endocytose van sialoadhesine, de receptor voor het porcien ... › fulltxt › rug01 › 000 › 782...
TRANSCRIPT
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT LANDBOUWKUNDIGE
EN TOEGEPASTE BIOLOGISCHE WETENSCHAPPEN
____________________
Academiejaar 2002 - 2003
Endocytose van sialoadhesine, de receptor voor het porcien arterivirus
Mathias LAGA
Promotor 1: Prof. Dr. P. Van Oostveldt
Promotor 2: Prof. Dr. H. Nauwynck
Scriptie voorgedragen tot het behalen van de graad van
BIO-INGENIEUR IN DE CEL- EN GENBIOTECHNOLOGIE
UNIVERSITEIT GENT
FACULTEIT LANDBOUWKUNDIGE
EN TOEGEPASTE BIOLOGISCHE WETENSCHAPPEN
____________________
Academiejaar 2002 - 2003
Endocytose van sialoadhesine, de receptor voor het porcien arterivirus
Mathias LAGA
Promotor 1: Prof. Dr. P. Van Oostveldt Laboratorium voor Biochemie & Moleculaire Cytologie
Faculteit Landbouwkundige & Toegepaste Biologische Wetenschappen
Promotor 2: Prof. Dr. H. Nauwynck Laboratorium voor Virologie Faculteit Diergeneeskunde
Scriptie voorgedragen tot het behalen van de graad van
BIO-INGENIEUR IN DE CEL- EN GENBIOTECHNOLOGIE
“De auteur en de promotoren geven de toelating deze scriptie voor consultatie
beschikbaar te stellen en delen ervan te kopiëren voor persoonlijk gebruik. Elk ander
gebruik valt onder de beperkingen van het auteursrecht, in het bijzonder met betrekking tot
de verplichting de bron te vermelden bij het aanhalen van resultaten uit deze scriptie.”
“The author and the promotors give permission to use this thesis for consultation and to
copy parts of it for personal use. Every other use is subject to the copyright laws, more
specifically the source must be extensively specified when using results from this thesis.”
19/05/03, Gent
Lijst met afkortingen
LIJST MET AFKORTINGEN AP: Adaptor proteïne
CCV: Clathrin coated vesicle
ECV: Endosomal carrier vesicle
EE: Early endosome, vroeg endosoom
EMM: Endosome maturation model
ER: Endoplasmatisch reticulum
FKS: Foetaal kalf serum
LE: Late endosoom, laat endosoom
Mas: Monoklonaal antistof
ORF: Open reading frame, open leesraam
PAM: Porciene alveolaire macrofagen
PRRSV: Porcien reproduktief en respiratoir syndroom virus
RE: Recycling endosome
Sia: Sialoadhesine
TGN: Trans Golgi netwerk
UP: Ultra puur water
Woord vooraf
WOORD VOORAF
Een eindwerk maken is een laatste stap naar het behalen van een diploma, en tegelijk een
eerste stap in de onderzoekswereld. Het is een unieke kans om na vier jaar studeren je
theoretische kennis om te kunnen omzetten in een “eigen onderzoek”. Uiteraard gaat zo’n eerste
onderzoek gepaard met vallen en opstaan, en heb je de steun en ervaring van anderen nodig,
waarvoor mijn oprechte dank.
In de eerste plaats wil ik mijn begeleider, Peter Delputte, bedanken. Jij hebt me mijn eerste
stappen in de onderzoekswereld laten zetten. Bedankt voor je grenzeloze inzet, je geduld en
enthousiasme, voor de energie die je elke dag in mij hebt gestoken. Ik heb dit jaar echt
ongelofelijk veel bijgeleerd dankzij jou!
Professor Nauwynck, de manier waarop jij gebeten bent door onderzoek en je enthousiasme is
onbeschrijfelijk. Bedankt voor de kritische discussies en je vernieuwende ideeën, waardoor ik
steeds verder kon werken aan mijn onderzoek. Ik wil je ook bedanken voor de mogelijkheden die
ik gekregen heb op het labo.
Professor Pensaert, u hebt mij de mogelijkheid gegeven om bij mijn onderzoek onbeperkt
gebruik te maken van de infrastructuur en middelen in uw labo. Omdat deze luxe is niet elke
thesisstudent gegeven is, wil ik u daarvoor ten zeerste bedanken.
Prof. Van Oostveldt, bedankt voor het ter beschikking stellen van dit onderwerp en voor het
gebruik van de confocale microscoop.
Ook Professor S. De Smedt en Bart Lucas wil ik bedanken voor het gebruik van hun confocale
microscoop en voor de tijd die ze voor mij hebben vrij gemaakt..
Verder wil ik nog de mensen van het labo virologie bedanken en in het bijzonder Herman,
Geert, Nathalie en Romeo voor de kennis en ervaring die jullie met mij gedeeld hebben. Bedankt
ook Chantal en Carine voor de hulp bij een aantal van mijn experimenten.
Tenslotte wil ik nog mijn ouders bedanken. Zij hebben mij tenslotte 5 jaar gesteund, zowel
financieel als moreel, zowel in leuke als in moeilijke tijden. Ik wil hen ook oprecht bedanken
voor de kansen die ik heb gekregen. Verder wil ik ook nog een woord van dank richten aan mijn
broer voor zijn deskundig advies, aan mijn vrienden en in het bijzonder Evi voor de steun en aan
mijn (ex)-kotgenoten voor de toffe studententijd.
Inhoudsopgave
1 LITERATUURSTUDIE _________________________________________________________________ 1
1.1 HET PORCIEN REPRODUCTIEF EN RESPIRATOIR SYNDROOM VIRUS ______________________________ 1 1.1.1 Inleiding _____________________________________________________________________ 1 1.1.2 Morfologie ___________________________________________________________________ 2 1.1.3 Het virale genoom _____________________________________________________________ 3 1.1.4 De meest voorkomende virale proteïnen ____________________________________________ 4 1.1.5 De virale replicatiecyclus________________________________________________________ 5
1.2 MACROFAGEN _____________________________________________________________________ 8 1.2.1 Voorkomen en functie___________________________________________________________ 8 1.2.2 Ontogenie ____________________________________________________________________ 8 1.2.3 Fagocytose ___________________________________________________________________ 9
1.3 SIALOADHESINE ___________________________________________________________________ 12 1.3.1 Inleiding ____________________________________________________________________ 12 1.3.2 Sialoadhesine en de siglec-familie ________________________________________________ 13 1.3.3 Herkenning van koolhydraten door siglecs _________________________________________ 15 1.3.4 Rol van cis-interakties _________________________________________________________ 17
1.4 ENDOCYTOSE _____________________________________________________________________ 19 1.4.1 Inleiding ____________________________________________________________________ 19 1.4.2 Receptorgemedieerde endocytose_________________________________________________ 20
1.4.2.1 Inleiding ________________________________________________________________________ 20 1.4.2.2 Eiwitten betrokken bij de eerste stappen in receptor gemedieerde endocytose via clathrine________ 22
1.4.2.2.1 Adaptor proteïnen (AP) ___________________________________________________________ 22 1.4.2.2.2 EPS15 ________________________________________________________________________ 23 1.4.2.2.3 Manteleiwitten __________________________________________________________________ 24 1.4.2.2.4 Dynamine______________________________________________________________________ 25 1.4.2.2.5 HSC70 ________________________________________________________________________ 27
1.4.2.3 Klassieke endosoom – lysosoom pathway ______________________________________________ 28 1.4.2.3.1 De verschillende vesikels _________________________________________________________ 28 1.4.2.3.2 De klassieke endosoom-lysosoom pathway wordt gecoördineerd door Rab-GTPasen. __________ 30
1.4.3 De verschillende manieren van virusopname________________________________________ 35 1.4.3.1 Inleiding ________________________________________________________________________ 35 1.4.3.2 Via clathrine _____________________________________________________________________ 35 1.4.3.3 Via caveolae _____________________________________________________________________ 36 1.4.3.4 Via macropinocytose en fagocytose ___________________________________________________ 36 1.4.3.5 Via een clathrine en caveolae onafhankelijk proces_______________________________________ 37
2 DOELSTELLINGEN __________________________________________________________________ 38
3 MATERIAAL EN METHODEN _________________________________________________________ 39
3.1 BUFFERS, REAGENTIA EN STOCKS______________________________________________________ 39
Inhoudsopgave
3.2 MEDIA __________________________________________________________________________ 40
3.2.1 Medium voor HEK-T __________________________________________________________ 40 3.2.2 Medium voor RK13, PK15 en SK _________________________________________________ 40 3.2.3 Medium voor 3D4_____________________________________________________________ 40 3.2.4 Medium voor PAM ____________________________________________________________ 40 3.2.5 LB (Luria Bertani)-medium _____________________________________________________ 41
3.3 CELCULTUREN ____________________________________________________________________ 42 3.3.1 HEK-T en 3D4 _______________________________________________________________ 42 3.3.2 RK13, PK15 en SK ____________________________________________________________ 42 3.3.3 Porciene alveolaire macrofagen (PAM)____________________________________________ 43
3.3.3.1 Isoleren en bewaren van PAM _______________________________________________________ 43 3.3.3.2 In cultuur brengen van de PAM ______________________________________________________ 43
3.4 DNA OPZUIVERING ________________________________________________________________ 43 3.5 TRANSFECTIE _____________________________________________________________________ 44
3.5.1 Transfectie van HEK-T, SK en RK13 ______________________________________________ 44 3.5.2 Transfectie van PK15 en 3D4____________________________________________________ 44
3.6 OPZUIVEREN VAN MONOKLONALE ANTISTOFFEN (MAS) ____________________________________ 45 3.6.1 Opzuivering _________________________________________________________________ 45 3.6.2 Analyse van de opgezuiverde Mas met SDS-PAGE ___________________________________ 45
3.7 ENDOCYTOSE ASSAYS_______________________________________________________________ 47 3.7.1 Microscopische analyse ________________________________________________________ 47
3.7.1.1 Bij PAM ________________________________________________________________________ 47 3.7.1.2 Bij HEK-T, PK15, RK13 en SK______________________________________________________ 47 3.7.1.3 Gebruik van inhibitoren ____________________________________________________________ 47
3.7.1.3.1 Genisteïne, tyrphostine1, tyrphostine25 en sucrose (Sigma)_______________________________ 47 3.7.1.3.2 Amantadine ____________________________________________________________________ 48
3.7.1.4 Kleuringen ______________________________________________________________________ 48 3.7.1.5 Assay voor spontane endocytose _____________________________________________________ 49
3.7.2 Flowcytometrische analyse bij PAM ______________________________________________ 49 3.8 STATISTISCHE VERWERKING__________________________________________________________ 50
4 RESULTATEN _______________________________________________________________________ 51
4.1 SIALOADHESINE GEMEDIEERDE ENDOCYTOSE IN PORCIENE ALVEOLAIRE MACROFAGEN MET BEHULP VAN
MAS 41D3 ______________________________________________________________________________ 51 4.1.1 Opzuiveren van Mas 41D3 ______________________________________________________ 51 4.1.2 Kinetiek van sialoadhesine endocytose in PAM ______________________________________ 52 4.1.3 Karakterisatie van het internalisatieproces in PAM __________________________________ 58
4.2 OPSTELLEN VAN EEN MODEL VOOR SIALOADHESINE GEMEDIEERDE ENDOCYTOSE _________________ 62 4.2.1 HEK-T _____________________________________________________________________ 62
Inhoudsopgave
4.2.2 RK13_______________________________________________________________________ 64 4.2.3 SK _________________________________________________________________________ 64 4.2.4 PK15_______________________________________________________________________ 64 4.2.5 3D4________________________________________________________________________ 71
5 DISCUSSIE __________________________________________________________________________ 75
6 BESLUIT ____________________________________________________________________________ 83
7 REFERENTIELIJST __________________________________________________________________ 84
Samenvatting / Summary
SAMENVATTING / SUMMARY
Recent werd in porciene alveolaire macrofagen (PAM) colokalisatie aangetoond tussen
clathrine en zowel PRRSV als sialoadhesine, de receptor voor PRRSV. Er werd dan ook
verondersteld dat sialoadhesine via clathrine gemedieerde endocytose wordt opgenomen. Deze
hypothese werd getoetst door endocytose te induceren met behulp van monoklonalen en gebruik
te maken van verschillende inhibitoren. In deze scriptie kon aangetoond worden dat clathrine
gemedieerde endocytose belangrijk is bij opname van sialoadhesine.
Om onder andere mutaties in de cytoplasmatische staart van sialoadhesine te kunnen
bestuderen werd gezocht naar een cellijn die na transfectie als model kan dienen voor de
internalisatie van sialoadhesine. Er kon aangetoond worden dat zowel PK15 en vooral 3D4
cellen geschikt zijn aangezien ze een gelijkaardige internalisatie vertonen als PAM en
verschillende inhibitoren een gelijkaardige reduktie geven.
Recently, colocalisation was shown in porcine alveolar macrophages (PAM) between clathrin
and PRRSV as well as sialoadhesin, the receptor of PRRSV. Therefore it was assumed that
sialoadhesin internalisation was clathrin mediated. This hypothesis has been verified by inducing
internalisation with monoclonal antibodies, and putting different inhibitors to the test. In this
thesis we could show that clathrin mediated endocytosis is important in sialoadhesin
internalisation.
In order to be able to study mutations, e.g. in the cytoplasmatic tail of sialoadhesin, we
searched a cell line that can serve as a model for internalisation. Because kinetics in PK15 en
3D4 were very similar to those in PAM, these cells were chosen as model.
Literatuurstudie 1
1 LITERATUURSTUDIE
1.1 Het porcien reproductief en respiratoir syndroom virus
1.1.1 Inleiding
In 1987 werd een nieuw ziektesyndroom waargenomen bij varkens in Noord-Amerika en
Canada (Keffaber, 1989). De nieuwe ziekte werd gekenmerkt door vroeggeboorte, een verhoogd
aantal doodgeboren biggen, sterfte van de biggen kort na de geboorte, laatabortus en
ademhalingsproblemen (Mengeling et al., 1998; Zimmerman et al., 1997; Pensaert & Vynckier,
1993; Collins et al., 1992; Wensvoort et al., 1992). In 1990 werd melding gemaakt van een
analoog syndroom in Duitsland (Lindhaus & Lindhaus, 1991). Begin 1991 werden ook de eerste
gevallen opgemerkt in Nederland (Wensvoort et al., 1991) en later in het jaar ook in België
(Pensaert & Vynckier, 1993). De ziekte heeft zich vervolgens snel over Europa verspreid en
kreeg verschillende namen zoals ‘mystery swine disease’ (MSD) ‘blue ear disease’, ‘porcine
epidemic abortion and respiratory syndrome’ (PEARS), ‘swine infertility and respiratory
syndrome’ (SIRS) en ‘porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV), wat nu de
officiële naam is (Wensvoort et al., 1992). Het agens dat de ziekte veroorzaakt, werd voor het
eerst uit porciene alveolaire macrofagen geïsoleerd in Nederland in 1991 en gekarakteriseerd als
een nieuw RNA virus met een enveloppe en werd het Lelystad virus genoemd (Rossow et al.,
1996; Wensvoort et al., 1992; Wensvoort et al., 1991).
PRRSV is een positief strengig RNA virus met enveloppe dat behoort tot de familie van de
Arteriviridae (Dea et al., 2000; Meulenberg, 2000; Cavanagh, 1997). Naast PRRSV behoren ook
het equine arteritis virus, het lactaat dehydrogenase-elevating virus uit muizen en het simian
hemorrhagic fever virus tot deze familie (Conzelmann et al., 1993). De sterke gelijkenissen
tussen de Arteriviridae en de Coronaviridae hebben er toe geleid dat beide families
ondergebracht zijn in de orde van de Nidovirales (Cavanagh, 1997). Sekwentieanalyse toonde
aan dat er significante verschillen zijn tussen Noord-Amerikaanse en Europese isolaten (met als
prototype respectievelijk VR-2332 en Lelystad virus). Terwijl vroeger beide types alleen op hun
specifiek continent voorkwamen, wordt nu ook het Europese type aangetroffen in Canada, en het
Amerikaanse type in Europa. Er is bovendien variatie binnen de types die toeneemt in de tijd
(Stadejek et al., 2002).
Literatuurstudie 2
1.1.2 Morfologie
PRRSV virions zijn sferisch en hebben een diameter van 45-65 nm voor de Europese types
(Ohlinger et al., 1991; Wensvoort et al., 1991) en 48-83 nm voor de Noord Amerikaanse types
(Benfield et al., 1992; Dea et al., 1992). Het virus bestaat uit een isometrisch nucleokapsied van
25–35 nm in diameter, bestaande uit een positieve, enkelstrengige RNA molecule omgeven door
een kapsied structuur die opgebouwd is uit het 15 kDa nucleokapsied eiwit (Dea et al., 2000;
Figuur 1). De nucleokapsied is omgeven door een dubbele lipide laag, de enveloppe, waarin zes
structurele proteïnen aanwezig zijn: het matrix proteïne M, het ‘major’ proteïne GP5, en de
‘minor’ proteïnes P2b, GP2a, GP3 en GP4. De verschillende GP zijn glycoproteïnen en M is een
niet N-geglycosyleerd matrix proteïne. GP5 wordt ook wel het enveloppe-proteïne genoemd. M
en GP5 vormen heterodimeren door middel van disulfide bruggen, welke essentieel zijn voor
infectie (Mardassi et al., 1996; Meulenberg et al., 1996; Van Nieuwstadt et al., 1996;
Meulenberg et al., 1995). P2b is een 10 kD proteïne dat recenter ontdekt werd en waarvan de
functie niet gekend is (Wu et al., 2001).
���������������������������������
����������������������������
������������������������������������
������������������������������������
����������������������������
���������������������������������������
������������������������������
������������������
���������������������������������
������������������������������������������
����������������������������
GP 5
GP 4
GP 3
������������������ GP 2
RNA�������������������������������������������� Nucleokapsied
M Proteïne
AAAA
������������������ P2b
���������������������������������
����������������������������
������������������������������������
������������������������������������
����������������������������
���������������������������������������
������������������������������
������������������
���������������������������������
������������������������������������������
����������������������������
GP 5GP 5GP 5
GP 4GP 4
GP 3GP 3
������������������ GP 2
������������������ GP 2
RNARNA�������������������������������������������� NucleokapsiedNucleokapsied
M ProteïneM Proteïne
AAAA
������������������ P2b
������������������ P2b
Figuur 1. Schematische structuur van PRRSV.
Literatuurstudie 3
1.1.3 Het virale genoom
De nucleotiede sekwentie en de organisatie van het genoom van PRRSV lijkt sterk op die van
andere virussen van de groep van de Arteriviridae (Meulenberg et al., 1993a). Het genoom
bestaat uit een enkelstrengige, positieve RNA molecule die een polyadenine staart draagt
(Meulenberg et al., 1993a). Het genoom is ongeveer 15 kb groot en bevat negen open leesramen
(open reading frame, ORF; Stadejek et al., 2002). De organisatie van het genoom wordt in
Figuur 2 weergegeven, en de functie van de verschillende ORF in Tabel 1. ORF1a en ORF1b
bevinden zich aan het 5’ uiteinde van het virale genoom, nemen 75% van genoom in beslag en
coderen voor de replicase eiwitten (Verheije et al., 2002; Dea et al., 2000; Snijder et al., 1998;
Meulenberg et al., 1993a). ORF 2-7 aan de 3’ zijde van het DNA, worden afgeschreven als een
‘nested set’ van subgenomische mRNA-strengen. Ieder subgenomisch mRNA heeft een zelfde
Figuu
gespl
2-5 co
ORF
ander
gepro
genom
zwart
Niet Structurele Proteïnen Structurele Proteïnen
1a1b
2 43 5
67
ORF
mRNA 1
mRNA 2
mRNA 3
mRNA 4
mRNA 5
mRNA 6
mRNA 7
3’5’
A
B
GP3 GP5 N
GP2a GP4 M
P2b
Niet Structurele Proteïnen Structurele Proteïnen
1a1b
2 43 5
67
ORF
mRNA 1
mRNA 2
mRNA 3
mRNA 4
mRNA 5
mRNA 6
mRNA 7
3’5’
A
B
GP3 GP5 N
GP2a GP4 M
P2b
r 2. (A) Genoomstructuur van PRRSV: ORF 1a en 1b, coderen voor een polyproteïne dat
itst wordt in kleinere niet structurele proteïnen die noodzakelijk zijn voor replicatie. ORF
deren voor glycoproteïnen GP2 tot GP5. ORF6 codeert voor het membraan proteïne M en
7 codeert voor het nucleokapsied proteïne N. Een intern ORF in ORF2 codeert voor een
structureel proteïne, P2b. (B) De 3’ ‘nested set’ van subgenomische mRNA die
duceerd worden gedurende de replicatie: De 5’ leider sequentie is afgeleid van het
isch RNA en is de 5’ terminus van alle subgenomische RNA strengen (voorgesteld als
e blokjes). (Aangepast naar Snijder et al., 1998)
Literatuurstudie 4
niet-coderende 5’ leider sekwentie die afgeleid is van het 5’ uiteinde van het virale genoom en
telkens wordt alleen het 5’ terminale ORF afgeschreven (Meulenberg, 2000) (zie verder: 1.1.5
De virale replicatiecyclus).
Tabel 1. Eigenschappen en functie van de ORF van PRRSV (Lelystad)
(Meulenberg 2000; Meulenberg 1993a).
ORF Berekende grootte (kDa) Codeert voor
ORF1a 260 Replicase (RNA polymerase)
ORF1b 161,8 Replicase (RNA polymerase)
ORF 2 28,4 GP2
ORF3 30,6 GP3
ORF4 20 GP4
ORF5 22,4 GP5 (enveloppe proteïne)
ORF6 18,9 M (matrix proteïne)
ORF7 13,8 N (nucleokapsied proteïne)
1.1.4 De meest voorkomende virale proteïnen
De meest voorkomende structurele proteïnen van PRRSV zijn GP5, M en N, respectievelijk
gecodeerd door ORF 5, 6 en 7 (Dea et al., 2000). Het N proteïne is klein en sterk basisch, wat de
interaktie met het negatief geladen genomisch RNA tijdens het maken van de nucleokapsied kan
vergemakkelijken (Meulenberg et al., 2000). Het N-proteïne is sterk antigenisch, waardoor het
uitermate geschikt is om het virus te detecteren (Dea et al., 2000). Het M proteïne is het meest
geconserveerde structurele proteïne van PRRSV (Meulenberg, 2000) en is betrokken bij de
aanhechting aan de heparaan sulfaat receptor op porciene alveolaire macrofagen, de natuurlijke
gastheercel voor PRRSV (Delputte et al., 2002). Het M-proteïne zou bovendien een rol spelen in
‘budding’ en in ‘virus assembly’ en accumuleert tijdens infectie in het endoplasmatisch
reticulum waar het heterodimeren vormt met GP5. Deze laatste induceert dan apoptose in
macrofagen (Dea et al., 2000; Meulenberg et al., 2000; Suarez et al., 1996).
Literatuurstudie 5
1.1.5 De virale replicatiecyclus
PRRSV kan slechts in een beperkt aantal cellen repliceren. In varkens kan PRRSV enkel
repliceren in alveolaire long macrofagen (‘pulmonary alveolar macrophages’; PAM) en in andere
gedifferentieerde cellen van de monocyt/macrofaag cellijn. Trouwens, voor alle Arterivirussen
zijn macrofagen de primaire doelcel (Snijder & Meulenberg, 1998). PRRSV repliceert ook in
drie, niet-porciene cellijnen, namelijk in MARC-145 en CL2621 - twee cellijnen afkomstig van
de MA104 apeniercellijn - (Duan et al., 1997) en in CRL-11171 (Meng et al., 1994). Ook
repliceert PRRSV in spermatiden en spermatocyten van varkens (Snijder & Meulenberg, 1998).
Na vijf tot zeven passages op celcultuur kan een titer van 105 à 107 TCID50 (50 percent tissue
culture infective dose) bereikt worden (Dea et al., 2000). PRRSV vermeerdert echter het beste op
alveolaire macrofagen die nog immatuur of recent geactiveerd zijn en afkomstig uit biggen
jonger dan zes weken (Suarez, 2000). Het cytopathisch effect (CPE) van PRRSV op macrofagen
bestaat uit het afronden van de macrofagen en het loskomen van de celcultuurplaat (Suarez,
2000; Snijder et al., 1998).
Het feit dat bepaalde cellijnen niet geïnfecteerd kunnen worden met het intacte virus, maar dat
na transfectie met het RNA wel replicatie optreedt, wijst er op dat het specifieke tropisme
bepaald wordt door de aanwezigheid van receptoren op de celmembraan (Snijder & Meulenberg,
1998). Duan et al. (1998) hebben aangetoond dat in het specifieke geval van PRRSV, deze
receptor een 210-kDa proteïne is dat recent geïdentificeerd werd als de porciene sialoadhesine
(Vanderheijden et al., 2003). De receptor kon geïmmunoprecipiteerd worden met een
monoklonale antistof 41D3 die gericht is tegen de receptor en de infectie in macrofagen volledig
kan blokkeren. Recent werd aangetoond dat de porciene sialoadhesine PRRSV opname en
infectie medieert, aangezien transfectie van het cDNA van dit eiwit leidde tot opname of infectie
van verschillende celtypes die resistent zijn voor infectie met PRRSV (Vanderheijden et al.,
2003). De receptor blijkt ook specifiek te zijn voor gedifferentieerde cellen van de
monocyt/macrofaag lijn, daar 41D3 niet bindt op andere celtypes (Duan et al., 1998). Er is ook
aangetoond dat een heparine-achtige receptormolecule op macrofagen een rol speelt in de
aanhechting van het virus op de macrofagen, daar heparinase behandeling van de macrofagen
een significante reductie van infectie gaf (Delputte et al., 2002).
Waarschijnlijk wordt het virus dan opgenomen door receptor gemedieerde endocytose met
clathrine daar deze opname kan geïnhibeerd worden met cytochalasine D en er colokalisatie kon
Literatuurstudie 6
aangetoond worden tussen clathrine en PRRSV (Nauwynck et al., 1999; Duan et al., 1998). Een
lage pH schok bij de initiële stappen van internalisatie blijkt ook noodzakelijk voor een normale
virusreplicatie (Nauwynck et al., 1999).
Positief strengige RNA-virussen repliceren door een proces waarbij een RNA afhankelijk
RNA polymerase (‘RNA dependent RNA polymerase’, RdRp) betrokken is. Het genomisch
RNA doet dienst als template voor de aanmaak van negatief strengig anti-genomisch RNA dat
op zijn beurt dan weer dienst doet als template om nieuwe positieve RNA strengen te maken
(Verheije et al., 2002). Het replicatie proces vereist dat het RdRp op specifieke plaatsen op de
template bindt. Deze sekwenties of structuren staan in de literatuur bekend als ‘cis-acting
replication elements’ en worden meestal aan de terminus van het virale RNA teruggevonden
(Buck et al., 1996).
Na vrijstelling van het virale genoom in het cytoplasma worden ORF1a en ORF1b
afgeschreven waarbij ORF1b ontstaat door een ribosomale frameshift net voor het stopcodon van
ORF1a (Verheije et al., 2002). Voor deze frameshift zijn een ‘slippery sequence’ en een
sekwentie die een pseudo-koop structuur kan vormen essentieel (Meulenberg et al., 1993a). De
polyproteïnen gecodeerd door ORF1a en ORF1b worden vervolgens gesplitst in ten minste
twaalf niet structurele proteïnen waaronder het replicase enzyme en het polymerase enzyme
(Verheije et al., 2002; Dea et al., 2000; Snijder et al., 1998; Meulenberg et al., 1993a). Het
daarvoor vereiste peptidase wordt gecodeerd door ORF1a (Snijder et al., 1998). Naast het
replicase enzyme worden ook andere niet structurele proteïnen gemaakt die nodig zijn voor
transcriptie en translatie van het subgenomische mRNA. De verdere replicatie en transcriptie van
PRRSV grijpt plaats in het cytoplasma (van Marle, 1999; Benfield et al., 1992; Wensvoort et al.,
1991).
Andere subgenomische mRNA strengen worden gevormd door een discontinue mRNA
transcriptie (Verheije et al., 2002; Meulenberg et al., 1993b). Deze subgenomische mRNA
strengen hebben allen dezelfde leider sequentie die is afgeleid van het 5’ uiteinde van het virale
genoom (Meulenberg et al., 1993b). Het 5’ uiteinde van het virale genoom wordt gekoppeld aan
subgenomische mRNA’s door een discontinue transcriptie. De plaats waar deze fusie met de 5’
leider gebeurt wordt de junction site genoemd (Meulenberg et al., 1993b; Snijder et al., 1998).
De 5’ leider sequentie is waarschijnlijk de plaats waar virale en cellulaire eiwitten binden die
betrokken zijn in de replicatie van PRRSV (Oleksiewicz et al., 1999). Het 3’ uiteinde is
waarschijnlijk het aanhechtingspunt voor het RdRp (Meng et al., 1994).
Literatuurstudie 7
Nieuwe virions worden geassembleerd door ‘budding’ van voorgevormde nucleopkapsieden
op het zacht endoplasmatisch reticulum en het Golgi-apparaat. Het virus wordt dan
waarschijnlijk vrijgesteld door exocytose (Dea et al., 2000).
Literatuurstudie 8
1.2 Macrofagen
1.2.1 Voorkomen en functie
Macrofagen vormen een uitzonderlijk veelzijdige populatie van cellen die in praktisch alle
weefsels aangetroffen worden (Morissette et al., 1999; Naito, 1993). Vanuit morfologisch en
functioneel standpunt kunnen de macrofagen gedefinieerd worden als gedifferentieerde
mononucleaire cellen met een uitgebreid stelsel van lysosomen en een dynamische
plasmamembraan met microvilli (Opdenakker & Van Damme, 1991). Het zijn sterk
secretorische cellen die stoffen afscheiden die ontsteking, groei of hematopoiese kunnen remmen
of induceren (Woods et al., 2000). Hun belangrijkste functie vervullen ze echter in het
immuunsysteem waar ze de primaire defensie zijn tegen tal van pathogenen: ze detecteren
infectieuze partikels, nemen ze intracellulair op en vernietigen ze (Aderem & Underhill, 1999;
Morissette et al., 1999). De fagocyterende eigenschap van macrofagen is onontbeerlijk bij het
opruimen van (tumor)cellen en infectieuze agentia (Aderem & Underhill, 1999). Macrofagen
stimuleren ook de T-cellen van het immuunsysteem door de antigenen van infectieuze partikels
aan hun oppervlak te presenteren (Morissette et al., 1999) en zijn belangrijk bij zowel de
aangeboren als de verworven (humoraal en cellulair) immuniteit (Morissette et al., 1999;
Gordon, 1998). Omdat macrofagen bij zo veel processen betrokken zijn, is hun functie sterk
gereguleerd. Een defect in deze regulatie kan oorzaak zijn van een ganse reeks van
inflammatoire ziektes (Morissette et al., 1999).
1.2.2 Ontogenie
Macrofagen ontstaan uit hematopoietische stamcellen in het beenmerg die differentiëren in
monoblasten, promonocyten, monocyten en macrofagen (Naito, 1997).
De heterogeniteit van macrofagen is al te merken bij de vroege ontogenie. In het embryo
ontwikkelen primitieve macrofagen zich tijdens ‘yolk sac hematopoiese’ tot foetale macrofagen.
Hierbij slaan ze de differentiatieweg die monocyten volgen over (Naito, 1993; Takahashi et al.,
1996). Monocyten vormen een minderheid van de celpopulatie in de vroege foetale fasen, maar
vergroten hun aandeel in de latere fasen (Naito, 1993). De foetale of primitieve macrofagen
Literatuurstudie 9
proliferen ter plaatse tijdens de foetale periode en differentiëren tot residente macrofagen na de
geboorte (Naito, 1993; Takahashi et al., 1996).
In adulten, differentiëren monocyten zich uit promonocyten, afgeleid uit de pluripotente
stamcellen in beenmerg. Als monocyt migreren ze via de bloedbaan naar de perifere weefsels
(Opdenakker & Vandamme, 1991). Macrofagen afgeleid van monocyten hebben een korte
levensduur en prolifereren niet meer (Takahashi et al., 1996; Naito, 1993). Residente
macrofagen daarentegen prolifereren wel nog en onderhouden hun populatie door
zelfvernieuwing (Naito, 1993).
1.2.3 Fagocytose
Vele cellen, zowel uni- als multicellulairen, kunnen fagocyteren, maar macrofagen doen dit op
wel zeer efficiënte wijze en worden daarom ook professionele fagocyterende cellen genoemd
(Garcia-Garcia & Rosales, 2002; Aderem & Underhill, 1999). De fagocyterende eigenschap van
macrofagen is onontbeerlijk voor de opname en degradatie van infectieuze agentia en
afgestorven cellen, en is betrokken bij ontstekingen en de immuunrespons (Aderem & Underhill,
1999). Fagocytose bij macrofagen verloopt zeer efficiënt omdat ze een gans arsenaal aan
fagocytische receptoren tot expressie brengen op hun celmembraan (Aderem & Underhill, 1999).
Die grote hoeveelheid receptoren is nodig om de verschillende pathogenen, die steeds de neiging
hebben tot muteren, te kunnen herkennen en om een onderscheid te kunnen maken tussen
lichaamseigen en lichaamsvreemde cellen (Aderem & Underhill, 1999). Het belang van deze
fagocytische receptoren blijkt uit experimenten waarbij door transfectie met het cDNA van een
fagocytische receptor het fagocytose proces nog efficiënter kan worden gemaakt en waardoor
niet fagocytische cellen fagocytisch kunnen worden. (Aderem & Underhill, 1999; Hunter et al.,
1994).
De meeste kennis omtrent de signalisatie pathways van fagocytose komt uit studies van de Fc-
receptor bij muizen (Aderem & Underhill, 1999). Deze receptor bindt de Fc-zijde van een
immunoglobuline (Garcia-Garcia & Rosales, 2002) en laat toe dat macrofagen pathogenen
herkennen die gedetecteerd werden door het adaptieve immuunsysteem (Aderem & Underhill,
1999). Naargelang het type immunoglobuline dat herkend wordt spreekt men van FcγR, FcεR en
FcαR, de respectievelijke receptoren voor IgG, IgE en IgA (Garcia-Garcia & Rosales, 2002).
Van FcγR zijn er drie verschillende klassen bekend: FcγRI (CD64), FcγRII (CD32), FcγRIII
Literatuurstudie 10
(CD16) (Ravetch & Bolland, 2001). FcγRI bindt alleen monomerisch IgG; FcγRII bindt
daarentegen alleen multimerisch IgG. Beide receptoren hebben een lage affiniteit voor hun
ligand, net zoals FcγRIII (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). FcγRI en FcγRIII bestaan uit een α
en een γ-keten en kunnen fagocytose induceren. De γ keten bevat immers een op tyrosine
gebaseerd immunoreceptor activatie motief (ITAM; immunoreceptor tyrosine-based activation
motif). De FcγRII receptor bestaat slechts uit één enkele keten en bevat een op tyrosine
gebaseerd immunoreceptor inhibitie motief (ITIM; immunoreceptor tyrosine-based inhibition
motif) (Nakamura et al., 2002; Ravetch & Bolland, 2001). Verscheidene inhibitorische
moleculen zoals een SH2 (Src homologie)-domein bevattend inositol 5-fosfatase, of een SH2-
domein bevattend proteïne tyrosine fosfatase, binden met deze FcγRII receptor. Echter, de
FcγRII receptor kan enkel inhibitorisch werken als deze receptor crosslinkt met een activerende
receptor (die een ITAM-motief bevat) (Nakamura et al., 2002). Het evenwicht tussen ITIM en
ITAM bevattende receptoren is meestal ook gerelateerd aan de differentiatie van de macrofaag
(Morisette et al., 1999).
Na binding van het ligand en clustering van de receptoren, worden de ITAM motieven
gefosforyleerd (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). Deze fosforylatie gebeurt door enzymen van de
Src tyrosine kinase familie (Korade-Mirnics & Corey, 2000). Syk, een ander tyrosine kinase
bindt dan op de gefosforyleerde ITAM motieven met hun SH-2 domein. Tezelfdertijd wordt het
Syk-proteïne op zijn beurt gefosforyleerd door Src kinasen (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). De
exacte rol van Syk is ongekend maar is wel essentieel voor het fagocytose proces in
hematopoietische cellen. (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). De verdere pathway is eveneens
onvolledig gekend. Voor een volledig overzicht van de tot nu toe gekende eiwitten, en hun rol in
fagocytose wordt verwezen naar Garcia-Garcia & Rosales (2002). Hierna wordt enkel kort het
internalisatie proces beschreven.
Verschillende eiwitten uit de Rho familie van kleine GTPasen, zoals Rho, Rac en Cdc42, zijn
belangrijk voor de reorganisatie van het actine cytoskelet waarbij ‘stress fibers’, lamellipodia en
fillopodia gevormd worden. (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). Vroeger werd gedacht dat door
actinepolymerisatie de celmembraan rond het partikel geduwd werd. Maar aangezien
macrofagen partikels kunnen opnemen die groter zijn dan zichzelf moeten macrofagen een
interne bron hebben die de nood aan membranen aanvult (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). Ook
myosines (dit zijn motor-proteïnen die hun ATPase activiteit koppelen aan beweging over
Literatuurstudie 11
actinevezels) zouden een kracht kunnen leveren om vesikels te internaliseren. Dynamine II en
amphiphisine, twee eiwitten die belangrijk zijn voor clathrine gemedieerde endocytose, zijn ook
belangrijk voor de vorming van fagosomen. Ook hier is, net zoals bij endocytose, niet duidelijk
of dynamine een mechanische kracht levert of werkt als GTPase die een cascade reactie in gang
zet (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). Er zijn trouwens nog overlappingen tussen endo- en
fagocytose. De merkers die teruggevonden worden op endosomen, de Rab proteïnen, worden
ook op fagosomen teruggevonden. Fagosomen zijn net zoals vroege endosomen geassocieerd
met Rab5. Later associëren die fagosomen ook met Rab7, een merker voor late endosomen.
(Garcia-Garcia & Rosales, 2002).
Literatuurstudie 12
1.3 Sialoadhesine
1.3.1 Inleiding
Sialoadhesine (Sia), een proteïne van 185 kDa, werd ontdekt in beenmerg macrofagen als een
receptor voor rode bloedcellen van schapen (McWilliam et al., 1992). Het feit dat Sia geen
fagocytische receptor is, wijst er op dat Sia niet direct betrokken is bij het opruimen van dode
cellen, celfragmenten en pathogenen. Wel kan de receptor coöpereren met fagocytische
receptoren waarbij deze het adsorptieproces efficiënter maken (Munday et al., 1999; Crocker et
al., 1997). De expressie van Sia is sterk gereguleerd en kan gestimuleerd worden, onder andere
door serumfactoren, glucocorticoïden en ontstekingscytokinen (van den Berg et al., 2001;
Crocker et al., 1999; Munday et al., 1999). Bij chronische ontstekingen worden veel
sialoadhesine receptoren teruggevonden op de inflammatoire macrofagen (van den Berg et al.,
2001).
Sialoadhesine bindt met siaalzuren (Figuur 3), welke zure monosachariden zijn die in
eukaryote cellen vaak teruggevonden worden aan het uiteinde van glycoconjugaten (Brinkman-
Van der Linden & Varki, 2000; Varki, 1997). Siaalzuur wordt vooral teruggevonden op
celmembranen, in uitgescheiden glycoproteïnen en in de extracellulaire matrix, waar siaalzuur
gebonden zit op de niet-reducerende uiteinden van oligosacharide ketens (Freeman et al., 2001).
Omdat er in de natuur meer dan veertig verschillende vormen van siaalzuur bestaan en omdat
siaalzuur op verschillende manieren kan binden op andere suikers en op zichzelf, is er een
enorme diversiteit aan siaalzuurderivaten en zijn siaalzuren uitermate geschikt voor de specifieke
herkenning van het celoppervlak (Nitschke et al., 2001; Munday et al., 1999). Deze eigenschap
Figuur 3. Chemische structuu
siaalzuur, fucose, glucose of g
hydroxyl groep; R3= Gal, GalN
o
OR1R1O
R1O
R2
OR1COOH
OR3
r van een siaalzuur. R1=acetyl, lactyl, methyl, sulfaat, fosfaat, anhydro,
alactose groep; R2= N-acetytl, N-glycolyl, N-glycolyl-O-acetyl, amino of
Ac, GlxNAc, Sialoadhesine of 5-O-Neu5Gc (Naar Varki, 1997).
Literatuurstudie 13
wordt benut door een ganse reeks van pathogene virussen, bacteriën en protozoa welke binden
met siaalzuur of siaalzuur van de cel overnemen als bescherming tegen vernietiging (Nitschke et
al., 2001). De term siaalzuur wordt dikwijls gelijkgesteld aan N-acetyl-neuraminezuur
(Neu5Ac), maar in feite is dit veel voorkomende siaalzuur, slechts een precursor van een familie
van meer dan 40 andere zure suikers (Varki, 1997).
1.3.2 Sialoadhesine en de siglec-familie
Sia behoort tot de superfamilie van de immunoglobulines (Ig; Freeman et al., 2001; van den
Berg et al., 2001), heeft een grote extracellulaire regio van 1619 aminozuren, een transmembrane
regio, en een korte cytoplasmatische staart van 35 aminozuren met daarop verschillende serine
en threonine fosforylatieplaatsen (Crocker et al., 1997). De vaststelling dat de sekwentie van Sia
opvallende gelijkenissen toonde met CD22, welke ook met siaalzuur bindt, deed het vermoeden
rijzen dat ook andere verwante receptoren zoals ‘myelin associated glycoprotein’ (MAG),
‘Schwann cell myelin protein (SMP)’, en CD33 siaalzuurbindende proteïnen waren (Munday et
al., 2000). Deze siaalzuurbindende proteïnen worden ‘siglecs’ genoemd (sialic acid-binding
immunoglobulin-like lectines of siaalzuurbindende lectines; Freeman et al., 2001; Brinkman-
Van der Linden et al., 2000; Munday et al., 1999). Omdat deze lectines ook deel uitmaken van
de superfamilie van immunoglobulines, worden zij ook I-lectines genoemd. Een typisch
kenmerk van alle siglecs is dat de expressie sterk weefsel- en celafhankelijk is en sterk
gereguleerd, wat er op wijst dat ze geen overlappende functie hebben (Crocker et al., 1999).
Behalve MAG (siglec-4a) en SMP (siglec-4b) die vooral aangetroffen worden in het centrale
zenuwstelsel, zijn alle siglecs betrokken bij de hemopoietische- en immuunsystemen (Crocker et
al., 1999; Munday et al., 1999). Omdat het expressiepatroon overeenkomt met de hoeveelheid
gevormd mRNA, gebeurt de regulatie waarschijnlijk op het transcriptieniveau (Crocker et al.,
1997).
Alle siglecs die tot dusver gekarakteriseerd zijn, hebben een analoge structurele opbouw
bestaande uit een V domein gevolgd door een aantal C2-Ig domeinen (Munday et al., 1999;
Crocker et al., 1999; Figuren 4 en 5). Sialoadhesine is het grootste lid van deze siglec-familie
met 16 C2 domeinen terwijl CD33 de kleinste is met slechts één domein (Brinkman-van der
Linden et al., 2000; Crocker et al., 1999; Figuur 5). Het V domein en het aangrenzende C2
domein hebben een sterk geconserveerd patroon van drie cysteïne residuen. Dit heeft tot gevolg
dat een intra-β-sheet disulfide brug ontstaat in het V-domein, welke uniek is voor deze Ig-familie
Literatuurstudie 14
F
C
F
(Vin
gevo
en h
��������
ATG
5’ UTR
LeiderPeptide
D1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17
V-SetSiaalzuurbindenddomein
C2-Set DomeinenTransmembraan
Regio
CytoplasmatischDomein
AAA+
3’ UTR AAA+
TGA
0 0,5 1kb
iguur 4. Schematische organisatie van het genoom van sialoadhesine-mRNA. (Aangepast naar
rocker et al., 1997)
Sialoadhesine
Siglec-1
CD22
Siglec-2
CD33
Siglec-3
MAG
Siglec-4a
OP-BP2
Siglec-5
OP-BP1
Siglec-6
P75AIRM1
Siglec-7
Siglec-8 Siglec-9
iguur 5. Schematische voorstelling van de siglec familie. (Aangepast naar Nitschke et al., 2001)
son et al., 1996). Daarnaast wordt ook een inter-β-sheet disulfide brug in het C2 domein
rmd (Crocker et al., 1997; Vinson et al., 1996). Een overzicht van de verschillende siglecs
un plaats van expressie wordt gegeven in Tabel 2 .
Literatuurstudie 15
Tabel 2. De verschillende siglecs en hun plaats van expressie (naar Freeman et al., 2001; Zhang et al.,
2000; Munday et al.,1999).
Siglec
Nr. Alternatieve naam Plaats van expressie
1 Sialoadhesine Bepaalde subsets van macrofagen
2 CD22 Uniek voor B-lymfocyten
3 CD33 Op niet-rijpe en op sommige rijpe
myeloiden waaronder macrofagen
4a ‘Myelin-associated glycoprotein’ (MAG) Zenuwstelsel
4b ‘Schwann cell myelin protein’ (SMP) Zenuwstelsel
5 OB-BP2 Rijpe myeloide cellen, sommige
macrofagen, neutrofielen en monocyten.
6 OB-BP1 Placentale trophoblasten en B-cellen
7 P75/AIRM1 Monocyten en ‘natural killer’ cellen
8 Eosinofielen, mast cellen en basofielen
9 Monocyten, neutrofielen, B cellen en
sommige T-cellen
Siglecs (behalve siglec-8; Nitschke et al., 2001) bevatten in hun cytoplasmatische staart een op
tyrosine gebaseerde, inhibitorische sekwentie (ITIM; Freeman et al., 2001; Zhang et al., 2000).
Men denkt dat receptoren die dergelijke motieven dragen, een inhibitorische werking hebben
wanneer ze crosslinken met activerende receptoren, welke een op tyrosine gebaseerd activatie
signaal (ITAM) bevatten (Zhang et al., 2000).
1.3.3 Herkenning van koolhydraten door siglecs
De plaats voor de binding van siaalzuur is beperkt tot het aminoterminale deel van het V-
domein. Dat domein is immers noodzakelijk en voldoende voor binding (van den Berg et al.,
2001; Crocker et al., 1999; Vinson et al., 1996). Het V-domein bestaat uit negen β-strengen (A
tot G) die samen twee ‘β-sheets’ vormen: de GFCC’C” en de ABED ‘sheet’ (Vinson et al.,
1996). Men heeft vastgesteld dat de binding van siaalzuur vooral afhangt van zes
Literatuurstudie 16
aminozuurresidu (Ile39, Tyr41, Asn95, Arg97, Arg105 en Asp108) gelegen als een cluster op de
GFCC’C” sheet en gecentreerd rond Arg97 dat op de F-streng gelegen is (Vinson et al., 1996;
Crocker et al., 1999). Het Arg97-resididu is geconserveerd in alle sialoadhesines en is cruciaal in
de herkenning van siaalzuur door sialoadhesines (Vinson et al., 1996). Uit kristallografie is
gebleken dat de carboxylgroep van siaalzuur een zoutbrug vormt met Arg97 en twee tryptofaan
residu’s (gelegen op de A en G β-sheet) zijn betrokken bij de hydrofobe interakties met de N-
acetyl en glycerol substituenten van neuraminezuur (Nitschke et al., 2001; Crocker et al., 1999;
Vinson et al., 1996)
Elk lid van de siglec familie heeft een welbepaalde voorkeur voor zowel het type siaalzuur als
voor de wijze waarop het gebonden is op het subterminale suikerresidu (Munday et al., 1999;
Crocker et al., 1999). Zo verkiest siglec-1 (Sia) net zoals siglec-3, α2,3 gebonden
sialyllactos(amine) boven de α2,6 gebonden vorm. Siglec-2 (CD22) bindt daarentegen alleen
α2,6 gebonden sialyllactosamines (Brinkman-Van der Linden, 2000; Munday et al., 1999;
Crocker et al., 1999). Siglec-4a vereist terminale α2,3 gebonden siaalzuren, siglec-5 bindt zowel
de α2,3 als de α2,6 vorm en de α2,8 vorm. De sialyl-Tn epitoop, (Neu5Acα2,6GalNAc) een
belangrijke merker voor kankercellen, kan herkend worden door siglec-2, 3, 5 en 6. Siglec-6 kan
naast suikers ook een proteïne herkennen, namelijk leptine (Brinkman-Van der Linden, 2000).
Bij de α2,3 binding wordt veelal op het onderliggende GlcNAc een fucose (fuc) residu gevonden
dat een negatieve invloed heeft op de bindingscapaciteiten van sialoadhesine (Binkman-Van der
Linden, 2000). Een overzicht van de bindingsspecificiteit verschillende siglecs wordt gegeven in
Tabel 3.
Literatuurstudie 17
Tabel 3. Overzicht van de bindingsspecificiteit van de verschillende
siglecs. (naar Nitschke et al., 2001; Brinkman-Van der Linden et al.,,2000)
Mogelijkheid tot herkennen van Siglec
Siaα2,6
Lac(NAc)
Siaα2,3
Lac(NAc)
Siaα2,6
GalNAc
(Sialyl-Tn)
Siaα2,8Sia
1 + ++ - +
2 ++ - ++ -
3 ++ + + -
4a - + - -
5 + + + +
6 - - + -
7 + + + nb
8 nb ++ Nb nb
9 + + + nb
-:geen affiniteit, +: grote specificiteit, ++: zeer grote
specificiteit
nb: data niet beschikbaar
1.3.4 Rol van cis-interakties
De meeste siglecs worden bestudeerd als opgezuiverde proteïnen. De bindingseigenschappen
van deze gezuiverde proteïnen kan echter grondig verschillen van siglecs die op de celmembraan
tot expressie komen (Nitschke et al., 2001). Dat verschil wordt toegeschreven aan het optreden
van cis-interakties op de celmembraan.
Siaalzuur wordt ook teruggevonden op de celmembraan, wat inhoudt dat vele siglec-
receptoren (die siaalzuur binden) in een siaalzuur-rijke omgeving tot expressie komen. Daardoor
kunnen cis-interakties optreden met endogene siaalzuren (Munday et al., 1999; Crocker et al.,
1997) en dit vermindert de mogelijkheid om exogene gesialyleerde liganden te binden (Nitschke
et al., 2001). Men denkt nu ook dat dit de reden is waarom Sia een zo groot aantal (17) Ig
Literatuurstudie 18
domeinen heeft, namelijk om ver boven de plasmamembraan uit te steken, en zo het inhibitorisch
effect van endogene siaalzuren te vermijden (Nitschke et al., 2001; Munday et al., 1999; Crocker
et al., 1997; Figuur 6). Deze evolutionaire verklaring wordt ook wel het ‘rainforest’ model
genoemd (Crocker et al., 1997).
Ong
evee
r 30
nm
Sialoadhesine CD22 CD33 Siaalzure
Siaalzuugradiën
Figuur 6. CIS-inhibitie van siaalzuurbindende plaatsen. De figuur toont aan hoe de extentie van
siaalzuurbindende sequenties, weg van de plasmamembraan, belangrijk is in cel-cel interakties.
Volgens dit model, bevinden de siaalzuur bindende sequenties van sialoadhesine zich ver van de
plasmamembraan, en zijn zo minder gevoelig aan CIS-inhibitie. Daarentegen worden de
bindingsplaatsen van CD33 volledig gemaskeerd door zijn relatief kleine afmeting. (Aangepast naar
Nitschke et al., 2001)
Literatuurstudie 19
1.4 Endocytose
1.4.1 Inleiding
Alle eukaryotische cellen kunnen macromoleculen, vaste deeltjes en vloeistoffen opnemen
vanuit het extracellulaire milieu waardoor zij in staat zijn voedingsstoffen op te nemen en een
homeostatisch evenwicht te handhaven (Lodish et al., 2001; Benmerah et al., 1998; Mellman
1996; Alberts et al., 1994). Ook voor interakties met de buitenwereld en de overdracht van
neurale, metabolische en proliferatieve signalen is internalisatie onontbeerlijk, net als voor het
opruimen van apoptotische cellen, opname van pathogenen en antigen presentatie en zelfs voor
gentranscriptie (Bild et al., 2002; Marsh & McMahon, 1999; Mellman, 1996).
Men kan in hoofdzaak onderscheid maken tussen fagocytose en endocytose. Fagocytose
(macropinocytose) is een actine-gemedieerd proces waarbij cellen, bacteriën en andere grote
partikels van meer dan 0,5 µm geïnternaliseerd worden. Nadat specifieke partikels zoals
bacteriën gebonden zijn op de membraanreceptoren, vindt in de cel eerst een lokale
polymerisatie van actine plaats op de plaats van de receptorbinding, waarna de cel pseudopodiën
uitstulpt die het deeltje omhullen en internaliseren (Sieczkarski & Whittaker, 2002a; Beningo en
Wang, 2001; Mellman, 1996). Bij endocytose daarentegen stulpt een kleiner deel van de
celmembraan in, dat dan afsplitst en een intercellulair vesikel vormt van 50 tot 100 nm groot
(Lodish et al., 2001). Recent onderzoek heeft aangetoond dat verschillende proteïnen betrokken
bij endocytose ook met actine geassocieerd zijn, en dat actine receptorgemedieerde endocytose
vergemakkelijkt. Echter, disruptie van de actine filamenten verstoort niet altijd het
endocytoseproces (Schafner et al., 2002; Qualman et al., 2000). Er wordt gedacht dat
actinepolymerisatie de kracht levert voor de invaginatie van de celmembraan en transport van de
geïnternaliseerde vesikels (Schafner, 2002). Hoewel er ook een constitutieve vorm van
endocytose bestaat (pinocytose), waarbij cellen kleine vloeistofdruppeltjes met de daarin
opgeloste stoffen opnemen (Royle et al., 2003; Lodish et al., 2001; Gaidarov et al., 1999), wordt
in wat volgt vooral aandacht besteed aan de receptorgemedieerde endocytose, en meerbepaald de
clathrine gemedieerde vorm.
Literatuurstudie 20
1.4.2 Receptorgemedieerde endocytose
1.4.2.1 Inleiding
Er bestaan in hoofdzaak drie vormen van receptor gemedieerde endocytose: endocytose via
clathrine, via caveolae of via een clathrine en caveolae onafhankelijk proces (Sieczkarski &
Whittaker, 2002a). De best gekende vorm van endocytose is de receptorgemedieerde endocytose
waarbij clathrine-mantels rond de vesikels gevormd worden (Figuur 7) en deze werd in 1964
voor het eerst beschreven door Roth en Porter (Roth & Porter, 1964). Omdat deze vesikels ook
een deel extracellulaire vloeistof opnemen, wordt dit proces ook wel vloeibare-fase endocytose
(fluid–phase endocytosis) genoemd of micropinocytose (Alberts et al., 1994). Deze vorm van
endocytose is uitvoerig bestudeerd geweest aan de hand van de low density lipoproteïne-receptor
(LDL) en de transferrinereceptor.
ee
zij
(M
tyr
hy
be
Figuur 7. Elektronenmicroscopische opname van de vorming van ‘clathrin coated pits’ op de
plasmamembraan met afsplitsing van een intercellulair vesikel en endocytose van LDL (low density
lipoprotein). (Uit Alberts et al., 1994)
Niet constitutieve, receptorgemedieerde endocytose via clathrine begint met de binding van
n ligand op een membraanreceptor. Deze laatste bevat één of meerdere signaalsekwenties in
n cytoplasmatische staart die het mogelijk maakt dat de receptor opgenomen wordt in de cel
ellman, 1996). Men kan onderscheid maken in vier belangrijke signalen, namelijk een op
osine gebaseerd signaal, voornamelijk van de vorm FxNPxY of Yxxφ (met φ een groot
drofoob aminozuur; x een willekeurig aminozuur, maar Y+2 is meestal R), een dileucine
vattend signaal, een gefosforyleerd serine-rijk domein op het COOH-uiteinde van vele ‘GTP-
Literatuurstudie 21
binding protein coupled receptors’ (GPCR) en motieven die gepaard gaan met ligand
geïnduceerde fosforylatie van serine residu’s (Pearse et al., 2000; Marsh et al., 1999; Mellman,
1996). Echter, de aanwezigheid van dergelijk signaal geeft nog geen garantie op internalisatie.
Het signaal moet ook een bepaalde conformatie aannemen om actief te zijn (Bonifacino et al.,
1999). De binding van een ligand zorgt ervoor dat receptoren dimeren vormen (Lodish et al.,
1999) waarna de celmembraan invagineert en vesikels worden afgesnoerd die omhuld worden
door clathrine (Mellman, 1996).
Caveloae (of caveosomen) worden ook geïnternaliseerd vanaf de plasmamembraan, zijn rijk
aan glycosfingolipiden en cholesterol en worden gekarakteriseerd door de aanwezigheid van het
integrale membraan proteïne caveaoline (21 kDa) (Pelkmans & Helenius, 2002; Thomsen et al.,
2002). De vorming van caveolae komt hoofdzakelijk voor bij celstimulatie en het ganse proces is
trager dan bij clathrine gemedieerde endocytose (Sieczkarski et al., 2002a; Marsh & Pelchen-
Matthews, 2000). De stimulatie kan de bijvoorbeeld de binding zijn van een virus of bacterie op
de cel. Een bijkomend verschil is dat caveosomen niet de endosoom – lysosoom pathway volgen,
en bijgevolg dus niet verzuren (Thomsen et al., 2002).
Naast de clathrine gemedieerde endocytose en caveolae, bestaat er nog een slecht
gedefinieerde route die onafhankelijk is van voorgaande processen. (Nichols & Lippincott-
Schwarz, 2001; Bishop, 1997). Zoals bij caveolae, is het erg waarschijnlijk dat deze pathway
sterk geassocieerd is met de aanwezigheid van detergent-resistente microdomeinen op de
plasmamembraan. De interleukine-2 (IL-2) receptor is waarschijnlijk de best gekarakteriseerde
merker voor deze pathway (Sieczkarski & Whittaker, 2002a; Lamaze et al., 2001). Een andere
cholesterol gevoelige pathway kan materiaal direct naar het Golgi-apparaat vervoeren, zonder
langs vroege endosomen te passeren (Nichols et al., 2001).
Literatuurstudie 22
1.4.2.2 Eiwitten betrokken bij de eerste stappen in receptor gemedieerde endocytose via
clathrine
1.4.2.2.1 Adaptor proteïnen (AP)
AP2 (~300 kDa) is een adaptorproteïne dat bestaat uit vier subeenheden die ook wel adaptines
genoemd worden: twee grote eenheden van 100 kDa (α en β-adaptine), een kortere keten van 50
kDa (µ2-adaptine) en een kleine keten van 20 kDa (σ2-adaptine) (Pearse et al., 2000; Wakeham
et al., 2000; Marsh et al., 1999; Benmerah et al., 1998; Clague, 1998). AP2 heeft de vorm van
een blok waar het COOH-uiteinde van de α en β units als oren uitsteken (Figuur 8; Marsh et al.,
1999).
Figuur 8. Schemati
aangeduid en tevens
Het Yxxφ- motief in
de µ2 subeenheid van
et al., 1996). Andere
clathrine en met β-adap
De α-keten zorgt er
en lijkt de werking v
celmembraan bevinden
Bovendien bindt α-ada
dynamine op de plas
COOH COOH
µ2
NH2 NH2σ2
α β
sche structuur van AP2. Op deze figuur werden de α, β, µ2 en σ2 keten
het COOH en NH2 terminale deel van de α en β keten. (Naar Clague, 1998)
de staart van receptoren, bindt in een uitgestrekte toestand rechtstreeks op
AP2 (Boll et al., 2002; Conner et al., 2002; Bonifacino et al., 1999; Ohno
motieven zoals het dileucine motief kunnen rechtstreeks binden met
tine van AP2 (Royle & Murell-Lagnado, 2003).
waarschijnlijk voor dat AP2 gelokaliseerd wordt op de plasmamembraan
an AP2 te regelen door interakties met fosfoinositides die zich op de
(Benmerah et al., 1999; Benmerah et al., 1998; Beck & Keen, 1991).
ptine met verscheidene andere proteïnen zoals amphiphysine (lokaliseert
mamembraan; Wigge et al., 1997), Eps15 (lokaliseert AP2 naar de
Literatuurstudie 23
plasmamembraan; Benmerah et al., 2000), epsine (lokaliseert Eps15 naar de plasmamembraan;
Benmerah et al., 2000), AP180 (induceert de vorming van clathrine triskelions; Morris et al.,
1993) en auxiline (begeleid Hsc70 naar de clathrine mantels; Ungewickell et al., 1997). De β-
keten bindt met clathrine (Clague, 1998; Benmerah et al., 1998). De rol van de σ2-subeenheid is
minder duidelijk, maar deze zou er voor zorgen dat µ2-eenheid correct gepresenteerd wordt voor
binding met de endocytosemotieven (Pearse et al., 2000).
Naast AP2 zijn er ook de adaptorproteïnen AP1, AP3 en AP4 die allen homologen van elkaar
zijn (Pearse et al., 2000). Terwijl AP2 een rol speelt bij vesikelvorming op de plasmamembraan,
is AP1 betrokken bij clathrine gemedieerde vesikelvorming op het trans-Golgi-netwerk (TGN)
(Obermüller et al., 2002; Pearse et al., 2000; Mellman 1996). AP3 speelt een rol in het transport
tussen het Golgi-apparaat en de lysosomen en recent werd aangetoond dat AP3 ook een rol speelt
bij de vorming van kleine synaptische vesikels vanaf endosomen (Pearse et al., 2000; Clague,
1998). Over de rol van AP4 is weinig gekend.
Een andere groep proteïnen die clathrine verbinden met proteïnen aan het celoppervlak zijn
arrestines, en komen vooral voor bij ‘G-protein coupled receptors’ (GPCR). Binding van β-
arrestines met GPCR koppelt de receptor los van het heterotrimere G-proteïne en lokaliseert de
receptor naar een ‘clathrin coated vesicle’ (CCV). Bovendien speelt β-arrestine ook een rol in de
signaaltransductie (Luttrell & Lefkowitz, 2002).
1.4.2.2.2 EPS15
Eps15 is een eiwit dat constitutief geassocieerd is met het AP2-complex en bestaat uit drie
structurele domeinen (Benmerah et al., 1998). Een eerste domein, DI, wordt nog eens
onderverdeeld in drie Eps15-homologie-domeinen (EH-domeinen) (Benmerah et al., 1999). DII
is belangrijk voor oligomerisatie van Eps15 (Cupers et al., 1997) en DIII zorgt voor de binding
met AP2 via α-adaptine (Benmerah et al., 1999). Bij mutantanalyse is gebleken dat de drie EH-
domeinen essentieel zijn voor een correcte lokalisatie van Eps15 zelf, maar ook van clathrine,
AP2 en dynamine op de plasmamembraan (Benmerah et al., 1999). Eps15 is dus essentieel
tijdens het endocytoseproces. De drie EH-domeinen kunnen interakties aangaan met andere
proteïnen die een asparagine-proline-fenylalanine (NPF) motief bevatten (Benmerah et al.,
1998). Epsine is zo’n NPF-bevattend proteïne dat zich aan de cytosolische zijde van de
plasmamembraan bevindt (Benmerah et al., 1999). De rol van epsine bestaat er in Eps15 aan de
Literatuurstudie 24
plasmamembraan te koppelen, terwijl Eps15 zelf er voor zorgt dat AP2 op de plasmamembraan
wordt gelokaliseerd (Benmerah et al., 2000).
1.4.2.2.3 Manteleiwitten
De manteleiwitten van de vesikels zorgen ervoor dat de donormembraan vervormt en dat er
vesikels kunnen gevormd worden (Figuur 14, pag. 34). De drie best bekende manteleiwitten zijn
coat-protein-I (COPI), COPII en clathrine. COPI mantels zijn vooral geassocieerd met het
transport van het Golgi-apparaat naar het endoplasmatisch reticulum (ER) en andere stadia in het
endosomale en Golgisysteem. COPII eiwitten zijn betrokken in het transport van het ER naar het
Golgi-apparaat (Marsh et al., 1999).
Clathrine-mantels zijn betrokk
vanaf de plasmamembraan naar d
endosomen (Marsh et al.,1999). D
takken en worden daarom triskel
1999). Elke tak bestaat uit een li
(Lafer, 2002; Wakeham et al.
rangschikken om een clathrine m
(Figuur 10). Hiervoor zijn minsten
keten (Figuur 9), is naar de binne
Bijgevolg bestaat een door clathrin
Figuur 9. Structuur van een clat
(Aangepast naar Lodish et al., 199
hrine triskelion bestaande uit drie lichte en drie zware ketens.
9)
en bij twee processen: de receptorgemedieerde endocytose
e vroege endosomen en het transport van het TGN naar de
e clathrine eiwitten die de mantels vormen bestaan uit drie
ions genoemd (Figuur 9) (Lodish et al., 2001; Marsh et al.,
chtere keten (22-28 kDa) en een zwaardere keten (192 kDa)
, 2000). Verschillende triskelions kunnen zich onderling
antel of kooi te vormen rondom de geïnvagineerde vesikels
s zestig triskelions vereist. Het terminale deel van elke zware
nkant van de kooi gericht (Figuur 10) en bindt daar met AP2.
e omhuld vesikel, respectievelijk van buiten naar binnen, uit 3
Literatuurstudie 25
verschillende lagen: d
al., 1998). De HUB-d
vormen en binden de l
Figuur 10. Verschille
vijf triskelions gekle
met de AP2 complex
1.4.2.2.4 Dynamine
Nadat de clathrine k
van dynamine (Hill et
een 100 kDa GTPase
1997) die zich in de h
(Hill et al., 2001; Fi
dynamineI (DI) en dyn
DI is specifiek voo
(Achiriloaie et al., 19
vanaf de plasmamem
(Nicoziani et al., 2000
van de plasmamembra
immers op dynamine
domeinen van dynami
nde triskelions vormen een clathrine kooi. In deze figuur (resolutie 21Å) werden
urd. Het terminale uiteinde van elk triskelion is naar binnen gericht en bindt
en (zie pijltjes voor de gele triskelion). (aangepast naar Marsh et al., 1999)
e triskelion laag, de terminale domeinen, en AP2-laag (Figuur 10; Smith et
omeinen, bestaande uit het C-terminale deel van clathrine, kunnen trimeren
ichte ketens (Greene et al., 2000; Nathke et al., 1992).
ooi gevormd is wordt deze van de plasmamembraan afgesplitst met behulp
al., 2001; Marks et al., 2001; Sever et al., 2000; Achiriloaie et al., 1999),
met een homotetramere structuur (Wakeham et al., 2000; Muhlberg et al.,
als bevindt tussen het nog niet afgesplitste vesikel en de plamamembraan
guur 11B). Er zijn twee soorten dynamines die goed beschreven zijn,
amineII (DII) (Achiriloaie et al., 1999).
r neuronen en het DII is betrokken bij receptor gemedieerde endocytose
99). De belangrijkste functie van dynamine is het afsnoeren van vesikels
braan, (Hill et al., 2001; Sever et al., 2000) maar ook vanaf endosomen
). Anderzijds is dynamine ook onrechtstreeks betrokken bij de invaginatie
an: endophiline, een eiwit dat de plasmamembraan concaaf maakt, bindt
(Sever et al., 2000). Figuur 12 geeft schematisch de verschillende
ne weer en hun rol in het endocytoseproces.
Literatuurstudie 26
Figuur 11. Model voor de
vorming van clathrin coated
vesicles. Na de binding van
adaptor proteinen gaat
clathrine polymeriseren (A).
Daarna gaat ook dynamine
polymerisren (B) en na
hydrolyse van GTP splitst
het vesikel af van de
plasmamembraan (C)
(aangepast naar Lodish et
al., 1999) .
Het N-terminale deel van dynamine bevat het GTPase domein en het C-terminale deel een
proline-arginine rijk domein (PRD). (Figuur 12; Marks et al., 2001; Muhlberg et al., 1997).
Daartussen liggen nog twee andere domeinen, namelijk het pleckstrin homologie domein (PH)
en het GTPase effector domein (GED) (Marks et al., 2001). Het PH-domein bindt met PI(4,5)P2
bevattende lipiden (Archiriloaie et al., 1999) en het GED-domein zou betrokken zijn in
oligomerisatie van dynamine en in de activatie van het GTPase-domein (Marks et al., 2001;
Achiriloaie et al., 1999; Muhlberg et al., 1997). Het PRD domein bevordert de spontane
opplooing van dynamine in ringen en spiralen en verscheidene proteinen zoals amphiphysine en
endophiline binden op dit domein via hun SH3-domein. Amphiphysine is verondersteld
betrokken te zijn bij de localisatie van dynamine op de plasmamembraan (Hill et al., 2001). De
zelfopplooing van dynamine stimuleert meteen ook de GTPase activiteit. Deze GTPase-
activiteit, evenals de daarbij behorende conformatie verandering, is onontbeerlijk voor de
werking van dynamine (Hill et al., 2001; Marks et al., 2001; Muhlberg et al., 1997). Omdat deze
conformatie verandering zowel een verkorten als een verlenging van de spiralen kan inhouden
(Sever et al., 2000) wordt er verondersteld dat dynamine een mechanische functie heeft (Hill et
al., 2001; Marks et al., 2001). Ofwel zou door een verkorten van de spiralen, de hals waarmee de
vesikels nog vasthangen aan de plasmamembraan, afgesnoerd worden, ofwel zou door een
toenemende afstand tussen de spiralen de vesikels van de membraan weggeduwd en
Literatuurstudie 27
afgescheiden wor
regulator is die a
afsplitsing van de
nog altijd niet dui
Figuur 12. Schema
ze interageren en h
1.4.2.2.5 HSC70
Na het vormen
celmembraan en
B, pag. 34; Newm
proteïnen en we
verwijderen van C
van Hsc70. Het o
en Schmid, 2001)
GTPase PH GED PRD1 300 510 633 746 864
Bindt metPI(4,5)P2bevattendelipiden
Oligomerisatie
Activatie
Spontane opplooing,binding metamphiphysine enendophiline
tische voorstelling van de verschillende domeinen in dynamine, de doelwitten waarmee
un rol bij endocytose. Onder de domeinen staat het aminozuurnummer vermeld.
den (Sever et al., 2000). Een ander mogelijkheid is dat dynamine enkel een
ndere proteïnen recruteert, die op hun beurt verantwoordelijk zijn voor de
vesikels (Hill et al., 2001). De precieze werking van dynamine is tot op heden
delijk.
van een clathrin coated vesicle (CCV) wordt het vesikel afgesplitst van de
worden de manteleiwitten terug verwijderd met behulp van Hsc70 (Figuur 14
yer en Schmid, 2001). Hsc70 is een eiwit dat verwant is met de ‘heat shock’
rkt ATP-afhankelijk. Hsc70 is bovendien noodzakelijk om ook AP2 te
CV. Auxilin lokaliseert Hsc70 naar de CCV en stimuleert de ATPase activiteit
ntmantelingproces heeft een halfwaardetijd van één à twee minuten (Newmyer
.
Literatuurstudie 28
1.4.2.3 Klassieke endosoom – lysosoom pathway
1.4.2.3.1 De verschillende vesikels
Over de manier waarop de ontmantelde vesikels omvormen tot vroege endosomen (early
endosome; EE), lopen de meningen uiteen. Volgens een eerste model – het ‘endosome
maturation model’ (EMM) - worden vroege endosomen de novo gevormd, waarschijnlijk door
samensmelten van verschillende ontmantelde CCV (Figuur 14 C2). Volgens een tweede model –
het ‘vesicular traffic’ model (VTM) - vormen de vroege endosomen een stabiele, reeds bestaande
pool in de cel, die in dynamisch evenwicht wordt gehouden door een voortdurende opname en
afgifte van eiwitten (Figuur 14 C1; Pillay et al., 2002; Clague, 1998; Thilo et al., 1995). Volgens
Thilo et al. is het EMM het meest waarschijnlijk. De vroege endosomen zijn kleiner dan 100 nm
en hebben een levensduur van ongeveer één minuut (Gu & Gruenberg, 1999). Vroege
endosomen hebben een licht zure pH (pH 6,3- pH 6,8; Mellman, 1996) veroorzaakt door de
aanwezigheid van V-type ATPasen op de membraan van de endosomen (Forgac, 2000).
Daardoor wordt dissociatie van receptor en ligand mogelijk (Pillay et al., 2002; Luzio et al.,
2000; Sheff et al., 1999). Door het scheiden van receptor en ligand, heeft een vroeg endosoom
een sorterende functie en wordt daarom ook wel ‘sorting endosome’ genoemd (Pillay et al.,2002;
Clague, 1998). De receptoren en andere membraanproteïnen accumuleren in de tubulaire
extenties van de EE en de oplosbare componenten in de vesiculaire regio’s (Figuur 14 D;
Mellman, 1996). De meerderheid van de receptoren wordt daarna gerecycleerd naar de
membraan door middel van ‘recycling endosomes’ (RE), terwijl de minderheid van de
receptoren naar het lysosomale compartiment worden meegevoerd (Figuur 14 E; Luzio et al.,
2002; Gu & Gruenberg, 1999), waarop eventueel nog een ligand gebonden is (Pillay et al.,
2002). RE ontstaan uit de tubulaire extenties van EE. Sommige RE fusioneren direct met de
plasmamembraan (perifere RE), terwijl anderen (perinucleaire RE) eerst in het perinucleaire
cytoplasma accumuleren waar ze een intracellulaire pool van receptoren vormen waarvan de
functie onduidelijk is (Daro et al., 1996).
De twee modellen van vesikel transport, namelijk het EMM en het VTM, stellen dat transport
tussen vroege en late endosomen (‘late endosomes’, LE of ook wel pre-lysosomale
compartimenten genoemd), gebeurt door vorming van een intermediair vesikel, ook wel
‘endosomal carrier vesicle’ genoemd (ECV; Piper & Luzio, 2001). Alleen over het ontstaan van
Literatuurstudie 29
dat vesikel lopen de meningen uiteen. Volgens het EMM is dat intermediair wat rest van een EE
nadat verschillende componenten verwijderd zijn uit dat vroege endosoom (Figuur 14 F2),
terwijl in het VTM dit ECV ontstaan door ‘budding’ vanaf een EE (Figuur 14 F1; Piper & Luzio,
2001). De pH van deze intermediaire vesikels zakt tot 5,5 à 5 (Pillay et al., 2002).
LE onderscheiden zich van EE door hun zuurdere pH (± pH 5), hun meer sferische vorm en
hun multivesikulair karakter. LE zijn ook groter zijn dan EE (± 0.5 µm) en hebben een veel
langere levensduur (15-30 min). Het onderscheid met lysosomen is dat LE twee types mannose-
6-fosfaat receptoren (MPR) bevatten terwijl lysosomen er geen bevatten (Piper & Luzio, 2001;
Mellman, 1996). LE bevatten reeds lysosomale hydrolasen en lijken zo het degradatieproces in
gang te zetten (Mellman, 1996). De precursoren van de hydrolasen worden, gebonden op een
MPR, naar de endosomen gebracht door een CCV, ontstaan op het TGN (Pillay et al., 2002; Gu
& Gruenberg, 1999). In de lysosomen worden zij omgezet in hun actieve vorm (Pillay et al.,
2002).
Het EMM kan geen voldoende verklaring geven voor de biosynthese van lysosomen noch
voor de aflevering van proteïnen vanuit LE naar de lysosomen (Luzio et al., 2000). Zowel in
vitro als in vivo is bewezen dat zowel tussen LE onderling als tussen LE en lysosomen als tussen
lysosomen onderling er uitwisseling kan gebeuren van membraanproteïnen en van de inhoud van
de vesikels (Piper & Luzio, 2001; Luzio et al., 2000). Luzio et al. toonde aan dat transport tussen
LE en lysosomen gebeurt door fusie van LE met lysosomen, met vorming van een hybride
organel (Figuur 14 H; Luzio et al., 2000, Mellman 1996). De hybride organellen gaan
vervolgens hun inhoud degraderen en zullen in dichtheid toenemen omdat verteerbaar materiaal
verwerkt wordt, katabolische producten vrijgesteld en het niet-verteerbaarbaar materiaal
geconcentreerd wordt (Figuur 14 I; Mellman, 1996). Op die manier worden opnieuw lysosomen
gevormd door ‘rijping’ van de hybride organellen (Piper & Luzio, 2001; Luzio et al., 2000). De
lysosomale pH bedraagt tussen de 4,5 en 5 (Pillay et al., 2002). Lysosomen mogen niet
beschouwd worden als het eindpunt van de pathway, aangezien secretorische lysosomen kunnen
fusioneren met de celmembraan wat resulteert in exocytose van de lysosomale inhoud (Pillay et
al., 2002).
De endolysosomale membranen bestaan hoofdzakelijk uit ‘lysosome-associated membrane
proteins’ (LAMP), die de membraan beschermen tegen hydrolyse en er dus voor zorgen dat de
hydrolasen niet lekken naar het cytoplasma (Obermüller et al., 2002; Pillay et al., 2002).
Literatuurstudie 30
1.4.2.3.2 De klassieke endosoom-lysosoom pathway wordt gecoördineerd door Rab-GTPasen.
Rab proteïnen zijn kleine GTPasen die in alle eukaryoten voorkomen en vesikulair transport
regelen in zowel endo- als exocytose. Rab proteïnen zitten door middel van een isoprenyl motief
op de membraan van vesikels gebonden en kunnen zo het koppelen en verenigen van twee
vesikels controleren (Seabra et al., 2002; Rodman et al., 2000; Pfeffer et al., 1995). Zoals andere
GTPasen worden Rab-proteïnen verondersteld moleculaire schakelaars te zijn die wisselen
Tabel 4. Overzicht van de endosomale Rab-proteinen.
Rab Intracellulaire lokalisatie Functie Referentie(s)
Rab4 EE en perifere RE Receptor recycleren naar PM Daro et al.,1996
Rab5 CCV en EE Internalisatie en EE fusies Christoforidis et al.,1999;
Mclauchlan et al., 1998
Rab7 LE Transport van EE naar LE Mukhopadhyay et al., 1997
Rab9 LE Transport van LE naar TGN Riederer et al., 1994
Rab11 Golgi en RE Exocytose vanaf golgi via
endosomen / Apikale en
basolaterale recyclage van de
receptor.
Calhoun et al., 1998; Chen et
al.,1998
Rab 15 EE en RE Inhibitie van internalisatie Zuk & Elferink, 2000
Rab17 Epitheel specifiek; apikale
RE
Transport via apikale RE Hunziker & Peters, 1998
Rab18 Epitheel specifiek; EE,
RE, PM
Recyclage van E naar PM Lütcke et al., 1994
Rab20 Epitheel specifiek;
Apikale EE
Onbekend Lütcke et al., 1994; Olkkonen
& Stenmark, 1997
Rab22 E, PM Onbekend Olkkonen et al., 1993
Rab24 ER, Golgi, LE Onbekend Olkkonen et al., 1993
Rab25 Epitheel specifiek; apikale
RE
Transport via apikale RE Casanova et al., 1999
Afkortingen: E: endosomen; EE: early endosome; RE: Recycling endosome; CCV: clathrin coated
vesicle; LE: Late endosome; PM: plasmamembraan; ER: endoplasmatisch reticulum; TGN: Trans-
Golgi netwerk
Literatuurstudie 31
tussen een actieve, GTP-gebonden, en inactieve, GDP gebonden vorm (Seabra et al., 2002;
Pfeffer et al., 1995). In actieve vorm lokaliseren Rab een diverse groep van proteïnen, effector-
proteïnen genoemd, op de cytoplasmatische zijde van de membraan.
De evolutionair geconserveerde Rab komen praktisch in alle celtypes en weefsels tot expressie
en regelen het fundamenteel transport. De minder geconserveerde families zijn meer betrokken
bij gespecialiseerde pathways (Seabra et al., 2002). Momenteel zijn er al zo’n zestig
verschillende Rab-proteïnen gekend, en elk Rab-proteïne blijkt specifiek geassocieerd te zijn met
een specifiek organel of pathway. Van die zestig proteïnen zijn er echter maar een aantal in detail
gekarakteriseerd (Seabra et al., 2002; Rodman et al., 2000). Er zijn ook aanwijzingen dat Rab
genen alternatieve splicing kunnen ondergaan waardoor verschillende isovormen ontstaan
(Seabra et al., 2002). Een overzicht van de verschillende Rab-proteïnen wordt gegeven in Tabel
4 en de endosomen waarmee de Rab proteïnen geassocieerd zijn worden in Figuur 14
voorgesteld.
Transportvesikels dragen GTP-gebonden, actieve Rab met zich mee (Pfeffer et al., 1995). Rab
proteïnen blijven tijdens het transport in deze actieve toestand door middel van een reeks
proteïnen die interageren met de Rab (Schimmöller et al., 1998). Tijdens of na de fusie worden
de Rab proteïnen terug omgezet in hun inactieve vorm (Figuur 13; Pfeffer et al., 1995), waarna
de effector-proteïnen van de Rab dissociëren en de Rab zelf kunnen dan losgekoppeld worden
van de membraan en gerecycleerd naar een donorcompartiment met behulp van Rab GDP
dissociation inhibitor (RabGDI; Seabra et al., 2002). Het RabGDP-GDI complex wordt herkend
door de donor membraan door een GDI displacement factor (GDF; Seabra et al., 2002).
Rab5 is belangrijk bij de initiële stappen van endocytose, meer bepaald het afzonderen van
liganden in CCVs en de daaropvolgende fusie van de vesikels met vroege endosomen
(Christoforidis et al.,1999a; McLauchlan et al., 1998). Overexpressie van Rab22 geeft
aanleiding tot de vorming van abnormaal grote endosomale structuren in de perinucleaire regio,
een fenomeen analoog met overexpressie van Rab5. Deze abnormaal grote vesikels zouden het
resultaat kunnen zijn van een hyperefficiënte fusie of clustering van vroege endosomen. De
colokalisatie van Rab22 en late endosomen doet het vermoeden rijzen dat Rab22 gerelateerd is
met transportvesikels die materiaal van vroege naar late endosomen overbrengen (Olkkonen et
al., 1993). Rab15 is een buitenbeentje in de Rab-proteïnen omdat overexpressie van Rab15 geen
aanleiding geeft tot een verhoogde opname van extracellulaire liganden. Rab15 maakt de
Literatuurstudie 32
werking van
2000).
Figuu
GDP
lokal
trans
GDI
GDI
naar
nucle
2000
De direct
is ook betro
efflux van v
de dissocia
GDI
RabGDP
GDI
RabGDP
RabGDP
GDF
RabGTP
GDI
Fusiecompartiment
Donorcompartiment
r 13. Werking van GDI: Na fusie van de vesikels wordt Rab-GTP omgezet naar Rab-
. Vrij cytosolisch GDI maakt geprenyleerd Rab-GDP vrij uit de membraan. GDI
iseert geprenyleerd Rab-GDP naar een nieuwe donormembraan waar nieuwe
portvesikels zullen ontstaan. De Rab-GDP-GDI complexen worden herkend door een
displacement factor (GDF). Terwijl Rab-GDP zich associeert met de membraan wordt
terug vrijgesteld en gerecycleerd naar het cytoplasma. Rab-GDP wordt terug omgezet
Rab-GTP door uitwisseling van nucleotiden door een membraangebonden Rab
otide uitwisselaar (GEF; niet op figuur weergegeven). (Aangepast naar Rodman et al.,
en Pfeffer et al., 1995)
Rab5 ongedaan en inhibeert de initiële processen van internalisatie (Zuk & Elferink,
e recyclage van receptoren naar de plasmamembraan is Rab4 afhankelijk, maar Rab4
kken bij reclyclage via perinucleaire endosomen. Rab4 en Rab5 blijken dus de in- en
roege endosomen te regelen (Rodman et al.,2000). Overexpressie van Rab4 inhibeert
tie van ijzer van de transferrine receptor. Waarschijnlijk gebeurt dit doordat
Literatuurstudie 33
geïnternaliseerde transferrine-receptoren foutief gelokaliseerd worden naar niet verzuurde
vesikels. Rab4 is enkel terug te vinden in vroege endosomen en perifere RV, en niet in
perinucleaire RV en kan bijgevolg gebruikt worden om onderscheid te maken tussen EE en
perinucleaire RV (Daro et al., 1996).
Een ander Rab-proteïne dat belangrijk is bij de recyclage van receptoren is Rab11. Rab11
werd teruggevonden op RE en het Golgi-apparaat (Chen et al., 1998) en zou een kritische factor
zijn op het ogenblik dat de receptor de RE moet verlaten (Calhoun et al., 1998). Bovendien is
gebleken dat Rab11 ook exocytotose het Golgi-apparaat via endosomen regelt (Rodman et al.,
2000). Geïnternaliseerde moleculen kunnen op minstens twee manieren naar het golgi-apparaat
getransporteerd worden. Een eerste mogelijkheid is transport van RE of EE naar het Golgi-
apparaat. Het daarmee geassocieerd Rab proteïne is echter nog onbekend (Ghosh et al.,1998;
Mallard et al., 1998). Een tweede pathway naar het golgi-apparaat verloopt via LE en is
geassocieerd met Rab9 (Riederer et al., 1994).
Dominant negatieve mutanten van Rab7 hebben een sterk inhiberend effect op transport van
vroege naar late endosomen, wat er op wijst dat Rab7 essentieel is voor dit transport
(Mukhopadhyay et al., 1997).
Een aantal epitheel specifieke Rab-proteïnen (Rab17, Rab18, Rab 20 en Rab 25)
vergemakkelijken endocytotisch transport naar apikale en basolaterale plasmamembranen
(Casanova et al., 1999; Hunziker & Peters, 1998; Lütcke et al., 1994). Over de functie van
Rab18 en Rab20 is weinig geweten (Lütcke et al., 1994). Rab17 en Rab25 reguleren receptor
gemedieerde transcytose1 en transport door apikale RE (Hunziker et al., 1998).
1 Transcytose is een pathway die de apikale en basolaterale endocytotische systemen verbindt.
Literatuurstudie 34
Budding
Eiwitten ,…
EE
ECV
Lysosoom
GefusioneerdLE
RE
Hsc70
Plasmamembraan
Receptor Ligand
Clathrine
CCV
Ontmanteld CCV
EE-Pool
Naarperinucleaireregio
LE
A
B
C1
C2
D
E
F1
F2
G
Rab5
Rab5Rab4Rab15
Rab4Rab11Rab15
Rab9Rab7Rab24
Figuur 14. Overzicht van de verschillende endosomen en hun geassocieerde Rab proteïnen. (A) Na binding van de ligand
op de receptor worden de receptoren geïnternaliseerd en wordt een clathrine mantel gevormd rond het groeiend vesikel.
(B) Nadat een CCV gevormd is, wordt het vesikel terug ontmanteld met behulp van Hsc70. De clathrine triskelions
worden gerecycleerd. (C1) Volgens het ‘vesicular traffic model’ smelt het ontmantelde CCV samen met een reeds
b pool van vroege endosomen en vormt zo een ‘early endosome’. (C2) Volgens het ‘endosome maturation model’
w
s
t
g
v
v
f
e
k
estaande
Vesicular traffic modelEndosome maturation model
Gemeenschappelijke pathway
Lysosoom / LEhybriede
Katabolischeprodukten
Naarplasmamembraan(exocytose)
H
I
ordt een ‘early endosome’ de novo gevormd door samensmelten van verschillende ontmantelde CCV. Vervolgens
cheiden receptor en ligand zich door de zure pH van het ‘early endosome’. (D) Daarna accumuleren de receptoren in de
ubulaire extenties van het ‘early endosome’. (E) Deze receptoren verzamelen zich in een ‘recycling vesicle’, en worden
erecycleerd naar de plasmamembraan. (F1) Volgens het ‘vesicular traffic model’ onstaat dan door budding vanaf de rest
an het ‘early endosome’ een ‘endosomal carrier vesicle’. (F2) In het ‘endosome maturation model’ gebeurt de vorming
an een ‘endosomal carrier’ door het verwijderen van een aantal componenten uit het ‘early endosome’. (G) Daarna
usioneert het ‘endosomal carrier vesicle’ met een ‘late endosome’. (H) Na de fusie fusioneert dit vesikel nog eens met een
en lysosoom. (I) Dit hybriede organel gaat zijn inhoud degraderen met behulp van de lysosomale hydrolasen en stelt de
atabolische produkten vrij. Na deze degradatie kan het lysosoom opnieuw gebruikt worden in de endosomale pathway.
Literatuurstudie 35
1.4.3 De verschillende manieren van virusopname
1.4.3.1 Inleiding
Virussen zijn obligate intracellulaire parasieten en moeten bijgevolg in de cel penetreren, om
replicatie en infectie te initiëren. In dierlijke cellen gebeurt dit volgens twee belangrijke wegen,
namelijk door een fusie mechanisme op de plasmamembraan zelf, of door endocytose
(Sieczkarski & Whittaker, 2002a). In het geval van endocytose is internalisatie alleen meestal
niet voldoende, omdat inkomende virussen in endosomen eigenlijk nog deel uitmaken van het
extracellulaire milieu. Daarom moeten geëndocyteerde virussen fusioneren met de endosomale
membraan ofwel de membraan penetreren. De endocytotische pathway wordt meestal
aangetroffen bij virussen die een specifieke locatie in de cel nodig hebben om te repliceren
(Sieczkarski & Whittaker, 2002a).
1.4.3.2 Via clathrine
Vele virusfamilies gebruiken de clathrine gemedieerde endocytose-pathway. De alphavirussen
(vb. semliki forest virus), orthomyxovirussen (vb. influenza), rhabdovirussen (vb. vesicular
stomatitis virus) en adenovirussen zonder enveloppe, hebben een lage pH nodig om hun genoom
vrij te stellen in het cytoplasma (Marsh & Pelchen-Matthews, 2000). Virussen ondergaan door
deze lage pH die terug te vinden in endosomen, een conformationele verandering die fusie of
penetratie bevorderd (Sieczkarski & Whittaker, 2002a). Ook PRRSV heeft een lage pH nodig
voor replicatie (Nauwynck et al., 1999). Maar ook virussen die geen lage pH nodig hebben,
maken gebruik van de endosomen als een snel transportsysteem doorheen het dense cytoplasma
(Sieczkarski & Whittaker, 2002a; Marsh & Pelchen-Matthews, 2000). Virussen die repliceren in
de nucleus, kunnen door middel van endosomen in de nabijheid van de kern gebracht worden,
zodat het virus snel in het nucleoplasma geraakt (Whittaker & Helenius, 1998).
Toch hangen virussen niet alleen af van het endocytose mechanisme, daar ze soms ook
intracellulair getransporteerd moeten worden of de geschikte plaats moeten vinden voor
replicatie. Zo resulteert fusie van het semliki forest virus met de plasmamembraan onder lage
extracellulaire pH wel in internalisatie maar niet noodzakelijk in replicatie (Marsh & Bron,
1997). Dergelijk intracellulair transport hangt af van de sorteringsfunctie van de endosomen na
internalisatie en in sommige gevallen ook van directe interakties van het virus met het
Literatuurstudie 36
cytoskeleton (Sodeik, 2000). Clathrine gemedieerde endocytose werd onder andere al
aangetoond voor het influenza virus (Krizanova et al., 1982), het polyoma JC virus (Pho et al.,
2000) en het picorna virus parechovirus type 1 (Joki-Korpela et al., 2000).
Ook het celtype speelt waarschijnlijk een rol bij de manier waarop een virus een cel
binnendringt. Het epstein-Barr virus dringt B-cellen van het immuunsysteem binnen via clathrine
gemedieerde endocytose, maar geen endotheelcellen (Miller & Hutt-Fletcher, 1992). Analoog
infecteert het humane cytomegalovirus epitheliale cellen via endocytose, maar infecteert
fibroblasten na fusie met de plasmamembraan (Bodaghi et al., 1999).
1.4.3.3 Via caveolae
Het polyoma virus simian virus 40 (SV40), dringt de cel binnen via caveolae die bekend staan
als centra voor de initiatie van signaaltransductie in de cel (Cereasa & Schmid, 2000; Pelkmans
& Helenius, 2000). Het is dus mogelijk dat polyomavirussen door binding in caveolae hun
opname en de daaropvolgende infectie bevorderen, door een signaalcascade in werking te stellen
(Sieczkarski & Whittaker, 2002a).
Endocytose via caveolae is onder andere ook al aangetoond voor het murine polyomavirus en
het picornavirus echovirus type 1 (Marjomaki et al., 2002).
1.4.3.4 Via macropinocytose en fagocytose
Bij macropinocytose worden, analoog als bij fagocytose, lamellipodia gevormd die dan
omvormen tot irregulaire vesikels die macropinosomen genoemd worden. Het mechanisme is
niet specifiek omdat het niet afhangt van een specifieke binding tussen receptor en ligand. De
internalisatie gebeurt na celstimulatie. Het mechanisme van macropinocytose is dus analoog aan
fagocytose dat voorkomt in gespecialiseerde cellen van het immuunsysteem zoals macrofagen,
en neutrofielen (Sieczkarski & Whittaker, 2002a). Het feit dat macropinosomen kunnen
verzuren, en dat ze kunnen interfereren met endocytotische vesikels, maakt dat deze route kan
gebruikt worden door een gans arsenaal virussen (Hewlett et al., 1994). Het belang van
macropinocytose ligt waarschijnlijk vooral in het presenteren van het virus aan het
Literatuurstudie 37
immuunsysteem omdat macropinocytose een belangrijke pathway vormt bij antigen
presenterende cellen, zoals dendritische cellen (Sieczkarski & Whittaker, 2002a).
De opname via macropinocytose is onder andere aangetoond voor HIV type 1 in macrofagen,
voor de intracellulaire en mature vorm van het vaccinia virus en voor het epstein-barr virus
(Sieczkarski & Whittaker, 2002a,b; Marechal et al., 2001).
1.4.3.5 Via een clathrine en caveolae onafhankelijk proces
Hoewel deze pathway nog niet goed gekend is, zou ze toch betrokken zijn bij de opname van
vele virussen zoals de picornavirussen (Madshus et al., 1987; Matlin et al., 1981). Ook het
influenza virus maakt gebruik van deze pathway, hoewel dit virus cel ook kan binnentreden via
clathrine gemedieerde endocytose (Sieczkarski et al., 2002b).
Doelstellingen 38
2 DOELSTELLINGEN
PRRSV repliceert zowel in vitro als in vivo in porciene alveolaire macrofagen (PAM), de
natuurlijke gastheercel voor het virus. Op het laboratorium Virologie van de Faculteit
Diergeneeskunde te Merelbeke werd in PAM een 210 kDa proteïne als mogelijke receptor voor
PRRSV geïdentificeerd (Duan et al., 1998). Immers Mas 41D3 (monoklonale antistof), gericht
tegen deze receptor, reduceert de binding van PRRSV in PAM en kan de infectie in PAM
volledig blokkeren. Bovendien werd colokalisatie tussen PRRSV en sialoadhesine/Mas 41D3
aangetoond (Duan et al., 1998). Vanderheijden et al. (2003) hebben deze receptor
geïdentificeerd als de porciene sialoadhesine en konden colokalisatie aantonen tussen
sialoadhesine en clathrine. Zij konden ook aantonen dat na transfektie met het cDNA van
sialoadhesine resistente cellen gevoelig werden voor opname van PRRSV. De hypothese is dan
ook dat sialoadhesine via clathrine gemedieerde endocytose wordt opgenomen.
Membraanreceptoren, zoals sialoadhesine, die opgenomen worden via clathrine gemedieerde
endocytose hebben veelal de consensus sekwentie YxxΦ in hun cytoplasmatische staart
(Mellman, 1996). AP2 bindt op deze consensus sekwentie (Boll et al., 2002; Conner et al., 2002;
Bonifacino et al., 1999), en lokaliseert clathrine triskelions naar de celmembraan om dan een
CCV te vormen (Clague, 1998; Benmerah et al., 1998).
Een eerste doelstelling van deze scriptie is verder te onderzoeken of sialoadhesine via clathrine
gemedieerde endocytose opgenomen wordt. Dit zal gebeuren met het monoklonale antilichaam
41D3, gericht tegen sialoadhesine. Endocytose zal geïnduceerd worden met dit antilichaam en
door gebruik te maken van specifieke inhibitoren zal bepaald worden via welk mechanisme het
Mas 41D3/sialoadhesine complex opgenomen word in PAM.
Op het labo werd de coderende DNA sekwentie voor het 210 kDa eiwit in een plasmide
gecloneerd. In een tweede deel van deze scriptie zullen cellijnen getransfecteerd worden met dit
plasmide en zal gezocht worden naar een cellijn waar de opname van sialoadhesine gelijkaardig
verloopt als in PAM. Op die manier willen we een cellijn zoeken waarin we de rol van
verschillende karakteristieken van sialoadhesine in het endocytoseproces kunnen bestuderen.
Materiaal en Methoden 39
3 MATERIAAL EN METHODEN
3.1 Buffers, reagentia en stocks
• Fosfaat gebufferde zoutoplossing (PBS; phosphate buffered solution)
NaCl 8,138 g/l
Na2HPO4 0,94 g/l
NaH2PO4 0,46 g/l
pH 7,3
• Fosfaat gebufferde zoutoplossing met Ca2+ en Mg2+ (PBS+)
NaCl 8 g/l
Na2HPO4 1,15 g/l
KCl 0,2 g/l
KH2PO4 0,2 g/l
MgCl2 0,1 g/l
CaCl2 0,1 g/l
pH 7,3
• TE-buffer
10mM Tris.Cl (pH 8,0)
1mM EDTA (pH 8,0; Vel)
in UP
• Versene stock: 53mM ethyleendiaminetetraacetaat (EDTA, Vel) in UP
• Trypsine stock: 24.400 units trypsine /ml (Sigma)
• Penicilline-streptomycine: 1g streptomycine en 106 units penicilline in 100ml UP.
• Ornithine: 100 µg poly-D/L-ornithine hydrobromide/ml UP; Sigma)
• Laminine: 3,45 µg/ml PBS (Sigma)
Materiaal en Methoden 40
3.2 Media
3.2.1 Medium voor HEK-T
DMEM (dulbecco’s modified eagles medium, Gibco)
+10% foetaal kalf serum (FKS)
+streptomycine (1g/100ml UP; Certa)
+10.000 units penicilline/ml (Continental pharma)
+1mM pyruvaat (Gibco)
+200mM glutamine (BDH biochemical)
3.2.2 Medium voor RK13, PK15 en SK
MEM (minimum essential medium, Gibco)
+5% foetaal kalf serum (FKS)
+1% penicilline-streptomycine oplossing
+1% kanamycine oplossing
+1% glutamine oplossing
3.2.3 Medium voor 3D4
MEM/RPMI (50/50)
+10% FKS
+1% penicilline-streptomycine oplossing
+1% kanamycine oplossing
+1% glutamine oplossing
+1% niet-essentiële aminozuren (Gibco)
3.2.4 Medium voor PAM
MEM (minimum essential medium, Gibco)
+10% FKS
+1% penicilline-streptomycine oplossing
+1% kanamycine oplossing
Materiaal en Methoden 41
+1% glutamine oplossing
+1% niet-essentiële aminozuren (Gibco)
+1% natriumpyruvaat oplossing (100mM oplossing, Gibco)
+1% gentamycine oplossing (10mg/l, Gibco)
+1% tylosine oplossing (0,1% oplossing in UP, bewaard bij –20°C)
3.2.5 LB (Luria Bertani)-medium
10 g bacto tryptone (Becton Dickinson)
5g bacto gist extract (Becton Dickinson)
10 g NaCl (Vel)
Ultra puur water tot 1l
Materiaal en Methoden 42
3.3 Celculturen
3.3.1 HEK-T en 3D4
Cellen werden gewassen met PBS en gedurende 10 minuten bij kamertemperatuur
geïncubeerd met 15ml PBS met daarin 530µM EDTA en 2440 units trypsine/ml. De celsuspensie
werd overgebracht in FKS en gedurende 10 minuten afgecentrifugeerd aan 260xg. De pellet
werd gesuspendeerd in 5ml medium en het aantal cellen geteld met een Bürker kamer. De cellen
werden geplant aan een concentratie van 40.000 cellen/ml en bij 37°C geïncubeerd met 5% CO2.
Na 3 dagen werden de cellen opnieuw gesplitst.
De glazen inserts waarop de HEK-T cellen werden gegroeid werden vooraf gecoat met
ornithine-laminine. In elke well van een 4 of 24 well plaat met glazen insert, werd 0,5ml
ornithine oplossing (100µg poly-D/L-ornithine hydrobromide/ml UP, Sigma) toegevoegd. Na 4
uur incubatie bij kamertemperatuur werd de ornithine oplossing vervangen door 0,1ml laminine
oplossing (3,45µg/ml PBS, Sigma) + 0,2ml PBS. Na twee uur incubatie bij kamertemperatuur
worden de welletjes nog 2 maal gewassen met Dulbecco’s modified Eagles medium voordat de
cellen geplant werden.
3.3.2 RK13, PK15 en SK
De cellen werden gewassen met PBS en gedurende 10 minuten geïncubeerd bij
kamertemperatuur. De PBS werd verwijderd en de cellen werden gedurende 10 minuten
incubatie bij kamertemperatuur geïncubeerd met 530µM EDTA en 2440 units trypsine/ml.
Daarna werd de celsuspensie aan opgevangen in FKS en 10 minuten gecentrifugeerd aan 200xg.
De pellet werd vervolgens geresuspendeerd in medium en de cellen werden geplant aan een
concentratie van 200.000 cellen/ml en geïncubeerd bij 37°C en 5% CO2. Na drie dagen werden
de cellen hervoed en na 1 week opnieuw gesplitst.
Materiaal en Methoden 43
3.3.3 Porciene alveolaire macrofagen (PAM)
3.3.3.1 Isoleren en bewaren van PAM
De PAM werden bekomen door de longen van PRRSV vrije biggen te spoelen met PBS. De
wasvloeistof van iedere big werd gedurende 10 minuten bij 260xg (4°C) gecentrifugeerd. De
pellet werd gewassen met PBS en geresuspendeerd in RPMI (met 30% FKS, 1% penicilline-
streptomycine) aan een concentratie van 80.106 cellen per ml.
Cryotubes (Sarstedt) werden vervolgens gevuld met 0.5 ml van de verdunde suspensie waarna
0,5 ml RPMI-1640 (Life Technologies) (+30% FKS, 20% dimethylsuloxide, 1% penicilline-
streptomycine) toegevoegd werd. De cryotubes werden gradueel ingevroren tot –150°C
(PTLPD81, Othodyne) en dan bewaard in vloeibare stikstof (-196°C).
3.3.3.2 In cultuur brengen van de PAM
De PAM werden uit de vloeibare stikstof gehaald, ontdooid in een warmwaterbad (37°C) en
overgebracht in een centrifugeerbuis met 10 ml celcultuurmedium op 4°C. Vervolgens werden
de cellen gecentrifugeerd, het supernatans verwijderd en de pellet geresuspendeerd in medium.
De cellen werden geplant aan 106 cellen/ml zonder FKS. Na 1uur werd het medium afgezogen
en vervangen door cultuurmedium met 10% FKS en de cellen werden teruggeplaatst in de CO2
incubator.
3.4 DNA opzuivering
Sialoadhesine werd reeds gecloneerd op het labo Virologie te Merelbeke (Vanderheijden et
al., 2003) in de pcDNA3.1D vektor (Invitrogen).
Een bacteriecultuur werd opgestart in LB medium met 1% ampicilline als selektie merker
(Figuur 15). Voor de opzuivering werd gebruik gemaakt van de midiprep kit van Qiagen en
werden de instructies van de fabrikant opgevolgd. Het bekomen DNA werd opgelost in 100µl
TE buffer en bewaard bij –20°C tot gebruik.
Materiaal en Methoden 44
Figuur 15. Schematisc
gekloneerd.
3.5 Transfectie
3.5.1 Transfectie van
De cellen werden 1 da
transfectie werden de ce
methode (Cellphect transf
producent. Wel werd de h
well van een 4- of 24 well
3.5.2 Transfectie van
De dag voor de transfe
siliconen flexiPERM micr
medium vervangen door
eppendorf met daarin 22
toegevoegd. In een tweed
met 22,5µl DMEM. De
minuten bij kamertemper
suspensie toegevoegd en w
he structuur van de pcDNA 3.1D / Sia vektor waarin sialoadhesine werd
HEK-T, SK en RK13
g voor de transfectie geplant aan 50.000 cellen/well en 2 uur voor
llen hervoed. De transfectie gebeurde volgens de calcium-fosfaat
ection kit, Amersham Biosciences) volgens de aanbevelingen van de
oeveelheid DNA geoptimaliseerd (optimale concentratie was 3µg per
plaat).
PK15 en 3D4
ctie werden de cellen geplant aan 350.000 cellen per ml op glas in
o 12 kamertjes (Viva Science). Twee uur voor de transfectie werd het
60µl DMEM met daarin 200mM glutamine (37°C). In een eerste
,5µl DMEM en 0,7µg DNA werd 5,4µl Plus reagens (Invitrogen)
e eppendorf werd 1,8µl lipofectamine reagens (Invitrogen) gemengd
twee eppendorfjes werden vervolgens gemengd en gedurende 15
atuur geïncubeerd. Aan elk welletje werd vervolgens 18µl van de
erden de cellen verder geïncubeerd bij 37°C + 5% CO2. Na drie uur
Materiaal en Methoden 45
werd 75µl DMEM met daarin 200mM glutamineoplossing en 10% FKS toegevoegd aan de well.
Na 24h incubatie bij 37°C en 5% CO2 werden de cellen gebruikt voor het experiment.
3.6 Opzuiveren van monoklonale antistoffen (Mas)
3.6.1 Opzuivering
Een proteïne G kolom (Amerstam Biosciences, proteïne G sepharose fast flow 1ml) werd
aangesloten op een peristaltische pomp (Pharmacia LKB Pump p-1; 1ml/min) en gewassen met
20ml fosfaatbuffer (Na2HPO4, 20mM, pH 7,0). Daarna werd 25ml hybridoma supernatans,
waaraan reeds 4ml 200mM fosfaatbuffer (pH 7,0) werd toegevoegd om de optimale
bindingscondities te bekomen, op de kolom aangebracht. De kolom werd nadien gewassen met
20mM fosfaatbuffer totdat de proteïne concentratie in het eluaat kleiner was dan 50µg/ml. De op
de kolom gebonden antilichamen werden geëlueerd met 10ml glycine (0,1M, pH 2,7). Het eluaat
werd in fracties van 500µl opgevangen in 100µl Tris (1M, pH 9,0), dit om de pH te
neutraliseren. Tenslotte werd de concentratie Mas van elke fractie bepaald, en de fracties met de
hoogste concentraties werden samengevoegd. De opgezuiverde monoklonalen werden
uitverdeeld en bewaard bij –70°C tot gebruik.
De proteïne concentratie werd gemeten met een spektrofotometer (Biorad SmartSpec 3000) bij
een golflengte van 278nm. De ijklijn werd opgesteld door de absorbantie van verschillende
concentraties immunoglobulines te meten.
3.6.2 Analyse van de opgezuiverde Mas met SDS-PAGE
Om na te gaan of de opzuiverde Mas vrij zijn van ongewenste proteïnen, werden de Mas
geanalyseerd met SDS-PAGE en Western blotting.
Op verschillende momenten in het opzuiveringsproces werden staaltjes genomen en
gescheiden op een 10% polyacrylamide gel. De samenstelling van de stacking en running gel
wordt weergegeven in Tabel 5.
Materiaal en Methoden 46
Tabel 5. Samenstelling van stacking en running gel voor de SDS-PAGE.
Component 4% Stacking
gel (ml)
10% Running
gel (ml)
30% acrylamide/bisacrylamide mix (37,5/1;
(Biorad))
0,66 1,67
1,5M Tris-Cl (pH 8,8) - 1,25
0,5 Tris-Cl (pH 6,8) 1,25 -
UP 3 2,165
SDS (10% in ultra puur water; Biorad) 0,05 0,05
Amoniumpersulfaat (10% in UP) 0,025 0,025
Tmed (N,N,N’,N’-tetramethyleendiamine;
Serva)
0,01 0,01
Totaal volume (ml) 5 5
De gel werd gemaakt en in een tank met SDS-PAGE buffer geplaatst (0,3% Tris pH 8,3,
1,44% glycine en 0,1% SDS in ultrapuur water). Aan de staaltjes werd een gelijke hoeveelheid
ladingsbuffer (0,125 M Tris-HCl pH 6,8; 4% SDS; 20% glycerol; 10% β-mercaptoethanol)
toegevoegd, waarna deze gedurende 5 minuten opgekookt werden. Aan welke well werd 15µl
toegevoegd. De gel werd nadien gekleurd met Coomassie blauw (1,25‰ Coommassie blauw R-
250, 50% MeOH, 10% azijnzuur in ultrapuur water). De eiwitbandjes werden dan gevisualiseerd
door de blot te ontkleuren met 50% MeOH en 10% azijnzuur in UP.
Materiaal en Methoden 47
3.7 Endocytose assays
3.7.1 Microscopische analyse
3.7.1.1 Bij PAM
Eén dag voor het experiment werden de cellen in een 4 of 24-well plaat geplant aan een
concentratie van 1.106 cellen/ml.
De cellen werden bij 4°C geplaatst en het medium vervangen door 350 µl RPMI (+2% FKS;
4°C), waaraan 5µg Mas 41D3 of Mas 13D12 per well toegevoegd werd. Na 1 uur incubatie bij
4°C werden de cellen twee maal gewassen met RPMI (+2% FKS). Daarna werd RPMI (+2%
FKS) van 37°C op de cellen gebracht en deze werden dan bij 37°C gezet om het
endocytoseproces te laten doorgaan. Na 15, 30, 60, 90 of 120 minuten worden de cellen 1 maal
gewassen met PBS+ en gefixeerd met paraformaldehyde (3% in PBS+). Als controle (tijdstip nul)
werden de cellen eerst tien minuten gefixeerd met paraformaldehyde (3% in PBS+) voor
toediening van Mab 41D3 of 13D12. Om de natuurlijke distributie van sialoadhesine in de
membraan te kunnen bekijken werden PAM gefixeerd met paraformaldehyde (3% in PBS+) net
voor de toediening van Mas 41D3.
3.7.1.2 Bij HEK-T, PK15, RK13 en SK
Voor de HEK-T, PK15, RK13 en SK cellen werd een analoog protocol gevolgd als bij de
PAM, met dezelfde controles. Na incubatie met Mas 41D3, werden de cellen echter nog 2 maal
gewassen met RPMI (+2% FKS) en dan 1 uur bij 4°C geïncubeerd met 300µl FITC gemerkt
geit-anti-muis antlichaam (GαM-FITC; 8 µg/ml in PBS+; Molecular probes) per well. Pas dan
werden de cellen bij 37°C geplaatst om het endocytoseproces te laten doorgaan.
3.7.1.3 Gebruik van inhibitoren
3.7.1.3.1 Genisteïne, tyrphostine1, tyrphostine25 en sucrose (Sigma)
Eén uur voor het eigenlijk endocytose experiment werd het medium vervangen door RPMI +
2% FKS met de gewenste concentratie inhibitor en werden de cellen verder bij 37°C
Materiaal en Methoden 48
geïncubeerd. Bij alle verdere stappen in het endocytose proces werd steeds de inhibitor in de
gepaste concentratie toegevoegd.
3.7.1.3.2 Amantadine
De cellen werden eerst 1h bij 37°C geïncubeerd in RPMI + 2% FKS met amantadine (Sigma).
Daarna werd Mas 41D3 of 13D12 toegevoegd samen met de inhibitor (37°C). De PAM werden
dan op verschillende tijdstippen gefixeerd. PK15 en 3D4 cellen werden echter, 15 minuten na
toevoeging van Mas 41D3 of Mas 13D12 gewassen, waarna GαM-FITC werd toegevoegd
samen met de inhibitor en dan op verschillende tijdstippen gefixeerd met paraformaldehyde.
3.7.1.4 Kleuringen
De cellen werden gedurende 2 minuten gepermeabiliseerd met 0,1% Triton-X-100 (t-
octylphenoxypolyethoxyethanol, Sigma) in PBS+. Van alle cellen, waarin endocytose niet werd
geïnduceerd met behulp van GαM-FITC, werd de sialoadhesine receptor met daarop Mab 41D3
gekleurd met GαM-FITC (8µg/ml in PBS+) door de cellen 1 uur bij 37°C te laten incuberen.
Corticale actine werd vervolgens gekleurd met phalloïdine Texas Red (2 units/ml in PBS+;
Molecular probes), gedurende 1 uur bij 37°C en de kern door de cellen 10 minuten te incuberen
met Hoechst-33342 (10 µg/ml).
De glazen inserts met daarop de cellen werden vervolgens op een draagglaasje gemonteerd
met glycerine-DABCO en geanalyseerd met een confocale microscoop. De cellen die
gecultiveerd werden in een flexiperm celcultuurkamertje werden gemonteerd door het kamertje
te verwijderen van het draagglaasje waarop dan een dekglaasje gemonteerd werd met behulp van
glycerine-DABCO.
Voor de confocale analyse werd gebruik gemaakt van een Leica TCS-SP2. FITC
(excitatiegolflengte: 494nm) werd geëxciteerd met een Ar-laser bij een golflengte van 488 nm.
Voor de drievoudige kleuringen (Tx-red, FITC en Hoechst) werd gebruik gemaakt van een
Biorad MRC-1024. FITC en Tx-red werden geëxciteerd met een Kr/Ar-laser bij respectievelijk
488 en 568 nm. Hoechst (excitatiegolflengte: 350nm) werd geëxciteerd bij 351 nm met een AI-
laser.
Materiaal en Methoden 49
3.7.1.5 Assay voor spontane endocytose
Voor de endocytose werd het zelfde protocol gevolgd beschreven onder 3.7.1.1. PAM werden
bij 4°C geïncubeerd met Mas 13D12 of Mas 41D3. Na de shift naar 37°C om endocytose toe te
laten en fixatie werden de cellen gepermeabiliseerd met triton-X-100. De PAM werden dan voor
1h bij 37°C geplaatst met Mas 41D3, nadien gewassen en gekleurd met GαM-FITC.
3.7.2 Flowcytometrische analyse bij PAM
Eén dag voor het experiment werden de cellen geplant in een 4 of 24 well plaat aan een
concentratie van 1.106 cellen/ml.
De cellen werden eerst 1 uur bij 4°C geïncubeerd met Mas 41D3. Daarna werden de cellen
overgebracht naar 37°C om het endocytoseproces te laten doorgaan. Op verschillende tijdstippen
werd het medium vervangen door ijskoude PBS met 2% versene om de cellen los te maken. De
celsuspensie werd vervolgens 15 minuten afgecentrifugeerd aan 520xg. De plasmembraan werd
gekleurd door de pellet in 0,2 ml ijskoude GαM-FITC verdunning (20µg/ml in PBS) + 10%
geitenserum te resuspenderen. Na 90 minuten werden de cellen gewassen en in PBS terug in
suspensie gebracht. Als controles werden de cellen geïncubeerd met Mas 13D12 in plaats van
Mas 41D3 of alleen met GαM-FITC.
Om te controleren of de totale fluorescentie intensiteit onveranderd blijft tijdens het
endocytoseproces werden PAM ook intern gekleurd. Na losmaken van de cellen en
centrifugeren, werden de cellen gefixeerd in 350µl paraformaldehyde (1% in PBS). De
celsuspensie werd afgecentrifugeerd waarna de cellen gepermeabiliseerd werden in 0,1% Triton-
X-100 (in PBS) gedurende 1 minuut. Na centrifugatie werden de cellen gewassen met PBS +
20% FKS en gersuspendeerd in GαM-FITC (20µg /ml in RPMI). Na 1 uur incubatie bij
kamertemperatuur werde,n de cellen gewassen met PBS +20% FKS en geresuspendeerd in PBS.
Voor de flowcytometrische analyse werd gebruik gemaakt van een Becton-Dickinson
FACScalibur, voorzien van een 15 mW luchtgekoelde ion laser. De flowcytometer was
gekoppeld aan een Macintosh computer (Apple Computer, Inc.). Metingen werden uitgevoerd
met behulp van de BD Cellquest software.
Materiaal en Methoden 50
3.8 Statistische verwerking
Voor de statistische verwerking werd gebruik gemaakt van het SPSS 10.0.1 software pakket.
Voor de vergelijking van twee gemiddelden werd een t-toets uitgevoerd (‘independent sample t-
test’). Om na te gaan of de varianties in beide populaties gelijk was werd de Levene’s test
uitgevoerd op het p=0,05 significantie niveau. Indien de varianties niet gelijk waren werd de t-
toets gebruikt waarin gelijkheid van variantie niet wordt aangenomen.
Resultaten 51
4 RESULTATEN
4.1 Sialoadhesine gemedieerde endocytose in porciene alveolaire macrofagen
met behulp van Mas 41D3
4.1.1 Opzuiveren van Mas 41D3
Om endocytose van sialoadhesine te induceren werd gebruik gemaakt van Mas 41D3 gericht
tegen sialoadhesine. Mas 41D3 werd aangemaakt op het Labo Virologie te Merelbeke in een
hybridoma cellijn. Het supernatans van deze hybridoma’s bevat naast Mas 41D3 ook een grote
hoeveelheid andere eiwitten. Om er zeker van te zijn dat de opgezuiverde Mas geen andere
eiwitten meer bevat die eventueel endocyose zouden kunnen induceren werd de zuiverheid
gecontroleerd met behulp van SDS-PAGE. Na blotten van de gel werden de eiwitten gekleurd
met commassie blauw.
Figuur 16. Controle van
PAGE. Het hybridoma su
andere proteïnen. Na aan
kolom gebonden daar he
kolom worden geen prote
41D3 zijn in het eluaat du
Zware keten
Lichte keten
Zware keten
Lichte keten
1 2 3 4
de zuiverheid van opgezuiverde Mas 41D3 met behulp van SDS-
pernatans (laantje 1) bevat naast de zware keten van Mas 41D3 ook
brengen het supernatans op de kolom wordt alle Mas 41D3 op de
t eluaat geen Mas 41D3 meer bevat (laantje 2). Na wassen van de
ïnen meer aangetroffen in het eluaat (laantje 3). Na elutie van Mas
idelijk de lichte en zware keten van Mas 41D3 te zien (laantje 4).
Resultaten 52
Op verschillende tijdstippen tijdens het opzuiveringsproces werden staatltjes genomen. Aan de
staaltjes werd β-mercapto-ethanol toegevoegd dat zwavel bruggen breekt. Zo wordt de zware
keten en de lichte keten van de Mas gescheiden. Het hybridoma supernatans (Figuur 16, laantje
1) bevat naast de zware keten van de Mas nog een grote hoeveelheid andere proteïnen. De kleine
keten is nog niet te zien omdat de Mas nog in een te lage concentratie aanwezig is. Mas 41D3
werd gebonden op een proteïne G-sepharose kolom. Na aanbrengen van het hybridoma
supernatans is in het eluaat de zware keten niet meer te zien op gel (laantje 2), wat er op wijst dat
Mas 41D3 op de kolom werd gebonden. Na wassen van de kolom is het eluaat vrij van alle
proteïnen (laantje 3) en na elutie van de op kolom gebonden Mas 41D3 is in het eluaat duidelijk
de zware en de lichte keten te zien en kunnen geen andere eiwitten meer gedetecteerd worden
(laantje 4). Voor de opzuivering van Mas 13D12 werd hetzelfde protocol gevolgd en werd
hetzelfde resultaat bekomen.
4.1.2 Kinetiek van sialoadhesine endocytose in PAM
Het endocytoseproces werd bestudeerd met behulp van Mas 41D3, gericht tegen de
sialoadhesine receptor (Duan et al., 1998). PAM werden 1 uur bij 4°C geïncubeerd met
opgezuiverde Mas 41D3. Bij deze temperatuur kunnen PAM overleven maar is geen endocytose
mogelijk, waardoor enkel de membraan van de PAM gekleurd wordt. Daarna werden de cellen
gewassen om niet gebonden Mas te verwijderen, vervolgens bij 37°C geplaatst om het
endocytoseproces te laten doorgaan en op verschillende tijdstippen gefixeerd met
paraformaldehyde. Na fixatie werden de PAM gepermeabiliseerd met Triton-X-100 en werd Mas
41D3 immunofluorescent gekleurd met behulp van een FITC gemerkt polyklonaal antilichaam,
gericht tegen muisantistoffen (goat-anti-mouse-fluoroisothiocyanaat, GαM-FITC). Als controle
voor internalisatie werden de cellen gefixeerd op tijdstip nul (voor de shift naar 37°C),
gepermeabiliseerd en gekleurd. Om de distributie van sialoadhesine op de membraan te kunnen
bekijken zonder de invloed van Mas 41D3, werden de PAM gefixeerd vÓÓr toevoeging van Mas
41D3. Als controle voor aspecifieke binding werd Mas 13D12 toegediend in plaats van Mas
41D3. Mas 13D12 is van hetzelfde isotype als Mas 41D3 (IgG1) en is gericht tegen
glycoproteïne D van het suid herpesvirus type I (Nauwynck et al., 1995).
Resultaten 53
Na kleuring met Mas 41D3 en Gα
waargenomen op de membraan (Figuu
met Mas 13D12 werd noch een memb
Figuur 17. Puntige distributie van siaload
GαM-FITC (bij 4°C). De foto geeft een c
van de apikale celmembraan. (Schaal=5 µ
Het endocytoseproces werd kw
microscopie. Telkens werden willek
vesikels per cel werd bepaald door va
aantal vesikels in de sekties per cel te
hadden werden beschouwd als celle
werden gebruikt en aangezien daardo
het aantal cellen met endocytose relat
De resultaten van het internalisatiepro
van 3 onafhankelijke experimenten.
worden dat na 15 minuten incubatie
aantal vesikels per cel bleef stijgen to
vesikels). Daarna daalde het aantal ves
Als extra controle voor internalis
(Figuur 19). De membraan werd gek
onder plasmamembraan kleurt (Figuu
membraan en zitten dus in het cytopla
Hoechst (Figuur 19C).
hesine in de membraan van PAM na kleuring met Mas 41D3 en
onfocaal beeld weer van één enkele z-sektie genomen ter hoogte
m)
M-FITC werd een puntige distrubutie van sialoadhesine
r 17). Op tijdstip nul was enkel de membraan gekleurd en
raankleuring, noch een interne kleuring gedetecteerd.
antitatief geananalyseerd met behulp van confocale
eurig 25 cellen geselekteerd voor analyse. Het aantal
n elke cel z-sekties op te nemen op 1 µm van elkaar en het
tellen. Enkel cellen die meer dan 3 intracellulaire vesikels
n met endocytose. Omdat verschillende batches PAM
or variatie optrad in het aantal opgenomen vesikels, werd
ief uitgezet ten opzichte van het maximum op 90 minuten.
ces worden weergegeven in Figuur 18 als een gemiddelde
Met behulp van confocale microscopie kon vastgesteld
bij 37°C sialoadhesine reeds opgenomen is in de cel. Het
t een maximum werd bereikt op 90 minuten (gemiddeld 11
ikels terug.
atie werd in PAM een drievoudige kleuring uitgevoerd
leurd met phalloïdine-Tx-red, dat het corticale actine net
r 19A). De vesikels (Figuur 19B) zitten duidelijk onder de
sma van de cel (Figuur 19E). De kern werd gekleurd met
Resultaten 54
F
h
g
v
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
Incubatieduur bij 37°C (m inuten)
Relatief aantal cellen met endocyt
0 min
60 min 90 min
15 min 30 min
120 min
iguur 18. Kinetiek van door Mas 41D3 geïnduceerde endocytose in PAM. In de grafiek wordt per tijdstip
et relatief aantal cellen weergegeven die meer dan 3 vesikels hebben opgenomen. De foto’s onder de
rafiek zijn confocale beelden van één z-sektie in PAM en geven telkens een typisch overzichtsbeeld op de
erschillende tijdstippen. De vesikels zijn aangeduid met pijltjes. (Schaal= 5 µm)
Resultaten 55
Figuur 19. Visuele controle van internalisatie in PAM. De figuren zijn confocale beelden van 1 z-sektie in
het midden van de cel. Corticale actine (A) werd gekleurd met phalloïdine-Tx-Red. Sialoadhesine werd
gekleurd met Mas 41D3 en GαM-FITC (B). De kern werd gekleurd met Hoechst (C). Figuur D is een
superpositie van A, B en C. (Schaal=5 µm)
Resultaten 56
Als controle voor spontane endocytose werden PAM bij 4°C geïncubeerd met Mas 41D3 of
Mas 13D12, dat niet met sialoadhesine bindt en dus normaal geen endocytose kan induceren. Na
60 minuten incubatie bij 37°C en fixatie, werden de PAM gepermeabiliseerd. Als spontane
endocytose optreedt bij induktie met Mas 13D12 dan zouden deze cellen intracellulaire vesikels
moeten bezitten met sialoadhesine, welke na permeabilisatie gekleurd worden met Mas 41D3 en
GαM-FITC. Na confocale analyse werden bij PAM geïnduceerd met Mas 13D12 geen vesikels
gedetecteerd, terwijl dat wel het geval was bij PAM geinduceerd met Mas 41D3. Als controle
werden PAM gefixeerd op tijdstip nul (Figuur 20).
F
fi
w
m
z-
De
analy
gedu
mM
naar
PA
mole
endo
geïnt
verm
van
0min
13D12
0min
41D3
60min
13D12
60min
41D3
0min
13D12
0min
13D12
0min
41D3
0min
41D3
60min
13D12
60min
13D12
60min
41D3
60min
41D3
iguur 20. Controle voor spontane endocytose in PAM. Op de figuren is telkens het tijdstip van
xatie gegeven en de Mas waarmee endocytose werd geïnduceerd. Op 60 minuten is enkel endocytose
aarneembaar bij PAM geïnduceerd met Mas 41D3 en niet met Mas 41D3. Op nul minuten is zowel
et Mas 13D12 als Mas 41D3 geen endocytose detecteerbaar. De foto’s zijn confocale beelden van één
sektie genomen ter hoogte van het midden van elke cel. (Schaal=5 µm)
internalisatie van sialoadhesine werd ook bevestigd met behulp van flowcytometrische
se. PAM werden gedurende 1 uur bij 4°C geïncubeerd met Mas 41D3 en vervolgens
rende 1 uur bij 37°C om endocytose te laten doorgaan, en dan losgemaakt met PBS (+ 25
EDTA). Als controle voor het tijdstip nul werden de cellen losgemaakt net voor de shift
37°C. Daarna werden alle cellen in suspensie gekleurd met GαM-FITC.
M werden niet gepermeabiliseerd voor de kleuring waardoor enkel sialoadhesine
culen in de celmembraan gekleurd werden en niet de geïnternaliseerde vesikels. Indien
cytose optreedt, wordt een deel van de sialoadhesine receptoren in de membraan
ernaliseerd in het cytoplasma, waardoor de fluorescentie intensiteit van de membraan
indert. Om het endocytoseproces kwantitatief te benaderen werd de fluorescentie intensiteit
de membraan gemeten, op nul (Figuur 21B) en 60 minuten (Figuur 21C) na de shift naar
Resultaten 57
37°C. Na flowcytometrische analyse analyse bleek dat 60 minuten na de shift naar 37°C, 28%
minder fluorescentie intensiteit werd vastgesteld t.o.v de controle op nul minuten. Als controle
werden PAM geïncubeerd met Mas 13D12 in plaats van Mas 41D3. Bij deze controle werd een
veel lagere fluorescentie intensiteit vastgesteld (2% van de fluorescentie intensiteit van de
controle op nul minuten; Figuur 21A). Om te bepalen of de totale fluorescentie intensiteit
(membraan + interne vesikels) tijdens het endocytoseproces constant blijft werden PAM na 60
minuten incubatie bij 37°C gepermeabiliseerd en zowel intern als extern gekleurd met GαM-
FITC (Figuur 21D) en werd de mediaan vergeleken met de mediaan op nul minuten (Figuur
21B). Van beide gevallen was de mediaan analoog.
Relatieve fluorescentie intensiteit
Rel
atie
f aan
tal c
elle
n
A
DC
B
A: Endocytose na 0 minuten met Mas 13D13 (externe kleuring)
B: Endocytose na 0 minuten met Mas 41D3 (externe kleuring)
C: Endocytose na 60 minuten met Mas 41D3 (externe kleuring)
D: Endocytose na 60 minuten met Mas 41D3 (interne +externe kleuring)
Mediaan:
A: 1,84
B: 71,05
C: 50,94
D: 74,32
Relatieve fluorescentie intensiteit
Rel
atie
f aan
tal c
elle
n
A
DC
B
A: Endocytose na 0 minuten met Mas 13D13 (externe kleuring)
B: Endocytose na 0 minuten met Mas 41D3 (externe kleuring)
C: Endocytose na 60 minuten met Mas 41D3 (externe kleuring)
D: Endocytose na 60 minuten met Mas 41D3 (interne +externe kleuring)
Relatieve fluorescentie intensiteit
Rel
atie
f aan
tal c
elle
n
A
DC
B
Relatieve fluorescentie intensiteit
Rel
atie
f aan
tal c
elle
n
Relatieve fluorescentie intensiteit
Rel
atie
f aan
tal c
elle
n
A
DC
B
A: Endocytose na 0 minuten met Mas 13D13 (externe kleuring)
B: Endocytose na 0 minuten met Mas 41D3 (externe kleuring)
C: Endocytose na 60 minuten met Mas 41D3 (externe kleuring)
D: Endocytose na 60 minuten met Mas 41D3 (interne +externe kleuring)
Mediaan:
A: 1,84
B: 71,05
C: 50,94
D: 74,32
Figuur 21. Flowcytometrische analyse van endocytose in PAM. Endocytose in PAM werd
geïnduceerd met Mas 41D3 of Mas 13D12. PAM werden op nul en zestig minuten extern gekleurd
met GαM-FITC en geanalyseerd. Na induktie met Mas 13D12 (A) lag de mediaan van
fluorescentie intensiteit beduidend lager dan na stimulatie met Mas 41D3 (C). Na 60 minuten
incubatie bij 37°C met Mas 41D3 (C) bedroeg de mediaan slechts 72% van de controle op nul
minuten (B). De totale fluorescentie intensiteit van de ganse cel wijzigde tijdens het
endocytoseproces bijna niet, daar de mediaan voor de interne+externe (D) kleuring op 60
minuten (membraan +cytoplasma en endosomen) niet veel verschilde van de externe kleuring (B)
op nul minuten (enkel membraan).
Resultaten 58
4.1.3 Karakterisatie van het internalisatieproces in PAM
Op het Labo Virologie te Merelbeke werd aangetoond dat PRRSV via een clathrine
gemedieerd proces PAM infecteert. Omdat sialoadhesine betrokken is bij opname van PRRSV,
wordt verondersteld dat sialoadhesine via een clathrine gemedieerd proces opgenomen wordt in
PAM. Er werd ook reeds met behulp van confocale microscopie colokalisatie tussen
sialoadhesine en clathrine vastgesteld (Vanderheijden et al., 2003).
Deze hypothese werd nagegaan door gebruik te maken van inhibitoren die clathrine
gemedieerde endocytose verhinderen. Amantadine stabiliseert CCV en verhindert zo hun
ontmanteling. Bijgevolg komt de receptor niet in de klassieke endosoom-lysosoom pathway
terecht (Phonphok Y.& Rosenthal K.S., 1991). Sucrose kan ook gebruikt worden als specifieke
inhibitor voor clathrine gemedieerde endocytose. Een hypertonische oplossing van sucrose geeft
aanleiding tot vorming van kleine ledige CCV, en maakt zo clathrine minder beschikbaar voor de
vorming van normale vesikels (Heuser & Anderson, 1989).
PAM werden voor het eigenlijke experiment 1 uur bij 37°C geïncubeerd met de inhibitor.
Daarna werden de PAM 1 uur bij 4°C geïncubeerd met Mas 41D3 en sucrose of amantadine,
waarna de cellen bij 37°C werden geplaatst en gefixeerd na 60 minuten. Omdat amantadine geen
effect heeft na incubatie bij 4°C (data niet gegeven), werd deze 4°C stap in de amantadine assay
weggelaten. In plaats daarvan werden de cellen na het 1e uur incubatie bij 37°, een uur met Mas
41D3 en amantadine geïncubeerd bij 37°C waarna de cellen gefixeerd werden. Het aantal
vesikels per cel bij de blanco (0 µM amantadine) was niet significant verschillend van PAM die
bij 4°C geïncubeerd werden.
Bij zowel sucrose als amantadine werd een vermindering van internalisatie vastgesteld. De
dosis afhankelijke respons wordt in Figuur 22 weergegeven. Telkens werd het aantal vesikels per
cel relatief uitgezet ten opzichte van de blanco (0µM inhibitor). Zowel amantadine als sucrose
hadden een dosis afhankelijk effect. Incubatie van PAM met 500 µM amantadine gaf aanleiding
tot 55 % reductie van internalisatie (significant op het p=0,01 niveau). Sucrose kon de
internalisatie met 94% reduceren bij een concentratie van 450 µM (significant op het p=0,01
niveau). Opvallend was ook dat niet alleen het aantal vesikels werd beïnvloed door de
inhibitoren, maar ook de distributie ervan in de cel. Bij hogere concentraties van de inhibitoren
werden de vesikels vooral tegen de celmembraan aangetroffen.
Resultaten 59
0 µM0 µM
0 µM
Figuur 22. Inhibitie
amantadine (A) en su
grafiek. Waarden die
met 1 (p=0,05) of 2 (p
1 z-zektie genomen d
concentratie. De vesik
A.
B.
0
20
40
60
80
100
120
0 125 250 500
Concentratie Am antadine (µM )
Relatief aantal vesikels per
*
**
**
125 µM 500 µM125 µM 500 µM
0
20
40
60
80
100
120
0 150 450
Concentratie sucrose (µM )
Relatief aantal vesikels per
*
**
450 µM150 µM
van clathrine gemedieerde endocytose in PAM door incubatie met
crose (B). De dosis afhankelijke respons wordt telkens weergegeven in de
significant verschillen van de blanco (0µM inhibitor) werden aangeduid
=0,01) sterretjes. De foto’s onder elke grafiek zijn confocale beelden van
oor het midden van de cel en geven een typisch beeld bij de aangeduide
els werden aangeduid met een pijltje. (Schaal = 5µm)
Resultaten
CH3OCN
CN
HOCN
CNHO
HO
OH
CH2
C
COOH
H+H3N
OH
CH2
C
COOH
H+H3N
60
Tyrphostine 1
Tyrphostine 25
Figuur 23. Chemische structuur van tyrosine en de tyrosine zijketen analogen tyrphostine 1 en 25.
Tyrosine
Om te bepalen of tyrosine fosforylatie belangrijk is bij de internalisatie van sialoadhesine
werden twee tyrosine fosforylatie inhibitoren uitgetest, typhostine 25 en genisteïne. Tyrphostines
zijn chemische analogen van de tyrosine zijketen (Figuur 23) en werden oorspronkelijk gebruikt
als substraatcompetitieve inhibitoren van tyrosine kinases die een YxxΦ sekwentie fosforyleren.
Omdat deze sekwentie ook herkend wordt door µ2 adaptine van AP2 werd vermoed dat µ2 en
bepaalde tyrosine kinasen een zelfde bindingsplaats bezitten voor YxxΦ. Daarom kunnen
tyrphostines ook de binding van µ2 adaptine op het YxxΦ motief verhinderen door competitie
voor het zelfde substraat. Crump et al. (1998) konden aantonen dat tyrphostine 25 de interaktie
tussen µ2 adaptine en het YxxΦ motief van TGN38 gedeeltelijk kan inhiberen en dat de werking
van tyrphostine 25 voornamelijk te wijten is aan de inhibitie van tyrosine kinasen. Ook
genisteïne inhibeert tyrosine-specifieke proteïne kinasen (Akiyama et al., 1987). In deze assay
werd gebruik gemaakt van tyrphostine 25 en als negatieve controle werd tyrphostine 1 gebruikt,
een inactieve vorm. Opnieuw werd een dosisafhankelijke respons waargenomen bij zowel
tyrphostine 25 en genisteïne. Tyrphostine 25 verminderde significant (p=0,01) de internalisatie
met 69% bij een concentratie van 250 µM (Figuur 24A). Het aantal vesikels per cel na incubatie
met tyrphostine 1 was voor alle concentraties behalve 0 µM, significant (p=0,01) hoger dan
aantal vesikels na incubatie met tyrphostine 25. Genisteïne reduceerde de internalisatie
significant (p=0,01) met 89% bij een concentratie van 100 µM (Figuur 24B).
Resultaten 61
0 µM
0µM
Figuur 24. Inhibitie van
twee tyrosine fosforylat
de grafiek. Waarden di
met 1 (p=0,05) of 2 (p=0
zektie genomen door
concentratie tyrphostin
5µm)
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200 250
Concentratie Tyrphostine (µm )
Relatief aantal vesikels per
Tyrphostine1
Tyrphostine25
**
**
**
****
*
250 µM100 µM
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Concentratie genisteïne (µM )
Relatief aantal vesikels pe
****
**
450µM450µM150µM
endocytose in PAM door incubatie met tyrphostine (A) en genisteïne (B),
ie inhibitoren. De dosis afhankelijke respons wordt telkens weergegeven in
e significant verschillen van de blanco (0µM inhibitor) werden aangeduid
,01) sterretjes. De foto’s onder elke grafiek zijn confocale beelden van 1 z-
het midden van de cel en geven een typisch beeld bij de aangeduide
e25 of genisteïne. De vesikels werden aangeduid met een pijltje. (Schaal =
Resultaten 62
4.2 Opstellen van een model voor sialoadhesine gemedieerde endocytose
Om te kunnen bepalen of sialoadhesine op tyrosine gebaseerde signalen bevat die
noodzakelijk zijn voor internalisatie, is het noodzakelijk om een model op punt te stellen waarin
mutanten van sialoadhesine kunnen bestudeerd worden. Daarom werd gezocht naar een cellijn
die na transfectie met het cDNA van sialoadhesine, sialoadhesine tot expressie brengt op de
plasmamembraan en waar het endocytoseproces van sialoadhesine gelijkaardig verloopt als in
PAM.
4.2.1 HEK-T
Omdat HEK-T cellen bij wassen en kleuren vrij gemakkelijk loskomen van de inserts waarop
ze zich vasthechten werd eerst gezocht naar een optimale coating. Van de coatings die werden
getest (collageen, lamininine, ornithine, BSA en ornithine-laminine) gaf de ornithine-laminine
coating de beste resulaten.
Vervolgens werd nagegaan of HEK-T cellen kunnen getransfecteerd worden met het cDNA
van sialoadhesine en of sialoadhesine tot expressie komt op de celmembraan. HEK-T cellen
werden getransfecteerd met de calcium-fosfaat methode en 1 dag later immunofluorescent
gekleurd bij 4°C met Mas 41D3, gericht tegen sialoadhesine, en GαM-FITC. Met behulp van
confocale microscopie kon sialoadhesine gelokaliseerd worden op de celmembraan en werd
opnieuw de typisch puntige distributie waargenomen zoals gezien werd bij PAM (Figuur 25).
Daarna werd het endocytoseproces bestudeerd met Mas 41D3. De cellen werden op
verschillende tijdstippen na de shift naar 37°C gefixeerd met paraformaldehyde,
Figuur 25. Puntige distributie van sialo
en GαM-FITC (bij 4°C) De foto geeft
hoogte van de apikale celmembraan. (Sc
adhesine in de membraan van HEK-T na kleuring met Mas 41D3
een confocaal beeld weer van één enkele z-sektie genomen ter
haal=5 µm)
Resultaten 63
gepermeabiliseerd en immunofluorescent gekleurd. Door middel van confocale microscopie kon
vastgesteld worden dat HEK-T zelfs na 60 minuten internalisatie slechts een paar intracellulaire
vesikels hadden (gemiddeld 2 vesikels).
Het endocytoseproces kon efficiënter gemaakt worden door gebruik te maken van het
secundair antilichaam GαM-FITC (gemiddeld 5 vesikels per cel). HEK-T cellen werden
daarvoor eerst 1 uur bij 4°C geïncubeerd met Mas 41D3 en daarna 1 uur met GαM-FITC,
eveneens bij 4°C. Door dit secundair antilichaam worden sialoadhesine eiwitten op de membraan
sterker samengetrokken, wat in dit geval aanleiding geeft tot een sterker endocytotisch signaal.
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
Incubatieduur bij 37°C (min)
Rel
taie
f aan
tal c
elle
n m
et e
ndoc
ytos
e (%
)
120
Figuur 26. Kinetiek van door Mas 41D3 geïnduceerde endocytose in HEK-T.
De kinetiek van opname van sialoadhesine wordt weergegeven in Figuur 26. Telkens werden
willekeurig 25 cellen geanalyseerd met behulp van confocale microscopie. Van elke cel werd om
de µm een z-sectie genomen en het aantal vesikels per sectie geteld. Het gemiddeld aantal cellen
die meer dan 3 interne vesikels hadden werd relatief uitgezet ten opzichte van het maximum op
120 minuten. Reeds na 15 minuten bij 37°C werden vesikels gevormd in PAM, en op 120
minuten werd het maximum bereikt. De internalisatie kon echter niet geremd worden door
amantadine. Daarom werden de andere inhibitoren niet meer getest en werden de HEK-T als
model uitgesloten.
Resultaten 64
4.2.2 RK13
RK13 cellen werden door middel van de calcium-fosfaat methode getransfecteerd met het
cDNA van sialoadhesine. Na 24 uur vertoonden de cellen een goede expressie van sialoadhesine
op de celmembraan. Voor de endocytose assay werd hetzelfde protocol gevolgd als bij de HEK-
T, waarbij de receptoren samengetrokken werden met Mas 41D3 en GαM-FITC. De cellen
bleken echter na 30 minuten al tot 50x meer vesikels opgenomen te hebben dan PAM, wat kan
wijzen op aspecifieke opname (Figuur 27). Daarom werden deze cellen geweerd als model.
Figuur 27. Internalisatie van sialoadhe
37°C. Op de figuur is een confocaal be
(Schaal=5 µm)
4.2.3 SK
Ook deze cellen werden getran
endocytose assay werd hetzelfde
confocale analyse konden slechts ee
cellijn niet verder gebruikt werd.
4.2.4 PK15
PK15 cellen werden getransfec
transfectie bracht 5% van de cellen
puntige distributie gelijkaardig aan
sine in RK13, gefixeerd en gekleurd 30 minuten na de shift naar
eld weergegeven van één enkele z-sektie in het midden van de cel.
sfecteerd volgens de calcium-fosfaat methode. Voor de
protocol gevolgd als voor HEK-T en RK13 cellen. Na
n paar vesikels per cel gedetecteerd worden, waardoor deze
teerd met het lipofectamine-plus reagens. Eén dag na
sialoadhesine tot expressie op de celmembraan, waarbij een
die in macrofagen werd waargenomen (Figuur 28). Voor de
Resultaten 65
endocytose-assay werd hetzelfde
waarbij sialoadhesine gegroepeerd
weergegeven in Figuur 29. Telke
opzichte van het maximum op 12
intracellulaire vesikels waargenom
aantal vesikels met een maximum
Figuur 28. Puntige distributie van sia
GαM-FITC (bij 4°C). De foto geeft e
van de celmembraan. (Schaal=5 µm)
De internalisatie werd visueel c
30). De membraan werd gekleurd
plasmamembraan kleurt (Figuur
membraan en zitten dus in het cyt
Hoechst (Figuur 30C).
Om het endocytoseproces te k
zoals bij PAM. Bij het uittesten va
PAM. Het endocytoseproces we
antilichaam te gebruiken. Alle in
afhankelijk effect in PK15 (Figure
toevoegen van 500 µM amantadin
79%. Deze dalingen zijn signific
tyrphostine en genisteïne hadden e
het endocytoseproces respektieve
loadhesine in de membraan van PK15 na kleuring met Mas 41D3 en
en confocaal beeld weer van één enkele z-sektie genomen ter hoogte
protocol gevolgd als voor de HEK-T, RK13 en SK cellen,
werd met GαM-FITC. De kinetiek van internalisatie wordt
ns werd het aantal cellen met endocytose relatief uitgezet ten
0 minuten. Vijftien minuten na de shift naar 37°C konden al
en worden (gemiddeld 2 vesikels per cel). Daarna steeg het
op 120 minuten (gemiddeld 6 vesikels per cel).
ontroleerd door een drievoudige kleuring uit te voeren (Figuur
met phalloïdine-Tx-red, dat het corticale actine net onder de
30A). De vesikels (Figuur 30B) zitten duidelijk onder de
oplasma van de cel (Figuur 30D). De kern werd gekleurd met
arakteriseren werden verschillende inhibitoren uitgetest net
n de inhibitoren werd steeds hetzelfde protocol gevolgd als bij
rd wel efficiënter gemaakt door GαM-FITC als secundair
hibitoren die gebruikt werden bij PAM, hadden een dosis
n 31 tot 32). Het aantal vesikels per cel daalde met 58% door
e. Door incubatie met sucrose (450 µM) daalde het aantal met
ant op het 0,01 niveau. De tyrosine fosforylatie inhibitoren
en dosisafhankelijk effect en reduceerden significant (p=0,01)
lijk met 65% en 74% bij een concentratie van 250 µM en
Resultaten 66
100 µM. Bij alle concentraties hoger dan 25 µM was het aantal vesikels per cel na incubatie met
tyrphostine 1 significant (p=0,01) hoger dan na incubatie met tyrphostine 25. Opvallend was dat
bij hogere concentraties inhibitoren de vesikels meer tegen de celmembraan aan te vinden waren.
Resultaten 67
F
p
fo
ty
µ
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
Incubatieduur bij 37°C (minuten)
Rel
atie
f aan
tal c
elle
n m
et e
ndoc
ytos
e (%
)
0 min 15 min 30 min
60 min 90 min 120 min
0 min 15 min 30 min
60 min 90 min 120 min
iguur 29. Kinetiek van door Mas 41D3 geïnduceerde endocytose in PK15. In de grafiek wordt
er tijdstip het relatief aantal cellen weergegeven die meer dan 3 vesikels hebben opgenomen. De
to’s onder de grafiek zijn confocale beelden van één z-sektie in PK15 en geven telkens een
pisch beeld op de verschillende tijdstippen. De vesikels zijn aangeduid met pijltjes. (Schaal= 5
m)
Resultaten 68
Figuur 30. Visuele controle van internalisatie in PK15. De figuren zijn confocale beelden van 1 z-
sektie in het midden van de cel. Corticale actine (A) werd gekleurd met phalloïdine-Tx-Red.
Sialoadhesine werd gekleurd met Mas 41D3 en GαM-FITC (B). De kern werd gekleurd met
Hoechst (C). Figuur D is een superpositie van A, B en C. (Schaal=5 µm)
Resultaten 69
0µM
0µM
Figuur 31. Inhibitie
amantadine (A) en s
de grafiek. Waarde
aangeduid met 1 (p=
beelden van 1 z-zekti
aangeduide concentr
A.
B.
0
20
40
60
80
100
120
0 125 250 500
Concentratie amantadine (µM)
Rel
atie
f aan
tal v
esik
els
per c
el (%
)
****
125µM 500µM
0
20
40
60
80
100
120
0 150 450
Concentratie sucrose (µM )
Relatief aantal vesikels per
*
**
450µM450µM150µM
van clathrine gemedieerde endocytose in PK15 door incubatie met
ucrose (B). De dosis afhankelijke respons wordt telkens weergegeven in
n die significant verschillen van de blanco (0µM inhibitor) werden
0,05) of 2 (p=0,01) sterretjes. De foto’s onder elke grafiek zijn confocale
e genomen door het midden van de cel en geven een typisch beeld bij de
atie. De vesikels werden aangeduid met een pijltje. (Schaal = 5µm)
Resultaten 70
0
20
40
60
80
100
120
0 50 100 150 200 250
Concentratie tyrphostine (µM )Relatief aantal vesikels per
Tyrphostine 25
Tyrphostine 1
*
**
** ****
0µM 100µM 250µM
0
20
40
60
80
100
120
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100
Concentratie genisteïne (µM )
Relatief aantal vesikels per
*
*
****
25µM25µM0µM 100µM
Figuur 32. Inhibitie van endocytose in PK15 door incubatie met tyrphostine (A) en genisteïne
(B), twee tyrosine fosforylatie inhibitoren. De dosis afhankelijke respons wordt telkens
weergegeven in de grafiek. Waarden die significant verschillen van de blanco (0µM inhibitor)
werden aangeduid met 1 (p=0,05) of 2 (p=0,01) sterretjes. De foto’s onder elke grafiek zijn
confocale beelden van 1 z-zektie genomen door het midden van de cel en geven een typisch
beeld bij de aangeduide concentratie tyrphostine25 of genisteïne. De vesikels werden
aangeduid met een pijltje. (Schaal = 5µm)
A.
B.
Resultaten 71
4.2.5 3D4
De 3D4 cellijn is een alveolaire macrofagen cellijn en dus wellicht ideaal als model aangezien
sialoadhesine van nature in deze macrofagen tot expressie komt en misschien bepaalde
cofactoren uit macrofagen nodig heeft om zijn functie correct uit te oefenen. Omdat 3D4 cellen
geen sialoadhesine tot expressie brengen, werden de cellen getransfecteerd met behulp van het
lipofectamine-plus reagens. Na transfectie brachten 3D4 cellen sialoadhesine in een typisch
puntige distrubutie op de membraan tot expressie (Figuur 33).
Figuur 33. Puntige distributie van sia
GαM-FITC (bij 4°C). De foto geeft e
van de celmembraan. (Schaal=5 µm)
Voor de endocytose-assay werd
PK15 cellen, waarbij sialoadhes
internalisatie wordt weergegeven i
relatief uitgezet ten opzichte van h
37°C werden gemiddeld 4 vesikels
maximum op 90 minuten (gemidd
werden verschillende inhibitoren g
cellen geïncubeerd met de op éé
resultaten van één experiment staa
respektievelijk bij een concentratie
64%. Tyrphostine 25 en genisteïn
internalisatie. De reduktie met tyrp
loadhesine in de membraan van 3D4 na kleuring met Mas 41D3 en
en confocaal beeld weer van één enkele z-sektie genomen ter hoogte
hetzelfde protocol gevolgd als voor de HEK-T, RK13, SK en
ine gegroepeerd werd met GαM-FITC. De kinetiek van
n Figuur 34. Telkens werd het aantal cellen met endocytose
et maximum op 90 minuten. Vijftien minuten na de shift naar
per cel waargenomen. Daarna steeg het aantal vesikels tot een
eld 8 vesikels). Om het endocytoseproces te karakteriseren
ebruikt, net zoals bij PAM. Voor elke inhibitor werden 3D4
n na hoogste concentratie die bij PAM werd gebruikt. De
n in Figuren 35 en 36. Amantadine en sucrose reduceerden
van 250 µM en 150 µM het endocytoseproces met 60% en
e gaven respektievelijk aanleiding tot 51% en 71% minder
hostine 1 bleef beperkt tot 14%.
Resultaten 72
F
w
o
g
m
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100
Incubatieduur bij 37°C (min)
Rel
atie
f aan
tal c
elle
n m
et e
ndoc
ytos
e (%
)
120
0 min 15 min 30 min
60 min 90 min 120 min
iguur 34. Kinetiek van door Mas 41D3 geïnduceerde endocytose in 3D4. In de grafiek
ordt per tijdstip het relatief aantal cellen weergegeven die meer dan 3 vesikels hebben
pgenomen. De foto’s onder de grafiek zijn confocale beelden van één z-sektie in 3D4 en
even telkens een typisch beeld op de verschillende tijdstippen. De vesikels zijn aangeduid
et pijltjes. (Schaal= 5 µm)
Resultaten 73
000
000
Figuur 35. Inhibitie van
(A) en sucrose (B). De
Waarden die significan
(p=0,05) of 2 (p=0,01) st
genomen door het midd
vesikels werden aangedu
A.
B.
0
20
40
60
80
100
120
0 250
Concentratie amantadine (µM)
Rel
atie
f aan
tal v
esik
els
per c
el (%
)
µM 250 µM µM µM 250 µM250 µM
0
20
40
60
80
100
120
0 150
Concentratie sucrose (µM)
Rel
atie
f aan
tal v
esik
els
per c
el (%
)
150 µM µM 150 µM150 µM µM µM
clathrine gemedieerde endocytose in 3D4 door incubatie met amantadine
dosis afhankelijke respons wordt telkens weergegeven in de grafiek.
t verschillen van de blanco (0µM inhibitor) werden aangeduid met 1
erretjes. De foto’s onder elke grafiek zijn confocale beelden van 1 z-zektie
en van de cel en geven een typisch beeld bij de aangeduide concentratie. De
id met een pijltje. (Schaal = 5µm)
Resultaten 74
Figuur 36. Inhibitie
twee tyrosine fosfory
de grafiek. Waarden
met 1 (p=0,05) of 2 (p
zektie genomen doo
concentratie tyrphos
5µm)
A.
B.
0
20
40
60
80
100
120
Tyrphostine 1 & 25 0 µM
Tyrphostine 1150µM
Tyrphostine 25150 µM
Rel
atie
f aan
tal v
esik
els
per c
el (%
)
0 µM 150 µM0 µM0 µM 150 µM150 µM
0
20
40
60
80
100
120
0 50
Concentratie genisteïne (µM)
Rel
atie
f aan
tal v
esik
els
per c
el
(%)
50 µM10 µM 50 µM50 µM10 µM10 µM
van endocytose in 3D4 door incubatie met tyrphostine (A) en genisteïne (B),
latie inhibitoren. De dosis afhankelijke respons wordt telkens weergegeven in
die significant verschillen van de blanco (0µM inhibitor) werden aangeduid
=0,01) sterretjes. De foto’s onder elke grafiek zijn confocale beelden van 1 z-
r het midden van de cel en geven een typisch beeld bij de aangeduide
tine25 of genisteïne. De vesikels werden aangeduid met een pijltje. (Schaal =
Discussie 75
5 DISCUSSIE
De opname van PRRSV werd reeds bestudeerd in PAM cellen en Marc-145 door Nauwynck et
al. (1999) en Kreutz & Ackerman (1996). In beide gevallen werd aangetoond dat PRRSV via een
clathrine gemedieerde weg opgenomen wordt. De vermoedelijke receptor voor PRRSV is
sialoadhesine daar Mas 41D3, gericht tegen sialoadhesine, de opname van PRRSV in PAM
volledig kon blokkeren. Daarenboven kan Mas 41D3, de binding van PRRSV met PAM
reduceren (Duan et al., 1998). Bovendien werd colokalistie tussen PRRSV en sialoadhesine/Mas
41D3 aangetoond en ook tussen sialoadhesine en clathrine (Vanderheijden et al., 2003; Duan et
al., 1998). Er wordt dan ook verondersteld dat sialoadhesine via clathrine gemedieerde
endocytose wordt opgenomen. De bedoeling van deze scriptie is om deze hypothese verder te
onderzoeken.
De hypothese werd eerst onderzocht in PAM, waarin sialoadhesine van nature tot expressie
komt (McWilliam et al., 1992). De internalisatie werd geïnduceerd met Mas 41D3. Deze
monoklonale antistof kan met zijn Fab regio twee sialoadhesine-moleculen binden, waardoor
sialoadhesine-moleculen gegroepeerd worden, wat aanleiding kan geven tot endocytose. Voor de
‘epidermal growth factor (EGF)’ receptor is bijvoorbeeld al aangetoond dat clusteren
noodzakelijk is voor interactie met het cytoskeleton (Van Belzen et al., 1991). Door PAM bij
4°C te incuberen met 15 µg Mas 41D3 per ml worden de sialoadhesine receptoren in PAM
verzadigd met Mas 41D3. Immers om infectie met PRRSV in PAM volledig te blokkeren met
Mas 41D3, is een veel lagere concentratie reeds voldoende (Duan et al., 1998). Bij 4°C gaat
vindt geen endocytose plaats, onder andere door afbraak van microtubili bij een temperatuur
lager dan 20°C en door een toegenomen riditeit van de celmembraan (Rode et al., 1997).
In deze scriptie werd aangetoond dat Mas 41D3 endocytose induceert in PAM. Na vijftien
minuten incubatie bij 37°C had reeds 25% van de PAM intracellulaire vesikels gevormd. Het
endocytoseproces werd waarschijnlijk wel vertraagd door de PAM eerst bij 4°C te incuberen met
Mas 41D3. Na de shift naar 37°C moeten de PAM immers eerst weer hun cellulaire processen
herstellen en microtubuli opbouwen. Het endocytoseproces bereikte een maximum na anderhalf
uur, daarna daalde het aantal vesikels per cel. Een mogelijkheid is dat na anderhalf uur het
lysosomale degradatie systeem Mas 41D3 en sialoadhesine sneller afbreekt dan het wordt
Discussie 76
opgenomen. Macrofagen zijn immers professioneel fagocyterende cellen met een goed werkend
lysosomaal systeem (Aderem & Underhill, 1999). Een andere mogelijkheid is dat na 90 minuten
minder sialoadhesine wordt opgenomen. Dit kan in overeenstemming zijn met feit dat na zelfs na
2 uur incubatie bij 37°C, nog steeds sialoadhesine kan waargenomen worden in de membraan en
dat dus niet alle sialoadhesine geïnternaliseerd wordt. Deze observatie werd bevestigd door
flowcytometrische analyse. Na 60 minuten incubatie bij 37°C werd slechts 28% van de
membraan geïnternaliseerd.
Om aspecifieke binding van Mas 41D3 met PAM te kunnen uitsluiten, werden PAM met Mas
13D12 geïncubeerd. Deze antistof is van hetzelfde isotype als 41D3 (IgG1) en is gericht tegen
glycoproteïne D van het suidherpesvirus type I (Nauwynck et al., 1995). Omdat na incubatie met
13D12 geen membraankleuring, noch een intracellulaire kleuring kon vastgesteld worden, mag
besloten worden dat de opname van Mas 41D3 specifiek is. Macrofagen hebben ook een Fc-
receptor die de Fc-zijde van antistoffen kan binden (Garcia-Garcia & Rosales, 2002). Als
bijkomende controle voor de Fc-receptor activiteit werd Mas 41D3 geïnduceerde endocytose
onderzocht na verzadiging van de Fc-receptoren met geintenserum. Omdat het aantal vesikels
niet significant daalde (data niet gegeven) mag besloten worden dat de vesikels in PAM enkel en
alleen afkomstig zijn van opname van Mas 41D3 door sialoadhesine.
Het is ook belangrijk te weten of sialoadhesine al dan niet spontaan opgenomen wordt in
PAM. Daarom werd endocytose geïnduceerd met Mas 41D3 of Mas 13D12 dat niet bindt met
sialoadhesine. Na fixatie van en permeabilisatie werden PAM gekleurd met Mas 41D3 en GαM-
FITC. Omdat na confocale analyse geen intracellulaire kleuring kon worden waargenomen bij
met Mas 13D12 geïncubeerde PAM, in tegenstelling met PAM die door Mas 41D3 werden
geïnduceerd, mag men besluiten dat sialoadhesine enkel opgenomen wordt na stimulatie met
Mas 41D3 en niet spontaan.
In deze scriptie werd ook aangetoond dat sialoadhesine waarschijnlijk via een clathrine
afhankelijk proces internaliseert. Specifieke inhibitoren konden immers het internalisatieproces
inhiberen. Amantadine, dat de ontmanteling van CCV verhindert (Phonphok Y.& Rosenthal
K.S., 1991), reduceerde het internalisatieproces met 55% bij een concentratie van 500 µM.
Sucrose, dat aanleiding geeft tot het vormen van kleine ledige CCV (Heuser & Anderson 1989),
reduceerde het internalisatieproces met 94%. Deze resultaten wijzen erop dat de vorming van
CCV belangrijk is bij de internalisatie van sialoadhesine. Tyrphostine 25, die naast tyrosine
Discussie 77
fosforylatie ook de binding van AP2 het YxxΦ motief verhindert (Crump et al., 1998), kon de
internalisatie van sialoadhesine sterk inhiberen. Dit is opnieuw een aanwijzing dat sialoadhesine
via een clathrine gemedieerde weg wordt opgenomen.
Ligand geïnduceerde endocytose van cellulaire receptoren is vaak afhankelijk van tyrosine
fosforylatie (Sibley et al., 1987). Zo is aangetoond dat binding van EGF (epidermal growth
factor) op zijn receptor, fosforylatie op tyrosine residu’s van de zware keten van clathrine
induceert (Wilde et al., 1999). Deze fosforylatie is betrokken bij de opbouw van clathrine
kooien. Ook EPS15 wordt na binding van EGF gefosforyleerd op tyrosine residu’s (van Delft et
al., 1997). Het feit dat genisteïne en tyrphostine 25, twee fosforylatie inhibitoren, de
internalisatie respektievelijk met 89% en 69% konden reduceren wijst er op dat tyrosine
fosforylatie een belangrijke rol speelt bij de internalisatie van sialoadhesine. Tyrphostine 1, de
inactieve vorm van tyrphostine 25, had weinig effect op het internalisatieproces. De tyrosine
fosforylatie pathway kan ook een verklaring bieden waarom bij hogere concentraties inhibitor,
de weinige vesikels in de cel vooral tegen de celmembraan gevonden worden. Immers indien een
receptor toch aan de inhibirende invloed van tyrphostine of genisteïne ontsnapt en internaliseert,
dan zal de internalisatie hoogst waarschijnlijk geremd worden in een later stadium van het
endocytoseproces. Er is bijvoorbeeld al aangetoond dat dynamine, dat de vesikels afsnoert van
de celmembraan, op tyrosine residuen gefosforyleerd wordt na activatie van de insuline receptor.
Ook bij EPS15 dat onder andere verantwoordelijk is voor correcte lokalisatie van dynamine naar
de membraan, werd tyrosine fosforylatie aangetoond (Paolo & Fox, 1999).
Om onder andere mutaties in de cytoplasmatische staart van sialoadhesine te kunnen
bestuderen, en te bepalen welke motieven in de staart belangrijk zijn voor het endocytoseproces,
werd gepoogd een model op te stellen voor de internalisatie van sialoadhesine. Hoewel HEK-T
cellen (Human embryo kidney) succesvol getransfecteerd werden met het cDNA van
sialoadhesine werd deze cellijn geweerd als model omdat amantadine geen effect had op het
endocytose proces. Dit kan erop wijzen dat HEK-T cellen, sialoadhesine niet via clathrine
gemedieerde endocytose opnemen, en dat HEK-T cellen bijgevolg geen goed model zijn.
Getransfecteerde RK13 cellen (Rabbit kidney) bleken na 30 minuten bij 37°C tot 50x meer
vesikels opgenomen te hebben dan PAM. De kans is dan ook reeël dat de opname van
sialoadhesine in RK13 cellen aspecifiek gebeurt - of toch tenminste niet via een gelijkaardig
mechanisme als in PAM - of dat de internalisatie ook gebeurt zonder stimulatie met Mas 41D3.
Discussie 78
Deze cellijn kan dus evenmin als model worden gebruikt. Getransfecteerde SK (Swine kidney)
cellen namen daarentegen te weinig op, waardoor geen statistisch betrouwbare tellingen konden
uitgevoerd worden en deze cellijn dus ook niet geschikt is als model.
De PK15 (Porcine kidney) cellijn is daarentegen wel een goed model voor de gemedieerde
internalisatie van sialoadhesine. De kinetiek van het internalisatieproces in PK15 heeft een
analoog verloop als bij de PAM (Figuur 37). Na 15 minuten incubatie bij 37°C had
respectievelijk 24% (PAM) en 6% (PK15) meer dan 3 interne vesikels gevormd. Het aantal
vesikels stijgt in beide cellijnen met de tijd en bereikt in PAM een maximum op 90 minuten
maar bij PK15 pas op 120 minuten. Het endocytoseproces in PK15 is dus minder efficiënt dan in
PAM, ook al omdat bij PK15 een secundair antilichaam nodig is om voldoende endocytose te
induceren. Van PK15 cellen die enkel met Mas 41D3 werden geïncubeerd, kon slechts in 10%
van de getransfecteerde cellen endocytose vastgesteld worden, terwijl dat met een secundair
antilichaam bij 80% van de getransfecteerde cellen het geval was. Deze resulaten wijzen er op
dat groepering van sialoadhesine belangrijk is bij de internalisatie van sialoadhesine.
0
20
40
60
80
100
120
0 20 40 60 80 100 120
Incubatieduur bij 37°C (min)
Rel
atie
f aan
tal c
elle
n et
end
ocyt
ose
(%)
PK15PAM
Figuur 37. Vergelijking van internalisatie van sialoadhesine in PAM en PK15. In de grafiek is het
gemiddeld aantal cellen met endocytose weergegeven in functie van de incubatieduur bij 37°C.
Het verschil tussen PAM en PK15 kan te wijten zijn aan het celtype. In tegenstelling tot PK15
cellen, delen in cultuur gebrachte PAM niet meer zodat zij meer energie ter beschikking kunnen
stellen voor het endocytoseproces. Bovendien gebruiken PK15 cellen na transfectie veel van hun
Discussie 79
energie voor de aanmaak van het sialoadhesine eiwit. Het belangrijkste verschil is waarschijnlijk
dat PAM professionele fagocyterende en endocyterende cellen zijn (Garcia-Garcia & Rosales,
2002) en dus beter uitgerust zijn om Mas 41D3 op te nemen. Dit kan tevens een verklaring geven
waarom na 2 uur het aantal vesikels in PAM daalt en in PK15 niet. Door inwerking van
lysosomale enzymen kan Mas 41D3 immers vernietigd worden, zodat bij kleuring met GαM-
FITC deze niet meer te detecteren zijn.
Om na te gaan of sialoadhesine via clathrine gemedieerde endocytose opgenomen wordt net
als in PAM, werden de inhibitoren die gebruikt werden bij de PAM, uitgetest op PK15 cellen. In
beide celtypes werd een dosisafhankelijk respons waargenomen. De redukties bekomen in beide
cellijnen wordt vergeleken Tabel 6. Uit de tabel blijkt duidelijk dat de internalisatie in PK15
cellen op een analoge wijze geïnhibeerd wordt door de verschillende inhibitoren. Enkel de
hoogste concentratie sucrose en de laagste concentratie tyrphostine waren significant
verschillend in PAM en PK15. Daaruit mag besloten worden dat het internalisatieproces volgens
een zelfde mechanisme verloopt als in PAM. PK15 cellen kunnen dus als model dienen voor de
internalisatie van sialoadhesine.
Discussie 80
Inh
Am
Su
Ty
Ty
Ge
Tabel 6. Vergelijking van reduktie van internalisatie in PAM en PK15 cellen.
Gemiddelde
reduktie in aantal
vesikels (%)
ibitor Concentratie
(µM)
In PAM In PK15
Significantie
van verschil
antadine 125 12,4 24,6 -
250 63,62 55,47 -
500 54,93 60,11 -
crose 150 47,96 60,96 -
450 94 78,4 P=0,01
rphostine 25 25 33,01 10,64 P=0,05
50 41,62 37,74 -
100 69,83 62,24 -
150 96,54 59,75 -
250 68,29 64,87 -
rphostine 1 25 -4,29 1,31 -
50 0,49 10 -
100 19,32 6,6 -
150 15,08 12,4 -
250 18,07 21,43 -
nisteïne 10 22,75 31,93 -
25 70,6 52,11 -
50 80,47 66,41 -
100 88,69 77,04 -
Discussie 81
Een tweede cellijn die werd uitgetest was de 3D4 macrofagen cellijn. De kinetiek van
internalisatie wordt met PAM vergeleken in Figuur 38. Uit de Figuur blijkt dat de internalisatie
vrij identiek verloopt als bij PAM. Beide celtypes bereiken een maximum op 90 minuten waarna
een lichte daling kan worden waargenomen in het aantal vesikels. Aangezien de inhibitoren in
3D4 cellen slechts eenmalig getest werden kan hierop geen statistische toets gebruikt worden.
Toch geeft Tabel 7 een indicatie van de verschillen tussen PAM en 3D4. Uit de tabel blijkt dat de
redukties in PAM en 3D4 vergelijkbaar zijn, met uitzondering voor tyrphostine 25 waar de
reduktie in 3D4 een stuk lager ligt. Desalniettemin toont Tabel 7 aan dat de internalisatie in 3D4
gelijkaardig is dan in PAM en dat 3D4 cellen waarschijnlijk een goed model zijn voor
sialoadhesine gemedieerde endocytose.
0
20
40
60
80
100
120
140
0 20 40 60 80 100 120
Incubatieduur bij 37°C (min)
Rel
atie
f aan
tal c
elle
n m
et e
ndoc
ytos
e (%
)
PAM3D4
Figuur 38. Vergelijking van internalisatie van sialoadhesine in PAM en 3D4. in de grafiek is het
gemiddeld aantal cellen met endocytose weergegeven in functie van de incubatieduur bij 37°C.
Discussie 82
Tabel 7. Vergelijking van reduktie van internalisatie in PAM en 3D4 cellen.
Gemiddelde
reduktie in aantal
vesikels (%)
Inhibitor Concentratie
(µM)
In
PAM
In 3D4
Amantadine 500 54,93 59,82
Sucrose 150 47,96 63,77
Tyrphostine 25 150 96,54 50,91
Tyrphostine 1 150 15,08 13,64
Genisteïne 50 80,47 70,37
Bij vergelijken van de internalisatie van sialoadhesine in PK15 en 3D4, mag men besluiten dat
3D4 cellen waarschijnlijk het beste model zijn. De kinetiek bij 3D4 is immers quasi identiek aan
die bij PAM en ook de redukties, behalve bij tyrphostine 25, zijn vrij identiek aan PAM. Het
3D4 model heeft ook als voordeel dat 3D4 cellen alveolaire macrofagen zijn, net zoals PAM en
dus ook beter uitegerust zijn als professioneel fagocyterende en endocyterende cellen. Voor de
verdere studie van (mutant) sialoadhesine kunnen beide cellijnen dus gebruikt worden als model,
maar 3D4 zijn waarschijnlijk het meest geschikt.
.
Besluit 83
6 BESLUIT
Reeds eerder werd aangetoond dat een 210kDa proteïne betrokken is bij de opname van
PRRSV in PAM. Later werd dit proteïne geïdentificeerd als het porciene sialoadhesine. In deze
scriptie werd met behulp van monoklonale antilichamen gericht tegen sialoadhesine en confocale
microscopie, aangetoond dat sialoadhesine via clathrine gemedieerde endocytose wordt
opgenomen in PAM. Incubatie van PAM met verscheidene inhibitoren van clathrine
gemedieerde endocytose resulteerde in sterke inhibitie van endocytose en toonde aan dat de
opname van sialoadhesine via clathrine gemedieerde endocytose verloopt. Controle antilichamen
van hetzelfde isotype resulteerden niet in internalisatie. Er werd ook aangetoond dat de opname
in PAM niet spontaan gebeurt waardoor besloten kan worden dat de opname van sialoadhesine
in PAM specifiek gebeurt en meer bepaald door receptor gemedieerde endocytose via clathrine.
Naar de toekomst toe is het de bedoeling om met behulp van mutanten te zoeken naar de
signalen in cytoplasmatische staart van sialoadhesine die aanleiding geven tot endocytose. Voor
dergelijk onderzoek is het nodig om een systeem te vinden waarin men sialoadhesine tot
expressie kan laten komen, en waarin de internalisatie van sialoadhesine gelijkaardig is als in
PAM. In deze scriptie werd aangetoond dat PK15 cellen en ook 3D4 cellen geschikt zijn als
modelsysteem. De internalisatie in PAM, PK15 en 3D4 was immers vrij analoog en bovendien
gaven de verschillende inhibitoren van clathrine gemedieerde endocytose aanleiding tot
gelijkaardige redukties.
Om te bepalen of de motieven in de cytoplasmatische staart van sialoadhesine belangrijk zijn
voor endocytose werd in het kader van deze scriptie gestart met de aanmaak van een staartloze
mutant. Wegens tijdsgebrek is het protocol nog niet volledig geoptimaliseerd. Verder onderzoek
is dus nodig om het protocol te optimaliseren en het effect van deze staartloze mutant op
endocytose te onderzoeken.
Referentielijst 84
7 REFERENTIELIJST Achiriloaie M., Barylko B. & Albanesi J.P. (1999). Essential role of the dynamin pleckstrin homology domain in
receptor mediated endocytosis. Molecular and cellular biology, 19(2), 1410-1415.
Aderem A. & Underhill D.M. (1999). Mechanisms of phagocytosis in macrophages. Annual reviews of
immunology, 17, 593-623.
Akiyama T., Ishida J., Nakagawa S., Ogawara H., Watanabe S., Itoh N., Shibuya M. & Fukami Y. (1987).
Genistein, a specific inhibitor of tyrosine-specific protein kinases. Journal of biological chemistry, 262 (12), 5592-
5595.
Alberts B., Bray D., Lewis J., Raff M., Roberts K. & Watson J.D. (1994). Molecular biology of the cell. Derde
druk, New York, Garland Publishing, Inc., 1293p.
Beck K.A. & Keen J.H. (1991). Interaction of phosphoinositide cycle intermediates with the plasma membrane
associated clathrin assembly protein AP-2. Journal of biological chemistry, 266(7), 4442-4447.
Benfield D.A., Nelson E., Collins J.E., Harris L., Goyal S.M., Robinson D., Christianson W.T., Morrison R.B.,
Gorcyca D. & Chladek D. (1992). Characterisation of swine infertility and respiratory syndrome (SIRS) virus
(isolate ATCC VR-2332). Journal of veterinary diagnostic investigation, 4, 127-133.
Beningo K.A. & Wang Y. (2002). Fc-receptor-mediated phagocytosis is regulated by mechanical properties of
the target. Journal of cell science, 115, 849-856.
Benmerah A., Bayrou M., Cerf-Bensussan N. & Dautry-Varsat A. (1999). Inhibition of clathrin-coated pit
assembly by an EPS15 mutant. Journal of cell science, 112, 1303-1311.
Benmerah A., Lamaze C., Bègue B., Schmid S.L., Dautry-Varsat A. & Cerf-Bensussan N. (1998). AP-2/EPS15
interaction is required for receptor-mediated endocytosis. Journal of cell biology, 140, 1055-1062.
Benmerah A., Poupon V., Cerf-Bensussan N. & Dautry-Varsat A. (2000). Mapping of EPS15 domains involved
in its targeting to clathrin-coated pits. The journal of biological chemistry, 5, 3288-3295.
Bild A.H., Turkson J. & Jove R. (2002). Cytoplasmatic transport of stat3 by receptor-mediated endocytosis.
European molecular biology organisation, 21(13), 3255-3263.
Referentielijst 85
Bishop N.E. (1997). An update on non-clathrin coated endocytosis. Reviews in medical virology, 7, 199-207.
Bodaghi B., Slobbe-van Drunen M.E., Topilko A., Vossen R.C., van Dam-Mieras M.C., Zipeto D., Virelizier J.L.
LeHoang P., Bruggeman C.A. & Michelson S. (1999). Entry of human cytomegalovirus into retinal pigment
epithelial and endothelial cells by endocytosis. Investigative ophtalmology & visual science, 40, 2598-2607.
Boll W., Rapoport I., Brunner C., Modis Y., Prehn S. & Kirchhausen T. (2002). The µ2 subunit of the clathrin
adaptor AP-2 binds to FDNPVY and YppØ sorting signals at distinct sites. Traffic, 3, 590-600.
Bonifacino J.S. & Dell’Angelica E.C. (1999). Molecular bases for the recognition of tyrosine-based sorting
signals. The journal of cell biology, 5, 923-926.
Brinkman-Van der Linden E.C.M & Varki A. (2000). New aspects of siglec binding specifities, including the
significance of fucosylation and of the sialyl-Tn epitope. Journal of biological chemistry, 275(12), 8625-8632.
Buck K.W. (1996). Comparison of the replication of positive stranded RNA virusses of plants and animals.
Advances in virus research, 47, 159-251.
Calhoun B.C., Lapierre L.A., Chew C.S. & Goldenring J.R.(1998). Rab11a redistributes to apical secretory
canaliculus during stimulation of gastric parietal cells. American journal of physiology, 275(1 pt 1), C363-370.
Casanova J.E., Wang X., Kumar R., Barthur S.G., Naverre J., Woodrum J.E., Altschuler Y., Ray G.S. &
Goldenring J.R. (1999). Association of rab25 and rab11a with the apical recycling system of polarized Madin-Darby
canine kidney cells. Molecular biology of the cell, 10(1), 47-61.
Cavanagh D. (1997). Nidovirales: a new order comprising Coronaviridae and arteriviridae. Archives of virology,
142, 629-633.
Ceresa B.P. & Schmid S.L. (2000). Regulations of signal transduction by endocytosis. Current opinion in cell
biology, 12, 204-210.
Chen W, Feng Y., Chen D. & Wandinger-Ness A. (1998). Rab11 is required for trans-golgi network-to-plasma
membrane transport and a preferential target for GDP dissociation inhibitor. Molecular biology of the cell, 9(11),
3241-3257.
Christoforidis S., McBride H.M., Burgoyne R.D. & Zerial M. (1999). The Rab5 effector EEA1 is a core
component of endosome docking. Nature, 397(6720), 621-625.
Referentielijst 86
Clague M.J. (1998). Molecular aspects of the endocytic pathway. Biochemical journal, 336, 271-282.
Collins J.E., Benfield D.A., Christianson W.T., Harris L., Hennings J.C., Shaw D.P., Goyal S.M., McCullough
S., Morrison R.B., Joo H.S., Gorcyca D. & Chladek D. (1992). Isolation of swine infertility and respiratory
syndrome virus (isolate ATCC VR-2332) in north America and experimental reproduction of the disease in
gnotobiotic pigs. Journal of veterinary diagnastic investigation, 4, 117-126.
Conner S.D. & Schmid S.L. (2002). Identification of an adaptor-associated kinase, AAK1, as a regulator of
clathrin-mediated endocytosis. The journal of cell biology, 156(5), 921-929.
Conzelmann K.K., Visser N., Van Woensel P. & Thiel H.J. (1993). Molecular characterization of porcine
reproductive end respiratory syndrome virus, a member of the arteritis group. Virology, 192, 1-11.
Crocker P.R., Vinson M., Kelm S. & Drickamer K. (1999). Molecular analysis of sialoside binding to
sialoadhesin by NMR and site-directed mutagenese. Biochemical journal, 341, 355-361.
Crocker P.R., Hartnell A., Munday J. & Nath D. (1997). The potential role of sialoadhesin as a macrophage
recognition molecule in health and disease. Glycoconjugate journal, 14, 601-609.
Crump C.M., Williams J.L., Stephens D.J. & Banting G. (1998). Inhibition of the interaction between tyrosine-
based motifs and the medium chain subunit of the AP-2 adaptor complex by specific tyrphostins. Journal of
biological chemistry, 273(43), 28073-28077.
Cupers P., ter Haar E., Boll W. & Kirchhausen T. (1997). Parallel dimers and anti-parallel tatramers formed by
epidermal growth factor receptor pathway substrate clone 15 (EPS15). Journal of biological chemistry, 272(52),
33430-33434.
Daro E., Van Der Sluijs P., Galli T. & Mellman I. (1996). Rab4 cellubrevin define different early endosome
populations on the transferrin receptor recycling. Proceedings of the national academy of sciences of the united
states of America, 93, 9559-9564.
Dea S., Bilodeau R., Athanaseous R., Sauvageau R.A. & Martineau G.P. (1992). PRRS syndrome in Quebec:
isolation of a virus serologically related to Lelystad virus. Veterinary Record, 130, 167.
Dea S., Gagnon A., Mardassi H., Piradeh B. & Rogan D. (2000). Current knowledge on the structural proteins of
porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European
isolates. Archives of virology, 145, 659-688.
Referentielijst 87
Delputte P.L., Venderheijden N., Nauwynck H.J. & Pensaert M.B. (2002). Involvement of the matrix protein in
attachment of porcine reproductive and respiratory syndrome virus to a heparinlike receptor on porcine alveolar
macrphages. Journal of virology, 76(9), 4312-4320.
Duan X., Nauwynck H.J. & Pensaert M.B. (1997). Effects of origin and state of differentiation and activation of
monocytes/macrophages on their susceptibility to porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV).
Archives of virology, 142, 1-15.
Duan X., Nauwynck H.J., Favoreel H.W. & Pensaert M.B. (1998). Identification of a putative receptor for
porcine reproductive and respiratory syndrome virus on porcine alveolar macrphages. Journal of virology, 72(5),
4520-4523.
Duman J.G., Tyagarajan K., Kolsi M.S., Moore H.P.& Forte J.G.(1999). Expression of Rab11a N124I in gestric
parietal cells inhibits stimulatory recruitment of the H+-K+-ATPase. American journal of physiology, 277(3 pt 1),
C361-372.
Forgac M. (2000). Structure, mechanism and regulation of the clathrin-coated vesicle and yeast vacuolar H+-
ATPases. The journal of experimental biology, 203, 71-80.
Freeman S., Birrell H.C., D’Alessio K., Erickson-Miller C., Kikly K. & Camilleri P. (2001). A comparative study
of the asparagine-linked oligosaccharides on siglec-5, siglec-7 and siglec-8, expressed in a CHO cell line, and their
contribution to ligand recognition. European journal of biochemistry, 268, 1228-1237.
Gaidarov I., Santini F., Warren R.A. & Keen J.H. (1999). Spatial control of coated-pit dynamics in living cells.
Nature, 1(1), 1-7.
Garcia-Garcia E. & Rosales C. (2002). Signal transduction during Fc receptor-mediated phagocytosis. Journal of
leukocyte biology, 72, 1092-1108.
Ghosh R.N., Mallet W.G., Soe T.T., McGraw T.E. & Maxfield F.R. (1998) An endocytosed TGN38 chimeric
protein is delivered to the TGN after trafficking through the endocytic compartment in CHO cells. Journal of cell
biology, 142(4), 923-936.
Gordon S. (1998). The role of the macrophage in immune regulation. Research in immunology, 149(7-8), 685-
688.
Greene B., liu S., Wilde A. & Brodsky F.M. (2000). Complete reconstruction of clathrin basket formation with
recombinant protein fragments: adaptor control of clathrin self-assembly. Traffic, 1, 69-75.
Referentielijst 88
Gu F. & Gruenberg J. (1999). Biogenesis of transport intermediates in the endocytic pathway. Federation of
European biochemical societies, 452, 61-66.
Heuser J.E. & Anderson R.G. (1989). Hypertonic media inhibit receptor-mediated endocytosis by blocking
clathrin-coated pit formation. Journal of cell biology, 108(2), 389-400.
Hewlett L.J., Prescott A.R. & Watts C. (1994). The coated pit and macropinocytic pathways serve distinct
endosome populations. Journal of cell biology, 124, 689-703.
Hill E., van der Kaay J., Downes C.P. & Smythe E. (2001). The role of dynamin and its binding partners in
coated pit invagination ans scission. The journal of cell biology, 2, 309-323.
Hunter S., Kamoun M. & Schreiber A.D. (1994). Transfection of an Fcγ receptor cDNA induces T cells to
become become fagocytic. Proceedings of the national academy of sciences of the united states of America, 91,
10232-10236.
Hunziker W. & Peters P.J. (1998). Rab17 localizes to recycling endosomes and regulates receptor-mediated
transcytosis in epithelial cells. The journal of biological chemistry, 273(25), 15734-15741.
Joki-Korpela P., Marjomaki V., Krogerus C., Heino J. & Hyypia I. (2001). Entry of human parechovirus 1.
Journal of virology, 75, 1958-1967.
Keffaber K.K. (1989). Reproductive failure of unknown etiology. American association of swine practitices
newletter, 1, 1-10.
Korade-Mirnics Z. & Corey S.J. (2000). Src kinase-mediated signalling in leukocytes. Journal of leukocyte
biology, 68, 603-613.
Kreutz L.C. & Ackerman M.R. (1996). Porcine reproductive and respiratory syndrome virus enters cells through
a low pH-dependant endocytic pathway. Virus research, 42, 137-147.
Krizanová O., Ciampor F. & Verber P. (1982). Influence of chlorpromazine on the replication of influenza virus
chick embryo fibroblasts. Acta virology, 26, 209-216.
Lafer E.M. (2002). Clathrin-protein interactions. Traffic, 3, 513-520.
Referentielijst 89
Lamaze C., Dujeancourt A., Baba T., Lo C.G., Benmerah A. & Dautry-Varsat A. (2001). Interleukin 2 receptors
and detergent-resistant membrane domains define a clathrin-independent endocytic pathway. Molecular cell, 7, 661-
671.
Lindhaus W. & Lindhaus B. (1991). Ratselhafte Sweinekrankheitt. Der praktische Tierarzt, 5, 423-425.
Lodish H., Berk A., Zipursky S.L., Matsudaira P., Baltimore D., Darnell J. (2001). Molecular cell biology. Derde
druk, New York, W.H. Freeman and company, 1084p.
Lütcke A., Parton R.G., Murphy C., Olkkonen V.M., Dupree P., Valencia A., Simons K. & Zerial M. (1994).
Cloning and subcellular localisation of novel rab proteins rerveals polarized and cell type-specific expression.
Journal of cell science, 107(pt.12), 3437-3448.
Luttrell L.M. & Lefkowitz R.J. (2002). The role of β-arrestins in the termination and transduction of G-protein-
coupled receptor signals. Journal of cell science, 115, 455-465.
Luzio J.P., Rous B.A., Bright N.A., Pryor P.R., Mullock B.M., Piper R.C. (2000). Lysosome-endosome fusion
and lysosome biogenesis. Journal of cell science, 113, 1515-1524.
Mallard F., Antony C., Tenza D., Salamero J., Goud B.& Johannes L. (1998). Direct pathway from early-
recycling revealed through the study of shiga toxin B-fragment transport. Journal of cell biology, 143(4), 973-990.
Mallet W.G. & Maxfield F.R. (1999). Chimeric forms of furin and TGN38 are transported with the plasma
membrane in the trans-Golgi network via distinct endosomal pathways. Journal of cell biology, 146(2), 345-359.
Mardassi H., Massie B. & Dea S. (1996). Intracellular synthesis, processing and transport of proteins encoded by
ORFs 5 to 7 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Virology, 221, 98-112.
Marechal V., Prevost M.C., Petit C., Perret E., Heard J.M. & Schwartz O. (2001). Human Immunodeficiency
virus type 1 entry into macrophages mediated by macropinocytosis. Virology, 75, 1856-1865.
Marjomaki V., Pietiainen V., Matilainen H., Upla P., Ivaska J., Nissinen L., Reunanen H., Huttunen P., Hyypia T.
& Heino J. (2002). Internalisation of echovirus 1 in caveolae. Virology, 76, 1856-1865.
Marks B., Stowell M.H.B., Vallis Y., Mills I.G., Gibson A., Hopkins C.R. & McMahon H.T. (2001). GTPase
activity of dynamin and resulting change are essential for endocytosis. Nature, 410, 231-235.
Referentielijst 90
Marsh M. & Bron R. (1997). SFV infection in CHO cells: cell-type specific restrictions to productive virus entry
at the cell surface. Journal of cell science, 110(pt 1), 95-103.
Marsh M. & McMahon H.T. (1999). The structural era of endocytosis. Science, 285(5425), 215-220.
Marsh M. & Pelchen-Matthews A. (2000). Endocytosis in viral replication. Traffic, 1, 525-532.
Madshus I.H., Sandvig K., Olsnes S. & van Deurs B. (1987). Effect of reduced endocytosis induced by hypotonic
shock and potassium depletion on the infection of Hep 2 cells by picornaviruses. Journal of cellular physiology, 131,
14-22.
Matlin K.S., Reggio H., Helenius A. & Simons K. (1982). Infectious entry pathway of influenza virus in a canine
kidney cell line. Journal of cell biology, 91, 601-613.
McLauchlan H., Newell J., Morrice N., Osborne A., West M., Smythe E. (1998). A novel role for Rab5-GDI in
ligand sequestration into clathrin coated pits. Current opinion in cell biology, 8(1),34-45.
McWilliam A.S., Tree P. & Gordon S. (1992). Interleukin 4 regulates induction of sialoadhesin, the macrophage
sialic acid-specific receptor. Proceedings of the national academy of sciences of the united states of America, 89,
10522-10526.
Mellman I. (1996). Endocytosis and molecular sorting. Annual reviews, 12, 575-625.
Meng X-J, Paul P.S. & Halbur P.G. (1994). Molecular cloning and nucleotide sequencing of the 3’-terminal
genomic RNA of the porcine reproductive and respiratory syndrome virus. Journal of general virology, 75, 1795-
1801.
Mengeling W.M., Lager K.M.& Vorwald A.C. (1998). Clinical effects of porcine reproductive and respiratory
syndrome virus on pigs during the early postnatal interval. Amercican journal of veterinary research, 59(1), 52-55.
Meulenberg J.J. (2000). PRRSV, The virus. Veterinary resaerch, 31(1), 11-22.
Meulenberg J.J.M., de Meijer E.J. & Moormann R.J. (1993a). Subgenomic RNAs of lelystad virus contain a
conserved leader-body junction sequence. Journal of general virology, 74(pt 8), 1697-1701.
Meulenberg J.J.M, Hulst M.M., De Meijer E.J., Moonen P.L.J.M., Den Besten A., De Kluyver E.P., Wensvoort
G. & Moormann R.J.M. (1993b). Lelystad Virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory
syndrome (PEARS), is related to LDV and EAV. Virology, 192, 62-72.
Referentielijst 91
Meulenberg J.J.M. & Den Besten A.P. (1996). Identification and characterisation of a sixth structural protein of
Lelystad virus: the glycoprotein GP2 encoded by ORF2 is incorporated in virus particles. Virology, 225, 44-51.
Meulenberg J.J.M., Petersen-den Besten E.P., De kluyver E.P., Moormann R.J., Schaaper W.M. & Wensvoort G.
(1995). Characterisation of proteins encoded by ORFs 2 to 7 of Lelystad virus. Virology, 206, 155-163.
Miller N. & Hutt-Fletcher L.M. (1992). Epstein-Barr virus enters B cells and epithelial cells by different routes.
Journal of virology, 66, 3409-3414.
Morris S.A., Schroeder S., Plessmann U., Weber K.& Ungewickell E. (1993). Clathrin assembly protein AP180:
primary structure domain organisation and identification of a clathrin binding site. European molecular biology
organisation, 12(2), 667-675.
Morrisette N., Gold E. & Aderem A. (1999). The macrofage – a cell for all seasons. Trends in cell biology, 9,
199-201.
Muhlberg A.B., Warnock D.E. & Schmid S.L. (1997). Domain structure and intramolecular regulation of
dynamin GTPase. European molecular biology organisation, 16(22), 6676-6683.
Mukhopadhyay AM., Funato K. & Stahl P.D. (1997). Rab7 regulates transport from early to late endocytic
compartments in Xenopus oocytes. The journal of biological chemistry, 272(20), 13055-13059.
Munday J., Floyd H. & Crocker P.R. (1999). Sialic acid binding receptors (siglecs) expressed by macrophages.
Journal of leukocyte biology, 66, 705-711.
Naito M. (1993). Macrophage heterogeneity in development and differentiation. Archives of histology and
cytology, 56(4), 331-351.
Naito M., Umeda S., Takahashi K. & Schultz L.D. (1997). Macrophage differentiation and granulomatous
inflammation in osteopetronic mice (op/op) defective in the production of CSF-1. Molecular reproduction and
development, 46,85-91.
Nakamura K., Malykhin A. & Coggeshall K.M. (2000). The Src homology 2 domain-containing inositol 5-
phosphatase negatively regulates Fcγ receptor-mediated phagocytosis through immunoreceptor tyrosine-besed
activation motif-bearing phagocytic receptors. Blood, 100(9), 3374-3382.
Referentielijst 92
Nathke I.S., Heuser J., Lupas A., Stock J., Turck C.W. & Brodsky F.M. (1992). Folding and trimerisation of
clathrin subunits at the triskelion hub. The cell, 68(5), 899-910.
Nauwynck H.J., Duan X., Favoreel H.W., Van Oostveldt P. & Pensaert M.B. (1999). Entry of porcine
reproductive and respiratory syndrome virus into porcine alveolar macrphages via receptor mediated endocytosis.
Journal of general virology, 80, 297-305.
Newmyer S.L & Schmid L.S. (2001). Dominant-interfering Hsc70 mutants disrupt multiple stages of the clathrin-
coated vesicle cycle in vivo. The journal of cell biology, 152(3), 607-620.
Nichols B.J. & Lippincott-Schwarz J. (2001). Endocytosis without clathrin coats. Trends in cell biology, 11, 406-
412.
Nichols B.J., Kenworthy A.K., Polishchuk R.S., Lodge R., Roberts T.H., Hirschberg K., Phair R.D. &
Lippincott-Schwarz J. (2001). Rapid recycling of lipid rafts markers between the cell surface and Golgi complex.
Journal of cell biology, 153, 529-541.
Nicoziani P., Vilhardt F., Llorente A., Hilout L., Courtoy P.J., Sandvig K. & van Deurs B. (2000). Role for
dynamin in late endosomen dynamics and trafficking of the cation-independent mannose 6-phosfate receptor.
Molecular biology of the cell, 11, 481-495.
Nitschke L., Floyd H. & Crocker P.R. (2001). New functions for the sialic acid-binding adhesion molecule CD22,
a member of the growing family siglecs. Scandinavian journal of immunology, 53, 227-234.
Obermüller S., Kiecke C., von Figura K. & Höning S. (2002). The tyrosine motifs of LAMP1 en LAP determine
their direct and indirect targetting to lysosomes, Journal of cell science, 115, 185-194.
Ohlinger V.F, Weiland F., Haas B., Visser N., Ahl R., Mettenleiter T.C., Weiland E., Rziha H.J., Saalmuller A. &
Straub O.C. (1991). Aetiological studies of the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS). Tierarztliche
Umschau, 46, 703-708.
Ohno H., Fournier M-C., Poy G. & Bonifacino J.S. (1996). Structural determinants of interaction of tyrosine-
based sorting signals with the adaptor medium chains. Journal of biological chemistry, 271(46), 29009-29015.
Oleksiewicz M.B., Bøtner A., Nielsen J. & Storgaard T. (1999). Determination of 5’-leader sequences from
radically disparate strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus reveals the presence of highly
conserved sequence motifs. Archives of virology, 144, 981-987.
Referentielijst 93
Olkkonen V.M., Dupree P., Killisch I., Lütcke A., Zerial M. & Simons K. (1993). Molecular cloning and
subcellular localisation of three GTP-binding proteins of the rab subfamily. Journal of cell science, 106, 1249-1261.
Opdenakker G. & Van Damme J. (1991). De macrofaag. Tijdschrift voor geneeskunde, 47(5), 365-374.
Paolo G.P. & Fox A.P. (1999). Tyrosine phosphorylation regulates rapid endocytosis in adrenal chromaffin cells.
Journal of neuroscience, 19(22), 9739-9746.
Pearse B.M.F., Smith C.S. & Owen D.J. (2000). Clathrin coat construction in endocytosis. Current opinion in
structural biology, 10, 220-228.
Pelkmans L. & Helenius A. (2001). Caveolar endocytosis of simian virus 40 reveals a new two-step vesicular
transport pathway to the ER. Nature cell biology, 3, 473-483.
Pelkmans L. & Helenius A. (2002). Endocytosis via caveolae. Traffic, 3, 311-320.
Pensaert M. & Vynckier A. (1993). Het porcien reproductief en respiratoir syndroom: een overzicht. Vlaamds
diergeneeskundig tijdschrift, 62, 113-117.
Pho M.T., Ashok A. & Atwood W.J. (2000). JC virus enters human glial cells by clathrin-dependent receptor-
mediated endocytosis. Journal of virology, 74, 2288-2292.
Phonphok Y. & Rosenthal K.S. (1991). Stabilisation of clathrin coated vesicles by amantadine, tromantadine and
other hydrophobic amines. Federation of European biochemical societies, 281(1-2), 188-190.
Pillay C.S., Eliott E. & Dennison C (2002). Endolysosomal proteolysis and its regulation. Biochemical journal,
363, 417-429.
Piper R.C. & Luzio J.P. (2001). Late endosomes: sorting and partitioning in multivesicular bodies. Traffic, 2,
612-621.
Pfeffer S.R., Dirac-Svejstrup A.B. & Soldati T. (1995). Rab GDP dissociation inhibitor: putting Rab GTPases in
the right place. Journal of biological chemistry, 270(29), 17057-17059.
Qualmann B., Kessels M.M. & Kelly R.B. (2000). Molecular links between endocytosis and the actin
cytoskeleton, Journal of cell biology, 150(5), F111-F116.
Ravetch J.V. & Bolland S. (2001). IgG Fc receptors. Annual reviews of immunology, 19, 275-290.
Referentielijst 94
Riederer M.A., Soldati T., Shapiro A.D.& Pfeffer S.R.(1994). Lysosome biogenesis requires Rab9 function and
receptor recycling from endosomes to the trans-Golgi network. Journal of cell biology, 125(3), 573-582.
Rode M., Berg T. & GjØen T. (1997). Effect of temperature on endocytosis and intracellular transport in the cell
line SHK-1 derives from salmon head kidney. Comparative biochemistry and physiology, 117(4), 531-537.
Rodman J.S.& Wandinger-Ness A. (2000). Rab GTPases coordinate endocytosis. Journal of cell science, 113,
183-192.
Royle S. & Murell-Lagnado R.D. (2003). Constitutive cycling: a general mechanism to regulate cell surface
proteins. Bioessays, 25, 39-46.
Rossow K.D., Benfield D.A., Goyal S.M., Nelson E.A., Christopher-hennings J.& Collins J.E. (1996).
Chronological immunohistochemical detection and localisation of porcine reproductive and respiratory syndrome
virus in gnotobiotic pigs. Veterinary pathology, 33, 551-556.
Roth T.F.& Porter K.R. (1964). Yolk protein uptake in the oocyte of the mosquito Aedes aegypti. Journal of cell
biology, 20, 313-330.
Schimmöller F., Simon I. & Pfeffer S.R. (1998). Rab GTPases, directors of vesicle docking. The journal of
biological chemistry, 273(35), 22161-22164.
Seabra M.C., Mules E.H.& Hume A.N. (2002). Rab GTPases, intracellular traffic and disease. Trends in
molecular medicine, 8(1), 23-30.
Sever S., Damke H. & Schmid S.L. (2000). Dynamin: GTP controls the formation of constricted coated pits, the
rate limiting step in clathrin-mediated endocytosis. The journal of cell biology, 5, 1137-1147.
Shafner D.A. (2002). Coupling actin dynamics and membrane dynamics during endocytosis. Current opinion in
cell biology, 14, 76-81.
Sheff D.L., Daro E.A., Hull M. & Mellman I. (1999). The receptor recycling pathway contains two distinct
populations of early endosomes with different sorting functions. The journal of cell biology, 145(1), 123-139.
Sibley D.R., benovic J.L., Caron M.G. & Lefkowitz R.J. (1987). Regulation of transmembrane signalling by
receptor phosphorylation. Cell, 48, 913-922.
Referentielijst 95
Sieczkarski S.B. & Whittaker G.R. (2002a). Dissecting virus entry via endocytosis. Journal of general virology,
83, 1535-1545.
Sieczkarski S.B. & Whittaker G.R. (2002b). Influenza virus can enter and infect cells in the absence of clathrin
mediated endocytosis. Journal of virology, 76(20), 10455-10464.
Smith C.J., Grigorief N. & Pearse B.M.F. (1998). Clathrin coats at 21Å resolution: a cellular assembly designed
to recycle multiple membrane receptors. European molecular biology organisation, 17, 4943-4953.
Snijder E.J. & Meulenberg J.M. (1998). The molecular biology of arterivirusses. Journal of general virology, 79,
961-979.
Sodeik B. (2000). Mechanisms of viral transport in the cytoplasm. Trends in microbiology, 8, 465-472.
Stedejek T., Stanckevicius A., Storgaard T., Oleksiewicz M.B., Belak S., Drew T.W. & Pejsak Z. (2002).
Identification of radically different variants of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in eastern
Europe: towards a common ancestor for European and Amerivan viruses. Journal of general virology, 83, 1861-
1873.
Suarez P. (2000). Ultrastructural pathogenesis of the PRRS virus. Veterinary research, 31, 47-55.
Suarez P., Diaz-Guerra M., Prieto C., Esteban M., Castro J.M., Nieto A. & Ortin J. (1996). Open reading frame 5
of porcine reproductive and respiratory syndrome virus as a cause of virus-induced apoptosis. Journal of virology,
70(5), 2876-2882.
Takahashi K., Naito M. & Takeya M. (1996). Development and heterogeneity of macrophages and their related
cell through their differentiation pathways. Pathology international, 46(7), 473-485.
Thilo L., Stroud E. & Haylett T. (1995). Maturation of early endosomes and vesicular trafiic to lysosomes in
relation to membrane recycling. Journal of cell science, 108, 1791-1803.
Thomsen P., Roepstorff K., Stahlhut M. & van Deurs B. (2001). Caveolae are highly immobile plasma membrane
microdomains, which are not involved in constitutive endocytic trafficking. Molecular biology of the cell, 13, 238-
250.
Ungewickell E., Ungewickell H. & Holstein S.E.H. (1997). Functional interaction of the auxilin J domain with
the nucleotide- and substrate-binding molecules of Hsc70. Journal of biological chemistry, 272(31), 19594-19600.
Referentielijst 96
Van Belzen N., Spaargaren M., Verkleij A.J. & Boonstra J. (1991). Interaction of the epidermal growth factor
receptors with the cytoskeleton is related to receptor clustering. Journal of cellular physiology, 145(2), 365-375.
Van Delft S., Govers R., Strous G.J., Verkleij A. & van Bergen en Henegouwen P.M.P. (1997). Epidermal
growth factor induces ubiquitinain of Eps15. Journal of biological chemistry, 272(22), 14013-14016.
Van den Berg T., Nath D., Ziltener H.J., Vestweber D., Fukuda M., van Die I. & Crocker P.R. (2001). Cutting
edge: CD43 functions as a T cell counterreceptor for the macrophage adhesion receptor sialoadhesin (Siglec-1).
Journal of immunology, 166, 3637-3640.
Van Nieuwstadt A.P., Meulenberg J.J.M., Van Essen-Zandbergen A.P., Den Besten R.J., Bende R.J., Moorman
R.J.M. & Wensvoort G. (1996). Proteins encoded by open reading frames 3 and 4 of the genome of Lelystad virus
(arteriviridae) are structural proteins of the virion. Journal of general virology, 70, 4767-4772.
Vanderheijden N., Delputte P.L., Favoreel H.W., Vandekerckhove J., Van Damme J, Van Woensel P.A. &
Nauwynck H.J. (2003). Sialoadhesin mediates swine arterivirus entry into alveolar macrophages. Submitted.
Varki A. (1997). Sialic acids as ligands in recognition phenomena. The Faseb journal, 11, 248-255.
Verheije M.H., Olsthoorn R.C.L., Kroese M.V., Rottier P.J.M. & Meulenberg J.J.M. (2002). Kissing interaction
between 3’ noncoding and coding sequences is essential for porcine arterivirus RNA replication. Virology, 76(3),
1521-1526.
Vinson M., van der Merwe P.A., Sørge K., May A., Jones E.Y. & Crocker P.R. (1996). Characterisation of the
sialic acid-binding stite in sialoadhesin by site-directed mutagenesis. Journal of biological chemistry, 271(16), 9267-
9272.
Wakeham D.E., Ybe J.A., Brodsky F.M. & Hwang P.K. (2000). Molecular structures of proteins involved in
vesicle coat formation. Traffic, 1, 393-398.
Wensvoort G., de Kluyver E.P., Pol J.M.A., Wagenaar F., Moormann R.J.M., Hulst M.M., Bloemraad R., den
Besten A., Zetstra T.& Terpstra C. (1992). Lelystad virus, the cause of porcine epidemic abortion and respiratory
syndrome: a review of mystery swine disease research at Lelystad. Veterinary microbiology, 33, 185-193.
Wensvoort G., Terpstra C., Pol J.M.A., ter Laak E.A., Bloemraad M., de Kluyver E.P., Kragten C., van Buiten L.,
den Besten A., Wagenaar F., Broekhuijsen J.M., Moonen P.L.J.M, Zetstra T., de Boer E.A., Tibben H.J., de Jong
M.F., van ’t Veld P., Groenland G.J.R., van Gennep J.A., Voets M.Th. Verheijden J.H.M.& Braamskamp J. (1991).
Mystery swine disease in the Netherlands: the isolation of lelystad virus. The veterinary quarterly, 13(3), 121-130.
Referentielijst 97
Whittaker G.R.& Helenius A. (1998). Nuclear import and export of virusses and virus genomes. Virology, 246,
1-23.
Wilde A., Beattie E.C., Lem L., Riethof D.A., Liu S-H., Mobley W.C., Soriano P. & Brodsky F.M. (1999). EGF
receptor signalling stimulates SRC kinase phosphorylation of clathrin, influencing clathrin redistribution and EGF
uptake. Cell, 96, 677-687.
Wigge P., Köhler K., Vallis Y., Doyle C.A., Owen D., Hunt S.P. & McMMahon H.T. (1997). Amphiphysin
heterodimers: potential role in clathrin-mediated endocytosis. Molecular biology of the cell, 8, 2003-2015.
Woods J.A., Lu Q., Ceddia M.A. & Lowder T. (2000). Exercise-induced modulation of macrophage function.
Immunology and cell biology, 78, 545-553.
Wu W.H., Fang Y., Farwell R., Steffen-Bien M., Rowland R.R.R., Christopher-Hennings J. & Nelson E.A.
(2001). A 10-kD structural protein of porcine reproductive and respiratory syndrome virus encoded ny ORF2b.
Virology, 287, 183-191.
Zhang J.Q., Nicoll G., Jones C. & Crocker P.R. (2000). Siglec-9, a novel sialic acid binding member of the
immunoglobulin superfamily expressed broadly on human blood leukocytes. Journal of biological chemistry,
275(29), 22121-22126.
Zimmerman J.J., Yoon K.J., Wills R.W. & Swenson S.L. (1997). General overview of PRRSV: A perspective
from the United States. Veterinary Microbiology, 55, 187-196.
Zuk P.A.& Elferink L.A. (2000). Rab15 differentially regulates early endocytic trafficking. The journal of
biological chemistry, 275(1), 26754-26764.
Inhoudsopgave