Techniques d’identification et de quantification Comprendre les différentes méthodes utilisées pour l’identification et la quantification des substances biologiques(les protéines, les sucres, les AGs, les AAs, les acides nucléiques...). Parmi lesquelles: les techniques de Chromatographie (CCM, CC, CPG, HPLC), l’Electrophorèse, la Spectrophotométrie et la Radio biologie et marquage à froid (Immuno assays, Fluorescence, Luminescence).
2020
Université Sétif 1 Faculté SNV Département de Biochimie M1 Biochimie appliquée
Techniques d’identification et de quantification 2020
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Chapitre 1 : Généralités, solutions et tampon
Le calcul de quantités de réactifs et de produits ainsi la préparation des solutions font partie du travail
quotidien du personnel technique en biologie. Par exemple, pour la séparation et l’analyse de protéines par la
méthode d’électrophorèse, pas moins de neuf solutions différentes sont nécessaires. Pour l’étude de la croissance
végétale en fonction des composés inorganiques présents dans le sol, ce sont quatorze solutions qui doivent être
préparées. Ces deux exemples à eux seuls illustrent la nécessité de connaître les définitions de la chimie
quantitative et, surtout, la façon de les employer pour connaître les masses ou les volumes de substance à prélever
en vue d’une expérience ou d’un test clinique.
1.1 Définitions générales
Quelques définitions générales indispensables en techniques biologique seront définies. On doit en premier
préciser la distinction entre trois termes qui se ressemblent, soit « solution », « soluté » et « solvant ». Puis, on
définit le sens scientifique du mot « suspension et émulsion ».
Une solution est un mélange homogène d’au moins deux constituants : un soluté et un solvant
Le solvant est normalement la substance présente en plus grande quantité (disperser les autres
substances chimiques).
Le soluté est toute substance placée dans le solvant, en quantité moins grande que le solvant.
Ce soluté peut être soit (solide, liquide, gazeux).
Une suspension : système liquide hétérogène = Liquide + substance non soluble dans ce liquide. Exp:
sable +H2O
Une émulsion est un mélange de deux substances liquides non miscibles comme l’eau et l’huile.
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1.2 Notion de concentration
Lorsqu’une substance (soluté) est mise en solution, la concentration de cette substance peut être exprimée de
diverses façons :
1.2.1 La concentration en poids par unité de volume (pondérale)
Elle est définie en gramme par litre de solution (g/l).exp. solution de NaCl à 9g/l : 9g de NaCl ont été dissous dans
de l’eau puis complétés le volume d’1 litre.
1.2.2 Concentration en pourcentage (%)
Elle est définie comme le nombre de gramme de soluté /100ml de solution.exp: solution de NaCl 9% : 9 g de NaCl
dans 100ml de solution
1.2.3 Concentration molaire (molarité)
La concentration molaire est l’échelle de concentration le plus employée. Elle traduit le nombre de molécules
grammes ou moles (n) dans un volume V de 1 litre de solution: M = n/V.
1.3 Les dilutions
1.3.1 Dilution simple
Diluer une solution, c’est la rendre moins concentrée (C2), il s’agit donc de verser une certaine quantité (un volume
initial V1) d’une solution concentrée (C1) et d’y ajouter une certaine quantité de solvant jusqu’à ce que le volume
final soit atteint (V2). L’équation qui relie ces termes est : C1.V1=C2.V2 (Figure 1).
C1 : est la concentration de la solution concentrée (on dit aussi la solution mère ou solution initiale).
V1 : est le volume prélevé à partir de la solution concentrée.
C2 : est la concentration de la solution diluée (on dit aussi la solution fille ou solution finale).
V2 : est le volume de la solution diluée.
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Figure 1 : Dilution simple.
1.3.2 Dilution successive
Afin d’éviter de préparer une solution mère ne contenant que quelques milligrammes de soluté par litre, ou de mesurer des volumes minuscules de solution mère, on procède par dilutions successives (Figure 2).
Figure 2 : Dilution successive.
1.4 La solution tampon
Une solution tampon est une solution qui résiste à la variation du pH lors de l'addition d'un acide fort ou d'une base
forte. Cette solution est préparée par deux méthodes :
Méthode 1 : mélange d'un acide faible et de sa base conjuguée (exp: tampon phosphate)
Méthode 2 : mélange d'une base faible et un peu d'acide fort (exp: tampon Tris-HCl) ou d'un acide faible et
un peu de base forte.
Chapitre II : Méthodes chromatographiques
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Le terme de chromatographie a été créé par Mikhail Tswett en 1905, pour écrire une technique de séparation
de pigments végétaux (chlorophylles et caroténoïdes) sur des colonnes remplies d’une substance adsorbante. Il
évoque donc la couleur des substances analysées, mais il est possible que l’origine du nom soit tout autre : en
effet, le nom de l’autre signifie couleur en russe, et il est donc possible que ce dernier ait voulu donner son nom à
la technique qu’il avait mise au point.
1. Vocabulaire
Chromatographie = Techniques de séparation des constituants d’un mélange homogène qui est basée sur un
processus de migration différentielle, où les analytes se répartissent en 2 phases, l’une mobile par rapport à
l’autre (phase stationnaire et phase mobile).
Chromatogramme = signal enregistré en fonction du volume d’élution.
Phase stationnaire = phase qui reste en place dans une colonne ou sur une plaque.
Phase mobile = éluant phase qui se déplace sur ou à travers la phase stationnaire, elle entraîne les
constituants à analyser.
Eluant = solution recueillit à la sortie de la colonne. La chromatographie permet l’identification et le dosage
des substances.
Elution = processus au cours duquel on sépare les phases.
2. Définitions et classification
La chromatographie est une méthode d'analyse physico-chimique qui sépare les constituants d'un mélange
en plusieurs fractions. Cette séparation se fait par entraînement d'une phase mobile le long d'une phase stationnaire.
Il y a donc une distribution ou partition des composants entre ces deux phases. Dans toute séparation par
chromatographie, l’échantillon est transporté par une phase mobile, un gaz, un liquide ou un fluide supercritique.
L’écoulement de cette phase mobile est forcé à travers une phase stationnaire non miscible immobilisée dans une
colonne ou sur une surface solide. Les molécules fortement retenues par la phase stationnaire se déplacent beaucoup
plus lentement que la phase mobile tandis que, à l’opposé, celles qui sont faiblement retenues se déplacent plus
rapidement, leur vitesse ne pouvant cependant jamais dépasser celle de la phase mobile. Cette différence de mobilité
provoque la séparation des constituants de l’échantillon en bandes ou zones discrètes que l’on peut analyser
qualitativement ou quantitativement.
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Les méthodes chromatographiques regroupent des techniques très variées qui peuvent être classées selon
trois modalités différentes :
Classification selon la nature physique des phases.
Classification selon le phénomène mis en œuvre.
Classification selon le procédé opératoire.
On peut définir deux grands types de techniques chromatographiques selon la nature de leur phase mobile:
La chromatographie en phase gazeuse (CPG ou GC) utilisant un gaz comme phase mobile,
La chromatographie en phase liquide (CL) où c'est un liquide qui joue le rôle de phase mobile.
Selon la mise en œuvre pratique de la méthode on distinguera dans cette dernière:
La chromatographie de surface sur papier ou sur couche mince (CCM)
La chromatographie sur colonne basse pression ou haute pression encore appelée Chromatographie Liquide
Haute Performance (CLHP).
Selon les phénomènes mis en jeu pour réaliser la séparation, on distinguera au sein des deux techniques :
La chromatographie de partage (CPG et CL) lorsque la séparation est basée sur les différences de solubilité
des molécules à séparer dans la phase liquide stationnaire qui imprègne un support solide.
La chromatographie d'adsorption (CPG et CL) lorsque la phase stationnaire est un solide adsorbant, la
séparation étant fondée sur les différences d'adsorption des composants du mélange par la phase
stationnaire.
La chromatographie d'échanges d'ions (CL) où la phase stationnaire est un échangeur d'ions, c'est à dire un
solide contenant des ions et susceptible de les échanger avec ceux de la solution avec laquelle il est en
contact.
La chromatographie d'exclusion est dite également chromatographie de perméation (ou filtration) sur gel.
La phase fixe est un solide poreux dont la dimension des pores est proche de celle de certaines molécules
du mélange à séparer. Les molécules du mélange dont la dimension est supérieure à celle des pores sont
exclues de la phase fixe et sont d'abord éluées, celles qui peuvent y pénétrer sont entraînées avec un certain
retard. Ce retard est d'autant plus grand qu'elles pénètrent facilement dans les pores.
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2.1. Chromatographie d'adsorption
Cette chromatographie liquide-solide est basée sur la répartition des solutés entre la phase stationnaire fixe
(l'adsorbant) et la phase liquide mobile (l’éluant). Chacun des solutés est soumis à une force de rétention (par
adsorption) et une force d'entraînement par la phase mobile. L'équilibre qui en résulte aboutit à une migration
différentielle des solutés de l'échantillon à analyser, ce qui permet leur séparation (Figure 3).
Figure 3 : Interactions entre le soluté, le solide adsorbant et l'éluant.
La chromatographie d'adsorption est appliquée selon différentes techniques :
sur couche mince : le gel adsorbant (cellulose, silice) est coulé sur une plaque (verre, aluminium, plastique),
mélangé à un liant (plâtre) ;
sur papier : dans cette technique le papier constitue la phase fixe ;
sur colonne : ouverte à pression ambiante, à moyenne pression ou en HPLC.
2.1.1. Chromatographie sur couche mince (CCM)
La chromatographie sur couche mince (CCM) repose principalement sur des phénomènes d'adsorption : la
phase mobile est un solvant ou un mélange de solvants, qui progresse le long d'une phase stationnaire fixée sur une
plaque de verre ou sur une feuille semi-rigide de matière plastique ou d'aluminium. Après que l'échantillon ait été
déposé sur la phase stationnaire, les substances migrent à une vitesse qui dépend de leur nature et de celle du
solvant.
Les principaux éléments d'une séparation chromatographique sur couche mince sont:
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La cuve chromatographique : un récipient habituellement en verre, de forme variable, fermé par un couvercle
étanche ;
La phase stationnaire : une couche d'environ 0,25 mm de gel de silice ou d'un autre adsorbant est fixée sur
une plaque de verre à l'aide d'un liant comme le sulfate de calcium hydraté (plâtre de paris) l'amidon ou un
polymère organique ;
L'échantillon : environ un microlitre (µl) de solution diluée (2-5%) du mélange à analyser, déposé en un point
repère situé au-dessus de la surface de l'éluant ;
L'éluant : un solvant pur ou un mélange qui migre lentement le long de la plaque en entraînant les composants
de l'échantillon (Figure 4).
Lorsque la plaque sur laquelle on a déposé l'échantillon est placée dans la cuve, l'éluant monte à travers la
phase stationnaire, essentiellement par capillarité. En outre, chaque composant de l'échantillon se déplace à sa
propre vitesse derrière le front du solvant. Cette vitesse dépend d'une part, des forces électrostatiques retenant le
composant sur la plaque stationnaire et, d'autre part, de sa solubilité dans la phase mobile. Les composés se
déplacent donc alternativement de la phase stationnaire à la phase mobile, l'action de rétention de la phase
stationnaire étant principalement contrôlée par des phénomènes d'adsorption. Généralement, en chromatographie
sur couche mince, les substances de faible polarité migrent plus rapidement que les composants polaires.
Figure 4 : Principaux éléments d'une séparation CCM.
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2.1.1.1. Mode opératoire
a. Dépôts des échantillons
L’échantillon est mis en solution (2 à 5 %) dans un solvant volatil, qui n’est pas forcément le même que
l’éluant: on emploie fréquemment le trichlorométhane (chloroforme), la propanone ou le dichlorométhane. La
solution est déposée en un point de la plaque situé à environ 1 cm de la partie inférieure. Il est important que le
diamètre de la tache produite au moment du dépôt soit faible; idéalement, il ne devrait pas dépasser 3 mm. Ce sont
généralement les dépôts les moins étalés qui permettent les meilleures séparations.
L’échantillon est déposé à l’aide d’une micropipette ou d’un tube capillaire en appuyant légèrement
et brièvement l’extrémité du tube sur la couche d’adsorbant. La nature des composants présumés d’un échantillon
est déterminée, en procédant à un dépôt séparé des solutions témoins. Ces dernières permettent de comparer la
migration de chaque composé avec celle de l’échantillon à analyser.
b. Développement de la plaque
Le développement consiste à faire migrer le solvant sur la plaque. Le principal type de développement est
la chromatographie ascendante. Pour cela, la plaque est placée en position verticale dans une cuve et le solvant
(phase mobile) monte par capillarité. Le niveau de liquide est ajusté à environ 0,5 cm du fond de la cuve. Pendant
le développement du chromatogramme, la cuve doit demeurer fermée. Lorsque la position du front du solvant
arrive à environ 1 cm de l’extrémité supérieure, la plaque est retirée de la cuve, le niveau atteint par le solvant est
marqué par un trait fin, puis la plaque est séchée à l’air libre ou à l’aide d’un séchoir.
c. Révélation
L'identification des substances isolées se fait selon différentes méthodes (valable également pour la
chromatographie sur papier): directement si les substances sont colorées à l'aide de révélateurs si elles sont
incolores afin de les transformer en taches colorées. Les méthodes usuelles de révélation sont les suivantes:
radiations UV, fluorescence, iode, atomisation.
Directement si les substances sont colorées.
A l'aide de révélateurs si elles sont incolores afin de les transformer en taches colorées; les produits sont
souvent décelés par leurs réactions fonctionnelles classiques : les acides aminés par la ninhydrine qui donne
avec la plupart une couleur bleu-violet, les acides organiques par des indicateurs colorés, les sucres par le
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réactif de Molisch qui utilise le pouvoir réducteur des sucres. Quelques réactifs comme l'iode ou le
permanganate donnent des colorations non spécifiques avec la plupart des composés organiques.
Toutes les substances ayant une absorption dans la région au-dessus de 230 nm sont étudiées sur des supports
additionnés de corps fluorescents par irradiation de lumière UV à ondes courtes (λmax< 254 nm).
Dans tous les cas, il faut noter les positions des taches colorées juste à la fin de la chromatographie en les
cerclant car certains produits disparaissent avec le temps.
d. Rapport frontal Rf
Un soluté très soluble dans la phase stationnaire aura un RF faible; alors qu’un composé très soluble dans
la phase mobile, verra son Rf proche de 1. Le rapport frontal d’un produit donné dépend de nombreux
paramètres: nature du revêtement de la plaque CCM (silice ou alumine), concentration de l’échantillon,
nature des solvants d’élution (Figure 5).
Figure 5: Rf « Rapport frontal ». Rf =di/ds dont di: distance parcourue par le composé (mesuré au centre de la tache)
et ds: distance parcourue par le front du solvant.
2.1.1.2. Applications de la CCM
Lorsque les conditions opératoires sont connues, elle permet un contrôle aisé et rapide de la pureté d'un
composé organique. Si l'analyse, réalisée avec divers solvants et différents adsorbants, révèle la présence d'une
seule substance, on peut alors considérer que cet échantillon est probablement pur.
De plus, étant donné que la chromatographie sur couche mince indique le nombre de composants d'un
mélange, on peut l'employer pour suivre la progression d'une réaction.
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La chromatographie sur couche mince est également la technique habituellement employée pour rechercher le
meilleur solvant, avant d'entreprendre une séparation par chromatographie sur colonne.
2.1.2. Chromatographie sur colonne (CC)
Alors que les autres méthodes chromatographiques sont habituellement employées pour l'analyse et la
séparation de très faibles quantités de produits, la chromatographie sur colonne peut être une méthode préparative;
elle permet en effet la séparation des constituants d'un mélange et leur isolement, à partir d'échantillons dont la
masse peut atteindre plusieurs grammes.
Cependant, la CC présente plusieurs inconvénients :
De grandes quantités de solvant sont nécessaires à l'élution ;
La durée de l'élution est généralement très grande ;
La détection des composés exige une attention constante.
2.1.2.1. Principe
C'est une technique basée sur des phénomènes d'adsorption. La phase solide, le plus souvent l'alumine ou
la silice, remplit une colonne de longueur et de section variables ; l'échantillon, en solution concentrée, est déposé
en haut de la colonne et la séparation des composants résulte de l'écoulement continu d'un éluant, traversant la
colonne par gravité ou sous l'effet d'une faible pression. On peut utiliser comme éluant un solvant unique ou bien
accroître progressivement la polarité de l'éluant de façon à accélérer le déplacement des composés. Les molécules
sont entraînées vers le bas à des vitesses variables selon leur affinité pour l'adsorbant et leur solubilité dans l'éluant.
Le chromatogramme se développe en formant une succession de zones cylindriques qui se séparent en migrant vers
le bas (Figure 6).
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Figure 6 : Séparation des protéines dans une chromatographie sur colonne.
Facteurs influençant CC : Quatre facteurs interviennent: l'adsorbant, l'éluant, la dimension de la colonne et la
vitesse d'élution.
a. L’absorbant : Le plus utilisé est l'alumine; cependant, on la limitera aux composés organiques stables car, sous sa forme
basique, elle peut provoquer la déshydratation des esters par exemple. Le gel de silice est également fréquemment
utilisé pour la séparation de composés qui n'ont pas une stabilité suffisante pour être traités par l'alumine. La
granulométrie de l'adsorbant doit être supérieure à celle des adsorbants utilisés en CCM. Leur taille est
habituellement comprise entre 50 et 200 µm.
La quantité d'adsorbant dépend de la difficulté de la séparation et de la masse d'échantillon. On peut
considérer que pour chaque gramme d'échantillon, il faut 30 à 50 g d'adsorbant si la polarité des composants à
séparer est très différente et jusqu'à 200 g si la séparation est difficile.
b. L’éluant : est en général un mélange de deux solvants. Au début de l'élution, on commence par le solvant le
moins polaire qui entraîne les substances les moins retenues par l'adsorbant (les moins polaires). Ensuite on fait
varier la composition de l'éluant en additionnant graduellement le solvant le plus polaire. Ainsi les composés les
plus polaires, retenus sur l'adsorbant, ne migreront que graduellement vers le bas de la colonne.
c. Dimension de la colonne :
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Les colonnes spécialement conçues pour cet usage ont à leur base une plaque de verre fritté ou de porcelaine
qui permet l'écoulement libre de l'éluant tout en empêchant le passage de l'adsorbant. On peut aussi utiliser une
burette, au fond de laquelle on place un tampon de laine de verre et du sable.
La quantité d'adsorbant est telle qu'il occupe une hauteur égale à environ 10 fois le diamètre de la colonne. Il faut
également prévoir un espace de 10 cm environ au-dessus de l'adsorbant pour placer le solvant.
d. La vitesse d'élution :
Elle doit être la plus constante possible. Il faut qu'elle soit suffisamment lente pour que le soluté soit au plus
près de l'équilibre entre les phases liquide et adsorbée.
Elle ne doit pas être trop lente car sinon les substances diffusent dans le solvant et on obtient des bandes de plus en
plus larges et une séparation médiocre.
2.1.2.2. Remplissage de la colonne
C'est l'opération la plus délicate car le remplissage doit être le plus homogène possible et exempt de bulle
d'air. Les surfaces inférieure et supérieure de l'adsorbant doivent être parfaitement horizontales. La colonne étant
verticale, le remplissage peut être réalisé selon deux méthodes au choix.
a. Remplissage par voie humide :
On prépare dans un bécher un mélange homogénéisé de l'adsorbant et du moins polaire des solvants utilisé
pour le développement en ajoutant par petites quantités l'adsorbant dans le solvant pour obtenir une bouillie
suffisamment fluide pour couler facilement. A l'aide d'un entonnoir, on verse suffisamment de bouillie pour que
l'adsorbant qui se dépose progressivement forme une couche d'environ 2 cm. On tapote les parois de la colonne
pour favoriser le tassement de l'adsorbant. On ouvre alors le robinet pour que le solvant s'écoule lentement et on
poursuit l'addition de la bouillie homogénéisée par portions successives. Quand tout l'adsorbant est introduit, on
laisse décanter jusqu'à ce que le liquide qui surnage soit limpide. Pendant l'opération, on doit veiller à ce que le
niveau de solvant soit toujours supérieur à celui de l'adsorbant.
b. Remplissage par voie sèche :
La colonne est remplie au deux tiers par le moins polaire des deux solvants et l'adsorbant en poudre est
ajouté en portions successives dans la colonne à l'aide d'un entonnoir; pendant l'addition, on frappe continuellement
sur les parois pour obtenir un tassement maximal. Quand la première portion forme une couche d'environ 2 cm, on
ouvre le robinet pour faire couler lentement le solvant.
2.1.2.3. Dépôt des produits à analyser :
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Ils doivent former une zone cylindrique étroite dans le haut de la colonne. Un liquide est déposé tel quel.
Un solide sera dissous dans le minimum du moins polaire des deux solvants.
On ajuste d'abord le niveau de solvant pour qu'il soit juste au-dessus de celui de l'adsorbant. A l'aide d'une pipette,
on coule l'échantillon au sommet de la colonne de façon uniforme sur toute la surface de la colonne sans la déformer.
Si nécessaire, on ajuste à nouveau, comme précédemment, le niveau de liquide de la colonne : l'échantillon
est ainsi adsorbé uniformément au sommet de la colonne. On peut placer un verre fritté ou une rondelle de papier
filtre au-dessus de l'adsorbant pour prévenir une remise en suspension de l'adsorbant.
2.1.2.4. L’élution:
On peut alimenter la colonne en continu à l'aide d'une ampoule de coulée ou bien ajouter manuellement
l'éluant. Dans tous les cas, la surface de l'adsorbant ne doit jamais être au contact de l'air. En quelques minutes, une
colonne laissée à sec se détériore: des fissures apparaissent dans la phase fixe et toute élution ultérieure se
transforme en ruissellement. Pour la plupart des opérations, une vitesse de 5 à 50 gouttes à la minute convient (la
limite inférieure correspond aux séparations difficiles).
Lorsque l'analyse des fractions est terminée, on réunit celles qui correspondent à des produits identiques, en prenant
soin d'éliminer celles qui correspondent à des recouvrements de zones. Les substances obtenues de cette façon sont
généralement d'une très grande pureté.
Techniques d’identification et de quantification 2020
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2.1.3. Chromatographie en phase gaz
La chromatographie en phase gaz (CPG ou CG) est une méthode de séparation de composés susceptibles
d’être vaporisés par chauffage (sans décomposition). La séparation se fait dans une colonne soit par partage soit
par adsorption. Elle permet :
La microanalyse (du µg au mg)
La séparation de mélanges complexes
Une analyse qualitative et quantitative aisée
Des analyses dans de nombreux domaines d’applications.
2.1.3.1. Principe
Le principe de séparation repose sur une différence de répartition des composés d'un mélange entre deux
phases, une phase mobile (le gaz vecteur) et une phase stationnaire. Le mélange à analyser est injecté sous forme
d’un fluide et est vaporisé dans l’injecteur. Le gaz vecteur l’entraîne dans la colonne de séparation thermostatée.
Les composés se répartissent différemment dans les 2 phases, se déplacent donc à des vitesses différentes puis
sortent à des temps différents. A leur sortie, ils sont détectés et des pics apparaissent sur l’enregistreur (Figure 7).
Figure 7: Principe de la CPG. 2.1.3.2. Matériels
Techniques d’identification et de quantification 2020
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Un appareil de CPG comprend schématiquement un injecteur, une colonne contenue dans une enceinte
thermostatée (four) et un détecteur relié à un intégrateur ou un ordinateur sur lequel apparaît le
chromatogramme (Figure 8).
Figure 8: L’appareil de CPG.
a. Les gaz
Deux types de gaz sont utilisés en chromatographie en phase gaz: gaz vecteur et gaz de combustion. Le gaz
vecteur, phase mobile, sert à entrainer le soluté depuis son injection jusqu'à sa sortie de la colonne. Hélium, azote,
et Argon sont les gaz vecteurs les plus utilisés. Ils sont prélevés dans une bouteille sous pression. Un manodétendeur
permet d’obtenir la pression d’entrée cherchée. Un manomètre, placé en amont de l’injecteur, permet d’avoir une
indication, peu précise de la pression d’entrée dans la colonne. Ces gaz vecteurs doivent être de très grande pureté
afin que les contaminants n'interfèrent pas dans le processus chromatographique et ils doivent être inertes.
Le choix du gaz vecteur est fonction du détecteur utilisé. Le débit du gaz vecteur varie de 30 à 40 ml/min
pour les colonnes classiques et de 0.2 à 2 ml/min pour les colonnes capillaires. Les gaz de combustion les plus
utilisés sont l'hydrogène et l'oxygène. Ces gaz servent à la combustion de la matière organique et la détection.
b. Le four
Le four est destiné à recevoir les colonnes et à les porter à la température désirée. C’est un four à bain d’air,
pourvu de résistances chauffantes et d’un système de ventilation et de brassage pour l’homogénéisation de la
température. Un chromatographe comporte souvent une enceinte pour assurer la régulation de la température de
l’injecteur, et quelquefois une autre pour contenir le détecteur, surtout lorsqu’il s’agit d’un catharomètre. La
Techniques d’identification et de quantification 2020
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température du four peut-être: stable et identique du début à la fin de la manipulation (conditions isothermes,
220°C), ou programmée par palier successif (en gradients, 180°C- 240°C).
c. Les colonnes
Elles contiennent la phase stationnaire et se présentent sous forme de tubes fins enroulés. Il existe deux
types de colonnes: les colonnes ordinaires et les colonnes capillaires.
Les colonnes ordinaires (remplies) sont des colonnes de remplissage, leur diamètre est de 2 à 6 mm, leur
longueur est de 1 à 5 m. Le remplissage des colonnes ordinaires est très difficile seuls les fournisseurs en
possèdent la technologie nécessaire pour faire le remplissage homogène. Elles sont en tubes d’acier ou
verre. Elles sont remplies d’un support poreux et inerte sous forme de grains sphériques (d’environ 0.2 mm de
diamètre) sur lequel est imprégnée la phase stationnaire.
Les colonnes capillaires (à tube ouvert) ne sont pas des colonnes de remplissage, leur diamètre est de
0.10 à 0.32 mm, leur longueur est de 10 à 100 m. Elles sont en tubes d’acier inoxydable ou en silice fondue. La
phase stationnaire est directement déposée sur la paroi interne de la colonne sur une épaisseur de 0,05 à 5 µm.
Techniques d’identification et de quantification 2020
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Colonne remplie colonne capillaire
Les phases stationnaires
Plusieurs phases stationnaires sont utilisées en CPG :
Les phases stationnaires solides et les phases stationnaires liquides. Les phases stationnaires solides sont
constituées de petites particules très homogènes (cristaux d’alumino-silicates). Les phases stationnaires liquides
sont classées en fonction de leur polarité et des températures qu’elles sont capables de supporter (Polyéther de
glycol (Carbowax) – phases polaires à base de polyéthylène glycol – supportent jusqu’à 225°C. Squalanes –
apolaires, hydrocarbures saturés – supportent jusqu’à 120°C).
d. Le système d'injection
Selon les types de colonnes reliées aux injecteurs, les caractéristiques des injecteurs et leur mode d’injection sont
différentes de façon à optimiser la qualité de la séparation :
Injecteur à vaporisation directe
Pour les colonnes remplies et les colonnes capillaires de gros diamètre. Tout l’échantillon introduit par la
seringue est entièrement entraîné dans la colonne
Techniques d’identification et de quantification 2020
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Pour les colonnes capillaires à faible débit, les quantités de composés dans la colonne doivent être très petites pour
éviter la saturation des colonnes. Les volumes injectés doivent être très faibles (saturation même pour des v injectés
= 0,1µL).
Injecteur avec système de fuite
Une grande partie de l’échantillon injecté, vaporisé et mélangé au gaz vecteur est éliminée de l’injecteur par une
vanne de fuite. Ainsi, une petite fraction du mélange pénètre dans la colonne. Il existe deux modes selon que l’on
injecte et la vanne de fuite est ouverte (mode split) ou vanne fermée pendant environ 1 minute après l’injection
(mode splitless) (Figure 39).
Injecteur à température programmable (PTV) (Programmed Temperature Vaporizer) Est de conception analogue à celle de l’injecteur split/splitless. Cependant la température de la chambre d’injection peut être programmée (20 – plus de 300◦C), en quelques dizaines de secondes.
e. Le système de détection
Les systèmes de détection d’une CPG sont présentés dans le tableau1.
Tableau 1 : Types, sous-types des systèmes de détection de CPG.
Types Sous-types Détecteurs universels
Catharomètre
Détecteur à ionisation de flamme (FID)
Détecteurs spécifiques
Détecteur à capture d’électrons
Photométrie de flamme
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2.1.3.3. Protocole opératoire
La phase stationnaire peut être un liquide (phénomène de partage) ou un solide
(phénomène d'adsorption). On distingue les phases apolaires et les phases polaires. Les premières sont
à base d’hydrocarbures aliphatiques saturés ou de silicones (squalane). Les secondes sont des
polymères possédant des fonctions polaires: polyalcools, polyesters, polyamides. En général, les
phases polaires sont utilisées pour les composés polaires et vice versa.
Les phases stationnaires solides constituées de matériaux adsorbants divers. Les plus
classiques sont les adsorbants minéraux, tels le charbon actif, l’alumine.
Préparer le soluté et les témoins.
Mettre en marche le chromatographe dans les conditions de travail choisies.
Régler le débit de chaque gaz (vecteur, et combustible).
Régler la température (isotherme ou gradient thermique).
Laisser stabiliser le chromatographe durant une heure avant l'injection.
Cette stabilisation est suivie par le système d'enregistrement.
Injecter le soluté (manuellement ou automatiquement).
Exploiter les résultats de la chromatographie (manuelle ou automatique).
Régénérer la colonne par un nouveau cycle.
2.1.3.4. Applications de chromatographie en phase gaz
L'analyse qualitative consiste à identifier la nature chimique des constituants du soluté et ceci en
analysant les chromatogrammes.
L'analyse quantitative consiste à estimer la concentration des différents constituants de
l'analyte préalablement purifié et identifié par rapport à la matière source (l'extrait brut)
Techniques d’identification et de quantification 2020
20
2.1.4. Chromatographie liquide à haute performance (HPLC)
La chromatographie liquide à haute performance ou HPLC est une chromatographie en phase
liquide sur colonne, dont, les performances, en termes de sélectivité et de résolution, sont grandement
améliorées. Cette chromatographie utilise une phase mobile liquide et une phase stationnaire très
finement divisée. Pour obtenir un débit satisfaisant, il faut injecter l’éluant sous des pressions de
plusieurs centaines de bars.
2.1.4.1. Principe
L'HPLC utilise une phase mobile liquide pour séparer les composants d'un mélange. Ces
composants sont dissous en premier dans un dissolvant, puis sont forcés à couler à travers une colonne
chromatographique sous une haute pression (Figure 10). Chaque soluté est donc soumis à une force de
rétention (exercée par la phase stationnaire) et une force de mobilité (due à la phase mobile).
Figure 10 : Principe de fonctionnement d’une HPLC.
2.1.4.2. Equipements chromatographiques
a. Les pompes
La pompe force la phase mobile à traverser la colonne. Il faut maintenir une pression
extrêmement élevée (50 à 200 bars) en amont de l’injecteur pour vaincre la perte de charge provoquée
par la phase stationnaire et permettre la traversée de la colonne par l’éluant.
Techniques d’identification et de quantification 2020
21
La pression à imposer dépend des facteurs suivants:
Débit de la phase mobile
Viscosité de l’éluant
Taille des grains de la phase stationnaire
Géométrie de la colonne
Les pompes doivent répondre aux exigences suivantes:
Fournir des pressions élevées jusqu'à 400 bars
Débit stable, non pulsé et réglable de 0,1 à 10 mL/min avec un contrôle meilleur que 0,5 %
Résistance à la corrosion
Il existe deux modes de fonctionnement:
Le mode isocratique pour lequel la composition de la phase mobile est fixe.
Le mode gradient de solvant pour lequel on fait varier la composition du solvant en cours
d’analyse en vue d’améliorer les séparations et surtout de raccourcir les temps d’analyse.
Les gradients de solvant nécessitent des pompes particulières permettant de faire varier
la composition du mélange éluant.
b. Les injecteurs
L’injection doit se faire de manière très rapide afin de ne pas perturber la circulation du solvant. La
difficulté consiste à introduire en tête de colonne un volume d’échantillon là ou la pression atteint
plusieurs dizaines de bars. L’échantillon est introduit avec une seringue à la pression atmosphérique
dans la boucle (position remplissage ou load), puis il est mis en communication par rotation de la vanne
avec la phase mobile et la colonne (position inject).
c. La colonne
C’est la partie active du système, c’est elle qui joue le rôle prépondérant. La colonne est
un cylindre calibré généralement en acier inoxydable parfois doublé d’un matériel inerte (verre ou
plastique spéciaux). Son diamètre varie de 0.5 à 5 mm et sa longueur de 0.5 à 30 cm. La phase
stationnaire est maintenue entre deux disques frittés.
Techniques d’identification et de quantification 2020
22
Les colonnes standards ont une longueur comprise entre 10 et 30 cm avec un diamètre intérieur
de 4 à 10 mm. Elles sont remplies de phase stationnaire de granulométrie de 5 à 10 µm. Il existe aussi
des microcolonnes de longueur 3 à 7 cm et de diamètre interne de 1 à 5 mm, remplie de phase
stationnaire de granulométrie de 3 à 5 µm.
La phase stationnaire
La phase normale (HPLC normale) est constituée de gel de silice, très polaire, Il faut donc utiliser
un éluant apolaire, Ainsi lors de l'injection d'une solution, les produits polaires sont retenus dans la
colonne, contrairement aux produits apolaire qui sortent en tête.
La phase inverse (HPLC phase inverse) est majoritairement composée de silice greffée par des
chaînes linéaires de 8 ou 18 atomes de carbones (C8 et C18). Cette phase est apolaire et nécessite donc
un éluant polaire. Dans ce cas, ce sont les composés polaires qui seront élués en premier.
d. Le détecteur
Leur rôle est de suivre au fur et à mesure l'élution des constituants du soluté séparé et entrainer
hors de la phase stationnaire depuis leur injection jusqu'à leur sortie de la colonne. Il existe plusieurs
détecteurs : Détecteur par spectroscopie UV-Visible, Détecteur fluorimétrique, Détecteur
réfractomètrique
e. L’intégrateur- enregistreur
Il s’agit d’un ordinateur qui récupère toutes les données issues des détecteurs, trace les
chromatogrammes et intègre la surface des pics. Il imprime un rapport d’analyse donnant les temps
de rétentions et les surfaces de chaque pic.
On peut le programmer pour qu’il fasse seul les divers calculs conduisant aux concentrations
à partir de chromatogrammes étalon et des chromatogrammes des mélanges analysés.
Applications
Analyse qualitative: le "temps de rétention" (temps au bout duquel un composé est élué de la colonne
et détecté), caractérise qualitativement une substance.
Techniques d’identification et de quantification 2020
23
Analyse quantitative: l'amplitude de ces pics, ou encore l'aire limitée par ces pics et la prolongation de
la ligne de base permet de mesurer la concentration de chaque substance dans le mélange injecté.
Chapitre III : L’Electrophorèse
1. Définition
Le terme " électrophorèse " décrit la migration de particules chargées sous l’influence d’un
champ électrique. Le préfixe " électro" fait référence à l’électricité du grec èlektron qui signifie l’ambre
jaune et la racine "phorèse" vient du grec phoresis qui signifie " porter d’un côté à l’autre.
L’électrophorèse est une méthode d'analyse (identification et dosage) qualitative et quantitative, de
séparation et préparative basée sur la migration différentielle de particules, chargées électriquement sous
l’influence d’un champ électrique.
2. Principe
L’électrophorèse est une méthode d'analyse qualitative et quantitative basée sur la migration
différentielle de particules, chargées électriquement sous l’influence d’un champ électrique.
3. Paramètres et conditions de réalisation
Plusieurs facteurs peuvent influencer l’électrophorèse des molécules biologiques :
4. 1. Nature des molécules
Les molécules à séparer jouent un rôle très important dans leur séparation par électrophorèse et ceci par
trois propriétés :
La charge : la vitesse de déplacement est d’autant plus élevée que la charge est grande.
La taille : la vitesse de migration est inversement proportionnelle au poids moléculaire des molécules à
séparer. Les molécules ayant un faible PM migrent plus rapidement.
La forme : les molécules possèdent diverses formes selon leur structure, linéaire, bi ou
tridimensionnelle. Sur un support, les molécules ayant les mêmes charges et les mêmes PM mais avec
des formes différentes migrent avec des vitesses différentes.
4.2. Champ électrique
La mobilité électrique est la vitesse de déplacement des particules dans la suspension, et elle
dépend de la charge et de la géométrie de la particule.
Techniques d’identification et de quantification 2020
24
Les particules dispersées ont une charge extérieure électrique, sur laquelle un champ électrique externe
exerce une force électrostatique.
Figure 11 : Illustration de l’électrophorèse.
4.3. Tampon :
Le tampon doit être, par sa composition, inerte vis-à-vis de l’échantillon et du support. Les
tampons les plus utilisés sont, véronal (barbital), phosphate, tris, pyridine, borate, acétate…
Force ionique : la FI est très importante du fait que le courant électrique est transporté par les ions du
tampon et de l’échantillon:
pH : le pH est très important puisqu’il détermine le degré d’ionisation des molécules contenues dans
l’échantillon. A pH acide les molécules sont chargées positivement et inversement à pH basique.
Si pH > pHi: charge nette négative (anion), la migration vers l'anode.
Si pH < pHi: charge nette positive (cation), la migration vers la cathode.
Si pH = pHi: charge nette nulle, pas de migration.
4.4. Support
Malgré que le support doit être totalement inerte, on trouve, en pratique, trois phénomènes dans
les différents supports utilisés.
Adsorption : certains supports peuvent s’adsorber aux composés de l’échantillon de façon non
spécifique mais différente d’une molécule à une autre. Cette adsorption va ralentir ces molécules et
empêcher leur migration. Le papier est le support qui présente le plus d’adsorption pour la plus part des
molécules biologique ce qui a poussé les chercheurs à l’abandonner complètement.
Electroendosmose (Electro-osmose) : dans les conditions expérimentales, le support se charge
négativement; une couche mobile de charges positives se forme dans le solvant, au contact du support
Techniques d’identification et de quantification 2020
25
et entraîne globalement la phase liquide (essentiellement le H3O+) vers la cathode (-). Ce courant
accélère ou ralentit la migration des molécules, suivant qu’elles migrent vers la cathode ou vers l’anode.
Tamisage : le gel d’acrylamide (et d’amidon) ressemble à un tamis. A un pourcentage donné du gel
certaines molécules sont retenues, d’autres passent difficilement et d’autre facilement. Si la
concentration augmente, le phénomène de tamisage accroît aussi de façon proportionnelle.
5. Matériels
5.1. Le montage horizontal
Ce genre de montage (Figure 12a) est surtout utilisé pour les matrices comme l'acétate de
cellulose ou le papier où les échantillons se déplacent à sa surface. Les deux bouts de la matrice plongent
dans une solution d'électrolytes, les ions se déplacent à la surface, créant le courant qui entraînera les
diverses molécules de l'échantillon qui migreront suivant leur charge. On utilise aussi des montages
horizontaux pour des matrices d'agarose lors de l'électrophorèse d'acides nucléiques ou d'immuno-
électrophorèse.
5.2. Le montage vertical
Ce genre de montage (Figure 12b) est surtout utilisé pour les matrices comme les gels de
polyacrylamide. Les échantillons se déplacent généralement à l'intérieur de la matrice.
La matrice est sous forme de matériel gélifié, entre deux plaques de verre. Elle est souvent préparée peu
avant usage en formant une plaque de verre/gel/plaque de verre. Durant la gélification on fait des puits
où on déposera des échantillons. Chaque extrémité du gel sera mise en contact avec un tampon contenant
des électrolytes qui, soumis dans à un potentiel électrique, permettra la propagation d'un courant dans
le gel. Ce courant entraînera les molécules constituant l'échantillon. Cette migration permettra la
séparation des diverses espèces moléculaires qui migreront à des vitesses différentes.
a b
Figure 12: Montage horizontal (a) et Montage vertical (b).
Techniques d’identification et de quantification 2020
26
5.2.1. Principales matrices d’électrophorèse
Il y a plusieurs types de matrices qui diffèrent au niveau de leur constitution (matériel avec lequel
elles sont faites), du type de montage dans lequel elles sont utilisées et leurs caractéristiques physico-
chimiques:
a. Papier : habituellement employé dans un montage horizontal, plus rarement vertical, il servait surtout
à séparer des acides aminés ou d’autres petites molécules chargées (Figure 13). Le dépôt et la migration
des échantillons se font en surface. Parmi les inconvénients on peut citer : les phénomènes d’adsorption,
l'électro-osmose et la grande quantité de l’échantillon.
Figure 13 : Un support en papier.
b. Acétate de cellulose : il s’agit de feuilles fines très poreuses et fragiles. Le dépôt et la migration se
font en surface sur un montage horizontal. La faible résolution ne permet que la séparation de grands
groupes de protéines. Son faible coût, sa rapidité, sa grande facilité d’emploi la rendent utile pour la
séparation des protéines sériques, particulièrement en biochimie clinique pour le diagnostic de maladies.
c. Silice ou la cellulose : la silice (en poudre) ou la cellulose (aussi en poudre) est étalée sur une plaque
de verre horizontale puis humidifiée par un tampon convenable. Après dépôt des échantillons à l’aide
de seringues ou de pipette à embout fin, les deux extrémités de plaque sont reliées au tampon
d’électrophorèse par du papier filtre imbibé du même tampon.
d. Amidon : rarement employée de nos jours, cette matrice forme un gel poreux. Les gels d'amidon
servaient à séparer les protéines destinées à des colorations enzymatiques.
e. Agarose : L’agarose ne polymérise pas par création de liens covalents, il se gélifie à basse température
(<38°C). Cette gélification est due à la formation d’une multitude de liens hydrogène entre les longues
molécules linéaires de dextran qui composent l’agarose. Les gels d’agarose ont de grands "pores" et sont
Techniques d’identification et de quantification 2020
27
utilisés essentiellement pour séparer les grandes molécules d’une masse moléculaire supérieure à 200
kDa. Sa faible adhésion au verre oblige généralement à étaler ce gel sur une plaque de verre horizontale.
C’est la matrice souvent utilisée pour l’électrophorèse des acides nucléiques. Les
immunoélectrophorèses sont aussi réalisées sur gel d’agarose (facilite la diffusion des anticorps). De
plus en plus, on utilise cette matrice pour la séparation des protéines sériques
d. Polyacrylamide : le gel de polyacrylamide est polymérisé entre deux plaques de verre ou à l'intérieur
de tubes cylindriques de verre, où il formera un gel poreux. On dépose l'échantillon sur le sommet de ce
gel vertical. Les molécules pourront alors migrer à l'intérieur de ce gel. Les gels de polyacrylamide
servent couramment à la séparation des protéines. Ils sont aussi souvent employés pour les acides
nucléiques de petite taille, particulièrement dans le séquençage.
5.2.2. Tampons
Les différentes catégories des systèmes disponibles de tampons pour l'électrophorèse sont :
dénaturant s et non-dénaturants, continus et discontinus.
Le système dénaturant et non-dénaturant : Lorsque l’on garde l’intégrité de la molécule et sa charge
nette le milieu est dit naturel ou non dissociant. Si l’on dénature les molécules en les dissociant en chaîne
unitaires ou si on change leurs charges nettes le milieu est appelé dénaturant ou dissociant. Parmi les
agents dissociant et / ou dénaturant on trouve :
Le sodium dodécyl sulfate (SDS): est un détergent anionique qui dénature des structures secondaires
et tertiaires (mais pas de liaisons disulfures), et applique une charge négative pour chaque protéine en
proportion de sa masse. En conséquence, les protéines se séparent selon la masse seulement (Figure
14).
Figure 14 : Structure et Mécanisme d'action du SDS.
Le mercaptoéthanol et le dithiothréitol (DTT) : ces deux agents sont utilisés pour réduire les ponts
disulfure (S-S) inter-chaînes en groupements sulfhydryle (-SH) ; (Figure 15). Ceci permettra l’étude
Techniques d’identification et de quantification 2020
28
des molécules composées de plusieurs chaînes. Utilisés avec le SDS on peut connaître les PM des
différentes chaînes des molécules.
Figure 15 : Mécanisme d'action du mercaptoéthanol.
L’urée: la principale propriété de l’urée est de rompre les liaisons hydrogène mais garde les charges
nettes telles qu’elles sont. En générale on utilise des concentrations de 2.5 à 6.25 M d’urée. La séparation
sur la base du poids moléculaire exige l'inclusion des agents dénaturants, qui déroulent les brins d'acides
nucléiques et éliminent l’influence de la forme sur leur mobilité.
Le système continu et discontinu :
Dans les systèmes tampons continus, l'identité et la concentration des composants du tampon
sont les mêmes dans le gel et la cuve. Les bandes tendent à être plus larges et par conséquence une
résolution plus pauvre. Ces systèmes sont employés pour la plupart des formes de l'électrophorèse de
gel d'agarose d'ADN,
Les systèmes discontinus utilisent souvent deux différents tampons dans le gel. Le gel est divisé en gel
de concentration (pH = 6.8) en haut du pourcentage faible de l'acrylamide et le gel de séparation (pH =
8.8) en bas avec un pourcentage d’acrylamide plus élevé.
5.2.3. La solution échantillon
Cette solution contient du glycérol ou du saccharose qui rendent plus dense l’échantillon et lui
permet donc de rester au fond du puits de chargement. Elle contient aussi des colorants qui permettent
de suivre la migration des échantillons à travers le gel comme le bleu de bromophénol, ou le xylène de
cyanol. Etant donné que ces molécules sont petites, elles migrent rapidement à travers le gel pendant
l'électrophorèse, indiquant ainsi le progrès de l'électrophorèse. On trouve aussi les agents de
dénaturation comme SDS, DTT, Urée...
5.2.4. Le courant appliqué
Techniques d’identification et de quantification 2020
29
Un générateur de courant continu relié aux électrodes de la cuve (cordons électriques :un noir,
un rouge) ; (Figure 16). Ce courant crée un champ électrique qui va permettre de faire migrer les
molécules. La tension du courant est en fonction de la longueur des fragments et la concentration du gel.
La haute tension cause une augmentation énorme de la température du tampon et du courant dans un
temps très court. Par conséquent, il est recommandé de ne pas dépasser 5-8 V / cm et 75 mA pour les
gels de taille standard ou 100 mA pour les mini gels. La tension du courant et en fonction de la longueur
des fragments et la concentration du gel.
Figure 16 : Le générateur du courant. 5.2.5. Visualisation ou coloration
La façon la plus simple de visualiser des protéines est de les colorer. Avant de procéder à cette
coloration, il faut fixer les protéines, en mettant le gel dans un acide dilué comme l'acide acétique ou
l'acide trichloroacétique 1 à 10%. Le colorant le plus couramment utilisé est le bleu de Coomassie
(Figure 17). Il y a aussi rouge Ponceau, Amido-schwartz (noir) et vert de lissamine. La décoloration se
fait en transférant le gel dans une solution méthanolique acide. On obtient un gel transparent avec les
bandes de protéines colorées.
L’agent d’intercalation le plus couramment utilisé pour rendes visible les bandes d’ADN à la
lumière ultraviolet est le bromure d’ethidium. Le colorant peut être inclus à la fois dans le tampon et le
gel, le gel seul, ou les gels peuvent être colorés après la séparation de l'ADN. La coloration à l'argent est
un procédé hautement sensible pour la visualisation des bandes d'acides nucléiques et de protéines.
Techniques d’identification et de quantification 2020
30
Figure 17 : Un gel d'achrylamide coloré par le bleu de Coomassie.
6. Différents types d’électrophorèses
6.1. Electrophorèse sur couche mince
L’appareillage utilisé est très simple ; composé d’une cuve ayant deux compartiments de
tampon, d’un générateur de courant continu et du support en verre ou en plastique dur sur lequel on
met la matrice (Figure 18).
Figure 18 : Electrophorèse sur couche mince
6.2. Mode opératoire
La bande support est imprégnée de tampon ensuite placée dans la cuve d’électrophorèse
remplie de tampon (Figure 19).
Les échantillons (quelques microlitres seulement) sont ensuite déposés au centre de la bande.
Un courant électrique est ensuite appliqué de part et d’autre de la cuve (il faut utiliser un courant
de faible intensité).
Techniques d’identification et de quantification 2020
31
Sous l’effet du champ électrique appliqué, les constituants de l’échantillon vont migrer vers
l’anode ou vers la cathode.
Le sens de migration et la vitesse (ou distance) de migration de chaque constituant sont
déterminés par la charge de ce constituant
Cette charge peut varier en fonction du pH, qui est fixé par l'expérimentateur au moyen de
l'utilisation d'une solution tampon.
Ceci permet donc une migration différentielle des constituants d’un échantillon en fonction de
la charge.
Après un temps de migration la bande est retirée, les protéines sont ensuite fixées par séchage,
chauffage ou par un acide fort pour éviter toute diffusion ultérieure.
Figure 19 : L'appareillage d'une électrophorèse sur couche mince.
6.2. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide
6.2.1. Électrophorèse sur gel de polyacrylamide (SDS-PAGE)
C’est une technique de séparation et d’analyse de particules chargées par migration
différentielles sous l’action d’un champ électrique. Dans ce type d'électrophorèse, la vitesse de migration
est en fonction de la taille (l'effet de la charge est annulé). Le gel est coulé entre des plaques de verre
fixées sur un support. Un peigne est enchâssé entre ces plaques. Après polymérisation du gel, le peigne
est retiré formant ainsi des puits. La taille et le nombre des dents des peignes sont variables ce qui permet
de déposer des volumes allant de 20 µL à 200µL d'échantillon de protéines à séparer.
Techniques d’identification et de quantification 2020
32
Deux gels peuvent être préparés : un gel de séparation (des pores sérés) et un gel de concentration
(des pores lâches). En fonction du taux d’acrylamide et le bis-acrylamide (Figure 20), TEMED et le
persulfate d’ammonium, la porosité du gel varie.
Figure 20 : Structure des gels d’acrylamide et de bis-acrylamide.
Le diamètre des pores (mailles) est inversement proportionnel à la concentration du gel (poids
de l’acrylamide + bis-acrylamide dans 100ml du gel). Le choix du diamètre des pores est fonction du
PM des molécules à séparer (Tableau 3).
Tableau 3 : Le diamètre des pores est fonction du PM des molécules.
Concentration du gel (%) PM (kDa) 2.5-5 300-1000 5-10 100-300 10-15 40-100 15-20 10-40 20-25 2-10
Le gel de polyacrylamide est un gel réticulé obtenu par polymérisation d'acrylamide qui forme
des chaines et de bis-acrylamide qui ponte les chaines d'acrylamide, persulfate et le TEMED catalyse la
réaction de polymérisation (Figure 21)
Techniques d’identification et de quantification 2020
33
.
Figure 21 : Réaction de polymérisation en présence du TEMED et le persulfate d'ammonium.
Pour désigner la concentration du gel on utilise généralement le terme T% et pour exprimer le rapport
bisa/acryl on utilise le terme C%.
T%= poids de l’acryl + poids de bisa en g par 100 ml du gel
C%= poids du bisa/acryl x 100
En pratique le rapport bisa/acryl étant constant (entre 2-3%), on parle du pourcentage du gel (ou T%)
en disant par exemple : une électrophorèse sur gel de polyacrylamide à 15% ou à T%=15%.
6.2.1.1. Mode opératoire d'une SDS-PAGE
Préparation du gel de concentration et le gel de séparation,
Le gel de séparation est coulé entre des plaques de verre fixées sur un support de coulage suivis
par le gel de concentration, un peigne est déposé entre ces plaques (Figure 22),
Après polymérisation du gel, la peigne est retiré formant des puits,
Déposer l’échantillon et les marqueurs de PM dans les puits,
Les plaques de verre contenant le gel polymérisé sont placées dans une cuve d'électrophorèse,
Remplir la cuve avec le tampon de migration,
Mettre en marche le générateur de courant,
A la fin de migration, enlever le gel à partir des plaques, faire une coloration ensuite une
décoloration,
Techniques d’identification et de quantification 2020
34
Analyse du gel.
Figure 22 : Appareillage d'une SDS-PAGE.
6.2.1.2. Applications
Vérifier la pureté des fractions chromatographies.
Déterminer le PM d’une protéine : Le PM des protéines est déterminé à l'aide de marqueurs qui sont des protéines standards de PM connues. Il faut déterminer : Rapport frontale (Rf) = distance de migration d'un composé/ front de migration (fm) ensuite tracer la droite : log (PM) = f (Rapport frontale) qui permet de déterminer le PM d'une protéine inconnue (Figure 23).
Figure 23 : Courbe d'étalonnage log (PM) = f (Rapport frontale).
6.2.2. Isofocalisation électrique (IEF)
On sait que les protéines ont une charge qui leur permet de migrer dans un champ électrique. Le
principe de base de la focalisation isoélectrique (IEF) est de créer un gradient de pH dans lequel pourront
se déplacer les protéines soumises à un champ électrique. Les protéines migreront dans ce champ
Techniques d’identification et de quantification 2020
35
électrique. Arrivées au pH correspondant à leur pI, elles s’immobiliseront puisque leur charge nette sera
nulle. De cette façon, il est possible de séparer les protéines selon leur pI (Figure 24).
La méthode consiste à placer les deux bornes du gel ou du support dans une solution d’un acide
fort à l’anode et dans une solution d’une base forte à la cathode et en ajoutant au support des ampholytes
portant un certain nombre de groupes ionisables positivement ou négativement (généralement des
polyamines, polycarboxyles ou sulfates) et l'on branche le courant électrique le gradient de pH est
maintenu par le fait que chaque ampholyte s’immobilise à son pI. Ceci est garanti par le fait que ces
ampholytes se distribueront par ordre de pI et leur capacité tampon aidera à maintenir autour d’elles une
petite zone de pH égal à leur pI. Une série d’ampholytes ayant chacun un pI couvrant une certaine
gamme de pH créera donc un gradient continu de pH. Si on fait migrer une petite quantité de protéines
dans ce système, après ou durant sa formation, elles migreront aussi et s’immobiliseront à leur pI.
Ces ampholytes peuvent balayer un domaine de pH:
Gamme large (Exp. pI entre 3-10): permettant analyser un grand nombre de protéines.
Gamme étroite (Exp. pI entre 4-5 ou 5-6.5): permettent une séparation très fine pour une mesure
précise. En utilisant une gamme de molécules ayant des pI connus on peut tracer une droite
d’étalonnage reliant les pI au distances parcourues, on peut, par projection trouver les pI des
protéines de l’échantillon.
Figure 24 : Un gel d'IEF.
6.2.2.1. Mode opératoire d'une IEF
Préparation du gel de polyacrylamide 6%,
Techniques d’identification et de quantification 2020
36
Le gel de séparation est coulé entre des plaques de verre fixées sur un support,
Déposer l’échantillon et les marqueurs de pI,
Le gel polymérisé est placées dans une cuve de séparation,
Mettre en marche le générateur de courant (les protéines sont plus grosses que les ampholytes,
elles migreront beaucoup plus lentement),
A la fin de migration, enlever le gel a partir des plaques, avant la coloration, il faut éliminer les
ampholytes car elles peuvent se colorer en mettant le gel dans une solution de lavage,
Faire une coloration ensuite une décoloration,
Analyse du gel.
6.2.2.2. Electrophorèse bi-dimensionnelle
La meilleure technique pour l'analyse d’un mélange complexe de protéines est l’électrophorèse
bidimensionnelle. Il s’agit de la combinaison d’une électrophorèse qui sépare selon le pI (une
focalisation isoélectrique, suivie d’une électrophorèse dénaturant SDS, séparant selon le poids
moléculaire.
Dans un premier temps, on sépare donc le mélange selon le pI dans un gel cylindrique ou plat
(en feuille). On découpe ensuite la bande verticale du gel plat ou on récupère le cylindre de gel. On
dépose ensuite cette bande horizontalement sur un gel de concentration et on la met à l’électrophorèse,
permettant une séparation selon le poids moléculaire (Figure 25).
Figure 25 : Electrophorèse bi-dimensionnelle.
Techniques d’identification et de quantification 2020
37
6.3. Électrophorèse sur gel d’agarose
L’électrophorèse en gel d'agarose est utilisée pour séparer les acides nucléiques ou des protéines
en fonction de leur poids moléculaire. Les gels d’agarose ont de grands « pores » et sont utilisés
essentiellement pour séparer les grandes molécules d’une masse moléculaire supérieure à 200 kD Il est
utilisé à des concentrations de 0,5% à 2%.
Les gels d’agarose sont obtenus en mettant la poudre d’agarose déshydraté en suspension dans
un tampon aqueux, puis en faisant bouillir le mélange ensuite le versée sur un moule. Le gel est refroidit
à une température ambiante jusqu’à formation d’un gel rigide. Il existe un nombre très varié de tampons.
Les plus souvent utilisés sont le Tris/Acétate/EDTA (TAE).
Les étapes d'une électrophorèse sur gel d’agarose (Figure 26).
Préparation du gel d’agarose : peser la quantité nécessaire d’agarose, y ajouter le tampon et porté ensuite à ébullition (microonde) jusqu’à ce que l’agarose soit complètement dissous.
Ajouter l’agent d’intercalation.
Remplir le support avec le gel d’agarose en évitant la formation des bulles d’air. Laisser le gel polymériser à température ambiante pendant environ 20 min.
Techniques d’identification et de quantification 2020
38
Préparation des échantillons : il est nécessaire de se munir un tampon de chargement, des standards de PM et l’ADN. Mélanger l’ADN avec le tampon de chargement.
Lorsque le gel s’est solidifié, retiré délicatement le peigne du gel.
Placer le gel dans la cuve et ajouter le tampon jusqu’à ce qu’il recouvre complètement le gel.
Charger les échantillons et le standard.
Fermer la cuve et la connecté au transformateur.
Techniques d’identification et de quantification 2020
39
Exposer le gel aux rayonnements ultraviolets afin de visualiser les différentes bandes d’ADN.
Les résultats positifs sont caractérisés par la présence de bandes, ce qui témoigne l’obtention des fragments.
Figure 26 : Les étapes d'une électrophorèse sur gel d'agarose.
6.3.1. Électrophorèse en champ pulsé
Pour séparer des fragments d'ADN de taille supérieure à 20 kb. Le principe de cette
électrophorèse consiste à changer l'orientation et/ou la polarité du champ électrique alternativement au
cours du temps. A chaque modification du champ, la molécule d'ADN doit se réorienter parallèlement
au nouveau champ. Lorsque le champ est rétabli dans son sens initial, la molécule doit une nouvelle fois
se réorienter. Ces temps de réorientation provoquent un retardement de la migration nette qui est
proportionnel à la taille de la molécule. Le support de migration est un gel d'agarose à 1% et la taille des
fragments séparés est de l'ordre de 50 kb à quelques mégabases.
6.4. Électrophorèse capillaire
C'est une technique récente qui commence à se développer et qui offre essentiellement les
avantages de la rapidité, de la très grande résolution et, partant, de la très grande sensibilité de la
détection. L'électrophorèse utilise un capillaire de silice de diamètre d'environ 50 µm et de longueur 1
m (rempli de tampon ou de gel), et des voltages élevés (15 -30 kV). Ceci aboutit à des vitesses de
migration très rapides des composés dans les capillaires et ceux-ci sont détectés par absorption UV,
fluorimétrie ou conductimétrie directement sur le capillaire (Figure 27).
Techniques d’identification et de quantification 2020
40
Figure 27 : Principe d'électrophorèse capillaire.
Les domaines d'application sont a priori nombreux : analyse de peptides, d'acides aminés,
d'oligonucléotides,…
6.5. Immunoélectrophorèse
L'immunoélectrophorèse est un nom général pour un certain nombre de méthodes biochimiques
de séparation et caractérisation de protéines basant sur l'électrophorèse et la réaction avec des anticorps.
Toutes les variantes de l’immunoélectrophorèse exigent des anticorps réagissant avec les protéines à
séparer ou à caractériser.
Le gel d’agarose 1% tamponnée à un pH élevé (environ 8.6) est, traditionnellement préféré pour
l’électrophorèse, ainsi que pour la réaction avec des anticorps. L’agarose a été choisi comme une
matrice, car il a de larges pores permettant le passage libre et la séparation des protéines, mais aussi
fournit un ancrage pour les protéines immuno-précipitées et des anticorps spécifiques. Le pH élevé a été
choisi parce que les anticorps sont pratiquement immobiles à pH élevé. Un équipement d'électrophorèse
avec une plaque horizontale est normalement recommandé pour l'électrophorèse. Les immuno-
précipités ou les Complexes Ac-Ag peuvent être vus dans le gel mais ils sont colorés avec les colorants
des protéines comme bleu de Coomassie.
6.5.1. Immunoélectrophorèse de Grabar et Williams
Cette technique est utilisée pour la séparation et l’identification d’un mélange d’antigène (Ag).
Le support utilisé est le gel d’agarose qui comporte deux types de puits : un puits ponctuel pour le dépôt
de l’Ag (sérum à analyser) et un puits en forme de rigole pour le dépôt de l’anticorps (Ac).
Techniques d’identification et de quantification 2020
41
Dans un premier temps, un mélange d’Ag est soumis à un champ électrique le long duquel les
constituants se répartissent en fonction de leur mobilité électrophorétique.
Dans un deuxième temps, l’Ac est déposé dans la fente. Ces derniers diffusent dans un sens
perpendiculaire à celui de la piste électrophorétique dont les fractions (Ag séparés) diffusent en sens
inverse. Lorsque l’Ag rencontre son Ac spécifique, le complexe Ac-Ag précipite donnant des arc de
précipitation. La plaque est lavée par la suite par une solution saline. La révélation se fait par le colorant
approprié (bleu de Coomassie). L’identification s’effectue par comparaison à un sérum de contrôle
normale traité dans les mêmes conditions (Figure 28).
Figure 28 : Immunoélectrophorèse de Grabar et Williams.
6.5.2. Electro-immunodiffusion monodimensionnelle (Laurell)
Cette technique permet d’accélérer le temps de diffusion en obligeant l’Ag a migrer sous l’effet
d’un champ électrique, dans un gel contenant l’Ac. Les Ag se déplacent et rencontrent les anticorps qui
forment alors des précipités en forme de fusée appelés "rockets" dont la hauteur est proportionnelle à la
concentration en protéine. On utilise une partie des puits pour faire une droite d'étalonnage (Figure 29).
Techniques d’identification et de quantification 2020
42
Figure 29 : Droite d'étalonnage utilisé pour déterminer la concentration des Ac ou Ag.
6.5.3. Electro-immunodiffusion bidimensionnelle
On sépare les protéines dans une première dimension en gel d'agarose. On coule ensuite un gel contenant
l'antisérum, puis on réalise la seconde dimension.
6.6. Immunoblotting
L'immunoblotting (Transfert des protéines) utilise l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide
pour séparer des protéines. Ces protéines sont ensuite transférées depuis le gel vers une membrane de
nitrocellulose (simple diffusion), où elles sont exposées à un anticorps spécifique de la protéine d'intérêt.
On transfert les protéines d'un gel d'acrylamide, (les pores trop petits) pour que les anticorps diffusent
facilement, à la surface de la membrane de nitrocellulose et peuvent facilement atteindre les protéines.
6.6.1. Les différentes étapes du transfert:
Électrophorèse sur gel
Transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose (sandwich) ; (Figure 30)
Incubation une solution d’anticorps primaire spécifiques
Incubation une autre solution d’anticorps marqué (coloration, fluorescence, radiographie ou
chimiluminescence) ; (Figure 31).
Techniques d’identification et de quantification 2020
43
Figure 30 : Transfert des protéines sur membrane de nitrocellulose (sandwich).
Figure 31 : L'étape d'incubation avec des anticorps primaire et secondaire marqués.
8. Applications de l’électrophorèse
1. Recherche scientifique : les applications de l’électrophorèse dans la recherche
scientifique sont très diverses et il est difficile les cerner. Les plus importantes sont :
Etude des protéines : les études concernant les protéines consistent surtout en la
détermination des poids moléculaires, la composition en chaînes primaires, les
résultats des digestions enzymatiques, la nature des protéines (glyco- ou lipoprotéines), la
contenance des cellules et des organites cellulaires en protéines, en enzymes…
Etude des acides nucléiques : surtout dans le séquençage des gènes, les résultats des
coupures avec des nucléases, la purification des acides nucléiques, les tailles des ARN et
ADN, les plasmides…
Techniques d’identification et de quantification 2020
44
2. Diagnostic : recherche des anticorps dirigés contre des antigènes de virus ou autres antigènes
par dot-immunoblotting (western blot) ou par immunoélectrophorèse, comparaison des
sérums par immunoélectrophorèse.
3. Sciences agronomiques : pour les études des effets des différents stress (thermique,
hydrique…) ou traitement (industrie agro-alimentaires…).
4. Contrôle de qualité : études des protéines caractéristiques des différents nutriments
(Blé : gliadines, viandes : dans le Merguez et les saucissons…).
Techniques d’identification et de quantification 2020
45
Chapitre IV : Spectrométrie
1. Définition
Le rayonnement électromagnétique se présente sous la forme d’onde électromagnétique qui se
propage dans le vide à la même vitesse que celle de la lumière. Seule une partie de ces ondes est visible
sous forme de lumière. L’ensemble de ces ondes, visibles ou non, forme ce qu’on appelle le spectre
électromagnétique. Le spectre électromagnétique (Figure 37) s’étend des radiofréquences de plus basse
énergie (ou de plus grande longueur d’onde) au rayonnement Gamma de haute énergie (ou de petite
longueur d’onde). Le rayonnement électromagnétique dans le domaine UV-VIS s’exprime par sa
longueur d’onde λ, en nm. Le domaine UV s’étend de 160 à 390 nm, celui du visible de 390 à 770 nm
(du bleu au rouge) et celui de l’infrarouge (IR) du 780 nm à 1mm.
Figure 37 : Le spectre électromagnétique.
A chacun des domaines particuliers du rayonnement électromagnétique correspond un type de
spectroscopie qui repose sur une interaction particulière de la matière avec ce rayonnement (Figure 38).
Pour le domaine :
Des γ et des RX, le rayonnement est extrêmement énergétique et il va pouvoir affecter les
électrons des orbitales atomiques de noyau.
Des UV et du visible, le rayonnement est énergétique et il peut affecter les électrons des orbitales
atomiques périphériques et/ou des orbitales moléculaires. Ces interactions sont utilisées
notamment dans la spectroscopie d’émission atomique (SEA), la spectroscopie d’absorption
atomique (SAA) et la spectroscopie moléculaire (UV-VIS).
Techniques d’identification et de quantification 2020
46
De l’IR, le rayonnement est faiblement énergétique et ne peut affecter principalement que les
modes de vibration des molécules. Ces interactions sont utilisées notamment dans la
spectroscopie IR et la spectroscopie Raman.
Des radio, finalement, le rayonnement est très faiblement énergétique et ne peut affecter que les
modes de rotation des molécules, modification d’états de spin électronique (résonance
paramagnétique électronique, RPE) et modification d’états de spin nucléaire (résonance
magnétique nucléaire, RMN).
Figure 38 : Les domaines de la spectroscopie.
2. Spectre, spectroscopie et spectrométrie
La spectroscopie est l’étude du spectre électromagnétique d’un phénomène, visuellement (d’où
le suffixe -scopie). Depuis un certain temps, l’œil a été remplacé par différents types de détecteurs
photoélectriques, et il convient alors de parler de spectrométrie (le suffixe-métrie indiquant que l’on
effectue une mesure et non une simple appréciation du phénomène). Il conviendrait de remplacer le
terme "spectroscopie", par le terme plus exact de "spectrométrie".
Le spectre est la distribution en énergie, puissance, intensité, absorbance, transmission, etc. en
fonction de la longueur d’onde ou de la fréquence. On distingue trois types de spectres :
Les spectres continus, pour lesquels il existe un "signal" pour chaque longueur d’onde ou
fréquence (Figure 39a).
Les spectres discontinus, ou spectres de raies, ou encore spectres discrets, qui ne disposent d’un
signal que pour certaines fréquences ou longueurs d’onde spécifiques, caractéristique de la
matière irradiante ou irradiée (Figure 39b).
Techniques d’identification et de quantification 2020
47
Les spectres combinés qui sont constitués d’une superposition d’un spectre continu et d’un
spectre discret (Figure 39c).
Figure 39 : Différents types de spectres. a : spectre continu, b : spectre discontinus, c : spectre combiné.
3. Absorption et émission
Les échanges d’énergie entre les atomes et la lumière sont quantifiés: ils se font par paquets
d’énergie appelés photons (Figure 40).
3.1. Absorption
Un atome initialement au repos au niveau fondamental d’énergie Ef peut passer au niveau excité
supérieur d’énergie Ee, en absorbant de l’énergie ΔE = h.ν = Ee-Ef (la constante de Planck h = 6,63.10-
34 J.s), V est la fréquence de l’onde électromagnétique associée au photon.
3.2. Emission spontanée
Les états électroniques excités ne sont pas stables. Plus ou moins vite, l’atome retombe dans
l’état fondamental en émettant un photon. Le photon peut être émis dans n’importe quelle direction.
L’énergie hv du photon émis est égale à la différence d’énergie Ee – Ef entre les deux niveaux atomiques
(e) et (f).
Figure 40 : L'absorption et l'émission.
a b c
Techniques d’identification et de quantification 2020
48
4. Spectrométrie Uv-VIs
La spectrophotométrie UV-VIS repose sur l'interaction du rayonnement électromagnétique
et de la matière. L'absorbance des composés dans l'UV et le visible est exploitée en analyse quantitative
par application de la loi de Beer-Lambert.
4.1. Principe
Ce type de spectrométrie repose principalement sur des interactions entre les rayonnements
électromagnétiques et les électrons des orbitales moléculaires. L'absorption des rayonnements par les
molécules est due au passage d’un électron d’un niveau électronique à un autre niveau électronique
d’énergie supérieure.
Si on place une solution contenant une substance dissoute dans un solvant, dans un
spectrophotomètre. Et on mesure l’absorbance à différente longueurs d’onde, on va obtenir un graphique
des pics à des longueurs d’onde définies: c'est le spectre d'absorption. Le maximum d’absorbance
correspond à λ max (Figure 41).
Figure 41 : Le spectre d'absorption.
L’absorption d’un rayonnement ultraviolet ou visible correspond à une interaction des photons
avec les électrons des couches externes des atomes ou des molécules. La position du maximum
d’absorption correspond à la longueur d’onde de la radiation qui provoque la transition électronique.
4.2. Loi de Beer-Lambert
Les spectres dans l’UV- VIS donnent la transmittance ou l’absorbance de l’échantillon analysé
en fonction de la longueur d’onde du rayonnement. La transmittance, notée T, est donnée par : 𝑇 = 𝐼/𝐼0
Techniques d’identification et de quantification 2020
49
Où I0 est l’intensité incidente et I, l’intensité transmise.
Si :I0 = I, milieu transparent
Si :I0> I, milieu partiellement absorbant
Si :I = 0, milieu opaque (absorption totale)
L’absorbance A est définie par : 𝐴 = − log 𝑇
Cette dernière grandeur est très utile en analyse quantitative par application de la loi de Beer-Lambert
que nous verrons plus loin. Plus un composé est absorbant, plus la transmittance est faible et plus
l’absorbance est élevée.
Soit une lumière monochromatique traversant une solution absorbante de concentration C contenue dans
une cuve d’épaisseur l (Figure 42). Une partie de ce rayonnement sera absorbée par l’échantillon et une
partie sera transmise. Bouguer, Lambert et Beer ont étudié les relations qui existent entre I0 et I :
l'intensité d'une lumière monochromatique traversant un milieu où elle est absorbée décroît de façon
exponentielle : 𝐼 = 𝐼0 𝑒−𝑘𝑙𝐶
Ou’ :
l : la distance traversée par la lumière (épaisseur de la cuve) (en cm)
C : la concentration des espèces absorbantes
k : une constante caractéristique de l’échantillon.
Cette équation peut se réécrire log (I0/I) = klC/2.3 = ε l C. ε: est le coefficient d'extinction molaire ;
c’est une caractéristique de la substance étudiée à une longueur d'onde donnée. Si C’est la molarité, ε
est en M-1.cm-1. On obtient alors la relation connue sous le nom de loi de Beer-Lambert : 𝐴 =− log 𝑇 = 𝜀𝑙𝑐.
Figure 42 : L'absorbance d’une lumière monochromatique par une substance.
Techniques d’identification et de quantification 2020
50
4.2.1. Conditions de validité de la loi de Beer-Lambert:
Le monochromatisme (une seule longueur d’onde λ max),
Les faibles concentrations (diluées),
Température stable (ε dépends de la température),
pH stable,
Clarté du milieu,
Origine d’absorption.
Les rayonnements provoquent des transitions électroniques entre les différents niveaux
d’énergie des molécules. Les transitions électroniques correspondent au passage des électrons des
orbitales moléculaires liantes et non liantes remplies, vers des orbitales moléculaires antiliantes non
remplies. La longueur d’onde d’absorption dépend de la nature des orbitales mises en jeu. Les transitions
électroniques généralement observées en spectrophotométrie : π π* et n π*. Le diagramme suivant
illustre ceci pour des orbitales de type σ, π et n (Figure 43).
Figure 43 : Diagramme illustre des transitions électromagnétiques.
4.2.2. Matériels
La source lumineuse: les sources les plus utilisées sont :
La lampe à filament de tungstène dans une atmosphère halogène (lampe à iode), (Figure 44). Elle fournit
un spectre de lampe continu utilisable entre 350 et 700 nm (visible).
La lampe à arc dans une atmosphère d'hydrogène ou de deutérium (Figure 44), dite lampe à hydrogène
ou deutérium. Elle fournit un spectre de lampe continu utilisable entre 200 et 360 nm. Ainsi de nombreux
spectrophotomètres combinent lampe à deutérium et lampe à iode pour couvrir le VIS et l'UV.
Techniques d’identification et de quantification 2020
51
La lampe à arc en atmosphère de xénon (Figure 44). Elle fournit un spectre de lampe continu utilisable
entre 260 et 800 nm. C'est une lampe actuellement très populaire. En raison de leur large spectre
(couvrant le domaine UV et visible) et leur longue durée de vie.
Lampe à filament de tungstène dans une atmosphère halogène.
Lampe à arc dans une atmosphère de deutérium.
Lampe à arc en atmosphère de xénon.
Figure 44 : Les sources lumineuses.
4.2.3. Les monochromateurs
La sélection de la longueur d'onde est réalisée grâce au monochromateur. Il comprend
classiquement :
Une fente d'entrée permettant l'atteinte par un fin faisceau polychromatique.
Un système dispersif de type réseau.
Une fente de sortie, qui, par la motorisation précise, permettra de sélectionner une longueur
d'onde précise (en fait une bande passante étroite) dispersée et de la diriger vers le porte
échantillon.
4.2.4. Système porte échantillon
Classiquement on utilise des "cuvettes" à face optique parallèles, transparentes et déterminant
un trajet optique de 1 cm. Le matériau de la cuve renfermant l'échantillon est fondamental :
Les cuves à usage unique en polystyrène ne sont utilisables que dans le visible (Figure 45).
Certains plastiques permettent la réalisation de cuves à usage unique utilisables dans l'UV plus ou moins
lointain.
Les cuves en verre, à nettoyer après usage, ne sont utilisables que dans le visible et sont
généralement abandonnées au profit des cuves plastiques à usage unique. Mais il faut noter que le
plastique est parfois incompatible avec certains solvants (Figure 45).
Techniques d’identification et de quantification 2020
52
Les cuves en quartz (coût élevé) permettent les mesures dans l'UV jusqu'à 200 nm et aussi le visible (Figure 45).
a b c
Différentes cuves. a : cuve en polystyrène, b : cuve en verre, c : cuve en quartz.
Figure 45 : Détecteurs et amplificateurs.
Le principe de base du détecteur est de transformer le signal optique reçu en courant électrique
ou en tension. Il s'agit donc de compter les photons reçus par longueur d'onde en utilisant l'effet
photoélectrique.
Cependant, le signal de sortie restant très faible, il nécessite une amplification d'un facteur 10 au moins
pour être lisible. Du fait de cette limitation, on est vite passé à un système d'amplification interne, il
s'agit des photomultiplicateurs.
4.2.5. Les spectrophotomètres à mono-faisceau
Il y a deux possibilités selon que l'on travaille en faisceau monochromatique ou non (Figure 46):
Montage inversé: Source lumineuse, Echantillon, Polychromateur, détecteur polychromatique.
Montage direct: Source lumineuse, Monochromateur, Echantillon, détecteur.
Figure 46 : Spectrophotomètre à mono-faisceau.
Techniques d’identification et de quantification 2020
53
4.2.6. Les spectrophotomètres à double faisceau
Un faisceau traverse le compartiment échantillon et le second le compartiment référence (Figure 47).
La soustraction du blanc est faite automatiquement par un logiciel de traitement des données.
Figure 47 : Spectrophotomètres à double faisceau.
Notion de blanc
Lorsqu'une espèce chimique est solubilisée dans un solvant et placée dans une cellule de mesure,
l'absorption mesurée correspond à la somme de trois absorptions différentes :
L'absorption due à la cellule qui peut être en verre, en quartz ou en polymère.
L'absorption due au solvant.
L'absorption due à l'espèce chimique dissoute.
Les deux premières absorptions ne sont pas dues à l’espèce analysée. Il faut donc les retrancher.
Pour ce faire, on mesure l’absorbance de la cellule avec du solvant et on soustrait l’absorbance ainsi
obtenue (le blanc) de l’absorbance mesurée avec l’espèce que l’on veut étudier. Ceci est rendu possible
par l’additivité des absorbance.
4.3. Applications de la spectrométrie UV-VIS
Analyse quantitative (détermination de la concentration d’une substance inconnue): la
spectrophotométrie UV-VIS est utilisée pour mesurer la concentration d'un échantillon inconnu. Pour
cela, il faut d'abord choisir sa propre bande d'absorption. L'exemple de spectre d'absorption de
l'échantillon peut être disponible dans la littérature s’il a déjà été étudié. Si non, une spectrophotométrie
à double faisceau doit être effectué pour savoir où sa bande d'absorption se situera. Une bande
d'absorption appropriée est sélectionnée. Deux techniques de dosages sont utilisées en
spectrophotométrie :
Techniques d’identification et de quantification 2020
54
La méthode de la gamme d'étalonnage: la méthode de la gamme d'étalonnage consiste à préparer des
solutions dont la concentration est connue puis la solution de concentration inconnue. L'absorbance
mesurée pour chacune de ces solutions permet d'établir un graphe où l'on trace A = f(C). Il ne reste plus
qu'à placer l'absorbance de la solution inconnue et par projection on obtient la concentration inconnue
(Figure 48).
La méthode des ajouts dosés consiste à ajouter plusieurs fois un même volume d'une solution de
concentration connue à un volume donné de concentration inconnue. Un travail graphique ou
mathématique se basant aussi sur la proportionnalité entre A et C permet de trouver la concentration
inconnue.
Figure 48 : La courbe d'étalonnage.
Essais enzymatiques: l'activité enzymatique peut être, facilement et rapidement, calculé lorsque
le substrat ou le produit absorbe la lumière dans l’UV-Vis. Dans ces cas, le taux d'apparition ou
de la disparition d'un produit ou d'un substrat absorbant la lumière peut être mesurée à l'aide d'un
spectrophotomètre.
Techniques d’identification et de quantification
CHAPITRE 4 : Méthodes de marquage
Introduction
L’histoire de la médecine nucléaire est liée à celle de la physique nucléaire, notamment la
découverte de la radioactivité naturelle par Henri Becquerel. Le travail de Georg Von Hevesy a été
primordial dans le développement des isotopes radioactifs comme indicateurs en biologie. Il découvre
en 1923 la méthode des traceurs radioactifs.
1. Méthodes de marquage
Plusieurs méthodes de dosage consistent à mélanger à l’échantillon une quantité connue du
composé que l’on veut doser (Figure 1), sous forme marquée, afin qu’il soit reconnaissable. On peut
marquer un élément ou une molécule :
En modifiant le rapport isotopique de cet élément ou d’un des atomes de la molécule, soit
avec un radioélément (détection par comptage en becquerels), soit avec un isotope stable
(détection par spectrométrie de masse ou RMN). Ce sont les analyses isotopiques.
En fixant une enzyme ou un dérivé fluorescent. Ce sont en particulier les analyses
immuno-enzymatiques et immunochimiques.
Figure 1: Différents types de marquage.
1.1. Principe des méthodes de marquage
Techniques d’identification et de quantification
2
Pour doser un analyte dans un échantillon, on ajoute à la prise d’essai une quantité connue
du même composé sous forme marquée, c’est à dire porteur d’une sorte d’étiquette qui a pour but de
pouvoir le distinguer du composé réellement présent à l’origine dans l’échantillon. Ensuite, après avoir
bien mélangé les deux formes, on en récupère une fraction pour calculer, d’après sa composition, la
quantité initialement présente. Le marquage du composé ne doit pas altérer son comportement dans
l’étape de récupération. Il ne s’agit pas d’une méthode classique d’ajout.
Les méthodes de marquage ne se rencontrent pas qu’en analyse chimique. Pour évaluer, par
exemple, la quantité de saumons dans un bassin, on en pêche un certain nombre que l’on marque avec
une étiquette avant de les relâcher. Au bout de quelques jours, on prélève un échantillon de poissons et
à partir de la proportion de saumons marqués, on peut en déduire la population totale : si, après avoir
étiqueté puis relâché 500 saumons on repêche 200 saumons parmi lesquels 10 sont marqués, le
nombre total de saumons x sera tel que : 10 /200 = 500/x, soit x = 10 000.
1.2. Propriétés d’un marqueur idéal
Il doit avoir de multiples liaisons covalentes au réactif (antigène ou anticorps) pour une
haute sensibilité.
L’espèce marquée doit être stable.
Le marquage doit avoir un effet minimal sur les propriétés de liaison de l’antigène et de
l’anticorps
Le marqueur doit être facilement détectable avec une instrumentation peu coûteuse et
automatisée.
Le marqueur doit avoir des propriétés qui permettent de différentier entre une espèce
libre et une espèce liée sans une étape de séparation.
1.3. Radioactivité
Techniques d’identification et de quantification
3
L'atome comprend deux parties : un noyau et des électrons en mouvement rapide autour
de ce noyau. Le cortège électronique est constitué d'électrons de charge électrique négative qui
gravitent autour du noyau.
Le noyau est constitué de protons de charge électrique positive, et de neutrons de charge
électrique nulle. Ces particules qui constituent le noyau sont également appelées nucléons. Le
noyau perd deux protons, il change donc de nature. Dans le tableau périodique des éléments, il se
décalera de deux cases vers la gauche. Par exemple, le polonium 210 (Po) se transforme en
plomb 206 (Pb)
Les isotopes se trouvent partout dans notre environnement. Ils sont incorporés dans les
plantes par l'intermédiaire des sédiments et de l'eau, et dans les tissus animaux par l'alimentation,
les boissons et la respiration. Un organisme absorbe les isotopes tout au long de sa vie et les
remplace au fur et à mesure que ses tissus (ex. peau, cheveux, os) se renouvellent.
La désintégration est le dégagement de l'énergie sous forme rayonnement pour se
transformer en deux noyaux atomique plus stable.
La radioactivité est une réaction dite nucléaire car elle concerne le noyau de l'atome par
opposition aux réactions chimiques qui ne concernent que le cortège électronique sans modifier
le noyau.
Le terme chaud désigne une molécule marquée avec un isotope radioactif. Le terme froid
est utilisé pour désigner une molécule non radioactive.
1.3.1. Définition et principe
La radioactivité est une technique utilisée pour suivre le passage d'un isotope. Deux
atomes sont dits isotopes si leur noyau a un nombre de proton identique (z) mais un nombre de
neutrons différent (N) donc de masse atomique différente (A) : A = Z +N (Figure 2).
Techniques d’identification et de quantification
4
Figure 2: Isotope stable et radioactif.
Les isotopes sont les différentes formes d'un élément qui partagent les mêmes propriétés
chimiques, mais qui diffèrent par leur masse et par leur nombre de neutrons. Le carbone,
l'oxygène, l'hydrogène et l'azote sont des éléments chimiques courants qui possèdent différents
isotopes. Chacun de ces éléments est identifié par un sigle, par exemple « C » pour le carbone,
et le numéro placé devant ce sigle identifie l'isotope (ex. 13C et 12C). Il existe deux types
d'isotopes : les isotopes stables et les isotopes radioactifs.
Les isotopes stables ne changent pas au cours du temps, comme le carbone 13
et l’oxygène 18. Ils ne sont pas radioactifs et ne se désintègrent pas.
Les isotopes radioactifs se désintègrent en suivant un rythme prévisible. Afin de
distinguer les différents isotopes, les scientifiques utilisent des machines spécialisées
appelées spectromètres de masse. Caractérisés par un temps de demi-vie, qui est le temps
Techniques d’identification et de quantification
5
requis pour que la moitié d’un échantillon radioactif soit désintégré. Les isotopes
radioactifs sont soit naturels (carbone 14), soit artificiels (soit les deux).
1.3.2. Radioactivité et différents traceurs
La radioactivité est un phénomène physique naturel au cours duquel des noyaux
atomiques instables (radio-isotopes) se transforment spontanément « désintégration » en
dégageant de l'énergie sous forme de rayonnements divers, pour se transformer en des noyaux
atomiques plus stables ayant perdu une partie de leur masse. Au moment de la désintégration, un
noyau peut libérer différents types de rayonnements : alpha, bêta et gamma. A chacun de ces
rayonnements correspond une forme de radioactivité (Figure 3a).
Figure 3a: Différents types de la radioactivité.
La radioactivité alpha "α" : cette radioactivité ne concerne que les noyaux lourds, dont
le numéro atomique est en général supérieur à 74 (tungstène). Le noyau le plus lourd
concerné par cette radioactivité est l’uranium 238. Le noyau se désintègre en émettant un
noyau d’hélium (2 protons et 2 neutrons). Le noyau d’hélium est appelé rayonnement
alpha .Ce rayonnement n’est pas très dangereux car quelques millimètres de papier sont
suffisants pour le stopper.
Techniques d’identification et de quantification
6
La radioactivité Beta "β" : Il existe deux types de radioactivité bêta : la bêta- et la
bêta+ : La bêta- : un neutron se transforme en proton en émettant un électron (que l’on
appelle aussi le rayonnement bêta) et un neutrino (une particule de masse très faible,
voire nulle non chargée). La bêta+ : un proton se transforme en neutron en émettant un
positon (l’anti-particule de l’électron) et un neutrino. Les électrons (-) et les positons (+)
sont émis à grande vitesse mais sont facilement absorbés (quelques millimètre
d’aluminium suffisent), ils ne sont donc pas très dangereux (Figure 3b).
Figure 3b : Radioactivité bêta.
La radioactivité gamma γ: Lors de ce type de radioactivité, il n’y a pas d’émission de
particules ou de désintégrations à proprement dite. Elle intervient après chaque
transformation radioactive alpha ou bêta. Il s’agit de l’émission d’énergie (appelée juste
rayonnement gamma) due à la désexcitation du noyau fils. Lors de la transformation
radioactive, le noyau fils est excité (excitation marquée par *), c’est-à-dire que certains
de ses électrons se situent sur des couches électroniques trop éloignées du noyau. Les
électrons auront alors tendance à se rapprocher du noyau et c’est ce rapprochement, ce
« saut » d’une couche électronique à une autre qui provoque l’émission d’énergie. Cette
Techniques d’identification et de quantification
7
radioactivité est la plus dangereuse vu qu’elle produit beaucoup de dégâts et qu’elle est
difficile à stopper, il faut en général quelques mètres de béton (Figure 3c).
Figure 3c : Effets de trois types de rayonnements.
La plupart des radio-isotopes employés en biologie sont de ce type: 14C, 3H
(tritium), 32P, 35S, etc. D'autres radio-isotopes émettent du rayonnement γ. Généralement cette
émission résulte d'un processus complexe où plusieurs décompositions se produisent en série
et s'accompagnent également de la production de particules β. Un isotope de type γ est utilisé en
biochimie est l’ 125I.
1.3.3. Obtention de molécules marquées
Les molécules biologiques marquées peuvent être obtenues par conjugaison chimique ou
par synthèse.
Techniques d’identification et de quantification
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Conjugaison chimique : attacher, par un lien chimique covalent, un atome radioactif à
une molécule "froide" déjà existante et isolée de sa source naturelle (attacher de l'iode-
125 à de la concanavaline A). On utilise cette approche surtout si on veut marquer des
macromolécules.
Synthèse en laboratoire des molécules de façon à ce que, durant cette synthèse, certains
atomes radioactifs fassent partie de la structure normale de la molécule. Dans ce cas, il
s'agit généralement de petites molécules (glucose, acides aminés, ATP) relativement
faciles à synthétiser in vitro.
1.3.4. Détection et mesure de la radioactivité
Toutes les méthodes de détection sont fondées sur le fait qu’un rayonnement crée des
ionisations et des excitations, et donc laisse une trace au sein même de la matière. En calculant,
par unité de temps, le nombre d’ionisations ou d’excitations provoquées par les particules (dans
le cas d’un rayonnement α ou β) ou les photons (dans celui d’un rayonnement γ), il est possible
de quantifier l’énergie transmise du rayonnement à la matière.
Le principe des trois grands types de détecteurs les plus couramment utilisés (les
compteurs à gaz, les scintillateurs et les semi-conducteurs) est le même : ils convertissent en un
signal électrique les photons ou les électrons créés par le rayonnement.
La fonction de la plupart des détecteurs de rayonnements va donc être de séparer et de
compter les ions (ou les électrons) produits par le passage d’un rayonnement au travers du
détecteur et ceci au moyen d’un champ électrique imposé à ce détecteur. Généralement, le
rayonnement va pénétrer dans le volume sensible du détecteur qui sera un matériau gazeux,
solide ou liquide selon le type de rayonnements que l’on veut mesurer. L’interaction va produire
une série d’évènements discrets (électrons d’ionisation, photons, chaleur, etc).
Techniques d’identification et de quantification
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1.3.5. Principaux traceurs utilisés en radio activité
Carbone-14 : Cet isotope très stable, demi-vie de plus de 5000 ans. Il émet des
particules β moyennement énergétiques.
Tritium : Cet émetteur β assez stable, ayant une demi-vie de plus de 12 ans.
Phosphore-32 : Cet émetteur β relativement peu stable (demi-vie de 14.3 jours). caractérise par
sa forte émission de particules β très énergétique.
Souffre-35 : Cet émetteur β moyennement stable (demi-vie de 88 jours). En effet, on peut
obtenir facilement de la [35S]-méthionine et de la [35S]-cystéine, ce qui facilite l'expérimentation
où on étudie les changements rapides de la synthèse des protéines.
Iode-125 : Cet émetteur de rayonnement γ . De nombreuses applications de RIA (radio immuno
essay) utilisent des anticorps secondaires marqués à l'125I. Son rayonnement est particulièrement
puissant.
Sodium-22, Calcium-45, Fer-59, Potassium-40, etc. : Ces émetteurs de radiations β ou γ sont
rarement employés.
En résumé, les traceurs radioactifs servent à :
Suivre une voie métabolique,
Etudier les biosynthèses et les réactions se produisant dans un court laps de temps,
Etudier le transfert un groupement chimique d'une molécule à une autre,
Accumulation de macromolécules, etc.
Méthode de comptage et détection de la radioactivité,
Mesure quantitative des radio-isotopes.
1.3.6. Mesure quantitative des radio-isotopes
Techniques d’identification et de quantification
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Il existe diverses méthodes pour mesurer précisément la quantité d'un radio-isotope. Ces
méthodes dépendent surtout du type de radiation émise (Figure 4).
Figure 4: Principe de la mesure de la radioactivité.
La façon la plus fréquente de quantifier les émetteurs de particules β est le comptage par
scintillation en milieu liquide. Cette approche consiste à solubiliser l'échantillon dans une
solution (d'où "milieu liquide") contenant des molécules pouvant émettre des photons (d'où
"scintillations") lorsqu'elles sont excitées par les particules β de l'isotope. Ces photons peuvent
être détectés quantitativement par une cellule photoélectrique (Figure 5).
Figure 5 : Comptage par scintillation. a) appareil comportant un puit de comptage et un photomultiplicateur pour
mesurer la luminescence produite par l’échantillon mélangé à un cocktail de scintillation (en milieu aqueux ou non aqueux) ; b)
appareil pour mesurer l’activité d’un radio-isotope de faible énergie par la méthode des coïncidences. Une seule particule b
produit plusieurs centaines de photons. On peut donc en détecter un certain nombre au même instant avec deux PM en
opposition. Le comptage n’a lieu que si les deux PM fournissent un signal dont le décalage n’excède pas quelques nanosecondes.
a b
Techniques d’identification et de quantification
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1.3.7. Mesure qualitative des radio-isotopes
Autoradiographie : est une méthode permettant la détection qualitative de matériel radioactif
fixé sur un substrat solide : gel de polyacrylamide, feuille de nitrocellulose, plaque de
chromatographie sur couche mince, etc. Cette matrice peut alors être mise en contact avec un
film (généralement à rayons X). Les radiations émises ; particules β ou rayons γ,
impressionneront alors le film vis-à-vis leur lieu d'émission. Le développement subséquent du
film permettra de localiser le ou les endroits où est situé le traceur radioactif. Cette approche peut
aussi être appliquée au niveau microscopique. Dans ce cas, les films traditionnels (émulsion
photographique sur un support solide) sont moins facilement utilisables. On emploie plutôt des
émulsions photographiques qu'on dépose directement sur des coupes histologiques.
1.4. Dosage radio immunologique
De nos jours, la méthode immuno-enzymatique ELISA a largement supplanté la radio-
immunologie. C'est une technique basée sur un phénomène de compétition entre un Ag-marqué
par un radio-isotope (C14, I125, H3, S35) et un Ag non marqué que l’on veut doser, cette
compétition s’exerce vis-à-vis d’un anticorps spécifique.
C’est une méthode de dosages radio-immunologiques. C’est une technique de médecine
nucléaire in vitro qui utilise des composés radioactifs associés à des antigènes. Elle sert à doser
de manière très précise des substances biologiques telles que les anticorps, les hormones,
les enzymes, ou les stéroïdes…etc. dans le sang, l’urine, la salive, ou tout autre liquide corporel
dont lequel la formation du complexe antigène anticorps est détectée grâce à la désintégration
d’un atome radioactif (iode 125).
La radio-immunologie classique repose sur le principe d’une liaison compétitive mettons
en présence une certaine quantité d’anticorps spécifique d’un antigène donnée et cette même
antigène préalablement marqué par radio isotope. Ensuite, on ajoute un scintillateur pour
amplifier le signal. Un complexe anticorps antigène se forme selon l’équation : AC +Ag* = [Ac
Techniques d’identification et de quantification
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Ag*]. L’antigène à doser entre en compétition avec l’antigène marqué pour la liaison à
l’anticorps. La fraction liée qui diminue exponentiellement avec la concentration en Ag à doser
est mesurée (Figure 6a). Donc en premier, une courbe d’étalonnage est réalisée avec des
solutions d’Ag de concentrations connues puis la détermination de la concentration d’Ag
contenu dans le sérum à l’aide de la courbe d'étalonnage (Figure 6b).
Figure 6a: Principe de la radio-immunologie, Figure 6b: une courbe d’étalonnage permettant de déterminer la concentration d’Ag contenu dans le sérum.
-Les différents types d’ELISA :
Il y a 4 types d’ELISA: ELISA direct, ELISA indirect, ELISA Sandwich et ELISA par
compétition
- ELISA directe : les étapes de cette technique sont comme suit (figure 1) :
-sur un support on fixe notre échantillon d’Ag à doser
-Après quelques secondes on effectue un lavage de sorte à éliminer les Ag non
fixés
-Ensuite, on ajoute un échantillon d’AC conjugué avec une enzyme
-Enfin, on applique le substrat qui émet un signal fluorescent s'il est converti par
l'enzyme et on mesure l’activité enzymatique par spectrophotométrie
Techniques d’identification et de quantification
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- ELISA indirect : -sur un support on fixe notre échantillon d’Ag à doser -Après quelques secondes on effectue un lavage de sorte à éliminer les Ag non
fixés
-Ensuite, on ajoute un échantillon d’AC primaires spécifiques aux Ag mais non marqués
-Après un second lavage, on ajoute un échantillon d’AC secondaires marqué spécifique aux AC primaires -Enfin, après un 3éme lavage on mesure l’activité enzymatique par spectrophotométrie
ELISA sandwich : -Sur un support on fixe un échantillon d’AC connu -Ensuite, on effectue un lavage de sorte à éliminer les AC non fixés
-Après, on ajoute l’échantillon d’Ag à doser -Après un second lavage, on ajoute un échantillon d’AC marqués spécifiques aux Ag -Enfin, après un 3éme lavage on mesure l’activité enzymatique par spectrophotométrie
Techniques d’identification et de quantification
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ELISA double sandwich : -Sur un support on fixe un échantillon d’AC connu
-Ensuite, on effectue un lavage de sorte à éliminer les AC non fixés
-Après, on ajoute l’échantillon d’Ag à doser -Après un second lavage, on ajoute un échantillon d’AC spécifiques aux Ag mais non
marqués
-Enfin, on ajoute un 2éme échantillon d’AC spécifiques aux AC précédents mais non marqués et on mesure l’activité enzymatique par spectrophotométrie
Dosage d’un Ag par compétition
-Sur un support on fixe un échantillon d’AC limité -Après quelques secondes, on lave le support pour éliminer les molécules d’AC non fixées
-Ensuite, on ajoute l’échantillon d’Ag à doser ainsi qu’un échantillon d’Ag marqués spécifiques aux AC fixés.
-on rince le support de façon à retirer les anticorps non liés et donc seuls les
complexes AC-Ag et AC-Ag* restent liés.
-Enfin, on applique le substrat et on mesure l’activité enzymatique par spectrophotométrie
Techniques d’identification et de quantification
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Dosage d’un Ac par compétition
-Sur un support on fixe un échantillon d’Ag limité
-Après quelques secondes, on lave le support pour éliminer les molécules d’Ag non fixées
-Ensuite, on ajoute l’échantillon de sérum à tester c.à.d. les AC (s’ils sont présents) ainsi qu’un
échantillon d’AC marqués spécifiques à l’Ag.
-On rince le support de façon à retirer les anticorps non liés et donc seuls les complexes AC-
Ag et AC*-Ag restent liés.
-Enfin, on applique le substrat qui émet un signal fluorescent s'il est converti par l'enzyme pour
mesurer l’activité enzymatique par un spectrophotomètre (Figure 6).
Techniques d’identification et de quantification
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Chapitre 5 la Luminescence :
La lumière peut être considérée comme une onde électromagnétique. Elle est caractérisée par
une longueur d’onde λ et une fréquence v ", toutes deux liées par la relation suivante:
λ= c/v ; avec c = vitesse de la lumière dans le vide (c ≈ 3.10⁸ m/s)
• D’autre part, la lumière peut être aussi considérée comme un ensemble de corpuscules appelés photons. Chaque photon possède une énergie E qui peut être exprimée par la relation
suivante: E = h.v ; avec h = constante de Planck (h ≈ 6,626.10⁻³⁴Js).
Selon la longueur d’onde de la lumière, nous pouvons la classer dans différents domaines répartis sur un spectre électromagnétique.
I. La luminescence :
La luminescence consiste en une émission d’un rayonnement suite à une excitation non thermique (contrairement à l’incandescence).
1) Sorte de luminescence :
- La luminescence se divise en plusieurs branches. Nous nous intéressons particulièrement à :
a. Photoluminescence: l’excitation est provoquée par l’absorption de photons. On distingue dans cette catégorie les phénomènes de phosphorescence et fluorescence.
La fluorescence se produit quelques nanosecondes après l’excitation lumineuse ; la
phosphorescence apparait plus tardivement et dure plus longtemps.
b. Chimiluminescence: une réaction chimique génère un produit qui se trouve dans un
état excité. Un cas particulier, bien connu, de la chimiluminescence est la
bioluminescence.
2)L’intéraction entre la lumière et la matière :
Les atomes et les molécules sont caractérisés par un ensemble de niveaux d’énergie qui leur sont propres. Le niveau le plus bas en énergie est appelé «niveau fondamental» et les niveaux
supérieurs correspondent aux «niveaux excités».
A température ordinaire, tous les atomes et les molécules se trouvent dans leur état
électronique fondamental.
Un photon de fréquence peut permettre le passage d’un niveau d’énergie E1 à un niveau
E₂ tel que E₂-E₁= h.v (ce passage peut également se faire par une excitation).
Cette interaction entre la lumière et la matière peut être décrite par deux phénomènes :
• L’absorption d’un rayonnement peut faire passer un atome ou une molécule
d’un niveau de plus basse énergie vers un niveau de plus haute énergie.
• L’émission d’un rayonnement se produit lorsqu’un atome ou une molécule descend vers un état de plus basse énergie.
Figure 1: principe de luminescence.
II) Chimiluminescence :
La luminescence est le phénomène par lequel certaines molécules portées à un état excité
retournent à l'état fondamental en restituant une partie de l'énergie sous forme d'émission de
lumière. Lorsque l'énergie qui permet aux molécules d'atteindre l'état excité provient d'une
réaction chimique, il s'agit du phénomène de chimiluminescence.
a) Principe générale :
La chimiluminescence s’observe suite à une réaction chimique qui produit une molécule se
trouvant dans un niveau d’énergie excité. Cette molécule émet alors un rayonnement pour retomber dans son niveau d’énergie fondamental.
A + B = C* et C* C + hv
b) Chimiluminescence du luminol
La réaction se déroule en milieu basique. En présence d’un catalyseur tel que le fer contenu
dans l’hexacyanoferrate(III) de potassium K₃[Fe(CN)₆], l’eau oxygénée (H₂O₂) oxyde le
luminol (3 -aminophtalhydrazide).
Le produit formé, le 3-aminophtalate, se trouve dans un niveau d’énergie excité. Sa désexcitation produit l’émission de la lumière bleutée observée.
Figure 1 : Réaction de luminol et production de lumière bleutée
c) Applications de la chimiluminescence
Criminologie :
Le luminol est utilisé sur les lieux des crimes pour détecter les traces de sang, même si elles sont
en faible quantité ou si le sang est séché. Une solution de luminol, sur des traces de sang, réagira
par oxydoréduction avec les ions fer des globules rouges du sang et produira de la lumière,
rendant les traces de sang phosphorescentes.
Dosage du monoxyde d’azote (NO) :
Lors d'études environnementales, la chimiluminescence permet de détecter la présence du
dioxyde d'azote, en effet, ce gaz réagit bien avec le luminol.
Cette application est très importante car ce gaz est très dangereux, lorsqu'il est inhalé, il
réagit avec l'eau de la muqueuse présente dans les poumons et produit de l'acide nitrique.
La détection de sources de production de ce gaz est donc très utile pour pouvoir éviter les
zones à risques.
III) Bioluminescence :
a. Principe général :
La bioluminescence est la production et l'émission de lumière par un organisme vivant. Le
mot "bioluminescence" vient de l'assemblage du terme grec bios signifiant vie et du terme
latin lumen, lumière.
Cette émission de lumière se fait par la réaction biochimique entre une protéine substrat,
la luciférine (lucifer signifiant porteur de lumière), et une enzyme, la luciférase, au cours de
laquelle l'énergie chimique est convertie en énergie lumineuse.
La luciférase, catalyse l’oxydation de la luciférine par l’oxygène moléculaire O₂. Cette
réaction nécessite la présence d’ATP (adénosine triphosphate) comme source d’énergie. Le
produit formé, l’oxyluciférine, se trouve dans un niveau d’énergie excité. Il se désexcite en émettant un rayonnement. La luciférine est ensuite régénérée par une suite de réactions.
Figure 2 : réaction enzymatique de la bioluminescence
Ce phénomène est présent chez beaucoup d’êtres vivants, notamment chez les bactéries, les
protozoaires et les champignons. De nombreux animaux sont également capables d’émettre
de la lumière : plus de 700 espèces ont déjà été signalées, mais beaucoup d’espèces
lumineuses vivant dans les grands fonds marins ne sont pas encore connues.
b. Application :
1) La biomasse : En biotechnologie, la bioluminescence a permis le
développement de l’ATPmétrie. En effet, la luciférase est également capable de
réagir avec l’adénosine triphosphate (ou ATP). Elle permet donc de quantifier la
biomasse (masse totale de toutes les espèces vivantes présentes en un milieu
naturel donné à un moment donné) dans un échantillon grâce à un appareil appelé
luminomètre qui mesure l'intensité lumineuse.
2) Application dans le domaine médical et pharmaceutique :
La bioluminescence est aussi utilisée dans le diagnostique médical où il est parfois
nécessaire de connaître rapidement le taux de contamination de liquide
physiologique. De même, le dosage de l'ATP, vu précédement, peut servir de
témoin d'une activité physiologique (L'ATP intracellulaire des spermatozoïdes est
le témoin direct de leur mobilité et de leur fertilité.) D'autres applications peuvent
être envisagées comme le dosage des taux sériques ou le dosage d'antibiotiques.
IV. La fluorimétrie :
La spectroscopie de fluorescence, la fluorimétrie ou encore la spectrofluorimétrie est
l’analyse de la fluorescence d'un échantillon sous excitation par un rayon UV ou visible.
C’est une méthode très sensible pour la mise en évidence et le dosage des composés fluorescents à l’état de traces: elle permet de détecter ces composés à des concentrations très
faibles.
Le fluorimètre : permet de mesurer l'intensité de la fluorescence d'une molécule.
Fig.7 Fluorimètre
Le spectrofluorimètre : Les spectrofluorimètres sont dotés de fonctions qui leur permettent
l’étude plus complète des composés fluorescents, notamment par l’enregistrement de leurs
spectres d’émission et d’excitation.
Fig.8 Spectrofluorimètre.
L’instrumentation d'un fluorimètre ou d’un spectrofluorimètre est classique et comporte 4
parties :
Source lumineuse : généralement une lampe à arc xénon
Monochromateur ou filtre
Compartiment à échantillon
Détecteur : photomultiplicateur ou photodiode
a. Source lumineuse
-Lampe à arc en xénon
La source excitatrice est le plus souvent constituée d’une lampe à arc au xénon, de grande
énergie (de 150 à 800 watts) et qui fournit un spectre continu.
Fig.9 Lampe à arc en xénon
-Lampe à arc au mercure
La source la plus courante pour un fluorimètres à filtre est une lampe à vapeur de mercure à
basse pression. Elle Produit un spectre de raies intense au-dessus de 350nm.
Fig.10 Lampe à arc au mercure
b. Filtres et monochromateurs
b.1. Les filtres :
Les filtres primaires absorbent la lumière visible et transmettent la lumière UV.
Les filtres secondaires absorbent les radiations UV et transmettent la lumière visible.
Les filtres ont été utilisés dans les fluorimètres.
b.2. Les monochromateurs
La plupart des spectrofluorimètres sont à simple faisceau et sont munis de deux
monochromateurs à réseaux, l’un pour excitation, l’autre pour émission. Les monochromateurs d'excitation isolent uniquement le rayonnement qui est absorbé par la
molécule.
Les monochromateurs d'émission isolent seulement le rayonnement émis par la molécule.
c. La cellule de mesure
Des cellules cylindriques ou rectangulaires fabriquées de verre ou de silice sont utilisés pour
les mesures de fluorescence. La Longueur du chemin est généralement de 10 mm ou 1cm.
Toutes les surfaces du support d'échantillons sont polies en fluorimétrie.
Fig.11 Cellule (cuve) de mesure
d. Le détecteur
Les signaux de luminescence sont de faible intensité ainsi, de grands gains des amplificateurs
sont nécessaires : des tubes photomultiplicateurs, détecteurs à barrette de diodes.
Le tube photomultiplicateur est généralement disposé orthogonalement par rapport au
faisceau incident afin :
- Que la lumière incidente n’atteigne pas le détecteur
- De limiter les lumières parasites de diffusion
Fig.12 Photomultiplicateur
1. La loi de l’intensité de la fluorescence
La fluorescence des solutions diluée est bien proportionnelle à la concentration de la solution.
On utilise généralement une expression simplifiée:
If = K. I0 .C
I0 : l’intensité incidente
If : l’intensité de fluorescence
C : concentration
K : constante
Cette relation est valable uniquement pour les solutions diluées.
2. Facteurs influençant la fluorescence
L’intensité de fluorescence dépend de nombreux paramètres :
Le pH
L’intensité de la fluorescence varie selon le pH. Plus le pH baisse, plus l’intensité de la fluorescence est moins forte.
La température
L’augmentation de la température diminue le rendement quantique et donc l’intensité de fluorescence.
la concentration
Dans la pratique, l’intensité de fluorescence croit de manière linéaire puis sature
et enfin diminue lorsque la concentration augmente.
Figure1 : relation entre l’intensité de fluorescence et la concentration
a. Le solvant (La lumière parasite) : Des émissions radiatives dues au solvant
peuvent gêner la lecture de la fluorescence si les longueurs d'onde
d'excitation et démission sont proches.
a1) La diffusion Rayleigh :
Le solvant réémet une partie de intensité incidente à la même longueur
D’onde de la lumière d’excitation.
a2) La diffusion Raman:
Il y a excitation des molécules du solvant (énergie de vibration). Le retour à
l’état fondamental s’effectue avec émission de photons à de plus grande longueur d’onde, elle est beaucoup plus faible que la diffusion Rayleigh.
Figure2 : les lumières parasitée la fluorescence
3. Application
La fluorimétrie est une technique d’analyse très utilisée dans différents domaines en particulier:
En industrie minérale.
En industrie pharmaceutique: pour le dosage des vitamines.
En médecine pour le contrôle et la prévention (Cancers).
En immuno-analyse pour le dosage des anticorps et antigènes couplée aux
techniques de marquage immunologique.
En agro-alimentaire pour le diagnostic nutritionnel des végétaux.
En industrie chimique pour le dosage des composés aromatiques.