-
OPTIMASI METODE KROMATOGRAFI CAIR KINERJA TINGGI FASE
TERBALIK PADA PEMISAHAN KLORAMFENIKOL DAN LIDOKAIN
HIDROKLORIDA DALAM SEDIAAN TETES TELINGA COLME®
SKRIPSI
Diajukan untuk Memenuhi Salah Satu Syarat
Memperoleh Gelar Sarjana Farmasi (S.Farm)
Program Studi Ilmu Farmasi
Oleh:
Winarti H. Wibowo
NIM: 088114039
FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS SANATA DHARMA
2011
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
ii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
iii
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
iv
HALAMAN PERSEMBAHAN
“Kesuksesan itu jangan dilihat dari hasil yang dicapai tetapi lihatlah
dari proses hingga mendapatkan hasil yang dicapai tersebut”
“Looking your dream, it’s like looking place far away. The
important thing is don’t ever think about giving up, STAND
UP again towards the dream you’ll meet someday”
“Orang yang pesimistik selalu menemukan kesulitan dalam
setiap kesempatan. Orang yang optimistik justru menemukan
peluang disetiap kesempatan” –Lawrence P.J.-
“Hidup itu keras, mampukan dirimu untuk bertahan di
setiap rintangan dan cobaan. Jadikan semua itu
pengalaman yang berarti dalam hidupmu”
Karyaku ini kupersembahbahkan kepada:
Keluargaku tercinta
Sahabat-sahabat setiaku
Teman-teman seperjuangan
Almamaterku
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
v
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
vi
PRAKATA
Puji dan syukur penulis panjatkan kepada Tuhan Yang Maha Esa atas
berkat dan anugrah yang diberikan sehingga penelitian dan penyusunan skripsi
yang berjudul “Optimasi Metode Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Fase Terbalik
pada Pemisahan Kloramfenikol dan Lidokain Hidroklorida dalam Sediaan Tetes
Telinga Colme®” dapat diselesaikan dengan baik. Skripsi ini disusun sebagai
salah satu syarat untuk meraih gelar Sarjana Farmasi (S.Farm) di Fakultas
Farmasi, Universitas Sanata Dharma, Yogyakarta.
Dalam pelaksanaan penelitian hingga selesainya penyusunan skripsi ini,
penulis mendapat banyak dukungan dan bantuan dari berbagai pihak. Oleh karena
itu, penulis mengucapkan terima kasih kepada:
1. Bapak Ipang Djunarko, M.Sc., Apt. selaku Dekan Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma Yogyakarta.
2. Ibu Christine Patramurti, M.Si., Apt. selaku Dosen Pembimbing yang telah
membimbing dan memberikan pengarahan, masukan dan saran selama
berjalannya penelitian hingga berakhirnya penyusunan skripsi.
3. Bapak Jeffry Julianus, M.Si. dan Ibu Dra. MM. Yetty Tjandrawati, M.Si.
selaku Dosen Penguji yang telah memberikan saran dan kritik yang
membangun dalam penyusunan skripsi.
4. Prof. Dr. Sudibyo Martono, M.S., Apt. dan Ibu Prof. Dr. Sri Noegrohati,
Apt. selaku Dosen Pengajar yang telah bersedia menyediakan waktu untuk
diskusi pribadi terkait penelitian ini.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
vii
5. Seluruh Dosen Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma yang telah
memberikan ilmu yang bermanfaat demi kemajuan mahasiswa dan
mahasiswi dalam berkarya dalam bidang farmasi.
6. PT. Interbat yang telah bersedia memberikan senyawa standar yang
berguna bagi penelitian.
7. Seluruh staf kemananan, staf laboratorium kimia Fakultas Farmasi
Universitas Sanata Dharma terutama Mas Bimo, Pak Parlan, Mas Kunto,
Mas Otok, dan Pak Timbul yang telah banyak membantu selama
penelitian di laboratorium dan menyediakan sarana untuk terselesaikannya
seluruh kegiatan akademik dengan lancar.
8. Martha Herati sebagai sahabat terdekatku yang selalu menyemangatiku
untuk belajar dan mengenal arti kehidupan.
9. Pakde, bude, mas sunu, mas damar, mas daru, mba vero yang menjadi
keluargaku selama berada di Yogyakarta dan telah memberikan semangat,
doa dan dukungan dalam penyusunan skripsi ini.
10. Efrida Lusia Sari Tambunan dan Theresia Wijayanti sebagai teman
seperjuangan skripsi dan tempat saling berbagi suka dan duka. Terima
kasih atas semangat, doa, kegigihan dan kebersamaannya selama ini.
11. Felicia, Prasilya dan Sasa sebagai teman seperjuangan skripsi satu tema
yang selalu membantu dan memberikan semangat.
12. Novi, Citra, Helena, Ayesa, Amel, Dina, Susi, Nona, Susan sebagai teman
seperjuangan di laboratorium.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
viii
13. Teman kelompok bermainku: Dea, Siska, Yessi, Lia, Lala yang selalu
menyemangatiku dan memberikan saran, doa dan tempat saling berbagi
suka dan duka.
14. Semua teman-teman FST A yang telah menjadi teman terbaik selama
berada di Fakultas Farmasi Universitas Sanata Dharma.
15. Seluruh teman-teman Farmasi angkatan 2008, terima kasih atas
pengalaman dan kebersamaan selama ini.
16. Semua pihak yang tidak dapat disebutkan satu per satu yang telah
membantu penulis dalam mewujudkan skripsi ini. Terima kasih atas
dukungannya.
Penulis menyadari bahwa masih di dalam skripsi ini masih banyak
kekurangan. Oleh karena itu, segala kritik dan saran yang membangun sangat
penulis harapkan. Semoga skripsi ini membantu dan bermanfaat bagi pembaca
dan dapat berguna bagi perkembangan ilmu pengetahuan.
Penulis
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
ix
DAFTAR ISI
Halaman
HALAMAN JUDUL ................................................................................ i
HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING ......................................... ii
HALAMAN PENGESAHAN ................................................................... iii
HALAMAN PERSEMBAHAN ................................................................ iv
PERNYATAAN KEASLIAN KARYA .................................................... v
LEMBAR PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ................................. vi
PRAKATA ............................................................................................... vii
DAFTAR ISI ............................................................................................ xi
DAFTAR TABEL .................................................................................... xv
DAFTAR GAMBAR ............................................................................... xvi
DAFTAR LAMPIRAN ............................................................................. xix
INTISARI ................................................................................................. xxi
ABSTRACT ............................................................................................... xxii
BAB I. PENGANTAR .............................................................................. 1
A. Latar Belakang .................................................................................... 1
1. Permasalahan .................................................................................. 3
2. Keaslian penelitian.......................................................................... 3
3. Manfaat penelitian .......................................................................... 4
B. Tujuan Penelitian.................................................................................. 4
BAB II. PENELAAHAN PUSTAKA ....................................................... 5
A. Kloramfenikol ...................................................................................... 5
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
x
B. Lidokain Hidroklorida .......................................................................... 6
C. Obat Tetes Telinga ............................................................................... 6
D. Spektrofotometer UV ........................................................................... 7
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi ......................................................... 9
1. Pengenalan dan instrumentasi KCKT ................................................ 9
2. Kromatografi partisi fase terbalik ..................................................... 12
3. Pemisahan puncak dalam kromatografi ............................................ 13
F. Landasan Teori ..................................................................................... 20
G. Hipotesis .............................................................................................. 21
BAB III. METODE PENELITIAN ........................................................... 22
A. Jenis dan Rancangan Penelitian ............................................................ 22
B. Variabel Penelitian ............................................................................... 22
1. Variabel bebas .................................................................................. 22
2. Variabel tergantung ......................................................................... 22
3. Variabel pengacau terkendali ........................................................... 22
C. Definisi Operasional ............................................................................. 23
D. Bahan-bahan Penelitian ........................................................................ 23
E. Alat-alat Penelitian ............................................................................... 23
F. Tata Cara Penelitian .............................................................................. 24
1. Pembuatan fase gerak ....................................................................... 24
2. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
yang digunakan untuk untuk penentuan panjang gelombang
pengamatan ...................................................................................... 24
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xi
3. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
yang digunakan untuk optimasi dengan metode KCKT .................... 25
4. Pembuatan campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida......... 26
5. Penentuan panjang gelombang pengamatan kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida dengan spektrofotometer UV-Vis.................... 26
6. Preparasi sampel ............................................................................. 26
7. Optimasi pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
dengan metode KCKT fase terbalik .................................................. 27
G. Analisis Hasil ....................................................................................... 29
1. Bentuk peak pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida ..... 29
2. Waktu retensi (tR) ............................................................................. 30
3. Nilai resolusi .................................................................................... 30
4. Nilai HETP ...................................................................................... 31
5. Reprodusibilitas ............................................................................... 31
BAB IV. HASIL DAN PEMBAHASAN ................................................. 32
A. Pemilihan Pelarut ................................................................................. 32
B. Pembuatan Fase Gerak ......................................................................... 32
C. Pembuatan Larutan Baku ...................................................................... 34
D. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Kloramfenikol dan
Lidokain Hidroklorida dengan Spektrofotometer UV-Vis .................... 36
E. Optimasi Kloramfenikol dan Lidokain Hidroklorida dengan Metode
KCKT Fase Terbalik ............................................................................ 40
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xii
1. Fase gerak metanol:aquabides 75:25 dengan flow rate 0,8; 1,0;
dan1,2 mL/menit .............................................................................. 46
2. Fase gerak metanol:aquabides 85:15 dengan flow rate 0,8; 1,0; dan
1,2 mL/menit .................................................................................... 50
3. Fase gerak metanol:aquabides 95:5 dengan flow rate 0,8; 1,0; dan
1,2 mL/menit .................................................................................... 54
BAB V. KESIMPULAN DAN SARAN .................................................... 64
A. Kesimpulan .......................................................................................... 64
B. Saran .................................................................................................... 64
DAFTAR PUSTAKA ............................................................................... 65
LAMPIRAN ............................................................................................. 68
BIOGRAFI PENULIS .............................................................................. 139
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xiii
DAFTAR TABEL
. ...................................................................................................... Halaman
Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut pada KCKT ............................ 11
Tabel II. Komposisi fase gerak metanol p.a:aquabides ......................... 24
Tabel III. Indeks polaritas campuran fase gerak metanol:aquabides ...... 33
Tabel IV. Waktu retensi baku kloramfenikol, baku lidokain
hidroklorida dan baku campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida .......................................................................... 40
Tabel V. Tekanan kolom (kgf/cm2=kPa) ............................................. 44
Tabel VI. Hasil optimasi kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
berdasar parameter Asymmetry Factor (AF) dengan fase
gerak metanol:aquabides 75:25; 85:15; dan 95:5 pada flow
rate 0,8; 1,0; dan 1,2 mL/menit ............................................. 45
Tabel VII. Hasil optimasi flow rate baku campuran kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida dengan fase gerak metanol:aquabides
95:5 ...................................................................................... 58
Tabel VIII. Data hasil perhitungan %CV waktu retensi baku campuran
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida ............................... 60
Tabel IX. Data hasil perhitungan %CV nilai resolusi baku campuran
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida ............................... 61
Tabel XII. Data hasil perhitungan %CV waktu retensi dan nilai resolusi
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes
telinga Colme® .................................................................... 63
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xiv
DAFTAR GAMBAR
Halaman
Gambar 1. Struktur Kloramfenikol (D-treo-(-)-2,2-Dikloro-N-(β-
hidroksi-α-(hidroksimetil)-p)nitrofenetilasetamida) ............. 5
Gambar 2. Struktur Lidokain Hidroklorida (2-(Dietilamino)-2’,6’-
aetoksilidida monohidroklorida monohidrat) ....................... 6
Gambar 3. Instrumentasi KCKT ............................................................. 9
Gambar 4. Mekanisme pemisahan kromatografi partisi fase terbalik ...... 13
Gambar 5. Perhitungan bilangan lempeng teoritik .................................. 14
Gambar 6. Difusi Eddy .......................................................................... 15
Gambar 7. Transfer massa pada fase diam .............................................. 17
Gambar 8. Transfer massa pada fase gerak ............................................. 17
Gambar 9. Pemisahan dua senyawa ........................................................ 18
Gambar 10. Penentuan Peak Asymmetry dan Peak Tailing Factor ............ 20
Gambar 11. Distribusi analit dalam fase diam dan fase gerak ................... 20
Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom pada kloramfenikol ............ 37
Gambar 13. Gugus kromofor dan auksokrom pada lidokain hidroklorida . 37
Gambar 14. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 13
ppm (A) dan lidokain hidroklorida 300 ppm (B) .................. 37
Gambar 15. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 19,5
ppm (A) dan lidokain hidroklorida 450 ppm (B) ................. 38
Gambar 16. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 26
ppm (A) dan lidokain hidroklorida 600 ppm (B) .................. 38
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xv
Gambar 17. Interaksi kloramfenikol dengan fase diam C18
(oktadesilsilan) melalui interaksi Van Der Waals................. 41
Gambar18. Interaksi lidokain hidroklorida dengan fase diam C18
(oktadesilsilan) melalui interaksi Van Der Waals dan
interaksi ion-dipol ............................................................... 41
Gambar 19. Interaksi hidrogen antara kloramfenikol dengan fase gerak
metanol:aquabides ............................................................... 42
Gambar 20. Interaksi hidrogen antara lidokain hidroklorida dengan fase
gerak metanol:aquabides ..................................................... 42
Gambar 21. Kromatogram kloramfenikol (A.1), lidokain hidroklorida
(A.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25 dan flow
rate 0,8 mL/menit ............................................................... 46
Gambar 22. Kromatogram kloramfenikol (B.1), lidokain hidroklorida
(B.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25 dan flow
rate 1,0 mL/menit................................................................ 47
Gambar 23. Kromatogram kloramfenikol (C.1), lidokain hidroklorida
(C.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 75:25 dan flow
rate 1,2 mL/menit................................................................ 48
Gambar 24. Kromatogram kloramfenikol (A.1), lidokain hidroklorida
(A.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 85:15 dan flow
rate 0,8 mL/menit................................................................ 50
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xvi
Gambar 25. Kromatogram kloramfenikol (B.1), lidokain hidroklorida
(B.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 85:15 dan flow
rate 1,0 mL/menit ................................................................. 51
Gambar 26. Kromatogram kloramfenikol (C.1), lidokain hidroklorida
(C.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 85:15 dan flow
rate 1,2 mL/menit ................................................................. 52
Gambar 27. Kromatogram kloramfenikol (A.1), lidokain hidroklorida
(A.2) dengan fase gerak metanol:aquabides 95:5 dan flow
rate 0,8 mL/menit ................................................................. 54
Gambar 28. Kromatogram kloramfenikol (B.1), lidokain hidroklorida
(B.2), baku campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida (B.3) dengan fase gerak metanol:aquabides
95:5 dan flow rate 1,0 mL/menit ........................................... 55
Gambar 29. Kromatogram kloramfenikol (C.1), lidokain hidroklorida
(C.2), baku campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida (C.3) dengan fase gerak metanol:aquabides
95:5 dan flow rate 1,2 mL/menit ........................................... 56
Gambar 30. Kromatogram kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam
sediaan tetes telinga Colme® pada replikasi 1, replikasi 2,
dan replikasi 3 dengan komposisi fase gerak dan flow rate
hasil optimasi........................................................................ 62
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xvii
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman
Lampiran 1. Sertifikat analisis kloramfenikol ......................................... 69
Lampiran 2. Sertifikat analisis lidokain hidroklorida .............................. 70
Lampiran 3. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerak
metanol:aquabides (75:25) ................................................. 71
Lampiran 4. Nilai Asymmetry Factor (AF) peak kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides
(75:25) dan contoh perhitungannya .................................... 77
Lampiran 5. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerak
metanol:aquabides (85:15) ................................................. 79
Lampiran 6. Nilai Asymmetry Factor (AF) peak kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides
(85:15) dan contoh perhitungannya .................................... 85
Lampiran 7. Kromatogram hasil optimasi flow rate pada fase gerak
metanol:aquabides (95:5) ................................................... 87
Lampiran 8. Nilai Asymmetry Factor (AF) peak kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides
(95:5) dan contoh perhitungannya ...................................... 95
Lampiran 9. Nilai resolusi dan HETP pada fase gerak
metanol:aquabides (95:5) dan contoh perhitungannya ........ 97
Lampiran 10. Reprodusibilitas: Kromatogram baku kloramfenikol, baku
lidokain hidroklorida, baku campuran kloramfenikol dan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xviii
lidokain hidroklorida pada fase gerak metanol:aquabides
(95:5) flow rate 1,0 mL/menit ............................................ 100
Lampiran11. Reprodusibilitas: Kromatogram kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme®
.. 127
Lampiran 12. Data hasil uji reprodusibilitas sistem dan perhitungan
%CV .................................................................................. 130
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xix
INTISARI
Kloramfenikol dan lidokain hidroklorida merupakan zat aktif yang
terdapat dalam sediaan tetes telinga Colme®. Dalam produk tetes telinga perlu
adanya penjaminan mutu terkait kadar senyawa aktifnya sehingga semakin
terjamin keamanan dan khasiatnya. Pada penelitian ini digunakan metode
Kromatografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) fase terbalik sebagai metode analisis
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme®.
Penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kondisi optimum dari KCKT
sehingga dapat digunakan sebagai penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme®. Sistem KCKT fase terbalik
menggunakan kolom C18 dengan fase gerak metanol:aquabides. Optimasi
dilakukan dengan mengubah-ubah komposisi fase gerak metanol:aquabides
(75:25), (85:15) dan (95:5) serta mengubah-ubah flow rate yaitu 0,8; 1,0; dan 1,2
mL/menit dengan detektor ultraviolet pada λmaks 265 nm.
Kondisi optimum sistem KCKT yang didapatkan adalah fase gerak
metanol:aquabides (95:5) pada flow rate 1,0 mL/menit. Kondisi optimum ini telah
memenuhi parameter pemisahan yang baik yaitu peak yang simetri, tR kurang dari
10 menit, nilai resolusi ≥ 1,5 yaitu 3,1819, dan nilai HETP yang paling kecil yaitu
0,0128.
Kata kunci: kloramfenikol, lidokain hidroklorida, tetes telinga, optimasi metode,
KCKT fase terbalik
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
xx
ABSTRACT
Chloramphenicol and lidocaine hydrochloride is the active substances
contained in preparations Colme® ear drops. Ear drops needs the quality assurance
of products related to levels of the active compounds, so security is ensured and
usability. In this study using High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
reverse phase as a method of analysis of chloramphenicol and lidocaine
hydrochloride in the preparation Colme® ear drops.
This study aims to determine the optimum conditions for HPLC can be
used as a test of lidocaine hydrochloride and chloramphenicol in the preparation
Colme® ear drops. Reverse phase HPLC system using C18 column with mobile
phase methanol:aquabidest. Optimization is done by changing the composition of
mobile phase methanol:aquabidest (75:25), (85:15) and (95:5) and varying the
flow rate of 0,8; 1,0; and 1,2 mL/min with an ultraviolet detector at λmaks 265
nm.
The optimal conditions obtained by HPLC system is the mobile phase
methanol: aquabidest (95:5) at flow rate of 1,0 mL/min. Optimal conditions in
accordance with the parameters of a good separation of the peak of the symmetry,
tR less than 10 minutes, the value of resolution ≥ 1,5 is 3,1819, and the lowest
HETP is 0,0128.
Key words: chloramphenicol, lidocaine hydrochloride, ear drops, optimization
methods, reversed-phase HPLC
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
1
BAB I
PENGANTAR
A. Latar Belakang
Guttae auricularies atau obat tetes telinga adalah bahan obat berbentuk
cairan yang cara penggunaanya dengan meneteskan ke dalam saluran telinga,
kecuali dibuat dengan pembawa bukan air (Dirjen POM RI, 1974). Colme®
adalah
salah satu jenis obat tetes telinga yang beredar di Indonesia. Colme®
mengandung
senyawa antibiotik yaitu kloramfenikol 10% dan obat pemati rasa yaitu lidokain
hidroklorida 4% (Anonim, 2006).
Kloramfenikol memiliki kelarutan 1 bagian di dalam 400 bagian air dan 1
bagian didalam 2,5 bagian etanol, sangat larut di eter dan kloroform (Clarke,
1969). Menurut Farmakope Indonesia edisi IV (1995), tetes telinga kloramfenikol
adalah larutan steril kloramfenikol dalam pelarut yang sesuai, mengandung tidak
kurang dari 90,0 % dan tidak lebih dari 130% C11H12Cl2N2O5 dari jumlah yang
tertera pada etiket.
Lidokain hidroklorida (Otopain) adalah obat pemati rasa yang bekerja di
dalam kulit dan selaput lendir dengan menghilangkan rasa nyeri, rasa terbakar,
dan gatal pada telinga (Tan dan Rahardja, 2010). Lidokain berbentuk bubuk
kristal putih dan memiliki sifat larut 1 bagian dalam 0,7 bagian air, 1 bagian
didalam 1,5 bagian etanol, dan 1 bagian didalam 40 bagian kloroform dan tidak
larut dalam eter (Clarke, 1969). Larutan oral-topikal lidokain hidroklorida
mengandung lidokain hidroklorida tidak kurang dari 95,0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
2
% dan tidak lebih dari 105,0% dari jumlah yang tertera pada etiket (Dirjen POM
RI, 1995).
Dalam rangka menjamin kandungan mutu dari bentuk sediaan Colme®,
dibutuhkan suatu metode yang sensitif dan selektif sehingga khasiat dan
keamanannya benar-benar dapat dipertanggungjawabkan. Oleh karena itu, metode
yang dipilih sebagai metode analisis dalam pemisahan kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida dalam sediaan tetes telinga Colme® adalah metode KCKT fase
terbalik. Metode KCKT ini sering digunakan sebagai metode analisis kuantitatif
atau penetapan kadar suatu senyawa tertentu di dalam suatu matriks yang
kompleks atau terdapat banyak komponen lain di dalam matriks sampel (Khopkar,
1990). Detektor yang digunakan adalah detektor UV karena kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet.
Kloramfenikol di dalam metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar
ultraviolet yaitu pada 272 nm ( ) dan lidokain hidroklorida di dalam
metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet pada 263 nm (
) dan 271 nm ( ) (Dibbern, Muller and Wirbitzki, 2002).
Penetapan kadar kloramfenikol dan benzokain dalam suatu bentuk
sediaan dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik pernah
dilakukan oleh Sadana dan Ghogare (1990). Fase diam yang digunakan adalah
kolom µBondapak C18 (300 mm x 3,9 mm i.d; ukuran partikel 5µm) dan fase
gerak metanol:aquabides (36:65 v/v). Hal yang membedakan penelitian ini dengan
penelitian Sadana dan Ghogare adalah senyawa yang akan dipisahkan, yaitu
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida. Selain itu kolom yang akan digunakan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
3
pada penelitian ini adalah Kromasil sedangkan Sadana dan Ghogare adalah kolom
µBondapak. Adanya perbedaan tersebut maka diperlukan adanya suatu penelitian
optimasi pemisahan kedua senyawa tersebut untuk mendapatkan kondisi optimal.
Optimasi metode KCKT bertujuan untuk mengetahui kondisi yang
optimum pada metode KCKT sehingga dapat digunakan sebagai metode
penetapan kadar campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida pada obat
tetes telinga Colme®. Kondisi yang optimum yang diharapkan adalah bentuk peak
yang simetri, waktu retensi (tR) < 10 menit, nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak
terdekat, dan nilai HETP yang semakin kecil (Synder, Kirkland, and Glajh, 1997).
Optimasi yang dilakukan adalah dengan mengubah komposisi fase gerak dan
kecepatan alir atau flow rate sehingga parameter-parameter yang telah disebutkan
tersebut dapat terpenuhi.
1. Permasalahan
Berdasarkan latar belakang, permasalahan yang diperoleh adalah
bagaimanakah komposisi fase gerak dan flow rate yang optimum yang dapat
menghasilkan pemisahan dengan peak yang simetri, waktu retensi (tR) < 10 menit,
nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak terdekat, dan nilai HETP yang semakin kecil
untuk penetapan kadar campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida pada
obat tetes telinga Colme®
dengan menggunakan metode KCKT fase terbalik?
2. Keaslian penelitian
Penelitian terkait pernah dilakukan oleh Sadana dan Ghogare (1990),
yaitu penetapan kadar kloramfenikol dan benzokain dalam suatu bentuk sediaan
dengan menggunakan kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik dengan fase
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
4
diam yang digunakan adalah kolom µBondapak C18 (300 mm x 3,9 mm i.d;
ukuran partikel 5µm) dan fase gerak metanol:aquabides (36:65 v/v). Akan tetapi,
penelitian berupa optimasi campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
dengan metode kromatografi cair kinerja tinggi fase terbalik belum pernah
dilakukan sebelumnya.
3. Manfaat penelitian
a. Manfaat metodologis. Menjadi sumbangan karya ilmiah tentang
metode penelitian dalam melakukan optimasi alat KCKT untuk penetapan kadar
campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dalam sediaan topikal.
b. Manfaat praktis. Dapat digunakan sebagai metode awal untuk
validasi dan penetapan kadar kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang
nantinya dapat memberikan informasi bagi masyarakat mengenai penjaminan
mutu pada obat tetes telinga yang mengandung kedua obat tersebut.
B. Tujuan Penelitian
Berdasarkan latar belakang dan permasalahan di atas, maka penelitian ini
bertujuan untuk mengetahui komposisi fase gerak dan flow rate yang optimum
yang dapat menghasilkan pemisahan dengan peak yang simetri, waktu retensi (tR)
< 10 menit, nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak terdekat, dan nilai HETP yang
semakin kecil untuk validasi dan penetapan kadar campuran kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida pada obat tetes telinga Colme® dengan menggunakan
metode KCKT fase terbalik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
5
BAB II
PENELAAHAN PUSTAKA
A. Kloramfenikol
Kloramfenikol adalah senyawa antimikroba yang bekerja dengan cara
menghambat sintesis protein mikroba. Penghambatan yang terjadi yaitu pada
enzim peptidil transferase yang berperan sebagai katalisator dalam pembentukan
ikatan peptida ketika sintesis protein. Kloramfenikol bersifat bakteriostatik, dan
dapat bersifat baktersid pada konsentrasi yang tinggi (Setiabudy dan Kurnadi,
1995).
Gambar 1. Struktur Kloramfenikol (D-treo-(-)-2,2-Dikloro-N-(β-hidroksi-α-(hidroksimetil)-
p)nitrofenetilasetamida) (Hutt and O’Grady, 1996)
Kloramfenikol memiliki berat molekul (BM) 323,13 g/mol.
Kloramfenikol mengandung tidak kurang dari 97,0% dan tidak lebih dari 103,0%
C11H12Cl2N2O5. Namun, untuk tetes telinga kloramfenikol mengandung tidak
kurang dari 90,0% dan tidak lebih dari 130,0% C11H12Cl2N2O5 dari jumlah yang
tertera pada etiket. Kloramfenikol memiliki hablur halus, berbentuk jarum atau
lempeng memanjang, berwarna putih kelabu atau putih kekuningan, dan sifatnya
stabil dalam larutan netral atau larutan agak asam, serta sukar larut dalam air,
mudah larut dalam etanol, dalam propilenglikol, aseton, etil asetat (Dirjen POM
RI, 1995). Kloramfenikol di dalam metanol memiliki λmaks pada 272 nm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
6
( ) (Dibbern et al., 2002). Kloramfenikol memiliki pH antara 4,5 dan
7,5 (Dirjen POM RI, 1995), dan pKa 5,5 (Clarke, 1969).
B. Lidokain Hidroklorida
Lidokain memiliki daya kerja yang cepat dan merupakan obat anestesi
lokal yang paling sering digunakan karena lebih stabil dalam pemanasan dan
jarang menimbulkan reaksi hipersensitivitas (Sutedjo, 2008).
Gambar 2. Struktur Lidokain Hidroklorida (2-(Dietilamino)-2’,6’-aetoksilidida
monohidroklorida monohidrat) (British Pharmacopeia Comission, 2009)
Lidokain hidroklorida memiliki berat molekul (BM) 270,80 g/mol,
berbentuk serbuk hablur putih, tidak berbau dan rasa sedikit pahit dan sifatnya
mudah larut dalam air, dalam etanol dan dalam kloroform, tetapi tidak larut dalam
eter. Larutan oral-topikal lidokain hidroklorida mengandung lidokain hidroklorida
tidak kurang dari 95,0% dan tidak lebih dari 105,0% dari jumlah yang tertera pada
etiket (Dirjen POM RI, 1995). Lidokain di dalam metanol memiliki λmaks pada
263 nm ( ) dan 271 nm ( ) (Dibbern et al., 2002).
Lidokain hidroklorida memiliki pH antara 5,0 dan 7,0 (Dirjen POM RI, 1995),
dan pKa 7,9 (25°) (Clarke, 1969).
C. Obat Tetes Telinga
Tetesan (guttae) adalah sediaan cair yang mengandung bahan obat atau
sediaan obat atau bahan obat dan sediaan obat terlarut, teremulsi, atau tersuspensi,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
7
ditakar berdasar jumlah tetesan, digunakan untuk diminum dan diisikan ke dalam
wadah bertakaran ganda. Untuk tetesan tertentu yang digunakan di telinga,
dinamakan tetes telinga (otoguttae) (Voigt, 1994).
Menurut Farmakope Indonesia edisi IV, obat tetes telinga (guttae
auriculares) adalah obat tetes yang digunakan dengan cara meneteskan ke dalam
telinga. Kecuali dinyatakan lain, dibuat dengan menggunakan pembawa bukan air.
Pembawa pada obat tetes telinga harus mempunyai kekentalan yang cocok hingga
obat mudah menempel. Pada umumnya digunakan gliseril dan propilenglikol,
selain itu dapat juga menggunakan etanol, heksilenglikol, dan minyak lemak
nabati (Dirjen POM RI, 1995).
D. Spektrofotometer UV
Teknik spektroskopik merupakan salah satu teknik analisis fisiko-kimia
yang mengamati interaksi atom atau molekul dengan suatu radiasi
elektromagnetik (REM) (Mulja dan Suharman, 1995). Metode analisis
spektrofotometri ultraviolet didasarkan pada substitusi pada daerah panjang
gelombang sekitar 190-380 nm (Khopkar, 1990).
Absorbansi cahaya ultraviolet mengakibatkan transisi elektronik, yaitu
promosi elektron dari orbital keadaan dasar yang berenergi rendah ke orbital
keadaan tereksitasi yang lebih tinggi. Panjang gelombang ultraviolet bergantung
pada mudahnya promosi elektron. Molekul-molekul yang memerlukan banyak
energi untuk promosi elektron akan menyerap pada panjang gelombang yang
lebih pendek dan sebaliknya (Fessenden dan Fessenden, 1997).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
8
Ada empat tipe transisi elektronik yang mungkin terjadi yaitu σ σ*, n
σ*, n π*, dan π π* (Mulja dan Suharman, 1995). Pada transisi σ σ*,
elektron pada suatu orbital σ tereksitasi ke orbital σ*, dengan mengabsorbsi
radiasi. Anti-ikat Transisi n σ* terjadi dalam senyawa-senyawa jenuh dengan
elektron tidak berpasangan. Transisi tersebut memerlukan energi yang lebih kecil
dan terjadi dalam daerah 150-250 nm dengan є = 100-3000. Transisi n π* dan
π π*mencakup sebagian besar senyawa organik. Energi yang diperlukan untuk
transisi menghasilkan absorbsi maksimum dalam daerah 200-700 nm. Dengan
adanya orbital π berarti terdapat gugus fungsi tidak jenuh. Transisi n π*
memiliki є = 10-100 L/cm/mol sedangkan transisi π π* memiliki є = 1000-
10.000 L/cm/mol (Khopkar, 1990).
Kromofor merupakan suatu gugus fungsional tidak jenuh yang
menyediakan orbital π yang dapat menyerap pada daerah ultraviolet (Skoog,
1985). Sedangkan auksokrom merupakan gugus jenuh yang bila terikat pada
kromofor mengubah panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum,
cirinya adalah heteroatom yang langsung terikat pada kromofor (Sastrohamidjojo,
2001).
Spektrometer menghasilkan sinar dari spektrum panjang gelombang
tertentu dan fotometer adalah alat pengukur intensitas cahaya yang ditransmisikan
atau diabsorbsi. Sehingga, spektrofotometer digunakan untuk mengukur energi
yang ditransmisikan, direfleksikan atau diemisikan sebagai fungsi dari panjang
gelombang (Khopkar, 1990).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
9
E. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi
1. Pengenalan dan instrumentasi KCKT
Kromatografi cair kinerja tinggi atau yang dikenal dengan HPLC (High
Performance Liquid Chromatography) mulai dikembangkan akhir tahun 1960 dan
awal tahun 1970 (Rohman, 2009). Penggunaan High Performance Liquid
Chromatography (HPLC) tidak terbatas untuk sampel yang bersifat volatil atau
stabilitasnya yang mudah dipengaruhi oleh suhu. HPLC dapat memisahkan
makromolekul, spesies ion, produk alami yang bersifat labil, polimer, dan lain-
lain (Willard, Merrit, Dean, and Settle, 1988).
Pemisahan dengan KCKT dapat dilakukan dengan fase normal atau fase
terbalik. Fase normal apabila fase diamnya lebih polar dibandingkan dengan fase
geraknya dan fase terbalik apabila fase diamnya lebih non polar daripada fase
geraknya. Dengan adanya kedua pemisahan ini, sering kali KCKT dikelompokkan
menjadi KCKT fase normal dan KCKT fase terbalik (Gritter, 1991).
Gambar 3. Instrumentasi KCKT(Christian, 2004)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
10
Bagian yang harus diperhatikan pada kromatografi partisi fase terbalik
adalah kolom, fase gerak, dan detektor.
a. Kolom. Oktadesil silika (ODS atau C18) adalah fase diam yang paling
umum digunakan pada KCKT fase terbalik karena mampu memisahkan senyawa
dengan kepolaran rendah, sedang dan tinggi (Rohman, 2009).
Panjang kolom KCKT biasanya sekitar 5-25 cm, dengan tekanan yang
sangat tinggi yaitu sampai 6000 psi (Gritter, 1991). Standar diameter kolom
HPLC sekitar 4-5 mm. Diameter partikel berada pada kisaran 4 sampai 7 µm
untuk kolom pada umumnya (Dean, 1995).
b. Fase gerak. Selain susunan kimiawi dari fase gerak, ada empat hal
pada fase gerak yang harus diperhatikan yakni harus murni secara kimia, harus
bebas partikel yang dapat menyumbat kolom, harus bebas gas yang terlarut, dan
jika dilakukan pencampuran, maka saat pencampuran harus dicampur dengan
benar (Gritter, 1991).
Komposisi fase gerak yang digunakan dapat mempengaruhi variasi
retensi analit untuk pemisahan yang optimal. Sehingga fase gerak disesuaikan
komposisinya agar diperoleh kepolaran relatif yang mirip dengan sampel untuk
memperoleh pemisahan yang optimal (Willard et al., 1998).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
11
Tabel I. Karakteristik beberapa pelarut pada KCKT (Synder et al., 1997)
Dalam pemilihan fase gerak yang sesuai, parameter yang dilihat
berdasarkan kepolaran campuran pelarut yang semakin linier dengan pelarut
murni. Tingkat kepolaran suatu pelarut menunjukkan kemampuan pelarut dalam
mengelusi suatu senyawa. Besarnya polaritas dapat dihitung dengan cara seperti
dibawah ini:
P’camp: Ф1 P’1 + Ф2 P’2 + ........ + Фn P’n (1)
Keterangan:
P’= indeks polaritas
Ф = fraksi volume pelarut (Gritter, 1991).
Semakin besar nilai indeks polaritas campuran maka fase gerak yang digunakan
semakin polar (Synder et al., 1997).
c. Detektor. Secara umum suatu detektor harus memiliki karakteristik
tertentu yaitu memiliki respon cepat terhadap solut, reprodusibel, memiliki
sensitifitas tinggi, stabil dalam pengoperasian, signal yang dihasilkan berbanding
lurus dengan konsentrasi solut, tidak dipengaruhi suhu dan kecepatan alir fase
gerak (Rohman, 2009).
Secara umum detektor dibagi menjadi 2 kategori, yaitu:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
12
1) Bulk property detectors
Detektor ini merupakan detektor yang mengukur perubahan sifat fisik fase
gerak dan solut. Detektor ini cenderung relatif tidak sensitif dan menghendaki
suhu yang terkendali. Contohnya yaitu detektor indeks bias.
2) Solute Property detectors
Detektor ini hanya dapat mengukur sifat fisik solut dan 1000 kali lebih sensitif
serta mampu mengukur solut sampai satuan nanogram atau lebih kecil lagi.
Contohnya yaitu detektor fluoresensi, detektor penyerapan (UV-Vis), dan
detektor elektrokimia (Munson, 1991).
2. Kromatografi partisi fase terbalik
Konsep dasar kromatografi partisi yaitu perlakuan sampel dalam kondisi
cair-cair tergantung pada kelarutannya di dalam kedua cairan yang terlibat
(Gritter, Bobbit, and Schwarting, 1991). Partisi analit di antara dua fase yang tidak
saling campur, karena adanya perbedaan koefisien distribusi dari masing-masing
senyawa. Jika solut ditambahkan ke dalam sistem yang terdiri dari dua pelarut
tidak saling campur dan keseluruhan sistem dibiarkan setimbang, maka solut akan
tersebar di antara kedua fase menurut persamaan:
(2)
K = koefisien distribusi
Cs = konsentrasi solut dalam fase diam
Cm = konsentrasi solut dalam fase gerak (Johnson dan Stevenson, 1978).
Mekanisme pemisahan pada kromatografi partisi fase terbalik dapat digambarkan
sebagai berikut:
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
13
Gambar 4. Mekanisme pemisahan kromatografi partisi fase terbalik (Munson,
1991)
3. Pemisahan puncak dalam kromatografi
Parameter pemisahan dengan sistem KCKT sebagai ukuran kemampuan
kolom untuk memisahkan senyawa dari suatu campuran. Batasan yang digunakan
adalah efisiensi kolom, waktu retensi (tR), dan faktor resolusi (Munson, 1991).
a. Efisiensi Kolom. Salah satu karakteristik sistem kromatografi yang
paling penting adalah efisiensi atau jumlah lempeng teoritis (N) (Rohman, 2009).
Ada dua teori mengenai pemisahan puncak dalam kromatografi,yaitu lempeng
teoritik dan teori laju.
Pada teori Lempeng (Plate theory) dijelaskan bahwa ukuran efisiensi
kolom adalah jumlah lempeng (plate number, N) yang didasarkan pada konsep
lempeng teoritis (Rohman, 2009). Jumlah lempeng (N) dihitung dengan
persamaan (Willard et al., 1988):
(3)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
14
Nilai w adalah lebar alas, w1/2 adalah lebar alas puncak pada setengah
tinggi puncak, dan tR adalah waktu retensi (Sastrohamidjojo, 2001). Persamaan
dibawah ini menggambarkan hubungan anatra panjang kolom (L) dengan efisiensi
kolom (H):
(4)
Jumlah lempeng (N) yang tinggi disyaratkan untuk pemisahan yang baik
yang nilainya sebanding dengan semakin panjang kolom (L) dan semakin
kecilnya nilai H. H adalah tinggi ekivalen lempeng teoritis atau HETP (High
Equivalent Theoritical Plate), merupakan panjang kolom yang dibutuhkan untuk
menghasilkan suatu lempeng teoritis. Kolom yang baik seharusnya memiliki
jumlah plat teoritis (N) yang tinggi dan nilai H yang rendah. Ukuran partikel
merupakan suatu hal yang berpengaruh pada nilai H, dimana semakin kecil
ukuran partikel maka semakin tinggi bilangan lempeng teoritis (Rohman, 2009).
Gambar 5. Perhitungan bilangan lempeng teoritik
(Willard et al., 1988)
Pada teori laju dapat diketahui adanya pengaruh variabel-variabel lain
yang menyebabkan pelebaran peak, sedangkan teori lempeng hanya
menggambarkan laju migrasi secara kuantitatif. Ketika migrasi, solut mengalami
N
LHETPH
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
15
transfer pada fase diam dan fase gerak berkali-kali, solut bergerak bersama fase
gerak sehingga migrasi di dalam kolom tidak teratur yang mengakibatkan laju
rata-rata solut relatif terhadap fase gerak juga sangat bervariasi. Laju rata-rata
solut relatif terhadap fase gerak bervariasi sehingga mengakibatkan pelebaran
peak solut (Noegrohati, 1994).
Berdasarkan teori laju yang ada, efisiensi kolom dinyatakan dengan
persamaan Van Deemter yang dinyatakan sebagai berikut:
(5)
(6)
Keterangan:
λ = tetapan ukuran ketidakteraturan kemasan
dp = diameter rata-rata partikel penyangga
D = kedifusian linarut dalam fase gerak
k’ = Faktor kapasitas
µ = kecepatan alir
γ = faktor koreksi kelikuan saluran dalam kolom (Willard et al., 1988).
Berdasarkan persamaan Van Deemter di atas, hal-hal yang mempengaruhi
efisiensi kolom yaitu Difusi Eddy, Difusi Longitudinal, dan Transfer Massa
(Willard et al., 1988).
Difusi Eddy disebabkan oleh banyak kemungkinan pada kemasan kolom
yang kurang baik.
Gambar 6. Difusi Eddy (Noegrohati, 1994)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
16
Nomor 1 menunjukkan analit yang keluar lebih dahulu karena melewati kolom
dengan partikel berukuran besar dan kurang kompak. Nomor 2 menunjukkan
analit keluar lebih lambat dari nomor 1 karena ukuran partikel yang lebih kecil
dan lebih kompak daripada nomor 1. Nomor 3, analit keluar paling akhir, hal ini
terjadi karena melewati bagian kolom dengan ukuran partikel halus dan kompak
(Noegrohati, 1994).
Menurut Willard (1988), difusi Eddy dinyatakan sebagai A (2λdp) yang
menggambarkan ketidakhomogenan kecepatan alir dan panjang lintasan di sekitar
partikel yang ter-packing. Lintasan alir yang tidak sama pasti ditemukan dalam
setiap kolom ter-packing. Suatu molekul solut dapat melewati kolom dekat
dinding kolom di mana kerapatan kolom rendah dengan cepat mencapai akhir
kolom, khususnya pada kolom berdiameter kecil. Sedangkan suatu molekul solut
yang melewati bagian tengah kolom menjadi lebih lambat untuk mencapai akhir
kolom. Dengan demikian, laju tiap molekul melalui kolom berbeda-beda. Difusi
Eddy dapat diminimalkan dengan memperkecil diameter rata-rata partikel dalam
kolom hingga sekecil mungkin dan seseragam mungkin.
Difusi longitudinal dilambangkan dengan nilai B (2γD/µ) yang
menggambarkan pergerakan acak molekul dalam fase gerak. Pengaruh difusi
longitudinal terhadap ketinggian lempeng menjadi signifikan pada kecepatan fase
gerak yang rendah/lambat. Pada kecepatan difusi solut yang tinggi dalam fase
gerak menyebabkan molekul solut terdispersi secara aksial dan lambat bermigrasi
melalui kolom (Willard et al., 1988).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
17
Transfer massa dinyatakan dengan nilai Cstasionary dan Cmobile.
Cstasionery yang menunjukkan solut yang tertahan karena adanya fase diam.
Suatu molekul bergerak lambat pada fase diam, sementara molekul lainnya
bergerak melalui kolom bersama dengan fase gerak. Untuk mengatasi hal tersebut,
dapat dibuat fase diam yang lebih encer (tidak terlalu kental) (Willard et al.,
1988).
Gambar 7. Transfer massa pada fase diam (Willard et al., 1988)
Sedangkan Cmobile menggambarkan adanya peristiwa dimana solut dalam fase
diam bertemu dengan fase gerak yang masih baru.
Gambar 8. Transfer massa pada fase gerak (Willard et al., 1988)
b. Waktu retensi (tR) dan faktor resolusi. Waktu tambat atau waktu retensi
merupakan selang waktu yang diperlukan oleh analit mulai saat injeksi hingga
keluar dari kolom dan sinyalnya ditangkap oleh detektor. Waktu tambat atau
retensi ini dinyatakan sebagai tR. Apabila harga D (koefisien distribusi) kecil,
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
18
maka analit akan lebih banyak di dalam fase gerak atau (Cm > Cs) yang berarti
analit akan lebih lama tinggal di dalam fase gerak dan memiliki waktu retensi
lebih cepat (Mulja dan Suharman, 1995).
Kolom yang lebih efisien akan memiliki resolusi yang baik. Tingkat
pemisahan komponen dalam suatu campuran dengan metode kromatografi
direfleksikan dalam kromatogram yang dihasilkan. Hasil pemisahan yang baik
ditunjukkan dengan puncak-puncak yang terpisah secara sempurna atau tidak ada
tumpang tindih (overlapping) (Rohman, 2009).
Faktor resolusi atau daya pisah (Rs) dapat diukur secara kuantitatif
dengan persamaan (Willard et al., 1988):
(7)
Nilai tR2 dan tR1 adalah waktu tambat atau waktu retensi komponen, diukur pada
titik puncak maksimum puncak dan ∆t adalah selisih antara tR2 dan tR1. Nilai w2
dan w1 adalah lebar alas puncak (Johnson dan Stevenson, 1978).
Gambar 9. Pemisahan dua senyawa (Willard et al., 1988)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
19
Pemisahan sempurna dari dua puncak dengan ukuran yang sama dikenal
dengan base resolution dengan harga Rs ≥1,5. Dalam praktiknya, pemisahan
dengan nilai Rs = 1,0 (kedua puncak berhimpit 2%) dianggap memadai (Pescok,
Shields, and Cains, 1976).
Pada analisis dengan metode KCKT, kondisi percobaan yang dapat
menghasilkan puncak simetris lebih disukai, hal ini dikarenakan puncak asimetris
menghasilkan pengukuran bilangan lempeng teoritik dan faktor resolusi yang
tidak akurat, perhitungan yang tidak teliti, penurunan derajat resolusi dan puncak
minor pada ekor puncak tidak dapat terdeteksi, serta waktu retensi tidak
reprodusibel (Synder et al., 1997). Peak yang tidak simetris sering dijumpai bila
konsentrasi sampel dalam fase gerak terlalu besar. Apabila kapasitas kolom lebih
besar pada konsentrasi yang lebih rendah, bagian eluen dengan konsentrasi yang
lebih rendah akan bergerak lebih lambat dari pada bagian dengan konsentrasi solut
lebih tinggi, sehingga peak yang terjadi tidak simetris dengan bidang bagian
depan naik dengan tajam sedangkan bidang di bagian belakang turun dengan
landai (tailing). Keadaan sebaliknya dikenal sebagai leading atau fronting.
Penyebab tailing antara lain karena ketidaksesuaian antara analit dengan kolom,
pengemasan kolom yang tidak seragam, dan faktor yang terjadi di luar kolom
seperti pada injektor (Noegrohati, 1994).
Parameter yang digunakan untuk menilai bentuk puncak adalah peak
asymmetry factor (As), yang diukur 10% tinggi puncak. Peak yang simetri
memiliki nilai As =1,0. Sedangkan puncak lain dengan nilai As pada rentang 0,95-
1,1 masih dikatakan baik. Parameter lain yaitu peak tailing factor (Tf), yang
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
20
diukur pada 5% tinggi puncak (Synder et al., 1997). Sedangkan menurut Willard
(1988), nilai asymmetry factor (AF) pada peak yang simetri dengan rentang 0,95-
1,15.
Gambar 10. Penentuan Peak Asymmetry dan Peak Tailing Factor (Synder et al.,
1997)
Distribusi analit dalam fase gerak dan fase diam pada saat terjadinya
tailing dan leading terdapat pada gambar dibawah ini:
Gambar 11. Distribusi analit dalam fase diam dan fase gerak (Kuwana, 1980)
F. Landasan teori
Kloramfenikol merupakan senyawa antimikroba yang memiliki sifat
stabil dalam larutan netral, larutan agak asam, sukar larut dalam air, mudah larut
dalam etanol, dalam propilenglikol, aseton, etil asetat. Kloramfenikol di dalam
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
21
metanol memiliki λmaks pada 272 nm ( ). Senyawa ini memiliki pH
antara 4,5 dan 7,5, dan pKa 5,5.
Lidokain hidroklorida merupakan obat anestesi yang memiliki sifat
mudah larut dalam air, dalam etanol dan dalam kloroform, tetapi tidak larut dalam
eter. Lidokain di dalam metanol memiliki λmaks pada 263 nm ( ) dan
271 nm ( ). Senyawa ini memiliki pH antara 5,0 dan 7,0, dan pKa 7,9
(25°).
Sediaan tetes telinga Colme® merupakan sedian tetes telinga yang
mengandung kloramfenikol 10% dan lidokain hidroklorida 4%. Untuk menjamin
kandungan mutu dari bentuk sediaan Colme® maka dibutuhkan metode yang
sensitif dan selektif. Metode yang memiliki sensitifitas dan selektivitas yang
tinggi adalah metode KCKT. Optimasi dengan KCKT fase terbalik dilakukan
untuk memperoleh keadaan optimum pada pemisahan campuran kloramfenikol
dan lidokain hidroklorida. Parameter pemisahan dengan metode KCKT yang
menunjukkan kondisi optimum yaitu bentuk peak simetri, tR kurang dari 10 menit,
nilai resolusi ≥ 1,5 dan nilai HETP yang semakin kecil.
G. Hipotesis
Metode KCKT fase terbalik dengan komposisi fase gerak dan flow rate
yang optimum dapat menghasilkan kromatogram dengan bentuk peak yang
simetri, tR < 10 menit, resolusi pemisahan ≥ 1,5 terhadap peak terdekat, dan nilai
HETP yang semakin kecil sehingga dapat digunakan untuk validasi dan penetapan
kadar kloramfenikol dan lidokain hidroklorida pada sediaan tetes telinga Colme®.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
22
BAB III
METODE PENELITIAN
A. Jenis dan Rancangan Penelitian
Penelitian yang dilakukan merupakan jenis rancangan penelitian
eksperimental analitik karena ada perlakuan pada subjek uji.
B. Variabel Penelitian
1. Variabel bebas
Jenis dan perbandingan fase gerak yaitu metanol:aquabides dan flow rate
yang digunakan.
2. Variabel tergantung
Pemisahan peak dari tiap komponen yaitu kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida yang dilihat dari bentuk peak, waktu retensi (tR), nilai resolusi dan
HETP tiap-tiap senyawa.
3. Variabel pengacau terkendali
a. Kemurnian pelarut. Oleh karena itu, digunakan pelarut yang memiliki
kemurnian tinggi yaitu pelarut pro analysis.
b. Baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida. Oleh karena itu, digunakan
baku dengan kemurnian tinggi yang disertai dengan Certificate of Analysis
(CoA).
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
23
C. Definisi Operasional
1. Kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang dianalisis merupakan senyawa
aktif dalam sediaan tetes telinga Colme® dengan perbandingan 5:2.
2. Lidokain HCl yang digunakan adalah lidokain hidroklorida monohidrat.
3. Sistem KCKT fase terbalik yang digunakan adalah seperangkat alat KCKT
menggunakan kolom C18 dengan fase gerak metanol p.a:aquabides.
4. Optimasi dilakukan dengan mengubah komposisi fase gerak dan flow rate.
5. Parameter optimum dengan metode KCKT adalah bentuk peak, waktu retensi,
nilai resolusi dan HETP.
D. Bahan-bahan Penelitian
Bahan yang digunakan dalam penelitian ini adalah baku kloramfenikol
(Chemo Lugano Branch, No. batch 8000225001, kemurnian 99,1%) dan baku
lidokain hidroklorida (Megafine Pharma, No. batch ALH/449/10, kemurnian
99,20%) (PT. Interbat), metanol p.a (E.Merck), aqua bidestilata (PT.
Ikapharmindo Putramas), tetes telinga Colme® (PT. Interbat) dengan volume 8 ml
yang mengandung 10% kloramfenikol dan 4% lidokain hidroklorida.
E. Alat-alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian adalah seperangkat alat KCKT fase
terbalik dengan sistem gradien dengan detektor ultraviolet, Shimadzu LC-2010C,
kolom C-18 merek KNAUER C-18 (No. 25EE181KSJ (B115Y620), Dimensi 250
x 4,6 mm), seperangkat komputer (merk Dell B6RDZ1S Connexant System
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
24
RD01- D850 A03-0382 JP France S.A.S, printer HP Deskjet D2566 HP-024-000
625730), UV/Vis Spectrophotometer SP-3000plus merek OPTIMA dengan
detektor silicon photo diode, timbangan analitik Ohaus Carat Series PAJ 1003
(max 60/120g, min 0,001g, d = 0,01/0,1 mg), millipore, alat ultrasonikasi Refsch.,
Tipe: T460 (Schwing.1 PXE, FTZ-Nr. C-066/83, HF-Frequ.:35 kHz), kertas
saring Whatman 0,45 μm, alat vacuum, dan seperangkat alat gelas.
F. Tata Cara Penelitian
1. Pembuatan fase gerak
Fase gerak yang digunakan dalam penelitian ini adalah campuran metanol
dan aquabides dengan komposisi tabel II.
Tabel II. Komposisi fase gerak metanol p.a:aquabides
No. Komposisi Fase gerak
Metanol Aquabides
1. 75 25
2. 85 15
3. 95 5
Masing-masing pelarut disaring dengan penyaring Whatman yang dibantu
dengan pompa vakum dan didegassing selama 15 menit menggunakan
ultrasonicator. Untuk mendapatkan komposisi fase gerak di atas, pencampuran
fase gerak dilakukan di dalam sistem KCKT.
2. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang
digunakan untuk penentuan panjang gelombang pengamatan
a. Pembuatan larutan baku kloramfenikol. Sebanyak kurang lebih 10,0
mg kloramfenikol ditimbang seksama dan dilarutkan dalam metanol hingga 10,0
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
25
mL. Kemudian dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu 13; 19,5;
dan 26 ppm dengan mengencerkan 0,13; 0,195; dan 0,26 mL larutan stok tersebut
dalam metanol hingga 10,0 mL.
b. Pembuatan larutan baku lidokain hidroklorida. Sebanyak kurang lebih
10,0 mg lidokain hidroklorida ditimbang seksama dan dilarutkan dalam metanol
hingga 10 mL. Kemudian dibuat larutan seri dengan 3 konsentrasi berbeda yaitu
300; 450; dan 600 ppm dengan mengencerkan 3; 4,5; dan 6 mL larutan stok
tersebut dalam metanol hingga 10,0 mL.
3. Pembuatan larutan baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang
digunakan untuk optimasi dengan metode KCKT
a. Larutan stok kloramfenikol. Lebih kurang 10,0 mg kloramfenikol baku
ditimbang seksama, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga 10,0 mL.
b. Larutan intermediet kloramfenikol. Larutan stok kloramfenikol 1000
ppm tersebut dipipet seksama sebanyak 1 mL kemudian diencerkan dengan
metanol dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas, sehingga didapatkan
konsentrasi sebesar 100 ppm. Saring dengan milipore dan didegassing selama 15
menit.
c. Larutan stok lidokain hidroklorida. Lebih kurang 20,0 mg lidokain
hidroklorida baku ditimbang seksama, kemudian dilarutkan dalam metanol hingga
10,0 mL.
d. Larutan intermediet lidokain hidroklorida. Larutan stok lidokain
hidroklorida 2000 ppm tersebut dipipet seksama sebanyak 5 mL kemudian
diencerkan dengan metanol dalam labu ukur 10 mL hingga tanda batas, sehingga
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
26
didapatkan konsentrasi sebesar 1000 ppm. Saring dengan milipore dan
didegassing selama 15 menit.
4. Pembuatan larutan baku campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida
Campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yaitu dengan
konsentrasi masing-masing 100 ppm dan 1000 ppm dibuat dengan mencampur 1
mL stok kloramfenikol dengan 5 ml stok lidokain hidroklorida dalam labu ukur 10
mL, lalu tambahkan dengan metanol hingga tanda. Campuran kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida tersebut disaring dengan milipore dan didegassing selama
15 menit.
5. Penentuan panjang gelombang pengamatan kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida dengan spektrofotometer UV-Vis
Masing-masing seri konsentrasi baku kloramfenikol 13; 19,5; 26 ppm dan
lidokain hidroklorida 300; 450; 600 ppm diukur absorbansinya pada panjang
gelombang 200-400 nm dengan spektrofotometer UV-Vis. Dari spektra serapan
dapat diketahui panjang gelombang yang dihasilkan pada masing-masing
konsentrasi. Panjang gelombang yang akan digunakan pada sistem KCKT
ditentukan yaitu panjang gelombang yang menghasilkan serapan optimum pada
ketiga konsentrasi tersebut.
6. Preparasi Sampel
Sediaan tetes telinga Colme®
(kloramfenikol 10% dan lidokain
hidroklorida 4 %) digojog homogen, kemudian dipipet seksama sebanyak 0,1 mL
dan diencerkan dengan metanol sampai 10 mL sehingga didapatkan konsentrasi
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
27
kloramfenikol 1000 ppm dan lidokain hidroklorida 400 ppm. Larutan tersebut
kemudian dipipet seksama sebanyak 1 mL sehingga didapatkan konsentrasi
kloramfenikol 100 ppm dan lidokain hidroklorida 40 ppm. Larutan ini kemudian
ditambahkan 2,4 mL larutan stok lidokain hidroklorida 4000 ppm dan diencerkan
dengan metanol dalam labu takar 10,0 mL hingga batas tanda, sehingga
didapatkan konsentrasi kloramfenikol 100 ppm dan lidokain hidroklorida 1000
ppm. Larutan stok lidokain hidroklorida 4000 ppm disiapkan dengan menimbang
seksama lebih kurang 2,0 mg lidokain hidroklorida yang diencerkan dengan
metanol dalam labu takar 5,0 mL hingga batas tanda. Larutan sampel dengan
konsentrasi kloramfenikol 100 ppm dan lidokain hidroklorida 1000 ppm disaring
dengan milipore dan didegassing selama 15 menit.
7. Optimasi pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan
metode KCKT fase terbalik
a. Pengamatan nilai Asymmetry factor (AF) dan waktu retensi
kloramfenikol. Larutan baku kloramfenikol dengan konsentrasi 100 ppm
diinjeksikan sebanyak 16 µL ke dalam sistem KCKT. Optimasi dilakukan pada
panjang gelombang pengamatan dengan menggunakan fase gerak
metanol:aquabides dengan perbandingan 75:25; 85:15; dan 95:5 pada flow rate
0,5; 1,0 dan 2,0 mL/menit. Dari berbagai perbandingan fase gerak dan flow rate
tersebut dipilih yang nilai AF = 0,95-1,15 dan waktu retensinya kurang dari 10
menit.
b. Pengamatan nilai Asymmetry factor (AF) dan waktu retensi lidokain
hidroklorida. Larutan baku lidokain hidroklorida dengan konsentrasi 1000 ppm
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
28
diinjeksikan sebanyak 16 µL ke dalam sistem KCKT. Optimasi dilakukan pada
panjang gelombang pengamatan dengan menggunakan fase gerak
metanol:aquabides dengan perbandingan 75:25; 85:15; dan 95:5 pada flow rate
0,5; 1,0 dan 2,0 mL/menit. Dari berbagai perbandingan fase gerak dan flow rate
tersebut dipilih yang nilai AF = 0,95-1,15 dan waktu retensinya kurang dari 10
menit.
c. Pemisahan campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan
fase gerak hasil optimasi. Baku campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
dengan konsentrasi masing-masing yaitu 100 ppm dan 1000 ppm diinjeksikan
sebanyak 16 µL ke dalam sistem KCKT menggunakan perbandingan fase gerak
dan flow rate hasil optimasi. Pemisahan dilakukan pada panjang gelombang
pengamatan kemudian mengamati kromatogram yang terjadi. Setelah mendapat
kromatogram dilanjutkan dengan menghitung nilai resolusi dan HETP dari hasil
pemisahan campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida.
d. Reprodusibilitas baku campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida. Baku campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan
konsentrasi masing-masing yaitu 100 ppm dan 1000 ppm direplikasi sebanyak 3
kali, kemudian diinjeksikan sebanyak 12; 16; dan 20 µL ke dalam sistem KCKT
menggunakan perbandingan fase gerak dan flow rate hasil optimasi. Setelah
mendapat kromatogram dilanjutkan dengan menghitung %CV resolusi dan waktu
retensi dari hasil pemisahan campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida.
e. Reprodusibilitas campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
dalam sediaan tetes telinga Colme®. Sampel yang telah dipreparasi dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
29
konsentrasi kloramfenikol 100 ppm dan lidokain hidroklorida 1000 ppm
direplikasi sebanyak 3 kali, kemudian diinjeksikan sebanyak 16 µL ke dalam
sistem KCKT menggunakan perbandingan fase gerak dan flow rate hasil optimasi.
Setelah mendapat kromatogram dilanjutkan dengan menghitung %CV resolusi
dan waktu retensi dari hasil pemisahan campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida
F. Analisis Hasil
Hasil optimasi komposisi fase gerak dan flow rate tertentu menghasilkan
data kromatogram. Data kromatogram yang didapatkan yaitu kromatogram baku
dan sampel diamati, sehingga dapat diketahui sistem KCKT fase terbalik yang
memberikan pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida paling baik yaitu
dengan mengamati bentuk peak, waktu yang dibutuhkan untuk elusi, menghitung
nilai resolusi dan HETP. Pemisahan yang baik adalah pemisahan dengan bentuk
peak yang simetri (tidak tailing atau fronting), waktu retensi (tR) kurang dari 10
menit, memiliki nilai resolusi ≥ 1,5 terhadap peak terdekat dan nilai HETP yang
semakin kecil.
1. Bentuk peak pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
Bentuk peak yang diharapkan adalah simetri. Sebagai parameternya yaitu
Asymmetry Factor (AF) yang diukur 0,1 dari tinggi peak. Perhitungan AF melalui
persamaan: AF = b/a. Apabila AF = 1 maka peak dikatakan simetri dan pada nilai
AF = 0,95-1,15, peak masih dikatakan baik.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
30
(Willard et al., 1988)
2. Waktu retensi (tR)
Pengamatan waktu dilakukan untuk melihat waktu yang dibutuhkan
untuk pemisahan senyawa. Apabila kurang dari 10 menit, maka pemisahan
dikatakan efisien.
3. Nilai resolusi
Nilai resolusi pemisahan peak dihitung terhadap peak terdekat dengan
rumus sebagai berikut:
Pemisahan yang baik menghasilkan nilai Rs ≥ 1,5.
(Willard et al., 1988)
(8)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
31
4. Nilai HETP
Nilai HETP dapat dihitung dengan rumus sebagai berikut:
(9)
dimana “N” merupakan bilangan lempeng teoritik dengan persamaan sebagai
berikut:
Nilai HETP semakin kecil menandakan efisiensi kolom semakin baik dan
pemisahan juga semakin baik.
(Willard et al., 1988)
5. Reprodusibilitas
Reprodusibilitas resolusi dan waktu retensi diketahui dengan menghitung
nilai %CV dari nilai resolusi dan waktu retensi hasil pemisahan kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida pada baku campuran dan sediaan tetes telinga Colme®.
Perhitungan %CV dengan persamaan sebagai berikut:
Reprodusibilitas yang baik apabila harga CV kurang dari 2% (Mulja dan Hanwar,
2003).
N
LHETPH
(10)
(11)
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
32
BAB IV
HASIL DAN PEMBAHASAN
A. Pemilihan Pelarut
Pemilihan pelarut menjadi sangat penting karena hanya pelarut yang
sesuailah yang dapat melarutkan analit yang akan dianalisis. Syarat utama dari
pelarut yang akan dipilih adalah pelarut yang dapat melarutkan analit.
Berdasarkan Farmakope Indonesia edisi IV, kelarutan kloramfenikol adalah 1:2,5
dalam etanol dan kelarutan lidokain hidroklorida adalah 1:1,5 dalam etanol.
Namun dalam penelitian ini bukan menggunakan etanol, melainkan metanol.
Metanol dipilih karena memiliki viskositas yang lebih rendah daripada etanol
yaitu 0,54 cP, sehingga penggunaan metanol dapat mengurangi tekanan pada
kolom. Metanol yang digunakan merupakan metanol pro analysis karena
memiliki kemurnian yang tinggi sehingga hasil pengukuran lebih akurat. Syarat
pelarut yang baik untuk digunakan pada KCKT adalah murni, inert, dapat
melarutkan analit dan dapat bercampur dengan fase gerak.
B. Pembuatan Fase Gerak
Metode KCKT yang digunakan adalah KCKT fase terbalik dengan fase
diam oktadesilsilan (C18) yang bersifat non polar dan fase gerak yang bersifat
lebih polar yaitu campuran metanol dan aquabides. Sistem yang digunakan adalah
sistem gradien yaitu pencampuran komposisi fase gerak berada di dalam alat
KCKT untuk mendapatkan kepolaran fase gerak yang diinginkan dengan
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
33
mengubah-ubah komposisi fase gerak. Metanol dipilih karena memiliki solubilitas
yang baik untuk garam, hal ini sangat menguntungkan karena pada penelitian ini
menggunakan analit dalam bentuk garam yaitu lidokain hidroklorida. Metanol
juga merupakan pelarut organik yang umum dan sering digunakan pada sistem
KCKT fase terbalik. Selain itu digunakan aquabides untuk mendapatkan indeks
polaritas yang sesuai sehingga dengan komposisi yang tepat pada campuran
metanol dan aquabides akan dihasilkan profil kromatogram yang diinginkan dan
memenuhi syarat. Menurut Kellner et al. (1998), pada metode KCKT fase terbalik
sering kali digunakan solven seperti metanol, asetonitril yang dimodifikasi dengan
air (aquabides). Pemilihan komposisi fase gerak ini juga mengacu pada Sadana
dan Ghogare (1990) yang pernah memisahkan kloramfenikol dan benzokain
dengan campuran metanol dan aquabides dengan perbandingan 35:65.
Komposisi fase gerak yang digunakan pada penelitian ini adalah
metanol:aquabides dengan perbandingan 75:25 ; 85:15; dan 95:5. Menurut Synder
et al. (1997), dengan meningkatnya jumlah metanol pada KCKT fase terbalik
maka analit akan terelusi lebih mudah, sehingga perbandingan kompisisi fase
gerak ini dipilih dengan meningkatkan jumlah metanol secara bertahap. Fase
gerak yang telah dibuat terlebih dahulu disaring dengan penyaring Whatman
untuk menyaring partikel yang dapat menyumbat kolom. Selanjutnya fase gerak
diawaudarakan dengan menggunakan ultrasonicator untuk menghilangkan
gelembung udara yang dapat mengganggu pengukuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
34
Tabel III. Indeks polaritas campuran fase gerak metanol:aquabides
No Komposisi Fase Gerak
Indeks Polaritas Metanol Aquabides
1 75 25 6,375
2 85 15 5,865
3 95 5 5,355
Semakin kecil nilai indeks polaritas berarti semakin non polar fase gerak
tersebut sehingga urutan kepolaran dari yang polar ke non polar adalah 75:25,
85:15, dan 95:5. Menurut Mulja dan Suharman (1995), dalam sistem KCKT fase
terbalik, kemampuan elusi akan semakin meningkat dengan menurunkan indeks
polaritas fase gerak. Komposisi fase gerak tersebut diubah-ubah agar hasil
pemisahan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida memenuhi parameter yang
diinginkan yaitu peak yang runcing dan simetri, memenuhi nilai resolusi, dan
HETP yang semakin kecil.
C. Pembuatan Larutan Baku
Baku kloramfenikol dan lidokain hidroklorida didapatkan dari PT.
Interbat dan memiliki Certificate of Analysis (CoA) sehingga terjamin
kemurniannya. Larutan baku ini dibuat dengan menggunakan pelarut metanol pro
analysis dengan kemurnian 99,85%. Tujuan pembuatan larutan baku yaitu sebagai
pembanding atau reference standard yang dapat digunakan untuk memastikan di
dalam sampel benar-benar terdapat analit yang dimaksud.
Dalam optimasi ini dibuat dua larutan baku masing-masing untuk
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan tiga volume injeksi yang berbeda.
Volume injeksi tersebut dibuat rendah, sedang, dan tinggi yaitu 12; 16; dan 20µL
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
35
dengan mengambil dari konsentrasi stok kloramfenikol 100 ppm dan stok lidokain
hidroklorida 1000 ppm. Selain itu dibuat pula baku campuran untuk
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida yang juga dibuat dalam tiga volume
injeksi yang berbeda dengan konsentrasi masing-masing 100:1000 ppm.
Pada optimasi ini digunakan perbandingan kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida 1:10, perbandingan ini dipilih karena kedua senyawa tersebut dapat
dilihat pada respon yang sama yaitu 500mV. Kandungan kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida yang tertera pada sediaan tetes telinga Colme® masing-
masing adalah 10% dan 4% sehingga perbandingannya adalah 10:4 atau 5:2.
Namun, pada penelitian ini tidak digunakan perbandingan tersebut karena lidokain
hidroklorida dalam metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet
( ) yang kecil yaitu 14,2 sedangkan kloramfenikol dalam metanol memiliki
spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet ( ) yang jauh lebih besar yaitu 297
(Dibbern et al., 2002), sehingga dengan perbandingan 5:2 kloramfenikol memiliki
respon yang sangat besar sedangkan lidokain memiliki respon yang sangat kecil
dan keduanya terpaut jauh maka keduanya sulit dilihat pada respon yang sama.
Alasan tersebut yang mendasari digunakan perbandingan 1:10 karena dengan
perbandingan tersebut kedua senyawa tersebut dapat dilihat di respon yang sama.
Volume injeksi 16 µL sebagai volume tengah yang akan digunakan pada
pengamatan kromatogram dengan komposisi fase gerak 75:25; 85:15; dan 95:5
dan flow rate 0,8; 1,0; dan 1,2 mL/menit. Sedangkan volume injeksi 12; 16; dan
20 µL akan digunakan pada uji reprodusibilitas baku campuran kloramfenikol dan
lidokain hidroklorida dengan komposisi fase gerak yang telah optimum.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
36
D. Penentuan Panjang Gelombang Pengamatan Kloramfenikol dan
Lidokain Hidroklorida dengan Spektrofotometer UV-Vis
Penentuan panjang gelombang pengamatan dilakukan dengan mengukur
panjang gelombang masing-masing senyawa terlebih dahulu. Penentuan panjang
gelombang ini dilakukan dengan menggunakan spektrofotometer ultraviolet-
visibel. Secara teoritis kloramfenikol dan lidokain hidroklorida berada pada
rentang 200-400 nm, oleh karena itu dilakukan pengamatan panjang gelombang
pada daerah tersebut. Penentuan panjang gelombang pengamatan ini dilakukan
dengan mengukur absorbansi kedua senyawa dengan konsentrasi rendah, sedang
dan tinggi yaitu 13; 19,5; dan 26 ppm untuk kloramfenikol dan 300; 450; dan 600
ppm untuk lidokain hidroklorida. Penggunaan tiga seri konsentrasi ini bertujuan
untuk meyakinkan bahwa panjang gelombang pengamatan yang didapatkan
benar-benar berasal dari kloramfenikol dan lidokain hidroklorida. Selain itu, untuk
memastikan bahwa panjang gelombang pengamatan dan bentuk pola spektra yang
didapatkan sama.
Kloramfenikol dan lidokain hidroklorida memiliki gugus kromofor dan
auksokrom sehingga dapat memberikan serapan pada panjang gelombang
ultraviolet. Gugus kromofor bertanggung jawab dalam penyerapan cahaya
ultraviolet dan gugus auksokrom adalah gugus yang melekat pada kromofor yang
berperan dalam pergeseran panjang gelombang dan intensitas serapan maksimum
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
37
Gambar 12. Gugus kromofor dan auksokrom pada kloramfenikol
Gambar 13. Gugus kromofor dan auksokrom pada lidokain hidroklorida
Kurva serapan kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dapat dilihat pada
gambar dibawah ini:
Gambar 14. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 13 ppm (A)
dan lidokain hidroklorida 300 ppm (B)
A
B
. H2O
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
38
Gambar 15. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 19,5 ppm (A)
dan lidokain hidroklorida 450 ppm (B)
Gambar 16. Spektra panjang gelombang maksimum kloramfenikol 26 ppm (A)
dan lidokain hidroklorida 600 ppm (B)
Dari hasil spektra menunjukkan bahwa pada konsentrasi rendah, sedang
dan tinggi, panjang gelombang maksimum kloramfenikol adalah 270 nm dan
lidokain hidroklorida adalah 265 nm dan dihasilkan bentuk pola spektra yang
sama. Menurut Dibbern et al. (2002) panjang gelombang maksimal kloramfenikol
dalam metanol adalah 272 nm. Pergeseran panjang gelombang yang diijinkan
A
A
B
B
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
39
adalah 2 nm (Dirjen POM RI, 1995). Oleh karena itu panjang gelombang
kloramfenikol ini dapat diterima karena bergeser 2 nm dari panjang gelombang
teoritis. Berdasarkan Dibbern et al. (2002) panjang gelombang maksimal lidokain
hidroklorida dalam metanol adalah 263 nm, sehingga panjang gelombang ini juga
dapat diterima karena bergeser 2 nm dari panjang gelombang teoritis.
Berdasarkan pengamatan panjang gelombang maksimum yang ada dapat
diketahui panjang gelombang overlapping kedua senyawa. Titik potong panjang
gelombang kedua senyawa yang didapat adalah 267 nm.
Lidokain hidroklorida dalam metanol memiliki spektrum absorbsi pada
sinar ultraviolet ( ) yang kecil yaitu 14,2 sedangkan kloramfenikol dalam
metanol memiliki spektrum absorbsi pada sinar ultraviolet ( ) yang jauh lebih
besar yaitu 297 (Dibbern et al., 2002). Sehingga, nilai lidokain hidroklorida
yang kecil ini yang membuat lidokain hidroklorida lebih sukar terdeteksi daripada
kloramfenikol. Pada maks lidokain hidroklorida, serapan kloramfenikol masih
cukup tinggi, sedangkan serapan lidokain hidroklorida menjadi rendah pada
maks kloramfenikol. Hal ini yang mendasari pemilihan panjang gelombang
pengamatan yang digunakan dalam pemisahan kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida adalah 265 nm yang merupakan panjang gelombang lidokain
hidroklorida, hal ini bertujuan agar kedua senyawa tersebut dapat memberikan
serapan optimum.
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
40
E. Optimasi Kloramfenikol dan Lidokain Hidroklorida dengan Metode
KCKT Fase Terbalik
Optimasi dengan metode KCKT fase terbalik dilakukan dengan
mengubah-ubah komposisi fase gerak dan flow rate untuk didapatkan pemisahan
yang baik antara kloramfenikol dan lidokain hidroklorida. Komposisi fase gerak
yang digunakan yaitu 75:25; 85;15; dan 95:5 dengan flow rate 0,8; 1,0; dan 1,2
mL/menit.
Berikut merupakan waktu retensi yang diperoleh dari kloramfenikol,
lidokain hidroklorida, dan baku campuran kloramfenikol dan lidokain
hidroklorida pada masing-masing komposisi fase gerak dan flow rate yang
berbeda.
Tabel IV. Waktu retensi baku kloramfenikol, baku lidokain hidroklorida dan baku
campuran kloramfenikol dan lidokain hidroklorida
Komposisi fase gerak Analit
Waktu Retensi (tR)
(menit)
Metanol Aquabides
0,8
(mL/min)
1,0
(mL/min)
1,2
(mL/min)
75 25
Kloramfenikol 3,703 2,919 2,475
Lidokain
Hidroklorida 8,409 6,868 5,653
85 15
Kloramfenikol 3,387 2,534 2,303
Lidokain
Hidroklorida 5,463 4,052 3,690
95 5
Kloramfenikol 3,173 2,527 2,158
Lidokain
Hidroklorida 4,096 3,308 2,956
Baku Campuran
(Kloramfenikol)
-
2,532 2,141
Baku Campuran
(Lidokain
Hidroklorida)
3,306 2,805
Dari masing-masing komposisi fase gerak tersebut menunjukkan bahwa
dengan semakin meningkatnya metanol maka waktu retensi menjadi semakin
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
41
pendek atau singkat dan semakin meningkatnya flow rate pada masing-masing
komposisi fase gerak juga menunjukkan waktu retensi yang semakin pendek.
Struktur kloramfenikol dan lidokain hidroklorida memiliki gugus polar
dan non polar yang dapat berinteraksi dengan fase diam (oktadesilsilan) dan fase
gerak (campuran metanol dan aquabides). Gugus non polar akan berinteraksi
dengan fase diam melalui ikatan Van Der Waals sedangkan gugus polar akan
berinteraksi dengan fase gerak melalui interaksi hidrogen. Berikut interaksi
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan fase gerak dan fase diam:
Si
CH3
H3C
O
H3C
Interaksi Van Der Waals
Oktadesilsilan (C18)
N
H OH
H
H2C O H
NH
C
O
CHCl2O
o
Gambar 17. Interaksi kloramfenikol dengan fase diam C18 (oktadesilsilan) melalui
interaksi Van Der Waals
Si
CH3
H3C
O
H3C
CH3
HN
CH3
C
O
H2C NH
C2H5
C2H5
Cl
Interaksi Van Der Waals
Oktadesilsilan (C18)
Interaksi ion-dipol
Gambar 18. Interaksi lidokain hidroklorida dengan fase diam C18 (oktadesilsilan)
melalui interaksi Van Der Waals dan interaksi ion-dipol
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
42
Gambar 19. Interaksi hidrogen antara kloramfenikol dengan fase gerak
metanol:aquabides
CH3
N
CH3
C
O
H2C NH
C2H5
C2H5H
O
H
H
H
OCH3H
O
H OCH3
H
Cl
Gambar 20. Interaksi hidrogen antara lidokain hidroklorida dengan fase gerak
metanol:aquabides
Gambar di atas menunjukkan bahwa interaksi kloramfenikol dengan fase
diam lebih sedikit dibandingkan interaksi lidokain hidroklorida dengan fase diam
oktadesilsilan. Oleh karena itu, kekuatan ikatan kloramfenikol pada fase diam
lebih lemah sehingga waktu retensinya lebih pendek atau lebih cepat
dibandingkan lidokain hidroklorida. Dengan adanya fase gerak yaitu campuran
metanol dan aquabides akan berfungsi untuk membawa analit untuk keluar dari
PLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJIPLAGIAT MERUPAKAN TINDAKAN TIDAK TERPUJI
-
43
kolom. Semakin banyak jumlah interaksi hidrogen antara solut dengan fase gerak
maka solut akan lebih mudah dibawa oleh fase gerak melewati kolom (terelusi)
sehingga waktu retensinya akan semakin singkat dan sebaliknya.
Pada komposisi metanol:aquabides 75:25 menunjukkan waktu retensi
yang paling lama baik untuk kloramfenikol maupun lidokain hidroklorida. Hal ini
dikarenakan jumlah metanol yang ada pada komposisi fase gerak tersebut lebih
sedikit sehingga kemampuan untuk membawa analit lebih rendah dibandingkan
komposisi metanol:aquabides 85:15 dan 95:5. Oleh karena itu, interaksi
kloramfenikol dan lidokain hidroklorida dengan fase diam lebih kuat sehingga
akan lebih tertahan pada fase diam maka waktu retensi menjadi lebih lama.
Berbeda halnya pada komposisi metanol:aquabides 85:15 yang memiliki jumlah
metanol yang lebih banyak sehingga waktu