d’une eau de végétation (margine)

REPUBLIQUE ALGERIENNE DEMOCRATIQUE ET POPULAIRE

MINISTERE DE L’ENSEGNEMENT SUPERIEUR ET DE LA

RECHERCHE SCIENTIFIQUE

Université Larbi Ben M’Hidi Oum El Bouaghi

Faculté des Sciences Exactes et des Sciences de la Nature et de la Vie

Département des Sciences de la Nature et de la vie

N ° de série….. N °d’ordre……

Mémoire

Présenté pour l’obtention du diplôme de

MASTER

Filière : BIOLOGIE

OPTION : MICROBIOLOGIE APPLIQUEE

Thème :

.

Présenté par

LAMRAOUI Imane KADDOUR Ilham

Devant le jury

Président : ZOUAINIA Sabrina M.C.B. Univ. Oum EL Bouaghi.

Rapporteurs : ARHAB Rabah Pr. Univ. Oum EL Bouaghi.

Examinateur : MEDJOUDJ Hacene M.C.B. Univ. Oum EL Bouaghi.

Année universitaire: 2017-2018.

Caractérisation microbiologique et biochimique

d’une eau de végétation (margine).

مثم نىره كمشكاج فها مصثاح انمصثاح ف زجاجح انسجاجح كأنها كىكة الأرضالله نىر انسماواخ و »

ىقد من شجرج مثاركح زتىنح لا شرقح ولا غرتح كاد زتها ضئ و نى نم تمسسو نار نىر عهى دري

24.35 سىره اننىر. عهم نهناش و الله تكم شءنىر هدي الله ننىره من شاء وضرب الله الأمثال »

« Dieu est la lumière des Cieux et de la Terre, et le symbole de sa lumière serait un foyer

où se trouverait une lampe qui elle-même serait nichée dans un récipient de cristal ayant

l'éclat d'un astre brillant qui tirerait sa luminosité d'un arbre béni, un olivier qui n'est

ni de l'Orient ni de l'Occident et dont l'huile jetterait sa clarté presque d'elle-même, sans

avoir été touchée par aucune étincelle, donnant ainsi lumière sur lumière. Dieu guide

vers sa lumière qui il veut et propose des paraboles aux hommes, car sa science n'a point

de limite. »

انعظم الله صدق

Dédicaces

Dédicaces

Avec l’aide de Dieu, j’ai pu réaliser ce modeste travail dédié aux :

Chers Parents ;

Mes sœurs ;

Mes nièces et neveux ;

Toute la famille lamraoui ;

Tous les amis ;

Pour leur présence dans tous les instants,

Pour le soutien qu’ils m’ont apporté.

Avec toute mon affection et ma reconnaissance

Imane

J’ai l’honneur de dédier ce modeste travail

A ALLAH : Le tout puissant, le miséricordieux créateur des terres et des

Cieux, merci de m’avoir accordé la santé et la force pour réaliser ce travail.

Au prophète Mohamed : paix et salut sur lui.

A ceux qui m’ont toujours encouragé et soutenu durant toutes mes années d’étude.

Merci pour votre amour et votre confiance totale

A vous très chère Mama et Papa.

A mes frères Mohammed, Youcef et ainsi

Mes sœurs Fatima, Khadija, Rahma

A tous mes proches et toute la famille Kaddour

A ma binôme Iman et sa famille.

A tous ce qui m’ont aidée de prés ou de loin dans la réalisation de ce travail

A tout mes amis (es) sans exception.

A la promotion de microbiologie appliquée 2017/2018

Remerciements

Remerciements

Ce travail a été réalisé au Laboratoire de Microbiologie et Applications, faculté des

sciences exacte et sciences de la nature et de la vie, département des sciences de la nature et

de la vie. Université Larbi ben M’hidi oum el bouaghi. Nombreux sont qui ont contribués

d’une façon ou d’une autre à l’aboutissement de ce travail. C’est là un geste tout naturel

que de remercier ces personnes :

Je tiens tout d’abord à exprimer ma profonde gratitude, et ma vive reconnaissance à Mr.

ARHAB RABAH. Professeur à l’université Larbi ben M’hidi oum el bouaghi, pour avoir

accepté d’être notre directeur de mémoire, pour ses conseils avisés, sa rigueur scientifique

et sa grande disponibilité.

Je remercie chaleureusement Mme. ZOUAINIA SABRINA. Maitre de conférence à

l’université Larbi ben M’hidi oum el bouaghi, pour avoir accepté de présider le jury.

Un grand merci à Mr. MEDJOUDJ HACENE. Maître de conférences à l’université Larbi

ben M’hidi oum el bouaghi, pour l’honneur qu’il nous fait en participant au jury de ce

mémoire.

A tous ceux qui, à un moment ou un autre, nous ont prodiguées des conseils scientifiques,

fourni une aide matérielle et technique, ou tout simplement humaine. MERCI

Dédicace Remerciements

Liste des tableaux Liste des figures

Liste des abréviations

Introduction…………………………………………....................................................1

I. La production oléicole………………………………………………………………3

II. Les systèmes d’extraction de l’huile d’olive…………………………………….....5

III.Les sous-produits de l’oléiculture…………………………………………..….… 6

III.1 les grignons……………………………………………………………...…..… ..7

III.2.Les margine…………………………………………………………………...….7

III.2.2.Définition……………………………..…………………………..………..….7

III.2.3.L’origine des margines………………………....………………….…….….....8

III.2.4. Les caractéristiques des margines………………………………………..……8

III.2.4.1. Caractéristiques physico-chimique …………………….……………….… 8

III.2.4.2.Les caractéristiques microbiologique de les margines……………….……..12

III.2.5. L’effet environnementaux des margines………………………………..……13

III.2.6. Valorisation des margines………………………………………………...…..14

Chapitre II: Matériel et méthodes

I. Caractérisation physicochimique des margines…………………………..………..15

I.1. Echantillonnage………………………………………………..…………............15

I.2. paramètres physico-chimique des margines………….…………………………15

I.3. Paramètres biochimiques…………………………….……………...…………...16

TABLE DES MATIERES

Introduction

Chapitre I : Synthèse bibliographique

I.4.Extraction des polyphénols totaux……………..……………………………..…..17

I.5.1.Dosage des composés phénoliques des margines……………...……….……….18

I.5.1. Dosage des polyphénols totaux………………………………………………...18

II Analyses microbiologiques des margines………………...………………………..18

II.1.Traitement préalable de la margines………………….……….………………...18

II.2. Dénombrement de la FTAM………………………..………………………......19

II.2.1. Préparation des dilutions…………...………………………………………….19

II.2.2. Ensemencement par étalement sur gélose nutritive………………..….….…...19

II.2.3. les souches purifiées à partir de la GN………………………………...….…...20

II.2.3.1. Bacillus…………………………………………………………...………..…20

II.2.3. Recherche et dénombrement coliformes totaux et fécaux ………………...…...23

II.2.4.Recherche et Dénombrement des streptocoques fécaux………………….…….23

II.2.5.Recherche des staphylocoque …………………………………………….……24

II.3. Recherche des levures …………………………………………………...………25

II.4. Recherche des moisissures ……………………………………….……………. .27

III. évaluation de l’activité antibactérienne des margines ………………...………….28

1. Caractérisation physico-chimique et biochimique des margines …………………30

2. Caractérisation microbiologique……………………………………………………32

2.1. Dénombrement des micro-organismes……………………………..……….……32

2.2. Identification des microorganismes ………………………….………..…….…..33

2.2.1 Les bactéries…………………………….…………….………………………..33

a-Bacillus………………………………………………………………….…….……33

b- Staphylococcus.........................................................................................................36

Chapitre III : Résultats et discussion

2.2.2. La levure………………………………………...………………………..…… 37

2.2.3. Les moisissures…………………………………………….…...…………..…..40

2.3. Evaluation de l’activités antimicrobiennes …………………………......….……43

Conclusion et perspectives…………………………………………………….………46

Références bibliographiques…………………………………………………………..47-59

annexe

Résume

Liste des tableaux

Liste des tableaux page

Tableau 1 : Caractéristiques physico-chimiques des margine

(Amirantes., 1996)

9

Tableau 2 : Caractéristiques biologique des margines (Amirantes.,

1999).

9

Tableau 3 : Composition des margines : Sonsoucy R, 1984, FAO 9

Tableau 4 : Phénols totaux, ortho-diphénol et monomères aromatiques

contenus dans les margines (Casa et al., 2003).

11

Le tableau 5 : les Caractéristiques physico-chimiques et biochimiques

des margines prélevées du système traditionnelle à 03 phase.

30

Tableau 6: Caractérisation microbiologique des margines étudiées 32

Tableau 7: identification morphologique de Bacillus 33

Tableau 8: Identification biochimique de Bacillus galerie classique. 34

Tableau 9: Résultats de la mise en évidence de quelques activités

enzymatiques de Bacillus

35

Tableau 10: les Tests d’identification des staphylocoques 36

Tableau 11: représente l’examen macroscopique et microscopique de la

levure.

38

Tableau 12: représente les résultats des caractéristiques physiologiques

étudie chez la levure.

39

Tableau 13 : Diamètre des zones d’inhibition en (mm) montrant

l’activité antibactérienne des composés phénolique vis-à-vis les souches

à isolement clinique.

43

Listes des figures

Listes des figures page

Figure 1. les principaux pays producteurs d’huile d’olive en 2001 [Source

http://www.internationaloliveoil.org/downloads/production1.PDF].

3

Figure 2. répartition des superficies d’oliviers par wilaya. (Statistiques agricoles.

superficies et production série A 2002. Edité en janvier 2003).

5

Figure 3. les processus d’extraction de l’huile d’olive. 6

Figure 4. situation géographique du lieu d’échantillonnage. 15

Figure 5. DBO mètre. 16

Figure 6. Réacteur-DCO. 16

Figure 7. Courbe étalon correspondant aux dosages des phénols totaux. 18

Figure 8. Aspergillus ochraceus (IM1), A) observation macroscopique ;B)

Observation microscopique.

40

Figure 9. Aspergillus fumigatus (IM2),A) observation microscopique ;B)

observation macroscopique.

41

Figure 10. Aspergillus niger (IM3), A) observation macroscopique ;B)

observation microscopique.

41

Figure 11. (l’isolat IM4) Penicillium sp, A) observation macroscopique ;B)


41

Figure 12. (IM5) Penicillium chrysogenum , A) observation macroscopique ;B)


43

Figure 13. L’activité antibactérienne des polyphénols sur la levure et les bactéries

isolées.

44

Figure 14. L’activité antibactérienne des polyphénols sur les bactéries tests 45

Liste des abréviations

CE : Conductivité électrique

COI : Conseil Oléicole International

DBO5 : Demande Biologique en Oxygène pendant 5 jours

DCO : Demande Chimique en Oxygène.

DO : Densité Optique

FTAM : Flore Totale Aérobie Mésophile.

GN :Gélose Nutritive

h : heure.

OGA : Oxytétracycline Glucose Agar

NTU : Unité de Turbidité Néphélométrique

RM : Rouge de Méthyle

TSI : Triple Sugar iron Agar .

UFC: Unité Formant une Colonie.

VP: Vogue-Proskauer

Introduction

1

L'origine de l'olivier se perd dans la nuit des temps; son histoire se confond avec

celle des civilisations qui ont vu le jour autour du bassin Méditerranéen (Rayan et

Robards, 1998).il est considéré parmi les plus vieux arbres cultivés dans le monde

(Liphschitz et al., 1991).

L’industrie oléicole est une activité économique importante, concentrée principalement

dans les pays méditerranéens qui tiennent environ 95% de la production mondiale, dont

1% pour l’Algérie en 2001.

L’industrie oléicole, en plus de sa production principale qui est l’huile (l’huile d’olive

vierge et l’huile de grignon), engendre la production de deux résidus : un liquide

(margine) et l’autre solide (grignon) (Nefzaoui A. 1991).les margines sont considérées

comme l’un des effluents les plus nocifs produits par les industries agro-alimentaires

(Cardinali et al., 2010) en raison de leur charge polluante et de leur toxicité pour

l'ensemble de l'écosystème (plantes, microorganismes et organismes aquatiques et

aériens) due à leur pH acide, et leur richesse en matière organique, en particulier en

polyphénols (El-Abbassi et al., 2012b ; Dermeche et al., 2013).de ce fait, le rejet de ces

effluents dans les rivières et les égouts sans aucun traitement préalable pose de sérieux

problèmes pour le système aquatique (Levis-Menzi et al., 1992 ; Francesco, 1993 ;

Bouranis et al., 1995 ; Cabrera et al., 1996 ; Sayadi et al., 2000).Ces considérations ont

conduit plusieurs chercheurs à l’échelle nationale et internationale à choisir la voie du

traitement et de la valorisation des margines pour limiter leur pollution (Gharsallah et al.,

1999 ; Garcia Garcia et al., 2000 ; Leger et al., 2000 ; Kissi et al., 2001 ; Garrido Hoyos

et al., 2002 ; Pozo et al., 2002 ; Fenice et al., 2003). Cependant, les procédés développés

jusqu’à présent restent très limités et leur coût très élevé (Hamdi, 1993a ; Hamdi, 1993c).

Toutefois, plusieurs microorganismes se développent sur les margines et les utilisent

comme source de carbone (Vasquez et al. 1970).Des analyses microbiologiques ont

montré que les levures et les champignons sont capables de s’y développer mieux que les

bactéries (Aissam et al., 2002). Les travaux effectués sur cet axe sont rares.

Afin d’exploiter cette voie de recherche, cette étude s’intéresse à plusieurs

objectifs et pour atteindre ces derniers, nous avons suivi la démarche suivante :

1. Nous avons effectué une caractérisation physico-chimique et microbiologique c'est-à-

dire l’isolement et la purification de la microflore des margines d’olive prélevés à partir

Introduction

2

de la région du Sahara plus exactement Ghardaïa

2. Identification morphologique et biochimique des souches isolées.

3. La mise en évidence de l’impact (activité antibactérienne) d’extrait des margines que

manifestent leur composés phénoliques sur les bactéries identifiées.

Enfin, dans la conclusion générale, nous tentons de mettre en avant les points importants

apportés par notre travail, ainsi que nos perspectives

Chapitre I Synthèse bibliographique

3

I. La production oléicole

I.1.La production oléicole dans le monde :

Le patrimoine oléicole mondial compte actuellement environ 750 millions d’oliviers

cultivés sur une superficie de 9,23 millions d’hectares. Les pays méditerranéens comptent

715 millions d’oliviers sur une superficie d’environ 8.16 millions d’hectares, soit 95 % du

patrimoine oléicole mondial. (El hajjouji, 2007 ; Fiorentino et al. 2003 ; Tsagariki et al

2007). La grande majorité des olives est donc destinée à la fabrication de l’huile d’olive,

dont la production et la consommation mondiale ont triplé a atteint un record passant de 3,1

millions de tonnes pour la campagne 2011-2012, selon les estimations du Conseil Oléicole

International (COI, 2012).

La production de l’huile d’olive se concentre principalement dans les pays du pourtour

méditerranéen : Espagne, Grèce, Italie, Turquie, Syrie, Tunisie et Maroc avec 94 % de la

production mondiale (Benyahia et zien, 2003).

Figure 1 : les principaux pays producteurs d’huile d’olive en

2001. [Source :

http://www.internationaloliveoil.org/downloads/production1.PDF]

L’Europe est un acteur important de ce marché avec l’Espagne, premier producteur

mondial, et la Grèce, premier pays consommateur. Face à la baisse de la production

européenne, due aux mauvaises conditions climatiques (sécheresse de l’été et douceur de

l’hiver), la Tunisie est devenue le premier exportateur mondial en

http://www.internationaloliveoil.org/downloads/production1.PDF


4

2015(COI, 2016). Paradoxalement à la production d’huile d’olive, ces pays rejettent des

eaux usées appelées margines qui posent actuellement un vrai problème environnemental

pour toute la région méditerranéenne (Zimbalatti, 1995 ; Levis-Menzi et al. 1995). En effet,

plus de 30 106 m3 de margines sont produits annuellement dans le bassin méditerranéen par

rapport au volume mondial inférieur à 40 millions de m3/an (Fiestas Ros de Ursinos, 1981 ;

Sayadi et Ellouz, 1995 ; Borja et al. 1995a).

On estime que 10 à 30 millions de m3 de margines sont générés chaque année à partir de la

production d’huile d’olive (Niaounakis, 2006). Sachant qu’en moyenne 100 kg d’olives

traitées engendrent 100 litres de margines, la production mondiale de margine serait de 8,4

millions de mètres cubes (Boucherba, 2014).

I.2.La production oléicole dans l’Algérie

L’oliveraie occupe 45% du verger arboricole total et compte 32 millions d’arbres

dont 80% sont destinés à la production d’huile d’olive (Mendil, 2009), estimée à 55.000-

70.000 tonnes/an (Vossen, 2013).L’Algérie fait partie des principaux pays méditerranéens

dont le climat est des plus propices à la culture de l’olivier. Elle se positionne après

l’Espagne, l’Italie, la Grèce et la Tunisie qui sont par ordre d’importance, les plus gros

producteurs d’huile d’olive (Tsagariki E., Harris N., Lazarides., Konstantinos B. P. 2007).

Le patrimoine oléicole algérien est estimé à 32 millions d’oliviers, ce qui représente 4,26%

du patrimoine mondial. La production annuelle en huile a atteint 35.000 tonnes et celle de

l’olive de table 80.000 tonnes (Bensemmane A. 2009).

Selon les statistiques de l'Institut Technique des Arbres Fruitiers et de la Vigne

Algérien (ITAFV, non daté), l'oléiculture Algérienne a enregistré, entre 1999 et 2014, une

croissance de 130% en termes de superficie passant de 165.000 hectares à 380.000 ha, tandis

que la production d'huile d’olive est passée de 19.000 tonnes à 45.000 tonnes, avec des pics

atteignant 74.000 tonnes. L'entrée en production des nouvelles plantations (215.000 ha)

devrait hisser la production à 120.000 tonnes d'huile à l'horizon 2020.

La production d'huile d’olives est une activité traditionnelle en Algérie. L'activité

compte près de 1650 huileries, dont seulement 165 huileries modernes (Vossen, 2013).

L’Algérie vise à moderniser le secteur de l’huile d’olive afin d’améliorer la qualité et la

quantité du produit.Actuellement cette filière se concentre dans certaines willayas comme

Bejaia, Tizi –Ouzou et Bouira qui ont produit, à elle seules en 2008, 179180 hectolitres sur

une superficie de 102893 ha soit 51% de la production nationale et environ 44% de verger

national oléicole.ces trois willayas sont spécialiser beaucoup plus dans la production de


5

l’huile.Durant la campagne 2009/2010, la production oléicole algérienne était de 50000

tonne d’huile soit 1,7% de la production mondiale. (Conseil oléicole international. 2009a).

Figure 2 : Répartition des superficies d’oliviers par wilaya (Statistiques agricoles, 2003).

II. Les systèmes d’extraction de l’huile d’olive

Trois systèmes d’extraction sont à présent utilisés (fig. 3) : procédés discontinus ou

systèmes à presses et procédés continus ou systèmes à centrifugation. Ce dernier se déroule

soit selon un procédé continu à trois phases ou en un procédé continu à deux phases (procédé

écologique). (Morillo et al., 2009).

II.1. Système d’extraction par centrifugation à trois phases

Il s'agit d'un système de type mouture/centrifugation à trois phases. Le broyage est

réalisé par des broyeurs mécaniques à marteaux, couteaux ou disques. Ces broyeurs, placés

sur un axe entraîné par un moteur électrique à une vitesse de 1000 à 3000 tours par minute,

fonctionnent en continu et la pâte est alors obtenue instantanément. Les broyeurs métalliques

ont tendance à augmenter l’émulsion entre l’huile et l’eau, par conséquent le temps de

malaxage et/ou le nombre de bacs de malaxage sont plus importants que pour les systèmes à

meule de granit. Le malaxage se fait par rotation lente d’une vis sans fin qui va retourner

continuellement la pâte. Le temps de malaxage varie en général entre 15 et 30 minutes. Les

systèmes métalliques sont particulièrement adaptés pour des systèmes de production en

continu. Dans ce cas, le moulinier n’a jamais à manipuler directement la pâte d’olive car

celle-ci est convoyée automatiquement d’un appareil à un autre. Une fois la pâte d’olive est

homogénéisée et la coalescence est effectuée, l’étape suivante consiste en la séparation de la

phase solide et de la phase liquide. La pâte est donc injectée par une pompe dans une

centrifugeuse dont l'axe est horizontal appelée décanteur. Il permet la séparation de la pâte en

trois phases : les grignons, l’huile avec un peu d’eau et les margines avec un peu d’huile.

Les deux phases liquides n’étant pas bien séparées, elles sont regroupées et envoyées dans une


6

centrifugeuse verticale. A la sortie de la centrifugeuse, on retrouve d’un côté des grignons très

humides et de l’autre une émulsion huile/eau et le principal inconvénient de ce type de

système est qu’il requiert un grand ajout d’eau pour fonctionner. L’eau ajoutée va se mélanger

aux margines et donc grandement augmenter le volume de coproduits à éliminer. Le volume

d'eaux résiduaires est 2 à 3 fois supérieur à celui produit par le système en discontinu, les

margines sont, par conséquent moins concentrées (Aggoun, 2016). Dans ce système la

quantité d’eau ajoutée est supérieure à celle du système traditionnel, par conséquence La

production des margines est très importante (une tonne d’olives génère de 600 à 1200 litres de

margines) (CAR/PP, 2000 ; Martinez-Garcia et al., 2006 ; Ben Rouina, 2014)

Figure 3 : les processus d’extraction de l’huile d’olive. ( Morillo et al., 2009)

III. Les sous-produits de l’oléiculture

Ces dernières années, le développement de l’activité agro-industrielle a engendré une large

production de déchets qui sont notamment issus de la transformation des matières première de


7

l’agriculture. Comme toutes les industries agro-alimentaire, l’opération d’extraction nécessite

des grandes quantités d’eau, par conséquent elle engendre des quantités importantes de

déchets solides (grignons d’olive) et liquide (des margines) estimes a environ 3 millions de

m3 /an (zenjari et al., 2006).

III.1. Les grignons

C’est un sous-produit du processus d’extraction de l’huile d’olive, issus de la première

pression ou centrifugation (Nefzaoui, 1987). C’est un résidu solide composé des peaux, des

résidus de la pulpe et des fragments des noyaux. Il est composé par une fraction riche en

lignine provenant des fragments de noyaux, et l’autre renfermant principalement des glucides,

comme la cellulose et l’hémicellulose et, dans une moindre mesure, des protéines et de l’huile

résiduelle qui dépend de la technique d’extraction (Nefzaoui, 1984). Selon Sansoucy (1984),

les grignons se divisent en trois types, selon le procède d’extraction subit :

III.1.1. Le grignon brut

C’est le résidu de l’extraction de l’huile d’olive entière. Ses teneurs relativement élèves en eau

et en l’huile favorisent son altération rapides lorsqu’il est laissé à l’air libre (Nefzaoui, 1987).

III.1.2. Le grignon épuisé

C’est le résidu obtenus après déshuilage du grignon brut par solvant, l’hexane généralement

(Nefzaoui, 1987).

III.1.3. Le grignon partiellement dénoyauté

Il résulte de la séparation partielle des débris de noyau de la pulpe par tamisage ou

ventilation. Il dit "gras" si son l’huile n’est pas extraite par solvant et "dégraisses" ou

"épuises" si son l’huile est extraite par solvant.

III.2. Les margines

III.2.1. Définition

Les déchets liquides dénommés "margines" (aqua reflue en Italie, alpechin en Espagne,

katsigaros en Grèce, zebar dans les pays arabe) (Kapellakis et al., 2008) obtenus lors de

l’extraction de l’huile d’olive, constituent un important facteur de pollution du fait qu’ils

renferment une fraction organique

importante (des protéines, lipides, glucides et polyphénols) et aussi par leur acidité

moyennement élevée et leur concentration élevée de matière solide totale (Camurati et al.,

1984). Elles se présentent comme un liquide résiduel aqueux, de couleur brune rougeâtre à


8

noir due de la présence de polyphénols (Aissam, 2003) et est fonction de l’état de dégradation

des composés phénoliques et des olives dont ils dérivent (Hamdi et Ellouz, 1993 ; Zahari et al,

2014), nauséabond, d’aspect trouble et une odeur spécifique d’huile d’olive (Ranalli et al.,

1991). Son goût est amer.

La qualité et la quantité des margines dépendent de l’opération d’extraction d’huile d’olive,

elles sont aussi influencées par la variété d’olive, la saison de cueillette, le taux de maturation

des fruits et les conditions climatiques (Fiorentino et al., 2003).

III.2.3. L’origine des margines

Les olives contiennent environ 20% d’huile, 30% de grignons et 50% d’eau de

végétation (Di-Giovacchino et al., 1988 ; Hamdi et al., 1992). Les margines sont obtenues lors

de l’extraction de l’huile d’olive à partir de l’eau contenue dans le fruit et de l’eau ajoutée au

cours du broyage et des étapes de trituration (Galanakis et al., 2010). Les différentes

techniques d’extraction d’huile d’olive aboutissent à la formation des margines en quantités

variables, allant de 400 à 500 L/tonne d’olives pour les unités traditionnelles et une tonne de

margines /tonne d’olives pour les unités modernes (Achak et al., 2009).

III.2.4. Caractéristiques des margines

III.2.4.1. Caractéristiques physico-chimique

Les margines présentent une composition chimique très complexe et hétérogène. Elles

contiennent une variété de composés organiques et minéraux, de nature et de concentration

très différentes. Cette variation est due essentiellement aux procédés d’extraction d’huile

d’olive qui représente l’élément le plus important, au stade de la maturité des olives, à la

variété de l’olivier, aux conditions climatiques, à la durée de stockage des olives avant la

trituration, au système de culture, à la situation géographique, au temps de stockage des olives

avant la trituration, à la nature de conservation des olives et aux techniques et lieu de stockage

(Karapinar et Worgan, 1983 ; Bambalov et al., 1989 ; Annaki et al.1996b).

Les margines sont caractérisées par un pH compris entre 4,2 et 5,9 (Eroglu et al., 2008) et une

salinité élevée exprimée en conductivité électrique (18 à 50 mS/cm) (Levi-Minzi et al., 1992)

due surtout aux ions potassium, chlorure, calcium et magnésium.


9

Tableau 1 : Caractéristiques physico-chimiques des margine (Amirantes., 1996)

Caractéristiques biologiques

Il existe plusieurs paramètres biologique intervenir dans la caractérisation des

margines tel que la demande chimique en oxygène et la demande biologique en oxygène.

Tableau 2 : Caractéristiques biologique des margines (Amirantes., 1999).

Composition des margines

Les analyses menées sur les margines peuvent nous renseigner sur les intervalles de variation

de leurs différents composants chimiques (Fiestas Ros de Ursinos et Borja, 1992 ; Lutwin et

al., 1996).

Tableau 3 : Composition des margines : Sonsoucy R, 1984, FAO.

Les glucides sont essentiellement représentés par les composants pariétaux, en particulier la

cellulose et les pectines, ces dernières jouent un rôle important dans la texture des olives où ils

Paramètres Valeurs

pH 4,2 à 5,9

Turbidité (NTU) 140

Couleur coloration brun-rougeâtre

Conductivité 18 et 50 ms.cm-1

Température ambiante

Paramètres Valeurs

DCO

100 à 220 kg/m

DBO5

100 kg/m

Polyphénols 1,2 g/l

Composant Teneur en %

Eau 83-88%

Matières organiques 10-15 %

Matières minérales 1.5-2%

Matières azotées totales 1,25-2,4%

Matières grasses 0,08-1%

poly phénols 1-1,5%


10

représentent environ 0,6 % du poids de la pulpe fraîche (Obied. H et al. ,2005). Les sucres

représentent entre 4,1 et 4,8 % du poids total des margines pouvant se répartir comme suit :

arabinose (62-71%), galactose (17-25%), rhamnose (2-3%), xylose (12%), glucose (1%)

(Dermeche et al. 2013)

Les composés azotés

La fraction azotée est représentée principalement par les protéines avec une

concentration variant entre 1,2 et 2,4% (p/v). Tous les acides aminés contenus dans les

margines ont été identifiés. Les plus abondants sont l’acide aspartique, l’acide glutamique, la

proline et la glycine (Salvemini, 1985 ; Ranalli, 1991 ; Capasso et al, 2002 ; Jail et al, 2010).

Les vitamines

Plusieurs vitamines ont été identifiées .Les plus fréquentes sont les vitamines du groupe

et la vitamine PP avec une concentration de124 mg.kg-1 de teneur qui peut être exploitée a

l’échelle industrielle (Salvemini, 1985).

Les acides organiques

La proportion des acides organiques présente dans les margines varie entre 0,5 et 1,5%

(p/v). Les principaux acides organiques rencontrés sont les acides fumarique, glycérique,

lactique, malique et malonique (Fiestas Ros De Ursinos, 1981 ; Salvemini, 1985 ; Tsioulpas et

al, 2002).

L’huile

La concentration d’huile résiduelle contenue dans les margines est très variable selon le

procédé d’extraction utilisé. Elle varie entre 0,02 et 1% (v/v) (Fiestas Ros De Ursinos et

Borja, 1992). L’acide oléique est l’acide gras le plus abondant avec un pourcentage de 65%

par rapport à la totalité d’huile (Ranalli, 1991a).

Les composés phénoliques

Les composés phénoliques des margines sont très divers et leur structure est très

variable. Plus de 50 différents composés phénoliques ont été identifiés dans les margines

(Obied et al., 2005 ; Dermeche et al., 2013). Ils proviennent de l’hydrolyse enzymatique des

glucides et des esters de la pulpe d’olive au cours du processus d’extraction. Leur

solubilisation dans l’huile est cependant bien inférieure à celle dans les eaux de végétation, ce


11

qui explique leur concentration élevée détectée dans les margines. Les caractéristiques

organoleptiques de l’huile d’olive vierge dépendent de la présence des composés phénoliques

et des substances volatiles (Vazequez, 1978).

La teneur en composés phénoliques dans les margines varie entre 3 et 5 g.l-1

(Balice et al.,

1997 ; Al-Malah et al., 2000 ; Oukili et al., 2001 ; Garrido Hoyos et al., 2002 ; Tsioulpaet al.,

2002 ; Casa et al., 2003 ; Fenice et al., 2003) et elle peut même dépasser les 9 g.l-1

(Klibanov

et al., 1983 ; Borja et al., 1992 ; Sayadi et Ellouz, 1993 ; Kissi et al., 2001 ; Aissam et al.,

2002).

Les monomères phénoliques

Les acides phénoliques sont les monomères les plus abondants dans les margines, ce

qui explique leur acidité. Plusieurs acides phénoliques ont été identifiés dans différents types

de margines. BORJA et al. (1995) ont identifiés par (HPLC ou CPG). Ils sont représentés

essentiellement par des alcools et des acides phénoliques. Ils sont représentés essentiellement

par des alcools et des acides phénoliques.

Tableau 4 : Phénols totaux, ortho-diphénol et monomères aromatiques contenus dans les

margines (Casa et al., 2003).

Composés phénoliques Teneur

Phénols totaux (g.l-1) 3,7 0± 0,1

Ortho-diphénol (g.l-1) 1,20 ± 0,02

Acide 3 ,4-dihydroxybenzoique (mM) 0,35 ± 0,01

Catéchol (mM) 2,28 ± 0,1

Acide 4-hydroxybenzoique (mM) 0,12 ± 0,004

Tyrosol (mM) 2,47 ± 0,07

Acide syringique (mM) 0,196 ± 0,04

Acide caféique (mM) 1,53 ± 0,1

4-Methylcatechol (mM) 4,12 ± 0,3

Acide 3-hydroxyphénylpropionique (mM) 0,06

Acide para-coumarique (mM) 0,19

Acide vératrique (mM) 0,227 ± 0,21

Acide 3,4,5-trimethoxybenzoique (mM) 0,03

Acide trans-cinnamique (mM) 0,33 ± 0,08


12

Les polymères phénoliques

Les polyphénols identifiés dans les margines sont essentiellement :

Les anthocyanes (Tanchev et al., 1980).

Les tannins : leur structure est très complexe, leur concentration peut atteindre 12 g.l-1

(Balice et al., 1982) . Ils sont classés conventionnellement en tanins hydrolysables et

tanins Condensés (Monties, 1980).

Les tannins hydrolysables renferment trois groupes :

Esters d’acides phénoliques,

Esters d’acides phénoliques et sucres,

Glucosides

Les tanins condensés, appelés aussi flavotanins.

Autres composés phénoliques

D’autres composes phénoliques monomères ont été identifiés Capasso R. (1997) :

l’oleuropéine, L-caféyl-glucose, l’apégine et la lutéoline

III.2.4.2. Caractéristiques microbiologique des margines

Les études microbiologiques effectuées sur plusieurs échantillons de margines ont

confirmé l’absence totale de micro-organismes pathogènes. Donc, ces effluents ne posent

aucun problème hygiénico-sanitaire (Ranalli, 1991a). Toutefois plusieurs microorganismes

arrivent à se développer, ce sont essentiellement des levures et des moisissures sur les

margines et les utilisent comme source de carbone (Vazquez et al. 1970). Ces

microorganismes supportent la salinité élevée et le pH acide caractéristiques de ces effluents,

et résistent plus que les bactéries aux substances phénoliques.

Le pouvoir antimicrobien des margines est lié essentiellement à l'action exercée par les

phénols monomériques et les pigments bruns catéchol-mélaninique (Hamdi et Ellouz,

1993). Ces effluents agissent sur les bactéries en dénaturant les protéines cellulaires et en

altérant les membranes (Ranalli, 1991). 130 espèces de microorganismes lipolytiques (56

champignons, 22 levures et 52 bactéries) ont été rapportées dans les margines

les champignons

La flore fongique se compose essentiellement d’Aspergillus flavius, Aspergillus

candidus, Penicillium negricans, et Alternaria sp possèdent la capacité de dégrader les

phénols à faible concentration.

les bactérie

La flore bactérienne regroupe les bactéries qui résistent aux polyphénols particulièrement les

bactéries à Gram-négatif. Le genre Pseudomonas sp. ainsi que Bacillus megaterium ont été


13

décrits. Les espèces de ce genre sont dotées d’une grande activité métabolique (protéolyse,

lipolyse et dégradation des substances carbonées) (Thierru, 1997).

les levures

Parmi les levures, on trouve Trichosporium cutaneium, Cryptococcus albidius ainsi

que les genres Rhodotorula sp., Candida sp. et Saccharomyces sp. (Ramos-Cormenzana, 1986

; Gharsallah, 1993 ; Aissam et al., 2002 ; Fadil et al., 2003).

III.2.5. L’effet environnementaux des margines

III.2.5.1. Pollution des sols

L’épandage directe des margines sur le sol est l’origine de nuisances diverses, leur pH

acide, leur salinité élevée ainsi que leur abondance en composés phénoliques provoquent la

destruction de la microflore du sol et induisent des effets toxique aux cultures végétales.

(Fiestas, 1981). Ceci entraine la stérilisation du sol et le déséquilibre de la symbiose entre la

microflore du sol et les plantes (Marisot et Tournier, 1986). Les composés phénoliques

peuvent agir en tant que composants phytotoxiques, inhibant la croissance ainsi que la

germination des plantes et la croissance végétative (Morillo et al., 2009).

III.2.5.2.Pollution d’air et du paysage

La décharge des margines dans les bassins d’évaporation à ciel ouvert, sur les terres ou

dans les eaux naturelles génère des processus de fermentation et l’émission de plusieurs gaz,

notamment le méthane, le dioxyde de carbone et le sulfure d’hydrogène (Niaounakis et

Halvadakis, 2004). Ces derniers conduits aux dégagements d'odeurs désagréables qui

possèdent un effet négatif sur les activités économiques en zones touristiques et

archéologiques.

III.2.5.3.Pollution de l'eau

Les margines sont rejetées le plus souvent dans des récepteurs naturels, des cours d’eau,

sans aucun contrôle préalable et nuisent fortement à la qualité de ces eaux de surfaces; la très

forte charge en matières organiques empêche ces eaux de s'auto-épurer et la pollution peut

s'étendre sur de très longues distances (Mébirouk et al., 2002). Le contenu organique des

margines contribue à la consommation de l’oxygène dissous des fleuves (CAR/PP, 2000) et

empêche l’autoépuration des eaux, et la pollution peut s’étendre sur très longues distances


14

(Benyahia & Zein, 2003),

III.2.6.Valorisation des margines

Jusqu’à maintenant, le traitement des margines constitue un problème complexe vue la

qualité et la quantité des substances chimiques qu’elles renferment. Donc, l’application d’un

traitement simple s’avère insuffisant (Ranalli, 1991a ; Hamdi, 1993a). Toutefois, les procédés

de traitement envisageables pour l’élimination de la charge polluante des margines peuvent

être classés selon quatre catégories, et peuvent être utilisés seuls ou combinés : procédés

thermique, procédés physique, procédés chimique et procédés biologiques. Le choix du

système de traitement approprié est lié à plusieurs facteurs locaux, à savoir le système utilise

pour l’extraction d’huile, la possibilité de stockage et le rapport entre la charge produite par

les huileries et la population locale (Francesco, 1993).

Chapitre II Matériels et méthodes

15

I. Caractérisation physicochimique des margines

I.1. Echantillonnage

Les margines utilisées sont de la variété Sigoise proviennent d’une unité industrielle

moderne de trituration d’olives par centrifugation à trois phases, située dans la région de

Ghardaïa au sud de l’Algérie, pendant la compagne oléicole 2017/2018. Les échantillons ont

été prélevés le mois de décembre 2017 à partir du bassin de stockage des margines et

transportés dans des flacons stériles de 2 litres, puis ont été conservés à l’abri de la lumière à

4°C pour une utilisation ultérieure (caractérisation physicochimique et microbiologique).

Fig 4 : situation géographique du lieu d’échantillonnage (www.google.dz).

I.2. paramètres physico-chimique des margines.

I.2.1. Détermination du pH

Le pH est déterminé par un pH-mètre à affichage électronique à partir de 100 ml des

margines.

I.2.2. Determination de la conductivité

La conductivité électrique a été mesurée par un conductimètre Les résultats sont

exprimés en mS/cm à 20°C.

I.2.3. La turbidité

Elle est mesurée à l’aide d’un multi-paramètre de marque HACK-lange modèle

sensionTM+MM150 est exprimée en g/l.

I.2.4. La demande biologique en oxygène (DBO)


16

La demande biochimique en oxygène (DBO) est mesurée par la consommation

d'oxygène à 20°C à l'obscurité pendant 5 jours d'incubation d'un échantillon

préalablement ensemencé, temps nécessaire à l'oxydation biologique des matières

organiques carbonées (Allouchef et al., 1999 ; Tekfi, 2006 ; BOTTA, 2001).

La mesure de la DBO5 de notre échantillons a été faite par une méthode respirométrique

(Rodier et al., 2009) à l’aide d’un DBO-mètre (DBO Sensor 6,VELP Scientifica). Les

résultats sont exprimés en mg d’O2/l.

I.2.5. Détermination de la demande chimique en oxygène (DCO)

La DCO est la mesure de la quantité d’oxygène nécessaire pour la dégradation

chimique de toute la matière organique biodégradable ou non contenue dans une eau. Elle a

été effectuée par la méthode à petite échelle en tubes fermé (Rodier et al., 2009 ; Metahri,

2012). A 2 ml d'échantillon en tube sont ajouté le réactif DCO chauffé deux heures à 150 °C.

La lecture de la DCO est faite directement avec spectrophotomètre DR 930. Elle est exprimée

en mg d’O2/L.

Fig. 5 DBO-mètre. Fig.6 Réacteur-DCO.

I.3. Paramètres biochimiques

I.3.1. Détermination de taux d’humidité et de la matière sèche

Elle est déterminée en calculant la différence entre le poids de l’échantillon humide et

celui de l’échantillon séché (Tovar et al., 2002). Un échantillon de 1g a été séché à 105


17

C° pendant 24h, puis refroidi dans un dessiccateur. La teneur en eau est exprimée en

pourcentage de masse

Humidité (%) = (P-Ps)/ (P-Po) MS(%) = 100 - Humidité(%)

P: poids du creuset + échantillon avant séchage.

Ps: poids du creuset + échantillon après séchage.

P: poids du creuset vide.

L’analyse est effectuée en triple.

I.3.2. Matière organique et minérale

Les cendres (matières minérales) sont déterminées par incinération d’1g d’échantillon

sec dans un four à moufle à 550°C pendant 5 heures. La matière organique correspond à la

différence entre la prise d’essai et les cendres qui en résultent.

(%) cendre totale = M cendre × 100/M (prise d’essai)

I.4. Extraction des polyphénols totaux

L’acétate d’éthyle est confirmé être un solvant convenable pour la récupération des

composés phénoliques contenus dans les margines (Visioli et al., 1999; Bcherrawi, 2000).

4 ml d’acétate d’éthyle sont ajoutés à 4 ml de margines (v:v), l’ensemble est homogénéisé à

l’aide d’un vortex durant une minute, puis centrifugé pendant 5 min à 10000 rpm.

Une séparation en deux phases permet d’aspirer le surnageant d’acétate d’éthyle riche en

polyphénols à l’aide d’une micropipette. Le récupérât est ensuite filtré à travers un entonnoir

qui porte un papier de cellulose rempli du sulfate de sodium (≈ 10 g). Ce dernier a pour rôle

l’absorption d’une éventuelle humidité.

L’extraction a été répétée cinq fois, en ajoutant un volume similaire d’acétate d’éthyle

à chaque extraction, afin de récupérer les phénols totaux de notre échantillon de margines. Un

lavage du sulfate de sodium avec 70 ml d’acétate d’éthyle a été effectué à la fin de

l’extraction afin de récupérer les CP qui y restent attachés (Brenes et al., 2000).

L’acétate d’éthyle est évaporé sous vide à l’aide d’un évaporateur rotatif à 45°C jusqu’à

l’obtention d’un dépôt jaune foncé de polyphénols. Enfin, le dépôt jaune est récupéré dans 4

ml de DMSO à l’aide d’une micropipette.


18

I.5. Dosage des composés phénoliques des margines

I.5.1 Dosage des polyphénols totaux

Le réactif Folin Ciocalteu, consiste en une solution Jaune acide; contenant un

complexe polymérique d’ions formés à partir d’hétéropolyacides phosphomolybdiques

(H3PMO12O40) et phosphotungstiques (H3PW12O40). Il oxyde les phénols en ions

phénolates en milieu alcalin et réduit partiellement ces hétéropolyacides d’où la formation

d’un complexe molybdotungstene bleu La coloration bleuâtre obtenue est proportionnelle à la

quantité de phénols présente (Ribéreau Gayon , 1968). Les polyphénols sont dosés par la

technique colorimétrique de Folin ciocalteau .Un aliquote de 10 μl de la dilution 10-2 de

l’extrait phénolique est mélangé à : 990 μl d’eau distillée, 250 μl de solution de Folin

Ciocalteau (1N) et 1,25 ml de carbonate de sodium (Na2 CO3 20%). Le développement d’une

couleur bleue est obtenu après incubation à l’obscurité et à température ambiante pendant 40

min. L’absorbance est mesurée à 725 nm. La concentration en composés phénoliques d’extrait

est déterminée en se référant à la courbe d’étalonnage obtenue en utilisant l’acide gallique

comme standard.

Fig 7 : Courbe étalon correspondant aux dosages des phénols totaux.

II. Analyses microbiologiques des margines

II.1Traitement préalable des margines

Les margines ayant fait l’objet de notre travail ont subi les opérations de

prétraitements suivantes, afin d’éliminer les matières en suspensions et la matière grasse. La


19

délipidation a été faites par décantation à l’aide d’une ampoule à décanter et la fiiltration à

l’aide d’un papier de filtre wattman (Yahiaoui Moussaoui, 2013).

II.2 Dénombrement de la FTAM (flore totale aérobie mésophile)

Elle consiste à dénombrer la microflore existante dans l’échantillon des margines ;

Nous avons procédé à une culture sur gélose nutritive. Pour se faire, une série de dilution

variant de 10-1

au 10-4

qui a été préparée selon les étapes suivantes:

II.2.1 Préparation des dilutions :

Dans un tube à essai contenant 9 ml d’eau distillée stérile, est ajouté 1 ml de la solution

mère, c’est la dilution à 10-1

.1 ml de cette dilution est introduit dans 9 ml d’eau distillée

stérile, correspondra à la dilution 10-2

. On continue ainsi jusqu'à l'obtention de la dilution 10-4

.

II.2.2 Ensemencement par étalement sur gélose nutritive:

Le milieu gélosé préalablement fondu est réparti dans des boites de pétri à une hauteur

d'environ 3 à 4 mm qu’on laisse ensuite refroidir. 0.1 ml de chaque dilution est prélevé à

l’aide d'une pipette Pasteur puis déposé sur la gélose, ensuite étalé sur toute la surface du

milieu.

Après 24h à 48h d'incubation à 30°C, les colonies développées sont dénombrées à l'aide

d'un compteur de colonies (Djerbaoui Amina Nesrine, 2011).

Le nombre de germes par ml est déterminé en calculant la moyenne des résultats obtenus et en

tenant compte des facteurs de dilution, selon la formule:

N = n / d. v

Où :

N : nombre des microorganismes en UFC/ ml.

n : nombre des colonies dénombrées.

v: Volume prélevé (0.1ml).

d : Dilution (Marchal et Bourdon, 1982).

Isolement et purification

À partir d'un échantillon de les margines, des dilutions variant de 10-1 à 10-4 sont

réalisées, Ensuite, 0.1 ml de chaque dilution est ensemencé sur le milieu GN (milieu

d’isolement de toutes la flore microbienne qui s’installe dans les margines). L’incubation se

fait à 30°c pour une durée de 24 Heures.

Après 24 h d’incubation, l’étape de purification des cultures permet d’obtenir des

cultures pures à partir des différentes souches obtenues.


20

La sélection est basée sur l'aspect macroscopique des colonies : la couleur, la forme, le

diamètre, l’opacité…etc. Un échantillon de chaque type de colonie est prélevé et ensuite

purifié par repiquage successif selon la méthode de stries (Martinneau, 1996).

II.2.3.Les souches purifiées à partir de la GN

II.2.3.1.Bacillus

Le genre Bacillus, très hétérogène, comprend des espèces anaérobies facultatives ou aérobies

(P. Roger et J.L. Garcia, 2001). Elle est purifie et repiqué successivement sur milieu GN à

partir de ce dernier milieu. L'identification de Bacillus isolées est réalisée en se basant sur les

études morphologique et biochimique

a. Etude morphologique

L’étude morphologique a été réalisée pour tous les genres de bactéries, qui ont les

purifient et elle subdiviser en deux partie macroscopique et microscopique qui repose sur la

préparation du frottis et la coloration de Gram pour les différents germes bactérien ou une

coloration simple pour les levures :

Aspect macroscopique

L’observation de l'aspect macroscopique des colonies permet d'effectuer une

Première caractérisation, avec une orientation possible des résultats au cours de

l'identification.D’après Singleton(1999), les éléments d’identifications macroscopiques sont:

La forme , La taille , La Chromogenèse , L'élévation , L'opacité , La surface…etc

Aspect microscopique

L’observation microscopique consiste à observer les cellules bactériennes à l’état frais

et après une coloration de GRAM :

*Etat frais : permet de déterminer la forme, l'arrangement et la mobilité des bactéries. Il

consiste en l'observation d'une goutte de suspension bactérienne, préparée avec de

l'eau physiologique et placée entre lame et lamelle. L’observation se fait au

microscope photonique à grossissement X 100 (Singleton, 1999).


21

*Coloration de GRAM : est une double coloration qui nous permet de connaître forme,

l'arrangement, la pureté ainsi que la nature biochimique de la paroi des cellules purifiées.

Cette coloration permet de classer les bactéries selon leur capacité à fixer le cristal violet.

Celles qui possèdent une couche de peptidoglycane mince sont décolorées lors du lavage à

l’éthanol (GRAM-), alors que celles qui possèdent une couche de peptidoglycane épaisse vont

retenir le colorant (GRAM+). La consistance et la valeur de la coloration de Gram correspond

à des différences biochimiques entre la paroi des bactéries Gram positif et les bactéries Gram

négatif (Marchal et Bourdon, 1982).

b.Etude biochimique

Les épreuves biochimiques permettent en général de distinguer les espèces, même

Etroitement apparentées entre elles (Tortora et al., 2003).

b.1.test de catalase

b.2.Utilisation du citrate comme source de carbone

Le milieu utilisé ne contient que le citrate comme seule source de carbone. Seules les

bactéries possédant une citrate perméase seront donc capables de se développer sur ce milieu

en provoquant la libération des OH qui alcalinisent le milieu, donc il y aura virage au bleu

(Singleton, 1999).

b.3.Production d'indole

La production d’indole est mise en évidence par utilisation de tryptophane exempt

d'indole (Joffin et leyral ,2006).par une réaction complexe, le tryptophane est décomposé en

présence d’une tryptophanase en indole et d’autre produits après incubation, l’ajout de réactif

de kovacs permet de mettre en évidence l’indole formé la lecture se traduit par une couleur

rouge si le test est positive (indole +) et elle est de couleur jaune (couleur de réactif) si le test

(indole -) (Camille D. 2014).

b.4.Test Voges-Proskauer (vp) et Rouge de Méthyl (RM) :

La mise en évidence des voies fermentaires, est de grande utilité pour le diagnostic des

microorganismes. Ce test est opéré à partir d’une culture sur milieu Clark et Lubs qui servira

à la détermination des réactions de Voges Proskauer (VP) et Rouge de Méthyl (RM). Un tube


22

contenant le milieu Clark et Lubs est ensemencé à l’aide de quelques gouttes de la bactérie,

puis incubé à 37°C pendant 24h. Le lendemain, la moitié du tube est transvasée dans un autre

tube stérile :

- L’un servira à la recherche de la réaction VP, après adjonction des réactifs VP I, puis VP II,

attende environ 15 minutes puis noter la couleur ; si elle vire au rouge orangé, il s’agit d’une

réaction positive.

- L’autre servira à la recherche de la réaction RM, après adjonction du réactif RM ; s’il y a

virage de la couleur au rouge, il s’agit d’une réaction positive (Joffin et al., 2006)

b.5.Test TSI : (Tri-Sugar-Iron) :

Ce milieu solide, incliné, renferme un indicateur de pH coloré (rouge de phénol), trois

sucres (glucose avec une forte concentration au culot saccharose et lactose au niveau de la

pente), des peptones, des thiosulfates et du fer. Il nous renseigne sur trois caractéristiques:

- La production de gaz pendant la consommation du glucose se manifeste par un décollement

de la gélose au fond du tube.

- L’utilisation ou non du lactose qui se manifeste par un jaunissement de la pente sinon, la

pente reste légèrement rose.

- La production ou non d’H2S qui se traduit par un noircissement.

À partir du milieu TSI on fait ensemencer la pente par une strie longitudinale et

ensuite une piqure centrale à l’aide d’une pipette pasteur, et à partir d’une suspension de la

culture en eau distillée stérile, enfin on fait étuver ce tube à 37°C pendant 24 heures.

b.6.Hydrolyse de l’amidon :

L’amidon est un polysaccharide, polymère du glucose α, constitué d’amylose et

d’amylopectine Camille D. (2014). En cultivant la souche à caractériser sur milieu nutritive

additionnée de 1% d’amidon de pomme de terre puis incuber à 30°C, pendant 24 h .la lecture

est se fait comme suite :

*l’hydrolyse de l’amidon s’exprime par un halo d’éclaircissement autour de chaque colonie

(point d’ensemencement) l’observation est plus nette en inondant la surface du milieu avec du

lugol et

*si la zone reste bleue l’amidon dans ce cas n’est pas hydrolyser.


23

b.7.Hydrolyse de la gélatine :

La souche est ensemencer dans un tube content de la gélatine nutritive puis incuber à

30°C, pendant 24 h ensuite le tube est placé pendant 2heures environ au réfrigérateur

*si la gélatine devient solide cela implique qu’elle n’a pas été attaquée

* si elle reste liquide une enzyme extracellulaire la gélatinase l’a hydrolysée (Larpent et

Larpent -Gourgaud .1985).

b.8.Hydrolyse de la caséine :

L’hydrolyse de la caséine est étudiée selon la méthode de Gordon et Smith (1953) et

williams et cross (1971) sur un milieu gélose contenants5% de lait écrémé. Après 24h

d’incubation à 30°C, l’apparition de la zone d’éclaircissement du milieu autour des colonies

témoigne de l’hydrolyse de la caséine (Camille D. 2014).

b.9.Action sur le lait écrémé :

D’après williams et cross (1971) Un tube contenant une solution de lait écrémé en

poudre à 10%dans l’eau distillée est ensemencés et incubés à 30°C .une observation après

24h permettent de noter la coagulation ou la peptonisation du lait provoquée par la bactérie.

b.10. Mannitol mobilité :

Le mannitol est un produit de réduction du D-mannose. Il permet de rechercher

simultanément la fermentation du mannitol et la mobilité. On a ensemencé les souches

étudiées dans le milieu semi-solide mannitol-mobilité par piqûre centrale, et incubé à

37°C±1°C pendant 18 à 24h. Le virage au jaune du milieu indique la fermentation du

mannitol (Gerhard et al., 1994), une diffusion dans la gélose indique la mobilité des bactéries

(Marchal et al., 1991).

II.2.3.Recherche et dénombrement des coliformes totaux et fécaux

Le dénombrement des coliformes est réalisé en milieu de culture Désoxycholate (DCL).

Le milieu est ensemencé en masse et incubé à 37°C pendant 48 heures pour les coliformes

totaux alors que les coliformes fécaux ensemencé en surface et incubé à 44°C.

II.2.4.Recherche et dénombrement des streptocoques fécaux

La recherche et le dénombrement comporte deux tests :

Test présomptif:


24

A partir de la solution mère introduire 1 ml dans trois tubes de milieu ROTHE (BIO-RAD,

France) double concentration.

1 ml dans une série de 3 tubes de milieu ROTHE (BIO-RAD, France) simple concentration.

Bien homogénéiser et incuber à 37°C pendant 24 à 48heures.

Test confirmatif:

Tous les tubes qui présentent un trouble microbien, sont repiqués dans des tubes de

milieu LITSKY (BIO-RAD, France) et incubés à 37°C pendant 48heures.

II.2.5. Recherche des Staphylocoque

Les staphylococcus sont des coques Gram positif, immobile, isolés par 2 ou groupés

en amas caractéristique (grappes de raisin), de 1um de diamètre, réguliers, catalase positif. Ils

présentent des capacités importantes de thermorésistance .leur caractère saprophyte de la peau

et des muqueuses des êtres vivants en fait des agents de contamination par manipulation. Les

espèces de staphylococcus ne sont pas pathogènes, sauf quelques espèces qui sont coagulase

+, sont pathogènes (Leyral et Vierling, 2007 et Mardigan M et al.,2007).

II.2.5.1.Isolement par Méthode d’ensemencement en surface

A partir de la solution mère, porter aseptiquement à l’aide d’une pipette neuve 0.1 ml

et l’ensemencer à la surface du milieu Chapman (faire un étalement par râteau) puis incuber à

37 C pendant 24 heures

II .2.5.2.Purification des souches isolées

Les colonies sont ensemencées, sur le milieu adéquat (milieu Chapman). Celles qui

présentent un aspect caractéristique de celui des staphylocoques, sont réensemencées à l’aide

d’une pipette Pasteur, en stries selon la méthode des quatre cadrant à fin d’obtenir des

colonies bien isolées. Une coloration de Gram est refaite chaque fois pour contrôler la pureté

des souches.La conservation est réalisée dans des tubes de gélose de conservation par piqure

centrale. Les tubes sont ensuite conservés au réfrigérateur à 4°C, les repiquages sont effectués

tous les 15jours (Stephen et al., 2006).

II .2.5.3.Identification du genre

a. Identification biochimique

En plus des caractères morphologiques, l’identification est aussi effectuée sur la base de

quelques caractères biochimiques (Guiraud; 1998 ; Freney et al., 2007) :


25

a.1.Test de catalase

La catalase est une oxydoréductase intervenant dans le mécanisme de résistance à la

bactéricidie. Ce test permet de différencier les staphylocoques des streptocoques. À partir d'un

isolement, une petite quantité de culture bactérienne est prélevée à l’aide d’une pipette Pasteur

;on fait réagir la colonie dans 1 goutte de peroxyde d’hydrogène (H2O2) (10 volume) déposée

sur une lame. Une réaction positive se traduit par le dégagement de bulles de gaz (oxygène).

Ce test peut être réalisé en tube contenant 0.5 ml de H2O2 ; à l’aide d’une pipette

Pasteur des colonies sont prélevées et introduites dans le tube. Le résultat et identique à celui

obtenu lors du test sur lame (Denis et al., 2007).

II.2.5.4.Identification de l’espèce

1- Test de la staphylocoagulase

Ce teste a pour but de déterminer la pathogénicité d’un staphylocoque, les espèces de ce

type secrètent une enzyme qui est la staphylocoagulase qui a la propriété de coaguler le

plasma. Dans un tube d’hémolyse stérile, on introduit 0.5 ml de plasma humain qui

correspond au surnageant issus de la centrifugation du sang humain. Ajouter 0.5 ml d’une

suspension bactérienne de la souche étudiée (S. aureus).Placer le mélange à 37°c dans l’étuve

pendant 6 heures.

Lecture:

- Coagulation du plasma coagulase +

- Pas de coagulation du plasma coagulase - (Diamonet F., 2002.)

II.3. Recherche des levures :

Pour assurer la purification de la souche, fait appel à des isolements successifs sur

milieu OGA. Après l’incubation, l’observation des caractères culturaux permet de désigner la

Pureté de la souche.

Identification de la levure qui a été purifie :

L’identification ne peut être effectuée que sur une souche pure préalablement isolée sur

un milieu gélosé pour levure. Elle est basée sur l'analyse des caractères morphologiques et

sexuels, et sur l'étude de certains critères physiologiques.


26

1. caractéristiques morphologiques

1.1. Etude le mode de reproduction

La reproduction végétative chez les levures se fait par trois modes : Bourgeonnement,

fission ou par cloisonnement du mycélium (anse d’anastomose). Le mode de reproduction par

bourgeonnement est largement répondu chez les levures. La souche à examiner est mise en

culture en milieu OGA et incubées à 25°C pendant 3 jours. L’observation microscopique

portera sur la forme et la taille des cellules, et sur le mode de reproduction asexuée.

2. caractéristiques physiologiques

2.1. Fermentation des sucres

La souche est testée pour leur capacité à fermenter le glucose, galactose,

Saccharose, maltose et le lactose selon la méthode de Durham. Le milieu comporte

0,45% d’extrait de levures, 0,75% de peptone et 2% de sucre approprié. Pour la boite de Pétri

d’isolement de culture pure, 5 tubes à essai remplis sur une hauteur de 5 cm environ sont

utilisés. Il faut ensemencer en profondeur chaque souche de levure sur une gamme de cinq

tubes Il faut incuber les tubes à l’étuve à 25°C. Après 24 heures au moins constater les

résultats. La mesure de la partie vide dans la cloche de Durham donne une estimation du

volume du gaz formé par fermentation.

2.2. Recherche de nitrate réductase

L'étude de la réduction des nitrates se fait par la mise en évidence des nitrites

formés. Ces derniers en milieu acétique ou sulfurique, donnent une coloration rose.

L’enzyme nitrate réductase B catalyse la réduction des nitrates en nitrites

(réduction assimilatrice). Les nitrates peuvent aller également jusqu’au stade azote (N2).

à une culture de 24 à 48h d'incubation à 30°C en bouillon nitraté, cinq gouttes de réactif de

Griess sont ajoutés. Après agitation, la lecture est immédiate et elle se fera comme suit :

- Lorsque la coloration est rose ou rouge ; les nitrates sont réduits en nitrites, on parle de

nitrate réductase positive (NR+).

- Lorsque le milieu reste incolore ; on ajoute un peu de la poudre de zinc (réducteurs des

nitrates) ; après cinq minutes les tubes sont de nouveau observés :

- si le milieu devient rose ou rouge, il reste des nitrates, donc ces derniers n'ont pas été réduits

par la bactérie: nitrate réductase négative NR- .

-si le milieu reste incolore, il ne reste plus de nitrates, les bactéries les ont réduit au delà

du stade nitrites : nitrate réductase positive NR+ (Tortora et al., 2003).


27

II.4.Recherche des moisissures

II.4.1.Isolement sur milieu sabouraud

L’ensemencement et fait en surface par l’étalement de 0.1 ml de l’échantillon dans des

boites de pétri contenant le milieu sabouraud.

II.4.2.incubation

L’incubation a été réalisée à 25°C, température considérée comme optimale pour la

croissance des champignons jusqu’à l’apparition d’un mycélium de 48 h à 4 jours.

II.4.3.Purification des isolats

Après incubation, des repiquages de manière aseptique sont effectués jusqu’à

l’obtention des colonies pures sur milieu gélosé sabouraud.

II.4.4.Identification des isolats.

La détermination mycologique se fait , par observationmacroscopique et

microscopique des moisissures isolés. L’identification des espèces fongiques isolées est

effectuée en utilisant la clé de détermination de (Botton, 1990).

Observation macroscopique.

Les observations macroscopiques portent sur les critères culturaux, indispensables à la

détermination de l’espèce. L’aspect du mycélium aérien (dense, poudreux, floconneux…), la

couleur des colonies, la sporulation, la diffusion ou non d’un pigment dans la gélose…etc

Examen microscopique

on prend un fragment de scotch (technique de drapeau), que l’on colle sur le bord de la

colonie du moisissures, puis qu’on décolle délicatement. On le recolle ensuite sur une lame

sur laquelle est préalablement étalée une goutte de bleu de méthylène. On peut observer au

microscope les spores et le mycélium (N.GUEZLANE-TEBIBEL et al.,2015).

II.4.5.Conservation des isolats.

Dans des tubes inclinés contenant le milieu sabouraud incliné et après

une incubation de 7 jours, les tubes sont conservés à 4° C (les basses températures

augmentant considérablement la longévité des cultures).


28

III. Evaluation de l’activité antibactérienne des margines :

III.1.souches testées:

Les souches qui subissent une activité antibactérienne sont des souches isolées à partir

de nos échantillons de margines ; Staphylococcus aureus, Staphylococcus

epidermidis ,Saccharomyces cerevisiae , Bacillus subtilus. Et nous avons ciblé troix

microorganismes (originaire d’isolement clinique)

Tableau 5 : Souches d’isolement clinique testées.

Les bactéries (souche ATCC) Le code Le lieu

Staphylococcus aureus. 43900 EPH Constantine

Escherichia coli. 25925 EPH Constantine

Pseudomonas aeruginosa. 27853 EPH Constantine

III.2. Préparation de l’inoculum

III.2.1. Préparation de pré-cultures :

Les tests antimicrobiens doivent être réalisés à partir des cultures jeunes (de 18 à 24

heures) en phase de croissance exponentielle. Repiquage des souches est effectuée par

ensemencement des bactéries dans des boites de Pétri contenant de la gélose nutritive (GN)

pour Pseudomonas aeruginosa, Bacillus, le milieu Chapman pour Staphylococcus aureus,

Staphylococcus epidermidis le milieu Hekteon pour Escherichia coli et Sabouraud pour la

levure. Les souches bactériennes ont été incubées à 37°C pendant 18 heures, alors que la

levure et Bacillus a été laissée à température ambiante de 30°C pendant 24h.

III.2.2. Préparation de la suspension microbienne

A partir d’une culture jeune de 18 h, et à l'aide d'une anse de platine, on prend

quelques colonies bien isolées et parfaitement identiques et on le dépose dans 10 ml d'eau

physiologique stérile à 0,9% de NaCl. La suspension microbienne est homogénéisée pendant

5min dans le vortex.

La lecture de la transmittance est effectuée par un spectrophotomètre réglé à une

longueur d’onde de 625 nm, et la densité optique lue est justifiée à 0.08 à 0.10 nm. Ce qui

correspond à une concentration de 107 à 10

8 CFU /ml (Hazzit, 2008).la suspension

microbienne peut être ajusté soit en ajoutant de la culture s'il est moins concentré ou de l'eau

physiologique stérile dans le cas contraire.

III.2.3. Préparation des disques


29

Les disques sont fabriqués à partir du papier Wattman №02, par un perforateur à 2 trous

du papier, avec un diamètre de 6mm. Ensuite, ces disques sont mis dans un tube à essai,

stérilisés à l'autoclave, puis stockés à une température ambiante.

III.2.4.Activité antibactérienne :

L'évaluation de l’activité antibactérienne a été réalisée par la méthode de diffusion en milieu

gélosé (ou méthode des disques). On fait couler la gélose de Mueller-Hinton dans les boites

de pétri à environ de (4 mm) après solidification des milieux de culture. L’ensemencement est

réalisé par écouvillonnage sur boites Pétri, Un écouvillon est trempé dans la suspension puis

étalé sur la totalité de la surface gélosée, de haut en bas en stries serrées en tournant la boite à

chaque fois jusqu'à ensemencement de la totalité de la surface. On laisse sécher de 3 à 5

minutes. Dans des conditions aseptiques et à l’aide d’une pince stérile, des disques de papier

Wattman № 01 (2 disques/boite) imbibés avec 10 μl de l’extrait de composes phénolique, et

10 μl de DMSO sur un autre disque (les disques trempés de DMSO sont utilisés comme

contrôle négatif ou comme un témoin et l’autre disque est utilisés comme contrôle positif).

Sont déposés délicatement sur la surface de la gélose. Les boites de pétri sont maintenues à

4ºC pendant une heure pour que l’extrait puisse diffuser (Rožman et Jeršek, 2009 cité par

Kehal (2013)). L’incubation se fait à 37°C pendant 24h alors que la levure et Bacillus a été

laissée à température ambiante de 30°C pendant 24h.

III-2.5. Expression des résultats :

L’effet des extraits se traduit par l’apparition autour de disque d’une zone circulaire

transparente correspondant à l’absence de la croissance. Les résultats sont exprimés par la

mesure du diamètre de la zone d’inhibition à l’aide d’une règle en mm et sont Interprétés en

trois catégories : S= sensible (ɸ > 13mm), R= résistant (ɸ < 6mm), et I=intermédiaire (6mm <

ɸ <13mm).

Chapitre III Résultats et discusion

30

1. Caractérisation physico-chimique et biochimique des margines

Tableau 5: les Caractéristiques physico-chimiques et biochimiques des margines prélevées

du système traditionnelle à 03 phase.

Paramètres Valeurs

pH 4.8

Conductivité 1711us/cm

Turbidité 666.66 NTU

DBO5 1200 mg O2/ml

DCO 1300 mg O2/ml

%d’humidité 89.5%

%de la matière sèche 10.5%

%de la matière organique 9.5%

%de la matière minérale 1%

Polyphénols 2.2 ug/ml

Les margines présentent un rejet fortement pollué sous forme de liquide résiduel dont

la composition est variable. Cette variabilité dépend du type d’olives ; du degré de leur

maturation (selon la période de collecte), des systèmes de culture, de la pratique de salage

pour la conservation des olives, des conditions climatiques et du procédé utilisé pour

l’extraction d’huile d’olive (De Felice, B et al 1997). Les margines se caractérisent aussi par

une odeur nauséabonde qui s’accentue au fur et à mesure de leur stockage. On a constaté

qu’ils représentent une coloration brune à brune-rougeâtre, qui devient de plus en plus sombre

au cours de leur stockage, avec un aspect trouble et une odeur forte qui rappelle celle d’huile

d’olive.

Le pH

La mesure du pH effectuée donne une valeur de l’ordre de 4,8. Les margines sont donc

des effluents acides, en raison de la présence des acides organiques (acides phénoliques,

acides gras). La valeur enregistrée dans notre étude se trouve dans la limite inférieure de la

fourchette citée dans la littérature (4,5 à 6).


31

La conductivité électrique

Les margines étudiées ont une conductivité électrique faibles (1711us/cm)

comparativement à celles trouvées pour les margines par Sbai et Loukli (2015) (7890

μS/cm) et Di Serio et al. (2008) (1800 et 5000 μs/cm). La faible conductivité de nos

margines pourrait s’expliquer par leur grand teneur en composés organiques que les sels.

En effet, les sels minéraux dissouts en solution sont de bons conducteurs. Par contre, les

composés organiques sont de mauvais conducteurs (De villers, 2005). Ce résultat est

corroboré à la richesse de nos margines en matières organiques exprimés en terme de

DBO5 (demande biologique en oxygène) et DCO (demande chimique en

oxygène).DBO5=1200 mg O2/l et DCO=1300 mg O2/l. Ces rejets sont aussi caractérisés par

la prédominance de substances toxiques notamment les composés phénoliques (2.2 ug/ml)

qui leur confèrent un pouvoir antimicrobien.

La turbidité

Ces margines présentent une turbidité de l’ordre de 666.66 NTU en raison des teneurs

élevées en substances organiques.

La matière sèche

Le taux de matières sèches totales (en g/l) est déterminé (109.3g/l). Il est nettement

plus élevé que celui des margines prises comme échantillon par STEEGMANS et

FRAGEMAN (1992) (19,2 g/l), par contre, la valeur enregistrée dans notre étude est plus

proche à celle trouvée par EL ABBASSI et al. (2011) ayant trouvé que leur échantillon de

margines contenait 90 g/l de MST. Ces variations peuvent être dues à des paramètres

climatiques et géologiques, à des variations botaniques, au stade de maturation de l’olive et

au procédé d’extraction d’huile.


32

2.Caractérisation microbiologique

Peu de travaux ont été réalisés sur la caractérisation de la microflore des margines.

C’est pour cela nous avons fait une étude microbiologique (dénombrement, identification des

microorganismes) pour établir l’effet des composés phénoliques sur la microflore de ces

effluents et aussi pour une mise en évidence des microorganismes capables de survire dans

ces conditions (leur résistance à ces composés phénolique).

2.1. Dénombrement des micro-organismes

Tableau 6: Caractérisation microbiologique des margines étudiées :

Les résultats du dénombrement des germes présentés dans le tableau 5.Montre que

notre étude microbiologique effectuées sur les margines ont confirmé l’absence totale de

micro-organismes pathogènes. Cette valeur est similaire à celles rapportées par l’auteur

(Ranalli, 1991a). Par conséquence, l’absence totale de ces germes dans les margines ne

pourrait être expliquée que par une inhibition de leur croissance par les composés phénolique

(polyphénols, tannins, acides gras…) (Ranalli, 1991a).

La charge microbienne totale est évaluée par le dénombrement de la flore totale

aérobie mésophile (FTAM).elle est relativement faible de (6.35 104 UFC.ml

-1) par rapport à

celle enregistrée dans les effluents d’abattoir (1,23 106 UFC.ml

-1) (Aissam et al, 2001). Elle

est lié aux caractéristiques physico-chimiques des margines qui gênent la croissance des

micro-organismes notamment la présence des substances antimicrobiennes (composés

phénoliques, tanins, acides gras).

Flore microbienne UFC.ml-1

FMAT 6.35 104

Champignons 1.08 105

Levures 1.4 104

Coliformes fécaux 0

Coliforme totaux 0

Streptocoques fécaux 0


33

Les levures et les champignons représentent la flore majoritaire des margines Ils sont

d’environ 1.08 105

UFC.ml-1

et 1.7 104

UFC.ml-1

respectivement. Ce résultat sont en accord

avec les celle obtenus par d’autres auteurs qui ont montré que dans les margines, les levures

et les champignons sont capables de s’y développer mieux que les bactéries (Aissam et al.,

2002). Pour ce qui concerne les résultats de dénombrement des germes de contamination

fécaux coliformes totaux (CT), des coliformes fécaux (CF) et des streptocoques fécaux (SF)

montrent l’absence totale de ces germes les résultats qui a été obtenus pour nos margines est

accord à celle de Taza et Marrakech (Mouncif et al. 1993a).

2.2. Identification des microorganismes

2.2.1 Les bactéries

A. Bacillus

Les bactéries du genre Bacillus sont des grands bacilles à Gram positif, groupés en chaînettes,

sporulantes, et généralement mobiles avec des flagelles péritriches. Ce genre est aérobie, ou

parfois facultatif et catalase positive (Klein et al., 1998).

Tableau 7: identification morphologique de Bacillus

examen macroscopique et

microscopique

Résultats

L’aspect macroscopique de Bacillus

sur gélose nutritive représente des

colonies rugueuses avec un halo clair

de précipité blanchâtres.

L’aspect microscopique de Bacillus

par coloration de GRAM apparaît

comme des bacilles isolés (2 µm de

long, 1 µm de large), Gram +,

Formant une spore ovalaire centrale

non déformante.


34

Tableau 8: Identification biochimique de Bacillus -galerie classique-.

Les tests Résultats

Catalase L’observation du test

catalase a montré que la bactérie

catalase positive Elle est donc

aérobies ou anaérobies

facultatives.

VP :positif

RM :négatif

Indole :négatif

TSI : virage

au jaune dans

la pente

lactose positif

production de

gaz : négatif

H2S : négatif

Manitole

mobilité :

positif

Le virage au

jaune du

milieu

indique la

fermentation

du mannitol

Citrate

simons :

négatif

la bactérie

ne

possèdent

pas une

citrate

perméase

La bactérie à fermentation

butanediolique :

RM (-) VP (+)


35

Tableau 9: Résultats de la mise en évidence de quelques activités enzymatiques de Bacillus

Les tests Les résultats

Hydrolyse de la caséine : positif

l’apparition de la zone

d’éclaircissement du milieu autour

des colonies témoigne de

l’hydrolyse de la caséine.

avant et après incubation à 30°C pendant 24h

Hydrolyse de l’amidon : positif

l’apparition d’un halo

d’éclaircissement autour de chaque

colonie témoigne de l’hydrolyse de

l’amidon.

Avant et après l’ajout de lugol

Avant et après incubation à 30°C pendant 24h

Hydrolyse de la gélatine : Le milieu reste

liquide une enzyme extracellulaire la gélatinase

l’a hydrolysée c’est à dire résultats positif.

Action sur le lait écrémé : coagulation et la

peptonisation du lait provoquée par la bactérie

donc résultats positif.


36

D’après les résultats exprimés dans les tableaux 7,8 et le tableau 9 il apparait une grande

biodiversité métabolique remarquable chez cette souche ces caractéristiques indiquent que la

souche étudiée semble être Bacillus subtilis.

B.Staphylococcus

Sur milieu Chapman, les colonies de Staphylococcus apparaissent souvent pigmentées

et entourées d’une aréole jaune dans le cas où le mannitol est fermenté, sinon les colonies sont

de couleur blanche. Ces colonies sont arrondies à bords réguliers de 1 à 2 mm de diamètre

après 24 heures d’incubation à 37°C (Carbonnelle et al., 1990) .

Tableau 10 : les Tests d’identification des staphylocoques

Les souches

Les tests

Staphylococcus aureus Staphylococcus epidermidis

Isolement et

purification

Coloration de

GRAM


37

Coagulase

catalase

2.2.2. La levure :

Pour situer la souche de levures sur le plan taxonomique au niveau de l’espèce, nous

Avons fait appel à quatre tests critiques : la morphologie de l’appareil végétal (mycélium ou

Pseudomycélium), le mode de reproduction et un test physiologique basé sur l’assimilation

des nitrates et la fermentation des sucres.

+ -

+ +


38

Tableau 11 : représente l’examen macroscopique et microscopique de la levure.

L’aspect Résultats

L’aspect macroscopique de la levure sur

gélose de l’OGA représente

des colonies de couleur

crème légèrement convexes et lisses avec

striation lumineuses brillantes.

L’aspect microscopique de la levure par

coloration au bleu de méthylène représente

des cellules cylindriques, singulières ou en

paires le pseudo mycélium n’est pas formé.

Leur mode de reproduction par

bourgeonnement

L’aspect de la levure à l’état frais

La levure est immobile


39

Tableau 12: représente les résultats des caractéristiques physiologiques étudie chez la levure.

Les tests Les résultats

Assimilation de nitrate

(Nitrate réductase)

le milieu devient rouge et ça après

l’ajout de la poudre de zinc , il reste

des nitrates, donc ces derniers n'ont

pas été réduits par la levure nitrate

réductase négative NR- .

Donc la levure n’assimile pas les

nitrates.

Fermentation des sucres

Résultats positif apparait par virage de la couleur et production de gaz

les différents sucres testés dont le glucose, le saccharose, le maltose, le lactose et le

galactose, seul le lactose est non fermentescible. Il apparaît que la souche de levure étudiée

peut fermenter quatre sucres dont le glucose, le saccharose, le maltose et le galactose.


40

D’après les résultats obtenus dans les tableaux 12 et 13 il est à remarquer que cette

espèce de levure fait l’assimilation des quatre sucres sauf le lactose, mais n’assimile pas le

nitrate.

Ces caractéristiques fermentaires indiquent que la souche étudiée semble être

Saccharomyces cerevisiae. Parallèlement, l’étude de la discrimination des espèces du genre

Saccharomyces, leur faculté d’assimilation des sucres et celle des nitrates montre que l’espèce

étudiée est Saccharomyces cerevisiae.

2.2.3. Les moisissures

Le diagnostic macroscopique de l’isolat (IM1) révèle des colonies jaunes, ocre jaunes

ou chamois. D’après les clés d’identification de Botton (1990), peuvent être affiliés à l’espèce

d’Aspergillus ochraceus, leur caractère microscopique est : un mycélium cloisonné portant de

nombreux conidiophores dressés, non ramifiés, terminés en vésicule. Des phialides formées

directement sur la vésicule ou sur des métules, et des têtes conidiennes unisériées ou bisériées

; les conidies en chaîne unicellulaire (Figure 8).

Figure 8 : l’isolat (IM1) Aspergillus ochraceus.

A) Observation macroscopique, B) Observation microscopique.

Le diagnostic macroscopique de l’isolat (IM2) ; L’espèce Aspergillus fumigatus se

caractérise par un thalle à croissance rapide de couleur bleu-vert (Figure 9). Avec

l’observation microscopique il apparait des vésicules sub-hémisphériques et conidiophores

courts avec des conidies sub- globuleuses à globuleuses échinulées. Selon les

recommandations de Botton et al. (1990) cet isolat (IM2) peut être affilié à l’espèce

Aspergillus fumigatus.

A B


41

.

Figure 9 : (IM2) Aspergillus fumigatus ,

A) observation microscopique, B) observation macroscopique.

Le diagnostic macroscopique de l’isolat (IM3) révèle des colonies noires sur milieu

sabauraud. L’observation microscopique au grossissement (X 40) des conidiophores qui se

terminent par une vésicule sphérique, portant deux rangs de phialides produisant des chaines de

conidies globuleuses. D’après l’aspect microscopique et macroscopique de cet isolat peut être

affilié Aspergillus niger (Figure 10), selon les clés d’identification Botton et al. (1990), Rémi

(1997).

Figure 10 : (IM3) Aspergillus niger,

A) observation macroscopique ;B) observation microscopique.

B A

A Bb


42

Sur Sabauroud : les colonies de l’isolat (IM4) sont plates, couleur blanchâtre au début

puis elle tourne vers le beige un revers incolore. L’observation microscopique montre un

mycélium septé, et présente une forme fructifère spécifique (pénicille). Le conidiophore est

aussi septé et porte des phialides, aux quels sont attachés des conidies. Les conidies sont

globuleuses, lisses, et forment de longues chaînes irrégulières. À partir de l’ensemble de ces

informations recueillies la souche S1 peut être attribuée au genre Penicillium sp (Figure11).

D’après Botton et al. (1990), Rémi (1997).

Figure 11 : (l’isolat IM4) Penicillium sp,


Le diagnostic macroscopique de l’isolat (IM5) révèle des colonies à croissance

rapide ; vert jaune, sillonné radialement, velouté ou un peu floconneux et leurs caractères

microscopiques présentent un mycélium cloisonné pénicillé et ramifié avec des conidiophores

lisses, et des phialides ampulliformes. Les conidies sont sub-globuleuses, disposées en longues

colonnes irrégulières cet isolat peut être affilié Penicillium chrysogenum (Figure 12), selon

les clés d’identification Botton et al. (1990), Rémi (1997).

A B


43

Figure 12 : (IM5) Penicillium chrysogenum ,


2.3. Evaluation de l’activité antimicrobienne

Le pouvoir antibactérien de notre extrait phénolique contre les souches isolées

(Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis, Saccharomyces cerevisiae et Bacillus

subtilis) montrent qu’il n’existe aucun effet de ces composés sur ces souches donc elles

résistent aux composés phénolique par contre il y’a un effet très efficace à remarquer chez

les souches testes ayant montré des sensibilités différentes vis-à-vis ces composés phénolique

donc ces derniers inhibent d’une manière leur croissance efficace . Ces résultats concordent

avec les travaux de plusieurs auteurs qui ont montré que les champignons et les levures sont

capables de se développer plus que les bactéries dans les margines.

Tableau 13 : Diamètre des zones d’inhibition en (mm) montrant l’activité antibactérienne des

composés phénolique vis-à-vis les souches à isolement clinique.

Groupe microbienne Souches testées Diamètres d’inhibition en

(mm)

GRAM +

Staphylococcus aureus

26

GRAM -

Escherichia coli

14

Pseudomonas aeruginsa

22

A B


44

Figure 13. L’activité antibactérienne des polyphénols sur la levure et les bactéries isolées.

Bacillus subtilis Staphylococcus aureus

Saccharomyces cerevisiae Staphylococcus epidermidis


45

Figure 14. L’activité antibactérienne des polyphénols sur les bactéries tests.

Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus

Escherichia coli

Conclusion et perspectives

46

Conclusion

Cette étude avait pour objectifs la caractérisation physico-chimique et microbiologique

des margines, l’isolement des souches Staphylococcus, Bacillus, moisissures et levure à

partir des margines, ainsi que l’étude du profil de résistance des souches isolées vis-à-vis de

l’extrait phénolique.

La caractérisation microbiologique nous a permis de dévoiler une charge microbienne

importante des margines. L’étude physico-chimique effectuée sur ces margines a montré une

forte pollution organique manifestée particulièrement par les composés phénoliques. Nos

margines sont caractérisées, également par une forte acidité et une valeur de conductivité

électrique plus faible avec une forte charge polluante déterminée par la DCO et la DBO5. La

teneur du contenu phénolique obtenu par une extraction liquide-liquide en utilisant l’acétate

d’éthyle comme solvant concorde avec celle de la littérature. Le profil de résistance montre

que les souches isolées à partir des margines sont résistantes alors que les souches exogènes

sont sensibles aux composés phénolique.

Perspectives

Recherche de la flore totale présente dans les margine comme les bactéries lactique,

les levures, les champignons et les bactéries contaminants (bactéries pathogènes).

une identification génotypique par les méthodes moléculaires est devenue

indispensable pour compléter l’identification phénotypique.

recherche des gènes responsables de la résistance en vue de la production d’enzymes

capables de dégrader les composés phénoliques.

Références bibliographique

47

Aggoun M., 2016. Caractérisation de la composition en micro- constituants des

marginesissues de la production oléicole et utilisabilité comme complément dans la ration

chez lavache laitière. Thèse doctorat sciences. Institut de la Nutrition, de l'Alimentation et

desTechnologies Agro-alimentaires INATAA. Université Frères Mentouri-Constantine.,12-

13p.

AFNOR (1983). Recueil de normes françaises : eau, méthodes d’essai, 2éme édition, Paris,

France, 621p.

Allouchef. F, Lamri. D, et Zahf, F, 1999, « Surveillance de la qualité bactériologique

etphysico-chimique des eaux de contamination au niveau des trois communes : Ali

Boussid,Saby, Ben Badis, wilaya de sidi bel abbés » ; mémoire d'ingénieur d'état en

biologie.Université de sidi bel abbés.

Abbassi E. A., Kiai H. and Hafidi A. (2012).Phenolics profile and antioxidant activities of

olive mill waswater. Food chemistry, 132 :406-412p.

Achak A., Ouazzani N., Yaacoubi A., MANDI L. 2008. Caractérisation des margines issues

d’une huilerie moderne et essai de leur traitement par coagulation-floculation par la chaux et

le sulfate d’aluminium. Eau, 21 : 53-57p. Aissam H., Errachidi F., Merzouki M.,

Benlemlih M. (2002) Identification des levuresisolées des margines et étude de leur activité

catalase. Cahiers de l'Association ScientifiqueEuropéenne pour l'Eau et la Santé, 7, 23-30p.

Aissam H. (2003). Etude de la biodégradation des effluents des huileries (margines) etleur

valorisation par production de l’enzyme tannase. Thèse de doctorat. Université SidiMohamed

ben abdellah (Maroc), Fès, 94p.

Al-Malah K., Azzam M.O.J., Abu-Lail N.I. (2000) Olive mills effluent (OME)

wastewaterpost-treatment using activated clay. Separation and Purification Technology, 20,

225-234p.


48

Amirante P., Montervino A. (1996) Epuration par concentration thermique des effluents

deshuileries d’olives et compostage du concentré. Une expérience appliquée dans les

pouilles,Olivea, 63, 64-69p.

A.Morisot, J.P.Tournier ; Répercutions agronomique de l’épandage d’effluents et déchets

de moulins à huile d’olive ; Agronomie : 6 (1986), 235-241p.

Annaki A, chouch, M et Rafiq, M. (1996b).Influence de la duré du stockage des olivessur

L’évolution de la composition des margines .l’eau .l’industrie .les nuisances .218, 24-28p.

Balice V., Boari G., CERA O., Abbaticchio P. (1982) Indagineanaliticasulleacque di

vegetazione. Nota 1.,Inquinamento, 7, 49-53p.

Balice V., Carrieri C., Carrieri G. (1997) Trattamentochimico-fisicoseguito dal

biologicodelleaque di vegetazionedelle olive, Ricerca, 2, 50-53p.

Bambalov G, Israilides C, Tanchev S, (1989). Alcohol fermentation in olive oil Extraction

Effluents, Biological Wastes, 27, 71-75p.

Benyahia N et Zein K. (2003).Pollution and developement issues in the Mediteranean basin,

2nd conference international Swiss environmental Solution for emerging Countries

(SESECII), Lausane, Swiss, 28-29p.

Borja R., Martin M.A., Duran Barrantes M.M. (1992) Kinetic study of biomethanizationof

olive mill wastewater previously subjected to aerobic treatment with Geotrichumcandidum.

Grasas y Aceites, 43, 82-86p.

Borja R., Banks C.J. and Alba J. (1995). A simplified method for determination of kinetic

parameters to describe the aerobic biodegradation of two important phenolic constituents of

olive mill waste water treatment by a heterogeneous microbial culture.Environ. Sci. Health

A., 30: 607-626p.


49

Bouranis D.L., Vlyssides A.G., Drosopoulos J.B., Karvouni G. (1995) Somme

characteristics of new organic soil conditioner from the co-composting of olive oil processing

wastewater and solid residue. Soil. Sci. Plant. Annal.,26, 2461-2472p.

Bressan,A, Liberator,L,D'alessandro,N, Tonucci,L,Belli,CetRanalli;G(2004)/ Improved

combined chemical and biological treatments ofolive mill wastwaters.Journal of agricultural

and food chemistry ,52,p1228-1233p.

Ben Rouina B. (2014).L’épandage des margines sur les terres agricoles : résultats etgestion

pratique, 7èmes Journées Méditerranéennes de l’Olive, Meknès, Maroc.21-23Octobre, 3.

BOTTA A., Avril 2001, « Laurence BELLON. Pollution de l'eau et santé humaine

»Laboratoire de biogénotoxicologie et mutagenèse environnementale. Université

EuroméditerranéenTEHYS.

Balice V., Boari G., CERA O., Abbaticchio P. (1982) Indagineanaliticasulleacque

divegetazione. Nota 1.,Inquinamento, 7, 49-53p.

Balice V., Carrieri C., Carrieri G. (1997) Trattamentochimico-fisicoseguito dal

biologicodelleaque di vegetazionedelle olive, Ricerca, 2, 50-53p.

Bambalov G, Israilides C, Tanchev S, (1989). Alcohol fermentation in olive oil Extraction

Effluents, Biological Wastes, 27, 71-75p.

Benyahia N et Zein K. (2003).Pollution and developement issues in the Mediteranean basin,

2nd conference international Swiss environmental Solution for emerging

Countries(SESECII), Lausane, Swiss, 28-29p.

Borja R., Martin M.A., Duran Barrantes M.M. (1992) Kinetic study of biomethanizationof

olive mill wastewater previously subjected to aerobic treatment with Geotrichumcandidum.

Grasas y Aceites, 43, 82-86p.

Borja R., Banks C.J. and Alba J. (1995). A simplified method for determination of kinetic

parameters to describe the aerobic biodegradation of two important phenolic constituents of

olive mill waste water treatment by a heterogeneous microbial culture.Environ. Sci. Health

A., 30, 607-626p.


50

Bouranis D.L., Vlyssides A.G., Drosopoulos J.B., Karvouni G. (1995) Somme

characteristics of new organic soil conditioner from the co-composting of olive oil processing

wastewater and solid residue. Soil. Sci. Plant. Annal.,26, 2461-2472p. Bressan,A,

Liberator,L,D'alessandro,N, Tonucci,L,Belli,CetRanalli;G(2004)/ Improved combined

chemical and biological treatments ofolive mill wastwaters.Journal of agricultural and food

chemistry ,52,p1228-1233p.

Botton B., Breton A., Févre M. Gauthier S., Guy Ph., Larpent J-P., Reymond P.,

Sanglier J-J., Vayssier Y. and Veau R. (1990). Moisissures utiles et nuisibles :

importance industrielle. Édition Masson, Paris.

Cabrera F., Lopez R., Martinez-Bourdiu E., Dupuy De Lome E., Murillo J.M. (1996)

Land treatment of olive oil mill wastewater.International Biodegradation and

Biodeterioration, 38, 215-225p.

Camille D. (2014). Pratique en microbiologie de laboratoire : Recherche de bactéries etde

levures-moisissures. 3 Ed : Lavoisier, Paris. ISBN : 978-2-7430-1565-7. P 610-597p.

Capasso R. (1997). The chemistry, biotechnology and ecotoxicology of the

polyphénolsnaturally occurring in vegetable wastes.Curr.Top.Phytochem., Res. Trends, 1,

145-156p.

Capasso R., De Martino A., Cristinzio G. (2002b) Production, characterization, and

effectson tomato of humic acid-like polymerin metal derivatives from olive oil mill waste

waters. JAgric Food Chem., 50 (14), 4018-24p.

Cardinali A., Cicco N., Linsalata V., Minervini F., Pati S. &Pieralice M.

(2010).Compounds in the phenolic fraction of olive oil.Clinical Chemistry, 46, 976-988p.

Casa R., D'Annibale A., Pieruccetti F., Stazi S.R., GiovannozziSermanni G.,Lo Cascio B.

(2003) Reduction of the phenolic components in olive-mill wastewater by anenzymatic


51

treatment and its impact on durum wheat (Triticum durum Desf.) germinability.Chemosphere,

50 (8), 959-66p.

COI. (2015). Statistique de la production d’huile olive. Novembre 2015.

Dermeche S., Nadour M., Larroche C., moulti-mati F. andMichaud P. (2012). Olive

mill wastes : Biochemical characterizations andvalorisatio strategies. Process

Biochemistry.,48 :1532-1552p.

Dermeche, S., Nadour, M., Larroche, C., Moulti-Mati, F. & Michaud, P. (2013).Olive

millwastes: Biochemical characterizations and valorization strategies. Process Biochemistry,

48,1532-1552p.

Di-Giovacchino L., Mascolo A., Seghitti L. (1988) Sullecaractteristiche telle delle acque

divegetazione delle olive. La Rivista delle Sotanze Grasse. 65p.

De Felice, B., Pontecorvo, G., Carfagna, M., Acta Biotechnol 17(1997) 231p.

De Villers Juliette., Squilbin Marianne., Yourassowsky Catherine. 2005. Fiche 2

del'IBGE(Institut Bruxellois pour la Gestion de l'Environnement ) : "L'eau à Bruxelles"

DiamonetF., 2002.- Dictionnaire Larousse médicale. pp : 831p.

Di Serio M. G., Lanza B., Mucciarella M. R., Russi F., Iannucci E., Marfisi P. etMadeo

A., 2008. Effects of olive millwastewaterspreading on the physico-chemical

andmicrobiologicalcharacteristics of soil. International Biodeterioration and Biodegradation.

62:403-407p.

El Hajjouji H, Fakharedine N, Baddi G.A, Winterton P, Bailly J.C, Revel J.C et Hafidi

M. (2007). Treatmentof olive mill waste water by aerobic biodegradation: an analytical study

using gel permeation chromatography, ultraviolet-visible and fourier transforme infrared

spectroscopy. Bioresource Technology. 98: 3513-3520p.

Eroglu E., Eroglu I., Gunduz U. &Yucel M. (2009). Treatment of olive mill


52

wastewater by different physicochemical methods and the utilization of their liquid effluents

for biological hydrogen production. Biomass Bioenerg, 334, 701–5p.

Fadil K., Chahlaoui A., Ouahbi A., Zaid A., Borja R. (2003) Aerobic biodegradation and

detoxification of wastewaters from the olive oil industry. International biodeterioration&

biodegradation, 51, 37-41.

Fenice M., GiovannozziSermanni G., Federici F., D'Annibale A. (2003) Submerged and

solid-state production of laccase and Mn-peroxidase by Panustigrinuson olive mill

wastewater-based media. J Biotechnol, 100 (1), 77-85

Fiestas Ros de Ursinos J.A., Borja R. (1992). Use and treatment of olive mill

Wastewater : Current situation and prospects in Spain. Grasas y Aceites, 2 : 101-106.

Fiorentino F., Garofalo A., De Santi G., Bono., G.B.GiustoG.Norrito (2003) Spatio-

temporel distribution of recruits (o group) of Merluccius and Phycisblennoides (Pisces ;

Gadiformes) in the Strait of Sicily (Central Mediterranean). Hydrobiologie 503 :223-236p.

Francesco G.L. (1993). Evaluations économiques sur l’innovation technologique.

Lesproblèmes de l’environnement dans le lecteur oléicole en Italie. Olivae, 47, 15-20p.

Galanakis C.M., Tornberg E. & Gekas V. (2009). Dietary fiber suspensions from olive

millwastewater as potential fat replacements in meatballs. LWT- Food SciTechnol, 1–

8.GalanakisC. M.., Tornberg E. and Gekas V. (2010). A study of therecovery of the dietary

fibres from olive mill wastewater and the gelling ability ofthe soluble fibre fraction. LWT -

Food Sci. and Techn., 43 : 1009-1017.

Garcia Garcia I, Jimenez Pena PR, Bonilla Venceslada JL, Martin Martin A, Martin

Santos MA, Ramos Gomez E.(2000) Removal of phenol compounds from olive


53

millwastewater using Phanerochaetechrysosporium, Aspergillusniger, Aspergillusterreusand

Geotrichumcandidum. Process Biochem, 1, 35 (8), 751-758p.

GarridoHoyos S.E., MartinezNieto L., CamachoRubio F., RamosCormenzana A.

(2002)Kinetics of aerobic treatment of olive-mill wastewater (OMW) with Aspergillusterreus.

Pro.Biochem.,37, 1169-1176p.

Gharsallah N. (1993) Production of single cell protein from olive mill wastewater by

yeasts.Environ. Technol., 14, 391-395p.

Gharsallah N., Labat M., Aloui F., Sayadi S. (1999) the effect of

Phanerochaetechrysosporium pretreatment of olive mill wastewaters on anaerobic digestion.

RessourcesConservation and recycling, 27, 187-192p.

Guezlane-Tebibel N., Kahlouche B.,Athmani- Guemouri S .(2015) Microbilogie travaux

pratique 7 éme

édition 34p .

Hamdi M. (1991a) Nouvelle conception d’un procédé de dépollution biologique des

margines, effluents liquides de l’extraction de l’huile d’olive, Thèse de l’université de

Provence. Marseille, France.

Hamdi M. (1993a) Future prospects and constraints of alive mill waste waters use

andtreatment : A. Review. Bioprocess Engineering, 8, 209-214p.

Hamdi M. (1993c) Valorisation et épuration des effluents des huileries d’olives: l’utilité de

lamicrobiologie industrielle. Olivae, 46, 20-24p.

Hamdi M., Garcia J.L., Ellouz R. (1992) Integrated biological process for olive millWaste

waters treatment. Bioprocess.Eng., 8, 79p.

Hamdi M., Ellouz P. (1993) Treatment of detoxified olive mill wastewater’s by

anaerobicfilter and aerobic fluized bed processes. Environ. Technol., 14, 183-188p.

Hazzit, M. (2008). Etude de la composition chimique des huiles essentielles de différentes


54

espèces de thym et d’origan poussant en Algérie. Thèse de doctorat, Université des Sciences

etde la Technologie Houari Boumediene, Faculté de Chimie, Algérie, 204 p.

J.A.Fiestas Ros de Ursinos ; Différentes utilisations des margines. Actes du Séminaire

International sur la valorisation des sous-produits de l’olivier. Organisation des Nations Unies

pour l’Alimentation et l’Agriculture (FAO), Tunisie (1981), 93-110p.

JOFFIN J. N. et LEYRAL G., (2006). Microbiologie technique, Tome1 : Dictionnaire des

techniques, 4ème édition. Edition CRDP d’aquitaire. 368p.

Kapellakis L. E., Tsagarakis K. P., Crowther J. C. (2008). Olive oil history,production

and by-product management. Review in enviremental science biotechnology, 7(1),1-26p.

Karapinar M, Worgan M.J.T, (1989). Bioprotein production from the waste products

ofolive oil extraction,J. Chem. Tech. Biotechnol, 33, 185-188p.

Kissi M., Mountadar M., Assobhei O., Gargiulo E., Palmieri G., Giardina P., Sannia G.

(2001) Roles of two white-rot basidiomycete fungi in decolorisation and detoxification of

olive mill waste water. ApplMicrobiolBiotechnol., 57 (1-2), 221-6p.

Klibanov A.M., Tu T.M., Scott K.P. (1983) Peroxidase catalysed removal of phenols from

coal-conversion waste water’s. Science, 22, 259-261p.

Leger C.L., Kadiri-Hassani N., Descomps B. (2000) Decreased superoxide anion

production in cultured human promonocyte cells (THP-1) due to polyphenol mixtures from

olive oil processing wastewaters. J Agric Food Chem., 48 (10), 5061-7p.


55

Levy E., Eyal Z., Chet I etHochman A. (1992).Resistance mechanisms of Septoriatritici to

antifungal products of Pseudomonas. Physiol. Mol. Plant Pathol. 40:163-71p.

Levis-Menzi R., Raffaldi R., Saviozzi A., Cardelli R. (1995) Decomposition

ofanaerobically digested olive mill sludge, Environmental. Science, 7, 1411-1422p. Lutwin

B, Fiestas Ros De Ursinos J A, Geissen K, Kachouri M, Klimm E, DeLadordeMonpezat

G, Xanthoulis D, (1996). Les expériences méditerranéennes dans letraitement et

l’elimination des eaux residuaires des huileries d’olives, Edition (GTZ) Gmbh,Eschborn,

RepubliqueFederale d’Allemagne.

Morillo J. A., Antizar-Ladislao B., Monteoliva-Sánchez M., Ramos-Cormenzana A.,

Russell N. J. 2009.Bioremediation and biovalorisation of olive-millwastes.

AppliedMicrobiololgyBiotechnolology, 82 : 25–39p.

Martinez-Garcia G., Bachmann R.T., Williams C.J., Burgoyne A., Edyvean

R.G.J.(2006).Olive oilwaste as a biosorbent for heavymetals.InternationalBiodeterioration

etBiodegradation, 58, 231-238p.

Metahri M.S. (2012). Elimination simultanée de la pollution azotée et phosphatée des

eaux usées Traitées, par des procédés mixtes. Cas de la STEP Est de la ville de Tizi-Ouzou.

Thèse de Doctorat. Université Mouloud Mammeri. 148p.

Minzi, R., Saviozzi A., Riffaldi R., Falzo L. (1992). Lo smaltimento in

campodelleacquedivegetazione. Effettisulleproprieta` de l terreno.Olivae. 40: 20-25p.

Mébirouk M. (2002) Rejets des huileries, développement d'un procédé intégré pour la

biodégradation des polyphénols dans les margines .CMPP NEWS n°1.

Mendil, M., 2009. L’oléiculture: Experiences algériennes. Filaha Innove 4, 6, 23p.

Michaud P. (2012). Olive millwastes : Biochemicalcharacterizations and

valorisatiostrategies. ProcessBiochemistry., 48 :1532-1552p.

Monties B. (1980) Les polymères végétaux. Gautier-Villars (eds).


56

MorilloJA ,Antizar-Ladislao B., Monteoliva-Sa´Nchez M., Ramoscormenzana A.,

Russell NJ. (2009). Bioremediation and biovalorisation of olive mill wastes.

ApplMicrobiolBiotechnol, 82:25–39p.

Mouncif M., Tamoh S., Faid M., Achkari-Begdouri A. (1993a). A study of chemicaland

microbiological characteristics of olive mill waste water in Morocco.Grasas y Aceites,44,

335-338p.

Madigan M., Martinho J. (2007). Brock : Biologie des micro-organismes. 11ème édition,

Pearson Education, Paris.

Nefzaoui A. (1984). Importance de la production oléicole et des sous-produits del'olivier. In

: Etude de l'utilisation des sous-produits de l'olivier en alimentation animale enTunisie. Étude

FAO production et santé animales 43, Rome. Nefzaoui A. (1987).

Contribution à la rentabilité de l’oléiculture par la valorisationoptimale des sous-produits,

séminaire sur l’économie de l’olivier. Tunis, 20-22 Janvier.Science et Technique, Olivaen° :

19.

Nefzaoui A. (1991). Valorisation des sous produits de l’olivier. Optionméditerranéennes.

Série n 16 : 101-108p.

Niaounakis M, Halvadakis CP (2004) Olive millwaste management. Literature

ReviewandPatent Survey.Typothito-George Dardanos. Athens, Greece, pp xiv, 430p.

Niaounakis M., Halvadakis C.P. 2006. Olive processing waste management: literature

review and patent survey, second ed. Elsevier, Amsterdam.

ObiedH., Allen M., Bedgood D., Prenzler P., Robards K. andStockmannR. (2005).

Bioactivity and analysis of biophenols recovered fromolive mill waste. J. of agrical. Food

Chem., 53: 823-837p.


57

Oukili O., Chaouch M., Rafiq M., Hadji M., Hamdi M., Benlemlih M. (2001) Bleaching

of olive mill wastewater by clay in the presence of hydrogen peroxyde. Ann. Chim. Sci. Mat.

26, 45-53p.

Pozo C., Martinez-Toledo M.V., Rodelas B., Gonzalez-Lopez J. (2002) Effects of culture

conditions on the production of polyhydroxyalkanoates by AzotobacterchroococcumH23 in

media containing a high concentration of alpechin (wastewater from olive oil mills) as

primary carbon source. J. of Biotechnology, 97, 125-131p.

Rodier J. (1984). L’analyse de l’eau eaux naturelles, eaux de mer, 7éme édition

Dunod,Rordas Paris, France, 1365p.

Rodier J., Legube B., Merlet N. (2009). L’analyse de l’eau, 9ème Ed, DUNOD, Paris.

1525p.

Ribéreau-Gayon P. (1968). Les composés phénoliques des végétaux, Facultad de

Agronomía. Dunod. París.254p.

Rodier J., 1959, « L'analyse de l'eau », édition DUNOD, Paris.

Ramos-Cormenzana A. (1986) Physical, chemical, microbiological and biochimical

characteristics of vegetation water. In: Inter. Symp.: On olive by-products valorization.

Sevilla-Spain.41-60p.

Ranalli A. (1991a) The effluent from olive mills: Proposals for re-use and purification with

reference to Italian legislation. Olivae, 37 , 30-39p.

Ranalli A. (1991). The effluent from olive mills: Proposals for re-use and purification with

reference to Italian legislation. Olivae, 39, 26-40p.

Rožman,T., Jeršek, B.(2009).Antimicrobial activity of rosemary extracts (Rosmarinusofficinalis

L).against different species of Listeria. ActaagriculturaeSlovenica, 93(1), pp.51-58.In Kehal, F.

2013. Utilisation de l’huile essentielle de Citrus limon comme agent conservateur et aromatique

dans la crème fraîche. Mémoire de magister. Université Mentouri Constantine.Algérie, 93p.


58

SALVEMINI F. (1985) Composizionechimica e valutazionebiologica di

unmangimeottenutoessicandotercamente le acque di vegetazionedelle olive. Riv. Delle

SostanzeGrasse, 112 : 559-564p.

SANCOUCY R. (1984). Utilisation des sous-produits de l'olivier en alimentation

animaledans le bassin Méditerranéen. Étude FAO Production et santé animale Synthèse no.

43FAO Pub Rome.

Sayadi S., Ellouz R. (1992) Decolouration of olive mill wastewaters by the white-rot

fungusPhanerochaetechrysosporiuminvolvement of the lignin-degrading system. Appl.

Micrbiol.Biotechnol.,37, 813-817p.

Sayadi S., Ellouz R. (1995) Role of lignin peroxidase and manganese peroxidase

fromPhanerochaetechrysosporiumin the decolorization of olive mill waste-waters. Applied

andEnvironmental Microbiology, 61, 1098-1103p.

Sayadi S., Allouche N., Jaoua M., Aloui F. (2000) Detrimental effects of high

molecularmass polyphenols on olive mill wastewater biotreatment, Process Biochemistry, 35

(7), 725-73p5.

SINGLETON P., (1999), Bactériologie, Edition Duonod 4ème édition Paris. 415p.

Sbai G., Loukli M.,2015. traitement électrochimique des margines et identification

descomposes avant et apres traitement par chromatographie en phase gazeuse couplée

parspectroscopie de masse. Larhyss Journal. 22 : 139-152p.

Tekfi K, 2006, « étude des performances épuratoires d’une station d’épuration des boues.

activées », mémoire pour l’obtention de diplôme de DEUA. Option traitement et épuration de

l’eau, département hydraulique, université Tlemcen.

Tanchev S., Joncheva N., Genov N., Codounis M. (1980) Identification of anthocyanins

contained in olives. GeorgikeEreuna, 4, 5-73p


59

Thierry E. (1997). Les infections microbiennes. Eds. Nathan, Paris, (1), P : 128. -

TORTORA G .J., FUNKE B.R. et CASE C. L., (2003).Introduction à lamicrobiologie. Ed.

de Renouveau pédagogique Inc. pp : 157- 355p.

Tsagariki E., Harris N., Lazarides et Konstantinos B. P. (2007). Olive mill wastewater

treatment.Sprigerlink, 133-157p.

Tsioulpas A., Dimou D., Iconomou D., Aggelis G.(2002) Phenolic removal in olive

millwastewater by strains of Pleurotus spp. In respect to their phenol Oxidase (laccase)

activity.BioresourceTechnology, 84, 251-257p.

Vazequez R.A. (1978) Les polyphénols de l’huile d’olive et leur influence sur les

caractéristiques de l’huile, Revue française des corps gras, 25 (1), 21-26.

www.google dz.com

ZahariA., Tazi A., Azzi M. (2014). Optimisation des conditions de traitement desmargines

par un superoxydant K3FexMnyO8 [Optimization of treatment conditions ofOlive Oil Mill

Wastewater by superoxidant K3FexMnyO8] .J. Mater. Environ. Sci., 5 (2)484-489p.

Zenjari B., Hafidi M., El Hadrami Bailly J.P., Nejmeddine A. (1999). Traitement

aérobie des effluents d’huilerie par les micro-organismes du sol. Agrochimica, 43(5/6), 277p.

http://www.google/

Annexe

Milieux de cultures utilisées pour l’étude microbiologique

● Gélose nutritive ordinaire

- Peptone 10 g/l

- Extrait de viande 5 g/l

- Chlorure de sodium 5 g/l

- Agar-agar 15 g/l

- pH 7,2

Le milieu est stérilisé à 120 °C pendant 20 min

● Gélose Chapman.

- Tryptone 5g/l

- Extrait de levure 3g/l

- Extrait de viande 3g/l

- Chlorure de sodium 70g/l

- Peptone Bactériologique 10g/l

- Mannitol 10g/l

- Rouge de Phénol 0,05g/l

- Agar: 7,4±0,1

Stérilisé à 120°C pendant 20 min.

● Milieu mannitol mobilité

- Peptone 20g

- Gélose 4g

- Mannitol 2g

- Rouge de phénol 0,04g

- Nitrate de potassium 1g

- pH 8,1

Le milieu est réparti dans des tubes à essais, stérilisé à 120 °C durant 15 min.

● Milieu Clarck et Lubs

- Peptone thropsine de caséine 5g/l

- Glucose 5g/l

- Phosphate bipotassique 5g/l

Répartir en tube à raison de 5 ml par tube.

Stériliser à 115° C pendant 20 mn.

Annexe

● Bouillon Nitrate réductase

- Infusion coeur-cervelle 25,0 g/l

- Nitrate de sodium 10,0 g/l

● Milieu TSI

- Agar 12g/l

- Extrait de boeuf 3g/l

- Extrait de levure 3g/l

- Peptone 20g/l

- Lactose 10g/l

- Saccharose 10g/l

- NaCl 5g/l

- Glucose 1g/l

- Citrate ferrique 3g/l

- Thiosulfate de sodium 3g/l

- Rouge de phénol 0.025g/l

- pH 7.4

Stériliser à 120°C pendant 20min.

● Citrate de Simmons

- Chlorure de sodium 5g/l

- Sulfate de magnésium7420 0.2 g/l

- Phosphate d’ammonium PO2H2 1g/l

- Phosphate dipotassique PO4HK2 2g/l

- Citrate trisodique 2 g/l

- Solution de bleu bromothymol 8g/l

- Agar 15 g/l

- pH 7-7,2.

Répartir en tube à raison de 7 ml par tube et Stériliser à 120°C pendant 30 min.

● Muller Hinton

- Extrait de viande 3g/l

- Hydrolysat acide de caséine 17,5g/l

- Amidon 1,5g/l

- Agar 16g/l

- pH 7,3

Stérilisé à 120°C pendant 20 min.

Annexe

● Milieu Oxytétracycline Glucose Agar (O.G.A)

-Extrait de levure 5g

-Glucose 20 g

-Agar 16g

-Eau distillée 1000ml

-pH 6,8-7

Stériliser 20 min à 120°C

Ajouter au milieu refroidi à 50°C une solution d’Oxytétracycline (terramycine). La

concentration en Oxytétracycline doit être de 0 ,10 mg/ml de milieu de culture. Incubation ;

20à 25°C pendant 2 à 5 jours.

Milieu d’identification de levure

● Milieu eau de levure

-Extrait de levure 5g

-Eau distillée 1000 ml

Ajuster à pH 7

Stériliser 20min à 120°C

● Eau physiologique :

-Chlorure de sodium 8,5g

-Eau distillée 1000ml

Stériliser après mélanger à l’autoclave pendant 15 minutes à 120 °C

● Eau peptone exempte d’indole

-Chlorure de sodium 5g

-Peptone exempte 10g

-PH 7.2

Résumé

Abstract

The physicochemical characterization of the vegetable waters, which comes from the

modern industrial unit of trituration of olives by three-phase centrifugation, of the region of

Ghardaia, has shown that this effluent is too much loaded with organic matter evaluated in

terms of COD (1300 mg O2 / 1). It is also characterized by an acidic pH (4.8) and a high level

of phenolic compounds (2.2 μg / ml).

The microbiological study of these vegetable waters has made it possible to isolate three

Gram-positive bacterial strains (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis and

Bacillus subtilis) and five types of fungi (Penicillium sp, Aspergillus niger, Aspergillus

ochraceus, Aspergillus fumigatus and Penicillium chrysogenum), and a single species of yeast

Saccharomyces cerevisiae.

Liquid-liquid extraction was performed using ethyl acetate. Assays for total polyphenols

were determined by the Folin-Ciocalteu method. Antibacterial activity was determined by the

agar diffusion method against strains isolated from vegetable waters. Unlike clinically

sensitive bacteria that were sensitive to varying degrees of phenolic extracts, we were able to

show that our strains are resistant to phenolic compounds.

Key words: Margines, 3-phase extraction, polyphenols, antibacterial activity, molds, yeasts,

isolation.

Nom et Prénom : Lamraoui Imane

Nom et Prénom : Kaddour Ilham

Date de soutenance : 18/06/2018

Diplôme de master en microbiologie appliquée

Intitulé

Caractérisation microbiologique biochimique d’une eau de végétation (margine)

Résumé :

La caractérisation physico-chimique des margines qui provient de l’unité industrielle

moderne de trituration d’olives par centrifugation à trois phases, de la région de

Ghardaïa, a montré que cet effluent est trop chargé en matières organiques évaluées

en terme de DCO (1300 mg O2/l.). Il est caractérisé aussi par un pH acide (4.8) et un

taux élevé en composés phénoliques (2,2 ug/ml).

L’étude microbiologique de ces margines a permis d’isoler trois souches

bactérienne Gram positif (Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermidis et

Bacillus subtilis) et cinq types de champignons (Penicillium sp , Aspergillus niger,

Aspergillus ochraceus , Aspergillus fumigatus et penicillium chrysogenum), et une

seule espèce de levure Saccharomyces cerevisiae.

Une extraction liquide-liquide a été effectuée, en utilisant l’acétate d’éthyle. Les

dosages des polyphénols totaux ont été déterminés par la méthode de Folin-Ciocalteu.

L’activité antibactérienne a été déterminée par la méthode de diffusion sur gélose vis-

à-vis des souches isolées à partir des margines. Contrairement aux bactéries d’origine

clinique qui étaient sensibles aux extraits phénoliques à des degrés variables, nous

avons pu montrer que nos souches sont résistantes aux composés phénoliques.

Mots clés : Margines, extraction à 3-phases, polyphénols, activité antibactérienne,

moisissures, levures, isolement

Devant les membres de jury :

Président : ZOUAINIA Sabrina M.C.B. Univ. Oum EL Bouaghi.

Rapporteurs : ARHAB RABAH. Pr. Univ. Oum EL Bouaghi.

Examinateur :MEDJOUDJ Hacene. M.C.B. Univ. Oum EL Bouaghi.

d’une eau de végétation (margine)

Documents