvénient principal de cette méthode est la force de l'interaction, qui
Etat de l’art
Chapitre I
41
dépend de la solution environnante, et le changement de la concentration ionique et/ou pH peut
causer la libération des biomolécules;
L'attachement covalent des biomolécules à des films électropolymérisés de polymère portant
les groupements fonctionnels activés comme (–NH2, –COOH). C'est le plus prometteur, car la
croissance du film de polymère et l'immobilisation des biomolécules peuvent être effectuées
dans différentes conditions expérimentales, et en conséquence le problème de dénaturation
peut être surmonté. De plus, la physisorption est minimum, donc réduisant les chances de
lixivier les biomolécules capturées [60
]. En outre, pour cette méthode d'immobilisation, il est
critique de maintenir l'activité des molécules, d‟augmenter la stabilité, et d‟assurer
l'accessibilité de la cible pour que les interactions biologiques aient lieu telles que l'hybridation
des oligonucléotides complémentaires, de l'interaction anticorps-antigène, ou les réactions
catalysées par enzyme [61
].
V.1.4. Le polypyrrole
Le polypyrrole est le polymère conducteur le plus connu. Ce dernier est le plus fréquemment
employé dans les applications commerciales à cause de sa conductivité élevée, de sa stabilité à long
terme, de la possibilité de former des films d‟homopolymères ou des composites. Il possède
également des propriétés mécaniques optimales, une compatibilité avec le milieu biologique [62
,63
,64
].
Il est connu pour sa stabilité à l'état oxydé et ses propriétés redox intéressantes. Le polypyrrole peut
être préparé par voie chimique et par voie électrochimique. La synthèse électrochimique peut se
dérouler à un potentiel d‟oxydation bas, et elle peut s‟effectuer dans un milieu aqueux aussi bien que
dans un solvant organique. Plusieurs méthodes électrochimiques peuvent être utilisées pour
l‟électropolymérisation du polypyrrole : à courant constant (méthode galvanostatique), à potentiel
contrôlé (méthode potentiostatique) ou encore par voltammétrie cyclique à balayage (méthode
potentiodynamique). Les propriétés du polypyrrole peuvent être modifiées facilement en changeant
l'anion dopant qui est incorporé au matériau pendant l‟électropolymérisation.
V.2. Les nanoparticules
En général, les nanoparticules peuvent être classées par catégorie suivant la matière première
utilisée :
A base de carbone telle que les fullerènes et les nanotubes carbones,
Etat de l’art
Chapitre I
42
Les nanoparticules inorganiques basées sur des oxydes de métal (oxyde de zinc, oxyde de
fer, oxyde titane et oxyde de cérium),
Les métaux (or, argent et fer) et
les quantum dots de (sulfure de cadmium et séléniure de cadmium).
Ces nanomatériaux présentent différentes morphologies telles que des sphères, des tubes, des
tiges et des prismes. Parmi ces nanomatériaux, les nanoparticules jouent un rôle important dans
l'avancement de la nanotechnologie. Grâce à leurs petites tailles, les propriétés inhabituelles des
nanoparticules ont accéléré la croissance de la production des matériaux à l‟échelle nanométrique et
l'augmentation rapide de leurs applications dans différents secteurs.
V.2.1. Caractéristiques et applications
Grâce à la facilité relative avec laquelle elles peuvent être préparées et manipulées, leur réactivité
généralement élevée, leur surface développée et la nature de leurs propriétés optiques, électroniques,
magnétiques … [65
,66
], les nanoparticules sont actuellement employées dans les domaines de
l'électronique, la biomédecine, la pharmacie, les produits de beauté, l‟analyse environnementale, la
catalyse et la science des matériaux, et d‟une manière intensive de nos jours dans le domaine des
biocapteurs.
Les nanoparticules ont trouvé une large variété d'applications en raison de leurs propriétés et leurs
caractéristiques. Grâce à leur surface spécifique élevée ils sont utilisés pour accélérer l‟activité des
catalyseurs. Dans le domaine thermique, les nanoparticules sont utilisées pour améliorer l'efficacité
des réfrigérants dans les transformateurs et permettent d‟augmenter le transfert thermique des capteurs
solaires aux réservoirs de stockage. Elles sont utilisées aussi dans la préparation des écrans solaires qui
offrent une protection solaire efficace. Il existe aussi d‟autres applications dans d‟autres domaines.
V.2.2. Intégration des nanoparticules dans les biocapteurs
Des nanoparticules en métal ou semi- conducteur, de dimensions comparables aux dimensions des
biomolécules (par exemple, enzymes, antigènes-anticorps ou ADN), sont utilisées pour la fabrication
des biocapteurs. Ces nanoparticules permettent de maintenir l‟activité des biomolécules une fois
adsorbées sur la surface. A titre d‟exemple des nanoparticules d'or sont utilisées pour immobiliser des
enzymes par adsorption chimique sur des monocouches auto-assemblé [67
].
Etat de l’art
Chapitre I
43
Une nouvelle approche de l‟utilisation des nanoparticules pour le développement des
biocapteurs suscite un intérêt croissant car elles apportent une solution idéale dans l'optimisation des
molécules actives immobilisées. En effet, cette approche consiste à utiliser des nanoparticules
fonctionnalisées avec des groupements présentant des sites d'affinité qui servent à immobiliser, et donc
à concentrer localement, les espèces ciblées qui sont ensuite détectées (cf. figure I.20). Donc, cette
approche permet d‟une part de minimiser le problème de diffusion, d‟augmenter la surface de contact
avec le milieu environnant ainsi que la densité de greffage des biomolécules et d‟autre part, de
maintenir la stabilité et l‟activité de la biomolécule. En termes d‟amélioration des performances des
biocapteurs, grâce à leur comportement quasi moléculaire en raison de leur petite taille, les
nanoparticules fonctionnalisées permettent d‟augmenter la sensibilité et d‟abaisser le seuil de
détection.
Figure I.21 : exemple de nanoparticule fonctionnalisée.
A titre d‟exemple des nanoparticules d‟or fonctionnalisées par des streptavidines ont été
employées pour l‟immobilisation par affinité des protéines biotinylées (par exemple les
immunoglobulines et les albumines) ou des oligonucléotides biotinylés. Des billes magnétiques
fonctionnalisées par des streptavidines, ont été déposées sur le transducteur par application d‟un
champ magnétique, pour la détection de l‟Escherichia Coli [68
].
Etat de l’art
Chapitre I
44
VI. Conclusion
Cette étude bibliographique montre la très large gamme de recherches effectuées sur le
développement de biocapteurs. Ce chapitre nous a permis de définir les différents types de biocapteurs
ainsi que les techniques convenables avec lesquels nous avons choisi de travailler pour développer de
nouveaux biocapteurs.
Nous avons mis en avant les nouvelles approches qui mènent à l‟amélioration des
caractéristiques et des performances des biocapteurs.
Dans le chapitre suivant, nous présenterons les principes physiques des différentes techniques
utilisées au long de ce travail.
Etat de l’art
Chapitre I
45
Références Bibliographiques
[1] Georges Asch, Les capteurs en instrumentation industrielle, Edition: 4, Publié par Dunod,
1993, 816 pages.
[2] L.C.Clark and C.Lyons, Electrode systems for continuous monitoring in cardiovascular
surgery, Annals of New York Academy of Sciences. (1962) 29.
[3] S.J. Updike and G.P.Hicks,. The Enzyme Electrode. Nature 214(1967) 986.
[4] G.Guilbault and J. Montalvo, A Urea Specific Enzyme Electrode, Journal of the American
Chemical Society, 91(1969)2164.
[5 ] Guilbault and J. Montalvo, An Improved Urea Specific Enzyme Electrode, Anal. Lett., 2
(1969) 283.
[6 ] C. Tran-Minh, Les biocapteurs. Principe, construction et applications, Paris, Masson (1991).
[7 ] E.A.H. Hall, Biosensors, Open University Press, Buckingham, (1990).
[8] N. Comtat and A. Bergel (1997), “Biocapteur: rêve ou réalité industrielle ? “ Biofutur 171
(Octobre): 33- 36.
[9] R. S. Marks, A. Novoa, T. Konry, R. Krais and S. Cosnier, Indium tin oxide-coated optical
fiber tips for affinity electropolymerization, Materials Science and Engineering: C,
21(2002)189.
[10
] K.Cherif, S.Hleli, A.Abdelghani, N.J.Renault, V.Matejec, Chemical detection in liquid media
with a refractometric sensor based on a multimode optical fibre, Sensors 2 (2002)195.
[11
] A. Abdelghani, C. Veillas, J. M. Chovelon, N. Jaffrezic-Renault, H. Gagnaire, "Stabilization
of a surface plasmon resonance (SPR) optical fibre sensor with an ultra-thin organic film:
Application to the detection of Chloro-fluoro-carbon (CFC)" , Synthethic Metals 90,
(1997)193.
[12
] A. Abdelghani, J. M. Chovelon, N.Jaffrezic-Renault, C. Ronot-Trioli, C. Veillas, H. Gagnaire,
"Surface plasmon resonance fibre optic sensor for gas detection", Sensors and Actuators B 38-
39 ,( 1997)407.
[13
] R.G. Heideman, R.P.H. Kooyman, J. Greve, Performance of a highly sensitive optical
waveguide Mac–Zehnder interferometer immunosensor, Sens. Actuators B Chem. 10 (1993)
209.
Etat de l’art
Chapitre I
46
[14
] F.J. Blanco, M. Agirregabiria, J. Berganzo, K. Mayora, J. Elizalde, A. Calle, C. Dominguez,
L.M. Lechuga, Microfluidic-optical integrated CMOS compatible devices for label-free
biochemical sensing, J. Micromech. Microeng. 16 (2006)1006.
[15
] D.Clerc, W.Lukosz, ,. Integrated optical output grating coupler as refractometer and (bio-)
chemical sensor, Sens. Actuators, B 11(1993)461.
[16
] K. Nagatomo, T. Kawaguchi, N. Miura, K. Toko, K. Matsumoto, Development of a sensitive
surface plasmon resonance immunosensor for detection of 2,4-dinitrotoluene with a novel
oligo (ethylene glycol)-based sensor surface Talanta, In Press, Accepted Manuscript, Available
online 20 February 2009
[17
] Yrina benilova, Approche « biocapteur » pour ssonder la bioaffinité et les interractions
biocatalytiques de petit xénobiotiquethese, soutenue le 15 juin 2007.
[18
] N. Nath and A. Chilkoti, Label free colorimetric biosensing using nanoparticles, J. Fluor. 14
(2004)377.
[19
] C. Yu, J. Irudayaraj, Quantitative Evaluation of Sensitivity and Selectivity of Multiplex
NanoSPR Biosensor Assays, Biophysical Journal, 93( 2007)3684.
[20
] A. Shones, F.Dprman, J. Najarian, An immunospecific microbalance. J. Biomed. Mater. Res. 6
(1972)565.
[21
] S. Storri, T. Santoni, M. Minunni and M. Mascini, S. Storri, Surface modifications for the
development of piezoimmunosensors,. Biosensors and Bioelectronics. 13, 347-357, 1998.
[22
] F. Patolsky, A. Lichtenstein, I. Willner, Amplified microgravimetric quartz-crystal-
microbalance assay of DNA using oligonucleotide-functionalized liposomes or biotinylated
liposomes, J. Am. Chem. Soc, 122(2000)418.
[23
] A. Gole, P. Chaudhari, J. Kaur, M. Sastry, rotein-Friendly Intercalation of Cytochrome c and
Hemoglobin into Thermally Evaporated Anionic and Cationic Lipid Films: A New Approach
Based on Diffusion from Solution, Langmuir, 17( 2001)5646.
[24
] T. Zhou, K. A. Marx, A. Warren, H. Schulze, S. J. Brauhut, The Quartz Crystal Microbalance
as a Continuous Monitoring Tool for the Study of Endothelial Cell Surface Attachment and
Growth Biotechnol. Prog, 16 (2000)268.
[25
] S.A. Bassam, A.S. Ahmad, A piezoelectric immunosensor for the detection of cocaine.
Microchem. J. 54(1996)1747–1749
[26
] E.L. Florin, V.T. Moy et H.E. Gaub, Adhesion forces between individual ligand receptor pairs,
Science, 2264 (1994) 415.
Etat de l’art
Chapitre I
47
[27
] M. Rief, H. Clausen- Schaumann, et H.E. Gaub, Sequence-dependent mecahanics of single
DNA molecules, Nat Struct Bioll, 6(1999) 364-369
[28
] O.H. Willemsen, M.M . Snel A. Cambi, J. Greve , B. De Grooth, and C.G. Figdor,
Biomelecular interactions measured by atomic force microscopiy, Biophys J 79 ,(2000), 3267.
[29
] M. Benoit, D.Gabriel, G. Gerich, and H.E. Gaub, Discrete interactions in cell adhesion
measured by single molecule force spectroscopy, Nat. Cell Biol 2 (2000) 313-317.
[30
] R.P. Richter and A. Brisson , QCM-D on mica for parallel QCM-D-AFM studies, Langmuir
20 (2004) 4609.
[31
] K.M. Hassen et T. Thundat, microcantilever biosensors, Methods, 37(2005) 57.
[32
] M. MEHRVAR, M. ABDI, Recent developments, characteristics, and potential applications of
electrochemical biosensors, Analytical Sciences, 20(2004)1113 - 1126.
[33
] N. Jaffrezic-Renault, A. Senillou, C. Martelet, K. Wan, J. M. Chovelon. Sensors and Actuators
B, 59(1999) 154.
[34
] Z. E. Selvanayagam, P. Neuzil, P. Gopalakrishnakone, U. Sridhar, M. Singh, L. C. Ho.
Biosensors and Bioelectronics, 17(2002) 821.
[35
] P. Estrela, A.G. Stewart, F. Yan and P. Migliorato. Electrochimica Acta, 50(2005) 4995.
[36
] G.A. Zhylyak, S. V. Dzyadevych, Y.I. Korpan, A.P. Soldakin, A.V. Elskaya, Application of
urease conductimetric biosensors for heavy metal ion determination, Sens. Actuators B, (1995)
145.
[37
] I. Hafaiedh, S. Helali, K. Cherif, A. Abdelghani, G. Tournier, Characterization of tin dioxide
film for chemical vapors sensor, Materials Science and Engineering: C, 28(2008)584.
[38
] S. Helali, A. Abdelghani, I. Hafaiedh, C. Martelet, M.I. Prodromidis, T. Albanis, N. Jaffrezic-
Renault, Functionalization of niobium electrodes for the construction of impedimetric
biosensors, Mat. Sci. Engineer. C, 28 (2008) 826.
[39
] Y. Tan, X. Chu, G. L. Shen, R.Q.Yu, A signal-amplified electrochemical immunosensor for
aflatoxin B1 determination in rice Analytical Biochemistry, 387( 2009) 82.
[40
] N. Haddour, S. Cosnier, Ch.Gondran, Electrogeneration of a Poly(pyrrole)-NTA Chelator
Film for a Reversible Oriented Immobilization of Histidine-Tagged Proteins , Journal of
American Chemical Society 127 (2005) 5752.
Etat de l’art
Chapitre I
48
[41
] A.P.F.Turner, I. Karube, G.S. Wilson, (Eds.), Biosensors, fundamentals and applications.
Oxford University Press, Oxford (1987).
[42
] G.G.Guilbault, Handbook of immobilized enzymes. Marcel Dekker, New York,( 1984).
[43
] L.J Blum, P.R. Coulet, (Eds.), Biosensor principles and applications, Marcel Dekker, New
York(1991).
[44
] Y.G. Li, Y.X. Zhou, J.L. Feng, Z. H. Jiang, L.R. Ma, immobilization of enzyme on screen
prented electrode by exposure to glutaradehyde for the construction of amperometric
acetylcholinesterase electrodes. Analytica Chimica Acta , 382(1999)277.
[45
] H.H. Weetall, immobilized enzymes: Analitical application, Anal chem. 46 (1974) 602-615.
[46
] Nobel Foundation. "For the discovery and development of conductive polymers".
http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2000/.The Nobel Prize in Chemistry
2000.
[47
] H. Shirakawa , E. J. louis, A. G. MacDiarmid , C. K. Chiang et A. J. Heeger, synthesys of
electrically conducting organic polymer, Halogene derivatives of polyacetylene, (Ch)x., J.
Chem. Soc., Chem. Commun., (1977) 577.
[48
] H. Stubb, E. Punkka , J. Paloheimo, Electronic and optical properties of conducting polymer
thin films, Materials Science Reports 10 (1993) 85.
[49
] P.Audebert, G.Bidan, Polyhalopyrroles: Electrochemical synthesis and some characteristics, J.
Electroanal. Chem. 190 (1985) 129.
[50
] K.S.V Santhanam, N. Gupta, Conducting-polymer electrodes in batteries. TRIP 1, (1993)284.
[51
] B.Zinger, L.L Miller, Timed release of chemicals from polypyrrole films. J. Am. Chem. Soc.
106(1984)6861.
[52
] N. Angelova and D. Hunkeler Rationalizing the design of polymeric biomaterials, Trends
Biotechnol, 17(1999) 4091.
[53
] A. Ramanavicius , A. Ramanaviciene , A. Malinauskas , Electrochemical sensors based on
conducting polymer-polypyrrole, Electrochimica Acta 51 (2006) 6025.
[54
] H. Ben Fredj, S. Helali, C. Esseghaier, L. Vonna, L. Vidal, A. Abdelghani, Labeled magnetic
nanoparticles assembly on polypyrrole film for biosensor applications, Talanta, 75( 2008) 740.
[55
] H. Peng, L. Zhang, C. Soeller, J. Travas-Sejdic, Conducting polymers for electrochemical
DNA sensing, Biomaterials, 30 ( 2009) 2132.
Etat de l’art
Chapitre I
49
[56
] A. Ramanavicius, K. Habermüller, E. Csöregi, V. Laurinavičius , W. Schuhmann, Polypyrrole
entrapped quinohemoprotein alcohol dehydrogenase. evidence for direct electron transfer via
conducting polymer chains,Analytical Chemistry 71 (1999) 3581.
[57
] M. Gerard, A. Chaubey and B.D Malhotra, Application of conducting polymers to biosensors,
Biosenors Bioelectron 17 (2002) 345.
[58
] W. Khan, M. Kapoor and N. Kumar, Protein Attached Active Polypyrrole Coating for
Improved Biocompatibility of Metallic Surfaces, Acta Biomaterialia 3 (2007) 541.
[59
] U. Lange, N. V. Roznyatovskaya and V. M. Mirsky, Conducting polymers in chemical sensors
and arrays, Analytica chimica acta 614 (2008)1.
[60
] O. Ouerghi, A. Senillou, N. Jaffrezic-Renault, C. Martelet, H. Ben Ouada and S. Cosnier ,
Gold electrode functionalized by electropolymerization of a cyano N-substituted pyrrole:
application to an impedimetric immunosensor, J. Electroanal Chem 501(2001) 62.
[61
] N. K. Guimarda, N. Gomez and Ch. E. Schmidt, Conducting polymers in biomedical
engineering, Prog. Polym. Sci. 32 (2007) 876.
[62
] Chiheb Esseghaier, Saloua Helali, Heikel Ben Fredj, Asma Tlili, Adnane Abdelghani,
Polypyrrole–neutravidin layer for impedimetric biosensor, Sensors and Actuators B 131 (2008)
584.
[63
] A. Ramanaviciene, A. Kausaite, S.Tautkus and A. Ramanavicius, Biocompatibility of
polypyrrole particles: an in vivo study in mice, Journal of Pharmacy and Pharmacology 59
(2007) 311.
[64
] A. Sargent, O. A. Sadic, Monitoring antibody–antigen reactions at conducting polymer-based
immunosensors using impedance spectroscopy, Electrochemica Acta 44 (1999) 4667-4675.
[65
] C.M. Niemeyer Nanoparticles, proteins, and nucleic acids: biotechnology meets materials
science. Angew Chem Int Ed;40 (2001) 4128.
[66
] C.P. Poole, F.J. Owens. Introduction to Nanotechnology. Hoboken: Wiley-Interscience, 2003.
[67
] A.L. Crumbliss, S.C. Perine, J. Stonehuerner, K.R. Tubergen, J. Zhao, R.W. Henkens, J.P.
O‟Daly, Colloidal Gold As a Biocompatible Immobilization Matrix Suitable for the fabrication
of Enzyme Electrodes by Electrodeposition, Biotechnol. Bioeng. 40 (1992) 483.
[68
] Rita Maalouf, Conception, élaboration et caractérisation de biocapteur pour la détection de
neurotransmetteurs et bactéries dans les milieux physiologiques, thèse déposée en septembre
2006.
Principes Physiques
Chapitre II
Principes Physiques
Chapitre II
51
I. Introduction
Ce chapitre a pour but de présenter le principe physique des différentes techniques
expérimentales utilisées pour le développement des différents biocapteurs étudiés dans le cadre de
cette thèse.
Dans un premier temps, nous présentons les techniques électrochimiques telles que la
spectroscopie d‟impédance, la voltammétrie cyclique et la chronoampérométrie, ainsi que la
technique optique, la résonance plasmonique de surface de manière à souligner leur intérêt dans le
développement de biocapteurs. Nous présentons également les techniques d‟analyse chimique et de
topographie de surface utilisées tels que la spectroscopie infrarouge et la microscopie à force
atomique afin de permettre l‟obtention d‟informations souvent complémentaires nécessaires pour
l‟interprétation des résultats obtenus par les techniques de caractérisations électrochimiques et
optiques.
Dans un deuxième temps, nous décrivons la physique des polymères conducteurs et de l‟auto
assemblage moléculaire.
II. Techniques expérimentales
II.1. Techniques électrochimiques
II.1.1. Spectroscopie d’impédance électrochimique (EIS)
La spectroscopie électrochimique d'impédance (EIS) est une technique fiable et puissante
pour étudier les propriétés électriques des systèmes électrochimiques. Ainsi elle est largement
répandue dans différents champs de recherche tels que la corrosion [69
], la caractérisation des
couches minces, la cinétique d'électrode et les batteries [70
]. Dans la dernière décennie, l‟EIS a pris
une importance croissante dans les domaines des technologies liées à la biophysique et aux
biocapteurs [71
,72
]. Cette popularité est due à son aptitude à fournir un bon nombre d‟informations.
Elle permet une meilleure et plus complète compréhension d'un système électrochimique que les
autres techniques électrochimiques. Dans ce qui suit nous commençons par définir le principe de la
mesure par spectroscopie d‟impédance. Par la suite nous décrivons la théorie du calcul de
l‟impédance en présentant l‟impédance des différents éléments déduits des phénomènes produits à
l‟interface électrode/électrolyte.
Principes Physiques
Chapitre II
52
II.1.1.1. Principe de la spectroscopie d’impédance
La spectroscopie d‟impédance électrochimique est une méthode non stationnaire qui permet
d‟avoir des informations sur les étapes élémentaires qui constituent le processus électrochimique
global. En général, Cette technique repose sur la mesure d‟une fonction de transfert suite à la
perturbation volontaire du système électrochimique étudié. Ce système peut être considéré comme
étant une « boite noire » qui réagit en émettant un signal y(t) quand il est soumis à une perturbation
x(t) (figure II.1). Les deux signaux x(t) et y(t) sont alors reliés par une fonction de transfert H(ω)
telle que Y (ω) =H(ω) * X(ω), X(ω) et Y (ω) étant respectivement les transformées de Fourier de
x(t) et y(t). Avec ω est la pulsation.
Figure II.22 : Schéma d’une fonction de transfert.
Classiquement, la perturbation imposée au potentiel d‟une électrode indicatrice est une
perturbation sinusoïdale de faible amplitude. Le signal appliqué est donc de la forme x(t) = A sin
(ωt) et la réponse du système est y(t) = B sin (ωt + φ) avec une fréquence f, une pulsation ω = 2πf
et un déphasage φ.
En terme d‟impédance, à l‟instant t, le signal d‟excitation est défini par la valeur du potentiel
de l‟électrode qui est exprimée en fonction de sa composante stationnaire E0 et d‟un terme
sinusoïdal :
E(t)=E0 + | E| sin (ωt) Eq.II. 1
Comme on peut l‟écrire en notation complexe :
E(t) = E0 + | E| ej t
Eq.II. 2
Avec, j = 1 , E l'amplitude de tension de la composante alternative et la pulsation du signal.
Dans un système linéaire ou pseudo-linéaire la perturbation sinusoïdale du potentiel induit
un courant sinusoïdal superposé au courant stationnaire et déphasé d‟un angle φ :
Principes Physiques
Chapitre II
53
I(t)=I0 + | I| sin (ωt+ φ ) Eq.II. 3
En notation complexe l‟expression de courant est donnée par :
I(t)=I0 + | I| ej ( t+ φ)
Eq.II. 4
Les systèmes électrochimiques étudiés n‟étant généralement ni linéaires, ni stables dans le
temps, un certain nombre de précautions s‟imposent. Il faut s‟assurer que le système reste « quasi
stable » sur toute la durée de la mesure, et que l‟amplitude de la sinusoïde soit suffisamment faible
pour que la fonction I = f(E) soit linéaire dans le domaine perturbé (Figure II.2).
Figure II.23 : Principe de l’analyse en petits signaux d’un système électrochimique non linéaire
soumis à une perturbation sinusoïdale.
II.1.1.2. Théorie du calcul de l’impédance
Définition de l’impédance
Dans le cas général, l‟impédance d‟un circuit constitué des résistances, capacités,
inductances est définie comme étant le rapport de la tension appliquée à l‟intensité du courant qui le
traverse. L‟impédance est calculée à partir des impédances des éléments constitutifs du circuit.
Principes Physiques
Chapitre II
54
Cette impédance est une grandeur complexe que l‟on exprime en Ohms ( ), et que l‟on peut écrire,
pour une fréquence donnée, sous la forme d‟une fonction de transfert:
E wZ
I w
Eq.II. 5
Avec E(ω) et I (ω) étant respectivement les transformées de Fourier de E(t) et I(t).
Après réarrangement mathématique cette fonction devient :
Δ(cos sin )
Δ
j| E | Z j Z e
| I |
Eq.II. 6
Dans le plan complexe l‟impédance représente un vecteur, caractérisé par le module |Z| et
l‟angle de déphasage φ (figure II.3). On peut aussi l‟écrire comme une somme vectorielle d‟une
partie réelle et d‟une partie imaginaire :
Re ImZ Z jZ
Eq.II. 7
Le module de l‟impédance Z , peut être exprimé comme suit :
2 2
Re ImZ Z Z
Eq.II. 8
La phase de l'impédance est définie par:
Im
Re
Zarctg
Z
Eq.II. 9
Figure II.24 : Schéma représentatif de l’impédance en coordonnées cartésiennes et polaires.
Principes Physiques
Chapitre II
55
Représentation graphique de l’impédance
Les données d'impédance sont typiquement représentées suivant deux types de
représentations: le diagramme de Bode et le diagramme de Nyquist .
a. Diagramme de Bode
Dans le diagramme de Bode, le logarithme du module Z et le déphasage de
l'impédance sont tracés en fonction du logarithme de la fréquence
log = f1 (logf) Eq.II. 10
φ = f2 (log f) Eq.II. 11
b. Diagramme de Nyquist
Le diagramme de Nyquist, est une représentation graphique dans un plan complexe; l'axe
des abscisses d'un système de coordonnées cartésiennes correspond à la partie réelle de l'impédance
Z(ω), alors que l'axe des ordonnées correspond à sa partie imaginaire. Cette dernière représentation
ne fournit qu‟une seule courbe, il est indispensable de repérer les fréquences auxquelles les points
représentés correspondent.
Les spectres d‟impédance obtenus pour n‟importe quelle interface, peuvent être modélisés
par un circuit électrique équivalent. Les paramètres du modèle peuvent être obtenus en ajustant la
courbe expérimentale avec la courbe théorique.
Des exemples de diagrammes seront illustrés ultérieurement.
Exemples d’impédance de composants électriques et électrochimiques
a. Elément résistif R
Pour une résistance R l‟impédance Z est un réel. Elle est indépendante de la fréquence. Ceci
est traduit par une proportionnalité entre E(t) et I(t) à chaque instant, donc, dans le diagramme de
Fresnel (tableau II.1) E(t) et I(t) sont en phase, c'est-à-dire que φ= 0. L‟impédance d‟une résistance
est donnée par l‟équation suivante :
Principes Physiques
Chapitre II
56
ZR=R Eq.II. 12
Sa représentation graphique dans le plan de Nyquist est un point sur l‟axe des réels (Tableau II.1).
b. Elément capacitif C
Pour un élément capacitif, l‟impédance est donnée par l‟expression suivante:
C
jZ
Eq.II. 13
La représentation du courant et de la tension dans l‟espace de Fresnel montre que ces
signaux sont en quadrature de phase ( ).
Le graphe d‟impédance dans le plan de Nyquist est une droite verticale coupant l‟axe des
réels à une valeur nulle aux hautes fréquences et tend vers l‟infini aux basses fréquences.
c. Elément inductif L
L‟impédance d‟une inductance est :
Z(ω) = jL ω Eq.II. 14
Le graphe d‟impédance dans le plan de Nyquist est une droite verticale coupant l‟axe des
réels à une valeur nulle aux basses fréquences et tend vers l‟infini aux hautes fréquences.
2
Principes Physiques
Chapitre II
57
Table II.3 : Tableau récapitulatif de l’impédance des composants électriques élémentaires (u(t) présente la tension
au borne de l’élément électrique).
d. Elément de phase constante (CPE)
Pour représenter certains phénomènes électrochimiques, l‟impédance est nommée élément à
phase constante (en anglais : CPE : Constant Phase Element) [73
]. L‟expression de cette impédance
est donnée sous la forme suivante :
nCPEjwQ
Z)(
1
Eq.II. 15
La signification physique de Q et de n n‟est pas toujours claire, mais l‟analyse de cette
impédance dans le plan de Nyquist montre que lorsque n passe de 0 à 1, l‟impédance passe d‟une
résistance pure (n=0) à une capacité pure (n=1) et dans le cas particulier où n est égal à 0,5, nous
avons une impédance particulière appelée impédance de Warburg.
II.1.1.3. Impédance de différents phénomènes électrochimiques
La spectroscopie d‟impédance électrochimique permet d‟étudier les paramètres électriques
de l'interface métal/électrolyte. Le système électrochimique utilisé est une cellule à trois électrodes :
une électrode indicatrice, une électrode de référence et une électrode auxiliaires
Principes Physiques
Chapitre II
58
II.1.1.3.1. Résistance de la solution
Du coté de l‟électrode, le potentiel est constant en tout point de la surface. Par contre, dans
la solution, il se crée une variation de potentiel et de courant dans l‟électrolyte, qui conduit au
concept de chute ohmique. En SIE (à définir), l‟électrode de référence et la contre-électrode sont
placées relativement loin de la surface de l‟électrode de travail. A haute fréquence, la répartition des
courants secondaires peut donc être négligée. La chute ohmique est alors classiquement décrite
comme étant la résistance de la solution et des contacts électriques Rs [74
]. L‟impédance de la chute
ohmique est :
Z Rs(ω) = Rs Eq.II. 16
II.1.1.3.2. Capacité double couche
Un phénomène observé à l‟interface électrode/électrolyte est la formation d‟une double
couche d‟ions [75
]. L‟application d‟une perturbation sinusoïdale lors de la mesure d‟impédance
entraine la charge et la décharge de cette couche qui se comporte, selon le modèle de Stern [76
],
comme un condensateur électrique. La réponse de cette double couche génère un courant Idc qui
dépend de la fréquence de perturbation et de la variation de charge interfaciale. Ce type de
processus peut être généralisé à tous les phénomènes qui entraînent la charge et la décharge de deux
zones séparées par un diélectrique. L‟impédance d‟un condensateur de capacité C est donnée par
l‟équation :
wjCwZ
dl
Cdl
1)( , avec
e
ACdl 0
Eq.II. 17
Où Cdl est la capacité de la double couche, ε la permittivité relative du diélectrique, ε0 la
permittivité diélectrique du vide, A l‟aire de réaction électrochimique à l‟électrode de travail et e
l‟épaisseur du diélectrique.
II.1.1.3.3. Resistance de transfert de charge
La résistance de transfert de charge est due à un processus faradique, qui est défini par les
transferts d'électrons à travers l'interface électrode de travail/solution. Ce transfert électronique
provoque une réaction d‟oxydation ou de réduction d‟espèces à la surface de l‟électrode. En
considérant l‟équation suivante :
Principes Physiques
Chapitre II
59
dneOxf
b
k
KRe
Eq.II. 18
Dans ce cas la cinétique de réaction est limitée uniquement par le transfert de charge. La
contribution faradique au courant mesuré est indépendante de la fréquence et n‟influe que sur
l‟amplitude de la réponse du système. Cette résistance Rct est définie comme la dérivée partielle de
la densité du courant faradique (IF) par rapport au potentiel ( E ).
0
)(nFI
RT
E
IRwZ F
ctRch
Eq.II. 19
Où R est la constante des gaz parfait, T la température, n le nombre d‟électrons transférés, F
la constate de Faraday et I0 la densité de courant d‟échange au potentiel d‟équilibre (c'est-à-dire le
potentiel auquel la vitesse de diffusion de l‟espèce réduite est égal à la vitesse de diffusion de
l‟espèce oxydée) qui est reliée directement à la constante cinétique de transfert d‟électron 0k selon
la relation suivante :
0
00 knFACI
Eq.II. 20
A est la surface active de l‟électrode et 0C la concentration du couple redox en solution.
II.1.1.3.4. Impédance de Warburg
L'impédance de Warburg est l'impédance résultant de la diffusion d'une espèce de la solution
à l'électrode. C‟est le premier élément électrochimique qui a été présenté dans la description de
l'impédance de la diffusion semi-infinie. Cette impédance dépend de la fréquence de la
perturbation, du potentiel appliqué et de la concentration des espèces qui diffusent. L‟expression de
l‟impédance de Warburg est donnée par l‟expression suivante [77
] :
0.51WZ j
Eq.II. 21
Avec coefficient de Warburg.
Principes Physiques
Chapitre II
60
II.1.1.4. Etude de l’impédance pour un système électrochimique
De façon générale, vis-à-vis d'une faible excitation sinusoïdale, une cellule électrochimique
équivaut simplement à une impédance qui peut être représentée par un circuit électrique équivalent
selon le type du système (système faradique ou système non faradique).
Prenons comme exemple le circuit électrique équivalent le plus souvent utilisé pour les
systèmes électrochimiques, le circuit de Randles [78
]. Il se compose généralement de quatre
éléments : une résistance représentant la résistance due à la chute ohmique, Rs, un condensateur
représentant la capacité de double couche, Cdl, une résistance de transfert de charge, Rct, et
l‟impédance de Warburg, Z ω, représentant le phénomène de diffusion des espèces redox. La forme
générale du circuit équivalent est présentée sur la figure II.4.
Figure II.25: Circuit équivalent de Randles.
L'impédance totale Z de ce circuit a pour expression générale :
Eq.II. 22
Avec
Aux hautes fréquences, l'impédance de Warburg est négligeable, alors tend vers . Par
conséquent, le circuit équivalent est une combinaison parallèle de la résistance de transfert de
charge Rct et de la capacité de double couche Cdl en série avec la résistance correspondant à la chute
ohmique Rs. Avec un simple calcul l‟impédance équivalente est donnée par l‟expression suivante :
2
Re Im 2 2( ) (w) (w)
1 1 1
ct ct dl ctS S
ct dl ct dl ct dl
R R C RZ w Z jZ R R j
j R C R C R C
Eq.II. 23
Principes Physiques
Chapitre II
61
Aux basses fréquences, le système est commandé par des processus de diffusion, ce qui
signifie que l'impédance de Warburg est prédominante. Les expressions correspondantes de
l'impédance sont montrées dans les équations suivantes :
5,0
Re (w) ctS RRZ Eq.II. 24
Et
dlCZ 25,0
Im 2(w) Eq.II. 25
II.1.1.4.1. Présentation du diagramme de Bode
Dans le diagramme de Bode nous définissons le module de l‟impédance |)(|_
wZ et la phase
de l‟impédance (w) successivement pour les hautes fréquences et les faibles fréquences:
Aux hautes fréquences :
12 2 221_
2 2 2Re Im 2 2
| ( ) | (w) (w)1 ( ) 1 ( )
ct ct dls
ct dl ct dl
R R C wZ w Z Z R
R C w R C w
Eq.II. 26
2
2 2
Im
2
Re2
1 ( )(w)
(w) (1 ( ) )
1 ( )
ct dl
ct dl ct dl
ct s ct dl cts
ct dl
R C w
R C w R C wZarctg arctg arctg
RZ R R C w RR
R C w
Eq.II. 27
Aux faibles fréquences :
11_ 2 2 22 2 0,5 0,5 22
Re Im| | (w) (w) 2S ct dlZ Z Z R R C
Eq.II. 28
0,5 2
Im
0,5
Re
2(w)
(w)
dl
S ct
CZarctg arctg
Z R R
Eq.II. 29
Dans le diagramme de Bode, le logarithme du module Z et le déphasage de
l'impédance sont tracés en fonction du logarithme de la pulsation ou la fréquence (figure II.5).
Principes Physiques
Chapitre II
62
Figure II.26: Diagramme de Bode pour un système faradique.
II.1.1.4.2. Présentation du diagramme de Nyquist
Aux hautes fréquences nous écrivons l‟expression de l‟équation Eq II.22 sous la forme
suivante :
2 22
Re Im(w) (w)2 2
ct ctS
R RZ R Z
Eq.II. 30
C‟est l'équation d'un arc de cercle avec un rayon de 2
ctR et les intersection de cette équation
sur l'axe des abscisses sont à ,0SR et ,0S ctR R , suivant les indications de la figure II.6.
Aux faibles fréquences nous pouvons déduire une relation entre Z Im ( ) et Z Re ( ) qui
correspondent à l‟équation Eq.27:
dlCTS CRRZZ 2
ReIm 2(w)(w)
Eq.II. 31
Cette équation est l‟équation d‟une droite de pente -1 donc nous pouvons dire que c‟est une
droite inclinée à 45° par rapport à l‟axe des abscisses, et l‟intersection de cette droite avec l‟axe des
abscisses est à 22 ,0S ct dlR R C (figure 6).
Principes Physiques
Chapitre II
63
Figure II.27 : Diagramme de Nyquist pour un système faradique
II.1.2. La Voltamètrie cyclique
La voltammétrie est une technique électrochimique stationnaire couramment employée pour
le contrôle des processus qui se produisent sur une surface d‟un métal utilisé en tant qu'électrode de
travail. Cette technique est souvent utilisée pour étudier le comportement des espèces en solution
(système rapide, réversible, nombre d‟électrons échangés…) et pour avoir des renseignements quant
aux processus qui ont lieu à la surface de l‟électrode (adsorption, passivation…).
II.1.2.1. Principe
La voltampérométrie consiste à appliquer une différence de potentiel variable, deux
balayages linéaires (« aller »/« retour ») du potentiel en fonction du temps, entre une électrode de
référence et une électrode indicatrice, au contact de laquelle va se produire une réaction d‟oxydo
réduction ( Ox + ne ↔ Red). La réponse du système est l‟enregistrement du courant, en fonction de
la tension appliquée. Cette réponse se présente sous la forme de la courbe I = f (E), appelé
voltammograme, qui est une caractéristique de l‟espèce électroactive (figure II.7).
Principes Physiques
Chapitre II
64
Figure II.28 : Voltampérométrie cyclique. (a): forme du potentiel imposé (E =
f(t)), (b): réponse en courant I = f(E).
Pour un système réversible, lors du balayage « aller », on observe sur le voltampérogramme
une croissance du courant situé entre le nanoampère et le microampère. Pendant cette période, une
réaction de réduction (Red→ Ox + ne) commence à se produire, correspondant à l‟accélération du
processus par accroissement du potentiel. Suite à cette croissance, le maximum du pic d‟oxydation
(Epa) indique l‟intensité du courant anodique pour l‟espèce étudiée sur une électrode donnée. Puis
une décroissance lorsque le ralentissement dû au phénomène de diffusion l‟emporte.
Le balayage retour apporte des informations quant à la réversibilité de la réaction
électrochimique par la position et l‟intensité des courants faradiques enregistrés. Le tracé présentera
un second pic (de réduction) indiquant l‟intensité du courant cathodique issu de la réduction de
l‟espèce oxydée produite à l‟aller et encore présente dans la couche de diffusion.
Ces systèmes, qualifiés de réversibles, répondent en tout point du voltampérogramme à la
relation de Nernst (Eq. II.32).
Eq.II. 32
Principes Physiques
Chapitre II
65
E0 étant le potentiel standard du couple rédox, R la constante des gaz (8.314 J.K-1
.mol-1
), T la
température exprimée en Kelvin, n le nombre d‟électrons échangés, et F la constante de Faraday
(96487 coulombs).
II.1.3. Chronoampérométrie
La chronoampérométrie, appelée ampérométrie transitoire à potentiel constant, est une
technique électrochimique découverte pour la première fois en 1985 par Ledion[79
]. Il a étudié la
réduction électrochimique de l‟oxygène dans l‟eau par la polarisation d‟une électrode métallique
avec un potentiel négatif. De nos jours, cette technique présente un intérêt principalement dans le
cas de processus complexes avec formation d‟une phase solide. Elle trouve donc son application
dans l‟étude de la formation électrochimique de dépôts métalliques ou polymériques. Cette méthode
permet alors de mettre clairement en évidence les phénomènes transitoires de nucléation, puis de
croissance cristalline et de les caractériser quantitativement
II.1.3.1. Principe de la chronoampérométrie
Le principe de la chronoampérométrie consiste à imposer à une électrode indicatrice un saut
de potentiel à partir du potentiel d‟équilibre Eref (correspondant à un courant nul) jusqu‟à une valeur
fixe Eapp, à laquelle s‟effectue la réaction à l‟électrode, et à mesurer en fonction du temps le courant
ainsi que la quantité de charge qui traverse l‟interface. La figure II.8 présente la programmation du
potentiel au cours du temps, et les réponses en courant qui en résultent.
Principes Physiques
Chapitre II
66
Figure II.29: (A) Programmation du potentiel au cours du temps,(B) la
réponse en courant du système.
Dans notre travail, cette méthode a été utilisée pour l‟électropolymérisation du polypyrrole
de même que pour le contrôle de la quantité de charge échangée lors de la formation du film de
polymère. Elle a également permis de suivre l‟évolution du film de polymère déposé sur une
électrode de travail en fonction du temps.
II.2. Techniques optiques
II.2.1. Résonance plasmonique de surface (SPR)
La Résonance de Plasmons de Surface (SPR) est une technique optique exploitant les ondes
électromagnétiques de surface pour sonder les variations de masse, d‟indice de réfraction, et
d‟épaisseur survenant à l‟interface entre un métal et un diélectrique. Dans les paragraphes suivants,
après un bref aperçu historique, nous dériverons les propriétés de l‟onde électromagnétique de
surface (les plasmons de surface), ainsi que ses applications.
II.2.1.1. Historique
La Résonance de Plasmons de Surface est un phénomène optique découvert pour la
première fois en 1902 par R.W. Wood [80
]. L‟interprétation théorique de ce phénomène a été
Principes Physiques
Chapitre II
67
donnée en 1941 par U. Fano [81
]. Dès 1960, C.J. Powell et J.B. Swan apportent les preuves
expérimentales du phénomène, en bombardant une surface métallique par un faisceau d‟électrons
[82
]. En 1968 Otto [83
] puis Kretschmann et Raether [84
] ont mis aux point deux configurations
différentes pour exciter les plasmons de surface en utilisant la réflexion totale atténuée.
Suite à ces travaux, la résonance de plasmons de surface a été étudiée sous tous ses aspects
et a fait l‟objet de nombreuses recherches et publications, telles que l‟analyse des propriétés de la
phase de l‟onde plasmon [85
], l‟amélioration de la résolution en employant la spectroscopie par
résonance des plasmons de surface [86
], la propagation de l‟onde plasmon dans des couches
métalliques microscopiques [87
] et plus récemment l‟élaboration de capteurs basés sur la résonance
de plasmons de surface à l‟interface entre un métal et un milieu diélectrique absorbant [88
].
Le domaine d‟application de cette technique est large et très diversifié. Il s‟étend de la
détermination des indices et des épaisseurs des couches minces métalliques et organiques [89
,90
] à
son utilisation comme principe de base pour capteur chimique [91
] et un capteur biologique capable
de suivre des interactions entre enzymes et substrat [92
], des interactions antigènes/anticorps [93
],
des interactions ADN/protéines [94
]…
II.2.1.2. Définition
Lorsque nous sommes en présence d‟un métal contenant de nombreux électrons libres, son
comportement peut être assimilé à un nuage d‟électrons. Pour une certaine fréquence dite de
plasmaωp, le métal est le siège d‟une oscillation collective des électrons et une onde longitudinale
dite de plasmon prend naissance. Dans le cas d‟une interface métal / diélectrique (comme l‟air,
l‟eau), c‟est le nuage d‟électrons présent à cette interface qui peut être mis en oscillation et on parle
alors de plasmon de surface. Lorsqu‟il est excité par le biais d‟un faisceau lumineux, le plasmon
de surface s‟accompagne par un champ électromagnétique et représente une fluctuation de la
densité de charge dans le temps et dans l‟espace. Donc ce plasmon de surface se manifeste par une
grande intensité lumineuse au niveau de l‟interface, on parle alors de la résonance de plasmon de
surface. L‟onde résultante de ce phénomène est une onde évanescente, dont l‟amplitude diminue
exponentiellement dans la direction perpendiculaire de part et d‟autre de l‟interface (figure II.9).
Principes Physiques
Chapitre II
68
Figure 30: Représentation des ondes évanescentes à l’interface
diélectrique/métal : (A) Champ électromagnétique du plasmon de
surface, (B) Amplitude du champ électique du plasmon de surface
II.2.1.3. Physique du plasmon de surface
En optique classique les équations de Maxwell permettent de décrire la propagation des
ondes électromagnétiques dans le vide. Dans la matière, il faut rajouter les interactions entre les
photons et les particules chargées (principalement les électrons), grâce à une permittivité
diélectrique (ou constante diélectrique) ε qui caractérise, en fait, les propriétés électromagnétiques
macroscopiques du matériau.
Dans le cas des métaux, seuls les électrons libres en surface « voient » les photons incidents.
En effet, les ondes électromagnétiques ne se propagent pas dans le métal. Les électrons libres de
surface interagissent donc avec les photons dont la longueur d‟onde se situe dans le domaine
visible, infrarouge et micro-onde.
Lorsqu‟on excite un plasmon de surface, c‟est-à-dire un état couplé entre les photons et les
électrons de surface (entre lumière et plasmon), par une onde polarisée avec une polarisation
transverse magnétique TM encore notée-p [95
], l‟oscillation longitudinale des électrons prés de la
surface est couplée à une onde électromagnétique évanescente qui se propage le long de la surface
métallique. Cette onde est une solution des équations de Maxwell. Donc, à une pulsation ω0= k0c
donnée, l‟amplitude du champ magnétique est de la forme :
Eq.II. 33
Principes Physiques
Chapitre II
69
Où le vecteur d‟onde du plasmon kps dans la direction de propagation x est donné par la
formule suivante :
Eq.II. 34
Avec : εm est la permittivité diélectrique du métal (ou constante diélectrique du métal).
εd est la permittivité diélectrique du diélectrique considéré.
k0 est le vecteur d‟onde de la lumière dans l‟air :
Eq.II. 35
λ est la longueur d‟onde de la lumière:
À partir de ce vecteur d‟onde on en déduit la relation de dispersion ω = f (kx) (figure II.10):
Figure II.31: Relation de dispersion des plasmons de surface.
La figure II.10 montre que la courbe de dispersion des plasmons de surface se situe toujours
« à droite » de la courbe dite ligne de lumière à laquelle correspond la relation de propagation de la
lumière dans le vide k= ωc.
Nous remarquons que la relation de dispersion des plasmons de surface reste toujours
strictement en-dessous de la ligne de lumière. Cette absence d‟intersection entre la ligne de lumière
et la courbe de dispersion des plasmons de surface (SP) interdit tout couplage ou résonance entre
une onde électromagnétique du domaine visible en particulier, et un mode de propagation des
Principes Physiques
Chapitre II
70
plasmons de surface. En d‟autre terme, il est impossible d‟exciter les SP en éclairant directement le
métal avec une source de lumière, car l‟accord de phase ne peut pas être réalisé sans système
particulier de couplage comme nous allons le montrer.
II.2.1.4. Application du plasmon de surface
En pratique, des configurations existent pour mettre en évidence la résonance de plasmons
de surface. L‟idée vient du fait que générer une onde plasmon revient à faire interagir un faisceau
lumineux incident avec les ondes électromagnétiques de surface. Ceci est possible quand la
composante longitudinale du vecteur d‟onde incident (kx= ω/c sin ϴ ,)(avecϴ est l‟angle
d‟incidence et diélectrique du prisme) est égale au vecteur d‟onde correspondant à l‟onde
plasmon ( Kps donné par Eq.II.33 ). Or, kx est inférieur à Kps, donc, les plasmons de surface ne
peuvent pas être excités par une lumière directement incidente sur une surface métallique non
rugueuse. Pour observer les ondes plasmons, il faut réaliser l‟égalité kx= Kps en augmentant la
valeur de kx. Ce but peut être atteint en faisant passer la lumière incidente à travers un milieu
d‟indice de réfraction supérieur à celui du milieu diélectrique siège des ondes plasmons. En se
basant sur ce principe, A. Otto et E. Krestschmann proposent d‟exciter les plasmons en éclairant
l‟interface métal/diélectrique à travers un prisme (figure II.11) [96
,97
].
Figure II.32 : Configuration de Krestschmann-Reather (a) et de Otto (b).
Dans notre cas, nous nous intéressons à la configuration de Kretschmann (cf. Figure II.12)
qui est la structure la plus employée pour l‟application des biocapteurs optiques à plasmon de
surface.
Principes Physiques
Chapitre II
71
Figure II.33: principe de la configuration de Krestschmann.
Dans cette configuration une couche mince d‟or est fixée à la base d‟un prisme d‟indice np.
Une onde électromagnétique incidente polarisée TM (Transverse Magnétique) traverse le prisme,
éclaire sa base métallisée où il subit une réflexion totale. La composante longitudinale du vecteur
d‟onde de la lumière incidente est ainsi amplifiée et vaut kx = ω/c np sin(ϴ) où np est l‟indice du
prisme ( ), ω la fréquence angulaire de l‟onde incidente, c la célérité de la lumière et
ϴ l‟angle d‟incidence interne (Figure II.12). Quand l‟angle d‟incidence interne vérifie la condition
d‟accord de phase traduite par l‟équation suivante:
Eq.II. 36
L‟énergie, transportée par les photons incidents, est transférée aux ondes plasmons. Ce
transfert entraîne une diminution visible de l‟intensité de l‟onde réfléchie. Le rapport des intensités
lumineuses réfléchies et incidentes définit la réflectivité R dont. l‟expression est la suivante :
Eq.II. 37
Avec : et les amplitudes des champs incidents et réfléchis de l‟onde polarisée-TM ;
Γi représente l‟atténuation du plasmon de surface par effet joule;
Γrad caractérise l‟importance du transfert d‟énergie des plasmons aux photons.
Principes Physiques
Chapitre II
72
Pour une longueur d‟onde λ et des constantes diélectriques εp, εm, εd données en enregistrant
la réflectivité en fonction de l‟angle d‟incidence externe θ, nous obtenons une courbe de réflectivité
R=f(θ) (figure II.13). L‟évolution de la réflectivité en fonction de l‟angle d‟incidence présente un
pic d‟absorption à l‟angle θ0 de résonnance. Cet angle où l‟intensité de la réflexion totale est
minimale présente une caractéristique spécifique de l‟état de surface et il est sensible à la variation
de masse, l‟épaisseur, l‟indice de réfraction …
Figure II.34:Courbes de réflectivité en fonction de l’angle d’incidence.
II.3. Technique d’analyse de surface
II.3.1. Spectroscopie Infrarouge FTIR
La Spectroscopie Infrarouge à Transformée de Fourier (ou FTIR : Fourier Transformed
InfraRed Spectroscopy) est l‟un des outils spectroscopiques les plus utilisés pour la caractérisation
de la surface des matériaux. En effet, c‟est une méthode de caractérisation rapide et sensible, elle est
basée sur l'absorption d'un rayonnement infrarouge par le matériau analysé. Elle permet via la
détection des vibrations caractéristiques des liaisons chimiques d'effectuer l'analyse des fonctions
chimiques présentes sur le matériau.
II.3.1.1. Principe
Une molécule peut-être représentée par un ensemble d‟atomes liés entre eux par des liaisons
chimiques. Or, sous l‟action de l‟agitation thermique, les molécules vont être animées de
mouvements de translation, de rotation et de vibrations de leurs liaisons chimiques. Ces vibrations
Principes Physiques
Chapitre II
73
se font à différentes fréquences qui dépendent de la nature des liaisons ainsi que de leur
environnement. De plus il est à noter que la plupart des fréquences de vibrations moléculaires
correspondent au domaine infrarouge du rayonnement électromagnétique. Lorsqu‟on irradie une
molécule par une onde électromagnétique dans le domaine infrarouge, il y aura absorption de l‟onde
incidente à chaque fois que la fréquence de l‟onde incidente est égale à une des fréquences de
vibration de la molécule. Cette fréquence est donnée par la formule suivante (loi de Hook).
)(
2
1
21
21_
mm
mm
C
Eq.II. 38
Avec : _
= nombre d‟onde de la vibration (cm -1
) à définir ; C = vitesse de la lumière (cm sec -1
) ;
f = constante de force de la liaison (dyne cm -1
) ; m1 et m2= masses (g) des atomes liés.
Si on trace un graphe représentant l‟intensité du rayonnement transmis en fonction de la fréquence,
on verra apparaître des bandes d‟absorption aux différentes fréquences de vibration. On obtient
alors un spectre infrarouge dont l‟analyse des bandes d‟absorption permettra de remonter aux
liaisons des molécules présentes.
Cette analyse s'effectue à l'aide d'un spectromètre à transformée de Fourier qui envoie sur
l'échantillon un rayonnement infrarouge et mesure les longueurs d'onde auxquelles le matériau
absorbe et les intensités de l'absorption. La figure II.14 présente le schéma d'un spectromètre IR à
transformée de Fourier.
Principes Physiques
Chapitre II
74
Figure II.35:Schéma de principe spectromètre à transformée de Fourier.
Le signal qui arrive au détecteur apparaît comme un interférogramme , c'est à dire une
signature de l'intensité en fonction de la position du miroir. L'interférogramme est la somme de
toutes les fréquences du faisceau.
Cet interférogramme est ensuite converti en un spectre infrarouge par une opération
mathématique appelée transformée de Fourier. Le spectre infrarouge est donc porteur d‟information
sur la nature des liaisons chimiques caractéristiques du matériau. Il permet d‟identifier des
composés organiques ou inorganiques, de détecter la présence d‟espèces adsorbées ou greffées.
Un spectre infrarouge peut représenter l‟absorbance, A, ou la transmittance, T, de
l‟échantillon en fonction du nombre d‟onde. Ces deux grandeurs sont sans unités. La transmittance
est le rapport de l‟intensité la lumière transmise par l‟échantillon (I) et de l‟intensité incidente reçue
(I0) et on peut déduire l‟absorbance A :
et
Principes Physiques
Chapitre II
75
II.3.2. Microscopie à Force Atomique (AFM)
Le microscope à force atomique (AFM) a été mis au point par Binning, Quate et Gerber en
1986 [98
]. Il permet d‟obtenir une image en détectant les forces d‟interaction apparaissant entre une
pointe fine et une surface lorsqu‟elles sont séparées par une petite distance (<100 nm). Avec cette
technique, on peut directement déterminer la topographie de surfaces isolantes ou conductrices dans
l'espace réel, à l‟échelle de plusieurs dizaines de microns jusqu‟à l‟échelle atomique. Elle permet de
travailler à l‟air, sous vide ou bien en milieu liquide, aucune préparation ou traitement préalable de
l‟échantillon n‟est nécessaire.
Puisque le principe de cette technique est cité dans le chapitre I (paragraphe III.3.2.2. b), alors
nous nous intéressons dans ce chapitre, dans un premier temps à définir la nature des forces
d‟interaction mise en jeu entre la sonde de l'AFM et la surface de l‟échantillon. Dans un second
temps nous présenterons les différents modes de fonctionnement de l‟AFM.
II.3.2.1. Nature des forces d'interaction
La force est définie comme l‟inverse du gradient d'un potentiel:
F = -gradU Eq.II. 39
Dans le cas d‟AFM, supposons l‟interaction pointe-surface représentée par un potentiel V
( ), le cantilever par sa raideur normale k et que nous travaillons en statique. La géométrie est
représentée sur la figure, où h est la distance cantilever-surface et la distance apex de la pointe-
surface.
Figure 36: Géométrie de l’interaction pointe- surface.
L‟énergie du système s‟écrit :
Principes Physiques
Chapitre II
76
Eq.II. 40
k la constante raideur du ressort.
Pour une hauteur h fixée, la condition d‟équilibre est :
Eq.II. 41
Soit la force d‟interaction :
Eq.II. 42
La stabilité impose :
q.II. 43
soit :
Eq.II. 44
Une résolution graphique du problème peut être faite en choisissant une force d‟interaction
de type Lennard-Jones [99
].
Figure II.37:Force entre pointe et échantillon en fonction de leur distance.
II.3.2.2. Forces mises en jeu entre la sonde et la surface d’un échantillon
Les forces mises en jeu entre la sonde de l'AFM et la surface de l'échantillon peuvent être de
diverses natures :
Principes Physiques
Chapitre II
77
Les forces de Van Der Waals, très faibles, résultent d'une interaction de type dipôle-dipôle, lorsque
la distance pointe-surface est de quelques nanomètres.
Les forces coulombiennes, liées principalement à la non-pénétrabilité des nuages électroniques
formés par les électrons de cœur entre 2 atomes. Ces électrons sont ceux des couches internes du
nuage électronique, qui ne sont pas utilisées dans la formation de liaisons covalentes entre atomes.
Les forces capillaires, dix fois plus fortes que les forces de Van Der Waals, elles résultent de la
condensation de molécules d'eau et de la formation d'un ménisque entre la pointe et l'échantillon,
lorsque la distance pointe-surface est inférieure à 20 nm. Sans atmosphère contrôlée, elles sont
dominantes.
Les forces capacitives, de faible amplitude mais de longue portée, apparaissent lorsque les
matériaux de la pointe et de la surface sont de natures différentes, ou lorsqu'on applique une
différence de tension entre la pointe et la surface de l'échantillon
II.3.2.3. Modes de fonctionnement
Pour étudier une surface à l'aide d'un AFM, trois modes d'imagerie sont possibles : le mode
contact, le mode non-contact et le mode contact intermittent (dit tapping).
II.3.2.3.1. mode contact continu
Dans ce mode la pointe est toujours maintenue en contact avec la surface et les forces
agissant entre la pointe et la surface sont à l‟origine de la déflexion du levier. Cette déflexion est
maintenue constante grâce à l‟ajustement de la position en z de l‟échantillon.
II.3.2.3.2. Mode non-contact
Dans ce mode la sonde est excitée par un signal sinusoïdal proche de sa fréquence de
résonance. La sonde se comporte alors comme un oscillateur harmonique (Eq.II.44).
Eq.II. 45
avec Z la position de l'extrémité de la sonde (pointe), (m,k,γ) la masse, la raideur et l'amortissement
de la sonde, et la force d'excitation Fext(piezo) = A0 cos ωt et .
Principes Physiques
Chapitre II
78
La force d'interaction sonde-surface va déplacer la fréquence de résonance, diminuer le
facteur de qualité Q et modifier également la phase. Cette méthode permet de faire un balayage de
la surface sans la modifier car elle sonde la partie attractive du potentiel. Ce mode est
préférablement employé sous des conditions de vide poussé ou à basse température afin que
l'environnement ne perturbe pas la finesse du facteur de qualité.
II.3.2.3.1. Mode intermittent (Tapping)
C'est un mode discret qui réduit le risque de dégradation de la surface à imager. Dans ce
mode, le levier vibre à sa fréquence de résonance. Lorsqu'il s'approche suffisamment près de la
surface, la force d'interaction pointe-échantillon entraine une modification de fréquence, de phase
ou d'amplitude. Le rôle de la contre réaction est donc d'ajuster la distance pointe-échantillon afin de
maintenir constante la valeur de fréquence de résonance, de phase ou d'amplitude. Ce mode
présente l'avantage de pouvoir imager presque tous types de surfaces sans les endommager et aussi
d'être moins usant pour les pointes et donc de prolonger leur durée de vie. Le mode en régulation
d'amplitude est le plus utilisé pour l'imagerie en atmosphère ambiante. Il fonctionne à l'air, en
environnement contrôlé, sous ultravide, en milieu liquide ...
III. Physique des polymères conducteur
III.1. Les polymères conducteurs
Un polymère est une macromolécule, organique ou inorganique, constituée de l'enchaînement
répété d'un même motif, le monomère, relié à ses voisins par des liaisons covalentes. A l‟origine,
les polymères organiques (constitués principalement d'atomes de carbone et d'hydrogène) sont
connus par leur caractère isolant, de ce fait ils sont utilisés comme matière plastique pour isoler les
fils de cuivre des câbles électriques ordinaire. Vers la fin des années 1970, les scientifiques A.J.
Heeger, A.G. Mac Diarmid et H. Shirakawa, ont montré qu‟après certaines modifications, un
plastique peut devenir conducteur d‟électricité. Pour ce faire le polymère doit être conjugué; de plus
il doit être « dopé », ce qui consiste à enlever des électrons (par oxydation) ou à en ajouter (par
réduction). Ces trous ou électrons supplémentaire peuvent se déplacer le long de la chaine polymère
qui devient ainsi conductrice d‟électricité.
Principes Physiques
Chapitre II
79
III.2. Polymère organique conjugué
Le caractère conducteur (ou semi-conducteur) d‟un polymère organique est dû à la présence
d‟un système conjugué, c‟est à dire à l‟alternance de liaisons simples et doubles entre atomes de
carbone, le long de la chaîne. Ces liaisons sont issues de l‟hybridation sp2 des orbitales
moléculaires. De cette hybridation résulte trois orbitales dégénérées sp2 qui occupent le même plan
et une orbitale pz. Les orbitales sp2 sont à l‟origine de la liaison σ qui assume la stabilité de la
molécule. La quatrième orbitale, pz, est perpendiculaire au plan défini par les orbitales sp2. Le
chevauchement des orbitales pz de deux molécules voisines donne lieu à une liaison
supplémentaire. Cette liaison π induit une délocalisation de l‟électron de valence π le long de la
molécule.
Figure II.38: schéma de la structure de la double liaison carbone-carbone par hybridation des
orbitale moléculaires.
Les liaisons simples (type σ) assurent la cohésion du squelette du polymère, car elles sont
très stables. Par conséquent, les électrons ne peuvent guère se déplacer. Par contre, les doubles
liaisons (type π) permettent le transfert d‟électrons le long de la chaine de polymère sous l‟effet
d‟un champ électrique extérieur ce qui induit un dipôle électronique Ce mécanisme permet alors
aux molécules conjuguées d‟interagir entre elles et les amène à s‟arranger plus ou moins
régulièrement en un solide moléculaire. La force de cohésion de nature électrostatique comprend
une forte composante de Van der Waals.
III.3. Théorie des bandes
Les propriétés électriques des matériaux sont déterminées par leur structure électronique. La
théorie qui permet d'expliquer la structure électronique d'un matériau est la théorie des bandes
Principes Physiques
Chapitre II
80
(figure II.20). A l'état solide, les électrons sont placés dans les orbitales moléculaires, qui forment
un continuum d'énergie. L'orbitale moléculaire de plus haute énergie occupée par les électrons
(HOMO : plus haute orbitale moléculaire occupée) est appelée la bande de valence (BV), tandis
que l'orbitale moléculaire de plus basse énergie inoccupée (LUMO : l'orbitale moléculaire la plus
basse non occupée) est appelée la bande de conduction (BC). La zone comprise entre la bande de
valence et la bande de conduction est appelée la bande interdite (Eg). Cette dernière représente
l‟énergie qu‟il faut fournir à un électron pour qu‟il passe de la BV à la BC. Dans le cas d'un isolant,
la bande interdite est très large (Eg > 3.0 eV) rendant impossible le passage des électrons de la
bande de valence à la bande de conduction. Ainsi, la bande de valence reste complètement pleine et
les électrons ne peuvent se mouvoir sous l'effet d'un champ électrique. Dans un semi-conducteur,
les électrons peuvent se déplacer lorsqu'on applique un champ électrique puisque les bandes de
valence et de conduction ne sont pas complètement pleines ou complètement vides. En effet, la
bande interdite est étroite (0,5 eV < Eg < 3,0 eV) et un certain nombre d'électrons passent dans la
bande de conduction. Finalement, la conductivité électrique très élevée des métaux s'explique par
l'absence de la bande interdite (Eg = 0 eV). Ainsi, les bandes de valence et de conduction ne forment
qu'une seule bande, ou les électrons peuvent circuler librement lors de l'application d'un champ
électrique.
Figure II.39: La théorie des bandes des matériaux.
Le spectre de conductivité des matériaux représenté sur la figure II.21 montre que la
conductivité de la majorité des polymères conducteurs appartient à la gamme de la conductivité des
semi conducteurs inorganiques d‟où le caractère semi conducteur de ces polymères.
Principes Physiques
Chapitre II
81
Figure II.40: Spectre de conductivité des matériaux.
Dans la théorie des bandes, un semi-conducteur parfait est un isolant à T=0K, la bande de
conduction est entièrement vide. Lorsqu‟on l‟excite par n‟importe quelle source d‟énergie (lumière
ou tout rayonnement électromagnétique, chauffage, champ électrique…), la température augmente
et les électrons passent de la bande de valence vers la bande de conduction en laissant leur place à
des trous (figure II.22 (A)). Par contre pour un polymère conducteur à l‟état isolant, il a la structure
aromatique. Lorsqu‟on fait un dopage (forme oxydée), la structure va se déformer pour passer à la
forme quinoléique (figure II.22 (B)), forme plus énergétique, le polymère conjugué devient
conducteur.
Figure II.41 : Théorie des bandes :( A) pour un semi conducteur, (B) pour un polymère conducteur.
Principes Physiques
Chapitre II
82
III.4. Mécanisme de conduction dans les polymères conducteurs
Bien que la théorie des bandes explique en partie le principe de la conductivité électrique
des polymères conducteurs, elle n'en dévoile pas tous les aspects. Pour bien comprendre les
phénomènes électroniques impliqués dans ces polymères organiques, il faut faire intervenir la
notion de polarons et de bipolarons.
A l'état neutre, les polymères qui possèdent un système de liaisons doubles conjuguées sont
des isolants. Leur bande interdite est généralement assez large : de l‟ordre de 2,7 eV. Cependant, un
polymère peut devenir conducteur grâce à l‟introduction de charges
Soit par l‟injection d‟une charge par dopage (oxydation : type-p ou de réduction : type -n)
où va se créer un «défaut » (appelé aussi polaron ou soliton) chargé et associé à une
déformation locale de la chaine conjuguée. Ce polaron apte à se propager le long de la
chaine conjuguée (contribution intra-chaine à la conduction) ou de chaine à chaine
(contribution inter-chaine à la conduction) par permutation de simples et doubles liaisons
(on passe donc localement d‟une forme aromatique à une forme quinonique)
Soit par injection via un champ électrique entre deux électrodes lorsque la bande de
conduction du métal est suffisamment proche de celle du polymère pour permettre le
passage des électrons (des trous dans le cas de la bande de valence).
Pour expliquer profondément le phénomène de conduction dans le polymère conducteur nous
prenons le cas du dopage de type-p qui est plus courant. Lors d'une première oxydation, un électron
est retiré de la bande de valence du polymère conjugué et un polaron positif est créé. Le niveau
d'énergie associé à ce polaron positif, partiellement délocalisé le long de la chaine de polymère, est
représenté par une orbitale liante déstabilisée dont l'énergie est plus élevée que l'énergie de la bande
de valence du matériau. En d'autres termes, le niveau de la HOMO (correspondant au niveau
d'énergie de ce radical cation) passe dans la bande interdite, conduisant à un gain d‟énergie E
(figure II.23). En effectuant une deuxième oxydation sur le polymère, il peut se produire deux
phénomènes différents, soit la formation d'un deuxième polaron sur une autre unité tétramère, soit
la formation d'un bipolaron, Dans le second cas, un électron non-apparié se trouvant sur le plus haut
niveau d'énergie est enlevé, et ainsi, un bipolaron est formé. II n'y a aucun électron sur les deux
niveaux d'énergie situés entre la bande de valence et la bande de conduction Le bipolaron positif est
Principes Physiques
Chapitre II
83
constitué de deux trous électroniques dans la bande de valence (figure II.24). Tel que montré plus
tôt, les trous électroniques dans la bande de valence vont permettre la conduction électronique au
sein du matériau.
La formation d'un polaron ou d'un bipolaron dépend du degré de dopage du matériau. Ainsi,
un faible degré de dopage entraîne la formation de polaron, tandis qu'un dopage élevé entraîne la
formation de bipolarons.
Figure II.42: Défauts chargé dans les polymères conducteurs ; déformation
locale associée de la chaine polymère
Figure II.43: Porteurs de charge(s) dans du polypyrrole : polaron positif (B), bipolaron positif (C).
Principes Physiques
Chapitre II
84
Le mécanisme de la conduction électronique au sein des polymères conducteurs peut
finalement se résumer par la formation des polarons et des bipolarons lors du dopage. Ces espèces
chargées ont la capacité de se mouvoir le long de la chaîne de polymère par une permutation des
liaisons doubles et simples au sein du système conjugué, Ainsi, les électrons peuvent être
transportés tout au long des chaines polymères et entre celles-ci (figure II.25). Le transport de
charges d‟un site à l‟autre s‟effectue en fait par effet tunnel : il y a saut (hopping) entre états
localisés dans le gap.
Figure II.44: description schématique du principe de transfert de charge dans les polymères
conducteurs.
III.5. Synthèse des polymères
Dans cette partie nous nous intéressons au polypyrrole comme polymère conducteur conjugué
car il sera utilisé dans notre travail.
La première synthèse du polypyrrole a été faite en 1912. Deux voies majeures sont appliquées
pour la synthèse du polypyrrole : la polymérisation chimique et la polymérisation électrochimique
[100
].
Principes Physiques
Chapitre II
85
III.5.1. Polymérisation chimique
Cette méthode est plutôt simple, impliquant le monomère, l'oxydant et le dopant dans un
solvant organique ou aqueux. Dans quelques cas spéciaux, le dopant peut agir en tant qu'oxydant.
La polymérisation se produit habituellement dans une gamme de température allant de 20 à 80°C.
Le mécanisme proposé suppose que le cation radical est formé dans la majeure partie de la solution
par l'oxydation du monomère. La réaction entre le radical et le monomère et son oxydation produit
un cation bi-radical. La réaction et l'oxydation continuent jusqu'à ce que la chaîne de polymère
devienne insoluble dans la solution.
III.5.2. Polymérisation électrochimique
Les méthodes électrochimiques de synthèses de polypyrrole sont très utilisées pour former un
film mince et uniforme. Elles permettent une grande précision de contrôle de la réaction et donc des
propriétés des polymères obtenus. Ces méthodes de synthèses sont généralement effectuées dans
des solvants aqueux ou organiques, en utilisant des montages à trois électrodes : une électrode de
travail sur la surface de laquelle est électrodéposé le polymère, une électrode de référence pour
contrôler le potentiel de l'électrode de travail et une contre-électrode qui permet le passage du
courant. Donc, l‟électropolymérisation peut être effectuée par la voltamètrie cyclique, la
chronopotentiométrie ou le maintien potentiostatique. Ces méthodes permettent de contrôler très
précisément la morphologie des polymères, ainsi que la masse et l'épaisseur déposée.
III.5.3. Mécanisme de polymérisation du pyrrole
La formation électrochimique de polymères semi-conducteurs est un processus bien particulier
qui présente cependant des similitudes avec l'électro-dépôt des métaux comme le passage par une
nucléation suivie d'une étape de croissance de phase. Le mécanisme de polymérisation est initialisé
par l'oxydation électrochimique de monomères à la surface de l'électrode de travail, ce qui crée
autour de l'électrode une couche de monomères sous forme de radicaux cations (figure II.26)
[101
,102
]. L‟étape suivante est le couplage chimique de deux radicaux cations, qui conduit à un
dimère après la perte de deux protons. Le dimère est ensuite réoxydé au contact de l'électrode,
formant de nouveau un radical cation susceptible de se coupler avec un autre radical cation, et ainsi
de suite … Lorsque les chaînes ainsi formées deviennent insolubles, elles précipitent à la surface de
l'électrode et forment un film. Cependant, plus le film est épais et plus la chute ohmique est
Principes Physiques
Chapitre II
86
importante entre le potentiel fourni et le potentiel réel à l'interface électrode/solution. La réaction
s'achève lorsque cette chute ohmique abaisse le potentiel en-dessous du potentiel de polymérisation.
Cette limitation est assez importante car les épaisseurs maximales sont généralement de l'ordre de
quelques dizaines de microns.
Figure II.45: Mécanisme de polymérisation du pyrrole.
IV. Auto assemblage moléculaire
L‟auto-assemblage moléculaire est un phénomène pendant lequel des molécules suspendues
dans un milieu isotropique s‟organisent entre elles pour former une couche ordonnée. Cette
stratégie permet la construction spontanée d‟architectures moléculaires complexes à partir des
éléments moléculaires simples ou briques de construction. En termes d‟information, ces briques
moléculaires portent dans leur structure des sites spécifiques de reconnaissance et par conséquent
un algorithme d‟assemblage qui opère lorsqu‟elles sont en présence. Cette stratégie est
communément employée par la nature pour mettre en place des systèmes moléculaires d‟une très
grande complexité.
Principes Physiques
Chapitre II
87
IV.1. Les monocouches auto-assemblées (SAMs)
Des surfaces homogènes peuvent être réalisées par « auto-assemblage » de monocouches
organiques (Self Assembled Monolayer, SAMs) [103
]. Les monocouches auto-assemblées ou SAMs
sont des structures monomoléculaires ordonnées se formant spontanément par adsorption sur une
surface solide [104
]. Ces dépôts peuvent se produire soit en solution soit en phase gazeuse. En effet,
la conception de SAMs sur des surfaces de substrats présente un intérêt scientifique dont l‟enjeu
économique est considérable.
IV.2. Concept des monocouches auto-assemblées en solution
Sous des conditions adéquates (nature et propriétés des solvants, température de la solution)
les monocouches se forment spontanément, dans un temps compris entre quelques minutes et
plusieurs heures, par simple immersion d‟un substrat solide dans une solution de molécules actives.
Ces molécules sont généralement constituées d‟une longue chaîne carbonée terminée par deux
groupements chimiques : l‟un a une affinité marquée avec la surface (groupement réactif), l‟autre a
des fonctions chimiques spécifiques qui seront celles de l‟interface organique (groupement
fonctionnel) (figureII. 27).
Figure II.46: Formation des monocouches auto-assemblées sur un support solide.
Les composés employés les plus utilisés pour réaliser des SAMs sont les composés à base de
soufre, les thiols (ou mercaptans) de formule générale R-SH, en particulier sur des surfaces d‟or et
d‟argent. Ce sont les analogues sulfurés des alcools ou des phénols.
Principes Physiques
Chapitre II
88
IV.3. Techniques d'études des monocouches auto-assemblées
De nombreuses techniques d'analyse ont permis de comprendre les structures des
monocouches auto-assemblées. Parmi ces techniques nous trouvons la microscopie à force
atomique (AFM) et la microscopie à effet tunnel (STM) qui permettent de voir la surface de la
structure par une image directe. Ainsi les techniques de diffraction telles la diffraction de rayons X
(GIXD), d'électrons de faibles énergies (LEED) ou encore d'atomes de faibles énergies (LEAD)
permettent d'analyser en profondeur la périodicité atomique, l'épaisseur, les défauts …et la
diffraction d'atomes d'hélium (HAR) détermine la morphologie de la surface à l'échelle atomique.
D‟autre part, de nombreuses techniques spectroscopiques comme la spectroscopie
infrarouge (IR), la microscopie par génération de second harmonique (SHG), la spectrométrie
Raman (SERS), le near-edge X-ray absorption fine structure (NEXAFS) … permettent de donner
des informations sur la structure et sur la croissance des SAMs.
IV.4. Caractéristiques générales des monocouches auto-assemblées
Les monocouches auto-assemblées ont été étudiées de manière approfondie par plusieurs
techniques d‟analyse de surface citées ci-dessus. Il a été montré clairement que les chaînes
carbonées forment une monocouche dense et ordonnée sur le plan (111) de l‟or. Les composés
organosulfurés tels les alcanethiols se lient par affinité à la surface de l‟or sur des sites « Hollow »,
au creux de trois atomes d‟or. La monocouche formée par-dessus la surface d‟or est composée de
molécules de quelques nanomètres à quelques dizaines de nanomètres de longueur, séparées
d'environ 5 Å et inclinées d'un angle de 30° degrés par rapport à la normale à la surface (Figure
II.28).
Cet arrangement est typique des alcanethiols sur de l'or mais est aussi très représentatif de
telles structures en général. La longueur de la chaîne alcane, ou la présence de terminaisons alcools
n'influent que de quelques degrés sur l'orientation de la molécule [105
]. En revanche l'état de surface,
la nature du métal (Ag, Cu …) modifient plus fortement les caractéristiques structurelles des
monocouches (angle voisin de 10° degré).
Principes Physiques
Chapitre II
89
Figure II.47: Représentation schématique d’une molécule d’alcabethiol auto-
assemblée montrant l’angle d’inclinaison α de la chaine alcane par rapport à
la surface d’or.
En ce qui concerne la formation des monocouches auto-assemblées, de nombreux auteurs
s'accordent à penser que le processus d'adsorption de thiols à la surface d'une couche d'or peut être
divisé en 2 étapes. La première étape, pendant laquelle 80 à 90 % de la couche SAM est formée, a
lieu au bout d‟un temps allant de quelques secondes à quelques minutes alors que la deuxième étape
concernant l‟ordonnancement des chaînes est beaucoup plus lente, le phénomène peut durer des
heures. Le premier processus est déterminé par la chimisorption des chaînes via les atomes de
soufre sur le substrat d‟or et le deuxième processus par les interactions de Van der Waals entre les
chaînes.
IV.5. Préparation des SAMs thiols-or pour application biocapteur
Les SAMs sont utilisés dans les biocapteurs comme plate-forme sur laquelle sont
immobilisés des matrices de molécules présentant des interactions spécifiques avec des espèces
biologiques. Ils permettent une bonne orientation des molécules au niveau de la surface du biofilm.
En effet, pour immobiliser les biomolécules sur une électrode d‟or fonctionnalisé par du thiol, il
faut passer par les étapes suivantes :
La première étape est le nettoyage de l‟électrode d‟or, car la cristallinité et la propreté des
couches minces d‟or jouent un rôle crucial dans la détermination de la compacité des couches
Principes Physiques
Chapitre II
90
SAMs. Il existe plusieurs procédures de nettoyage tels que le plasma froid à l‟oxygène, l‟UV-
ozone, l‟immersion dans des solutions oxydantes puissantes et le nettoyage électrochimique.
La deuxième étape est la préparation d‟une solution diluée de thiols allant de 1 μM jusqu‟à 1
mM dissoute dans un solvant approprié. L‟éthanol est le plus souvent utilisé car il dissout la plupart
des thiols et peut être obtenu sous forme pure. Toutefois, d‟autres solvants peuvent être employés
comme le chloroforme, le toluène, l‟acétonitrile, etc. Les électrodes d‟or nettoyées sont immergées
et incubées dans la solution de thiol pendant un certain temps puis rincées avec le même solvant et
séchées à l‟azote. Généralement, des solutions diluées de thiols donnent naissance à des
monocouches bien ordonnées alors que des solutions concentrées et des temps d‟incubation très
long (>6 jours) favorisent la formation de multicouches. La longueur de la chaîne aliphatique est
aussi un paramètre important à prendre en considération puisque les longues chaînes de thiols
forment des SAMs plus denses et plus ordonnées.
La dernière étape, est l‟immobilisation des biomolécules sur des surfaces d‟électrode
modifiée par des SAMs. Cette étape peut être effectuée selon deux approches :
Réaction directe entre les groupes fonctionnels exposés sur la surface d'une
monocouche SAM et les biomolécules, dans des conditions bien déterminées.
Activation de la surface de la monocouche (COOH, NH2, OH) par des réactifs qui
sont capables à leur tour de fixer une biomolécule
Une méthode populaire utilisée pour attacher de façon covalente des biomolécules à une
SAM substituée par des acides carboxyliques est basée sur l‟utilisation d‟un agent d‟activation
(carbodiimide) qui permet le couplage avec des amines. Dans cette réaction le N-ethyl-N-
[dimethylaminopropyl] carbodiimide (EDC) convertit l'acide carboxylique en un groupement
intermédiaire très actif qui peut réagir facilement avec des groupes amine. Dans certains cas les
réactifs EDC et N-hydroxysuccinimide (NHS) sont utilisés ensemble formant un groupement
intermédiaire plus stable et qui permet d‟obtenir un bon rendement de réaction avec des
biomolécules portant des amines [106
].
Principes Physiques
Chapitre II
91
V. Conclusion
Dans ce chapitre, nous avons présenté, d‟abord, le principe physique des différentes
techniques expérimentales qui seront exploitées pour l‟étude des biocapteurs développés dans ce
travail. Par la suite, nous avons décrit les polymères conducteurs et l‟auto assemblage moléculaires
qui seront utilisés comme outil pour la fabrication de l‟élément sensible des biocapteurs.
Dans le chapitre suivant, nous présenterons et dériverions, d‟une part, les dispositifs
expérimentaux utilisés. D‟autre part nous détaillerons les différentes méthodes utilisées pour la
fabrication de l‟élément sensible des biocapteurs.
Principes Physiques
Chapitre II
92
Références bibliographiques
[69
] C.F. Dong,a, H.B. Xue,a X.G. Li,a H.B. Qi,b Y.F. Cheng, Electrochemical corrosion
behavior of hot-rolled steel under oxide scale in chloride solution, Electrochimica Acta,
Accepted Manuscript.
[70
] S. Hong et L. Tai-Chin, Electrochemical Impedance Spectroscopy for Battery Research and
Development. Rapport technique 31, Solartron, 1996.
[71
] Bobby Pejcic, Roland De Marco, Impedance spectroscopy: Over 35 years of
electrochemical sensor optimization, Electrochimica Acta 51 (2006) 6217–6229.
[72
] Saloua Helali, conception te réalisation de matériaux bifonctionnel pour des dispositifs
capteurs impédimétriques, thèse soutenue le 15 décembre 2005
[73
] Impedance Spectroscopy", JR Macdonald, ed., John Wiley, 1987. Sect. 2.2.3.4.
[74
] J. Newman, Frequency dispersion in capacity measurements at a disk electrode. J.
Electrochem. Soc., 117(1970)198–203.
[75
] S. Amokrane et J. P. Badiali : Modern aspects of electrochemistry, chapitre Analisys of the
capacitance of the metal–solution interface, Plenum press, Numero 22.( 1992) 1–91.
[76
] L.Bousse, N.F.de Rooij, P.Bergveld “Operation of Chemically Sensitive Field-Effect Sensor
as a function of the Insulator- Electrolyte Interface”, IEEE Trans.Electron Devices ED-30
(1983) 1263-1270
[77
] C. Gabrielli, Identification of electrochemical processes by frequency response analysis.
Rapport technique 004/83, Solartron, 1998.
[78
] J. Randles, Discuss. Faraday Soc. 1 (1947) 11.
[79
] J. Lédion, P.Leroy, J.P. Labbé, Détermination de caractère d‟une eau par essai d‟entartrage
accélérée. TSM- L‟eau 80 (7-8) : (1985) 323-328
[80
] R. W. Wood, On a remarkable case of uneven distribution of light in a diffraction grating
spectrum, Phil.Magm., 4(1902) 396.
[81
] U. Fano, The theory of anomalous diffraction of Quasi-Stationary waves on metallic
surfaces (Sommerfeld‟s waves), J.Opt.Soc.Am., 1941, 31, 213.
[82
] C.J. Powell et J.B. Swan, Phys. Rev. 118 (1960) 640.
[83
] A. Otto, Excitation of nonradiative surface plasma waves by the method of frustrated total
reflection, Z.Physik, 1968, 216, 398.
Principes Physiques
Chapitre II
93
[84
] E. Kretschmann, H. Raether, Radiative decay of non radiative Surface plasmons Excited by
light, Z. Naturforsch, 23 (1968) 2135-2136.
[85
] V. E. Kochergin, A. A. Beloglazov, M. V. Valeiko, P. I. Nikitin, Phase properties of a
surface-plasmon resonance from the view point of sensor applications, Quantum electronics,
28(1998) 444-448.
[86
] S. Boussaad, J. Pean, N. J. Tao, High-Resolution multiwavelenght surface Plasmon
resonance spectroscopy for probing conformational and electronic changes in Redox
Proteins, Anal.Chem., , 72(2000)222-226.
[87
] B. Lamprecht, J. R. Krenn, G. Schider, H. Ditlbacher, M. Salermo, N. Felidj, A. Leitner, R.
Aussenegg, J. C. Weeber, Surface plasmon propagation in microscale metal stripes, Applied
physics letters, , 79, 1, (2001)51-53.
[88
] K. Kurihara, K. Suzuki, Theoretical understanding of absorption-based surface plasmon
resonance sensor based on Kretchmannn‟s theory, Anal. Chem., , 74(2002) 696- 701.
[89
] W. P. Chen, J. M. Chen, Use of surface plasma waves for determination of the thickness of
metallic films, J.Opt. Soc.Am., 71, 2, (1981) 189-191.
[90
] A. G. Frutos, M. C. Corn, SPR of ultrathin organic films, Analytical Chemistry News and
Features, (1998) 449 -455.
[91
] ABDELGHANI Adnane, étude physico-chimique de capteurs à fibre optique à onde
évanescente et application de surface pour la detection de polluant gazeux, these soutenue en
Juillet 1997
[92
] H. C. M. Yau, S. Y. Wu, H. P. Ho, M. Yang, Surface plasmon resonance measurement of
pyridoxal kinase-pyridoxamine binding on self-assembled monolayer, Sensors and
Actuators B, 85(2002) 227-231.
[93
] B. Hock, M. Seifert, K. Kramer, Engineering receptors and antibodies for biosensors,
Biosensors and bioelectronics, 17(2002)239-249.
[94
] D. Hao, M. Ohme-Takagi, K. Yamasaki, A modified chip for surface Plasmon resonance
enables a rapid determination of sequence specificity of DNA-binding proteins, FEBS
letters, 536 (2003)151-156.
[95
] N.J. Cronin, Microwave and optical waveguides, British Library Cataloguing-in-
Publication Data, ISBN 0 7503 0215 1 hbk.
Principes Physiques
Chapitre II
94
[96
] A. Otto, Excitation of nonradiative surface plasma waves by the method of frustrated total
reflection, Z.Physik, 216 (1968) 398.
[97
] E. Kretschmann, H. Raether, Radiative decay of non radiative Surface plasmons Excited by
light, Z. Naturforsch, 23 a( 1968) 2135-2136
[98
] G. K. Binnig and C. F. Quate, Atomic force microscope, Physical Review Letters, 56(1986)
930-933.
[99
] Lennard-Jones, J. E. Proc. Roy. Soc., 1924, v. A 106, p. 463.
[100
] A. F. Diaz and J. Bargon "Handbook of Conducting Polymers", T. A. Skotheim Ed.,1(1986)
82-100.
[101
] A. F. Diaz and J. C. Lacroix, New J. Chem. , 12, (1988)171-177.
[102
] R. ANSARI, Polypyrrole Conducting Electroactive Polymers: Synthesis and Stability
Studies, E-Journal of Chemistry,3( 2006)186-201.
[103
] Harry O. Finklea; Self-assembled Monolayers on Electrodes, Electroanalytical Methods.
[104
] A. Ulman, An introduction to ultrathin organic films: from Langmuir-Blodgett to
selfassembly, Academic Press, Boston, MA, (1991).
[105
] F. Schreiber, Structure and growth of self-assembling monolayers, Progress in Surface
Science, 65 (2000) 151-256.
[106
] M.F. Diouani , S. Helali , I. Hafaid , W.M. Hassen b,d, M.A. Snoussi a, A. Ghram c, N.
Jaffrezic-Renault d, A. Abdelghani, Miniaturized biosensor for avian influenza virus
detection, Materials Science and Engineering C 28 (2008) 580–583
Matériels & Méthodes
Chapitre III
Matériels & Méthodes
Chapitre III
96
I. Introduction
L‟objectif de ce chapitre est de présenter, dans une première partie, l‟ensemble des
dispositifs expérimentaux permettant l‟étude et la caractérisation des différents biocapteurs
développés au cours cette thèse. Dans une deuxième partie, nous présentons les protocoles de
fabrication de l‟élément sensible (biorécepteur) ainsi que leur mise en œuvre pour le développement
des biocapteurs.
II. Dispositifs Expérimentaux
II.1. Dispositif électrochimique expérimental
Toutes les expériences électrochimiques, l‟impédance électrochimique, la voltamètrie
cyclique et la chronoampérométrie sont basées sur le montage expérimental de la figure III.1. Ce
dernier est composé d‟un potentiostat et d‟un analyseur d‟impédance, et d‟un ordinateur pour le
pilotage des appareils et l‟acquisition et le traitement des données et d‟une cellule électrochimique
constituée de trois électrodes :
Une électrode de travail sur laquelle on examine les différents processus électrochimiques à
explorer.
Une électrode de référence dont le potentiel est constant et connu ce qui permet ainsi de
contrôler le potentiel à l‟électrode de travail.
Une électrode auxiliaire appelée aussi contre-électrode qui permet de boucler le circuit
électrique dans la cellule électrochimique.
Figure III.48 : Schéma du dispositif expérimental pour les mesures électrochimiques.
Matériels & Méthodes
Chapitre III
97
II.1.1. Cellule électrochimique
La plus part des expériences électrochimiques, l‟impédance électrochimique, la voltamètrie
cyclique et la chronoampérométrie sont réalisées dans une cellule électrochimique en verre, de
volume 5 ml, à trois électrodes : une électrode de travail (WE), une électrode de référence (RE) et
une contre-électrode (figure III.2). La géométrie de cette cellule permet une disposition bien
déterminée des trois électrodes. Il est important en effet, afin d‟assurer une densité de courant
homogène à l‟électrode de travail et de minimiser le phénomène de la chute ohmique, de maintenir
aussi proche que possible l‟électrode de travail et l‟électrode auxiliaire.
Figure III.49 : Schéma de la cellule électrochimique à trois électrodes.
Les électrodes de travail utilisées pour les expériences électrochimiques sont des macros
électrodes d‟or d‟épaisseur 300 nm. Elles sont déposées par évaporation sur des substrats de
Si/SiO2 en utilisant une couche d'accrochage de 30 nm de Titane (Ti). Ces électrodes d‟or sont
fournies par le Laboratoire d'Analyse et d'Architecture des Systèmes (LAAS), Toulouse. Une
couche de résine est déposée sur la surface d'or afin de protéger la surface d'or durant la découpe et
le stockage. La surface active de ces électrodes lorsqu‟elles sont fixées grâce à un joint torique sur
la cellule électrochimique est de l‟ordre de 0.19 cm2.
L’électrode de référence est une électrode au calomel saturée de marque Radiometer-
Analytical SA (Villeurbanne, France).
Matériels & Méthodes
Chapitre III
98
La contre-électrode est une électrode en platine dont la surface active, lorsqu‟elle est fixée
sur la cellule, grâce à un joint torique, est de l‟ordre de 0.52 cm2. La surface est plus grande que
celle de l‟électrode de travail pour négliger son impédance et pour que la contre-réaction puisse se
dérouler sans perturber le système.
II.1.2. Microélectrodes
Dans une partie de notre travail on a utilisé des microélectrodes dans laquelle les trois
électrodes (travail, auxiliaire et référence) sont intégrées sur le même support (cf. figure III.3). Ce
sont des électrodes sérigraphiées fabriquées par la société BVT Technologies (www.bvt.cz/).
Figure III.50 : Image de la microélectrode.
Pour cette électrode on a utilisé une simple cellule électrochimique d‟un volume de 5 ml
(figure III.4).
Figure III.51 : Image de la cellule électrochimique avec la microélectrode.
Matériels & Méthodes
Chapitre III
99
II.1.3. Appareil de mesure électrochimique
Toutes les expériences électrochimiques, l‟impédance électrochimique, la voltamètrie cyclique et la
chrono-ampérométrie, ont été réalisées avec un analyseur d‟impédance Voltalab 80 auquel la
cellule électrochimique, placée dans une cage de Faraday (figure III.5). Pour les mesures
d‟impédance, cet appareil sert à la fois à générer le signal sinusoïdal avec l‟amplitude et la
fréquence désirées et à extraire les parties réelles et imaginaires de l‟impédance du système étudié.
L‟analyseur d‟impédance est pilotés par un ordinateur à l‟aide du logiciel Volta Master .
Figure III.52 : Dispositif de mesure électrochimique.
Afin de pouvoir traiter les propriétés des différents systèmes, les diagrammes de SIE sont
généralement normés par la surface analysée afin de ramener les valeurs à l‟unité de surface
( .cm2). Les diagrammes d‟impédance sont traités à l‟aide du logiciel Zview (Scribner Associate,
Inc) qui permet la construction de circuits électriques équivalents et l‟ajustement des spectres à
l‟aide de ces circuits.
II.2. Dispositifs et matériels optiques
II.2.1. La cellule du SPR (Surface Plasmon Resonance)
Matériels & Méthodes
Chapitre III
100
La cellule du plasmon de surface est une cellule en plexiglas de volume 20 µl. Elle est fixée
sur la plaque de verre dorée qui est posée sur le prisme (figure III.6). Afin d‟éviter l’incohérence et
avoir une bonne adhérence entre la partie en verre de l‟électrode et le prisme, on a utilisé une huile
spéciale de même indice que le prisme.
Figure III.53 : Représentation schématique du prisme et de la cellule de plasmon de surface.
Les plaques de verre dorées, employées dans les analyses par résonance plasmonique de
surface, sont carrées, de 2 cm de côté. Elles sont fabriquées par évaporation d‟une mince couche
d‟or (50 nm), sur des substrats de verre revêtus d‟une sous-couche d‟accrochage de chrome (1-5
nm).
II.2.2. Appareil de mesure de Plasmon de surface
Les expériences de résonance plasmonique de surface ont été effectuées par l‟appareil
"Biosuplar 3" (www.micro-systems.de) qui a été développé à l'institut de physique des semi-
conducteurs de la National Academy of Sciences of Ukraine (Kyiv) (figure III.7). Ce dispositif
optoélectronique permet de mesurer le phénomène de la résonance plasmonique de surface basé sur
la configuration du Kretchmann par l'intermédiaire d‟un logiciel développé commandé par un
ordinateur. Durant l‟expérience, un rayon incident de lumière p-polarisée d'une diode de laser à
semi-conducteur (λ=650 nm) permet d‟exciter une oscillation de nuage électronique (plasmon de
surface) sur le film métallique. Le prisme spécial est capable de faire la rotation sur une gamme
Matériels & Méthodes
Chapitre III
101
d‟angle définie par l‟ordinateur et d‟obtenir des conditions optimales pour l'excitation du plasmon.
Le signal qui correspond au phénomène de plasmon de surface s‟enregistre comme une diminution
d'intensité de la lumière réfléchie.
L‟écoulement du liquide dans la cellule est effectué à l‟aide d‟une pompe Gilson Minipuls
3.
Figure III.7 : Dispositif de mesure de résonance plasmonique de surface.
Les expériences de résonance plasmonique de surface réalisées pour le développement du
biocapteur à base de polymère conducteur sont effectuées par AUTOLAB ESPRIT à double canal
dans l‟Equipe de Chimie Bioorganique et Bioinorganique de l‟ICMMO, à l‟Université Paris-Sud.
II.3. Dispositifs expérimentaux d’analyse de surface
II.3.1. Le spectromètre à transformé de Fourier (FTIR)
Les spectres de FTIR pour la caractérisation de biocapteur à base de polymère conducteur
ont été obtenus sur un spectromètre de type Brucker IFS66 FTIR de l‟équipe Chimie Bioorganique
et Bioinorganique, de l‟ICMMO à l‟Université Paris-Sud. Ce spectromètre est équipé d‟un
détecteur MCT avec un cristal de germanium pour l‟atténuation de réflexion totale (ATR). Les
spectres infra-rouge sont obtenus en mode réflexion.
Matériels & Méthodes
Chapitre III
102
II.3.2. Microscope à force atomique (AFM)
Les images AFM obtenues pour la caractérisation du biocapteur à base de nano particule
d‟or ont été obtenues avec un microscope de type Pico Plus Molecular, dans notre laboratoire. Ces
images ont été enregistrées en mode tapping en utilisant une pointe pyramidal de silicon Si3N4. La
fréquence de résonance moyenne de la pointe est de 300 kHz à l‟air.
Les images AFM obtenues pour la caractérisation du biocapteur à base de polymère
conducteur ont été obtenues avec un microscope de type Vecco instruments, USA du Laboratoire
de Recerca en Nanobioenginyeria (CREBEC), au Parc scientifique de Barcelona .Ces images ont
été enregistrées en mode tapping en utilisant une pointe rectangulaire en silicium de (MikroMasch
NSC18/AIBS) avec une constante de raideur de 3.5 N.m-1
et une fréquence de résonance moyenne
de la pointe de 75 kHz à l‟air .
III. Méthodes et conditions expérimentales
III.1. Nettoyage des électrodes d’or
Avant toute analyse, l‟électrode doit être nettoyée. Or, lors de la réalisation de notre travail
trois sortes d‟électrodes d‟or ont été utilisées. Un traitement différent s‟avère nécessaire pour ces
électrodes à cause de leur épaisseur et de leur conception différentes.
En effet les macroélectrodes d‟or (origine LAAS) sont nettoyées en deux étapes. Le premier
nettoyage consiste à enlever la couche de résine sur la surface d'or. L‟électrode est alors trempée
dans l‟acétone pendant 10 min sous ultrason. Ensuite, elle est séchée sous flux d‟azote (N2). La
deuxième étape de nettoyage est la plus importante. L'électrode d'or est nettoyée en utilisant le
mélange "piranha" [107
]. Cette solution est composée d'un mélange de 2/3 d'acide sulfurique
concentré (96%), H2SO4, et de 1/3 d'eau oxygénée, H2O2. L'échantillon est laissé 1 minute dans la
solution. Après ce traitement, l‟électrode est rincée à l‟eau ultrapure et séchée sous un flux d‟azote.
Pour les électrodes de SPR, l‟échantillon d‟abord, rincé à l‟éthanol et séché sous un flux
d‟azote puis trempée pendent 15 s dans le mélange "piranha". Ensuite, elle est rincée à l‟eau
ultrapure puis séchée sous un flux d‟azote.
Le nettoyage des microélectrodes sérigraphies est effectué par un simple rinçage par
l‟éthanol puis séchage sous un flux d‟azote.
Matériels & Méthodes
Chapitre III
103
III.2. Elaboration d’un biocapteur à base de polymère conducteur
Dans ce qui suit nous présentons les étapes de développement d'un immunocapteur basé sur
un film co-polypyrrole fonctionnalisé (pyrrole (Py)+N-hydroxyphtalimide pyrrole (Py-NHP))
déposé sur l‟électrode par voie électrochimique. Sur ce dernier (figure III.8.a), la partie variable
FAB marquée histidine de l‟anticorps (Fab fragment Hist-ScAc (figure III.8.b)) est immobilisée par
l'intermédiaire d‟un agent de greffage NTA (Nα, Nα-Bis(Carboxymethyl)-L-lysine Hydrate)
coordonné avec un ion métallique Cu2+
(Acétate de cuivre) [108
], pour la reconnaissance de
l‟antigène qui est un peptide antigénique couplé à la BSA. Cette approche est intéressante parce
qu'elle donne la possibilité de lier réversiblement l'anticorps en employant un agent complexant du
cuivre sans aucune dénaturation du film de co-polypyrrole fonctionnalisé.
PPY PPY- NHP ANTA
Cu2+ Ag sc Ab
(a)
(b)
Figure III.8 : (a) Représentation schématique d’un biorécepteur à base de polymère conducteur. (b) Représentation
schématique de la structure du fragment d’anticorps.
Matériels & Méthodes
Chapitre III
104
Les solutions de fragment d‟anticorps et de l‟antigène sont fournies par la société Wyeth dans
le cadre du projet européen DVT-IMP.
Pour la préparation de la solution 0,2M d‟ions métalliques Cu2+
, l‟acétate de cuivre a été dilué
dans une solution de tampon acétate pH 4,6. La solution tampon utilisée pour toutes les expériences
est le Phosphate Buffer Saline (PBS) contenant 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 0,01 M KH2PO4 and
0,01 M K2HPO4, pH 7,4. Toutes les solutions aqueuses ont été réalisées à partir d‟une eau ultra-
pure purifiée et désionisée par le système Milli Q® d‟une résistance de 18,2 MΩ cm-1
.
III.2.1. Electropolymérisation
Le film du polymère est obtenu grâce à la méthode chrono-ampérométrique où on impose
un potentiel d‟oxydation proche de celui des monomères pyrroles.
L'électropolymérisation de poly [Py+Py-NHP] est effectuée à un potentiel contrôlé de 0,9 V
dans une solution de carbonate de propylène (C4H6O3) contenant du perchlorate de lithium (LiClO4)
1M et les monomère Py-NHP et Py dans des concentrations respectives de 2 mM et de 8 mM. La
polymérisation est arrêtée à une durée bien déterminée afin de contrôler la charge électrique qui
fixe l'épaisseur du film de polypyrrole à la surface de l'électrode.
III.2.2. Construction du biorécepteur à base de polymère conducteur
Suite à l‟électropolymérisation, l‟électrode modifiée par PPy+PPy-NHP est rincée
respectivement par le carbonate de propylène et la solution de PBS. Par la suite, elle est trempée
dans une solution de 7mM de NTA pendant une heure à température ambiante. Après un rinçage
par le PBS, l‟électrode est rincée par la solution d‟acétate de sodium et trempée dans une solution
de Cu2+
0,2M pendant 15 min. Ensuite, elle est rincée respectivement par la solution d‟acétate de
sodium et la solution de PBS puis incubée pendant 1heure dans une solution contenant 0,4 mg/ml
de fragment d‟anticorps marqué histidine. Enfin, pour différentes concentrations d‟antigène
l‟électrode modifiée (PPy+PPY-NHP/NTA/Cu2+
/scAc) a été incubée pendant 30 minutes à la
température ambiante.
La figure II.9 montre une représentation schématique des différentes étapes de la procédure
de l‟élaboration du biocapteur à base de polymère conducteur.
Matériels & Méthodes
Chapitre III
105
Figure III.9 : Représentation schématique des différentes étapes de la procédure de l’élaboration
de biocapteur à base de polymère conducteur.
III.3. Elaboration d’un biocapteur à base de nanoparticules d’or
Afin de montrer l‟utilité de l‟utilisation des nanoparticules d‟or fonctionnalisées, deux
systèmes de biofilm ont été réalisés. Un biosystème utilisant un réactif de pontages protéiques, le
glutaraldéhyde (système 1), et un biosystème utilisant les nanoparticules d‟or fonctionnalisées
(système 2).
Dans ce qui suit nous décrivons les étapes de développement des deux biosystèmes (figure
III.10).
Matériels & Méthodes
Chapitre III
106
III.3.1. Elaboration d’un biosystème utilisant un réactif de pontages protéiques
Après nettoyage, l‟électrode est rincée par l‟éthanol et trempée pendant 24 heures dans une
solution 0,1M de 11-amino-1-undecanethiol (AUT) (Thiol amine) afin de construire la couche auto-
assemblée. Par la suite, elle est rincée par l‟éthanol et séchée sous flux d‟azote, puis elle est rincée
par le PBS et trempée dans une solution de 5% de glutaraldehyde pendant 1 h 30 min à la
température ambiante. Après un rinçage par le PBS, l‟électrode est incubée pendant 2 heures dans
une solution contenant 10-5
M de neutravidine. Enfin et après rinçage au PBS, l'électrode est incubée
dans différentes concentrations de biotine pendant 30 minutes
III.3.2. Elaboration d’un biosystème utilisant des nanoparticules d’or fonctionnalisées
Les nanoparticules d‟or ont été synthétisées et fonctionnalisées par un thiol-disulfure avec
une extrémité contenant des groupements acides carboxyliques selon la référence [109
] permettant le
greffage par couplage peptidique sur une surface d‟or fonctionnalisées par des composés thiol-
aminés. Cette synthèse a été réalisée par « l‟équipe chimie supramoléculaire appliquée » à
l‟université Lyon I. L‟activation de ces nanoparticules d‟or a été effectué dans notre laboratoire par
un agent d‟activation tel que le 1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide hydrochloride
(EDC) et le N-hydroxysulfosuccinimide (NHS). En fait, les nanoparticules d‟or synthétisées et
fonctionnalisées ont été dispersées dans une solution de N,N-Dimethylformamide puis diluées
dans une solution PBS pH7 contenant 0,4 M de l‟EDC et 0,1 M de NHS, pendant 2 h, afin
d‟effectuer leur activation.
Après nettoyage, l‟électrode est rincée par l‟éthanol et trempée pendant 24 heures dans une
solution 0,1M de 11-amino-1-undecanethiol (AUT) (Thiol amine) afin de construire la couche auto-
assemblée. Par la suite, elle est rincée par l‟éthanol et séchée sous flux d‟azote, puis elle est rincée
par le PBS et trempée dans une solution à 1mg/ml de nanoparticules d‟or activées pendant 2 h à une
température ambiante. Après un rinçage par le PBS, l‟électrode est incubée pendant 2 heures dans
une solution contenant 10-5
M de neutravidine. Enfin et après rinçage au PBS, l'électrode est incubée
dans différentes concentrations de biotine pendant 30 minutes.
Matériels & Méthodes
Chapitre III
107
Figure III.10 : Représentation schématique des différentes étapes de la procédure d’élaboration de deux
biosystèmes. Système 1 : Biosystème utilisant un réactif de pontages protéiques. Système
2 :Biosystème utilisant des nanoparticules d’or fonctionnalisées
Matériels & Méthodes
Chapitre III
108
III.3.3. Elaboration d’un immunocapteur a base de nanoparticules d’or
Pour l‟élaboration d'un immunocapteur basé sur les nanoparticules d‟or (figure III.10), le
même protocole de biosystème utilisant des nanoparticules d‟or fonctionnalisées a été suivi mais à
la place de greffage de biotine, l‟électrode est trompée pendant 1 heure dans une solution contenant
0.4 mg/ml de fragment d‟anticorps biotinylé anti-E. coli. Enfin, pour différentes concentrations
d‟antigènes spécifiques, bactérie E. coli, l‟électrode modifiée a été incubé pendant 30 minutes à la
température ambiante. La figure III.11 présente les différentes couches constituant le biofilm.
: Thiol amine : Nanoparticule d‟or
: Neutravidine : Anticorps biotinylé
Figure III.11 : Représentation schématique d’un immunocapteur à base de nanoparticules d’or fonctionnalisées.
IV. Conclusion
Dans ce chapitre, nous avons présenté les différents dispositifs expérimentaux qui ont été
utilisés durant ce travail. Ensuite nous avons présenté les protocoles de fabrication des biocapteurs
(immunocapteurs).
Dans le chapitre suivant, ces différents dispositifs seront utilisés pour l‟optimisation et la
validation des différents immunocapteurs étudiés.
Matériels & Méthodes
Chapitre III
109
Références Bibliographiques
[107
] S. Hleli , C. Martelet , A. Abdelghani , N. Burais , N. Jaffrezic-Renault, Atrazine analysis
using an impedimetric immunosensor based on mixed biotinylated self-assembled
monolayer, Sensors and Actuators B 113 (2006) 711–717.
[108
] N. Haddour, S. Cosnier, Ch.Gondran, Electrogeneration of a Poly(pyrrole)-NTA Chelator
Film for a Reversible Oriented Immobilization of Histidine-Tagged Proteins , Journal of
American Chemical Society 127 (2005) 5752- 5753.
[109
] S. Roux, B. Garcia, J.-L. Bridot, M. Salome, C. Marquette, L. Lemelle, P. Gillet, L. Blum,
P. Perriat, O. Tillement, J. Travas-Sejdic, H. Peng, R.P. Cooney, G.A. Bowmaker, M.B.
Cannell and C. Soeller: Synthesis, Characterization of Dihydrolipoic Acid Capped Gold
Nanoparticles, and Functionalization by the Electroluminescent Luminol, .Langmuir, 21,
(2005). 2526 - 2536
Résultats & discussion
Chapitre IV
Résultats & discussion
Chapitre IV
111
Introduction
Ce chapitre s‟articule autour de 4 parties dans lesquelles les résultats sont d‟abord présentés
puis discutés. La première partie présente l‟étude des conditions électriques de fonctionnement
optimales pour le développement d‟un immunocapteur impédimètrique basé sur un polymère
conducteur modifié, le polypyrrole. Puis, en se basant sur ces conditions optimales pour cet
immunocapteur, la détection d‟un antigène modèle dans le plasma humain et dans le sang d‟un rat
est présentée dans la deuxième partie. Pour la miniaturisation de l‟immunocapteur, l‟utilisation de
microélectrodes pour la détection de l‟antigène D-Dimer, marqueur de la thrombose veineuse
profonde (DVT), dans le tampon PBS est présentée dans la troisième partie de ce chapitre. Celui-ci
est complété par la détection de l‟antigène D-dimer dans le plasma sanguin de patients atteints de
cette maladie. La quatrième partie présente l‟étude et le développement d‟un immunocapteur
impédimètrique à base des nanoparticules d‟or fonctionnalisées. L‟ensemble de ces résultats
conduira à préciser l‟utilité de nouveaux matériaux, tel que les polymères conducteurs et les
nanoparticules, comme outils très prometteurs pour l‟amélioration des performances des biocapteurs.
Résultats & discussion
Chapitre IV
112
Partie A. Conditions électriques de fonctionnement optimales pour un
immunocapteur impédimètrique basé sur un polymère
conducteur modifié: le polypyrrole
I. Introduction
Grâce aux propriétés qu'ils offrent et à leur biocompatibilité, les polymères conducteurs
ouvrent un nouveau chemin de fabrication des immunocapteurs avec la particularité d'amplifier la
réponse de signal de l'interaction antigène–anticorps et d'améliorer les caractéristiques des
immunocapteurs [110
,111
]. Dans ce contexte, cette partie explore le développement des
immunocapteurs impédimétriques basés sur un film de copolymère conducteur sur lequel la partie
variable FAB marquée histidine de l‟anticorps (Fab fragment Hist-ScAc) est immobilisée par
l'intermédiaire d‟un agent de greffage le NTA coordonné avec un métal complexe [112
], pour la
reconnaissance de l‟antigène. Il s‟agit d‟un peptide antigénique couplé à la BSA fournis par la
société Wyeth dans le cadre du projet européen DVT-IMP. De ce fait, différentes techniques de
caractérisations ont été utilisées pour la caractérisation de l‟immunocapteur. La résonance
plasmonique de surface (SPR) a été utilisée pour un contrôle in-situ de développement du biofilm
sur le film de co-polypyrrole. Les propriétés électriques, la morphologie et la caractérisation de la
structure chimique du film de copolymère ont été caractérisées respectivement par la Spectroscopie
d‟Impédance Electrochimique (EIS), la Microscopie à Force Atomique (AFM) et la spectroscopie
Infrarouge à Transformée de Fourrier (FTIR). L'étude expérimentale d'EIS a été faite avec des
différents potentiels DC afin de montrer, d'une part, le comportement du film de copolymère pour
ces différents potentiels et d‟autre part, de trouver le potentiel pour lequel l'immunocapteur est plus
sensible et stable.
II. Caractérisation du film copolymère
Comme les performances du biocapteur sont intimement liées aux caractéristiques du film de
polymère, dans un premier temps, nous avons optimisé la charge électrique du film qui permet
d‟obtenir un film homogène et adhérant dans le cadre d‟une collaboration entre notre laboratoire et
l‟équipe de Chimie Bioorganique et Bioinorganique, de l‟Université Paris-Sud. Dans un deuxième
Résultats & discussion
Chapitre IV
113
temps, nous avons étudié les propriétés électriques du film pour différents potentiels DC par la
spectroscopie d‟impédance électrochimique.
II.1. Electrodéposition de co-polypyrrole sur l’électrode d’or
L'électrodéposition du co-polypyrrole sur la surface de l'électrode d'or a été réalisée par
technique chronoampérométrie à un potentiel de 0.9 V (contre CSE). En fait, l‟électro-oxydation du
monomère de pyrrole et pyrrole-NHP se produit à l'anode, et résultants un copolymère déposés sur la
surface de l'électrode d'or [113
]. La figure IV.1 présente le courant et la charge électrique en fonction
du temps. Le Chronoamperogrammme montre une première augmentation brusque du courant dû à
l'oxydation de monomère en solution. Ceci suivi d'une augmentation légère du courant dû à une
nucléation électrochimique des l‟oligomères produites en solution et la croissance du copolymère sur
l'électrode d'or. L électropolymérisation du copolymère a été exécuté en 2 s.
0.0
1.0x10-4
2.0x10-4
3.0x10-4
0 2 4 6 8 10 120.0
2.0x10-5
4.0x10-5
6.0x10-5
8.0x10-5
1.0x10-4
1.2x10-4
1.4x10-4
1.6x10-4
Ch
arg
e (C
)
Courant
Co
ura
nt
(A)
Temps (s)
Charge
Figure IV. 1: Courant et charge en fonction du temps montrant l'électrodéposition du film de co-popyrrole
sur la surface d’une électrode d'or à 0.9 V (contre CSE). L’électropolymérisation effectué dans
une solution de propylène carbonate contenant 0.04 M de pyrrole de, 0.06 M de pyrrole- NHP
et 0.5 M de LiClO4.
La charge du film de co-polymère a été déterminée part l'équation suivante:
(1)
Résultats & discussion
Chapitre IV
114
La charge du film obtenue pendant l'électropolymérisation est de 2.54 10-4
C. Elle correspond
à une densité de charge électrique de 1.33 mC/cm2. Avec cette quantité de charge nous avons obtenu
un film homogène et adhérant de co-polypyrrole que nous pouvons voir à l'œil nu.
En effet, la conductivité électrique du film de copolymère est réalisée par oxydation (dopé-
p), suivie de l'insertion des espèces anioniques telles que le ClO4-. En raison de l'alternance de lien
double dans l'épine dorsale conjuguée de polymère, les espèces chargées formées peuvent se
déplacer le long de la chaîne de Carbone (délocalisation) en permettant le transport d'électron et
donnant de ce fait un matériau électroniquement conducteur [114
].
II.2. Propriétés électriques du film de co-polypyrrole à différents potentiels
Nous avons procédé à l‟étude des propriétés électriques du film co-polypyrrole à différents
potentiels DC par spectroscopie d‟impédance électrochimique. Les résultats exposés dans la figure
IV.2 présentent les diagrammes de Nyquist des films de PPy/PPy-NHP à différents potentiels DC
appliqués.
Figure IV. 2: Diagrammes Nyquist pour un film de co-polypyrrole électrodéposé sur une électrode d’or
obtenues à différents potentielsDC vs. SCE. Les potentiels dc utilisés sont: 0, -200, -400, -600,
-800 et -1400 mV. Les mesures d’impédances ont été réalisées dans une gamme de fréquence de
100 mHz-100kHz dans la solution PBS ( 10 mM,pH7) avec une Amplitude de 10 mV.
Ces digrammes ont été analysés en employant plusieurs modèles des circuits électriques
équivalents qui sont appropriés pour les films de polymère conducteur [115
,116
,117
,118
]. La majorité
des fittes obtenus ont été peu satisfaisants (le coefficient de corrélation χ2
été insuffisant). En
Résultats & discussion
Chapitre IV
115
revanche, nous avons obtenu les meilleurs fittes avec un coefficient de corrélation χ2 10
-3, pour une
gamme de fréquences de 0,05 à 100000 Hertz. Cette modélisation a été effectué en utilisant le circuit
équivalent représenté dans figure IV.3, où Rs, C f R f, CPE, Rtc et W représentent respectivement:
la résistance de l‟électrolyte, la capacité du film de copolymère, la résistance de film de polymère,
l‟élément constant de phase, la résistance de transfert de charge et l‟impédance de Warburg. Les
paramètres électriques modélisés sont présentées dans le tableau IV.1.
Figure IV. 3: Circuit électrique équivalent permettant la modélisation des spectres d’impédance correspondant
à un film de polymer.
Potentiel (mV) Rs (Ωcm2) Rf(Ωcm2) Cf(mFcm2) Rtc(Ωcm2) W (Ωcm2) CPE (mFcm2) αCPE 2
0 38.89 0.13 11.00 0.23 1.60 0.02 7679 86 48789 978 0.41 0.012 0.81 0.002 0.0018
-200 37.38 0.12 24 0.48 1.73 0.019 5071 53 7546 98 0.64 0.013 0.80 0.002 0.0012
-400 37.24 0.13 78 1.56 1.01 0.012 5506 55 9205 121 0.20 0.024 0.87 0.002 0.0021
-600 36.51 0.13 181 2.52 0.16 0.0024 4150 40 7581 85 0.15 0.002 0.87 0.002 0.0021
-800 35.31 0.14 224 3.36 0.126 0.0017 3202 34 5683 75 0.03 0.002 0.87 0.002 0.0013
-1400 27.53 0.13 355.8 4.29 0.036 0.0004 136 1.33 64.07 1.02 0.067 0.002 0.90 0.002 0.0019
Tableau IV. 1: Paramètres de simulation d’une électrode d’or modifiée à l'aide d'un film de co-polypyrrole, à
différentes polarisations. Paramètres issus du fittage avec la circuit de la figure IV.3.
Les spectres d'impédance ont été mesurés dans une gamme de potentiel DC entre -1.4 et 0 V.
Cette gamme appartient à la plage de la gamme à laquelle les films de polymère passent de l‟état
isolant à l‟état conducteur [119
,120
]. Néanmoins, les spectres montrent un changement considérable
avec le changement de potentiel dans toute la gamme de fréquence. Ce changement est dû aux
transformations produites dans le film durant sa transition de l‟isolateur à l‟état conducteur.
Dans la partie des hautes fréquences des diagrammes de Nyquist, nous remarquons l‟apparition
d‟un petit cercle (figure IV.2) permettant de définir les paramètres électriques du film de
copolymère. En effet, la modélisation montre que ce dernier présente un comportement résistif pur
suivi d'une réponse capacitive. La variation de la capacité de film (Cf) avec le potentiel DC appliqué
est présentée dans figure IV 4.a. Nous remarquons que pour des potentiels plus négatifs la capacité
Résultats & discussion
Chapitre IV
116
est autour de 36 µF. cm2. Quand le film de copolymère subit une translation de l'état non dopé à
l'état dopé (des potentiels plus négatif à des potentiels moins négatif :-200 mV) la capacité du film
augmente jusqu' à une valeur de 1.73 mF. cm2. Par conséquence, les générations de porteur de
charge par des réactions électrochimiques d'oxydation dans l'épine dorsale de film de polymère sont
responsables de la translation de l‟état isolateur à l‟état conducteur dans le film de co-polypyrrole.
En outre, pendant cette translation, le niveau dopé change, et donc, l'augmentation de C f avec le
potentiel peut être liée au niveau de dopage du film [ 121
]. L‟équation présentant la variation de la
capacité est la suivante :
d
ACf
Avec , A et d représentent respectivement : la constante diélectrique du vide, la constante
diélectrique de double couche, la surface du film et l'épaisseur du film. Le processus de dopage de la
couche de polypyrrole mène à l'augmentation de l'épaisseur du film par éclusions de la couche de
polymère et devrait également augmenter la constante diélectrique de double couche qui est due à
l'accumulation de la charge négative venant du dopage par les anions.
La reproductibilité de la réponse capacitive des différents films de copolypyrrole est
caractérisée par une variation de 16% obtenu pour 4 mesures.
La figure IV 4.b montre la variation de la résistance du film de co-polypyrrole (Rf) avec les
potentiels DC appliqués. Nous remarquons, une augmentation de Rf quand le film de co-polypyrrole
subit une translation de l'état oxydé à l‟état réducteur (translation de l‟état conducteur l‟état
isolateur). En fait, cette résistance est inversement proportionnelle à la conductivité électronique de
PPy. Alors, cette conductivité est faible dans l'état réducteur puisque les anions incorporés dans le
film de polymère sont expulsées (état non dopé) et le polymère est dans l'état isolant [122
]. En plus, la
diminution de la conductivité à des basses densités de courant (potentiel cathodique élevé) peut
également être provoquée par la réaction des nucléophiles (H2O) avec l'épine dorsale de polymère.
Ceci interrompt la structure conjuguée et fait abaisser la conductivité intrinsèque du polymère [123
].
La reproductibilité de la réponse résistive films de co-polypyrrole pour différents potentiels
DC est caractérisée par une variation de 12% obtenu pour 4 mesures.
Résultats & discussion
Chapitre IV
117
-1600 -1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 200
-2.0x10-4
0.0
2.0x10-4
4.0x10-4
6.0x10-4
8.0x10-4
1.0x10-3
1.2x10-3
1.4x10-3
1.6x10-3
1.8x10-3
2.0x10-3
2.2x10-3
Cf(F
cm
2)
potentiel (mV) /SCE
-1600 -1400 -1200 -1000 -800 -600 -400 -200 0 200
0
50
100
150
200
250
300
350
400
Rf(
cm
2)
potentiel (mV) / SCE
(a) (b)
Figure IV. 4: (a) : Variation de la capacité (Cf) du film de co-polypyrrole en fonctions de différents potentiel
dc. (b): Variation de la résistance (Rf) du film de co-polypyrrole en fonction de différents
potentiel dc. Valeurs issus des paramètres présentés dans le tableau IV.1.
Dans la région de basse fréquence des diagrammes de Nyquist, les réponses d'impédance aux
faibles potentiels dc négatifs appliqués sont sensiblement différentes de ceux aux potentiels DC
négatifs relativement élevé. Ceci pourrait être attribué à la diminution de la résistance de transfert de
charge (Rtc) qui est due au phénomène redox se produisant à l'interface film - électrolyte, ainsi que
l'impédance de Warburg qui est due au transfert de masse de l'espèce redox sur l'électrode (voir le
tableau IV.1). Il est important de noter qu‟à -1400 mV le film présente la résistance de transfert de
charge la plus faible avec une faible impédance de Warburg (Rct =136 1.33 cm2
et W = 64.07
1.02 cm 2). Contrairement aux autres potentiels, nous notons que le phénomène de diffusion est
plutôt élevé. Il est également important de noter que le potentiel -1400 mV appartient au domaine de
la réduction de H2 O. Par conséquence, dans ce secteur l'activité de l'espèce chimique (H+
/ H 2) dû
aux augmentations de réduction résulte l'augmentation du courant faradique.
III. Caractérisation du biofilm
Comme les performances d‟un immunocapteur sont intimement liées à la construction du
biofilm et au mode d‟immobilisation de l‟anticorps, nous avons utilisé différentes techniques de
caractérisation permettant le contrôle de construction du biofilm couche par couche.
Résultats & discussion
Chapitre IV
118
III.1. Caractérisation par SPR
L'épaisseur de la couche de co-polypyrrole a été évaluée en utilisant la technique de SPR;
dans ce cas la réflectivité en fonction de l'angle d‟incidence a été mesurée dans la solution de PBS
pour une surface d'or nu et après la réaction de polymérisation. La figure IV.5.a montre la réflectivité
en fonction de l'angle avant et après le dépôt de la couche de copolymère dans le PBS. L'épaisseur de
la couche de co-polypyrrole pourrait être estimée en fittant les courbes théoriques de SPR aux
courbes expérimentales en utilisant l'indice de réfraction du film de polypyrrole (n=1.423)[124
] et on
obtient une épaisseur de 12.3 nm .
8000 10000 12000 14000
0.0
0.2
0.4
0.6
0.8
1.0
1.2
1.4
Ac
Cu2+
NTA
( °
)
temps(s)
(a) (b)
Figure IV. 5: (a )Réflectivité en fonction de l‘angle d’incidence (b) Contrôle en temps réel de l’élaboration du
biofilm de l’immunocapteur à base des co-polypyrrole.
La procédure d‟immobilisation successive de NTA, Cu2+
et Sc-Ac sur le film de co-
polypyrrole électrodéposé sur une électrode d‟or a été suivit en temps réel par l‟enregistrement de
l‟angle de résonance en fonction du temps. La figure IV.5.b présente toutes les étapes
d‟immobilisation. En effet, les résultats montrent une augmentation de l‟angle de résonance de
∆θNTA= 0,075° suite à l‟injection du NTA suivie du lavage par le PBS. Cette variation d‟angle
montre que le NTA est bien fixé sur la couche du co-polypyrrole. L‟injection de la solution de Cu2+
a provoqué l‟augmentation rapide de l‟angle de résonance ce qui correspond à l‟immobilisation de
ces ions. Après 15 min d‟incubation, et suite au lavage par le PBS nous observons une variation de
l‟angle de résonance qui est estimé à ∆θ Cu2+ = 0.088°. Cette variation d‟angle montre que les ions
Résultats & discussion
Chapitre IV
119
Cu2+
sont bien fixés par liaison de coordination sur les groupements carboxyliques du NTA.
L‟injection des fragments d‟anticorps induit une augmentation du signal optique par rapport au
niveau de la réponse optique de la couche Cu2+
. Cette variation ∆θSc-Ac qui est de l‟ordre de 0.776°
vérifie la coordination des fragments d‟anticorps de tag Histidine avec les ions Cu2+.
A partir de cette caractérisation nous tentons à déterminer le taux de fixation des fragments
d‟anticorps sur la surface de l‟électrode modifiée (PPy.PPy-NHP/NTA/Cu2+
). En utilisant la
méthode méthodes de simulation [ 125
] la quantité a été évaluée à 15 pmole/cm2.
III.2. Caractérisation morphologique par AFM
Les topologies de la surface de l‟électrode d'or modifiée après chaque couche greffée
constituant le biofilm ont été réalisées en utilisant l'AFM en mode contact dans une gamme de 1µm
x de 1µm de substrat. Les figures IV.6. a,b, c et d, montrent les images de la topologie du co-
polymère après les différentes étapes de formation du biofilm. Le paramètre de rugosité a été calculé
dans le but de permettre la comparaison de la densité de la couche après chaque étape de formation
du biofilm. La figure IV.6.a présente la photo d‟AFM du film de co-polypyrrole électrodéposé sur
une électrode d‟or. Le film est sous forme des globules relativement denses et homogènes à l‟échelle
micrométrique comme prévue pour les polypyrroles [126
,127
]. La couche présente un facteur de
rugosité de 5nm comparable à la valeur obtenue pour le poly (pyrrole-NHS) [128
]. Le greffage
covalent des groupes de NTA mène à la même structure avec une diminution de facteur de rugosité
qui est de l‟ordre de 3,99 nm (figure IV.6.b). L'immobilisation des ions de cuivre (Cu2+
) mène à
rendre la couche extérieure du biofilm sous forme particules nano-agrégées bien organisées (figure
IV.6.c) qui sont toujours observées après immobilisation du fragment de l‟anticorps (figure IV.6.d)
démontrant sa bonne organisation et son orientation sur cette surface.
Résultats & discussion
Chapitre IV
120
(a) (b)
(c) (d)
Figure IV. 6: Images AFM des différentes couches constituant le biofilm : (a) film de co-polypyrrole
(PPy.PPy-NHP),(b) film PPy.PPy-NHP-NTA, (c) film PPy.PPy-NHP-NTA-Cu2+
et (d) film
PPy.PPy-NHP-NTA-Cu2+
-Sc-Ac. Images obtenues en mode contact.
III.3. Caractérisation par FTIR
La couche de copolymère a été analysée avec la spectroscopie infrarouge pour démontrer la
formation de la co-polypyrrole reliant le Py-NHP et le Py. Les figures IV.7.a et b représentent
respectivement, les spectres infrarouges de la couche de co-polypyrrole et NTA entre 500 cm-1
et
2000 cm-1
et entre 2500 et 4000 cm-1
. Sur les figures IV.7.a, les pics situés entre 1820 et 1784 cm-1
correspondant aux parties de pyrrolidone du groupe ester activé substitué du monomère du pyrrole.
Une autre bande apparaît entre 1500 et 1580 cm-1
, qui correspond à la chaîne aromatique de
polypyrrole. Les spectres enregistrés après le greffage de NTA sur le film de co-polypyrrole (figure
IV.7.b), présentent un pic situé à 3500 cm-1
correspond au groupement carbonylique et un pic située
Résultats & discussion
Chapitre IV
121
à 2924 cm-1
correspond à un groupement alkyle. Finalement un pic à 1445 cm-1
est attribué au mode
déformation de vibration des groupes carboxyliques.
4000 3500 3000 2500
4000 3500 3000 2500
Poly(Py-PyNTA)
Poly(Py-PyNHP)
a CH2
2924
C=O
3500
nombre d'onde (cm-1)
Tra
nsm
itta
nce
(u
.a)
b
a
2000 1500 1000 500
0.85
0.90
0.95
1.00
1.052000 1500 1000 500
0.90
0.92
0.94
0.96
0.98
1.00
1.02
nombre d'onde (cm-1)
Tra
nsm
itta
nce
(u
.a)
s O-C-O
1445C=O
1726
b
C=O
1784C=O
1733
aC=C
1580
a
Figure IV. 7 : Spectre infrarouge du film de co-polypyrrole électrodéposé sur une électrode d’or(a) et NTA
greffé sur le film de co-polypyrrole (b).
III.4. Caractérisation par voltammétrie cyclique
Les propriétés électrochimiques de la couche de polypyrrole ont été analysées par la
voltamètrie cyclique après chaque étape de la construction du biofilm. En effet, la caractérisation
électrochimique de chaque couche est confirmée par le contrôle du flux d‟électrons entre le film de
copolymère et les médiateurs. La figure IV.8 montre le spectre I (V) d‟un film de copolymère
électrodéposé sur une électrode d‟or et d‟un film de copolymère modifié successivement avec une
couche de NTA et une couche de Cu2+
dans une solution PBS pH7
En balayant le potentiel à 50 mV/s entre -0.8 et 0.6 V, le voltamogramme correspondant au
film du copolypyrrole (Py, PyNHP) montre un large signal où le potentiel d‟oxydation est dans la
gamme de 0.18 V et la réduction à 0.29 V/ ECS. Ce signal est généralement obtenu dans le cas des
films de polypyrrole fonctionnalisé [129
]. La présence d‟une couche de NTA a été confirmée par la
diminution du courant. En effet, cette couche provoque le blocage de transfert d‟électron au niveau
du film du copolypyrrole. Par la suite, l‟interaction de l'ion de cuivre (Cu2+
) avec NTA greffé sur le
film mène à l'apparition d'un signal électrochimique réversible où le potentiel d'oxydation est
observé à 189 mV. Ce signal électrochimique résulte d'une épine dorsale bien organisée de
Résultats & discussion
Chapitre IV
122
polypyrrole après interaction avec le Cu2+
et également une contribution des propriétés redox du
cuivre pour augmenter la conductivité du film avec une stabilité redox plus élevée [130
].
-1.0 -0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
-0.00003
-0.00002
-0.00001
0.00000
0.00001
0.00002
0.00003
0.00004
0.00005
0.00006
co
ura
nt (A
)
Tension (V)
PPY
NTA
Cuivre
Figure IV. 8 : Voltamogrammes des différentes couches constituant le biofilm déposé sur une électrode d’or.
Mesures effectuées dans le PBS pH 7 entre -0.8 et 0.6 V, avec une vitesse de balayage le
potentiel à 50 mV/s .
III.5. Caractérisation électrique par EIS pour différent potentiels dc
La spectroscopie d‟impédance électrochimique a été employée pour caractériser et étudier la
construction du biofilm à différents potentiel DC (0, -200, -400, -600, -800 et -1400 mV) dans le but
de déterminer les conditions optimales de fonctionnement de l‟immunocapteur. Sur la figure IV.9
sont reportés pour chaque potentiel appliqué les diagrammes de Nyquiste d‟un film de copolymère
électrodéposé sur une électrode d‟or et d‟un film de copolymère modifiée successivement avec une
couche de NTA, une couche de Cu2+
et une couche de fragment d‟anticorps. Tous ces diagrammes
ont été modélisés en utilisant le circuit équivalent représenté dans figure IV.3. Les paramètres
électriques modélisés sont présentées dans le tableau IV.2.
Résultats & discussion
Chapitre IV
123
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
-Im
(Z)
(c
m)
Re(Z) ( cm )
PPY
NTA
Cu
Ac
0V
-500 0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500 5000 5500 6000
-500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
4500
5000-200 mV
- Im
(Z
) (
cm
2)
Re (Z) ( cm2)
PPY/PPY-NHP
ANTA
Cu2+
His-Ab
-1000 0 1000 2000 3000 4000 5000 6000 7000 8000 9000
-1000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
- Im
(Z
) (
cm
2)
Re (Z) ( cm2)
PPY
NTA
Cu2+
Ac
- 400 mV
0 2000 4000 6000 8000 10000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
-600 mV
- Im
(Z
) (
cm
2)
Re (Z) ( cm2)
PPy/PPy-NHP
ANTA
Cu2+
His-Ab
0 2000 4000 6000 8000 10000
-500
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
4000
-
Im (
Z)
( c
m2)
Re (Z) ( cm2)
PPY
NTA
Cu2+
Ac
- 800 mV
0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200
0
100
200
300
400
500
- Im
(Z
) (
cm
2)
Re (Z) ( cm2)
PPy/PPy-NHP
ANTA
Cu2+
His- Ab
- 1400 mV
Figure IV. 9: Diagrammes de Nyquist pour différentes couches constituant le biofilm obtenus pour différents
potentiels (0, -200, -400, -600, -800 et -1400 mV) .Les mesures d’impédances ont été réalisées
dans une gamme de fréquence 100mHz-100kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
Résultats & discussion
Chapitre IV
124
Potential (mV)
Couches Rs (Ωcm2) Rf(Ωcm2) Cf(mFcm2) Rtc(Ωcm2) W (Ωcm2) CPE (mFcm2)- αCPE 2
0 PPY 38.89 0.13 11.003 0.16 1.60 0.019 7679 101.09 48789 657 0.41 0.006 0.81 0.0018 0.0018
NTA 37.30 0.12 14.72 0.14 1.90 0.018 12679 134.87 5384 64.7 0.29 0.005 0.87 0.0017 0.0019
Cu+2 35.25 0.14 58.07 1.34 1.10 0.015 7135 107.56 7550 110.3 0.36 0.005 0.82 0.0016 0.0018
Ac 35.01 0.13 86.56 2.78 0.85 0.012 9943 124.8 10164 123.7 0.22 0.005 0.82 0.0017 0.0018
-200 PPY 37.38 0.12 24 0.45 1.73 0.019 5071 88.8 7546 106.1 0.64 0.006 0.80 0.0018 0.0012
NTA 29.98 0.11 53 1.23 1.02 0.019 6340 93.8 4359 63,7 0.41 0.005 0.81 0.0019 0.0016
Cu+2 29.09 0.12 73 1.96 4.07 0.024 4877 75.8 13456 189.9 0.34 0.004 0.81 0.0017 0.0015
Ac 26.92 0.13 23 0.52 1.38 0.015 7793 99.7 12250 156.8 0.16 0.002 0.86 0.0019 0.0019
-400 PPY 37.24 0.14 78 1.35 1.01 0.019 5506 83.9 9205 115.2 0.20 0.002 0.87 0.0018 0.0021
NTA 27.47 0.15 33.5 1.34 1.09 0.019 6172 97.7 9677 119.0 0.18 0.002 0.89 0.0016 0.0023
Cu+2 28.9 0.14 87 1.87 9.10 0.019 4225 64.0 10184 122.0 0.18 0.002 0.88 0.0017 0.0021
Ac 27.2 0.13 97 1.81 0.94 0.019 6749 98.3 9806 117.8 0.15 0.002 0.85 0.0018 0.0022
-600 PPY 36.51 0.13 181 2.25 0.16 0.001 4150 62.1 7581 106.6 0.15 0.002 0.87 0.0019 0.0021
NTA 27.32 0.13 145 2.14 0.12 0.001 5003 67.9 8502 113.7 0.13 0.001 0.85 0.0019 0.0020
Cu+2 28.78 0.12 168 2.25 0.15 0.001 4520 63.2 9121 124.0 0.15 0.002 0.79 0.0018 0.0019
Ac 26.91 0.12 160 2.11 0.21 0.001 4901 65.3 9357 125.6 0.10 0.001 0.78 0.0016 0.0023
-800 PPY 35.31 0.12 224 2.83 0.12 0.001 3202 54.3 5683 79.6 0.032 0.0009 0.87 0.0018 0.0013
NTA 26.81 0.14 291 2.93 0.23 0.001 2543 59.7 13002 176.8 0.023 0.0009 0.90 0.0017 0.0015
Cu+2 28.02 0.12 284 2.73 0.25 0.001 3102 54.9 12040 165.9 0.018 0.0008 0.91 0.0019 0.0014
Ac 25.75 0.12 253 2.56 0.22 0.01 3402 57.3 14100 213.0 0.018 0.0008 0.92 0.0018 0.0012
-1400 PPY 27.53 0.13 355.8 3.25 0.036 0.0004 136 1.44 64.07 0.76 0.0 67 0.001 0.90 0.0015 0.0019
NTA 27.27 0.11 491.9 3.45 0.034 0.0004 554.7 1.98 117.4 0115 0.10 0.001 0.92 0.0015 0.0019
Cu+2 26.51 0.11 325.8 3.29 0.028 0.0004 212.1 1.56 64.99 0.81 0.15 0.001 0.91 0.0018 0.0020
Ac 27.73 0.12 473.6 3.32 0.025 0.0004 272.6 1.45 81.11 0.92 0.25 0.002 0.89 0.0017 0.0016
Tableau IV. 2: Paramètres de simulation des diagrammes de Nyquist pour différentes couches constituant le
biofilm obtenus à différents potentiels. Paramètres issus du fittage avec le circuit de la figure
IV.3.
Pour chacun des potentiels, les résultats montrent une augmentation de la résistance de
transfert de charge Rtc après l'immobilisation de NTA sur le film de co-polypyrrole, ce qui vérifie
clairement l'attachement covalent du film de NTA sur l'électrode modifiée. Par conséquent, la
formation d'un film isolant et négativement chargé de NTA permet partiellement le blocage de
transfert d'électron au niveau de l‟électrode modifié. Ceci mène à la diminution de la conductivité
ionique de la couche entière du copolymère. Par la suite, la diminution de Rtc pendant le greffage
des ions métalliques, indique l'attachement du cuivre sur l'électrode modifiée. La formation d'une
couche de Cu2+
favorisera le transfert d'électron de l'électrode modifiée, donc l‟augmentation de la
conductivité ionique. Finalement, l'immobilisation des fragments d‟anticorps (scAb) sur l'électrode a
été indiquée par une augmentation de Rtc.
Outre, les spectres d'impédance des différentes couches montrent le phénomène de diffusion
vers les basses fréquences pour les potentiels variant de 0 jusqu‟à -800 mV, donc, nous ne pouvons
pas observer la résistance de transfert de charge puisque l'impédance de Warburg est très élevée par
Résultats & discussion
Chapitre IV
125
rapport à cette dernière. Ceci a pu être expliqué par la diffusion des ions à la couche de polypyrrole
pour assurer l'électroneutralité dans le processus de dopage. Par contre, à -1400 mV, nous avons
obtenu des faibles impédances de Warburg qui sont attribuées à la diminution du mouvement
ionique de l'interface film-électrolyte, puisque la couche de co-polypyrrole est dans l'état isolant et
aucun échange ionique n'était obtenu à ce potentiel.
Les paramètres analysés (Tableau IV.3), montrent que la valeur de Rtc change avec la variation
du potentiel. À -1400 mV, nous avons obtenue une faible valeur de la résistance de transfert de
charge pour le film PPy.PPy-NHP/NTA/Cu2+
/ Sc-Ac qui est de l‟ordre de 272.6 cm2. Par contre, à
0 V nous avons obtenu une Rtc l‟ordre de 9943 cm.2
La faible valeur de Rtc obtenue à-1400 mV
peut être attribuée à la résistance de transfert de charger du complexe redox NTA/Cu2+
/ Sc-Ac
résultant du processus de réduction du complexe et d'eux une augmentation du courant faradique. Le
complexe NTA/Cu2+
est connu par avoir subir le processus de réduction de Cu2+
/ Cu vers la basse
gamme de potentiel comme il est démontré déjà dans le cas du polypyrrole fonctionnalisé avec
NTA/Cu 2+
[3] et aussi les monocouches de NTA/Cu2+
déposé sur l'électrode de verre de carbone
[référence Limoges ] où le potentiel de réduction est observé autour de -1.2v. A -1400 mV le
processus redox électrochimique de la réduction du complexe de cuivre a lieu et ceci provoque une
diminution de la résistance de transfert de charge. En conséquence, ce processus redox mène à une
augmentation de la conductivité ionique de la membrane d'immunocapteur à ce potentiel.
Pour étudier la stabilité du biofilm, la caractérisation des différentes couches a été répétée
plusieurs fois dans les mêmes conditions à -1400 mV. L'histogramme présenté dans la figure IV.10
indique les valeurs moyennes de la résistance de transfert de charge pour les différentes couches. La
résistance moyenne Rtc du film modifié par la couche NTA est de l‟ordre de 563.575 Ω cm2 avec un
écart type relatif de 8.9 %. La résistance moyenne Rtc du film modifié par la couche Cu2+
est de
l‟ordre de 164.5 Ω cm2 avec un écart type relatif de 6.4%. Et finalement la valeur moyenne de la
résistance de transfert de charge correspondant au film modifié par la couche de sc-Ac est de l‟ordre
de 284 Ω cm2 avec un écart type relatif de 7.1 %. Ces résultats prouvent la stabilité du système à -
1400 mV.
Résultats & discussion
Chapitre IV
126
ANTA Cu2+ Ab
0
100
200
300
400
500
600
Couche
Rtc
cm
2)
Figure IV. 10: Histogramme présentant la variation de la résistance de transfert de charge de chaque couche
constituant le biofilm.
IV. Réponse de l’immunocapteur à différents potentiels
Les interactions antigène - l'anticorps ont été suivies par la spectroscopie d'impédance à
différents potentiels (0, -200,-400, -600, -800 et -1400 mV) dans le but de déterminer les conditions
électriques optimales de fonctionnement de l‟immunocapteur. Sur la figure IV.11 sont reportés pour
chaque potentiel appliqué le de diagramme de Bode d‟une l'électrode modifiée PPy.PPy-
NHP/NTA/Cu2+
/ Sc-Ac suivit des spectres obtenus après incubation de cette électrode dans
différentes concentrations d'antigène dilués dans une solution PBS pH7. Systématiquement,
l'électrode modifiée avec le fragment d'anticorps de tag-histidine a été équilibrée avec une gamme
des concentrations de l'antigène spécifique (de 0 à 100 ng ml-1
).
Résultats & discussion
Chapitre IV
127
-2 -1 0 1 2 3 4 5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
log
Z
log(f)
Ac 0,4 mg/ml
Ag 100 pg/ml
Ag 500 pg/ml
Ag 4,5 ng/ml
Ag 100 ng/ml
0 mV
-2 -1 0 1 2 3 4 5
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
4.0
log
|Z|
log (f)
Ac 0.4 mg/ml
Ag 100 pg/ml
Ag 500 pg/ml
Ag 4.5 ng/ml
Ag 100 ng/ml
- 200 mV
-2 -1 0 1 2 3 4 5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
lo
g|Z
|
log (f)
His-Ab 0.4 mg/ml
Ag 100 pg/ml
Ag 500 pg/ml
Ag 4.5 ng/ml
Ag 100 ng/ml
-400 mV
-2 -1 0 1 2 3 4 5
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
log(f)
log
Z
Ac 0,4 mg/ml
Ag 100 pg/ml
Ag 500 pg/ml
Ag 4,5 ng/ml
Ag 100 ng/ml
-600 mV
-2 -1 0 1 2 3 4 5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
5.0
log(f)
log
Z
Ac 0,4 mg/ml
Ag 100 pg/ml
Ag 500 pg/ml
Ag 4,5 ng/ml
Ag 100 ng/ml
- 800 mV
-1 0 1 2 3 4 5
1.2
1.4
1.6
1.8
2.0
2.2
2.4
2.6
2.8
3.0
3.2
3.4
3.6
3.8
log (f)
log
|Z|
His-Ab 0.4 mg/ml
Ag 100 pg/ml
Ag 500 pg/ml
Ag 10 ng/ml
Ag 100 ng/ml
- 1400 mV
-
Figure IV. 11 : Diagrammes de Bode obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or modifiée
(PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Sc-Ac) dans différentes concentrations d'antigène à différents
potentiels .Les mesures d’impédances ont été réalisées dans une gamme de fréquence 100mHz-
100kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
Résultats & discussion
Chapitre IV
128
Les résultats montrent que vers les basses fréquences, le module |Z(f)| d'impédance augmente
clairement avec l'augmentation de la concentration de l‟antigène ce qui prouve l‟interaction
spécifiques entre l‟antigène et l‟anticorps qui est immobilisé sur la couche extérieure de l‟électrode
et perturbe les propriétés électriques de la couche. Par ailleurs, pour les potentiels variant de 0 à -800
mV/SCE les spectres d'impédance correspondants à l‟interaction l'Ag-Ac indiquent un
comportement de diffusion. Alors que les spectres d'impédance obtenus à -1400 mV indiquent que le
biofilm présente une électroactivité assez élevée, venant de la réduction d'ions de cuivre du
complexe, par rapport aux autres potentiels
Tous ces diagrammes de la figure IV.11ont été modélisés en utilisant le circuit équivalent
représenté dans figure IV.3. Les paramètres électriques modélisés sont présentées dans le tableau 3.
Les résultats montrent que la résistance de transfert de charge augmente avec l‟augmentation de la
concentration d‟antigènes. Ce qui mène au traçage des courbes de calibration pour chaque potentiel.
Résultats & discussion
Chapitre IV
129
Potential (mV)
Ag Concentration
Rs (Ωcm2) Rf(Ωcm2) Cf(mFcm2) Rtc(Ωcm2) W (Ωcm2) CPE (mFcm2)- αCPE 2
0 0 28.01 0.15 12.30 0.14 0.15 0.001 6165 72.34 1960 17.01 0.54 0.005 0.87 0.0018 0.0022
100 pg/ml 29.68 0.14 12.50 0.14 0.078 0.0005 6229 70.09 2047 18.34 0.42 0.005 0.85 0.0019 0.0015
500 pg/ml 29.33 0.15 18.99 0.23 0.191 0.001 6313 65.84 6017 45.09 0.37 0.004 0.80 0.0019 0.0021
4.5 ng/ml 30.89 0.16 29.51 0.34 0.27 0.001 6365 72.32 16491 234.0 0.25 0.004 0.76 0.0017 0.0014
100.ng/ml 29.66 0.15 44.10 0.51 0.16 0.001 6447 73.34 19933 243.1 0.15 0.003 0.74 0.0019 0.0016
-200 0 27.61 0.14 53.80 0.61 1.06 0.011 5025 53.43 19327 224.2 0.60 0.007 0.84 0.0018 0.0022
100 pg/ml 29.02 0.13 48.60 0.51 1.98 0.022 5050 49.87 12327 151.0 0.50 0.007 0.79 0.0017 0.0019
500 pg/ml 28.22 0.14 58.48 0.65 1.07 0.013 5198 53.87 13188 165.9 0.28 0.004 0.71 0.0016 0.0015
4.5 ng/ml 28.72 0.13 94.90 0.87 1.07 0.013 5317 59.76 20296 275.1 0.17 0.003 0.70 0.0016 0.0024
100.ng/ml 29.01 0.13 80.70 0.81 1.60 0.024 5367 45.34 23943 279.6 0.29 0.004 0.70 0.0015 0.0023
-400 0 26.66 0.15 96.31 0.87 0.024 0.0003 4864 39.43 9771 134.6 0.46 0.005 0.87 0.0017 0.0017
100 pg/ml 27.23 0.15 102.36 0.90 0.042 0.0004 4919 37.64 8923 110.9 0.29 0.004 0.82 0.0017 0.0020
500 pg/ml 26.11 0.13 83.10 0.76 0.011 0.0002 4948 38.34 11103 156.5 0.17 0.003 0.69 0.0016 0.0023
4.5 ng/ml 28.19 0.11 82.00 0.76 0.056 0.0007 4986 39.98 9709 137.3 0.081 0.001 0.77 0.0016 0.0020
100.ng/ml 27.53 0.12 97.30 0.81 0.036 0.0002 5036 45.12 8943 112.0 0.062 0.0009 0.80 0.0017 0.0026
-600 0 27.42 0.14 108.72 0.95 0.034 0.0004 4595 51.25 10469 142.0 0.210 0.004 0.79 0.0016 0.0020
100 pg/ml 26.98 0.14 145.90 1.34 0.074 0.0010 4634 52.76 10100 140.1 0.10 0.003 0.78 0.0016 0.0021
500 pg/ml 26,45 0.15 134.50 1.23 0.033 0.0004 4754 56.34 14008 165.8 0.048 0.0008 0.83 0.0019 0.0025
4.5 ng/ml 28.55 0.12 125.70 1.21 0.047 0.0005 4866 58.23 19203 241.2 0.032 0.0008 0.87 0.0018 0.0019
100.ng/ml 27.00 0.13 123 1.12 0.035 0.0004 4865 59.34 22277 269.3 0.022 0.0007 0.88 0.0019 0.0024
-800 0 26,02 0.14 150 1.24 0.021 0.0003 3920 42.87 24100 281.8 0.060 0.001 0.82 0.0017 0.0023
100 pg/ml 26.87 0.15 198 1.56 0.021 0.0003 3957 42.23 25588 297.2 0.060 0.001 0.83 0.0018 0.0024
500 pg/ml 26.82 0.14 134 1.28 0.021 0.0003 3986 42.87 28869 301.2 0.058 0.001 0.82 0.0017 0.0024
4.5 ng/ml 28.18 0.15 130 1.22 0.023 0.0003 4016 53.34 45289 490.0 0.049 0.001 0.83 0.0017 0.0023
100.ng/ml 29.45 0.13 189 1.45 0.014 0.0002 4072 54.32 52910 523.9 0.049 0.001 0.79 0.0016 0.0025
-1400 0 28.38 0.14 284.1 5.86 27.8 0.41 214.4 2.63 44.03 0.81 0.18 0.002 0.90 0.002 0.0017
100 pg/ml 29.14 0.15 217.7 4.34 34.8 0.43 279.9 2.91 44.02 0.84 0.120 0.002 0.89 0.002 0.0018
500 pg/ml 27.72 0.14 338.7 6.56 31.7 0.47 438.4 6.73 78.25 0.91 0.14 0.002 0.87 0.002 0.0017
10 ng/ml 27.73 0.14 302.5 5.03 34.2 0.39 614.4 9.56 119.5 1.11 0.097 0.0004 0.86 0.002 0.0018
100.ng/ml 26.58 0.13 308.6 4.98 38.4 0.43 891.4 12.00 195.4 1.61 0.077 0.0004 0.87 0.002 0.0017
Tableau IV. 4: Paramètres de simulation des diagrammes de Bode de différent potentiels obtenus avant et
après incubation d’une électrode d’or modifiée (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Sc-Ac) dans
différentes concentrations d'antigène diluées dans le PBS. Paramètres issus du fittage avec le
circuit de la figure IV.3.
Les résultats du tableau montrent que la résistance de transfert de charge apparaît comme
valeur variable importante lors de l'interaction d'antigène-anticorps. On observe également et
particulièrement une variation des paramètres Rf et Cf correspondant aux caractéristiques électriques
de la couche de polypyrrole à 0 V où le polypyrrole est dans l'état conducteur.
En outre, les valeurs de R tc correspondant aux interactions Ag-Ac montrent le phénomène de
diffusion vers les potentiels variant de 0 jusqu‟à -800 mV, donc, la résistance de transfert de charge
est faible par rapport à l'impédance de Warburg. Par contre, à -1400 mV les valeurs de Rtc indiquent
que le biofilm présente une électroactivité assez élevée, due à la réduction d'ions de cuivre du
complexe, par rapport aux autres potentiels
Résultats & discussion
Chapitre IV
130
Afin d'étudier la réponse d'immunocapteur, pour différents potentiels DC, les courbes
d'étalonnage correspondant à la variation de la résistance de transfert de charge (Rt c) en fonction des
différentes concentrations d‟antigènes dans la solution de PBS, ont été présentées dans figure IV.12.
La variation de la résistance de transfert de charges a été calculée à partir de l'équation suivante :
Où et sont respectivement les valeurs de la résistance de transfert de charge pour
l‟anticorps et les antigènes obtenue à partir du modèle électrique.
0.0000 0.0002 0.0004 0.0006 0.0008 0.0010
0
50
100
150
200
250
R
tc c
m2)
Concentrations ( µg/ml)
-1400 mV
- 800 mV
- 600 mV
- 400 mV
- 200 mV
- 0 mV
Figure IV. 12 : Courbe de calibration présentant la variation de la résistance de transfert de charge en
fonction des différentes concentrations d’antigènes à différents potentiels. Détection effectuée
dans le PBS (10 mM, pH 7).
Les courbes d'étalonnage d'immunocapteur montrent une relation linéaire entre le Rtc et la
concentration d‟antigène dans une gamme de 10-1
jusqu'à pg 500 ml -1
pour la majorité de potentiels
appliqués, avec une limite de détection de l‟ordre de 100 pg ml -1
.
Les caractéristiques de l'immunocapteur, déduites de ces courbes, telles que la sensibilité, le
coefficient de corrélation, l‟étendue de mesure du système et l‟écart type relatif moyen pour chaque
potentiel ont été présenté dans le tableau IV.4. Par conséquent, ces résultats prouvent bien que
l'immunocapteur est plus sensible à -1400 mV parce qu'il montre la plus grande variation de Rtc avec
la meilleure étendue de mesure allant de 10 -1
à 10 ng ml-1
et la grande sensibilité dont son équation
Résultats & discussion
Chapitre IV
131
de régression linéaire obtenue est Rtc = 4,33 10 5
[ AG ] + 60,64, avec un coefficient de corrélation
de 0,951. La reproductibilité et la stabilité de l'immunocapteur a été étudiée à différents potentiel en
répétant l'expérience avec quatre immunocapteur différents. Le meilleur écart type moyen est obtenu
pour le potentiel -1400 mV. Donc la reproductibilité de la meilleure réponse de l‟immunocapteur
pour différentes concentration d‟antigènes est caractérisée par une variation de 9%.
Potentiel (mV) Sensibilité
(Ωcm2/µg .ml-1)
R2 Etendue de mesure Ecart type moyen
(%)
0 2.92 0.950 0 - 500 pg /ml
14.5
-200 3.5 0.996 0 - 500 pg /ml 11.01
-400 4.1 0.986 0 - 100 pg /ml 12.73
-600 3.1 0.997 0 - 500 pg /ml 13.2
-800 3.7 0.997 0 - 100 pg /ml 15.3
-1400 4.3 0.990 0 - 10 ng /ml 9
Tableau IV. 5: Caractéristiques de la repense de l’immunocapteur à différents potentiels.
La figure IV.13 présente le diagramme de Nyquiste correspondant à l'électrode modifiée avec
le fragment d'anticorps suivit des spectres obtenus après incubation avec différentes concentrations
d'antigène et la courbe calibration pour une gamme de concentration plus large (10-4
jusqu‟à 1 µg
ml-1
) pour le potentiel -1400 mV. La réponse du système (cf. figure IV.13.b) à ce potentiel est
caractérisée par une variation moyenne de 9%.
Résultats & discussion
Chapitre IV
132
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
mesure d'impedance pour l'injection des differentes
concentrations d'Ag
Re (Z) (Ohm cm2)
- Im
(Z
) (O
hm
cm
2)
Ag - 0.4 mg/ml
Ag - 100 pg/ml
Ag - 500 pg/ml
Ag - 10 ng/ml
Ag - 100 ng/ml
Ag - 1 microg/ml
Ag - 10 microg/ml
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
100 ng/ml
10 ng/ml
500 pg/ml
100 pg/ml
Rtc
cm
2)
[Ag] ( µg/ml)
Figure IV. 13: (a) Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or
modifiée (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Sc-Ac) dans différentes concentrations d'antigène (de 0
jusqu’à 10µg ml-1
). Detection effectué dan le milieu PBS pH7. Les mesures d’impédances ont
été réalisées dans une gamme de fréquence 100mHz-100kHz dans la solution PBS pH7. (b)
Courbe de calibration présentant la variation de la résistance de transfert de charge en fonction
des différentes concentrations d’antigènes. Détection effectuée dans le PBS pH 7.
Sur la figure IV.13.a nous observons sur les spectres correspondant aux grandes
concentrations d‟antigènes le phénomène de diffusion vers des basses fréquences. Ce phénomène
mène à l‟augmentation de l‟impédance de Warburg ce qui est un compromis pour la repense de notre
capteur.
V. Conclusion
Dans cette partie, nous avons présenté une nouvelle méthode pour la fabrication des
immunocapteurs basés sur l'immobilisation de l'anticorps de tag Histidine sur un film de co-
polypyrrole maintenant le complexe NTA/Cu2+
. Premièrement, nous avons démontré qu'en
employant la spectroscopie électrochimique d'impédance combinée avec les modèles théoriques de
circuits équivalents il est possible de déterminer les propriétés électriques et d'étudier le
comportement du film de copolymère pour différents potentiel. Nous avons également prouvé que
l'EIS peut être employé pour contrôler la construction de la membrane de biofilm à coté de la
résonnance plasmonique de surface l‟AFM et la spectroscopie infrarouge.
L‟étude de la réponse de l‟immunocapteur à différents potentiels de polarisation nous a
permis de déterminer les conditions électriques optimales où le capteur est plus sensible. Les
Résultats & discussion
Chapitre IV
133
résultats montrent que le potentiel -1400mV où se provoque la réduction du processus redox du
complexe (NTA/Cu2+
) greffé le biofilm mène à la plus sensible variation du signal d‟impédance.
Résultats & discussion
Chapitre IV
134
Partie B. Mise au point d’un immunocapteur impédimètrique à base de
polymère conducteur : détection d’antigène dans le plasma humain
et dans le sang pour le diagnostique de la thrombose veineuse
profonde (DVT).
I. Introduction
La thrombose veineuse profonde (DVT) est l‟une des plus grandes maladies causant la mort
inattendue des patients hospitalisés dans les pays développés. Bien que l'évaluation de la DVT soit
souvent guidée par l‟utilisation de la technique standard, l'ultrasonographie dépendant largement de
l'expérience du radiologiste et paraissant difficile [131
], une étude diagnostique est souvent exigée.
Dans ce contexte, nous nous somme investis dans la mise au point d‟un immunocapteur
impédimètrique à base de polymères conducteurs permettant la détection d'antigène modèle, dans un
premier temps, puis d‟un marqueur spécifique à cette maladie, le D-dimer. Bien que ce type
d‟immunocapteur constitue de nos jours un progrès significatif par rapport aux immunocapteurs de
première génération, avec la particularité d'amplifier la réponse du signal de l'interaction antigène–
anticorps et d'améliorer les caractéristiques d'immunocapteur [132
], une détection dans le plasma
sanguin humain s‟avère nécessaire afin de permettre le diagnostic de cette maladie sur les patients.
En effet, dans la partie précédente de ce chapitre nous avons optimisé les conditions
électriques de fonctionnement pour le développement d‟un immunocapteur impédimètrique basé sur
le polymère conducteur modifié, le polypyrrole. Cet immunocapteur a été fabriqué par un
biomatériau constitué d‟un film de co-polypyrrole fonctionnalisé sur lequel la partie variable FAB de
l‟anticorps marquée histidine (Fab fragment Hist-ScAc) est immobilisée par l'intermédiaire de
l‟agent NTA coordonné avec un métal le cuivre Cu2+
, pour la reconnaissance de l‟antigène modèle
qui est un peptide antigénique couplé à la BSA.
De ce fait, dans cette partie nous nous intéressons à la mise au point de cet immunocapteur
pour la détection de l‟antigène modèle en se basant sur les conditions optimales définies dans la
première partie de ce chapitre. Nous nous sommes intéressés à l‟étude de la spécificité de la réponse
Résultats & discussion
Chapitre IV
135
de l‟immunocapteur dans différents milieux tels que le milieu tampon (PBS), le plasma humain et le
sang entier d‟un rat, afin de déterminer son applicabilité pour le diagnostic.
La caractérisation électrique, les étapes de l'élaboration de l'immunocapteur ont été présentés
dans la partie précédente. Dans cette partie nous nous intéressons à l‟étude de la détection de
l‟antigène modèle dans différents milieux en utilisant la technique de spectroscopie d'impédance
électrochimique (EIS).
II. Réponse de l’immunocapteur en milieu PBS
II.1. Sans blocage de la surface avant incubation de l’antigène
Dans cette partie nous présentons les résultats de la partie précédente de ce chapitre (détection
d‟antigène dans le PBS (10mM pH7) à -1400 mV) afin de faire la comparaison avec la détection de
l‟antigène modèle dans les autres milieux.
Après avoir élaboré l‟immunocapteur, nous avons effectué la détection dans la solution de PBS
(10mM pH7) afin d'étudier ses caractéristiques. La figure IV.14 présente les diagrammes de Nyquist
à -1400 mV obtenus avant et après incubation avec différentes concentrations d'antigène (de 0
jusqu‟à 10µg ml-1
). Les mesures d‟impédances ont été réalisées dans une gamme de fréquence
100mHz-100kHz dans la solution PBS (10 mM pH7).
0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
Re (Z) ( cm2)
- Im
(Z
) (
cm
2)
Ac - 0.4 mg/ml
Ag - 100 pg/ml
Ag - 500 pg/ml
Ag - 10 ng/ml
Ag - 100 ng/ml
Ag - 1 g/ml
Ag - 10 g/ml
Figure IV. 14: Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or
modifiée (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Sc-Ac) dans différentes concentrations d'antigène (de 0
jusqu’à 10µg ml-1
). Les mesures d’impédances ont été réalisées dans une gamme de fréquence
100mHz-100kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
Résultats & discussion
Chapitre IV
136
Comme le montre la figure IV.14, le diamètre des spectres d'impédance augmentent
clairement avec l'augmentation de la concentration de l‟antigène, ce qui est dû à l‟interaction
spécifique entre l‟antigène et l‟anticorps. Par ailleurs, tous ces diagrammes ont été modélisés en
utilisant le circuit équivalent représenté sur la figure IV.3. Les paramètres électriques obtenus sont
présentés dans le tableau IV.5.
Potentiel
(mV)
Ag
Concentration
Rs
(Ωcm2)
R
f(Ωcm2)
Cf
(µFcm2)
Rtc
(Ωcm2)
W (Ωcm2) CPE (mFcm2)- αCPE 2
-1400
0 28.38 0.14 284.1 5.86 27.8 0.41 214.4 2.63 44.03 0.81 0.18 0.002 0.90 0.002 0.0017
100 pg/ml 29.14 0.15 217.7 4.34 34.8 0.43 279.9 2.91 44.02 0.84 0.120 0.002 0.89 0.002 0.0018
500 pg/ml 27.72 0.14 338.7 6.56 31.7 0.47 438.4 6.73 78.25 0.91 0.14 0.002 0.87 0.002 0.0017
10 ng/ml 27.73 0.14 302.5 5.03 34.2 0.39 614.4 9.56 119.5 1.11 0.097 0.0004 0.86 0.002 0.0018
100.ng/ml 26.58 0.13 308.6 4.98 38.4 0.43 891.4 12.00 195.4 1.61 0.077 0.0004 0.87 0.002 0.0017
1µg/ml 25.25 0.15 767.9 8.78 32.9 0.46 1481 19.83 7241 54 0.084 0.0004 0.85 0.002 0.0019
10µg/ml 23.72 0.14 666 7.98 36.707 0.47 1639 23.09 7181 37 0.086 0.0004 0.85 0.002 0.0017
Tableau IV. 6: Paramètres issus du fittage avec le circuit de la figure IV.3 des diagrammes de Nyquist
obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or modifiée (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Sc-
Ac) dans différentes concentrations d'antigène diluées dans le PBS (10 mM, pH7).
Les résultats de ce tableau montrent que la résistance de transfert de charge Rtc augmente avec
l‟augmentation de la concentration en antigène. Pour tracer la courbe de calibration, nous
représentons la variation de la résistance de transfert de charge Rtc en fonction de la concentration
en antigène modèle dilué dans la solution de PBS (figure IV.15).
La variation de la résistance de transfert de charges est calculée à partir de l'équation
suivante:
Résultats & discussion
Chapitre IV
137
Où et sont respectivement les valeurs de la résistance de transfert de charge pour
l‟anticorps seul et pour une certaine concentration en antigène, obtenues à partir du modèle
électrique.
Figure IV. 15: Courbe de calibration présentant la variation de la résistance de transfert de charge en
fonction des différentes concentrations d’antigènes. Détection effectuée dans le PBS (10 mM pH
7).
La réponse de l‟'immunocapteur montre une relation linéaire entre la Rtc et la concentration
d‟antigène dans une gamme de 10-1
jusqu'à 10 ng ml-1
avec une limite de détection de l‟ordre de 100
pg ml-1
. L'équation de régression linéaire est : Rtc = 4,33 105 [Ag] + 60,64, avec un coefficient de
corrélation de 0,951.
La reproductibilité de l'immunocapteur a été étudiée en répétant l'expérience avec quatre
immunocapteurs différents. Les résultats montrent que la réponse de l‟immunocapteur présente un
écart type moyen de 9 % ce qui vérifie la bonne reproductibilité du système pour la détection
d'antigène dans le PBS.
III. Réponse de l’immunocapteur en plasma humain
Pour évaluer la faisabilité de l'immunocapteur, la détection de l'antigène a été faite dans le plasma
humain. En fait, l'antigène modèle a été dilué dans le plasma humain à différentes concentrations. Ensuite,
l'électrode modifiée avec le fragment d'anticorps marqué histidine a été incubé dans le plasma humain
0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
10 ng/ml
500pg/ml
[Ag] ( µg/ml)
Rtc
( c
m2)
100pg/ml
100 ng/ml
Résultats & discussion
Chapitre IV
138
contenant une certaine concentration de l'antigène modèle. La figure IV.16 présente les diagrammes de
Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation avec différentes concentrations d'antigène (de 0
jusqu'à 4,5 à µg ml-1). Les mesures d’impédance ont été réalisées dans une gamme de fréquence de
100mHz-100kHz dans la solution PBS 10 mM pH7.
0 500 1000 1500 2000 25000
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
1200 Ac - 0.4 mg/ml
Ag - 100 pg/ml
Ag - 500 pg/ml
Ag - 4,5 ng/ml
Ag - 500 ng/ml
Ag - 4,5 µg/ml
- Im
(Z
) (O
hm
cm
2)
Re (Z) ( cm2)
Figure IV. 16: diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or
modifiée (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Sc-Ac) dans différentes concentrations d'antigène (de 0
jusqu'à 4,5 à µg ml-1
) dans le plasma humain. Les mesures d’impédances ont été réalisées
dans une gamme de fréquence 100mHz-100kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
Comme le montre la figure IV.16, les spectres d'impédance augmentent clairement avec
l'augmentation de la concentration de l’antigène, ce qui est dû à l’interaction spécifique entre l’antigène et
l’anticorps. Par ailleurs, tous ces diagrammes ont été modélisés en utilisant le circuit équivalent représenté
sur la figure IV.3. Les paramètres électriques obtenus sont présentés dans le tableau IV.6.
Résultats & discussion
Chapitre IV
139
Potentiel
(mV) Ag
Concentration
Rs (Ωcm2) Rf
(Ωcm2)
Cf
(µFcm2)
Rtc
(Ωcm2)
W (Ωcm2) CPE (mFcm2)- αCPE 2
-1400
0 35.14 0.12 218.6 2.76 29.4 0.44 267.8 4.34 15.12 0.12 0.0793 0.001 0.90 0.002 0.0020
100 pg/ml 32.68 0.13 236 2.98 29.7 0.44 345.9 5.34 6.412 0.09 0.61 0.007 0.79 0.001 0.0019
500 pg/ml 33.19 0.14 310 3.24 22.6 0.38 536.2 6.84 1.40 0.01 0.22 0.003 0.82 0.002 0.0020
4.5 ng/ml 31.96 0.15 345 3.43 21.6 0.37 700 9.12 2.03 0.01 0.30 0.004 0.83 0.002 0.0021
500.ng/ml 35.76 0.14 420 3.98 27.3 0.40 1271 11.23 2.09 0.01 0.12 0.002 0.83 0.002 0.0018
4.5 µg/ml 35.28 0.16 543 4.13 62.31 0.75 149412.53 2.47 0.01 0.61 0.007 0.89 0.002 0.0019
Tableau IV. 7: Paramètres issus du fittage avec le circuit de la figure IV.3 des diagrammes de Nyquist
obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or modifiée (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Sc-
Ac) dans différentes concentrations d'antigène dans le plasma humain .
Les résultats montrent que la résistance de transfert de charge augmente avec l’augmentation de la
concentration d’antigène. Pour tracer la courbe de calibration, nous présentons la variation de la résistance
de transfert de charge Rtc en fonction de la concentration en antigène dilué dans la solution de plasma
humain (cf. figure IV.17).
0 1
0
200
400
600
800
1000
1200
4.5ng/ml
500pg/ml
100pg/ml
Rtc
( c
m2
)
[Ag] ( µg/ml)
Figure IV. 17: Courbe de calibration présentant la variation de la résistance de transfert de charge en
fonction des différentes concentrations d’antigènes. Détection effectuée dans le plasma humain.
Résultats & discussion
Chapitre IV
140
La réponse de l‟'immunocapteur montre une relation linéaire entre le Rtc et la concentration
d‟antigène dans une gamme de 10-1
jusqu'à 4.5 ng ml-1
, avec une limite de détection de l‟ordre de
100 pg ml-1
. L'équation de régression linéaire est : Rct = 51935 [ AG ] + 11,62, avec un coefficient
de corrélation de 0,99.
La reproductibilité de l'immunocapteur a été étudiée en répétant l'expérience avec quatre
immunocapteurs différents. Les résultats montrent que la réponse de l‟immunocapteur présente un
écart type moyen de 10,2% ce qui vérifie la reproductibilité du système pour la détection de
l‟antigène modèle dans le plasma humain.
IV. Comparaison de la réponse de l’immunocapteur dans le PBS et dans le
plasma humain
La faisabilité d'immuno-analyse de notre immunocapteur a été évaluée en comparant ses
réponses dans le PBS et dans le plasma humain. la courbe de calibration de la figure IV.18 présente
la variation de la résistance de transfert de charge en fonction des concentrations de l‟antigène
modèle détectées dans le PBS et dans le plasma humain.
1E-4 1E-3 0.01 0.1 1 10 100
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
R
ct(
cm
2)
[Ag] ( g/ml)
Ag detection in PBS
Ag detection in human plasma
Figure IV. 18: Comparaison de la variation de la résistance de transfert de charge pour différentes
concentration d’antigène dilué dans le PBS avec les variations de résistances pour des
concentrations d’antigène dilué dans le plasma humain.
Résultats & discussion
Chapitre IV
141
La comparaison entre les valeurs de Rtc obtenues avec l‟antigène dilué dans le PBS et dans
le plasma humain montre un écart relatif moyen de 17%. Ceci vérifie clairement la faisabilité et la
validité de la détection de l'antigène dans le plasma humain.
V. Après blocage de la surface par la caséine avant incubation de l’antigène
Nous avons remarqué que pendant la détection d'antigène dans la solution PBS les spectres
d‟impédances présentées dans la figure IV.14, montrent, vers les basses fréquences, un phénomène
de diffusion significatif pour des concentrations en antigène élevées. Ceci est vérifié par les valeurs
d'impédances de Warburg présentées dans le tableau IV.5. D'ailleurs, pendant la détection d'antigène
dans le plasma humain le phénomène de diffusion a été presque atténué, ceci peut être expliqué par
la présence des molécules dans le plasma humain qui permettent de bloquer les sites non spécifiques
de la surface de l'anticorps. Pour cette raison, les sites non spécifiques qui sont sur la surface
d'anticorps ont été bloqués par la caséine avant de faire la détection. En fait, après l'immobilisation
de l'anticorps sur le biofilm, l'électrode modifiée (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Sc-Ac) a été incubée
dans 50 mg/ml de solution de caséine pendant 30 minutes à une température ambiante. Ensuite, cette
électrode modifiée était incubée successivement dans différentes solutions contenant des
concentrations d'antigène, diluées dans la solution de PBS.
La figure IV. 19 présente les diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après
blocage des sites non spécifiques avec de la caséine et après incubation de l‟électrode modifiée dans
différentes concentrations d'antigène dans le PBS. Les mesures d‟impédances ont été réalisées dans
une gamme de fréquence de 100 mHz-100kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
Résultats & discussion
Chapitre IV
142
0 500 1000 1500 2000 2500
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
1000
1100
- Im
(Z
) (
cm
2)
Re (Z) ( cm2)
Ac 0.4 mg/ml
Caseine
Ag 100 pg/ml
Ag 10 ng/ml
Ag 10 g/ml
Figure IV. 19 : Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or
modifiée (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Sc-Ac-caseine) dans différentes concentrations d’antigène
après blocage avec la caséine. Les mesures d’impédances ont été réalisées dans une gamme de
fréquence 100mHz-100kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
Nous remarquons une augmentation du diamètre du spectre d'impédance correspondant à la
couche de caséine par rapport à la couche d‟anticorps indiquant l'immobilisation de la caséine sur
l'électrode modifiée. Egalement, nous remarquons que les diamètres des spectres d'impédance
augmentent avec l'augmentation de [Ag] dans le PBS, ce qui est dû à l‟interaction spécifique entre
l‟antigène et l‟anticorps. De plus, nous remarquons que le spectre d'impédance correspondant à une
concentration élevée d‟antigène (10µg ml-1
) ne présente pas le phénomène de diffusion vers les
basses fréquences. Ceci indique l‟efficacité du blocage des sites non spécifiques sur la densification
du biofilm.
Par ailleurs, tous ces diagrammes ont été modélisés en utilisant le circuit équivalent représenté
sur la figure IV.3. Les paramètres électriques obtenus sont présentées dans le tableau IV.7.
Résultats & discussion
Chapitre IV
143
Potenti
el (mV) Ag
Concentration
Rs
(Ωcm2)
Rf
(Ωcm2)
Cf
(Fcm2)
Rct
(Ωcm2)
W
(Ωcm2)
CPE
(mFcm2)-
αCPE 2
-1400
0 27.28 0.14 396.7 3.45 24.5 0.19 366.5 4.34 148.6 2.32 0.13 0.001 0.88 0.002 0.0020
Caseine 31.1 0.15 509 6.27 23.0 0.18 645.6 7.75 330.9 3.43 0.22 0.002 0.82 0.002 0.0019
100 pg/ml 28.99 0.15 764 6.98 23.8 0.19 856.3 12.56 455.5 5.43 0.14 0.001 0.86 0.002 0.0020
10 ng/ml 28.1 0.16 618.5 5.87 39.9 0.30 987 14.32 492.9 5.65 0.11 0.001 0.84 0.002 0.0021
10 µg/ml 28.18 0.15 764 6.40 38.3 0.29 1265 18.65 503.1 5.98 0.19 0.002 0.79 0.002 0.0018
Tableau IV. 8: Paramètres issus du fittage avec le circuit de la figure IV.3.des diagrammes de Nyquist obtenus avant
et après incubation d’une électrode d’or modifiée (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Sc-Ac/caseine) dans
différentes concentrations d'antigène diluées dans le plasma humain.
Les résultats montrent que la résistance de transfert de charge augmente avec l‟augmentation
de la concentration d‟antigène.
VI. Réponse de l’immunocapteur dans le sang entier d’un rat
Pour évaluer la faisabilité de l'immunocapteur et pour quantifier un test clinique, la détection
de l'antigène modèle a été faite dans le sang entier de rat. L'antigène modèle a été dilué dans le sang
entier d‟un rat afin d'obtenir différentes concentrations. Ensuite, l'électrode, modifiée avec le
fragment d'anticorps marqué histidine et bloquée par la caséine, était incubée dans le sang contenant
une certaine concentration de l'antigène modèle. La figure IV.20 présente les diagrammes de Nyquist
à -1400 mV obtenus après incubation de l'antigène modèle (concentrations entre 100 pg ml-1
et 10
ng ml-1
). Les mesures d‟impédances ont été réalisées dans une gamme de fréquence de 100 mHz-
100kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
Résultats & discussion
Chapitre IV
144
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 1800 2000
0
100
200
300
400
500
600
700
- Im
(Z
) (
cm
2)
Re (Z) ( cm2)
Ab 0.4 mg/ml
Ag 100 pg/ml
Ag 10 ng/ml
Figure IV. 20: Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or
modifiée (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Sc-Ac-caseine) dans différentes concentrations d’antigène
dans le sang de rat. Les mesures d’impédances ont été réalisées dans une gamme de fréquence
100mHz-100kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
Nous remarquons que les diamètres des spectres d'impédance augmentent avec l'augmentation
de la concentration d‟antigène modèle, ce qui est dû à l‟interaction spécifique entre l‟antigène et
l‟anticorps dans le sang.
Tous ces diagrammes ont été modélisés en utilisant le circuit équivalent représenté sur la
figure IV.3. Les paramètres électriques modélisés sont présentés dans le tableau IV.8.
Potenti
el (mV) Ag
Concentratio
n
Rs
(Ωcm2)
Rf
(Ωcm2)
Cf(µFcm2) Rtc
(Ωcm2)
W
(Ωcm2)
CPE
(mFcm2)-
αCPE 2
-1400
0 29.35 0.13 797.7 10.6 26.2 0.35 441.9 6.8 1893 24
.9
0.350 0.005 0.77 0.00
2
0.0020
100 pg/ml 36 0.17 1013 12.6 27.1 0.37 701.6 8.3 550 8.8 0.503 0.006 0.82 0.0019
10 ng/ml 28.61 0.14 723.4 10.9 32.4 0.48 834. 8 9.7 498.8 6.
3
0.117 0.001 0.86 0.0020
Tableau IV. 9: Paramètres issus du fittage avec le circuit de la figure IV.3 des diagrammes de Nyquist obtenus avant
et après incubation d’une électrode d’or modifiée (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Sc-Ac/caseine) dans
différentes concentrations d'antigène diluées dans le sang. .
Résultats & discussion
Chapitre IV
145
La faisabilité d'immuno-analyse de notre immunocapteur a été évaluée par la comparaison
des réponses de l'immunocapteur dans le PBS et dans le sang entier de rat. A partir des données
présentées dans les tableaux IV.7 et IV.8, nous avons calculé la variation de la résistance Rtc pour les
concentrations d‟antigène 100 pg. ml-1
et 10 ng. ml-1
. La figure IV. 21 présente l'histogramme
indiquant la variation de Rtc obtenue pour ces concentrations d'antigène dans le PBS (10 mM, pH7)
et celles obtenues pour la détection dans le sang.
100 pg/ml 10 ng/ml
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
[Ag]
Rtc
( c
m2
)
Ag dilué dans le PBS
Ag dilué dans le sang
Figure IV. 21: Comparaison de la variation de la résistance de transfert de charge pour deux concentrations
d’antigène dilué dans le PBS (10 mM, pH7) avec les variations de résistances pour des
concentrations d’antigène dilué dans le sang.
La comparaison entre les valeurs de Rtc obtenues dans sang entier de rat et celle obtenue
avec le PBS a montré un écart relatif moyen de 15,7%. Ceci vérifie clairement la faisabilité de la
détection d'antigène dans le sang entier ainsi que la possibilité d‟utiliser cet immunocapteur pour le
diagnostic de la DVT.
VII. Test de non-spécificité de l’immunocapteur
Le plasma et le sang sont des milieux complexes contenant des espèces biologiques
susceptibles d‟interférer avec la détection de l‟antigène. Pour ce faire, afin d‟évaluer la spécificité de
l'immunocapteur, nous avons choisi de faire un test de non spécificité de quelques éléments
biologiques existant dans le sang humain avec leur taux normal tels que l'héparine : 0,6 unit ml-1
,
l'hémoglobine : 1200mg L-1
, la bilirubine : 190 mg L-1
et le glycérol : 2,5 mg ml -1
.
Résultats & discussion
Chapitre IV
146
Nous avons préparé quatre immunocapteurs. Ces derniers ont été préparés de la même
manière, chaque électrode d‟or présente les couches suivantes. : PPy-PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Fab-
Ac/caséine.
Par la suite, pour chaque élément biologique, nous avons préparé la concentration désirée. La
dilution des solutions mères a été effectuée dans la solution PBS (10 mM, pH7). Chaque électrode
modifiée a été incubée dans une solution contenant la concentration désirée de chaque élément
biologique pendant 30 min.
Les figures IV. 22-23-24 et 25 présentent les diagrammes de Nyquist à -1400 mV
obtenus avant et après incubation de l‟électrode modifiée dans une solution de concentration de
l‟espèce interférente à tester. Les mesures d‟impédance ont été réalisées dans une gamme de
fréquence de 100 mHz-100kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
VII.1. Test avec 190 mg/L de bilirubine
0 95 190 285 380 475 570 665 760 855 950 1045
0
76
152
228
304
380
456
- Im
(Z
) (
cm
2)
Re (Z) ( cm2)
Ac bloqué par Caseine
190 mg/L Bilirubin
Figure IV. 22 : Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or
modifié (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Ac /caséine), dans une concentration de 190 mg/L de
Bilirubine dans le PBS (10 mM, pH7). Les mesures d’impédances ont été réalisées dans une
gamme de fréquence 1 Hz-100 kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
Résultats & discussion
Chapitre IV
147
VII.2. Test avec 1200mg/L d’hémoglobine
0 95 190 285 380 475 570 665 760
0
38
76
114
152
190
228
266
304
342
- Im
(Z
) (
cm
2)
Re (Z) ( cm2)
Ac bloqué par Caseine
_._1200 mg/L d' Hémoglobine
Figure IV. 23 : Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or
modifié (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Ac /caséine), dans une concentration de 1200 mg/L
d’Hémoglobine dans le PBS (10 mM, pH7). Les mesures d’impédances ont été réalisées dans
une gamme de fréquence 1 Hz-100 kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
VII.3. Test avec 0.6 unit/ml d’héparine
0 100 200 300 400 500
0
50
100
150
200
- Im
(Z
) (
cm
2)
Re (Z) ( cm2)
Ac bloqué par Caseine
Heparin 0,6 unit/ml
Figure IV. 24: Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or
modifié (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Ac /caséine), dans une concentration de 0,6 unité/ml
d’Héparine dans le PBS (10 mM, pH7). Les mesures d’impédances ont été réalisées dans une
gamme de fréquence 1 Hz-100 kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
Résultats & discussion
Chapitre IV
148
VII.4. Test avec 2.5mg/ml de triglycéride
-100 0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 1100 1200
-50
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
Re (Z) ( cm2)
- Im
(Z
) (
cm
2)
Ac bloqué par Caseine
triglyceride 2.5mg/ml
Figure IV. 25: Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or
modifié (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Ac /caséine), dans une concentration de 2,5mg/ml de
triglycéride dans le PBS (10 mM, pH7). Les mesures d’impédances ont été réalisées dans une
gamme de fréquence 1 Hz-100 kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
Comme le montrent les figures IV. 22-23-24 et 25, le spectre d'impédance correspondant à
l‟espèce interférante varie légèrement par rapport au spectre correspondant à la couche Fab-Ac
caséine. Ceci montre une interaction entre l‟espèce interférante et l‟anticorps. Tous ces diagrammes
ont été modélisés en utilisant le circuit équivalent représenté dans figure IV.3 afin de déterminer la
variation de la résistance de transfert de charge pour chaque élément biologique testé.
L‟histogramme de la figure IV 26 présente la variation de Rtc pour chaque élément biologique
testé avec son taux normal dans le sang humain ainsi que la Rtc qui correspond à la concentration
d‟antigène de saturation (10µg/ml) détecté dans le PBS (la valeur de Rtc déduite du tableau IV.7).
Résultats & discussion
Chapitre IV
149
Figure IV. 26: Comparaison de la variation de la résistance de transfert de charge pour chaque élément
interférant avec la variation de Rtc correspondant à la saturation de la réponse de
l’immunocapteur.
Comme le montre l‟histogramme précédent, la variation de la résistance de transfert de
charge pour chaque élément biologique testé apparait faible par rapport à Rtc de saturation de
l‟immunocapteur ce qui montre la faible interférence de chaque élément.
VIII. Conclusion
Dans cette partie nous avons présenté les résultats expérimentaux de l‟étude de la mise au
point d‟un immunocapteur impédimètrique à base de co-polypyrrole pour la détection d‟antigène
dans le plasma humain et dans le sang pour le diagnostique de la thrombose veineuse profonde
(DVT). . Les résultats, ont vérifié la faisabilité de la détection d'antigène dans le sang entier ainsi que
la possibilité de valider cet immunocapteur pour le diagnostic de la DVT.
Résultats & discussion
Chapitre IV
150
Partie C. Mise en application d’un immunocapteur impédimètrique à base
d’un co-polymère conducteur: détection du D-dimer dans des
prélèvements de plasma sanguin de patients atteints de la DVT sur
des microélectrodes d’or
I. Introduction
Au cours des dernières décennies, le développement de la biotechnologie a fait l‟objet de
nombreuses recherches pour la mise au point et la mise en application de biocapteurs avec pour
intérêt majeur, d‟une part, l‟amélioration de leurs performances et leurs caractéristiques et d‟autre
part, leur faible coût, leur processibilité mais surtout leur facilité de fonctionnalisation et de
miniaturisation.
Dans ce cadre, la recherche acquise dans le domaine d‟immunodosage nous a conduit à
élaborer un immunocapteur rapide et fiable pour la mesure de concentrations en D-dimer, permettant
d‟exécuter une évaluation efficace des patients montrant des symptômes de la thrombose veineuse
profonde, d‟une manière anticipée et dés le premier diagnostic.
En fait, le D-Dimer est une protéine insoluble entrant dans la constitution de la majeure partie
du caillot sanguin et provenant de la scission du fibrinogène sous l'action de la thrombine au cours
de la coagulation sanguine. Le taux de D-Dimer étant augmenté dans des affections telles que la
thrombose veineuse profonde et l'embolie pulmonaire.
Alors, l‟objectif est de mettre en application un immunocapteur impédimètrique à base de
polymère conducteur pour la détection sur des prélèvements de plasma sanguin de patient atteints la
maladie DVT sur des microélectrodes .Ce travail a été réalisé suivant deux approches :
- La première consiste à développer un immunocapteur sur des microélectrodes
pour aboutir à la miniaturisation du dispositif biocapteur, ce qui permet
d‟effectuer l‟analyse avec de très faibles volumes de matériel biologique, afin à
terme, d‟intégrer ce biocapteur dans des puces.
- La deuxième, consiste à effectuer la détection des antigènes D-dimer ainsi que la
détection dans des prélèvements de plasma sanguin de patients atteints de la
Résultats & discussion
Chapitre IV
151
maladie DVT. Les tests de l‟immunodétection ont été réalisés par la
spectroscopie d‟impédance électrochimique.
II. Détection du D-Dimer avec des macroélectrodes
La détection des différentes concentrations d‟antigène D-dimer a été effectuée dans cette
première partie sur les macroélectrodes d‟or utilisées précédemment. En effet, nous avons développé
le même type d‟immunocapteur étudié précédemment, mais au lieu d‟immobiliser les fragments
d‟anticorps modèle sur l‟électrode d‟or modifiée (PPy-PPy-NHP /NTA/Cu2+
), nous avons
immobilisé les fragments d‟anticorps anti-D-dimer marqués hystidine, fournis par la société Wyeth.
Par la suite, cette électrode a été incubée dans 50 mg/ml de solution de caséine pendant 30 minutes à
la température ambiante, afin de bloquer les sites non spécifiques de la surface. Après avoir préparé
l‟immunocapteur, différentes concentrations de l‟antigène D-dimer dans une solution de PBS (10
mM, pH 7), ont été incubées successivement sur l'électrode modifiée.
La figure IV. 27 présente les diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après
incubation avec différentes concentrations d‟antigène D-dimer (de 0 jusqu‟à 4µg ml-1
). Les mesures
d‟impédances ont été réalisées dans une gamme de fréquence 100mHz-100kHz dans la solution PBS
(10 mM, pH 7).
Résultats & discussion
Chapitre IV
152
0 1000 2000 3000 4000 5000 6000
0
500
1000
1500
2000
2500
-
Im (
Z)
( c
m2)
Re (Z) ( cm2)
His-Ab 0.4 mg/ml
Ag 500 pg/ml
Ag 4 ng/ml
Ag 50 ng/ml
Ag 500 ng/ml
Ag 4 g/ml
Figure IV. 27 : Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une macroélectrode
d’or modifiée (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Ac-anti-D-dimer/caséine), dans différentes
concentrations d'antigène D-dimer (de 0 jusqu’à 4µg ml-1
). Les mesures d’impédances ont été
réalisées dans une gamme de fréquence 100mHz-100kHz dans la solution PBS (10 mM pH7).
Comme le montre la figure IV. 27, les diamètres des spectres d'impédance augmentent
clairement avec l'augmentation de la concentration en antigène D-dimer, ce qui est dû à l‟interaction
spécifique entre l‟antigène et l‟anticorps de l‟anti-D-dimer. Par ailleurs, tous ces diagrammes ont été
modélisés en utilisant le circuit équivalent représenté sur la figure IV.3. Les paramètres électriques
obtenus sont présentés dans le tableau IV. 10.
Pote
ntiel
(mV)
Ag
Concentr
ation
Rs (Ωcm2) Rf(Ωcm
2) Cf(Fcm
2) Rtc W
(Ωcm2)
CPE (Fcm2)- αCPE
2
Macro
electr
ode
-1400
0 28.57 0.11 820.8 3.9747E-5 1088 524.9 0.0719 0.92382 0.0019
500 pg/ml 28.52 0.10 901.2 4.0102E-5 1240 618.9 0.0784 0.9147 0.0019
4 ng/ml 28.55 0.11 981.3 3.933E-5 1400 703.7 0.0793 0.93444 0.0019
50 ng/ml 27.94 0.09 1042 5.0398E-5 2546 1557 0.0581 0.91933 0.0023
500 ng/ml 27.37 0.09 1149 4.0148E-5 3125 2217 0.0299 0.94937 0.0021
4µg/ml 24.28 0.08 1290 3.4261 E-5 3806 2707 0.2874 0.9333 0.0021
Tableau IV. 10: Paramètres issus du fittage avec le circuit de la figure IV.3 des Diagrammes de Nyquist
obtenus avant et après incubation avec différentes concentrations d'antigène D-dimer.
Résultats & discussion
Chapitre IV
153
Les résultats de ce tableau montrent que la résistance de transfert de charge augmente avec
l’augmentation de la concentration de l’antigène D-dimer. Pour tracer la courbe de calibration, nous
représentons la variation de la résistance de transfert de charge Rtc en fonction des différentes
concentrations d’antigène D-Dimer dilué dans la solution de PBS (figure IV. 28).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
50 ng. ml-1
4 ng. ml-1
[Ag D-Dimer ] ( µg/ml)
Rtc
cm
2)
500 pg. ml-1
Figure IV. 28 : Courbe de calibration présentant la variation de la résistance de transfert de charge en
fonction des différentes concentrations d’antigènes D-Dimer. Détection effectuée dans PBS 10
mM pH7 en utilisant des macroélectrodes.
La réponse de l‟'immunocapteur montre une relation linéaire entre la Rtc et la concentration
de l‟antigène D-dimer dans une gamme de 5 10-1
jusqu'à 50 ng ml-1
, avec une limite de détection de
l‟ordre de 500 pg ml-1
. L'équation de régression linéaire est : Rtc = 66105 [Ag D-Dimer] + 55,5, avec
un coefficient de corrélation de 0,93.
La reproductibilité de l'immunocapteur a été étudiée en répétant l'expérience avec trois
immunocapteur différents. Les résultats montrent que la réponse de l‟immunocapteur présente un
écart-type moyen de 8,7 % ce qui montre la bonne reproductibilité du système pour la détection de
l'antigène D-Dimer dans le PBS.
Afin d‟étudier le temps de réponse de l‟immunocapteur, nous avons contrôlé le temps de
stabilisation de chaque réponse. Le tableau IV.11 montre la moyenne de la durée de stabilisation du
signal d‟impédance pour chaque concentration d‟antigène D-dimer.
Résultats & discussion
Chapitre IV
154
Concentration d’antigène D-dimer Temps de stabilisation
500 pg/ml 45 min
4 ng/ml 55 min
50 ng/ml 1 h 30min
500 ng/ml 1h 45 min
4 µg/ml 4 h 30 min
Tableau IV. 11: Moyennes de la durée de stabilisation du signal d’impédance pour chaque concentration
d’antigène D-dimer détectée en utilisant les macroélectrodes.
Les résultats montrent que plus la concentration augmente plus le temps de stabilisation de la
repense augmente.
III. Détection D-Dimer avec les microélectrodes
Les tests de détection des différentes concentrations d‟antigène D-dimer ont été effectués dans
une deuxième partie sur des microélectrodes d‟or (voir présentation chapitre III §II.1.2). En effet,
l‟immunocapteur a été développé sur ces microélectrodes, en utilisant les mêmes conditions utilisées
pendant le développement de ce dernier sur les macroélectrodes. En effet, sur la microélectrode d‟or
modifiée (PPy-PPy-NHP /NTA/Cu2+
), nous avons immobilisé les fragments d‟anticorps anti-D-
dimer marqué histidine. Par la suite, cette électrode a été incubée dans 50 mg/ml de solution de
caséine pendant 30 minutes à la température ambiante, afin de bloquer les sites non spécifiques de la
surface. Après avoir préparé l‟immunocapteur, différentes concentrations de l‟antigène D-dimer,
diluées dans la solution de PBS, ont été incubées successivement sur l'électrode modifiée, pendant
10 min.
La figure IV. 29 présente les diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après
incubation des différentes concentrations d‟antigène D-dimer (de 0 jusqu‟à 4µg ml-1
). Les mesures
d‟impédances ont été réalisées dans gamme de fréquence 1Hz-100kHz dans la solution PBS (10
mM, pH7)
Résultats & discussion
Chapitre IV
155
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
-Im
(Z)
(c
m2)
Re(Z) ( cm2)
Ac 0.4 mg/ml
Ag 0.4 ng/ml
Ag 4 ng/ml
Ag 400 ng/ml
Ag 0.4 g/ml
Figure IV. 29: Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une microélectrode
d’or modifié (PPy-PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Ac-D-Dimer/caséine), dans différentes concentrations
d'antigène D-Dimer (de 0 jusqu’à 4µg ml-1
) dans le PBS pH7. Les mesures d’impédances ont
été réalisées dans une gamme de fréquence 1 Hz-100 kHz dans la solution PBS 10 mM pH7.
Comme le montre la figure IV. 30, les diamètres des spectres d'impédance augmentent
clairement avec l'augmentation de la concentration de l‟antigène D-Dimer, ce qui est dû à
l‟interaction spécifique entre l‟antigène et l‟anticorps anti-D-dimer en utilisant des microélectrodes.
Par ailleurs, tous ces diagrammes ont été modélisés en utilisant le circuit équivalent présenté sur la
Figure IV.30. Les paramètres électriques obtenus sont présentés dans le tableau IV. 12.
Figure IV. 30: Circuit électrique équivalent permettant la modélisation des spectres d’impédance obtenus avec
les microélectrodes.
Résultats & discussion
Chapitre IV
156
Potenti
el (mV) Ag
Concentr
ation
Rs (Ωcm2) Rf(Ωcm
2) Cf(Fcm
2) Rtc CPE
(Fcm2)-
αCPE 2
Micro electrode
-1400
0 1.105 0.005 37.8 0.00017609 98.79 0.000360 0.81984 0.0009
400 pg/ml 1.031 0.004 57.86 0.0001578 134.3 0.000373 0.82089 0.0010
4 ng/ml 0.990 0.003 66.75 0.00014841 156.2 0.000360 0.82803 0.0011
400 ng/ml 0.971 0.004 76.21 0.00014304 171.1 0.000349 0.83578 0.0011
4 µg/ml 0.953 0.005 85.98 0.00013591 179.1 0.000386 0.82425 0.0011
Tableau IV. 12: Paramètres issus du fittage avec le circuit de la figure IV.3 des Diagrammes de Nyquist
obtenus avant et après incubation avec différentes concentrations d'antigène D-Dimer.
Les résultats présentés dans ce tableau montrent que la résistance de transfert de charge augmente
avec l’augmentation de la concentration de l’antigène D-dimer. Pour tracer la courbe de calibration, nous
représentons la variation de la résistance de transfert de charge Rtc en fonction de la concentration en
antigène D-Dimer dilué dans la solution de PBS (cf. figure IV. 31).
0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0
0
20
40
60
80
100
400 ng/ml
400 pg/ml
4 ng/ml
R
tc
cm
2)
[Ag D-dimer ] ( µg/ml)
Figure IV. 31: Courbe de calibration présentant la variation de la résistance de transfert de charge en
fonction des différentes concentrations d’antigène D-dimer. Détection effectuée dans PBS en
utilisant des microélectrodes.
La réponse de l‟'immunocapteur montre une relation linéaire entre le Rtc et la concentration
de l‟ antigène D-dimer dans une gamme de 4 10-1
jusqu'à 4 ng ml-1
avec une limite de détection de
Résultats & discussion
Chapitre IV
157
l‟ordre de 400 pg ml-1
. L'équation de régression linéaire est : Rtc = 11081 [Ag D-Dimer] + 35,3, avec
un coefficient de corrélation de 0,90.
La reproductibilité de l'immunocapteur a été étudiée en répétant l'expérience avec trois
immunocapteurs différents. Les résultats montrent que la réponse de l‟immunocapteur présente un
écart type moyen de 7.6 % ce qui montre la bonne reproductibilité du système pour la détection
d'antigène D-Dimer dans le PBS.
Afin d‟étudier le temps de réponse de l‟immunocapteur, nous avons contrôlé le temps de
stabilisation de chaque réponse. Dans le tableau IV.13 sont rassemblées les durées moyennes de
stabilisation du signal d‟impédance pour chaque concentration antigène D-dimer.
Concentration d’antigène D-Dimer Temps de stabilisation
400 pg/ml 30 min
4 ng/ml 40 min
400 ng/ml 40 min
4 µg/ml 1h
Tableau IV. 13: Les durées moyennes de stabilisation du signal d’impédance pour chaque concentration
d’antigène D-dimer détectée en utilisant des microélectrodes.
Les résultats montrent que plus la concentration augmente plus le temps de stabilisation de la
repense augmente
Comparaison des réponses des immunocapteurs développés sur les deux types d’électrodes
En comparant la réponse de l‟immunocapteur développé sur des macroélectrodes et celui
développé sur des microélectrodes, nous remarquons, d‟une part, que l‟étude de reproductibilité de
l‟immunocapteur montre un écart type moyen de 8,7 % en utilisant les macroélectrodes et un écart
type moyen de 7,6 % en utilisant les microélectrodes. D‟autre part, en comparant les temps de
réponse de l‟immunocapteur pour les deux types d‟électrodes (tableau 11 et tableau 13), nous
remarquons qu‟en utilisant les microélectrodes, l‟immunocapteur répond plus rapidement qu‟en
utilisant les macroélectrodes. En comparant l‟étendu de mesure obtenu en utilisant les deux types
Résultats & discussion
Chapitre IV
158
d‟électrode, nous remarquons la gamme de détection obtenue par les macroélectrodes est plus large
que celle obtenue par les microélectrodes (cf. figures IV.28 et IV.31). La comparaison de ces
caractéristiques montre quelques avantages d‟utilisation des microélectrodes pour le développement
des immunocapteurs. Mais ces dernières présente un problème de saturation à 50ng/mL.
IV. Détection du D-dimer chez des patients suspectés d’être atteints de la DVT
Dans l‟objectif d‟évaluer et de valider la détection de D-Dimer pour le diagnostic de
thrombose veineuse profonde, nous avons testé notre immunocapteur sur quatre échantillons de sang
prélevés sur des patients suspectés d‟être atteints de cette maladie, fournis par l‟hôpital de Bratislava.
Le tableau IV.15 présente quelques caractéristiques des plasma sanguins de chaque patient tels
que l'âge, le sexe, le niveau de D-Dimer et la concentration du D-dimer après dilution du plasma
dans du liquide physiologique.
Tableau IV. 14: Caractéristiques des plasma sanguins prélevés sur des patients suspectés d’être atteints de la DVT.
En effet, nous avons préparé quatre immunocapteurs avec des microélectrodes. Ces derniers
ont été préparés de la même manière et dans les conditions décrites précédemment, chaque
microélectrode d‟or étant modifiée avec les couches suivantes. : PPy-PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Ac-anti-
D-dimer/ caséine.
Par la suite, pour chaque patient, nous avons dilué l‟échantillon de plasma sanguin dans du
liquide physiologique pour le ramener à une concentration soit de 0,4ng/mL soit 4ng/mL de D-
Dimer pour la tester avec l‟immunocapteur étudié (figure IV.30). Chaque électrode modifiée a été
date de naissance
des patients
Sexe Niveau D-
Dimer
Concentration
testée
P1:L.M. (1940) F 167 ng/ml 0,4 ng/ml
P2:S.J. (1980) M 810 ng/ml 0,4 ng/ml
P3:Z.L. (1935) F 900 ng/ml 4 ng/ml
P4:M.M. (1927) F 2500ng/ml 0,4 ng/ml
4 ng/ml
Résultats & discussion
Chapitre IV
159
incubée dans le sérum sanguin dilué à la concentration présentée dans le tableauIV.15, pendant 10
min.
Les figures IV. 32-33-34-35 présentent les diagrammes de Nyquist à -1400 mV
obtenus avant et après incubation dans le plasma dilué de chaque patient. Les mesures d‟impédances
ont été réalisées dans une gamme de fréquence de 1Hz-100kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7).
Par ailleurs, tous ces diagrammes ont été modélisés en utilisant le circuit équivalent représenté dans
la figure IV.30. Les paramètres électriques modélisés pour chaque test sont présentés dans les
tableaux IV. 15-16-17-18.
IV.1. Teste 1: Patient 1 :L.M. (1940)
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160
0
10
20
30
40
50
60
70
-Im
(Z)
(cm
2)
Re(Z) ( cm2)
Ab+ caseine
LM1940 0.4 ng/ml
Figure IV. 32: Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une microélectrode
d’or modifié (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Ac-anti-D-Dimer/caséine), dans le plasma sanguin
dilué du patient L.M. (1940). Les mesures d’impédances ont été réalisées dans une gamme de
fréquence 1 Hz-100 kHz dans la solution PBS 10 mM pH7.
Patient Ag
Concentration
Rs (Ωcm2) Rf(Ωcm
2) Cf(Fcm
2) Rtc CPE
(Fcm2)-
αCPE 2
L.M.
(1940)
0 0.95723 31.23 0.00023852 79.29 0.00042247 0.80238 0.0011
0.4 ng/ml 1.098 42.89 0.00021888 120.3 0.00038448 0.80346 0.0011
Tableau IV. 15: Paramètres issus du fittage avec le circuit de la figure IV.30 des diagrammes de Nyquist
obtenus avant et après incubation dans le plasma sanguin dilué du patient L.M. (1940).
Résultats & discussion
Chapitre IV
160
IV.2. Teste 2:Patient 2: S.J. (1980)
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Ab + Caseine
J.S. 1980 0.4 ng/m
Re (Z) ( cm2)
-Im
(Z)
( c
m2)
Figure IV. 33: Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une microélectrode
d’or modifié (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Ac-anti-D-dimer/caséine), dans le plasma sanguin
dilué du patient S.J. (1980). Les mesures d’impédances ont été réalisées dans une gamme de
fréquence 1 Hz-100 kHz dans la solution PBS 10 mM pH7.
Patient Ag
Concentration
Rs
(Ωcm2)
Rf
(Ωcm2)
Cf
(mFcm2)
Rtc
(Ωcm2)
CPE (mFcm
2)-
αCPE 2
S.J.
(1980)
0 0.94741 35.28 0.157 98.83 0.359 0.83901
0.0013
0.4 ng/ml 0.89079 53.96 0.973 135.8 0.224 0.8431
3
0.0011
Tableau IV. 16: Paramètres issus du fittage avec le circuit de la figure IV.30 des diagrammes de Nyquist
obtenus avant et après incubation le plasma sanguin dilué du patient S.J. (1980).
Résultats & discussion
Chapitre IV
161
IV.3. Teste 3:Patient 3: Z.L. (1935)
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220 240 260 280
-10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
120
Ab+ caseine
4 ng/ml (Z.L.1937)
Re (Z) ( cm2)
-Im
(Z)
( c
m2)
Figure IV. 34: Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une microélectrode
d’or modifié (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Ac-anti-D-Dimer/caséine), dans le plasma sanguin
dilué du patient (Z.L. (1935). Les mesures d’impédances ont été réalisées dans une gamme de
fréquence 1 Hz-100 kHz dans la solution PBS (10 mM pH7).
Patient Ag
Concentration
Rs (Ωcm2) Rf(Ωcm
2) Cf(Fcm
2) Rtc CPE
(Fcm2)-
αCPE 2
Z.L.
(1935))
0 0.88765 42.41 0.00017462 78.03 0.00064805 0.83901 0.0012
4 ng/ml 0.87197 53.02 0.0015956 147.7 0.00028523 0.86558 0.0010
Tableau IV. 17: Paramètres issus du fittage avec le circuit de la figure IV.30 des diagrammes de Nyquist
obtenus avant et après incubation dans le plasma sanguin dilué du patient (Z.L. (1935)..
Résultats & discussion
Chapitre IV
162
IV.4. Teste 4:Patient 4: M.M. (1927)
0 20 40 60 80 100 120 140
0
10
20
30
40
50
60
Ab+ caseine
0.4 ng/ml (M.M.1927)
Re (Z) ( cm2)
-Im
(Z)
( c
m2)
Figure IV. 35: Diagrammes de Nyquist à -1400 mV obtenus avant et après incubation d’une microélectrode
d’or modifié (PPy .PPy-NHP /NTA/Cu2+
/Ac-anti-D-Dimer/caséine), dans le plasma sanguin
dliué du patient (M.M. (1927). Les mesures d’impédances ont été réalisées dans une gamme de
fréquence 1 Hz-100 kHz dans la solution PBS 10 mM pH7.
Patient Ag
Concentration
Rs (Ωcm2) Rf(Ωcm
2) Cf(Fcm
2) Rtc CPE (Fcm
2)- αCPE
2
M.M.
(1927)
0 0.9932 39.55 0.0001903 72.79 0.00068972 0.77 0.0010
0.4 ng/ml 0.89841 30.26 0.0003262 112.1 0.000301 0.84 0.0010
IV.5. Tableau IV. 18: Paramètres issus du fittage avec le circuit de la figure IV.30des diagrammes de Nyquist
obtenus avant et après incubation dans le plasma sanguin dilué du patient (M.M. (1927). Comparaison de
la réponse de l’immunocapteur dans le PBS et dans le plasma humain
La précision et la validité d'immuno-analyse de notre système d'immunocapteur a été évaluée
en comparant les réponses de l‟immunocapteur pour une concentration d‟antigène D-Dimer détecté
dans le PBS et une même concentration d‟antigène D-Dimer détectée dans des échantillons prélevés
sur des patients. L‟histogramme de la figure IV.36 présente la variation de la résistance de transfert
de charge pour une concentration de D-Dimer de 400 pg.ml-1
détectée dans le PBS (valeur déduite de
la courbe de calibration de la figure IV.31) comparée aux variations de résistances pour la même
concentration d‟antigène D-Dimer détecté des échantillons de plasma sanguin de patients atteints de
la maladie DVT. L‟histogramme de la figure IV.37 présente la variation de la résistance de transfert
de charge pour une concentration de D-Dimer de 4 ng.ml-1
détecté dans le PBS (valeur déduite de la
Résultats & discussion
Chapitre IV
163
courbe de calibration de la figure IV.31) comparée aux variations de résistances pour la même
concentration d‟antigène D-Dimer détecté des échantillons de plasma sanguin de patients atteints de
la maladie DVT.
Figure IV. 36: Comparaison de la variation de la résistance de transfert de charge pour une concentration de
D-Dimer de 400 pg.ml-1
détecté dans le PBS (10 mM, pH7) avec les variations de résistances
pour la même concentration d’antigène D-Dimer détecté des échantillons de plasma sanguin de
patients atteints de la maladie DVT.
Comme le montre l‟histogramme précédent, la variation de résistance de transfert de charge
correspondante à la concentration de D-Dimer de 400 pg.ml-1
détecté d‟un échantillon de plasma
sanguin prélevé sur chaque patient atteint de la maladie DVT apparait très proche à la valeur de la
variation de résistance de transfert de charge pour une même concentration de D-Dimer détecté dans
le PBS. Nous présentons sur le tableau IV.19 l‟écart relatif de chaque résistance de transfert de
charge correspondant à chaque patient par rapport à la résistance détectée dans le PBS.
Patient Ecart relatif (%)
P1:L.M. (1940) 10,42
P2:S.J. (1980) 15,44
P4:M.M. (1927) 3,60
Tableau IV. 19 : Ecarts relatifs correspondant à la détection D-dimer (0,4ng/ml) pour chaque patient
comparé à la détection de 400 pg.ml-1
de D-dimer dans le PB (10 mM, pH7) S.
Résultats & discussion
Chapitre IV
164
Les résultats montrent des écarts relatifs faibles dont leur moyenne est de 9,82 %, de l‟ordre
de l‟écart-type correspondant à la reproductibilité de l‟immunocapteur en milieu PBS (7,6%).
Figure IV. 37: Comparaison de la variation de la résistance de transfert de charge pour une concentration de
D-Dimer de 4 ng.ml-1
détecté dans le PBS (10 mM, pH7) avec les variations de résistances pour
la même concentration d’antigène D-Dimer détecté des échantillons de plasma sanguin
prélevés sur des patients atteints de la maladie DVT.
Comme le montre l‟histogramme précédent, la variation de résistance de transfert de charge
correspondante à la concentration de D-Dimer de 4 ng.ml-1
détectée dans des échantillons de plasma
sanguin prélevés sur chaque patient atteint de la maladie DVT apparait très proche de la valeur de la
variation de résistance de transfert de charge pour une même concentration de D-Dimer détectée
dans le PBS. Nous présentons sur le tableau IV.20 l‟écart relatif de chaque résistance de transfert de
charge correspondant à chaque patient par rapport à la résistance détectée dans le PBS.
Résultats & discussion
Chapitre IV
165
Patient Ecart relatif (%)
P3:Z.L. (1935) 21,3
P4:M.M. (1927) 5,93
Tableau IV. 20: écarts relatifs correspondant à la détection D-dimer (4ng/ml) pour chaque patient comparé
à la détection de 4 ng.ml-1
de D-dimer dans le PBS (10 mM, pH7).
Les résultats montrent des écarts relatifs faibles dont leur moyenne est de 13,61 %,
sensiblement le double de la valeur de l‟écart-type correspondant à la reproductibilité de
l‟immunocapteur en milieu PBS (7,6%).
A fin de mieux adapter la validité de l‟immunocapteur nous avons choisi d‟étudier la réponse
de détection de différentes concentrations d‟antigène D-Dimer dans un échantillon sanguin du
patient M.M. (1927). En effet, nous avons préparé quatre immunocapteurs sur des microélectrodes.
Ces derniers ont été préparés de la même manière et dans les mêmes conditions décrites
précédemment, chaque microélectrode d‟or étant modifiée par les couches suivantes. : PPy-PPy-
NHP /NTA/Cu2+
/Ac-D-Dimer/ caséine.
Par la suite, pour chaque immunocapteur, nous avons fixé une concentration d‟antigène D-
dimer à partir de l‟échantillon de plasma sanguin pour la tester et comparer sa réponse avec la
réponse de l‟immunocapteur étudié pour la détection de D-Dimer dans le PBS (figure IV.31). La
dilution des échantillons de plasma sanguin a été effectuée dans l‟eau physiologique. Chaque
électrode modifiée a été incubée dans les différentes dilutions de plasma sanguin pendant 10 min.
Nous avons choisi d‟étudier la réponse pour les concentrations suivantes: 400 pg.ml-1
, 4 ng.ml-1
, 400
ng.ml-1
et 2,5 µg.ml-1
L‟histogramme de la figure IV.38 présente la variation de la résistance de transfert de charge
pour différentes concentrations d‟antigène D-Dimer détecté dans le PBS (valeur déduite de la courbe
de calibration de la figure IV.31) comparée aux variations des résistances pour les mêmes
concentrations d‟antigène D-dimer dans l‟échantillon de plasma sanguin du patient M.M. (1927).
Résultats & discussion
Chapitre IV
166
Figure IV. 38 : Comparaison de la variation de la résistance de transfert de charge pour différentes
concentration d’antigène D-Dimer détecté dans le PBS (10 mM, pH7) avec les variations de
résistances pour la même concentration d’antigène D-Dimer détecté de l’échantillon de plasma
sanguin du patient M.M. (1927).
Comme le montre l‟histogramme précédent, la variation de résistance de transfert de charge
correspondante à chaque concentration de D-Dimer détecté d‟un échantillon de plasma sanguin dilué
apparait très proche à la valeur de la variation de résistance pour une même concentration de D-
Dimer détecté dans le PBS. Nous présentons sur le tableau IV.20 l‟écart relatif de chaque résistance
de transfert de charge correspondant à chaque concentration par rapport à la résistance de D-Dimer
détectée dans le PBS.
Concentration d’antigène D-dimer
détecté dans l’échantillon de plasma
sanguin dilué
Ecart relatif (%)
400 pg.ml-1 8,30
4 ng.ml-1 5,13
400 ng.ml-1 2,05
Saturation : 2.5 µg.ml-1
2,53
Tableau IV. 21: écarts relatifs correspondant à la détection de D-dimer pour chaque échantillon de plasma
sanguin du patient M.M. (1927) comparé à la détection de D-Dimer dans le PBS(10 mM, pH7).
Résultats & discussion
Chapitre IV
167
En comparant la réponse de l‟immunocapteur dans le PBS et dans l‟échantillon sanguin
désiré, les résultats montrent de très faibles écarts relatifs correspondant à la réponse de chaque
concentration détectée dans l‟échantillon de plasma sanguin dilué comparé à la détection des mêmes
concentrations de D-dimer dans le PBS.
En conclusion, cette comparaison a montré un écart relatif moyen de 4,5%. Ceci vérifie
clairement la faisabilité de la détection d'antigène D-dimer dans un échantillon de plasma sanguin
prélevé sur un patient atteint de la DVT donc, la validation de cet immunocapteur pour le diagnostic
de cette maladie.
V. Conclusion
Dans cette partie nous avons présenté les résultats expérimentaux pour la mise en application d‟un
immunocapteur impédimètrique à base d‟un co-polypyrrole pour détection de D-dimer dans des
échantillons sanguins des patients atteints de la DVT sur des microélectrodes d‟or. Les résultats, ont
vérifié la faisabilité et la validité de l‟immunocapteur.
Résultats & discussion
Chapitre IV
168
Partie D. Nouveau concept d’Immunocapteur Impédimètrique
base de nanoparticules d’or fonctionnalisées.
I. Introduction
Dans le domaine des immunodosages, des approches récentes utilisent la détection sans
marquage soit par résonance plasmonique de surface (SPR), soit par mesure d‟impédance
électrochimique (EIS), en ayant, au préalable, fixé de façon covalente les anticorps sur une surface
d‟or. La fixation de l‟antigène spécifique induit une variation des propriétés optiques et électriques
de la couche d‟anticorps. L‟utilisation de nanoparticules d‟or [133
] fonctionnalisées pour la détection
suscite un intérêt croissant car elle permet d‟augmenter non seulement la surface de contact avec le
milieu environnant donc la densité de greffage, mais également la sensibilité (comportement quasi
moléculaire en raison de leur petite taille) [134
], ce qui permet d‟abaisser le seuil de détection. Les
fonctions greffées à la surface servent à immobiliser (et donc à concentrer localement) les espèces
ciblées qui sont ensuite détectées.
Dans cette approche, des nanoparticules d‟or de taille de l‟ordre de 20 nm ont été synthétisées [135
] et
fonctionnalisées successivement par un acide-disulfure et un agent d‟activation tel que l‟EDC et le
NHS, permettent de fixer l‟anticorps biotinylé anti-E.Coli sur la surface du substrat par
l‟intermédiaire de la neutravidine, pour la détection de la bactérie pathogénique E.Coli. De ce fait,
différentes techniques de caractérisation ont été utilisées pour le développement de l‟immunocapteur.
La résonance plasmonique de surface (SPR) a été utilisée pour un contrôle in-situ de développement
du biofilm. Les propriétés électriques et la morphologie ont été caractérisées respectivement par la
spectroscopie d‟impédance électrochimique (EIS) et la Microscopie à Force Atomique (AFM).
L‟immunodétection sans marquage a été réalisée par la technique EIS.
II. Auto-Assemblage moléculaire sur l’or
II.1. Caractérisation par voltamètrie cyclique
Pour remonter aux caractéristiques isolantes de la monocouche de thiol amine, 11-amino-1-
undecanethiol (AUT), déposée sur l‟électrode d‟or, nous avons utilisé la voltamètrie cyclique. La
figure I.V.39 montre la courbe I (V) de l‟or nue et de l‟or fonctionnalisé avec le thiol amine en
présence du couple redox Fe(CN)63-
/4-
, avec une vitesse de balayage de 50 mV/s. La courbe I(V) de
Résultats & discussion
Chapitre IV
169
l‟or nu (a) montre un processus réversible d‟une réaction d‟oxydo-réduction à la surface de l‟or.
Après le dépôt de la couche auto-assemblée, les pics du processus d‟oxydo-réduction diminuent, ce
qui montre que la couche déposée diminue le processus faradique.
-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
-2.0x10-4
-1.5x10-4
-1.0x10-4
-5.0x10-5
0.0
5.0x10-5
1.0x10-4
1.5x10-4
2.0x10-4
b
or nu
thiol amin
co
ura
nt
(A)
potentiel (V)
a
Figure IV. 39: Voltamètrie cyclique d’une électrode d’or nue (a) et d’une électrode fonctionnalisée par le
thiol amine (SAM) (b). Mesures effectuées dans 5mM de K3 [Fe(CN)6] / K4[Fe(CN)6] dans le
PBS (10 mM,pH 7).
II.2. Caractérisation par mesure d’impédance
Pour déterminer taux de couverture de la couche de thiol amine déposée sur l‟électrode d‟or,
nous avons réalisé des mesures d‟impédance dans le PBS (10 mM, pH7). La figure IV.40 représente
les diagrammes de Nyquist, dans la gamme de fréquence 100 mHz et 100 KHz, de l‟électrode nue et
de l‟électrode modifiée par la couche de thiol amine.
Résultats & discussion
Chapitre IV
170
-2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000
0
1000
2000
3000
4000
5000
Re(z) ( cm2)
-Im
(z)
(cm
2)
Or nu
Thiol Amin
Figure IV. 40: Digramme de Nyquist correspond à une électrode d’or nue et à la couche de thiol amine.
Mesures effectue à -400mV dans le PBS pH 7.
Les résultats montrent un demi-cercle, caractéristique d‟une résistance en parallèle avec une
capacité. Le diamètre du demi-cercle de Nyquist augmente nettement après la formation de la
couche auto-assemblée. Ce qui vérifie le greffage du thiol sur l‟électrode d‟or.
Les propriétés électriques de chaque couche ont été modélisées par l‟utilisation d‟un circuit
électrique équivalent présenté dans la figure IV.41.
Figure IV. 41: Circuit électrique équivalent permettant la modélisation des spectres d’impédance
Avec, Rs représente la résistance de la solution, Rm celle de la couche, CPE l‟élément de
phase constante et W l‟impédance de Warburg.
en simulant ce modèle électrique, la résistance extraite de la courbe d‟or nu est de 4.72
kOhm.cm2 alors que celle du thiol est de 14,06 k . cm
2. Ce qui nous donne un taux de couverture de
l‟électrode par la couche de thiol [136
]:
= 1- Ror
m / RSAM
m = 0.68
Résultats & discussion
Chapitre IV
171
Où Ror
m : Résistance moyenne de l‟électrode d‟or nu.
RSAM
m : Résistance moyenne de la couche de SAM.
La valeur obtenue du taux de recouvrement montre que la couche de thiol-amine couvre 68%
la surface d‟or.
III. Caractérisation du biocapteur
Avant d‟aborder le développement d‟un immunocapteur à base des nanoparticules d‟or nous
avons étudié l‟intérêt d‟utiliser des nanoparticules pour l‟amélioration des caractéristiques d‟un
biocapteur. En effet, nous avons étudié, par SPR, la comparaison entre un biosystème utilisant un
réactif de pontage (cf. figure IV.42.a) et un biosystème utilisant des nanoparticules (cf. figure
IV.42.b) d‟or fonctionnalisées pour la détection de la biotine.
(a) (b)
Figure IV. 42: (a)Représentation schématique d’un biosystème à base de glutaraldéhyde
(b)Représentation schématique d’un biosystème nanoparticules d’or fonctionnalisées
III.1. Caractérisation d’un biosystème utilisant un réactif de pontage protéique
La formation des différentes couches constituant le biofilm a été suivit par la comparaison
des courbes de la réflectivité = f (angle d‟incidence) correspondantes à chaque étape (Figure IV.43).
En effet, nous observons une perturbation de la réponse du SPR suite à la fixation du GA, de la
neutravidine ainsi que pour la biotine. Nous observons l‟augmentation de l‟angle de résonnance de
62,451° pour la couche de GA à 62,511° pour celle de neutravidine témoigne de l‟immobilisation de
celle si. De même, la variation de l‟angle minimum des plasmons de surface de 0,303° montre que la
Résultats & discussion
Chapitre IV
172
neutravidine s‟est fixée sur le GA. Enfin, la dernière couche de la biotine a interagi avec la
neutravidine puisque l‟angle de résonnance a augmenté de 0,069°.
58 60 62 64 66 68 70
0
500
1000
1500
2000
2500
61.0 61.5 62.0 62.5 63.0 63.5 64.0
0
100
200
300
400
500
600
Refl
ecti
vit
é (
u.a
.)
Angle d'incidence (°)
thiol amine
GA
Neutravidine 10-5
M
Biotine (2 mM)Refl
ecti
vit
é (
u.a
.)
Angle de résonnance (°)
Cysteamine
GA
Neutravidine 10-5
M
Biotine (2 mM)
Figure IV. 43: Courbe de réflectivité =f (angle d’incidence) pour chaque couche constituant le biofilm
utilisant le glutaraldéhyde.
La procédure de réaction successive du Glutaraldéhyde (GA), de la neutravidine (Neu) et de
la biotine sur une électrode d‟or fonctionnalisée par le thiol amine a été suivie en temps réel par
l‟enregistrement de l‟angle de résonance en fonction du temps. Les figures IV.44.a et b présentent
toutes les étapes. En effet, les résultats de la figure IV.44.a montrent une augmentation de l‟angle de
résonance de ∆θGA= 0,060° suite à l‟injection du GA suivie du lavage par le PBS. Cette variation
d‟angle montre que le la Glutaraldéhyde est bien fixé sur la couche de thiol. L‟injection de la
solution de neutravidine 10-5
M a provoqué l‟augmentation rapide de l‟angle de résonance ce qui
correspond à l‟immobilisation de cette protéine. Après 2 h d‟incubation, et suite au lavage par le
PBS nous observons une variation de l‟angle de résonance qui est estimée à ∆θNeu= 0,303°. Cette
variation d‟angle montre que la Neutravidine est bien fixée par liaison covalente le Glutaraldéhyde.
L‟injection de la biotine induit une augmentation du signal optique par rapport au niveau de la
Résultats & discussion
Chapitre IV
173
réponse optique de la couche neutravidine (figure IV.44.b). Cette variation ∆θbiotine qui est de l‟ordre
de 0,069° montre la liaison de la biotine avec la neutravidine via l„biotine-avidine.
0 50 100 150 200 250
62.4
62.5
62.6
62.7
62.8
62.9
63.0
5
4
32
1
1- Rincage par PBS
2- Injection de GA
3- Rincage par PBS
4- Injection de 105M de Neutravidine
5- Rincage par PBS
An
gle
de r
éso
na
nce
(°)
Temps (min)
325 350 375 400 425 450 475 500 525 550
62,86
62,88
62,90
62,92
62,94
62,96
62,98
0,06912°
Biotine (2 mM)
NeutravidineAn
gle
de r
éso
nn
an
ce (
°)
Temps (min)
(a) (b)
Figure IV. 44:Contrôle en temps réel de l’élaboration du biofilm utilisant le Glutaraldéhyde pour la détection
de la biotine.
A partir de cette caractérisation nous tentons à déterminer la surface moyenne occupée par
chaque molécule de neutravidine par le calcul du taux de fixation de la neutravidine sur la surface
d‟une électrode d‟or modifié par le réactif de pontage protéique. En effet, Le taux de fixation des
protéines, Г, exprimé par unité de masse surfacique (mg/mm²) est estimé en employant l‟incrément
d‟indice de réfraction, dn/dc selon l‟équation I.8 exprimée dans le chapitre. I [137
]. De ce fait, le taux
de fixation calculé est de l‟ordre de 1,13 ng/mm2. Ce résultat nous mène à déterminer
successivement la densité de la surface qui est de l‟ordre de 1.04 1010
molécules de
neutravidine/mm2 et la surface moyenne occupée par chaque molécule de neutravidine qui est de
l‟ordre de 9,61 10-11
mm2.
III.2. Caractérisation d’un biofilm utilisant des nanoparticules d’or fonctionnalisées
La formation des différentes couches constituant le biofilm a été suivit par la comparaison
des courbes de la réflectivité = f (angle d‟incidence) correspondantes à chaque étape (Figure IV.45).
En effet, nous observons une perturbation de la réponse du SPR suite à la fixation des
Résultats & discussion
Chapitre IV
174
nanoparticules d‟or, de la neutravidine ainsi que pour la biotine. En fait, nous observons
l‟augmentation de l‟angle de résonnance de 62,420° pour la couche de GA à 64,041° pour celle de
neutravidine témoigne de l‟immobilisation de celle si. De même, la variation de l‟angle de résonante
des plasmons de surface de 0,720° montre que la neutravidine s‟est fixée sur les nanoparticules d‟or.
Enfin, la dernière couche de la biotine a interagi avec la neutravidine puisque l‟angle de résonnance
a augmenté de 0,485°.
58 60 62 64 66 68 70
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
Angle d'incidence (°)
Refl
ecti
vit
é (
u.a
.)
thiol amine
Nano particules
Neutravidine 10-5
M
Biotine (2 mM)
Figure IV. 45 : Courbe de réflectivité =f (angle d’incidence) pour chaque couche constituant le biosystème
utilisant des nanoparticules d’or fonctionnalisées.
De même, la procédure d‟immobilisation des nanoparticules d‟or, de la neutravidine (Neu) et
de la biotine sur une électrode d‟or fonctionnalisée par le thiol amine a été suivit en temps réel par
l‟enregistrement de l‟angle de résonance en fonction du temps. Les figures IV.46.a et b présentent
toutes les étapes d‟immobilisation. En effet, les résultats de la figure IV.46.a montrent une
augmentation de l‟angle de résonance de ∆θNanop= 1.621° suite à l‟injection des nanoparticules d‟or
suivie du lavage par le PBS. Cette variation d‟angle montre que les nanoparticules d‟or sont bien
fixés sur la couche de thiol. L‟injection de la solution de neutravidine 10-5
M a provoqué
l‟augmentation de l‟angle de résonance ce qui correspond à l‟immobilisation de cette protéine. Après
2 h d‟incubation, et suite au lavage par le PBS nous observons une variation de l‟angle de résonance
qui est estimée à ∆θNeu= 0,720°. Cette variation d‟angle montre que la Neutravidine est bien fixée
sur l‟électrode d‟or modifiée successivement par le thiol amine et les nanoparticules d‟or. Ensuite,
Résultats & discussion
Chapitre IV
175
l‟injection de la biotine induit une augmentation du signal optique par rapport au niveau de la
réponse optique de la couche neutravidine (figure IV.46.b). Cette variation ∆θbiotine qui est de
l‟ordre de 0,485° montre que la biotine est fixée sur la neutravidine via la liaison d‟affinité biotine-
avidine.
0 50 100 150 200 250
62,5
63,0
63,5
64,0
64,5
65,0
65,55
4
3
2
1
An
gle
de r
éso
na
nce
(°)
Temps (min)
1- Rincage par PBS
2- Injection des nano particules
3- Rincage par PBS
4- Injection de 105M de neutravidine
5- Rincage par PBS
250 300 350 400 450 500
64,9
65,0
65,1
65,2
65,3
65,4
65,5
65,6
0,4856°
Biotine (2 mM)
Neutravidine
Temps (min)
An
gle
de r
éso
nn
an
ce (
°)
(a) (b)
Figure IV. 46: Contrôle en temps réel de l’élaboration d’un biofilm utilisant des nanoparticules d’or
fonctionnalisées pour la détection de la biotine.
A partir de ces résultats nous tentons de déterminer la surface moyenne occupée par chaque
molécule de neutravidine par le calcul du taux de fixation de la neutravidine sur la surface d‟une
électrode d‟or modifié par les nanoparticules d‟or fonctionnalisées. En effet, le taux de fixation de la
neutravidine sur la surface des nanoparticules d‟or calculé est de l‟ordre de ΓNeutravidine = 2.77
ng/mm2. Ce résultat nous mène à déterminer successivement la densité de la surface qui est de
l‟ordre de 2,55 1010
molécules de neutravidine/mm2 et la surface moyenne occupée par chaque
molécule de neutravidine qui est de l‟ordre de 3.91 10-11
mm2 .
III.3. Effet de la variation de la concentration de la biotine sur les deux biofilms étudié par
SPR
La l‟injection de différentes concentrations de biotine sur les deux types de biofilms, a été
étudiée par la résonance plasmonique de surface. La figure IV.47 présente les courbes d‟étalonnage
Résultats & discussion
Chapitre IV
176
(variation de l‟angle de résonnance en fonction des différentes concentrations de biotine) qui
correspondent aux deux biofilms.
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
21.510.5
0,05mM 0,6mM
()
(°)
Concentration (mM)
Nano particules d'or
GA
0
Figure IV. 47:Courbes de calibration obtenues par SPR avec les deux biofilms représentant la variation de
l’angle de résonnance suite à l’injection des différentes concentrations de biotine.
Les résultats présenté dans la figure IV.46 nous a permis de déterminer successivement la
sensibilité et la limite de détection de la biotine pour chaque biofilm. En effet, le biofilm utilisant le
glutaraldéhyde montre une sensibilité de l‟ordre de 19,33 °/M et une limite de détection de 0,6 mM
et le biofilm utilisant les nanoparticules d‟or montre une sensibilité de l‟ordre de 196,6 °/M et une
limite de détection de 0,05 mM.
III.4. Comparaison des caractéristiques d’un biosystème utilisant un réactif de pontage protéique
d’un biosystème utilisant des nanoparticules d’or fonctionnalisées
Le tableau IV.23 présente les différentes caractéristiques des deux biosystèmes étudié
précédemment.
Résultats & discussion
Chapitre IV
177
Tableau IV. 22: Comparaisons des caractéristiques d’un biosystème à base d’un réactif de pontage et d’un
biosystème à base des nanoparticules d’or.
En comparant les résultats du tableau précédent, nous remarquons que les mesures optiques
ont montré que les nanoparticules d‟or ont prouvé leurs intérêts comme étant un système
d‟amplification de la détection par la grande surface active qu‟elles offrent. En effet, le système a
permis d‟améliorer la limite de détection de 0,6 mM jusqu‟à 0,05 mM d‟où sa grande sensibilité. Les
nanoparticules permettent de greffer 2,45 fois plus de molécules de neutravidine d‟où 10 fois plus de
site fixation de biotine.
IV. Caractérisation du biofilm constituant l’immunocapteur de bactérie E.coli
par les méthodes électrochimiques
Comme les performances d‟un immunocapteur sont intimement liées à la construction du
biofilm et au mode d‟immobilisation de l‟anticorps, nous avons utilisé différentes techniques de
caractérisation permettant le contrôle de construction du biofilm couche par couche (cf figure
IV.48).
caractéristiques
biofilm à base de
Glutaraldéhyde.
biofilm à base des
nanoparticules d’or
Nombre de molecule de neutravidine
/mm2
1.04 1010
molécules de
neutravidine/mm2
2,55 1010
molécules de
neutravidine/mm2
la surface moyenne occupée par
chaque molécule de neutravidine
9,61 10-11
mm2 3.91 10-
11 mm
2
Sensibilité en SPR 19,33 deg/M 196,6 deg/M
limite de détection en SPR 0.6 mM 0.05 mM
Résultats & discussion
Chapitre IV
178
: Thiol amine : Nanoparticule d’or
: Neutravidine : Anticorps biotinylé
Figure IV. 48: Représentation schématique d’un immunocapteur à base de nanoparticules d’or fonctionnalisées
IV.1. Caractérisation par voltamètrie cyclique
Les propriétés électrochimiques de chaque couche constituant le biofilm ont été analysées par
la voltamètrie cyclique. En effet, chaque couche est caractérisée par ses propriétés de transfert
électronique en présence du couple redox Fe(CN)63-
/4-
. La figure IV.49 présente la courbe I (V)
d‟une électrode l‟or successivement avec une couche thiol amine, une couche de nanoparticule d‟or
fonctionnalisé, une couche de neutravidine et une couche d‟anticoprs.les mesures ont été en présence
de couple redox Fe(CN)63-
/4-
, avec une vitesse de balayage de 50 mV/s.
Résultats & discussion
Chapitre IV
179
-0.8 -0.6 -0.4 -0.2 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8
-0.00012
-0.00010
-0.00008
-0.00006
-0.00004
-0.00002
0.00000
0.00002
0.00004
0.00006
0.00008
0.00010
0.00012
potentiel (V)
co
ura
nt
(A)
Thiol
nanoparticules d'or
Neutravidine
anticorps
Figure IV. 49: Voltamogrammes des différentes couches constituant le biofilm déposé sur une électrode d’or.
Mesures effectuées dans 5mM de K3 [Fe(CN)6] / K4[Fe(CN)6] dans le PBS (10 mM,pH 7).
Le voltamogramme correspondant à la couche du thiol montre un large signal où le potentiel
d‟oxydation est dans la gamme de 0.330 V et celui de la réduction à 0.029 V/ ECS. La présence
d‟une couche de nanoparticules d‟or entraine une augmentation du courant correspondant aux pics
d‟oxydo-réduction et à la variation du potentiels d‟oxydation à 0.296V/ESC et ce lui de réduction à
0.060V/ESC. En effet, cette couche favorise le transfert d‟électron au niveau de la couche du thiol,
donc elle augmente la conductivité du système d‟où l‟augmentation de la densité de transfert de
charge. En plus, la présence des nanoparticules permet d‟augmenter la surface spécifique. Par la
suite, l‟immobilisation de la neutravidine sur la couche les nanoparticules d‟or mène à la disparition
du transfert de charge, montrant que la couche déposée est une couche bloquante pour tous les
processus faradiques. Et finalement, lors de l‟immobilisation de l‟anticorps le courant diminue
encore.
IV.2. Caractérisation par AFM
Les topologies de la surface de l‟électrode d'or modifiée successivement par le thiol amine te
les nanoparticules d‟or ont été caractérisé par l'AFM en mode contact. Les figures IV.50.a et b,
montrent les images de la topologie de l‟électrode d‟or modifiée successivement par le thiol amine te
les nanoparticules d‟or.
Résultats & discussion
Chapitre IV
180
(a)
(b)
Figure IV. 50:(a )Image AFM d’une électrode d’or fonctionnalisée par le thiol amine. (b) Image AFM des
nanoparticules d’or greffées sur une électrode d’or fonctionnalisée par le thiol amine.
La figure IV.48.a montre que la surface de l‟électrode d‟or fonctionnalisé par le thiol amine
est sous forme des petits agrégats (de l‟ordre de 75 nm) répartis d‟une façon homogène. La figure
IV.51.b montre que la surface de l‟électrode modifiée par les nanoparticules d‟or est sous forme des
grains cristallins relativement denses et homogènes à l‟échelle nanométrique ce qui vérifie le
Résultats & discussion
Chapitre IV
181
greffage des nanoparticules d‟or sur la surface ainsi que leur bonne dispersion qui mène l‟
organisation et l‟orientation de l‟anticorps sur cette surface. En plus cette figure nous a permis de
déterminer la taille des nano particules d‟or qui sont de l‟ordre de 20 nm.
IV.3. Caractérisation par impédance
La caractérisation électrique du biofilm a été suivie par la spectroscopie d‟impédance. Les
figures IV.49.a, b et c présentent successivement le diagramme de Nyquist et le diagramme de Bode
d‟une électrode d‟or modifiée successivement par le thiol amine et les nanoparticules d‟or.
-2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
0 25 50 75 100 125
0
50
100
150
200
-Im
(z)
(cm
2)
Re(z) ( cm2)
Thiol Amin
Nano pareticules d'or
-Im
(z)
(cm
2)
Re(z) ( cm2)
Thiol Amin
Nano pareticules d'or
(a)
-1 0 1 2 3 4 5
-2000
0
2000
4000
6000
8000
10000
12000
14000
16000
|Z|
(c
m)
log (f)
Nanopartcule
Thiol
-1 0 1 2 3 4 5
-70
-60
-50
-40
-30
-20
-10
0
Ph
as
e (
de
gré
)
log (f)
Nanoparticule
Thiol
(b)
Figure IV. 51: Diagramme d‘impédance correspond à la couche de thiol amine et la couche des
nanoparticules d’or. (a) Nyquist, (b) Bode : Module v.s. fréquence, (c) Bode : Phase v.s.
fréquence. Mesures effectueés à -400mV dans le PBS ( 10 mM, pH 7).
Résultats & discussion
Chapitre IV
182
En effet, les resultats montrent un changement de spectre lors du greffage des nanoparticules
d‟or. Sur le diagramme de Nyquist nous remarquons l‟apparition d‟un petit cercle caracterisant la
couche des nanoparticules d‟or vers les hautes frequences. Ceci est verifié par l‟augmentation de la
phase qui est présentée sur le diagramme de bode (figure IV.49.c).
Les propriétés électriques de chaque couche ont été modélisées par l‟utilisation de deux types
de circuits électriques équivalents. Pour la couche de thiol nous avons modélisé le spectre qui lui
correspond par le circuit de la figure IV.41. Par contre le spectre correspondant à la couche de
nanoparticules d‟or a été modélisée par le circuit équivalent de la figure IV.52, où Rs, C f , R f, CPE,
Rm et W représentent respectivement: la résistance de l‟électrolyte, capacité de la couche de
nanoparticules d‟or, résistance de la couche des nanoparticule d‟or, élément de phase constant,
résistance de la membrane et impédance de Warburg. Les paramètres électriques obtenus sont
présentée dans le tableau IV.24.
Figure IV. 52: Modèle de circuit électrique équivalent d’une électrode d’or fonctionnalisée par des
nanoparticules d’or.
Sur la figure IV.53 sont reportés les diagrammes de Nyquist d‟une électrode d‟or modifiée
successivement avec une couche de thiol amine, une couche des nanoparticules d‟or, une couche de
neutravidine et une couche de d‟anticorps biotinylés. Les mesures d‟impédance ont été réalisées dans
une gamme de fréquence de 100 mHz-100kHz dans la solution PBS (10 mM, pH7) et avec une
polarisation de -400 mV.
Résultats & discussion
Chapitre IV
183
-2000 0 2000 4000 6000 8000 10000 12000 14000 16000
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
Re(z) ( cm2)
-Im
(z)
(c
m2)
Thiol amin
Nano particule d'or
Neutravidine
Ab
Figure IV. 53: Spectres d’impédance des différentes couches constituant le biofilm sur une électrode d’or
Mesures sont effectuées dans le PBS (10 mM, pH 7) à un potentiel -400mV.
En premier temps nous remarquons que le greffage des nanoparticules d‟or provoque la
diminution du diamètre du spectre d‟impédance par rapport à celui du thiol. L‟immobilisation de la
neutravidine provoque une la diminution du spectre de l‟impédance. Et finalement, le greffage des
anticorps biotinylé provoque l‟augmentation du diamètre du spectre.
Par ailleurs, tous ces diagrammes ont été modélisés en utilisant le circuit équivalent représenté sur
figure IV.52. Les paramètres électriques obtenus sont présentés dans le tableau IV.24.
Potentiel
(mV)
couches Rs
(Ωcm2)
Rf
(Ωcm2)
Cf
(Fcm2)
Rm
(Ωcm2)
W
(Ωcm2)
CPE
(µFcm2)-
αCPE 2
-400
Thiol (AUT) 27.60 - - 14060 2464 0.108 0.775 0.0013
Np.or 28.79 2754 0.367 172.9 7550 2.545 0.982 0.0003
Neutravidine 26.02 2451 0.315 133.3 7031 2.532 0.981 0.0002
Ac 27.39 3596 0.0134 142.4 6468 2.738 0.991 0.0005
Tableau IV. 23: Paramètres estimés à partir des modèles électriques.
Résultats & discussion
Chapitre IV
184
Les résultats montrent que la résistance du film diminue lors du greffage de la couche de
nanoparticules d’or. La présence de cette dernière favorise le transfert d'électrons de l'électrode modifiée,
donc l’augmentation de la conductivité du film. Par la suite, lors du greffage de la neutravidine la résistance
continue à diminuer. Ce phénomène peut être expliqué par la charge portée par cette protéine [27]. En plus
cette diminution peut être attribuée au changement de structure de la couche SAMs après la formation de
cette nouvelle couche. Finalement, l'immobilisation des anticorps sur l'électrode modifiée a été provoquée
par une augmentation de Rm.
V. Réponses de l’immunocapteur
La réponse de l‟immunocapteur consécutive aux injections d‟antigènes bactérie (E-coli), a été
étudiée. En fait, après avoir préparé l‟immunocapteur, l'électrode modifiée a été incubées
successivement dans différentes concentrations de bactérie, diluées dans la solution de PBS (10 mM,
pH7) pendant 30 min. La figure IV.54 présente les diagrammes de Nyquist obtenus avant et après
incubation de l‟électrode modifiée (AUT-NpOr-Neu-Ac) avec différentes concentrations d'antigène.
Les mesures d‟impédances ont été réalisées dans une gamme de fréquence 100mHz-100kHz dans la
solution PBS (10 mM, pH7) avec une polarisation de -400 mV.
0 2000 4000 6000 8000 10000
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
-Im
(Z)(
cm2
)
Re (Z)( cm2)
Ac
Ag1
CFU/ml
Ag10 CFU//ml
Ag102 CFU/ml
Ag103 CFU/ml
Ag104 CFU/mll
Figure IV. 54: Diagramme de Nyquist correspondant à la détection de différentes concentrations de la
bactérie E.Coli. Mesures effectuées dans le PBS (10 mM pH 7) à un potentiel -400mV.
Résultats & discussion
Chapitre IV
185
Comme le montre les résultats de figure IV.54, les spectres d'impédance augmentent
clairement avec l'augmentation de la concentration de l‟antigène, ce qui est dû à l‟interaction
spécifiques entre l‟antigène et l‟anticorps. Par ailleurs, tous ces diagrammes ont été modélisés en
utilisant le circuit équivalent présenté sur la Figure IV.50. Les paramètres électriques obtenus sont
présentées dans le tableau IV.25.
Potential
(mV)
Concentrations
Ag
(CFU/ml)
Rs
(Ωcm2)
Rf
(Ωcm2)
Cf
(mFcm2)
Rm
(Ωcm2)
W
(Ωcm2)
CPE
(µFcm2)
αCPE 2
- 400
0 27.39 3596 0.134 142.4 6468 2.73 0.991 0.0005
1 26.62 3085 0.183 134.8 7071 2.89 0.962 0.0005
10 27.64 2970 0.214 119.2 7071 2.74 0.968 0.0005
102 28.23 2836 0.105 60.94 5610 2.60 0.967 0.0006
103 27.92 2730 0.163 53.94 5345 2.58 0.967 0.0006
104 28.42 2047 0.435 49.53 7640 2.79 0.966 0.0006
Tableau IV. 24: Paramètres issus du fittage avec le circuit de la figure IV.50 des diagrammes de Nyquist
obtenus avant et après incubation d’une électrode d’or modifiée (AUT /Np.or/Neu/Ac) dans
différentes concentrations d'antigène diluées dans le PBS.
Les résultats montrent que la résistance de la membrane varie avec la variation de la concentration
d’antigènes. La courbe de calibration, représentant la variation de la résistance Rm en fonction de la
concentration en antigène dilué dans la solution de PBS., est présentée sur la figure IV.55.
La variation de la résistance de la membrane est calculée à partir de l'équation suivante :
Où et sont respectivement les valeurs de la résistance du biofilm pour l‟anticorps seul et en
présence d‟une concentration de bactérie obtenue à partir du modèle électrique.
Résultats & discussion
Chapitre IV
186
0.0 3.0x102
6.0x102
9.0x102
0
20
40
60
80
100
120
R
m (
cm
2)
[Ag] (CFU/ml)
Figure IV. 55: Courbe de calibration représentant la variation de la résistance du biofilm pour différentes
concentrations de la bactérie E.Coli.
La réponse de l'immunocapteur présente deux régions : une région linéaire, comprise entre 1
et 100 CUF/ml, avec une pente de 2,087 cm2 / CUF/ml et une limite de détection de l‟ordre de 1
CUF/ml. La seconde région commence à 100 CUF/ml, et représente la zone de saturation de
l‟immunocapteur.
Afin d‟étudier le temps de réponse de l‟immunocapteur, nous avons contrôlé le temps de
stabilisation du spectre pour chaque concentration d‟antigène. Nous avons remarqué que le temps de
réponse est en moyenne d‟une heure.
La reproductibilité de l'immunocapteur a été étudiée en répétant l'expérience avec cinq
immunocapteurs différents. Les résultats montrent que la réponse de l‟immunocapteur présente un
écart type moyen de 10,7%.
VI. Conclusion
Dans cette partie nous avons présenté les résultats expérimentaux pour le développement
d‟un immunocapteur à base de nanoparticules d‟or par des mesures optiques et électriques. Nous
avons également étudié l‟interaction spécifique entre l‟anticorps et l‟antigène. En plus, par
Résultats & discussion
Chapitre IV
187
comparaison aux analyses effectuées sur un système à base des billes magnétiques [138
], nous avons
pu vérifier que l‟usage des nanoparticules d‟or offre un nouveau concept permettant d‟améliorer la
limite détection de l‟antigène jusqu‟à de 1CUF/ml.
Résultats & discussion
Chapitre IV
188
Références bibliographique
[110
] J. Travas-Sejdic, H. Peng, R.P. Cooney, G.A. Bowmaker, M.B. Cannell and C. Soeller:
Current Applied Physics 6 (2006) 562.
[111
] P. N. Bartlett and P. R. Birkin: Synthetic Metals 61 (1993) 15.
[112
] N. Haddour, S. Cosnier and Ch.Gondran: J. AM. CHEM. SOC 127 (2005) 5752.
[113
] W. Schuhmann, R. Lammert, B. Uhe and H.L. Schmidt, Sens. Actuators B 1 (1990) 537.
[114
] S. sadki, Ph. Shttland, N. Brodie and G. Sabouraud: Chem. Soc. Rev. 29 (2000) 283.
[115
] A.Hallik, A. Alumaa, J. Tamm, V.Sammelselg, M. Vaartnou, A. Janes and E. Lust: Synthetic
Metals 156 (2006) 488.
[116
] A. A. Diagne, M. Fall, M. Guene, M. M. Dieng, F. Deflorian, S. Rossi, P. Bonora and C.
Della Volpe, C. R. Chimie 10 (2007) 558.
[117
] A. Sezai Sarac, S. Sezgin, M. Ates and C. Metehan Turhan: Surface & Coatings Technology
202 (2008) 3997.
[118
] N.F. Atta, A. Glal and F. Khalifa, Applied surface Science 253 (2007) 4273.
[119
] A.F. Diaz, I.C Catillo, J.A. Logan and L. Wen-Young: J. Electroanal. Chem. 129 (1981) 115.
[120
] T.Shmidzu, A. Ohtani, T. Iyoda and K. Honda: J.Electroanal. Chem. 224 (1987) 123.
[121
] A. Sezai Sarac, S. Sezgin, M. Ates, C. Metehan Turhan, Surface and Coatings Technology
202 (2008) 3997.
[122
] J. Heinze, R. Bilger, Physical Chemistry, 97 (1993) 502.
[123
] F. T. A. Vork, B. C. A. M. Schuermans and E. Barendrecht: Electrochemica. Acta 35 (1990)
567.
[124
] W. Hu, C. M. Li, X. Cui, H. Dong, and Q. Zhou, Langmuir., 23 (2007), 2761.
[125
] Stenberg H., Persson B., Roos H., Urbaniczky C., Colloid Interface Sci., 143(1991) 513.
[126
] H. Ben Fredj, S. Helali, C. Esseghaier, L. Vonna, L. Vidal, A. Abdelghani , Talanta, 75,
(2008)740.
[127
] T. Silk, Q. Hong, J. Tamm, R. G. Compton, Synth. Met., 93(1998) 59.
[128
] R. E. Ionescu, N. Jaffrezic-Renault, L. Bouffier, C. Gondran, S. Cosnier, D. G. Pinacho, M.-
P. Marco, F. J. Sánchez-Baeza, T. Healy and C. Martelet, Biosensors & Bioelectronics.,
30(2007)549.
Résultats & discussion
Chapitre IV
189
[129
] H. Korri-Youssoufi, P. Godillot, P. Srivastava, A. El Kassmi, F. Garnier. Synth. Met., 84
(1997)169.
[130
] E.K.M. Ueda, P.W. Gout, L. Morganti, Journal of Chromatography A., 23 (2003) 1.
[131
] A.S. McQueen, S.T. Elliott, M.J. Keir, , Clinical Radiology 64(2009) 148.
[132
] J. Travas-Sejdic, H. Peng, R.P. Cooney, G.A. Bowmaker, M.B. Cannell and C. Soeller:
Current Applied Physics 6 (2006) 562.
[133
] C.A. Mirkin, R.L. Letsinger, R.C. Mucic, J. Storhoff, Nature, 382 (1996) 607.
[134
] L. Andrew Lyon, M.D. Musik, Anal.Chem, 70 (1998)5177.
[135
] S. Roux, B. Garcia, J.-L. Bridot, M. Salome, C. Marquette, L. Lemelle, P. Gillet, L. Blum, P.
Perriat, O. Tillement, Langmuir, 21 (2005) 2526.
[136
] S.Helali, conception et réalisation de matériaux bifonctionnels pour des dispositifs capteurs
impédimétriques, thèse soutenue en décembre 2005.
[137
] B.A., Snopok K.V.Kostyukevych, O.V. Rengevych, Y.M. Shirshov, E.F. Venger, Semicond.
Phys., Quant. Electron. Optoelectron. 1(1998) 121.
[138
] R. Maalouf, Ch.Fournier-Wirth, J. Coste, H. Chebib, Y.Saı1kali, O. Vittori, A. Errachid, J.-P.
Cloarec, C. Martelet, N. Jaffrezic-Renault, Anal. Chem., 79(2007) 4879.
Conclusion générale
190
Conclusion Générale
Conclusion générale
191
Les techniques de diagnostic et les immuno-essaies classiques sont sélectifs et sensibles mais
nécessitent plusieurs étapes successives et se font grâce à des marqueurs enzymatiques. Ils sont donc
inadaptés à la demande croissante du diagnostic médical. Nous avons présenté dans le travail de
thèse une étude physique sur le développement des capteurs à base des nouveaux nanomatériaux
pour l‟amélioration de la détection sans marqueur d‟antigènes. L‟ensemble des résultats obtenus a
permis d‟apporter des nouvelles modes de détection d‟une importance fondamentale pour le
diagnostic médical. Nous avons montré que lorsque l'anticorps se fixe sur l'antigène, il se produit des
variations des propriétés électriques, et des propriétés optiques. Ces variations peuvent être détectées
par différents transducteurs. L‟objectif de notre étude était de développer des immunocapteurs à base
des nanomatériaux permettant l‟amélioration de leurs performances.
La biofonctionnalisation est une étape clé pour la réalisation du biocapteur et donc pour
l‟obtention de bonnes performances analytiques. Deux procédures de fonctionnalisation de la
surface d‟or ont été étudiées par mesure d‟impédance et par résonance plasmonique de surface.
Nous avons, en premier lieu, déposé sur l‟électrode d‟or un copolymère fonctionnalisé (co-
polypyrrole) par voie électrochimique. L'immobilisation de l'anticorps sur ce matériau est
assurée par l‟intermédiaire de l‟agent NTA coordonné avec un métal (le cuivre Cu2+
). La
deuxième procédure consiste en l‟immobilisation d‟une couche des nanoparticules d‟or
fonctionnalisées par l‟intermédiaire d‟une monocouche auto assemblée (SAM).
La première procédure de fonctionnalisation a été appliquée pour le développement d‟un
immunocapteurs pour le diagnostic de la thrombose veineuse profonde (DVT). En effet nous
avons étudié, en premier lieu, les propriétés électriques et le comportement du film de
copolymère à différents potentiels appliqués. Nous avons également prouvé que l'EIS peut être
employée pour contrôler la construction du biofilm de la même façon que la résonance
plasmonique de surface. L‟AFM et la spectroscopie infrarouge interviennent por la
caracterisation morphologique et chimique. L‟étude de la réponse de l‟immunocapteur à
différents potentiels de polarisation nous a permis de déterminer les conditions électriques
optimales où le capteur est le plus sensible. En second lieu, nous avons étudié la mise au point
de l‟immunocapteur pour la détection d‟antigène dans le plasma humain et dans le sang pour le
diagnostic de la thrombose veineuse profonde (DVT). Les résultats, ont vérifié la faisabilité de la
Conclusion générale
192
détection d'antigène dans le sang entier ainsi que la possibilité de valider cet immunocapteur
pour la detection d‟un antigène modèle. Finalement, la mise en application de l‟immunocapteur
impédimètrique pour la détection du D-dimer dans des échantillons sanguins de patients atteints
de la DVT a été réalisée. Les résultats, ont vérifié la faisabilité et la validité de l‟immunocapteur.
L‟utilisation des nanoparticules pour le développement d‟un immunocapteur, pour la
détection de la bactérie pathogénique E.Coli, a suscité un intérêt croissant. Cette approche
permet d‟une part de minimiser le problème de diffusion, d‟augmenter la surface de contact avec
le milieu environnant ainsi que la densité de greffage des biomolécules et d‟autre part, de
maintenir la stabilité et l‟activité de la biomolécule. En terme d‟amélioration des performances
des biocapteurs, grâce au comportement quasi moléculaire en raison de leur petite taille, les
nanoparticules fonctionnalisées permettent d‟augmenter la sensibilité et d‟abaisser le seuil de
détection.
En perspective de ce travail, notre objectif futur est leur développement et l‟intégration en
parallèle des capteurs dans des cellules microfluidiques, ce qui permettra une réduction en temps
remarquable (de plusieurs jours à quelques dizaines de minutes), et la réduction de volume pour
minimiser l‟usage des réactifs. Cela nous permettra aussi de se rapprocher des réactions telles
qu‟elles se font en milieu biologique (vaisseaux sanguins….). La microfluidique est un domaine en
pleine expansion aussi bien au niveau académique qu‟industriel.