PHYSIQUE CELLULAIREIntroduction à la Neurobiologie
-2-Potentiel d’action et canaux ioniques
Jean-Pierre HENRY 18 Février 2010
Canaux ioniques:du macroscopique à l’atomique
• Le potentiel d’action:Hodgkin et Huxley, Prix Nobel 1963
• Les canaux ioniquesNeher et Sakman, Prix Nobel 1991
• La structure des canaux ioniquesMacKinnon, Prix Nobel 2003
Canaux ioniques:du macroscopique à l’atomique
• Le potentiel d’action:Hodgkin et Huxley, Prix Nobel 1963
Travaux commencés à Cambridge en 1930et publiés en 1952
Andrew Huxley est le demi-frère d’AldousHuxley (Le meilleur des mondes)
• Les canaux ioniquesNeher et Sakman, Prix Nobel 1991
• La structure des canaux ioniquesMacKinnon, Prix Nobel 2003
Un matériel d’étude privilégié:l’axone de calmar
• Le calmar possède une axonegéant impliqué dans le réflexede fuite
• Le diamètre est de 0,5 mm• Plus le diamètre est grand, plus
la conduction de l’influx estrapide
La préparation utilisée• A l’aide d’un rouleau en
caoutchouc, on peutextruder le milieuintracellulaire, puisperfuser avec un milieusalin
• On peut introduire uneélectrode dans leneurone; la préparationest équipotentielle (pasde propagation)
• Par dépolarisation, onobtient des centainesde potentiels d’action,identiques à ceux duneurone initial
(Kuffler et Nicholls (1976)
Origine du potentiel de repos
385A-
-6056052Cl-+5544050Na+
-7520400K+
mVmMmM
PotentieldeNernst
Milieuexterne
CytoplasmeIon
•Le potentiel de repos (Vi - Vo) est de - 70 mV, voisin du potentiel deNernst de K+
•Le potentiel de repos est fixé par la perméabilité aux ions de lamembrane•La perméabilité à K+ est dominante
Origine du potentiel de repos
• Si on varie laconcentration de K+
extracellulaire, le potentielde repos varie
• Mais il s’écarte de la loi deNernst à bassesconcentrations
Origine du potentiel de repos• La membrane n’est pas seulement perméable à K+
• Il y a un courant entrant faible, associé à une faibleperméabilité à Na+
• A l’équilibre, le courant sortant I K+ est égal aucourant entrant I Na+
• Les ions Cl- se répartissent en fonction du potentielcréé par les cations
• Le potentiel réel est donné par l’équation deGoldman, Hodgkin et Katz! !
!
E = 59logPk Ko[ ] + PNa Nao[ ] + PCl Cli[ ]Pk Ki[ ] + PNa Nai[ ] + PCl Clo[ ]
La pompe à sodium
• L’existence de courants INa+ et IK+ impose la présence d’unepompe
• Dans la membrane, une ATPase utilise l’ATP intracellulaire pourexpulser 3 ions Na+
• La deuxième partie du cycle est le pompage de 2 ions K+
• La pompe polarise négativement l’intérieur de la cellule• Il n’y a jamais de correspondance intérieur:extérieur
La pompe à sodium
• Son activité est nécessaire pour maintenir les cellulesà un potentiel négatif
• Elle est présente dans toutes les cellules, nerveusesou non
• Son inhibition conduit à la mort cellulaire• Des substances végétales sont des inhibiteurs de la
pompe: ouabaïne et digitaline• Ces poisons ont été utilisés à petites doses comme
stimulants cardiaques• Le « découvreur » de la Na,K ATPase, JC Skou a
reçu le Prix Nobel en 1997
Le potentiel d’action:hypothèse de base (1)
• Un potentiel d’action estobtenu par dépolarisation
• Au delà d’un seuil, lepotentiel monte rapidement àdes valeurs positives, puisdiminue
• Les valeurs atteintes sontproches du potentiel deNernst de Na+
• On peut faire l’hypothèsed’une augmentation de laperméabilité au Na+, induitepar la dépolarisation (B)
Le potentiel d’action:hypothèse de base (2)
• L’augmentation de laperméabilité à Na+ induit uncourant entrant
• Ce courant entrant augmentela dépolarisation
• En C, un deuxièmeévénement augmente laperméabilité relative au K+ etpermet la restauration desconditions initiales
• Ceci nécessite que lesgradients ioniques ont étépeu modifiés pendant lepotentiel d’action
Circuit électrique équivalent à un élémentde membrane
• Les perméabilités sontéquivalentes à un générateur(gradient ionique) et uneconductance en série
• La membrane a une capacitéC
• Vm est le potentielmembranaire
• Les conductances gK et gNasont variables avec lepotentiel Vm
Formulation électrique du potentield’action
• Les éléments de basesont:
• Une augmentationexplosive de laconductance Na+
• Une augmentationdécalée de laconductance K+
Mesures expérimentales:le voltage-clamp
• La difficulté vient du lienentre conductance etpotentiel
• On impose un potentiel etun amplificateur mesure ladifférence entre ce potentielet Vm
• Il injecte un courant pourque cette différencedisparaisse
(Hodgkin et al(1952) JPhysiol,116, 424)
Les résultats (1)
• On dépolarise depuis- 65 mV de 56 mV
• On observe 3 phases• Courant capacitatif
rapide• Courant entrant
transient• Courant sortant
retardé
Les résultats (2)
• La même expérience (A)est faite en supprimant lesions Na+ dans le milieuextérieur
• Le courant entrant estsupprimé et seul subsiste lecourant K+ (B)
• Par différence, on obtient lecourant Na+ (C )
Les toxines, des outils pharmacologiquesprécieux
• Le Fugu (tétrodon) est un poissonconsommé au Japon
• Mal préparé, il est mortel (plusieursdizaines des cas/an)
• Il contient une toxine,tétrodotoxine, bloquant les canauxNa+
Séparation pharmacologique
• Courants obtenus pardépolarisations à différentesvaleurs
• A, courants complexes• B, traitement par la
tétrodotoxine: seuls les courantssortants (K+) sont visibles
• C, Lavage• D, traitement par le TEA, un
bloquant des canaux Na+
Exploitation des résultats
• Les conductances Na+ et K+
ont été mesurées à toutevaleur du potentiel imposé
• On remarque quel’augmentation de laconductance Na+ esttransitoire: elle est suivied’une inactivation
• Des équations empiriquesdécrivant ces comportementsont été établies
Exploitation des résultats
• A partir des équations empiriques, il est possible de retrouverla forme du potentiel d’action avec une bonne exactitude
Le Modèle Hodgkin-Huxley décrit bien lepotentiel d’action
• L’existence d’un seuil critique correspond au point oùles courants entrants l’emportent sur les courantssortants
• L’existence d’une valeur maximale correspond àl’ouverture différée des canaux K+
• Après un potentiel d’action, il y a une périoderéfractaire où une dépolarisation est inefficace
• Cette période réfractaire est due à la conductance gKtoujours ouverte
Propagation du potentiel d’action
• Les charges positivesentrantes (Na+) déchargentla capacité membranaire, depart et d’autre
• Cela induit unedépolarisation qui au seuilamorce le potentiel d’action
• Propagation dans les deuxsens
Vitesse de propagation
• Elle dépend des propriétés de cable de l’axone:résistances axiale et membranaire, capacité de lamembrane
• La vitesse augmente si le diamètre augmente(diminution de la résistance axiale)
• La vitesse de propagation varie de 1 à 100 m/s.• Les vitesses élevées s’observent dans les neurones
de fort diamètre• Dans les neurones myélinisés, l’axone est « isolé » et
la conduction est rapide et saltatoire.
Neurone myélinisé
• Une cellule, dite gliale,s’enroule autour de l’axone
• Cette cellule a unemembrane riche en uneprotéine hydrophobe, lamyéline
• Le long de l’axone la gainede myéline s’interrompt àdes points réguliers, lesnœuds de Ranvier
Conduction saltatoire
• La gaine de myeline agit comme un isolant limitant lesmouvements de charge
• La dépolarisation progresse par saut jusqu’auxnœuds de Ranvier où le potentiel d’action apparait
Conclusions
• Les potentiels de repos sont dus à:– l’existence de gradients ioniques et pompes– des différences de perméabilité entre les ions
• Le potentiel d’action est dû à:– La variation de conductance/perméabilité avec le potentiel– Na+ et K+ sont des « canaux excitables »
• La conductance Na+ augmente avec la dépolarisationet s’inactive très rapidement
• La conductance K+ augmente avec la dépolarisation• La théorie de Hodgkin-Huxley ne préjuge pas des
mécanismes: transporteurs ou canaux
Canaux ioniques:du macroscopique à l’atomique
• Le potentiel d’action:Hodgkin et Huxley, Prix Nobel 1963
• Les canaux ioniquesNeher et Sakman, Prix Nobel 1991
• La structure des canaux ioniquesMacKinnon, Prix Nobel 2003
Un exemple de transport d’ion partransporteur: la valinomycine
• La valinomycine est un peptide cyclique extrait de champignons• Sa couronne (résidus hydrophobes) lui permet de s’insérer dans
une bicouche• Les radicaux cabonyl chélatent spécifiquement un ion K+• La vitesse de passage est de l’ordre de 104 ions/s
Val Val
Val-K+ Val-K
+
K+
membrane
K+
Valinomycin
O
O O
O O
Hydrophobic
O
K+
Le « patch-clamp » permet de mesurerl’activité d’un canal unique
• Le principe est d’isoler àl’extrémité d’une micropipetteun fragment de membraneportant des canaux ioniques
• Plusieurs solutions existent• Le scellement entre la
membrane cellulaire et lapipette a une résistance del’ordre du Gigaohm
• On mesure le courantpassant à travers le fragmentmembranaire à V constant
(Hamill et al (1981) Pfugers Arch,391, 85)
Exemples d’enregistrement de canauxuniques
• On observe des transitions entre 2 niveaux, représentant lecanal ouvert ou fermé (en D, canal double)
• A et B sont des canaux K+, C un canal Na+ et D un canal Cl-
Exploitation des donnéesexemple d’un canal dimérique
• Tracé à différents potentiels• Mesure de la conductance• Mesure de la probabilité
des états en fonction dupotentiel imposé
(Thieffry et al (1988) EMBO J,7, 1449)
Canal Na+ de l’axone de calmar
• En haut, canaux unitaires enréponse à une dépolarisation
• Remarquez l’inactivation rapide• En bas, les enregistrements
d’une centaine de canaux ontété moyennés
• L’enregistrement moyennécorrespond au courant entrantobservé macroscopiquement
• Un courant de 1 pA correspondà 6 x 106 ions/s
Canal K+ de l’axone de calmar
• En haut, enregistrement decanaux individuels
• En bas, moyennage d’unecentaine de canaux,analogue au courantmacroscopique
• On n’observe pasd’inactivation dans l’échellede temps observée
• Remarquez l’ouverture lentedu courant moyenné
Conductance des canaux Na+
• Les mesures permettent d’obtenir la conductance ducanal et sa densité surfacique
• D’autres canaux Na+ ont été analysés• Pour le canal K+ de neurone de calmar, γ = 6 pS avec
une densité de 70
Sélectivité des canaux Na+
• La perméabilité relativepar rapport au Na+ a étémesurée pour unensemble d’ions pour lesdifférents canaux
• D’une manière générale,la sélectivité est voisinede 20
• Pour les canaux K+, lasélectivité est de 100
Questions et réponses
• L’étude des canaux uniques permet de retrouver lespropriétés macroscopiques (activation par lepotentiel, inhibition, sélectivité)
• Comment expliquer l’efficacité du transfert (voisin deslimites de la diffusion) et la grande sélectivité?
• Les différents canaux Na+ et surtout K+(plusieursdizaines, avec des propriétés différentes)correspondent-ils à des espèces moléculairesdifférentes?
• Nécessité de caractériser biochimiquement lescanaux
Clonage des canaux Na+ et K+:Isolement des gènes et production de la protéine
• Canal Na+:– Purification de la protéine à l’aide des toxines (TTX)– Isolement du gène chez la torpille (laboratoire de Shosaku
Numa, 1984)
• Canal K+:– Analyse de mutants chez la drosophile– Le mutant shaker correspond à un canal K+ (laboratoire de
Jan,1987)
Le canal Na+ (sous-unité α)
• Une très grosse chaîne polypeptidique (plus de 2000résidus)
• Nombreuses traversées de la membrane cellulaire (24)• Un domaine répété 4 fois, contenant 6 hélices trans-
membranaires
Les canaux K+
• La canal shaker possède 6hélices transmembranaires
• Les 6 hélices sont organiséescomme un domaine du canal Na
• Le canal K est composé de 4sous-unités identiques
• D’autres canaux K ont 2, 3, 4, 5hélices dans leurs sous-unités
• Les 2 hélices blanches (5 et 6)représentent la structureminimum des canaux de cettefamille (sensible au potentiel)
La famille des canaux sensible aupotentiel
• Plus de 140 membres (Yu et al, 2005, PharmacolRev, 57, 387)
Propriétés moléculaires des canauxexcitables
• Les canaux appartiennent à une même grandefamille
• La structure minimale est composée de 4 sous-unitéscomportant chacune 2 hélices trans-membranaire
• Le canal Na est vraisemblablement plus jeune,résultant d’une fusion de gènes
• Tous les canaux K possèdent une séquencecommune de 8 acides aminés, placée entre leshélices 5 et 6: c’est la signature des canaux K
Propriétés fonctionnelles des protéinesrecombinantes
• Le « truc » le plus populaire estd’introduire le « gène » (ARN)dans un ovocyte de grenouille(Xenopus)
• Cette cellule exprime la protéine(canal) dans sa membrane
• On peut alors mesurer l’activitéélectrique par « patch-clamp »ou « voltage-clamp »
• Le gène peut être manipulé pourtester des protéines mutantes ouchimérique
• Par exemple, le changementd’un acide aminé donne un canalNa résistant à la TTX
Canaux ioniques:du macroscopique à l’atomique
• Le potentiel d’action:Hodgkin et Huxley, Prix Nobel 1963
• Les canaux ioniquesNeher et Sakman, Prix Nobel 1991
• La structure des canaux ioniquesMacKinnon, Prix Nobel 2003
Roderick MacKinnon
• Initialement formé comme électrophysiologiste,MacKinnon, après 10 ans de recherche, décide à 42ans, sans expérience de s’intéresser à la structureatomique des canaux K, avec une petite équipe
• Chez les bactéries, des protéines membranairesportent la signature des canaux K.
• Il entreprend la cristallisation du canal KcsA, deStreptomyces lividans, dont la sous-unité necomporte que 2 segment trans-membranaires
L’hypothèse initiale
• D’après des expériences demutagénèse faites sur lecanal à 6 segments trans-membranaires, la boucleentre les segments 5 et 6 estimportante pour la sélectivité
• Cette boucle serait repliée àl’intérieur du pore
Structure atomique de KcsA
• Le canal est vu de côté, lamembrane est coupée
• Seules les hélices 6(extérieure) et 5 (intérieure)de 2 sous-unités sontmontrées
• Les densités dans l’axe sontdes ions K+
• Le canal est fermé; letroisième K+ est dans unecavité centrale
(Doyle et al, 1998, Science,280, 69)
Extérieur de la cellule
Cytoplasme
Le problème de la sélectivité est résolu
• Analyse plus fine des cations dansla protéine
• 4 cations deshydratés sont visiblesà l’intérieur du canal
• Un cinquième est rehydraté dans lacavité
• La deshydratation est possible carles 4 ions sont coordinés à descarbonyl de la protéine
• La coordination du Na+ deshydratéest impossible
• Le Na+, bien que plus petit, nepasse pas
(Zhou and MacKinnon, 2004, Biochemistry,338, 839)
Vue du canal en coupe: extérieur
Structure d’un canal K+ bactérien ouvert
• Canal de Methanobacterthermoautotrophicum (MthK)
• A, MthK, Transmembranaires 5 et6 de deux sous-unités; le canalouvert est au milieu
• B, KcsA : même échelle, le canalest fermé
• C, Superposition de A et B: lafermeture est due à undéplacement de la partiecytosolique de l’hélice6
• D, vue du dessus; le canal est lapartie centrale
A C
B D
(Jiang et al, 2002,Nature,417, 523)
Le canal ouvert possède une cavitécentrale importante
• Le canal MthK est vu depuisle cytoplasme
• Le point vert est un ion K+
engagé dans le filtre desélectivité
• La cavité peut accueillir desmolécules de grande taille
• Ces molécules sont desbloquants
Potentiel électrique à travers lamembrane
• Le potentiel électrique a étécalculé pour KcsA (fermé) etMthK (ouvert)
• L’ouverture du canal diminueénormément la dépenseénergétique requise pour lefranchissement de lamembrane
Conclusion sur les canaux à 2 hélices:sélectivité et perméabilité
• 1- la cavité du canal ouvertdiminue l’épaisseur hydrophobeà franchir
• 3- la disposition des O descarbonyl permet unecomplexation sélective de K+
• 4- plusieurs ions en lignepeuvent occuper le filtre desélectivité
• 2- les charges négatives àl’extrémité de l’hélice stabilise lecation dans la cavité
Le problème de la sensibilité au potentiel
• Les canaux K+ sont sensibles au potentiel: ilspassent de fermés à ouverts en 50 mV
• Cela suppose un senseur de potentiel très chargé: aumoins 12 charges positives par canal
• Les canaux à 4 x 2 hélices sont insensibles• L’hélice 4 porte au moins 4 charges (Arg) selon le
type de canal: c’est un candidat senseur• En fait, les hélices 1 à 4 sont structuralement
indépendantes de 5 et 6 (pore)• On peut faire des chimères en échangeant ces 2
parties
Structure d’un canal K+ à 6 hélicestransmembranaires
• Ce canal est une chimèreentre deux canaux deneurones de rat
• Vue en coupe: le pore estdans la partie centrale
• Les charges positives(portées principalement parl’hélice 4) sont en rouge
• Les domaines H1 à H4 etH5H6 sont clairementindépendants
(Long et al, 2007, Nature, 450, 376)
Extérieur
Intérieur
Modèle de sensibilité au potentiel
• La structure obtenue est uncanal ouvert (a et c), b et dreprésentent la structurefermée hypothétique
• On postule un basculementde S4, portant les chargespositives
• Le mouvement transmis parl’hélice jaune appuie surl’hélice bleue S6 qui decoudée devient droite
• Le mouvement de S6 fermele pore
Résumé de la potentiel-dépendance
• Le modèle est en pagaïe (paddle): la pagaïe est l’hélice S4qui passe d’un côté à l’autre de la membrane; cemouvement est transmis au pore qui se ferme
• Le canal a les propriétés d’un transistor (F. Sigworth)