SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM:
NOUVELLES APPLICATIONS
DANS LE DIAGNOSTIC DES MALADIES LYSOSOMALES
Pettazzoni M, Froissart R, Pagan C, Cheillan D, Latour P, Vianey-Saban C
Monique PIRAUD Laboratoire des Maladies Héréditaires
du Métabolisme et Dépistage Néonatal Centre de Biologie Est
Hospices Civils de Lyon FRANCE
Réunion de printemps 18 juin 2016
•Mucopolysaccharidoses •Oligosaccharidoses •Maladie de surcharge en acide sialique libre •Sphingolipidoses •Autres: CLN, Wolman, Niemann-Pick type C, maladie de Pompe…
Autosomiques récessives sauf Fabry, MPS II. Pathologies précoces (anténatales, anasarques) … ou tardives Signes cliniques
•Retard psychomoteur
•Traits grossiers, déformations osseuses
•Troubles neurologiques, convulsions
•±Hépatomégalie, opacités cornéennes, surdité
Méthodes de screening (urine, liquide amniotique) •Mucopolysaccharides (ou glycosaminoglycanes): isolement, puis dosage et électrophorèse •Oligosaccharides: chromatographie couche mince •Acide sialique libre et total •PAS DE METHODE GLOBALE POUR LES SPHINGOLIPIDOSES
MALADIES DE SURCHARGE LYSOSOMALE
Chromatographie liquide
Analyseur triple quadripôle
Introduction de l’échantillon: mélange
de molécules complexe
Ionisation des molécules à doser
Analyseur: séparation des analytes ionisés (ion
parent) selon m/z
Cellule de collision: fragmentation ion parent ---> ion fragment
Détecteur (transformation en signal électrique) + traitement informatique des données
Analyseur: séparation des ions fragments selon m/z
ION PARENT
ION FRAGMENT
Tran
siti
on
ou
M
RM
SPECTROMETRIE DE MASSE EN TANDEM
Technique Très sensible
Très spécifique
APPLICATIONS METABOLIQUES -Acides aminés -Acylcarnitines, carnitine -Homocystéine -Ac méthylmalonique -Succinylacétone -Créatine, guanidino-acétate -… -Gb3 (U) -Sulfatides (U) -Glc4 (U) -… -Enzymologie (Krabbe) -(Screening sur taches de sang séché) -…
Standards internes (si
possible deutérés), disponibles commercialement
Mode positif (cations) Mode négatif (anions)
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20 25 30 35 40
Aci
de
Sia
liqu
e li
bre
(µ
mo
l/L)
Semaines d'Aménorrhée
Témoins ISSD Faux + En cours
Dosage de l’acide Sialique Libre
Confirmation du diagnostic par mesure du contenu en acide sialique libre (et total) dans les cellules cultivées (fibroblastes, cellules amniotiques) par MS/MS.
NANA: N-acetyl neuraminic
acid
Normal
AF
100 µl
ISSD
AF
100 µl
Control Urine
Ac Sialique
libre
Recherche de maladie de surcharge en acide sialique libre. Prélèvement : urine, liquide amniotique Technique MS/MS depuis 2011
LIQUIDES AMNIOTIQUES
Quantification MS/MS
Protéine N-glycosylée
• Catabolisme lysosomal par des hydrolases spécifiques
• Déficit enzymatique: oligosaccharidose
D’après Bonesso et al.
Oligosaccharidoses
ASPARTYLGLUCOSAMINURIA
Chromatographie Couche Mince des urines
Humbel, 1975
Excrétion massive d’oligosaccharides dans les urines
Confirmation par mise en évidence du déficit enzymatique
Oligosaccharidoses, diagnostic
• 1 oligosaccharidose: 1 profil de bandes caractéristique
• Technique manuelle et qualitative
• Interférences: lait maternel, amikacine, Ca glubionate, Dotarem® (IRM gadolinium)
• Faux négatifs: adultes, formes modérées
• expérience
Identification des ions parents
Et des ions fragments
caractéristiques des oligosaccharidoses.
7 pathologies étudiées: Fucosidose Aspartyglucosaminurie
α-Mannosidose Gangliosidose à GM1
Maladie de Sandhoff (GM2) Sialidose
Mucolipidose II
Transposition des résultats sur un analyseur de type triple quadripôle (API 4500, ABSciex) : recherche et optimisation des MRM (couples ion parent/ion fragment) caractéristiques des oligosaccharidoses par infusion d’urines.
Mode positif: [M+H]+ ou [M+Na]+ Mode négatif: [M-H]-
Louise MENEGAUT
Développement d’une chromatographie liquide sur colonne greffage NH2 (Uptisphere 5 µm, 120 Å, 50 mm x 2.1 mm, Interchrom©, Interchim)
Excellente spécificité Excellente sensibilité Quantification non validée faute d’IS pour chaque oligosaccharide Résultats rapportés à la créatinine, exprimés en MoM des urines témoins du jour
Alexandre MARTINS
Fucosidose (n = 6)
280 MoM
Fuc 1 OS
Fuc 2 OS
IS
2.2 e6
IS
Fuc 1 OS
4.9 e4 IS
ManA 3 OS
ManA 2 OS
ManA 1 OS
7.0 e3
IS
ManA 1 OS
ManA 2 OS
ManA 3 OS
4.5 e5
Control
Patient
a-Mannosidose (n = 10) 48 MoM
Mode pos.
GM1 Gangliosidose (n = 20) 1013 MoM,
Galactosialidose (n = 5) 108 MoM
GM1 1-OS
GM1 2-OS
IS
1.10 e5
IS
GM1 1-OS
1.15 e4
GM2 1-OS
IS
1.15 e4
GM2 2-OS
GM2 1-OS
GM2 3-OS
IS
1.3 e5
Maladie de Sandhoff
(n = 11) 120 MoM
Témoin
Patient
MRM spécifiques des oligosaccharidoses IS : Glc7
GlcNAsn
IS
AGU-OS 1
1.04 e7
GlcNAsn
AGU 1 and 2
IS
1.20 e7
IS
GlcNAsn 4.1 e5
AGU 1 and 2
Aspartylglucosaminurie (n = 7)
44 MoM 72 MoM
Mode pos. Mode neg.
Sialyl-OS
IS
2.0 e5
IS
Sialyl-OS
3.9 e5
Sialyl-OS
5.4 e4 IS
Sialyl-OS
1.28 e5
Mucolipidose type II (n = 9)
116 MoM
Témoin
Galactosialidose (n = 5)
1689 MoM
Mode neg.
MRM Sialyl-oligosaccharide
de masse 1200
MRM Aspartylglucosaminurie
IS
GlcNAsn
IS
5.8 e5
Témoin
Sialidose (n = 11)
1287 MoM
GalNAc-O-Ser
IS
1.10 e6
418
IS 1.8 e5
GalNAc-O-Ser
9.5 e4
IS
GalNAc-O-Thr
5.8 e4 IS
IS
307
345
5.00 e5
IS
Hex-HexNac
3.8 e4 IS
Hex-HexNac
1.8 e5 IS
307
IS
418 1.04 e6
Témoin
Mode neg. Mode neg.
Témoin
Mode pos. Mode pos.
b-Mannosidose Maladie de Schindler (n = 1) (n = 4)
MRM obtenus par infusion d’urine
16 MoM 28 MoM
20 MoM
113 MoM 169 MoM
Oligosaccharides Résultats en MoM : moyenne (range)
• Très grande sensibilité et spécificité • Remplace la CCM depuis 2016 • Interférence fragmentation dans la source • Interférence des mucopolysaccharidoses sur le MRM de la
sialidose (10 – 20 MoM) • Aucune des interférences observées en CCM • Une seule méthode oligosaccharides + acide sialique libre
Oligosaccharides anormaux dans le LA
Oligosaccharides et liquide amniotique
• Sialidose • Galactosialidose • GM1-gangliosidose
Normal
AF
25 µl Lactose
Sialidosis type 2
AF
25 µl 50 µl
MRM Oligo 1200 mode neg
LA Témoin
LA GalSial
Sphingolipidoses
From Schulze et al. Biochim Biophys Acta. 2014
Fabry
LDM
Gaucher
GM1 gangliosidosis
NPA/B
Krabbe
GM2 gangliosidosis
b-D-Galactosidase
Sandhoff: Hexo totale Tay-Sachs: Hexo A
Glucocérébrosidase
Sphingomyélinase acide
Galactocérébrosidase
Arylsulfatase A
a- Galactosidase A
Sphingolipidoses
S : serum. U : urine. From Schulze et al. Biochim Biophys Acta. 2014
Fabry
LDM
Gaucher
GM1 gangliosidosis
NPA/B
Krabbe
GM2 gangliosidosis
Sulfatides (U)
Chitotriosidase, (CCL18) (S)
Globotriaosylceramide (Gb3) (U)
Sphingolipides / LysoSphingolipides
Glucosylceramide
2
LysoGlucosylceramide / Glucosylsphingosine
• Sphingolipides : élévation très modérée dans le plasma • Lysosphingolipides (LysoSL) = forme déacylée des sphingolipides, marqueurs émergents pour le diagnostic et le suivi des sphingolipidoses
Ceramide
- Fatty acid acyl chain
Fabry
LDM
Gaucher
GM1 gangliosidosis
GM2 gangliosidosis
NPA/B
Krabbe
LysoGM1 ganglioside
(LysoGM1)
LysoGM2 ganglioside
(LysoGM2) Plasma sur EDTA
LC-MS/MS en une seule analyse
LysoGb3
Aerts JM, et al. Proc Natl Acad Sci USA, 2008
Lysogalactosyl-céramide (LysoGalCer) Chuang WL et al. Clin Chim Acta 2013 Lysosphingomyéline(LysoSM)
Chuang WL, et al . Mol Genet Metab 2014
Lysoglucosyl- céramide (LysoGlcCer)
Rolfs A, et al. PLoS One 2013
Lysosulfatide (LysoSulf)
Mirzaian,et al. Blood cell Mol Dis 2015
From Schulze et al. Biochim Biophys Acta. 2014
LysoSphingolipides dans le plasma
M Pettazzoni
Méthode
Extraction 200 µL of EDTA plasma
Adapted from Boutin et al. Clin. Chim. Acta 2012
Protein precipitation + mix Internal Standard (IS) + phosphoric acid
Centrifugation 8 min 14 000g Supernatant Purification by SPE cartridge OASIS® Elution
Methanol / formic acid Methanol / ammoniac
Evaporation + 1 mL migration phase
Injection 50 µL
Phase A : formic acid 0.2% (v/v) Phase B : formic acid 0.2% (v/v) in acetonitrile Analysis time: 13 minutes
Liquid Chromatography C8 Column (Uptisphère. Interchim©) + precolumn
Analyte STANDARDS** Internal Standard ** MODE TRANSITION
Lyso Gb3 Lyso Gb3 Glycinated lyso-Gb3 Positive 786.5 > 282.3
Lyso HexCer Lyso GlcCer Lyso GlcCer d5 Positive 462.3 > 282.3
Lyso SM Lyso SM d18:1 Lyso SM d17 :1 Positive 465.3 > 184
Lyso GM1 Lyso GM1 S1P d17 :1 Negative 1278.6 > 290.1
Lyso GM2 / S1P d17 :1 Negative 1116.6 > 290.1*
Lyso Sulf Lyso Sulf S1P d17 :1 Negative 540.3 > 96.9
MS/MS API 4500 Q-Trap (AbSciex©) – Multiple Reaction Monitoring Mode (MRM)
* No standard; calculated from mass/structure ** Commercialy available
Elution gradient
Time (min)
Aceto
nitrile
(%
)
Chromatogrammes
Positive mode
Validation quantitative (sauf LysoGM1 et Lyso GM2)
Negative mode
LysoGM1 1278.6>290.1
S1P d17 (IS) 364.2>78.9
LysoSulf 540.3>96.9
LysoSM d17 (IS) 451.3>184
LysoGb3 Gly (IS) 843.5>339.3
LysoGb3 786.5>282.3
LysoSM 465.3>184
LysoGalCer 462.3>282.3
LysoGlcCer 462.3>282.3
LysoGlcCer d5
(IS) 467.3>2853
Lysoglucosylcéramide et lysogalactosylcéramide non séparés sur la chromatographie: mesurés ensemble en tant que lysohexosylcéramide
LysoGM1 Method Validation pool - pool + Intraseries Biais (n = 10) / 7.8 % Interseries Biais (n = 12) / 47.3 %
LysoGM1 et LysoGM2 IS : S1P d17 N : non détecté
Standard
Témoin
GM1 gangliosidosis
LysoGM1 1278.6>290.1
IS
LysoGM2 1116.6>290.1
Témoin
GM2 gangliosidosis
IS
n = 6/8
Sandhoff 10/12 Tay-Sachs 3/5
Conclusion Bonne spécificité Sensibilité insuffisante
Lysohexosylcéramide: Gaucher et Krabbe
** p<0,001 * p<0,005
GAUCHER KRABBE Controls
NOMBRE n = 8 n = 7 n = 228
LysoHexCer
(nmol/L)
Mediane 224.0 14.4 < 1.9 (95e perc.)
Range 45.7-236.5 9.3-21.6 0.1-3.5
Conclusion Gaucher : forte élévation Krabbe infantile : élévation Krabbe adulte : ? Probablement normal Déficit en saposine C : 1 cas traité (68,9 nmol/L ) Diagnotic et suivi des maladies de Gaucher Diagnostic de la maladie de Krabbe infantile
LA Gaucher LA Témoins
n = 5 n = 37
Lysohexosylcéramide (nmol/L)
Médiane 524 < 0.5
Range 70 - 1520
LHexCer 462.3>282.3
LA Témoin
LA Gaucher
LGlcCer (IS) 467.3>287.3
Lysohexosylcéramide dans le liquide amniotique: maladie de Gaucher
Conclusion Screening de la maladie de Gaucher dans le LA (anasarques) Résultat plus rapide que la mesure d’activité glucocérébrosidase sur CAC
Maladie de Fabry Liée à l’X FORME CLASSIQUE Hommes hémizygotes : - déficit en alpha Gal A - Gb3 urinaire très élevé - clinique sévère Femmes hétérozygotes : - début différé - alpha Gal A normale (1/3 des cas) ou diminuée - Gb3 urinaire normal (1 cas sur 10) ou légèrement élevé
0
100
200
300
400
500
600
700
800
900
0 5 10 15 20 25
alpha Gal A (µkat/kg)
Gb
3 (
nm
ol/m
mo
l c
rea
tin
ine
)
Controls (males n = 4)
Controls (females (n= 25)
Fabry classic form
Fabry variants
FORME VARIANT Mutations « variant » du gène GLA: ex p.N215S Hommes hémizygotes : - forme tardive (late-onset) - Gb3 urinaire normal, - activité résiduelle parfois Femmes hétérozygotes :
SCREENING Hommes : - activité alpha Gal A Femmes : - activité alpha Gal A - Gb3 urinaire
LysoGlobotriaosylcéramide : Fabry
** p<0,001 * p<0,005
F Classique
Homme
Variant
Homme
F Classique
Femme
Variant
femme Témoins
NOMBRE n = 7 n = 6 n = 26 N = 3 n = 228
LysoGb3
(nmol/L)
Median 70.7 4.8 5.6 1.7 < 0.5 (95e perc.)
Range 47.8-100.8 1.8-9.4 1.1-31.2 0.6-2.8 0-1.1 Conclusion Meilleur marqueur que le Gb3 urinaire SCREENING Hommes : activité alpha Gal A Femmes : activité alpha Gal A + LysoGb3 plasma SUIVI PATIENTS Gb3 urine + LysoGb3 plasma
Lysoglobotriaosylcéramide urinaire
et isoformes
Il existe des isoformes du LysoGb3 dans l’urine/le plasma. Ce sont des composés dérivant du LysoGb3 sur la partie sphingosine, avec des différences de masse de -2, -12, -28, +14, +16, +18, +34 et +50 Da.
Structure non élucidée.
Control
NPB
IS
LysoSM
NPC
** LLOQ
Niemann-Pick type A/B Déficit en sphingomyélinase (méthode radioisotopique, B 1200)
Niemann-Pick type C Accumulation de cholestérol non estérifié intracellulaire, mis en évidence par le test à la filipine sur fibroblastes cultivés (B 1000 + B 1250 culture de cellules)
Maladies de Niemann-Pick
Lyso-SM « 509 » = LSM + 44 Giese AK. et al. (2015) Orphanet Journal of rare diseases 10-78. A novel, highly sensitive and specific biomarker for Niemann-Pick type C1 disease,
(Chitotriosidase serum)
Lysosphingomyéline
** p<0,001 * p<0,005
NPA/B NPC Controls
NOMBRE n = 13 n = 8 n = 228
LysoSM
(nmol/L)
Median 19.9 0.90 < 1.1 (95e perc.)
Range 7.9-69.6 0.3-2.1 0.1-2.0
Résultats : LysoSM509 exprimée en MoM
** p<0,001 * p<0,005
NPA/B NPC Controls
NOMBRE n = 13 n = 8 n = 228
LysoSM509 (MoM) Median 221.6 172.1 < 4.3 (95e perc.)
Range 126.8-363.7 101.5-348.6 0-9.1
Isoformes des lysosphingolipides
Lyso-HexCer Mirzaian M. et al. (2015) Blood Cells Molecules and Diseases (54) 307-314. Mass spectrometric quantification of glucosylsphingosine in plasma and urine of type 1 Gaucher patients using an isotope standard,
Il existe des isoformes des LSL dans l’urine/le plasma. Ces isoformes sont des composés dérivant du LSL correspondant, sur la partie
sphingosine, avec des differences de masse de -2, -12, -28, +14, +16, +18, +34 et +50 Da. Structure non élucidée.
Lyso-Gb3 Lavoie P. et al. (2013) Anal. Chem. (85) 1743-1752. Multiplex analysis of novel urinary Lyso-Gb3 related biomarkers for fabry disease by tandem mas spectrometry.
Lyso-SM « 509 » = LSM + 44 Giese AK. et al. (2015) Orphanet Journal of rare diseases 10-78. A novel, highly sensitive and specific biomarker for Niemann-Pick type C1 disease,
Isoformes de la LysoSM IS : LysoSM d17:1
Etude systématique des isoformes Nombreux pics. Interférence des lysophosphatidylcholines (même fragment 184), hydrolysées par KOH
méthanol.
X = hydrolysed by KOH methanol (not Lyso-SMs)
+18 +18+14 +18+28 +18+42 +18+56
IS (red)
-28 -12 -2
IS IS
+14 +16 +34 +50
IS IS IS IS Control
NPA/B
NPC
X X
X
X
X
X
= Isoform of
interest
IS IS IS IS IS Control
NPA/B
NPC
X X
X X X
X
X
X
X
X
X X
X X
X
L’ensemble constitue un profil différent pour NPA/B et NPC.
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
LSM
LSM
50
9
(-2
) R
T 2
,92
(+1
4)
RT
4,3
5
(+1
6)
RT
4,0
5
(+3
4)
RT
2,9
2
(+5
0)
RT
1,5
4
(+1
8)
RT
3,0
7
(+1
8)
RT
3,6
3
(+1
8)
RT
4,0
3
(+1
8+2
8)
RT
0,8
3
(+1
8+2
8)
RT
5,5
7
(+
18
+4
2)
RT
1,4
2
(+1
8+4
2)
RT
5,2
5
(+1
8+5
6)
RT
1,3
6
(+1
8+5
6)
RT
1,8
(+1
8+5
6)
RT
5,3
9
(+1
8+5
6)
RT
8,1
Mo
M
Controls (n=305)
NPC children(n=21)
NPC adults (n=22)
NPA/B (n=13)
LSM isoforms patterns in NPC and NPAB patients
Expressed in MoM
0
50
100
150
200
250
300
350
400
LSM
LSM
50
9
-2
RT
2,9
2
(+1
4)
Rt
4,3
5
(+1
6)
RT
4,0
5
(+3
4)
RT
2,9
2
(+5
0)
RT
1,5
4
18
RT
3,0
7
18
RT
3,6
3
18
RT
4,0
3
Mo
M
Controls
NPC children
NPC adults
NPA/B
Un profil NPA/B Un profil NPC Expérience en cours… Il est parfois difficile de se prononcer!...
Cholestane-3ß,5a,6ß-Triol
7-Céto-cholesterol
Dosage des oxystérols – Produits d’auto-oxydation du
cholestérol,
– Screening du NPC
–Porter (2010)
–Jiang (Porter + Ory, 2011)
–Cholestane-3ß,5a,6ß-triol plus discriminant que le 7-Cétocholesterol
Cholestane-3β-5α-6β-Triol (résultats C. Pagan)
CTRL, controls; CTX, Cerebro-Tendinous-Xanthomatosis; HETZ, Heterozygotes; NP-B, Niemann-Pick disease Type B; NP-C, Niemann-Pick disease Type C; WOL, Wolman disease
0
50
100
150
200
250
300
0 200 400 600 800
LSM
50
9 (
Mo
M)
Triol (nmol/L)
NPC (pediatric)
NPC (adult)
NPB
LALD
CTX
LSM 509 cut-off
Triol cut-off
LSM 509 versus triol (C. Pagan)
(Chitotriosidase)
Excellents tests d’orientation
Triol plus spécifique que 7-céto-cholestérol
Formes adultes: marqueurs moins élevés, mais LSM-509 semble
plus sensible que oxystérols
n = C-Triol
(nmol/l)
LysoSM
(nmol/l)
LysoSM-509
(MoM)
NPA/B 12 114 (68 - 181) 16 (6,5 – 41,7) 167 (98 - 280)
NPC enfants 20 191 (94 - 546) 0,6 (0,23 - 1,68) 120 (36 - 224)
NPC adultes 16 86 (12 - 244) 1,3 (0,28 – 3,51) 63 (7 – 148)
Wolman / CESD 1 / 1 574 / 73 0,1 / 0,2 9 / 8
XCT 3 60 - 205 0,27 – 0,49 1 - 4
Contrôles < 20 < 1,1 1 - 3
Biomarqueurs plasmatiques NPA/B et NPC
Conclusion
PLASMA Lysosphingolipides •Au laboratoire: une seule méthode pour mesurer simultanément tous les LSL dans le plasma.
•Nouveaux marqueurs pour Fabry , Gaucher , déficit Saposine C, Krabbe infantile, NPA/B, NPC. •Diagnostic et suivi. •Si résultat normal, la plupart de ces maladies sont exclues.
URINES Une seule méthode Oligosaccharides Excellente sensibilité / spécificité Formes adultes, atténuées Acide sialique libre
EN PRATIQUE
Tube EDTA (5 ml adultes, 1 ml enfants); si envoi: centrifuger, congeler le plasma à -20°C Réalisation : mensuelle [email protected] [email protected] [email protected]
LIQUIDE AMNIOTIQUE (surnageant)
anasarques Meilleure sensibilité/spécificité - ISSD - oligosaccharidoses - + maladie de Gaucher
Diagnostic des sphingolipidoses
Fabry Hommes: - a-Galactosidase A (Guthrie, leucos): B 100 Femmes: - a-Galactosidase A (Guthrie, leucos): B 100 - Lyso-Gb3 Plasma (B 120)
Krabbe Enfants - b-Galactocérébrosidase (B 500), 10 ml EDTA
ou - Lyso-hexosylcéramide (B 120) Adultes - b-Galactocérébrosidase (B 500), 10 ml EDTA
Niemann-Pick type A/B Déficit en sphingomyélinase (méthode radioisotopique, B 1200)
ou Lysosphingomyéline +509+isof (B 500) Oxystérols (B 120)
Niemann-Pick type C Accumulation de cholestérol non estérifié intracellulaire, mis en évidence par le test à la filipine sur fibroblastes cultivés (B 1000 + B 1250 culture de cellules)
ou Lysosphingomyéline +509+isof (B 500) Oxystérols (B 120)
Gaucher - b-Glucocérébrosidase taches de sang (B 100) - b-Glucocérébrosidase lymphos (B 500), 10 ml EDTA
ou - Lyso-hexosylcéramide (B 120)
Chitotriosidase serum (B 100)
Remerciements
Service des Maladies Héréditaires du Métabolisme Centre de Biologie et de Pathologie Est
Magali PETTAZZONI
Roseline Froissart
Cécile Pagan David Cheillan
Christine Vianey-Saban Séverine Ruet
Philippe Latour Marie T Vanier