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Un modèle de régulation -la répression catabolique
et l’opéron lac chez Escherichia coli
cours de Guennadi SEZONOV
BMC421 - 2009
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http://
Les diapos du cours en couleur peuvent être téléchargées sur :
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les enseignants de BMC421/2009
Céline Fabret
Pierre-Louis Blaiseau
Claude Gerbaud
Guennadi Sezonov
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Céline Fabret
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Pierre-Louis Blaiseau
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Claude Gerbaud
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Guennadi Sezonov
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La lecture conseillée
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Introduction
de l’adaptation enzymatique au principe de régulation de l’expression des gènes chez les bactéries
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J Monod à l’Institut Pasteur
1946-1947 Participe avec A. Lwoff à deux congrès de Cold Spring Harbor qui vont marquer l'orientation de sa carrière. en 1946, où il prend connaissance des travaux de Beadle et Tatum sur la reproduction de Neurospora et de leur hypothèse d'une relation entre gènes et enzymes et,en 1947, le 11th Growth Symposium où il donne une conférence intitulée : The phenomenon of enzymatic adaptation
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Le phénomène d’adaptation enzymatique – les bactéries sont intelligentes !!
Certaines enzyme apparaissent dans les cellules seulement en présence de leurs substrats.
Ce phénomène a été baptisé par J. Monod « adaptation enzymatique »
maximumjusqu’à 60.000 molécules par cellule
minimum 5-10 molécules par cellulesans induction « la fuite »
enzyme inductible
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Le phénomène de la diauxie – E. coli choisit son sucre
croissance bi-phasiquedans le milieu contenant le glucose et le lactose
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Diauxie
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1959 – le modèle de l’opéron lactose de F. Jacob, J. Monod et A. Lwoff
1 – postule l’existence des gènes régulateurs et des gènes de structure;
2 – constate que les gènes peuvent former des unités de régulation et de transcription - OPERONS
3 – explique la nature (protéine) et le principe de l’action du répresseurLacI – notion de l’OPERATEUR; du PROMOTEUR et de l’INDUCTEUR
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F. Jacob, J. Monod et A. Lwoff – Prix Nobel 1965
- opéron- opérateur- promoteur- répresseur- inducteur
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Partie 1
l’opéron lac revisité
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Opéron – définition du terme et principaux éléments structuraux
A B C D
promoteur
operateur
Opéron – une unité de régulation et de transcription composée de plusieurs gènes placéssous contrôle du même promoteur
Les éléments structuraux d’un opéron incluent :
- un promoteur et un terminateur de transcription- les gènes structuraux- une région régulatrice appelée opérateur
terminateur
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Opéron lactose – la position
7,8 min
carte génétique
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7,8 min
lacZ lacY lacAlacIséquences régulatrices PlacI
3075 pb 1254 pb 612 pb1083 pb
gènes
Opéron lactose – la position, les gènes
carte génétique
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7,8 min
lacY lacAlacIPlacI
3075 pb 1254 pb 612 pb1083 pb
ARNm polycistronique lacZYA- sa demi-vie est de 3 minARNm lacI
ARNm
lacZséquences régulatrices
gènes
Opéron lactose – la position, les gènes , les ARNm
carte génétique
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7,8 min
lacY lacAlacIPlacI
3075 pb 1254 pb 612 pb1083 pb
b- galactosidasedemi-vie 5 heures
b-galactoside perméase
b-galactosidetransacétylaserépresseur LacI
protéines
ARNm polycistronique lacZYA- sa demi-vie est de 3 minARNm lacI
ARNm
lacZséquences régulatrices
gènes
Opéron lactose – la position, les gènes , les ARNm et les protéines
carte génétique
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La régulation de la transcription de l’opéron lac – vision simplifiée
Deux états de l’opéron lactose sont régulés par le répresseur LacI
Fermé- en l’absence de lactose
Ouvert - en présence du lactose
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L’état « fermé » est assuré par LacI en l’absence de lactose
inhibition par LacI de l’initiation de la transcriptionpar l’ARN polymerase
le tétramère LacI, la forme active du répresseur
ARN polymérase
REPRESSION
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En présence du lactose le répresseur est inactivé par un inducteur - allolactose
l’opéron est induit
changement de conformation de LacI
inducteur
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lac est faiblement exprimé même sans lactose- la « fuite » de l’opéron
entrée du lactoseet induction de l’opéron
opéron lac pleinement induit
il n’y a plus de lactose le répresseur « ferme » l’opéron lac
opéron lacfortement réprimé
lactose devient disponible
Le cycle d’induction et de répression de l’opéron lac
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le défaut du modèle lac simple –
le modèle n’explique absolument pas la croissance diauxique
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Partie 2
les propriétés des protéines codées par l’opéron lac et le gène lacI
LacZ – b -galactosidaseLacY - b-galactoside perméaseLacA - thiogalactosidetransacétylase
LacI - répresseur transcriptionnel
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-réactions enzymatiques-substrats -phénomène de l’a-complémentation
b-galactosidase LacZ
![Page 29: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/29.jpg)
Les réactions enzymatiquesde la b galactosidase
C4C6
– isomérisation du lactose
– clivage en Gal et Glu
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La structure de la b-galactosidase: un tétramère portant un ion de Mg2+
Mg2+
monomère tétramère
![Page 31: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/31.jpg)
b-galactosides Substrat Inducteur
lactose,
allolactose+ +
métabolisable
Xgal
(chromogène) + -
IPTG - +non métabolisable
ONPG
(chromogène)+ -
glucose, maltose - -
Résumé:b galactosidase– les substrats et les inducteurs
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Inducteur métabolisableallolactose
Inducteur non- métabolisableou « gratuit » - IPTG
Les inducteurs de l’opéron lac
![Page 33: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/33.jpg)
ONPG - dosage enzymatique de la b-galactosidase dans un milieu liquide
ONPG – nitrophényle-galactoside non coloré
galactose +ONP (jaune)
lac-
![Page 34: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/34.jpg)
-LB + Xgal
- MacConkey
- M63 lactose
Les phénotypes Lac+ et Lac- sur différents milieux de croissance
![Page 35: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/35.jpg)
Visualisation de l’activité enzymatique de la b-galactosidasedans un milieu solide contenant X-Gal
X-Galbromo- 5- chloro-4-indolyl- b– D - galactoside
Lac- Lac+ Lac+
peu de colonies beaucoup de colonies
blanches bleues bleues
![Page 36: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/36.jpg)
Réactions chimiques avec le X-Gal produisant la coloration bleue
nécessite l’oxygène
indigo
![Page 37: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/37.jpg)
Le milieu MacConkey: la fermentation qui donne la coloration
Souche lac+
Souches lac-
[MK avec les oligopeptides] +lactose
Souche lac+
un colorant sensible au pH
![Page 38: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/38.jpg)
Le milieu M63 (milieu minimum)+ lactose
une souche Lac+ une souche Lac-
dans ce milieu, le lactose est la seule source de carbone
![Page 39: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/39.jpg)
L’opéron lac et les mutants lacZ-
sauvage lac+
+ + +
mutation non polaire (ex. ponctuelle)
- + +
mutation polaire (insertion d’un Tn)
- - -
effet polaire
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La complémentation a
1025 aa
985 aa
40 aa
LacZ+ Lac+
11-40 aaN-terminale Lac-fragment w
N C
40 aa (fragment a) Lac-
985 aa 40 aa+???
![Page 41: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/41.jpg)
La complémentation a
1025 aa
985 aa
40 aa
LacZ+ Lac+
11-40 aaN-terminale Lac-fragment w
N C
40 aa (fragment a) Lac-
Dans un diploïde
plasmide avec le fragment a
Lac+
w
achromosome avec le fragment w
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Complémentation a - interaction non covalente entre les deux fragments
fragment w
fragment a
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La complémentation a - les vecteurs de clonage
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Le gène lacZ comme un gène rapporteur… chez les eucaryotes
Exemple 2: embryogenèse chez la Drosophile
Exemple 1: embryogenèse chez la souris
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LacY - b-galactoside perméase -la protéine qui transporte le lactose
![Page 46: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/46.jpg)
LacY – une protéine intégralement transmembranaire
12 hélices transmembranairesde LacY
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La fonction de la protéine LacY – une perméase des b galactosides
- transporteur du lactose
-LacY sauvage transporte également le mélibiose (glucose a D-galactoside)
-LacY* - une forme mutée de LacY est capable de transporter le maltose
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Le mécanisme de Lactose/H+ symport
![Page 49: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/49.jpg)
b-galactosides transportés
obligatoirement
par LacY
rentrent par
d’autres voies
indépendamment de
LacY
lactose + -
Xgal - +
IPTG - +
glucose - -
mélibiose +
37°C et 43°C
+ à 37°C
- à 43°C
Perméase LacY – les substrats (résumé)
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Répresseur transcriptionnel LacI
![Page 51: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/51.jpg)
Le répresseur LacI agit comme tétramère
-domaine de fixation à l’ADN
-domaine de fixation de l’inducteur
domaine d’oligomérisation
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une séquence répétée inverséecomme pour beaucoup de protéines régulatrices se fixant à l’ADN
LacI – le site de liaison à l’ADN reconnu dans l’operateur lac
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3 séquences opératrices de l’opéron lac
lacZ lacY lacAlacIpromoteur
PlacI
O1+11
O2+412
O3-82
formation d’une boucle d’ADN
O3O1
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La répression par LacI nécessite la présence de trois opérateurs
TD1
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LacI – un obstacle stérique pour l’ARN pol
~40 molécules de LacIpar cellule =10 tétramères
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Le répresseur LacI – l’action de l’inducteur
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Un peu de génétique…
les mutations lacI-, lacIS et lacOC
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Mutation lacI-
en l’absence de LacI fonctionnelle, l’opéron lac est exprimé de façon constitutive
transcription
c’est une mutation recessive
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Mutation lacIS
LacIS ne peut pas se lier à l’inducteur
l’opéron lac est réprimé de façon constitutive
c’est une mutation dominantenegative
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Mutation OC
LacI ne se fixe plus sur son operateurl’opéron lac est exprimé de façon constitutive
c’est une mutation dominante
![Page 61: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/61.jpg)
Conclusion:
le phénotype « Lac constitutif » peut êtreobservé à la suite des mutations qui touchent des site distincts
- soit le gène lacI- soit l’operateur o
Réfléchir sur la distinction entre les deux cas
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Régulation de l’expression du gène lacI
Comment les ribosomes terminent la traduction de l’ARNm lacI tronqué?
![Page 63: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/63.jpg)
Les principales étapes de la traduction
releasing factors
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l’action de SsrA – un ARN trans-messager sur les ribosome bloqués sur les mARN sans codon STOP
P A
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l’action de SsrA – un ARN trans-messager sur les ribosome bloqués sur les mARN sans codon STOP
P A
La structure de l’ARN SsrA
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l’action de SsrA – un ARN trans-messager sur les ribosome bloqués sur les mARN sans codon STOP
P A
La structure de l’ARN SsrALe rôle de la protéine SmpB
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SsrA – un ARN trans-messagerqui sauve la traductiond’un ARNm sans codon STOP
P A
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Régulation de l’expression du gène lacI – SsrAtmARN
SsrA tag –AANDENYALAA11 aa peptide
TD3
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Partie 3
l’opéron lac et la répression catabolique
pourquoi en présence de lacose+glucose l’opéron lac ne s’exprimera pas??
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maximumjusqu’à 60.000 molécules par cellule
minimum 5-10 molécules par cellulesans induction « la fuite »
enzyme inductible
Cette régulation s’explique parfaitement bien par l’action de LacI
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??????????????????????????????????
![Page 72: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/72.jpg)
Quelle que soit la proportion entre les deux sucres les bactéries ne se trompent pas
le phénomène de diauxie
![Page 73: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/73.jpg)
La synthèse de la b-galactosidase ne commence que en phase lag apresla consommation du glucose
b-gal
unités de b-galDO
glucose lactose
![Page 74: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/74.jpg)
La répression catabolique (la préférence pour le glucose)
– un phénomène général
![Page 75: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/75.jpg)
Repression Catabolite(glucose)
catabolic operons
LactoseMaltose
Arabinose
Rhamnose
SymbiosisCentral metabolismVirulenceMotilityNitrogen utilizationChemotaxis
5%-10% of all bacterial genes!!!!
flux de phosphates
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le transportdes glucidesest couplé à leur phosphorylation
non spécifique
spécifique
histidineprotèine
enzyme I
![Page 77: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/77.jpg)
La protéine EIIA-Glu est le senseur principal de la présence du glucose
-la forme non phosphorylée de EIIA-Glu est majeure -si le glucose est présent
- la forme phosphorylée de EIIA-Glu s’accumule si le glucose est absent
![Page 78: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/78.jpg)
La protéine EIIA-Glu est le senseur principal de la présence du glucose
-la forme non phosphorylée de EIIA-Glu est majeure si le glucose est présent et transporté
-Cette forme bloque l’activité du transporteur LacY. -Le lactose ne rentre pas – c’est « l’exclusion de l’inducteur »-l’opéron lac reste réprimé par le répresseur LacI
X
lactose
![Page 79: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/79.jpg)
La protéine EIIA-Glu est le senseur principal de la présence du glucose
-la forme phosphorylée de EIIA-Glu est majeure si le glucose est absent
-lactose est transporté par LacY
-la répression par LacI est levée mais l’opéron lac s’exprime seulement siune autre protéine , CRP, est présente et activée
X lactose
![Page 80: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/80.jpg)
La protéine EIIAGlu est le senseur principal de la présence du glucose
X lactose
adenylatecyclase
catabolite répresseur protéine
opéron lactosed’autres gènes régulés par la répression catabolique
![Page 81: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/81.jpg)
Les deux conformations de CRP – activateur transcriptionneml
se fixe à l’ADN en présence de l’AMPc
incapable de se lier à l’ADN sans soneffecteur AMPc
![Page 82: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/82.jpg)
L’adénylatcyclase catalyse la synthèse de l’AMP cyclique (AMPc) à partir de l’ATP
l’adénylatecyclase est codée par le gène cyaA
![Page 83: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/83.jpg)
sans AMPc
avec AMPc
![Page 84: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/84.jpg)
en présence de glucosel’adenylate cyclase n’est pas activée
X
lactose
adenylatecyclase
catabolite répresseur protéine
XX
![Page 85: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/85.jpg)
X lactose
adenylatecyclase
catabolite répresseur protéine CRP
opéron lactose???? quel cible?
en l’absence de glucosel’adenylate cyclase est activéeet la forme active CRP est presente
![Page 86: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/86.jpg)
AMPc
CRP activée
transcription par RNApol
répresseur LacI inactif
promoteur lac
operateur lac libresite de fixationde CRP
La double régulation de l’opéron lac– activation par CRP et répression par LacI
en présence du lactose et en l’absence de glucoseCAP+AMPc active la transcription de l’opéron lac
![Page 87: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/87.jpg)
La position du site de fixation de CAP dans le promoteur de l’opéron lac
![Page 88: Un modèle de régulation - la répression cataboliquetsunku111.free.fr/University of Paris VI/BMC4212009cours.pdf · Le phénomène d’adaptation enzymatique –les bactéries sont](https://reader031.vdocuments.fr/reader031/viewer/2022022613/5b9e3bc509d3f2e02c8b5947/html5/thumbnails/88.jpg)
Quel est le rôle de CRP dans la régulation de l’opéron lac?
1 - c’est un activateur transcriptionnel
2 – son rôle n’est pas accessoire, sans CRP l’opéron lac n’est pas transcrit
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Le mécanisme d’action de CAP
promoteur canonique-35 -10
TTGACA TATAAT
promoteur lacTTTACA TATGTT
promoteur lacUV5 indépendant de CAPTATAAT
sans CAP le complexe ouvert ADN/ARNpol n’est pas stable
T69T79G61A56C54A54 -- 161717431817 -- T77A76T60A61A56T82
-61 +1
opérons lactose, arabinose opéron galactose-50
ARNPol.alfa
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4 états de l’opéron lac - état 1
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4 états de l’opéron lac - état 2
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4 états de l’opéron lac - état 3
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Double verrouillage en l’absence de lactose et en l’absence de glucose
CAP favorise la formation d’uneboucle de 93pb
-82 +11
LacItétramère
CAP
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4 états de l’opéron lac - état 4
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Comment le glucose activela répression catabolique?
Modèle 1 – inhibition de l ’activité de l’AMP cyclique par EIIA-Glu
variation de la concentration de l’AMPc
Modèle 2 – inhibition de l ’activité de la lactose perméase (exclusion de l’inducteur) par le système PTS
X
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TD4
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TD5
EIIBC
sans action de CRP sur le gène ptsGil n’a pas de répression catabolique
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TD6
Inhibition de l’entrée du lactose… par le lactose lui-même
Troisième clef de la régulation???
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TD7
Comment EIIA-Glu agit sur l’adénylate cyclase
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Partie 4
X opéron lactose
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Combien de gènes lacZ chez E. coli ?
étalerlacZlacY+ lacA+ sur milieu minimum+lactose
pas d’activitéb-gal autre que codée par lacZ
il existe une autreactivité b-gal
soit soit
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http://genolist.pasteur.fr/Colibri/
ebgA– « evolved » beta galactosidase
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l’opéron lac est faiblement exprimé même en l’absence de l’inducteur – LA FUITE
Pourquoi une régulation parfaite serait-t-elle une erreur biologique?
La fuite transcriptionnelle de l’opéron lac ou le paradoxe d’une régulation parfaite
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avec la fuite
-après une longue absence le lactoseest ajouté dans le milieu
- les bactéries possèdent toujours quelques molécules de LacY et LacZpour transporter le lactose et produirel’inducteur - allolactose
- l’induction du système est donc possible;l’opéron lac s’exprime; le lactose estmassivement transporté et consommé
opéron lacest faiblement exprimé même en l’absence de l’inducteur
Pourquoi une régulation parfaite serait-t-elle une erreur biologique?
sans fuite
La fuite transcriptionnelle de l’opéron lac ou le paradoxe d’une régulation parfaite
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avec la fuite
-après une longue absence, le lactoseest ajouté dans le milieu
- les bactéries possèdent toujours quelques molécules de LacY et LacZpour transporter le lactose et produirel’inducteur - allolactose
- l’induction du système est donc possible;l’opéron lac s’exprime; le lactose estmassivement transporté et consommé
lac est faiblement exprimé même en l’absence de l’inducteur
Pourquoi une régulation parfaite serait-t-elle une erreur biologique?
sans fuite
-aucune molécule LacY n’est présente dans la bactérie;
-le lactose ne rentre pas -l’opéron lac n’est pas induit
-pire encore, l’opéron lac ne peut jamais être induit
- E. coli meurt de faim en baignant dans le lactose
-après une longue absence le lactoseest ajouté dans le milieu
La fuite transcriptionnelle de l’opéron lac ou le paradoxe d’une régulation parfaite
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Et le gène lacA?
Acetyl-CoA
Thiogalactosidetransacetylaseest capable d’acétyler des b-galactosides non métabolisables pour les détoxifier et de les éliminer des cellules. Ses substrats naturels sont inconnus.
Acetyl-CoA + isopropylb-D-thiogalactoside
CoA + acetylatedisopropylb-D-thiogalactoside
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L’opéron lactose est-t-il là pour assurer la dégradation du lactose?
- peu de lactose dans le tract digestif des adultes
- le lactose n’est pas l’inducteur direct de l’opéron lac
- beaucoup de b-galactosides sont libérés pendant la digestion des plantesLes membranes des chloroplastes contiennent beaucoup de b-galactosyl-glycérol
-b-galactosyl-glycérol est à la fois un substrat de la b-galactosidase et un très fort inducteur de l’opéron lac
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le gènes lac ont été transférés dansle génome d’E. coli par le transfert horizontal
les gènes lacI et lacZ n’ont pas le même% de GC que lacYA.L’opéron lac à été rassemblé des sources différentes.
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Partie 5
Travaux pratiques BMC421: les principales expériences
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Les principaux buts de ces TP
- identifier les génotypes d’une collection de mutants par les approchesphénotypiques, par le dosage de la b-galactosidase et par l’analyse à l’aide dela PCR
les gènes visés - lacZ, lacY, lacA, lacI, cya, crp
- lacA – a –t –il un rôle dans la catabolisme du lactose?
- le mutant cya, peut il être sauvé par l’ajout de l’AMPc exogène?
-peut on « sauver » ces mutants cya- par un milieu de culture d’une souche lac+(bio feeding)?
- la fuite de l’opéron lac en l’absence de lactose, existe-t- il vraiment?
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Les principaux buts de ces TP
- construire par la transduction avec le bactériophage P1 et à partir de simplesmutants lacI-::CmR et cyaA::Km un double mutant lacI::Cm cyaA-.
Question posée – quel sera le phénotype de ce mutant en l’absence à la fois de larégulation positive et de la régulation négative
AMPc
CRP activée
transcription par RNApol
répresseur LacI inactif
operateur lac libresite de fixationde CRP
X
X
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Les principaux buts de ces TP
construire par l’approche de génétique inverse les mutants knock-out pour les gènescrr, ptsG, ptsH, cya ou crp. Analyse moléculaire de ce mutants.
- étudier par le dosage de l’activité de la b galactosidase le phénotype de ces mutants pour déterminer si l’effet de glucose est toujours observable et si le rôle de crp et de cya est vraiment important
ptsG
crr
ptsH
crp
cya
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Délétion propre par la recombinaison homologue avec un fragment linéaire
courte région de homologuel’extrémité 5’ du gène
5’ 3’cassette de remplacement
recombinaison homologue
mutant lacA::KmR
lacY lacA cynX
KmR
lacY cynX
X X
courte région de homologuel’extrémité 3’ du gène
lacA::KmR
TD7
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Les principaux buts de ces TP
-- analyser directement la quantité de l’ARMm produit dans le mutant dérépriméLacI- et comparé avec la souche sauvage (RT-PCR)
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Les principaux buts de ces TP
La lecture critique et la discussion de 7 articles scientifiques pour
-mieux comprendre le sujet-comparer vos résultats avec les résultats publiés par des chercheurs chevronnés
TD1TD2
TD3TD4
TD5TD6
TD7
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fin