enseignements dirigés biochimie pcem 1 acides aminés – oligopeptides méthodes d’étude l....

Enseignements dirigésBiochimiePCEM 1

Acides Aminés – OligopeptidesMéthodes d’étude

L. Coulbault

Année 2008-2009

I – Equilibre acide-base

Exercice 1

Indiquez les bonnes réponses concernant les propositions suivantes : A – Un acide faible en solution est totalement dissocié.B – Pour un acide faible en solution, le calcul du pH fait intervenir une constante.C – Ka = -Log ([A-]. [H+]/ [AH]).D – La constante pKa peut être déterminée par des courbes de titrage.E – Les constantes pKa1 et pKa2 d’un acide aminé ne peuvent pas être déterminées par titration.

Ka = constante de dissociation

[H+].[A-]Ka = ________

[AH]

Equation d’Hendersson-Hasselbach ; pH = pKa + log ([A-]/[AH])

EQUILIBRES ACIDO-BASIQUES

HA A- + H+

+ B

+ A

A = point d'équivalence où le pH varie beaucoup

B = Point de demi-neutralisation = pKa où le pH varie peuDonc [A-] = [AH]

* Autour de son pKa , [A-] = [AH] et le tampon maintient le pH d'une solutionRésistant aux modifications de pH quand ajout de H+ ou OH-

SOLUTIONS TAMPONS

* Un tampon est généralement constitué d’une solutiond’acide faible et d’un de ses sels de base forte oud’une solution de base faible et d’un de ses selsd’acide fort

pH = pKa + log10 [Sel]/[AH]

Exercice 1

Indiquez les bonnes réponses concernant les propositions suivantes : A – Un acide faible en solution est totalement dissocié.

FAUX

B – Pour un acide faible en solution, le calcul du pH fait intervenir une constante

VRAI

C – Ka = -Log ([A-]. [H+]/ [AH]).FAUX

Exercice 1

D – La constante pKa peut être déterminée par des courbes de titrage

VRAI

E – Les constantes pKa1 et pKa2 d’un acide aminé ne peuvent pas être déterminées par titration

FAUX

Exercice 2

Parmi les produits suivants, quel(s) est (sont) celui (ceux) qui peut (pourront) en théorie être utilisé(s) pour le dosage de l’activité d’un enzyme dont le pH optimum d’activité est de 7,5 ?

A/ Tris hydroxyméthyl aminométhane pKa=8.06B/ Acide propionique pKa=4.87C/ Pipéridine pKa=11.2D/ Acide phosphorique pKa1 = 2.15, pKa2 = 7.2, pKa3 = 12.33E/ Hydroxyde d’ammonium pKa=9.25F/ Acide acétique pKa=4.76

pH = 7,5

pKa de la molécule doit être proche de la valeur de pH voulue

donc Acide phosphorique à son pKa2 = 7,2

éventuellement Tris (8,06)

Propriétés Structurales des Acides Aminés

Définition d’un acide aminé

H

NH2/ NH3+ - C* - COO-/COOH

R

* Chaine latérale variable

* 20 AA impliqués dans la structure des protéines

AA ALIPHATIQUES NEUTRES

Aliphatique :

R = chaîne latérale hydrocarbonée linéaire ou ramifiée

Neutre :

Ne possède pas de fonction carboxylique (COOH) ou

aminée (NH2) supplémentaire sur R

* A CHAINE HYDROCARBONEE.

Glycine ou Gly R = H seul AA sans C asymétrique

donc dépourvu de pouvoir rotatoire

Alanine ou Ala R = - CH3

CH3

Valine ou Val R = - CH- CH3

CH3

Leucine ou Leu R = - CH2- CH - CH3

Isoleucine ou Ile R = - CH – CH2 - CH3

CH3

* A FONCTION ALCOOL –OH.

Sérine ou Ser

R = - CH2-OH fonction alcool primaire

Thréonine ou Thr

R = -CHOH-CH3 fonction alcool IIre

* A FONCTION SOUFREE -SH.

Cystéine ou Cys R = - CH2 – SH (SH = gpt thiol)

Méthionine ou Met R = - CH2- CH2- S- CH3

AA AROMATIQUES NEUTRES(possèdent une structure cyclique de type

benzénique)

Responsables de l’absorption dans l’UV des protéines Phénylalanine ou Phé

Tyrosine ou Tyr qui possède une fonction phénolique

Tryptophane ou Trp Absorbe à 280 nm

AA NEUTRE HETEROCYCLIQUE Proline ou Pro

AA ACIDES(possédent un groupement acide carboxylique

supplémentaire sur la chaîne latérale)

NB :leurs dérivés : la glutamine (Gln) , l’asparagine (Asn)

sont considérés comme des AA neutres

AA BASIQUES(possédant une fonction aminée supplémentaire

sur la chaîne latérale)

C

COO-

R

HNH3+ C

COO-

R

NH3+H

série L série D

perspective

STEREOCHIMIE

Notion de polarité

Ex de l’eau : Atome O très électronégatif (attraction des électrons ++)Formation d’un dipôle permanent + -Favorise la formation des liaisons hydrogène.

Fonction acide carboxylique/Gpt phosphate/Gpt Ammonium+ Hydroxyles

AA avec Groupement polaire:

Polaires non ionisables : Ser(OH),Thr (OH), Asn, Gln

Polaires ionisables en fonction du pH :Lys , Arg, His, Asp, Glu, Cys, Tyr

seuls les AA ionisables (Lys , Arg, His, Asp, Glu) peuvent

intervenir dans une liaison ionique à pH physiologique (car groupements NH3+ ou COO-)

NB : Pour Tyr (O-/OH) et la Cys (S-/SH) au pH physiologique, pas de dissociation de Tyr (OH) et Cys (SH) au regard de leur pKa(groupement chargé seulement à pH basique)

Leu IleValAlaGly

Phe

MetCys

TrpTyr

Thr ProSer

HisGluGln AspAsn

Lys

Arg

M

Polarité

Le caractère polaire ou apolaire d’une molécule dépendra de la

présence ou non d’une ou plusieurs fonctions chimiques supplémentaires.

Hydrosolubilité est fonction de la proportion de

groupements polaires dans la molécule.

Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :

L’alanine, la leucine et la phénylalanine ont en commun :

A/ Le caractère hydrophile de leur chaîne latérale

B/ Le caractère lipophile de leur chaîne latérale

C/ Une chaîne latérale chargée

D/ Une chaîne latérale apolaire

E/ Elles n’ont aucun point commun

Exercice 3


L’alanine, la leucine et la phénylalanine ont en commun :

A/ Le caractère hydrophile de leur chaîne latéraleFAUX

B/ Le caractère lipophile de leur chaîne latéraleVRAI

C/ Une chaîne latérale chargéeFAUX

D/ Une chaîne latérale apolaireVRAI

E/ Elles n’ont aucun point communFAUX

Exercice 4Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les

propositions suivantes :La sérine et la thréonine sont :A/ des acides aminés avec une chaîne latérale

de nature phénolique

B/ de la série D à l’état naturel

C/ des acides aminés basiques

D/ des acides aminés alcool

E/ des acides dicarboxyliques.

Exercice 4


La sérine et la thréonine sont :

A/ des acides aminés avec une chaîne latérale de nature phénolique

FAUX

B/ de la série D à l’état naturel

Série L (série D ex : glucose)

C/ des acides aminés basiques

FAUX

D/ des acides aminés alcool

VRAI

E/ des acides dicarboxyliques.

FAUX

* A FONCTION ALCOOL –OH.

Sérine ou Ser

R = - CH2-OH

fonction alcool primaire

Thréonine ou Thr

R = -CHOH-CH3

fonction alcool IIre

Exercice 5Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :Les acides aminés pouvant participer à des interactions électrostatiques dans les protéines sont : A. La phénylalanine.B. L’arginine.C. La glutamine.D. L’acide aspartique.E. La glycine.

Les acides aminés pouvant participer à des interactionsélectrostatiques dans les protéines sont des AA présentant une chaîne latérale ionisable

AA acides

AA basiques

Polaires ionisables en fonction du pH :

Lys , Arg, His, Asp, Glu, Cys, Tyr

Exercice 5


Les acides aminés pouvant participer à des interactions électrostatiques dans les protéines sont :

A. La phénylalanine

FAUX

B. L’arginine

VRAI

C. La glutamine

FAUX

D. L’acide aspartique

VRAI

E. La glycine.

FAUX

Exercice 6


Parmi les acides aminés suivants, les acides aminés essentiels sont :

A/ La leucine

B/ Le tryptophane

C/ La glycine

D/ L’alanine

E/ La lysine

AA essentiels : Pas de synthèse par l’organisme

Val / Leu / Ile / Lys / Phe / Trp / Met / Thr / His / Arg

Arg et His sont synthétisés par les tissus, mais en quantité insuffisante pour le soutien de la croissance chez les enfants

Réponses A, B, E

Exercice 7 Certains neurotransmetteurs proviennent de la transformation biochimique d’un acide aminé ; le(s)quel(s) ?Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : A/ AcétylcholineB/ NoradrénalineC/ SérotonineD/ DopamineE/ Acide -amino butyrique (GABA)

Ex : Dopamine

Sérotonine

Histamine

A/ AcétylcholineFAUX

B/ NoradrénalineVRAI (tyrosineDOPADopamineNorAdAd)

C/ Sérotonine VRAI (tryptophane)

D/ Dopamine VRAI (tyrosine)

E/ Acide -amino butyrique (GABA) VRAI (précurseur : glutamate)

Exercice 8 Concernant l'acide aminé X, on donne pKa1 = 2 pKa2 = 9 et pKa3 chaîne latérale = 12,5. Indiquez la (ou les) bonne(s) réponse(s) parmi les propositions suivantes :

A. La forme zwitterion de X est majoritaire à un pH = 5,5

B. Le point isoélectrique (pHi) calculé pour X est de 7,25

C. Le pHi calculé pour X est de 10,75

D. A pH = 10, X est essentiellement sous forme de cation

E. Le pHi représente la valeur de pH pour laquelle X n’est pas chargé

Propriétés acido-basiques

des acides aminés

Ka = constante de dissociation

[H+].[A-]Ka = ________

[AH]

Equation d’Hendersson-Hasselbach ; pH = pKa + log ([A-]/[AH])

EQUILIBRES ACIDO-BASIQUES

HA A- + H+

SIGNIFICATION DES pKA DES AA

(Valable pour tous les AA)

Gpt (COO-/COOH) pKa1 (# 2-2,5)

pKa1 = pH pour lequel [COO-] = [COOH]

Gpt (NH2/NH3+) pKa2 (# 9-10)

pKa2 = pH pour lequel [NH2] = [NH3+]

POINT ISOELECTRIQUE (pI ou pHi)

pH pour lequel le nombre de charges positives est égal au nombre de charges négatives

à pH << pKa1 (donc < 2) = pH acide

Les 2 Gpts sont sous forme protonée

COOH et NH3+

COOH-CHR-NH3+ charge nette = +1

cation

à pH = pKa1

[COO-] = [COOH]

et forme majoritaire NH3+ (pH < pKa2)

charge nette :Pour 2 molécules, CN= (2 charges (+) + 1 charge (-))/2= +0,5

INFLUENCE DU pH SUR LA CHARGE NETTECas de l’Alanine

O-

O-

A pH compris entre pKa1 et pKa2

forme majoritaire [COO-] (pH > pKa1)forme majoritaire NH3

+ (pH < pKa2)

Forme majoritaire de l’AA = zwitterion

COO- - CHR – NH3+ charge nette = 0

pI = pH pour lequel la molécule estélectriquement neutre

pI = (pKa1 + pKa2)/2

O-

à pH = pKa2[NH2] = [NH3+]et forme majoritaire COO- (pH >>> pKa1)

charge nette = ((1 x +1)+ (2x-1))/2 = -0,5 (en moyenne)

à pH >> pKa2 (donc > 10) donc pH basique

gpts sous forme déprotonée COO- et NH2

COO- – CHR – NH2

charge nette = -1anion

O-

O-

Une fonction acide carboxylique supplémentaire

NH2 - CH – CH2- CH2 - COOH

COOH

Caractérisé par 3 pKa :

- pKa1 = pH pour lequel [COO-] = [COOH]

- pKa2 = pH pour lequel [NH2] = [NH3+]

- pKa3 = pH pour lequel [CLCOO-] = [CLCOOH]

INFLUENCE DU pH SUR LA CHARGE NETTECas de l’acide glutamique

pH << pKa1

Tous les gpts sous forme protonée :COOH, CLCOOH et NH3

+

charge nette : +1

pH compris entre pKa1 et pKa3

Gpts sous forme COO-, CLCOOH et NH3+

charge nette :0 (zwitterion)

pI = (pKa1+ pKa3)/2 = 3,25

pH compris entre pKa3 et pKa2

Gpts sous forme COO-, CLCOO- et NH3+

charge nette : -1

pH >> pKa2

Gpts sous forme COO-, CLCOO- et NH2

charge nette : -2

Ex : Lys ; une fonction amine supplémentaire

NH2 - CH – CH2- CH2 – NH2

COOH

Présence de 3 pKa- pKa1 = pH pour lequel [COO-] = [COOH]

- pKa2 = pH pour lequel [NH2] = [NH3+]

-pKa3 = pH pour lequel [CLNH2] = [CLNH3+]

pI = (pKa2 + pKa3)/ 2

INFLUENCE DU pH SUR LA CHARGE NETTECas des acides aminés basiques





D. A pH = 10, X est essentiellement sous forme de cation




Zwitterion majoritaire si pH proche du pHi

Valeur pKa3 élevée d’où acide aminé basique

Calcul du pHi

pHi = ( 9 + 12,5) / 2 = 10,75


Faux


Vrai

D. A pH = 10, X est essentiellement sous forme de cation Faux

pH << pHi , charge nette +

pH # pHi, charge nette nulle

pH >> pHi, charge nette -


Faux

Exercice 9 Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :Les techniques permettant la séparation des acides aminésen solution sont :

A/ L’électrophorèse

B/ L’ultracentrifugation

C/ La chromatographie liquide

D/ L’électrophorèse capillaire

E/ La chromatographie d’échange d’ions

ELECTROPHORESE Principe Une molécule chargée se déplace dans un champ électrique vers l’électrode de signe opposé à sa charge.

Cathode : électrode chargée négativementAnode : électrode chargée positivement

Gel d’agarose

Gel d’acétate decellulose

ELECTROPHORESE CAPILLAIRE : principe identique,Séparation d’un mélange complexe dans un capillaire soumis à une différence depotentiel élevée ; Pouvoir de séparation très important.Utilisé par exemple pour la détermination de séquences nucléotidiques(=séquenceur)

La vitesse de migration d’un AA dans un champ électrique est

- fonction de la charge globale de l’AA donc

- fonction du pH de la solution d’électrophorèse

A retenir

pH << pHi , charge nette + = cation migrant vers la cathode

pH # pHi, charge nette nulle = zwitterion ne migrant pas

pH >> pHi, charge nette - = anion migrant vers l’anode

ULTRACENTRIFUGATION DE ZONE.M. (1-v.r)

S= ____________

fAvec M : masse moléculaireS : coefficient de sédimentationV : volume spécifique partiel de la particuleR : densité de la solutionF : coefficient de friction.

METHODES CHROMATOGRAPHIQUES :

Chromatographie en couche mince

METHODES CHROMATOGRAPHIQUES :

Chromatographie liquide (CLHP)

Pompe Injecteur Colonne Détecteur

Solvants Echantillons

SéparationEx :- C18- Echange d’ions

Ex :-UV-visible- Fluorimétrie

CHROMATOGRAPHIE D’ECHANGE D’IONS

Colonne : résine synthétique munie de groupementschargés

résine échangeuse de cations : charges –

Ex résine de polystyrène sulfoné (ions SO3-)

carboxyméthylcellulose : C02- - CH2 – O – cellulose

résine échangeuse d’anions : charges +

DEAE-cellulose : (CH3-CH2)2NH+ - (CH2)2 - cellulose

Technique reposant sur l’interaction électrostatique entre un AA chargé et une particule stationnaire portant une charge de signe opposé.

L’interaction peut-être modifiée en faisant varier le pH, donc en variant les charges des AA et donc leur vitesse de migration le long de la colonne

Résine portant des charges - (échangeuses de cations)

À pH 2, tous les AA sous forme de cations = fixation de tous les AA sur la colonne

Si on augmente le pH, les 1ers AA à se retrouver sous forme de zwitterion sont les AA à pHi bas (AA acides) qui se détachent de la colonne et sont élués les 1ers en bas de la colonne

Exercice 9 Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :Les techniques permettant la séparation des acides aminésen solution sont :

A/ L’électrophorèseVRAI

B/ L’ultracentrifugation FAUX

C/ La chromatographie liquideVRAI

D/ L’électrophorèse capillaireVRAI

E/ La chromatographie d’échange d’ionsVRAI

Exercice 10On dispose d’un mélange de 4 acides aminés appartenant à la liste suivante : Glu, His, Val, Arg. Valeurs des différents pKGlu pKa1=2,2 pKa2=9,9 pKa3=4,4Ala pKa1=2,3 pKa2=9,7Arg pKa1=2,2 pKa2=9,4 pKa3=12,5Asp pKa1=2 pKa2=10 pKa3=3,9Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : A/ Une électrophorèse à pH=7 permet de séparer les 4 acides aminésB/ Une électrophorèse à pH=3 permet de séparer les 4 acides aminésC/ On peut identifier les 4 acides aminés du mélange au moyen de deux électrophorèses à pH=3 et pH=7.D/ La séparation électrophorétique dépend du pHi des acides aminés et du pH imposé.E/ Aucune réponse bonne.

Glutamate pKa1=2,2 pKa2=9,9 pKa3=4,4

Alanine pKa1=2,3 pKa2=9,7

Arginine pKa1=2,2 pKa2=9,4pKa3=12,5

Aspartate pKa1=2 pKa2=10pKa3=3,9

1ère étape : calcul du pHi

Glutamate pHi =3,3

Alanine pHi = 6

Arginine pHi = 10,95

Aspartate pHi = 2,95

Glutamate pHi =3,3

Alanine pHi = 6

Arginine pHi = 10,95

Aspartate pHi = 2,95

pH = 7

pH >>> pHipH >> pHi + 2Charge nette ---

pH =~pHiCharge nette -

pH<<<pHipH << pHi – 2Charge nette +

pH >>> pHipH >> pHi + 2Charge nette ---

pH = 3

pH ~ pHiZwitterion +++

pH <<< pHi - 2Charge nette +++

pH<<<pHipH << pHi – 2

Charge nette +++

pH ~ pHiZwitterion +++


A/ Une électrophorèse à pH=7 permet de séparer les 4 acides aminés

Faux

B/ Une électrophorèse à pH=3 permet de séparer les 4 acides aminés

Faux

C/ On peut identifier les 4 acides aminés du mélange au moyen de deux électrophorèses à pH=3 et pH=7.

Faux

D/ La séparation électrophorétique dépend du pHi des acides aminés et du pH imposé.

Vrai

E/ Aucune réponse bonne.

Faux

x

4

2 3

1

Exercice 11 Un mélange de quatre acides aminés (Leu, His, Thr, Lys) est séparé par la technique de Finger Print (électrophorèse sur papier à pH 6 suivie d’une chromatographie ascendante en solvant organique). Après coloration à la ninhydrine, on obtient la cartographie suivante :

+ Electrophorèse -

Dépôt

On donne :Leu pKa1 = 2,3 pKa2= 9,7His pKa1 = 1,7 pKa2= 9,1 pKa3= 6,0Ala pKa1 = 2,3 pKa2= 9,9Lys pKa1 = 2,0 pKa2= 9,1 pKa3= 10,7 Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :A/ Le spot 1 est un acide aminé aliphatique.B/ Le spot 2 correspond à l’histidine.C/ Les spots 1 et 3 correspondent à des acides aminés possédant une valeur de pHi supérieure à 6.D/ Les spots 2 et 4 correspondent à des acides aminés présentant une chaîne latérale ionisée.E/ Les spots 2 et 4 correspondent respectivement à la leucine et à l’alanine.

Leu pKa1 = 2,3 pKa2= 9,7 pHi= 6

His pKa1 = 1,7 pKa2= 9,1 pKa3= 6,0 pHi = 7,05

Ala pKa1 = 2,3 pKa2= 9,9 pHi = 6,1

Lys pKa1 = 2,0 pKa2= 9,1 pKa3= 10,7 pHi = 9,9

Electrophorèse sur papier à pH = 6

Leu et Ala ne migrent pas

His et Lys chargés positivement avec la charge la plus importante pour Lys (d’où migre le plus loin)

Chromatographie avec une phase organiqueLes solutés migrent avec un solvant organiqueLes acides aminés avec une chaîne latérale très apolaire migreront en même temps que le front de solvant de la phase organique (donc migrent plus loin par comparaison aux composés les plus polaires)

+ Electrophorèse -

x

4

2 3

1

Dépôt

LysHis

Leu

Ala

Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes :A/ Le spot 1 est un acide aminé aliphatique

Faux

B/ Le spot 2 correspond à l’histidineFaux

C/ Les spots 1 et 3 correspondent à des acides aminés possédant une valeur de pHi supérieure à 6

Vrai

D/ Les spots 2 et 4 correspondent à des acides aminés présentant une chaîne latérale ionisée

Faux

E/ Les spots 2 et 4 correspondent respectivement à la leucine et à l’alanine.

Faux

Exercice 12 La chromatographie sur résine échangeuse de cations :

1 – indique que la colonne porte des charges négatives

2 – indique que la colonne porte des charges positives

3 – fait intervenir un éluant de pH constant par rapport au temps

4 – permet la séparation de la valine et de la lysine

5 – fixe les acides aminés sous forme de cations à pH 13

6 – ne peut échanger que des cations

1 – indique que la colonne porte des charges négativesVRAI

2 – indique que la colonne porte des charges positives

FAUX3 – fait intervenir un éluant de pH constant par rapport au temps

FAUX

4 – permet la séparation de la valine et de la lysine VRAI

5 – fixe les acides aminés sous forme de cations à pH 13 FAUX

6 – ne peut échanger que des cations Réponse D : 1,4,6

VRAI

Exercice 13 Soit un mélange de 3 oligopeptides1/ Phe-Gly-Leu-Lys2/ Val-Ile-Thr-Asp3/ Ala–Gly-Trp-Ser Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les propositions suivantes : A/ Une migration électrophorétique à un pH approprié permettra la séparation du mélangeB/ Aucune séparation du mélange ne pourra avoir lieu quelque soit la valeur de pH imposé au cours de l’électrophorèse C/ A pH très acide, seuls deux polypeptides migrent vers la cathodeD/ Les trois peptides migrent vers l’anode à pH très basiqueE/ La chromatographie d’exclusion est une technique appropriée pour la séparation du mélange

Valeur du pH

1 6 13

Phe-Gly-Leu-Lys +2 +1 -1

Val-Ile-Thr-Asp +1 -1 -2

Ala–Gly-Trp-Ser +1 0 -1

Exemple à pH=6 :

+H3N-Phe-Gly-Leu-Lys-COO-

NH3+ CN=(2x+1) + (1x-1)=+1

Valeur du pH

1 6 13

A Phe-Gly-Leu-Lys +2 +1 -1

B Val-Ile-Thr-Asp +1 -1 -2

C Ala–Gly-Trp-Ser +1 0 -1

Exemple à pH=6 :

+H3N-Phe-Gly-Leu-Lys-COO-

NH3+ CN=(2x+1) + (1x-1)=+1

dépôt

Cathode (-) Anode (+)

A B C

A/ Une migration électrophorétique à un pH approprié permettra la séparation du mélange

VRAIB/ Aucune séparation du mélange ne pourra avoir lieu quelque soit la valeur de pH imposé au cours de l’électrophorèse

FAUX C/ A pH très acide, seuls deux polypeptides migrent vers la cathode

FAUXD/ Les trois peptides migrent vers l’anode à pH très basique

VRAIE/ La chromatographie d’exclusion est une technique appropriée pour la séparation du mélange

FAUX

Exercice 14 Indiquez la ou les bonnes réponses parmi les

propositions suivantes : Voici cinq peptides :A/ Ala-Asp-Arg-Asp-GlyB/ Arg-Ala-Arg-Ala-PheC/ Asp-Lys-Asp-Ala-LysD/ Glu-Lys-Trp-Lys-ValE/ Glu-Asp-Ala-Asp-Val et quatre critères 1) Hydrolyse/HCl = 3 spots2) Hydrolyse trypsique = 3 spots3) Electrophorèse à pH 6 = migration vers la cathode4) Absorption UV à 280 nm Lequel (ou lesquels) de ces peptides répond(ent) à

tous ces critères ?

Hydrolyse par HCl = séparation des AA avec destruction du TrpAla-Asp-Arg-Asp-Gly 4 spots = Ala, Asp, Arg et Gly

Arg-Ala-Arg-Ala-Phe 3 spots : Arg, Ala et PheAsp-Lys-Asp-Ala-Lys 3 spots : Asp, Lys, AlaGlu-Lys-Trp-Lys-Val 3 spots : Glu, Lys et ValGlu-Asp-Ala-Asp-Val 4 spots : Glu, Asp, Ala et Val

Hydrolyse trypsique = 3 spotsTrypsine = coupe la liaison peptidique du coté carboxyliquedes AA basiques Lys et Arg

Arg Ala-Arg et Ala-Phe 3 spots

Asp-Lys et Asp-Ala-Lys 2 spots

Glu-Lys Trp-Lys et Val 3 spots

Électrophorèse à pH 6 ; migration vers la cathode donc sous forme de cation chargé positivement

Arg-Ala-Arg-Ala-Phe 2 AA basiques et 3 AA neutres

3 NH3+ et 1 COO- charge nette = +2 vrai

Glu-Lys-Trp-Lys-Val

1 AA acide, 2 AA basiques et 2 AA neutres

3 NH3+ et 2 COO- charge nette = +1 vrai

Absorption dans l’UV à 280nm : oligopeptide d)

Hydrolyse acide (Hcl) Séparation des AA avec destruction du Trp

Trypsine : Endopeptidase coupant l’AA basique Lys ou Arg

à son extrémité carboxylique

Carboxypeptidase B : Exopeptidase permettant de séparer

l’AA du côté carboxylique

Chymotrypsine : Endopeptidase coupant essentiellement les

AA aromatiques du côté carboxylique

Bromure de cyanogène : Coupe du côté carboxylique de la Met.

= Coupure des liaisons peptidiques

-mercaptoéthanol : rupture des ponts disulfures établis entre 2 Cys

Urée 8M / Dodécylsulfate de sodium : rupture des liaisons hydrogène,ioniques

Exercice 15 Le composé peptidique A comporte huit acides aminés mais l’hydrolyse acide totale ne permet d’identifier que six acides aminés différents.L’action du -mercaptoéthanol sur le composé A libère un hexapeptide B et un dipeptide C.L’action de courte durée d’une carboxypeptidase libère Arg sur le peptide C et Ile sur le peptide B.L’action du réactif d’Edman sur le peptide B libère le PTH-Asp.L’hydrolyse trypsique sur le peptide B libère un tétrapeptide dont la composition suit (Lys, X, Asp, Trp) et un dipeptide. Le dernier acide aminé encore inconnu X est dépourvu de pouvoir rotatoire.L’action de la chymotrypsine sur le peptide B permet l’obtention de deux tripeptides.Indiquer la séquence des peptides A, B et C.

Le composé peptidique A comporte huit acides aminés mais l’hydrolyse acide totale ne permet d’identifier que six acides aminés différents.

Attention à la terminologie : A possède huit AA et il n’est pas spécifié qu’il s’agit d’un octapeptide c-à-d enchainement de 8 AA

Hydrolyse : 6 AAPossibilité de Trp (1 ou 2) détruit lors de l’hydrolyse acideou de la présence d’un ou deux AA identiques

L’action du -mercaptoéthanol sur le composé A libère un hexapeptide B et un dipeptide C.Mercaptoéthanol : rupture d’un pont disulfure entre 2 Cys

Donc 2 Cys l’un sur l’hexapeptide B (a-b-c-d-e-f)l’autre sur le dipeptide C (g-h)

B et C étants reliés par un pont disulfure pour former A

L’action de courte durée d’une carboxypeptidase libère Arg sur le peptide C et Ile sur le peptide B.

Carboxypeptidase B : exopeptidase permettant de séparer

l’AA du côté carboxylique

Donc f = Ile h = Arg et g = Cys

Donc B = a-b-c-d-e-Ile (dont 1 cys) et C = Cys-Arg

L’action du réactif d’Edman sur le peptide B libère le PTH-Asp

Réactif d’Edman : Réaction qui permet de séquencer

l’oligopeptide à partir de son extrémité aminée

Donc a = Asp

L’hydrolyse trypsique sur le peptide B libère un tétrapeptide dont la composition suit (Lys, X, Asp, Trp) et un dipeptide.

Deux info :Tétrapeptide contient 1 Trp détruit par l’hydrolyse acide

Donc 8 AA : Cys (2), Trp, Asp, Ile, Arg, Lys, X

Par hydrolyse acide, 6 spots correspondant à 6 AA différentsCys, Asp, Ile, Arg, Lys et X

B = tétrapetide-dipeptide ou dipeptide-tétrapeptide

Or le tétrapeptide contient Asp = a-b-c-d =

Tétrapeptide = Asp – (Trp,X)- Lys

Donc B = Asp – (Trp, Gly) – Lys – Cys – Ile

Car le dernier acide aminé encore inconnu X est dépourvu de pouvoir rotatoire. Il s’agit de Gly.

L’action de la chymotrypsine sur le peptide B permet l’obtention de deux tripeptides.

Donc c = Trp et b = Gly pour obtenir deux tripeptides

Asp-Gly-Trp et Lys-Cys-Ile

C = Cys-Arg

B = Asp-Gly-Trp-Lys-Cys-Ile

A Asp-Gly-Trp-Lys-Cys-Ile

SS

Cys -Arg

enseignements dirigés biochimie pcem 1 acides aminés – oligopeptides méthodes d’étude l....

Documents