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A P P L I Q U É E A U X P R O T É I N E S
Spectroscopie de Résonance Magnétique Nucléaire
Objectifs
• L’objectif est de vous donner les bases de la RMN• connaître les avantages de cette technique et ses limites• donner un aperçu de quelques applications de la RMN liquide
pour l’étude des protéines
la RMN ne se limite pas à la détermination de la structure des protéinescaractérisation des interactions protéine-protéine ou protéine-
ligand…criblage de composés à visée pharmacologiqueétude des protéines non structurées identification de modifications post-traductionnelles et étude de
leur impact structural et fonctionnel
2
De la structure à la fonction
3
Structure primaire Structures secondaires
Structure tertiaire
acides aminés
Fonction biologique
Structure quaternaire
interactions protéine-ligand/substrat
protéine-protéine …
Les bases de la spectroscopie RMN
• Spectroscopie : on va mesurer l’énergie qu’il faut fournir pour passer de l’état énergétique fondamental (Ea) à une état excité (Eβ)
• Nucléaire : c’est l’état énergétique des noyaux des atomes qui va être mesuré
• Magnétique : c’est sous l’effet d’un champ magnétique (champ B0, de l’ordre de 105 fois le champ magnétique terrestre) qu’on va pouvoir observer des transitions énergétiques entre les niveaux occupés par les noyaux
• Résonance : on dit que les noyaux entrent en résonance quand ils font la transition d’un niveau à un autre, c’est-à-dire quand l’énergie fournie au système (champ B1) est exactement égale à la différence d’énergie entre les niveaux
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Appareillage : spectromètre RMN
sonde
Il faut injecter 200A de courant dans la bobine pour créer un champ magnétique de 18,6 tesla.
Appareillage : les sondes
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Bases de spectroscopie
Les ondes électromagnétiques sont généralement caractérisées par les grandeurs suivantes :
longueur d'onde λ : unité de longueur (distance) qui sépare deux pics d'onde (exprimé généralement en nm)nombre d'onde σ : nombre d'onde par unité de longueur, (exprimé généralement en cm-1)fréquence ν : nombre d'onde par seconde (exprimé en Hz = s-1).
Ces grandeurs sont reliées par la relation suivante :
où c, la célérité est la vitesse de la lumière (3.108 m.s-1).
σ = = 1 νλ c
Spectrométrie UV-visible, IR
Longueur d’onde (nm)
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Différence d’énergie entre les états de spin nucléaire
distribution de Boltzmann Δn = e -ΔE/kT
B0=0
Seuls les noyaux possédant un spin nucléaire (nombre quantique I) différent de 0 peuvent entrer en résonance
ils ont la capacité de se comporter comme des petits aimants et d’adopter des orientations préférentielles dans un champ magnétique intense
ΔE = h . γ . B0
2 π
B0
Différence d’énergie entre les états de spin nucléaire
distribution de Boltzmann Δn = e -ΔE/kT
B0=0
B0
=> ces 2 états du spin nucléaire en présence du champ B0correspondent à 2 niveaux énergétiques différents
ΔE = h . γ . B0
2 π
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Spectre électromagnétique : la RMN se situe dans la gamme des radiofréquences
ici avec B0 = 9.4T soit 400 MHz
Rapport gyromagnétique γ : constante pour un noyau donné
Le champ magnétique ressenti Beff est différent de B0
Quels sont les noyaux que l’on peut étudier par RMN ?
Noyau Spin Net (I)
γ / 2π (MHz/T)
abondance naturelle
sensibilité relative en abondance naturelle
1H 1/2 42,58 99.98% 1 000 00019F 1/2 40,08 100% 833 05031P 1/2 17,25 100% 66 61013C 1/2 10,71 1.11% 17015N 1/2 -4,31 0.37% 4
pas de marquage isotopique
marquage isotopique nécessaire
Les noyaux qui ont un spin nucléaire non nul (I ≠ 0)
ΔE = h . γ . B0
2 πEnrichissement
isotopiques des protéines en 15N et/ou 13C
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Champ magnétique et fréquence de résonance
ν0 fréquences (Hz)
ΔE = h . γ . B0
2 π= h . ν0
Ce qui revient à dire que tous les noyaux d’une molécule (par exemple, tous les protons 1H) auraient la même fréquence de résonance ν0 qui correspond à la fréquence du champ du spectromètre (B0)
or ce n’est pas le cas…
Spectre proton (1H) d’une petite protéine
en théorie, on devrait avoir autant de signaux que de protons
1H
spectre 1D proton d’une protéine de 200 aa
@ 600 MHz
6000 Hz
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Spectrométrie RMN à transformée de Fourier (RMN impulsionnelle)
en RMN, on va mesurer la relaxation c’est-à-dire le retour à l’état d’équilibre après excitation, pendant la période dite d’acquisition (ACQ)
RMN impulsionnelle : on excite tous les noyaux simultanément en imposant une impulsion magnétique de forte intensité, de courte durée (p1) = impulsion non sélective
Spectrométrie RMN à transformée de Fourier (RMN impulsionnelle)
ν0
fréquences (Hz)FID (Free Induction Decay) :
décroissance du signal au cours du temps
(ms)FT
(transformée de Fourier)
Domaine temps Domaine fréquences
Cas d’un noyau unique ou d’un groupe de noyaux équivalents
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Spectrométrie RMN à transformée de Fourier (RMN impulsionnelle)
Domaine temps Domaine fréquences
δ
FT
La réalité de la RMN des protéines
spectre 1D proton d’une protéine (500 aa) structurée
spectre 1D proton d’une protéine (100 aa) structurée
La RMN est limitée aux protéines de 200-250 aa soit 20-25 kDaenviron (pour des études structurales)
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La réalité de la RMN des protéines
spectre 1D proton protéine structurée
spectre 1D proton protéine non structurée
200 aa200 aa
Possibilité d’étude des protéines intrinsèquement non structurées
20
La réalité de la RMN des protéines : le problème du solvant, l’eau
H2O
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21
La RMN des protéines : présaturation du signal de l’eau
‘irradiation’ du signal de l’eau
Les structures de protéines obtenues par RMN vs. cristallographie dans la PDB
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Interpréter un spectre RMN
la nature chimique du(es) noyau(x) étudiés à partir de leur fréquence de résonance ou déplacement chimique : présence d’hétéroatomes, de noyaux aromatiques, de double ou triple liaisons C-C, de groupements fonctionnels (alcool, thiol, acide, ester…)
aspect quantitatif : l’intégration des signaux du spectre RMN va donner le nombre de noyaux qui résonnent à une même fréquence
L’interaction avec les noyaux voisins (même les noyaux de nature différentes) : par l’intermédiaire des couplages scalaires à plus ou moins longue distance
Interpréter un spectre RMN, c’est en retirer 3 informations essentielles :
Interpréter un spectre RMN
la nature chimique du(es) noyau(x) étudiés à partir de leur fréquence de résonance ou déplacement chimique : présence d’hétéroatomes, de noyaux aromatiques, de double ou triple liaisons C-C, de groupements fonctionnels (alcool, thiol, acide, ester…)
Interpréter un spectre RMN, c’est en retirer 3 informations essentielles :
identification des groupements chimiques présents dans la molécule (les acides aminés dans le cas des protéines)
leur environnement dans l’espace
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Déplacement chimique δ (ppm)
la fréquence va dépendre du champ magnétique B0
on va plutôt utiliser une valeur indépendante de B0 : le déplacement chimique (δ) exprimé en ppm (parties par million)
il va falloir utiliser une référence : cette référence est utilisée pour comparer la fréquence de résonance de chaque proton de la molécule à celle de la molécule de référence (cette référence va donc avoir un déplacement chimique de 0 ppm)
donc, pour un proton donné, on aura une même valeur de déplacement chimique quelque soit la valeur du champ magnétique B0
utilisé
δ (ppm)= ν – νref
νref.106
1. La fréquence de résonance (en Hz) ou déplacement chimique (en ppm)
• l'environnement électronique modifie la valeur du champ magnétique local Beff expérimenté par le noyau
Beff = B0 (1 - σ) où σ est la constante d'écran (σ >0 ou <0)
et donc la fréquence de résonance ν du noyau sera
• le déplacement chimique dépend donc de l'environnement local de chaque noyau (groupements fonctionnels…)
ν = γBeff
2π
TMS
δ (ppm) δ0
écran faible
déblindageécran fort
blindage
14
27
Un exemple de l’influence des électrons sur le déplacement chimique : les courants de cycles
Origine de la dispersion spectrale dans les protéines
Protéine repliée Protéine non repliée
spectre 1H @ 600MHz, 298K d’une protéine de 200 résidus
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Pour les peptides et les protéines
O
NH
H
H
H
H
H
H
HH
H
NH2
α
βγ
δ
ε
lysine
HN
Spectre 1D proton des peptides et protéines
δ
HN amides, H aromatiques H aliphatiques
référence
H2O
O
NH
H
H
H
H
H
H
HH
H
NH2
α
βγ
δ
ε
HN
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Interpréter un spectre RMN
la nature chimique du(es) noyau(x) étudiés à partir de leur fréquence de résonance ou déplacement chimique : présence d’hétéroatomes, de noyaux aromatiques, de double ou triple liaisons C-C, de groupements fonctionnels (alcool, thiol, acide, ester…)
aspect quantitatif : l’intégration des signaux du spectre RMN va donner le nombre de noyaux qui résonnent à une même fréquence
Interpréter un spectre RMN, c’est en retirer 3 informations essentielles :
identification des groupements chimiques
Dosage (metabolomics) mais la RMN est une technique peu sensible!
2. Informations quantitatives
référence : triméthylsilane (TMS)
Exemple : spectre de l’éthanol CH3-CH2-OH
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Interpréter un spectre RMN
la nature chimique du(es) noyau(x) étudiés à partir de leur fréquence de résonance ou déplacement chimique : présence d’hétéroatomes, de noyaux aromatiques, de double ou triple liaisons C-C, de groupements fonctionnels (alcool, thiol, acide, ester…)
aspect quantitatif : l’intégration des signaux du spectre RMN va donner le nombre de noyaux qui résonnent à une même fréquence
L’interaction avec les noyaux voisins (même les noyaux de nature différentes) : par l’intermédiaire des couplages scalaires à plus ou moins longue distance
informations structurales à plus ou moins longue distance (à l’échelle d’une protéine)
Interpréter un spectre RMN, c’est en retirer 3 informations essentielles :
3. Couplages scalaires (J)
référence : triméthylsilane (TMS)
Exemple : spectre de l’éthanol CH3-CH2-OH
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3. Couplages scalaires (J)
On appelle système de spins un ensemble de spins couplés de façon scalaire.
• hétéronucléaires : le système de spins est constitué de noyaux de nature différente (par exemple 1H et 13C). Il s'agit de couplage 1J
• homonucléaires : le système de spins est constitué de noyaux de même nature (par exemple des protons) il s'agit de couplages nJ avec n > 1
Couplage Nombre de liaisons
Nom
2J 2 géminal3J 3 vicinal
4J… 4… longue distance
3. Couplages scalaires (J)
Exemple : 2 protons voisins Ha et Hbayant des déplacements chimiques
différents
19
3. Couplages scalaires (J)
Couplages hétéronucléaires dans les chaînes polypeptidiques
BILAN N°1
Paramètres utiles :
fréquence de résonance (Hz) ou déplacement chimique
(ppm) : renseigne sur l’environnement chimique
intégration des signaux : quantification
couplages scalaires : connections entre les atomes
Attribution des spectres = déterminer à quelle résonance correspond quel 1H (ou 13C ou 15N)
À quoi ça sert ?
20
BILAN N°1
H
H
H
De la RMN 1D à la RMN 2D
RMN 1D ↔ 1 seule fréquence
21
De la RMN 1D à la RMN 2D
41
RMN 2D : 2e dimension = 1H ou 15N ou 13C
enrichissement des protéines en 15N et/ou 13C : isotopes stables, non radioactifs!
par exemple : détection des couples 15N-1H dans les protéines (tous les NH du squelette + ceux présents dans les chaînes latérales)
deux 1H qui auraient la même fréquence de résonance proton peuvent avoir deux fréquences de résonances 15N différentes
% 1H 99,9885
% 2H 0,0115
% 3H 0
% 12C 98,93
% 13C 1,07
% 14C 0
% 14N 99,632
% 15N 0,368
ν 1H1H
15N
ν (1H)
ν1 (15N)
ν2 (15N)
RMN 2D ↔ 2 fréquences
De la RMN 1D à la RMN multi-dimensionnelle
22
1H-15N HSQC (2D) spectroscopie de corrélation hétéronucléaire
1H (ppm)
15N (ppm) nécessite un marquage isotopique des protéines en 15Nc’est l’expérience de base en RMN des protéines
Expérience de base pour l’étude des protéines par RMN : 1H-15N HSQC
44
1H (ppm)
15N (ppm)
The 1H-15N HSQC2D proton-nitrogen correlation spectrum
One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.
23
Attribution du spectre 1H-15N HSQC
45
1H (ppm)
15N (ppm)
The 1H-15N HSQC2D proton-nitrogen correlation spectrum
One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.
46
1H (ppm)
15N (ppm)
The 1H-15N HSQC2D proton-nitrogen correlation spectrum
One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.
Attribution du spectre 1H-15N HSQC
24
47
1H (ppm)
15N (ppm)
The 1H-15N HSQC2D proton-nitrogen correlation spectrum
One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.
Attribution du spectre 1H-15N HSQC
48
1H (ppm)
15N (ppm)
The 1H-15N HSQC2D proton-nitrogen correlation spectrum
One peak per Amino Acid (excepts prolines) originating from the amide function present in every amino acid.
Attribution du spectre 1H-15N HSQC
25
1H-13C-HMQC (2D) spectroscopie de corrélation hétéronucléaire
50
Spectroscopie de corrélation homonucléaire
via les couplages scalaires (COSY, TOCSY)
via les couplages dipolaires (NOESY, ROESY)
26
1H-1H NOESY (2D)
nécessite aucun marquage isotopique c’est l’expérience qui va fournir les contraintes de distances en utilisant l’effet NOE
1H
1H
1H-1H COSY et TOCSY
O
NH
H
H
H
H
H
H
HH
H
NH2
COSY : couplages homonucléaires 1H-1H 3J (3 liaisons chimiques)
TOCSY : couplages homonucléaires 1H-1H 3J+ 4J+ 5J + 6J (de 3 à 6 liaisons chimiques)
α
β γ
δε
nécessitent aucun marquage isotopique
Ce sont des expériences qui vont permettre
l’attribution des résonances protons
27
1H-1H COSY et TOCSY
O
NH
H
H
H
H
H
H
HH
H
NH2
COSY : couplages homonucléaires 1H-1H 3J (3 liaisons chimiques)
TOCSY : couplages homonucléaires 1H-1H 3J+ 4J+ 5J + 6J (de 3 à 6 liaisons chimiques)
α
β γ
δε
3J4J
5J6J
Couplages HN-Hα, HN-Hβ, HN-Hγ… Couplages entre
protons aliphatiques
1H
1H
1H-1H COSY et TOCSY
O
NH
H
H
H
H
H
H
HH
H
NH2
tables des valeurs δ HN, Ha, Hb, Hg, Hd, He,… :peptides non structurés GGXGG
moyennes de l’ensemble des protéines répertoriées dans la BioMagResBank (BRMB)
α
β γ
δε
Couplages HN-Hβ, HN-Hγ…TOCSY
COSY
Couplages HN-Hα
identification d’un type de résidu
1H
1H
3J
4J 5J
28
Déplacements chimiques 1H des acides aminés
O
NH
H
H
H
H
H
H
HH
H
NH2
α
βγ
δ
ε
lysine
HN
BILAN N°2
Paramètres utiles :corrélations scalaires (TOCSY/COSY) : renseignent sur la nature des
acides aminés (déplacements chimiques, couplages scalaire 1H-1H au sein d’un même acide aminé)
corrélations dipolaires (contacts NOEs) : renseignent sur la proximité des protons dans l’espace
pour les peptides non structurés : identifier les acides aminés en interprétant les connections entre acides aminés (voisins dans la
séquence)
Attribution des spectres à 2 dimensions = déterminer à quelle résonance correspond quel 1H (ou 13C ou 15N)
Identifier chaque résonance = l’attribuer à un proton, à un acide aminé dans la séquence primaire
29
HNCO (3D)
nécessite un marquage isotopique des protéines en 15N et 13CCette expérience va permettre de connecter le HN du résidu i avec le 13C carbonyl (CO) du résidu i-1
HN(CA)CO (3D)
nécessite un marquage isotopique des protéines en 15N et 13CCette expérience va permettre de connecter le HNdu résidu i avec le CO du résidu i et du résidu i-1
30
HN(CA)CO et HNCO (3D)
nécessite un marquage isotopique des protéines en 15N et 13CCette expérience va permettre de connecter le HNdu résidu i avec le CO du résidu i et du résidu i-1
HN(CO)CACB (3D)
nécessite un marquage isotopique des protéines en 15N et 13CCette expérience va permettre de connecter le HN du résidu i avec le Cα et le Cβ du résidu i-1
31
HNCACB (3D)
nécessite un marquage isotopique des protéines en 15N et 13CCette expérience va permettre de connecter le HN du résidu i avec le Cα et le Cβ du résidu i et du résidu i-1
Déplacements chimiques 13C des acides aminés
O
NH
H
H
H
H
H
H
HH
H
NH2
αβ
γδ
ε
lysine
HN
Cα Cβ CO Hn NA 52,5 19,1 177,8 8,35 125,0
C 55,4 41,1 174,6 8,54 118,7
D 54,2 41,1 176,3 8,56 119,1
E 56,6 29,9 176,6 8,40 120,2
F 57,7 39,6 175,8 8,31 120,7
G 45,1 174,9 8,41 107,5
H 55 29 174,1 8,56 118,1
I 61,1 38,8 176,4 8,17 120,4
K 56,2 33,1 176,4 8,36 121,6
L 55,1 42,4 177,6 8,28 122,4
M 55,4 32,9 176,3 8,42 120,3
N 53,1 38,9 175,2 8,51 119,0
P 63,3 32,1 177,3
Q 55,7 29,4 176 8,44 120,5
R 56 30,9 176,3 8,39 121,2
S 58,3 63,8 174,6 8,43 115,5
T 61,8 69,8 174,70 8,25 112,0
V 62,2 32,9 176,3 8,16 119,3
W 57,5 29,6 176,10 8,22 122,1
Y 57,9 38,8 175,9 8,26 120,9
32
Déplacements chimiques 13C des acides aminés
O
NH
H
H
H
H
H
H
HH
H
NH2
αβ
γδ
ε
lysine
HN
Cα Cβ CO Hn NA 52,5 19,1 177,8 8,35 125,0
C 55,4 41,1 174,6 8,54 118,7
D 54,2 41,1 176,3 8,56 119,1
E 56,6 29,9 176,6 8,40 120,2
F 57,7 39,6 175,8 8,31 120,7
G 45,1 174,9 8,41 107,5
H 55 29 174,1 8,56 118,1
I 61,1 38,8 176,4 8,17 120,4
K 56,2 33,1 176,4 8,36 121,6
L 55,1 42,4 177,6 8,28 122,4
M 55,4 32,9 176,3 8,42 120,3
N 53,1 38,9 175,2 8,51 119,0
P 63,3 32,1 177,3
Q 55,7 29,4 176 8,44 120,5
R 56 30,9 176,3 8,39 121,2
S 58,3 63,8 174,6 8,43 115,5
T 61,8 69,8 174,70 8,25 112,0
V 62,2 32,9 176,3 8,16 119,3
W 57,5 29,6 176,10 8,22 122,1
Y 57,9 38,8 175,9 8,26 120,9
Principe de l’attribution séquentielle d’une protéineavec les expériences 3D
64
1H13C
15N
plan HSQC
. . .. .. .. . ...
. ...
.. ..
. ...
15N
33
Principe de l’attribution séquentielle d’une protéineavec les expériences 3D
65
1H
15N
15N
i-1 iextraction d’un
plan 13C-1H
Principe de l’attribution séquentielle d’une protéineavec les expériences 3D
66
1H
15N
13C
extraction d’un plan 13C-1H
1H
13C
signaux intenses : Cα , Cβ du résidu i
signaux moins intenses : Cα , Cβ du résidu i-1
HNCACB
i-1 i
34
2009 Structures des protéines – MO2 671H
15N
13C
Cα (i)
Cα (i-1)
Cβ (i-1)
Cβ (i)
Principe de l’attribution séquentielle d’une protéine avec les expériences 3D
68
(Cα i, Cβ i) i = Gln (Q)
(Cα i-1, Cβ i-1) i-1 = Ser (S)
paire Ser-Gln (SQ)
séquence de la protéine : klppgwekrmsrssgrvyyfnhitnasq33werpsgns
1H
13C
Cα (i-1)
Cβ (i-1)
Q
S
Cα (i)
Cβ (i)
Q33
Principe de l’attribution séquentielle d’une protéine avec les expériences 3D
35
691H
15N
13C
Cα (i)
Cα (i-1)
Cβ (i-1)
Cβ (i)
Q33
Principe de l’attribution séquentielle d’une protéineavec les expériences 3D
Principe de l’attribution séquentielle d’une protéineavec les expériences 3D
70
(Cα i, Cβ i) i = Gln (Q)
(Cα i-1, Cβ i-1) i-1 = Ser (S)
paire Ser-Gln (SQ)
séquence de la protéine : klppgwekrmsrssgrvyyfnhitnasq33werpsgns
1H
13C
Cα (i-1)
Cβ (i-1)
Cα (i-1)
Cβ (i-1)
Cα (i)
Cβ (i)
Q
S
A
Cα (i)
Cβ (i)
Q33 S32
36
2009 Structures des protéines – MO2 71
Cα (i-1)
Cβ (i)
Cα (i)
Cβ (i-1)
S32
1H
15N
13C
Q33
Principe de l’attribution séquentielle d’une protéineavec les expériences 3D
72
Variations des déplacements chimiques importants dans les protéines structurées !
Structure de PIN1At
Cα chemical shift deviations from random coil values for residues of PIN1At, showing
regions predicted to be α helices and β strands
α helices
β strandsβ1 β2
α1 α2 α3 α4
β3 β4
α helices
β strands
37
Déplacements chimiques 13C des acides aminés
O
NH
H
H
H
H
H
H
HH
H
NH2
αβ
γδ
ε
lysine
HN
Cα Cβ CO Hn NA 52,5 19,1 177,8 8,35 125,0
C 55,4 41,1 174,6 8,54 118,7
D 54,2 41,1 176,3 8,56 119,1
E 56,6 29,9 176,6 8,40 120,2
F 57,7 39,6 175,8 8,31 120,7
G 45,1 174,9 8,41 107,5
H 55 29 174,1 8,56 118,1
I 61,1 38,8 176,4 8,17 120,4
K 56,2 33,1 176,4 8,36 121,6
L 55,1 42,4 177,6 8,28 122,4
M 55,4 32,9 176,3 8,42 120,3
N 53,1 38,9 175,2 8,51 119,0
P 63,3 32,1 177,3
Q 55,7 29,4 176 8,44 120,5
R 56 30,9 176,3 8,39 121,2
S 58,3 63,8 174,6 8,43 115,5
T 61,8 69,8 174,70 8,25 112,0
V 62,2 32,9 176,3 8,16 119,3
W 57,5 29,6 176,10 8,22 122,1
Y 57,9 38,8 175,9 8,26 120,9
74
Identification de structures secondaires avec l’index des déplacements chimiques (CSI)
CSI
CSI
n° résidu
différence des valeurs Cα, Cβ ou CO par rapport aux valeurs Cα, Cβ ou
CO ‘random coil’ respectivement
si ∆Cα <0, ∆Cβ >0, ∆CO <0 feuillet β
si ∆Cα >0, ∆Cβ <0, ∆CO >0 hélice α
38
BILAN N°3
Paramètres utiles :résonances 13C : renseignent sur le type d’acide aminéHNCACB, HNcaCO… : donnent les connections entre acides aminés
permet de les identifier dans la séquence primaire
Attribution des spectres à 3 dimensions = déterminer à quelle résonance correspond quel acide aminé dans le spectre 1H-15N HSQC
Identification de structures secondaires
Paramètres utiles :résonances 13C : les variations des résonances 13C (des Cα, Cβ, CO)
de chaque acide aminé dans la séquence par rapport aux valeurs standards ou ‘random coil’ permet d’identifier et localiser les éléments de structures secondaires
idem pour les résonances HN, Hα, 15N
APPLICATION N°1D É T E R M I N AT I O N D E L A S T R U C T U R E 3 D D E S P R OT É I N E S
39
Différences entre les données cristallographiques et les données RMN
Différences entre les données cristallographiques et les données RMN
diffractogramme
40
Différences entre les données cristallographiques et les données RMN
diffractogramme
Densité électronique
Différences entre les données cristallographiques et les données RMN
Spectres à deux ou trois dimensions = attribution, contraintes de distances…
41
Différences entre les données cristallographiques et les données RMN
Spectres à deux ou trois dimensions = attribution, contraintes de distances…
Quelles informations peut-on tirer de ceci?
42
15N-TOCSY-HSQC (3D)
15N-NOESY-HSQC (3D)
43
Comment peut-on relier ce spectre à la structure 3D d’une protéine?
1H
1H
Contraintes de distances 1H-1H ensemble de structures possibles
Contraintes de distance
distances 1H-1H de moins de 5 Å
44
De la séquence à la structure tridimensionnelle des protéines
1H
1H
conformation étendue
ensemble de structures 3D
NOESY
distances 1H-1H : donne un pic de corrélation pour 2 protons
distants de moins de 5 Å
88
Interprétation du NOESY
1H
1H > 10 000 couples 1H-1H avec d < 5 Å
10 000 contacts NOEs ?
environ 400-500 contacts NOEs « seulement » pour une protéine de 40 aa!
45
89
Interprétation du NOESY
ensemble de conformères possiblestous répondant aux contraintes
expérimentales
trop peu de contacts NOEs pour établir une
structure unique
environ 400-500 contacts NOEs « seulement » pour une protéine de 40 aa!
> 10 000 couples 1H-1H avec d < 5 Å
10 000 contacts NOEs ?
90
Constante de couplage 3J HN-Hα : détermination de l’angle φ
Equation de Karplus
3J HN-Hα < 6 Hz hélice α3J HN-Hα > 8 Hz feuillet β
6 Hz < 3J HN-Hα < 8 Hz random coil
θ = Φ – 60°
hélice α
feuillet β
hélice α
feuillet β
46
Degré de liberté de la chaîne polypeptidique
91
angles dihédraux :
• phi (φ) : angle de rotation autour de la liaison N-Cα
• psi (ψ) : angle de rotation autour de la liaison Cα-C’
• ω= 0° liaison peptidique cis; ω= 180° liaison peptidique trans
Liaisons peptidiques
CC’
N
O
C’N
O
α CαCα
φ ψω
R1
R2
R3 H
H
H
N C’
O
i i+1i-1
H
H
H
C’ (i)
N
C’ (i-1)
Cα (i)
C’ (i-1)
N
C’ (i)
Cα (i)φ
φ
Degré de liberté de la chaîne polypeptidique
92
Liaisons peptidiques
CC’
N
O
C’N
O
α CαCα
φ ψω
R1
R2
R3 H
H
H
N C’
O
i i+1i-1
H
H
H
φ
ψ
Diagramme de Ramachandran
+180
-180-180 +1800
0
angles dihédraux :
• phi (φ) : angle de rotation autour de la liaison N-Cα
• psi (ψ) : angle de rotation autour de la liaison Cα-C’
toutes les orientations ne sont pas possibles diagramme de Ramachandran : représentation des régions stériquement permises
feuillets β
hélices α
hélices α
47
93
Données structurales : échanges des protons
Données structurales : échanges des protons
94
48
95
Localisation/identification des structures secondaires
contacts NOEs
CSI (A= α helices; B= β strands)
Echange H/D (○échange lent, incomplet après 6h; ●échange très lent, incomplet après 12h)
conclusion
96
Autre méthode pour l’obtention de données structurales par RMN
Simulation des contacts NOEs à partir de la structure d’ADN en
rouge ensemble des structures représentées en noir
short-range
long-range
best fitsuperpositiondone for this end
Zhou et al. Biopolymers (1999-2000) 52, 168.
pas de contacts NOEs (d<5Å)
pas d’angle φ (3J= 3 liaisons covalentes
comment positionner ces 2 régions l’une par rapport à l’autre ?
49
97
RDCs : contraintes orientationnelles à longue distancesans RDCs
15N15N
1H
1H
deux liaisons NHproches l’une de l’autre
15N15N
1H
1H
deux liaisons NH éloignées l’une de l’autre (même
orientation)
avec RDCs
Contrairement aux contacts NOEs et aux angles dièdres qui donnent des informations sur des
noyaux relativement proches dans l’espace (d<5Å ou reliées par 3 liaisons covalentes,
respectivement), les RDCs donnent des informations sur des couples 1H-15N quelque soit la distance qui
les sépare
B0
98
Residual Dipolar Couplings (RDC) : contraintes orientationnelles
Pas d’orientation préférentielle des
protéines en solution (milieu
isotrope)Protéines dans un cristalOrientation totale couplages dipolaires très importants (les couplages dipolaires sont aussi grand que le spectre 1H entier)
B0 B0
Protéines en milieu liquide faiblement orientéacquisition d’une orientation macroscopique dans un champ magnétique
produit un faible couplage dipolaire informations structurales
B0
phages filamenteux, milieu biphasique (bicelles), cristallites
pas de contraintes orientationnelles : les interactions dipolaires sont moyennées à zéro du fait de l’agitation moléculaire pas de couplages dipolaires observables
50
99
Mesure des RDCs
-regular HSQC-decoupled in both dimensions-15N-1H splittings not observed
-HSQC without decoupling in 15N dimension-15N-1H splittings observed, equal to 15N-1H one-bond scalar coupling (1JHN ~92-95 Hz)
-HSQC without decoupling in 15N dimension-15N-1H splittings observed, equal to 15N-1H one-bond scalar coupling 1JHN + RDC (RDC< 0 or RDC >0)
isotropic solution partly oriented
APPLICATION N°2E T U D E D E S I N T E R A C T I O N S P R O T É I N E - P R O T É I N E O U P R O T É I N E -
L I G A N D
51
101
Cartographie des interactions : identification de régions fonctionnelles
Caractérisation d’interfaces protéine-protéine: constante de dissociation d’un complexe
102
A + B ABkon
koffB]A[
[A].[B]K D =
]AB[]A[]A[ 0 +=]AB[]B[]B[ 0 +=
Les concentrations des composants à l’équilibre sont décrites par :
où [A]0 et [B]0 sont les concentrations initiales de A et B.
où [A], [B] et [AB] sont les concentrations de A, B et du complexe AB à l’équilibre.
)]B[]A[4)K]B[]A([K]B[]A([21]AB[ 00
2D00D00 −++−++=
La concentration de complexe à l’équilibre s’exprime de la manière suivante à partir de l’expression du KD :
52
Caractérisation d’interfaces protéine-protéine: cinétique d’association et de dissociation
103
dt]AB[d]B][A[kv onnassociatio +==
dt]AB[d]AB[kv offondissociati −==
0]AB[k]B][A[kdt
]AB[doffon =−=
on
offD k
kB]A[
[A].[B]K ==
Les paramètres cinétiques d’association et de dissociation sont :
à l’équilibre :
A + B ABkon
koffB]A[
[A].[B]K D =
Calcul du KD par RMN
104
νlibre νlié
νlibre
νlibre νlié
νlié
νlibre νlié
1H
1H
1H
1H
1H
[liga
nd] ↑
cas d’un échange lent
complexe fort
le déplacement chimique d’un atome donné est un paramètre sensible à l’environnement chimique de celui-ci
si on considère une protéine (A) de concentration constante en présence d’un ligand (B) de concentration croissante : les signaux RMN de (A) vont varier en fonction de la quantité de (B) ajoutée, c’est-à-dire en fonction de la quantité de complexe (AB)
53
105
νlibre 1H
νlié 1H
[liga
nd] ↑
cas d’un échange rapide
complexe faible
1Hν
1Hν
νlibre νlié
νlibre νlié
le déplacement chimique d’un atome donné est un paramètre sensible à l’environnement chimique de celui-ci
si on considère une protéine (A) de concentration constante en présence d’un ligand (B) de concentration croissante : les signaux RMN de (A) vont varier en fonction de la quantité de (B) ajoutée, c’est-à-dire en fonction de la quantité de complexe (AB)
Calcul du KD par RMN
Calcul du KD par RMN
106
[liga
nd] ↑
Variation des signaux d’une protéine 15N enrichie en présence d’un ligand non marqué
2D : 15N-1H HSQC
[ligand] ↑
54
Calcul du KD par RMN
107
Variation des signaux d’une protéine 15N enrichie en présence d’un ligand non marqué
Δδ (15N)
δ0 (1H)δ (1H)
δ0 (15N)
δ (15N)
Δδ (1H)
∆δ = δ - δ0 = [∆δ (1H)]2 + 0.2 [∆δ (15N)]2
Calcul du KD par RMN
108
Variation des signaux d’une protéine 15N enrichie en présence d’un ligand non marqué détermination de la constante de dissociation (KD)
Δδ (15N)
Δδ (1H)
)][][4)][]([][]([2 00
20000
max BAKBAKBA DD −++−++Δ=Δ δδ
points expérimentauxcourbe théorique
KD = 150 μM
55
Aspect qualitatif : cartographie des surfaces d’interaction
15N
1H
état libre
état lié (saturation)
Criblage de ligands par RMN
on va observer les variations des signaux de la protéine marquée 15N en présence des ligands sur un spectre 1H-15N HSQC :
détermination du KD
détermination du site de liaison
1H
15N
56
APPLICATION N°3C R I B L A G E D E L I G A N D S
Criblage de ligands par RMN
112
Deux grandes stratégies :
• on a accès à une protéine enrichie en 15N
on va observer les variations des signaux de la protéine en présence des ligands sur un spectre 15N-1H HSQC
• on n’a pas accès à une protéine enrichie en 15N
on va observer les variations des signaux du ligand avec ou sans protéine
57
SAR by NMR : structure-activity relationship
113
nécessite de la protéine enrichie 15N car on va observer les signaux de la protéine en présence de ligands
1 2 3+ =
3
2
LiaisonEvolution
Optimisation
Criblage de “fragments”100 à 1000 moléculesComplexité faible
(lead-like)Réussite : 1 – 10 %Criblage d’affinité,
analyses physico-chimiques,techniques transposables àdifférentes cibles
114
SAR by NMR
Criblage “fragments”
Réussite : 1,7 %
Activité initiale faiblemais détectable
Simplicité des hitsoptimisation efficace
Infrastructure plus légère, ∼ 500 molécules testées
Criblage “haut-débit”
Réussite : 0,2 %
Activité initiale élevée(ou indétectable !)
Complexité des hitsoptimisation difficile
Infrastructure lourde, + 100 000 molécules testées
58
115
SAR by NMR
Criblage de ligands pour le site de liaison n°1 KD1
Optimisation des ligands du site de liaison n°1 KD1’
Criblage de ligands pour le site de liaison n°2 KD2
Optimisation des ligands du site de liaison n°2 KD2’
Liaison covalente des 2 ligands et optimisation du linker
KD = KD1’ x KD2’
116
SAR by NMR
59
117
SAR by NMR
SAR by NMR
118
60
119
Protéine cibleMolécules organiques libres
Complexe
+
Perturbations de déplacement chimique
Modification des propriétés de diffusion et de relaxation
Modification de la taille de l’édifice
Environnement électromagnétique modifié
Détection d’échanges par RMN
120
Criblage de ligands par RMN
Sans protéine 15N enrichie
• expériences de diffusion
• STD (Saturation Transfer Difference)
• transfert de NOE
Lorsque le ligand est lié à la protéine, il adopte le même comportement que la protéine
61
121
Méthodes ne nécessitant pas de protéine enrichie
Ligand libre Protéine Ligand liéLargeur de raie étroite large élargieRelaxation lente rapide augmentéetrNOE faible (+) fort (-) faible (-)Diffusion rapide lente ralentieSTD non saturé saturé saturé
122
Saturation transfer difference (STD)
différence B-A
on ne détecte que les molécules libres ( , ) tandis que les
molécules liées ( ) ne sont plus détectables car elles adoptent le
même comportement que la protéine
par soustraction du spectre où on a irradié la protéine par le spectre de contrôle (=sans irradiation de
la protéine), on récupère les signaux du ligand en interaction
avec la protéine
ne nécessite pas de protéine enrichie 15N car on va observer les signaux du (des) ligand(s) en présence de la protéine
62
123
Saturation transfer difference (STD)
ligand non ligand
124
Diffusion
décroissance plus rapide diffuse plus vite
63
125
Diffusion
spectre (A) – spectre (B) : différence dans le spectre des ligands uniquement s’il y a changement de diffusion
Mélange de composés sans protéine + gradient
Mélange de composés avec protéine + gradient
Composé de référence détecté comme ligand en (c)
Protéine seule (référence)