etude de l'effet d'une contrainte d'étirement équibiaxial

AVERTISSEMENT

Ce document est le fruit d'un long travail approuv par le jury de soutenance et mis disposition de l'ensemble de la communaut universitaire largie. Il est soumis la proprit intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de rfrencement lors de lutilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pnale. Contact : [email protected]

LIENS Code de la Proprit Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Proprit Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10 http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm

Laboratoire de Physiopathologie et Pharmacologie Articulaires UMR 7561 CNRS-UHP, Facult de Mdecine - 54505 Vanduvre-ls-Nancy

Ecole Doctorale Biologie-Sant-Environnement

Thse

Prsente et soutenue le 21 juillet 2009 pour obtenir le grade de

DOCTEUR DE lUNIVERSITE HENRI POINCARE, NANCY I

Spcialit : Ingnierie cellulaire et tissulaire

Par

Huahua CHEN

Titre :

Mcanotransduction et cellules souches msenchymateuses humaines.

Etude de leffet dune contrainte dtirement quibiaxial sur la voie de TGF

Directeur de thse : Docteur Danile BENSOUSSAN

Co-Directeur de thse : Docteur Natalia de ISLA

JURY Rapporteurs : Mme. Nadia BENKIRANE-JESSEL DR/INSERM U977, Universit Louis Pasteur, Strasbourg M. Ren SANTUS PU/INSERM U312, MNHN, Paris Examinateurs : M. Jean-Franois STOLTZ PU-PH, UMR 7561 CNRS-UHP, Nancy Mme. Danile BENSOUSSAN HDR-PH, UTCT, CHU, Nancy Mme. Natalia de ISLA MCU, UMR 7561 CNRS-UHP, Nancy M. Daniel ISABEY DR/ INSERM U841, Universit Paris 12, Crteil

Avant-propos et remerciements

1

AVANT-PROPOS ET REMERCIEMENTS


2

Ce travail a t ralis dans le cadre dune collaboration scientifique entre le

Laboratoire de Physiopathologie, Pharmacologie et Ingnierie Articulaires (CNRS UMR

7561) de la Facult de Mdecine de lUHP, lUnit de Thrapie Cellulaire et Tissulaire du

CHU de Nancy, et le Dpartement de Physiopathologie de la Facult de Mdecine de

lUniversit de Wuhan, Chine.


3

A mes parents

A mon mari

A toute ma famille et tous mes amis


4

Au terme de ce travail, je tiens avant tout adresser mes remerciements les plus chaleureux

tous ceux qui mont aide au cours de sa ralisation.

Je tiens tout dabord manifester ma gratitude Monsieur le Professeur

Jean-Franois STOLTZ, directeur du laboratoire, qui ma fait lhonneur de maccueillier

et ma permis de raliser ce travail dans son laboratoire. Je lui suis trs reconnaissante pour

sa confiance, ses remarques, son soutien financier et scientifique.

Je tiens exprimer ma reconnaissance Madame le Docteur Danile BENSOUSSAN,

mon directeur de thse qui ma encadre. Je la remercie plus spcialement pour les

nombreuses discussions et suggestions prcieuses et pour la patience et le courage dont elle

a tmoign lors de la correction de ce manuscrit.

Jexprime ma profonde reconnaissance Madame le Docteur Natalia DE ISLA,

matre de confrence, ma co-directrice de recherche, pour ses nombreux conseils

scientifiques durant ces trois annes. Je la remercie plus spcialement pour la patience et le

courage dont elle a tmoign lors de la correction de ce manuscrit.

Je remercie trs sincrement Madame le Professeur Jing-Ping OUYANG, directeur de

laboratoire Wuhan, pour mavoir donn la possibilit de participer cette collaboration

scientifique, pour son aide et ses conseils scientifiques.

Jexprime ma profonde reconnaissance galement Monsieur le Professeur Xiong

WANG, pour sa disponibilit et ses encouragements au cours de ma thse ainsi que pour

son aide, sa gentillesse et ses prcieux conseils.

Je tiens remercier Madame le Docteur Sylvaine MULLER, CR1 INSERM, pour

mavoir aide lors de mon initiation ces travaux.

Je tiens remercier Madame le Docteur Cline GIGANT-HUSELSTEIN, matre de

confrence, pour ses encouragements et son amiti.


5

Je remercie beaucoup Claude WENDLING, pour sa gentillesse, son aide et sa

disponibilit.

Mesdames Ghislaine CAUCHOIS, Monique GENTILS, Brigitte GUERBER et

Karine LORCIN, pour leur gentillesse mon gard et leur soutien constant. Je leur

exprime ma profonde reconnaissance.

Je tiens remercier Monsieur le Docteur Dominique DUMAS, Ingnieur de

Recherche, pour sa sympathie, sons conseils et son aide concernant notamment la

microscopie confocale.

Enfin, mes remerciements vont galement vers mes chers collgues et amis du

laboratoire pour mavoir encourage et supporte durant ces annes :

Assia, Leticia, Nicolas B, Jessica, Nicolas S, Nasser, Estelle, Mariama, Lei, Cyril,

Cdryck, Jingwei, Yinping, Yun, Elisabeth, Vanessa, Halima.

Table de Matires

6

TABLE DE MATIERES

Table de Matires

7

AVANT-PROPOS ET REMERCIEMENTS ................................................. 1TABLE DE MATIERES ................................................................................. 6LISTE DES PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS ....................... 13LISTE DES ABREVIATIONS ..................................................................... 15LISTE DILLUSTRATIONS ........................................................................ 18INTRODUCTION GENERALE .................................................................. 29CHAPITRE I : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUES .................................... 33I. Physiologie du cartilage articulaire ............................................................................. 34

I.1. Constitution du cartilage articulaire ..................................................................... 34

I.2. Structure du cartilage articulaire .......................................................................... 37

I.3. Les contraintes mcaniques sur le cartilage articulaire ........................................ 38

I.4. Fonctions du cartilage articulaire ......................................................................... 38

II. Physiopathologie du cartilage articulaire .................................................................. 39

II.1. Stratgies thrapeutiques concernant les lsions cartilagineuses ....................... 40

II.1.1. Les traitements mdicaux ......................................................................... 40

II.1.2. Les traitements chirurgicaux ..................................................................... 41

II.1.3. Lingnierie tissulaire du cartilage ............................................................ 42

III. Cellules souches (CSs) ............................................................................................... 43

III.1. Les cellules souches embryonnaires (CSEs) ..................................................... 44

III.2. Les cellules souches ftales et ombilicales ...................................................... 46

III.3. Les cellules souches adultes .............................................................................. 46

III.3.1. Les cellules souches msenchymateuses (CSMs) ................................... 47

III.3.2. Utilisation des CSMs en ingnierie cellulaire et tissulaire ....................... 53

IV. La diffrenciation de CSMs ....................................................................................... 54

IV.1. La rgulation de la diffrenciation des CSMs ................................................... 54

IV.1.1. Runx2 dans lostogense et la chondrogense ...................................... 56

IV.1.2. Sox9 dans la chondrogense ................................................................... 58

V. La chondrogense ........................................................................................................ 59

V.1. La condensation de CSMs ................................................................................... 59

V.2. La diffrenciation chondrocytaire ....................................................................... 60

Table de Matires

8

V.3. Lhypertrophie des chondrocytes ........................................................................ 61

VI. La voie de signalisation de TGF- et les protines Smads ....................................... 62

VI.1. Membres de la famille du TGF- ...................................................................... 62

VI.1.1. Le TGF- ................................................................................................. 62

VI.2. Le modle gnral de la voie de signalisation de TGF- via Smads ................ 63

VI.2.1. La navette des Smads entre le noyau et le cytoplasme ..................... 70

VI.3. La phosphorylation de Smads rgule par les voies de kinase ......................... 71

VI.4. La signalisation de TGF- Smad-indpendante ................................................ 72

VI.5. La relation entre la signalisation par TGF- et le cytosquelette ....................... 73

VI.6. Rle des TGF-s dans la diffrenciation des CSMs ......................................... 74

VI.7. Rle de la protine Smad3 dans la diffrenciation des CSMs .......................... 75

VII. Les contraintes mcaniques ..................................................................................... 75

VII.1. Rponse des cellules aux contraintes mcaniques ........................................... 76

VII.1.1. Le mcanisme de la mcanotransduction cellulaire .............................. 76

VII.2. Les comportements cellulaires et la prcontrainte (tensegrity) ........... 78

VII.2.1. La prcontrainte cellulaire et le modle tensgrit ................................ 79

VII.2.2. La morphologie cellulaire et leur destin .............................................. 81

VII.3. Diffrenciation des CSMs par des contraintes mcaniques externes ............... 82

VII.3.1. La compression ...................................................................................... 83

VII.3.2. Ltirement ............................................................................................. 84

VII.3.3. La pression hydrostatique ...................................................................... 85

VII.3.4. Le cisaillement ....................................................................................... 86

VII.3.5. Contraintes mcaniques complexes ....................................................... 86

VII.4. Application de contraintes mcaniques contrles ........................................ 87

CHAPITRE II : MATERIELS ET METHODES ...................................... 88I. Culture cellulaire .......................................................................................................... 89

I.1. Ractifs ................................................................................................................. 89

I.2. Protocoles ............................................................................................................. 90

I.2.1. Isolement des cellules partir des prlvements ....................................... 90

I.2.2. Comptage des cellules ................................................................................ 92

I.2.3. Comptage des CFU-Fs ............................................................................... 92

Table de Matires

9

I.2.4. Passage et conglation des cellules ............................................................ 92

I.3. Mise en condition des cellules ............................................................................. 93

II. La stimulation mcanique ........................................................................................... 94

II.1. Les appareils de stimulation mcanique ............................................................. 94

II.1.1. Lappareil dtirement .............................................................................. 94

II.1.2. Lappareil de compression ........................................................................ 95

II.2. Ractifs et matriels ............................................................................................ 96

II.3. Protocole ............................................................................................................. 97

II.3.1. Fabrication des cylindres dalginate/HA .................................................. 97

II.3.2 La stimulation mcanique .......................................................................... 97

III La stimulation biochimique ........................................................................................ 98

III.1. Ractifs .............................................................................................................. 98

III.2. Protocole ............................................................................................................ 98

IV. Cytomtrie en flux ...................................................................................................... 99

IV.1. Analyse de viabilit cellulaire, apoptose et ncrose en cytomtrie en flux ....... 99

IV.1.1. Principe .................................................................................................... 99

IV.1.2. Ractifs .................................................................................................. 100

IV.1.3. Protocole ................................................................................................ 100

IV.2. Analyse du cycle cellulaire en cytomtrie en flux .......................................... 101

IV.2.1 Principe .................................................................................................. 101

IV.2.2 Ractifs ................................................................................................... 103

IV.2.3 Protocole ................................................................................................. 103

IV.3. Analyse de lexpression de marqueur de surface cellulaire en cytomtrie en flux

..................................................................................................................................... 103

IV.3.1. Marquage par immunofluorescence directe .......................................... 103

V. Analyse du mtabolisme cellulaire ............................................................................ 105

V.1. Principe ............................................................................................................. 105

V.2. Ractifs ............................................................................................................. 106

V.3. Protocole ........................................................................................................... 106

VI. Etude de lexpression de protines en microscope confocal .................................. 107

VI.1. Marquage par immunofluorescence indirect ................................................... 107

Table de Matires

10

VI.1.1 Principe du marquage par immunofluorescence indirecte ..................... 107

VI.1. 2 Ractifs .................................................................................................. 107

VI.1.3 Protocole ................................................................................................ 108

VI.2. Observation en microscopie confocale balayage laser ................................. 109

VI.2. 1 Principe ................................................................................................. 109

VI.2.2. Protocole ............................................................................................... 112

VI.3. Analyse de la densit de fluorescence ............................................................. 112

VII. Etude de lexpression des protines par Immuno-empreinte (Western blot) ....... 113

VII.1. Principe .......................................................................................................... 113

VII.2. Ractifs .......................................................................................................... 113

VII.3. Protocole ........................................................................................................ 115

VII.3.1. Extraction et prparation des protines des cellules ............................ 115

VII.3.2. Electrophorse des protines ............................................................... 116

VII.3.3 Transfert ................................................................................................ 117

VII.3.4. Coloration au rouge ponceau ............................................................... 118

VII.3.5. Blocage de la membrane ...................................................................... 119

VII.3.6 Immunomarquage ................................................................................. 119

VII.3.7. Rvlation par chimiluminescence ...................................................... 119

VIII. Etude de lexpression de gnes par RT-PCR (Reverse Transcription-Polymerase

Chain Reaction) ................................................................................................................. 120

VIII.1. Principe ......................................................................................................... 120

VIII.2. Ractifs ......................................................................................................... 120

VIII.3. Protocole ....................................................................................................... 122

VIII.3.1. Extraction des ARN totaux des cellules ............................................. 122

VIII.3.2. Rtrotranscription des ARNm (RT) .................................................... 123

VIII.3.3. Raction de PCR ................................................................................. 123

VIII.3.4. Electrophorse des produits dADNs ................................................. 124

IX. Etude de la concentration de TGF-1 dans le milieu de culture par ELISA ........ 125

IX.1 Le principe dELISA ........................................................................................ 125

IX.2. Ractifs ............................................................................................................ 126

IX.3. Protocole ......................................................................................................... 127

Table de Matires

11

X. Etude de llongation des cellules par microscope optique ...................................... 127

XI. Analyse statistique .................................................................................................... 128

CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSIONS ................................ 129Partie I : Optimisation des conditions de culture pour lisolement et lexpansion des

CSMs .................................................................................................................................. 130

I.1. Caractrisation morphologique des CSMs ......................................................... 130

I.2. Formation de colonies (CFU-Fs) ....................................................................... 134

I.3. Prolifration cellulaire ........................................................................................ 135

I.4. Caractrisation phnotypique des cellules ......................................................... 136

I.5. Discussion : ........................................................................................................ 138

Partie II : Etude de leffet du TGF-1 sur les CSMs et les chondrocytes ....................... 142

II.1. Effet du TGF-1 sur la viabilit cellulaire ........................................................ 143

II.2. Effet du TGF1 sur le mtabolisme des CSMs ................................................ 143

II.3. Leffet du TGF-1 sur le cycle cellulaire des CSMs ........................................ 144

II.4. Etude de leffet du TGF-1 sur la phosphorylation de Smad3 (Smad3p) dans les

CSMs et les chondrocytes ........................................................................................... 145

II.5. Effet du TGF-1 sur lexpression des gnes de Sox9, Runx2 et PPAR dans les

CSMs par RT-PCR. ..................................................................................................... 149

II.6. Discussion ......................................................................................................... 151

Partie III: Etude de leffet dune contrainte dtirement sur les CSMs et les chondrocytes

............................................................................................................................................ 154

III.1. Leffet de ltirement sur la viabilit des CSMs et des chondrocytes. ............ 155

III.2. Leffet de ltirement sur la prolifration des CSMs et des chondrocytes. ..... 156

III.3. Leffet de ltirement quiaxial sur la phosphorylation de protines Smad3

(Smad3p) ..................................................................................................................... 158

III.3.1. Leffet de ltirement en fonction du temps .......................................... 158

III.3.2. Effet de linteraction de ltirement et du TGF-1 sur la phosphorylation

de Smad3 .............................................................................................................. 163

III.3.3. Effet de la frquence dapplication de ltirement sur la phosphorylation

des protines Smad3 ............................................................................................. 164

III.4. Effet de ltirement sur lexpression des gnes Sox9, Runx2, PPAR et du

Table de Matires

12

Collagne II dans les CSMs. ....................................................................................... 166

III.5. Vers un mcanisme de mcanotransduction conduisant la phosphorylation de

Samd3 .......................................................................................................................... 168

III.5.1. Implication du rcepteur du TGF ............................................................... 168

III.5.2. Activation du TGF latent par la contrainte mcanique ....................... 170

III.5.3. Implication du cytosquelette ................................................................. 173

III.6. Discussion ....................................................................................................... 178

CHAPITRE IV : CONCLUSIONS ET PERSPECTIVES ...................... 181REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES .................................................. 187

Liste des publications et communications

13

LISTE DES PUBLICATIONS ET COMMUNICATIONS

Liste des publications et communications

14

Publications dans des revues internationales

1. H.H. Chen, V. Decot, J.P. Ouyang, J.F. Stoltz, D. Bensoussan, N.G. de Isla. In vitro

initial expansion of mesenchymal stem cells is influenced by the culture parameters

used in the isolation process. Bio-Medical Materials and Engineering, 2009 (sous

presse).

2. H.H. Chen, J.P. Ou-Yang, J.F. Stoltz, D. Bensoussan, N. de Isla. Effects of short-term

cyclic tensile strain and TGF-1 on smad pathway in undifferentiated human

mesenchymal stem cells (en preparation).

Communications dans des congrs

1. H.H. Chen, J.P. Ou-Yang, J.F. Stoltz, N. de Isla. Effect of short-term cyclic tensile

strain and TGF-1 on smad pathway in human mesenchymal stem cells. (Abstract)

FASEB Journal, 2009 (sous presse)

2. H.H. Chen, N.G. de Isla, N. Wang, H. Louis, C. Huselstein, P. Lacolley, J.P. Ouyang,

J-F. Stoltz. Cyclic tensile strain effects on smad3 phosphorylation in human

chondrocytes and mesenchymal stem cells. (Abstract, poster presentation) OARSI

septembre 2008 Rome, Osteoarthritis & cartilage, 2008, Volume 16 (supplement 4):

S199

3. H.H. Chen, V. Decot, J.P. Ouyang, J.F. Stoltz, D. Bensoussan, N.G. de Isla. In vitro

initial expansion of mesenchymal stem cells is influenced by the culture parameters

used in the isolation process. (Abstract, poster) 5rd meeting on Bioengineering and

biotherapies and 4rd meeting of Lorraine Center of Cartilage Engineering.

Septembre 2008 Nancy

4. N.G. de Isla, H.H. Chen, C. Huselstein, D. Mainard, P, Netter, J.F. Stoltz, S. Muller.

Mechanical compression effects on NO production in human OA cartilage explants

under different oxygen tensions. (Abstract, poster) 4rd meeting on Bioengineering

and biotherapies and 3rd meeting of Lorraine Center of Cartilage Engineering.

Septembre 2007 Nancy

Liste des abrviations

15

LISTE DES ABREVIATIONS


16

ADN Acide Dsoxyribonuclique

ADNc ADN Complmentaire

ARN Acide Ribonuclique

BMPs Bone Morphogenetic Proteins

BSA Albumine de Srum Bovin

CD Cluster de Diffrenciation

CMF Cytomtrie en Flux

COMP Cartilage Oligo Matrix Protein

CSEs Cellules souches embryonnaires

CSHs Cellules Souches Hmatpoptiques

CSMs Cellules Souches Msenchymateuses

DMEM Dulbeccos Modified Eagle Medium

DMSO Dimethyl Sulfoxide

DO Densit Optique

EDTA Acide Ethylnedinitrilottraactique

ET Etirement

FACS Fluorescence Activated Cell Sorting

FITC Fluorescein Isothiocyanate

FSC Forward Scatter

GAGs Glycosaminoglycannes

HA Acide Hyaluronique

HBSS Hanks Balanced Salts Solution

HLA Humain Leukocyte Antigen

HS Sulfate dHparanne

ICAM-1 Intercellular Adhesion Molecule-1

IMF Intensit Moyenne de Fluorescence

IP Iodure de Propidium

KS Sulfate de Kratanne

MAPCs Multipotent Adult Progenitor Cells

MEC Matrice Extracellulaire


17

PAF paraformaldhyde

PBS Phosphate Buffered Saline

PCR Polymerase Chain Reaction

PVDF Polyfluorure de vinylidne

PMT Photomultiplicateur

RT-PCR Reverse Transcription Polymerase Chain Reaction

SC Sans contrainte

SVF Srum de Veau Ftal

TF Facteurs de Transcription

TGF- Transforming Growth Factor-

VCAM-1 Vascular Cellular Adhesion Molecule-1

-MEM Alpha MEM Eagle avec EBSS

Liste dillustrations

18

LISTE DILLUSTRATIONS


19

Figures

Chapitre I :

Figure 1 : Etapes impliques dans lingnierie du cartilage.

Figure I-1 : Reprsentation schmatique de l'organisation des collagnes dans le tissu

cartilagineux.

Figure I-2 : Structure du cartilage articulaire.

Figure I-3 : Etapes impliques dans lingnierie du cartilage.

Figure I-4 : Reprsentation schmatique des diffrentes tapes de la chondrogense et de

lostogense au cours du dveloppement des os longs.

Figure I-5 : Reprsentation schmatique de lexpression des facteurs transcriptionnels lors

des diffrentes tapes de la chondrogense et de l'ossification endochondrale.

Figure I-6 : Classification des cellules souches selon leur origine.

Figure I-7 : Diffrenciation des tissus humains.

Figure I-8 : Filiation des diffrentes populations cellulaires de la moelle osseuse.

Figure I-9 : Capacit de diffrenciation des cellules souches msenchymateuses.

Figure I-10 : Conditions de culture favorisant le processus de la diffrenciation in vitro des

CSMs en tissu spcifique (lgende encadr).

Figure I-11 : Rgulation de la diffrenciation des CSMs par les facteurs de transcription

spcifiques.

Figure I-12 : Processus de scrtion du TGF-.

Figure I-13 : Le mcanisme gnral de la voie de signalisation de TGF- via les protines

Smads.

Figure I-15 : La localisation subcellulaire des rcepteurs et la rgulation de la voie de la

signalisation de TGF-.

Figure I-16 : La structure et le rle des domaines de Smads.


20

Figure I-17 : Le complexe R-Smads/Smad4 sassocie avec les facteurs de transcription

spcifiques de squence (X) qui ont une affinit haute pour la squence

dADN (XBE).

Figure I-18 : Modle de la navette des Smads dans les cellules avec ou sans la stimulation

de TGF-.

Figure I-19 : Les voie de signalisation de TGF- Smad-indpendantes.

Figure I-20 : Signalisation de TGF- sur le cytosquelette de lactine.

Figure I-21 : Les effets des protines membres de la famille de TGF- sur la diffrenciation

des CSMs.

Figure I-22 : Les mdiateurs de la mchanotransduction cellulaire.

Figure I-23 : La voie de mcanotraduction par les intgrines, le complexe dadhnsion

focale (CAF) et le cytosquelette.

Figure I-24 : La morphologie des cellules sur des substrats lastique dpend de la rigidit

du substrat.

Chapitre II :

Figure II-1 : La plaque BioFlex et les chambres de lab-tek.

Figure II-2 : Appareil dtirement Flexcell Tension Plus System (FX-4000T)

Figure II-3 : Principe dtirement.

Figure II-4 : Appareil de compression et son principe.

Figure II-5 : Moule pour la cration de cylindre dalginate/HA.

Figure II-6 : La structure de linhibiteur de Smad3.

Figure II-7: La structure de linhibiteur du rcepteur de type I.

Figure II-8: Diffrentes phases du cycle cellulaire.

Figure II-9 : Analyse des phases du cycle cellulaire par cytomtrie en flux.

Figure II-10 : Principe du marquage par immunofluorescence directe.


21

Figure II-11 : Principe du marquage par immunofluorescence indirecte.

Figure II-12: Acquisition de l'image en microscopie confocale. Dplacement dans les axes x,

y et z.

Figure II-13 : Gomtrie de l'optique confocale balayage laser.

Figure II-14 : Principe de lillumination laser en mode Multiphoton.

Figure II-15: Microscope optique confocale Leica TSC SP2-AOBS.

Figure II-16: Le montage de transfert des protines du gel vers la membrane PVDF.

Figure II-17 : Principe de la technique de PCR

Figure II-18 : Principe et tapes principales dELISA.

Figure II-19 : Mthodes danalyse de lindice dlongation des cellules.

Chapitre III :

Figure III-1 : La morphologie des cellules sous la microscopie optique dans les milieux de

-MEM (A, B, C, D), et DMEM (E, F, G, H).

Figure III-2 : La morphologie des cellules des clonies sous la microscopie optique.

Figure III-3 : Effet du milieu de culture sur le nombre de colonies de CSMs en P0

(*p


22

Figure III-9 : Etude du mtabolisme des CSMs soumises aux diffrentes concentrations de

TGF-1 en utilisant lAlamar Blue.

Figure III-10 : Analyse la phase de G1 du cycle cellulaire des CSMs.

Figure III-11 : Analyse la phase de S du cycle cellulaire des CSMs

Figure III-12: Expression de Smad3p dans les CSMs soumises aux diffrentes

concentrations de TGF-1 pendant 1 heure par western-blot.

Figure III-13 : Images des CSMs soumises aux diffrentes concentrations en TGF-1

pendant 1 heure (Microscope confocal Leica, objectif 40x).

Figure III-14 : Analyse de lintensit de fluorescence dans les noyaux des CSMs par le

logiciel ImageJ (IMF : intensit moyenne de fluorescence ; *p


23

lAlamar Blue.

Figure III-24 : Etude de la prolifration des CSMs avec ou sans tirement en utilisant

lAlamar Blue. (SC: sans contrainte ; ET: tirement)

Figure III-25 : Etude de la prolifration des chondrocytes avec ou sans tirement en

utilisant lAlamar Blue. (SC: sans contrainte ; ET: tirement)

Figure III-26: Expression de Smad3p et Smad2/3 dans les CSMs soumises ou non un

tirement pendant 10min, 30min, 1h et 3h. Analyse ralis par western-blot

(SC: sans contrainte ; ET: tirement).

Figure III-27: Expression relative de Smad3p dans les CSMs pendant 10min, 30min, 1h et

3h par le logiciel QuantityOne (SC: sans contrainte ; ET: tirement) (BioRad,

USA).

Figure III-28: Ratio de lexpression de Smad3p entre ltirement et sans contrainte dans les

CSMs (SC: sans contrainte ; ET: tirement ; N=5, **p


24

Figure III-34 : Analyse de lintensit de fluorescence dans les noyaux des chondrocytes

pendant 10min, 30min, 1h et 3h par le logiciel ImageJ (SC: sans contrainte ;

ET: tirement ; IMF : intensit moyenne de fluorescence ; *p


25

One.

Figure III-45 : Image de llectrophorse des ADNs (Sox9, Runx2, PPAR).

Figure III-46: Analyse de la densit optique des bandes avec le logiciel dimage Quantity

One.

Figure III-47 : Expression de RII des CSMs avec deux frquences dtirement pendant

30min et 1h (SC: sans contrainte) (Microscope confocal Leica, objectif 40x).

Figure III-48 : Expression de la phosphorylation de Smad3 par western-blot. (iRI :

inhibiteur du RI ; Tmoin : tirement)

Figure III-49 : Analyse de lexpression de la phosphorylation de Smad3 par western-blot.

(iRI : inhibiteur du RI ; Tmoin : tirement)

Figure III-50: Expression de LTBP-1 dans la matrice extracellulaire des CSMs pendant 1

jour, 2 jours et 5 jours par immunofluorescence. (Les points rouges

reprsentent lexpression de LTBP-1)

Figure III-51: Analyse de la concentration de TGF-1 dans le surnageant de milieu de

culture des CSMs avec ou sans contrainte dtirement pendant 30min ou 1h

par ELISA. (SC: sans contrainte ; *p


26

Figure III-56 : Images du cytosquelette des CSMs (vert: microfilaments; rouge:

microtubules; bleu: noyau) avec deux frquences dtirement pendant 30min

(SC: sans contrainte) (Microscope confocal Leica, objectif 40x).

Figure III-57 : Voies de diffrenciation des CSMs et influence du cytosquelette in vitro.

Figure III-58 : Comparaison de lexpression de gne de Sox9 sous leffet de TGF-1 et

dtirement.

Figure III-59 : Schma de lactivation de TGF dans la matrice extracellulaire.

Chapitre IV :

Figure IV-1 : Etapes impliques dans lingnierie du cartilage.

Figure IV-2: Expression de Smad3 dans les CSMs aprs stimulation avec TGF-1 ou pas.

Figure IV-3: Expression du cytosquelette des CSMs avec ou san une contrainte de

compression (vert : microfilament ; rouge : microtubule ; SC : sans

contrainte)

Figure IV-4: Expression du cytosquelette des CSMs aprs stimulation avec TGF-1 (vert :

microfilament)


27

Tableaux

Chapitre I :

Tableau I-1 : Comparaison des constitutions des trois cartilages.

Tableau I-2 : Classifications et caractristiques des cellules souches.

Tableau I-3 : Comparaison des potentiels de prolifration et de diffrenciation

chondrocytaire en fonction de lorigine des CSMs.

Tableau I-4 : Liste des marqueurs de surface exprims ou non par les CSMs humains.

Tableau I-5 : Les facteurs de transcription associs lADN et interagissant avec les Smads

dans les cellules de mammifres.

Tableau I-6 : Les kinases et la phosphorylation des Smads, avec la fonction positive (+) ou

ngative (-).

Tableau I-7 : Effets de la compression sur la rponse cellulaire en fonction du modle.

Tableau I-8 : Effets de ltirement sur la rponse cellulaire.

Tableau I-9 : Effets de la pression hydrostatique sur la rponse cellulaire en fonction du

modle.

Chapitre II :

Tableau II-1 : Les paramtres de culture tests pour les CSMs.

Tableau II-2 : Conditions de stimulations mcaniques utilises dans ltude.

Tableau II-3 : Anticorps impliqus dans les immunomarquages directs.

Tableau II-4: Anticorps impliqus dans les immunomarquages indirects.

Tableau II-5 : Ractifs pour le marquage des structures cellulaires par fluorescence.

Tableau II-6 : Composition des diffrents tampons.

Tableau II-7 : Anticorps primaires impliqus dans les immunomarquages.

Tableau II-8 : Anticorps secondaires impliqus dans les immunomarquages.


28

Tableau II-9 : Prparation de la gamme talon des protines.

Tableua II-10: Amorces et conditions de PCR des gnes.

Tableau II- 11 : Composants de la raction de rtrotranscription.

Tableau II-12 : Composants de la phase damplification.

Chapitre III :

Tableau III-1 : Caractristiques des cellules selon les conditions de culture initiales.

Tableau III-2 : Conditions de culture choisies pour les experiences.

Chapitre IV :

Tableau IV-1 : Conditions de culture choisies pour les expriences.

Introduction gnrale

29

INTRODUCTION GENERALE

Introduction gnrale

30

Le cartilage est un tissu hautement spcialis qui a un rle damortisseur et de

transmission des forces lorsquune pression ou une charge est exerce sur une articulation.

Le cartilage est donc ncessaire au fonctionnement articulaire. Le cartilage articulaire est un

cartilage hyalin de faible cellularit avec une matrice extracellulaire (MEC) riche en

collagnes et protoglycannes. La composition et lorganisation structurale de la MEC sont

responsables des proprits biomcaniques du cartilage et protgent les surfaces osseuses

au niveau des zones articulaires. Les protoglycannes offrent au cartilage une rsistance la

pression et les fibres de collagne forment un rseau rsistant la tension.

Le cartilage articulaire peut tre ls par des traumatismes ou au cours de pathologies

dgnratives, comme larthrose. Sa capacit dautorparation est fortement limite, car le

cartilage est un tissu avasculaire. Les thrapies actuelles utilises sont les traitements

pharmacologiques anti-douleurs et anti-inflammatoires ou des approches chirugicales

(autogreffes de cartilage, greffes de tissu synthtique, stimulation de la rparation spontane

par microfractures). Cependant, aucune thrapie ne permet la rgnration dun tissu

fonctionnel. Depuis quelques annes, lingnierie tissulaire constitue une ouverture qui

pourrait conduire la rgnration dun no-cartilage rimplantable.

Lingnierie tissulaire du cartilage consiste en la culture de cellules dans un

biomatriau tridimensionnel, sous des conditions biochimiques ou mcaniques contrles,

afin de reconstruire un cartilage fonctionnel artificiel. La figure 1 prsente une stratgie

classique dingnierie tissulaire, les paramtres contrler pour son laboration et les

connaissances multidisciplinaires ncessaires.

Figure 1 : Etapes impliques dans lingnierie du cartilage. [Daprs Freyria AM et al, 2008]

Introduction gnrale

31

Deux sources principales de cellules sont proposes pour lingnierie du cartilage : les

chondrocytes et les cellules souches msenchymateuses (CSMs). La transplantation de

chondrocytes autologues aprs expansion in vitro est dj au stade de lapplication clinique.

Mais, elle nest pas trs satisfaisante car les chondrocytes prsentent des problmes

damplification et de ddiffrenciation in vitro. Par apport aux chondrocytes, les CSMs

adultes offrent des facilits dobtention, dexpansion (autorenouvellement) et de

diffrenciation (multipotence). Cest ainsi que les CSMs sont de plus en plus utilises en

ingnierie tissulaire. Il est ncessaire cependant damplifier les CSMs in vitro car elles sont

trs peu abondantes dans la moelle osseuse. De ce fait, la mise au point des conditions de

culture des CSMs est une tape importante pralable aux applications en ingnierie

tissulaire.

Les CSMs peuvent se diffrencier en plusieurs types cellulaires (chondrocytes,

ostoblastes, adipocytes et myoblastes) sous linfluence de stimulations biochimiques ou

biomcaniques. Les membres de la famille du TGF- jouent un rle important dans la

diffrenciation des CSMs. Plusieurs tudes montrent que les TGF-s activent les premiers

stades de la chondrogense et de losteogense, mais ils inhibent la myogense,

ladipogense, et l'tape finale de la diffrenciation ostoblastique. Les TGF- transmettent

leur signal lintrieur de la cellule travers des rcepteurs membranaires, puis par

lactivation de facteurs de transcription de type Smad, en particulier Smad2 et Smad3. La

protine Smad3 est trs importante pour que sexerce leffet inhibiteur des TGF-s sur la

myogense, ladipogense, et la fin de l'tape de la diffrenciation ostoblastique. En fait,

Smad3 peut sassocier physiquement avec les facteurs de transcriptions, par exemple,

MyoD, C/EBPs et Runx2, et inhiber leur activit. En revanche, Smad3 stimule lactivit de

Sox9 en sassociant lui, et joue un rle pendant les premiers stades de la diffrenciation

chondrocytaire.

En ce qui concerne la stimulation biomcanique, plusieurs types de contrainte sont

impliqus, par exemple, la compression, le cisaillement, la pression hydrostatique et

ltirement. La compression est la contrainte la plus couramment utilise dans lingnierie

du cartilage. Dans notre travail, nous avons fait le choix dune contrainte dtirement

quibiaxial, comme une forme de distorsion de stress. Ce choix repose sur des tudes qui

montrent que ce type de stimulation favorise lengagement des CSMs vers la ligne

Introduction gnrale

32

chondrocytaire.

Cependant, les paramtres optimaux pour favoriser la formation dun no-cartilage in

vitro sont loin dtre dtermins. Il est donc ncessaire de dvelopper les connaissances sur

les comportements des cellules en rponse aux stimuli biochimiques et mcaniques pour en

comprendre le mcanisme ainsi que pour contrler les conditions in vitro afin daboutir

un no-tissu fonctionnel.

Dans la premire partie de notre travail, nous avons dfini les conditions de culture

optimales pour lisolement et lexpansion des CSM humaines obtenues partir de la moelle

osseuse, et ceci en absence des facteurs de croissance exognes.

Dans la deuxime partie, nous avons tudi leffet du TGF-1 sur la phosphorylation

de la protine Smad3 (Smad3p) ainsi que sa localisation dans les CSMs et les chondrocytes.

Leffet du TGF-1 sur lexpression des gnes des facteurs de transcription impliqus dans

la diffrenciation des CSMs, Sox9, Runx2 et PPAR a galement t analys.

Dans la troisime partie, nous avons tudi leffet de ltirement quibiaxial sur la

voie de signalisation de TGF-. Pour cela nous avons analys la phosphorylation et la

localisation de la protine Smad3 dans les CSMs et les chondrocytes, en fonction du temps

et de la frquence de stimulation. De plus, nous nous sommes intresss linteraction

entre ltirement quibiaxial et le TGF-1. Nous avons galement tudi lexpression des

gnes des facteurs de transcription Sox9, Runx2 et PPAR aprs stimulation mcanique des

cellules. Enfin, pour essayer de comprendre le mcanisme conduissant la phosphorylation

de Smad3 dans les cellules aprs stimulation mcanique, nous avons tudi leffet de

ltirement sur la localisation du rcepteur du TGF- de type II, lactivation de TGF-1

latent et sur le cytosquelette cellulaire.

Etudes bibliographiques

33

CHAPITRE I : ETUDES BIBLIOGRAPHIQUES


34

I. Physiologie du cartilage articulaire

Le cartilage est un tissu hautement spcialis qui a un rle damortisseur et de

transmission des forces lorsquune pression ou une charge est exerce sur une articulation.

Cest un tissu conjonctif avasculaire et non innerv. La nutrition du cartilage est donc

assure par le liquide synovial et les vaisseaux sanguins provenant de los sous-chondral. Il

est constitu dun seul type cellulaire, le chondrocyte, qui synthtise la matrice

extracellulaire (MEC) [Steinert AF et al, 2007]. Les composants majeurs de cette MEC sont

leau, les collagnes, les protoglycannes et aussi des lectrolytes.

Chez lhomme, trois types de cartilage sont prsents. Ils ont des localisations, des

compositions et des fonctions diffrentes (tableau I-1) : le cartilage hyalin, le cartilage

lastique et le cartilage fibreux. Le cartilage articulaire est un cartilage hyalin.

Tableau I-1 : Comparaison des constitutions des trois cartilages.

Cartilage Composition de la MEC Localisation

Hyalin - collagne de type II (majoritaire), IX et XI

- microfibrilles de collagne peu abondantes, de

petit calibre, non visibles en microscopie

optique (MO) do laspect amorphe et

homogne de la MEC

nez, bronches, trache, ctes,

articulations

Elastique - en plus du collagne de type II, prsence de

nombreuses fibres lastiques

trompe dEustache, pavillon de

loreille externe, piglotte, certains

cartilages laryngs

Fibreux - pais faisceaux de fibres de collagne de type I disques intervertbraux, symphyse

pubienne, mnisque du genou,

insertion du tendon dAchille

I.1. Constitution du cartilage articulaire

Le cartilage articulaire normal apparat blanc, brillant et discrtement translucide. Il est

constitu de deux lments principaux : les chondrocytes et la MEC [Muir H et al. 1986 ;


35

Schulz RM et al, 2007].

Les chondrocytes constituent le seul type cellulaire (3%-8% du volume total) du

cartilage articulaire [Heath CA, 1996]. Les chondrocytes synthtisent tous les composants

de la MEC, ainsi que les enzymes de dgradation de cette matrice, afin dassurer un

quilibre. Dans des cas pathologiques, les cellules peuvent aussi produire des cytokines

pro-inflammatoires provoquant la destruction du cartilage par augmentation de la synthse

et de l'activit des mtalloprotinases [Shlopov BV et al, 1997], des hyaluronidases et des

agrcannases.

Les chondrocytes sont spars de la MEC par un espace pricellulaire particulier. Le

mtabolisme des chondrocytes est influenc par les conditions physico-chimiques dfinies

dans cet espace pricellulaire [Wilkins RJ et al, 1995], qui entrane des modifications du pH,

et a des incidences sur la forme et la dformabilit du chondrocyte.

La matrice extracellulaire (MEC) est principalement constitue deau (60%-80%),

de fibres de collagnes et de protoglycannes.

Rseau du collagne : au niveau du cartilage articulaire, sept principaux types de

collagnes (II, IX, XI, X, V, VI et VII) ont t identifis (Figure I-1). Ces collagnes

confrent ce tissu sa proprit mcanique dlasticit.

Figure I-1 : Reprsentation schmatique de l'organisation des collagnes dans le tissu cartilagineux.

Les collagnes de types II, VI, IX, XI constituent les principaux collagnes impliqus dans la charpente

de la MEC du cartilage articulaire. [Daprs Mallein-Gerin F et al, 1996]

Le collagne de type II est la protine collagnique la plus abondante trouve dans le


36

cartilage et constitue 80 85 % du contenu en collagnes [Cremer MA et al, 1998]. Il est

spcifique du cartilage articulaire et trs rsistant aux attaques protolytiques. Il est

compos de trois chanes de type 1 (II) codes par le gne Col2a1. La synthse de

collagne est quasiment nulle dans le cartilage adulte.

Les protoglycannes constituent la substance fondamentale, situe entre les cellules et

les fibres. Ce sont des macromolcules formes par une protine axiale ou porteuse

(protine de noyau) sur laquelle se branchent une ou plusieurs chanes de

glycosaminoglycannes (GAGs). Le cartilage articulaire contient deux sortes de

protoglycannes : d'une part des protoglycannes formant de larges agrgats, d'autre

part des protoglycannes de petites tailles. La fonction principale des protoglycannes

est de retenir l'eau dans le cartilage, ce qui confre ce tissu sa proprit mcanique de

viscosit.

Les GAGs sont des polysaccharides composs d'une rptition de disaccharides

contenant un sucre amin (hexosamine) et un sucre de type hexuronique [Roughley PJ et al,

2006]. Il existe 5 types de chanes de GAGs : le sulfate de chondrotine (CS), le sulfate de

dermatanne (DS), le sulfate d'hparanne (HS), le sulfate de kratane (KS) et l'acide

hyaluronique (HA). Tous ces GAGs sont retrouvs dans le cartilage, en concentration

variable en fonction de la zone du cartilage considre.

Le HA est le seul GAG qui ne possde pas de groupement SO42- et qui ne soit pas li

une chane protique. Il joue un rle structural indispensable au niveau de la matrice

cartilagineuse puisquil participe la formation des agrgats de protoglycannes. De plus,

le HA influence de nombreuses fonctions cellulaires, telles que la migration, ladhrence ou

la prolifration, en raison de la prsence de rcepteurs spcifiques sur les chondrocytes

[Lindenhayn K et al, 1999]. Au niveau de la MEC, il jouerait un rle important dans la

rtention des protoglycannes [DSouza AL et al, 2000] et favoriserait leur synthse par les

chondrocytes [Kawasaki K et al, 1999].

L'agrcanne est le plus important des protoglycannes parce quil constitue 90 % des

protoglycannes du cartilage articulaire. Il est compos d'une protine axiale de 220kDa sur

laquelle sont fixes, de faon covalente, une centaine de CS et une trentaine de KS.

L'agrcanne se lie avec HA, de faon non-covalente. Cette interaction est stabilise par une


37

protine de liaison. Plus de 300 molcules d'agrcannes peuvent s'associer autour d'un

squelette d'HA et constituer un ensemble pouvant atteindre 10 m [Buckwalter JA et al,

1998] et crant de larges domaines hydrodynamiques entre les fibres de collagne. Du fait

de leur taille, ces protoglycannes sont retenus dans la MEC durant les dformations subies

par le cartilage. La perte de ces macromolcules conduit une diminution de la viscosit du

tissu et est observe lors de l'arthrose.

I.2. Structure du cartilage articulaire

Le cartilage articulaire est constitu de quatre couches successives : la couche

superficielle (5 10 % de la hauteur totale du cartilage), la couche moyenne (40 45 %), la

couche profonde (40 45 %) puis la couche basale (5 10 %) (Figure I-2). Les

chondrocytes et les constituants de la MEC sont organiss diffremment suivant la couche

considre. Par ailleurs, les contraintes mcaniques ne sont pas ressenties de la mme

manire selon la couche.

Figure I-2 : Structure du cartilage articulaire.

[http: //www.ukcte.org/images/cartilage.jpg]

Couche superficielle : fibres de collagnes trs tasses entre elles et parallles la

surface articulaire, peu de protoglycannes

Couche moyenne : fibres de collagne entrecroises obliquement en un rseau non

orient

Couche profonde : fibres de collagnes perpendiculaires la surface articulaire,

chondrocytes aligns verticalement en colonnes, zone la plus riche en protoglycannes


38

Couche basale ou intermdiaire : en contact avec la plaque osseuse sous-chondrale,

cartilage en voie de calcification

I.3. Les contraintes mcaniques sur le cartilage articulaire

Le cartilage est soumis en permanence plusieurs contraintes mcaniques. La

contrainte principale est la compression qui engendre dautres contraintes telles que des

flux de liquide, des contraintes de cisaillement, des pressions hydrostatiques et des forces

de tension ou dtirement etc. [Kerin A et al, 2002 ; Urban JP, 1994 ; Smith RL et al, 1995].

La capacit du cartilage articulaire exercer sa fonction physiologique, quand il est soumis

diffrents types de contraintes, dpend de l'interaction sensible des constituants du

cartilage et de l'coulement du fluide interstitiel travers la matrice permable [Hasler EM,

1999]. De nombreuses tudes ont montr que les forces mcaniques influencent la

prolifration de chondrocytes et stimulent la synthse de la MEC, maintiennent la structure

et l'intgrit, amliorent les proprits mcaniques du tissu cartilagineux [Lee CR et al,

2005]. En revanche, la MEC rgule les proprits biomcaniques du cartilage articulaire.

Gnralement, le rseau de collagne agit au niveau de ltirement [Mow WC et al, 1990],

tandis que les protoglycannes interviennent sur la compression [Bader DL et al, 1994 ;

Korhonen RK et al, 2003]. Ainsi, la rsistance ltirement dcrot alors que la rsistance

la compression crot lorsque lon senfonce dans le cartilage, dfinissant ainsi une

anisotropie axiale [Schinagl RM et al, 1997, Wang CC et al, 2002].

I.4. Fonctions du cartilage articulaire

Le cartilage constitue la partie essentielle de l'articulation. Il recouvre les extrmits

osseuses et il joue un rle de " film protecteur " de l'articulation. Lors de la ralisation de

mouvement, il remplit deux fonctions principales. Il assure d'une part, le glissement des

segments osseux les uns contre les autres, en diminuant au maximum les forces de friction

prsentes. Le cartilage tant non innerv, il ne peut donc transmettre aucune information au

cerveau, ce qui rend le mouvement imperceptible et indolore. D'autre part, le cartilage

assure la transmission, la rpartition et l'amortissement des contraintes subies par

l'articulation. Une troisime fonction, dpendante des deux premires, peut lui tre

attribue : celle d'assurer sa propre trophicit. Le cartilage est effectivement nourri

par le liquide synovial, lui-mme scrt par la membrane synoviale.


39

II. Physiopathologie du cartilage articulaire

Le cartilage articulaire peut tre ls par des traumatismes ou au cours de pathologies

dgnratives, comme larthrose.

La dgradation du cartilage peut conduire, plus ou moins long terme, l'apparition

de lsions qui peuvent aller jusqu' l'os sous-chondral, o il se produit au niveau du foyer

lsionnel, une invasion de cellules issues de la moelle osseuse [Setton LA et al, 1999]. La

raction de type inflammatoire qui s'ensuit engendre alors la formation d'un tissu

cartilagineux proche du fibrocartilage, par sa constitution riche en collagne de type I et

faible en lastine [Setton LA et al, 1999]. Les proprits mcaniques, moins lastiques et

moins rsistantes, d'un tel tissu ne lui permettent pas de rsister aux fortes contraintes que

subirait sans dommage un cartilage articulaire sain ; il finit gnralement par se fissurer

[Naumann A et al, 2002]. Or le cartilage articulaire n'a pas la capacit de se rgnrer

naturellement dans le cas de lsions qui dpassent 2 millimtres de diamtre [Ghivizzani

SC et al, 2000]. Ceci explique que lon rencontre des lsions du cartilage articulaire dans

plus de 10% de la population [Bliddal H et al, 2006].

Lexposition du cartilage des lments agressifs (enzymes protolytiques, cytokines

inflammatoires, etc.) peut stimuler la dgnrescence des protoglycannes ou en inhiber la

synthse [Zhang L et al, 2007]. Ces agressions peuvent galement agir sur le collagne et

les chondrocytes. La plupart des lsions ont une origine traumatologique (entorses graves

ou luxations rotuliennes) mais elles peuvent galement apparatre la suite de phnomnes

inflammatoires (ostochondrite juvnile ou aprs une corticothrapie). Elles peuvent aussi

tre dues au vieillissement. La rparation spontane de ces lsions est dtermine par de

nombreux facteurs : le type, l'ampleur et la svrit des lsions, l'tat gnral du cartilage et

l'ge de l'individu [Zhang L et al, 2007].

Il faut bien souligner que les influences mcaniques sont souvent lorigine du

dveloppement de pathologies du cartilage [Hayes DW et al, 2001]. Les lsions du cartilage

se produisent quand la contrainte applique excde la capacit dabsorption de charge du

tissu [Cornwall MW, 1984]. Tout dabord, un dommage mcanique peut se produire ds

quune articulation se dplace au del de sa possibilit habituelle de mouvement, induisant

un effort sur les parties plus molles du cartilage qui ne peuvent pas supporter la contrainte,


40

et endommagent ainsi le rseau de collagne. [Andersson S et al, 1989].

Par ailleurs, il peut galement avoir lieu de manire chronique lors d'exercices sportifs

physiques intenses et repts. Dans ce cas, les articulations sont rptitivement exposes

des contraintes de niveaux levs, et les dommages sont associs une fissure de fatigue

[Kujala UM et al, 1995].

Enfin, lexposition des surcharges et une utilisation anormale et rpte de

larticulation dj endommage mnent des lsions plus graves et la dgnrescence du

cartilage [Simmons EJ et al, 1999 ; Van de Breevaart Bravenboer J et al, 2004].

II.1. Stratgies thrapeutiques concernant les lsions cartilagineuses

Aprs un traumatisme, le cartilage articulaire ne peut se rparer spontanment.

Actuellement, on dispose de traitements mdicaux et chirurgicaux, auxquels sajoute laide

de lingnierie tissulaire.

II.1.1. Les traitements mdicaux

Le traitement mdical combine gnralement plusieurs des techniques suivantes

[Minas T et al, 1997] :

- Mise en dcharge : on retrouve souvent comme point commun une pression

intra-articulaire trop leve, entranant pour le cartilage une surcharge mcanique nfaste.

De plus, il a t dmontr que dans des conditions de pression moindre, l'activit

mtabolique du chondrocyte s'accrot, ce qui pourrait favoriser la rgnration matricielle.

- Agents pharmacologiques : de nombreuses tudes sont effectues sur des substances

comme les corticostrodes, des acides hyaluroniques et des facteurs de croissance.

Cependant, leur utilisation est assez controverse.

- Mouvement passif : cette technique est aujourd'hui massivement reconnue pour son

succs dans le traitement des lsions cartilagineuses. Le mouvement est ncessaire

l'inhibition du cartilage alors que l'immobilisation complte d'un membre produit son

amincissement et une diminution de son contenu en protoglycannes.

Lorsque le traitement mdical est un chec, on peut alors recourir au traitement

chirurgical.


41

II.1.2. Les traitements chirurgicaux

II.1.2.1. Techniques palliatives

- Lavage articulaire : il permet le renouvellement du liquide synovial, permet

d'liminer les mdiateurs inflammatoires produits par la membrane synoviale du milieu

intra-articulaire [Minas T et al, 1997].

- Stimulation de los sous-chondral : il sagit de favoriser lapparition dun

fibrocartilage partir de cellules souches de la moelle osseuse de los sous-chondral [Minas

T et al, 1997].

II.1.2.2. Techniques de rparation cartilagineuse

- Greffe de prioste ou de prichondre : ce type de greffe aboutit la formation de ce

que les auteurs appellent un "hyalin-like cartilage". Cependant, il existe un risque

dossification endochondrale du greffon qui volue vers un pronostic dfavorable long

terme.

- Implantation de chondrocytes autologues : des chondrocytes sains prlevs chez le

patient sont mis en culture pendant plusieurs semaines puis sont rimplants au niveau de la

lsion cartilagineuse. Cette technique reste insatisfaisante car elle se heurte au problme

damplification et de ddiffrentiation in vitro des chondrocytes. Il y a ainsi formation in

vivo dun fibrocartilage peu fonctionnel [Brittberg M et al, 2003].

- Greffes ostochondrales : l'allogreffe ostochondrale est une bonne solution pour le

traitement des lsions cartilagineuses. L'os sous-chondral supportant le cartilage ls est

creus pour former une cavit correspondant exactement la forme du greffon prlev. Le

cartilage tant un tissu fragile, il ne peut donc pas subir de procd de strilisation agressif.

Il existe donc un risque de transmissions virales au niveau des allogreffes cartilagineuses.

Lautogreffe ostochondrale est ralise grce au prlvement d'un greffon ostochondral

en zone de moindre portance. Lintgration du greffon est gnralement excellente.

Cependant, cette technique est limite par la quantit de cartilage disponible et ne permet

donc pas de traiter des lsions cartilagineuses tendues.

A ce jour, aucune mthode nest disponible pour produire de manire reproductible et

fiable du cartilage pleinement fonctionnel. Une nouvelle gnration de traitement a vu le


42

jour rcemment : lingnierie tissulaire.

II.1.3. Lingnierie tissulaire du cartilage

Dans le cas de lingnierie tissulaire du cartilage, il sera possible de crer un cartilage

artificiel pour combler les lsions articulaires et maintenir, amliorer ou restaurer les

fonctions au niveau de cette zone [Jorgensen C et al, 2004].

En ingnierie tissulaire, cest certainement la combinaison dun support

tridimensionnel, de cellules et de facteurs de diffrenciation qui permettra damliorer la

fonctionnalit du tissu noform [Galois L et al, 2005].

Cette technique a besoin dune source abondante de cellules saines. Le choix des

cellules est conditionn par la ncessit dobtenir une nouvelle matrice la plus proche

possible du tissu dorigine. Une des sources cellulaires pouvant servir la rparation du

cartilage est le chondrocyte, du fait de sa capacit synthtiser la MEC. Cependant, compte

tenu du nombre limit de cellules, lamplification ncessaire de ces cellules entrane une

ddiffrenciation cellulaire, occasionnant ainsi une modification de la morphologie

cellulaire et de la synthse de la matrice.

Pour saffranchir de ce problme, une autre source cellulaire peut tre utilise : les

cellules souches msenchymateuses.

La figure I-3 prsente une stratgie classique dingnierie tissulaire du cartilage.

Figure I-3 : Etapes impliques dans lingnierie du cartilage.


43

III. Cellules souches (CSs)

Les cellules souches sont des cellules immatures indiffrencies, caractrises par leur

capacit de sautorenouveler sur une trs longue dure et de se diffrencier en cellules

spcifiques dorgane. Ces deux proprits multipotence (ou pluripotence dans le cas de

cellules embryonnaires), et auto-renouvellement sont absolument ncessaires pour

affirmer le caractre souche dune cellule ; celle-ci doit en effet pouvoir tre cultive

long terme, et donc tre capable dun grand nombre de divisions cellulaires [Weissman IL

et al, 2001 ; Coulombel L, 2004 ; 2005 ; 2007].

Le terme de cellule souche regroupe plusieurs sous-types cellulaires prsentant

dimportantes diffrences biologiques et fonctionnelles. La classification des cellules

souches est base sur leur potentiel de diffrentiation ou sur leur origine. Selon leur

capacit de diffrentiation, les cellules souches sont classes comme tant totipotentes,

pluripotentes, multipotentes ou unipotentes (Tableau I-2). Selon leur origine, on distingue

les cellules souches embryonnaires, ftales, ombilicales, et adultes (Figure I-4).

Tableau I-2 : Classifications et caractristiques des cellules souches.

Types de cellules souches

Capacits et rles Exemples

Totipotentes Premires cellules embryonnaires directement issues du zygote jusquau stade Morula, du premier au quatrime jour

Ebauche dembryon complet

Zygote et cellules filles immdiates

Pluripotentes Peuvent se diffrencier en nimporte quelle cellule originaire des 3 feuillets embryonnaires (=200 varits)

Ne peuvent pas reproduire un tre humain en entier

Cellules souches embryonnaires de la masse interne du blastocyte

Cellules germinales embryonnaires

Multipotentes Peuvent se diffrencier en plusieurs lignes cellulaires diffrentes

Cellules souches hmatopotiques

Cellules souches msenchymateuses

Unipotentes Ne peuvent se diffrencier que vers un seul tissu spcifique

Kratinocytes

Oligodendrocytes immatures


44

Figure I-4 : Classification des cellules souches selon leur origine. [Modifi daprs Godara et al,

2008]. * inclut les cellules de lpiderme (peau, cheveux), des yeux, du foie et les cellules neuronales.

III.1. Les cellules souches embryonnaires (CSEs)

Les cellules souches embryonnaires (CSEs) proviennent de la masse interne du

blastocyte, qui dfinit le premier stade de l'embryon, quand celui-ci a cinq ou six jours et

possde moins de 64 cellules (Figure I-5). Elles sont pluripotentes, voire totipotentes

puisquelles peuvent donner tous les feuillets embryonnaires (msoderme, endoderme,

ectoderme) qui sont lorigine de tous les tissus de lorganisme, y compris les tissus de la

ligne germinale, mme aprs une culture prolonge in vitro [Kerr CL et al, 2006]. En

mme temps, Elles conservent leur tat indiffrenci, ce qui leur permet de

sautorenouveler [Boyer LA et al, 2006].


45

Figure I-5 : Diffrenciation des tissus humains

(http://stemcells.nih.gov/info/scireport/chapter1.asp)

Bien quil soit possible dinduire la diffrenciation in vitro des cellules souches

embryonnaires [Hwang NS et al, 2006 ; zur Nieden NI et al, 2005], plusieurs problmes

devront tre rsolus avant darriver ltape finale dapplication clinique. Dabord, le

maintien en culture de cellules peut entraner des mutations gntiques, et induire un risque

de dveloppement ultrieur de tumeurs [Draper JS et al, 2004]. Ensuite, la rponse immune

de l'hte aux CSEs doit tre prise en compte. Une autre difficult majeure, non rsolue ce

jour, est labsence de facteurs contrlant de faon systmatise la diffrenciation cellulaire

in vitro pour pouvoir orienter spcifiquement les CSEs vers un lignage tissulaire dfini.

Enfin, lobstacle majeur au dveloppement de la recherche sur les CSEs humaines reste,

notamment en France, dordre thique. Labsence daccords quant lutilisation de cellules

souches embryonnaires humaines dans un but exprimental limite leur application en

ingnierie tissulaire [Bobbert M, 2006].


46

III.2. Les cellules souches ftales et ombilicales

Les cellules souches ftales sont issues de tissus ftaux un stade beaucoup plus

tardif (5-9 semaines) que le stade de blastocyte embryonnaire et sont isoles partir de

ftus rsultant davortements [Guillot PV et al, 2006].

III.3. Les cellules souches adultes

Lexistence, ds la naissance, de cellules souches dites adultes, au sein des diffrents

tissus de lorganisme, est connue depuis longtemps. La plupart sont unipotentes,

uniquement ddies au maintien dun tissu cellulaire dtermin : peau, muscle, pulpe

dentaire, par exemple. Les cellules souches adultes multipotentes sont plus rares, plus

difficiles identifier et purifier in vitro. On peut citer les cellules souches

hmatopotiques, msenchymateuses, neuronales, pithliales, gastro-intestinales,

pidermiques etc. [Tarnowski M et al, 2006].

La moelle osseuse est une source riche et accessible de cellules souches adultes [Tuan

RS et al, 2003]. Elle contient plusieurs types de cellules souches : les cellules souches

hmatopotiques (CSHs) qui donnent naissance aux diffrentes lignes de cellules

sanguines, les cellules souches msenchymateuses (CSMs) qui assurent la fonction de

soutien stromal, et une troisime population dcouverte en 2002 par l quipe de

Verfaillie, des cellules souches trs primitives de type embryonnaire qui correspondent

la dfinition dune cellule souche somatique est qui sont pluripotentes dsignes

sous le terme de multipotent adult progenitor cell (MAPC) (Figure I-6) [Coulombel L,

2003]. Il sagit dune nouvelle population de cellules souches pluripotentes, dont la

localisation nest probablement pas restreinte la moelle osseuse, et dont le potentiel

de diffrenciation les apparente aux cellules souches embryonnaires [Jiang Y et al,

2002; Reyes M et al, 2001]. Les MAPCs sont dcrites comme tant les anctres de

toutes les populations hmatopotiques et msenchymateuses prsentes dans la moelle

osseuse humaine [Verfaillie CM, 2005]. A la diffrence des cellules souches adultes

connues, elles possdent certains marqueurs molculaires, Oct-4 et Rex, spcifiques

jusqu maintenant aux cellules souches embryonnaires. Les MAPCs ne peuvent tre

amplifies efficacement que si elles sont ensemences dans un milieu de culture trs

pauvre en srum et une trs faible densit cellulaire, ce qui reprsentent deux


47

avantages en culture cellulaire, notamment orientation clinique.

Figure I-6 : Filiation des diffrentes populations cellulaires de la moelle osseuse

MAPCs : multipotent adult progenitor cells; CS : Cellule Souche ; GR : Globule Rouge ; PN :

Polynuclaire neutrophile ; NK : naturel killer ; Mo : Monocyte ; Meg : Mgacaryocyte ; T, B :

Lymphocyte T et B ; Dend : Cellule dendritique. [Daprs Coulombel L et al, 2003].

III.3.1. Les cellules souches msenchymateuses (CSMs)

Friedenstein et al ont identifi des progniteurs capables de produire des colonies de

cellules dallure fibroblastique. Ces progniteurs ont t appels CFU-F pour Colony

Forming Unit-Fibroblast ; capables de se diffrencier en tissus osseu ou cartilagineux, et


48

de soutenir lhmatopose [Friedenstein et al, 1976 ; 1978 ; 1987]. Ce nest que trs

rcemment que le concept de lexistence de CSMs post-natales a merg pour une

utilisation thrapeutique. Les travaux de Prockop et de Pittenger et al ont permis

lidentification, parmi la population des CFU-F, de cellules possdant des proprits

biologiques de cellules souches et depuis, de nombreuses tudes ont montr que les CSMs

constituent un potentiel norme pour lingnierie cellulaire et tissulaire [Prockop DJ, 1997 ;

Pittenger MF et al, 1999 ; Uccelli A et al, 2008].

III.3.1.1. Localisation des CSMs

La moelle osseuse est considre comme la source la plus riche et la plus accessible de

CSMs [Tuan RS et al, 2003]. En plus de la moelle osseuse, dautres CSMs ayant des

caractristiques biologiques similaires ont t isoles partir dorganes tels que :

Le tissu adipeux [Wickham MQ et al, 2003 ; Katz AJ et al, 2005 ; Zuk PA et al, 2002]

Le sang priphrique adulte [Kuznetsov SA et al, 2001; Zvaifler NJ et al, 2000]

Le sang de cordon [Rosada C et al, 2003 ; Bieback K et al, 2004 ; Romanov YA et al,

2003 ; Erices A et al, 2000 ; Goodwin HS et al, 2001]

Le placenta [Battula VL et al, 2007 ; Yen BL et al, 2005 ; Igura K et al, 2004], la

veine et les artres de cordon ombilical [Romanov YA et al, 2003 ; Sarugaser R et al,

2005], la gele de Wharton du cordon [Wang HS et al, 2004], le liquide amniotique

[Tsai MS et al, 2004 ; Int Anker PS et al, 2003],

Le cartilage [Romanov YA et al, 2003 ; Alsalameh S et al, 2004]

Le tissu synovial [Fickert S et al, 2003] et la membrane synoviale [De Bari C et al,

2001]

Les dents de lait [Miura M et al, 2003], la pulpe dentaire [Gronthos S et al, 2000] et le

ligament pridentaire [Seo BM et al, 2005]

Le muscle cardiaque [Warejcka DJ et al, 1996]

Le pancras [Hu Y et al, 2003]

La rate [Derubeis AR et al, 2003]

Le prioste [Fukumoto T et al, 2003]

Los trabculaire [Nth U et al, 2002]

Le poumon [Sabatini F et al, 2005]


49

Le muscle squelettique [Levy MM et al, 2001 ; Wada MR et al, 2002]

Le derme [Yong HE et al, 2001]

Les CSMs isoles partir de diffrents tissus prsentent une expression des marqueurs

de surface cellulaire similaire quelle que soit lorigine du tissu [Yoshimura H et al, 2007].

Cependant, leurs potentiels dexpansion et de diffrenciation chondrognique sont

diffrents :

- Les CSMs issues de la moelle osseuse ont un taux de prolifration important et

peuvent se diffrencier en chondrocytes en prsence de facteurs de croissances tels

que les TGF-s, les BMPs etc. Cependant, leur potentiel de diffrenciation

cartilagineuse diminue au fur et mesure des passages [Sakaguchi Y et al, 2005].

- Les CSMs provenant du cordon ombilical peuvent se multiplier rapidement et

suivent la voie de la diffrenciation chondrocytaire mme aprs plusieurs passages

[Wang JF et al, 2004].

- Les CSMs isoles partir du prioste et de la membrane synoviale ont un potentiel

plus important dexpansion que celles de la moelle osseuse [Sakaguchi Y et al,

2005 ; Yoshimura H et al, 2007]. Le nombre de colonies obtenues aprs 7 jours de

culture est 6 fois plus lev que celui de CSMs dorigine mdullaire. De plus, une

meilleure potentialit de synthse de la MEC cartilagineuse a t dcrite pour des

CSMs isoles partir du prioste et de la membrane synoviale, comparativement

aux CSMs dorigine mdullaire [Shirasawa S et al, 2006].

- Le tissu adipeux pourrait servir dexcellente source de CSMs du fait de la

importante quantit prsente dans lorganisme humain et de la disponibilit de

dchets opratoires lis la chirurgie [Mehlhorn AT et al, 2006]. Il est noter que

les CSMs, isoles partir du tissu adipeux, ont un potentiel dexpansion suprieur,

mais un potentiel chondrognique infrieur celui des CSMs isoles partir de la

moelle osseuse [Sakaguchi Y et al, 2005 ; Yoshimura H et al, 2007]. Aprs 2

semaines de culture dans un gel dalginate en prsence de TGF-1, les CSMs

originaires du tissu adipeux expriment 10 fois moins le gne de col21 et 4 fois

moins dagrcanne, deux marqueurs caractristiques de la ligne chondrocytaire,

que celles de la moelle osseuse [Mehlhorn AT et al, 2006].


50

Le tableau I-3 rassemble des tudes portant sur les potentiels de prolifration et de

diffrenciation cartilagineuse de CSMs selon leur origine.

Tableau I-3 : Comparaison des potentiels de prolifration et de diffrenciation chondrocytaire en

fonction de lorigine des CSMs

Origine de CSMs

Prolifration

Diffrenciation chondrocytaire

Rfrences Expression du collagne II

Synthse de MEC

Moelle osseuse + +++ +++ Sakaguchi Y et al, 2005 Mehlhorn AT et al, 2006 Yoshimura H et al, 2007

Prioste ++++ ++++ ++++ Sakaguchi Y et al, 2005 Shirasava S et al, 2006 Yoshimura H et al, 2007

Membrane synoviale

+++++ ++++ +++++ Sakaguchi Y et al, 2005 Yoshimura H et al, 2007

Muscles ++ ++ ++ Sakaguchi Y et al, 2005 Yoshimura H et al, 2007

Tissu adipeux +++ + + Sakaguchi Y et al, 2005 Mehlhorn AT et al, 2006 Yoshimura H et al, 2007

III.3.1.2. Morphologie cellulaire et capacit de prolifration des CSMs

Pendant leur prolifration en monocouche in vitro, les CSMs peuvent produire des

colonies de cellules dallure fibroblastique, sous le terme Colony-forming unit-fibroblasts

(CFU-Fs). Cest un des critres pour lidentification des CSMs cultives in vitro

[Friedenstein AJ et al, 1970].

Les CSMs ont une forme de fuseau et ressemblent aux fibroblastes en tat

indiffrenci [Roberts I, 2004].

Une proprit intressant des CSMs est leur capacit dadhrence au plastique. Cette

proprit en permet lisolement partir de la moelle osseuse, contrairement aux CSHs.

[Kassem M et al, 2004 ; Rickard DJ et al, 1996].

De plus, les CSMs ont un pouvoir de prolifration lev. Les CSMs se dveloppent

rapidement sous linfluence de mitognes tels que le PDGF, le bFGF et lIGF-1 [Colter DC


51

et al, 2000 ; Bianco P et al, 2001]. Ceci permet de crer facilement une banque de

cellules souches. De plus, les CSMs peuvent garder leur phnotye en culture sur plusieurs

passages [Pittenger MF et al, 1999 ; Leo AJ et al, 2006] et conserver leur capacit se

diffrencier [Bhatia R et al, 2005 ; Pereira RF et al, 1995].

III.3.1.3. Les marqueurs de surface

Comme toutes les autres cellules, les CSMs prsentent de nombreux marqueurs de

surface cellulaire. Mais, ce jour, il nexiste aucun marqueur spcifique pour identifier les

CSMs. Donc les CSMs sont dfinies par un profil dexpression dantignes. Elles sont

identifies principalement par lexpression de CD105 (endogline), CD73 (5 terminal

nucleotidase) et CD90 (Thy-1), et sont ngatives pour les marqueurs hmatopotiques,

notamment CD34 et CD45 [Nol D et al, 2002]. Cette proprit permet de distinguer

aisment les CSMs des CSHs partir dun chantillon de la moelle osseuse. Mais, les

CSMs isoles directement de la moelle osseuse sont positives pour CD34, elles perdent cet

antigne lors de la culture in vitro. Les diffrents marqueurs de surface exprims par les

CSMs humaines actuellement connus sont regroups dans le Tableau I-4 [Pittenger MF et

al, 2004]

Tableau I-4 : Liste des marqueurs de surface exprims ou non par les CSMs humains

CD = Cluster de Diffrenciation ; TGFIR = Transform growth factor receptor type I; TGFIIR =

Transform growth factor receptor type II; HLA = Humain leukocyte antigen; SSEA = Stage specific

embrynnic antigen.

Marqueurs prsents

CD13, CD29, CD44, CD49a, b, c, e, f, CD51, CD54 (ICAM1), CD58, CD71, CD73,

CD90 (Thy-1), CD102, CD105, CD106 (VCAM), CDw119, CD120a, CD120b,

CD123, CD124, CD126 (ALCAM), CD127, CD140a, CD166, P75, TGFIR,

TGFIIR, HLA-A, B,C, SSEA-3, SSEA-4, D7, CD271.

Marqueurs absents CD3, CD4, CD6, CD9, CD10, CD11a, CD14, CD15, CD18, CD21, CD25, CD31,

CD34, CD36, CD38, CD45, CD49d, CD50, CD62E,L,S, CD80, CD86, CD95,


52

CD117, CD133, SSEA-1, HLA-DR.

III.3.1.4. Proprits biologiques

Comme toute cellule souche, les CSMs ont deux proprits principales :

auto-renouvellement [Carlo-Stella C et al, 1993] et multipotence [Deans RJ et al, 2000 ;

Caplan AL et al, 2006]. La figure I-7 montre la capacit de diffrentiation des CSM.

Elles possdent aussi la proprit de transdiffrenciation. Cette proprit dsigne la

possibilit quaurait une cellule dj engage dans une voie de diffrenciation de changer

de cap et demprunter une autre route. Par exemple, les CSMs peuvent se diffrencier, dans

certaines conditions, en cellules pidermiques [Deng W et al, 2005].

Figure I-7 : Capacit de diffrenciation des cellules souches msenchymateuses. [Daprs Caplan

AL et al, 2006]

Les CSMs peuvent scrter un ensemble de cytokines et de facteurs de croissance, par

exemple, IL (interleukine)1, 6, 7, 8, 11, 12, 14, 15, LIF (leukemia inhibitory factor), SCF

(stem cell factor), G-CSF (granulocyte-colony stimulating factor), M-CSF (macrophage-


53

colony stimulating factor), GM-CSF (granulocyte/ macrophage -colony stimulating factor) ;

IL-1R, Il-3R, IL-4R, IL-6R, IL-7R, LIF-R, SCF-R, G-CSFR, TNF-IR, TNF-IIR, TGF-bIR,

TGF-bIIR, bFGF-R, PDGF-R, EGF-R [Minguell JJ et al, 2001 ; Molloy AP et al, 2009].

Grace cette proprit de scrtion, les CSMs favorisent la prolifration et la

diffrenciation des CSHs, et ainsi sont impliques dans le soutien de lhmatopose

[Minguell JJ et al, 2001 ; Almeida-Porada G et al, 2000].

Les CSMs, par leurs proprits immunomodulatrices, inhibent la prolifration des

cellules T in vitro [Di Nicola M et al, 2002 ; Bartholomew A et al, 2002; Le Blanck et al,

2003; Tse WT et al, 2003; Krampera M et al, 2003; Maitra B et al, 2004; Bhatia R et al,

2005]. Plusieurs tudes in vitro ou in vivo, aussi bien chez lanimal que chez lhomme, ont

mis en vidence linfluence des CSMs, grce leurs proprits immunosuppressives, non

seulement sur la diffrenciation des lymphocytes mais aussi sur la rponse immunitaire T.

In vitro, les CSMs humaines ont une action suppressive sur la prolifration des lymphocytes

T , en partie lie a la production du transforming growth factor beta 1 (TGF1) et

lhepatocyte growth factor (HGF) [Di Nicola M et al,2002]. De par leurs proprits

immunosuppressives, il devient vident que les CSMs peuvent avoir une incidence sur la

survenue et lintensit des ractions du greffon contre lhte (graft versus host disease ou

GvHD). La GvHD est la raction miroir ou symtrique du rejet, mdie par les

lymphocytes T, qui prsents dans le greffon hmatopotique, vis--vis des tissus du

receveur. En effet, les CSMs nexpriment pas les molcules du complexe majeur

d'histocompatibilit (MHC) de classe II, HLA-DR. Dune manire gnrale, les molcules

HLA de classe II sont prsentes sur les cellules prsentatrices dantignes (CPA) et servent

prsenter au rcepteur T (TcR) des lymphocytes T des peptides, processs par les CPA

partir dantignes exognes. Les CSMs nexprimant HLA-DR, sont incapables de prsenter

un peptide antignique et dtre immunostimulantes. Lorsque les CSMs sont ajoutes dans

une culture mixte, on oberve quelles inhibent la raction dalloractivit.

III.3.2. Utilisation des CSMs en ingnierie cellulaire et tissulaire

Grce leurs proprits biologiques, la facilit pour les isoler, les faire prolifrer et

diffrencier en culture, les CSMs deviennent la source de cellules idales pour lingnierie

cellulaire et tissulaire [Bartmann C et al, 2007].


54

Plusieurs tudes dans une varit de systmes ont mis en vidence la grande

perspective de construire les tissus en bioingnierie base de CSMs. Les cellules souches

ont servi, dans en premier temps, reconstruire des tissus msenchymateux [Bianco P et al,

2001] et rcemment, une vaste gamme de tissus pithliaux est concerne. Il a t rapport

que les CSMs avaient le potentiel de se diffrencier en cellules pidermiques, sous certaines

conditions, et quelles peuvent servir comme source de cellules pour l'ingnierie tissulaire

de la peau [Han CM et al, 2007; Paunescu V et al, 2007]. De mme, de nombreuses

recherches sur lutilisation des CSMs en ingnierie tissulaire de los, du cartilage, du tissu

adipeux, du vaisseau, du foie, etc... ont t effectues rcemment [Bianco P et al, 2000;

Fraser JK et al, 2004; Hui JH et al, 2005; Risbud MV et al, 2005; Wang QW et al, 2005 ;

Tong ZC et al, 2008].

En conclusion, les CSMs constituent un outil original et offrent un potentiel pour la

thrapie cellulaire et la bioingnierie tissulaire.

IV. La diffrenciation de CSMs

In vitro, les CSMs peuvent se diffrencier en plusieurs types des cellules selon les

conditions de culture utilises. Le microenvironnement cellulaire est en effet trs important

pour lorientation de la diffrenciation des CSMs [Grassel S et al, 2007]. La figure I-8

montre plusieurs conditions de culture in vitro qui favorisent le processus de diffrenciation

des CSMs en tissu spcifique [Tuan RS et al, 2003].

IV.1. La rgulation de la diffrenciation des CSMs

Les processus de diffrenciation des CSMs sont contrls de faon organise et

dynamique par des facteurs spcifiques impliqus dans diffrentes voies de signalisation.

Plusieurs facteurs de transcription qui contrlent spcifiquement les programmes de

diffrentiation des CSMs ont t identifis dans la dcennie passe. La figure I-11 montre la

rgulation de la diffrenciation des CSMs par les facteurs spcifiques de transcription

[Nishimura R et al, 2008]. On y trouve :

Runx2 (Cbf1) et Ostrix (Sp7), des facteurs de transcription indispensables pour le

dveloppement d'osteoblastes [Komori T et al, 1997 ; Otto F et al, 1997 ; Nakashima K

et al, 2002].


55

Les membres de la famille de Sox, ncessaires dans les premiers tapes de la

diffrenciation chondrocytaire [de Crombrugghe B et al, 2001 ; Kronenberg HM, 2003 ;

Komori T, 2006].

Les membres de la famille C/EBP (CCAAT enhancer binding protein) et PPAR-

(peroxisome proliferator-activated receptor-), trs importants dans la diffrenciation

en adipocyte [Morrison RF et al, 1999; Spiegelman BM, 1998].

Les membres de la famille MyoD (myogenic differentiation antigen), sont importants

dans la myogense.

Figure I-8 : Conditions de culture favorisant le processus de la diffrenciation in vitro des CSMs en

tissu spcifique (lgende encadr).

Les composants des voies de signalisation sont montrs en italiques. Les pointes de flches

pointilles dnotent des vnements reversibles de la diffrentiation. bFGF, basic fibroblast

growth factor; bHLH, basic helixloophelix; BMP, bone morphogenetic protein; Cbf1, core

binding factor alpha 1; ECM, extracellular matrix; FGF, fibroblast growth factor; GDF,


56

growth/differentiation factor; IBMX, 3-isobutyl-1-methylxanthine; LRP, low-density lipoprotein

receptor-related peptide; MAPK, mitogen-activated protein kinase; PDGF, platelet-derived growth

factor; SMAD, vertebrate homologue of Drosophila Mothers Against Decapentaplegic (MAD);

TGF-, transforming growth factor beta; WISP, Wnt-1-inducible protein. [Daprs Tuan RS et al,

2003]

Le rle fonctionnel des facteurs de transcription est rgul strictement par la

transduction de signal qui lie les changements extracellulaires avec le noyau via le

cytoplasme. Plusieurs cytokines et hormones, telles que BMP, TGF-, Wnt, hedgehog, FGF,

strogne et androgne, sont impliques dans la rgulation de la diffrentiation des CSMs

en stimulant des voies de signalisation

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