DÉTERMINATION QUANTITATIVE D’ANTIBIOTIQUES (CHLORTÉTRACYCLINE, OXYTÉTRACYCLINE, TYLOSINE) DANS QUELQUES TYPES DE FUMIERS DE FERME ENRICHIS ARTIFICIELLEMENTOXYTÉTRACYCLINE, TYLOSINE) DANS QUELQUES TYPES DE FUMIERS DE FERME
ENRICHIS ARTIFICIELLEMENT
Mémoire de maîtrise présenté à la Faculté des études supérieures de l’Université Laval
dans le cadre du programme de maîtrise en Microbiologie agricole pour l’obtention du grade de Maître ès sciences (M.Sc.)
DÉPARTEMENT DES SOLS ET DE GÉNIE AGROALIMENTAIRE FACULTÉ DES SCIENCES DE L’AGRICULTURE ET DE L’ALIMENTATION
UNIVERSITÉ LAVAL QUÉBEC
Résumé
Les hormones et les antibiotiques administrés aux animaux d’élevage peuvent
contaminer les terres agricoles et parfois les plantes lors de l’épandage du fumier. Pour
déterminer les concentrations d’antibiotiques dans les fumiers de ferme, il est important
d’élaborer une méthode d’extraction et de détection fiable, rapide et peu coûteuse. Dans la
présente étude, des méthodes d’extraction liquide et les ultrasons ont été employés pour
extraire l’oxytétracycline (OTC), la chlortétracycline (CTC) et la tylosine (TYL) dans
quelques fumiers de ferme enrichis en OTC, CTC et TYL. Plusieurs paramètres ont été
analysés pour optimiser les méthodes d’extraction d’antibiotiques développées par
Blackwell et al. (2004b) : la longueur d’onde de détection, la dégradation des antibiotiques
dans le méthanol, le type de fumiers, le temps de contact entre l’antibiotique et le fumier, la
concentration en solutés, le volume de la solution extractive, la température d’extraction et
le type de méthode SPE (Solid phase extraction). La détection a été effectuée par LC-UV.
Après un ajout de 20 ppm d’antibiotiques, les taux d’extraction de l’OTC, de la CTC et de
la TYL étaient respectivement de 79,4 ± 0,4 %, 58,9 ± 1,3 %, 40,7 ± 1,5 % pour le fumier
de porc frais et de 72,2 ± 10,8 %, 40,2 ± 3,7 % et 49,6 ± 4,2 % pour le fumier de bovin de
boucherie frais. Quant au fumier lyophilisé, les taux d’extraction étaient de 81,7 ± 32,3 %
et de 55,7 ± 4,7 % pour l’OTC et la CTC respectivement. D’autres techniques ont été
testées à savoir l’ELISA, le LC-MS et le FT-NIR. L’utilisation de l’ELISA pour la
détection de CTC et de TYL est possible, mais la variabilité entre les répétitions est élevée.
Des enrichissements allant de 1,4 à 75 ppm en CTC dans des fumiers préalablement
lyophilisés et broyés à 1mm ont été analysés par FT-NIR (Fourier transform near-
infrared). Des régions spécifiques ont été sélectionnées et le modèle de régression PLS
(Partial least square) a permis la prédiction des données (validation). Selon les lignes
directrices interprétant des indices de précision (r2, RPD, RER), le FT-NIR peut être
utilisable pour la plupart des applications, car sa classification est acceptable et son filtrage
non précis.
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Avant-Propos
Ce mémoire fait suite à deux années de travail, de recherche, de curiosité et de
dynamisme. Le projet ciblant initialement une simple méthode de détection des
antibiotiques nous a tôt fait comprendre que tout ne serait pas aussi simple. Cela nous a
donné l’opportunité de toucher et de découvrir plusieurs méthodes d’extraction et
techniques de détection.
Je tiens d’abord à remercier mon directeur de recherche, le Dr Antoine Karam, pour
son grand respect, ses patientes explications et sa direction dans le projet, ainsi que mes
examinateurs Dre Muriel Subirade et Dr Richard Hogue pour avoir accepté d’évaluer le
mémoire. Je remercie aussi Nicolas Samson pour le travail sur le terrain, Marie-Ève
Tremblay pour la formation sur le FT-NIR, Alain Gaudreau pour la formation et le soutien
technique avec le LC-UV, Pascal Dubé pour l’analyse au LC-MS ainsi que la Dre Claudia
Sheedy pour ses conseils dans la compréhension de la technique ELISA. Pour avoir fourni
des échantillons de fumier sans antibiotique, je remercie également la « Ferme Saint-
Joseph » de Saint-Alban dans la région de Portneuf et la « Ferme Côté et fils senc. » de
Cacouna dans la région du Bas Saint-Laurent. Enfin, je tiens à remercier nos partenaires de
la ferme Dolbec, sans eux, le projet sur la détermination quantitative d’antibiotiques dans
des fumiers de ferme n’aurait pu avoir été réalisé.
Ce mémoire est divisé en sept chapitres. Le premier débute avec une introduction, et
la présentation des hypothèses et de l’objectif du projet de recherche. Le deuxième chapitre
comporte une revue de littérature et explique les propriétés physico-chimiques des
antibiotiques. Ce chapitre aborde également les techniques d’extraction et de détection des
antibiotiques ainsi que les facteurs affectant l’extraction des antibiotiques. Les chapitres
suivants traitent de différentes méthodes utilisées pour la détection des antibiotiques. Le
chapitre trois porte sur une méthode basée sur les immunoessais (ELISA). Les deux
chapitres suivants présentent des méthodes chromatographiques : LC-MS (chapitre 4) et
LC-UV (chapitre 5). Le dernier chapitre présente une méthode spectroscopique FT-NIR
iv
(chapitre 6). Enfin, le chapitre sept est une conclusion générale qui résume les principaux
résultats en fonction des objectifs, des hypothèses et des perspectives du travail.
v
Ce mémoire est dédié à mon père
« Celui qui se perd dans sa passion a moins perdu que celui qui perd sa passion »
Alexandre Jardin
Chapitre 3: Extraction et dosage de deux antibiotiques (chlortétracycline et tylosine) par la méthode ELISA........................................................................................................41 3.1 Matériel et Méthodes ....................................................................................................41
3.1.1 Fumiers ................................................................................................................41 3.1.2 Réactifs ................................................................................................................41 3.1.3 Matériel ................................................................................................................42 3.1.4 Méthodes ELISA .................................................................................................42
5.2.1 Extraction et dosage des antibiotiques.................................................................73 5.2.2 Adsorption de la CTC par le fumier de porc .......................................................90
5.3 Discussion ......................................................................................................................91 5.4 Conclusion .....................................................................................................................95 Chapitre 6: Détermination de la chlortétracycline par spectroscopie FT-NIR ............96 6.1 Matériel et Méthodes ....................................................................................................96
6.3 Discussion ....................................................................................................................111 6.4 Conclusion ...................................................................................................................112 Chapitre 7: Conclusion générale .....................................................................................113 Bibliographie .....................................................................................................................116 Annexes ..............................................................................................................................130 Annexe 1. Grille du suivi des pesées à exécuter lors de l’expérience ................................130 Annexe 2. Description des échantillons détectés par LC-UV à 285 nm.............................131 Suite Annexe 2. Description des échantillons détectés par LC-UV à 285 nm ...................132 Suite Annexe 2. Description des échantillons détectés par LC-UV à 285 nm ...................133 Suite Annexe 2. Description des échantillons détectés par LC-UV à 285 nm ...................134 Annexe 3. Chromatogrammes de la CTC dans l’eau (0-25 min) et extraite du fumier de porc (12-20 min) .................................................................................................................135 Annexe 4. Chromatogrammes de la CTC extraite du fumier de bovin de boucherie et de veau (12-20 min).................................................................................................................136 Annexe 5. Courbes standards de l’OTC, de la CTC à 285 nm...........................................137 Annexe 6. Courbe standard de la TYL à 285 nm ...............................................................138 Annexe 7. Courbes standards de l’OTC et de la CTC à 355 nm ........................................139 Annexe 8. Spectres et chromatogramme de la TYL analysée par LC-MS.........................140 Annexe 9 Extraction des antibiotiques à partir de fumier de porc......................................141 Annexe 10. Expériences de centrifugation (ELISA) ..........................................................142 Suite Annexe 10. Expériences de centrifugation (ELISA) .................................................143 Annexe 11. Équations de calculs des indices de précision du FT-NIR ..............................144 Annexe 12. Lignes directrices pour l’interprétation du coefficient de détermination (r2) et des ratios RDP et RER........................................................................................................145 Annexe 13. Spectres pur et différentiels de la CTC et des modifications dues à l’acétone146 Annexe 14. Programmation de l’appareil FT-NIR avec le logiciel Result Integration ......147
Liste des tableaux
Tableau 1. Ionisation de la chlortétracycline selon le pKa (Anderson et al., 2005). ...........18 Tableau 2. Solutions utilisées pour l’extraction de tétracyclines dans le fumier de porc et
leur taux de récupération...............................................................................................23 Tableau 3. Extraction de tétracyclines dans les aliments et leur taux de récupération........26 Tableau 4. Extraction de tétracyclines dans les sols et leur taux de récupération. ..............27 Tableau 5. Différentes températures et pressions pour l’extraction d’antibiotiques dans
l’environnement (sol, fumier, boue). ............................................................................29 Tableau 6. Protocole utilisant différentes méthodes publiées dans la littérature pour
l’extraction d’antibiotiques par la méthode SPE (Essai 1). ..........................................43 Tableau 7. Paramètres des procédures d’extraction et de purification des antibiotiques
(chlortétracycline, tylosine) pour la détection ELISA. .................................................45 Tableau 8. Concentrations récupérées de la chlortétracycline (enrichissement de l’eau sans
fumier avec 250 ppb) après un passage dans différentes cartouches Oasis..................48 Tableau 9. Concentrations récupérées en chlortétracycline et en tylosine après
enrichissement en fonction de la courbe diluant les standards dans le tampon fourni par la compagnie (courbe 1) et en fonction de la courbe diluant les standards dans le contrôle négatif extrait de fumier de porc (courbe 2). ..................................................50
Tableau 10. Taux de récupération de deux antibiotiques détectés par LC-MS à partir d’échantillons de bovins de boucherie lyophilisés préalablement enrichis. .................59
Tableau 11. Paramètres de l’extraction et de la détection des antibiotiques évalués par LC- UV.................................................................................................................................66
Tableau 12. Type de méthode SPE et les modifications apportées au protocole de Blackwell et al. (2004a). ...............................................................................................69
Tableau 13. Programmation utilisée pour la quantification des antibiotiques par LC-UV. 70 Tableau 14. Principaux pics révélés par balayage du spectre d’antibiotiques (190 à 600
nm). ...............................................................................................................................73 Tableau 15. Quantité d’antibiotique (OTC, CTC) extraite du fumier de porc après
enrichissement de 20 ppm en fonction des longueurs d’onde (285 nm et 355 nm). ....75 Tableau 16. Type de matrices utilisées pour l’élaboration de trois différentes courbes
d’étalonnage et le nombre d’échantillons pour chaque type.........................................98 Tableau 17. Détection des liens chimiques de la CTC avec l’appareil FT-NIR dans
différentes matrices (eau, méthanol)...........................................................................103 Tableau 18. Détection des liens chimiques de la CTC avec l’appareil FT-NIR dans
différentes matrices (fumiers). ....................................................................................104 Tableau 19. Détection des liens chimiques de la CTC avec l’appareil FT-NIR dans
différentes matrices (fumiers). ....................................................................................105 Tableau 20. Performance du FT-NIR pour l’étalonnage de la CTC (ppm) à partir de
fumiers divers de bovin de boucherie, de bovin laitier et de veau* broyés à 1 mm...107 Tableau 21. Comparaison des techniques FT-NIR et LC-UV dans la détermination de la
CTC dans divers fumiers lyophilisés préalablement enrichis.....................................110 Tableau 22. Concentrations estimées en chlortétracycline et en tylosine après
enrichissement en fonction des valeurs d’absorbance ajustées au contrôle négatif utilisant la courbe diluant les standards dans le tampon fourni par la compagnie
ix
(courbe 1) et la courbe diluant les standards dans le contrôle négatif de l’extrait de fumier de porc (courbe 2). ..........................................................................................141
Tableau 23. Concentrations récupérées en chlortétracycline après enrichissement en fonction de la courbe diluant les standards dans le tampon fourni par la compagnie (courbe 1) et en fonction de la courbe diluant les standards dans le contrôle négatif de l’extrait de fumier de porc (courbe 2). ........................................................................142
Tableau 24. Concentrations estimées en chlortétracycline après enrichissement en fonction des valeurs d’absorbance ajustées au contrôle négatif utilisant la courbe diluant les standards dans le tampon fourni par la compagnie (courbe 1) et la courbe diluant les standards dans le contrôle négatif de l’extrait de fumier de porc (courbe 2)..............143
Tableau 25. Lignes directrices pour l’interprétation du coefficient de détermination (r2). ....................................................................................................................................145
Tableau 26. Lignes directrices pour l’interprétation des ratios RPD et RER dans l’industrie. ...................................................................................................................145
Liste des figures
boucherie enrichis, en fonction du temps d’extraction aux ultrasons (10, 20, 30 min). ......................................................................................................................................58
Figure 10. Schéma de l'extraction des antibiotiques............................................................71 Figure 11. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC) après extraction dans l’eau ou
du fumier de porc en fonction de la longueur d’onde. Extrait de fumier de porc (n = 11). Extrait aqueux (n = 5)............................................................................................76
Figure 12. Taux de récupération de la chlortétracycline (CTC) après extraction dans l’eau ou du fumier de porc en fonction de la longueur d’onde. Extrait de fumier de porc (n = 10). Extrait aqueux (n = 5)............................................................................................76
Figure 13. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC) des extraits aqueux et de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps d’attente dans le méthanol. Extrait de fumier de porc (n = 1). Extrait aqueux (n = 2). .......................77
Figure 14. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps d’attente dans le méthanol (n = 17, sauf pour la tylosine où n = 16). ......................................................................................................................................78
Figure 15. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC) en fonction du type de fumiers. Fumier de porc (n = 3, sauf pour la concentration de 20 ppm où n = 8). Fumier de bovin de boucherie (n = 3). Fumier de veau lyophilisé (n = 3 à 20 ppm). ..80
Figure 16. Taux de récupération de la chlortétracycline (CTC) en fonction du type de fumiers. Fumier de porc (n = 3, sauf pour la concentration de 20 ppm où n = 8). Fumier de bovin de boucherie (n = 3). Fumier de veau lyophilisé (n = 3 à 20 ppm). ..80
Figure 17. Taux de récupération de la tylosine (TYL) en fonction du type de fumiers. Fumier de porc (n = 3, sauf pour la concentration de 20 ppm où n = 8). Fumier de bovin de boucherie (n = 3). ...........................................................................................81
Figure 18. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps de contact. Expérience 1 (n = 1). Expérience 2 (n = 1, sauf pour le temps de 15 min où n = 2).......................................82
Figure 19. Taux de récupération de la chlortétracycline (CTC) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps de contact. Expérience 1 (n = 1). Expérience 2 (n = 1, sauf pour le temps de 15 min où n = 2).......................................83
Figure 20. Taux de récupération de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du temps de contact (n = 1)...............................................83
xi
Figure 21. Taux de récupération de l'oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC), de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction de la concentration en solutés de la solution extractive. Facteur 0,5 X (n = 2). Facteur 1 X (n = 8). Facteur 2 X (n = 4)....................................................................................85
Figure 22. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction du volume de la solution extractive. Volumes de 8 mL et de 16 mL (n = 4, sauf pour la tylosine où n= 2). Volumes de 16, 24, 40 et 48 mL (n = 2)......................86
Figure 23. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) de fumier de porc ayant reçu 20 ppm d’antibiotiques en fonction de la température du bain à ultrasons. Températures 25, 35, 40, 50, 60°C (n = 1). Température 43°C (n = 8). Température 45°C (n = 4). ...........................................87
Figure 24. Taux de récupération de l’oxytétracycline (OTC), de la chlortétracycline (CTC) et de la tylosine (TYL) après extraction dans de l'eau seulement, en fonction des types de méthodes SPE. Méthode 1 (n = 5). Méthode 2 (n = 2). Méthode 3 (n = 3). ............89
Figure 26. Quantité de chlortétracycline (CTC) adsorbée par les constituants du fumier de porc (Histogramme et échelle Y de gauche) et Taux de récupération de la chlortétracycline (CTC) adsorbée sur les constituants du fumier de porc (Losange et échelle Y de droite) exprimés en fonction de la quantité ajoutée .................................90
Figure 27. Données prédites versus données calculées pour la détermination de la CTC dans divers fumiers. ....................................................................................................108
Figure 28. Données prédites par validation croisée pour la détermination de la CTC dans divers fumiers. ............................................................................................................108
Figure 29. Quantification de l’OTC en fonction de l’aire sous la courbe..........................137 Figure 30. Quantification de la CTC en fonction de l’aire sous la courbe. .......................137 Figure 31. Quantification de la tylosine en fonction de l’aire sous la courbe. ..................138 Figure 32. Quantification de l’OTC en fonction de l’aire sous la courbe..........................139 Figure 33. Quantification de la CTC en fonction de l’aire sous la courbe. .......................139 Figure 34. Spectres des antibiotiques CTC (472) et TYL (918)........................................140 Figure 35. Chromatogramme de la TYL............................................................................140
12
Lexique
CTC Chlortétracycline DOXY Doxycycline ELISA Enzyme linked immunosorbent assay = Dosage d'immunosorption liée à enzyme ESI Electrospray ionization = Ionisation avec détection de conductivité supprimée FAB Fast atom bombardment = Bombardement atomique rapide FT-NIR Fourier transform-near infrared = Proche infrarouge à transformée de Fourier FT-MIR Fourier transform-mid infrared = Moyen infrarouge à transformée de Fourier FT-MS Fourier transform-mass spectrometry = Spectrométrie de masse à transformée de
Fourier IT Ion traps = Piège d’ions LC-UV Liquid chromatography-ultraviolet = Chromatographie liquide à détecteur UV LC-MS Liquid chromatography-mass spectroscopy = Chromatographie liquide couplé à
un détecteur de masse simple quadripôle LC-MS/MS Liquid chromatography-mass spectroscopy / mass spectroscopy =
Chromatographie liquide couplé à un détecteur de masse en tandem MCAC Metal chelate affinity chromatography = Chromatographie d’affinité métal-
chélate OTC Oxytétracycline PBS Phosphate buffer saline = Tampon phosphate salin PLS Partial least square = Moindre carré partiel PRESS Prediction residual sum of squares = Somme des carrés résiduels de la prédiction RER Ratio error range = Étendue du rapport de l’erreur RPD Ratio of prediction deviation = Rapport de l’erreur-type de prédiction par
rapport à l’écart-type ou Erreur standard de prédiction RMSEC Root mean square error of calibration = Écart-type résiduel de calibration ou
Valeur moyenne de l’erreur quadratique de calibration RMSECV Root mean square error of cross-validation = Écart-type résiduel de la validation
croisée RMSEP Root mean square error of prediction = Écart-type résiduel de prédiction =
Valeur moyenne de l’erreur quadratique de prédiction SD Standard deviation = Écart-type SEC Square error of calibration = Erreur-type d’étalonnage ou Erreur quadratique de
calibration SEP Square error of prediction = Erreur-type de prédiction ou Erreur quadratique de
prédiction SPE Solid phase extraction = Extraction en phase solide SSQ Single-stage quadrupole = Simple quadripôle TOF Time-of-flight = Temps de vol TP Température de la pièce TSQ Triple-stage quadrupole = Triple quadripôle TYL Tylosine
13
Introduction
En agriculture, les antibiotiques sont utilisés non seulement pour guérir, mais aussi
comme agents prophylactiques, promoteurs de croissance et comme promoteurs d’efficacité
d’absorption de la nourriture en productions animales (Steinfeld et al., 2006). Leur
utilisation prévient plusieurs maladies chez l’animal d’élevage, lui apporte un certain
confort et améliore le rendement à la ferme. Néanmoins, leur abus de consommation et
l’application insuffisante des mesures d’hygiène ont engendré l’émergence d’une autre
menace : la résistance des micro-organismes (Levent et al., 2005 ; WHO, 2002). En effet, le
fumier utilisé comme fertilisant sur les terres agricoles est un réservoir de plasmides de
résistance aux antibiotiques transférables (Binh et al., 2008). Les statistiques sur les
antibiotiques démontrent l’ampleur d’une urgence de contrôle. En plus, un concept
menaçant a été élaboré sur la métabolisation des antibiotiques : les antibiotiques peuvent
être modifiés par oxydation, réduction, hydrolyse, conjugaison dans l’animal ; cependant ils
peuvent retrouver leur forme parentale plus toxique (Halling-Sørensen et al., 2002a).
Environ 80 % des antibiotiques administrés au bétail sont utilisés en prophylaxie ou
en promotion de croissance (Wallinga, 2002). Les animaux excrètent dans l’urine entre 50
et 80 % des composés antibiotiques sous forme presque inchangée (Aiello et al., 1998).
Pour la tétracycline administrée, jusqu’à 95 % sont excrétés (Kühne et al., 2000). Ces
antibiotiques rejetés dans le fumier et l’urine peuvent contaminer les terres et s’incruster
dans le cycle écologique. D’ailleurs, quelques recherches ont pu détecter des concentrations
de 0,005 à 20 mg/L de tétracycline, de 4,45 à 7,9 mg/L de CTC dans le fumier de porc
liquide (Kumar et al., 2004 ; Aga et al., 2003 ; Gupta et al., 2003) et de 0,1 à 46 mg/L de
CTC dans le fumier de porc lyophilisé (Martínez-Carballo et al., 2007). En conséquence,
les concentrations de tétracyclines restées à la surface du sol après des épandages répétés
sont en moyenne de 0,15 mg/kg (Hamscher et al., 2005).
14 Au Canada, il n’existe aucune restriction quant à l’usage des antibiotiques en
agriculture, mais le gouvernement assure une surveillance épidémiologique de la résistance
avec le PICRA1 et le groupe d’Edward Topp d’Agriculture et Agroalimentaire Canada qui
travaille sur la résistance des bactéries intestinales aux antibiotiques administrés aux
animaux d’élevage. Récemment au Québec, la CAAAQ2 a reçu des recommandations sur
les promoteurs de croissance (Poirier, 2007). Elles recourent au principe de précaution par
l’élimination graduelle des facteurs de croissance ; l’utilisation se base sur l’efficacité, la
dose, la durée de l’antibiotique ainsi que le rapprochement avec les molécules en thérapie
humaine (Poirier, 2007). Le Canada a su identifier des champs de recherches prioritaires,
dont celle de développer les méthodes d’analyses chimiques et biologiques (Servos et al.,
2002 ; Santé Canada, 2002). Les travaux de recherche portant sur l’extraction
d’antibiotiques de fumiers ou de sols amendés avec du fumier présentent une grande
variabilité. Le but du projet de recherche vise à optimiser une méthode de détection
d’antibiotiques afin d’établir un contrôle environnemental des antibiotiques dans les
fumiers de ferme.
1 PICRA Programme Intégré Canadien de la Résistance des Antibiotiques 2 CAAAQ Commission sur l’Avenir de l’Agriculture et de l’Agroalimentaire Québécois
15
Hypothèses de recherche
1. La méthode de Blackwell et al. (2004b) permet d’extraire l’oxytétracycline, la
chlortétracycline et la tylosine dans différents types de fumiers de ferme enrichis
artificiellement.
2. La détermination de la chlortétracycline et de la tylosine par LC-MS est influencée
par la température et le temps d’exposition du fumier enrichi d’antibiotiques dans
un bain à ultrasons.
3. La méthode ELISA peut détecter la chlortétracycline et la tylosine présentes dans le
fumier.
4. La méthode FT-NIR peut détecter la chlortétracycline dans différents types de
fumiers de ferme enrichis artificiellement.
Objectifs de recherche
1. Extraire trois antibiotiques dans quelques types de fumiers de ferme enrichis
artificiellement, et les doser à l’aide de l’une ou l’autre des méthodes suivantes :
ELISA, LC-MS, LC-UV ou FT-NIR.
2. Proposer une méthode de détection reproductible pour la détection d’au moins un
antibiotique dans quelques types de fumiers de ferme.
16
2.1 Propriétés physico-chimiques des tétracyclines
Dans la famille des tétracyclines, les composés sont amphotères et caractérisés par
trois pKa (Thiele-Bruhn, 2003). Les molécules sont hydrosolubles et non volatiles (Thiele-
Bruhn, 2003). La faible liposolubilité diminue les risques de bioaccumulation dans les
organismes. Chimiquement, les tétracyclines peuvent rester stables dans les milieux acides,
mais non dans les milieux alcalins ; elles forment aussi des sels dans les deux conditions
ioniques (Halling-Sørensen et al., 2002a). Tout comme pour les quinolones, les
tétracyclines sont photosensibles (Toriniainen et al., 1996 ; Davies et al., 1979 ; Mitscher
ed., 1978). Par contre, il a été démontré qu’une dissolution d’oxytétracycline (OTC), faisant
partie de la famille des tétracyclines, dans de l’eau Milli-Q sous condition lumineuse ne
présente pas d’effet de dégradation en cinq jours (Halling-Sørensen et al., 2002b) et que la
lumière n’était donc pas un facteur important de dégradation (Wu et Fassihi, 2005). La
photolyse des tétracyclines dépendrait d’autres facteurs dont le pH et le taux initial de
renouvellement d’oxygène (Wiebe et Moore, 1977). Des composés du groupe des
tétracyclines sont sensibles à l’hydrolyse et aux réactions d’oxydation (Halling-Sørensen et
al., 2002a). D’autre part, elles ont une certaine stabilité à travers une large gamme de
températures (Budavary ed., 1996). Le maximum d’adsorption dans le sol se trouve à un
pH de 4,3 ; elle diminue fortement à des pH au-dessus de 7 (Gu et al., 2007). Il a d’ailleurs
été observé que la sorption de l’OTC sur les solides de rivière était plus faible à pH 8,3 qu’à
pH 6,1 (Rose et Pedersen, 2005). La sorption peut s’expliquer par l’attraction
électrostatique aux charges négatives du sol et/ou par l’échange de cations (Jones et al.,
2005). Les antibiotiques peuvent migrer selon leur solubilité et leurs interactions avec la
matrice. Du côté environnemental, la sorption des tétracyclines au sol est plus forte à pH
acide. Dans un sol acide, la sorption peut diminuer avec la compétition cationique (Ter
Laak et al., 2006). L’ajout au sol de fumier enrichi en OTC a démontré une plus grande
17
concentration en surface du sol (De Liguoro et al., 2003). Dans une étude environnementale
sur les sols fertilisés avec du fumier, des concentrations de tétracyclines (TC) ont été
retrouvées dans les couches 0-10 cm (86,2 µg/kg), 10-20 cm (198,7 µg/kg) et 20-30 cm
(171,7 µg/kg) (Hamscher et al., 2002). La couche 30-90 cm et les eaux souterraines ne
contiennent pas de quantité détectable (Hamscher et al., 2002). La contamination semble
restée en surface. Dans le cas de la CTC, la translocation du fumier vers le sol minéral a été
démontrée, à de faibles niveaux de concentrations (Aust et al., 2008). Dans les sols riches
en matière organique, les tétracyclines sont susceptibles à migrer dans le profil de sol, car il
y a une suppression de la sorption avec une plus forte concentration en acides humiques
(Gu et Karthikeyan, 2008). Les facteurs influençant la sorption de l’OTC par le sol sont la
texture, la capacité d’échange de cations et le contenu en oxydes de fer et d’aluminium
(Jones et al., 2005 ; Thiele-Bruhn, 2003).
La structure moléculaire de la chlortétracycline (CTC) est constituée de quatre
anneaux à six membres en alternance de double liaison (Figure 1). La formule moléculaire
de la CTC est C22H23ClN2O8. Elle a un poids moléculaire de 478,89 g/mol (Budavary ed.,
1996).
La CTC possède trois valeurs de pKa soit 3,3, 7,3 et 9,1 et est un acide faible.
Tableau 1. Ionisation de la chlortétracycline selon le pKa (Anderson et al., 2005).
pH < pKa1 0, 0, + ionisation globale positive
pKa1 < pH < pKa2 -, 0, + ionisation globale neutre
pKa2 < pH < pKa3 -, -, + ionisation globale négative
pKa3 < pH -, -, 0 ionisation globale doublement négative
Le Kow est d’environ 0, ce qui lui confère un caractère hydrosoluble (Halling-Sørensen et
al., 2001). Sous forme d’hydrochlorure (C22H23ClN2O8*HCl), elle est encore plus
hydrosoluble et son poids moléculaire est alors de 515 g/mol.
L’action antibiotique de la CTC est à large spectre. La CTC agit en inhibant la
synthèse de protéines bactériennes. En effet, l’antibiotique empêche la liaison du ARN-
aminoacyl avec la partie A de la sous-unité 30S du ribosome (Chopra, 1985). Les
tétracyclines sont en général utilisées pour contrôler plusieurs bactéries Gram-positif et
Gram-négatif, et quelques protozoaires (Speer et al., 1992 ; Kiatfuengfoo et al., 1989). Le
substrat auréomycine (nom de commerce : chlortétracycline) a été isolé de l’actinobactérie
Streptomyces aureofaciens (Budavary ed., 1996 ; Duggan, 1948). Il est toxique pour la
moitié de la population de rats à une concentration de 10 300 mg/kg (Budavary ed., 1996).
À la ferme, l’utilisation de la CTC a un effet sur la croissance et sur l’efficacité
d’absorption de la nourriture pour les bovidés et les porcs (Gustafson et Kiser, 1985 ;
Bartley et al., 1953 ; Jukes et al, 1950). L’antibiotique prévient aussi les abcès du foie des
ruminants et la pneumonie par invasion de Mycoplasma hyopneumoniae (Gustafson et
Kiser, 1985 ; Switcher et Ross, 1975). Le coefficient de distribution (Kd) de la CTC se situe
entre 400 et 1620 L/kg. Par rapport à la tylosine (TYL) qui a un Kd de 8-128 L/kg, la CTC
s’adsorbe plus rapidement aux solides. Les forces de dispersion, les interactions polaires et
les ponts hydrogènes peuvent contribuer à diminuer la sorption pour une meilleure
solubilité (Pharmasolve, 1999). La stabilité de certains antibiotiques dans le sol a été
examinée et suggérée comme suit, par ordre de persistance : chlortétracycline > bacitracine
19
> érythromycine > bambermycine > tylosine > pénicilline et streptomycine (Gavalchin et
Katz, 1994). La persistance varie en fonction de l’antibiotique, mais aussi en fonction de la
matrice dans laquelle il se retrouve.
2.2 Méthodes d’extraction et de détection des antibiotiques
2.2.1 Généralités
Une seule méthode ne peut détecter les nombreuses classes d’antibiotiques présents
dans un produit. La première étape est donc de faire un screening test pour détecter la
présence d’antibiotiques (Neubert, 2006, entretien de Michael Petz). Le brilliant black test
est un milieu réducteur révélant les antibiotiques par un changement de couleurs (McEwen
et al., 1992). La deuxième étape est de faire des tests d’inhibition microbiologique qui
permettent de déterminer certains groupes d’antibiotiques. Cette technique est la base du
test de détection d’antibiotiques de l’Eclipse 100, créé par Zeu-Inmunotec. D’autres
techniques de détection ont été suggérées. Entre autres, un système d’électrophorèse
capillaire tandem spectrométrie de masse a été utilisé par Lara et al. (2006) afin de détecter
les fluoroquinolones dans le lait (Figure 3). Le test est d’une durée de 4 h. Puis, des tests
ELISA (Enzyme linked Immunosorbent Assay) (Figure 5), très sensibles, ont été
expérimentés ; néanmoins, ils sont difficilement quantitatifs (Aga et al., 2003). La HPLC
(High performance liquid chromatography) (Figure 4) et le MS (Mass spectroscopy)
permettent de détecter les antibiotiques ainsi que leur concentration respective. La HPLC a
une bonne sensibilité et une haute sélectivité (O’Connor et al., 2007), mais la méthode est
aussi laborieuse dans la préparation des échantillons et la séparation des antibiotiques.
D’ailleurs, l’utilisation de la SPE (solid-phase extraction) avec les cartouches SAX et HLB
est souvent une étape de purification et de concentration de l’échantillon ajoutée pour une
meilleure détection à la HPLC. Pour ce qui est de la spectroscopie à proche infrarouge, à
notre connaissance, Sivakesava et Irudayaraj (2002) sont les seuls à l’avoir expérimentée
pour la détection de la tétracycline, dans le lait. Cette technologie peut analyser plusieurs
échantillons en peu de temps, lorsque le spectrophotomètre est calibré adéquatement. Les
modèles de spectroscopie FT-MIR (Fourier Transform Mid-Infrared) et FT-NIR (Fourier
20
Transform Near Infrared) (Figure 3) avec le modèle de régression PLS (Partial Least
Square) avaient été utilisés.
©Beckman Coulter
Figure 2. Le Paragon CZE® 2000, un modèle de système d'électrophorèse capillaire.
Figure 3. Modèle Nicolet Antaris FT- NIR.
http://www.uams.edu/metabolites/images/Shimadzu%20HP LC.jp
Figure 4. Un modèle de High Performance Liquid Chromatography (HPLC).
Figure 5. Une plaque d’Enzyme linked Immunosorbent Assay (ELISA).
http://www.poultry- health.com/library/serodiss/elisa.htm
© PerkinElmer
21
2.2.2 Facteurs influençant l’extraction et les composantes de l’antibiotique
2.2.2.1 Les solvants d’extraction
La solubilité des tétracyclines est plus élevée dans les alcools comme le méthanol et
l’éthanol et varie dans les solvants organiques comme l’acétate d’éthyle, l’acétone,
l’acétonitrile (O’Neil ed., 2001; Mitscher ed., 1978). L’acétate d’éthyle a d’ailleurs été
exploité avec succès comme solvant d’extraction dans plusieurs publications ; néanmoins il
a été aussi critiqué pour un faible pourcentage de récupération dans le sol (Jacobsen et al.,
2006). D’autres solvants ont été testés : méthanol, acétonitrile, sulfoxide de diméthyle
(DMSO), acétone, dichlorométhane, tétrahydrofurane, isopropanol, méthyl t-butyl éther
(MTBE), hexane (Jacobsen et al., 2006). Les solvants les plus polaires sont les plus
prometteurs : méthanol, acétone, DMSO (Jacobsen et al., 2006). Le méthanol ajouté
d’acide trichloroacétique (TCA) a mieux performé que l’éthyle d’acétate et l’acétonitrile
dans le cas d’extractions dans le sérum (Iwaki et al., 1993). La solubilisation de la CTC par
divers solvants semble prendre cette tendance : méthanol > acétonitrile = 2-propanol >
acétone > acétate d’éthyle (Lindsey et al. 2001). La CTC est insoluble dans l’hexane
(Anderson et al., 2005). Elle a une solubilité de 0,5-0,6 mg/mL dans l’eau et est
relativement soluble dans le méthanol (Budavary ed., 1996). En utilisant la forme
hydrochlorure de la CTC, à 28°C, la solubilité augmente à 8,6 mg/mL dans l’eau, à 17,4
mg/mL dans le méthanol et à 1,7 mg/mL dans l’éthanol (Budavary ed, 1996).
Des cosolvants permettent d’augmenter la solubilité en réduisant la tension
interfaciale entre le caractère hydrophobe du soluté et la solution aqueuse (Yalkowsky et
al., 1975). L’ajout de 2-pyrrolidone a pu augmenter la solubilité de l’OTC sur toute
l’étendue de pH ; son efficacité se trouve surtout dans la zone plus acide et neutre
(Tongaree et al., 1999). À pH acide, l’OTC possède plusieurs protons à donner et des
groupes accepteurs qui interagissent avec la 2-pyrrolidone (Tongaree et al., 1999). La
forme zwitterion de l’OTC forme des interactions moléculaires et des auto-associations en
présence de cations (Tongaree et al., 1999). Néanmoins, ces interactions sont plus
22
négligeables dans les solvants polaires, l’eau interagissant alors avec le complexe (Day et
al., 1978). La 2-pyrrolidinone ne peut être considérée, car sa forme ressemble à celle de la
CTC ; dans des techniques comme l’ELISA, elle pourrait interférer dans les résultats.
Les solvants acides et organiques ainsi que la chaleur sont aussi utilisés pour la
précipitation des protéines (Anderson et al., 2005). L’acétonitrile a démontré une certaine
déprotéinisation et est utilisé dans plusieurs publications à cette fin (Blackwell et al.,
2004b ; Furusawa, 2004 ; Kawata et al., 1996).
2.2.2.2 Le pH de la solution extractive
La chlortétracycline est plus soluble à un pH basique > 8,5 (Budavary ed., 1996).
Cependant, elle y est instable (Stephens et al., 1954 ; Waller et al., 1952), surtout à des pH
entre 10 et 14 (Budavary ed., 1996). Au-dessus d’un pH de 8, l’anneau de la CTC s’ouvre.
À un pH < 3, l’antibiotique se déshydrate (Mitscher ed., 1978 ; McCormick et al., 1968).
De ce fait, des produits de dégradations se forment en fonction du pH. À des pH acides (2 à
6), l’épimérisation peut se produire en condition aqueuse et former des epiTCs et des keto-
CTC (Halling-Sørensen et al., 2002a ; Kühne et al., 2000). Celles-ci peuvent retrouver leur
forme initiale sous des conditions alcalines spécifiques et en présence d’un métal
complexant (Mitscher ed., 1978). Dans des conditions très acides, des anhydroTCs peuvent
aussi apparaître ; celles-ci restent en majorité stables. À un pH de 2, la tétracycline a une
forte solubilité (Wu et Fassihi, 2005), mais cette condition oblige la détection de produits
de dégradation dans la méthode. À un pH > 6,5, les produits sont principalement des iso-
TC, iso-CTC, keto-CTC, iso-OTC (Halling-Sørensen et al., 2002a). Certains résidus de
dégradation conservent un potentiel inhibiteur ou de résistance, sur les bactéries du sol ou
de la boue ; c’est le cas plus faiblement des iso-CTC et des ter-OTC (terrinolide : potentiel
inhibiteur imposé seulement contre les bactéries de boues) et plus fortement des
anhydroTC, anhydroCTC (Halling-Sørensen et al., 2002a).
En laboratoire, un tampon acétate de pH 8 avec un mélange de méthanol et d’eau
50 :50 exploite la propriété de solubilité à pH basique afin d’extraire des tétracyclines
23
(O’Connor et al., 2007). Néanmoins, un solvant alcalin co-extrait une portion significative
de la matière organique naturelle du sol ou du fumier, ce qui la rend peu apte à la détection
sans purification (Dams et al., 2003; Schnitzer, 1978). L’utilisation de cartouches comme la
Oasis HLB a été popularisée dans les revues scientifiques. Néanmoins, certaines cartouches
apportent une surévaluation des concentrations lors de la détection par ELISA (Koivunen et
al., 2006).
Les méthodes élaborées dans la littérature présentent des solutions extractives avec
des pH variables (Tableau 2).
Tableau 2. Solutions utilisées pour l’extraction de tétracyclines dans le fumier de porc et leur taux de récupération.
Auteurs Type de
4,7/0,2 M acide citrique :
pH 7
OTC 77-102
24 Pour l’extraction des antibiotiques du groupe tétracycline dans le sol, les pH varient
entre < 2 et 8. La plupart des extractions procèdent avec une solution acide. Pour ce qui est
du fumier, la revue de littérature couvre moins de méthodes publiées qu’avec le sol. Tout
comme pour le sol, les extractions dans le fumier sont aussi basées en majorité sur un pH
acide. Dans certains cas, la méthode semble apporter une surévaluation de la récupération
de l’antibiotique contenu dans le fumier. Pour Jacobsen et al. (2004), la dégradation de
l’antibiotique se produisant avant lyophilisation pourrait en être la cause, alors que dans le
cas de Kumar et al. (2004), ce serait la méthode de détection ELISA. Les procédures
appliquées par les équipes de Blackwell, Martínez-Carballo ainsi que de Brambilla sont peu
affectées par la surévaluation.
Finalement, les pH présentés pour l’extraction des tétracyclines dans le sol et le
fumier diffèrent grandement, soit de < 2 à 8 en passant par les pH 3,5 ; 4 ; 4,7 ; 7 et 7,8.
2.2.2.3 La nature de la matrice
La chlortétracycline (CTC) et d’autres antibiotiques peuvent être détectés dans les
aliments comme le lait, le miel, les œufs et les tissus d’animaux par des méthodes
officielles (ACIA, 2007). En plus, des méthodes de détection ont été publiées dans les cas
du plasma et de l’urine (Nelis et al., 1992 ; Koivunen et al., 2006). Chez l’humain, la CTC
a une demi-vie de 5,6 h dans le sang (Rogalski, 1985). Par comparaisons de méthodes
(Tableau 3), les antibiotiques semblent plus facilement extraits du miel et des graines que
du lait, des œufs, des reins et du plasma. L’extraction des antibiotiques à partir de muscles
et de tissus d’animaux marins a engendré les plus faibles pourcentages de récupération
(Tableau 3). Plusieurs procédés de purification ont été utilisés, principalement la filtration,
la centrifugation et la SPE. Brambilla et al. (2007) ont purifié les échantillons par MCAC et
Farrington et al. (1991) avec des colonnes de sépharose et de résine. Pour ce qui est de
l’environnement, des études ont déterminé la présence d’antibiotiques dans les eaux de
surface et souterraines, les sols, les fumiers et même les plantes (Davis et al., 2006 ; Boxall
et al., 2006 ; Kumar et al., 2005 ; Hamscher et al., 2005 ; Migliore et al., 1996). La
tétracycline peut subir des dégradations considérables (Kühne et al., 2000).
25 Dans la mise au point d’une méthode d’extraction pour fins d’analyse, la sorption de
l’antibiotique à la matrice est à considérer. En effet, la CTC interagit fortement avec les
ions métalliques divalents, surtout le magnésium et le calcium (Choudhary et al., 1996) et
avec des parties déprotonées d’acides humiques, comme des groupes fonctionnels
carboxyliques (Gu et al., 2007). Le sol adsorbe plus l’OTC et la CTC avec un contenu en
argile et en oxydes, comme l’oxyde de fer (Carlson et al., 2006 ; Jones et al., 2005 ; Simon,
2005 ; Figueroa et MacKay, 2005 ; Blackwell et al., 2004b). Les acides humiques et
fulviques contenus dans le fumier à respectivement 0,70-2,47 % et 0,50-1,00 % contiennent
des groupes fonctionnels comme des acides carboxyliques et des phénols qui peuvent se
lier aux sites des tétracyclines, sulfonamides et de la TYL en faisant des ponts hydrogène et
des échanges d’ions (Jacobsen et Halling-Sørensen, 2006). Donc, les tétracyclines
interagissent fortement principalement avec la matière organique naturelle et les
composants argileux dans le sol (Kulshrestha et al., 2004). Une comparaison entre
différents types de sols (Tableau 4) permet de constater un taux d’extraction des
tétracyclines plus élevé dans les textures sableuses sans argile. D’autre part, des interactions
hydrophobes et électrostatiques, des forces de Van der Waals ainsi que des réactions de
complexassions en surface peuvent accentuer la sorption des antibiotiques avec la matière
organique (Jones et al., 2005). La sorption dans le sol se fait en 10 min pour la CTC et une
suggestion de 4 h de temps de contact pour l’évaluation d’un ensemble d’antibiotiques a été
émise (Allaire et al., 2006). Pour ce qui est de la dégradation, un entreposage à la noirceur
et sous -80°C d’une solution diluée dans l’eau en fait la prévention pour une durée de 60
jours (Allaire et al., 2006). L’entreposage de la solution durant 48 h à la température de la
pièce (TP) ne semble pas affecter l’antibiotique (Allaire et al., 2006). Le temps de contact
entre l’antibiotique et le fumier après enrichissement doit donc être ajusté en fonction de la
sorption et de la dégradation de la CTC afin d’en évaluer un taux de récupération le plus
proche possible de la réalité environnementale.
26
Tableau 3. Extraction de tétracyclines dans les aliments et leur taux de récupération.
Auteurs Types de
Ammonium/Cartouches MAX
et HLB
TC
sulfite pH 5,4
Acétate d’éthyle/alcool
83-85
27
Tableau 4. Extraction de tétracyclines dans les sols et leur taux de récupération3.
* Sol fertilisé au fumier † Matière organique ‡ Carbone organique
3 Adapté de O’Connor et Aga, 2007
Auteurs Types de sol Tampon d'extraction Composés Taux de récupération
(%) 1 M acide citrique pH < 2/acétone avec acide formique pH 4
103, 108, 99Aga et al., 2005
Loam limoneux* (0,54-1,14)†
CTC, OTC, TC -
Oakville, sable (0,52)‡
5 % acétate de sodium/EDTA/Méthanol pH 8
CTC, OTC
Sable loameux (1,3)‡ Loam sableux (1,3)‡ Loam sablo-argileux (3,5)‡ Loam argileux (2,2)‡
Méthanol/EDTA/Tampon McIlvain pH 7
OTC 81
Hamscher et al., 2002
Sable* (1,8)† 1 M citrate pH 4,7/acétate d'éthyle CTC, OTC, TC
57-76, 67-86, 34-47
33-76, 102- 277
Loam sableux 1 M citrate pH 5,8 : acétate d’éthyle
CTC 55
Sols arables lyophilisés*
OTC 85-87
64-90, 82-91
Plusieurs sols A1A2, 41 % argile (1,38)‡ A3A2, 82 % argile (0,70)‡
0,5 M NaCl/0,25 M acide oxalique/acétate d’éthyle CTC
94 59 77
2.2.2.4 La température et la pression atmosphérique
La chaleur peut convertir les tétracyclines en épimères et en forme anhydroTCs
(Blackwood et al., 1985 ; Mitscher ed., 1978). Ainsi, pour l’utilisation du système
Accelerated system extraction (ASE), il est utile d’ajuster les paramètres de températures et
de pression. L’extraction des antibiotiques utilisant ce système est la Pressurized Liquid
Extraction (PLE).
Pour les tétracyclines (Tableau 5), la plupart des extractions se font à la température
de la pièce (TP), car la chaleur peut affecter la molécule. Néanmoins, il a été démontré
qu’une température de 75°C sous une pression de 2500 psi durant 5 min n’affecte pas
l’OTC, mais qu’au-dessus de cette valeur, une forte détérioration se présente (Jacobsen et
al., 2006). La structure des antibiotiques et leur extraction semblent peu affectées entre les
pressions 500 et 2500 psi (Jacobsen et al., 2006).
D’autres antibiotiques tels les sulfonamides (Tableau 5) sont extraits utilisant
l’ASE, avec une température de 200°C (Stoob et al., 2006). Par contre, une autre étude a
révélé qu’au-dessus de 100°C, la sulfaméthoxazole était détruite (Göbel et al., 2005). Les
fluoroquinolones sont quant à elles extraites à 100°C sur plusieurs cycles (Golet et al.,
2002). Enfin, les antibiotiques ont une sensibilité thermique propre à chacun et ce, en
fonction des paramètres de l’extraction.
29
Tableau 5. Différentes températures et pressions pour l’extraction d’antibiotiques dans l’environnement (sol, fumier, boue).
*Tylosine (TYL), Sulfadiazine (SDZ), Sulfaméthazine (SMZ), Sulfadoxine (SDX), Sulfaméthoxine (SMX),
Sulfaméthoxazole (SMXZ), Sulfathiazole (STZ)
2.2.2.5 La force ionique
La famille des tétracyclines se lie fortement aux groupes silanol et aux protéines et
forme des complexes chélateurs avec des ions métalliques divalents et ß-dikétones (Oka et
al., 2000). La présence de cations multivalents inhibe d’ailleurs le potentiel antibiotique des
tétracyclines notamment en le rendant moins disponible (Froehner et al., 2000). Dans les
sols, un mécanisme formant des liaisons ioniques entre l’antibiotique et les métaux
Auteurs Type de matrice
(%) Jacobsen et al., 2006
Fumier de porc lyophilisé
75 2500 psi TC, OTC, CTC, TYL, SDZ, SMZ, SDX
69-93, 42-54, 76-228, 9-35, 59-73, 84-109, 82-101
Aga et al., 2005
O’Connor et al., 2007
Sol (2,6% de OC ; 19% d’argile)
60 104 bar TC, OTC, CTC, DOXY
99, 99, 92, 99
Thorsten et al., 2003
Sol fertilisé de fumier
-
200 100 bar SDZ, SMX, SMZ, SMXZ, STZ
62-93 sauf SMXZ (41)
Göbel et al., 2005
78-142
100 100 bar Ciprofloxacine, Norfloxacine
80-89, 84-88
30
(calcium, magnésium) qui sont à leur tour associés à la matière organique est proposé par la
littérature (Gu et al., 2007 ; Loke et al., 2002). L’ajout de calcium au sol augmente la
sorption des tétracyclines pour des pH > 5 (Gu et al., 2007 ; Jones et al., 2005). L’ajout de
CaCl2 ou de NaCl augmente la force ionique et facilite la désorption de l’OTC (Ter Laak et
al., 2006 ; Sassman et al., 2005). Le magnésium forme le plus important complexe avec
l’OTC devant le calcium (Tongaree et al., 1999) et le calcium devant le potassium
(Sassman et al., 2005). Dans l’eau, le magnésium aide à la solubilité de l’OTC pour toute la
gamme de pH (Tongaree et al., 1999). Le calcium favorise la solubilité de l’OTC à pH 7-8
tandis que le zinc, sous pH 7 (Tongaree et al., 1999). Une extraction de sulfonamides dans
le fumier de ferme a d’ailleurs été proposée en ajoutant du NaCl à l’échantillon (Haller et
al., 2002).
Finalement, l’échange ionique à l’intérieur de la matrice semble être un élément
controversé dans l’extraction des antibiotiques. L’ajout d’EDTA au sol est aussi débattu,
parfois il apporte un effet bénéfique en brisant le lien avec le métal (Long et al., 1990),
parfois, il n’en apporte aucun (Stoob et al., 2006). L’ajout d’acide citrique et de phosphate
de potassium au sol est bénéfique à la récupération de la tétracycline (TC) contenue dans
les eaux de lagune (Zhu et al., 2001).
2.2.3 Technologies d’extraction et de détection des antibiotiques
2.2.3.1 Les ultrasons et la pression liquide (extraction)
Le bain à ultrasons et la méthode PLE (Pressurized liquid extraction) sont deux
techniques d’extraction proposées pour récupérer les antibiotiques contenus dans une
matrice complexe. Il semble que l’élévation de la température pourrait permettre de retirer
plus efficacement les antibiotiques. En effet, l’augmentation de la température entraîne une
meilleure solubilité d’un contaminant ; par exemple l’atrazine est plus soluble à 125°C
(1780 µg/mL) qu’à 50°C (70 µg/mL) (King, 2006). La majorité des extractions
mentionnées dans la littérature utilisent la technique PLE pour bénéficier de cette approche;
31
la pression permet l’augmentation de la température sans ébullition de la solution
extractive.
Il a été rapporté que le bain à ultrasons a engendré de bons résultats lors de
l’extraction d’antibiotiques provenant d’œufs et de lait (Furusawa, 2004) et lors de
l’extraction de pesticides dans le sol (Sun et al., 1998 ; Babié et al., 1998). Le bain à
ultrasons est un instrument moins dispendieux que la PLE et ne requiert pas de larges
volumes de solvants (Blackwell et al., 2004b). Pour l’extraction de l’OTC dans le fumier,
les taux de récupération sont élevés dans l’étude de Brambilla et al. (2007) (83-86 %) et
dans celle de Blackwell et al. (2004b) (77-102 %). Les solutions extractives ainsi que la
méthode de purification diffèrent dans les deux cas. La méthode avec les ultrasons a été
comparée à la technique PLE pour l’extraction des sulfonamides, macrolides et
triméthoprime contenus dans des boues activées (Göbel et al., 2005). Les ultrasons ont
engendré des taux de récupération significativement moins élevés que la technique PLE. Il
est à noter que les conditions et les solvants comparés n’étaient pas les mêmes.
Durant les traitements aux ultrasons, une température de 60°C et un temps de 30
minutes permet d’optimiser l’extraction de composés tels les anthraquinones (hydrocarbure
aromatique polycyclique provenant de plantes) (Hemwimol et al., 2006). La température
ainsi que les solvants organiques contribuent au phénomène de cavitation acoustique
(diminution des bulles pour former une vague de son adéquate) des ultrasons (Toma et al.,
2001). Une dilution de la matière organique peut aussi être bénéfique, car cela permet une
meilleure diffusion des substances dissoutes de l'intérieur de la cellule vers le milieu
d'extraction, évitant ainsi l’absorption des ondes par la matière organique totale (Vilarem et
al., 1997). Néanmoins, une trop grande dilution accumule une perte d’énergie dans le
milieu d’extraction (Vilarem et al., 1997). Enfin, la vaisselle de plastique peut absorber
l’énergie ultrasonique et du matériel en verre est alors recommandé (Song et al., 2007).
32
La chromatographie en phase liquide à haute performance (HPLC, high
performance liquid chromatography) est une technique qui permet la séparation analytique
des constituants d’un mélange. Comme dans toutes les techniques de séparations
chromatographiques, le mélange est d’abord dissous dans une phase liquide ou gazeuse
(phase mobile) (Voet et Voet, 1998). Cette solution est ensuite filtrée dans une colonne
dotée d’un support solide poreux (phase stationnaire) (Voet et Voet, 1998). La phase
stationnaire ralentit plus ou moins la migration des substances en fonction de propriétés
propres aux solutés (Voet et Voet, 1998). Dans la HPLC, la séparation peut être fondée sur
l’adsorption, l’échange d’ions, l’exclusion par la taille, les interactions hydrophobes et la
polarité (Voet et Voet, 1998). Les avantages de la HPLC sont : une haute résolution, une
certaine rapidité, une forte sensibilité et une possibilité d’automatisation (Voet et Voet,
1998). Plusieurs types de chromatographie en phase liquide existent : la chromatographie
d’absorption (liquide/solide), de partage (liquide/liquide), d’échange d’ions et d’exclusion.
Le système HPLC est couramment utilisé dans la séparation des antibiotiques (Martel,
2007). Les détecteurs couplés à la HPLC utilisés pour quantifier les antibiotiques sont
surtout ceux de type spectromètre de masse (MS), à absorption aux ultraviolets (UV) et de
type UV à barrette de diodes (DAD). D’autres détecteurs existent : les détecteurs à
absorption visible, à indice de réfraction, à fluorescence et le détecteur d’évaporation à
diffusion de la lumière (DEDL) (Voet et Voet, 1998 ; Dreux et Lafosse, 1992; Waters,
2009).
2.2.3.2.1 LC-UV
Couplé à la HPLC, la détection UV est une technique sensible, sélective et fiable.
La technique mesure la différence d’absorbance entre le solvant avec le soluté et le solvant
seul (Dubreui, 2003). L’ajout du DAD apporte les renseignements spectraux des
substances, mais son emploi est plus difficile (Dubreui, 2003). L’avantage du HPLC-UV
est qu’il est facile d’entretien et d’utilisation, qu’il est peu sensible aux variations de
33
température et de débit, et qu’il peut être utilisé en mode gradient d’élution (Dubreui,
2003). L’inconvénient majeur est que les substances doivent être chromophores.
2.2.3.2.2 LC-MS
Le spectromètre de masse (MS) permet de déterminer de faibles traces d’un
composé particulier provenant d’un mélange complexe avec plus de rapidité et de précision
que les techniques classiques (Voet et Voet, 1998 ; Prakash et al., 2006). Pour utiliser le
MS, l’effluent de la phase mobile provenant de la HPLC doit d’abord être vaporisé et
ionisé. Il existe plusieurs techniques d’ionisation douces associées au MS : le fast atom
bombardment (FAB), la matrix assisted laser desorption–ionization (MALDI),
l’atmospheric pressure ionization (API) qui comporte l’atmospheric pressure chemical
ionization (APCI) et l’electrospray ionization (ESI) (Prakash et al., 2006). L’APCI et l’ESI
sont les plus ubiquitaires (Prakash et al., 2006). Pour ce qui est de l’APCI, l’éluat passe par
un capillaire de verre rempli de gaz de transport et est chauffé à haute température (450-
550°C) (Prakash et al., 2006). La vapeur remplie de molécules se dirige vers l’électrode à
décharge couronne (Prakash et al., 2006). Une décharge d’une forte différence de potentiel
(de 4 à 6 kV) est alors appliquée (Prakash et al., 2006; Zaikin et Halket, 2006). L’air
ambiant à proximité de l’électrode est ionisé et devient une source potentielle d’électrons
qui participent à des réactions chimiques afin d’ioniser les molécules (Prakash et al., 2006).
Pour ce qui est du ESI, cette technique permet de vaporiser les molécules sans qu’elles ne
se décomposent sous l’effet de la chaleur (Voet et Voet, 1998). En premier lieu,
l’échantillon passe dans un capillaire métallique rempli de gaz N2 (Prakash et al., 2006).
Puis, une pulvérisation (2-8 kV) est administrée à l’échantillon (Prakash et al., 2006),
« formant ainsi de très fines gouttelettes chargées d’où le solvant s’évapore rapidement »
(Voet et Voet, 1998). Les gouttes chargées s’accumulent pour engendrer une charge
répulsive : l’« explosion Coulombique » (Prakash et al., 2006). Les molécules sont alors
dissoutes dans la phase gazeuse sous forme d’ions positifs ou négatifs, selon la polarité du
voltage, et introduites dans le spectromètre de masse (Voet et Voet, 1998; Prakash et al.,
2006). Pour ce qui est du FAB, il est souvent associé au tandem MS (LC-MS/MS ou TSQ).
34
Dans le premier MS, la macromolécule préalablement dissoute dans un solvant peu volatile
(glycérol), est bombardée par un rayon d’atome (Ar, Xe) (Voet et Voet, 1998). Cette étape
entraîne des ions dans la solution de glycérol (M et H+) (Voet et Voet, 1998). Elle permet
alors de sélectionner l’ion « M » d’intérêt parmi les autres ions et les agents contaminant
(Voet et Voet, 1998). Puis, l’ion sélectionné entre dans une cellule de collision où il
s’entrechoque avec des atomes de gaz chimiquement inertes (He, Ar, N2) (Voet et Voet,
1998 ; Prakash et al., 2006). L’ion accumule de l’énergie et cela provoque une
fragmentation à chacune de ses extrémités pour engendrer une série d’ions de plus en plus
petits (Voet et Voet, 1998). Les fragments de la molécule permettent d’identifier la
molécule et de déterminer, par exemple, les acides aminés contenus dans un polypeptide
(Voet et Voet, 1998).
Après vaporisation et ionisation, les effluents de la HPLC se dirigent vers
l’analyseur de masse et enfin vers le détecteur. Il existe plusieurs types d’analyseurs de
masse : le single-stage quadrupole (SSQ), le triple-stage quadrupole (TSQ), le ion traps
(LCQ et LTQ), le quadrupole time-of-flight (Q-TOF) et le Fourier transform-mass
spectrometry (FT-MS), aussi nommé FT-ionization cyclotron resonance (FT-ICR) (Prakash
et al., 2006). Le SSQ est la technique communément appelée LC-MS lorsque couplé à la
HPLC. Il est composé d’un quadripôle simple. Le quadripôle possède quatre électrodes et
chaque paire opposée est connectée électriquement (John Innes Centre, 2009). La machine
contient une source d’ion de mode linéaire (Q0) et une lentille qui transporte les ions à
l’analyseur de masse SSQ (Q1) (Prakash et al., 2006). Dans le Q1, les ions sont filtrés en
fonction de leur stabilité de trajectoire et de leur ratio masse/charge ; seulement certains
ions atteignent le détecteur. Le SSQ peut générer une fragmentation, mais elle est non
spécifique (Prakash et al., 2006). Ce problème est outrepassé avec le TSQ qui possède deux
quadripôles (Prakash et al., 2006). Le TSQ a en plus du Q0 et du Q1, une cellule de
collision (Q2) et un second analyseur de masse (Q3). Les ions filtrés entre dans la cellule de
collision et sont fragmentés dans le premier MS. Dans le second MS, les fragments d’ions
sont filtrés à nouveau, ce qui augmente la précision et la sélectivité par rapport au SSQ. Les
inconvénients de cette méthode restent le coût très élevé des appareils et leurs plus faibles
sensibilités par rapport à d’autres séquenceurs comme la dégradation d’Edman (Voet et
35
Voet, 1998). De leur côté, les ions traps (IT-MS) sont composés d’une source d’ion, d’un
quadrupole ion trap, d’un analyseur de masse (Prakash et al., 2006) et souvent, d’un
spectromètre de masse supplémentaire (MS-MS). Les IT-MS suivent un mode linéaire
comme le SSQ et le TSQ (Prakash et al., 2006). Ils ont l’avantage d’être sensibles,
spécifiques et rapides, et ce sans filtration des ions (Prakash et al., 2006). Dans les IT-MS,
les ions entrent dans un champ électrique provoqué par un voltage de fréquences radio
créés par des changements d’amplitudes dans le potentiel (pulsations) (Prakash et al.,
2006). La différence principale entre les types d’IT-MS LCQ et LTQ mentionnés se situe
dans leur géométrie ; le LCQ a une géométrie 3D traps, alors que le LTQ possède une 2D
traps, ce dernier peut entreposer plus d’ions avant l’apparition d’une surcharge (Prakash et
al., 2006). Pour ce qui est du TOF, il permet d’augmenter la sensibilité et la résolution (± 5-
10 ppm) (Prakash et al., 2006). Cette résolution peut aussi s’avérer être un désavantage, car
le bruit de fond en est augmenté. La machine comporte une source d’ion, un TOF MS
contenant un propulseur d’ions, un réflectron qui inverse la trajectoire des ions et un
détecteur (Prakash et al., 2006), et souvent un quadripôle (Q) supplémentaire connecté à
une cellule de collision (Q-TOF). Dans le Q-TOF, les ions sont propulsés par une énergie
cinétique égale ; la vélocité de la molécule dépend alors du ratio masse/charge (les grosses
molécules sont plus lentes) (Ferrer et Thurman, 2003). Enfin, le FT-MS est le plus sensible
et le plus précis des MS. Il peut analyser des solutions complexes sans chromatographie
préalable. Les tétracyclines ont été analysées avec les différents types d’ionisation décrits
précédemment et les types d’analyseur de masse SSQ, TSQ et LCQ.
De façon générale, un désavantage du ESI se trouve dans sa sensibilité aux
suppressions ou aux augmentations de l’ionisation dues aux interférences des acides
humiques contenus dans le sol (Gustavsson et al., 2001 ; Mallet et al., 2004). L’APCI
démontre de son côté une augmentation d’ionisation (Liang et al., 2003). Dans l’analyse de
tétracyclines, le LCQ utilisé semble être plus sensible à la suppression ou à l’augmentation
d’ionisation que le SSQ (O’Connor et al., 2007). Ceci était possiblement dû soit aux
agrégats formés autour des molécules de tétracyclines en solution, ce qui les rendait moins
aptes à la formation de gaz et d’ionisation, soit à la position orthogonale de l’ESI
(O’Connor et al., 2007).
36
2.2.3.3 ELISA
Les tests ELISA font appel à des techniques variées utilisant la fixation directe
d’anticorps (Ab) ou d’antigènes (Ag), les molécules cibles (Janeway et al., 2003). Les
ELISA se fondent sur trois principes réactionnels :
1. Une compétition utilisant des antigènes marqués Ag* (Figure 6).
2. Une double capture utilisant des anticorps marqués Ab*, à l’origine de la
technique sandwich (Figure 7).
(Martel, 2007)
Figure 8. Principe de compétition avec un anticorps marqué Ab*.
L’anticorps au fond du puit
capte directement l’antigène
est ensuite révélé par un second
anticorps.
ceux de l’échantillon
moins le signal sera élevé lors de
la détection de l’échantillon.
Figure 9 : Principe de
anticorps marqués et
engendrent une diminution du
signal durant la détection.
La détection par ELISA peut être appliquée comme méthode alternative dans les
études sur le devenir et le transport des antibiotiques dans l’environnement (Aga et al.,
2003). Cependant, les anticorps peuvent interagir par réactions croisées avec plusieurs
produits structurellement semblables aux tétracyclines, entre autre les épimères de
tétracyclines et les sous-produits de dégradation (Aga et al., 2005). Ces réactions croisées
engendrent une augmentation de la concentration en antibiotiques par rapport au LC-MS
(Aga et al., 2005). Il est à noter que l’utilisation de cartouches peut apporter aussi certaines
contraintes. En effet, la cartouche HLB (Hydrophilic Lipophilic Balance) apporte une
surévaluation avec le système ELISA, alors que la MCX (Mixed-mode Cation eXchange)
engendre une bonne récupération dans le cas de l’urine (82 %) (Koivunen et al., 2006).
Enfin, la technique ELISA est considérée comme fiable, rapide et peu coûteuse (Dolliver et
al., 2008), mais elle surestime la concentration en antibiotiques par rapport aux techniques
actuelles de LC-MS (Aga et al., 2005).
2.2.3.4 FT-NIR
« La spectroscopie proche infrarouge permet de connaître la composition chimique
des aliments et matières premières beaucoup plus rapidement que les dosages biochimiques
classiques » (Bertrand, 2002). Un spectromètre, lorsque bien étalonné, peut réaliser
plusieurs analyses sans coût additionnel. La région du proche infrarouge couvre les
longueurs d’onde entre 800 et 2500 nm (4000-12 500 cm-1) alors que l’infrarouge moyen
couvre de 2500 à 25 000 nm (400-4000 cm-1) (Bertrand, 2006). Pour schématiser le
fonctionnement de la spectroscopie de vibrations, Bertrand (2002) imagine une molécule
comme un ensemble d’atomes reliés entre eux par des ressorts. « Chaque ressort vibre à
une fréquence donnée qui dépend du groupe chimique impliqué dans la liaison » (Bertrand,
2002). Par exemple, s’il n’existe que deux masses reliées entre elles par une liaison, une
seule fréquence lui est propre et détermine un modèle harmonique (Loi de Hooke). Dans la
réalité, les liaisons inter-atomiques regroupent plutôt des fréquences de vibrations
fondamentales, harmoniques et des bandes de liaison (Bertrand, 2002). Le modèle
d’oscillateur anharmonique permet de constater cette diversité de fréquences de vibration
38
(Bertrand, 2002). Les longueurs d’onde de la fondamentale, de la première harmonique et
de la deuxième harmonique sont respectivement λ0, λ0/2, λ0/3 (Bertrand, 2002). Le proche
infrarouge caractérise les bandes harmoniques et de combinaison. Les absorptions des
groupements C-H, O-H, N-H et de diverses molécules comme CONH2(R) peuvent être
détectées par FT-NIR.
À des fins de connaissance générale, l’eau provoque de fortes bandes d’absorption à
970 nm (10 309 cm-1), 1190 nm (8403 cm-1), 1440 nm (6944 cm-1), 1940 nm (5155 cm-1) et
les bandes à 970 nm (10 309 cm-1) et 760 nm (13 160 cm-1) sont les 2e et 3e harmoniques.
Les protéines sont à 1523, 1600, 2050, 2180 nm où la bande à 2180 nm est utilisée pour
l’analyse et celle à 1680 nm sert de bande de référence de la ligne de base du spectre. Les
lipides sont à 1734, 1765, 2304, 2348 nm. Enfin, les glucides se trouvent entre 2070 et
2110 nm ; ces bandes de vibrations sont des groupements OH et CO. L’erreur d’analyse
augmente lorsque des produits hétérogènes ou des mélanges d’aliments sont analysés. Pour
permettre de prédire la concentration du produit ciblé, l’algorithme de PLS (Partial Least
Square), contrairement à la méthode classique CLS (Classic Least-Square), a l’avantage
d’être insensible aux impuretés (Cai et Singh, 2004). Le choix du modèle peut se faire à
l’aide du coefficient de corrélation r2 et de la PRESS (Prediction residual sum of squares)
afin d’optimiser le nombre de facteurs en jeu. Le choix du modèle se fait aussi en fonction
de l’erreur standard de calibration (SEC) et de la répétitivité (SD) pour évaluer la
calibration, et de l’erreur standard de prédiction (SEP) pour estimer la précision de la
validation4 (Sivakesava et Irudayaraj, 2002). En plus, une validation croisée (cross-
validation) permet d’évaluer les standards de la courbe de calibration en les validant un à
un et engendre des indices de précision r2 et RMSECV (Root mean squared error of cross-
validation). Afin de comparer ces termes d’erreur entre eux, le rapport de l’erreur standard
de prédiction (RPD) et l’étendue du rapport de l’erreur (RER) sont fortement suggérés5
(Malley et al., 2004 ; Tremblay, 2008). Pour établir une courbe d’étalonnage adéquate, il
faut d’abord collecter une série d’échantillons représentatifs, comportant typiquement entre
50 et plusieurs centaines de produits de même nature (Bertrand, 2002). Les échantillons
4 Les formules de SEC, SEP et de SD sont reproduites en annexe 11. 5 Les formules de RDP et RER et les lignes directrices pour leurs interprétations sont présentées en annexe 11.
39
doivent être analysés par une méthode de référence. Un test de faisabilité est suggéré avant
de débuter cette partie onéreuse de la méthode, afin de déterminer si la détection est
d’abord possible. Les échantillons sont ensuite divisés : une série de calibration et une série
de validation (du tiers à la moitié de la totalité) (Leeson et al., 2000). Ensuite, les indices de
précision sont évalués et des transformations peuvent être apportées aux spectres. Les
transformations qui peuvent être effectuées afin d’optimiser la méthode sont : le lissage
pour éliminer le bruit de fond, les dérivées première ou seconde pour raffiner et révéler
certains pics, la correction de la ligne de base et les corrections multiplicatives (Heise et
Winzen, 2006). Aussi, le choix de régions spécifiques dont les effets linéaire ou
quadratique peuvent être retirés et l’ajustement de la linéarité de la courbe ont une influence
sur la précision de la méthode.
Le FT-IR (Fourier transform infrared) est une technologie utilisant l’infrarouge à
des fins d’analyses dans les régions du visible et de l’infrarouge loin, moyen et proche. Le
FT-NIR (Fourier transform near infrared) ainsi que le FT-MIR (Fourier transform mid
infrared) couvrent respectivement les régions du proche infrarouge et du moyen infrarouge.
Déjà, ces technologies ont permis l’analyse de composés dans le lait : taux en protéines,
gras, humidité, sucres, caséines, cholestérol et antibiotiques comme la tétracycline (Hansen
et al., 1999 ; Rodriguez-Otero et al., 1997 ;