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  • Thse de doctorat de l'universit Pierre et Marie Curie

    Spcialit Interfaces Physique-Biologie

    Pour obtenir le grade de

    Docteur de l'Universit Pierre et Marie Curie

    Micro-manipulation de l'ADN

    Vers une visualisation directe par

    microscopie de uorescence

    Prsente par M. Adrien Meglio

    Soutenue le 1er avril 2010 devant le jury compos de :

    Prof. Jean-Franois Allemand ExaminateurDr. Vincent Croquette InvitProf. Jean-Franois Joanny ExaminateurDr. Christophe Escud RapporteurDr. Marcelo Nollmann RapporteurProf. David Sherratt ExaminateurDr. Terence Strick Invit

  • Adrien Meglio

    Groupe de Physique des BiomolculesLaboratoire de Physique Statistique

    Tel. +33 1 44 32 34 96Fax. +33 1 44 32 34 [email protected]

    http://www.lps.ens.fr

    Ecole Normale Suprieure - 24 rue Lhomond - 75231 Paris Cedex 05 France

  • Remerciements

    Oui, c'est elle ! C'est la desse !

    En ce jour qui vient nous unir,

    Et dle ma promesse,

    Comme un frre je veux te

    chrir !

    C'est elle, c'est la desse

    Qui vient en ce jour nous unir !

    Oui, partageons le mme sort,

    Soyons unis jusqu' la mort !

    (Bizet, Les Pcheurs de Perles)

    Avant d'aborder le travail scientique que j'ai eectu pendant cette thse, je tiens souligner qu' mes yeux elle n'est pas un vnement isol et dnitif, mais qu'elles'inscrit en compagnie d'autres activits et d'autres personnes qui ont contribu monpanouissement.

    En particulier, je suis reconnaissant mes parents, Gilbert et Soa, d'avoir su m'ac-compagner avec subtilit depuis mon enfance sans jamais me donner l'impression d'treforc quoi que ce soit, sinon par le plaisir de bien le faire. Les principaux enseignementsque je pense avoir retirs de leur ducation sont l'obligation permanente de vrit etd'humilit. Cette pratique qu'ils m'ont transmise n'est sans doute pas trangre monengagement scientique.

    Je me rappelle galement de mes plus jeunes annes, avec mon frre Arno qui a t la fois un compagnon de jeux et un contradicteur formidable, et dont j'admire toujoursla retenue et la profondeur de vue.

    Pendant le temps pass dans les direntes sections de l'enseignement public, j'aitoujours eu la chance d'avoir d'excellents professeurs et surtout d'avoir su retirer deleur passion d'enseigner une passion d'apprendre. J'ai oubli le nom de certains d'entreeux, d'autres plus rcents dont le souvenir est plus frais comme Chantal de Zamaroczy,Bernard Chambaz, Dominique Zann, Paul Watson, Grard Mantin et Yves Dulac.

    Tous ont eu l'intelligence de nous prsenter la connaissance et la comprhension denotre monde (que ce soit en histoire, en littrature ou en physique) comme un modede vie qui se concevait comme un projet personnel et pas comme une distinction reuepar certains et refuse d'autres. Etant devenu moi-mme enseignant, j'ai toujours eu coeur de susciter chez mes lves l'intrt d'observer le monde qui les entoure avec desyeux vifs.

    Je suis galement reconnaissant de la grande diversit de recrutement des lves que j'yai trouv, que ce soit pendant mes annes Neuilly ou Louis-le-Grand, par laquelle mesamis et moi nous sommes muls mutuellement par nos caractres complmentaires. Letravail en commun et les confrontations de points de vue sont des lments essentiels del'enseignement que j'ai reu. De mes amis au collge Aryan Nikeghbali, Marc El-Kouheiriet Michal Fribourg, ou en classes prparatoires Julien Dahan, Mario Nicolas, LaurentCohen-Solal et Johann Walter, je garde un souvenir plein de gratitude comme s'ils avaientt mes professeurs.

    En entrant l'ENS, j'ai fait le choix de la libert de l'apprentissage. Je pense quecette libert provenait de la conance que les professeurs mettaient en leurs lves. Cette

    i

  • Remerciements

    philosphie a t particulirement panouissante pour moi puisque j'y ai commenc tre vraiment acteur de mon propre apprentissage. Certaines gures m'ont plus partic-ulirement marqu, parce qu'elles m'ont ouvert plus encore les yeux sur ces possibilits :Ludovic Jullien, Romain Graziani, Pierre Turq, Jean-Franois Allemand, Pierre Sina ,Goerey Bodenhausen, Clotilde Policar...J'y ai galement trouv des camarades dont l'acuit intellectuelle, mais surtout la force

    de caractre, m'ont encourag construire une personnalit propre : Johanna Brazard,Lucie Norel, Plamen Bokov, Romain Planques, Fabien Trousselet, Fabrice Deschtres,Fabien Montel.Cette construction s'est faite elle aussi sous l'inuence du plaisir du partage et de la

    jouissance de la dcouverte. Par l'coute, l'observation et la dgustation, j'ai beaucoupappris du vin de Francois Rosenfeld, Axel Marchal et Lucile Petit, et j'ai maintenant leplaisir de le partager avec la bonne chre en compagnie de mes camarades Rmy Verdo,Lorenzo Sterzi, Mlanie Plican, Franois Falconet, Guillaume Stirnemann, Pierre Lairez,Aurlien Momin, Benot Richert, Florian Caero, Mathieu Valdenaire, Michal Mestreet Matthieu Solnon.Le temps de mes tudes termin, je pense que ma personnalit et ma sensibilit scien-

    tique se sont naturellement trouves mises en adquation avec mon laboratoire de thse,et plus particulirement avec Jean-Franois Allemand. Je pense que nous nous sommesmutuellement trouvs une joie d'ouvrir les yeux sur le monde devant nous, qu'il soit dansune assiette ou sur une paillasse.J'ai galement admir le regard pntrant que Vincent Croquette porte sur presque

    toute chose dont j'ai pu discuter avec lui, qualit que j'avais galement apprcie chezLudovic Jullien lorsque j'avais travaill chez lui en compagnie de Damien Alcor et An-dr Estevez-Torres. De mes encadrants, seul David Bensimon porte peut-tre plus fortl'enthousiasme quotidien de la recherche scientique par un sourire et un foisonnementd'ides permanent.Je les remercie de m'avoir permis de partager ces annes passionnantes en compag-

    nie de membres du groupe plus expriments dont j'ai cherch atteindre la vivacitintellectuelle, comme Terence Strick, Keir Neumann, Omar Saleh, Gilles Charvin, PierreNeveu et Timothe Lionnet. J'ai surtout pass ce temps en compagnie d'autres jeuneschercheurs : Thomas Julou, Elise Praly, Etienne Cavatore, Fangyuan Ding, FrancescoMosconi, avec qui j'ai toujours apprci de partager points de vue et tats d'me.Naturellement, j'ai partag cette joie permanente d'ouvrir les yeux sur le monde, qui

    n'a pas t dpourvue d'interrogations sur ce que j'y voyais ou pas, avec Alexis Bizon.De ces annes de vie, professionnelle en tant que jeune chercheur autant que personnelle,je garde au moment de conclure la rdaction de ce manuscrit un sentiment de plaisir deles avoir vcues avec gourmandise, intensit et en si bonne compagnie.

    ii

  • Table des matires

    Remerciements i

    Rsum 1

    Franais . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

    English . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1

    I Ractivit biologique l'chelle de la molcule unique 3

    Ractivit biologique l'chelle de la molcule unique 5

    Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

    A l'chelle de la molcule unique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5

    Les translocases ADN et protines apparentes . . . . . . . . . . . . . . . . . 6

    Rsultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7

    1 Techniques de micromanipulation 9

    1.1 Questions d'chelle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

    1.1.1 Longueurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10

    1.1.2 Actuateurs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

    1.1.3 Pourquoi l'ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 11

    1.2 Microbre optique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

    1.3 Microscopie force atomique (AFM) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

    1.4 Pinces optiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 13

    1.5 Pinces magntiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

    1.6 Comparaison . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

    1.6.1 Comparaison qualitative . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 14

    1.6.2 Rsolution force-bande passante . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

    1.6.3 Rsolution spatiale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

    1.6.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16

    2 Dtection de molcules uniques par uorescence 17

    Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

    2.1 Fluorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17

    2.1.1 Principe de la uorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 18

    2.1.2 Quantication de l'absorbance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19

    2.1.3 Rendement quantique et brillance . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21

    2.1.4 Etat lectronique du uorophore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

    2.1.5 Photodestruction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 23

    2.1.6 Etats sombres et clignotement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

    2.1.7 Eets du clignotement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 24

    2.1.8 Transferts non-radiatifs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 25

    2.1.9 Excitation deux photons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 26

    2.2 Marqueurs uorescents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

    iii

  • Table des matires

    2.2.1 Fluorophores organiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 27

    2.2.2 Quantum Dots . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28

    2.2.3 Protines uorescentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29

    2.2.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

    2.3 Techniques d'excitation en solution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

    2.3.1 Excitation directe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 30

    2.3.2 Excitation en ondes vanescentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 32

    2.3.3 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 33

    2.3.4 Techniques de modulation temporelle . . . . . . . . . . . . . . . . . 35

    2.3.5 Techniques de modulation spatiale transverse . . . . . . . . . . . . 36

    2.3.6 Microscopie 4Pi . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 41

    2.3.7 Excitation deux photons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 42

    2.4 Techniques de dtection de signaux de uorescence de uorophores uniques 43

    2.4.1 Problmatiques gnrales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 43

    2.4.2 Introduction aux dtecteurs de uorescence . . . . . . . . . . . . . 45

    2.4.3 Microscopie de uorescence directe . . . . . . . . . . . . . . . . . . 47

    2.4.4 Imagerie multicouleurs et Dual View . . . . . . . . . . . . . . . . . 48

    2.4.5 Microscopie confocale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 49

    2.5 Techniques de localisation de uorophores . . . . . . . . . . . . . . . . . . 52

    2.5.1 Le critre de Rayleigh dans le plan transverse . . . . . . . . . . . . 52

    2.5.2 Localisation par calibration position-intensit . . . . . . . . . . . . 55

    2.5.3 Colocalisation par FRET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 56

    Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

    II Pinces magntiques et uorescence en ondes vanescentes 59

    3 Micro-manipulation par pinces magntiques 61

    Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

    3.1 Principe des expriences . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 61

    3.2 Le dispositif . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

    3.2.1 Description globale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

    3.2.2 Microchambre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

    3.2.3 Optique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

    3.2.4 Bti . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 64

    3.2.5 Aimants . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 65

    3.3 Billes magntiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

    3.4 Suivi vido et mesure de position . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 66

    3.5 Mesure de force . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

    3.5.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

    3.5.2 Principe de la mesure de force . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69

    3.5.3 Comment est vraiment mesure la force . . . . . . . . . . . . . . . 693.5.4 Comment est vraiment vraiment mesure la force . . . . . . . . . . 703.5.5 Eet des paramtres exprimentaux sur la bande passante . . . . . 73

    Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73

    4 Physique statistique de l'ADN 75

    4.1 Comportement en traction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 75

    4.1.1 Corrections haute force . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 76

    4.2 Comportement en torsion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

    iv

  • Table des matires

    4.2.1 Etude des phases de l'ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 774.3 Application aux expriences en molcule unique . . . . . . . . . . . . . . . 80

    III Expriences 83

    5 Caractristiques exprimentales du montage 85Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 855.1 Calibrations et mesures . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85

    5.1.1 Rendement de transmission des optiques . . . . . . . . . . . . . . . 855.1.2 Excitation TIRF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 865.1.3 Calibration du grandissement du montage . . . . . . . . . . . . . . 865.1.4 Stabilit mcanique (pinces magntiques) . . . . . . . . . . . . . . 885.1.5 Stabilit mcanique (uorescence) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 885.1.6 Correction des drives (uorescence) . . . . . . . . . . . . . . . . . 895.1.7 Mesure de z (uorescence) . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 905.1.8 Bruit de mesure de z (pinces magntiques) . . . . . . . . . . . . . . 925.1.9 Bruit de mesure en (x,y) (pinces magntiques) . . . . . . . . . . . 935.1.10 Prcision de point en (x,y) (uorescence) . . . . . . . . . . . . . . 935.1.11 Contrle indpendant de z (pinces magntiques) . . . . . . . . . . 975.1.12 Proprits du dtecteur CCD . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 985.1.13 Conclusion sur les expriences de calibration . . . . . . . . . . . . . 99

    5.2 Expriences de principe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1005.2.1 Dtection transitoire d'un uorophore unique . . . . . . . . . . . . 1005.2.2 Excitation multicolore alterne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1015.2.3 Suivi d'un Quantum Dot unique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1025.2.4 Combinaison pinces magntiques - uorescence en ondes vanescentes1035.2.5 Conclusion sur les expriences de principe . . . . . . . . . . . . . . 104

    6 Stratgies de marquage uorescent 105Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1056.1 Prparation des ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 105

    6.1.1 Principe gnral . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1056.1.2 Prparation du fragment central . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1076.1.3 Prparation des fragments extrieurs . . . . . . . . . . . . . . . . . 1086.1.4 Cas particulier de la torsion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1106.1.5 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

    6.2 Prparation des protines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1116.2.1 FtsK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1116.2.2 ARN Polymrase de E. Coli . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1116.2.3 ARN Polymrase de T7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 112

    6.3 Marquage des protines . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1126.3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1126.3.2 Marquage direct . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1126.3.3 Marquage en excs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1136.3.4 Pr-purication par critre de taille . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1136.3.5 Pr-purication par critre de charge . . . . . . . . . . . . . . . . . 1146.3.6 Purication par critre de taille . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 114

    6.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 115

    7 Etude de la transcription chez le phage T7 117

    v

  • Table des matires

    Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

    7.1 Introduction la transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 117

    7.1.1 Le dogme central de la biologie molculaire . . . . . . . . . . . . . 117

    7.1.2 Les formes de transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

    7.1.3 La rgulation de la transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

    7.2 Les mcanismes de la transcription des ARNm . . . . . . . . . . . . . . . 119

    7.2.1 Etudes structurelles et mcanistiques des ARN polymrases . . . . 120

    7.2.2 Transcription par les ARN polymrases bactriennes . . . . . . . . 121

    7.2.3 Discussion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 124

    7.3 La transcription chez le bactriophage T7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . 126

    7.3.1 Le bactriophage T7 et son ARN polymrase . . . . . . . . . . . . 126

    7.3.2 Transcription par l'ARN Polymrase de T7 . . . . . . . . . . . . . 127

    7.3.3 Un modle pour la transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

    7.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 130

    8 Caractrisation de l'activit de l'ARN polymrase 133

    Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

    8.1 Inuence de la biotinylation sur l'activit . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

    8.1.1 Principe de l'exprience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

    8.1.2 Rsultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 133

    8.1.3 Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 135

    8.2 Elments de cintique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

    8.2.1 Principe de l'exprience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 138

    8.2.2 Attribution des bandes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

    8.2.3 Rsultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 139

    8.2.4 Analyse . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 141

    8.3 Inuence de la temprature . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

    8.3.1 Principe de l'exprience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

    8.3.2 Rsultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 143

    8.3.3 Analyse : Cintique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

    8.3.4 Analyse : Rpartition des transcrits . . . . . . . . . . . . . . . . . . 144

    8.3.5 Analyse : Proportion de rNTP incorpors . . . . . . . . . . . . . . 145

    8.3.6 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 145

    8.4 Inuence de la concentration en nuclotides . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

    8.4.1 Principe de l'exprience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

    8.4.2 Rsultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

    8.4.3 Analyse : cintique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 146

    8.4.4 Analyse : Rpartition des transcrits . . . . . . . . . . . . . . . . . . 147

    8.4.5 Analyse : Proportion de rNTP incorpors . . . . . . . . . . . . . . 148

    8.4.6 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148

    8.5 Incorporation de nuclotides modis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 148

    8.6 Couplage un uorophore . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

    8.6.1 Protocole . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

    8.6.2 Inuence du couplage sur l'activit . . . . . . . . . . . . . . . . . . 149

    Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

    9 Expriences en molcules uniques sur l'ARN polymrase 153

    9.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 153

    9.1.1 Contraintes des manipulations en molcule unique . . . . . . . . . 153

    9.1.2 Substrats d'ADN utiliss . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 154

    vi

  • Table des matires

    9.2 Activit mcanique en molcule unique de l'ARN Polymrase de T7 . . . . 1549.2.1 Principe de l'exprience . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1549.2.2 Dnaturation spontane de l'ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1569.2.3 Visualisation de l'insertion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1569.2.4 Sensibilit de l'insertion la torsion . . . . . . . . . . . . . . . . . 1589.2.5 Visualisation de l'insertion en prsence de bruit . . . . . . . . . . . 1609.2.6 Visualisation en prsence de bruit (suite) . . . . . . . . . . . . . . 1619.2.7 Complexe pr-chargs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 162

    9.3 Marquage uorescent de l'ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1639.3.1 Incorporation de nuclotides uorescents . . . . . . . . . . . . . . . 1639.3.2 Sonde uorescente . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1649.3.3 Marquage secondaire de l'ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164

    Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 165

    10 FtsK et la sgrgation des chromosomes chez Escherichia coli 167Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16710.1 FtsK et les protines ASCE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 167

    10.1.1 La superfamille FtsK/HerA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16710.1.2 ASCE core ATPases . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 168

    10.2 Structure et activit in vitro de FtsK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16910.2.1 Structure primaire et secondaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16910.2.2 Activit in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17010.2.3 Structure tertiaire et quaternaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17110.2.4 FtsK-C/alpha/beta . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 172

    10.3 Modles structuraux et mcanistiques de FtsK . . . . . . . . . . . . . . . . 17410.3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17410.3.2 Composition de l'unit moteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17410.3.3 Nombre d'units moteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17610.3.4 Coordination de l'activit ATPase . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17710.3.5 Couplage mcanochimique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17910.3.6 Interaction avec les squences de polarisation du chromosome . . . 180

    10.4 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181

    11 Article Crozat, Meglio et al. 183

    12 Autres lments sur l'tude de FtsK en molcule unique 195Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19512.1 Mutants de l'unit moteur du complexe de FtsK . . . . . . . . . . . . . . 19512.2 Activit ADN translocase de mutants en molcules uniques . . . . . . . . 196

    12.2.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19612.2.2 Description . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19712.2.3 Comparaison avec les donnes connues . . . . . . . . . . . . . . . . 19712.2.4 Activit de FtsKc . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20012.2.5 Activit des mutants WA, WB et RF . . . . . . . . . . . . . . . . . 20312.2.6 Inuence de la force de tension . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 206

    12.3 Complexes xs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20812.3.1 Introduction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20812.3.2 Comportement observ . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20812.3.3 Interprtation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21012.3.4 Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 210

    12.4 Rsultats sur les complexes xs . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 211

    vii

  • Table des matires

    12.4.1 Stimulation de l'activit de formation de boucle . . . . . . . . . . . 21112.4.2 Etude basse concentration en ATP . . . . . . . . . . . . . . . . . 21112.4.3 Etude du vieillissement protique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212

    12.5 Modulation de l'activit ADN translocase . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21412.5.1 Eet de la concentration en ATP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21412.5.2 Eet de la concentration en ADP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 215

    12.6 Activit ATPase non processive . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21712.7 Conclusion . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 218

    Conclusions gnrales 219Rappel des rsultats . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 219Perspectives . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 219

    IV Annexes 221

    13 Remerciements 22313.1 Collaborations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 22313.2 Financements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 224

    14 Protocoles 225Protocole 1 Antiobiotiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 226Protocole 2 Prparation de milieux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 228Protocole 3 Prparation de cellules comptentes . . . . . . . . . . . . . . . . 229Protocole 4 Transformation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 230Protocole 5 Slection de colonies bactriennes . . . . . . . . . . . . . . . . . 231Protocole 6 Extraction d'ADN (sur colonne) . . . . . . . . . . . . . . . . . . 233Protocole 7 Extraction d'ADN (Phnol-Chloroforme) . . . . . . . . . . . . . 234Protocole 8 Purication d'ADN (isopropanol/actate) . . . . . . . . . . . . . 236Protocole 9 Purication d'ADN (gel d'agarose) . . . . . . . . . . . . . . . . 237Protocole 10 Double restriction . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 238Protocole 11 Dephosphorylation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 240Protocole 12 Hybridation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 241Protocole 13 Ligation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 242Protocole 14 Restriction simple . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 243Protocole 15 PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 244Protocole 16 RNAP Test in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 246Protocole 17 RNAP Expression de proteine biotinyle . . . . . . . . . . . . 247Protocole 18 RNAP Purication de protine biotinyle . . . . . . . . . . . 249Protocole 19 RNAP contrle de l'expression . . . . . . . . . . . . . . . . . 251Protocole 20 Fluorescence Nettoyage de surfaces . . . . . . . . . . . . . . . 254Protocole 21 Pinces magntiques Films hydrophobes . . . . . . . . . . . . 256Protocole 22 Fluorescence Film hydrophile . . . . . . . . . . . . . . . . . . 257Protocole 23 Pinces magntiques Surface anti-digoxygnine . . . . . . . . . 258Protocole 24 Pinces magntiques/uorescence Surface biot ou strep . . . . 259Protocole 25 Pinces magntiques Greage sur billes magntiques . . . . . . 261Protocole 26 Pinces magntiques Greage des complexes bille-ADN . . . . 263Protocole 27 Pinces magntiques et uorescence Purication de marqueurs 265Protocole 28 T7RNAP Prparation de complexes bloqus . . . . . . . . . . 267Protocole 29 T7RNAP Test d'activit in vitro . . . . . . . . . . . . . . . . 269Protocole 30 Rglage optique Faisceau d'excitation . . . . . . . . . . . . . 270

    viii

  • Table des matires

    Protocole 31 Rglage optique Alignement de la bre optique . . . . . . . . 272Protocole 32 Rglage optique Alignement de la source . . . . . . . . . . . . 274Protocole 33 Rglage optique Mise en uvre de l'onde vanescente . . . . 276Protocole 34 Rglage optique Alignement des camras . . . . . . . . . . . 278

    15 Solutions 28115.1 Solution de stockage au glycrol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28115.2 Solution TfbIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28115.3 Solution TfbIIA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28115.4 Tampon TAE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28115.5 Tampon PP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28115.6 Tampon PP-gly . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28215.7 Tampon PIPES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28215.8 Tampon HEPES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28215.9 Tampon Tris Acetate pH 7,9 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28215.10Tampon PBS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28215.11Tampon de passivation PB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28215.12Tampon pour surfaces SB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28315.13Tampon de base pour purication de protines APB . . . . . . . . . . . . 28315.14Tampon de lyse cellulaire LyB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28315.15Tampon bas sel LSB . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28315.16Tampon TE . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28315.17Tampon de transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28315.18Tampon pour FtsK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 284

    16 Calculs, dtails et prcisions 28516.1 Etude des phases de l'ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 285

    16.1.1 Description . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28516.1.2 Transition en torsion basse force . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28716.1.3 Transition en torsion haute force . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28916.1.4 Transition en force torsion ngative . . . . . . . . . . . . . . . . . 291

    16.2 Physique du montage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29216.2.1 Mesure de la force magntique (dans l'espace direct) . . . . . . . . 29216.2.2 Mesure de la force magntique (dans l'espace rciproque) . . . . . 29316.2.3 Statistique de photons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 294

    ix

  • Table des matires

    x

  • Table des gures

    1.1 Catalyse enzymatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91.2 Allostrie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101.3 Micromanipulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121.4 Mthodes de micromanipulation d'ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 12

    2.1 Transition adiabatique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 182.2 Transition verticale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 192.3 Transitions condusant l'mission de uorescence . . . . . . . . . . . . . . 202.4 Superposition des spectres d'absorption et d'mission de Cy5 . . . . . . . 202.5 Dsexcitation non radiative . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 212.6 Leve de l'interdition de spin . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 222.7 Clignotement d'un uorophore organique unique . . . . . . . . . . . . . . 252.8 Variation de l'ecacit de Fret . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262.9 Excitation deux photons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 262.10 Spectres d'absorption un et deux photons . . . . . . . . . . . . . . . . . 272.11 Fluorescence d'une srie de Quantum Dots . . . . . . . . . . . . . . . . . . 292.12 Optique d'excitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 312.13 Schma optique d'excitation directe deux longueurs d'onde . . . . . . . . 312.14 Longueur de pntration dans l'eau pure . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 322.15 Augmentation de l'angle de dviation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 332.16 Variation de l'intensit de uorescence en fonction de z . . . . . . . . . . . 342.17 Excitation en onde vanescente l'aide d'un prisme . . . . . . . . . . . . . 342.18 Excitation en onde vanescente l'aide d'un objectif . . . . . . . . . . . . 352.19 Facteur de qualit de l'AOTF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 362.20 Temps de rponse d'un ltre acousto-optique accordable . . . . . . . . . . 372.21 Obtention de gures d'interfrence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 382.22 Imagerie haute rsolution . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 392.23 Principe du STED . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402.24 Microscopie confocale versus Sted . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 402.25 Principe de l'illumination structure dans l'espace rciproque . . . . . . . 412.26 Microscopie 4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 422.27 Zone d'excitation un et deux photons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 422.28 Optique d'excitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 432.29 Image d'un uorophore unique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 442.30 Principe de fonctionnement d'un capteur CCD . . . . . . . . . . . . . . . 452.31 Microscopie de uorescence directe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 482.32 Dual View . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 492.33 Fluorescence hors focus . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 502.34 Eet de taille du dtecteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 512.35 Eet d'un stnop sur la profondeur de champ . . . . . . . . . . . . . . . 512.36 Critre de Rayleigh . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 522.37 FIONA . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 532.38 SHRIMP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 54

    xi

  • Table des gures

    2.39 Application de SHREC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 55

    2.40 ALEX-FRET . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 57

    3.1 Stratgie d'ancrage des molcules d'ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 62

    3.2 Le dispositif de pinces magntiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 63

    3.3 Principe du montage permettant la compensation thermique des drives . 65

    3.4 Eet de la compensation thermique sur les drives . . . . . . . . . . . . . 65

    3.5 Proprits magntiques des billes utilises . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67

    3.6 Principe du suivi de la position de la bille . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68

    3.7 Calcul de la force par la mesure des uctuations transverses . . . . . . . . 69

    3.8 Spectre de puissance des uctuations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70

    3.9 Repliement du spectre . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71

    3.10 Anisotropie de la constante de raideur du pige magntique . . . . . . . . 72

    4.1 Courbe Force-Extension exprimentale . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77

    4.2 Formation de plectonemes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78

    4.3 Courbes extension-torsion basse force . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79

    4.4 Courbes extension-torsion haute force . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

    4.5 Diagramme de phase de l'ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80

    5.1 Elements visibles en TIRF . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

    5.2 Calibration du grandissement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 87

    5.3 Drives mcaniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88

    5.4 Spectre des drives mcaniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 89

    5.5 Eet des uctuations de plan focal . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 90

    5.6 Correction des variations d'excitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 91

    5.7 Mesure de z en uorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92

    5.8 Mesure de z en pinces magntiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

    5.9 Suivi direntiel de position . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93

    5.10 Suivi (x,y) en pinces magntiques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94

    5.11 Suivi (x,y) en microscopie de uorescence . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95

    5.12 Prcision de point de uorescence en (x,y) . . . . . . . . . . . . . . . . . 96

    5.13 Dpendance de la prcision avec le temps d'intgration . . . . . . . . . . . 96

    5.14 Mesure du nombre de photons . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 97

    5.15 Calibration directe de la camera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 98

    5.16 Calibration alternative de la camera . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 99

    5.17 Observation de uorophores uniques . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

    5.18 Excitation alterne . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 101

    5.19 Clignotement d'un Quantum dot . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 102

    5.20 Combinaison pinces magntiques - uorescence en ondes vanescentes . . . 103

    6.1 Schma de prparation des ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 106

    6.2 Prparation du fragment central par digestion . . . . . . . . . . . . . . . . 107

    6.3 Prparation du fragment central par PC . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 108

    6.4 Attachement en pingle cheveux . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 110

    6.5 Purication du complexe ARNP-streptavidine . . . . . . . . . . . . . . . . 115

    7.1 Dogme central de la biologie molculaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 118

    7.2 L'opron lactose . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 119

    7.3 Schma de la transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

    7.4 Etats du complexe RNAP:ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 121

    xii

  • Table des gures

    7.5 Facteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1227.6 Complexe RPo . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1227.7 Complexe RPitc et scrunching . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1237.8 Pauses transcriptionnelles . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1247.9 Infection par le phage T4 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1277.10 Reconnaissance du promoteur T7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1287.11 Dtachement du promoteur . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1287.12 Ouverture du canal du transcrit . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1297.13 Structure de la bulle de dnaturation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1297.14 Rotation de la RNAP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 131

    8.1 Test de transcription par la polymrase biotinyle . . . . . . . . . . . . . . 1348.2 Linarit de la mesure de quantit d'ARN . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1368.3 Test d'intgrit de l'ADN de rfrence . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1378.4 Gel de la cintique de transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1398.5 Analyse de la cintique de transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1408.6 Rpartition des transcrits 37C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1418.7 Rpartition des nuclotides incorpors dans les transcrits 37C . . . . . . 1418.8 Composantes de la vitesse de transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1428.9 Gel de la cintique de transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1438.10 Analyse de la cintique de transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1448.11 Rpartition des transcrits 15C et 25C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1458.12 Rpartition des nuclotides incorpors dans les transcrits 15C et 25C . 1458.13 Gel de la cintique de transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1468.14 Analyse de la cintique de transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1478.15 Rpartition des transcrits 25C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1478.16 Rpartition des nuclotides incorpors dans les transcrits 25C . . . . . . 1488.17 Incorporation de nuclotides modis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1508.18 Activit en prsence de streptavidine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 151

    9.1 Exemples de constructions d'ADN utilises . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1559.2 Ouverture de bulles de dnaturation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1569.3 Diagramme de phase des bulles de dnaturation . . . . . . . . . . . . . . . 1579.4 Insertion de RNAP en l'absence de rNTP . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1579.5 Insertion de RNAP en prsence de rNTP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1589.6 Dcalage des courbes en chapeau . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1599.7 Dcrochement l'aller . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1599.8 Dcrochement au retour . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1609.9 Evnement d'jection d'une RNAP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1619.10 Changement d'extension lors de l'jection d'une RNAP . . . . . . . . . . . 1629.11 R-insertion rapide d'une RNAP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1629.12 Evnements en prsence d'ATP uorescent . . . . . . . . . . . . . . . . . . 164

    10.1 Resolution de dimres de chromosomes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16710.2 Structure secondaire de FtsK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16810.3 FtsK et les protines apparentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16910.4 Structure primaire de FtsK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 16910.5 Structure de FtsK-C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17110.6 Structure partielle de FtsK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17210.7 Structure du complexe FtsK-ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17210.8 Changement conformationnel dans FtsK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 173

    xiii

  • Table des gures

    10.9 Structure de l'interaction de FtsK avec KOPS . . . . . . . . . . . . . . . . 17410.10Formtion d'hexamres de FtsK sur l'ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17510.11Modles de la structure du complexe actif de FtsK . . . . . . . . . . . . . 17610.12Modles de cooprativit de l'activit ATPase . . . . . . . . . . . . . . . . 17810.13Exemple d'eet du nombre de mutants sur l'activit . . . . . . . . . . . . 17810.14Modles mcanochimiques apparents . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 180

    12.1 Domaines de FtsK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19512.2 Variants de FtsK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19612.3 Translocation de FtsK-50C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19812.4 Dtection automatique des vnements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19812.5 Distribution des vitesses pour FtsK-50C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 19912.6 Processivit de FtsK-50C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20012.7 Translocation de FtsK-C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20112.8 Vitesse de FtsK-50C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20112.9 Raccrochement du complexe . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20212.10Vitesse de mutants de FtsK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20312.11Comparaison de l'activit des mutants de FtsK . . . . . . . . . . . . . . . 20412.12Stimulation de l'activit des complexes xs . . . . . . . . . . . . . . . . . 20412.13Possibilit alternatives de structure du complexe actif . . . . . . . . . . . . 20512.14Dplacement de la liaison biotine-streptavidine par FtsK . . . . . . . . . . 20712.15Dpendance en force de la vitesse de translocation de FtsK . . . . . . . . 20712.16Absence d'eet de la biotinylation sur l'activit . . . . . . . . . . . . . . . 20912.17Rinage de la cellule . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 20912.18Formation de dirents types de boucles d'ADN . . . . . . . . . . . . . . . 21112.19Evenements de FtsK basse concentration en ATP . . . . . . . . . . . . . 21212.20Processivit de FtsK basse concentration en ATP . . . . . . . . . . . . . 21212.21Vieillissement rapide . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 21312.22Activit de FtsK en fonction de la concentration en ATP . . . . . . . . . . 21512.23Inhibition par l'ADP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 217

    14.1 Diagramme schmatique du cycle de PCR . . . . . . . . . . . . . . . . . . 245

    16.1 Torsion de l'ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28516.2 Formation de plectonemes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28616.3 Transition plectonmique basse force . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28816.4 Courbes extension-torsion basse force . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 28916.5 Transition de dnaturation haute force . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29016.6 Courbes extension-torsion haute force . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29116.7 Transition plectonmes/dnaturation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29116.8 Diagramme de phase de l'ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 29216.9 Le pige magntique vu comme un pendule invers . . . . . . . . . . . . . 29216.10Fluctuations x,y,z . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 293

    xiv

  • Liste des tableaux

    1.1 Techniques de micromanipulation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 15

    4.1 Coecients du modle du ver . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 764.2 Quantits utiles dans le traitement du comportement de l'ADN en torsion 78

    5.1 Rendement des optiques d'excitation . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 855.2 Rendement des optiques de dtection . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 855.3 Calibrations et proprits du montage . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 100

    6.1 Prparation des fragments d'ADN . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 111

    7.1 Donnes structurales sur les RNAP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1207.2 RNAP en molcule unique . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 120

    8.1 Inuence de la biotinylation sur l'activit . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1348.2 Cintique de transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1388.3 Vitesse d'incorporation des rNTP 37C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1408.4 Cintique de transcription . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1438.5 Vitesse d'incorporation des rNTP 25C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1448.6 Vitesse d'incorporation des rNTP 25C . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1478.7 Incorporation de ribonuclotides modis . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1498.8 Inuence de la streptavidine . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 150

    9.1 Plasmides utiliss pour la transcription en molcules uniques . . . . . . . . 1549.2 Table des constructions d'ADN utilises . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 1559.3 Observation de T7 RNAP en molcule unique . . . . . . . . . . . . . . . . 165

    10.1 Structure et mcanisme de protines analogues FtsK . . . . . . . . . . . 17510.2 Consquences des modles du complexe actif de FtsK . . . . . . . . . . . . 17710.3 Eet de mutations selon le modle . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 17810.4 Expriences proposes sur FtsK . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 181

    14.1 Test d'activit in vitro de RNAP . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 269

    xv

  • Liste des tableaux

    xvi

  • Rsum

    Franais

    Dans ce travail, nous proposons un nouvel appareillage, destin aider la dter-mination du mcanisme de certaines protines. Cet outil, qui combine un appareil depinces magntiques, et un microscope de uorescence en ondes vanescentes, a t conupour pemettre la fois la manipulation mcanique et l'observation de l'activit d'ADNtranslocases l'chelle de la molcule unique.Nous prsentons d'abord ici la conception, la ralisation et l'exprimentation de ce

    montage. Nous montrons que, d'une part, il se compare favorablement ses composantsspars (pinces magntiques et microscope de uorescence), et que d'autre part leurrunion dans un appareil unique permet d'obtenir des rsultats d'un type nouveau.Nous avons orient l'tude des ADN translocases avec cet appareil sur l'exemple de

    deux protines : le moteur FtsK de Escherichia coli et l'ARN Polymrase de T7. Nousdtaillons dans cette tude les questions importantes encore en suspens concernant lemcanisme et prsentons les expriences que nous avons envisages pour y rpondre.Nous relatons ensuite galement la dicult que nous avons rencontre obtenir des

    substrats protiques adapts aux expriences que nous avons envisages, et les solutionsque nous avons mises en oeuvre pour y remdier.Enn, nous analysons les rsultats obtenus dans des expriences en volume ou en pinces

    magntiques seules, qui ont permis de mettre en valeur de nouveaux comportements etde prparer la ralisation de nouvelles expriences sur notre montage combin.

    English

    In this work, we present an apparatus designed to help unravel the molecular mech-anism of a certain class of proteins. It combines the capabilities of a magnetic tweezersapparatus with those of a uorescence microscope in TIRF mode. It has been designedto allow for mechanical manipulation and direct observation of DNA translocases at thesingle molecule level.We will rst explain the design and testing of this setup. We will show that it does

    not only compare very well with the state of the art in magnetic tweezers or uores-cence microscope alone, but also that their combination lets us collect a new type ofinformation.More specically, we studied the T7 RNAP polymerase and the FtsK motor from Es-

    cherichia coli . We will highlight the current questions arising concerning their mechanismof action, and propose a set of experiments to address them.Then we will explain why we had a lot of trouble obtaining the adequate uorescent

    protein substrates, and how we believe we will solve this problem.We will nally analyze the results we obtained, either in bulk or magnetic tweezers

    experiments. They have unraveled new behaviours that we plan to use in new experimentson our combined MT/TIRF setup.

    1

  • Rsum

    2

  • Premire partie

    Ractivit biologique l'chelle

    de la molcule unique

    3

  • Ractivit biologique l'chelle de la

    molcule unique

    Rien ne fait voir l'avenir couleur

    de rose

    comme de le contempler

    travers un verre de chambertin

    (Alexandre Dumas)

    Introduction

    Dans ce travail, nous avons entrepris de construire un appareil permettant d'tudier laractivit de protines en conditions de molcules uniques. C'est un objectif que de nom-breux groupes de recherche ont dj ralis en proposant un certain nombre de techniquesoriginales, sur lesquelles nous reviendrons rapidement ultrieurement (p. 9).

    Nous allons d'abord introduire ici le cheminement scientique qui nous a amens choisir un systme cohrent et novateur de manipulation et d'observation de l'activitmcanique d'une certaine classe de protines. Nous nous attacherons expliquer pourquoicette dmarche nous semble intressante pour la comprhension d'un certain nombre decaractristiques biochimiques du vivant.

    A cette chelle la physique, la biologie et la chimie proposent des grilles de lecturedirentes issues de leur histoire propre. De manire gnrale, dans le corps de ce tra-vail, nous nous attacherons montrer combien la pratique exprimentale et thorique la frontire de ces trois disciplines a t, et pourrait encore tre, fructueuse pour leurensemble.

    Nous essaierons de montrer que, au del de la contribution technologique de chacunedes disciplines (par exemple l'optique applique la microscopie ou la chimie applique la synthse de uorophores), ces travaux, leur tour, les enrichissent mutuellement denouveaux modles, et surtout de nouvelles problmatiques.

    A l'chelle de la molcule unique

    Le cadre gnral de ce travail est une contribution l'tude biochimique de certainesprotines. La plupart des techniques d'analyse biochimique utilises sont issues du cadreconceptuel de la chimie analytique : partir d'un modle du comportement l'chellemolculaire (nergie d'activation d'une raction, nergie d'interaction avec une phasestationnaire), est calcul le comportement moyen d'une assemble de molcules (vitessede raction, temps de rtention dans une colonne).

    L'observation du comportement collectif permet, par comparaison avec le modle, demesurer des paramtres molculaires. En ralit, ces expriences ne permettent le plussouvent que de mesurer la valeur moyenne de ces paramtres molculaires. Elles donnentparfois accs l'cart-type, mais presque jamais l'intgralit de la distribution.

    Pourtant, contrairement la plupart des objets tudis en chimie analytique, les pro-tines sont des dices molculaires complexes, pas ncessairement bien caractriss(repliements alternatifs, modications post-traductionnelles, etc.). Une partie de leur

    5

  • Ractivit biologique l'chelle de la molcule unique

    intrt rside d'ailleurs dans la possibilit de moduler de faon importante leur activitpar de petites modications de structure.Dans les cas o la distribution des activits est large autour de sa valeur moyenne, ne

    prendre en compte que cette dernire contribue un appauvrissement de la description l'chelle molculaire : une vitesse moyenne mesure sur un ensemble de protines dontune fraction signicative est inactive conduira dduire une valeur individuelle loignede la ralit molculaire. Cela compliquera l'intgration ultrieure de cette donne dansun modle plus gnral de la protine, par exemple en lien avec des donnes structurales.Dans un nombre restreint de cas, il est cependant possible d'eectuer une mesure de

    l'activit directement l'chelle molculaire, ce que nous appellons ici des expriencesen molcule unique. Nous rappellerons dans les prochains chapitres quelques techniquesprouves permettant d'isoler une molcule parmi l'ensemble des autres et de mesurer sonactivit (p. 9 et 17). Par accumulation des donnes sur un certain nombre de molculesindividuelles, la distribution des activits pourra ainsi tre reconstitue, compare auxdonnes obtenues en volume (c'est dire sur un grand nombre de molcules) et utilisedans un modle plus gnral de la protine tudie.Lors de ce travail, nous avons construit un appareil combinant deux techniques clas-

    siques. Il comprend un micromanipulateur pinces magntiques qui permet de manip-uler et d'observer des modications mcaniques qui rsultent de l'activit d'une protineunique. Nous y avons adjoint un microscope de uorescence qui permet d'observer, dansdes cas favorables, la position et donc le dplacement d'une protine unique conscutive-ment son activit.Bien qu'individuellement ces deux techniques soient dj rpandues, nous montrerons

    que leur utilisation combine peut enrichir les informations observables sur certainesprotines.

    Les translocases ADN et protines apparentes

    Pour tudier une protine en conditions de molcule unique, la dicult principalerside dans la possibilit (ou non) de pouvoir isoler une molcule des autres pendant untemps susant pour raliser une mesure. Il faut galement que cete activit se traduisepar une observable facilement mesurable, la contrepartie principale par rapport aux ex-priences en volume tant un signal trs faible.Historiquement, notre groupe de recherche a contribu au dveloppement des pinces

    magntiques pour l'tude de la physique statistique de l'ADN (p. 75). Notre appareilest le fruit de dveloppements prcdents, qui permettent de manipuler en torsion et entraction une molcule unique d'ADN, par le biais d'une bille magntique qui la coupleau monde macroscopique (p. 61).En tudiant des protines interagissant avec l'ADN, nous disposons ainsi d'un systme

    o l'enzyme est squestre sur son substrat le temps de la mesure. Sous rserve quel'activit s'accompagne d'une modication de longueur de l'ADN, notre montage permetainsi de mesurer l'activit en molcules uniques.Les protines prsentant une telle activit sont la fois trs nombreuses et gnralement

    d'un grand intrt biologique, puisqu'elles sont par exemple impliques dans la rplication(ADN polymrases), la transcription (ARN polymrases), la modication (gyrases, topo-isomrases, ligases, enzymes de restriction), la rparation, etc. du gnome. Cela expliquele succs des pinces magntiques comme techique d'tude, bien que les ADN translocasesne reprsentent nalement qu'une fraction faible du protome.Dans ce travail, nous avons essentiellement tudi deux protines : FtsK (p. 167) et

    l'ARN Polymrase de T7 (p. 117). L'une comme l'autre ont dj t extensivement

    6

  • tudies, dans des expriences en volume comme en molcule unique, mais des ques-tions substantielles ont t souleves par des tudes rcentes sur leur mcanisme dtaill.Par ailleurs, en tant que systme de dmonstration pour notre montage, nous les avonschoisies de telle manire qu'elles prsentent un ventail de comportements le plus largepossible. Nous en expliciterons les dtails dans les chapitres consacrs ces protines.Nous montrerons que les questions souleves par les expriences prsentes dans la lit-

    trature peuvent tre tudies grce un montage comme le ntre, qui associe la manip-ulation et l'observation de l'activit mcanique (translocation, rotation) la visualisationde la position de l'enzyme.

    Rsultats

    L'tude des caractristiques physiques de notre montage est ralise pour valuer dansquelle mesure il est compatible avec l'observation de l'activit biologique en conditionsde molcules uniques (p. 85). Nous comparerons ces caractristiques l'tat de l'artdans des montages quivalents et discuterons des possibilits d'extension de nouvellesexpriences.Avant de procder l'tude de FtsK et de l'ARN Polymrase de T7 en combinant

    les deux techniques, nous avons eectu un certain nombre de mesures pour valuer lesproprits biochimiques des variants que nous avons utiliss et les comparer aux donnesde la littrature (p. 133 et 183) sur les variants dj connus. Nous avons galement sondun certain nombre de proprits originales destines tre utilises spciquement dansnos expriences de molcule unique (p. 153 et 195).Nous montrerons que le passage d'observations ralise sparment avec l'une ou l'autre

    technique (pinces magntiques ou microscopie de uorescence) des observations com-bines a t trs dicile. Nous expliciterons une partie des dicults rencontres lors dela prparation des protines uorescentes et les moyens que nous avons mis en oeuvrepour y remdier (p. 105).Enn, nous prsenterons les protocoles que nous avons utiliss, amliors ou mis au

    point pour l'ensemble des expriences eectues dans ce travail (p. 225).

    7

  • Ractivit biologique l'chelle de la molcule unique

    8

  • 1 Techniques de micromanipulation

    Introduction

    A partir d'un raisonnement sur le concept de mesure mcanique de l'activit biologique,nous allons introduire ici les techniques de micromanipulation les plus courantes. Aprsun tat de l'art rapide, nous expliquerons pourquoi notre choix s'est port sur les pincesmagntiques et quelles en sont les caractristiques gnrales.

    La ractivit biochimique, au niveau du centre actif des protines, est la traduction dedplacements lectroniques stabilisant gnralement l'tat de transition (cf. Fig 1.1 p. 9).Dans cette description, la fonction de la protine ne serait que d'tre une sorte de cargo

    transportant le centre actif, et ne prenant qu'une part passive la ractivit (sous formed'eets striques statiques par exemple, guidant la raction vers un certain chemin rac-tionnel). La catalyse biologique ne serait donc pas fondalement dirente de la catalyse(in)organique purement chimique.

    Fig. 1.1: Bilan nergtique de la catalyse enzymatique. L'enzyme (E) stabilise les ractifs(R), les produits (P) et l'tat de transition (T). L'ecacit de la catalyse est lie la capacit stabiliser direntiellement le ractif (E:R) et l'tat de transition (E:T),souvent prcoce donc proche en structure des ractifs. Il est notable que la ractioninverse est gnralement galement catalyse, et avec une plus grande ampleur puisqueles produits (EP) sont gnralement mal stabiliss.

    En ralit, le squelette de la protine joue un rle considrable, qui justie le cot n-ergtique dpens pour produire et maintenir ces immenses architectures autour de leurspetits centres actifs. Les eets statiques voqus plus haut reprsentent une contributionimportante l'ecacit de la catalyse, et les tudes structurales actuelles (essentielle-ment statiques comme les rayons X ou la cryo-lectromicroscopie) n'ont pas encore nid'explorer cet aspect de la ractivit.

    Mais la vritable richesse des protines consiste en leur capacit coupler dynamique-ment des modes locaux (lectroniques et vibrationnels au niveau du centre actif) avec

    9

  • 1 Techniques de micromanipulation

    Fig. 1.2: Couplage dynamique avec un mode grande chelle : mouvement de l'hlice12 du Estrogen Receptor conscutif l'interaction avec son ligand (en bleu ple : avantinteraction, en rouge : aprs interaction). Reproduit de (Ho 2009) Fig.9.

    des modes de dformation globaux du squelette : rotation d'hlice , dstabilisationslective de sous-units d'une holoenzyme, etc. (Brooks 1985; Brnger 1985; Xu 2003).Cette notion d'allostrie (Monod 1965; Swain 2006) est galement fondamentale dansla comprhension de la rgulation dynamique de la ractivit l'chelle molculaire, unconcept qui est loin d'tre encore matris en catalyse organique ou inorganique purementchimique.

    1.1 Questions d'chelle

    1.1.1 Longueurs

    Que nous cherchions sonder la ractivit molculaire au niveau du centre actif ou dela protine globale, les dplacements mcaniques restent au plus de l'ordre du nanomtre.Dans une exprience en volume, il faudrait discriminer des populations avec une rsolu-tion d'au moins 0.1 nm ; par des mthodes lectromagntiques, cela impose l'utilisationde rayons X, de faisceaux d'lectrons ou de neutrons. Ces mthodes sont peu compatiblesavec un contexte biologique.

    En complment des techniques prcdentes, la manipulation d'une unique molcule parune sonde mcanique permet une observation directe de la raction. En soi, la dtectionmcanique de dplacements nanomtriques n'est pas problmatique (on en verra des ex-emples ci-dessous, ainsi que la dtection par des mthodes d'imagerie de uorescence).Mais la fabrication de sondes mcaniques (sub-)nanomtriques utilisables dans un con-texte biologique demeure relativement dicile. De mme, leur couplage un appareil demesure chelle humaine est souvent fastidieux.

    Le compromis idal consiste coupler la protine un actuateur, c'est dire un objetd'une part assez grand pour qu'il puisse tre fabriqu et manipul aisment, et d'autrepart assez petit pour coupler avec une rsolution susante avec les changements deconformation de la protine.

    10

  • 1.1 Questions d'chelle

    1.1.2 Actuateurs

    Une ide relativement naturelle est d'utiliser des actuateurs lastiques qui permettentd'exercer des forces et de mesurer les dplacements. La raideur k de ces systmes estdonne par la balance

    kx2 = kBT k kBT

    x2(1.1)

    L'ordre de grandeur correspondant une rsolution x = 0.1 - 1 nm est k 102 pN nm1. Dans le cas d'actuateurs mcaniques, des systmes grand rapport d'aspect (typ-iquement 100-1000) permettent de coupler des dplacements nanomtriques des objectsmicromtriques.Ces lments se comportent globalement comme des poutres lastiques de rayon R et

    de longueur L, dont la raideur est de l'ordre de

    k ER4

    L3(1.2)

    Pour des matriaux standard, le module d'Young E tant de l'ordre de 10 GPa, lesactuateurs adapts la raideur souhaite sont les bres optiques (L = 1 mm et R 1m, cf. 1.2 p.12) et les poutres d'AFM (L = 100 m et R 100 nm, cf. 1.3 p.13)Des actuateurs non-mcaniques peuvent galement tre utiliss ; dans ce cas, la force

    est transmise l'actuateur via un champ extrieur : faisceau laser dans le cas des pincesoptiques (p. 13), champ magntique dans le cas des pinces magntiques (p. 14). Dans cesdeux cas, la dimension de l'actuateur est surtout dtermine par sa capacit couplersusamment fortement avec le champ, qui dpend en bonne approximation du produitdu volume et de la constante de couplage matire-rayonnement. Ces actuateurs sontdonc plutt faible rapport d'aspect (billes sphriques gnralement) et de dimensionmicromtrique.

    1.1.3 Pourquoi l'ADN

    Pour pouvoir avoir une raideur adapte, ces actuateurs sont donc contraints tre aumoins deux ordres de grandeur plus gros que les protines sur lesquelles ils doivent agir. Orils sont supposs pouvoir coupler trs spciquement avec certains lments structurauxde la protine tudie (hlice mobile, entre d'un pore, etc.). Cette dirence de tailleet la non-spcicit de la surface de l'actuateur (silicium, polystyrne, verre) rendentexprimentalement ce couplage dlicat. Il peut tre parfois ralis dans le cas de l'AFM(Puchner 2009) qui possde une pointe trs ne et spciquement fonctionnalisable, maiscela n'entre pas dans le cadre de notre travail.Ces mthodes de micromanipulation ne sont donc pas des systmes universels qui per-

    mettraient d'tudier n'importe quel dplacement spatial induit par n'importe quelle rac-tion. En revanche, il existe un certain nombre de classes de protines qui interagissent avecdes macromolcules grand rapport d'aspect comme l'ADN, l'actine, les microtubules,etc. Sous rserve que la raction tudie soit couple un dplacement de cette macro-molcule, celle-ci va coupler relativement passivement la protine au micromanipulateur(nous discuterons de l'opportunit de ce terme au chapitre 4 p.75).L'ADN tant une molcule tellement centrale dans le fonctionnement de la cellule,

    nous disposons parmi les protines qui interagissent avec lui de beaux ds scientiquesen biologie molculaire : le rplisome, le transcriptome, l'tude de la rgulation de latranscription, l'infection par les virus, etc. Avant de prciser dans le chapitre 3 le travaileectu dans cette thse, nous allons dtailler rapidement les caractristiques de quelquestechniques de micromanipulation.

    11

  • 1 Techniques de micromanipulation

    Fig. 1.3: Utilisation d'un ADN pour eectuer un couplage mcanique entre une protineet un dispositif de micromanipulation. [A] Un actuateur (orange, reprsent chelletrs rduite) est coupl au monde macroscopique (violet). Cet actuateur est galementcoupl une macromolcule grand rapport d'aspect (noir). [B] Sous l'eet d'une sollic-itation macroscopique z0 (che violette) l'actuateur exerce une tension (che bleue)sur la macromolcule. [C] L'action d'une protine (vert) engendre un dplacement zmicroscopique mais mesurable de l'actuateur.

    Fig. 1.4: Reprsentation schmatique des principales techniques de micromanipulationde l'ADN. A : Microbre optique. B : Microscopie force atomique (AFM). C : Pincesoptiques. D : Pinces magntiques.

    1.2 Microbre optique

    Dans cette technique l'ADN est maintenu par une extrmit une micropipette, et l'autre une microbre optique (cf. g.1.4A et (Cluzel 1996; Leger 1998)). La microbremesure typiquement 1 m de diamtre et de 1 mm 1 cm de long. Lorsqu'on impose undplacement la micropipette, cela engendre une force sur l'ADN, son tour transmise la bre optique. Celle-ci se courbe alors, ce qui modie la direction du faisceau laser quien sort, qui est recueilli dans un objectif de microscope. La dexion du faisceau permetde remonter la force exerce sur l'ADN en utilisant la raideur de courbure de la bre.

    La raideur est calibre au pralable par analyse des uctuations de position dues aumouvement brownien, ou bien en mesurant la dexion induite par la force de tranevisqueuse exerce lors d'un mouvement relatif de la bre et de l'chantillon. La mesurede l'extension de l'ADN est extraite de la position de la pipette et de la dexion du

    12

  • 1.3 Microscopie force atomique (AFM)

    faisceau laser. Cette mthode permet d'obtenir une rsolution de l'ordre de 10 nm. Laraideur typique du ressort eectif que constitue la bre varie entre 103 et 10 pNnm1(Cluzel 1996; Essevaz-Roulet 1997).

    1.3 Microscopie force atomique (AFM)

    Le microscope force atomique a t conu dans le but d'imager des surfaces (avec unersolution atomique) (Binnig 1986). On peut en eet avoir accs au relief d'une surface enla balayant avec une pointe de taille submicromtrique et en enregistrant les dplacementsde la pointe, comme la tte d'une platine sur un disque vinyle. Ce dispositif permet ausside mesurer les forces ncessaires pour tirer une molcule ou briser une liaison covalente(cf. g.1.4B et (Moy 1994)).La molcule d'intrt, par exemple une molcule d'ADN, est ancre d'une part la

    surface de l'chantillon et d'autre part la pointe du micro-levier (Rief 1999). Celui-cimesure typiquement 100 m de long, 5 m de large, et 100 nm d'paisseur (Viani 1999).On envoie un faisceau laser sur le micro-levier, et on recueille le faisceau rchi, dont onenregistre la position. Lorsque l'on dplace l'chantillon par rapport au levier, celui-ci secourbe sous l'eet de la force exerce sur l'ADN. La dexion du faisceau laser permetaprs calibration, de mme que pour la microbre, de remonter la force exerce. Lagamme des raideurs accessibles par ces decteurs varie de 1 103 pNnm1.

    1.4 Pinces optiques

    Le pigeage optique consiste faire passer un faisceau laser travers un objectif degrande ouverture numrique an de fortement le focaliser (cf. Fig. 1.4C et (Svoboda 1994;Molloy 2002; Neuman 2004)). Le gradient de champ lectrique rsultant permet de pigerau voisinage du point focal une particule dont l'indice de rfraction est plus importantque celui du milieu environnant (typiquement des billes de polystyrne dans l'eau).

    Il est possible d'utiliser des particules mesurant quelques centaines de nanomtres,et d'y greer une molcule d'ADN. En xant l'autre extrmit de l'ADN une billemaintenue la pointe d'une micropipette, on obtient un systme qui permet de tirersur l'ADN. Les pinces optiques constituent donc naturellement un systme de micro-manipulation distance constante : l'exprimentateur impose la position du pige optiquemais la force exerce rsulte de l'quilibre du systme constitu par la bille pige et lamolcule qui y est ancre.

    La raideur de ce systme est impose par le potentiel d'interaction entre la bille etle faisceau. Elle peut tre rgle facilement car elle est proportionnelle l'intensit dufaisceau laser ; les valeurs utilises dans les expriences sur l'ADN s'tendent sur unegamme allant de 102 10 pNnm1 (Molloy 2002; Abbondanzieri 2005a). Il faut dansun premier temps calibrer la raideur du pige (dirente pour chaque bille) avant demesurer le dplacement de l'actuateur (la bille) et d'en dduire la force.

    On peut noter toutefois qu'une version amliore du dispositif utilisant deux faisceauxse propageant dans des directions opposes permet, en rcoltant la lumire diuse parla bille, de calculer la force exerce en utilisant une calibration indpendante de la bille(Smith 2003).

    Les pinces optiques ne permettent pas, dans la plupart des cas, de bloquer la billepige en rotation. Cependant, il est possible d'exercer une contrainte de torsion, enmodiant le systme ; plusieurs mthodes ont t mises au point cet eet. La premireconsiste utiliser des particules birfringentes qui vont pouvoir eectuer un transfert de

    13

  • 1 Techniques de micromanipulation

    moment angulaire avec le faisceau lumineux, ce qui gnre un couple. La seconde consiste utiliser un faisceau anisotrope, ce qui est ralis en utilisant par exemple un modelev de faisceau gaussien, une gure d'interfrence asymtrique, ou tout simplementun faisceau lgrement diract par une ouverture. On peut enn utiliser une particuleanisotrope (Molloy 2002). Ce type d'approche permet aussi la mesure du couple exerc(La Porta 2004; Funk 2009).

    1.5 Pinces magntiques

    L'actuateur est une bille superparamagntique (de dimension 1 m) (cf. g.1.4D).Un couple d'aimants permanents placs au-dessus de l'chantillon gnre un gradient dechamp magntique. La bille est alors soumise d'une part une force dans la directionde ce gradient et d'autre part un couple qui oriente son moment magntique dans ladirection du champ magntique (cf. 3 p.61) (Gosse 2002).

    Les ples des aimants sont spars d'une fraction de mm, ce qui xe l'chelle de vari-ation du champ magntique rsultant. Ainsi, l'chelle des dplacements de la bille (1 m), le gradient de champ est essentiellement homogne, et la force exerce est doncconstante. Celle-ci peut tre varie en approchant ou en loignant le couple d'aimants del'chantillon. Ce systme se distingue donc des pinces optiques dans son principe mme :ici, la force est impose par l'exprimentateur via la position des aimants et c'est l'ex-tension de la molcule qui relaxe sa valeur d'quilibre. Notons toutefois que l'existencede systmes de rtroaction permet d'une part d'exercer une force constante l'aide depinces optiques (Neuman 2004; Nambiar 2004; Greenleaf 2005), et d'autre part de pigerspatialement une bille l'aide d'aimants (Gosse 2002). Une contrainte de torsion peuttre impose simplement en tournant la direction du champ magntique.

    La position de la bille est enregistre en temps rel (la bande passante typique est de60 Hz) avec une rsolution de l'ordre du nm et la force est mesure pour chaque positiondes aimants partir des uctuations browniennes transverses de la bille (cf. 3.5.2 p.69).La raideur de l'actuateur dpend de la force exerce sur la molcule. Pour une molculed'ADN double brin de longueur 1 m sur laquelle on exerce une force de 0.5 pN, la raideurtransverse vaut quelques 103 pNnm1. Cette raideur augmente de manire importanteavec la force : 10 pN, elle vaut environ 1 pNnm1.

    1.6 Comparaison

    1.6.1 Comparaison qualitative

    On peut regrouper les techniques de micromanipulation en deux groupes : les tech-niques qui imposent une extension constante la molcule et mesurent la force rsultante(microbre, AFM et pinces optiques) et celles qui ralisent l'opration inverse (les pincesmagntiques). Travailler dans des conditions o la force est constante est souvent pratiqueen biologie, les pinces magntiques permettent d'y accder naturellement (dans le cas desautres techniques, il faut mettre en place un dispositif de rtroaction). D'autre part, lespinces magntiques permettent d'exercer une contrainte de torsion sur la molcule pigede manire extrmement simple.

    14

  • 1.6 Comparaison

    Technique OF AFM OT MT

    Conditions Bio Natif Possible Natif Natif

    Traction applicable Oui Oui Oui OuiParamtre impos Position Position Position ForceForce mesurable Avec calib. Avec calib. Avec calib. Sans calib.Raideur (pN/nm) 10310 1103 10210 (rglable) 1031 (rglable)

    Torsion applicable Oui Non Oui OuiParamtre impos Rotation - Rotation/Couple RotationCouple mesurable Non - Oui Dicile

    Paralllisation Non Non Oui Haute ( 50)

    Tab. 1.1: Comparaison des direntes techniques de micromanipulation : Optical Fiber(OF), Atomic Force Microscope (AFM), Optical Tweezers (OT) et Magnetic tweezers(MT). Les informations reprsentent le comportement natif de ces dispositifs : il est parexemple possible de raliser des pinces optiques force impose ou des pinces magntiques couple mesurable.

    1.6.2 Rsolution force-bande passante

    La rsolution ultime en force d'une technique est dtermine par la force de Langevin.Celle-ci est lie la frquence de coupure C du systme par (cf. eq. 4.9 p.78)

    FL LkBTC (1.3)

    La viscosit et la temprature sont des paramtres imposs par la biologie (les expri-ences sont eectues dans l'eau 25 ou 37C). Pour chantillonner correctement, il fautimposer une frquence de coupure suprieure la frquence caractristique du phnomneobserv (typiquement 1-100 Hz). Le paramtre de contrle restant est la taille L de laparticule considre, c'est dire celle du senseur de force.Dans le cas de la microbre la rsolution en force vaut typiquement quelques pN

    pour une bande passante de l'ordre de quelques centaines de Hz (Leger 1998), maispeut descendre une fraction de pN en rduisant la bande passante quelques Hz(Essevaz-Roulet 1997).La rsolution oerte par l'AFM est elle aussi de l'ordre de quelques pN pour une bande

    passante de l'ordre de la centaine de Hz.Pour les pinces optiques, la rsolution typique en force vaut 0.1 pN (bille de 1 m

    mesure avec une bande passante de 100 Hz).La mesure de force dans le cas des pinces magntiques consiste en gnral en une cali-

    bration prliminaire pour une bille donne ; la prcision de la mesure de force n'est doncpas dpendante de la frquence caractristique du phnomne observ et on peut parconsquent mesurer des forces trs prcisment. La limite la mesure est alors d'ordrepratique : la dure typique d'acquisition pour obtenir une prcision de l'ordre de 10% 0.01 pN est de quelques dizaines de minutes. Cette technique de mesure empche cepen-dant de mesurer des forces leves (voir chapitre suivant). La force maximale mesurablepour une bille de diamtre 1 m attache une molcule de longueur 1 m vaut typ-iquement quelques pN pour une bande passante de 60 Hz.

    1.6.3 Rsolution spatiale

    La limite thorique de rsolution des mthodes de microscopie optique utilises dans lestechniques de micromanipulation est de l'ordre de 200 nm, cependant cette valeur limite

    15

  • 1 Techniques de micromanipulation

    le pouvoir de sparation de deux objets proches ; elle ne limite donc pas la prcision dupositionnement d'un objet. On peut dtecter la position d'un objet avec une prcisionarbitrairement grande, pour peu que le nombre de photons mis par l'objet soit susant.En pratique, les mthodes de suivi de particule permettent en gnral de trouver laposition d'une particule de taille de l'ordre de 1 m avec une prcision de l'ordre dunanomtre dans la gamme des bandes passantes typiques (cf. 5.1.9 p. 93).En gnral, le principal facteur limitant est donc impos par les uctuations browni-

    ennes du senseur, qui sont relies via la raideur du senseur k aux uctuations de la forcede Langevin voques plus haut par une balance des forces

    kx2

    LkBTC (1.4)

    1.6.4 Conclusion

    En concevant le montage exprimental pour ce travail, nous avons souhait combiner lamesure d'activit mcanique sur une molcule unique un positionnement en microscopiede uorescence.Par son caractre de mesure force constante, le systme de pinces magntiques tait

    un choix naturel de micromanipulateur. Par ailleurs, la volont d'eectuer des mesuresen prsence de torsion dans l'ADN a confort ce choix.Dans l'absolu, un systme comparable aurait pu tre ralis par des pinces optiques,

    avec cependant comme dsavantage la prsence des Laser intenses ( 1W) utiliss pourle pige optique ; nous avons ainsi fait le choix d'utiliser l'exprience dj acquise dansnotre groupe sur les appareils de pinces magntiques, pour concentrer notre eort surleur intgration sur un systme de microscopie de uorescence.

    16

  • 2 Dtection de molcules uniques par

    uorescence

    Un tat de l'art

    Le thisme est l'art de cacher la

    beaut que l'on est capable de

    dcouvrir, et de suggrer celle

    que l'on n'ose pas rvler.

    (Kazuko, Le Livre du Th)

    Introduction

    Nous allons dans ce chapitre dcrire de manire gnrale les principales caractris-tique du phnomne de uorescence et l'utilit qu'il a dans les expriences en molculesuniques. Nous allons aussi prsenter les principales techniques d'excitation et d'observa-tion de uorescence existantes et expliciter celles que nous avons choisies. Nous dcrironsgalement succinctement les caractristiques des quipements de dtection pour expliquerles choix technologiques que nous avons eectus pour construire notre montage.

    La prcision de positionnement d'une source lumineuse augmente avec le nombrede photons collects par le dtecteur (Thompson 2002). Les progrs accomplis dansla production de uorophores plus brillants et plus stables ont permis d'eectuer desmesures de localisation de plus en plus prcises spatialement et temporellement jusqu'descendre simultanment sous la limite du nanomtre et de la dizaine de milli-secondes(Yildiz 2003; Yildiz 2004; Churchman 2005; Betzig 2006; Rust 2006).

    Paralllement, des techniques d'excitation sophistiques mettant en jeu des propritsphysico-chimiques trs prcises des uorophores ont t dveloppes (Dyba 2002; Gordon 2004;Churchman 2005; Hell 2009). Elles introduisent dans l'image des longueurs caractris-tiques bien plus petites que la longueur d'onde de la lumire visible et augmentent ainsila prcision du positionnement.

    Par ailleurs, l'augmentation de la sensibilit des dtecteurs, amenant certains unrendement quantique proche de l'unit (APD, EM-CCD), permet la dtection de signauxfaibles comme ceux de uorescence d'une molcule unique (Fldes-Papp 2001; Kaji 2009;Koutsopoulos 2009), avec un signal d'environ 10 kHz. La gnralisation des dtecteursrefroidis permet de diminuer l'inuence du bruit thermique sur les signaux faibles. Cettesensibilit, conjugue des cadences d'acquisition de plus en plus leves notammenten imagerie par CCD double matrice et transfert de trame permet prcisionconstante des mesures de plus en plus rapides (typiquement 10MHz/pix).

    2.1 Introduction la uorescence

    Les bases physiques de la uorescence sont bien comprises ; nous allons les dcrirerapidement. Elles reposent principalement sur le dcouplage entre direntes chelles detemps et d'nergie (Gell 2006).

    17

  • 2 Dtection de molcules uniques par uorescence

    2.1.1 Principe de la uorescence

    Dans une petite molcule organique, la sparation entre niveaux lectroniques corre-spond des transitions dans le proche ultraviolet et le visible, c'est dire [100 nm ;1000 nm]. Ces transitions, d'nergie comprise entre 50 et 500 kBT, ne peuvent pas treexcites thermiquement. Le niveau fondamental est gnralement singulet de spin et notS0. Les premiers niveaux excits singulet et triplet sont nots S1 et T1 respectivement.

    Pour chaque niveau lectronique, des sous-niveaux vibrationnels v N sont excitablesdans l'infrarouge moyen ( 5m), correspondant des nergies d'environ 10 kBT. Lesniveaux excits sont peu peupls thermiquement.

    En plus, les niveaux rotationnels globaux de la molcule sont excitables dans les micro-ondes et sont notablement peupls thermiquement. Dans la suite de ce chapitre, nous lesconsidrerons comme dgnrs l'chelle d'nergie des niveaux vibrationnels.

    Le couplage d'un photon visible avec la molcule peut conduire une transitionS0(v = 0) S1. La transition S0 T1 est interdite de spin. Des considrations ther-modynamiques indiquent que la transition la plus probable (correspondant la longueurd'onde d'absorption maximale dans le spectre) est la transition adiabatique entre le fonda-mental vibrationnel de S0 et le fondamental vibrationnel de S1 : S0(v = 0) S1(v = 0).

    Fig. 2.1: Transition d'absorption adiabatique d'un photon S0(v = 0) S1(v = 0).

    Exprimentalement, l'absorption prfrentielle se fait nergie plus importante (c'est dire longueur d'onde plus courte) que la transition adiabatique. En eet, l'nergielectronique des niveaux S0 et S1 dpend de la conformation de la molcule. On noter un paramtre d'ordre spatial qui caractrise la conformation des noyaux atomiques[1]. Au voisinage de la conformation d'quilibre, cette nergie est minimale et peut trereprsente comme un puits parabolique centr sur req avec les niveaux vibrationnelsassocis (cf. Fig 2.2 p. 19).Rien n'impose req(S0) d'tre identique req(S1). Comme la transition lectronique

    se fait l'chelle de S0S1 = 1015 s et la rorganisation vibrationnelle des noyaux

    l'chelle de 1012 1010 s, les noyaux atomiques n'ont pas le temps de changer deposition pendant le temps de l'absorption du photon.

    Dans cette approximation de type Born-Oppenheimer, la transition S0 S1 se fait r constant et gal req(S0). On parle de transition verticale. Par les mmes considrations

    1La coordonne spatiale pertinente r est le vecteur propre correspondant la valeur propre maximale

    de la matrice jacobienne de l'nergie en fonction des coordonnes des noyaux atomiques.

    18

  • 2.1 Fluorescence

    thermodynamiques que prcdemment, la transition la plus probable, donc correspondant la longueur d'onde d'absorption maximale, se fait pour S0(v = 0, r = req(S0)) S1(v 6=0, r = req(S0)) et aboutit un tat vibrationnel excit de S1 (la transition n'est pasadiabatique).

    Fig. 2.2: Transitions d'absorption verticale (noir) et adiabatique (gris) dans un systmesingulet de spin.

    Par couplage vibrationnel avec le solvant, la molcule subit une transition non radiativeappele relaxation vibrationnelle (cf. Fig 2.3 p. 20) vers l'tat vibrationnel fondamentalde S1 : S1(v 6= 0, r = req(S0)) S1(v = 0, r = req(S1)). Le temps caractristique decette transition est de l'ordre de RV = 1012 1010 s. L'tat obtenu est instable etpeut se dsexciter en mettant un photon selon une transition verticale S1(v = 0, r =req(S1)) S0(v 6= 0, r = req(S1)) avec un temps caractristique S1S0 = 1010 107 s. La molcule subit nalement une dsexcitation non radiative S0(v 6= 0, r =req(S1)) S0(v = 0, r = req(S0)) pour retourner son tat fondamental.Du fait de l'nergie perdue dans les transitions non radiatives, l'nergie du photon

    mis par uorescence est plus basse que celle du photon absorb. Cette dirence estappele dcalage de Stokes. Il est gnralement de l'ordre de 15-50 nm. Les spectresd'absorption et d'mission prsentent donc des maxima disjoints.

    2.1.2 Quantication de l'absorbance

    Soit un volume de base S et de profondeur l de solution clair par une densit sur-facique de ux de photons JE , le dbit de photons entrants vaut

    dn

    dt= JE S (2.1)

    En notant JS la densit surfacique de ux de photons sortant de ce volume, la vari-ation totale du nombre de photons vaut (JS JE) S. En rgime stationnaire, cettequantit s'quilibre exactement avec le nombre de photons absorbs par les uorophoresprsents la concentration [c] (en l'absence d'autres phnomnes comme la uorescenceou l'mission stimule).Cette quantit s'exprime simplement comme le produit du nombre de uorophores

    [c]Sl par une constante de vitesse d'absorption des photons k+

    JE S (JSJE 1)

    = k+ [c]Sl (2.2)

    19

  • 2 Dtection de molcules uniques par uorescence

    Fig. 2.3: [G] Sous l'eet de l'absorption d'un photon d'excitation, le systme subit unetransition verticale (trait plein) S0 S1 suivie d'une relaxation vibrationnelle (pointill).Une seconde transition verticale (trait plein) correspond l'mission radiative d'un pho-ton de uorescence. Cette mission est suivie d'une relaxation vibrationnelle (pointill)dans l'tat S0. [D] Reprsentation quivalente du cycle de uorescence sans mention dela coordonne spatiale.

    Fig. 2.4: Spectre d'absorption (tiret) et d'mission de uorescence (plein) de Cy5 enfonction de la longueur d'onde (nm). Les ordonnes sont normalises 100% respective-ment au maximum d'absorption et d'mission. Reproduit de Molecular Probes (Invitro-gen).

    Par dnition, on appelle absorbance A la quantit A = log(JS/JE). Dans la limitedes solutions dilues et pour l'absorption un photon, la loi de Beer-Lambert reliesimplement A [c] par la rel


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