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REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEIGNEMENT SUPERIEUR

ET DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

UNIVERSITE KASDI MERBAH, OUARGLA

FACULTE DES SCIENCES DE LA NATURE ET DE LA VIE

DEPARTEMENT DES SCIENCES BIOLOGIQUE

Projet de Fin d’Etudes

En vue de l’obtention du diplôme de

Licence Domaine : Sciences de la nature et de la vie

Filière : Biologie

Spécialité : Biochimie fondamentale et appliquée

Thème

Encadreur : Mme Annou Ghania Présenté par :

GOBBI RABIA

Examinateur : Melle Hammoudi Rokia

KHEBBAZ WARDA

.

Traçabilité de l’identification des métabolites secondaires végétaux

Année universitaire 2013/2014

REMERCIEMENTS

Tout d’abord, nous remercions Dieu « tout puissant » de nous avoir accordé la

force, le courage et les moyens à fin de pouvoir accomplir ce modeste travail.

Au terme de ce travail, nous tenons à exprimer notre profonde gratitude et

à remercier ;

Mme ANNOU GHANIA Maitre assistant, université Kasdi Merbah-Ouargla pour

son aide ,ses orientations, ses conseille et ses corrections sérieuse pour ce travail.

Melle HAMMOUDI ROKIA D’avoire accepté du juger notre travail

Nous remercions également les personnels de la bibliothèque

Nous remercions tous nos amis en particulier les étudiants de l’option de

biochimie

Enfin nous remercions tous les enseignant, nous leur adressons nos sincères

remerciements pour leur patience et pour tout ce qu’il nous avons offert comme

enseignements et son conseils durant se long cycle de formation, et tous ceux qui ont

participé de prés ou de loin pour la réalisation de ce travail.

SOMMAIRE

Introduction 1

CHAPITRE I : Généralités sur les métabolites secondaires

1. Définition des métabolites secondaires 2

2. Classification des métabolites secondaires 2

2.1. Les composés phénoliques 2

2.1.1. Définition 2

2.1.2. Activités biologiques des polyphénols 3

2.2. Les alcaloïdes 3


2.2.2. Activités biologiques des alcaloïdes 3

2.3.Lesterpénoides 3


2.3.2. Les huiles essentielles 4

2.3.2.1. Définition 4

2.3.2.2. Activités biologiques des huiles essentielles 4

CHAPITE II : Méthodes d’extraction des métabolites secondaires

1. Extraction solide- liquide 5

1.1. Extraction par macération 5

1.2. Extraction par soxhlet 6

1.3. Extraction en mode batch (échelle laboratoire) 6

2. Extraction par distillation 7

2.1. Hydrodistillation 7

2.1.2. Hydrodistillation assistée par ultrason 8

2.1.3. Hydrodistillation assistée par micro-onde 8

2.1.3. Hydrodistillation sous pression 9

2.2. Extraction par entrainement à la vapeur d’eau 9

2.3. Extraction par hydrodiffusion 10

2.3.1. Extraction par hydrodiffusion par micro-onde et gravité 10

3. Extraction assistée par ultra-sons (UAE Ultrasonic Assisted Extraction) 11

4. Expression à froid 11

5. Extraction au CO2 supercritique 11

CHAPITRE III Technique de séparation et purification des métabolites

Secondaires

1. Tests rapides confirmâtes des 13

1.1. Polyphénols totaux 13

1.2. Alcaloides totaux 13

1.3. Terpènoides totaux 13

2. Technique de séparation et purification des métabolites Secondaires 13

2.1. Extraction (partage) liquide-liquide 13

2.2. Les méthodes chromatographiques 14

2.2.1. Chromatographie sur couche mince 14

2.2.2. Chromatographie sur colonne ouverte 15

2.2.2.1. Chromatographie d’affinité 15

2.2.2.2. Chromatographie d’exclusion stérique 16

2.2.2.3 Chromatographie d’adsorption 17

2.2.2.4. Chromatographie de partage 17

2.2.3. Chromatographie liquide à moyenne pression(MPLC) 17

2.2.4. Chromatographie en phase liquide 18

CHPITRE VI : Technique d’identification des métabolites secondaires

1. Chromatographie liquide à haute performance 19

1.1. Principe 19

1.2. Exemple d’identification des métabolites 19

1.1.3. Discussion de résultat 21

2. Spectrométrie de masse (MS) 21

2.1. Principe 21

2.1. Exemple d’identification des métabolites secondaires par MS 21

3. Chromatographie en phase gazeuse 22

3.1. Principe 22

3.2. Exemple d’identification des métabolites secondaires par CPG 23

4. Spectrométrie d’infrarouge 24

4.1. Principe 24

2.4.2. Exemple d’identification des métabolites secondaires par IR 24

5. Résonance magnétique nucléaire (RMN) 26

5.1. Exemple d’identification des métabolites secondaires par RMN 26

CHAPITRE V : Exemple expérimental de la traçabilité d’identification des

métabolites secondaires

1. Méthodes 28

1.1. Extraction 28

1.2. Fractionnement de l’extrait brut 28

1.3. Identification des flavonoïdes 28

1.3.1. Test préliminaire (La réaction de Shibata) 28

1.3.2. Dosage colorimétrique 29

1.3.3. Analyse qualitative par HPLC 29

1.3.3.1. Principe 29

1.3.3.2. Expression des résultats 30

2. Résultat et discussion 30

2.1. Test préliminaire 30

2.2. Dosage colorimétrique 30

2.3. Analyse qualitative par HPLC 31

Conclusion 33

Référence bibliographie 34

LISTE DE TABLEUA

Tableau Titre

Page

Tableau 01 Les alcaloïdes identifiés dans l’extrait aqueux de Retama

sphaerocarpa

23

Tableau 02 Analyse du spectre infrarouge du taxol 25

Tableau 03 Analyse du spectre RMN-H a du taxol et d'un texane inconnu 27

Tableau 04 Virement de la couleur des extraits du cumin 30

Tableau 05 Teneur en flavonoïdes des extraits cumin 30

LISTE DE FIGURE

Figure Titre

Page

Figure 01 Extraction par macération

05

Figure 02 Extracteur de Soxhlet

06

Figure 03 Photographie de l’agitateur secoueur utilisé pour l’extraction

batch

07

Figure 04 Montage hydro distillation par micro-onde 08

Figure 05 Montage de l’entrainement à la vapeur d’eau 09

Figure 06 Montage d’hydrodiffusion 10

Figure 07 Extraction au CO2 supercritique 12

Figure 08 Développement chromatographique d’un plaque 15

Figure 09 Chromatographie d’ exclusion 16

Figure 10 Chromatogramme en HPLC de scopolamine 20

Figure 12 Chromatogramme en HPLC de l’atropine 20

Figure 12 chromatogramme en HPLC des alcaloïdes totaux des graines

de plante

20

Figure 13 Spectre de masse EI de composée triterpènique des feuilles

de Agauriak Polyphylla

22

Figure 14 Profils des pics de l'extrait aqueux de Retama sphaerocarpa, 14

Figure 15 Spectre infrarouge du taxol 25

Figure 16

Spectre RMN-H du taxol 26

Figure 17 Courbe d’étalonnage de la quercétine 29

Figure 18

Chromatogramme d’HPLC de la quercétine enregistré à 254 nm 31

Figure 19 Chromatogramme d’HPLC d’EBr du cumin enregistré à 254

nm.

31

Figure 20 Chromatogramme d’HPLC d’En-BuOH du cumin enregistré à

254 nm.

31

Figure 21 Chromatogramme d’HPLC d’En-BuOH du cumin enregistré à

254 nm.

32

Introduction

Introduction

Introduction

Les végétaux supérieurs ont la capacité de synthétiser, par des voies métaboliques

Complexes des métabolites dits secondaires. Ces composés sont utilisés par les plantes pour

diverses fonctions adaptatives notamment en réponse aux stress biotiques et abiotiques qu‘ils

peuvent subir. (THOMAS, 2011 )

Ces métabolites sont situés dans l’un des trois classes, des polyphénols, des alcaloïdes

et des terpénoides. De nombreuses études ultérieures ont prouvé la bioactivité de ces

molécules, citant les activités antitumorale, antivirale, antimicrobienne, antioxydant, anti-

inflammatoire…….etc. Dû l’usage des plantes renfermant ces métabolites dans diverses

domaines thérapeutiques, pharmaceutiques, cosmétologiques et alimentaires (THOMAS,

2011 ; RISPAIL et al., 2005).

Cette large vertu d’utilisation des métabolites secondaires implique leur identification.

Cette dernière nécessite un trajet de procédure, commençant par l’extraction de des

métabolites à partir de matériels végétale, séparation et purification de ces métabolites et enfin

leur identification structurale.

C’est dans ce cadre d’étude, se situe notre travail qui est à l’objectif de déposer un

plan qui trace le parcours de l’identification des métabolites secondaire.

Notre travail est scindé en cinq chapitre, le premier montre des généralités sur les

métabolites secondaires, alors que le deuxièmes présentes les différents techniques

d’extraction. Les méthodes de séparation et de purification font l’objet de troisième chapitre,

concernant le quatrième chapitre, se sont les méthodes d’identification qui ont été présentées.

En fin un exemple expérimental a été illustré dans le cinquième chapitre.

CHAPITRE I

Généralité sur les


Généralités sur les métabolites secondaires

1. Définition des métabolites secondaires

Les métabolites secondaires végétaux peuvent être définis comme des molécules

indirectement essentielles à la vie des plantes, par opposition aux métabolites primaires

(protéines, lipides et glucides). Ces métabolites secondaires interviennent dans la structure des

plantes (lignines et tannins) mais également, elles exercent une action déterminante sur

l’adaptation des plantes à leur environnement (MANSOUR, 2009). Ils participent ainsi, d’une

manière très efficace, dans la tolérance des végétaux à des stress variés : action anti-herbivore

(menthe par exemple), inhibition des attaques pathogènes des bactéries et des champignons,

prédation d’insectes, défense contre la sècheresse et lumière UV. Mais elles peuvent être

antinutritifs. Beaucoup de métabolites secondaires sont toxiques, ils sont alors stockés dans

des vésicules spécifiques ou dans la vacuole (SANDRIN, 2004).

D’un point de vue appliqué, ces molécules constituent la base des principes actifs que

l’on retrouve chez les plantes médicinales (MANSOUR, 2009).

2. Classification des métabolites secondaires

Les métabolites secondaires sont caractéristiques des plantes supérieur. Ces métabolites

secondaires sont repartis en trois grandes familles chimiques : les composés phénolique, les

terpénoides et les alcaloïdes (Mamadou, 2011).

2.1. Les composés phénoliques

2.1.1. Définition

Les polyphénols constituent un groupes largement distribué des substances dans le

royaume des végétaux, avec plus de 8000 structures phénoliques présents dans tous les

organes de la plante, ils résultent bio génétiquement de deux voies synthétiques principales, la

voie de shikimate et d’acétate (Hopkins, 2003)

L’élément structural fondamental qui les caractérise est la présence d’un cycle aromatique

(benzoïque) portant au moins un groupement hydroxyles libres ou engagés dans une autre

fonction chimique (éther, méthylique, ester, sucre...) (Bruneton, 1993).

La structure de ces composés varie, des molécules simples (acides phénoliques simples) aux

molécules hautement polymérisées (tanins condensés). Ils participent à la pigmentation des

fleurs, des légumes et de quelques fruits (raisins, agrumes, etc…), certains d’entre eux sont

responsables d’amertume et d’astringence (Hopkins, 2003).

Les polyphénols sont répartit en plusieurs classes : les acides phénoliques, les flavonoïdes,

Les tanins, Les stilbènes, Les lignanes et les coumarines (Hopkins, 2003).


2.1.2. Activités biologiques des polyphénols

Les polyphénols sont associés à de nombreux processus physiologiques interviennent

dans la qualité alimentaire, impliqués lorsque la plante est soumise à des blessures

Mécaniques. La capacité d’une espèce végétale à résister à l’attaque des insectes et des

microorganismes est souvent corrélée avec la teneur en composés phénoliques (Bahorun,

1997).

Ces composés montrent des activités anti-carcinogènes, anti-inflammatoires,

antiathérogènes, anti-thrombotiques, analgésiques, antibactériens, antiviraux, anticancéreux

(Babar et al, 2007), anti-allergènes, vasodilatateurs (Falleh et al., 2008) et antioxydants

(Gomez et al., 2006).

2.2. Les alcaloïdes

2.2.1. Définition

Les alcaloïdes forment une grande famille de molécules chimiquement hétérogène.

Leurs caractéristiques communes sont la présence d’au moins un atome d’azote et leur forte

activité biologique. L’atome d’azote accepte souvent un proton, ce qui leur confère un

caractère légèrement basique en solution (d’où leur nom d’alcaloïde). Dans leur grande

majorité, les alcaloïdes sont hétérocycliques, bien que quelque composé azoté aliphatique

(non cyclique) comme la mescaline et la colchicine soient parfois classés dans les

alcaloïdes. Globalement en a recensé quelque 10.000 alcaloïdes dans à peu prés 20 pour 100

des plantes à fleurs essentiellement des dicotylédones herbacées (sou thon et Buckingham,

1989).

2.2.2. Activités biologiques des alcaloïdes

Les alcaloïdes provoquent chez l’Homme diverses réponses physiologiques par ce

qu’ils interférent avec les neurotransmetteurs. A forts dose la plupart des alcaloïdes sont très

toxique par contre à faible dose ils peuvent avoir une valeur thérapeutique. De la préhistoire

jusqu’à nos jours, les alcaloïdes ou des extraits qui en renferment ont été utilises comme

médicaments relaxants musculaires, analgésique et tranquillisants (Hopkins, 2003).

2.3. Les terpénoides

2.3.1. Définition

Les terpènes sont des substances généralement lipophiles qui dérivent d’une unité

simple à cinq atomes de carbone nommée isoprène. Leur grande diversité trouve son origine


dans le nombre d’unités de base qui composent la chaine, ainsi que dans les divers modes

d’assemblage. La formation de structures cycliques, l’addition de fonction comprenant de

l’oxygène et la conjugaison avec des sucres ou d’autres molécules peuvent rendre leurs

structures complexes (Hopkins ,2003).

Solon le nombre d’unités isopréniques qui constituent les terpénoïdes on distingue les

monoterpènes en C10, les sesquiterpènes en C15, les diterpènes en C20, les triterpènes en C30,

les tétraterpénes en C40 et les polyterpénes qui comportent plus de 500 carbone. Les

monoterpénes et les sesquiterpénes volatiles sont les principaux composants des huiles

essentielles (HE) (LAMARTI et al., 1994).

2.3.2. Les huiles essentielles

2.3.2.1. Définition

Selon la pharmacopée française (1965), les huiles essentielles (en d’autres nom,

essences ou huiles volatiles) sont des produits de composition généralement assez complexe

renferment les principes volatils contenu dans les végétaux. Les terpènes (principalement les

monoterpènes) représentent la majeure partie (environ 90%) des huiles (BRUNETON, 1993 ;

SMALLFIELD, 2001).

2.3.2.2. Activités biologiques des huiles essentielles

Depuis leur découverte, les HE possèdent de nombreuses activités biologiques. Elles

sont très utilisables dans de multiples domaines, alimentaires, cosmétiques et

pharmaceutiques, elles ont une large application en phytothérapie en tant qu’agents

antimicrobiens, antioxydants, relaxants et antispasmodiques (BRUNETION,1999) grâce aux

diverse propriétés, les plants aromatiques et leur essences trouvent leur emploi dans multiples

domaines, telles que le domaine alimentation, pour l’assaisonnement, coloration et la

conservation des aliments ou des boissons, certaines sont aussi utilisées comme suppléments

diététiques (BRUNETION, 1999).

Les propriétés odoriférantes des huiles essentielles, leur confèrent une consommation

importante en parfumerie et en cosmétique (BRUNETION, 1999).

Certaines des huiles essentielles peuvent avoir un intérêt médicinal en particuliers dans le

domaine des antiseptiques externe mais qui majoritairement sont surtout destinées à

l’aromatisation des formes médicamenteuses destinées à la voie orale (BRUNETION, 1999).

CHAPITRE II

Méthodes d’extraction des


Chapitre II Méthodes d’extraction des métabolites secondaires

L’extraction est une opération qui consiste à séparer certains composés d’un

organisme végétal selon diverses techniques. Dans les domaines de la chimie des substances

naturelles et de la chimie thérapeutique, L’extraction des métabolites secondaires ciblent est

une phase primordiale. (CHEMAT ,2011).

Le choix de la méthode d’extraction est basé sur des données préalables sur les

caractéristiques physicochimiques des métabolites à extraire. Mais, il est d’usage d’appliquer

différentes procédés afin de savoir le plus adéquat.

1. Extraction solide-liquide

L’extraction solide-liquide est une opération de transfert de matière entre une phase qui

contient la matière à extraire «solide», et un solvant d’extraction «liquide». Le but de cette

opération est d’extraire et de séparer un ou plusieurs composants mélangés à un solide dans

un solvant (CHEMAT ,2011).

1.1. Extraction par macération

La macération est une méthode consiste à laisser la poudre de la plante en contact

prolongé avec un solvant (LAGNICA, 2005). Le choix de solvant est orienté par les

caractéristiques chimiques spécifiques pour chaque famille de métabolites secondaires

(RISPAIL et al., 2005). Généralement les solvant les plus utilisées sont l’éthanol, le méthanol

ou même l’eau pour l’extraction des composés polaires et le dichlorométhane pour

l’extraction des composés non polaires (RISPAIL et al., 2005). Le méthanol et l’éthanol

possèdent l’avantage d’être plus facilement éliminés, dans le cas ou l’on veut concentrer

l’extrait sous vide. L’utilisation de l’eau est intéressante si l’on veut fractionner la solution

obtenue.


Figure 01 : Extraction par macération

1.2. Extraction par soxhlet

Un extracteur soxhlet est une pièce de verrerie utilisée pour extraire les molécules

aromatiques de la plante. Quand le ballon est chauffé, les vapeurs de solvants passent par le

tube adducteur, se condensent dans le réfrigérant et retombent dans le corps de l’adducteur,

faisant ainsi macérer les résidus dans le solvant. Le solvant condensé s’accumule dans

l’extracteur jusqu’à atteindre le sommet du tube siphon, qui provoque alors le retour du

liquide dans le ballon, accompagné des substances extraites. Le solvant contenu dans le ballon

s’enrichit progressivement en composés soluble. La taille du corps en verre étant limitée, il

peut être nécessaire de réaliser plusieurs extractions successives pour récupérer une quantité

suffisante d’extrait (EL KALAMOUNI, 2010).

Figure 02 : Extracteur de Soxhlet

1.3. Extraction en mode batch (échelle laboratoire)

Il s’agit d’un dispositif simple composé de fioles de 500 ml (où l’on dispose la matière

première et le solvant) et d’un agitateur secoueur thermostaté. Les expériences qui ont été

réalisées grâce à cette technique nous ont permis d’estimer l’influence de divers paramètres


(nature et concentration du solvant, hydromodule (rapport solvant-matière solide),

granulométrie, température etc.) (PENCHEVE, 2010)

Figure 03 : Photographie de l’agitateur secoueur utilisé pour l’extraction batch

2. Extraction par distillation

Solon PIOCHON, (2008), il existe 3 différents procédés utilisant le principe de la

distillation. Il s’agit de l’hydradistillation, l’hydrodiffision et l’entrainement à la vapeur d’eau.

2.1. Hydrodistillation

L’hydro-distillation est la méthode la plus employée pour l’extraction des huiles

essentielles (MOHAMMDI, 2006). Le principe de l’hydro-distillation consiste à immerger la

matière première dans un bain d’eau. L’ensemble est porté à ébullition et l’opération est

généralement conduite à pression atmosphérique. lors de la distillation des huile essentielle,

plusieurs phénomènes sont à la base d’échange de matière entre les phases solide, liquide et

vapeur, d’où l’influence d’un grand nombre de paramètre sur la qualité et le rendement de la

production (HAJJI et al., 1985). Dans le cas ou ces structures sont superficielles, la membrane

externe ou la cuticule qui constituent les seule barrières à la libération de l’huile essentielle,

est vite rompue à ébullition, les composés volatile sont aussitôt évaporés. Lorsque les huiles

essentielles sont sous-cutanées, Elles doivent d’abord diffuser à travers l’épaisseur du tissu

végétal avant d’entrer en contact avec l’eau ou sa vapeur. Elles sont alors évaporées comme

dans le cas des secrétions superficielles. Ainsi durant la distillation, l’eau bouillant pénètre

dans les cellules végétales et solubilise une partie de l’huile essentielle de l’appareil sécréteur

interne. La solution aqueuse chargée de composés terpéniques, diffuserait ensuite à travers

une épaisseur de tissu, plus ou moins dense, selon l’organe, vers la surface extérieure où

l’huile essentielle serait vaporisée et entrainée sous forme d’azéotrope (EL KALAMOUNI,

2010).


2.1.1. Hydrodistillation assistée par ultrason

Il s’agit dans ce cas précis d’un traitement de la plante «pré» ou «post» opératoire. En

effet, la structure des parois des plantes et les tissus cellulaires se désorganisent, sous l’effet

des ondes Ultrason et les micros cavitations générées par les ultrasons (ROMDHANE, 1999).

Ainsi, ces changements favorisent la diffusion de l’eau dans les tissus cellulaires, ce qui peut

également augmenter la cinétique d’extraction des molécules aromatiques des HEs

(ROMDHANE ,1999).

2.1.2. Hydrodistillation assistée par micro-onde

C’est une technique récente développée dans le but d’extraire des produits naturels

comparables aux HEs et aux extraits aromatiques. Dans cette méthode, la plante est chauffée

par un rayonnement micro-ondes dans une enceinte dont la pression est réduite de façon

séquentielle. Les molécules volatiles sont entrainées dans le mélange azéotropique formé avec

la vapeur d’eau propre à la plante traitée (MARROUF et TROMBLIN, 2009). Ce chauffage,

en vaporisant l’eau contenue dans les glandes oléifères, crée à l’intérieur de ces dernières une

pression qui brise les parois végétales et libère ainsi le contenu en huile

(MARROUF et TROMBLIN, 2009)

Figure 04 : montage hydro distillation par micro-onde (NAIT ACHOUR ,2012)


2.1.3. Hydrodistillation sous pression

C’est une technique de choix pour les essences difficilement distillables (BOCCHIO,

1985). On traite ainsi certaines matières premières dont les constituants ne peuvent être

entraînés par la vapeur à la pression atmosphérique du fait de leur masse moléculaire élevée,

par exemple le santal, le girofle, les rhizomes de vétiver, de gingembre ou encore d’iris

(GARNERO, 1985 ; Tournaire, 1980). Bien que le procédé sous pression conduise à une

amélioration du rapport d’entraînement, donc, à des économies d’énergie (BOCCHIO et

GARNERO, 1985), l’influence d’une température élevée (Supérieure à 100ºC) sur la qualité

de l’huile donne lieu à certains artéfacts. De plus, les prix et les contraintes des équipements

nécessaires contribuent à freiner l’utilisation du procédé (TOURNAIRE, 1980).

2.2. Extraction par entrainement à la vapeur d’eau

C’est l’une des méthodes officielles pour l’obtention des huiles essentielles. A la différence de

l’hydro distillation cette technique ne met pas en contact direct l’eau et la matière végétale à traiter. De

la vapeur d’eau fournie par une chadiére traverse le libèrent l’huile essentielle qui est vaporisée sous

l’action de la chaleur pour former un mélange (eau+huile essentielle). Le mélange est ensuite véhiculé

vers le condenseur et l’essencier avant d’être séparé en une phase aqueuse et une phase organique.

L’absence de contact direct entre l’eau et la matière végétale. Puis entre l’eau et les molécules

aromatiques évite certains phénomènes d’hydrolyse ou de dégradation pouvant nuire à la qualité de

l’huile (NAIT ACHOUR ,2012)


Figure 05 : montage de l’entrainement à la vapeur d’eau ( NAIT ACHOUR,2012)

2.3. Extraction par hyrdodiffusion

L’hydrodiffusion est une variante de l’entrainement à la vapeur d’eau, dans le cas de

l’hydrodiffusion, le flux de vapeur n’est pas ascendant mais descendant. Cette technique

exploite ainsi l’action osmotique de la vapeur d’eau. Le principe de cette méthode réside dans

l’utilisation de la pesanteur pour dégager et condenser le mélange (vapeur d’eau-huile

essentielle) dispersé dans la matière végétale ( WARNOD, 1984).

Comme pour l’entrainement à la vapeur d’eau, l’hdrodiffusion présente l’avantage de

ne pas mettre en contact le matériel végétal et l’eau, de plus l’hydrodiffusion permet une

économie d’énergie due à la réduction de la distillation et donc à la réduction de la

consommation de vapeur (NAIT ACHOUR ,2012)

Figure 06: Montage d’hydrodiffusion (NAIT ACHOUR,2012)

2.3.1. Extraction par hydrodiffusion assisté par micro-ondes et gravité

Hydrodiffusion assisté par micro-ondes et gravité (Microwave Hydrodiffusion and

Gravity : MHG) consiste en une MAE (extraction assistée par micro-ondes) à pression

atmosphérique qui fait intervenir en plus deux phénomènes physiques que sont

l‘hydrodiffusion et la gravité. La matière végétale est soumise à une extraction MAE


classique sans ajouter ni eau ni solvant organique. Les molécules sont extraites et transférées

de l’intérieur vers l’extérieur de la matrice végétale via l’effet de l’irradiation micro-ondes,

c’est le phénomène d’hydrodiffusion. L’extrait liquide, contenant les molécules, s’écoule

ensuite du four micro-onde vers un système de refroidissement par simple gravité. Ce procédé

premièrement développé pour l‘extraction d‘huiles essentielles (ABERT VIAN et al., 2008,

BOUSBIA et al., 2009), a ensuite été adapté pour l‘extraction de flavonoïdes de l‘oignon

(ZILL et al., 2009) et de co-produits de l‘argousier (PERINO-ISSARTIER et al.2010), ainsi

que pour l‘extraction de jus de fruits (CENDRES et al., 2011).

3. Extraction assistée par ultra-sons (UAE, Ultrasonic Assisted Extraction)

Les ultrasons sont des ondes vibrationnelles mécaniques de fréquence allant de 16 KHz à

1 GHz pouvant se propager dans les solides, les liquides et les gaz. Dans un milieu Liquide la

propagation des ondes va générer des cycles successifs de compression (haute Pression) et de

raréfaction (basse pression) (WANG et WELLER , 2006 ). Cette différence de pression va

générer des mouvements moléculaires au sein du milieu. Lors d‘un cycle de raréfaction la

distance entre molécules est augmentée et au dessus d‘une certaine distance, dépendant de

chaque milieu, des bulles de cavitations vont se former. Ces bulles vont croître pendant les

phases de raréfaction et diminuer pendant les phases de compression. La répétition de ces

Cycles va conduire à l’implosion des bulles de cavitation, libérant ainsi une grande quantité

de matière (PETRIER et al. ,2008)

4. Expression à froid

C’est une technique "physique" simple où les écorces des agrumes (citron, orange,…)

sont pressées à froid pour extraire leurs HEs en utilisant des rouleaux. Aucune source de

chaleur n’est utilisée, laissant ainsi à l'huile une odeur très proche de l'original. Le principe de

cette méthode consiste à faire éclater par différents procédés mécaniques (compression,

perforation) les poches qui sont situées à la superficie de l’écorce de ces fruits renfermant

l’HE. L’huile libérée est ensuite recueille par un courant d’eau (MARROUF et TREMBLIN,

2009 ; BRUNETON, 1999)

5. Extraction au CO2 supercritique

Il s’agit du procédé le plus récent d’extraction à froid des matières premières végétales

utilisant le gaz carbonique : le CO2 sous pression et à température supérieure à 31 °C, le gaz

carbonique se trouve dans un état «supercritique », la matière végétale est chargé dans


l’extracteur puis le CO2 est introduit sous pression et réfrigéré. Le mélange est recueilli dans

un vase d’expansion. La pression y étant réduite, le CO2 reprend ainsi sa forme gazeuse et est

complètement éliminé. L’extrait végétal est isolé , les matiére premiéres ainsi obtenues sont

proches du produit naturel d’origine sans trace résiduelle de solvant.(MOHAMMEDI ,2005)

Figure 07 : Extraction au CO2 supercritique

Chapitre III

Technique de séparation des


Chapitre III Techniques de séparation et purification des métabolites secondaires

1. Tests rapides confirmâts l’existence des métabolites dans un extrait

1.1. Polyphénols totaux

Pour mettre en évidence les polyphénols, la réaction au chlorure ferrique (FeCl3) a été

utilisée. Ainsi, à 2 mL de chaque solution, est ajoutée une goutte de solution alcoolique de

chlorure ferrique à 2%. Le chlorure ferrique provoque en présence de dérivés polyphénoliques

l’apparition d’une coloration bleu noirâtre ou verte plus ou moins foncée. (ALAIN et al

.,2010)

1.2. Alcaloïdes totaux

Pour mettre en évidence les alcaloïdes, les réactifs de DRAGENDORFF (réactif de

l’iodobismuthate) et de BOUCHARDAT (réactif iodoioduré) ont été utilisés. En effet,

l’extrait sec est repris dans 6 mL d’alcool à 60°C. L’addition de 2 gouttes du réactif de

Dragendorff à la solution alcoolique provoque un précipité ou une coloration orangée. L’ajout

de 2 gouttes du réactif de Bouchardat à la solution alcoolique provoque un précipité de

coloration brun-rougeâtre et indiquait une réaction positive. (ALAIN et al .,2010).

1.3. Terpènoides totaux

Pour mettre en évidence les stérols et les polyterpènes, nous avons utilisé le réactif de

LIEBERMANN. En effet, cinq (5) mL d’un extrait de plante est évaporé à sec dans une

capsule sur bain de sable ou bain marie. Le résidu est dissout à chaud dans 1 mL d’anhydride

acétique. L’adition de 0,5 mL d’acide sulfurique concentré au triturât. Induit l’apparition, à

l’interphase, d’un anneau pourpre et violet, virant au bleu puis au vert, indique une réaction

positive. (ALAIN et al .,2010) .

2. Techniques de séparation et purification de métabolites secondaire

2.1. Extraction (partage) liquide-liquide

L'extraction liquide-liquide est la plus simple des méthodes de séparation. Elle

consiste à faire passer des métabolites (solutés) dissous dans une phase liquide, dans une

seconde phase liquide non miscible avec la première. En pratique, les solutés sont souvent

dans une phase aqueuse. Un solvant organique (éther diéthylique, acétate d’éthyle,

chloroforme etc.) est utilisé pour les extraire.

La quantité de soluté A extraite est estimée par la constante de distribution ou par le

coefficient de partage exprimé par :

Korg/aq = [C]org / [C]aq

[C]org : Concentration de soluté A dans la phase organique.


[C]aq : Concentration de A qui reste dans la phase aqueuse à l’équilibre.

Il est à noter que plus le coefficient K est grand, plus le volume de solvant organique

nécessaire à une bonne extraction est petit. (LIDE,1996 ; BRUNETON,1999)

Le procédure proposée par GUNATILAKA et al., (1998) sur le fractionnement

liquide-liquide d’un extrait d’une plante, consiste à partager ces extraits entre une phase

apolaire hexane et une phase polaire méthanolique aqueuse (MeOH :H2O 80 :20). Après cette

opération, de l’eau a été ajoutée à la solution méthanolique pour obtenir une phase à 60 % de

méthanol, qui a été ensuite extraite par du chloroforme. Après évaporation des solvants, ce

partage a donc permis d’obtenir trois fractions de polarité croissante : hexane, CHCl3 et

MeOHaq

2.2. Méthodes chromatographiques

Les méthodes chromatographiques sont des méthodes permettant de séparer les

éléments d’un extrait végétal en solution plus ou moins complexe. le mélange à

chromatographie entrainé par une phase mobile circule au contact d’une phase stationnaire

liquide ou solide. Des interactions physique ou chimique s’établissent entre la phase

stationnaire, qui possède une très grande surface de contact, et les molécules à séparer. Des

échanges rapides et réversibles se produisent dont la force dépend de la nature chimique des

molécules à séparer. Celles–ci sont plus ou moins retenus selon l’importance de leur

interaction avec la phase stationnaire. Les molécules sont alors entrainées chimiquement, ce

qui permet leur séparation. Cette séparation peut être effectuée dans un but analytique

quantitatif ou qualitatif ou dans un but préparatif (HAINQUE, 2008)

2.2.1. Chromatographie sur couche mince

La Chromatographie sur couche mince est une technique couramment utilisée pour

séparer des composants dans un but d'analyse (CCM analytique) ou de purification (CCM

préparatrice).

Cette technique (CCM) repose principalement sur des phénomènes d'adsorption et

d‟interaction. La phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le

long d'une phase stationnaire fixée sur une plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de

matière plastique ou d'aluminium.

Après que l'échantillon ait été déposé, les substances migrent essentiellement par

capillarité. La vitesse dépend d’une part, des forces électrostatiques retenant le composant sur


la phase stationnaire et, d’autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se

déplacent alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile. Généralement, en CCM,

les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires.

(ANDRIAMIALIHARISO, 2001)

Le constant de migration caractéristique de chaque espèce chimique dans un système

de phase stationnaire /phase mobile donné est appelée facteur de rétention Rf (rapport entre la

distance parcourue par la tache et la distance parcourue par le front du solvant de puis la ligne

de dépôt) la comparaison des Rf entre les taches d’extrait avec des témoins connus permet

l’identification de la nature des composés (HAINQUE, 2008).

Dans la chromatographie préparatrice, La bande qui contient le produit purifié est grattée, la

silice est dissoute dans un solvant, puis filtré, le filtrat obtenu il est ainsi à l’état pur.

Figure 08 : Développement chromatographique d'une plaque

2.2.2. Chromatographie sur colonne ouverte

Pour les chromatographies sur colonnes ouvertes, plusieurs types de phases ont été mis

en œuvre dans des colonnes en verre. La taille et le diamètre de la colonne sont choisis en

fonction de la quantité d’échantillon à purifier et de la résolution souhaitée (LHUILIER,

2007).

2.2.2.1. Chromatographie d’affinité

La Chromatographie d’affinité est fondée sur l’interaction spécifique et réversible qui

peut exister entre deux molécules, l’une étant la molécule à séparer, l’autre un ligand

immobilisé sur gel inerte. Seul le ligand est reconnu par la molécule qui possède le site de


liaison spécifique ; les interactions mises en jeu sont essentiellement des liaisons hydrogènes,

auxquelles peuvent s’ajouter des interactions hydrophobes, voire des liaisons ioniques. Là

encore, la chromatographie se déroule en deux temps ;

-dans la phase de charge de la colonne, seule la molécule reconnue par le ligand immobilisé se

fixe sur la colonne ; les autres molécules traversent la colonne et éluent directement ;

-pour récupérer la molécule fixée, on met en jeu la réversibilité de l’interaction en

apportant le ligand sous forme libre. Par la loi d’action de masse, le ligand apporté en excès

déplace la molécule immobilisé. Cette réversibilité est réalisé soit en détruisant les interaction

faible comme en protonant (élution en milieu acide) ou en augmentant la force ionique,

parfois, l’élution fait par dénaturation à l’urée (6 à 8M) (HAINQUE, 2008).

2.2.2.2. Chromatographie d’exclusion stérique

La chromatographie d’exclusion stérique, appelée également chromatographie de

filtration de gel, ou encore de perméation de gel. A pour de but de séparer de petites

molécules, en phase organique. Cette méthode utilise une phase stationnaire constituée d’un

polymère, qui donne un gel poreux dont le degré de réticulation va conditionner la taille des

pores. Ce gel laisse pénétrer les molécules de taille inférieure à celle de ses pores. Alors que

les grosses molécules restent à l’extérieur. Les grosses molécules sont donc exclus du gel et

peuvent être séparées des petites molécules qui ne sortent du gel que plus tardivement.

Cette méthode permet la séparation de molécules de masse moléculaire élevée. si

l’élution est réalisée par une phase mobile constituée par un tampon non dénaturant, cette

méthode peut être utilisée dans les protocoles d’isolement et de purification (HAINQUE,

2008)

Figure 09 : Chromatographie d’exclusion


2.2.2.3. Chromatographie d’adsorption

Elle utilise une phase stationnaire solide sur laquelle vont s’adsorber les molécules à

séparer par des liaisons hydrophiles ou des forces de Van Der Waals dont l’intensité dépend

de la structure de la molécule. La grande surface d’échange fait que ces liaisons s’établissent

facilement et que les molécules fixées peuvent aussi être aisément libérées, d’où la possibilité

de leur séparation en fonction des fores de rétention. Ce phénomène se retrouve en CPG ; en

CPL et en CCM (HAINQUE, 2008)

2.2.2.4. Chromatographie de partage

La chromatographie de partage utilise la différence de solubilité entre deux phases non

miscibles. En CPG, l’échange se fait entre une phase stationnaire plus ou moins polaire

adsorbé sur des particules de très petite taille et d’une phase mobile gazeuse. En CPL, la

phase mobile est constituée par un mélange de solvant, mélange dont la polarité dépend de la

phase stationnaire. Le matériau poreux remplissant la colonne sert de support à la phase

stationnaire liquide. Celle-ci est constituée par le solvant constitutif de la phase mobile ayant

la polarité la plus proche de celle du support poreux. Ce solvant qui va s’adsorber sera en

permanence entrainé par la phase mobile. Cela évite les phénomènes de lessivage et la

désactivation, phénomènes observés avec les premières phases stationnaires imprégnées. Les

substances à séparer se partagent entre la phase mobile et le solvant adsorbé (HAINQUE,

2008)

La séparation des composés est due à la différence relative de leur vitesse d’élution et

donc à la différence de vitesse d’échange entre la phase mobile et la phase stationnaire. Les

vitesses d’élution dépendent des coefficients de partage de la molécule entre les deux phases.

Dans cette technique, On distingue deux types :

La chromatographie en phase normale, dans laquelle la phase stationnaire est polaire

et la phase mobile apolaire, les composés polaires étant les plus retenus.

La chromatographie en phase inverse ou la phase stationnaire est apolaire et phase

mobile polaire, en générale aqueuse. Dans ce cas les composés apolaires sont les plus

retenus. (HAINQUE, 2008)

2.2.3. Chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC)

La chromatographie liquide à moyenne pression (MPLC) est réalisée à l’aide d’une

pompe Büchi 688, sur colonnes de chromatographie moyenne pression en verre Büchi


remplies soit avec de la silice SDS 60 Å 6-35 μm (SDS, Peypin) en phase normale

(préalablement activée quelques heures à l’étuve à 110 °C), soit avec de la silice en phase

inverse de type C18 90 Å 40-60 μm .L’échantillon est introduit sous forme solide mélangé à

la phase stationnaire. Les systèmes d’élution utilisés sont généralement des mélanges binaires

dans des proportions variables au cours de l’élution. La colonne est éluée avec un débit

d’environ 20 mL/min et la pression est en moyenne de 2 bar.

Les fractions recueillies sont regroupées selon les résultats de l’analyse par CCM

(LHUILIER, 2007)

2.2.4. Chromatographie en phase liquide

Méthode de séparation des constituants d’un mélange ; elle utilise une phase

(stationnaire) solide ou liquide, immobilisé dans une colonne, et une (mobile) liquide qui se

déplace à travers la phase stationnaire. Les composée sont introduits (on dit injectés), en

mélange, tête de la colonne ; ils interagissent alors avec les phases stationnaire et mobile selon

une série d’équilibres successifs. Chaque composé à séparer présente un coefficient de

distribution entre les deux phases différentes ; ils sont donc plus ou moins retenus par la

phase stationnaire dans la colonne et plus ou moins entrainés rapidement par la phase mobile

à l’extérieur. Ils se déplacent ainsi dans le système à des vitesses différentes, ce qui permet de

les séparer (HAINQUE et al., 2008)

Chapitre IV

Méthodes d’identification des

métabolites secondaires végétaux

Chapitre IV Techniques d’identification des métabolites secondaires

1. Chromatographie liquide à haute performance

1.1. Principe

La chromatographie liquide haute-performance (CLHP) est une puissante technique de

séparation utilisée pour l’identification, la quantification et/ou la purification

(chromatographie semi-préparative ou préparative) des composés dans un mélange. Ce

dernier est mis en solution dans la phase mobile (solvant) puis est injecté sous haute pression

en tête de la colonne (tube en acier inoxydable contenant la phase stationnaire) (DONG,

2006 ; SNYDER et al, 2009). Il existe plusieurs types de phases stationnaires mettant en jeu

des mécanismes de rétention variés les temps de rétention diminuent avec la polarité des

analytes (ROSSET et al., 1991) et peuvent être ajustés en utilisant un gradient d’élution

combinant l’eau et un solvant organique (notamment le méthanol et l’acétonitrile) comme

phase mobile. Cette méthode détriment de la phase normale du fait d’une meilleure

reproductibilité des temps de rétention. Ceux-ci, spécifiques de chaque constituant, sont

fortement dépendants de la nature de la phase stationnaire, de la composition de la phase

mobile et des conditions opératoires (débit, pression et température)

Les couplages CLHP/SM en utilisant un spectromètre de masse par désorption de

champ dont les multiples inconvénients – notamment ceux liés à la préparation de

l’échantillon – en ont restreint l’utilisation. L’une des avancées majeures a été le

développement de l’ionisation chimique directe (HUNT et al, 1977) avec cette technique,

l’échantillon déposé sur un émetteur chauffé est placé directement dans le gaz réactant. Les

ions générés sont résorbés et accélérés jusqu’au spectromètre de masse.

1.2. Exemple d’identification des métabolites par HPLC

L’exemple donné concerne l’extrait des alcaloïdes totaux des graines de datura

stramonium L. dont l’identification est réalisé par HPLC en référant par les standards

l’atropine et la scopolamine. Les résultats sont illustrés dans la figure 3. les chromatogrammes

standards sont illustrés dans les figures 1et 2 qui montrent que les temps de rétention pour

l’atropine et la scopolamine (standard) sont respectivement 13.37min et 7.64 min.


Figure 10: Chromatogramme en HPLC de scopolamine (benouadah ,2009)

Figure 11 : chromatogramme en HPLC de l’atropine (benouadah ,2009)

Figure 12 : chromatogramme en HPLC des alcaloïdes totaux des graines de plante

(benouadah ,2009)


1.3. Discussion de résultat

L’analyse qualitative et quantitative par HPLC

La comparaison des RT entre les standard et l’extrait permet de confirmer que l’extrait de la

plante de datura stramonium l renferme ces deux alcaloïdes, atropine et scopolamine

(BRENUTON, 1999).

2. Spectrométrie de masse (MS)

2.1. Principe

La spectrométrie de masse consiste à séparer et identifier des molécules selon leur masse

et leur charge, la séparation des molécules par cette technique est plus douce qu’avec les

autres méthodes. Elle permet d’ioniser des molécules de grande taille, peu volatiles et

sensibles à la chaleur sans les dégrader (YOUNG, 2004). L’échantillon est placé sur une

lame, le dépôt (ou spot) formé est appelé cible. Une source laser est dirigée sur la cible afin

d’ioniser les molécules de l’échantillon. Les ions sont ensuite détectés en mesurant le temps

que mettent les différentes particules à atteindre le détecteur. La vitesse de chaque particule

dépend du rapport masse/charge. Les molécules plus grandes mettront plus de temps à

atteindre le détecteur, tandis que les molécules plus petites arriveront plus vite. Une fois l’ion

arrivé au détecteur, le signal est amplifié et envoyé à un ordinateur qui traite les données et

donne les résultats sous forme de spectre (TONELLA et PETRINI, 2007).

2.2. Exemple d’identification des métabolites par MS

La mesure du spectre de masse en ionisation impact électronique (EI) en mode positif

des triterpène des feuilles de Agauriak polyphylla montre un ion à m/z 426 qui correspond à

l’ion moléculaire M•+. Le spectre présente également des ions résultant de la fragmentation

de la molécule et notamment l’ion B à m/z 207 qui est caractéristique des cycles A et B d’un

triterpène (BUDZIKIEWICZ et al.,1963 ; ULLAH et al., 1999), la perte par cet ion d’une

molécule d’eau indique que les cycles A et B portent un groupement hydroxyle, très

probablement en position 3 pour des raisons biogénétiques.


Figure13 : Spectre de masse EI de composée triterpènique des feuilles de Agauriak

Polyphylla

3. Chromatographie en phase gazeuse

3.1. Principe

La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une technique permettant de séparer

et d’identifier (technique couplés GC-MS) les composés d'un mélange. Elle s'applique

principalement aux composés gazeux ou susceptibles d'être vaporisés par chauffage sans

décomposition. Dans la CPG la phase mobile est gazeuse. Le mélange à analyser est vaporisé

à l'entrée de la colonne. La phase stationnaire dans la colonne peut être solide ou liquide. Le

mélange est transporté à travers celle-ci à l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les

différentes molécules du mélange se séparent et sortent de la colonne les unes après les autres

après un certain intervalle de temps dépendant de l'affinité de la phase stationnaire avec ces

molécules. A la sortie de la colonne, les composés rencontrent un élément essentiel qui est le

détecteur. Il évalue en continu la quantité de chacun des constituants séparés au sein du gaz

porteur grâce à la mesure de différentes propriétés physiques du mélange gazeux et envoie un

signal électronique vers un enregistreur (PENCHEV, 2010)


3.2. Exemple d’identification de métabolite par CPG

Les analyses par GC/MS de l'extrait aqueux de Retama sphaerocarpa ont permis de

détecter 9 alcaloïdes, signalés dans le chromatogramme (figure 13).

Figure 14: Profils des pics de l'extrait aqueux de Retama sphaerocarpa,

(CORDERO et al., 1989) Les composés numérotés sont donnés au tableau suivant

Tableau 01 : Les Alcaloïdes identifiés dans l’extrait aqueux de Retama sphaerocarpa.

CORDERO et al., 1989)

Némuro Nom du composé (%)

1 B-isoparteine 1.23

2 11,12-dehydrosparteine 5.54

3 Ammodendrine 7.22

4 Retamine 44

5 Cytisine 1.81

6 5,6- dehydrolupamine 1.49

7 Lupamine 2.14

8 Anagyrine 3.30

9 Baptifoline 3.1.


Le présent travail utilise la GC/MS pour analyser les alcaloïdes de l'extrait aqueux de

Retama sphaerocarpa. Les résultats indiquent la présence des alcaloïdes suivants: β-

isosparteine,11,12-dehydrosparteine, Ammodendrine, Retamine, Cytisine, 5,6–

dehydrolupamine, Lupamine, Anagyrine, Baptifoline. (CORDERO et al., 1989)

4. Spectrométrie d’infrarouge

4.1. Principe

La spectrométrie infrarouge est une méthode utilisée pour identifier les différents

groupes de métabolites secondaires des plantes. La méthode est basée sur l’excitation des

molécules par des radiations infrarouge. L’absorption des rayonnements de nombres d’ondes

comprises entre 4000 et400 Cm entant qu’énergie de vibration moléculaire modifie à la fois

les états de rotation et de vibration des molécules (BERTRAND ET DUFOUR, 1987)

La spectrométrie d’IR est basée sur l’absorption ou la réflexion par l’échantillon des

radiations électromagnétiques comprises entre 1 et 50 µm.

Dans le proche et moyen IR, l’absorption de la lumière par la matière a pour origine

l’interaction entre les radiations de la source lumineuse et les liaisons chimiques.

Les atomes situés aux deux extrémités d’une liaison sont animés d’un mouvement de

vibration l’un par rapport à l’autre et s’ils sont différents ils forment un dipôle électrique

oscillant à cette même fréquence.

Si on irradie à cette même fréquence, il y aura absorption (accord entre fréquence

mécanique et électromagnétique) (BERTRAND et DUFOUR, 1987)

2.4.2. Exemple d’identification des métabolites par IR

L’exemple donné est le spectre infrarouge du taxol (figure 14). La bande à 2362 cm-1

ne provient pas du taxol, c'est une impureté présente dans le système FTIR employé.

Le tableau 3 nous indique les bandes caractéristiques des principaux groupements

fonctionnels de la molécule du taxol, retrouvées sur le spectre infrarouge. On remarque que

les groupements cétonique et acétates de la molécule se retrouvent au même endroit à 1735

cm1-

(JEAN, 1992)


Figure15: Spectre infrarouge du taxol (JEAN, 1992)

Tableau 02 Analyse du spectre infrarouge du taxol ((JEAN, 1992)

Bande (cm-1

) Groupement fonctionnel

3500-3300

2957

1735

1655

1486

1373

1253

1076

688

714

O—H

N—H

C—H (CH3 ,CH2,CH)

C=O (ester et cétone )

C=C (alcène)

C=C (aromatique)

N—H (amide)

C—H(méthyl)

C—O(ester)

C—O(alcool)

C—O(alcool)

C—N(benzene)


5. Résonance magnétique nucléaire (RMN)

5.1. Principe

La RMN tire des informations de l’interaction qui naît entre les noyaux des atomes de

certains éléments présents dans l’échantillon et le champ magnétique intense et constant,

produit par un aimant auquel on le soumet (signaux de résonance).

Sur un appareil, on donne la fréquence nominal du proton qui est lié au champ de

l’appareil (exemple B0=9T entraîne 1H=400MHz)

Le spectre RMN correspond à l’absorption, par certain atome de l’échantillon, de

certaines des fréquences présentent dans la source électromagnétique. Cette technique fait

appelle au spin des noyaux qui permet d’expliquer le comportement des atomes dans un

milieu où il règne une direction privilégiée.

Il ne faut donc pas de spin nul pour étudier un atome en RMN il ne faut donc pas que

A (nucléon) et Z (proton) soient tous deux paire, sinon il n’y a pas de spin (donc pas de RMN)

(PCA, 2004)

5.2. Exemple d’identification des métabolites par RMN

(Détermination de structure de taxol de Taxus canadensis)

La RMN est la technique permettant la meilleure confirmation de la structure d'un

produit naturel comme le taxol. La figure (15) nous montre le spectre RMN-H du taxol de

Taxus canadensis.

Le tableau 3 détaille les déplacements chimiques des divers atomes d'hydrogène, la

multiplicité et les constantes de couplage (JEAN,1992)

Figure16 : spectre RMN-H du taxol ((JEAN, 1992)


Tableau 03 : Analyse du spectre RMN-H a du taxol et d'un taxane inconnu ((JEAN, 1992)

H Taxol b

litterature C

inconnu D

2 5,652 (d): J=6,8 5,64 (d); J = 7 5,728 (d); J = 5,9

3 3,772 (d); J = 6,6 3,78 (d); J = 7 3,024 (d); J = 5,9

5 4,929 (dd); J = 8,1 et 0, 4,92 (dd); J = 8 et 2 4,932 (d); J =8,5

6 a

1,820 (m) 1,82 (m) 1,911 (m)

b 2,454 (m) 2,50 (m) 2,515 (m)

7 4,410 (m) 4,38 (m) 4,438 (m)

9 - - 4,438 (d)

10 6,243 (s) 6,21 (s) 6,167 (d); J=1,6

13 6,208 (t); J = 5,2 6,20 (t); J = 8 6,147 (m)

14 2,299 (m) 2,25 (m) 2,158 (m)

16 1,220 (s) 1,24 (s) 1,911 (s)

17 1,122 (s) 1,12 (s) 1,792 (s)

18 1,770 (s) 1,78 (s) 1,654 (s)

19 1,662 (s) 1,66 (s) 1,224 (s)

20 a

4,171 (d); J = 8,5 4,16(d);J = 8 4,137 (d); J=8,4

b

4,289 (d); J = 8,3 4,28 (d); J = 8 4,247 (d); J=8,3

2 ‘ 4,772 (s large) 4,76 (d); J = 3 -

3 ‘ 5,767 (dd); J = 9,3 et 1,9 5,76 (dd); J = 9 et 3 -

OAc 2,223 (s) 2,20 (s) 2,117 (s)

2,368 (s) 2,38 (s) 2,170 (s)

2,258 (s)

2-OBz 8,125 (d) 8,11 (dd) 8,073 (dd

7,4 (m) 7,4 (m) 7,588 (t)

3’ ph 7,4 (m) 7,36 7,479 (t)

3’-NBz 7,734 (dd) 7,7 (dd) -

7,4 (m) 7,4 (m) -

NH 6,961 (d); J = 9 6,97(d);J = 9 -

2’-OH 3,532 (d)

Chapitre v

Exemple expérimentale de

traçabilité d’identification des


Chapitre V EXEMPLE expérimental

Exemple expérimental de la traçabilité d’identification des métabolites

secondaires

Cette étude est réalisée par ATHMENA, (2008). Dont elle a étudiée le contenu des

feuilles sèches de romarin et des graines de cumin en flavonoides.

1. Méthodes

1.1. Extraction

L’extraction des flavonoïdes est réalisée selon le schéma présenté par ELAGOUN,

(2003). Les graines de cumin sont mises à macérer pendant une nuit à température ambiante,

dans un mélange méthanol-eau (7:3 V/V) qui est porté à ébullition, le tout par la suite est filtré

sur papier Whatman, l’extraction est refaite plusieurs fois avec renouvellement du solvant. Le

solvant est éliminé du filtrat par évaporation rotative dans un rotavapor (BÜCHI).

1.2. Fractionnement de l’extrait brut

L’extrait brut est mélangé avec de l’eau distillée bouillante et laissé à température

ambiante pendant 24 heures. Après filtration, l’extrait brut est épuisé successivement par 2

solvants (l’acétate d’éthyle et le n- butanol).

L’extrait brut est initialement mélangé avec l’acétate d’éthyle, le mélange est laissé

décanter et la phase organique supérieure est récupérée. L’extraction est refaite plusieurs fois

jusqu’à ce que le solvant devienne transparent. L’acétate d’éthyle est par la suite évaporé et

l’extrait résultant est considéré comme étant la fraction d’acétate d’éthyle.

La phase aqueuse résiduelle est soumise à une autre extraction liquide-liquide par le n

butanol, en suivant les mêmes étapes que la première extraction.

La série d’extraction permet d’obtenir quatre fractions ; l’extrait brut hydro-

méthanolique (EBr), la fraction d’acétate d’éthyle (EAcOEt), la fraction du n-butanol (En-

BuOH), et la fraction aqueuse (EAq) résiduelle. Les extraits sont conservés jusqu’à

utilisation.

1.3. Identification des flavonoïdes

1.3.1. Test préliminaire (La réaction de Shibata)

La présence ou l’absence des flavonoïdes dans un extrait peut être mis en évidence par

un test simple et rapide. Ce test consiste à mettre 2 ml d’extrait dans un tube, d’additionné

quelques fragments de magnésium et quelques gouttes d’HCl. La présence des flavonoïdes

aglycones dans les extraits est indiquée par le virement de la couleur vers l’orange ou le rouge

brique (CIULEI, 1982).


1.3.2. Dosage colorimétrique

La méthode de trichlorure d’aluminium (AlCl3) cité par (DJERIDANE et al., 2006) ;

(BOUDIAF, 2006) est utilisée pour quantifier les flavonoïdes dans les extraits.

1 ml d’extrait et du standard (querci(dissous dans le méthanol) avec les dilutions

convenables a été ajouté à un volume égal d’une solution d’ AlCl3 (2% dans le méthanol).

Le mélange a été vigoureusement agité et l'absorbance à 430 nm a été lue après 10

minutes d’incubation.

La quantification des flavonoïdes à été faite en fonction d'une courbe d'étalonnage

Linéaire (y = a x + b) réalisé par un standard "la quercétine" à différentes concentrations

(1.75-40 μg/ml) dans les mêmes conditions que l’échantillon. Les résultats sont exprimés en

microgrammes d’équivalent de quercétine par milligramme d’extrait (μg EQ/mg)

Figure17. Courbe d’étalonnage de la quercétine

1.3.3. Analyse qualitative par HPLC

L’analyse est réalisée par un HPLC (VP SHIMADZU LIQUID

CHROMATOGRAPH). Le besoin de savoir les profils et d'identifier les composés individuels

dans les échantillons exige le remplacement des méthodes traditionnelles par des techniques

séparatives. L’HPLC est la technique analytique la plus utile pour caractériser les composés

polyphénoliques (GOMEZ-CARAVACA et al., 2006).

1.3.3.1. Principe

20 μl d’extrait ont été injectés sur une colonne de type phase inverse C18, de

dimensions égales à 125 x 4.6 mm. La phase mobile est constituée de trois éluants : l’eau

distillée, méthanol, acide acétique (50 : 47 : 2.5) (V /V /V). Le gradient d’élution appliqué est


de type isocratique étalé sur 10 min. Le débit est de 1 ml / min (AMAROWICZ et al.,

2005). La détection a été effectuée par un détecteur UV-Vis à une longueur d’onde égale 254

nm.

1.3.3.2. Expression des résultats

Les flavonoïdes contenus dans l’extrait analysé ont été identifiés par la comparaison

des temps de rétention obtenus par ceux des témoins.

2. Résultat et discussion

2.1. Test préliminaire

Les résultats du dosage préliminaire des flavonoïdes sont rapportés dans le tableau 04

Tableau 04 : Virement de la couleur des extraits du cumin

Extrait Couleur

EBr Rouge brique clair

EAcOEt Rouge brique très foncé

En-BuOH Rouge brique foncé

Le test préliminaire a indiqué la présence des flavonoïdes aglycones dans les extraits

et sur tout dans l’extrait éthanolique. Au Préalable, l’intensité de la couleur observée indique

la richesse du cumin en flavonoïdes.

2.2. Dosage colorimétrique

Les résultats du dosage quantitatif des flavonoïdes déduit à partir de la courbe

d’étalonnage révèlent, comme montre le tableau 05, la richesse de la fraction d’acétate

d’éthyle en flavonoïdes.

Tableau 05 : Teneur en flavonoïdes des extraits du cumin.

Extrait Teneur en flavonoïdes

EBr 17.39± 2.71

EAcOEt 54.21± 2.82

En-BuOH 20.11±5.80


23. Analyse qualitative par HPLC

Les chromatogrammes d’HPLC de standard et des différents extraits sont représentés dans les

figures ci-dessous.

Figure18 : Chromatogramme d’HPLC de la quercétine enregistré à 254 nm.

Figure19 : Chromatogramme d’HPLC d’EBr du cumin enregistré à 254 nm.

Figure20 : Chromatogramme d’HPLC d’EAcOEt du cumin enregistré à 254 nm


.

Figure 21 : Chromatogramme d’HPLC d’En-BuOH du cumin enregistré à 254 nm.

La comparaison des temps de rétention de standards avec ceux enregistrés dans les

différents chromatogrammes, permet d’identifier l’existence de quercétine dans l’extrait brut

en grand quantité et moyennement dans la fraction d’acétate d’éthyle et faiblement dans la

fraction de n butanol.

Conclusion

Conclusion

Depuis des milliers d’années, l’humanité a utilises plantes trouves dans son

environnement, afin de traiter et soigner toutes sortes des maladies, ces plantes représentent

un réservoir immense de composés potentiels attribués aux métabolites secondaires qui ont

l’avantage d’être d’une grande diversité de structure chimique et ils un possèdent un très large

éventail d’activités biologique.

La recherche sur les métabolites secondaires dans les plantes est d’actualité en raison de

leurs importantes propriétés biologique.

Traçabilité de l’identification des métabolites secondaires végétaux sont procédés par

une extraction, dosage, séparation et purification.

Les principales méthodes d’extraction utilisées sont : la macération par solvant, soxhlet

pour les molécules aromatiques, différentes types de distillation pour l’extraction des huiles

essentielles.

Et le dosage est effectué par des méthodes colorimétriques à l’aide des réactions

critiques spécifiques.

Les méthodes de séparation préparative par le chromatographie sur couche mince de

gel de silice et les séparations analytiques par différent types de chromatographie sur colonne,

partage liquide-liquide, chromatographie liquide, permettent la séparation des différent

classes des métatolites secondaires végétaux

Les principales méthodes d’identification des métabolites secondaires végétaux ;

chromatographie liquide àhaute performance (CLHP) ,chromatographie phase gazeuse

(CPG) , spectrométrie de masse (MS) , ,infrarouge (IR) , résonance magnétique nucléaire

(RMN).

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فصم و ححذٌذ منخىج اال ٌض انثانىي انفالفىنٍذي ننبخت طبٍت حنخمً انى انعائهت انشفىٌت و دراست انخاثٍز انمضاد نهبكخٍزٌا

ادة ماخسخٍز قسنطٍنتهش

:ملخص

وٌبذأ هذا انخخبع مع اسخخالص انمصادر . ٌزكش عمهنا عهى حخبع ححذٌذ هىٌت انمزكباث انثانىٌت فً اننباث

. وحصمٍمها، واالنفصال، وحنقٍخها، وأخٍزاً انخعزف عهٍها (نىاحح انمزكباث انثانىٌت)اننشطت

صهب بىاسطت انمذٌباث -مخخهف أنىاع االسخخالص سائم:انطزق انمسخعمهت من اخم االسخخالص مخعذدة نكن أهمها

. طزق انخقطٍز,انعضىٌت

قٍاص انطٍف , (CPG )غاس انهىنً , (HPLC )وكذنك ححذٌذ انهىٌت ٌخطهب خصىصا أداة ثقٍهت حشمم انسائم انهىنً

( IR )و األشعت ححج انحمزاء (RMN) (انزنٍن انمغناطٍسً )انزنٍن انمغناطٍسً اننىوي انطٍفً, MS ))انكخهً

. اننباحاث,االسخخالص، االنفصال، ححذٌذ انهىٌت، نىاحح انمزكباث انثانىٌت: مفخاحٍتانكهماث ال

Résumé : Notre travail porte sur la traçabilité de l’identification des métabolites secondaires végétaux.

Cette traçabilité débute par l’extraction des principes actifs (métabolites secondaires), leurs dosage,

séparation et purification et enfin leurs identification. Enormément de méthode d’extraction sont

utilisées, mais essentiellement les différentes type d’extraction solide liquide par des solvants

organiques et les méthodes de distillation. La séparation basée sur les méthodes chromatographiques.

Ainsi l’identification nécessite particulièrement un instrument lourd incluant la chromatographie liquide

à haute performance(CLHP), la chromatographie phase gazeuse (CPG), le spectrométrie infrarouge (IR),

le spectrométrie de masse (MS) et la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN).

Mots clés : extraction, séparation, identification, métabolites secondaires, végétaux.

Summary: Our work focuses on the traceability of the identification of the plant secondary metabolites. This

traceability starts with the extraction of active principles (secondary metabolites), their determination,

separation, and purification and finally their identification. Lot of extraction method are used, but

essentially the different type of extraction solid -liquid by organic solvents and methods of distillation.

Separation based on chromatographic methods. Thus identifying particularly requires a heavy

instrument including liquid chromatography high performance (HPLC), gas chromatography (GC),

infrared spectroscopy (IR), mass spectrometry (MS) and Nuclear Magnetic Resonance (NMR).

Keywords : Extraction , Separation, identification, secondary metabolites, plants

en vue de l’obtention du diplôme licence - univ · principe 21 2.1. exemple d‘identification...

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