Nouvelle méthode de monitoring Nouvelle méthode de monitoring in situ in situ du du phytoplancton : phytoplancton :
Analyse automatisée, à haute fréquence et à l’échelle Analyse automatisée, à haute fréquence et à l’échelle individuelle des cellulesindividuelle des cellules
M. Thyssen, G.Grégori, A. Malkassian & M. Denis
Laboratoire LMGEM, Centre d’Océanologie de Marseille (OSU) Université de la Méditerranée
Campus de Luminy, Marseille
Atelier Haute Fréquence, 22-23 octobre 2009 (Wimereux)Atelier Haute Fréquence, 22-23 octobre 2009 (Wimereux)
Importance des microorganismes marinsImportance des microorganismes marinsImportance des microorganismes marinsImportance des microorganismes marins
Le phytoplancton:• Principal producteur de matière organique• Phytoplancton = premier élément du
réseau trophique (entrée du C dans le réseau)
• Cycles rapides (jusqu’à plusieurs divisions par jour)
• Sensibilité aux variations environnementales biotiques (prédation, lyse virale) et abiotiques (hydrologie, vent)
• Réponse plus rapide à ces changements
- Groupe polyphylétique très diversifié (>15 000 espèces)
- Principalement des organismes photosynthétiques unicellulaires (<1 à ~ 2 000 µm)
- Flottent dans la couche euphotique
Flux biogéochimiques : Flux biogéochimiques : fonction de la structure de la communautéfonction de la structure de la communauté
Prise de conscience du rôle des microorganismesPrise de conscience du rôle des microorganismes
www.soes.soton.ac.uk
www.jochemnet.de
Toxicité de certaines espècesToxicité de certaines espècesToxicité de certaines espècesToxicité de certaines espèces
© European Communities, 1995-2003
Le problème de l’échantillonnageLe problème de l’échantillonnage
• Nécessité d’un suivi des populations• Compréhension de leurs dynamiques à des échelles de temps et d’espace adéquates.
Approche par analyse individuelle et haute fréquence temporelle
Neither qualitative nor quantitative surveys generally sample the
phytoplankton adequately (Smayda, 1998, Baretta et
al., 1998)
Méthodologie pour étudier le phytoplancton à l’échelle Méthodologie pour étudier le phytoplancton à l’échelle individuelle des cellules (méthode non destructrice)individuelle des cellules (méthode non destructrice)
Echantillonnage
Analyse traditionnelle
Analyse par cytométrie en flux
Principe de la cytométrie en fluxPrincipe de la cytométrie en fluxPrincipe de la cytométrie en fluxPrincipe de la cytométrie en flux
•particules en suspension
•flux monodisperse
•interception par un faisceau laser.
•La diffusion de la lumière et les émissions de fluorescence sont collectées, filtrées et
•converties en valeurs digitales enregistrées sur un PC.
FluidiqueFluidique
OptiqueOptique
ElectroniqueElectronique
Analyse du phytoplancton Analyse du phytoplancton (taille <10 micron)(taille <10 micron)
Analyse du phytoplancton Analyse du phytoplancton (taille <10 micron)(taille <10 micron)
Fluo. verte (ua)Diffusion 90°(ua)
Flu
o.
rou
ge
(ua)
Prochlorococcus
picoeucaryotes
Synechococcus
picoeucaryotes Synechococcus
Billes de calibrage
nanoeucaryotes• 6-10 microns • 3-6 microns
Analyse ataxonomique
Pourquoi la cytométrie en flux devient Pourquoi la cytométrie en flux devient populaire chez les microbiologistes?populaire chez les microbiologistes?
Pourquoi la cytométrie en flux devient Pourquoi la cytométrie en flux devient populaire chez les microbiologistes?populaire chez les microbiologistes?
• Analyses rapides (plusieurs dizaines de milliers de cellules analysées par seconde)
Permet d’analyser un grand nombre de cellules Résultats statistiques robustes et représentatifs
• Analyse multiparamétrique à l’échelle individuelle
• Données quantitatives (corrélation avec d’autres données biochimiques)
• Mesures en temps réel
• Classes de taille et abondance cellulaire
• Marqueurs uniques: - naturels (chlorophylle, autres pigments autofluorescents) - induits (coloration) fluorochromes (sondes)
• Tri (post-analyses, cultures)
Plateforme régionale de cytométrie pour la microbiologie Plateforme régionale de cytométrie pour la microbiologie (PRéCyM) du COM (2005)(PRéCyM) du COM (2005)
Qu’est-ce qu’une plateforme?Qu’est-ce qu’une plateforme?
- Centralisation d’équipements et d’un savoir faire à disposition des unités/instituts, des domaines public et privé,
- Exploitation technique, économique et scientifique optimale des appareils,
- Développement et veille technologique, valorisation de la recherche, formation.
<<< Plateforme animée par un comité de gestion (mise en place en 2005) >>>Contacts : [email protected] et [email protected]
http://precym.com.univ-mrs.fr
EquipementEquipement
2 analyseurs (paillasse) 2 trieurs dont un embarquable 1 analyseur in situ
Cytosub (Cytobuoy) : un cytomètre en flux Cytosub (Cytobuoy) : un cytomètre en flux
dédié à l’analyse autonome dédié à l’analyse autonome et et in situin situ du phytoplancton. du phytoplancton.
•Analyse in situ jusqu’à 200 m. de profondeur
•Fréquence d’échantillonnage maximale toute les 10 min.
•Durée d’immersion possible de plusieurs semaines
- Deux variables dites de diffusion des photons du laser :+ Aux petits angles (FWS : forward scatter) Taille des particules. + A 90° (SWS : sideward scatter) Morphologie de la cellule (forme,
granularité, paroi cellulaire, composition interne,...).
- Trois variables d’émission de fluorescence (autofluorescence):
+ Rouge centrée sur 734-668nm carotène et chlorophylle a.+ Orange centrée sur 601-668nm phycobilines (spécifiques aux
Cyanobactéries et Cryptophytes)+ Jaune centrée sur 536-601nm phycoérythrine.
- Profil des signaux le long des particules (signature optique du phytoplancton)
- Module de prise d’image (module Image in flow)
Variables mesurées par le CytosubVariables mesurées par le Cytosub
Temps
Flux
FaisceauLaser
Chambre en Quartz
Fluide
Intensité du Signal
Acquisition de Acquisition de donnéesdonnées
Exemples de donnéesExemples de données
Exemples de donnéesExemples de données
Exemples de données sur des chaînesExemples de données sur des chaînes
De la particule détectée De la particule détectée in situ in situ à la cellule identifiéeà la cellule identifiée
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1 100 10000 1000000
Flu
ores
cenc
e ro
uge
(ua)
Taille (ua)
…à la particule …De l’échantillon naturel …
… à la cellule
Travaux de thèse de Mélilotus THYSSEN
Diversité du phytoplancton étudiée cellule par cellule sur la base de leurs propriétés optiques (diffusion, fluorescence)
Analyse in situ = pas de modifications du système étudiéAnalyse individuelle des cellules = diversité et physiologie
Diversité des types cellulaires est variable en fonction des conditions environnementales Notion de groupe fonctionnel de réponse
Thyssen et al., 2008a, J. Plank. Res.
0.001
0.01
0.1
1
10
100
1 100 10000 1000000
Fluorescence rouge (u.a.)
Diffusion (u.a.)
Type cellulaire 2
Phytoplankton spatial and temporal high frequency analysis using automated and submersible flow cytometry
Type cellulaire 3
Type cellulaire 1
Point fixe côtier Méditerranée. Fréquence d’analyse 30 min. Données in situ.
Travaux de thèse 2/ L’hétérogénéité temporelle
L’observation à haute fréquence donne une estimation réaliste de la variation de leur biomasse, donc des flux de matière
02 07 12 Jours
103
cells
.cm
-3
010
2030
40
Jours
µg
chl a
.dm
3
01
23
45
6
02 07 1202 07 12 Jours
103
cells
.cm
-3
010
2030
40
Biomasse globale (fluorimétrie)Sur- sous estimation liées aux facteurs de conversion C/Chl
Si échantillonnage classique: sur ou sous estimation de la variation de la biomasse
Exemple de deux types phytoplanctoniques
Thyssen et al. 2008b, J. Plankt. Res.
17 h
8 h
14 000 échantillons!
Hétérogénéité en fonction:- du régime de vent,- du rapport N/P
Travaux de thèse 3/ L’hétérogénéité spatiale
Déconvolution entre cause interne (cycle cellulaire) ou
externe (hydrodynamisme) de la variation des abondances
Thyssen et al. 2008, BiogeosciencesThyssen et al. 2005, J. Geophy. Res.
ajustement des algorithmes de calcul de la biomasse autotrophe á
partir des images satellites avec des données in situ de même résolution
(1-2 km)
Projet ACYPHAR - radiale Açores - Lorient, Atl. Nord Est. Résolution ~2 km.Prélèvement automatisé des eaux de surface par cytométrie en flux
Chlorophylle de surface par téledétection Ex. de deux types phytoplanctoniques
Denis & Thyssen 2007. Quand océanologie et réinsertion sociale se concertent. Journal de l’INSU
Pour chaque type cellulaire et grâce à l’observation à haute fréquence
Temps t
010
2030
40
02 07 12
103
cells
.cm
-3Taux journalier de croissance et de
décroissance apparente
Production Nette = Δ Biomasse / Δt
Abo
ndan
ce
(Bio
mas
se)
Détermination de la production nette grâce à la haute fréquence Estimation adéquate de la variation des stocks de matière particulaire biogène
Travaux de thèse 4/ Détermination de la production communautaire nette
Nouvelle thèse sur l’Etang marin de BerreNouvelle thèse sur l’Etang marin de Berre
FRANC E
Berre
M arignane
M artigues
St C h am a s h yd ro e le ctricp ow e r s ta tion
(Figures David Nérini)
Particularités : - Forte stratification haline- Arrivées soudaines et massives d’eau douce (Centrale EDF)- Vent (Mistral) homogénéisation- Episodes d’eutrophie (anoxie)
- Un des plus grands étangs marins de Méditerranée.- Proche de l’agglomération Marseillaise, - Soumis à de fortes pressions d’origine anthropique (rejets d’eau douce de la centrale EDF, activités industrielles, forte population sur son bassin versant, etc.).
Très fort intérêt pour la Région
Etang sous haute surveillanceEtang sous haute surveillance
+ Hydrologie : -Température, - Salinité, - Turbidité, - Oxygène Dissous Données horairesDonnées horaires 5 niveaux de la colonne d’eau + Courantologie (XSurvey)
+ Chimie (Sels nutritifs…)
+ Météorologie
+ Biologie : - « gros » phytoplancton - algues et phanérogames - zooplancton - poissons
Et les micro-organismes dans tout ça?Et les micro-organismes dans tout ça?
Carte bathymétriquede l'Etang de Berre
Station automatique de prélèvements
Automatisation du traitement des Automatisation du traitement des données issues du Cytosubdonnées issues du Cytosub
• Problème : Discriminer des groupes sur la base de leur signature optique.
• Hypothèse : Information discriminante dans la forme que prennent les profils.
(Malkassian et al. En préparation)
• Description (Qui est là? Et quand?):– Caractériser spatialement et temporellement les composantes de
l’assemblage microbien en relation avec l’environnement biotique et abiotique
- d’après leurs propriétés optiques de diffusion et de fluorescence,- par analyse d’image (automatisée).
– Etudier les abondances avant, pendant et après les forçages :– Vent (Mistral) Rupture de la stratification haline – Apport d’eau de mer (passe de Caronte) Espèces marines– Apport soudain et massif d’eau douce (Centrale
hydroélectrique de Saint-Chamas) Espèces dulçaquicoles
Pourquoi ce sujet ? [Intérêt scientifique]Pourquoi ce sujet ? [Intérêt scientifique]
• Dynamique (Qui varie comment?)- Réponse des assemblages microbiens aux changements environnementaux biotiques et abiotiques (notions de groupes fonctionnels)- Modélisation
ConclusionConclusion
Cytométrie en flux autonome in situ:– Permettra de réaliser un suivi à haute fréquence et à l’échelle individuelle des
assemblages phytoplanctoniques.– Analyse réalisée grâce a un instrument immergé autonome permet de
s’affranchir de l’opérateur et des sorties en bateau dépendantes de la météorologie
– Ce système garantit des séries de données à haute fréquence, et continues (peu ou pas de données manquantes).
Appréhender la dynamique de l’écosystème suite à une perturbation soudaine (fort vent, apport massif d’eau douce, rupture de la stratification haline, etc.)
Répondre aux questions posées (cas de l’Etang de Berre par exemple)------------------------------------------------------------------------------------------------ Finalité de l’approche : le domaine marin côtier et ouvert (stations fixes et navires
d’opportunité (Méthaniers? Ferries? Portes-conteneurs?)- Etendre l’approche aux « bactéries » (AO INSU-CSOA & CETSM)
Observation = Constitution d’une base de données unique sur le phytoplancton en Mer Méditerranée
L’équipeL’équipe
• Michel DENIS (DR émérite CNRS)• Mélilotus THYSSEN (Post-doctorante)
• Anthony MALKASSIAN (Doctorant 2009)• Zhao LI (Doctorante 2009)
Ainsi que :
• Aude BARANI (plate-forme PRECYM)• Beatriz BECKER (identification du phytoplanton)• Nicole GARCIA (analyses sels nutritifs)• David NERINI (MCF, Statistiques)• Patrick RAIMBAULT (SO du COM)