effet toxique des résidus des pesticides utilisés sur la flore de la région de … · 2013. 1....

N0 ……../SNV/2021

Département de Biologie Végétale et Ecologie

MEMOIRE

Présentée par : BENZIDANE CHAHRAZED

Pour obtenir le diplôme de Magister

Option : Biodiversité et gestion des écosystèmes

THEME :

Effet toxique des résidus des pesticides utilisés sur la flore de la région de Sétif

Soutenu publiquement le 13/11/2012

Devant le jury

Président : M. KAABECHE

Pr. UFA- Sétif

Rapporteur : S. DAHAMNA Pr. UFA- Sétif

Examinateur : H. BOUZERZOUR

Examinateur : M. BOUNECHADA

Pr. UFA-Sétif

M.C.A. UFA- Sétif

Année universitaire 2011-2012

Remerciements La réussite d’une thèse doit beaucoup à l’environnement scientifique et humain dans

laquelle elle se déroule.

La rédaction de ces pages clôt une aventure de trois années qui n’a pas toujours été facile

et je tiens à exprimer ma reconnaissance à tous ceux et celles qui, par leur soutien, leur aide

et/ou leurs encouragements, ont contribué, de près ou de loin, à la concrétisation de ce travail.

J’exprime toute ma reconnaissance et ma profonde gratitude à ma directrice de thèse, Mm

e

DAHAMNA pour le temps qu’elle m’a consacré, son aide constante et ses conseils avisés.

J’ai beaucoup apprécié de travailler à vos côtés, pour votre dynamisme, votre franchise, votre

rigueur, votre soutien et disponibilité au quotidien et pour toutes les conversations échangées.

Mes remerciements les plus sincères s’adressent tout particulièrement à Mer KAABECHE,

qui m’a fait l’honneur d’accepter de présider le jury de cette thèse, veuillez trouver ici

l’expression de ma profonde gratitude. Vous m’avez épaulée lors de mes recherches et mes

moments de doute. Je vous prie de trouver le témoignage de mon plus profond remerciement.

Ma gratitude va aussi à Mers

BOUZERZOUR et BOUNECHADA, je suis honorée de vous

compter parmi les membres de mon jury malgré votre emploi du temps chargé. Merci pour

votre disponibilité, votre aide et votre soutien moral et d’avoir accepté d’évaluer ce travail.

Je souhaiterais remercier également Mer BOUHARATHI, pour son aide précieuse au début

des recherches bibliographiques, ses conseils scientifiques sa gentillesse et sa patience. Ses

commentaires et critiques ont permis l’amélioration du manuscrit final.

Je remercie profondément Pr. TOUABTI pour son soutien, sa précieuse aide. Merci de

m’avoir aidé à mener à bien ce travail avec tant de bienveillance.

Je n’oublierai pas de remercier Dr. ABDELLOUCHE, Directeur du laboratoire

d’Anatomie-Pathologique pour m’avoir si bien accueillie au sein de son laboratoire mais

également pour sa sympathie et son encouragement. Merci pour tout ce que j’ai appris à vos

côtés.

Je réserve une mention particulière à toutes les personnes qui m’ont apporté leur soutien et

leur aide et tout particulièrement ma tante Malika et à mon beau frère Nacir.

Mes remerciements s’adressent également à Sonia, Nadia et Karima ainsi qu’a toutes les

autres personnes que je n’ai pas citées. Merci pour votre gentillesse et votre amabilité, Cette

thèse marque la fin de 2 années au sein de l’écosystème que forme le laboratoire de biologie

animale.

Je dédie ce travail à la mémoire de ma chère et regrettée maman, c’est pour toi que j’ai fait

ce parcours et je regrette que tu ne sois pas parmi nous en ce moment tant attendu. Tu es dans

mon cœur et mon esprit en toute circonstance.

Merci à mon père adoré, à ma sœur, à mes frères et à tout le reste de la famille. Je dédie

également ce travail à mon cher époux Halim et à ma tendre fille Sérine auxquels je suis

redevable pour leur soutien inconditionnel et leurs sacrifices. Ce travail n’aurait jamais pu être

mené à bien sans leur encouragement et compréhension. Sérine, ton amour me donne des ailes

pour avancer dans la vie. Je ne crois pas avoir besoin d’en dire plus je t’aime très fort.

A ma frangine Nadia: Aujourd’hui tu es présente pour moi, demain ce sera mon tour de

faire partie de ton auditoire, avec autant de fierté. J’espère que tu t’épanouiras toujours dans ta

vie, notamment au travers d’une belle carrière qui t’attend. On a partagé beaucoup de bons

moments, et c’est loin d’être fini.

Liste des abréviations

ACh Acétylcholine

AChE Acétylcholinestérase

AFSSA Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments

AMM Autorisation de mise sur le marché

ANOVA

AU

CCM

Analyse de variance

Acide urique

Chromatographie sur Couche Mince

CEC Commission of the European Communities

Chol T

Créât

CPF

Cholestérol total

Créatine

Chlorpyrifos

CPO Chlorpyrifos-oxon (métabolite actif du CPF)

CYP

D

DDT

DEP

DES

DF

DJA

DL50

E ou E C

EDTA

F

FAO

FNS

Glu

Cytochrome

Poussière ou poudre

(Dichloro-Diphényl-Trichloroéthane),

Diéthylphosphate

Dose sans effet

Pâte granulée

DJA Dose journalière administré,

Dose létal

Concentré émulsifiable

Ethylène-diamine-tétra-acétate

Suspension concentrée

Food and Agriculture Organization

Formule numérique sanguine

Glucose

GR Granulé

HCT Hématocrite

HGB

HPLC

IBS

K

LMR

MCH

MCHC ou CCMH

MCV ou VGM

mEq/L

MPV

Na

NOAEL

O.M.S

OP

ORP

P

PAL

PLT

POPs

PPP

REACH

RBC

SC

SEM

SN

SP

TCPY

TG T

TGO

TGP

UI/L

WBC

WDG

Hémoglobine

Chromatographie Liquide Haute Performance

Inhibiteurs de la synthèse des stérols

Potassium

Limite Maximale de Résidus

Teneur corpusculaire en Hémoglobine

Concentration corpusculaire moyenne en Hémoglobine

Volume globulaire moyen

Milliéquivalent par litre

Volume plaquettaire moyen

Sodium

Non Observable Adverse Effect Level)

Organisation mondiale de santé

Insecticides organophosphores

Observatoire des résidus des pesticides

Pastille

Phosphatase alcaline

Plaquette

Polluants Organiques Persistants

produits phytopharmaceutiques

Registration, evaluation and authorization of chemicals

Red Blood Cells ou globules rouges

Concentré pulvérisable

Erreur standard de la moyenne

Solution

Poudre soluble

Trichloro-2-pyridinol

Triglycérides totaux

Transaminase Glutamate Oxolo-acétate

Transaminase Glutamate Pyruvate

Unité internationale par litre

White Blood Cells ou Globules blancs

Granulé soluble

WP Poudre mouillable

WS Concentré soluble dans l'eau

ERROR: undefinedresource OFFENDING COMMAND: findresource STACK: /4 /CSA /4 /CSA -mark-

CHAPITRE II

MATÉRIELS ET MÉTHODES

Chapitre II

II. 1. Méthodes et dosage des pesticides

Matériels et méthodes

La recherche et le dosage de résidus de pesticides dans les aliments et notamment dans les

légumes et fruits nécessitent des techniques d'extraction, de séparation et de détection très

performantes afin de traiter rapidement un grand nombre d'échantillons susceptibles de

contenir plusieurs substances actives.

Les méthodes chromatographiques sont parmi les techniques les plus utilisées, les

techniques mises en œuvre: chromatographie en phase liquide ou en phase gazeuse sont

associées aux méthodes de détection courantes ou bien à la spectrométrie de masse pour

atteindre des limites de détection de plus en plus basses garantissant ainsi la qualité des

produits de consommation.

II.1. 1. Chromatographie Liquide Haute Performance (HPLC)

Elle permet le dosage des composés thermolabiles et ioniques. La colonne la plus utilisée

est celle qui contient une phase stationnaire greffée en C18. Le détecteur UV est très sollicité

dans les dosages de routine cependant le détecteur à barrette diode (DAD) offre de grandes

possibilités d’identification des composes grâce à sa banque de spectres de référence. Cun et

al. (2002) ont mis en place une méthode d’analyse de 14 pesticides de la famille des

carbamates avec une HPLC/UV-DAD.

Le couplage de la HPLC et la SM permet le dosage d’un éventail de produits et surtout

d’éliminer les interférences de la matrice. Beaucoup de travaux sont de plus en plus cités qui

utilisent ce couplage (Ramos et al. 1999, Jeannot et al. 2000 et Zambonin et al. 2002).

II.1. 2. Dosage par HPLC

La Chromatographie Liquide Haute Performance permet de séparer et de doser différents

composés d’une solution qui absorbe dans l’UV. Pour des conditions opératoires précises,

chaque compose présente un pic avec un temps de rétention bien défini. La hauteur des pics

ou l’intégration de la surface de ces pics permet d’obtenir la concentration des produits.

II. 2. Matériel

II.2.1. Matériel chimique

Le pesticide : chlorpyrifos testé est choisi parmi ceux communément utilisés pour les

traitements phytosanitaires des légumes et fruits dans la région de Sétif. Les pesticides

- 28 -

Chapitre II Matériels et méthodes

peuvent être testés en mélange en fonction de leur nature chimique, de leurs modes d’action

ou de leurs cibles selon l’index phytosanitaire ACTA, 2005). Pour l'analyse chimique

l’acétonitrile eau extra pure. Tous les solvants utilisés sont de pureté chromatographique

(Fluka, HPLC grade).

II.2. 2. Choix du pesticide

Pour notre étude nous avons choisi dans un premier temps de déterminer les pesticides les

plus utilisés sur les fruits et légumes en Algérie et particulièrement dans la région de Sétif.

Ensuite, nous avons établi une liste afin de déterminer les pesticides les plus fréquemment

utilisés. Cette démarche nous a conduit à définir le pesticide à tester. Les légumes ont été

récoltés en juillet 2011 aux environs de Mezloug et Guellal zones situées respectivement au

Nord de Sétif. Quant aux fruits ils proviennent de Cheikh El-Aifa situé à Ain Roua.

II.2. 3. Matériel biologique

Nous avons utilisé dans le cadre de cette étude des rats mâles et femelles albino Wistar

ayant un poids variant entre 150 et 350 g et provenant de l’institut Pasteur d’Alger. Ils sont

hébergés dans des cages en plastique transparentes d’une longueur de 55 cm, d’une largeur de

33 cm et d’une hauteur de 19 cm. Chaque cage est marquée d’un numéro de lot qui lui

correspond. Les animaux ont été disposés d’une alimentation standard (Croquettes, Ets

ONAB El Kseur, Béjaia) et soumis à des conditions de température et d’éclairement

contrôlés. La litière utilisée est la sciure renouvelée trois fois par semaine pour assurer le bon

état hygiénique des animaux. Les animaux sont acclimatés aux conditions de l’animalerie du

département de Biologie- Sétif pendant une quinzaine de jours avant l’expérimentation.

(Figure 5). Figure 5 : Conditionnement des rats dans l’animalerie de l’université.

- 29 -

Chapitre II

II. 3. Méthodes


La méthode d'extraction mise en œuvre est celle proposée par Steinwandier ; 1985 C’est

une extraction simple de résidus par de l’acétone suivie d’un partage acétone eau

dichlorométhane (2 :1: 1.5) pour avoir la phase organique contenant les résidus qui seront

concentrés à 1ml.

II.3. 1. Préparation de l'échantillon et procédure d'extraction

a. Préparation de l’échantillon

Pour l’extraction des résidus dans les végétaux nous devons respecter 3 points d’intérêt

essentiel.

Le rapport acétone eau doit être deux volumes d’acétone pour un volume d’eau c'est-à-

dire que 200 ml d’acétone sont rajoutés pour l’extraction d’un volume eau + échantillon égal

à 100 ml. 30 grammes de chlorure de sodium (NACL) sont utilisés pour séparer les résidus de

pesticides dans la phase organique, 150 ml de dichlorométhane sont ajoutés pour enlever

l’eau de la phase organique.

b. Préparation de la solution aqueuse

La teneur en eau des échantillons sur lesquels nous avons travaillé pour déterminer les

résidus de pesticides est supérieure à 70%. Chaque échantillon (salade, concombre, courgette,

poivron, tomate, pomme et poire) doit peser 100 g.

Une quantité d’eau est additionnée à chaque échantillon afin d’obtenir un total de 100 g

selon la formule 100-TE où TE représente la teneur en eau de l’échantillon. Pour tout ce qui

est concombre, courgette, poivron, pomme et poire, on ajoute 15ml d’eau distillée. Pour la

salade et tomate l’apport en eau distillée est seulement 5ml.

c.

Extraction

Extraction liquide – liquide

La méthode consiste à extraire les pesticides hydrophobes se trouvant dans l’eau par un

solvant approprié et non miscible avec l’eau. L’extraction est effectuée sur un volume

important de l’échantillon dans une ampoule à décanter puis le solvant est évaporé et le résidu

est repris dans le milieu adéquat pour être analysé. Boussahel, (2001) note l’utilisation du

dichlorométhane comme solvant d’extraction et souligne que cette méthode est déjà

homologuée et normalisée pour le dosage de 15 pesticides organochlorés et

- 30 -


21organophosphorés. L’extrait obtenu est injecté directement en chromatographie

(Boussahel., 2001).

II.3. 2. Mode opératoire et technique d’extraction

Les aliments sont d’abord coupés séparément en petits morceaux puis mixés dans un

robot. Nous rajoutons 200 ml d’acétone à chaque échantillon. Le tout est mélangé pendant

3 minutes à l’aide d’un mixeur à grande vitesse et laissé au repos pendant 20 minutes à

température ambiante. Les mélanges obtenus sont définitivement homogénéisés par agitation

durant 3 minutes. Partage acétone / eau / dichlorométhane (2 : 1: 1.5) :

Dans un entonnoir de Buchner doté d’un papier filtré Wattman n°1, nous filtrons

l’homogénat préparé lors de l’opération d’extraction. Dans l’ampoule nous ajoutons 30 g de

chlorure de sodium (NaCl) à 200 ml de filtrat; le tout est agité pendant 3 minutes.

Ensuite, 150 ml de dichlorométhane sont ajoutés à la préparation et l’ensemble est agité

pendant 2 minutes.

Enfin, le mélange est laissé au repos une deuxième fois pendant 15 minutes et à

température ambiante jusqu’à séparation des deux phases : la phase aqueuse et la phase

organique. Cette séparation permet de réserver la phase aqueuse afin de procéder au séchage

de la phase organique isolement avec 30 g de sulfate de sodium (Na2SO4) et ce durant 30

minutes. La phase organique est filtrée dans un ballon de 500 ml dans un entonnoir contenant

une couche de sulfate de sodium. L’ampoule à décanter est rincée à l’aide de 40 ml de

dichlorométhane. La filtration de cette phase aqueuse est alors effectuée. Une seconde et une

troisième concentration sont obtenues par addition de dichlorométhane afin d’évaporer tout

l’acétone et cela dans le but d’obtenir un extrait égal à 1 ml. Cet extrait mis dans un flocon de

5ml est alors prêt à être analysé.

- 31 -


. Homogénéisation par agitation 3 min

Partage acétone / eau / dichlorométhane

Filtrer

+ 30 g de chlorure de sodium (NaCl)

+150 ml de dichlorométhane

Agiter 2 min.

Repos 15 minutes, séparation Séchage de la phase organique avec 30g de (Na2SO4) pendant 30 min

Filtrer avec une couche de sulfate de sodium

. 2éme et 3éme concentration + dichlorométhane

Evaporer tout l’acétone

1 ml d’extrait dans un flacon de 5ml

Analyse

Figure 6 : Méthode d’extraction des résidus de pesticides - 32 -

Chapitre II

II. 4. Evaluation de la toxicité aiguë chez les rats


Les tests de toxicité aiguë (DL50 orale, DL50 cutanée et CL50) inhalatrice chez le rat,

permet d’estimer la dose létale ainsi que les effets irritants ou sensibilisants d’un produit qui

apparaissent dans un temps court entre 1 et 14 jours après l’administration d’une substance

(pour notre étude le chlorpyrifos (CPF) administré par dose unique Les principaux effets

recherchés sont :

� les signes cliniques.

� les modifications pathologiques visibles à l’œil nu.

� La mortalité.

II. 4. 1. Toxicité aiguë

La toxicité aiguë d’une substance chimique est estimée par une série de tests réalisés sur

des animaux de laboratoire. La DL50 est la dose requise pour tuer la moitié d’une population

d'animaux de laboratoire. Le pesticide à tester est dilué dans de l’eau physiologique et est

administré à une dose unique, par voie orale, à raison d’une dose pour tous les groupes. La

DL50 pour le chlorpyrifos se situe entre 82 et 270 milligrammes par kilogramme (mg / kg)

de poids corporel de rats.

Pour le rat femelle la dose létale par voie orale : DL50 : 96 mg / kg (72-140)

Pour le rat male la dose létale par voie orale : DL50 : 102 mg / kg (94-110)

II. 4. 2. Choix de la dose

La plupart des études entreprises en toxicologie s'effectuent à la suite de l’administration

de la dose par voie orale. Cependant d'autres voies d'administration sont possibles : intra

veineuse, intramusculaire, sous-cutanée, percutanée et par inhalation. D’après les valeurs

expérimentales des DL50, les rats males paraissent plus sensibles que les rats femelles, cette

sensibilité liée au sexe pourrait être due aux différences physiologiques. Pour notre étude nous

choisissons les doses 1/5 pour la toxicité aiguë et 1/20 pour la toxicité subaiguë (Dahamna

2004).

� Mode opératoire

Le produit à tester est dilué dans de l’eau distillé et administré à une dose unique, par voie

orale. L’étude porte sur 60 rats adultes mâles et femelles de la souche Wistar.

- 33 -


Après une période d’habituation, les rats sont pesés, identifiés par une marque sur la

queue. Les animaux, sont répartis en 6 groupes de dix animaux (cinq males et cinq femelles)

Chacun, dont un, est le groupe témoin, sont privés de nourriture 24 heures avant l’essai. Le

chlorpyrifos est administré par voie orale aux animaux en une dose unique et par sonde

gastrique Les 5 lots ont reçu la dose de 1/5 de la DL50. Le groupe témoin a reçu de l’eau

physiologique. Après l’administration du chlopyrifos, les animaux sont observés

individuellement chaque heure pendant le premier jour et chaque jour pendant 14 jours. Le

comportement et les symptômes cliniques des animaux sont notés pendant toute la durée de

l’expérience.

II.4.3. Toxicité subaigüe

Ces épreuves ont pour objet :

1/ De mettre en évidence les altérations fonctionnelles et/ou pathologiques consécutives à

l’administration répétée des substances actives examinées.

2/ D’établir les conditions d’apparition de ces altérations en fonction de la posologie.

Notons que les expérimentations durent de 2 à 6 semaines. (Manahan, 2003). Il est utile de

choisir la dose la plus élevée de façon à faire apparaître les effets nocifs tandis que les doses

inférieures permettent de situer la marge de tolérance du nouveau produit chez l’animal.

L’appréciation des effets toxiques est faite sur la base de l’examen du comportement, de la

croissance pondérale, de la formule sanguine. Nous prenons en compte de surcroît la base des

comptes rendus nécrosiques, accompagnés des examens histologiques qui s’y rattachent

(Diallo, 2005)

Les 30 rats sont repartis en deux lots : un lot témoin de dix rats et un lot traité de vingt

rats (cinq par cage). Les rongeurs sont traités par voie orale avec du chlorpyrifos dissout dans

de l’eau distillée. Une dose de 1/20 de DL 50 et qui correspond à 22 mg/kg/semaine leur est

données au rythme d’un jour sur sept pendant 6 semaines. On note un retard dans l’apparition

des symptômes d’intoxication (30 min), salivation, difficulté de se mouvoir, l’administration

par voie orale du pesticide a provoqué une accélération du rythme respiratoire, une

vasodilatation au niveau des oreilles une excitation enregistrée dans les lots aucune toxicité

n’est apparue dans les conditions de la toxicité subaiguë, les seuls signes cliniques observés

chez les rats traités, sont des diarrhées et une faiblesse (manque de vivacité), après chaque

opération, qui se déroule une fois par semaine, on observe une légère diminution de

- 34 -


croissance pondérale les 15 premiers jours. Cette diminution pourrait être expliquée par une

réduction de la consommation des aliments, une diminution de l’activité motrice. Nous pesons

les rats chaque semaine. Au terme de 42 jours nous sacrifions les rats. Nous prélevons les

organes tels que les reins, la rate, le foie, les testicules, les poumons et le cœur que nous

observons macroscopiquement. Les organes prélevés sont débarrassés de l'excès de graisse.

Ils sont alors séchés avec du papier filtre préalablement pesés. Nous conservons les organes

dans du formol à 10% pour des études anatomopathologiques.

II. 5. Dosage de quelques paramètres hématologiques et biochimiques

II.5.1. Prélèvement sanguin

Le prélèvement du sang est effectué à l’aide d’un tube capillaire d’hématocrite à travers le

sinus rétro-orbital au niveau de la veine orbitale des rats anesthésiés au départ par l’éther par

voie ophtalmique. Nous recueillons le sang dans un tube EDTA pour la FNS, et dans un tube

héparine pour le bilan rénal. Nous centrifugeons les tubes héparines à 4000 g/5min. à 4°C. Le

sérum obtenu est aliquoté et conservé à une température de –20°C jusqu’au moment des

analyses biochimiques.

II. 5. 2. Examens Biochimiques

Le dosage des paramètres sériques : Glucose (Glu), Urée, Créatinine (Créat), Acide

urique (AU), Sodium (Na), Potassium (K), Cholestérol total (Chol T), Triglycérides totaux

(TG T), Transaminase Glutamate Oxolo-acétate (TGO), Transaminase Glutamate Pyruvate

(TGP), Phosphatase alcaline (PAL) sont mesurés par des méthodes enzymatiques réalisés au

niveau du Laboratoire Central (CHU) de Sétif à l’aide d’un Beckman coulter Synchro CX-9

clinical system ALX.

II. 5. 3. Examens hématologiques

Dans la formule numérique sanguine (FNS) on trouve les paramètres suivants :

Red Blood Cells ou globules rouges (RBC), volume globulaire moyen (MCV) ou (VGM),

hématocrites (HCT), plaquette (PLT), volume plaquettaire moyen (MPV), white Blood Cells

ou globules blancs (WBC), hémoglobine (HGB), teneur corpusculaire en hémoglobine

(MCH), concentration corpusculaire moyenne en hémoglobine (MCHC). Les analyses des

paramètres hématologiques sont effectuées à l’aide d’un Beckman coulter Médonic au

laboratoire central de Sétif.

- 35 -

Chapitre II

II. 5. 4. Technique histologique


Pour l’examen anatomo-histo-pathologique, les organes fixés dans du formol 10 %, sont

déposés dans des cassettes en plastique, puis sont déshydratés (par immersion dans des bains

successifs d’alcool, l'alcool est éliminé par des solvants (xylène)) avant d’être coulé dans des

moules contenant de la paraffine fondue par chauffage (paraffine liquide). Après

refroidissement, le bloc solide de paraffine contenant le tissu est coupé à l’aide d’un

microtome permettant de réaliser des coupes de 5 m d’épaisseur.

Les coupes obtenues sont étalées et collées sur des lames, puis séchées dans une étuve

pendant une nuit. Elles sont ensuite colorées par une solution d'hématoxyline-éosine. Après

coloration, le montage se fait à l’aide de l’eukitt placé entre lame et lamelle. La préparation

est séchée à l'air. Ces coupes histologiques sont réalisées au laboratoire d'anatomopathologie

de CHU de Sétif.

II. 6. Analyses statistiques

Les résultats expérimentaux sont exprimés sous forme de moyennes arithmétiques,

accompagnées de l’erreur standard (m ± SEM). La comparaison des moyennes est réalisée à

l’aide du test t de « Student», grâce au logiciel GraphPad et ANOVA uni-variée suivie du test

de Dunnett pour les comparaisons multiples et la détermination des taux de signification. Les

valeurs de p < 0.05 sont considérées statistiquement significatives. - 36 -

CHAPITRE III

RÉSULTATS

Chapitre III

III.1. Extraction

Résultats

L’extraction liquide-liquide du chlorpyrifos à partir des légumes et fruits a permis

d'obtenir des extraits de couleur jaune et orange avec un rendement d'extraction de

5mg /100g de légume.

III.2. Chromatographie sur couche mince (CCM)

a. Principe de la technique

Lorsque la plaque sur laquelle est déposé l’échantillon est placée dans la cuve, l’éluant

monte à travers la phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque

composant de l’échantillon se déplace à sa propre vitesse derrière le front du solvant. Cette

vitesse dépend d’une part des forces électrostatiques retenant le composant sur la plaque

stationnaire et, d’autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se déplacent

donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l’action de rétention de la

phase stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d’adsorption.

Généralement, en chromatographie sur couche mince, les substances de faible polarité

migrent plus rapidement que les composants polaires.

b. Révélation.

Lorsque les composants de l’échantillon analysé sont colorés, leur séparation est

facilement observable sur la plaque ; dans le cas contraire, on doit rendre les taches visibles

par un procédé de révélation. Les taches sont ensuite cerclées au crayon. Les méthodes

usuelles de révélation sont les suivantes : radiations UV, fluorescence, iode, atomisation. Si

un indicateur fluorescent est incorporé à l’adsorbant, la plaque entière devient fluorescente

lorsqu’elle est soumise à une radiation UV ; les composés y sont révélés sous forme de taches

sombres.

III.2.1. Conditions chromatographiques

Les extraits ont été analysés en utilisant une série 1100 HPLC (Agilent Co., Sunnyvale,

CA) muni d'un détecteur UV / Vis (UV à 230 nm). Un Phenomenex (Torrance, CA) Prodigy

ODS / 3, C18, 5mm, 4,6 mm Identifiant 250 mm analytique colonne a été utilisé, avec une

colonne Phenomenex garde Security Guard (4mm 2 mm, C18). Les extraits ont été

chromatographiés avec un pré-mélangé phase mobile composée de 75% acetonitrile/25%

1mM PO4 (pH 4,5) à température ambiante.

-37-

Chapitre III

Méthode

L'injection de 25 ml à un débit de 1 ml/min pendant 25 min.

III.2.2. Analyse qualitative

Résultats

La chromatographie sur couche mince de l’extrait a permis de séparer deux substances

qui sont apparues sous forme de tâches colorées après révélation, un spot en bas de la plaque

CCM situé à un niveau inferieur que celui de chlorpyrifos (témoin), et qui correspond à celui

d’un de l’extrait de concombre. Les 2 spots correspondent donc au chlopyrifos.

Figure 7 : Séparation par chromatographie sur couche mince du chlopyrifos Model : Phase mobile : acétonitrile/eau: 20/80V.

III.3. Dosage par HPLC

La Chromatographie Liquide Haute Performance permet de séparer et de doser différents

composés d’une solution qui absorbent dans l’UV. Pour des conditions opératoires précises,

chaque composé présente un pic avec un temps de rétention bien défini. La hauteur des pics

ou l’intégration de la surface de ces pics permet d’obtenir la concentration des produits.

III.3.1. Résultats de l’analyse par HPLC

La figure (8) montre le chromatogramme standard.

Le temps de rétention pour chlopyrifos est respectivement 10,81min.

-38-

Chapitre III

Figure 8 : Chromatogramme en HPLC du chlorpyrifos.

Résultats

Index

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

Total

Nom

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Chlorpyrifos

Temps [min]

2,38

2,68

3,20

3,30

3,39

4,21

4,89

5,73

8,29

9,24

10,81

Quantité [% Surface]

8,45

50,58

13,85

4,63

8,18

0,08

1,00

0,59

0,97

2,45

9,22

100,00

Hauteur [mAU]

0,4

4,5

1,0

0,8

0,7

0,0

0,1

0,1

0,1

0,1

0,4

8,1

Surface [mAU.min]

0,119

0,714

0,196

0,065

0,116

0,001

0,014

0,008

0,014

0,035

0,130

1,412

Surface [%]

8,447

50,580

13,853

4,628

8,184

0,084

0,998

0,591

0,966

2,448

9,221

100,000

Tableau 2 : Révélation du temps de rétention en HPLC du chlorpyrifos

Le Chromatogramme en HPLC du chlorpyrifos dans le poivre rouge L'identification du

composé de l’extrait des légumes et fruits se fait par comparaison de leurs temps de rétention

avec celui obtenu pour le même composé standard. Cette comparaison, nous a permis de

confirmer la présence du chlorpyrifos dans le poivre rouge, avec un temps de rétention 11,12

min, la figure 9 est illustrée ci après.

-39-

Chapitre III

Figure 9 : chromatogramme en HPLC du chlorpyrifos dans le poivre rouge

Quantité

Résultats

Index Nom Time [% Surface] Hauteur Surface

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

13

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

Inconnu N

[min] 2,61

2,83

3,19

3,41

3,65

3,92

4,12

4,45

4,71

4,92

5,04

7,62

9,05

21,70

16,14

14,34

9,33

9,54

1,56

1,75

6,67

5,54

4,39

7,58

1,20

0,21

[mAU] 265,8

265,3

215,8

169,0

212,5

59,4

56,9

82,4

74,2

99,5

57,6

4,9

1,6

[mAU.Min] 58,548

43,528

38,678

25,162

25,722

4,216

4,720

17,988

14,940

11,834

20,445

3,245

0,575

Surface [%]

21,705

16,137

14,339

9,328

9,535

1,563

1,750

6,669

5,539

4,387

7,580

1,203

0,213

14

Total

Chlorpyrifos 11,12 0,05

100,00

0,5

1565,4

0,143

269,746

0,053

100,000 Tableau 3 : Révélation du temps de rétention en HPLC du chlorpyrifos dans le poivre rouge

-40-

Chapitre III Résultats

Les temps de rétention du chlorpyrifos sont présentés dans les tableaux 2 et 3

respectivement. Ils sont déterminés sur les chromatogrammes donnés dans les figures 8 et 9

respectivement. Les temps de retentions du produit CPF identifié à partir de leur

chromatogramme est de 10,81 et 11,12 minutes.

La droite d'étalonnage exprime la variation de l'absorbance en fonction de la concentration

en Chlorpyrifos. Elle est représentée par la figure 10. Cette droite nous servira de base dans

l'analyse quantitative de nos résidus. Les droites d’étalonnage sont réalisées pour chacun des

composés avec des solutions étalons, les équations des droites (y=ax) ou hauteur en fonction

des concentrations permettent ensuite de remonter à des concentrations inconnues. La

corrélation est bonne avec R2 > 0,999 Les phases éluantes sont préparées avec de l'eau ultra

pure et de l’acétonitrile (qualité HPLC), elles sont filtrées et dégazées avant utilisation.

Chlorpyrifos 0,2

0,15

0,1

0,05

0

0

y = 0,1748 x R² = 0,999

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

Concentration en µg/ml Figure 10 : Droite d’étalonnage de chlorpyrifos

-41-

Chapitre III

Les résultats d’analyse des concentrations sont représentés sur le tableau 4.

Résultats

Tableau 4 : Résultats des concentrations en Chlorpyrifos dans les échantillons végétaux

Concentration µg/ml Echantillons

1 2

Poivre vert

Poivre rouge

Concombre

Courgettes

Pommes

Poires

Laitues

Tomates ND= Non Détectable

DL = 0.1 µg/ml

ND

0,5378 ± 0.043

ND

ND

0,9124 ± 0,057

ND

ND

ND

-42-

ND

0,5092 ± 0,041

0,8524 ± 0,065

-------

0,5187 ± 0,028

-------

-------

1,4817 ± 0,107

Chapitre III

III.4. Interprétation des résidus

Résultats

L’interprétation des résultats étant fonction de la connaissance des facteurs susceptibles de

modifier la réponse.

Pour examiner la quantité de résidus de pesticides dans les fruits et légumes un total

de 50 échantillons ; 4 fruits et 6 légumes différents ont été recueillis en 2011. Nos résultats

ont révélé les concentrations en résidus de chlorpyrifos dans les pommes qui nous

proviennent de la Nouvelle-Zélande, les tomates provenant du Mexique, poivre vert et rouge

cultivés au pays et le concombre comme suit : L’insecticide chlopyrifos est présent à raison de

0,5378 µg/ml dans poivre rouge, 1,4817 µg/ml dans les tomates, 0,9124 µg/ml dans les

pommes et 0,8524 µg/ml dans le concombre. Dans la courgette, poires et la laitue nous

n’avons pas trouvé de traces de résidus, le chlorpyrifos n’a pas été détecté dans ces

échantillons.

Les résultats d’analyses en résidus de pesticides dans nos échantillons de fruits et légumes

frais sont les suivants : Plus de 67% des échantillons étaient sans résidus détectables, (6,5 %)

des échantillons contenaient des résidus de pesticides inférieurs ou égaux à la LMR et (6,5%)

des échantillons nettement supérieur à la LMR. Les taux égaux ou inférieurs à la LMR ont été

trouvés le plus souvent dans les pommes, les tomates, suivis par les poivres rouges, les

poivres verts et le concombre. Au niveau des fruits les dépassements concernent

essentiellement les pommes nos résultats montrent que 61% des échantillons analysés en

Italie présentent des valeurs de résidus de pesticides qui sont largement supérieures à la limite

maximale de résidus.

III.4.1. Test de la DL50

Le test de la DL50 a été effectué sur des rats ayant reçu différentes doses 1/5, 1/10, 1/20

respectivement.

III.4 .2. Comportement des rats après traitement

Rats injecté à 9h 05min a tendance à boire juste après. Après 20 minutes on a remarqué

les signes cliniques suivants :

Rythme cardiaque accéléré; difficulté respiratoire, perte d’équilibre, agitation suivie d’une

diminution de la mobilité, poils piqués, paralysie des membres postérieurs puis des membres

-43-

Chapitre III

antérieurs, enfin une exophtalmie des yeux suivie de la mort après 40 min.

III.4.3. Observation du comportement et tableau clinique des animaux

Résultats

Les symptômes observés chez les rats mâles et femelles traités par une dose unique de 1/5

de la DL50 au chlopyrifos présentent les symptômes ci-après :

De fortes convulsions et agitation, accélération du rythme cardiaque et une difficulté

respiratoire. Une légère irritation de l'iris est observée. L’activité des animaux est réduite, leur

démarche devient lente jusqu’à ce qu’ils se couchent sur le ventre avec pattes postérieures

écartées et cyanosées, et enfin ils se rangent les uns à côté des autres. Au bout de la 40éme min.

La mort intervient de la 24éme à la 72

èmeheure. Au-delà du 4

ème jour, les rats ayant survécu,

redeviennent normaux avec disparition de tous signes.

L’étude biochimique comme paramètre de la fonction hépatique montre une

augmentation de l’activité d’enzyme sérique d’ALP, et une diminution de l’activité de LDH,

AST, ALT. Les enzymes transaminases sont considérées comme indicateurs de dommage des

tissus, les modifications dans les tissus hépatiques peuvent être expliquées par la diminution

des taux des paramètres l’ALT, AST. Cette diminution de l'activité enzymatique du foie a été

accompagnée par une diminution du glucose. D'autre part, les données montrent une

augmentation significative (P ≤ 0,05) des concentrations sériques de triglycérides, du

cholestérol, de la créatinine et de la bilirubine chez le rat traité avec une dose unique de

chlorpyrifos par rapport au témoin. Les animaux traités par le pesticide ont eu une

hypoglycémie légère. L’effet du CPF fut accompagné d'une diminution du gain de poids

corporel qui a conduit à une perte de poids corporel à la fin de l'expérience. III.4.4. Effets du chlorpyrifos chez les rats in vivo

a. Toxicité aigue

Les signes d’intoxication chez les rats étaient compatibles avec l’inhibition du

cholinestérase et inclus l'inactivité, la salivation accrue, une posture voûtée, paralysie flasque,

diarrhée, vomissements, exophtalmie, respiration laborieuse, tremblements, coloration

oculaire et larmoiement. L’activité de cholinestérase cérébrale était inhibée. Une Réduction

du poids corporel et de la consommation de nourriture a été observée chez les animaux.

-44-

Chapitre III

b. Poids corporel

Résultats

Le suivi de la variation de la masse corporelle des animaux au cours de l’expérience de

toxicité subaiguë a démontré qu’il y a une diminution significative du poids comparativement

aux témoins. 300

250

200

150

100

50

0

Série1

0 1 2 3 4 5 6 7

Figure 11 : Variation du poids corporel des rats traités dans les conditions de toxicité subaiguë avec la dose de 24mg/kg.

c. Le poids absolu des organes

L’examen des organes des rats révèle une augmentation du poids absolu du foie, du rein

des testicules comparativement aux témoins néanmoins on note une diminution du poids des

ovaires par rapport aux témoins.

d. Masse relative des différents organes

La variation de la masse relative des différents organes chez les rats témoins et traités

avec la dose 1/5de la DL50, montre une augmentation significative de la masse relative des

reins, poumons, foie. On a enregistré aussi une augmentation significative de la masse relative

des testicules. Cependant, une diminution significative au niveau des ovaires, cœur et cerveau

a été constatée.

e. Masse relative du foie : Augmentation de la masse relative du foie chez les femelles plus que chez les mâles

comparativement aux témoins.

-45-

Chapitre III

f. Masse relative du cerveau :

Résultats

Diminution significative de la masse relative du cerveau chez les rats traités


g. Masse relative des testicules :

Augmentation significative de la masse relative des testicules par rapport aux témoins.

h. Masse relative des ovaires :

Diminution significative de la masse relative des ovaires chez les rats traités


i. Masse relative reins :

Augmentation significative de la masse relative des reins par rapport aux témoins.

j. Masse relative poumons :

Augmentation significative de la masse relative des poumons par rapport aux témoins.

k. Masse relative de la rate :

Légère augmentation de la masse relative de la rate chez les femelles comparativement

aux témoins.

l. Masse relative du cœur :

Diminution significative de la masse relative du cœur chez les rats traités


Les paragraphes (e f g h i j k l) Correspondent aux figures ABCDEFGH ci après :

-46-

Chapitre III 1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

0.0 2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

A

Dose (mg/kg)

C

Dose (mg/kg)

E Dose (mg/kg)

-47-

2.0 1.5 1.0 0.5 0.0

15 10 5 0

1.5 1.0 0.5 0.0

B Dose (mg/k g)

D Dose (mg/kg)

F Dose (mg/k g)

Résultats

Chapitre III

0.20

0.15

0.10

0.05

0.00

G

Dose (mg/kg)

4

3

2

1

0

H

Dose (mg/k g)

Résultats

Figure 12 : Variations des valeurs de la masse relative des organes pour la dose1/5de la DL50 au cours du traitement aiguë avec le chlorpyrifos. Les valeurs sont les moyennes ± SEM. Selon le test d’ANOVA ; (P≤0.05). Groupes : A (masse relative de la rate), B (masse relative du foie), C (masse

relative des reins) D (masse relative du cœur), E (masse relative des poumons), F (masse relative du cerveau) G (masse relative des ovaires), (masse relative des testicules). La dose D0 : témoin ; D1 les

groupes traités avec la dose : 96 mg/kg de chlorpyrifos.

III.4.5. Effets sur les paramètres biochimiques Les études sériques effectuées sur les rats traités par chlorpyrifos montrent une

diminution significative des taux des paramètres suivants : Urée,des transaminases (ALAT,

ASAT) glycémie, AURI ALB/GLOB et HDL par rapport aux groupes témoins D0. Toutefois,

les résultats des rats traités présentent une élévation significative des taux des paramètres

suivants : ALB2, BILTS, cholestérol, créatine, triglycéride, LDL, Une augmentation

significative de l’activité phosphatase alcaline (ALP) et des taux (TP) total protéines a été

observée comparativement au groupe témoin D0.

On trouvera dans les figures et tableau 5 dessous les principales constantes biochimiques

ainsi que les résultats issus de la variabilité des constantes sanguines. -48-


Tableau 5 : Analyses biochimiques des rats après traitement aigue par le chlorpyrifos et avec les doses D0(0 mg/kg), D1(96 mg/kg). Les données sont exprimées par moyenne ± S.E.M. (P≤0.05).

Tests biochimiques

AURI mg/l

ALAT U/L

ALB2 g/L

ALB/GLOB g/L

ALP2L U/L

ASAT U/L

BILTS mg/l

CHOL g/l

CREJ2 mg/l

GLUC3 g/L

HDLC3 g/l

LDL-C g/l

TP2 g/L

TRIGL g/l

D0

16 ± 5,52

38,75 ± 14,11

48,8 ± 2,23

1,88 ± 0,19

103,86 ± 24,8

100,8 ± 25,84

0,58 ± 0,26

0,88 ± 0,11

7,4 ± 0,8

1,94 ± 0,38

0,61 ± 0,09

0,04 ± 0,01

75,44 ± 5,96

0,48 ± 0,14

D1

8,5 ± 3,33

30,92 ± 7,04

49,58 ± 7,99

1,66 ± 0,47

137,8 ± 45,48

91 ± 14,90

0,81 ± 0,28

0,90 ± 0,19

7,46 ± 1,69

1,92 ± 0,51

0,53 ± 0,12

0,05 ± 0,02

79,3 ± 13,93

0,82 ± 0,33

Figure 13 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration de l’acide urique et la créatine chez les rats Wistar.

-49-


Figure 14 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les paramètres biochimiques chez les rats Wistar. Figure 15 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur la phosphatase alcaline et l’albumine chez les rats

Wistar.

Figure 16 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur LDL chez les rats Wistar.

-50-


Figure 17 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les activités de protéines sériques totales, de l'aspartate aminotransférase (ASAT), la phosphatase alcaline (ALP) chez les rat Wistar.

III.5. Effets sur les paramètres hématologiques Un tube hématocrite est enfoncée dans l’angle postérieur ou antérieur de l’œil, perfore la

paroi du sinus caverneux; le sang monte par capillarité dans le tube ainsi le sang est récupéré

au moment de l’euthanasie des rats après 6 semaines de traitement par gavage au

chlorpyrifos. Les résultats hématologiques obtenus sont illustrés dans le tableau 6 et révèlent

les observations ci-après :

Une augmentation significative du volume globulaire moyen (MCV), hémoglobine,

(HGB) de la teneur corpusculaire en hémoglobine (MCH) et de la concentration globulaire

moyenne en hémoglobine (MCHC) est observée. On a enregistré aussi une diminution

significative des taux des globules rouges : RBC, des hématocrites : HCT, des plaquettes :

PLT, et des taux des globules blanc WBC (Wight Blood Cells). Cependant la concentration

du volume plaquettaire moyen (MPV) ne montre pas de différence significative par rapport

aux témoins. D'autre part, les résultats montrent une augmentation significative (P ≤ 0,05) des

concentrations sériques des triglycérides, du cholestérol, de la créatinine et de la bilirubine

chez les rats traités avec une dose unique de chlorpyrifos par rapport au témoin. -51-


Tableau 6 : Paramètres hématologiques des rats traités dans les conditions de la toxicité aiguë par chlorpyriphos et avec les doses D0 (0 mg/kg), D1 (96 mg/kg). Les données sont exprimées par

moyenne ± S.E.M. (P≤0.05)

Tests hématologiques

RBC (106/mm3)

MCV (3µm)

HCT (%)

PLT (103/mm)

MPV (3µm)

WBC (10 3/mm3)

HGB (g/dl)

MCH (p g)

MCHC (g/dl)

D0

8, 09 ± 0, 46

51, 48 ± 1, 47

41,64 ± 2,45

859, 4 ± 410, 96

7 ± 0, 23

7, 02 ± 1, 29

13,86 ± 0,93

17,14 ± 0, 93

33, 32 ± 1, 02

D1

7, 88 ± 1, 09

52, 58 ± 5, 47

40,91 ± 3,99

747, 05 ± 205, 52

7, 09 ± 0, 29

7, 6 ± 1, 56

14,02 ± 1,00

18, 21 ± 3, 21

34, 49 ± 1, 93

Figure 18 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les paramètres hématologiques chez le rat Wistar.

-52-


Figure 19 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les paramètres; hématocrites : HCT, MCV (volume globulaire moyen), MCHC (concentration globulaire moyenne en hémoglobine) chez le rat Wistar.

Figure 20 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les plaquettes PLT chez le rat Wistar.

IV. Toxicité subaiguë Dans les conditions de la toxicité subaiguë induite par le chlorpyrifos (CPF), les seuls

signes cliniques observés chez les rats traités, sont des diarrhées et une faiblesse (manque de

vivacité), On a noté une baisse du poids corporel des rats mâles traités au cours de la

cinquième semaine, cette diminution pourrait être expliquée par une réduction de la

consommation des aliments, mais aussi à une diminution de la quantité de nourriture

absorbée.

Les échantillons de sérum ont été évalués pour les concentrations de glucose, protéines

totales (TP), l'albumine, les électrolytes (Na +, K +, Cl ¯ ), l'urée, la créatine et les activités de

-53-


l'aspartate aminotransférase (AST), alanine aminotransférase (ALT), la phosphatase alcaline

(ALP).

L’effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration sérique des électrolytes est comme

suit :

Une légère diminution (p> 0,05) de la concentration en ions sodium Na + dans le groupe

traité comparativement au groupe témoin. Toutefois, la concentration en ions potassium K +

a légèrement augmenté dans le groupe traité comparativement au groupe témoin. Cependant,

une baisse de la concentration en ions Cl¯ a été observée dans le groupe traité par rapport au

groupe témoin. Figure 21 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration d'électrolytes sérique chez les rats

Wistar.

L’effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration sérique de glucose se manifeste par

une diminution significative (p

Chapitre III

L’effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration sérique des protéines :

Résultats

Aucun changement significatif (p> 0,05) sur la concentration sérique en protéine total n’a été

constaté chez les rats traité. Néanmoins une diminution significative (p> 0,05) de la

concentration sérique en albumine a été observée dans le groupe traité par rapport aux

témoins.

Figure 23 : Effet du chlorpyrifos (CPF) sur les protéines sériques totales, l'albumine chez les rat Wistar.

L’effet du chlorpyrifos (CPF) sur la concentration d'urée sérique :

Augmentation significative (p 0,05) de la concentration de créatinine sérique dans le groupe

traité par rapport au groupe témoin. -55-


Figure 25 : Effet de chlorpyrifos (CPF) sur la concentration de créatinine sérique chez les rats Wistar

Augmentation significative (p> 0,05) d’ALT dans le groupe traité par rapport aux

témoins.

Augmentation significative (p> 0,05) de l'activité ALP dans le groupe traité par rapport

aux témoins.

V. Histopathologie

Les procédés histologiques ont été réalisés selon Martoga et Martoga P.M. 1967.

� L’Histopathologie du foie:

L’observation des coupes histologiques du tissu hépatique des rats traités au chlopyrifos a

révélé que les principales différences résident au niveau d’une prolifération ductulaire des

canaux biliaires. On à trouvé jusqu’à 6 canicules biliaires autour de l’espace porte de Kiernan

qui témoigne de la toxicité aiguë. Un infiltrat inflammatoire autour de la veine

centrolobulaire, Figure (26.). Alors que dans le tissu hépatique des rats témoins on a observé

de 2 à 4 canaux biliaires autour de l’espace porte de Kiernan. -56-


Figure 26 : Coupe histologique du tissu hépatique des rats traités avec la dose D1 (96 mg/kg) par chlorpyrifos. Coloration éosine hématoxyline/Grossissement (X200).

Figure 27: Coupe histologique du tissu hépatique des rats témoins traités avec la dose D0 (0 mg/kg) Coloration éosine hématoxyline/Grossissement (X200).

-57-


L’examen histologique révèle aussi dans plusieurs coupes et dans plusieurs secteurs du

tissu hépatique des foyers inflammatoires et une stéatose (vacuole chargé de gras ; amas

graisseux) observés sur les coupes des rats traités avec la dose 96 mg/kg dans les conditions

de toxicité aigue comparativement aux témoins.

Figure 28: Coupe histologique du tissu hépatique des rats traités avec la dose D1 (96 mg/kg) Coloration éosine hématoxyline/Grossissement (X400).

� L’Histopathologie du rein

L’examen du tissu rénal a révélé la présence de vacuoles (vacuolisation), intra-

cytoplasmiques l’installation d’un œdème entre les travées hépatocytaires comparativement

aux groupes témoins qui n’ont montré aucune modification de la structure du tissu rénal

(Figure29).

Figure29 : Coupe histologique du tissu rénal : présence de vacuoles (vacuolisation), intra- cytoplasmiques. Coloration éosine hématoxyline/Grossissement (X630)

-58-


Figure 30: Coupe histologique du tissu rénal : Architecture normale, absence de vacuoles cytoplasmiques. Coloration éosine hématoxyline/Grossissement (X630)

Les OP sont parmi les pesticides synthétiques les plus largement utilisés. Cette utilisation

a stimulé des recherches sur les effets toxiques sur la reproduction (Joshi et al. 2007). Le

traitement par CPF modifie les fonctions testiculaires éventuellement par induction de stress

et l'inhibition de l'activité des enzymes, ce qui perturbe la reproduction.

Les résultats des interprétations des coupes histologiques des testicules de rats après

exposition aiguë par voie orale au chlorpyrifos des groupes traités et témoins sont présentés

dans les figures 31, 32,33 et 34 respectivement.

� L’Histopathologie des testicules: L’histologie a révélé une maturité normale des tubes séminifères avec une série complète

de spermatogénèse et une concentration élevée des spermatozoïdes dans la lumière (figure

31). Les figures 32 et 33 ont révélé une dégénérescence et une atrophie des tubules, les tubes

séminifères n’arrivent pas à maturité et très peu de spermatozoïdes dans la lumière des tubes.

-59-


Figure 31 : Testicule de rat du groupe témoin montrant la structure histologique normale : maturité des tubes séminifères avec série spermatogenèse. (X 400)

Figure 32 : Testicule de rat administré chlorpyrifos. La dégénérescence progressive et une atrophie due aux dysfonctionnements des tubes séminifères. (X 630).

-60-

Chapitre III

.

Résultats

Figure 33 : Testicule de rat administré au chlorpyrifos montrant un arrêt de la spermatogénèse terrain désertique (X 630).

Figure 34 : Testicule de rat administré chlorpyrifos montrant un fonctionnement normal maturité séminifères tubules (X 400).

-61-

Chapitre III

� L’Histologie du cerveau

Résultats

La neurotoxicité est définie comme un changement structural ou une altération

fonctionnelle du système nerveux, qui trouve son origine dans l’exposition à des agents

physiques, biologiques ou chimiques (Philbert et al. 2000). Les effets neurotoxiques

impliquent l’entrée de l’agent dans l’organisme. Chez les adultes, la neurotoxicité touche plus

facilement le système nerveux périphérique car le système nerveux central est protégé grâce à

une série d’agents chimiques par la barrière hématomeningée (Costa et al. 2004). Cependant,

certaines substances très petites ou lipophiles, telles que les OP sont susceptibles de passer

cette barrière et d’atteindre le système nerveux central (Costa et al. 2008).

La littérature souligne que le CPF produit une augmentation du niveau d’anxiété chez les

femelles uniquement. Par contre, le CPF diminue l’activité locomotrice spontanée des mâles

et non des femelles à partir de doses inferieures.

L’observation des coupes histologiques du cerveau des rats témoins a permis de constater

la conservation de l’architecture cellulaire; vaisseaux normaux et absence d’halo clair

autour des vaisseaux figures 35 et 36.

Figure 35: Coupe histologique du cerveau montrant la présence de vaisseaux normaux (X100)

-62-

Chapitre III Résultats Figure 36 : Coupe histologique du cerveau montrant des vaisseaux normaux et absence d’halo clair.

L’examen du cerveau des rats traités a révélé la présence d’œdèmes (figure 37, 38)

Figure 37 : Coupe histologique du cerveau montrant la présence d’halo clair périvasculaire (X200)

-63-


Dans la figure 38 présence d’ halo clair autour des vaisseaux halo péri-vasculaire.

Figure 38 : Coupe histologique du cerveau montrant la présence d’halo clair périvasculaire (X200).

Figure 39 : Coupe histologique du cerveau montrant la présence d’halo clair en Y (X400).

-64-

Chapitre III

� L’Histologie du cœur

Résultats

La coupe histologique du cœur du rat traité montrant la présence d’une congestion

vasculaire. Comparativement à celle d’un rat témoin qui présente une structure normale.

Figures 40 et 41 ci-après :

Figure 40: Coupe histologique du cœur d’un rat normal (X200)

Figure 41: Coupe histologique du cœur d’un rat traité montrant la présence d’une congestion vasculaire (X100)

-65-

CHAPITRE IV

DISCUSSION DES RÉSULTATS

Chapitre IV

DISCUSSION

Discussion des résultats

Avec l’utilisation massive des pesticides sont apparus des signes évidents de toxicité et

d’effets néfastes pour l’environnement et pour l’Homme (Eriksson et al. 1990; Eriksson et

al.1992; Snedeker, 2001; Den Hond et al. 2006; Schoeters et al. 2006; Bonde et al. 2008).

Pour faire face à ce problème, le parlement Européen a instauré le projet REACH

(Registration, evaluation and authorization of chemicals) dans lequel les industriels doivent et

devront faire la preuve scientifique de la non-toxicité de leurs substances en fonction de

normes officielles.

Beaucoup d’études ont pu mettre en évidence la présence permanente et préoccupante de

résidus et multi-résidus contaminant les denrées alimentaires. L’analyse de ces résidus est très

complexe à cause de leurs propriétés physico-chimiques telles que la solubilité dans l’eau par

exemple. Cette analyse est menée par des instituts de recherche, des universités, des

laboratoires privés et des agences gouvernementales. Elle permet non seulement la protection

des consommateurs et des plantes, mais aussi un contrôle rigoureux de la pollution de

l’environnement. Dans les pays développés, les laboratoires d’analyse des pesticides sont

facilement accessibles, mais leurs coûts ne cessent d’augmenter.

Les organochlorés et les biphényls polychlorés sont très stables, liposolubles, et peuvent

s’accumuler et persister longtemps dans le sol, les tissus végétaux et adipeux. Ils sont

neurotoxiques. Ainsi, vingt ans après sa restriction aux Etats-Unis, le dichloro diphényl

trichloroéthane (DDT) continue d’être détecté dans le lait maternel dans 19% des échantillons

à des concentrations allant jusqu’à 2 ppm. Le dieldrin (2% des échantillons ; 0,071 ppm) et le

lindane se retrouvent aussi dans le lait. Ce dernier a été utilisé comme substitut du DDT à

cause de sa rémanence inférieure, et ses résidus sont toujours trouvés en moindre quantité

(0,12 ppm) (Mattison et al. 1992 ; National Research Council, 1993).

Le dicofol, fortement hydrophobe, s’accumule dans les tissus adipeux des bovins nourris

par des purées de pommes contaminées (Archer, 1973). Des résidus de fenvalérate, ont été

aussi détectés dans les rations à base de fruits des vaches laitières ; cet acaricide étant souvent

pulvérisé sur pomme, la moitié de ses résidus est excrétée dans le lait (Spittler et al. 1982).

-66-

Chapitre IV Discussion des résultats

Des études ont mis en évidence que les bébés nourris au sein avaient accumulé des

quantités d’organochlorés (pesticides à base de chlore) dans leur organisme, dont du DDE et

de la dieldrine (deux pesticides persistants). Ces enfants développaient 10 à 15 fois plus

d’otites que les enfants du sud du Québec (Dewailly, E. et al. 2000).

Les pesticides se trouvent souvent à la surface des légumes et fruits. Une étude a montré

que le lavage couplé avec le frottement du végétal peut réduire plus significativement la

présence de résidus (Barooah et Yein, 1996). Etant donné que certains pesticides sont

lipophiles, ils peuvent pénétrer au cœur de la plante. Il est évident que le fait de laver et peler

les fruits et légumes ne signifie pas qu’on peut réduire, ni éliminer ces résidus définitivement.

En effet, une autre étude a pu montrer la présence de ces résidus même dans les concombres

traités et pelés (Sheikhorgan et al. 1994).

Afin d’éviter la contamination de ces denrées qui sont à l’origine d’intoxication chez

l’homme et les animaux, il est donc recommandé de respecter les délais d’emploi des

pesticides avant la récolte.

Pluygers et al. (1994). J.F.Viel, (1992) ont remarqué que les utilisateurs de pesticides sont

plus souvent atteints par certains cancers (estomac, prostate, vessie, cerveau, lèvres, LNH,

leucémies),

Keetles M.A et al. (1997) ont montré dans une région aux USA fortement contaminée par

des herbicides organochlorés et triazines, une augmentation significative du risque de cancer

du sein.

D’autres études montrent que les effets neurocognitifs des pesticides organophosphorés

sur les populations exposées professionnellement sont : troubles de la mémoire, anxiété,

irritabilité et dépression G.A.Jamal (1997).

Actuellement, la détermination du taux des résidus de pesticides dans les denrées

alimentaires peut être effectuée par HPLC (chromatographie liquide à haute performance).

Celle-ci a été appliquée dans les oranges. Il existe également une autre technique qui est

utilisée pour évaluer le taux des résidus : la chromatographie en phase gazeuse (CG). -67-


Notre travail consiste à étudier la toxicité des pesticides et plus particulièrement le

chlorpyrifos (CPF) au niveau des légumes et fruits. Cet insecticide organophosphoré, chloré

est l'un des insecticides les plus largement utilisés à l'échelle mondiale (Aly et al. 2010) et très

utilisé dans la région de Sétif au Nord Est de l’Algérie. Ce produit toxique produit des méfaits

chez l’homme, ainsi que chez les animaux comme les rongeurs.

La méthode par HPLC (chromatographie liquide à haute performance) est simple, robuste

et fiable, pour la détermination de Chlorpyrifos dans les denrées alimentaires Pour la plupart,

l'analyse du chlorpyrifos est généralement réalisée à l'aide de gaz chromatographie (GC) avec

détection photométrique de flamme ou de phosphore d'azote de détection Serrano et al.

(1997), Zeumer et al. (1987).

La méthode que nous avons adoptée est celle de Gaurdino et al. (2005) qui a utilisé la

chromatographie liquide à haute performance (HPLC) pour la détermination du chlorpyrifos

dans les oranges. Les denrées alimentaires que nous avons choisies sont très répandues, et

pour la plus part très consommées.

Pour examiner la quantité de résidus de pesticides dans les fruits et légumes un total de

50 échantillons ; 4 fruits et 6 légumes différents ont été recueillis en 2011. Nos résultats ont

révélé les concentrations en résidus de chlorpyrifos dans les pommes qui nous proviennent de

la Nouvelle-Zélande, les tomates provenant du Mexique, poivre vert et rouge cultivés au pays

et le concombre comme suit : L’insecticide chlopyrifos est présent à raison de 0,5378 µg/ml

dans poivre rouge, 1,4817 µg/ml dans les tomates, 0,9124 µg/ml dans les pommes et 0,8524

µg/ml dans le concombre. Courgettes, poires et laitues étaient sans résidus détectables.

Nos résultats ont montré qu’il y a absence de résidus dans plus de 67% des échantillons.

Par contre, certains échantillons (6,5 %) présentaient un taux des résidus de pesticides

inférieur ou égal à la LMR et dans d’autres (6,5%), ce taux est nettement supérieur à la LMR.

Les taux égaux ou inférieurs à la LMR ont été trouvés le plus souvent dans les pommes, les

poivres rouges, les poivres verts et le concombre. En ce qui concerne les pommes, nos

résultats montrent que 61% des échantillons analysés en Italie présentent des valeurs de

résidus de pesticides qui sont largement supérieures à la limite maximale de résidus.

-68-


Le chlorpyrifos persiste sur les pommes même après 14 jours du dernier traitement. Il est

aussi présent dans les compotes et les jus de fruits.

Par ailleurs, Fitzell et Peak (1992) reportent la diminution des résidus, après un délai avant

récolte de sept jours et suite à des applications adéquates. Aussi, des résidus de cyhéxatin sont

retrouvés dans les pommes à des teneurs ne dépassant pas 2 ppm, la limite maximale admise

pour ce résidu (Anderson et al. 1998) ; or cet acaricide est le plus sélectif et le plus utilisé

parmi sept autres tolérés pour la lutte contre les acariens sur pomme, (Welty et al. 1991.

Certains pesticides appliqués disparaissent à la cueillette, bien sûr avec respect du délai de

pulvérisation pré-récolte pour chacun, d’autre par contre persistent des semaines (Cabras et

Angioni, 2000).

Appliqué au champ, ce pesticide est faiblement dégradé durant l’entreposage réfrigéré et

présente dans ces conditions un temps de demi-vie de 122 jours pour les pommes

(Athanasopoulos et Pappas, 1999).

Dans le cas des poires, l’absence de résidus est un résultat que nous avons obtenu et qui a

été confirmé par Cabras et al.1995; Sala et al. 1996, qui ont constaté une diminution rapide

de ces résidus sur les poires durant les 7 jours qui suivent la récolte.

Par ailleurs, Le mancozèbe, fongicide de contact, est capable de pénétrer dans la pulpe de

pomme quelques millimètres sous la peau (Sharma et al. 2001). Des résidus d’azinphos-

méthyle, chlorpyrifos, esfenvalérate, méthomyl, fénarimol, myclobutanil, thiabendazole,

penconazole, bénomyl, et fenvalérate dépassaient les normes dans le fruit frais (Spittler et al.

1982 ; Arauz et al. 1990 ; Jones et Ehret, 1993 ; Zabik et al. 2000).

Pour la tomate nous avons enregistré des dépassements, les tomates sont issues de cultures

classiques (sans traitement post-récolte), sont contaminées par des pesticides et contiennent

des résidus de chlorpyrifos. Nos résultats concordent bien avec ceux trouvés par plusieurs

auteurs ; Edder et al. (2004) qui ont constaté plusieurs non conformités et Ortelli et al. (2005)

ont remarqué que des fruits issus de culture «sans traitement post-récolte» sont contaminés et

contiennent des résidus de chlorpyrifos dépassant leur LMR.

-69-


Une étude a montré que des résidus dépassent la limite maximale de résidus sur des

légumes et fruits tels que le poivre vert et le poivre rouge, même si on réalise les bonnes

pratiques culturales (Lipowska et al. 1998).

Enfin les doses résiduelles trouvées, en accord ou non avec les normes, créent un risque

certain pour le consommateur. Un contrôle permanent et régulier des résidus s’avère

indispensable, ainsi que des études de toxicité et génotoxicité de ces molécules chimiques très

stables faisant partie de notre alimentation quotidienne.

Des doses du chlopyrifos qui dépassent les normes au niveau des denrées alimentaires

peuvent devenir très néfastes pour la santé. Des travaux effectués sur les rats in vivo ont

montré que le chlopyrifos entraine des perturbations de la mémoire, des altérations au niveau

de l’activité, des modifications du niveau d’anxiété, ainsi que la dépression chez les animaux

comme les rongeurs. D’autre part, des troubles comportementaux ont été décrits à partir de

différentes périodes d’exposition, et à des doses sous le seuil de toxicité de ce produit.

Les résultats que nous avons obtenus ont pu mettre en évidence des effets toxiques. On a

constaté que l’administration du chlorpyrifos a entrainé des troubles comportementaux tels

que la salivation, la lacrymation, la dilatation pupillaire et les vomissements. Ce pesticide a

également entrainé des troubles cardiaques (rythme cardiaque accéléré) et respiratoires, ainsi

que des convulsions et coma menant parfois à la mort. Nos résultats concordent avec ceux

trouvés par Keifer et Mahurin (1997) et Lotti (1995).

Le traitement subaiguë au CPF (in vivo) des rats avec les doses 1/20 de la DL50 qui

correspond à 24mg / kg de poids pendant 42 jours, a permis de révéler qu’une dose de CPF

plus faible, produisait une augmentation du niveau d’anxiété plus importante que celle d’une

dose de 1/5 mg/kg de la DL50 chez la rats femelles. L’effet d’une dose unique de

chlorpyrifos administrée aux rats, a montré une diminution significative du poids. Cette perte

de poids corporel des rats est due à l’effet du CPF sur la production d'immunoglobulines. Nos

résultats concordent avec ceux obtenus par Rizk, G.A et al. (1990) et Seleim, Z.M.

(1988). Des résultats similaires ont été également trouvés par Gupta et al. (1992), Esia Amel

et Selium (1992) Baron D.N, (1984) et Kadota et al (1976). De plus, le CPF diminue l’activité

-70-


locomotrice spontanée (test d’actomètrie et vidéotracking) des rats mâles et non des femelles.

L’effet des doses diffère chez les mâles et femelles.

Les résultats de la masse relative du foie (chapitre résultats figure 12) ont montré une

augmentation significative (P ≤ 0,05) comparativement au groupe témoin. Le poids du foie

augmente considérablement après traitement au pesticide. D’après les résultats, le foie est

l’organe cible de l’effet du pesticide. Cette augmentation du poids du foie peut être attribuée à

l’augmentation des demandes accrues de détoxification des composés toxiques (Kadota et al.

1976). En outre, il désigne l'augmentation de la masse cellulaire ou de la densité cellulaire

(Abston P.A et al. 1976). Une autre littérature a indiqué que l'élargissement du foie peut être

lié au maintien de la capacité fonctionnelle du foie normale (Robinson, K.M. et al. 1978). Une

augmentation du poids du foie ainsi qu’une apparition d’une tumeur du foie ont été

observées chez les souris mâles. (Quest, J.A.et al. 1990 ; Chang, J.C.et al. 1991).

D’un autre côté, nous avons testé l’activité de ce produit toxique in vivo sur des rats. Le

dosage des paramètres sériques biochimiques, hématologiques et l’évaluation de l’état

anatomo-histo-pathologique nous a révélé que les taux anormaux des paramètres sanguins et

des transaminases sont liés à la nécrose des hépatocytes.

Nous avons constaté que l’administration du chlorpyrifos engendre chez les rats d’une

part, une diminution du taux d’hématocrites, du nombre de globules rouges, des globules

blancs ainsi que celui des plaquettes. Ce qui explique l’anémie hémolytique conséquente. Les

résultats hématologiques obtenus ont révélé également une augmentation significative de

l’hémoglobine, MCV, MCH et MCHC. Cependant la concentration de MPV ne montre pas

une différence significative. D’autre part, nos résultats ont pu montrer une diminution

significative du taux de l’urée,la glycémie, les transaminases (ALAT, ASAT), AURI

ALB/GLOB et HDL. Par contre, nous avons observé une augmentation significative du taux

des paramètres suivants : ALB2, BILTS, LDL, le cholestérol, la créatine, les triglycérides, les

protéines totales et le TP ainsi qu’une augmentation significative de l’activité phosphatase

alcaline (ALP).

L’effet du CPF sur certains paramètres sanguins et les transaminases étant considéré

comme indicateur de dommage des tissus, nos résultats ont montré une augmentation

-71-


significative (P ≤ 0,05) des concentrations sériques des triglycérides, du cholestérol, de la

créatinine et de la bilirubine du sérum chez les rats traités avec une dose unique de

chlorpyrifos par rapport au témoin. Nos résultats concordent avec ceux trouvés par Terada et

al. (1998). Un traitement prolongé de 6 semaines subaiguë des rats par CPF provoque des

modifications dans les tissus hépatiques peuvent être expliquées par la diminution des taux

des paramètres l’ALT, AST. Cette diminution de l'activité enzymatique du foie a été

accompagnée par une diminution du glucose.

D'autre part, les résultats prouvent que le même traitement provoque une légère

hypoglycémie. Nos résultats sont similaires à ceux trouvés par de nombreux auteurs qui

travaillent sur différents insecticides. Baron, D.N (1984). L’observation des coupes

histologiques du foie des rats traités a révélé une prolifération ductulaire des canaux biliaires.

Nous avons pu trouver jusqu’à 6 canicules biliaires autour de l’espace porte de Kiernan qui

témoigne de la toxicité aiguë. Un infiltrat inflammatoire autour de la veine centrolobulaire.

Dans plusieurs coupes et dans plusieurs secteurs du tissu hépatique, des foyers inflammatoires

et une stéatose. Le rein a révélé la présence de vacuoles (vacuolisation), intra-cytoplasmiques

et l’installation d’un œdème entre les travées hépatocytaires. L’examen du testicule a montré

une dégénérescence progressive et une atrophie due aux dysfonctionnements des tubes

séminifères.

Les figures 32 et 33(chapitre résultats montrent une dégénérescence et une atrophie des

tubules ce qui conduit à l’absence de maturité des tubes et une oligospermie. Ces résultats

sont compatibles avec ceux trouvés par Joshi et al. (2007) qui a conclu une dégénérescence

ainsi qu’une rupture du processus de spermatogenèse. Des résultats similaires ont été

enregistrés par Sujatha et al. (2001) et Luc Multigner et Alejandro Oliva (2001) qui ont

montré que l’exposition aux pesticides et à certains solvants est associée à des concentrations

en spermatozoïdes bien en dessous de la limite de la fertilité.

Nos résultats ont révélé que chez tous les groupes de rats traités par le chlorpyrifos, il y a

une diminution de l'activité de produits alcalins, de la phosphatase acide et de la lactate

déshydrogénase (LDH) ce qui a provoqué une perturbation de la spermatogénèse qui peut

souvent conduire à une infertilité. Nos résultats sont similaires à ceux trouvés par Sinha et

Al. (1997) qui a trouvé chez les rats traités par le chlorpyrifos, une inhibition de l'activité de

-72-


LDH au niveau des testicules. L’activité de ces enzymes est considérée comme un indicateur

du bon fonctionnement de la spermatogenèse (Johnson et al. 1970).

Yousef et al. (2001) ont également confirmé que l’activité de la lactate déshydrogénase

(HDL) est associée à la maturation de la couche germinale de l'épithélium des tubules

séminifères et au bon déroulement de la division méiotique. Une telle diminution de l’activité

de ces enzymes engendre également une augmentation de l’activité de l’enzyme (ALP).

-73-

CONCLUSION ET PÉRSPECTIVES

Conclusion et perspectives

CONCLUSION ET PERSPECTIVES

La présente étude a montré que l'exposition répétée de bas niveau pour le PCF a entraîné

la détérioration des paramètres biochimiques de rats illustrant des changements pathologiques

dans certains tissus tels que le rein, le foie, le cerveau, et les appareils génitaux.

Les pesticides forment un groupe important de substances chimiques qui peuvent

contaminer l’écosystème aboutissant à l’exposition. Douze millions d’enfants, rien qu’aux

Etats-Unis, souffrent de troubles de l’apprentissage, d’altérations neuro-développementales et

comportementales liées à une exposition environnementale à différents produits chimiques

dont certains insecticides.

Malgré les efforts déployés pour développer des méthodes alternatives, les pesticides sont

toujours le moyen de lutte prédominant et leurs résidus constituent une menace potentielle. Il

est donc impératif d’étudier la toxicité des pesticides car ils ont été très cités pour leur

cytotoxicité et génotoxicité dans les études toxicologiques.

Cette étude représente une contribution importante à l’évaluation correcte de l’ampleur du

risque sanitaire dû à l’exposition aux résidus de pesticides, particulièrement le chlorpyrifos.

Il est important de vérifier si la toxicité est due à la matière active elle-même ou à la

dégradation de celle-ci et confirmer ces résultats par l’une des analyses biochimiques

hématologiques.

Ce sujet suscite un grand intérêt actuellement et mérite de réaliser plus de recherches en

vue de mieux comprendre l’effet du chlorpyrifos sur la santé humaine. Il serait également

intéressant d’étudier les taux de ces résidus dans le temps et à long terme. Il serait aussi

indispensable de tester leur bioaccum

effet toxique des résidus des pesticides utilisés sur la flore de la région de … · 2013. 1....

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