AVERTISSEMENT
Ce document est le fruit d'un long travail approuvé par le jury de soutenance et mis à disposition de l'ensemble de la communauté universitaire élargie. Il est soumis à la propriété intellectuelle de l'auteur. Ceci implique une obligation de citation et de référencement lors de l’utilisation de ce document. D'autre part, toute contrefaçon, plagiat, reproduction illicite encourt une poursuite pénale. Contact : [email protected]
LIENS Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 122. 4 Code de la Propriété Intellectuelle. articles L 335.2- L 335.10 http://www.cfcopies.com/V2/leg/leg_droi.php http://www.culture.gouv.fr/culture/infos-pratiques/droits/protection.htm
1
U.F.R. Sciences & Techniques Biologiques
École Doctorale BioSE
Thèse
présentée pour l’obtention du titre de
Docteur de l’Université Henri Poincaré, Nancy1
en Biologie Moléculaire
par Tatiana WITTMANN
Analyse phylogénétique des souches du virus de la
fièvre hémorragique Ebola et mise en évidence de
souches atypiques
Soutenance publique le 18 décembre 2007
Membres du jury :
Rapporteurs : M. Xavier de LAMBALLERIE Professeur, Université de Marseille
M. Hervé BOURHY Directeur de recherches Institut Pasteur, Paris
Examinateurs : M. Sylvain BAIZE Chargé de recherches, Institut Pasteur, Lyon
Mme Christiane BRANLANT Directeur de recherches CNRS, Nancy I
M. Éric LEROY Directeur de recherches IRD, Gabon
Directeur de thèse
2
À Michel & Fernande JOFFRE, mes grands-parents,
À Jacky & Patricia WITTMANN, mes parents,
À Khalid KETOINE
Qui m’ont forgée et ont fait de moi la personne que je suis.
3
Remerciements Je remercie le Centre International de Recherches Médicales de Franceville, par
l’intermédiaire de son Directeur Général, le Professeur Philippe Blot, d’avoir bien voulu prendre en charge ces travaux de thèse.
J’adresse également mes remerciements au Docteur Christiane Branlant qui m’a
fait l’honneur de m’accepter au nombre de ses thésards. Je remercie le Docteur Éric Leroy pour l’honneur qu’il m’a fait en dirigeant cette thèse, pour son dynamisme et sa
patience, son amabilité et sa recherche constante de la perfection.
Merci aux Docteurs Xavier de Lamballerie et Hervé Bourhy pour l’honneur qu’ils m’ont témoigné en acceptant d’en être les rapporteurs. Merci au Docteur Sylvain Baize pour l’intérêt qu’il a porté à mes travaux.
Cette thèse n’aurait pas lieu d’être sans le Docteur Maria Makuwa, qui a accompagné mes premiers pas en virologie et à qui je suis infiniment reconnaissante de m’avoir lancé dans cette aventure.
Un grand merci également au Docteur Jean-Bernard Lekana-Douki, qui a pris le temps de relire mes fautes de conjugaison. Ses questions et recherches d’explications ont permis d’améliorer un peu plus la version finale.
Je n’oublie pas non plus les membres de l’Unité des Maladies Virales Émergentes, et en particulier André Délicat et Philippe Yaba pour leur bonne humeur
et leurs compétences techniques, le Docteur Brice Kumulungui et Ghislain Moussavou pour leur capacité de tout discuter et palabrer pour rien. Une pensée spéciale pour le
Docteur Loïs Allela, ancien membre de l’équipe, qui a guidé mes premiers pas en
Afrique et à Franceville, m’a permis d’exercer ma patience et qui continue à l’éprouver régulièrement.
Je ne peux pas non plus laisser de côté les collègues du service de rétrovirologie, entre autres : Sandrine Souquière, Augustin Mouinga Ondémé pour ses éditoriaux du matin, le « bidoc » ya Richard Onanga pour ses discussions et ses conseils avisés, Armel Mintsa Ndong pour ses conseils à ne pas suivre, ya Guy-Roger Ndong Atome, et mon voisin le Docteur Ulrich Bisvigou. J’adresse un merci particulier à Chimène Nze Nkoghe et Sonia Lekana-Douki, membres d’honneur du Club Gastronomique, sans qui les pauses du vendredi 10h n’auraient pas eu le même goût.
J’adresse également mes remerciements aux travailleurs du CIRMF, Maman
Albertine Nkouyi ; Véronique Ndjougou, documentaliste ; Marguerite Adimina et
4
Nicole Mvou, réceptionnistes ; les techniciens et techniciennes, ménagères, secrétaires, maintenanciers, chauffeurs, … tous ces travailleurs, trop nombreux pour être cités nommément, qui font vivre le CIRMF et lui apportent leurs joie et bonne humeur.
J’aimerais adresser un merci particulier à mes grand-frères du Shotokan-Karaté-Municipal de Franceville, la DreamTeam représentée par Esmentho Otounga
Botomo, Christian Chukwuegbo et Wargha Dounda Bamzouzi, qui ont si bien su me supporter et m’épauler quand j’en avais besoin, qui ont accompli le miracle de me faire courir, ainsi que pour leurs empis au chantier et leur plus grande dévotion dans leur rôle de punching-ball !!!
Je n’ai pas de mots pour exprimer la gratitude que j’ai envers notre instructeur, M. Dominique Mikomba-Liyinda, ceinture noire 3è dan et Président de la ligue du Haut-
Ogooué de Karaté-Do. Il a dépensé sans compter son temps et son énergie à tenter de nous ouvrir les yeux et l’esprit afin de nous faire prendre conscience de ce que sont l’Art et la Voie du Karaté. Son enseignement a été inestimable et j’espère, à force de travail, pouvoir un jour me dire son élève.
Je remercie ma famille : mes grands-parents, mes parents et ma sœur Floriane (la
seule, l’unique, l’incomparable, qui a été d’une efficacité et d’une aide remarquables dans le dépôt de mon dossier), grandes-tantes, tantes et oncles, cousines et cousins, qui ont été présents malgré les plus de 6 000 km nous séparant. Leurs lettres et mails remplis de diaporamas insolites et d’images marrantes m’ont donné l’impression d’être juste à côté d’eux.
Je remercie également Tantine Marie Christine Mba Ndong qui s’est occupée de moi comme une mère lors de mes séjours à Libreville, Céline Vebert et Fatma Aït-Mesbah, les familles Tounkara, Wague et Doucouré pour leur disponibilité, leur joie de vivre et leur sérénité.
Enfin, merci à toi Khalid pour m’avoir soutenue et poussée dans la dernière ligne droite, m’avoir changé les idées lors de mes retours toujours trop courts et supporté ces longues années de séparation.
5
Résumé
La fièvre hémorragique à virus Ebola (FHVE) est due à un virus à ARN non segmenté
de polarité négative de l’ordre des Mononégavirales. Il compose avec le virus de Marburg
la famille des Filoviridae. Il existe 4 espèces Ebolavirus réparties géographiquement :
Zaïre en Afrique centrale, Soudan en Afrique de l’Est, Côte d’Ivoire en Afrique de l’Ouest
et Reston en Asie.
Ebolavirus zaïre, apparu en 1976 en République Démocratique du Congo, est l’espèce
la plus létale pour l’homme (jusqu’à 88% de mortalité) et a été à l’origine de plusieurs
vagues d’épidémies depuis sa ré-émergence en 1995. Les flambées épidémiques de 2001 à
2005 sont caractérisées par de multiples chaînes épidémiques indépendantes et des
épizooties concomitantes dans les populations de grands singes (gorilles et chimpanzés).
L’amplification et le séquençage du gène viral de la glycoprotéine (GP) ont été
effectués à partir de prélèvements obtenus lors des deux dernières épidémies humaines de
2003 et 2005, ainsi que sur des échantillons de carcasses animales trouvées à partir de 2001
dans la forêt de la région Gabon-Congo.
Un deuxième gène viral codant la nucléoprotéine (NP) a été amplifié et séquencé à
partir de prélèvements obtenus pendant les épidémies humaines survenues depuis 2001 et
de prélèvements animaux.
L’analyse phylogénétique basée sur le gène codant la GP montre la séparation des
souches virales en deux lignées génétiques fortement soutenues. Cette séparation est
confirmée par l’existence de signatures moléculaires spécifiques aux séquences de chaque
lignée, ainsi que par le calcul des distances génétiques entre les séquences. Les analyses
effectuées sur le gène de la NP donnent les mêmes résultats. Cependant, la topologie des
souches humaines obtenues entre 2001 et 2003 diffère entre les arbres basés sur la GP et la
NP.
Les résultats indiquent l’existence de deux lignées phylogénétiques et supposent un
événement de recombinaison entre les souches des deux lignées.
L’estimation de l’âge des ancêtres communs les plus récents indique que la séparation
des deux lignées se serait produite avant la première apparition de la FHVE, vers 1975
(1971 calculé sur la NP). L’événement de recombinaison est daté par cette méthode entre
1998-1999.
6
Abstract
The virus Ebola, a negative non segmented RNA virus, is responsible for an hemorrhagic
fever disease. Together with the Marburg virus, they compose the Filoviridae family (order
Mononegavirales). Ebolavirus is geographically divided into 4 species: Zaire in Central
Africa, Sudan in East Africa, Ivory Coast in West Africa, and Reston in Asia.
Zaire ebolavirus, first appeared in 1976 in the Democratic Republic of Congo, has the
highest mortality rate in humans (up to 88%) and has caused several outbreaks since its re-
emergence in 1995. Outbreaks from 2001 to 2005 are characterized by multiple
independent epidemic chains and large concomitant outbreaks in chimpanzee and gorillas.
The viral glycoprotein (GP) gene was amplified and sequenced from samples obtained
during the two last human outbreaks in 2003 and 2005 and samples from great apes
carcasses found in the forest of the Gabon-Congo area since 2001.
A second viral gene coding the nucleoprotein (NP) was amplified and sequenced from
animal samples and human outbreaks since 2001.
Phylogenetic analysis based on the GP gene showed the separation of Zaire ebolavirus
strains into two genetic lineages. This separation is supported by molecular signatures
specific to sequences of each lineage, and by genetic distances between sequences.
Analysis based on the NP genes give the same results. However, the topology of human
strains recovered between 2001 and 2003 is different in both trees.
Results show the existence of two phylogenetic lineages and suggest a recombination
event between strains of these lineages.
The estimation of the age of the most recent common ancestor tracks back the separation
of the lineages before the first appearance of Ebolavirus, up to 1975 (1971 estimated on the
NP gene). With this method, the recombination event is dated to 1998-1999.
Table des matières
7
Table des matières Remerciements .......................................................................................................... 3
Résumé ...........................................................................................................................5
Abstract...........................................................................................................................6
Table des matières ..................................................................................................... 7
Abréviations ............................................................................................................ 11
Avant-propos ........................................................................................................... 13
INTRODUCTION................................................................................................... 15
I. Historique..................................................................................................................16
I.1. Épizooties dues aux souches asiatiques (Reston)...................................................... 16
I.2. Épidémies dues aux souches africaines..................................................................... 18
a. Côte d’Ivoire ............................................................................................................ 18
b. Soudan ..................................................................................................................... 19
c. Zaïre ......................................................................................................................... 20
II. Épidémiologie, cycle du virus..................................................................................24
II.1.Dimensions spatio-temporelles et médicales (santé publique) ................................. 24
a. Aire d’endémicité .................................................................................................... 24
b. Mortalité et Fréquence............................................................................................. 26
c. Impact s’il n’y a pas de contrôle.............................................................................. 27
d. Importance du virus aux niveaux culturel, social et économique............................ 28
II.2. Transmission du virus chez l’Homme ..................................................................... 30
a. Importance du contact lors des soins, des rites funéraires et de la médecine
traditionnelle................................................................................................................ 30
b. Infection nosocomiale.............................................................................................. 33
c. Infection par voie respiratoire.................................................................................. 34
d. Autres modes de contamination .............................................................................. 36
III.3. Cycle naturel du virus Ebola .................................................................................. 37
a. Transmission aux espèces sensibles : Hommes et Primates.................................... 37
b. Recherche de l’espèce réservoir .............................................................................. 38
III. Les épidémies .........................................................................................................44
III.1. Caractéristiques cliniques chez l’homme ............................................................... 44
III.2. Méthodes de diagnostic .......................................................................................... 46
Table des matières
8
a. L’examen direct du virus ......................................................................................... 47
b. Isolement viral ......................................................................................................... 50
c. Détection de la présence virale ................................................................................ 53
d. Diagnostic sérologique ............................................................................................ 55
e. Méthodes diverses ................................................................................................... 56
III.3. Contrôle, prévention et traitement .......................................................................... 57
a. Prévention : mesures sanitaires, vaccin ................................................................... 57
b. Traitement................................................................................................................ 63
IV. Les mécanismes physiopathologiques ...................................................................67
IV.1. Physiopathogénèse ................................................................................................. 67
a. Modèle animal ......................................................................................................... 67
b. Paramètres biochimiques et hématologiques........................................................... 68
IV.2. Immunologie .......................................................................................................... 70
a. Immunité cellulaire .................................................................................................. 70
b. Cytokines................................................................................................................. 72
c. Immunité humorale.................................................................................................. 76
d. Cas asymptomatiques humains................................................................................ 77
V. Agent pathogène : le virus Ebola.............................................................................78
V.1. Taxonomie des fièvres hémorragiques tropicales.................................................... 78
a. Les Arenaviridae...................................................................................................... 78
b. Les Bunyaviridae..................................................................................................... 79
c. Les Flaviviridae ....................................................................................................... 80
d. Les Filoviridae......................................................................................................... 82
V.2. Morphologie et structure ......................................................................................... 84
a. Morphologie ............................................................................................................ 84
b. Structure .................................................................................................................. 84
c. Inactivation physico-chimique................................................................................. 85
V.3. Organisation du génome.......................................................................................... 86
V.4. Cycle de réplication ................................................................................................. 87
a. Entrée dans la cellule ............................................................................................... 88
b. Transcription et réplication...................................................................................... 90
c. Sortie de la cellule.................................................................................................... 91
V.5. Protéines et leurs fonctions...................................................................................... 94
a. Nucléoprotéine......................................................................................................... 94
Table des matières
9
b. Protéine virale de 35 kDa (VP35)............................................................................ 95
c. Protéine virale de 40 kDa ........................................................................................ 96
d. Protéine virale de 30 kDa ........................................................................................ 98
e. Protéine virale de 24 kDa ........................................................................................ 98
f. RNA Polymérase...................................................................................................... 99
g. Glycoprotéines......................................................................................................... 99
VI. Phylogénie moléculaire des souches virales ........................................................108
Problématique.............................................................................................................111
MATÉRIEL et MÉTHODES ................................................................................ 112
I. Laboratoire P4.........................................................................................................113
II. Matériel biologique................................................................................................114
II.1. Chaîne des évènements : du prélèvement au labo ................................................. 114
II.2. Prélèvements d’origine humaine ........................................................................... 115
II.3. Prélèvements animaux ........................................................................................... 116
III. Méthodes de diagnostic ........................................................................................119
III.1. Sérologie............................................................................................................... 119
a. Dosage des antigènes circulants ............................................................................ 119
b. Dosage des Immunoglobulines G.......................................................................... 120
c. Détection d’antigènes par immunofiltration.......................................................... 121
III.2. Amplification d’un fragment ARN....................................................................... 122
a. Extraction de l’ARN .............................................................................................. 122
b. Transcription inverse ............................................................................................. 124
c. Amplification des gènes......................................................................................... 124
d. Électrophorèse sur gel d’agarose........................................................................... 127
e. Purification du produit de PCR sur gel.................................................................. 128
III.3. Isolement viral ...................................................................................................... 129
a. Culture de cellules Vero E6................................................................................... 129
b. Infection des cellules par le virus Ebola................................................................ 130
IV. Caractérisation des souches par PCR ...................................................................130
IV.1. PCR des gènes GP, NP et L ................................................................................. 130
IV.2. Séquençage et analyses phylogénétiques ............................................................. 131
RÉSULTATS ........................................................................................................ 132
I. Réponse internationale à l’épidémie de Mbandza...................................................133
II. Diagnostic ..............................................................................................................134
Table des matières
10
II.1. Diagnostic par immunofiltration............................................................................ 134
II.2. Diagnostic par ELISA............................................................................................ 135
II.3. Diagnostic par RT-PCR......................................................................................... 137
II.4. Infection des cellules Vero..................................................................................... 138
II.5. Mise en évidence de souches atypiques................................................................. 139
III. Séquençage de gènes de protéines virales ............................................................139
III.1. Séquences du gène codant la glycoprotéine ......................................................... 139
a. Comparaison des souches d’origine humaine et animale ...................................... 140
b. Cas des gorilles de Lossi ....................................................................................... 150
III.2. Séquences du gène codant la nucléoprotéine ....................................................... 154
IV. Analyses phylogénétiques ....................................................................................160
V. Etude de la variabilité ............................................................................................163
VI. Datation de la séparation des groupes ..................................................................164
DISCUSSION........................................................................................................ 166
I. Mise au point d’un outil diagnostic.........................................................................167
II. Caractérisation de nouvelles souches virales.........................................................169
III. Les souches de ZEBOV sont divisées en deux lignées génétiques ......................170
III.1. Évolution des virus à ARN responsables de fièvres hémorragiques .................... 171
III.2. Plusieurs lignées suggérées par les données épidémiologiques sans pouvoir être
démontrées..................................................................................................................... 172
III.3. Composition de la lignée B .................................................................................. 173
III.4. Pourquoi la lignée B n’est-elle détectée qu’après 2001 ?..................................... 174
IV. Évènement de recombinaison entre les lignées....................................................176
V. Multi-émergence ou propagation ?........................................................................179
V. Perspectives ...........................................................................................................182
ANNEXE............................................................................................................... 185
PUBLICATIONS .................................................................................................. 195
RÉFÉRENCES BIBLIOGRAPHIQUES .............................................................. 236
Abréviations
11
Abréviations ARNnns ARN négatif non-segmenté
CIEBOV Ebolavirus côte d’ivoire
EBOV Ebolavirus
FHV Fièvre Hémorragique Virale
FHVE Fièvre Hémorragique à Virus Ebola
GP Glycoprotéine membranaire
ICAM Inter Cellular Adhesion Molecule
IFN Interféron
IgG Immunoglobuline G
IL Interleukine
MARV Marburg virus
MCP Macrophage Chemoattractant Protein
MIP Macrophage Inflammatory Protein
ml millilitre
NP Nucléoprotéine
nt Nucléotide
PBMC Peripheric Blood Monocytic Cells,
cellules monocytiques du sang
périphérique
RANTES Regulated on Activation Normal T-cell
Expressed and Secreted
RDC République Démocratique du Congo
RC République du Congo
RCA République de Centre Afrique
REBOV Ebolavirus reston
SEBOV Ebolavirus soudan
TNF Tumor Necrosis Factor
VIH Virus de l’Immunodéficience Humaine
VP Protéine Virale (Viral Protein)
Abréviations
12
ZEBOV Ebolavirus zaïre
Symboles des aminoacides
A Ala Alanine M Met Méthionine
C Cys Cystéine N Asn Asparagine
D Asp Aspartate P Pro Proline
E Glu Glutamate Q Gln Glutamine
F Phe Phénylalanine R Arg Arginine
G Gly Glycine S Ser Sérine
H His Histidine T Thr Thréonine
I Ile Isoleucine V Val Valine
K Lys Lysine W Trp Tryptophane
L Leu Leucine Y Tyr Tyrosine
Avant-propos
13
Avant-propos
Le Centre International de Recherches Médicales de Franceville (CIRMF) a été créé en
1974 à l’instigation de son excellence El Hadj Omar Bongo Ondimba, président de la
République Gabonaise, et du président d’Elf Aquitaine de l’époque, Monsieur Pierre
Guillaumat. Inauguré le 5 décembre 1979, son financement est assuré conjointement par
Total-Elf, l’État gabonais et la Coopération française. Initialement orienté sur les
pathologies parasitaires et notamment leurs conséquences sur la fécondité humaine, les
thématiques de recherche se sont au cours des années élargies aux études fondamentales et
épidémiologiques concernant les problématiques majeures d'Afrique Centrale, notamment
le paludisme (neuropaludisme), les rétrovirus (VIH, SIV) et les fièvres hémorragiques
virales (Ebola). Le CIRMF est divisé en trois sections : la division de recherche basée sur
le SIDA, le paludisme, l’étude des écosystèmes tropicaux, et les maladies virales
émergentes ; la division de santé publique représentée par le laboratoire d’analyses
médicales au service de la population ; et la divison de primatologie regroupant près de
400 primates pour la plupart originaires du Gabon (chimpanzés, gorilles , mandrills,
cercopithèques à queue de soleil, mangabeys à collier blanc, hocheurs) maintenus captifs
en cage individuelle, dans de grandes « volières » ou encore dans des enclos de semi-
liberté de plusieurs hectares.
Sa localisation au sud-est du Gabon, à une centaine de kilomètres de la frontière avec la
République du Congo, et sa proximité de la zone d’endémie est un atout que le CIRMF a
su utiliser dans la lutte contre la fièvre hémorragique à virus Ebola. Dès la ré-émergence du
virus Ebola et les trois épidémies successives qui touchèrent le Gabon en 1995-96, le
CIRMF a évolué en collaboration avec le Ministère gabonais de la santé publique et les
Avant-propos
14
représentants de l’OMS. Grâce à la Coopération française, le CIRMF possède une bulle
hermétique en pression négative permettant la manipulation du virus Ebola pour
diagnostiquer les cas suspects, isoler le virus et effectuer les travaux de recherche dans des
conditions de biosécurité maximales.
Depuis 2000, le CIRMF a reçu l’homologation « centre collaborateur de l’OMS
de référence et de recherche pour les fièvres hémorragiques virales africaines ». C’est la
deuxième infrastructure P4 du continent africain, avec le laboratoire qui existe déjà en
Afrique du Sud.
Introduction
15
INTRODUCTION
Introduction
16
I. Historique
Depuis la première apparition de la fièvre hémorragique à virus Ebola (FHVE), de
nombreuses épidémies ont touché l’Afrique et l’Asie. Ces épidémies, causées par les 4
espèces du virus, sont sporadiques et réparties géographiquement selon l’espèce virale.
Ainsi, des pays d’Afrique Centrale, de l’Ouest et de l’Est ont été touchés par 3 espèces
virales (Zaïre, Soudan et Côte d’Ivoire) ; et les États-Unis d’Amérique et les Philippines
ont été touchés par la quatrième espèce (Reston).
I.1. Épizooties dues aux souches asiatiques (Reston)
Les premières épizooties dues aux souches asiatiques du virus Ebola éclatèrent entre
1989 et 1990 dans des colonies de macaques cynomolgus (Macaca fascicularis) mis en
quarantaine dans 3 laboratoires américains : à Reston en Virginie, à Austin au Texas et à
Philadelphie en Pennsylvanie. Les singes importés provenaient tous du même centre
d’exportation situé à Manille, aux Philippines [1] (figure 1). Les mesures sanitaires ayant
consisté à euthanasier les animaux lorsque l’infection par EBOV fut confirmée, les
données épidémiologiques disponibles sont peu nombreuses et difficilement exploitables.
Au même moment, une épizootie dans le centre d’exportation de Manille causa 383 décès
sur un total de 1 404 animaux. Parmi les animaux décédés, 85 avaient des anticorps dirigés
contre Ebolavirus (EBOV) [2].
La forte ressemblance de ce virus, nommé espèce reston (REBOV), avec les souches
africaines d’EBOV, responsables d’un grand nombre de décès au Soudan et au Zaïre,
conduisirent le département de la santé philippin à enquêter sur le risque de transmission
des animaux à l’homme et la répercussion de ce virus sur la Santé Publique. Cette enquête
montra que 22% des travailleurs au contact d’animaux infectés présentaient des anticorps
dirigés contre REBOV, bien qu’aucun symptôme de fièvre hémorragique ne fut enregistré
[3].
Parce que le centre d’exportation de Manille ne respecta que partiellement les mesures
sanitaires prises à l’encontre de l’épidémie [4], le virus Ebola fut retrouvé chez 4 singes
provenant de ce centre, à Sienne, en Italie en 1992 [5]. Afin d’éviter une flambée
Introduction
17
épidémique, tous les singes du lot importé furent euthanasiés. Aucun contact humain ne
présenta de signe clinique ou sérologique d’infection [6].
De même, en 1996 à Alice, Texas, un singe importé de Manille, aux Philippines,
mourru après 3 jours de maladie. Quelques jours avant la mise en évidence d’une infection
par EBOV, un autre singe détenu dans la même pièce présenta les mêmes symptômes.
Lorsque l’infection par EBOV fut confirmée, les singes détenus dans cette pièce furent
euthanasiés et une étude épidémiologique fut menée à partir des prélèvements de singes
sacrifiés. Parmi les animaux asymptomatiques, 2 étaient infectés par EBOV, bien que leurs
cages ne soient pas adjacentes à celles des animaux malades. Dans ces cas d’infection, il
semblerait que le mode de transmission fut les aérosols créés lors du nettoyage des cages
par des jets haute-pression [7].
Suite à ces nouvelles infections aux U.S.A., une enquête épidémiologique fut menée
aux Philippines. Pendant toute la durée de l’investigation, des animaux fortement infectés
furent trouvés dans un seul des 3 centres de primatologie exportateurs. Aucun des
employés en contact avec les singes ne présenta de signes d’infection [8].
Figure 1 : Localisation des épizooties dues à REBOV dans les populations de macaques importés des
Philippines à destination de laboratoires américains et italien.
Introduction
18
I.2. Épidémies dues aux souches africaines
a. Côte d’Ivoire
En novembre 1994, une éthologue suisse tomba malade quelques jours après avoir
autopsié un chimpanzé (Pan troglodytes) trouvé mort dans le parc national de Taï, au sud-
ouest de la Côte d’Ivoire à proximité de la frontière avec le Libéria (figure 2). Après 15
jours de maladie, caractérisée entre autres par de la fièvre, des céphalées, douleurs
musculaires et abdominales, diarrhées et vomissements, la patiente guéri sans séquelles [9].
Une nouvelle espèce d’Ebolavirus, nommée Côte d’Ivoire (CIEBOV), fut identifiée à
partir des prélèvements du chimpanzé et de la patiente. Ce virus est apparenté
sérologiquement à l’espèce Zaïre (ZEBOV), cependant le séquençage montra jusqu’à 40%
de divergence entre les 2 espèces [10, 11].
Le groupe auquel appartenait le chimpanzé trouvé mort et autopsié était suivi depuis
plusieurs années par une équipe d’éthologues. Cette équipe pu étudier l’épizootie de FHVE
dans le groupe de chimpanzés, observer les comportements à risque, et déterminer un taux
de mortalité d’environ 25% [12].
Cette épizootie touchant les chimpanzés et un unique cas humain non létal due à
l’espèce CIEBOV est la seule observée à ce jour en Afrique de l’Ouest.
Figure 2 : Localisation des épidémies
dues aux souches africaines d’Ebolavirus.
Espèce Côte d’Ivoire (jaune) en 1994 dans
le Parc National de Taï (1 cas, 0 décès).
Espèce Soudan (orange) dans le Sud du
Soudan (1976 : 284 cas, 151 morts ; 1979
34 cas, 22 morts ; 2004 : 17 cas, 7 morts)
et le Nord de l’Ouganda (2000 : 425 cas,
173 morts). Espèce Zaïre (rouge), en
République Démocratique du Congo
(1976 : 315 cas, 280 décès ; 1977 : 1 cas, 1
mort ; 1995 : 315 cas, 255 décès), en
République du Congo (RC) et au Gabon.
Introduction
19
b. Soudan
Entre juin et novembre 1976, une maladie hémorragique inconnue toucha les villes de
Nzara et Maridi au sud du Soudan, proches de la frontière avec la République
Démocratique du Congo (RDC) (figure 2). Les premiers cas furent des employés d’une
usine de coton de Nzara qui contaminèrent les membres de leurs familles. Un de ces
patients déplaça l’épidémie à Maridi, à environ 180 km à l’est de Nzara, où il parti se faire
soigner. Alors que l’épidémie semblait contenue à Nzara, l’hôpital de Maridi agit comme
un amplificateur et devint la source principale d’infection. Pendant les 5 mois que dura
l’épidémie, on recensa 284 cas et 151 décès (53% de mortalité). L’enquête virologique à
partir de prélèvements de patients malades mit en évidence un nouveau virus, qui fut
nommé Ebolavirus soudan (SEBOV) [13].
Fin août 1979, cette région fut de nouveau touchée par une épidémie de fièvre
hémorragique. L’hospitalisation d’un employé de l’usine de coton de Nzara, l’absence de
précautions sanitaires à l’hôpital ainsi que l’aide aux soins apportée par les membres des
familles propagèrent l’infection. L’épidémie fut transportée à Yambio, à 25 km de Nzara,
par un malade venu s’y faire soigner. Cette flambée épidémique causa 22 décès parmi les
34 cas (65% de mortalité) [14].
Après une longue période de latence, SEBOV ré-emergea entre août 2000 et janvier
2001 en Ouganda, touchant principalement la ville de Gulu et son district, dans le Nord du
pays.
Dès la confirmation en laboratoire de la présence de SEBOV, une unité d’isolement a
été mise en place afin d’éviter toute transmission. Cependant, cette épidémie causa le plus
de victimes à ce jour, avec 425 cas présumés (dont 218 confirmés en laboratoire) et 173
décès (40,7% de mortalité). Les causes de la propagation furent :
- la présence aux obsèques de cas probables, où les contacts rituels avec le
défunt sont coutumiers ;
- l’aide aux soins des nombreux membres de la famille ;
- la transmission nosocomiale due au respect seulement partiel des mesures
sanitaires.
Introduction
20
Deux flambées locales éloignées furent déclenchées par le déplacement de personnes
infectées qui se sont rendues dans le district de Mbarara, au sud du pays, proche de la
frontière avec la République Unie de Tanzanie, et le district de Masindi, à mi-chemin entre
Gulu et Mbarara. Lorsque des mesures de dépistage, de protection et d’isolement des cas
furent mises en place et appliquées, la transmission cessa, entraînant la fin de l’épidémie
[15].
La dernière apparition de SEBOV eut lieu en 2004 au Soudan, dans le district de
Yambio, déjà touché en 1979. Entre mai et juin 2004, 17 cas furent recensés entraînant la
mort dans 41% des cas (7 décès) [16].
c. Zaïre
Quelques mois après l’apparition des premiers cas de fièvre hémorragique au Soudan,
des cas de maladie identiques apparurent dans la région de Bumba, au Nord-ouest de la
RDC (figure 2). La principale source de soins pour les habitants de cette région est
l’hôpital de la Mission Catholique de Yambuku. Cette ville se situe à environ 100 km au
nord de Bumba et est baignée par la rivière Ebola, qui donna son nom aux virus isolés lors
de cette épidémie et celle voisine au Soudan. L’hôpital de la Mission Catholique joua le
rôle d’un amplificateur de l’épidémie, essentiellement à cause de la réutilisation d’aiguilles
et seringues non stérilisées et du manque de précautions sanitaires lors des soins. De
septembre à novembre 1976, cette épidémie causa 280 décès sur les 318 cas enregistrés
(soit 88% de mortalité) [17].
La même année, un technicien de laboratoire anglais se contamina accidentellement
alors qu’il manipulait un échantillon biologique d’un patient décédé d’une maladie non
identifiée au Kenya. Le technicien développa des symptômes caractéristiques d’une fièvre
hémorragique mais il survécu et ne causa aucun cas secondaire [18].
En 1977, un cas isolé apparu à Tandala, ville du Zaïre, proche de la frontière avec le
Cameroun et à environ 325 km de Yambuku. Une fillette de 9 ans décéda des suites d’une
maladie dont les manifestations cliniques étaient typiques d’une FHVE. L’analyse
biologique permi l’isolement de ZEBOV [19].
Introduction
21
En 1995, après une longue période de silence, Ebolavirus, espèce Zaïre (ZEBOV), refit
son apparition à Kikwit, en République Démocratique du Congo (RDC), à 475 km à l’est
de la capitale Kinshasa. En avril, quelques cas de FHVE apparurent dans l’équipe
d’infirmiers de la maternité de Kikwit, mais ces cas furent diagnostiqués comme une
épidémie de dysenterie. La présence du virus Ebola fut suspectée et confirmée lorsque
l’équipe chirurgicale qui a opéré un patient et les infirmières qui l’ont soigné
développèrent les symptômes caractéristiques d’une FHVE [20]. L’enquête
épidémiologique rétrospective montra que le premier cas survint au début de l’année. Cet
homme se serait infecté dans son travail à la mine, ou dans sa plantation aux environs de
Kikwit. Au moins 3 membres de sa famille proche et 10 personnes de sa famille étendue
auraient été contaminées.
Entre janvier et juillet 1995, cette épidémie provoqua 255 décès parmi les 315 victimes
(81% mortalité). Le délai dans l’identification de ZEBOV lors de cette épidémie est dû à
un mauvais diagnostic [21].
Figure 3 : Localisation des épidémies dues à Ebolavirus, espèce Zaïre, en RDC et dans la région
frontalière du Gabon-Congo.
La première épidémie due à ZEBOV fut déclarée en 1994 et deux autres survinrent en
1996 (figure 3).
La première épidémie s’est déroulée en 2 vagues. La première, début décembre 1994,
affecta 3 camps d’orpailleurs avec 32 cas cliniques. Certaines victimes se sont déplacées
par pirogue vers l’hôpital de Makokou, dans le Nord-Est du Gabon, où ils provoquèrent
des cas secondaires. La deuxième vague, fin janvier début février 1995, commença avec un
Introduction
22
patient ayant quitté l’hôpital de Makokou contre avis médical pour se faire soigner par le
tradipraticien (« nganga ») d’un village voisin. Le voisin du nganga s’infecta probablement
au contact de ce patient et ramena l’épidémie à Makokou lorsqu’il y fut hospitalisé. Cette
flambée épidémique causa 49 cas et 29 décès (59% mortalité). Certains symptômes
biologiques et cliniques suggéraient une épidémie de fièvre jaune. Lors de cette première
épidémie, la coexistence des virus Ebola et de la fièvre jaune fut mise en évidence.
La deuxième épidémie toucha le village de Mayibout 2, à 6h de pirogue au sud de
Mekouka et 7h au nord de Makokou, au début de février 1996. L’épidémie débuta lorsque
18 adolescents dépouillèrent et découpèrent le cadavre d’un chimpanzé trouvé mort en
forêt. Tombés malades, ils furent évacués sur Makokou. Il y eu 31 cas et 21 décès (67,7%
mortalité).
La troisième épidémie toucha la ville de Booué et les villages environnants. Booué est
situé au centre du Gabon, à 200 km au Sud-ouest de Mekouka et 120 km de Makokou. La
première vague débuta par les décès successifs de 3 chasseurs, puis du nganga et de son
neveu qui soignèrent le dernier chasseur, et transmirent la maladie à leurs patients des
villages voisins. Un docteur gabonais qui avait pratiqué une endoscopie sur un patient
malade dans une clinique privée de Libreville parti se faire soigner en Afrique du Sud, à
Johannesburg, dès qu’il commença à développer des symptômes de fièvre hémorragique. Il
y contamina l’infirmière sud-africaine chargée des soins, qui mourut sans provoquer
d’autres cas. Une deuxième vague toucha les villages entourant Booué fin novembre 1996,
avec un cas confirmé à Lastourville (130 km au sud) et 11 décès parmi 15 cas dans un
hôpital de Libreville. Cette troisième épidémie provoqua 45 décès parmi les 60 victimes
[22].
Entre octobre 2001 et mai 2002, le Nord-Est du Gabon fut de nouveau frappé par une
épidémie composée de plusieurs foyers isolés résultant de plusieurs introductions du virus
dans la population humaine.
Cette épidémie commence en octobre 2001, quand des chasseurs du village de
Mendemba tombèrent malades après avoir été au contact d’une carcasse de Céphalophe
(Cephalophus monticola) trouvée morte en forêt. Ces patients générèrent plusieurs cas
secondaires dans les villages voisins, dont Mekambo. L’épidémie a été transportée jusqu’à
Makokou suite à l’évacuation sanitaire de patients de Mekambo.
Deux épidémies débutèrent presque simultanément. Fin novembre 2001 à Ekata,
dernier village gabonais sur l’axe Mekambo-République du Congo (RC), l’épidémie
Introduction
23
toucha d’abord des personnes ayant touché une carcasse d’antilope (Cephalophus
dorsalis). Début décembre à Olloba, premier village congolais de cet axe, l’épidémie suivit
le contact avec une carcasse de gorille (Gorilla gorilla).
Fin décembre 2001, 2 épidémies indépendantes frappèrent le Gabon, de nouveau à
Ekata sur l’axe Est et à Etakangaye, sur l’axe Nord, suite à la « manipulation » d’une
carcasse de chimpanzé. Pendant cette épidémie, un cas isolé apparut à Franceville, à près
de 600 km de l’épicentre. La patiente survécut, et l’enquête épidémiologique rétrospective
n’identifia aucune source de contamination [23].
Le village d’Entsiami, en RC, situé à 200 km d’Olloba, fut touché par une épidémie
mi-janvier 2003. L’épidémie se répandit jusqu’à Kelle, 65 km au sud-est.
Enfin, une épidémie due au dépeçage et à la consommation d’une carcasse de gorille
trouvée en forêt frappa, fin mars 2002, le village de Grand Etoumbi, sur l’axe Nord reliant
Makokou au Cameroun.
Les épidémies qui ont frappé l’axe Mekambo-Olloba se répandirent jusqu’à Mbomo,
en RC, à 80 km à l’est d’Olloba. Ces épidémies causèrent 53 décès parmi les 65 victimes,
soit un taux de mortalité de 81% [15, 24, 25].
Mbomo et Kelle, en RC, furent de nouveau touchées entre décembre 2002 et mai 2003
par 2 épidémies indépendantes. L’enquête épidémiologique suggèra 3 introductions par
contact avec des carcasses d’antilope ou de gorille. Les cas index (premières victimes de
l’épidémie) qui apportèrent l’épidémie à Mbomo et Kelle provenaient, respectivement, des
villages de Mvoula et Yembelengoye. Il y eut 89% de mortalité (143 cas et 128 décès)
[26].
D’octobre à décembre 2003, Mbomo connu une nouvelle épidémie de FHVE, suite à
une partie de chasse dans le village voisin, Mbandza, à 30 km au Nord. Vingt-neuf des 35
cas décédèrent, soit 83% des victimes [27, 28] [29].
D’avril à juin 2005, le village d’Etoumbi, en RC, subit une flambée occasionnant 12
cas et 9 décès, soit 75% de mortalité [30].
La dernière épidémie en date fut déclarée le 11 septembre 2007 dans le Kassaï
occidental, en RDC. L’épicentre est localisé à Mweka, à environ 300 km de Kikwit,
touchée en 1995. La particularité de cette flambée réside dans une épidémie concomitante
Introduction
24
de dysenterie à Shigella. Peu d’informations sur le nombre de cas sont disponibles à
l’heure actuelle.
A partir de 2001, simultanément aux épidémies humaines, de grandes épizooties de
FHVE affectèrent les populations animales, notamment les chimpanzés, gorilles et
antilopes, provoquant un fort déclin de ces populations [26, 31-33].
II. Épidémiologie, cycle du virus
II.1.Dimensions spatio-temporelles et médicales (santé publique)
a. Aire d’endémicité
L’aire d’endémicité est la région dans laquelle le virus circule librement, de manière
permanente ou selon un rythme saisonnier, au sein de la population animale lui servant de
réservoir. Les apparitions sporadiques et mortelles d’EBOV représentant un marqueur de
sa présence, l’aire d’endémicité est donc délimitée par les cas de contamination humaine
recensés. Cependant, le virus peut circuler d’une manière « invisible » à l’extérieur de cette
aire lorsqu’il circule dans la population réservoir sans provoquer de cas clinique.
L’aire d’endémicité déterminée par les flambées épidémiques comprend donc les
régions de forêts denses et humides peu accessibles à l’homme : forêt tropicale du Bassin
du Congo et forêt de Taï pour la Côte d’Ivoire (figure 2). Ce milieu correspond à la niche
écologique de l’espèce réservoir, donc l’aire dans laquelle le virus est conservé. Les
transmissions aux espèces sensibles (singes, hommes) y sont rares.
Cette aire est comprise entre les 5è parallèles Nord et Sud autour de l’équateur. Cette
zone possède, d’une part, une végétation dense et un climat de type tropical, avec 2 pics de
précipitations séparés par 2 saisons sèches. Cette aire a été confirmée par modélisation de
niche écologique. D’autre part, les conditions écologiques appropriées à la circulation
d’EBOV sont également présentes en Asie du Sud-Est et aux Philippines, où l’espèce
Reston circule [34].
Introduction
25
A l’intérieur de cette aire d’endémicité se trouve la zone d’émergence, zone dans
laquelle la contamination humaine est possible, bien que les contaminations des hommes
par EBOV soient rares et accidentelles. De nombreuses raisons peuvent expliquer cette
difficulté de contamination humaine (faible démographie de l’espèce animale réservoir,
transmission difficile lors du contact, différents vecteurs, …). Cependant, la non-
compatibilité des habitats et/ou des modes de vie semble plus plausible [35]. En effet, la
plupart des villages sont situés dans des clairières de déforestation dans lesquelles le
réservoir animal ne peut évoluer. De plus, la construction de nouvelles maisons en bordure
du village, la création de plantations ou d’espaces divers créent des zones tampons qui
renforcent la « barrière écologique » séparant l’habitat humain de celui du réservoir
animal. La contamination a donc lieu soit dans une zone d’interpénétration des 2 habitats,
soit lors de la pénétration inhabituelle de l’homme dans la zone d’habitat du réservoir
animal (forêt).
Des études de séroprévalence menées dans différents pays supposés non infectés, c’est-
à-dire sans passé épidémique, de l’aire d’endémicité ont mis en évidence la présence
d’anticorps dirigés contre EBOV tant par les méthodes d’immunofluorescence indirecte
que par ELISA ou Western Blot.
En 1982, une enquête de séroprévalence des anticorps anti-fièvre hémorragiques a
montré que 15% de la population de la région du Pool, en RC, présentent des anticorps
dirigés contre Ebola [36].
En RDC, les taux d’individus porteurs d’anticorps anti-EBOV de Kikwit, ville touchée
par une épidémie en 1995 a été comparé à celui des habitants des villages avoisinant où
aucun cas de FHVE ne fut enregistré. Cette étude voulait également comparer les risques,
entre les activités forestières et les activités fermières. Un taux de séroprévalence de 9,3%
en anticorps anti-Ebola a été observé dans les villages sans passé épidémique, alors que
2,2% des résidents de Kikwit et des environs proches, qu’ils travaillent en ville ou en forêt,
présentent des anticorps, confirmant que les villageois au contact fréquent de la forêt sont
plus exposés à EBOV [37].
Au Cameroun, une étude menée sur des personnes saines dans 5 régions différentes a
montré que 9,7% de la population étaient porteurs d’anticorps anti-EBOV. Le taux le plus
élevé a été trouvé dans la population Pygmée [38].
Enfin, en République Centre Africaine (RCA), l’étude de la séroprévalence a été menée
en fonction de l’environnement, dans 5 zones écologiquement distinctes, et en fonction de
Introduction
26
l’ethnie. Dans les zones explorées, un taux moyen de 21,3% de la population étaient
séropositifs pour les anticorps anti-Ebola [39]. Par contre, des fortes disparités ont été
relevées entre les groupes ethniques. La séroprévalence trouvée chez les hommes adultes
Pygmées Aka, ethnie vivant en forêt et dont l’activité est principalement la chasse et la
cueillette, est 3 fois supérieure (37,5%) à la séroprévalence trouvée chez les hommes
adultes des ethnies Monzombo et Mbati, qui sont planteurs (13,2%) [40]. Ce résultat a été
confirmé par une enquête de séroprévalence utilisant la méthode ELISA dans des zones
forestières de RCA. La présence d’anticorps dirigés contre Ebola était près de 2 fois plus
importante chez les populations Pygmées vivant en forêt comparée aux populations des
villages [41].
Le virus Ebola circule donc dans des régions sans passé épidémique appartenant à
l’aire d’endémicité. L’étude des facteurs de risque montre que les populations dont les
activités sont fortement liées à la forêt sont plus exposées. Ceci souligne l’importance du
franchissement de la barrière écologique, lors d’un déplacement de l’homme dans le milieu
forestier par exemple.
b. Mortalité et Fréquence
Les 4 espèces d’Ebolavirus sont différemment pathogènes pour l’Homme. Si les
espèces Reston et Côte d’Ivoire sont non pathogènes pour l’Homme ou n’entraînent pas de
décès, respectivement [3, 8, 11], les autres espèces, Soudan et Zaïre, ont décimé des
familles et des villages.
Les épidémies dues à SEBOV ont causé environ 50% de mortalité parmi les victimes
[13, 15, 16].
Les épidémies dues à ZEBOV sont les plus meurtrières, avec des taux de mortalité
pouvant aller jusqu’à près de 90% [17, 21, 22, 24, 28].
Les épidémies de FHVE causées par différentes espèces dans des régions
géographiques distinctes sont apparues simultanément : 1976 (SEBOV au Soudan et
ZEBOV en RDC) et en 1994-1996 (CIEBOV en Afrique de l’Ouest et ZEBOV en Afrique
centrale). Ces coïncidences suggèrent que le cycle de transmission pourrait faire intervenir
des conditions écologiques et environnementales, telles que les précipitations ou les
changements cycliques au sein de la population réservoir. En Afrique Centrale, les
Introduction
27
épidémies de FHVE se sont produites lors de la saison des pluies ou de la petite saison
sèche.
c. Impact s’il n’y a pas de contrôle
Aucun vaccin et aucun traitement n’est disponible à ce jour pour lutter contre la FHVE.
La maîtrise des épidémies consiste dans l’isolement des cas, la mise en place et le respect
des mesures de précautions sanitaires lors des soins ou rites funéraires et la reconnaissance
précoce de l’épidémie.
Cependant, même en zone d’endémie, les symptômes en phase primaires ne sont pas
spécifiques et peuvent être associés à d’autres pathologies. En effet, cette première phase
est pseudo grippale, et certains symptômes, comme la fièvre et la diarrhée, sont aussi
caractéristiques de dysenterie et d’autres pathologies tropicales. Cette non-spécificité des
symptômes risque de conduire à des erreurs de diagnostic, comme ce fut le cas à Kikwit,
RDC, en 1995, où les décès par FHVE ont été confondus avec une épidémie de dysenterie
nosocomiale [20]. Les mesures de précaution sanitaires étant plus drastiques dans le cadre
d’une épidémie de FHVE, plusieurs décès et contacts se sont produits avant que ZEBOV
ne soit identifié. Ce retard de diagnostic a causé un grand nombre de victimes et a été à
l’origine de la plus grande épidémie.
Lors de l’épidémie de Gulu, Ouganda, en 2000-2001, bien que l’épidémie de FHVE ait
été reconnue rapidement, la transmission ne s’est interrompue que lorsque les mesures de
dépistage et d’isolement ont été mises en place. Toutefois, malgré les mesures sanitaires, le
personnel soignant fut durement touché par cette épidémie : sur les 29 travailleurs infectés,
14 l’ont été après la mise en place des mesures sanitaires. De plus, des foyers secondaires
se sont déclarés dans 2 villes du sud du pays, suite au déplacement non contrôlé des
populations [15]. Cette épidémie fut la plus vaste flambée jamais enregistrée due à l’espèce
SEBOV.
La reconnaissance précoce et l’isolement des malades restent à ce jour les seules armes
à notre disposition pour lutter contre le virus Ebola et les épidémies qu’il provoque. Afin
de répliquer rapidement à toute nouvelle flambée épidémique, qu’elle soit due au virus
Ebola ou à d’autres agents pathogènes, un réseau global d’alerte et de réponse aux
épidémies (GOARN : Global Outbreak Alert and Response Network) a été mis en place en
2000 par l’OMS et ses centres collaborateurs. Désormais, tout cas clinique suspect est
Introduction
28
isolé, et un prélèvement est envoyé au centre de référence le plus proche pour diagnostic
du cas en laboratoire. Ainsi, la mise en place de dispositifs de lutte contre la maladie
devient plus rapide, permettant de diminuer significativement le nombre de victimes.
d. Importance du virus aux niveaux culturel, social et économique
� Perception de l’épidémie
Une épidémie est l’apparition et la propagation d’une maladie contagieuse qui atteint
dans une même région un grand nombre d’individus. Depuis toujours, les épidémies ont
bouleversé les sociétés. Elles furent et sont une cause majeure de mortalité et de
changements démographiques.
L’homme, par ses activités économiques ou son comportement, a été le point d’origine
ou l’élément de diffusion de nombreuses épidémies passées ou récentes. Bien que l’aspect
biologique de ces épidémies soit essentiel à leur compréhension, le volet culturel est tout
aussi important, puisqu’il permet de mieux cerner les modes d’appréhension socioculturels,
psychologiques et religieux par lesquels l’homme explique les épidémies qui le touchent
[42].
Les réactions provoquées par une épidémie sont universelles, bien que certaines
réactions soient spécifiques de la culture locale et de la maladie qui sévit.
La mort causée par ce mal et la peur exacerbée par son origine inconnue entraînent une
modification des structures sociales et des liens familiaux. Les relations humaines sont
affectées par l’absence de contact, la société peut être déstabilisée par les fuites ou
réclusions, la peur de la maladie peut éloigner les membres d’une famille.
La peur de l’inconnu amène les individus à trouver une origine spirituelle à cette
épidémie. Toutes les grandes épidémies passées ont vu la désignation de boucs émissaires,
accusés de propager ou d’avoir créé la contagion, chargés des péchés de la collectivité.
Très souvent, la population attribue à l’épidémie une origine divine, où Dieu serait en
colère et punirait les hommes à cause de leurs mauvaises mœurs.
Sur le point de la religion, la société africaine est duale, avec d’un côté la culture
ancestrale, basée sur l’animisme et la médecine « traditionnelle », et de l’autre, la culture
importé par la colonisation, basée sur le christianisme et la médecine « moderne ». La
culture ancestrale africaine est basée sur la notion de force. Chaque être naît avec un
Introduction
29
certain potentiel de force, qu’il est possible d’entretenir au cours de sa vie. L’animiste croit
en plusieurs divinités dont l’une est supérieure aux autres. Cette croyance a facilité
l’intégration des religions monothéistes en Afrique. De même, la maladie et l’infortune
n’existent pas [43]. Les décès ne sont pas dus à la maladie, mais plutôt à une diminution de
la force ou à une élimination spirituelle causée par un ennemi, c’est donc un phénomène
naturel et normal.
Cette notion spirituelle encourage le déni de l’existence du virus Ebola. Les personnes
refusent de reconnaître qu’un virus invisible et inconnu les menace.
De multiples explications sont trouvées pour justifier une épidémie. Elle peut être due à
la colère divine, à cause du mauvais comportement des fidèles, ou à la colère d’un esprit
suite à un rituel mal exécuté. Elle peut également trouver son origine dans un sort jeté par
un sorcier, un jaloux ou un envieux, par un individu à la recherche de profit financier ou de
pouvoir politique. L’explication par le sort perdure tout au long de l’épidémie voire même
après. Dans la région Gabon-Congo, une épidémie circonscrite à 1 ou 2 familles est
considérée comme un sort collectif jeté sur ces dernières. La multitude d’explications
possibles implique une multitude de recours [44, 45]. En effet, lorsqu’un cas clinique
apparaît, il peut soit aller consulter un tradipraticien et/ou un sorcier et/ou aller à l’église
pour l’imposition des mains et/ou aller à l’hôpital et/ou à la gendarmerie. Foi et
superstition se mêlent alors pour donner naissance à des micro-croyances locales
combinant le divin et l’attachement à un guérisseur. Au Congo, de nouvelles églises,
fondées sur le modèle d’un cabinet médical par un guérisseur-prophète, proposent un
traitement à base de plantes associé à un exorcisme, traitement spirituel. L’exorcisme est
destiné à chasser le démon du corps du patient malade, démon entré dans ce corps à cause
d’une action répréhensible, ou par l’action d’hommes qui cherchent à nuire et dont la force
spirituelle est supérieure [43].
� Survivants
Une étude succincte sur la stigmatisation des survivants a été menée lors de l’épidémie
de 2000 en Ouganda. Bien que la moitié des villageois déclarent se sentir capables d’un
contact avec un survivant de FHVE plus d’un mois après sa sortie de l’hôpital, beaucoup
de convalescents sont mis à l’écart longtemps après cette période. En effet, les douleurs
musculaires et articulaires sont toujours présentes, ainsi qu’une grande fatigue [46] et
Introduction
30
certains convalescents ont été atteints de troubles oculaires [47]. L’amalgame est rapide
pour les villageois qui les considèrent comme toujours contagieux.
Plusieurs survivants ont été plus fortement stigmatisés. Certains n’étaient plus acceptés
dans leur maison, leurs vêtements et biens avaient été brûlés, leur famille les avait
abandonnés. Cette discrimination peut aussi s’étendre aux membres de la famille et du
village. Les survivants sont craints dans leur communauté, ils sont rejetés au marché,
parfois même lorsqu’ils marchent dans le voisinage [48].
La mise à l’écart des survivants peut également découler du modèle d’explication de la
sorcellerie. En effet, la guérison de ces personnes est la preuve de leurs pouvoirs de
sorciers grâce auxquels ils ont pu déjouer le sort. Enfin, l’aide matérielle apportée aux
convalescents suscite les jalousies et déclenche un processus d’accusation.
En Afrique Centrale, dans la région Gabon-Congo, les épidémies sont survenues dans
des villages enclavés où les familles se situent de part et d’autre de la frontière. Les
survivants y sont très entourés, contrairement à l’Afrique de l’Est. Les hommes sont
soutenus et les femmes qui ont soigné leur mari et survécu sont considérées comme de
grandes guérisseuses. La mise à l’écart ne vient pas des villageois, mais bien des
convalescents qui s’écartent d’eux-mêmes pour 2 raisons principales. La première est
l’habitation offerte par l’OMS et construite en bordure du village. La seconde est une
précaution qu’ils prennent en cas de nouvelle épidémie, afin de ne pas en être considéré
comme responsables. Le reste du village les respecterait et craindrait beaucoup moins leur
potentielle contagiosité que leur force spirituelle, qui leur aurait permis de survivre au sort
jeté par un individu plus puissant que la majorité des membres de leur famille [Gasquet C.,
communication personnelle].
II.2. Transmission du virus chez l’Homme
a. Importance du contact lors des soins, des rites funéraires et de la médecine
traditionnelle.
Dès la première apparition en 1976, des études épidémiologiques cherchent à
déterminer les causes et moyens de contamination afin d’enrayer la transmission et mettre
fin aux épidémies. Ces études au sein de foyers hautement infectés ont montré un taux
Introduction
31
d’attaque (taux d’infection secondaire) de 20% des personnes ayant simplement dormi et
touché le cas primaire lors de la phase aiguë de la maladie contre 81% des personnes qui
lui ont apporté des soins [13, 17]. Lors de l’épidémie de Kikwit, 173 membres de familles
ayant eu des contacts avec des malades ont été suivis. Les 78 membres de la famille qui
n’ont eu aucun contact physique avec les personnes malades n’ont développé aucun
symptôme. Les 28 personnes ayant eu des contacts physiques directs avec un malade, soit
pendant la phase précoce de la maladie à domicile, soit pendant l’hospitalisation, ont été
infectés et sont tombés malades à leur tour [49]. Cette étude souligne l’importance d’un
contact physique direct, prolongé et continu entre le malade et le soignant pour que la
contamination ait lieu. De plus, les contacts physiques répétés lors de la phase d’incubation
n’ont pas été associés avec un risque accru de contamination, de même que les contacts
sporadiques tels que parler, partager un repas ou un lit avec un malade. Le sexe n’est pas
un facteur de risque significatif. En effet, autant d’hommes que de femmes sont victimes
de la FHVE du fait de leurs occupations respectives : les hommes, chargés de la chasse
sont le plus souvent les cas index, ils sont également chargés de l’enterrement des autres
hommes ; la population féminine paie son tribu par le biais des soins aux malades et des
funérailles des femmes. Les taux de mortalité des hommes et des femmes sont équivalents,
avec une légère prédominance pour l’un ou l’autre sexe en fonction des épidémies [13, 17,
21, 22, 24]. Un taux d’infection faible (9%) a été observé chez les enfants de moins de 17
ans [49]. Cette faible transmission aux enfants a été expliquée par la tradition africaine de
les tenir le plus souvent possible éloignés des malades [50], ce qui renforce l’idée d’un
contact étroit indispensable à la contamination. Cependant, les épidémies de Booué,
Gabon, en 1996 se sont déclarées chez des adolescents, et 20% des victimes des flambées
de 2001-2002 au Gabon étaient âgés de moins de 14 ans [24].
L’importance de la fréquence de contact avec un patient en phase symptomatique dans
la transmission a été confirmée lors des épidémies de 1994-97 au Gabon et de 2000 en
Ouganda [22, 51].
Les études faites lors des premières épidémies et la ré émergence à Kikwit montrent un
risque de contamination accru pour les personnes assistant aux funérailles d’un cas infecté
[17, 52]. Ce facteur de risque a été confirmé lors de l’épidémie de Gulu, Ouganda en 2000,
pendant laquelle une équipe de chercheurs a interrogé des personnes ayant eu des contacts
qui ont développé ou pas des symptômes (ou les proches des malades décédés). Quatre-
Introduction
32
vingts pourcent d’entre eux déclarent avoir assisté aux funérailles de leur cas index, et près
de 35% ont nettoyé le cadavre [51].
En Ouganda, c’est la tante paternelle du décédé (ou une femme âgée de la lignée
paternelle) qui s’occupe de la toilette et de l’habillement du cadavre. Les personnes
assistant aux funérailles se lavent toutes les mains dans un même récipient, puis sont
invités à venir toucher la dépouille une dernière fois. Le corps est ensuite enveloppé dans
un tissu blanc puis enterré à proximité de la maison [48]. Ce rituel est très important, c’est
pourquoi les parents éloignés font spécialement le voyage pour participer à la cérémonie,
participant ainsi à la propagation du virus dans des villages parfois très distants du foyer
primaire de l’épidémie [49].
Dans les villages du Nord-est du Gabon et de la Cuvette Ouest de la RC, les funérailles
donnent lieu à des rituels similaires. Beaucoup de personnes assistent à l’enterrement, mais
ce sont surtout les membres de la famille qui touchent et pleurent sur le corps du défunt.
Dans les villages, les structures sanitaires ne sont pas toujours fonctionnelles, et les
habitants ont souvent recours à la médecine traditionnelle pour diagnostiquer et soigner les
maladies. Les pratiques des tradipraticiens (appelés nganga) se fondent souvent sur une
thérapie de groupe. Le nganga réuni sous son toit des personnes aux maladies diverses et
les soigne au moyen d’incantations, d’herbes et souvent de scarifications non stériles [53].
Toutefois, suite aux campagnes de lutte contre le SIDA, de nombreux nganga ont
diminué leur recours à la scarification, et ont pris de nouvelles précautions contre le VIH.
Ainsi, ils utilisent des lames propres à chaque patient pour les scarifications. Il existe
également d’autres modes de purification utilisés par les nganga. L’un d’eux est la
purification par l’eau. Si certaines ethnies lavent les impuretés à la source afin qu’elles
soient emportées, certains nganga font puiser l’eau à l’aube par leurs patients et les
soignent au village. Ceux-là peuvent parfois être amenés, par soucis d’économie de l’eau
et/ou des herbes, à réutiliser l’eau pour traiter plusieurs patients.
Les tradipraticiens sont donc considérés comme de potentiels amplificateurs de
l’épidémie par leurs pratiques. Cependant, leur popularité représente également un facteur
d’amplification. Lors de l’épidémie de 2000 en Ouganda, la mort d’une guérisseuse
infectée auprès d’un de ses patients atteint de FHVE illustre ce rôle de la popularité des
tradipraticiens. Dès le début des symptômes, cette femme partit dans son village, où elle
n’y soigna personne, son matériel étant resté en ville. La transmission de la maladie à
plusieurs personnes du village n’était donc pas due aux pratiques traditionnelles, mais au
Introduction
33
fait qu’elle était une puissante guérisseuse. Beaucoup de personnes l’ont donc assistée,
soignée, et ont nettoyé son cadavre pour les funérailles se contaminant par contact direct
[48].
Voyons maintenant quels sont les liquides biologiques assurant la transmission.
Le premier matériel biologique infectieux identifié fut le sang. Dès les premières
épidémies de 1976, les titrages de prélèvements sanguins de malades ont révélé des
virémies importantes durant toute la durée des symptômes. Des macaques rhésus et
cynomolgus (Macaca macaca et Macaca fascicularis) et des singes verts (Cercopithecus
aethiops) infectés expérimentalement par du sang de singes ou humains prélevés en phase
symptomatique ont développé la maladie et presque tous en sont morts [54, 55]. Tout
matériel biologique contenant du sang (écoulement nasal, liquide diarrhéique, vomissures,
c’est-à-dire presque tous dans le cadre d’une fièvre hémorragique) sont donc
potentiellement infectieux pour les muqueuses, une peau abrasée, voire une peau saine.
EBOV a également été isolé dans les urines, la salive et les fécès de macaques infectés
par REBOV [56] et ZEBOV [57]. Chez les humains, la présence de virus a été détectée
jusque 33 jours après le début des symptômes dans l’urine, la salive, les selles, les liquides
vaginal et séminal, les larmes et la peau de patients convalescents [58]. Le virus a
également été mis en évidence dans des biopsies post-mortem de peau et autour des
glandes sudoripares, faisant de la sueur un mode de contamination potentiel [59].
b. Infection nosocomiale
La transmission nosocomiale se produit selon 2 modes.
D’un côté, la mauvaise ou non-application des mesures de protections sanitaires de
base par le personnel médical entraîne leur contamination par contact direct avec les
liquides corporels des patients infectés. Des cas de contamination par frottement des yeux
avec des gants souillés ou lors d’un acte chirurgical ont été recensés [21] et le risque de
piqûre accidentelle avec une aiguille contaminée n’est pas à exclure. Le personnel médical
malade contamine ensuite les patients lors des auscultations ou soins.
D’un autre côté, les patients hospitalisés pour d’autres pathologies et ceux venus en
consultation externe peuvent être contaminés suite à l’injection de médicament avec des
Introduction
34
seringues et aiguilles non stériles réutilisées [17]. Il y a également de nombreuses
occasions de contamination pour ces patients et leurs visiteurs qui parfois aident aux soins
dans les salles d’hôpital, tels que le contact avec des draps ou vêtements souillés, les
bassins hygiéniques, le matériel non stérile, l’air ambiant rempli de particules virales
émises par la sueur, les diarrhées et vomissements [14].
c. Infection par voie respiratoire
Le mode de transmission principal, nous venons de le voir, est constitué par le contact
direct avec un patient malade et ses fluides corporels. Or les enquêtes épidémiologiques
lors des épidémies de 1976 et 1979 au Soudan mettent en évidence plusieurs cas n’étant
pas reliés à un contact physique. De même, lors de l’épidémie de Kikwit, en 1995 en RDC,
5 des 315 cas n’ont eu aucun contact physique avec un malade ou des personnes présentant
les symptômes caractéristiques de la FHVE [52]. Ces victimes sans cas index suggèrent
l’existence d’une voie de transmission autre que le contact physique, probablement une
transmission par les voies respiratoires faisant intervenir de larges gouttes ou des particules
virales aérosolisées.
Lors des épidémies de FHVE de l’espèce Reston qui ont touché les populations de
singes macaques cynomolgus exportés des Philippines, plusieurs cas d’infection sans
contact physique ont également été observés [2, 7, 60]. Ce mode de contamination a été
remarqué lors d’un protocole expérimental visant à étudier le rôle protecteur de l’IFN-α
dans l’infection de singes macaques rhésus par ZEBOV. Tous les singes infectés, qu’ils
aient reçu ou non de l’IFN-α, développèrent des symptômes et moururent. Quelques jours
après le décès du dernier animal, 2 des 3 animaux contrôles négatifs succombèrent à la
FHVE. Une forte présence d’antigène viral fut détectée dans les tissus pulmonaires de ces
animaux, qui étaient détenus dans des cages situées à 3m des animaux infectés
expérimentalement. De plus, pendant toute la durée du protocole, les animaux utilisés
comme contrôles négatifs furent prélevés les premiers, afin d’éviter une contamination
accidentelle par les seringues ou les tampons de prélèvement. Leur contamination n’aurait
pas été le fait d’une contamination accidentelle par le matériel de prélèvement, et la forte
présence d’antigènes dans les tissus pulmonaires suggérait une contamination par voie
aérienne [61].
Introduction
35
Un mode de transmission autre que le contact physique direct fut donc envisagé. Il
ferait intervenir l’exposition des voies respiratoires, conjonctivales ou buccales par des
gouttelettes contenant de fortes quantités de virus, ou des suspensions de particules virales
sous forme d’aérosols [62]. Les gouttelettes ou aérosols contenant EBOV peuvent soit
provenir des projections lors des évacuations de liquides biologiques infectés (vomissures,
liquides diarrhéiques, salive, sueur, …) soit être générés au cours de la respiration.
Dans le but d’étudier le potentiel d’infection aérogénique, différentes infections
expérimentales ont été menées chez le singe. D’abord, l’infection de 8 macaques rhésus, 4
par voie conjonctivale et 4 par voie orale, a induit une pathologie associée à une FHV
aboutissant au décès de 7 animaux [63]. Bien que ces résultats aient été obtenus grâce à de
fortes quantités de virus déposées directement sur les muqueuses, ils doivent tout de même
être pris en considération dans l’application de mesures de précaution lors de la
manipulation d’animaux infectés.
Une autre étude faisant intervenir une inhalation forcée d’une faible quantité de virus a
entraîné la mort des singes infectés et a mis en évidence une forte concentration d’antigène
viral dans l’épithélium des voies respiratoires et les tissus pulmonaires [64]. De même,
l’inhalation de grandes quantités de virus de Marburg provoque la maladie puis la mort
chez les singes verts [65]. Les résultats de ces études sont renforcés par l’analyse en
microscopie électronique et en immunohistochimie des coupes pulmonaires prélevées sur
les animaux décédés. De fortes concentrations d’antigène viral sont retrouvées dans les
alvéoles pulmonaires, le tissu interstitiel pulmonaire et à l’intérieur des pneumocystes de
type I qui tapissent les parois alvéolaires [56, 61, 64, 66]. Enfin, certaines études ont
montré que EBOV est relativement stable dans le milieu atmosphérique et notamment dans
le mucus alvéolaire, et qu’il résiste assez bien à certains traitements physiques
(congélation/décongélation, exposition aux rayons U.V.) [67].
Tous ces arguments suggèrent l’existence d’une transmission aérienne, bien qu’aucun
ne la démontre formellement. Cependant, les faits suggèrent que la transmission aérienne
n’est pas courante. En effet, lors de l’épidémie de 1979 au Soudan, parmi la famille proche
au contact d’un malade, seulement ceux ayant eu des contacts directs et prolongés lors des
soins développaient la maladie. Les membres de la famille exposés à un malade dans
l’espace confiné, relativement petit et peu ventilé qu’est une hutte ou une chambre
commune étaient épargnés [14]. De même, le petit nombre de cas sans contact physique
avec un malade lors de l’épidémie de Kikwit (5 cas sur 315, soit 1,6%) rend l’hypothèse
d’une transmission par voie aérienne peu probable [52]. Néanmoins, la mise en évidence
Introduction
36
par des études expérimentales de ce mode de contamination, soit par gouttelettes, soit par
aérosols, justifie la mise en place de mesures de prévention dans les hôpitaux et les centres
de recherche lors de la survenue de cas cliniques [62].
d. Autres modes de contamination
Un autre de mode de transmission concerne le virus de Marburg et n’a été observé
qu’une seule fois. Trois mois après l’épidémie qui a touché l’Institut virologique de
Marburg, la femme d’un technicien survivant est tombée malade. Les analyses
virologiques ont révélé que cette femme avait été contaminée par le sperme de son mari
lors de sa convalescence [68]. Ce mode de transmission a été corroboré par la détection de
virus infectieux dans le sperme d’un technicien de laboratoire en Angleterre qui avait
développé les symptômes caractéristiques de la FHVE plus de 2 mois avant [18]. Lors de
l’épidémie de Kikwit, RDC, en 1995, une étude sur la persistance d’EBOV chez 12
patients convalescents a permis de mettre en évidence la présence de virus jusqu’à 101
jours dans le fluide séminal, et la présence de virus infectieux dans le sperme d’un patient
82 jours après le début des symptômes [58]. Toutefois, aucune contamination par ce mode
n’a été observée avec EBOV.
Introduction
37
III.3. Cycle naturel du virus Ebola
a. Transmission aux espèces sensibles : Hommes et Primates
La propagation inter-humaine de la maladie a lieu, comme nous l’avons vu
précédemment, par le contact physique répété avec les fluides corporels d’un individu
infecté et en phase symptomatique. L’origine suspectée de l’épidémie, ou cas index, est la
personne qui a contracté la maladie auprès d’un animal, et non d’un autre individu malade.
� Infection du cas index à partir d’un animal malade.
La plupart des épidémies de FHVE ont eu comme une source de contamination un
animal connu.
En Côte d’Ivoire, en 1994, une éthologue suisse s’est contaminée lors de l’autopsie
d’un chimpanzé. L’étude d’identification a montré qu’il était infecté par la même souche
virale que l’éthologue [10].
Au Gabon, en 1996, les cas index furent des adolescents ayant dépecé un cadavre de
chimpanzé trouvé en forêt [22]. Les flambées épidémiques de 2001-2002 dans le Nord-est
du Gabon ont débuté par la manipulation d’un céphalophe (Cephalophus monticola) trouvé
mort, une partie de chasse ou la manipulation de la viande d’un gorille (Gorilla gorilla)
[24].
Au Congo, les épidémies de Mbomo-Kelle et de Mbandza, en 2003, et Etoumbi en
2005, suivirent des contacts avec des gorilles ou d’autres mammifères tués ou trouvés
morts.
Les primates et certains mammifères sont sensibles à EBOV et pourraient jouer le rôle
de vecteur du virus pour l’aider à traverser la « barrière écologique » séparant l’espèce
réservoir et l’homme.
� Infection du cas index à partir du réservoir
Cependant, certaines épidémies survinrent sans source animale identifiée. Les
premières épidémies au Soudan en 1976 et 1979 débutèrent par quelques travailleurs d’une
usine de coton tombés malades, aucun contact avec un animal ni aucune chasse en forêt ne
furent enregistrés [13, 14]. L’origine de l’épidémie en RDC en 1976 fut un homme venu à
l’hôpital avec des symptômes présumés de paludisme [17]. Le cas index de la ré-
Introduction
38
émergence en 1995 contracta la maladie soit dans la mine de charbon où il travaillait, soit
dans sa plantation [21].
Ces cas index se seraient donc infectés directement auprès de l’espèce réservoir.
b. Recherche de l’espèce réservoir
Le réservoir est une (ou des) espèce(s) animale(s) dans lesquelles le virus peut se
répliquer de manière asymptomatique. La question de l’hôte naturel d’EBOV est
longtemps restée posée, le voile commençant seulement à se lever sur ce mystère. De
nombreuses enquêtes de terrain et de laboratoire ont été initiées afin d’identifier l’espèce
animale, vertébrée ou invertébrée, capable d’héberger le virus sans développer de maladie.
� Enquêtes de terrain
La première enquête de terrain eut lieu lors de l’épidémie de Yambuku, en 1976 en
RDC. Des insectes et animaux autour et dans les habitations des malades ont été capturés
et l’isolement viral a été tenté sur des lignées cellulaires sensibles à EBOV, telles que la
lignée de cellules de rein de singe vert (cellules Vero). Les cellules ont été infectées par le
broyat des moustiques et de 818 punaises de lit capturés, ou par le sérum de 10 cochons
domestiques, 1 vache, 7 chauves-souris, 123 rongeurs, 8 écureuils, 6 singes cercopithèques
ou 2 petites antilopes (Cephalophus monticola). Aucun isolement viral n’a pu être obtenu
[17]. Une étude similaire portant sur une capture de 501 vertébrés a été menée au Soudan
au moment de l’épidémie de 1976, avec les mêmes résultats [69].
Après le cas isolé d’infection par ZEBOV à Tandala, RDC, en 1977 [19],
d’importantes captures furent entreprises durant la saison sèche de 1979 dans cette région
du Nord de la RDC. Cette étude, centrée sur Yambuku et Tandala, à environ 300 km, a été
menée sur 267 primates, 463 chauves-souris, 137 écureuils, 514 rongeurs, 186 autres
mammifères, 67 oiseaux et 30 reptiles. Aucun isolement viral n’a pu être obtenu [70].
A la suite de l’épidémie de 1995 en RDC, 2 nouvelles enquêtes de terrain ont été
menées. Dès la fin de l’épidémie, 3 066 vertébrés [71] et 27 843 arthropodes [72] ont été
capturés dans des habitats proches de Kikwit, ainsi que dans les champs où le cas index
travaillait. Des tentatives d’isolement viral et les dosages d’Immunoglobuline G (IgG)
circulant chez les vertébrés furent réalisées, ne donnant lieu à aucun isolement et à aucune
Introduction
39
détection d’anticorps. La collection de vertébrés comprenait, entre autres, 1914 rongeurs,
539 chauves-souris, 265 oiseaux et 129 reptiles et amphibiens. La collection d’arthropodes
était constituée de 15 118 moustiques, 6 538 punaises de lit, 144 puces, 103 poux et 5 816
tiques.
Récemment, une enquête de prévalence en anticorps a été menée sur 439 chiens dans le
Nord-est du Gabon. Cette étude a été entreprise suite à l’observation, lors des épidémies de
2001-2002, que le léchage et/ou le comportement charognard des chiens les exposait
fortement à EBOV. Dans les villages ayant enregistré des cas, 25 % des chiens prélevés
présentaient des anticorps dirigés contre le virus. Ces résultats suggèrent que les chiens
puissent être infectés par EBOV, et que cette infection serait asymptomatique. Sans en être
l’espèce réservoir (les contacts homme-chien sont trop fréquents et réguliers par rapport à
l’apparition sporadique des épidémies), les chiens pourraient être des vecteurs du virus et
avoir un rôle de source primaire ou secondaire d’infection de l’homme [73].
� Infections expérimentales
Parallèlement aux enquêtes de terrain, plusieurs infections expérimentales d’animaux,
plantes ou arthropodes ont été effectuées. Les tentatives d’inoculation par voie intra-
thoracique d’arthropodes avec REBOV [74] ou ZEBOV [75] n’ont pas abouti à la
détection de réplication virale. Une autre étude a mis en évidence une virémie élevée
pendant près de 4 semaines chez des chauves-souris insectivores et frugivores infectées
expérimentalement par ZEBOV [75]. Ces résultats ne procurent pas la preuve définitive
que les chauves-souris pourraient être le réservoir d’EBOV, mais ils ouvrent un axe de
recherche pour les enquêtes de terrain.
� Éléments de spéculation sur le réservoir
Plusieurs hypothèses plus ou moins fiables ont été émises sur la nature du réservoir et
la méthode à utiliser pour le découvrir. Dans ce but, des indicateurs pratiques sont
proposés. Il s’agit d’accumuler des preuves épidémiologiques, puis d’identifier l’infection
naturelle par détection d’anticorps ou par isolement du virus, et enfin de caractériser le(s)
agent(s) pathogène(s) trouvé(s) [76]. Une autre méthode propose d’émettre une série de
postulats concernant la nature du réservoir, de développer une liste de mammifères
répondants aux critères émis et dont la distribution correspond à la zone endémique, afin
d’étudier les différentes espèces par ordre de priorité [77].
Introduction
40
Cependant, l’animal sur lequel pèsent le plus de soupçons est la chauve-souris (pour
revue [28]). Cette hypothèse est appuyée non seulement par des infections expérimentales
encourageantes mais aussi par quelques constatations. (i) Des chauves-souris ont été
repérées dans des entrepôts de l’usine de coton de Nzara, au Soudan, où eurent lieu les
premières épidémies [13]. L’Australien infecté par MARV qui a contaminé 2 personnes à
Johannesburg en 1975 rentrait d’un voyage au Zimbabwe durant lequel il dormait souvent
à la belle étoile et plus d’une fois dans une maison abandonnée dont le grenier était habité
par de nombreuses chauves-souris [78]. De même, 2 semaines avant de tomber malade,
l’ingénieur français victime du virus de Marburg au Kenya en 1980 avait visité un parc
national et il était entré dans des grottes abritant une large population de chauves-souris
[79]. Dans le but de tester l’hypothèse de la contamination par les chauves-souris, des
babouins et singes vervets ont été placés en cage à l’intérieur de la grotte incriminée.
Aucun des animaux ne tomba malade [80]. (ii) Certaines espèces virales génétiquement
proches des Filoviridae, telles que les Rhabdoviridae et les Paramyxoviridae, ont les
chauves-souris pour hôte naturel [35].
Cependant, l’hypothèse des arthropodes comme réservoir ou vecteur ne doit pas être
définitivement écartée. Bien que les infections expérimentales n’aient donné que des
résultats négatifs [74, 75], l’Australien infecté par MARV en 1975 a déclaré avoir été
piqué ou mordu par un arthropode inconnu 6 jours avant le début des symptômes [78]. De
plus, l’infection expérimentale de moustiques Aedes aegypti a montré la persistance de
MARV pendant plus de 3 semaines [81].
� Les chauves-souris, espèce réservoir ?
Les connections épidémiologiques ainsi que quelques infections expérimentales font
peser de lourds soupçons sur les chauves-souris frugivores. Dans le but de vérifier ces
présomptions, des enquêtes de terrain ont été menées avec 3 missions de capture
d’animaux dans 2 zones forestières touchées par différentes épidémies entre 2001 et 2004.
Les filets de captures ont été posés dans un rayon d’une dizaine de km autour du lieu où
une carcasse de gorille a été trouvée infectée par EBOV. Les captures se sont étendues sur
3 semaines, quelques jours après la découverte de la carcasse. Au total, 1 030 animaux,
dont 679 chauves-souris ont été capturés [82].
Introduction
41
Les analyses de laboratoire, combinant détection d’anticorps dirigés contre EBOV
(IgG) et amplification de séquences virales, ont montré que 3 espèces de chauves-souris,
Hypsignathus monstrosus, Epomops franqueti et Myonycteris torquata, sont
asymptomatiquement infectées par EBOV. Des IgG ont été détectées chez des individus de
ces espèces. L’amplification virale a été possible chez ces mêmes espèces, mais à partir
d’individus différents [83]. Ces premières preuves de l’infection asymptomatique de
chauves-souris frugivores étayent l’hypothèse émise par les précédentes investigations
identifiant ces animaux comme réservoir candidat (Figure 4).
Figure 4 : Distribution
géographique des espèces de
chauves-souris frugivores
suspectées réservoir d’EBOV.
Hypsignathus monstrosus en bleu,
Epomops franqueti en rouge et
Myonycteris torquata en jaune.
D’après Leroy [83]
Des analyses phylogénétiques ont été menées sur les séquences amplifiées à partir des
chauves-souris capturées. Les séquences obtenues se groupent avec les séquences déjà
connues de l’espèce Zaïre. Ce résultat confirme l’appartenance du virus qui infecte les
chauves-souris à l’espèce ZEBOV [83]. La disposition des séquences en fonction du temps
suggère des relations de descendance. Les populations des 3 espèces de chauves-souris
auraient pu subir une diminution drastique due à des conditions écologiques et
environnementales inconnues. Cette réduction aurait diminué la population virale, faisant
Introduction
42
disparaître les lignées virales existantes, à l’exception d’une seule. Les variations
génétiques observées seraient alors la conséquence d’une accumulation de mutations
ponctuelles lors des 30 dernières années [84]. Cependant, ces découvertes n’excluent pas
l’existence d’autres espèces de chauves-souris ou d’autres animaux abritant naturellement
EBOV.
Toutefois, le mode et les conditions de transmission d’EBOV des chauves-souris aux
humains restent à découvrir. Les analyses phylogénétiques suggèrent une introduction
récente d’EBOV dans les 3 espèces de chauves-souris étudiées. Dans l’hypothèse où les
chauves-souris ne seraient pas le seul réservoir de ZEBOV, l’existence d’un ancêtre
commun viral pourrait être expliquée par l’introduction du virus chez les chauves-souris
frugivores au même moment où le virus a infecté d’autres populations sauvages et a
émergé chez l’homme. Cette hypothèse impliquerait l’existence d’un réservoir primaire à
découvrir [84].
Les enquêtes épidémiologiques ont montré que la mortalité due à EBOV chez les
grands singes est accrue pendant la saison sèche. Or vers la fin de cette saison, les denrées
alimentaires se raréfient en forêt. Différentes espèces animales frugivores, dont les grands
singes et les chauves-souris, se retrouveraient donc au même moment à consommer les
mêmes fruits dans une zone restreinte. Cette compétition pour la nourriture favoriserait et
augmenterait les contacts entre les 2 espèces, par la salive laissée sur les fruits, l’urine ou
les fécès. De plus, la saison sèche est la période des mises bas groupées chez les femelles
chauves-souris. Cet événement physiologique permettrait la réplication du virus chez les
chauves-souris gestantes, grâce à la modification de la nature et du niveau de la réponse
immunitaire, pouvant aller jusqu’à favoriser l’apparition de virus dans la circulation
sanguine. Les grands singes se contamineraient alors à partir du sang et/ou des tissus
placentaires [82, 83].
Le cycle naturel du virus Ebola se compose donc de 3 étapes : (i) la transmission de
virus de l’espèce réservoir à une espèce sensible (primate ou directement l’homme) ; (ii)
contamination de l’homme à partir d’un animal infecté ; (iii) transmission inter-humaine
avec l’hôpital comme amplificateur de l’épidémie (Figure 5).
Introduction
43
Figure 5 : Schéma récapitulatif de l’épidémiologie de l’infection par EBOV. Le virus est conservé et
circule dans la forêt tropicale d’Afrique centrale à l’intérieur d’une population réservoir, probablement les
chauves-souris frugivores. Dans des conditions environnementales précises, les espèces réservoirs et
sensibles partageraient les mêmes aire de répartition et nourriture, favorisant la contamination des primates.
L’homme se contamine auprès des cadavres de grands singes infectés par EBOV, ou auprès de gibier infecté
et tué lors de parties de chasses. L’homme pourrait aussi se contaminer directement auprès de l’espèce
réservoir. Une épidémie se déclare lorsque le cas index transmet le virus à sa famille et ses amis. L’infection
est relayée et amplifiée par l’hôpital et peut se propager dans des villes et villages très éloignés du foyer
primaire.
Introduction
44
III. Les épidémies
III.1. Caractéristiques cliniques chez l’homme
En 1976, 2 épidémies d’une maladie inconnue se sont déclarées quasi simultanément
dans le Sud du Soudan et au Nord de la RDC. Bien que les taux de mortalité diffèrent entre
les 2 épidémies, les symptômes furent uniformes, à des degrés différents (Tableau I).
La maladie se déclare soudainement. Les premiers symptômes ressemblent à un état
grippal, avec une forte fièvre, maux de têtes soudains douloureux et persistants.
Simultanément, le patient est faible, ses articulations ainsi que ses muscles cervicaux et
lombaires sont douloureux. Deux jours après le début des symptômes, les manifestations
pulmonaires et gastro-intestinales apparaissent. Elles correspondent à une douleur dans la
poitrine associée à une toux sèche, avec une sensation de balle dans la gorge, une diarrhée
plus ou moins sanguinolente ainsi que des vomissements qui entraînent la déshydratation,
des douleurs abdominales et une annorexie. Les symptômes hémorragiques sont le plus
souvent discrets et apparaissent majoritairement chez les patients dont l’issue sera fatale
(Tableau I). Ils se caractérisent par des méléna (évacuation par l’anus de sang noir, car en
partie digéré, mélangé ou non aux selles), hématémèse (rejet de sang par la bouche lors du
vomissement), épistaxis (communément appelé un saignement de nez), des saignements
aux points d’injection, gingival, oral, vaginal, cutané et/ou conjonctival. Des
manifestations cutanées ont été observées 5 ou 6 jour après le début des symptômes, il
s’agit de rash et de desquamations localisés souvent sur le tronc, les avant-bras ou les
cuisses. Certains patients présentent également des troubles nerveux traduits par des
comportements bizarres, une grande léthargie ou une prostration. Le décès survient 7 à 8
jours après le début des symptômes [13, 17, 85, 86]. La période de convalescence dure 1 à
3 semaines. Cependant, le suivi de groupes de survivants pendant 6 mois montre qu’ils
souffrent d’arthralgie, myalgie, douleurs abdominales, d’extrême fatigue et d’anorexie, qui
se résolvent seuls au cours du temps [46].
En 1994 en Côte d’Ivoire, l’éthologue s’est contaminée lors de l’autopsie d’un
chimpanzé par un virus de l’espèce CIEBOV. Ses symptômes correspondaient au tableau
clinique présenté pour les espèces Zaïre et Soudan. Cependant, aucune manifestations
hémorragiques ne fut observée [9, 11].
Introduction
45
Le Tableau I résume les principaux symptômes et compare leurs fréquences
d’apparition entre les patients survivants et les patients décédés. Ces fréquences sont
obtenues grâce à un questionnaire rétrospectif des convalescents et des membres de la
famille proche des patients décédés. D’autres manifestations cliniques ont été observées
lors des différentes épidémies de FHVE.
Chez les femmes enceintes, l’avortement spontané est fréquent. Sur les 15 femmes
enceintes hospitalisées à Kikwit, RDC, en 1995, une seule a mis au monde un prématuré
mort-né. Une seule femme a survécu, mais elle a du subir un curetage suite à un
avortement incomplet au 8è mois. Les autres femmes enceintes ont succombé à la FHVE
avant leur délivrance. A Yambuku en 1976, 23% des femmes enceintes ont avorté
spontanément. Les rares enfants nés à terme (1 à Kikwit et 10 à Yambuku) sont morts
quelques jours après leur naissance. Ces nourrissons sont considérés comme cas probables
contaminés par leur mère, bien qu’il n’y ait ni confirmation, ni certitude sur le mode de
contamination (in utero, pendant l’accouchement, suite à l’allaitement) [17, 87].
Certains patients survivants souffraient de douleur oculaire, de photophobie,
d’hyperlacrimation et d’une perte d’acuité visuelle progressive. Ces patients étaient atteints
d’uvéites, inflammation de la membrane intermédiaire entre l’enveloppe externe de l’œil et
la rétine [47]. Cette pathologie a également été observée chez un patient atteint par MARV
en Afrique du Sud [78].
Enfin, une patiente de Kikwit transportée dans la capitale Kinshasa présenta un abcès
péri-orbital douloureux accompagné d’une cécité de l’œil droit. Une biopsie de la paupière
permit de mettre en évidence un mucormycosis, infection opportuniste fongique des sinus,
du cerveau ou des poumons qui apparaît chez les personnes immunodéprimées ou
diabétiques. Or cette patiente n’était pas diabétique, et le test de sérologie se révéla négatif
pour le VIH. Deux ans après l’intervention et le traitement, les séquelles furent une cécité
de l’œil droit, une ophtalmoplégie droite (anomalie de la motilité de l’œil) et une légère
paralysie faciale [88].
Introduction
46
Tableau I : Fréquences des symptômes entre des patients survivants et d’autres dont l’issue était fatale
[86]
Symptômes % patients décédés % patients convalescents
Fièvre 100 100
Céphalées 100 40
Diarrhée 94 100
Vomissements / nausées 89 / 78 60 / 60
Saignements
(points injection) 39 0
Méléna 56 0
Saignement
gingival / oral 39 0
Douleurs abdominales 100 80
Arthralgie 22 20
Conjonctivite 89 40
Hématémèse 39 0
Épistaxis 6 0
Asthénie 100 100
Anorexie 94 100
III.2. Méthodes de diagnostic
Dans la zone d’endémie du virus Ebola, de nombreuses pathologies et fièvres
hémorragiques virales partagent des symptômes communs. En effet, la Vallée du Rift, la
fièvre de Crimée-Congo, Lassa, la fièvre jaune, la dysenterie, le paludisme, les fièvres
hémorragique à virus Ebola et de Marburg présentent des manifestations cliniques
similaires : accès de fièvre soudain, des céphalées, des douleurs musculaires et articulaires,
des diarrhées pour certaines et des symptômes hémorragiques pour les cas sévères. Le
diagnostic à partir des observations cliniques peut donc être faussé, c’est pourquoi une
confirmation en laboratoire est indispensable afin de prendre les mesures de lutte
adéquates.
Introduction
47
a. L’examen direct du virus
La forme caractéristique des filovirus permet de visualiser directement les particules
virales ou leurs antigènes grâce à l’utilisation de sérums polyclonaux spécifiques [89].
� La microscopie électronique
Cette méthode consiste à observer le virus dans des échantillons sanguins, des
surnageants de cultures cellulaires infectées par un sérum ou des coupes d’organes (peau,
foie, rate, rein) découpés et fixés sur des lames. La différentiation entre les espèces Ebola
ou Marburg est obtenue par microscopie immunoélectronique, en utilisant des anticorps
spécifiques [90].
Les culots de cellules infectées, les sérums ou les organes sont fixés dans du
glutaraldéhyde, puis subissent une contre-fixation dans une solution de tétroxyde
d’osmium à 1%. Les échantillons sont ensuite colorés par une solution d’acétate d’uranyl,
déshydratés puis fixés dans une résine. Des sections ultrafines sont découpées, puis
colorées par une solution d’acétate d’uranyl et de citrate de plomb. Les sections sont
ensuite récoltées et examinées à 80kV [90-92].
La microscopie immunoélectronique utilise un protocole similaire. Les cellules ou
organes sont d’abord fixés dans une solution de paraformaldéhyde-glutaraldéhyde (2%-
0,1%) puis stérilisés par irradiation gamma et fixés dans une résine. Les sections ultrafines
de résine sont immergées dans un mélange d’anticorps monoclonaux dirigés de souris
contre les protéines virales. Ces anticorps sont à leur tour reconnus par des anticorps anti-
souris marqués par des billes d’or [90]. Les sections sont ensuite fixées et colorées.
Cette technique a été utilisée pour mettre en évidence la présence de ZEBOV dans des
coupes de foie et de rate [54, 61] ; de SEBOV dans des coupes de foie, rein, rate et
poumons (Figure 6) [91] ; de REBOV dans des coupes de foie [54, 66] et de rate [61]. Elle
a également permis de visualiser les particules virales extracellulaires [54] et les inclusions
intracytoplasmiques. La microscopie électronique a été utilisée pour étudier l’assemblage
des virions et leur sortie de la cellule [93, 94].
Introduction
48
Figure 6 : Vue générale de particules d’Ebolavirus, espèce Soudan, dans une coupe de foie d’après Ellis
et al. [91]. Les flèches indiquent les particules virales filamenteuses.
� L’immunohistochimie
La méthodologie de cette technique ressemble à celle de la microscopie électronique
[59]. Les prélèvements d’organes sont stockés dans de la paraffine. Avant utilisation, ils
sont nettoyés de toute trace de paraffine, et réhydratés. Comme pour la microscopie
électronique, l’échantillon est mis en présence d’anticorps polyclonaux dirigés contre
EBOV. Cependant, le second jeu d’anticorps est marqué par la biotine, et la révélation
utilise la streptavidine conjuguée à une phosphatase alcaline. L’activité de la phosphatase
alcaline est détectée grâce au substrat naphtol/rouge, puis les sections sont contre-colorées
par l’hématoxyline.
Cette technique fut utilisée pour détecter la présence de virus dans des prélèvements
post-mortem de peau lors de l’épidémie de Kikwit, RDC (Figure 7) [59]. Elle a également
servi à diagnostiquer l’infection par EBOV du chimpanzé autopsié par l’éthologue suisse
dans la forêt de Taï en Côte d’Ivoire [10, 95] et à identifier l’espèce Reston responsable des
épizooties survenues aux USA en 1990 [1, 66].
Introduction
49
Figure 7 : Visualisation par immunohistochimie des particules d’EBOV sur coupe de peau
(grossissement x50) d’après Zaki et al. [59]. De grandes quantités d’antigène viral peuvent être observées à
proximité des glandes sudoripares.
� Intérêt de ces méthodes
Ces techniques sont très sensibles. Leur efficacité a été prouvée par la concordance des
résultats avec ceux obtenus par les techniques sérologiques lors de l’épidémie de Kikwit,
RDC. De plus, l’immunohistochimie a permis de montrer la présence d’antigènes viraux
dans un prélèvement de peau d’un patient convalescent, dont les tests sérologiques étaient
négatifs. Ce résultat indique que le virus persisterait plus longtemps dans les tissus que
dans la circulation sanguine [59]. Enfin, la méthode de prélèvement en elle-même (avec
une pince) est plus sécurisante, et l’échantillon est inactivé est immédiatement inactivé par
la fixation par la formaline.
Cependant, ces techniques ne sont pas adaptées au diagnostic de routine lors d’une
épidémie. En effet, elles nécessitent un matériel lourd inadapté aux conditions de terrain et
l’établissement du diagnostic est trop long.
Introduction
50
b. Isolement viral
L’isolement viral est la technique de diagnostic de référence qui a permis la première
identification des virus Ebola et de Marburg.
� Méthode
L’ isolement viral consiste à infecter des lignées cellulaires permissives ou des animaux
sensibles par des sérums suspects ou des suspensions de broyats d’organes. L’identification
du virus est ensuite assurée par une technique immunologique spécifique. Les premiers
isolements en 1976 ont été effectués sur lignées de cellules de rein de singes verts (cellules
Vero) et par infection de cochons d’Inde [13]. Les animaux susceptibles à EBOV sont les
souriceaux âgés de 1 à 3 jours et les cochons d’Inde. La première inoculation se réalise
souvent avec un sérum infecté par voie intrapéritonéale. Plusieurs passages successifs par
inoculations de broyat de foie issu du passage précédent sont nécessaires avant que
l’animal ne développe des symptômes [96]. La mortalité et la présence de symptômes chez
le souriceau ou le cochon d’Inde atteste de la présence d’un agent pathogène dans le sérum
humain testé.
Le virus est isolé dans des flasques de 25cm3. Le sérum infecté ou la suspension de
broyat d’organe dilués sont déposés sur un tapis de cellules confluentes. Lorsque les effets
cytopathogènes apparaissent, le surnageant est collecté pour confirmation de l’isolement
par microscopie électronique, immunohistochimie, capture d’antigène ou RT-PCR. Les
effets cytopathogènes sont caractérisés entre le 3è et 4è jour par un « lâcher de ballons »,
puis par la formation de plages de lyse de taille croissante dans le tapis cellulaire dès le 7è
jour après inoculation [1].
Les espèces Zaïre, Côte d’Ivoire, et de MARV ont été isolées sur cellules Vero.
L’isolement des espèces Reston et Soudan s’avère plus difficile sur cette lignée cellulaire
et plusieurs passages en aveugle sont nécessaires [97]. Les cellules de rein de macaques
rhésus fœtal, MA-104, sont plus sensibles et plus appropriées à ces 2 espèces. D’autres
lignées cellulaires telles que les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine
(HUVEC) [98] ou les monocytes/macrophages humains différenciés sont également
sensibles à EBOV.
Introduction
51
� Quantification des charges virales
� Charge virale infectieuse
La quantification du virus a d’abord été déterminée en fonction de l’infectivité de
l’échantillon sur un modèle animal [99]. Cependant, cette méthode est peu reproductible en
raison de réactions des animaux à l’infection trop disparates. Deux techniques semblables
ont donc été développées sur lignées cellulaires pour quantifier les virus infectieux. Il
s’agit du test de plages et de celui de zones de fluorescence.
Le test de plages consiste à infecter des cellules Vero, non pas en flasques, mais en
puits de 6 ou 12 puits. Au 6è jour de culture, les cellules sont recouvertes d’une couche
d’agarose contenant du rouge neutre. Dès le lendemain, des plages blanches sont visibles à
l’œil nu aux endroits où le virus s’est répliqué. Le titre viral est alors proportionnel au
nombre de plages de 2 à 5 mm de diamètre, il est exprimé en log10 d’unités formant plages
(PFU) [100]. Cette méthode est peu sensible, des sérums de patients testés positifs par
d’autres techniques dont l’isolement viral peuvent ne former aucune plage.
Le test des zones de fluorescence est basé sur le même principe, mais les zones de
réplication sont détectées par un sérum de lapin dirigé contre EBOV, lui-même reconnu
par des anticorps conjugués à la fluorescéine [101]. Le titre est exprimé en unité de foyer
fluorescent (FFU)/ml. Cette technique est plus sensible que le test de plages, probablement
grâce à l’identification microscopique des zones de fluorescence.
� Charge virale totale
Le développement de la RT-PCR (transcription inverse et réaction de polymérisation
en chaîne) quantitative ou en temps réel a ouvert un nouvel axe d’études pour le diagnostic
rapide. Cette technique consiste à amplifier une séquence d’ARN viral et déterminer
simultanément la quantité de copies d’ADN d’origine virale présentes dans le milieu de
réaction.
La première mise au point de cette technique pour détecter EBOV a été réalisée avec
des sérums de patients infectés. En moins de 6h, la RT-PCR en temps réel a permis de
mesurer le nombre de copies d’ARN viral chez un patient malade et chez un convalescent,
sans aucun faux positif. Le gène de la polymérase était amplifié et détecté grâce au
Introduction
52
SybrGreen, fluorophore s’intercalant dans l’ADN [102]. L’éventualité d’une amplification
non-spécifique doit tout de même être écartée en faisant migrer les produits de PCR sur gel
d’agarose et en les séquençant.
Lors de l’épidémie de Gulu, Ouganda, en 2000, la détection par sonde Taqman a été
développée. La sonde, couplée à un fluorophore, est complémentaire à une séquence de
l’ADN à mesurer, ce qui permet à la technique d’être beaucoup plus spécifique [103].
Enfin, sur la base de la RT-PCR en temps réel, a été développée une technique de
transcription inverse suivie d’une amplification isotherme (RT-loop mediated isothermal
amplification, RT-LAMP). Cette méthode de détection rapide cible la région trailer du
génome viral. Elle permet de détecter un nombre faible de copies en un temps très court
(104 FFU détectées en 20 minutes). De plus, cette technique ne nécessite pas d’instrument
sophistiqué, elle peut donc être utilisée facilement sur le terrain [104].
Cette technique est utilisée comme diagnostic rapide lors d’une épidémie, pour
comparer les charges virales entre les patients convalescents et ceux qui décèdent [102,
105], ou pour tester des composants antiviraux [106].
� Intérêt de ces méthodes
L’ isolement viral reste la méthode de diagnostic de référence. Cependant, cette
technique n’est pas appropriée pour un diagnostic en routine car les délais sont trop longs
et elle nécessite un laboratoire de biosécurité de niveau maximal de type 4. De plus, la
comparaison des différentes techniques de diagnostic lors de l’épidémie de Kikwit, RDC,
montre que l’isolement du virus n’est possible que pendant la phase symptomatique, au
plus jusqu’à 2 semaines après leur apparition [101]. L’isolement est la première étape
obligatoire pour les études de caractérisation morphologique, structurale et moléculaire des
virus.
La quantification de la charge virale totale, bien que hautement spécifique et rapide,
utilise des amorces et des sondes spécifiques d’une espèce et/ou souche virale. Pour rester
à jour, cette technique nécessite de dessiner et utiliser de nouvelles sondes et amorces au
fur et à mesure des caractérisations de souches virales [102]. Bien que cette technique soit
la plus rapide et la plus spécifique méthode de diagnostic à ce jour, les conditions idéales
de manipulations ne sont pas toujours obtenues dans un laboratoire de terrain, et les
Introduction
53
villages dans lesquels sévissent les épidémies de FHVE n’ont pas toujours d’électricité ou
de générateur pour faire fonctionner l’appareil et son ordinateur.
c. Détection de la présence virale
Les antigènes viraux peuvent être détectés par immunofluorescence, capturés par
ELISA ou le matériel génétique viral peut être amplifié par RT-PCR.
� Immunofluorescence
Les techniques d’immunofluorescence classique permettent de détecter efficacement
les particules virales dans des suspensions de foie, rate ou reins [89]. La révélation y est
assurée par la conjugaison de l’anticorps final avec la fluorescéine. La détection par
immunohistochimie, la deuxième technique d’immunofluorescence, a été décrite
précédemment.
� Capture d’antigènes par ELISA
La technique de reconnaissance des antigènes Ebola a été mise au point lors des
épizooties de 1990 [107]. L’Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay (ELISA) est basée sur
la double reconnaissance des antigènes viraux par un mélange d’anticorps monoclonaux de
souris fixés à la plaque et par un sérum de lapin anti-EBO.
Cette technique a depuis été utilisée pour le diagnostic de toutes les épidémies
survenues en Afrique.
Récemment, la spécificité de cette technique a été améliorée par le développement
d’anticorps poly- et monoclonaux dirigés contre les protéines d’enveloppe (GP) des 3
espèces Soudan, Zaïre et Reston [108] ainsi que contre la protéine de matrice (VP40) des 4
espèces virales [109].
� RT-PCR
La caractérisation des différentes souches virales responsables des épidémies de FHVE
a permis de développer la technique de transcription inverse et réaction de polymérisation
en chaîne (RT-PCR). Cette technique autorise la détection rapide d’ARN viral, les
Introduction
54
séquences obtenues sont ensuite comparées avec les séquences virales connues. L’ARN
viral peut être obtenu à partir de sang ou de tissus prélevés en période de symptômes ou
par nécropsie [110]. En effet, cette technique permet de détecter l’ARN viral 24 à 48h plus
tôt que les autres méthodes de diagnostic, et jusqu’à 3 semaines après la fin des symptômes
[111].
La RT-PCR permet d’amplifier le gène codant pour la polymérase (L), qui est le plus
stable du génome, et celui codant pour la nucléoprotéine (NP) qui est exprimé en
abondance [105].
Récemment, la technique a été améliorée en fonction de la diversité des filovirus. La
méthode de PCR consensus développée met en jeu un mélange d’amorces spécifiques à
chaque espèce virale. La nouveauté réside dans l’automatisation de l’analyse des séquences
qui repose sur une base de données en constante évolution [112].
� Intérêt de ces méthodes
La capture d’antigène constitue le test de référence. La comparaison avec d’autres
méthodes de diagnostic lors de l’épidémie de Kikwit montre que ce test est hautement
sensible et spécifique pour les patients en phase symptomatique [101]. Ces méthodes sont
très rapides et donnent en quelques heures des résultats fiables dès les premiers jours de
symptômes [107]. L’inactivation des échantillons testés par irradiation ou par
dodécylsulfate de sodium permet de l’utiliser en l’absence de laboratoire spécialisé.
La RT-PCR est une technique rapide, très sensible et hautement spécifique. Cependant,
les molécules d’ARN peuvent être détériorées par de mauvaises conditions de stockage
pendant le transport du lieu d’épidémie au laboratoire et/ou si l’extraction n’est pas opérée
correctement. La détection par RT-PCR vient donc en complément de la capture
d’antigènes et de l’isolement viral [110].
Introduction
55
d. Diagnostic sérologique
� Immunofluorescence Indirecte (IFI)
Cette technique consiste à faire réagir les sérums à tester sur un broyat de cellules Vero
infectées fixé sur des lames. L’interaction est révélée par des anticorps spécifiques dirigés
contre les immunoglobulines G (IgG) ou les IgM et conjugués à la fluorescéine [113, 114].
L’immunofluorescence indirecte est longtemps restée la seule méthode pour le
diagnostic et le dosage des anticorps. Elle fut utilisée lors des épidémies de 1976 et 1979 et
lors des enquêtes de séroprévalence [38, 40, 115]. Cependant, cette technique possède une
faible spécificité et a causé de nombreux résultats faux-positifs lors des enquêtes [39].
� Détection d’anticorps par ELISA
� Détection des IgM
Les IgM sont détectées selon le principe ELISA. L’IgM du sérum à tester est d’abord
capturée par un anticorps anti-µ fixé au puits, puis elle est incubée en présence de
surnageant de culture de cellules Vero infectées. L’antigène capturé est à son tour reconnu
par un sérum polyclonal anti-EBO, lui-même reconnu par des anticorps monoclonaux
conjugués à la peroxydase. Le résultat est obtenu par lecture de l’absorbance du composé
coloré produit [116].
Cette technique a été testée par l’infection expérimentale de singes. L’étude a montré
que les IgM apparaissent dès le 6è jour, atteignent un pic pendant 3 semaines, puis
diminuent pour devenir indétectables au bout de 3 mois [116]. Par contre, chez les
humains, les IgM apparaissent dès le 2è ou 4è jours après le début des symptômes et
disparaissent 2 mois après la fin des symptômes. La faible persistance des IgM empêche
leur détection dans le cadre d’études rétrospectives ou de séroprévalence. De plus, de
nombreux patients décèdent sans développer de réponse anticorps [101]. La détection des
IgM serait donc plus adaptée au diagnostic rapide en période d’épidémie ou pour la
confirmation de patients survivants en période de convalescence.
Introduction
56
� Détection des IgG
La détection des IgG est elle-aussi basée sur le principe ELISA, mais la méthodologie
diffère de la détection des IgM. Le sérum à tester reconnaît l’antigène viral, généralement
un surnageant de culture ou un broyat de cellules Vero infectées, et préalablement fixé aux
puits. L’IgG est ensuite reconnu par un sérum polyclonal de souris anti-γ conjugué à la
peroxydase. Le résultat est lu par spectrophotométrie [116, 117].
Les IgG sont détectées à partir de 10-12 jours chez les macaques infectés
expérimentalement. Cependant, chez l’Homme, les IgG apparaissent vers le 3è jour et
persistent au moins pendant 2 ans [101]. Ainsi, les sérums de 2 survivants de l’épidémie de
1976 en RDC présentaient plus de 10 ans après des taux d’IgG équivalents à ceux des
singes expérimentaux convalescents. Les IgG étant rarement détectées chez les patients qui
décèdent, cette technique ne peut pas être appliquée au diagnostic en cours d’épidémie. La
longue persistance des IgG en fait une méthode de prédilection pour les études
rétrospectives ou les enquêtes de séroprévalence.
e. Méthodes diverses
D’autres techniques ont été développées dans le but d’obtenir un diagnostic toujours
plus rapide, sensible et spécifique.
Le Western Blot permet de reconnaître des protéines virales par des anticorps. Cette
technique, longue à appliquer, n’a jamais été utilisée pour le diagnostic. Elle peut
cependant être utilisée pour confirmation la spécificité des anticorps détectés par les
méthodes ELISA [118].
La radioimmunoprécipitation (RIPA) consiste à incuber les sérums avec des antigènes,
puis dans une solution contenant la protéine A marquée à l’iode 125. Le résultat est obtenu
par comptage des rayons γ émis [119]. Cette méthode, bien que sensible, spécifique et
n’utilisant que peu de sérum, n’est pas adaptée aux conditions de terrain. Elle n’est
pratiquement jamais utilisée pour le diagnostic.
Introduction
57
III.3. Contrôle, prévention et traitement
a. Prévention : mesures sanitaires, vaccin
� Mesures sanitaires
En l’absence de traitement et de vaccin, les mesures d’hygiène générale représentent la
seule arme des personnels de santé pour lutter contre la progression d’une épidémie.
Dans un premier temps, un cordon sanitaire est mis en place autour des foyers
épidémiques afin de limiter au maximum la contamination des personnes extérieures au
cours d’échanges entre les populations touchées des foyers épidémiques primaires et celles
des zones extérieures saines [20, 120].
Dans un second temps, la stratégie de prévention est basée sur le diagnostic rapide des
cas et l’isolement des malades afin de briser les chaînes de transmission [121].
Une fois le diagnostic clinique établi, les cas suspects sont isolés et reçoivent dans la
mesure du possible des traitements palliatifs prophylactiques et curatifs [20, 122]. Le
traitement des symptômes inclus du paracétamol, des antiémétiques, des antispasmodiques
et des antipsychotiques. En l’absence de confirmation en laboratoire, les patients reçoivent
également des antibiotiques et un traitement antipaludéen [122].
Le personnel de santé est formé sur le terrain pour l’utilisation correcte des équipements
de protection. Les soins aux malades se donnent équipé de blouse, gants, masque et sur-
chaussures jetables. Le matériel médical, les vêtements, déchets et locaux souillés sont
systématiquement désinfectés avec une solution d’hypochlorite de sodium à 2% [20].
Enfin, un réseau de surveillance des individus ayant eu un contact avec un malade et de
l’apparition de nouveaux cas est mis en place par les médecins présents sur place assistés
par les volontaires de la Croix-Rouge [29, 121].
Malheureusement, dans la zone d’endémie du virus Ebola où les villages sont souvent
enclavés, les structures sanitaires sont souvent peu fonctionnelles, les équipements de
protection et le personnel soignant manquent.
Introduction
58
� Vaccins
Le génome d’EBOV étant très stable au fil du temps et des chaînes de transmission [58,
123], un moyen de vaccination est envisageable. Plusieurs vecteurs et méthodes ont été
testés sur le modèle murin avant d’être testés sur le modèle primate, qui mime mieux
l’infection chez l’homme.
� Expérimentations sur le modèle rongeur
Le virus Ebola est mortel pour les souris nouvellement nées, et non pour les adultes. Les
souches d’Ebolavirus zaïre peuvent être adaptées par passages successifs sur des souris de
plus en plus âgées, jusqu’à provoquer une infection létale chez des souris adultes [124]. Le
même processus d’adaptation de souches par passage successif est également utilisé chez
le cochon d’Inde. Grâce à ces variants adaptés à ces animaux, diverses prophylaxies ou
vaccins peuvent être étudiés.
Une première étude a utilisé des souris infectées pour tester le transfert passif
d’anticorps. Les souris survécurent et développèrent de forts taux d’immunoglobuline G
(IgG). Leur sérum transfusé à des souris naïves protégeait ces dernières d’un challenge
contre une dose létale d’EBOV [125]. Cependant, le transfert passif de sérum ne protégeait
pas les souris naïves lorsque le premier groupe avait été immunisé par un virus recombiné
avec les protéines virales VP24, VP40 et VP30 [126]. De même, cette approche vaccinale
n’aboutit pas chez le modèle primate [127].
Les équipes de chercheurs se sont ensuite penchées sur une technique d’immunisation
génétique appliquée avec succès pour d’autres agents pathogènes [128-130]. Cette
technique consiste à incorporer des gènes viraux dans un vecteur d’expression. Une fois
injecté, l’hôte va exprimer ces protéines, ce qui induira une réponse immunitaire humorale
et cellulaire. Des vecteurs d’expression plasmidiques contenant les gènes viraux de la
nucléoprotéine (NP) et des glycoprotéines (GP) soluble et membranaire ont été injectés à
des souris. Les animaux immunisés présentaient une réponse anticorps ainsi que des
cellules T cytotoxiques activées, ils ont tous survécu à un challenge létal, jusqu’à 4 mois
après la première injection [131]. Les vecteurs d’expression codant les GP et la NP
confèrent donc une protection. Par contre, les vecteurs codant les protéines virales VP24,
VP30, VP35 et VP40 ne protègent pas efficacement les souris. Seule la souche de souris
Introduction
59
C57BL/6 a pu être protégée contre un challenge létal par une immunisation avec la VP35.
Les autres protéines virales pouvaient induire une réponse immune, mais pas protéger les
souris du challenge [126].
La coexpression dans des cellules de mammifères de la GP et de la protéine de matrice
(VP40) d’EBOV résulte en la production et sortie de particules qui ressemblent aux virions
infectieux (VLP, virus-like particles). Ces particules induisent la maturation in vitro des
cellules dendritiques dérivées de moëlle osseuse et les activent. De plus, la vaccination de
souris avec les VLP activait les cellules T CD4+ et CD8+, et protégeait 100% des souris
contre une inoculation létale d’EBOV [132].
L’étude des effets de mutations dans le gène de la GP montre que les sites de N-
glycosylation de la GP2 sont importants pour l’antigénicité et le pouvoir immunogène. Au
contraire, la mutation des sites de N-glycosylation de la GP1 pourrait démasquer des
épitopes et augmenterait le pouvoir immunogène du mutant [133].
L’immunisation par un vecteur adénoviral a prouvé son efficacité sur les modèles
animaux. Cependant, ces vaccins ne sont dirigés que contre l’espèce Zaïre, dont le taux de
mortalité est le plus élevé, laissant de côté l’espèce Soudan dont les épidémies sont tout
aussi dévastatrices. Un vaccin adénoviral bivalent a été testé sur des souris. Il contient les
GP des espèces Soudan et Zaïre dans un vecteur adénoviral. L’administration de ce vaccin
à des souris induit une réponse immunitaire humorale et cellulaire, et les protège contre
l’infection par une très forte dose du virus de l’espèce Zaïre adapté aux souris [134].
Malheureusement, certaines de ces stratégies vaccinales, efficaces chez la souris ou le
cochon d’Inde, ne protègent pas les macaques cynomolgus ou rhésus [135].
� Expérimentations sur le modèle primate
Bien que le modèle primate soit très proche de l’humain, l’entretien des animaux
nécessite des infrastructures spécifiques, et il est parfois difficile d’avoir un nombre
d’individus suffisant pour des résultats significatifs.
L’utilisation de vecteurs non viraux pour l’expression de protéines virales permet
d’éviter une réponse immunitaire dirigée contre le vecteur. En effet, le facteur limitant des
vaccins à base d’adénovirus ou de virus de la vaccine est l’exposition possible d’une part
Introduction
60
importante de la population à ces virus naturels ou utilisés pour une autre vaccination.
L’existence d’une immunité contre le vecteur diminuerait l’efficacité du vaccin [136].
Cependant, les vecteurs viraux sont nécessaires pour obtenir une réponse immune
importante et durable [137]. Les études se concentrent donc sur un vecteur pour lequel la
population aurait peu d’immunité naturelle, ainsi que sur une planification des
immunisations qui produirait la meilleure réponse. De ce fait, plusieurs vaccins à base de
plasmides, d’adénovirus, de paramyxovirus, d’alphavirus ou du virus de la stomatite
vésiculaire (VSV) ont été testés, seuls ou en combinaison avec un plasmide portant l’ADN
viral, suite à une ou plusieurs injections.
L’« immunisation génétique » a été utilisée en association avec un vecteur adénoviral
dont la réplication est déficiente et qui exprime des protéines d’EBOV. Ce vecteur sert de
rappel afin d’améliorer la réponse immune. Des macaques cynomolgus ont été immunisés
par 3 injections, séparées par 4 semaines, d’un plasmide codant pour la nucléoprotéine et
les GP des 3 espèces (Soudan, Zaïre et Côte d’Ivoire). Après environ 3 mois (16
semaines), ces animaux subissaient une immunisation de rappel avec un adénovirus
recombinant qui exprimait seulement la GP de l’espèce Zaïre. Chez les animaux
immunisés, une réponse en anticorps spécifique était détectée 4 semaines après la dernière
injection du plasmide. Les titres en anticorps ont augmenté de 10 à 20 fois après l’injection
de rappel adénoviral. La réponse immunitaire induite était également cellulaire, avec une
stimulation des cellules T. Enfin, le challenge par une dose létale de la souche Mayinga
(ZEBOV) a démontré la protection conférée par cette technique puisque aucune
augmentation du titre viral ni aucun symptôme n’ont été observés chez les animaux
immunisés [138].
Cependant, cette stratégie vaccinale nécessite plus de 6 mois pour compléter
l’immunisation. Afin de réduire le temps d’immunisation, des macaques ont reçu une
injection d’adénovirus codant pour la GP et la nucléoprotéine suivie par un rappel 9
semaines plus tard. Une semaine après le rappel, les animaux ont reçu soit une faible soit
une forte dose d’us isolat de l’épidémie de 1995. Tous les animaux immunisés ont survécu
au challenge, quelle que soit la dose reçue. De plus, les réponses des cellules T CD8+ ainsi
que celle des anticorps dirigés contre EBOV ont significativement augmenté chez les
animaux vaccinés. La comparaison des réponses immunes observées après la première et la
deuxième immunisation suggère que la première injection serait suffisante. Pour cela, des
macaques ont été immunisés une seule fois par une injection d’adénovirus. Quatre
Introduction
61
semaines plus tard, ils ont reçu une dose létale d’EBOV. Tous les animaux immunisés ont
survécu à l’infection, que la dose reçue soit forte ou faible. Dans ce cas de vaccination, la
réponse des cellules T CD8+ était similaire à celle de la vaccination « prime-boost ». Par
contre, la réponse des cellules T CD4+, non détectable avant le challenge, augmentait après
l’infection. La stratégie de vaccination « prime-boost » confère une meilleure protection. Si
la réponse est durable, elle pourrait être utilisée pour les vaccins préventifs, chez le
personnel de laboratoire ou hospitalier par exemple. D’autre part, l’administration d’un
seul vaccin adénoviral, plus rapide, aurait une utilité lors des épidémies [137].
Le vaccin à base d’adénovirus codant la GP et la NP procure une protection spécifique.
Cependant, la GP a un effet cytopathique sur les cellules in vitro, et plusieurs variants de la
GP ont été identifiés. La GP a été modifiée afin d’éliminer les effets cytopathiques tout en
gardant la protection spécifique. La délétion de la partie transmembranaire de la GP
élimine les effets cytopathiques sur les cellules HEK293 transfectées, mais le vaccin à base
de GP délétée est moins efficace pour protéger des macaques d’une dose létale d’EBOV.
Le variant E71D, muté dans une région qui lierait le récepteur [139], procure une
protection spécifique aux macaques vaccinés avec une cytopathie réduite in vitro. De plus,
l’élimination de la NP et l’administration de doses réduites ne diminue pas son efficacité
[140].
Suite au développement prometteur d’un vaccin basé sur le virus atténué de la stomatite
vésiculaire (VSV) recombiné avec une protéine du virus Lassa [141], une étude a testé ce
vecteur pour les virus Ebola et de Marburg. Le vaccin utilisait un VSV recombiné à la GP
du virus Ebola ou de Marburg. La glycoprotéine filovirale synthétisée et maturée par le
VSV recombinant est identique à la GP produite par EBOV [142]. Une simple injection
intramusculaire du vaccin à base de VSV permettait d’induire une réponse cellulaire et
humorale chez les singes vaccinés. Tous les animaux immunisés ont survécu au challenge,
aucune trace de réplication du virus n’a été détectée. De plus, aucun rejet du vecteur n’a été
observé [143].
De même, un vaccin basé sur le virus de l’encéphalite équine, souche Venezuela (VEE) a
été testé. Le système du vecteur réplicon VEE consiste en un réplicon vecteur d’expression
à ARN codant le gène contre lequel se fera l’immunisation, et un ARN bipartite assistant
l’empaquetage, produits in vitro par des plasmides. Ces réplicons sont encapsidés dans des
particules ressemblant aux VEE grâce aux capsides et protéines d’enveloppe virales.
Durant la vaccination, le vecteur VEE délivre, amplifie et exprime in vivo le gène vaccinal
Introduction
62
[144]. Une réponse immune à 2 antigènes différents a été détectée suite à plusieurs
inoculations de ce vecteur VEE. Le potentiel immunogène et protecteur d’une
immunisation par un réplicon VEE codant pour une protéine du virus Lassa a été mis en
évidence. Ainsi, un réplicon combinant l’expression de gènes des virus Lassa et Ebola a été
évalué. Des réponses anticorps ont été détectées pour les 2 gènes codés par le vecteur
réplicon, avec une réponse apparente plus forte pour la GP d’EBOV. Cette étude montre
qu’une protection contre une dose létale d’EBOV ou du virus de Lassa peut être apportée
par un vecteur co-exprimant plusieurs antigènes aussi bien que par plusieurs vecteurs
codant un seul antigène [145].
L’utilisation d’un vecteur paramyxovirus a été étudiée à la fois chez les cochons d’Inde
puis sur des singes. Le vaccin, basé sur le virus parainfluenza humain de type 3 (HPIV3)
recombiné avec la GP seule ou avec la NP d’EBOV, a été administré par inoculation
intranasale à des cochons d’Inde. Cette étude a montré que la réponse en anticorps dirigés
contre EBOV est 100 fois supérieure à la réponse en anticorps dirigés contre le vecteur
HPIV3. De plus, les animaux immunisés ont tous survécu à l’injection intrapéritonéale
d’EBOV, sans qu’aucun signe de maladie, aucune virémie ou antigène ne soit détecté dans
le sang, ni qu’aucun signe d’infection dans les organes cibles (foie, rate, poumons) ne soit
observé [146].
L’efficacité d’une immunisation par un vecteur viral vivant et recombiné a ensuite été
étudiée sur le modèle primate. Le vecteur paramyxovirus HPIV3 recombiné avec la GP
filovirale seule ou en combinaison avec la NP ou associé à une cytokine stimulant les
granocytes-macrophages a été administré par voie respiratoire à des macaques rhésus. Une
simple immunisation par un vecteur exprimant la GP était moyennement immunogène et
protégeait 88% des animaux contre une infection par EBOV. L’administration de 2 doses
s’est révélée être hautement immunogène, la totalité des animaux vaccinés a survécu à une
dose mortelle d’EBOV, sans aucun symptôme [147].
L’immunisation par un plasmide recombinant a été étudiée dans la phase I sur les
humains. Le vaccin contient 3 plasmides en concentration égales qui codent chacun pour
les GP des espèces Zaïre et Soudan, et pour la NP. Des adultes sains, de 18 à 44 ans, ont
reçu 3 injections de ce vaccin en double aveugle, aléatoire, en fonction de la dose. Le
vaccin a été bien toléré. Les réponses en anticorps spécifiques et des cellules T CD4+ ont
Introduction
63
été observées chez tous les sujets vaccinés. La réponse des cellules T CD8+ a été détectée
sur 6 des 20 sujets vaccinés [148].
b. Traitement
� Chimiothérapie
� La ribavirine
Les résultats in vitro et lors d’expérimentations animales montrent que la ribavirine est
capable d’inhiber des virus de fièvre hémorragique. La ribavirine est un nucléoside triazole
synthétisé pour la première fois en 1970. C’est un analogue des pyrimidines de part sa
structure similaire à celle de la guanosine. La ribavirine est efficace en prophylaxie ou en
traitement contre, entre autres, des arénavirus, le virus de la fièvre de Lassa, de la Vallée
du Rift, le virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo. Cependant, EBOV n’est pas
inhibé in vitro par la ribavirine. De même, l’administration de ribavirine en tant que
prophylaxie ne change pas le taux de survivants chez des cobayes infectés par les espèces
Zaïre ou Soudan, bien que le temps moyen avant le décès soit prolongé dans le cas d’une
infection par l’espèce Soudan. La ribavirine n’a également aucun effet sur le cours de la
maladie chez des macaques cynomolgus infectés par Ebolavirus zaïre [149].
� Les inhibiteurs de la SAH
La S-adenosylhomocystéine (SAH) hydrolase (EC 3.3.1.1) est une enzyme cellulaire
impliquée dans le transfert d’un groupe méthyle sur le résidu guanosine de la coiffe 5’ de
l’ARNm viral. Cette étape est indispensable à l’initiation de la réplication du virus.
Plusieurs inhibiteurs de la SAH ont été testés en fonction de leur pouvoir inhibiteur et de
leur toxicité. Sur les 9 candidats, seule la 3-déazaadénosine carbocyclique (Ca-c3 Ado)
conférait une protection significative (90% de survie) lorsque le traitement est commencé
au plus tard 2 jours après l’infection. Lorsque le traitement est initié 3 jours après
l’infection, le taux de survie chute à 40%. Toutefois, l’emploi et l’efficacité de cet
inhibiteur restent conditionnés par un protocole strict (une dose supérieure à 0,7mg/kg
toutes les 8 heures) [150].
Introduction
64
� Le rNAPc2
Un des symptômes de la FHVE est une coagulation intravasculaire disséminée (CIVD).
Dans le cas d’une infection par EBOV, les facteurs de la coagulation sont surexprimés par
les monocytes et macrophages. [151].
La protéine recombinante c2 de nématode (rNAPc2) est une protéine anticoagulante de
85 résidus qui inhibe directement le complexe facteur VIIa/facteur tissulaire [152]. Son
potentiel antithrombique a été démontré lors de la phase II des essais cliniques sur des
patients ayant subi une angioplastie coronaire [153]. Afin de tester si l’inhibition de la
coagulation a un impact sur le devenir de la maladie, des macaques ont été traités par des
injections de rNAPc2 une fois par jour. Le traitement débutait soit 10 minutes soit 24h
après l’infection par EBOV et a continué pendant 14 et 8 jours. Les 2 traitements
permettaient de prolonger le temps de vie des animaux de quelques jours, associé à une
atténuation de la réponse proinflammatoire, une réduction de la coagulation et de la
fibrinolyse [154].
� Les PMO
Les oligomères antisens morpholino-phosphorodiamidate (PMO) sont des agents
antisens qui se fixent à l’ARN messager (ARNm) viral pour former des complexes
bloquant la transcription et la réplication virale, le temps que la réponse immunitaire se
mette en place [155]. Le traitement PMO antisens, dont l’efficacité a été prouvée in vitro
[156], a été testé in vivo sur le modèle murin puis primate, en prophylaxie avant ou en
traitement après infection. Une dose de PMO antisens dirigés contre 3 sites différents de
l’ARNm administrée 24h post-exposition a permis de protéger efficacement des souris et
cochons d’Inde.
Porté sur le modèle primate, l’administration de PMO antisens complémentaires aux
ARNm des gènes VP35, VP24 et L s’est montré efficace à protéger les macaques rhésus 2
jours avant jusqu’à 9 jours après l’infection [157].
� Transfert passif de sérum
Le transfert passif d’immunoglobuline G (IgG) d’origine équine a été étudié sur les
modèles de souris, cochons d’Inde et de macaques cynomolgus. Les souris n’étaient pas
entièrement protégées quand le traitement commençait le jour de l’infection. Au contraire,
les cochons d’Inde ont été protégés lorsque le traitement était commencé avant l’apparition
d’une virémie. Enfin, les singes traités par une dose d’IgG le jour de l’infection ont tous
Introduction
65
succombé, mais avec un début des symptômes et l’apparition de la virémie retardés [158].
L’administration d’une seconde dose d’IgG au cinquième jour post-infection n’a pas eu
d’effets bénéfiques. L’administration d’interféron-α2b aboutissait aux mêmes observations
sur les macaques, à savoir retarder l’apparition de la virémie et la mort [159]. Chez le
Babouin, l’inoculation de sérum jusqu’à 1h30 après l’infection empêche le développement
de la virémie. La différence observée entre les modèles babouin et macaque pourrait être
causée soit par des différences spécifiques aux espèces utilisées soit par la dose injectée
pour le challenge qui différait entre les deux études. Chez les babouins, les anticorps
atteignent leur concentration maximale dans la circulation sanguine plus rapidement que le
virus n’infecte les cellules cibles [160].
Lors de l’épidémie de 1995 à Kikwit, RDC, 8 patients ont été transfusés avec du sang
de donneurs convalescents. Le sang transfusé contenait des anticorps dirigés contre EBOV,
mais aucun antigène n’a été détecté. Sur les 8 patients, un seul est décédé. Il doit cependant
être noté que les patients transfusés étaient mieux soignés que les patients du début de
l’épidémie. Ils ont reçu des injections de glucose et d’électrolytes, un traitement à base
d’antibiotiques et d’antipaludéens ainsi qu’un supplément alimentaire. La raison de ce plus
faible taux de mortalité reste à expliquer. En effet, 4 des 5 patients de Mosango et Kikwit
qui présentaient des saignements et ont été transfusés sont morts des suites de la maladie
bien qu’ils furent transfusés avec du sérum de patients convalescents [161]. Par ailleurs, en
1976, une nonne belge était décédée après avoir reçu plusieurs transfusions de sang de
patient convalescent [162].
� Anticorps neutralisants
Afin de tester la capacité des anticorps à protéger contre EBOV, des anticorps
monoclonaux ont été générés à partir de banques d’ADN et leur efficacité a été étudiée.
Les anticorps dirigés contre la GP étaient divisés en 5 groupes, selon leur épitope. Sur les
14 anticorps monoclonaux générés, 10 apportaient une protection à des souris infectées par
un variant adapté lorsque que l’anticorps purifié était administré 24h avant le challenge.
D’autres anticorps se sont révélés efficaces même s’ils étaient administrés 2 jours après
infection. Cependant, aucun anticorps n’a pu protéger les souris quand il était administré 3
jours après l’infection, lorsque le titre viral était trop élevé [163].
Introduction
66
L’anticorps monoclonal humain KZ52 a été produit et caractérisé à partir du sérum
d’un survivant [164]. L’administration de l’anticorps KZ52 à des cochons d’Inde avant ou
jusqu’à 1h après l’infection par EBOV résultait en une protection dépendante de la dose
d’anticorps injectée, la plus forte dose protégeant tous les animaux, la plus faible n’en
protégeant aucun. La protection ainsi apportée par l’anticorps KZ52 n’inhibait pas la
réplication du virus, puisque des titres viraux bas étaient détectés dans le plasma des
animaux traités. En prophylaxie, l’administration de l’anticorps KZ52 une heure avant
l’infection a permis de protéger tous les animaux. En traitement, l’anticorps KZ52 a
protégé du challenge 4 des 5 animaux traités une heure après l’infection, mais aucun des
cochons d’Inde traités 6h après infection n’ont pu être protégés [165]. L’anticorps pourrait
intervenir dans la destruction des cellules infectées, aidant ainsi à contrôler les dommages
causés aux organes.
D’autres anticorps, dont les épitopes sont différents de celui de KZ52, ont été testés sur
les souris et cochons d’Inde. Le traitement 2 jours après infection protégeait complètement
les souris. Si le traitement était administré 3 ou 4 jours après infection, la protection était
tout de même partielle. Le traitement des cochons d’Inde n’était pas aussi efficace, une
dose injectée jusqu’à 2 jours après l’infection par EBOV protégeant seulement une partie
des animaux. Il est intéressant de remarquer que le comportement in vitro des anticorps
utilisés pour cette étude ne correspondait pas à la protection observée chez les animaux
[166]. Ceci suggère des mécanismes différents dans la neutralisation par les anticorps
lorsqu’ils sont utilisés seuls ou dans le contexte immun d’un hôte.
Enfin, l’anticorps neutralisant KZ52 a été étudié dans le modèle primate. Des macaques
rhésus ont été traités par cet anticorps 1 jour avant et 4 jours après infection par EBOV.
Aucun des animaux n’a survécu. De plus, l’administration de l’anticorps n’a eu aucun effet
sur la réplication virale. Les anticorps acquis passivement seraient incapables de bloquer
l’entrée de toutes les particules virales aux cellules. Une fois les particules entrées, la
réplication virale explosive ne pourrait plus être contenue par la réponse cellulaire. Il
semblerait que le mécanisme de propagation de l’infection chez le macaque soit insensible
à la concentration d’anticorps [167].
� Vaccin post-exposition
Le vaccin basé sur le virus de la stomatite vésiculaire (VSV) s’est montré efficace pour
protéger les macaques contre une dose mortelle d’EBOV [143]. Récemment, le traitement
de macaques rhésus par un vaccin VSV recombinant portant une protéine de MARV a
Introduction
67
permis de protéger tous les animaux. Le traitement était administré 20 à 30 minutes après
l’infection par une forte dose de virus de la même souche que celle utilisée pour le vaccin
ou par une autre souche [168, 169]. L’utilisation de ce vaccin contre EBOV a donc été
testée après exposition sur les 3 modèles animaux. Cinquante et 100% des cochons d’Inde
et souris, respectivement, traités jusqu’à 24h après l’infection ont survécu. De même, 50%
des macaques rhésus traités 20 à 30 minutes après l’infection par EBOV ont survécu.
L’efficacité de ce traitement post-exposition pourrait être augmentée par une plus forte
dose, par des traitements multiples au cours du temps. Le traitement post-exposition est
particulièrement adapté aux cas d’exposition accidentelle d’individus et pourrait être
amélioré en association avec le traitement inhibant les désordres de la coagulation [170].
Ces études prometteuses suggèrent que l’emploi d’une multithérapie pourrait
augmenter l’efficacité de traitement. La recherche d’un vaccin se heurte aux problèmes
éthiques posés par la phase humaine des tests cliniques pour un virus aussi mortel.
IV. Les mécanismes physiopathologiques
IV.1. Physiopathogénèse
a. Modèle animal
Le modèle primate a d’abord été utilisé pour étudier les modifications biologiques et
hématologiques induites par EBOV. Chez des singes verts et macaques rhésus infectés, la
maladie ressemblait à celle observée chez les humains, avec perte de poids, anorexie,
fièvre, hémorragies et rash. De fortes concentrations virales ont été trouvées dans plusieurs
organes, mais surtout dans le foie, la rate et les poumons [91, 171]. La microscopie
électronique a mis en évidence des nécroses coagulatrices locales dans le foie, la rate, les
reins, les poumons et les testicules d’animaux infectés, ainsi que des dommages vasculaires
modérés [95, 172]. L’infection de 21 macaques cynomolgus et leur suivi sur 6 jours a
permis d’identifier les cellules dendritiques des tissus lymphoïdes comme des cibles
précoces d’EBOV [173]. De plus, l’infection par aérosols produit le même tableau clinique
Introduction
68
que l’inoculation parentérale, à la différence de saignements sous-cutanés, aux points de
ponction, et du nez [64].
L’infection de cochons d’Inde avec un variant adapté à cette espèce provoque des
lésions similaires à celles observées chez les singes ou les humains infectés. Ce modèle a
permis d’identifier les macrophages et autres cellules du système de la phagocytose
mononucléaire comme les cellules cibles primaires d’EBOV [174].
Le modèle murin présente des modifications similaires à celles observées sur les 2
autres modèles animaux. L’étude sur les souris a confirmé la grande prédilection d’EBOV
pour les cellules du système de la phagocytose mononuclée. Le virus infecterait ensuite les
tissus connectifs et les cellules parenchymales associées à ce système. Toutefois,
l’infection expérimentale des souris ne provoque que peu de dépôts de fibrine dans les
vaisseaux sanguins des souris lors de la phase tardive de la maladie [175].
Différents paramètres biologiques ont été comparés entre des groupes de souris, de
cochons d’Inde et 3 macaques rhésus après infection par un variant EBOV adapté par
passages successifs chez la souris. L’étude a montré des perturbations hématologiques et
biochimiques similaires dans les 3 modèles, bien que les anomalies de coagulation soient
moins marquées chez les souris [176]. Les auteurs suggèrent que le degré de virémie, ainsi
que les changements hématologiques, biochimiques et de la coagulation pourraient être
utilisés pour prédire l’issue de la maladie. Il est toutefois nécessaire de remarquer que
l’expérimentation sur un modèle animal doit tenir compte de l’espèce. En effet, une
infection expérimentale comparée sur 2 espèces primates a montré que certaines
caractéristiques sont spécifiques à l’espèce : la virémie était détectée plusieurs jours après
l’infection chez les babouins alors qu’elle était détectée après 24h seulement chez les
singes verts. Une autre différence a été observée au niveau de la coagulation : les babouins
étaient sujets à de nombreuses hémorragies quand les singes verts présentaient une
thrombose généralisée. Ces spécificités en fonction de l’espèce sont importantes dans le
choix du modèle expérimental [177].
b. Paramètres biochimiques et hématologiques
Les changements hématologiques majeurs observés lors d’infections comprennent
l’élévation du nombre de leucocytes puis sa diminution brusque, des désordres de
Introduction
69
coagulation, la diminution du nombre de plaquettes qui reste tout de même dans la
fourchette normale au 8è jour pi, quand aucune agrégation en présence de collagène,
d’ADP ou d’adrénaline n’est plus possible in vitro, malgré des doses supraoptimales [178].
D’autres caractéristiques récurrentes sont une neutrophilie, une sévère lymphopénie,
ainsi que le non-fonctionnement des plaquettes avant la thrombocytopénie (diminution du
nombre de plaquettes dans le sang). Cette perte de fonction des plaquettes est associée à
leur activation et leur dégranulation. Les causes probables à l’origine de cet événement
sont leur agrégation/désagrégation suite aux dommages causés à l’endothélium auquel elles
ont brièvement adhéré, leur activation directe dans la circulation par le virus ou des
produits secrétés par les lymphocytes actifs, ou la formation de complexes immuns [57].
Dans le cas d’une infection virale, l’hémostase est altérée par effet direct du virus sur la
fonction cellulaire ou suite à l’activation des voies immunes et inflammatoires. L’infection
virale produit une grande variété de dommages, dont la thrombocytopénie causée par un
auto-anticorps dirigé contre les plaquettes ou par l’agrégation de celles-ci accélérée par le
virus. La coagulation intravasculaire disséminée (CIVD) correspond à la diminution du
taux de facteurs de coagulation suite à l’augmentation de la consommation (utilisation des
facteurs pour transformer le fibrinogène en fibrine, élément constituant des caillots
sanguins) ou à une synthèse défectueuse (foie endommagé). La CIVD est causée soit par
l’augmentation puis la diminution du taux des facteurs de coagulation soit par la
circulation d’anticoagulants [179]. Treize facteurs de coagulation sont nécessaires pour
transformer le fibrinogène soluble en fibrine insoluble composant le caillot. La circulation
d’anticoagulants et le disfonctionnement des cellules endothéliales sont d’autres
dommages causés par une infection virale [179]. La CIVD, mise en évidence par des
niveaux élevés en produits de dégradation du fibrinogène, se développe plus tard au cours
de la maladie et majoritairement chez les humains et animaux moribonds [57]. L’infection
et l’activation des monocytes/macrophages pourrait également sécréter des facteurs qui
induisent le développement d’anomalies de la coagulation [151].
Les analyses biochimiques mettent en évidence une fonction rénale défectueuse
(rapport ASAT/ALAT élevé), des dommages modérés des cellules du foie et des
changements d’électrolytes compatibles avec une infection sévère [178].
Chez des animaux infectés, les lésions provoquées se situaient surtout dans le foie, bien
que l’infection par EBOV ne soit pas toujours associée à cette inflammation. Les foci
Introduction
70
granuleux observés dans des sections de foie d’animaux infectés seraient donc des pièges à
virus, où les monocytes infectés migreraient du sang sous l’effet des chémoattractants
secrétés par les macrophages produits par les foci enflammés [180].
Les cellules endothéliales ne sont pas des cibles précoces d’EBOV et les autopsies
d’animaux infectés expérimentalement montrent un endothélium relativement intact [181].
Cependant, les caractéristiques cliniques des fièvres hémorragiques virales (FHV) sont en
accord avec une perte générale d’intégrité de l’endothélium. Ces caractéristiques sont un
développement soudain d’un choc hypovolémique et hyponatrémique, des effusions
multiples et de multiples points de saignement [57]. Bien qu’il y ait de nombreux
saignements, les volumes de sang perdus ne sont pas assez élevés pour entraîner la mort.
De même, la nécrose hépatique et l’étendue des disfonctionnements hépatique et rénal ne
sont pas aussi dangereux pour la vie qu’ils ne le sont par exemple dans le cas d’une
hépatite B fulminante. [57]
IV.2. Immunologie
a. Immunité cellulaire
L’endothélium a des fonctions importantes de régulation. Les virus de Marburg et
Ebola s’y répliquent aussi bien que dans les cellules de reins de singes couramment
utilisées [182]. L’infection de cellules dérivées des poumons montre qu’elles ne sont pas
des cibles précoces d’EBOV [181]. Par des essais d’infection in vitro, les macrophages et
autres cellules du système de la phagocytose mononuclée ont été identifiées comme les
cibles primaires d’EBOV [95, 174, 183]. Comme pour les macrophages adhérents en
culture, l’activation de monocytes en suspension est indépendante de la réplication virale.
De plus, les chémokines et cytokines produites par les monocytes activés pourraient
déstabiliser l’endothélium de l’hôte [184]. In vivo, l’infection des cellules de l’immunité
par EBOV se traduit par une prolifération des lymphocytes, suivi d’une baisse des indices
de prolifération.
En effet, les analyses pratiquées sur des patients atteints par SEBOV qui décèdent
montrent une diminution de leur nombre de cellules T CD8+ alors que le nombre de ces
cellules augmente chez les patients qui survivent [185]. Afin de mieux comprendre cette
Introduction
71
variation dans l’immunité cellulaire des patients, les mécanismes d’élimination du virus
ont été étudiés dans un modèle murin. Toutes les souris déficientes en cellules T CD8+ ont
succombé. Au contraire, les souris déficientes en cellules B ou T CD4+ ont éliminé
l’infection et ont survécu. Les cellules T CD8+ seraient donc essentielles à la protection
contre une infection sous-cutanée par EBOV. De leur côté, les cellules T CD4+ ainsi que
les anticorps seraient plutôt nécessaires pour une protection à long terme. Dans certaines
conditions d’immunodéficience, un hôte pourrait alors héberger le virus pour des périodes
prolongées, agissant ainsi comme un réservoir [186].
Les cellules Natural Killer (NK) ont également un rôle décisif lors d’une infection par
EBOV. En effet, l’injection d’un pseudovirus exprimant la GP ne procure aucune
protection à des souris déficientes ou déprimées en cellules NK lors d’une infection par
EBOV. Par contre, les cellules NK traitées avec ce pseudovirus protègent contre un
challenge létal quand elles sont transférées à des souris naïves. De plus, les cellules NK
stimulées in vitro par ce pseudovirus secrètent des cytokines et chémokines pro-
inflammatoires et tuent les cellules cibles infectées [187].
Les cellules dendritiques sont également des cibles primaires d’EBOV. A la surface de
ces cellules se trouvent des protéines membranaires associées en homotrimères, qui lient
les GP des rétrovirus afin d’en faciliter l’entrée dans la cellule. Ces protéines
membranaires, nommées DC-SIGN/R pour Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing
Nonintegrin / Related, agissent comme des cofacteurs lors de l’entrée d’EBOV dans les
cellules dendritiques. DC-SIGN/R est exprimé par de nombreuses cellules cibles précoces,
dont les cellules dendritiques, les macrophages alvéolaires, les cellules endothéliales
sinusoïdales ou du foie et des ganglions lymphatiques [188]. De la même manière que DC-
SIGN/R aide le VIH à pénétrer dans les cellules T CD4+, cette protéine permet à des
particules pseudovirales exprimant une partie du génome d’EBOV d’infecter des cellules
dendritiques [189]. La capacité de fixation du virus aux DC-SIGN/R dépend du type de la
structure carbohydrate de la GP virale. Plus la proportion de glycanes N-liés est grande,
meilleure sera l’infectivité du virus [190]. La comparaison des interactions DC-SIGN/R
avec les GP des espèces Soudan et Zaïre a montré qu’elle serait gouvernée par le peptide
signal. En effet, il influencerait l’attachement du virus aux cellules à 2 niveaux : d’abord au
niveau de la glycosylation de la GP virale, le peptide signal modulerait la modification de
la GP et pourrait donc influer sur l’interaction DC-SIGN/R-virus, qui dépend des
Introduction
72
carbohydrates de la GP ; ensuite, au niveau de l’incorporation de la GP dans les virions.
Ceci suggère la nécessité de liaison DC-SIGN-virus multiples pour une infection robuste
[191].
Enfin, les cellules dendritiques répondent à l’infection par la production de nombreuses
cytokines pro-inflammatoires, l’activation de nombreux facteurs de transcription dont
NFκB, et l’activation des MAP kinases ERK1/2. Cependant, l’étude de pseudovirions
exprimant une GP mutante délétée de son domaine « mucin-like » montre que l’activation
de NFκB et de ERK est affectée et que les cellules produisent moins de cytokines [192].
Les monocytes infectés pénètreraient donc dans la circulation sanguine et
dissemineraient le virus dans d’autres cellules et organes [175]. EBOV pourrait également
être propagé par le biais des cellules dendritiques et leur capacité d’infecter les cellules en
trans [193]. Cependant, les anomalies de coagulation observées chez des patients atteints
de FHVE ne seraient pas le seul résultat d’une cytolyse des cellules endothéliales par le
virus, mais pourraient faire également intervenir le système immunitaire [181].
b. Cytokines
Les cytokines sont un groupe de petites protéines (8 à 30kDa) et peptides utilisés par
les organismes comme éléments de signalisation. Il existe 4 types de cytokines en fonction
de leur structure : la famille de cytokines à 4 hélices-α subdivisée en 3 sous-familles ; la
famille des IL-1 ; la famille des IL-17 ; et la famille des chémokines. Les cytokines
peuvent également être classifiées selon leur rôle dans la prolifération et le fonctionnement
des cellules T helper de type 1 ou 2. Les cytokines constituent le 3è signal requis pour
l’activation des cellules T en présence d’une cellule présentatrice d’antigène (CPA).
L’activation de la cellule T passe tout d’abord par la molécule du complexe majeur
d’histocompatibilité (CMH)-II présentant l’antigène au récepteur de la cellule (TCR). Cette
interaction est ensuite stabilisée par des interactions entre les molécules d’adhésion et leurs
récepteurs. Enfin, la CPA secrète des cytokines qui, une fois liées à leurs récepteurs sur la
cellule T, vont activer celle-ci [194]. Les cytokines sont produites par les cellules de
l’immunité et plus particulièrement par les cellules T et les monocytes-macrophages [183].
Leurs effets sont variés et incluent la régulation de plusieurs gènes, l’augmentation du
nombre de récepteurs de surface pour d’autres cellules, ou la suppression de leur propre
Introduction
73
effet par retro-inhibition. Ainsi, l’IL-6 pourrait altérer la production de plaquettes en
augmentant la transcription dans le foie du régulateur de la thrombopoièse [195]. In vitro,
l’IL-6 agirait comme un facteur de maturation des mégacaryocytes [196].
Les chémokines (pour chemotactic cytokines) sont une famille de petites cytokines ou
de protéines secrétées par les cellules. Elles sont caractérisées par leur petite taille (8 à 10
kDa) et la présence de 4 cystéines à des positions conservées. Le rôle majeur des
chémokines est de guider la migration des cellules grâce à un gradient de concentration.
Elles ont alors un rôle dans l’inflammation où leur fonction de chémoattraction permet de
recruter les leucocytes, monocytes, neutrophiles et autres cellules effectrices de la
circulation sanguine au site d’infection. La distance qui sépare les 2 premiers résidus
cystéine permet de classer les chémokines en 4 types. Il s’agit des γ-chémokines (ou
chémokines C) qui attirent les précurseurs de cellules T dans le thymus ; des δ-chémokines
(ou chémokines CX3C) qui servent à la fois de chémoattractant et de molécule d’adhésion ;
des α-chémokines (ou chémokines CXC) dont une classe, contenant l’interleukine (IL)-8,
induit la migration des neutrophiles. Il s’agit également des β-chémokines (ou chémokines
CC) qui induisent la migration des monocytes, cellules NK et dendritiques. Cette classe
comporte la protéine chémoattractant les monocytes (MCP-1 ou CCL2) ainsi que la
chémokine RANTES ou CCL5 qui attire les cellules T, les éosinophiles et les basophiles
[197]. Les chémokines RANTES, MIP-1α et MIP-1β ont été identifiées comme des
facteurs de suppression du VIH-1 produit par les cellules T CD8+ [198, 199]. La sécrétion
de chémokines est souvent stimulée par des cytokines pro-inflammatoires. Ainsi, l’IL-2 et
l’IL-10 induisent l’expression des récepteurs CCR1 et CCR2 à la surface des cellules T
[200, 201]. Ces récepteurs sont spécifiques des chémokines RANTES, MIP-1 et MCP-1
[202].
L’infection par le virus ZEBOV bloque l’induction de différents gènes dans les cellules
endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC). Ainsi, l’expression des gènes du
CMH-I, de l’IL-6, de l’ICAM-1 (molécule d’adhésion intercellulaire) et du facteur de
régulation de l’IFN est inhibée. Le CMH-I est une protéine de surface qui présente
l’antigène aux cellules T cytotoxiques CD8+ ; l’IL-6 est un signal de différentiation des
cellules B, signal de sécrétion des anticorps aux cellules du plasma, et un co-stimulateur
pour cellules T ; l’ICAM-1 permet aux cellules endothéliales de recruter les leucocytes afin
de les faire transiter au site de l’infection. Son inhibition pourrait atténuer la réponse
Introduction
74
inflammatoire. L’inhibition de l’expression de ces gènes pourrait jouer un rôle dans
l’immunosuppression observée lors d’infections par ZEBOV, donc dans la pathogenèse de
la maladie [98].
En effet, la GP d’EBOV comporte un motif semblable au domaine immunosuppresseur
identifié chez les rétrovirus et plus particulièrement dans le VIH-1 [203]. Des cellules
mononucléaires sanguines d’humain ou de macaques rhésus (PBMC) activées ont été
exposées à ZEBOV inactivé ou à des peptides représentant le motif immunosuppresseur
des différentes souches de filovirus. Une diminution de l’expression des marqueurs
d’activation sur les cellules CD4 et CD8 a été observée, ainsi que l’apoptose de ces cellules
12h après exposition, l’inhibition de la progression de leur cycle cellulaire, la diminution
de l’expression de l’IL-2, l’IFN-γ et l’IL12-p40, et l’augmentation de l’expression de l’IL-
10 [204].
Les macrophages et monocytes étant les premiers producteurs de cytokines et
chémokines, l’effet direct de EBOV sur les macrophages humains a été étudié en mettant
des PBMC ou des macrophages dérivés de monocytes en présence d’EBOV. L’infection
des PBMC résultait en l’induction des MCP-1, MIP-1α, RANTES et du Tumor Necrosis
Factor (TNF)-α 24h après l’infection. L’infection des macrophages par un virus vivant
induisait la production de MIP-1α et TNF-α alors que la mise en présence des cellules avec
un virus inactivé ou vivant stimulait dans les 2 cas la production de RANTES et MCP-1.
Les macrophages étant une cible importante pour la réplication virale, les filovirus
pourraient exploiter les propriétés chémotactiques des chémokines pour sa propre
propagation dans l’hôte. Curieusement, les interférons de type I (IFN-α et –β), l’IL-1β et
l’ IL-10 n’étaient pas induits par EBOV dans cette étude alors qu’ils sont observés en taux
élevés dans les sérum de patients [205].
Cette étude est en accord avec l’inhibition de la production d’IFN type 1 par la VP35
grâce à la synthèse d’ARN double-brin inhibiteur [206].
En effet, un microarray d’expression montre que les gènes liés au système immunitaire
sont sur-exprimés dans les cellules hépatiques humaines infectées par les filovirus
ZEBOV, REBOV et MARV. Au contraire, les gènes codant pour des protéines de la
coagulation ou de la phase aïgue sont sous-exprimés. Une caractéristique commune de la
virulence des filovirus est la suppression des réponses antivirales clé de la cellule.
L’infection par ZEBOV ou MARV inhibe l’expression des gènes stimulés par l’IFN. Il est
Introduction
75
probable qu’une corrélation existe entre l’antagonisme des réponses IFN type I et la
virulence des filovirus [207].
Un test multiplex a été développé afin de mesurer les taux de cytokines et chémokines
circulantes chez des macaques cynomolgus infectés par REBOV. L’augmentation en
cytokines circulantes était corrélée à l’augmentation en antigènes viraux circulant. Les
chémokines dont les taux ont augmenté étaient les MCP-1 et -1β, RANTES et l’IL-1β à
des taux plus variables. MCP-1 et RANTES peuvent affecter la perméabilité vasculaire par
induction de sécrétion de radicaux superoxydes et histamine [208, 209]. RANTES
affecterait également la fonction des plaquettes par sécrétion d’acide arachidonique [210].
Les cytokines dont les taux ont augmenté étaient :l’IL-6, le TNF-α, l’IFN-γ, les IL-2, -4, -
8, et -10. Les cellules Th1 sécrètent principalement l’IL-2, le TNF-α et l’IFN-γ en vue
d’activer les macrophages. L’IL-4 est plus spécifiquement secrétée par les cellules Th2
afin d’activer les cellules B et de stimuler l’immunité humorale. Contrairement aux
résultats trouvés chez les humains asymptomatiques [211], 81% des macaques infectés
pour lesquels de forts taux d’IL-4 ont été déterminés avaient également un fort taux
d’anticorps IgM [210].
Les taux de cytokines ont été comparés entre des sérums de patients décédés, de
survivants et de contrôles. Les patients qui décèdent présentent une forte augmentation à
des degrés variables des niveaux d’IFN-γ, d’IL-2 et -10, de TNF-α et d’IFN-α, dont le taux
d’ARNm dans les cellules sanguines est élevé. Ces résultats suggèrent qu’une forte
activation immune accompagne la phase aïgue et terminale de la maladie et pourrait
contribuer à l’issue fatale de la FHVE. La présence d’IFN en grandes quantités pourrait
contribuer au syndrome de fuite des capillaires et aux symptômes hémorragiques associés à
la FHVE. Cette hypothèse est corrélée par l’observation clinique lors d’épidémies que la
plupart des victimes meurent d’un état de choc accompagné de fièvre, polypnée,
disfonctionnement des reins et altérations du système nerveux central [212].
L’apoptose des cellules CD4 et CD8 avait été observée 12h après exposition de PBMC
à Ebolavirus zaïre [204]. La mort cellulaire intervient par 2 mécanismes distincts [213] :
soit la perforine provoque l’ouverture de pores dans la membrane des cellules cible [214,
215], soit le ligand FasL, exprimé par les cellules effectrices et principalement les cellules
T activées, interagit avec son récepteur Fas situé à la surface des cellules cibles [216].
Introduction
76
Les mécanismes impliqués dans l’apoptose des lymphocytes ont donc été étudiés chez
des primates infectés. Les cytokines et chémokines dans le sérum ont été mesurées, ainsi
que le taux du facteur soluble Fas. L’infection in vitro de PBMC montre une forte
induction des cytokines/chémokines, utilisées comme voie de signalisation, et une
augmentation du nombre de lymphocytes apoptotiques observés par microscopie
électronique. La plupart des caractéristiques pathologiques observées seraient donc la
conséquence de ces évènements [217].
c. Immunité humorale
Chez les malades atteints de FHVE, les IgG et les IgM apparaissent à peu près au
même moment après le début des symptômes (8 à 10 jours), mais les IgM persistent pour
une période plus courte chez les patients convalescents. En effet, des IgG ont été détectés
jusqu’à 2 ans après la convalescence. La détection d’anticorps est beaucoup plus utile pour
le diagnostic de survivants en début de convalescence et dans le classement des cas [101].
Un panel d’anticorps monoclonaux humains recombinants a été isolé à partir d’ARN
extrait du sang de survivants de l’épidémie de 1995 à Kikwit, RDC. Les anticorps étaient
d’abord sélectionnés selon leur capacité à réagir avec un lysat de cellules Vero infectées
avec la GP soluble, puis avec une préparation de membrane de virion [218]. Les anticorps
qui réagissaient fortement avec la nucléoprotéine (NP) et les GP soluble et membranaire
ont été caractérisés. Un des anticorps dirigés contre la GP (KZ52) neutralisait 50% du virus
à des concentrations nanomolaires [164].
Les anticorps ont une activité de neutralisation du virus [163, 165]. Tous les anticorps
murins, humain, équins ou primates testés permettaient de neutraliser l’infection de
monocytes/macrophages ou de cellules Vero par EBOV [219]. Cette activité est toutefois
réduite en présence de GP soluble, dont le rôle serait de capter les anticorps destinés aux
cellules infectées [220].
Introduction
77
d. Cas asymptomatiques humains
Lors de 2 épidémies en 1996 dans le Nord du Gabon, des personnes ayant eu des
contacts permanents sans protection avec du matériel contaminé n’ont pas développé de
symptômes. La réponse immune de 7 d’entre eux a été étudiée. Des gènes viraux ont pu
être amplifiés par RT-PCR, mettant en évidence leur infection. Des IgG et IgM dirigés
contre EBOV, et des IgG dirigé contre protéines NP et VP40 ont été identifiés confirmant
l’infection. Le taux d’IgG augmente entre 17 à 25 jours, celui d’IgM augmente entre 10 à
18 jours après le contact infectieux. La réponse anticorps est induite plus tardivement que
chez les patients symptomatiques. Ces 7 patients asymptomatiques présentaient une
réponse inflammatoire forte et précoce, caractérisée par de fortes concentrations de
cytokines circulantes : IL-1β, TNF-α, IL-6 (qui enclenchent et régulent la réponse
inflammatoire) et chémokines circulantes : MCP-1, MIP-1α, MIP-1β (qui recrutent les
cellules immunitaires au site d’infection) [211].
Les réponses inflammatoires de ces patients asymptomatiques étaient en association
temporelle avec la phase anti-inflammatoire composée par l’antagoniste soluble de
l’interleukine 1, l’IL-1RA, par les récepteurs solubles du TNF- α, de l’IL-10 et du cortisol,
qui sont des médiateurs anti-inflammatoires. La régulation négative de la réponse
inflammatoire était suivie par l’activation transitoire des cellules T pendant quelques jours.
Cette activation était indiquée par la régulation positive de l’ARNm des cytokines IL-2 et
IL-4 et des marqueurs d’activation CD28, CD40L et CTLA4. La réponse des cellules T
était associée à l’activation des cellules cytotoxiques, mise en évidence par l’augmentation
marquée et maintenue de l’ARNm de IFN-γ, du ligand FasL et de la perforine impliquées
dans la mort cellulaire. La diminution des marqueurs cytotoxiques coïncidait avec la
disparition de l’ARN viral, suggérant l’élimination des cellules infectées de la circulation
par les cellules cytotoxiques [221]. Les résultats suggèrent que les composants pro- et anti-
inflammatoires forment une boucle d’autorégulation, dans laquelle l’IL-10 et le cortisol
réguleraient négativement les cytokines pro-inflammatoires et stimuleraient leurs
antagonistes. Dans cette boucle d’autorégulation, les récepteurs solubles du TNF- α et l’IL-
1RA réduiraient l’activité des cytokines pro-inflammatoires. Ainsi, la rapide régulation des
réponses inflammatoires permettrait d’éviter les fortes fièvres et les dommages causés aux
tissus.
Introduction
78
V. Agent pathogène : le virus Ebola
V.1. Taxonomie des fièvres hémorragiques tropicales
Les fièvres hémorragiques virales (FHV) sont des maladies virales d’étiologies
diverses mais regroupées sur leurs caractéristiques cliniques (Tableau II). Les FHV ont des
symptômes communs fréquemment observés dans les régions tropicales. Il s’agit de fièvre,
de symptômes digestifs et de signes hémorragiques généralisés ou localisés à certains
organes [222]. Ces caractéristiques cliniques peuvent être provoquées par de nombreux
virus, des parasites, des bactéries ou des venins. Douze virus distincts associés à des
fièvres hémorragiques chez les humains sont classés en 4 familles : Arenaviridae,
Bunyaviridae, Flaviviridae et Filoviridae (revues réf [223]).
a. Les Arenaviridae
Les virus du genre Arenavirus, famille Arenaviridae, sont des virus enveloppés dont la
face extérieure est couverte de glycoprotéines. Leur génome est composé de 2 segments
d'ARN négatif simple brin, nommés Small (S) et Large (L), contenant chacun 2 gènes en
orientation ambisens [224]. Le petit segment code pour la nucléoprotéine (N) et la
glycoprotéine (GPC), le grand pour la polymérase (L) et la protéine de matrice (Z) [225].
La plupart des arénavirus ont une distribution géographique restreinte, leur espèce
réservoir est en général un rongeur [224]. Des 16 virus composant cette famille, 6 sont
pathogènes pour l’Homme. Les Arenavirus les plus connus provoquent la fièvre de Lassa
et les fièvres hémorragiques Argentine et Bolivienne [89].
La fièvre de Lassa a été décrite pour la première fois en 1969, mais il est possible que
des épidémies non reconnues aient existé auparavant. L’apparition de la fièvre de Lassa
dans la population humaine implique un premier contact de l’homme avec le réservoir
murin du virus, Mastomys natalensis. La transmission secondaire est principalement
nosocomiale. Cette maladie est endémique en Afrique de l’Ouest où plusieurs épidémies
ont sévi au Nigeria, en Sierra Leone et au Libéria [226]. Des analyses sérologiques chez les
populations guinéennes et sénégalaises ont révélé la présence d’anticorps suggérant le
Introduction
79
contact avec le virus Lassa [227]. Le taux de mortalité observé lors de la dernière épidémie
varie de 12 à 23% [228].
D’autres maladies dues aux arénavirus sont la fièvre hémorragique argentine, reconnue
depuis 1943 et causée par le virus Junin, et la FH bolivienne, reconnue depuis 1959 et
causée par le virus Machupo [89]. La FH argentine est restreinte à une région bien
délimitée où des épidémies ont lieu presque tous les ans [229], en relation avec des
changements dans les conditions de vie du réservoir [230]. De même, le virus Machupo
infecte naturellement une espèce rongeur et sévit dans une région précise de Bolivie. Ces 3
virus se transmettraient à l’homme par des aérosols d’excréta de rongeurs infectés [231].
b. Les Bunyaviridae
Les virus de la famille des Bunyaviridae sont des virus enveloppés, dont la face
extérieure est couverte de glycoprotéines. Leur génome est composé de 3 segments d’ARN
négatif simple brin (grand L, moyen M et petit S) codant en antisens les protéines virales
[225]. Plusieurs virus de cette famille provoquent des FH chez l’homme. Les maladies les
plus connues sont la fièvre de la vallée du Rift, la fièvre hémorragique de Crimée-Congo et
les fièvres hémorragiques avec syndrome rénal.
La fièvre de la vallée du Rift est causée par un virus du genre Phlebovirus, isolé pour la
première fois en 1930. La transmission de la maladie à l’homme est le plus souvent
observée en période d’épizootie, soit par le biais du vecteur, les moustiques du genre Culex
ou Aedes [232, 233], soit par aérosols émis lors de l’abattage des animaux infectés [223].
Elle a touché l’Égypte [234] et les pays de l’Afrique de l’Est : Ouganda, Kenya, Somalie
[235-237] bien que des petits foyers épidémiques aient éclaté dans le sud de l’Afrique
[238], au Sénégal [239] et en Mauritanie [240]. Toutes les épidémies recensées suivent des
périodes de précipitations élevées, propices au développement de la végétation et à
l’explosion démographique des moustiques [241, 242]. La croissance importante de la
population de moustiques infectés occasionne alors de grosses épidémies en nombre de
cas. La dernière épidémie de fièvre de la vallée du Rift survenue au Kenya au touché 404
personnes de novembre 2006 à janvier 2007 et provoqué 118 décès (29% de mortalité)
[236].
Introduction
80
La fièvre hémorragique de Crimée-Congo (FHCC), décrite en 1944 en Crimée de
l’ancienne Union Soviétique, est causée par un virus du genre Nairovirus, décrit en 1967 et
similaire à un virus isolé en 1956 au Congo. La maladie peut être transmise par les
morsures de tiques du genre Hyalomma, par contact avec des animaux infectés ou des
personnes malades [243]. Sept lignées génétiques du virus de la FHCC ont été mises en
évidence en fonction de leur localisation géographique [244]. Des épidémies et cas de
FHCC ont été recensés dans l’Ouest et le Sud de l’Afrique [243, 245], en Europe de l’Est
[246], Turquie [247], Asie [248], et Moyen-Orient [249], avec un taux de mortalité de
27%.
Les virus responsables de la fièvre hémorragique de Corée, des épidémies de FH avec
syndrome rénal (FHSR) en Chine et dans l’ancienne Union Soviétique sont proches et
forment le genre Hantavirus. Ces virus sont eux aussi véhiculés par un réservoir rongeur
[250] et existent au-delà de l’aire d’extension de la FHSR [251]. En 1993, une maladie
inconnue avec des symptômes pulmonaires est apparue dans le sud-ouest des USA,
entraînant le décès de 75% des cas confirmés. L’amplification de fragments du génome
viral a mis en cause un membre du genre Hantavirus [252]. L’apparition de cas de
syndrome pulmonaire à Hantavirus est liée à des facteurs saisonniers et temporels [253-
255]. La grande répartition des virus responsables de FHSR et de ses espèces réservoir ont
permis de nombreuses captures, études de caractérisation moléculaire [256, 257] et études
de leurs relations phylogénétiques [258]. Les cas d’infection par un Hantavirus sont
estimés de 100 000 à 200 000 cas par an [259].
c. Les Flaviviridae
Le genre Flavivirus de la famille des Flaviviridae est composé de virus enveloppés
dont le génome, une molécule d’ARN positif simple brin, code une seule phase ouverte de
lecture. Celle-ci est clivée pendant et après la transcription afin de produire 3 protéines
structurales et 7 protéines non structurales. Les virus responsables de FH chez l’homme
sont pour la plupart des arbovirus, c’est-à-dire transmis par des arthropodes.
Introduction
81
Le représentant le plus connu de cette famille est le virus amaril de la fièvre jaune.
Depuis le XVIIè siècle, la fièvre jaune est responsable d’épidémies urbaines aux
conséquences dramatiques pour des pays tropicaux d’Amérique du Sud et d’Afrique. Le
virus est transmis par 2 genres de moustiques distincts selon le continent (Aedes en Afrique
et Haemogogus en Amérique) et il se perpétue grâce à 2 cycles de transmission : un cycle
silencieux dans la forêt, maintenu par des transmissions continues moustique-singe-
moustique, et un cycle urbain potentiellement dévastateur pour l’homme. L’homme
s’infecte suite à une piqûre de moustique infecté. La fièvre jaune peut être responsable de
gigantesques épidémies, telles celles du Sénégal en 1965 et du Burkina-Faso en 1969 et
1983 qui ont totalisé près de 800 cas [260]. Elle peut aussi survenir sous la forme de petits
foyers épidémiques de quelques cas sporadiques [261, 262]. Le taux de mortalité observé
était de 11% pour l’Afrique en 2004 [260]. Ce taux était en une nette progression lors de
l’année 2005 avec des taux de mortalité allant de 20 à 43%, alors qu’il restait stationnaire
en Amérique du Sud avec 45% de décès [263]. Le développement d’un vaccin a permis de
maîtriser les épidémies en organisant des campagnes de vaccination de rattrapage lors de
l’apparition de cas de fièvre jaune. Cependant, la couverture vaccinale moyenne des pays
d’Afrique reste inférieure à 50% [264].
La dengue est quant à elle connue depuis près de 200 ans, mais ne fut caractérisée qu’à
partir de 1960 [265]. Les virus de la dengue comportent 4 sérotypes distincts DEN1 à
DEN4, transmis par les moustiques du genre Aedes. La maladie peut prendre 3 formes
selon le degré de gravité de la maladie. La fièvre de la dengue est la forme bénigne
classique, avec peu ou pas de symptômes. Une forme sévère, la fièvre hémorragique de la
dengue, a été observée chez des personnes qui ont déjà été infectées par d’autres sérotypes.
Dans 1% des cas, cette forme est associée à un syndrome de choc [266]. Les taux de
mortalité de ces 2 formes sévères sont respectivement de 10-20% à 40% [267, 268].
Originaire de l’Asie du Sud-Est où il a émergé il y a 50 ans, le virus de la dengue s’est
propagé aux régions du Pacifique, allant jusqu’en Amérique latine. Au niveau mondial,
près de 50 millions d’infections apparaissent chaque année, provoquant 24 000 décès et
90% des 500 000 hospitalisations recensées sont des enfants [269].
Les Flavivirus ont été divisés en différents sérogroupes sur la base de tests de réactions
de neutralisation croisées. Un de ces groupes comprend les virus encéphalite transmis par
les tiques. Parmi ce sérogroupe, 3 virus provoquent des fièvres hémorragiques. Le virus de
Introduction
82
la maladie de la forêt de Kyasanur, reconnu en 1957 suite à une épidémie qui touchait les
personnes entrant dans la forêt, provoque chaque année entre 400 et 500 cas dans la zone
d’endémie avec un taux de mortalité d’environ 10% [270]. La fièvre hémorragique
d’Alkhurma est causée par un variant du virus de Kyasanur dont les séquences
nucléotidiques présentent 89% d’homologie. Ce virus a été isolé dans les années 1990 en
Arabie Saoudite. A ce jour, seulement 24 cas ont été recensés dont 25% est décédé [271].
Enfin, le virus d’Omsk a été isolé en 1947 en Sibérie, il est restreint à la partie asiatique de
la Russie. Très peu de cas ont été recensés, 2 sous-types antigéniques ont pu être identifiés.
Il est provoque une maladie hémorragique associée à une encéphalite létale dans 0,5 à 3%
des cas [272].
d. Les Filoviridae
En 1967 une nouvelle FH apparaissait dans des laboratoires de Marburg (Allemagne) et
Belgrade (Yougoslavie) qui travaillaient avec des singes verts (Cercopithecus aethiops) en
provenance d’Ouganda [273]. En 1976, 2 autres épidémies d’une nouvelle FH se sont
déclarées quasi simultanément au Soudan [13] et au Zaïre [17]. De ces 3 épidémies ont été
isolés et identifiés 2 nouveaux virus aux morphologies et structures similaires, mais aux
propriétés génétiques légèrement différentes. Ils ont été nommés, selon leur lieu
d’apparition, virus de Marburg et virus Ebola, nom de la rivière baignant le village de
Yambuku, épicentre de l’épidémie du Zaïre. Ces 2 virus, qui ne possèdent aucune parenté
antigénique avec les virus connus responsables de FH, ont été groupés en une nouvelle
famille basée sur leur morphologie filamenteuse : les Filoviridae [274].
Les Filoviridae sont des virus enveloppés, dont le génome est composé d’un brin non
segmenté d’ARN négatif. La maladie qu’ils provoquent correspond au tableau clinique des
autres FH. Ils proviennent des régions tropicales d’Afrique, à l’exception d’une espèce.
Le virus de Marburg et la FH qu’il induit sont les mieux étudiés des Filoviridae tout en
étant la plus rare des FH. En effet, depuis son en 1967, seulement 5 épidémies dues à
MARV ont été répertoriées. La première épidémie a touché des laboratoires de Marburg
(Allemagne de l’Ouest) et de Belgrade. Trente et un employés qui manipulaient des reins
de singes verts provenant d’Ouganda ont été infectés, 7 d’entre eux ont succombé à la
maladie [275]. La deuxième épidémie eut lieu en 1975 en Afrique du Sud avec 1 cas
primaire fatal et 2 cas secondaires qui ont survécu [78]. La troisième épidémie est apparue
Introduction
83
au Kenya en 1980 où un patient et son médecin ont été infectés. Seul le médecin a survécu
à la maladie. Malgré le grand nombre de contacts, aucun cas secondaire n’a été enregistré
[79]. La quatrième épidémie a sévi en 1999 en République Démocratique du Congo (RDC)
dans la région du Kivu, zone entièrement contrôlée par les rebelles. Malgré l’enclavement
de la région et le conflit, 73 cas ont pu être identifiés [276, 277]. La dernière apparition de
MARV a provoqué 252 cas dont 227 décès dans la province d’Uige, en Angola, d’octobre
2004 à juillet 2005. C’est l’épidémie la plus importante à ce jour, en nombre de cas et en
taux de mortalité (90% contre environ 25% pour les autres épidémies) [278]. Ces données
montrent également que la FH de Marburg est la moins contagieuse des FH avec une
transmission secondaire peu commune [279].
Au contraire, EBOV est plus fréquent et beaucoup plus contagieux (voir chapitre I.
Historique). Depuis sa première apparition en 1976, 4 espèces d’Ebolavirus ont été
identifiées sur les bases de leurs propriétés physico-chimiques, leurs différences
biologiques (taux de mortalité, cultures cellulaires, immunologie) [97, 119] et leur
phylogénie [280].
Tableau II : Les fièvres hémorragiques virales, leurs virus, vecteur et distribution d’après LeDuc [223]. Famille Genre ARN Virus Maladie Distribution Vecteur
Lassa Fièvre de Lassa Afrique Ouest Rongeur Junin FH argentine Argentine Rongeur Arenaviridae - Machupo FH bolivienne Bolivie Rongeur
Phlebovirus Vallée du Rift F vallée du Rift Afrique Moustique Nairovirus Crimée-Congo FH Crimée-Congo Afrique, Asie Tique
Bunyaviridae Hantavirus
- Hantaan FHSR
Afrique, Asie, Europe, Amérique
Rongeur
Amaril Fièvre Jaune Afrique, Amérique du Sud
Moustique
Dengue Dengue Asie, Pacifique, Amérique
Moustique
Virus d’Omsk FH d’Omsk Russie Tique
Virus Kyasanur Maladie de la forêt de Kyasanur
Inde Tique
Flaviviridae +
Virus d’Alkhurma
FH d’Alkhurma Arabie Saoudite Tique
Marburg FH de Marburg Afrique Filoviridae - Ebola FH d’Ebola Afrique
Introduction
84
V.2. Morphologie et structure
a. Morphologie
Les virus Ebola et de Marburg sont pléiomorphiques. Ils peuvent se présenter sous la
forme la plus connue d’un filament, parfois branché, en forme de « 6 », de « U » ou
épingle, ou plus rarement sous forme circulaire (Figure 8) [92]. Les filaments viraux ont un
diamètre de 80 nm, cependant, leur longueur est variable, pouvant aller jusqu’à 14 µm
[281]. Le pic d’infectivité d’EBOV serait associé à une longueur de 805 nm [282].
Figure 8 : Images d’Ebolavirus en microscopie électronique. Les formes circulaires, en 6 et en épingle sont
représentées. D’après Leroy [80].
Les virus sont composés d’un complexe ribonucléocapsidique entouré d’une enveloppe
lipidique dérivant en partie de la membrane des cellules infectées. L’enveloppe est
entièrement recouverte de spicules globulaires d’environ 7 nm de longueur et espacées
d’environ 10 nm [282].
b. Structure
Les filovirus sont composés de 2 éléments structuraux : l’enveloppe et le complexe
ribonucléocapsidique, résultant de l’assemblement des 7 protéines virales. Les spicules
recouvrant l’enveloppe virale sont constitués par la GP membranaire, en homotrimère sur
la face externe et associée à 2 autres protéines de structure, la VP24 et la VP40 sur la face
interne de l’enveloppe [282]. Le complexe ribonucléocapsidique est composé d’un brin
d’ARN linéaire, de polarité négative, et des 4 protéines structurales impliquées dans la
Introduction
85
formation de la nucléocapside : la nucléoprotéine (NP), l’ARN polymérase (L), la protéine
virale de 35kDa (VP35) et la VP30 [283]. La nucléocapside hélicoïdale a une longueur de
50 nm et une périodicité d’environ 5 nm par tour d’hélice (Figure 9) [89, 281].
Figure 9 : Représentation schématique de la structure d’Ebolavirus. L représente l’ARN polymérase, GP
correspond à la glycoprotéine, NP à la nucléoprotéine, et VP aux protéines virales structurales.
c. Inactivation physico-chimique
Plusieurs traitements physiques inactivent le virus Ebola. Chauffer un sérum à 60°C
pendant 1h inactive complètement le virus, même lorsque le titre est très élevé [284].
L’exposition à 1,27 x 106 rads de rayons gamma inactive le virus sans en modifier la
structure protéique ni les qualités immunologiques [285]. Par contre, l’exposition au
rayonnement ultra-violet (1 200 à 2 000 W/cm² pendant 30 minutes minimum) ainsi que
les cycles de congélations/décongélations successives n’inactivent pas en totalité le virus et
en diminuent l’antigénicité [285].
De nombreux traitements chimiques sont également utilisables. Lorsque le matériel
biologique est destiné à des études immunologiques, EBOV peut être inactivé par la β-
propiolactone (solution finale diluée à 1/400) ou par la dilution du sang dans une solution
d’acide acétique à 3% (pH 2,5, pendant 15 minutes). Toutefois, ces traitements peuvent
altérer certaines protéines présentes dans le sérum [284, 285]. Sur le terrain, l’eau de javel
et les désinfectants à base de phénol sont régulièrement utilisés pour la désinfection du
matériel médical et ménager, des vêtements, et des bâtiments infectés.
Par contre, EBOV reste infectieux en milieu ambiant plusieurs jours. Ainsi, du virus a
pu être isolé à partir de sang resté dans des seringues sur des paillasses de laboratoire et à
partir de carcasses animales en voie de décomposition [59].
Introduction
86
V.3. Organisation du génome
Le génome des filovirus est représenté par un simple brin d’ARN, linéaire, de polarité
négative et d’une longueur d’environ 19 kb (18,9 kb pour EBOV et 19,1 kb pour MARV).
Le génome code pour 7 gènes disposés comme suit : 3’-leader-NP-VP35-VP40-GP-VP30-
VP24-L-trailer-5’ (Figure 10).
Figure 10 : Organisation génomique de Marburgvirus et de 3 espèces d’Ebolavirus, d’après Sanchez et
al. [286]. RI : Région Intergénique ; C : Chevauchement.
Certains gènes des filovirus sont séparés par des régions intergéniques de longueur
variable, tandis que d’autres se chevauchent. EBOV possède 3 régions intergéniques qui
alternent le long du génome avec 3 chevauchements de gènes, situés entre les régions
codant pour la VP35 et la VP40, celles codant pour la GP et la VP30 et celles codant pour
la VP24 et la protéine L. Les chevauchements sont limités à 5 nucléotides très conservés :
3’-UAAUU-5’. Ce motif est présent dans tous les signaux de transcription Start ou Stop
des gènes impliqués. Ces zones de chevauchement influeraient sur le niveau d’expression
du gène en aval en agissant sur la transcription. Dans ce cas, ils pourraient permettre à la
polymérase de reconnaître le site d’initiation de transcription du gène en aval après la
polyadénylation de l’ARN messager (ARNm), et éventuellement de se repositionner [287].
Les régions non codantes situées aux extrémités 3’ et 5’ du génome contiennent les
signaux de réplication et d’encapsidation [288].
Introduction
87
La prédiction de structures secondaires a montré que les extrémités 5’ des ARNm
forment des structures stables en épingles à cheveux (Figure 11), les motifs conservés
d’initiation et de terminaison de transcription se situant dans la partie tige de la structure
[287]. Les longueurs des structures en épingle à cheveux sont similaires pour les espèces
Zaïre et Soudan. Cependant, leurs longueurs et stabilités diffèrent pour les transcrits des
différents gènes. Ainsi, la protéine VP40, protéine virale produite en plus grande quantité,
se caractérise par un ARNm dont la structure secondaire en épingle à cheveux est la plus
longue et la plus stable. Ces structures secondaires auraient pour rôle de stabiliser l’ARNm
et/ou d’améliorer leur fixation aux ribosomes dans le but d’influer sur l’expression des
gènes [286].
Figure 11 : Représentation
schématique des structures secondaires
prédites aux extrémités 5’ des 7 gènes
d’EBOV espèces A) Zaïre [287] et B)
Soudan [286]. Les séquences conservées
de transcription se trouvent dans la tige et
sont représentées par les traits.
V.4. Cycle de réplication
Le danger représenté par les filovirus pour l’être humain, ajouté à l’absence de
traitement ou vaccin, contraint à des manipulations de virus vivants en laboratoires de
niveau de biosécurité 4. Ces contraintes ont obligé les équipes de chercheurs à trouver une
alternative : les mécanismes d’entrée, réplication et sortie de la cellule sont donc étudiés
Introduction
88
par le biais de virus pseudotypés ou recombinés, ou par transfection de cellules. Ce sont
des virus dont un gène est remplacé par la séquence codant une ou plusieurs protéines du
filovirus. Les systèmes utilisés sont les virus de l’immunodéficience humaine de type 1
(VIH-1) pseudotypés, les virus de la stomatite vésiculaire (VSV) recombinants, le virus de
la leucémie murine (MLV) pseudotypé. L’utilisation de ces systèmes ne nécessite pas les
conditions rigoureuses du travail en laboratoire de niveau de biosécurité 4. Toutefois,
même si les résultats obtenus donnent une idée des mécanismes impliqués, ils ne restent
qu’hypothétiques et nécessitent une confirmation par le virus vivant, dans lequel peuvent
intervenir des interactions entre protéines.
a. Entrée dans la cellule
Les premières études concernant l’entrée d’EBOV dans les cellules humaines ont
cherché à connaître la gamme d’infection du virus. Pour cela, plusieurs lignées de cellules
humaines ont été infectées par le virus de la leucémie murine (MLV) pseudotypé avec la
glycoprotéine membranaire (GP). MLV-GP infecte un grand nombre de cellules
mammifères, bien que les cellules lymphoïdes (cellules T) ne soient pas permissives,
probablement à cause de l’absence d’un récepteur fonctionnel. En parallèle, l’étude des
bases faibles sur l’infection a montré que le mécanisme d’entrée dans la cellule serait
dépendant du pH [289, 290]. Le rôle de la GP dans l’entrée dans la cellule a été démontré
grâce à l’induction du gène rapporteur β-galactosidase (LacZ) exprimé dans les cellules
cibles. Ce système est utilisé afin de mettre en évidence les échanges de cytoplasme,
indicateurs de fusion des membranes. Lors de cette étude, il a été démontré que l’activation
par acidification des cellules exprimant la GP était nécessaire à une fusion efficace [291].
La GP membranaire, seule protéine virale à être exposée à la surface du virus, joue un
rôle dans l’entrée du virus dans les cellules. Les virus recombinants ou pseudotypés utilisés
dans la détermination des mécanismes d’entrée dans la cellule expriment donc la GP.
L’étude de différents peptides de fusion potentiels a montré leur fusion avec des
vésicules contenant du phosphatidylinositol dans leur membrane. Ce résultat suggère
l’utilisation des cavéoles comme moyen d’entrer dans les cellules par endocytose.
De plus, la mise en évidence du récepteur folate-α (FRα) comme cofacteur de l’entrée
cellulaire d’EBOV supporte cette hypothèse, l’endocytose de ce récepteur dépendant des
Introduction
89
cavéoles [292, 293]. L’utilisation du système cavéole par EBOV est encore soutenue par
l’absence d’entrée dans des cellules humaines en présence d’inhibiteurs du système. De
plus, les pseudotypes utilisés sont colocalisés avec le marqueur de la protéine cavéolaire :
la caveoline-1. Ces résultats suggèrent fortement l’utilisation de ce système, et du FRα
comme moyen d’entrée du virus [292-294].
Ce résultat doit cependant être tempéré par l’étude de la capacité du récepteur folate-α
dans la médiation de l’entrée de virus pseudotypés portant la glycoprotéine d’Ebola (EBO-
GP). En effet, cette étude a montré que plusieurs cellules primaires et de lignées
permissives à EBOV, telles que les macrophages, ne portent pas le FRα sur leur surface.
De plus, d’autres cellules de lignées déficientes pour le système cavéole peuvent être
infectées par le virus, et les cellules T non permissives expriment le FRα. Ces résultats
prouvent, contrairement aux études précédentes, que le FRα ne serait pas essentiel à
l’ entrée d’EBOV [295]. Un autre mode d’entrée parmi les nombreux ligands cellulaires
doit donc être recherché.
La similarité structurelle de l’enveloppe d’EBOV avec les enveloppes rétrovirales
ouvre de nouveaux axes de recherche [296]. Les rétrovirus étant mieux caractérisés (car
plus faciles à manipuler), les mécanismes qu’ils font intervenir sont étudiés dans le cadre
de cellules exprimant EBO-GP. Ainsi, lorsqu’il a été démontré que l’interaction de la
gp120 du VIH avec le récepteur DC-SIGN (Dendritic Cell-Specific ICAM-3 Grabbing
Non integrin), protéine membranaire exprimée par les cellules dendritiques immatures,
facilite l’infection de cellules permissives, le rôle des lectines de type C DC-SIGN a été
étudié dans des cellules exprimant EBO-GP [188]. L’expression de DC-SIGN et de son
homologue L-SIGN (exprimé à la surface de cellules endothéliales dans le foie, les
ganglions lymphatiques, et le placenta) est suffisante pour permettre l’infection de lignées
cellulaires non permissives. De plus, il apparaît que ces récepteurs agiraient en trans en
liant EBOV et transmettant l’infection aux cellules permissives [189]. Une autre lectine de
type C, mise en évidence dans les macrophages humains et spécifique pour la galactose et
la N-acetylgalactosamine (hMGL) permet d’augmenter l’infection par les filovirus. Ses
ligands sont différents de ceux utilisés par les récepteurs DC-SIGN. De plus, la présence
d’un domaine « mucin-like » de la GP serait nécessaire à une reconnaissance efficace par
la lectine [297]. EBOV utiliserait donc différents récepteurs en fonction du type de cellules
à infecter.
Introduction
90
Toujours d’après le modèle d’autres virus similaires, le rôle des cathepsines a été
étudié. Les cathepsines B et L (CatB et CatL), des cystéines protéases endosomales,
agiraient sur l’entrée du virus dans la cellule grâce à la protéolyse de la GP1 [298]. Les
pseudovirions présentant la GP1 clivée (de 19 kDa au lieu de 130 kDa) seraient plus
infectieux et résisteraient aux effets des inhibiteurs de CatB et des petits ARN interférant
(siRNA). Leur présence serait donc nécessaire mais non suffisante à l’infection de
pseudovirions VSV-GP, car un troisième facteur endosomal ou lysosomal interagirait alors
avec la GP2 dont l’accès est facilité pour déclencher la fusion [299]. Récemment, 3 des
membres de la famille Tyro3 récepteurs des tyrosines kinases ont été identifiés comme
éléments du mécanisme d’entrée. Leur implication a été confirmée par l’augmentation de
l’infection de cellules de lignées non permissives les exprimant, et par la diminution de
l’infection en présence d’anticorps anti-Tyro. De plus, la distribution des récepteurs Tyro3
correspond au tropisme des filovirus [300]. Enfin, différentes autres études ont montré
l’implication du cytosquelette (microtubules et microfilaments) [301], et le rôle de
différents domaines des GP1 et GP2 [139, 302, 303].
En résumé, le mécanisme d’entrée d’EBOV dans les cellules cibles n’est toujours pas
défini. Cependant, les expériences d’infection avec des virus recombinants exprimant la
GP permettent de penser que EBOV utiliserait différents récepteurs en fonction du type de
cellules à infecter. EBOV entrerait dans la cellule au niveau des endosomes, dont le pH bas
faciliterait la fusion, grâce à la fixation de la GP membranaire avec différents récepteurs
dont le récepteur folate-α, les lectines de type C DC-SIGN ou hMGL, de la famille Tyro3
de tyrosines kinases, ou suite au clivage de la GP1 par des protéases afin de faciliter
l’accès de la GP2 à un (des) facteur(s) de fusion à déterminer.
b. Transcription et réplication
La transcription et la réplication d’EBOV ont lieu dans le cytoplasme des cellules
infectées. La transcription débute, comme pour les autres virus à ARN négatif non
segmenté, au niveau d’une petite séquence amorce de polarité positive. L’ARN génomique
est alors transcrit en 8 ou 9 ARNm monocistroniques codant pour 8 ou 9 protéines et
complémentaires de l’ARN génomique [287, 304]. Les extrémités 5’ et 3’ portent les
Introduction
91
signaux d’initiation et de terminaison de transcription qui comportent le motif conservé 3’-
UAAUU-5’. Le site de terminaison de transcription en 3’ comporte un signal de
polyadénylation.
Le promoteur de réplication est bipartite : un premier élément serait situé dans la région
leader du génome, le second élément se trouverait en aval, dans la région 3’ non traduite du
premier gène. La séparation des 2 éléments serait indispensable à la réplication, bien que le
contenu de cette séquence ne soit pas important [305]. La réplication est inhibée par la
protéine antivirale zinc finger (ZAP). Cette protéine fixerait les transcrits du gène de la
polymérase L sur ses 2ème et 4ème motifs en doigt de zinc, avant d’affecter les taux d’ARN
génomique et antigénomique [306].
c. Sortie de la cellule
La protéine de matrice VP40 joue un rôle central dans l’assemblage et le
bourgeonnement des particules virales. Cependant, d’autres protéines virales interviennent
dans ces processus. L’influence des différentes protéines virales dans l’assemblage et la
sortie de particules virales a été étudiée par co-transfection de cellules mammifères. Les
protéines virales (VP) 35 et 24 ainsi que la nucléoprotéine (NP) sont nécessaires et
suffisantes pour l’assemblage de la nucléocapside. Par tomographie électronique, une
technique de reconstruction pleiomorphique haute résolution de macromolécules
complexes en 3D, des structures ressemblant à la nucléocapside ont été observées dans le
cytoplasme de cellules exprimant ces 3 protéines. Ces structures étaient des hélices
gauches à petits sillons, ce qui correspond aux nucléocapsides observées chez les autres
virus à ARN négatif non segmenté [307]. La formation de la nucléocapside n’a lieu que si
la NP est O-glycosylée et sialisée [308]. Les protéines VP35 et VP40 en interaction
suffisent pour incorporer un mini génome dans des particules pseudo virales [309].
L’expression par des cellules transfectées de la GP augmente la sortie de pseudovirions,
suggérant un rôle de la GP membranaire dans le bourgeonnement [310]. Le
bourgeonnement médié par la protéine de matrice est augmenté en présence de la NP ou de
la GP, l’augmentation étant plus importante lorsque les 2 protéines sont présentes
simultanément [311]. Les processus d’assemblage et de bourgeonnement nécessiteraient
donc des interactions entre les protéines VP40, VP24, VP35, NP et GP. Sur la base de ces
interactions potentielles, le rôle des différentes protéines a été étudié des points de vue
Introduction
92
structurel et biochimique dans des cellules transfectées par différentes combinaisons de
protéines virales et des cellules infectées par EBOV. Cette étude montre que l’interaction
entre la VP40 et les nucléocapsides, formées par un noyau de NP auquel s’associent les
VP35 et VP24, permettrait leur transport au site d’assemblage grâce à l’utilisation des
microtubules cellulaires. Enfin, 80% des virions issues de cellules infectées par EBOV et
la quasi-totalité des particules pseudovirales issues de cellules transfectées possédant une
nucléocapside bourgeonnait horizontalement. Le mode majoritaire de bourgeonnement
d’EBOV serait donc parallèle à la surface cellulaire, quand les particules virales sans
nucléocapside bourgeonnent perpendiculairement à la surface [94].
Les filovirus sortent généralement des cellules infectées par bourgeonnement, pouvant
conduire à la mort cellulaire. Cependant un bourgeonnement intracellulaire et une
accumulation des particules virales dans les vacuoles ont été observés pour MARV et
pourraient être utilisé par le virus pour échapper à la surveillance du système immunitaire
[183]. Le processus de bourgeonnement pourrait avoir lieu au niveau de la membrane
plasmique, où la GP virale est incorporée, grâce à des interactions entre les différentes
protéines virales assemblées et des constituants cellulaires [282]. Dans des cellules
polarisées, la GP exprimée seule se situe dans la partie apicale de la cellule, quand MARV
bourgeonne dans sa partie basale. Des facteurs autres que les protéines de surfaces
interviendraient alors dans le bourgeonnement [312].
La GP des filovirus présente des similitudes structurelles avec les protéines
d’enveloppe du VIH et du virus Influenza [313], regardons comment s’effectue la sortie
des rétrovirus de la cellule infectée.
La machinerie cellulaire de conjugaison à l’ubiquitine par le biais du domaine L des
protéines virales de matrice joue un rôle crucial dans le bourgeonnement de différents
groupes de virus enveloppés [314]. La mono-ubiquitination fonctionne comme un signal de
dégradation qui utilise un mécanisme différent de la poly-ubiquitination, signal de
reconnaissance pour la dégradation des protéines par le protéasome. Contrairement à
d’autres signaux d’internalisation contenus dans la séquence primaire de la protéine, le
signal d’internalisation de l’ubiquitine est contenu dans sa structure tridimensionnelle, ce
signal dirige les protéines vers une dégradation ou une régulation négative par endocytose
[315-317]. La sortie des rétrovirus des cellules infectées est réduite en présence
d’inhibiteur du protéasome (réduction de la quantité d’ubiquitine libre). Cependant, l’effet
est reversé par la sur-expression d’ubiquitine libre ou fusionnée à la protéine virale
Introduction
93
d’enveloppe. L’ubiquitination, et surtout celle de la protéine virale d’enveloppe, serait une
étape du processus de bourgeonnement des rétrovirus [318].
Les protéines Gag de nombreux rétrovirus et les protéines de matrice de rhabdovirus et
filovirus contiennent des domaines jouant un rôle crucial dans la séparation des particules
virales de la membrane plasmique. Ils sont appelés domaines tardifs ou L (late domains) à
cause de leur influence sur la dernière étape du bourgeonnement. Il existe 3 classes de
motifs (PTAP, PPxY, YxxL ; x = n’importe quel acide aminé) dont l’intégrité semble
essentielle à l’activité du domaine L, suggérant une interaction avec un (ou des)
composant(s) cellulaire(s). Les 3 classes sont représentées chez les rétrovirus et les
protéines de matrice des rhabdoviridae contiennent la séquence PPxY [319]. Les filovirus
se démarquent par la présence dans la protéine de matrice de 2 motifs chevauchants
PTAPPxY (séquence ILPTAPPEYMEA), tous 2 participant à la sortie du virus. L’étude de
la contribution relative de ces 2 motifs suggère le recrutement d’enzymes
déubiquitinylantes (facteurs de classe E intervenant dans la dégradation des protéines),
ainsi que la nécessité de différents cofacteurs cellulaires recrutés par les domaines L pour
le bourgeonnement [320]. Le motif PPxY interagit plus particulièrement avec des protéines
cellulaires comportant un domaine WW, domaines riches en tryptophanes. La famille des
E3 ubiquitine protéines ligases contient plusieurs domaines WW [321]. Ces ligases sont
situées au niveau de la membrane plasmique et jouent un rôle dans l’endocytose [322]. La
protéine de matrice du Vesicular Stomatitis Virus (VSV) et du virus de la rage, 2
représentant des Rhabdoviridae, proches des filovirus, interagissent physiquement et
fonctionnellement avec l’ubiquitine protéine ligase de Levure Rsp5 [323]. Les oligomères
de la protéine de matrice VP40 d’EBOV interagirait avec l’homologue humain de Rsp5,
Nedd4, par le biais des domaines WW et du motif viral PPxY [324]. La protéine cellulaire
Nedd4 régulerait la sortie des virions. En effet, lorsque le site actif de cette ubiquitine
protéine ligase est détruit par mutagenèse, le virus ne sort plus des cellules infectées. Les
domaines tardifs contenant le motif PPxY utiliseraient spécifiquement les facteurs de la
classe E3 dans le processus de bourgeonnement [325].
Chez les Rétroviridae, dont le représentant étudié était le VIH-1, le domaine L contient
le motif PTAP, également présent chez les filovirus. Afin de découvrir quel facteur
cellulaire interagit avec le motif PTAP, une banque d’ADNc humain a été screenée,
résultant en l’hybridation du gène codant pour Tsg101 (Tumor susceptibility gene 101),
facteur impliqué dans le tri des protéines. La déplétion de Tsg101 par des petits ARN
interférant (siRNA) arrête le bourgeonnement à une étape tardive, le processus de sortie du
Introduction
94
VIH-1 ne reprend que lorsque Tsg101 est réintroduit. Le bourgeonnement de rétrovirus
infectieux nécessiterait une machinerie de tri des protéines fonctionnelles, le rétrovirus
utiliserait la machinerie cellulaire pour sortir par les différents corps multivésiculaires du
lysosome [326]. La présence du motif PTAP dans le chevauchement du domaine L des
filovirus permet l’interaction des protéines de matrice avec le facteur cellulaire Tsg101,
interaction essentielle à la progression du bourgeonnement [327]. La fixation de la protéine
virale VP40, quelle que soit sa conformation, au facteur cellulaire Tsg101 augmente la
sécrétion de virions.
Les facteurs cellulaires Nedd4 et Tsg101 pourraient jouer des rôles complémentaires
dans les étapes tardives d’assemblage en recrutant les facteurs cellulaires nécessaires au
bourgeonnement par 2 voies indépendantes, et pourraient aider ainsi à franchir la barrière
énergétique requise pour la fission des membranes cellulaires et virales par l’utilisation des
vésicules du lysosome [324, 325, 328]. Le rôle des corps multivésiculaires dans le
transport de VP40 et la formation de la membrane virale a été mis en évidence pour
MARV [329, 330].
V.5. Protéines et leurs fonctions
a. Nucléoprotéine
La nucléoprotéine (NP) est produite par le premier gène situé à l’extrémité 3’ du
génome d’EBOV. Composée de 739 acides aminés, elle a un poids moléculaire de 104 kDa
[331], poids beaucoup plus élevé que les nucléoprotéines des autres virus à ARNnns dont
les poids moléculaires varient de 42 à 68 kDa [332, 333]. La partie N-terminale est
hydrophobe alors que la partie C-terminale est hydrophile et très acide. La NP est une
phosphoprotéine structurale majeure, la forme phosphorylée étant la seule incorporée dans
les virions [282, 334]. L’analyse comparative des séquences protéiques des virus MAR et
EBO montre une forte homologie pour les 400 acides aminés de la partie N-terminale. Par
contre, la partie C-terminale est moins conservée, et une petite région située au milieu de la
protéine est fortement homologue à d’autres virus à ARNnns tels que Paramyxoviridae et
Rhabdoviridae [335].
Introduction
95
La NP possède un double rôle fonctionnel et structural. En premier lieu, les systèmes
de cotransfection et de minigénomes artificiels ont montré que la NP est indispensable à la
réplication, à la transcription et à l’encapsidation des virions [288, 336]. La caractérisation
de variants adaptés aux souris a montré la présence de nombreuses substitutions dans la
séquence de la NP, suggérant une éventuelle contribution à la virulence par le biais de la
transcription et la réplication [337]. En second lieu, la NP, O-glycosylée et sialylée, est une
des 4 protéines de la nucléocapside [308], son caractère phosphorylé lui permettant de se
lier à l’ARN pour former le complexe ribonucléocapsidique. La microscopie
immunoélectronique a permis de visualiser de larges agrégats dans lesquels la NP
s’assemble en structure tubulaire hexagonale, similaire aux nucléocapsides, que ce soit en
l’absence d’autres protéines virales [93], ou associée à 2 autres protéines [307]. Les acides
aminés 1 à 450 de la région N-terminale sont importants pour cet auto-assemblage de la
NP en structure tubulaire. Les 150 acides aminés suivant sont impliqués dans la formation
de la nucléocapside par interaction avec les protéines virales de 30 et 35 kDa (VP30 et
VP35) et pour la réplication [283, 338]. Enfin, les extrémités C- et N-terminales (dont les
50 derniers acides aminés de cette partie) seraient essentielles pour l’interaction avec la
VP40 [311], interaction qui permettrait le transport de la nucléocapside vers la membrane
plasmique, la partie C-terminale seule étant importante pour l’encapsidation des virions
[94, 339].
b. Protéine virale de 35 kDa (VP35)
Cette protéine est codée par le 2è gène du génome. La VP35 a un poids moléculaire de
35 kDa et est composée de 340 à 351 acides aminés [287, 340]. Comme la NP, elle existe
sous les formes phosphorylées et non phosphorylées, mais contrairement à la NP, la forme
non phosphorylée seule est présente dans les virions [332, 334]. Par sa situation dans le
génome et son caractère phosphorylé, la VP35 pourrait être l’analogue de la
phosphoprotéine P de Paramyxovirus et Rhabdovirus.
La VP35 est une des protéines composant la nucléocapside, où elle interagit avec la NP
et la polymérase (L) pour former un complexe tripartite NP-VP35-L [283, 308]. L’étude de
minigénomes artificiels a montré que l’interaction de la VP35 avec la protéine de matrice
suffirait pour encapsider le génome. De plus, la VP35 permettrait de fixer l’ARN
Introduction
96
génomique à la nucléocapside [309]. Cette protéine est donc indispensable à la
transcription, la réplication et l’encapsidation des virions [288, 336].
La recherche d’un vaccin contre EBOV a montré l’induction d’une réponse immune,
mais une protection contre le challenge seulement sur des souris C57BL/c [126]. Cela
ouvre la voie à l’étude de l’influence de VP35 sur le système immunitaire et la réaction
immune de l’hôte. Il s’avère que la VP35 inhibe l’induction des gènes antiviraux en
bloquant l’activation par IRF-3 (Interferon Regulatory Factor-3), facteur de transcription
cellulaire important pour l’initiation de la réponse interféron (IFN) de la cellule hôte [341].
L’activation de IRF-3 se ferait par surexpression de l’hélicase cellulaire RIG-I [342]. La
VP35, en fixant l’ARN double-brin, bloquerait donc l’induction de la réponse IFN,
l’induction du promoteur IFN-β ainsi que la réponse antivirale induite par l’IFN-α [206,
342, 343]. La mutation du domaine en C-terminal de la VP35 qui intervient dans
l’inhibition de IRF-3 ne perturbe pas la transcription ni la réplication. Les 2 fonctions de la
VP35 seraient donc distinctes [344].
c. Protéine virale de 40 kDa
Produite par le 3è gène, la protéine virale de 40 kDa est composée de 326 acides aminés
[340]. Cette protéine n’est pas associée au complexe ribonucléocapsidique. La VP40 se
comporte comme une protéine associée à la membrane, de part sa position sous-
membranaire et son abondance dans les virions. Elle correspondrait donc aux protéines de
matrice des autres virus à ARNnns [330, 345]. La VP40 aurait un rôle dans la réplication et
l’encapsidation des particules virales.
L’étude de minigénomes ARN artificiel montre que l’interaction entre la VP35 et la
VP40 suffit pour son encapsidation [309]. La cotransfection de cellules et l’étude par
microscopie électronique à transmission montre que VP40 intervient dans le transport de la
nucléocapside vers la surface cellulaire, où son interaction avec la NP permet
l’incorporation de la nucléocapside dans les virions [94]. Enfin, l’expression de VP40 seule
dans des cellules mammifères est suffisante pour induire la formation de particules
filamenteuses semblables aux virions, probablement par auto-agrégation de la VP40 [346].
En effet, la VP40 s’associe en octamère capable de lier l’ARN. La mutation des 2 acides
aminés impliqués dans l’oligomérisation a abouti à une inhibition partielle ou totale de la
fixation de l’ARN sans incidence sur l’encapsidation. L’oligomérisation de la VP40 n’est
Introduction
97
pas essentielle pour l’encapsidation, mais est indispensable pour la fixation à l’ARN et la
réplication [347].
La VP40 présente un motif conservé riche en prolines dans sa partie N-terminale.
L’interaction physique et fonctionnelle de ce motif avec une ubiquitine protéine ligase
suggère une rôle important dans le bourgeonnement des virions et l’existence d’un
domaine L [321].
Les domaines L (late) ou tardifs permettent l’interaction entre une protéine virale et des
facteurs cellulaires. Ce sont des motifs très conservés connus pour l’interaction protéine-
protéine dans la cellule hôte. Ils sont appelés domaines tardifs car ils interviennent dans la
dernière étape du bourgeonnement. Il existe 3 classes de motifs : (i) PxxP, dont un exemple
est le motif PTAP présent entre autres chez le rétrovirus VIH-1, ce motif interagit
préférentiellement avec le domaine SH3 (Src homology 3) présent dans des protéines ayant
une fonction GTPase, ligase, ou phosphatase ; (ii) PPxY, présent par exemple dans le
Rhabdovirus Vesicular Stomatitis Virus (VSV), ce motif interagit avec les domaines riches
en tryptophane (domaine WW) présent dans de nombreuses protéines aux fonctions
variées ; (iii) YxxL. La particularité d’EBOV réside dans le chevauchement de 2 motifs
PTAPPxY. De nombreux résultats suggèrent que le domaine L de la VP40 et la machinerie
d’ubiquitination cellulaire interagissent. Cette interaction permettrait de diriger les
protéines virales vers l’endocytose ou par la voie biosynthétique vers les corps
multivesiculaires [319].
Les 2 motifs présents dans la VP40 d’EBOV sont impliqués dans la sortie des
particules virales. Leur contribution relative diffère lorsqu’ils sont transférés dans d’autres
virus [320]. La mutation de l’un ou l’autre motifs, ou des 2, atténue légèrement le pouvoir
infectieux du virus. Le domaine L ne serait pas indispensable à la réplication, mais
permettrait plutôt d’en améliorer l’efficacité [348]. Les 2 motifs recrutent 2 protéines aux
fonctions différentes. L’étude des interactions in vitro a montré que le motif PPxY, situé en
N-terminal de l’héxamère VP40, se lie avec le domaine WW de Nedd4, une ubiquitine
protéine ligase. Quant au motif PTAP, il se fixerait au domaine inactif de conjugaison de
l’ubiquitine présent en N-terminal de Tsg101 [324]. Il est intéressant de remarquer que
l’interaction du facteur cellulaire Tsg101 avec la protéine de matrice de MARV se réalise
par le biais d’un motif PPxY [349]. La VP40, par le biais du domaine L, recruterait par 2
voies indépendantes des facteurs cellulaires aux rôles complémentaires dans l’étape tardive
d’encapsidation.
Introduction
98
d. Protéine virale de 30 kDa
Cette protéine issue du 5è gène tient son nom de son poids moléculaire de 30 kDa.
Composée de 260 acides aminés, sa partie C-terminale est hydrophobe, son milieu est
neutre, et sa partie N-terminale est hydrophile et très basique. Cette partie positivement
chargée pourrait interagir dans la nucléocapside avec la région basique C-terminale de la
NP, ou interagir avec l’ARN génomique [283, 287]. La VP30 est une phosphoprotéine
minoritaire dans les virions [332]. L’étude de minigénomes artificiels de MARV a montré
que la VP30 n’était pas nécessaire à la réplication ni à la transcription [288]. Cependant, la
même étude sur EBOV a montré que la VP30 était indispensable à la transcription [336].
Plusieurs hypothèses peuvent être émises quant au rôle de la VP30 dans la transcription.
Elle pourrait agir soit comme un régulateur positif de l’initiation de la transcription, soit
comme un facteur d’élongation lors de la synthèse d’ARNm ou lors de la polyadénylation,
soit stabiliser l’ARNm.
Récemment, la structure tridimensionnelle de la partie C-terminale de la VP30 a été
résolue à 2Å. La structure montre que la VP30 s’associe en hélice homodimère, cette
hélice s’assemblant ensuite en héxamère dans les virions. L’étude par mutagenèse a montré
que 2 clusters basiques de cette partie seraient requis pour interagir avec la nucléocapside
[350].
e. Protéine virale de 24 kDa
Produite par le 6è gène, cette protéine se compose de 251 acides aminés pour un poids
moléculaire de 24 kDa [287, 332]. La VP24 constitue la 2è protéine de matrice, elle est
localisée dans la région périnucléaire ou au niveau de la membrane plasmique en forte
association avec la membrane lipidique. Elle s’associe préférentiellement en tétramères,
probablement par sa partie N-terminale. Cette capacité d’oligomérisation et son interaction
avec les membranes lipidiques suggèrent un rôle dans l’assemblage et le bourgeonnement
des particules virales [351]. En effet, contrairement aux autres protéines virales, la VP24
n’est pas indispensable pour la réplication, ni la transcription, et l’encapsidation de mini
génomes est possible en son absence [311, 352]. Cependant, des changements de
composition du complexe ribonucléoprotéique (RNP) ont été observés en l’absence de
Introduction
99
VP24. Cette protéine serait probablement essentielle pour la formation correcte et
fonctionnelle du complexe RNP [94, 353]. Enfin, la caractérisation de variants adaptés au
cochon d’Inde a montré la présence de mutations dans la VP24, ce qui suggère un rôle
dans l’acquisition de la pathogénicité [96]. Cette hypothèse est étayée par la mise en
évidence récente de l’inhibition du signal IFNα/β et IFNγ par la protéine VP24. En effet, la
VP24 bloquerait l’accumulation dans le noyau de la protéine phosphorylée PY-STAT1,
étape clé dans la voie de signalisation par les IFN. De plus, VP24 interagirait avec la
karyophérine α1, récepteur du signal de localisation de STAT1. Cette interaction VP24-
karyophérine α1 empêcherait l’interaction entre les protéines cellulaires karyophérine α1-
PY-STAT1, inhibant la signalisation par les IFN [354].
f. RNA Polymérase
Codée par le dernier gène du génome, le gène L, c’est une protéine de 2212 acides
aminés, dont le poids moléculaire calculé est de 252 kDa. La comparaison des séquences
de la protéine L d’EBOV et d’autres représentants de l’ordre de Mononégavirales montre
la présence de plusieurs domaines communs, qui permettent d’identifier la protéine L
comme l’ARN polymérase ARN-dépendante [355]. La caractérisation du gène L de
MARV montre que la partie N-terminale contient les sites enzymatiques communs aux
virus à ARNnns, la partie C-terminale étant plus variable et spécifique du virus [356].
g. Glycoprotéines
La glycoprotéine membranaire est codée par le 4è gène. La particularité de ce gène
réside dans l’existence de 2 phases ouvertes de lecture (ORF) qui se chevauchent sur un
nucléotide et qui sont transcrites dans 2 cadres de lecture différents. La zone de jonction
entre ces 2 ORF comporte une succession de 7 bases Uridine qui correspond au site
d’édition. Lors de la transcription, une base Adénosine est ajoutée par édition pour 20%
des ARNm qui possèdent donc une suite de 8 bases Adénosine. Les 80% des ARNm non
édités gardent les 7 adénosines initiales [123, 357]. La traduction des ARNm 7A produit
une GP structurale tronquée, codée seulement par l’ORF I, soluble dans le milieu
Introduction
100
extracellulaire ou le sang de patients infectés. L’ARNm 8A synthétise la GP
transmembranaire codée par les 2 ORF et présente à la surface des virions (Figure 12).
Il est intéressant de remarquer l’existence de variant viraux dont l’ARN génomique
comporte 8 bases Uridine. La transcription de ces variants produit dans 80% des cas des
ARNm possédant 8A, 10% d’ARNm édités comportant 6A ou 9A après délétion ou
insertion d’une base Adénosine. Ces ARNm édités codent alors pour une petite
glycoprotéine soluble, la ssGP [358].
L’ajout d’une base supplémentaire pourrait être imputé à un glissement du ribosome
sur cette séquence poly U suite à une pause de la polymérase. Cependant, la transcription
d’un plasmide d’expression de la GP par une polymérase ADN-dépendante (le système
vaccinia virus / T7 polymérase) synthétise les mêmes glycoprotéines, totale ou tronquées,
avec l’addition d’une base supplémentaire. Bien que le changement de cadre de lecture ne
puisse pas être complètement exclu, l’édition est suffisante pour expliquer la présence des
différentes GP détectées [357].
L’édition a un rôle important dans la pathogénicité et la propagation du virus. Afin de
bloquer l’édition par glissement du complexe de transcription, 2 bases adénosine du site
d’édition ont été mutées en bases guanosine. Au lieu de produire 80% de GP soluble, le
virus recombinant produisait exclusivement la GP membranaire. Cette sur-expression
entraînait la mort des cellules infectées, probablement par épuisement de la machinerie
cellulaire, bloquée par la quantité de GP à maturer. Ainsi, en régulant le rapport de GP
membranaire/GP soluble, l’édition permet de réduire la cytotoxicité du virus [359].
Figure 12 : Représentation schématique du site
d’édition dans le 4è gène codant pour les différentes
glycoprotéines de ZEBOV, d’après Volchkov et al.
[357] et Sanchez et al. [123]. Les 2 ORF représentées
par les rectangles colorés se chevauchent et le cadre
de lecture de l’ORF II est en décalage d’un
nucléotide. Les traits aux 2 extrémités du gène
correspondent aux séquences non codantes. Après
transcription et édition des ARN génomique
comportant 7 ou 8 bases Uridine au site d’édition, les
GP sont produites, soit entière et transmembranaire,
soir tronquées et secrétées dans le milieu
extracellulaire.
Introduction
101
� La glycoprotéine membranaire
La glycoprotéine membranaire est produite par le 4ème gène. Son ARNm contient 2
ORF chevauchantes, la traduction de la première ORF est initiée par 2 codons AUG en
phase, le deuxième codon étant le plus utilisé. Après édition et ajout d’une base adénosine,
la protéine synthétisée contient 676 acides aminés, pour un poids moléculaire calculé de 75
kDa. Le centre de la GP est hydrophile et variable, les extrémités sont hydrophobes,
hautement conservées. L’extrémité C-terminale servirait d’ancre membranaire pour la GP
dont l’extrémité N-terminale serait au contact du milieu extracellulaire [287].
La GP de MARV est présente à la surface des virions sous forme d’homotrimère [360].
Dans les cellules infectées, 3 espèces ont été identifiées selon leur degré de maturation : le
précurseur non glycosylé de 90 kDa, le précurseur de 140 kDa après addition des
mannoses, la protéine mature clivée de 170 à 200 kDa après conversion des sucres liés à
l’azote et addition d’oligosaccharides O-liés. L’étude de ce processus de maturation a
montré que la N-glycosylation est nécessaire au transport de la GP vers la membrane
plasmique [361].
La comparaison par alignement des séquences peptidiques des GP de MARV et
d’EBOV a permis de prédire des sites de clivage dans la région basique N-terminale, la
région centrale hydrophobe et la région polaire C-terminale [287].
La maturation de la GP transmembranaire d’EBOV implique une suite d’évènements
co- et post-traductionnels (pour revues voir ref. [362] et [358]). La traduction de l’ARNm
produit dans le réticulum endoplasmique un premier précurseur de 110 kDa, préGPer,
auquel sont ajoutés des oligomannosides sur les positions N. Dans l’appareil de Golgi, la
maturation de ce deuxième précurseur de 160 kDa, préGP, continue sur les
oligomannosides pour aboutir à une protéine N- et O-glycosylée. La majorité des sites
glycosylés se situent dans la région centrale de la GP [287]. La délétion des sites de O-
glycosylation entraîne une amélioration de la maturation et de l’incorporation e la GP dans
des particules pseudovirales. La délétion des sites de N-glycosylation n’a pas d’impact
significatif, excepté pour 2 résidus conservés, le premier site de glycosylation proche de la
cystéine impliquée dans le pont dissulfure (Asn 40) et le résidu Asn 296 situé dans la
région variable « mucin-like ». Ces 2 sites de glycosylation seraient impliqués dans la
Introduction
102
conformation tridimensionnelle de la GP [363]. La protéolyse du préGP a lieu dans
l’appareil de Golgi et génère la protéine mature GP1,2 dont les 2 parties protéiques sont
liées par un pont dissulfure (A et B Figure 13). La GP1 (140 kDa) correspond à la partie N-
terminale de la préGP et GP2 (26 kDa) en est la partie C-terminale. La GP1,2 est présente
dans l’appareil de Golgi et dans l’enveloppe des particules virales où elle est associée en
homotrimère [364].
Le site de clivage identifié par mutagénèse dirigée se situe au niveau du motif
497RTRR501, potentiellement un motif de reconnaissance pour les proprotéines convertases.
La protéolyse serait effectuée par une endoprotéase, probablement la furine convertase.
Seules des preuves indirectes permettent d’émettre cette hypothèse. En effet, la GP n’est
pas protéolysée lorsqu’elle est exprimée dans des lignées cellulaires déficientes en furine
[365]. Il en est de même lorsqu’un ou plusieurs acides aminés du site de clivage ont été
mutés [364, 366]. La faible sensibilité au clivage par la furine de la GP de l’espèce Reston,
espèce la moins pathogène d’EBOV, suggère que la protéolyse joue un rôle déterminant
dans la pathogénicité [364]. Cependant, lorsque le motif de reconnaissance de la furine est
altéré, les virions produits, qui comportent des GP non clivées, se sont révélés viables et
capables d’infecter différentes lignées cellulaires ou des primates sans différence
significative entre l’infection par des virions dont la GP n’est pas clivée et l’infection par le
virus sauvage [365, 367]. Ces résultats suggèrent que le clivage puisse in vitro ne pas être
nécessaire pour l’activité et la fonction de la GP. Toutefois, ces résultats n’excluent pas la
nécessité du clivage in vivo, ou un clivage par une autre classe d’enzymes [365, 366]. En
effet, l’analyse de l’infection de lignées cellulaires déficitaires en protéases ou en présence
d’inhibiteurs de protéases a permis d’identifier la cathepsine B, et à un moindre degré la
cathepsine L, comme des protéases essentielles pour l’entrée d’EBOV dans les cellules
[298].
La proximité des protéines des filovirus avec celles des Paramyxoviridae, des
Retroviridae et des Rhabdoviridae a été abordée lors d’études visant à déterminer les
fonctions des différentes protéines virales. Les fonctions de ces protéines étant similaires et
la fonction étant issue de la conformation de la protéine, la comparaison s’est poursuivie
pour l’étude de la structure tridimensionnelle des protéines, et particulièrement de la GP
membranaire. Ainsi, la comparaison de la GP d’EBOV et de la protéine transmembranaire
du virus du sarcome de Rous (RSV) met en évidence des similitudes pour 181 acides
Introduction
103
aminés de la région C-terminale. Cette partie de la GP2, associée à la membrane, est
composée de 2 hélices en orientation anti-parallèle pour former une structure tertiaire en
épingle à cheveu dont la boucle serait maintenue par un pont dissulfure. Le premier tiers en
C-terminal de l’hélice amphipathique présente 50% d’identité avec le motif
immunosuppresseur identifié chez les rétrovirus. Enfin, une séquence de 13 à 16 résidus
non chargés et hydrophobes, présentant le plus fort degré d’homologie, pourrait être un
peptide de fusion essentiel pour l’entrée du virus dans les cellules (C Figure 13) [296].
La structure tridimensionnelle a été résolue à 3 Å par cristallographie aux rayons X, sur
179 résidus auxquels a été hybridée en N-terminal une queue isoleucine zipper GCN4 afin
de faciliter la purification, la solubilisation et la stabilité du repliement de la GP2. Les
résultats ont été comparé aux structures déjà résolues de rétrovirus. Ils confirment le
repliement du monomère en épingle à cheveu à 2 hélices et la conservation structurelle du
motif immunosuppresseur entre les filovirus et les rétrovirus. De plus, les résultats mettent
en évidence l’oligomérisation de la GP en homotrimère déjà observée chez MARV [360].
Les hélices N-terminales de la GP2 sont assemblées en une hélice α coiled-coil triple brins,
stabilisée par des segments brin linéraire-hélice-brin entre les hélices α (D Figure 13). Près
de l’extrémité C-terminale du coiled-coil central se trouve une séquence correspondant à
une trappe à ions chlorure, dont la conservation suggère un rôle, probablement dans le
changement de conformation [368]. La similitude observée entre la conformation en hélice
coiled-coil de la GP d’EBOV avec la conformation de la gp41 du VIH suggère une
fonction identique dans la fusion membranaire. Les auteurs proposent donc un mécanisme
de fusion membranaire basé sur le mécanisme de la gp41 du VIH-1 et de HA2 de Influenza
[368-370]. La cristallisation de 74 résidus de la GP2 insensibles à la protéolyse et la
résolution de la structure à 1,9 Å a confirmé les résultats précédents et la similarité de la
GP2 avec les rétrovirus oncogènes, par comparaison avec le virus de la leucémie murine de
Moloney (MoMLV) [313]. De plus, cette structure du monomère en épingle à cheveu
associé en hélices coiled-coil pourrait être la conformation active de la GP2, la structure du
monomère permettrait alors l’apposition des 2 membranes virales et cellulaire, mises en
présence par l’interaction des 2 hélices, l’hélice C-terminale stabiliserait la conformation
[371].
Introduction
104
Figure 13 : Structure de la glycoprotéine membranaire d’EBOV. A) Représentation schématique de la
séquence protéique et des différents domaines des GP1 et GP2 codées par les 2 ORF. PS : peptide signal. E :
site d’édition. F : peptide de fusion. CC : zone hélicoïdale en coiled-coil. TM : ancre transmembranaire. Le
site de clivage est signalé par une grande flèche. B) Représentation schématique du pont dissulfure liant les
GP1 et GP2. C) Modélisation de la région C-terminale de la GP2 selon Gallaher et al. [296], par comparaison
des séquences protéiques avec la glycoprotéine du virus du Sarcome de Rous (RSV). Les acides aminés sont
identifiés par le code 1 lettre encerclé. Les ponts dissulfures sont indiqués par 2 lignes pointillées, les sites de
glycosylation par une patte d’oie en ligne pointillée. Les acides aminés hydrophobes sont représentés par un
cercle plein. D) Structure cristalline à 1,9 Å d’une région de la GP2 d’après Malashkevich et al. [313]. La
structure du bas représente le monomère en forme d’épingle à cheveu. Le dernier tour de l’hélice N-terminale
ainsi que les petites hélices α et 310 qui suivent (magenta) correspondent au domaine immunosuppresseur. La
structure du haut montre l’agencement en coiled-coil des hélices amphipathiques N-terminales (bleu) dans le
trimère.
La GP2 est une succession, depuis l’extrémité N-terminale vers la C-terminale, des
régions suivantes : peptide de fusion – hélice α amphipathique – domaine
immunosuppresseur – petite hélice α fortement chargée – ancre transmembranaire. Chaque
domaine prend part au rôle de la GP dans la fusion membranaire et l’entrée du virus dans
la cellule ainsi que dans le potentiel infectieux du virus.
Introduction
105
Situé à proximité du site de clivage (22 résidus) dans une boucle formée par un pont
dissulfure, le peptide de fusion est constitué de 10 acides aminés hydrophobes non chargés.
Ces résidus sont situés aux mêmes positions que les résidus impliqués dans la fusion
membranaire et l’entrée dans la cellule identifiés chez les Retroviridae [296]. Sa propriété
fusiogénique serait plus liée à son orientation oblique par rapport à la membrane, due à la
distribution asymétrique des résidus hydrophobes dans l’hélice, qu’à sa composition en
acides aminés [372]. Une étude récente sur le mécanisme d’interaction et de fusion entre la
membrane et ce peptide a mis en évidence le rôle essentiel des résidus Tryptophane et
Phénylalanine situés aux positions 8 et 12 du peptide de fusion [373]. L’intervention de ce
peptide dans la fusion membranaire a été confirmée par mutagénèse dirigée. En effet, la
mutation de certains acides aminés de ce peptide affectait le potentiel d’infection de
pseudovirus VSV [374].
Du dernier tiers de l’hélice amphipathique à la boucle séparant les 2 hélices, la
séquence aminoacide est très homologue au domaine immunosuppresseur des protéines
d’enveloppe de différents rétrovirus oncogènes. Cette séquence de 18 acides aminés bloque
l’induction des lymphocytes T chez l’hôte, induisant une immunodéficience [203].
La GP transmembranaire est participe au pouvoir infectieux du virus.
D’une part, la GP permet au virus d’entrer dans la cellule grâce à 150 résidus de la
région N-terminale de la GP1 mature. Deux groupes d’acides aminés ont été identifiés :
ceux dont la mutation rompt l’expression et la maturation de la GP, et ceux dont la
mutation inhibe l’incorporation de la GP dans le virion [139, 375]. De plus, la mutation de
2 résidus Phénylalanine (Phe88 et Phe159) annule l’infectiosité du virus mutant [303].
D’une autre part, sous sa forme associée à une particule, la GP1,2 active les cellules
endothéliales et entraîne une diminution de leur fonction de barrière [376-378]. Plusieurs
études mettant la partie transmembranaire de la GP en présence de cultures cellulaires ont
montré le détachement des cellules. Cependant, ce phénomène est indépendant de la mort
cellulaire, puisque 95% des cellules détachées étaient viables. Le détachement des cellules,
corrélé au niveau d’expression de la GP, serait du à la diminution de l’expression des
molécules d’adhésion et de nombreuses autres protéines de surface [379, 380]. La GP ne
diminuerait pas l’expression globale des protéines, mais agirait particulièrement sur des
groupes de molécules spécifiés par leur voie de trafic cellulaire ou leur localisation au
niveau de la membrane et dépendant du type de cellule dans lesquelles elle est exprimée
Introduction
106
[381]. Cet effet sur les molécules de surface est visible par l’augmentation de perméabilité
de la membrane plasmique [302].
� Les glycoprotéines solubles
Des glycoprotéines ont été trouvées dans le milieu extracellulaire en l’absence de lyse.
Ces GP non structurales pourraient avoir un rôle dans la pathogénicité et interférer avec le
mécanisme de défense humorale en agissant comme un leurre. Contrairement à la GP
membranaire, les GP solubles se fixent aux neutrophiles par le récepteur FcγIIIRB
(CD16b). Elles inhiberaient in vitro l’activation précoces des neutrophiles, grâce à
l’inhibition de la régulation de la L-sélectine, ce qui affecterait les mécanismes de défense
de l’hôte [377]. La GP soluble la plus étudiée, la sGP, perturberait la liaison physique de
FcγIIIRB, protéines membranaires des neutrophiles, avec le récepteur du complément de
type 3 (RC3), afin de bloquer la signalisation inflammatoire [382]. Cependant, l’absence
de GP soluble chez MARV, ainsi que la forte production de ces GP chez l’espèce REBOV,
qui pourtant est peu pathogène, réfutent cette hypothèse [383].
Cinq glycoprotéines solubles ont été identifiées dans le sang de patients ou dans le
milieu de cultures infectées (Figure 14).
La forme majoritaire de glycoprotéine soluble (sGP) est une protéine de 50 à 70 kDa.
En absence d’édition, la production de la sGP est arrêtée à la fin de l’ORF I du 4è gène. La
sGP partage donc 364 acides aminés N-terminaux avec la GP membranaire, sa sécrétion
est due à l’absence de l’ancre membranaire située à l’extrémité C-terminale [123]. La sGP
se présente sous la forme d’un homodimère [384]. L’orientation de l’homodimère est sujet
à discussion. Certains auteurs ont décrit un homodimère anti-parallèle, lié par un pont
dissulfure entre les cystéines 53 et 306 [385], quand d’autres décrivent une orientation
parallèle liée par des ponts dissulfures entre les résidus C53-C53’ et C306-C306’ [386]. La
sGP partage des épitopes avec la GP membranaire, ce qui lui permettrait d’interagir avec et
de bloquer les anticorps neutralisants dirigés contre le virus ou les cellules infectées [378].
La petite glycoprotéine soluble (ssGP) est produite dans le milieu de culture de cellules
infectées par un variant viral contenant 8 bases Uridine au site d’édition. La ssGP est
produite par des ARNm édités comportant 6 ou 9 bases Adénosine. Elle partage l’extrémité
N-terminale avec la GP membranaire et la sGP, mais son extrémité C-terminale est
Introduction
107
tronquée du à l’utilisation d’un troisième cadre de lecture –2 [357]. La ssGP est un
monomère d’un poids moléculaire inférieur de 6,5 kDa à la sGP [385].
La sous-unité GP1 peut être retrouvée en quantités significatives dans les milieux de
culture. La présence de la GP1 libre est due à l’instabilité du pont dissulfure la reliant à la
GP2 ancrée à la membrane. De même que le pont dissulfure entre HA1 et HA2 du virus
Influenza peut être réduit, le pont dissulfure formé avant la protéolyse et liant la GP1 et la
GP2 peut être altéré lors de la maturation dans l’appareil de Golgi [383, 385].
Une quantité non négligeable de GP1,2∆ est présente dans le sang d’animaux infectés
expérimentalement. Il s’agit du complexe GP1,2 dont l’ancre transmembranaire a été clivée
par une métalloprotéinase zinc-dépendante après le résidu Asp637. La GP1,2∆ est secrétée
par les cellules infectées sous forme d’un trimère et pourrait contribuer à la suppression
d’immunité observée chez les animaux infectés expérimentalement ; elle absorberait les
anticorps destinés à interagir avec le virus ou la cellule infectée [387].
Enfin, la dernière glycoprotéine non structurale secrétée dans le milieu extracellulaire
est un petit fragment issu de la maturation par protéolyse de la sGP. Ce petit fragment,
appelé peptide ∆, est un monomère fortement O-glycosylé [388]. Son rôle reste encore à
déterminer.
Figure 14 : Représentation schématique des
différentes glycoprotéines non structurales
secrétées par les cellules infectées par EBOV
d’après Wahl-Jensen et al. [389]. GP1,2∆
correspond à la GP exprimée à la surface des
virions dont l’ancre membranaire est clivée. GP1
est libérée dans le milieu suite à l’altération
pendant le processus de maturation du pont
dissulfure la reliant à la GP2. sGP est synthétisée à
partir d’ARNm non édité. Le peptide ∆ est un
fragment issu de la maturation de sGP. ssGP est
produite à partir d’un ARNm variant dont l’édition
résulte en la succession de 6 ou 9 bases adénosines
au site d’édition, entraînant l’utilisation d'un 3è
cadre de lecture. PS : peptide signal. E : site
d’édition. F : peptide de fusion. CC : zone
hélicoïdale en coiled-coil. TM : ancre
transmembranaire.
Introduction
108
VI. Phylogénie moléculaire des souches virales
La grande variabilité du gène codant pour la GP en fait un marqueur phylogénétique
très utilisé pour élucider les relations phylogénétiques liant les EBOV et MARV. L’analyse
des séquences nucléotidiques de la GP dont la région variable a été supprimée pour un
meilleur alignement met en évidence les 4 espèces EBOV qui forment 4 lignées
monophylétiques différentes de MARV (Figure 15A). Les gènes de la GP des différentes
espèces Ebolavirus diffèrent de 55% du gène de Marburgvirus au niveau nucléotidique, et
de 67% pour la séquence protéique. Les séquences nucléotidiques du gène de la GP des 4
espèces d’EBOV diffèrent entre elles de 37-41%, et de 34-43% pour la séquence
aminoacide [123]. Cette analyse met aussi en évidence la grande stabilité du génome
d’EBOV. En effet, le gène de la GP ne diffère que de 1,6% entre la souche de la première
épidémie à Yambuku en 1976 et celle isolée lors de l’épidémie de Kikwit en 1995, alors
que ces 2 épidémies sont distantes de plus de 1000 km et séparées par 19 ans.
L’analyse phylogénétique permet également de caractériser les souches responsables
d’épidémies. Les souches issues des épidémies du Gabon en 1994-96 se groupent avec les
autres souches de l’espèce Zaïre, confirmant leur appartenance à cette espèce. Il est
intéressant de noter que ces 3 épidémies correspondent à 3 évènements distincts provoqués
par 3 souches et sources différentes [390] (Figure 15B).
Le taux de substitution nucléotidique, calculé en divisant le nombre de substitutions
non synonymes (substitutions nucléotidiques qui entraînent un changement d’acide aminé)
par le temps séparant l’isolement des souches, est d’en moyenne 3,6 10-5
substitutions/site/an. Ce taux de substitution est équivalent à celui des autres virus à
ARNnns (entre 10-5 et 10-3). Il étaye les résultats des analyses phylogénétiques qui
suggéraient la stabilité du génome d’EBOV, probablement due à de fortes contraintes
fonctionnelles imposées au génome viral. A partir de ce taux de substitution, les temps de
divergence déterminés montrent une séparation des espèces d’Ebolavirus de quelques
milliers d’années, la séparation serait plus ancienne entre Ebolavirus et Marburgvirus
[391].
La stabilité génétique d’Ebolavirus a été démontrée lors de l’épidémie de Kikwit en
1995 et celles du Gabon en 1994-96. En effet, la souche virale responsable d’une épidémie
Introduction
109
ne varie pas au long de la chaîne de transmission. De même, les souches virales qui ont
causé les épidémies du Gabon étaient identiques chez des patients dont l’issue de la
maladie était différente (convalescence, asymptomatique ou décès) [25, 58].
A partir de 2001, de nouvelles épidémies humaines de FHVE ont touché le Gabon et la
République du Congo, et des carcasses animales infectées par EBOV ont été trouvées dans
les forêts de cette région frontalière. Chaque nouvelle épidémie avait une source distincte,
ainsi, 11 nouvelles souches ont pu être isolées et caractérisées. Toutes les épidémies
apparues depuis 1976 étaient causées par des souches virales différentes. Ce résultat
suggère l’existence de nombreuses souches virales dans le milieu forestier d’Afrique
centrale. Ces souches circuleraient au sein de leur hôte naturel, et apparaîtraient dans les
populations de grands singes et humaines par le biais de contaminations simultanées et
indépendantes des grands singes [26].
En contradiction avec l’hypothèse de la persistance des souches virales dans le milieu
forestier est l’hypothèse d’une épizootie constante qui propagerait le virus selon un front
avançant. Cette hypothèse se base sur l’analyse des relations phylogénétiques des souches
virales et leurs date et lieu d’émergence. En effet, les souches virales issues des épidémies
les plus récentes descendent des souches virales plus anciennes, et toutes descendent de la
première souche virales isolée à Yambuku en 1976 (Figure 15C). Ceci suggère que les
épidémies sont épidémiologiquement liées. De plus, les situations géographiques des
épidémies suggèrent un déplacement en fonction du temps. Les auteurs émettent
l’hypothèse d’une épizootie persistante dans les populations de grands singes qui se
transmettrait d’individu à individu en progressant vers le sud-ouest puis retournerait vers
l’est depuis 1996 (Figure 15D). Les épidémies humaines apparaîtraient sur le front de cette
vague lors de contact entre les hommes et les singes [392].
Introduction
110
Figure 15 : Analyses phylogénétiques des souches d’Ebolavirus. A) Relations phylogénétiques pour les
séquences nucléotidiques concaténées du gène de la GP (régions conservées N- et C-terminales). L’arbre,
obtenu avec la méthode du Maximum de Parcimonie, permet de distinguer les 3 espèces EBOV des souches
de MARV, chaque espèce EBOV représente une lignée monophylétique [123]. B) Analyse phylogénétique
sur les séquences prédites d’acides aminés de la GP et la NP. L’arbre, obtenu par la méthode du Maximum de
Vraissemblance, montre l’appartenance à l’espèce Zaïre des souches responsables des épidémies de 1994-96
au Gabon [25]. C) Analyse phylogénétique sur les séquences nucléotidiques du gène de la GP (excepté une
région de 576pb dont l’alignement est incertain). L’arbre, construit avec la méthode du Maximum de
Vraissemblance, met en évidence la descendance des souches plus récentes de la première souche isolée à
Yambuku en 1976. D) Représentation spatiale de la progression d’EBOV. La corrélation entre la date
d’apparition de nouveaux cas de FHVE et la distance géographique par rapport aux autres cas permet
d’émettre l’hypothèse d’une épizootie persistante dans les populations de grands singes qui propageraient le
virus selon une vague [392].
Introduction
111
Problématique
Le risque de nouvelle épidémie de FHVE est constant dans les régions tropicales de
l’Afrique, et ses conséquences seraient désastreuses sur les populations de grands singes
déjà menacées. Il devient donc urgent de comparer les 2 hypothèses d’émergence avec le
maximum de données afin d’établir de meilleures prédictions et stratégies de contrôle.
L’information maîtresse manquante à notre compréhension de l’épidémiologie et
l’évolution d’EBOV est indéniablement la caractérisation des souches virales circulant
parmi les espèces sauvages sensibles.
Grâce aux données uniques collectées sur une période de 5 ans, nous avons pu décrire
les premiers isolats de l’espèce ZEBOV obtenus à partir de carcasses de grands singes de
la région frontalière Gabon/Congo, ainsi que les 2 dernières épidémies de FHVE humaines.
Matériel et Méthodes
112
MATÉRIEL et
MÉTHODES
Matériel et Méthodes
113
I. Laboratoire P4
La manipulation d’agents pathogènes aussi dangereux que EBOV pour l’individu et la
communauté requiert le plus haut niveau de sécurité biologique. Le CIRMF dispose d’un
laboratoire de biosécurité de niveau 4, plus communément appelé P4. Il s’agit d’un espace
de travail isolé du monde extérieur par 3 sas successifs. Le 1er sas est un simple local dans
lequel est un autoclave à double-entrée. Le 2è sas est une salle d’habillement, dont la
pression est inférieure à la pression atmosphérique et supérieure à celle du sas suivant. On
y revêt une combinaison jetable couvrant le corps entier, des sur-chaussures, un masque
anti-poussière et 3 paires de gants en latex. Avant d’entrer dans l’espace de travail, on
s’équipe dans le dernier sas d’un masque qui crée une surpression autour du visage grâce à
de l’air filtré par des filtres absolus. A la sortie de l’espace de travail, on ôte la
combinaison potentiellement contaminée dans ce 3è sas.
L’espace de travail comporte tout le matériel d’un laboratoire (hotte à flux laminaire,
étuve à CO2, centrifugeuse, microscope optique relié à un système vidéo, congélateurs et
réfrigétateur, bonbonne d’azote liquide…). De plus, il est équipé d’un isolateur de virus
hermétique. Cette boite à gants (ou bulle) est en pression négative par rapport à l’espace de
travail et au petit sas présent à son entrée, lui-même en dépression par rapport à l’espace de
travail. L’air qui y circule est filtré par 2 filtres absolus. Enfin, l’autre entrée de l’autoclave
double-face est scellée hermétiquement dans le mur séparant l’espace de travail du 1er sas,
ainsi, les déchets produits dans l’espace de travail et le 3è sas peuvent être décontaminés et
sortis en toute sécurité.
Par mesure de sécurité supplémentaire dans cette région où les pluies et orages sont
fréquents, le laboratoire P4 est relié à un onduleur d’une autonomie de 30 minutes, qui
prend le relais entre le secteur général et un groupe électrogène en cas de coupure de
courant généralisée.
Matériel et Méthodes
114
Figure 16 : photographies de l’isolateur hermétique du laboratoire P4 du CIRMF, et du travail en
combinaison et masque.
II. Matériel biologique
II.1. Chaîne des évènements : du prélèvement au labo
Lors d’épidémies humaines de FHVE, le sang des patients ou des cas contacts était
collecté dans des tubes EDTA qui étaient laissés à sédimenter la journée. Lorsque le
plasma était séparé du sang total, il était aliquoté et stocké dans une bonbonne d’azote
liquide jusqu’au retour au laboratoire du CIRMF, distant de 600 à plus de 1 000 km. Les
prélèvements post-mortem de peau étaient conservés soit dans du RNA later soit en tubes
Matériel et Méthodes
115
secs dans des glacières refroidies par des pains de glace, ainsi que les tampons de
prélèvement de salive.
Au laboratoire, les sérums étaient décongelés, aliquotés en tubes de 1ml puis conservés
à –80°C jusqu’à utilisation. Les tampons de prélèvement étaient lavés dans du PBS
(Phosphate Buffer Saline), lequel était aliquoté et stocké à –80°C avec les tubes de
nécropsies.
Les prélèvements animaux étaient collectés soit dans des tubes secs soit dans des tubes
contenant du RNA later, puis transportés au CIRMF dans un triple emballage en accord
avec les recommandations de l’ONU relatives au transport de matières infectieuses
(Annexe 1)
II.2. Prélèvements d’origine humaine
Les séquences de la glycoprotéine des souches virales responsables des épidémies de 2001-2003 proviennent de la banque de gènes (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/GenBank) sous les numéros d’accession suivants :
Nom, souche GP NP
Ivory coast ebolavirus U28006 Reston ebolavirus
Pennsylvania 1989 AF034645 Reston 1989 U23152
Sudan ebolavirus Ouganda 2000 AY729654 Boniface 1976 AF173836
Zaire ebolavirus Mayinga 1976 AF086833 AF086833 Kikwit 1995 L11365 AF054908 Mekouka 1994 U77384 Y09358 Booué 1996 AY058898 AY058895 Mendemba B 2001 AY526098 Olloba 2001 AY526099 Etakangaye 2001 AY526100 Makokou 2001 AY526101 Entsiami 2002 AY526102 Mvoula 2003 AY526104 Mendemba A 2001 AY526105
Matériel et Méthodes
116
Les souches virales responsables des épidémies de 2003 et 2005, ainsi que le gène
codant la NP des souches virales ci-dessus, ont été caractérisées à partir de sérums humains
prélevés lors d’épidémies et conservés au CIRMF à –80°C.
II.3. Prélèvements animaux
Un réseau de surveillance des mortalités animales a été mis en place en 2001 en
collaboration avec les Ministères gabonais et congolais de la Santé, et ceux des Eaux et
Forêts ainsi qu’avec le WWF (World Wildlife Fund), le WCS (Wildlife Conservation
Society) et ECOFAC (Écosystèmes Forestiers d’Afrique Centrale).
Des carcasses d’animaux ont depuis été retrouvées dans 2 sites principaux, l’un à
Ekata, village situé à une soixantaine de kilomètre de Mékambo, chef lieu du département
de la Zadié dans la province de l’Ogooué Ivindo (Gabon) et l’autre dans la Cuvette Ouest
de la République du Congo, notamment au district de Mbomo et dans le sanctuaire de
Lossi où la population de primates (Gorilles, Chimpanzés et Céphalophes) a baissé de
presque 50% [26].
Les espèces animales échantillonnées, ainsi que leur date et lieu de découverte sont
résumés dans le tableau III. Parmi ces prélèvements, seulement 25 proviennent de grands
singes (19 gorilles et 6 chimpanzés). En combinant les méthodes de diagnostic, l’infection
par EBOV a été confirmée pour 13 gorilles, 3 chimpanzés et une antilope. Cependant, en
raison de l’état de décomposition avancée des carcasses, les gènes codant la NP et la GP
(séquence entière de 2031 nucléotides (nt) ou courte de 538 nt) ont pu être amplifiés à
partir des prélèvements de 6 gorilles et 1 chimpanzé. Ces prélèvements sont surlignés dans
le tableau III.
Les coordonnées GPS des carcasses sont indiquées dans le tableau IV et localisées sur
la figure 17.
Matériel et Méthodes
117
Tableau III : Mortalité animale dans la région frontalière du Gabon/République du Congo entre 2001 et
2006.
n° Espèce Date Localisation Échantillons Diagnostic
1 Chèvre 17 déc. 01 Olloba (RC) Muscle, peau -
2 Genet 18 déc. 01 Malouma (Gabon) Muscle, peau -
3 Gorille 20 déc. 01 Ekata (Gabon) Muscle, peau +
4 Genet 21 jan 02 Peau formol -
5 Genet 13 fév. 02 Ekata (Gabon) Muscle, peau -
6 Gorille 23 mars 02 Grand Etoumbi (Gabon) Moelle osseuse +
7 Sitatounga 04 avr 02 Muscle -
8 Gorille 30 avr 02 Ekata (Gabon) Os broyé +
9 Gorille 30 avr 02 Ekata (Gabon) Os broyé +
10 Gorille 03 déc. 02 Lossi (RC) Muscle, peau +
11 Gorille 03 déc. 02 Lossi (RC) Muscle, peau +
12 Gorille 03 déc. 02 Lossi (RC) Os +
13 Gorille 03 déc. 02 Lossi (RC) Os +
14 Chimpanzé 04 déc. 02 Lossi (RC) Muscle, peau +
15 Chimpanzé 04 déc. 02 Lossi (RC) Muscle, peau, foie +
16 Antilope 03 déc. 02 Lossi (RC) Os -
17 Antilope 04 déc. 02 Lossi (RC) Os +
18 Chimpanzé 03 fév. 03 Lossi (RC) Muscle +
19 Gorille 03 fév. 03 Lossi (RC) Muscle +
20 C. cephus 03 fév. 03 Lossi (RC) Muscle -
21 Faucon 03 fév. 03 Lossi (RC) Muscle -
22 Gorille juin 03 Mbandza (RC) Muscle +
23 Gorille Déc. 03 Odzala (RC) Peau -
24 Gorille 10 mai 04 Lokoué (RC) Moelle osseuse +
25 Gorille sept 04 Ouesso (RC) Peau -
26 C. cephus 20 mai 04 Conkuati (RC) Intestin -
27 Chimpanzé mai 04 Conkuati (RC) Peau -
28 Antilope 11 juin 04 Lopé (Gabon) Muscle -
29 Antilope 18 juin 04 Lopé (Gabon) Peau -
30 Buffle 23 avr 04 Offoué (Gabon) Intestin -
31 Buffle 23 oct 04 Petit Loango (Gabon) Peau -
32 Buffle 25 oct 04 Petit Loango (Gabon) Peau -
33 Buffle oct 04 Petit Loango (Gabon) Moelle osseuse -
34 Éléphant Oct. 04 Petit Loango (Gabon) Peau -
35 Gorille Nov. 04 Gamba (Gabon) Os -
Matériel et Méthodes
118
36 Gorille 23 nov. 04 Dja (Cameroun) Peau -
Tableau III : suite
n° Espèce Date Localisation Échantillons Diagnostic
37 Gorille jan 05 Dja (Cameroon) Os
38 Chimpanzé jan 05 Dja (Cameroon) Os
39 Chimpanzé jan 05 Dja (Cameroon) Muscle -
40 Gorille juin 05 Odzala (RC) Peau -
41 Gorille juin 05 Odzala (RC) Muscle +
42 Gorille juin 05 Odzala (RC) Muscle +
43 Gorille juil 05 Nouabalé-Ndoki (Gabon) Peau -
44 Antilope 20 juin 03 Lossi (RC) Peau -
45 Gorille 20 juil 05 Niangui (Sangha, RC) Peau -
46 Éléphant 29 nov. 05 Lopé (Gabon) Muscle -
47 Chimpanzé 07 juin 06 Nouabalé-Ndoki (Gabon) Muscle -
48 Chimpanzé Nov. 06 -
49 Gorille 23 jan 07 Louame (Sangha, RC) Peau -
Tableau IV : Coordonnées GPS des gorilles et du chimpanzé à partir desquels l’ARN viral a pu être amplifié
(prélèvements surlignés dans le tableau III) ainsi que les coordonnées des deux dernières
épidémies humaines en 2003 et 2005.
Animaux Région Coordonnées GPS Date
GOR1_Ekata_nov2001 Zadié 0.7055 N 14.2747 E Nov. 2001
GOR1_Lossi_déc2002 Lossi 0.2395 N 14.4938 E Dec 2002
GOR2_Lossi_déc2002 Lossi 0.2354 N 14.4839 E Dec 2002
CH_Lossi_fév2003 Lossi 0.2387 N 14.4885 E Feb 2003
GOR_Mbandza_juin2003 Mbandza 0.6987 N 14.7029 E Juin 2003
GOR1_Odzala_juin2005 Odzala 0.5166 N 15.0732 E Juin 2005
GOR2_Odzala_juin2005 Odzala 0.5116 N 15.0667 E Juin 2005
Mbandza_nov2003 Mbomo 0.6765 N 14.5583 E Nov. 2003
Etoumbi_mai2005 Etoumbi 0.0350 N 14.8910 E May 2005
Matériel et Méthodes
119
Figure 17 : Localisation de toutes les souches Zaïre ebolavirus d’origine humaine et animale isolées
depuis 1976. La source (GOR pour gorille, CH pour chimpanzé, rien pour humain), la localisation et la date
de prélèvement sont indiqués.
III. Méthodes de diagnostic
III.1. Sérologie
a. Dosage des antigènes circulants
Principe : Les antigènes circulants dans le sang sont détectés grâce à un mélange
d’anticorps spécifiques fixés à la plaque ou libre. Ce dernier est reconnu par un anticorps
spécifique conjugué à la peroxydase. La détection des antigènes se fait grâce à la
transformation par la peroxydase du substrat en composé coloré.
Protocole :
� Fixation d’un mélange de 7
anticorps monoclonaux
murins dirigés contre EBOV
dilués au 1/1000è sur les
plaques ELISA.
Parallèlement, fixer un
mélange d’anticorps
monoclonaux murins
normaux qui constituera le
Matériel et Méthodes
120
témoin négatif. La plaque est incubée 12 à 14h à +4°C.
� La plaque est lavée avec du PBS-T : phosphate buffer saline pH 7 + Tween
20 0,01%.
� Les échantillons sont dilués en cascade au ¼, 1/16è, 1/64è et 1/256è dans du
PBS-T-L (5% lait dans du PBS-T), puis distribués sur la plaque, qui sera
incubée 2h à température ambiante.
� Une fois la plaque lavée, le sérum polyclonal de lapin anti-Ebola est dilué
au 1/1500è et distribué dans les puits. L’incubation dure 1h à température
ambiante.
� Lavage puis incubation 1h à température ambiante avec le sérum de chèvre
anti-sérum de lapin conjugué à la peroxydase, dilué au 1/10 000è dans du
PBS-T-L contenant 2% de sérum normal de chèvre
� Révélation avec le substrat TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine, TMB
Microwell Peroxydase system Dymex Thermo Bioanalysis, Suède). Lorsque
du bruit de fond apparaît dans les puits témoins négatifs, la réaction est
arrêtée avec 100 µl par puits d’HCl 2 M.
� La densité optique (DO) est lue à la longueur d’onde de 450 nm grâce à un
lecteur de plaques (LP400, sigma).
Le résultat équivaut à la comparaison des densités optiques entre les puits où le
mélange d’anticorps monoclonaux anti-Ebola ont été fixés et ceux où ont été fixés les
anticorps normaux.
b. Dosage des Immunoglobulines G
Principe : Les Immunoglobulines (Ig) G sont détectés grâce à leur capacité de
reconnaissance et de fixation aux antigènes, fixés que la plaque. La peroxydase, conjuguée
à un anticorps anti-IgG, permet de visualiser la réaction par la transformation du substrat
en composé coloré.
Matériel et Méthodes
121
Protocole :
� Les antigènes et contrôles négatifs
sont dilués au 1/1.000è dans du PBS
et incubés 12 à 14h à +4°C. Les
antigènes correspondent à un lysat
de cellules Vero E6 infectées par
EBOV. Les contrôles négatifs sont
des lysats de cellules Vero E6
saines.
� Lavage puis incubation 12-14h à +4°C des échantillons dilués au 1/100è, 1/400è,
1/1600è et 1/6400è dans du PBS-T-L.
� Lavage puis incubation 2h à température ambiante d’anticorps polyclonaux dirigés
contre les IgG humains conjugués à la peroxydase, dilués au 1/4000è dans du PBS-
T-L.
� Lavage puis révélation avec le substrat TMB pour lecture de la DO à 450 nm.
c. Détection d’antigènes par immunofiltration
L’objectif de cette technique est de pouvoir effectuer des diagnostics dans des
conditions de terrain à partir de prélèvements non invasifs.
Ce test est basé sur une technique d’immunofiltration utilisant des anticorps
monoclonaux (mAc) dirigés contre la protéine de matrice (VP40) de toutes les espèces
connues d’EBOV. Les anticorps ont déjà été testés avec succès pour les méthodes
d’ELISA conventionnelles [109].
Cette technique repose sur le principe de l’ELISA : un premier mAc anti-VP40 fixé à
la colonne permet de capturer l’antigène ; qui sera reconnu par un second mAc marqué à la
biotine. Le résultat est lu par spectrophotométrie après réaction enzymatique.
Protocole :
� Incuber 30min les prélèvements (sérum et urine) dans une solution à 1% de SDS
afin de dénaturer et inactiver les particules virales ;
Matériel et Méthodes
122
� Diluer le sérum à 1/4 (v/v) avec le tampon de dilution (0,01M PBS, 5% BSA
(Bovine Serum Albumine), 0,05% Tween 20). Diluer l’urine selon un ration 9:1
(v/v) avec le tampon de dilution (0,1M PBS, 50% BSA, 0,5% Tween 20) ;
� Filtrer les prélèvements d’urine dilués avec un filtre à 1,2 µm ;
� Les échantillons dilués sont passés sur la colonne ;
� Laver avec 750µl de tampon de lavage (0,01M PBS, 0,1% BSA, 0,05% Tween 20,
0,2% BND) ;
� Déposer 500 µl d’anticorps secondaire marqué à la biotine (10 µg/ml, dilué dans
100 mM de potassium phosphate buffer, 1,5% caséine, 0,05% Tween 20, 0,1%
BND, pH 4,9) ;
� Déposer sur la colonne 500 µl de streptavidine conjuguée à la peroxydase (Senova,
Jena, Allemagne, 2 µg/ml, dilué dans 100mM potassium phosphate buffer, 1,5%
caséine, 0,05% Tween 20) ;
� Laver 2 fois la colonne avec 750 µl de tampon de lavage, puis une fois avec 750 µl
de tampon de substrat (100mM NaCl, 0,03% BND) ;
� La réaction est initiée par l’ajout de 500µl de TMB puis stoppée par 750 µl de
tampon de substrat ;
� Le résultat est obtenu par lecture de la DO à 510nm.
III.2. Amplification d’un fragment ARN
a. Extraction de l’ARN
� à partir d’organes
Le RNeasy Mini Kit (Qiagen) permet d’isoler l’ARN à partir de tissus d’origine
animale par fixation de l’ARN sur une membrane à base de gel de silice. L’échantillon est
d’abord broyé dans un tampon de lyse très dénaturant, contenant de l’isothiocyanate de
guanidine (GITC), un inactivateur de RNases. Le lysat est déposé dans une colonne
QIAshredder et centrifugé afin d’être homogénéisé. L’éthanol ajouté permet de créer les
conditions adéquates à la fixation de l’ARN sur la membrane. Les contaminants sont
éliminés par 3 lavages successifs par 2 tampons différents. L’ARN est enfin élué par de
l’eau RNase-free.
Matériel et Méthodes
123
Protocole :
� Broyer l’échantillon dans un mortier avec 400 µl de tampon RLT additionné de10
µl de β-Mercaptoethanol par 1 ml de tampon. Mettre le broyat dans une colonne
QIAshredder et centrifuger 2 min à vitesse maximale.
� Ajouter 1 volume d’éthanol 70% au lysat clarifié, mélanger par pipetage. Déposer
sur une colonne RNeasy et centrifuger 15 s à 13 000 tr/min. L’ARN est fixé à la
membrane, jeter l’éluat.
� Laver la membrane avec 700 µl de tampon RW1 et centrifuger 15 s à 13 000
tr/min. Répéter l’opération par 2 lavages de 500 µl de tampon RW2 suivis de
centrifugation pendant 15 s et 2 min, respectivement.
� Eluer l’ARN dans un nouveau tube en centrifugeant 1 min à 13 000 tr/min avec 80
µl d’eau RNase free.
L’ARN est prêt à être utilisé ou stocké à -80°C.
� à partir de sérum
Le QIAamp Viral RNA Mini Kit (Qiagen) a été élaboré pour extraire, en 3 étapes,
l’ARN viral grâce à la combinaison des propriétés de fixation d’une membrane à base de
gel de silice et de la vitesse de centrifugation.
L’échantillon est d’abord lysé en conditions dénaturantes qui permettent d’inactiver les
RNases, protégeant ainsi l’intégrité de l’ARN. Le « carrier RNA » présent dans le tampon
de lyse, augmente la fixation de l’ARN viral sur la membrane et limite son éventuelle
dégradation. Le lysat, déposé sur la colonne, est soumis à une centrifugation permettant à
l’ARN de se fixer sur la membrane. Les conditions de salinité et de pH sont adaptées à la
fixation de l’ARN mais pas des contaminants tels que les protéines. Ces derniers sont
éliminés par 2 étapes successives de lavages par 2 tampons différents qui n’affectent pas la
fixation de l’ARN sur la membrane. L’ARN est enfin élué par de l’eau RNase-free
contenant 0,04% d’azide de sodium empêchant la prolifération microbienne.
Protocole :
� Ajouter 140 µl de plasma dans un tube contenant 560 µl de tampon AVL
additionné du « carrier RNA ». Mélanger rapidement au vortex et incuber 10 min à
température ambiante.
Matériel et Méthodes
124
� Ajouter 560 µl d’éthanol absolu, vortexer, et déposer sur la colonne. Centrifuger 3
min à 13 000 tr/min, jeter le filtrat.
� Déposer 500 µl de tampon AW1 sur la colonne. Centrifuger 1 min à 13 000 tr/min.
� Répéter l’opération avec le tampon AW2. Centrifuger 2 min à 13 000 tr/min.
� Eluer l’ARN dans un nouveau tube en centrifugeant 1 min à 13 000 tr/min avec 80
µl d’eau ppi.
L’ARN peut être utilisé de suite ou stocké à -80°C.
b. Transcription inverse
Afin d’éviter toute contamination des pièces et réactions, les amplifications se font
dans 3 pièces différentes : une pour la préparation du milieu réactionnel, une deuxième
consacrée à la préparation des échantillons et la troisième pour l’amplification et la
détection.
La transcription inverse permet d’obtenir de l’ADN complémentaire (ADNc) à l’ARN
viral, dans le but de l’amplifier.
L’ARN est d’abord dénaturé 7 minutes à 65°C. Le milieu de réaction est ensuite ajouté.
Il est composé de DTT (0,1 M), d’un inhibiteur de RNases, d’une amorce oligo-dT (500
µg/ml), de 10 mM de chaque dNTP, d’un tampon (contenant 250 mM Tric-HCl, pH 8,3 à
température ambiante, 375 mM KCl, 15 mM MgCl2) et de la transcriptase inverse
(superscript II, Invitrogen).
La réaction de transcription inverse suit le programme suivant :
L’ADNc est prêt à être utilisé pour une réaction d’amplification.
c. Amplification des gènes
La Polymerase Chain Reaction (PCR), réaction de polymérisation en chaîne, permet
d’amplifier de façon exponentielle une région précise du génome, comprise entre les
amorces utilisées. La Figure 18 schématise l’amplification d’un fragment d’ADN.
65°C
42°C
65°C
4°C
7 :00
90 :00
5 :00
∞
Matériel et Méthodes
125
Figure 18 : Principe de l’amplification par réaction
de polymérisation en chaîne (PCR). Les amorces
spécifiques s’hybrident au brin d’ADN
complémentaire (ADNc) issu de la transcription
inverse. Pendant l’étape d’élongation, la polymérase
synthétise un nouveau brin complémentaire au brin
matrice sur lequel elle s’est hybridée. L’étape de
dénaturation permet de séparer les brins pour l’étape
d’hybridation du cycle suivant. Chaque cycle produit
2n brins d’ADN, avec n le nombre de copies
initiales.
� suite à transcription inverse
L’ ADNc est ajouté au milieu réactionnel comprenant : 5 µl de tampon d’incubation (10
mM Tric-HCl, pH 9 à 25°C, 50 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,1% Triton x100, 0,2 mg/ml
BSA), 1 µl d’un mélange de dNTP, 1 µl du mélange d’amorces (20 µM), 0,5 µl (2,5 U) de
Taq DNA polymérase (Qbiogene), de l’eau en quantité suffisante pour 50 µl.
L’amplification se déroule en 45 cycles de 3 étapes représentées sur le diagramme
suivant. Un cycle se compose d’une étape de dénaturation à 94°C permettant de séparer les
2 brins d’ADN, suivie de l’étape d’hybridation des amorces. La température dépend du Tm
des amorces utilisés. Pour amplifier le gène de la polymérase (gène L), la température
d’hybridation était de 46°C. Pour les amplifications des gènes de la nucléoprotéine (NP),
de la glycoprotéine (GP) ; les températures d’hybridations étaient respectivement de 52 et
56°C. Enfin, l’étape d’élongation pendant laquelle la Taq polymérase synthétise le
nouveau brin d’ADN.
Matériel et Méthodes
126
� one-step RT-PCR
Les amplifications du gène de la NP ont en partie été réalisées avec le kit SuperScript
III One-step RT-PCR System with Platinum® Taq High Fidelity (invitrogen). Le mélange
réactionnel comprend la SuperScript III, transcriptase inverse conçue pour réduire
l’activité RNase H et augmenter la stabilité à température ambiante, ainsi qu’un mélange
enzymatique composé d’un recombinant de Taq ADN polymérase, enzyme possédant un
système de relecture et une activité 3’-5’ exonucléase, et d’anticorps dirigés contre la
polymérase qui permettent de bloquer son activité à température ambiante, assurant
également un départ « hot-start » de la PCR.
Dans un tube, mettre 25 µl de mélange réactionnel (fourni dans le kit, contenant 0,4
mM de chaque dNTP et 2,4 mM de MgSO4), 2 µl d’amorces sens et anti-sens (20 µM), 1
µl de mélange enzymatique, et l’ARN. Compléter avec de l’eau jusqu’à 50 µl.
Le diagramme suivant représente les étapes de l’amplification :
La réaction se compose d’une transcription inverse à 42°C immédiatement suivie par la
première dénaturation à 94°C de la PCR. Les 3 étapes de la PCR sont plus courtes, la durée
de l’étape d’élongation est fonction de la taille du fragment à amplifier (1 min par kb).
� Amorces et détermination de la température d’hybridation
Afin d’hybrider les amorces à la température optimale, des mises au point de la
température sont nécessaires. A partir de la température de fusion théorique calculée en
fonction de la séquence de l’amorce (Tm = 2 (A+T) + 4 (G+C)), des amplifications sont
94°C
52°C
68°C 0 :15
0 :30
1 :00
68°C
5 :00
94°C
2 :00 42°C
30 :00
45 cycles
15°C
∞
94°C
56°C
72°C 1 :00
1 :30
1 :00
72°C
7 :00
94°C
5 :00
45 cycles
Matériel et Méthodes
127
faites à différentes températures comprises entre Tm-5° et Tm+5°. Les Tm des amorces
étant tous proches, les amplifications ont donc été faites à 46°, 50°, 52°, 54° et 56°C.
La température utilisée pour l’étape d’hybridation des PCR suivantes sera celle pour
laquelle le produit de PCR est le plus abondant, sans bande parasite ni dimères d’amorces
ou traces laissées par la migration sur gel.
Les amorces utilisées, leur température d’hybridation ainsi que les tailles des fragments
amplifiés sont résumés dans le tableau V.
d. Électrophorèse sur gel d’agarose
Quatre µl de produit de PCR sont déposés avec 3 µl de tampon de dépôt (bleu de
bromophénol et glycérol) sur un gel à 1,25% d’agarose (2 g d’agarose dans 160 ml de
tampon TBE (121,14 g Tris + 51,32 g acide borique + 3,72 g EDTA)).
En polymérisant, l’agarose va former des mailles par lesquelles les produits de PCR
soumis au champ électrique de la migration vont passer et seront séparés en fonction de
leur taille, évaluée grâce à un marqueur de taille/quantité (Low DNA Mass Ladder,
invitrogen).
Tableau V : Amorces utilisées pour l’amplification des gènes codant la GP et la NP,
leurs températures d’hybridation et la taille des fragments résultants.
Gènes Amorces (5’ à 3’) Sens / Antisens Temp.
(°C)
Fragment
(pb)
Protéine L TATMGRAATTTTTCYTTYTCATT
PCR 1 ATGTGGTGGGYTATAAWARTCACTRACAT 46 420
Protéine L GCWAAAGCMTTYCCWAGYAAYATGATGG
PCR nichée ATAAWARTCACTRACATGCATATAACA 52 297
GP 1 GATGAAGATTAAGCCGACAG
PCR 1 CTGTTCTGCGATGATTGTTG 56 1 428
GP 1 GTGAGCGTAATCTTCATCTC
PCR nichée TTGTTCAACTTGAGTTGCCT 56 1 388
GP 2 TGCAATGGTTCAAGTGCACA
PCR 1 AAGAGATAACTAGATTGATG 56 1 242
GP 2 CAAGGAAGGGAAGCTGCAG 56 1 159
Matériel et Méthodes
128
PCR nichée GAATCACATTGGCTATGTTT
GP diagno GAAGGTGTCGTKGCATTTCTGAT
PCR 1 CCTTGAYTGTGCACTTGAACCA 50 494 (589)
GP diagno TGAGAGAGCCGGTCAATGCAAC
PCR nichée GAGGAATTTTCTGAAGCCATG 362 (447)
NP 1 TTTGCAAGTCTATTCCTTCCG
PCR 1 CCGTTTTCCGAGTAACTCT 52 971
NP 2 GATCCGACTGACTCACAGGATA
PCR 1 GGCTCATCCTTCATCATATGAT 50 671 (692)
NP 2 TGGTCCTATTCGATCTAGACGA
PCR nichée ATGTGGCGATACATCTCCTCAA 517
e. Purification du produit de PCR sur gel
Les produits de PCR ont été purifiés sur gel grâce au kit QIAquick Gel Extraction
(Qiagen). Le tampon QG fournit dans le kit a été conçu pour solubiliser l’agarose et fournir
les conditions de pH et salinité optimales pour la fixation de l’ADN à la membrane de
silice de la colonne. La présence d’un indicateur coloré permet de vérifier que le pH est
dans la fourchette optimale, ainsi que la correcte solubilisation des morceaux d’agarose.
Les produits de PCR sont migrés sur gel d’agarose, les bandes correspondantes aux
produits sont découpées, pesées et incubées 10 min à 50°C dans 3 volumes de tampon QG.
Lorsque le gel est complètement dissous, ajouter 1 volume d’isopropanol et mélanger.
Déposer le mélange sur la colonne et centrifuger 1 min à 13 000 tr/min. L’ADN s’adsorbe
sur la membrane, les produits indésirables, tels les amorces, sels, enzymes, nucléotides
libres, agarose, bromure d’éthidium, sont élués. Laver deux fois avec 500 µl de tampon PE
et centrifugation 1 min à 13 000 tr/min. Le produit de PCR est élué dans 80 µl d’eau ppi
par centrifugation 2 min à 13 000 tr/min.
Matériel et Méthodes
129
III.3. Isolement viral
a. Culture de cellules Vero E6
Les cellules Vero sont des cellules immortalisées de rein de singe vert (Cercopithecus
aethiops). Ce sont des cellules adhérentes.
Composition du milieu de culture à 10% SVF : 450 ml milieu simple DMEM
(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium), 50 ml SVF (Sérum de Veau Fœtal
décomplémenté), 5 ml Glutamine (compris dans DMEM), pyruvate de sodium (compris
dans DMEM), 450 mg/l glucose (compris dans DMEM), 500 µl de PSN
(penistreptomycine)
� Décongélation des cellules
Sortir de l’azote liquide et mettre l’ampoule rapidement dans la glace le temps de
préparer le plan de travail, puis au bain-marie pendant quelques minutes.
Mettre dans tube 15 ml contenant 10 ml de SVF 50% dans du milieu simple. Ce lavage
permet de mieux éliminer le DMSO qui se fixe aux parois des cellules. Centrifuger 10 min
à 1 200 tr/min, jeter le surnageant et recommencer l’opération.
Suspendre les culots dans 5 ml de milieu DMEM à 20% SVF le temps que les cellules
reprennent et mettre dans boîte de culture 25 cm3. Incuber à 37°C, 5% CO2.
� Repiquage des cellules
Enlever le milieu de culture et laver avec 3 ml de Versène deux fois pendant 5 min.
Mettre 1 ml de Trypsine, incuber à 37°C pendant 3 min maximum afin que les cellules se
détachent de la paroi tout en évitant l’effet toxique de la Trypsine sur les cellules.
Reprendre les cellules dans 10 ml de milieu simple et centrifuger 10 min à 1400 tr/min.
Jeter le surnageant et recommencer l’opération.
Reprendre le culot dans du milieu DMEM à 10% SVF en fonction de la dilution des
cellules. Incuber à 37°C ; 5% de CO2.
Matériel et Méthodes
130
b. Infection des cellules par le virus Ebola
Cela correspond à l’inoculation d’un tapis cellulaire préalablement vidé du milieu de
culture avec un sérum infecté par EBOV. L’infection des cellules Vero se réalise dans le
laboratoire P4.
Diluer le sérum infecté au 1/10è dans un milieu de culture d’infection contenant 2,5%
de SVF. Mettre 200µl du sérum dilué dans une boîte de culture de 25 cm3 contenant un
tapis de cellules Vero préalablement vidée de son milieu et incuber 1 heure à 37°C,
5%CO2.
Après incubation, ajouter 5 ml de milieu d’infection à 2,5% SVF.
Les cultures infectées sont observées au microscope tous les jours afin de repérer la
sortie du virus des cellules après réplication, se situant souvent vers le 5è jour post-
infection et caractérisé par un « lâcher de ballon » correspondant à une forte mortalité
cellulaire.
L’isolement viral a également été tenté à partir d’échantillons de carcasses animales.
Dans ces cas, un aliquot de prélèvement de muscle était broyé dans du PBS puis déposé sur
le tapis de cellules Vero.
IV. Caractérisation des souches par PCR
IV.1. PCR des gènes GP, NP et L
Les gènes codant la GP, la NP et la polymérase étaient amplifiés selon le protocole
décrit précédemment (voir III.2. Amplification d’un fragment ARN).
Matériel et Méthodes
131
IV.2. Séquençage et analyses phylogénétiques
Le séquençage des produits de PCR était effectué par la société GeneCust (4 rue Pierre
Fontaine, 91058 Évry Cedex, France).
Les séquences obtenues étaient visualisées et vérifiées grâce au logiciels BioEdit et
Chromas. Elles ont ensuite été alignées grâce à un serveur utilisant le logiciel ClustalW
(http://www.clustalw.genome.jp). Les données utilisées pour les analyses phylogénétiques
comprenaient 21 séquences complètes du gène GP (2031 nt), 24 séquences partielles (538
nt) et 18 séquences partielles codant la NP (1448 nt). Les séquences des autres espèces
Ebolavirus (Reston, Soudan et Côte d’Ivoire) ont été inclues afin d’enraciner les arbres
phylogénétiques de l’espèce Zaïre.
Des analyses phylogénétiques préliminaires ont été effectuées par le logiciel MEGA
3.1 [393] qui permet la construction d’arbres selon les méthodes du maximum de
parcimonie et du plus proche voisin. Les analyses bayésiennes étaient menées grâce au
logiciel MrBayes v3.1 [394].
L’âge de séparation entre les 2 lignées ZEBOV et entre les autres nœuds de l’arbre était
estimé grâce au programme BEAST v1.4 (accessible à l’adresse suivante :
http://beast.bio.ed.ac.uk.). Seules les séquences de ZEBOV et leur date de prélèvement
étaient utilisées.
Résultats
132
RÉSULTATS
Résultats
133
I. Réponse internationale à l’épidémie de Mbandza
Mi-novembre 2003, suite à la confirmation par le CIRMF de l’infection par ZEBOV
d’un cas suspect à Mbomo, RC, une équipe de l’Unité des Maladies Virales Émergentes
(UMVE), dont j’ai fait partie, a rejoint les équipes médicales déjà en place pour aider au
diagnostic de l’épidémie.
Une réponse internationale à une épidémie se divise en plusieurs niveaux. À
Brazzaville, la capitale du Congo, la réponse est organisée par le comité national de lutte
contre les épidémies, présidé par le Ministre de la santé et de la population. Ce comité est
composé des représentants des ministères de la santé et de la population, de
l’administration du territoire, de la défense, de l’économie forestière, des représentants de
la Croix-Rouge congolaise et des partenaires qui ont participé au contrôle de l’épidémie,
dont l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) et Médecins Sans-Frontières (MSF Pays-
Bas pour cette flambée).
Sur le terrain, un comité de coordination technique et scientifique assurait la
coordination de la réponse par le biais de 5 commissions dédiées à : la surveillance
épidémiologique et la mobilisation sociale ; la prise en charge des cas, diagnostic et
laboratoire ; l’hygiène, assainissement et funérailles ; la logistique ; et le soutien
psychosocial.
Tous les matins, des membres de la commission surveillance épidémiologique et
mobilisation sociale sillonnaient la ville armés de porte-voix, répétaient les consignes
d’hygiène et de protection à suivre, et suivaient les personnes contact de cas suspects ou
confirmés. Les cas étaient définis en 4 catégories : un cas « alerte » est une personne
présentant une forte fièvre à début brutal ou mort subitement avec hémorragie, diarrhée
sanglante ou hématurie ; un cas « suspect » est une personne qui a été en contact avec un
cas probable ou confirmé et qui présente au moins 3 symptômes spécifiques ; un cas
« probable » est une personne qui présente les symptômes caractéristiques d’une FHVE,
évalués par un médecin, ou une personne liée épidémiologiquement avec un cas « confirmé
en laboratoire ».
Les malades, quels qu’ils soient, étaient pris en charge au sein de l’hôpital de Mbomo.
Les patients aux symptômes spécifiques de la FHVE étaient isolés, ceux qui refusaient
d’être pris en charge dans le pavillon d’isolement étaient remis à leur famille avec, lorsque
les conditions le permettaient, du matériel de protection et une formation pour l’utiliser
Résultats
134
correctement. La commission hygiène, assainissement et funérailles était chargée des
inhumations dans le respect des mesures de protection et des temps forts des rituels pour
aider au travail de deuil des familles.
Le diagnostic était assuré par l’UMVE dans les laboratoires du CIRMF à Franceville.
Notre rôle était de stocker et acheminer les prélèvements de cas contact, suspects et
probables, et d’en réaliser le diagnostic un fois arrivés à Franceville. Nous avons
également apporté notre aide aux deux équipes venues mettre au point des outils de
diagnostic rapides et adaptés aux conditions de terrain. Il s’agit du test par
immunofiltration mis au point par un représentant de l’Institut de Microbiologie de
Munich, Allemagne ; et d’un diagnostic par RT-PCR en temps réel réalisé par une équipe
du Laboratoire National de Microbiologie de Winnipeg, Canada. Les structures sanitaires
locales étant peu fonctionnelles, les conditions de terrain n’étaient pas toujours idéales
pour les manipulations. Ainsi, l’équipe de Winnipeg a plus d’une fois été obligée de se
brancher sur une batterie de véhicule pour faire fonctionner sa PCR en temps réel.
II. Diagnostic
II.1. Diagnostic par immunofiltration
La mise au point de la méthode de diagnostic par immunofiltration est le résultat d’une
collaboration avec l’Institut de Microbiologie de Munich, Allemagne, et le Laboratoire
National de Microbiologie de Winnipeg, Canada.
En vue de ce test, des prélèvements de sérum, urine, salive, sueur ou larmes ont été
collectés à partir de cas probables ou suspects, ainsi que leurs contacts, lors de l’épidémie
de novembre-décembre 2003 en République du Congo. Deux prélèvements sanguins
intracardiaques ont également été obtenus à partir de cas probables décédés (cas 1 et 2,
Tableau VI).
L’antigène viral était capturé et détecté efficacement dans les deux prélèvements post-
mortem. Par contre, les prélèvements, quels qu’ils soient, des cas suspects et des contacts
se sont révélés être négatifs, même aux faibles dilutions (Figure 19).
Les résultats obtenus par immunofiltration ont été confirmés par RT-PCR en temps réel
et par détection d’anticorps et capture d’antigènes par ELISA.
Résultats
135
Figure 19 : Diagnostic par immunofiltration. A) Photomètre
et colonnes utilisées sur le terrain. B) Résultats d’un test sur le
terrain. N = témoin négatif ; P = témoin positif, ZEBOV,
souche Mayinga ; 1 à 9 = sérums à tester. Les sérums 1 et 6
réagissent positivement, les autres ne présentent pas
d’antigène ZEBOV. L’observation visuelle est confirmée par
lecture photométrique.
Le test de validation de la technique d’immunofiltration a donné lieu à la publication
suivante (Annexe 2) :
Lucht A., Formenty P., Feldmann H., Götz M., Leroy E., Bataboukila P., Grolla A.,
Feldmann F., Wittmann T., Campbell P., et al. Development of an Immunofiltration-based
Antigen Detection Assay for Rapid Diagnosis of Ebola Virus Infections, J. Infect. Dis.
(Sous presse)
II.2. Diagnostic par ELISA
Lorsqu’un prélèvement suspect arrive au CIRMF pour diagnostic, ou dans le cadre
d’une épidémie, les échantillons sont aliquotés dans le laboratoire P4, un aliquot de sérum
est inactivé 60 min à 56°C puis sorti du laboratoire pour détection d’IgG et capture
d’antigène par ELISA. L’ARN est extrait dans le laboratoire P4 à partir d’un autre aliquot
de sérum.
Le tableau VII présente les diagnostics antigènes et détection d’IgG de quelques
sérums obtenus lors de l’épidémie de Mbandza, RC, en novembre 2003. Le diagnostic des
prélèvements post-mortem étaient utilisé dans la gestion des cas. La confirmation en
laboratoire permet de discerner les non-cas des cas probables (personne présentant des
symptômes compatibles avec la FHVE, évalués par un médecin, ou une personne décédée
présentant un lien épidémiologique avec un cas confirmé). Il en est de même pour les cas
suspects (cas contact présentant au moins trois des symptômes spécifiques ou des
saignements inexpliqués) prélevés en période de symptômes.
Les prélèvements n°1 montrent l’évolution du diagnostic en fonction du devenir de la
maladie. Le premier prélèvement 9 jours après le début des symptômes est positif en
Résultats
136
antigène capture et négatif pour la détection d’IgG. Vingt jours après le début des
symptômes, alors que la patiente était en voie de guérison, l’antigène n’est plus détectable,
et des IgG sont présents.
Tableau VI : Comparaison du diagnostic par immunofiltration avec les méthodes de RT-PCR en temps réel
et ELISA sur des prélèvements de cas suspects ou probables et leurs contacts lors de
l’épidémie de Mbandza, RC, en 2003.
N° Sexe Age
(ans) Cas
Jour post-
symptôme
DO
Immunofiltration
/ interprétation
RT-
PCR
Capture
Antigène
ELISA
Détection
Anticorps
ELISA
Résultat
1 F 5 Probable 7 2,158 / + NT + - Confirmé
2 M 22 Probable 8 1,671 / + + + - Confirmé
3 M 19 Suspect 6 0,223 / - - - - Non-cas
4 M 1 Suspect 8 0,260 / - - - - Non-cas
5 M 6 Suspect 10 0,218 / - - - + Convalescent
6 M 31 Suspect 10 0,150 / - - - + Convalescent
7 M 26 Suspect 14 0,078 / - - - - Non-cas
8 F 23 Suspect 15 0,141 / - - - - Non-cas
9 F 18 Suspect 15 0,259 / - - - + Convalescent
10 F 22 Suspect 16 0,065 / - - - + Convalescent
11 F 20 Suspect 16 0,108 / - - - - Non-cas
12 F 40 Suspect 18 0,190 / - - - - Non-cas
13 F 14 Suspect 18 0,128 / - - - - Non-cas
14 F 22 Suspect 20 0,299 / - - - + Convalescent
15 F 38 Suspect 20 0,084 / - - - - Non-cas
16 M ? Contact 0,145 / - - - - Non-cas
17 F ? Contact 0,241 / - - - - Non-cas
18 M 43 Contact 0,127 / - - - - Non-cas
19 F ? Contact 0,073 / - - - - Non-cas
20 M ? Contact 0,094 / - - NT NT Non-cas
F = Féminin ; M = Masculin ; Immunofiltration réalisée sur le terrain par l’équipe de l’Institut de
Microbiologie de Munich, Allemagne ; RT-PCR réalisées sur le terrain par l’équipe du Laboratoire National
de Microbiologie, Winnipeg, Canada ; NT = non testé.
Résultats
137
Tableau VII : capture d’antigène et détection d’anticorps sur des sérums obtenus lors de l’épidémie de
Mbandza, RC, en 2003.
Numéro Sexe Age Cas DDS Prélèvement Ag IgG
1 F 22 15 nov. 03 24 nov. 03 + -
Convalescent 5 déc. 03 - +
2 F 50 Décès (24 nov.) 18 nov.03 24 nov. 03 + -
3i M 24 Décès (23 nov.) 15 nov. 03 23 nov. 03 + -
4 M 40 Décès (23 nov.) 14 nov. 03 24 nov. 03 + -
5 M 25 Décès (21 nov.) 16 nov. 03 22 nov. 03 + -
6 F 8 Décès (23 nov.) 17 nov. 03 24 nov. 03 + -
7 M 40 Décès (10 nov.) 06 nov. 03 11 nov. 03 + -
8 M 26 Décès (24 nov.) 13 nov. 03 24 nov. 03 + +
9 M 16 Décès (29 nov.) 20 nov. 03 24 nov. 03 + -
F = Féminin ; M = Masculin ; DDS = Date de Début des Symptômes ; Ag = Capture d’antigène ; IgG =
détection d’Immunoglobuline G. Les numéros ne correspondent pas à ceux attribués aux sérums testés par
immunofiltration.
II.3. Diagnostic par RT-PCR
Enfin, l’infection par EBOV était confirmée plus spécifiquement par l’amplification du
gène L codant la polymérase.
La figure 20 montre la migration sur gel d’agarose des produits de PCR nichée pour
quatre patients diagnostiqués positifs par les méthodes ELISA. La bande inférieure
correspond à l’amplicon de 391pb.
Figure 20 : Migration sur gel d’agarose des produits d’amplification nichée du gène L pour les
prélèvements diagnostiqués positifs par capture d’antigène par ELISA. La bande correspondant à l’amplicon,
d’une taille de 391pb, est indiquée par une flèche. La bande supplémentaire présente dans les lignes 5, 7 et 8
est due à une amplification non spécifique. MM : échelle de masse moléculaire ; - : eau ; -n : eau de la PCR
nichée ; 4, 5, 7, 8 : cas décrits dans le tableau VII.
Résultats
138
Le même protocole a été appliqué aux prélèvements issus de carcasses animales
trouvées en forêt. En raison de la décomposition rapide en milieu tropical, plusieurs
échantillons diagnostiqués positifs par ELISA ou PCR sur le gène L n’ont pas pu être
amplifiés sur le gène de la GP, probablement à cause de la trop grande dégradation de
l’ARN viral (voir tableau III).
Le diagnostic est également réalisé sur des prélèvements de malades présentant des
symptômes correspondant à la FHVE et provenant de régions endémiques. L’infection par
EBOV est recherchée par amplification des gènes L et GP. Un diagnostic de l’infection par
le virus de Marburg est également effectué par amplification du gène VP35 (figure 21).
Figure 21 : Diagnostic de l’infection par
EBOV par RT-PCR sur les gènes L et GP et de
l’infection par MARV sur le gène VP35. MM :
échelle de masse moléculaire ; - : eau ; + :
témoin positif ; E : échantillon à tester.
II.4. Infection des cellules Vero
Dans le but d’obtenir de plus grandes quantités de
matériel viral, des cellules Vero ont été infectées par des
sérums positifs. L’infection était contrôlée par capture
d’antigène et/ou PCR sur des aliquots post-infection.
Plusieurs passages sur cellules Vero étaient parfois
nécessaires pour que certains prélèvements infectent
efficacement les cellules. La figure 22 montre un exemple d’isolement efficace du virus sur
un prélèvement humain et l’absence d’infection cellulaire par un second sérum humain,
prélevé et stocké dans des conditions similaires. Plusieurs ml de milieu de culture infectée
ont pu être obtenus à partir du sérum du patient 4.
Figure 22 : Contrôle de l’infection de cellules Vero par migration sur gel d’agarose des produits
d’amplification du gène de la GP (2è ORF, 1242pb) à partir des surnageants aliquotés le 4è jour post-
infection. MM : échelle de masse moléculaire ; - : eau ; 4 et 5 : surnageants de culture infectée par les sérum
des patients 4 et 5 (tableau VII).
Résultats
139
II.5. Mise en évidence de souches atypiques
La combinaison de ces différentes méthodes de diagnostic a permis faire ressortir le
diagnostic de certains prélèvements. En effet, lors de l’épidémie humaine de 2002 à
Mékambo, Gabon, une chaîne épidémiologique a présenté un taux de mortalité de 50%, au
lieu des 80% spécifique à ce sous-type. Cette souche se comportait différemment des
autres : une grande quantité d’antigènes a été détectée par ELISA, mais aucune
amplification par PCR ni aucun isolement sur cellules Vero n’étaient possibles. Trois
souches au profil identique ont été découvertes à partir d’échantillons prélevés sur des
carcasses d’un gorille (Mbandza, juin2003) et de deux chimpanzés (mère et enfant, Lossi,
déc2002).
De par leur comportement différent, ces souches ont été qualifiées d’« atypiques ».
III. Séquençage de gènes de protéines virales
III.1. Séquences du gène codant la glycoprotéine
Les séquences de longs fragments des régions codantes des gènes de la GP (2030 des
2166 nt) ont été obtenues à partir des prélèvements obtenus lors des épidémies humaines et
de la plupart des prélèvements d’origine animale. Seules les souches infectant 3 carcasses
de grands singes n’ont pu être amplifiées ni séquencées entièrement, en raison de la
dégradation de l’ARN viral. L’amplification et le séquençage des prélèvements
GOR_Mbandza_jun03, GOR1_ et GOR2_Odz_jun05 a donc été effectué sur une petite
zone variable de 538 nt de la première ORF de la GP.
Les séquences obtenues sont clairement différentes les unes des autres.
Les séquences inédites de la GP ont été déposées dans la banque de gènes sous les
numéros d’accession suivants :
• Séquences GP totale (2030 nt) : EU051634 (Etoumbi_mai05) ; EU051635
(Mbandza_nov03) ; EU051630 (GOR1_Lossi_dec02) ; EU051631
Résultats
140
(GOR2_Lossi_dec02) ; EU051632 (GOR_Ekata_nov01) ; EU051633
(CH_Lossi_fev03) ;
• Séquences GP partielles (538 nt) : EU051636 (GOR_Mbandza_jun03) ;
EU051637 (GOR1_Odzala_jun05) ; EU051638 (GOR2_Odzala_jun05).
a. Comparaison des souches d’origine humaine et animale
Les séquences déterminées à partir des prélèvements des épidémies humaines et des
carcasses animales ont été alignées et comparées avec les séquences déjà publiées dans la
banque de gènes (Figure 23). L’alignement des séquences partielles et totales de la GP
montre que toutes ces séquences appartiennent à l’espèce Ebolavirus zaire, et qu’elles sont
toutes différentes les unes des autres.
Lorsque les séquences sont comparées deux à deux, de nombreuses substitutions sont
observées. Cependant, l’alignement des séquences met en valeur la présence de signatures
moléculaires. Elles sont définies comme des nucléotides (ou acides aminés) communs à
toutes les souches d’un groupe et qui diffèrent du nucléotide (ou acide aminé) commun à
toutes les souches de l’autre groupe au même site. Sur les 538 nt de la séquence partielle, 9
signatures nucléotidiques sont observées, donnant lieu à 4 substitutions d’acides aminés
dans la séquence prédite (Tableau VIII). Les signatures nucléotidiques sont surlignées sur
la figure 23 et les modifications d’acides aminés sont indiquées au-dessus des séquences.
Les séquences de la GP peuvent donc être classées en deux groupes selon les signatures
nucléotidiques :
- Le groupe A qui comprend les séquences issues des premières épidémies humaines, à
savoir Mayinga_76, Mekouka_94, Kikwit_95, Booué_96 et Mayibout_96 (séquences en
vert dans la figure) ainsi que les séquences issues des épidémies humaines de 2001 à 2003
(en bleu dans la figure), nommées Mendemba_A_oct01, Mendemba_B_oct01,
Makokou_dec01, Olloba_dec01, Etakangaye_dec01, Entsiami_jan02 et Mvoula_jan03 ;
- Le groupe B (en rouge), qui est composé des séquences issues des deux dernières
épidémies humaines de 2003 et 2005 (Mbandza_nov03 et Etoumbi_mai05) ainsi que des
séquences issues de carcasses animales (GOR_Ekata_nov01, GOR1_Lossi_dec02,
GOR2_Lossi_dec02, CH_Lossi_fev03, GOR_Mbandza_jun03, GOR1_Odz_jun05 et
GOR2_Odz_jun05).
Résultats
141
Tableau VIII : Signatures moléculaires nucléotidiques entre les séquences des groupes A et R et les
séquences du groupe B.
Nucléotide* Groupes A+ R Groupe B
630 TCT Ser S TCC Ser S
690 ACA Thr T ACG Thr T
747 ACA Thr T ACG Thr T
757 CTG Leu L TTG Leu L
784 ACA Thr T GCA Ala A (262)
804 AAT Asn N AAC Asn N
949 AAC Asn N GAC Asp D (317)
992 GGG Gly G GAG Glu E (331)
997 AAC Asn N TAC Tyr Y (333)
*Numérotation à partir du 1er nucléotide de l’amplicon et 1er acide aminé de la séquence prédite
Résultats
142
Mayinga_76 ATG GGC GTT ACA G GA ATA TTG CAG TTA CCT CGT GAT CGA TTC AAG AGG ACA TCA TTC TTT CTT TGG GTA ATT ATC CTT TTC CAA AGA ACA TTT TCC ATC CCA CTT GGA GTC ATC CAC AAT AGC ACA TTA CAG GTT AGT GAT GTC GAC AAA
Mekouka_94 ... ..T G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ..T G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ..G ... ... ...
Booue_96 ... .. T G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ..T G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ..T G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... . ..
Mendemba_B_oct01 ... ..T G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ..T G.. . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...
Makokou_dec01 ... ..T G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ..T G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... .. T G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ... .. T G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... .. T A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ..T A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ...
GOR_Ekata_nov01 ... .. T A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 ... ..T A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 ... .. T A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ...
CH_Lossi_fev03 ... .. T A.. ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ...
GOR_Mbandza_jun03
GOR1_Odz_jun05
GOR2_Odz_jun05
Côte d’Ivoire ..C A AG CG. CAG ... T. C.. ..A ..G ..C ... ..G ..C ... .G. .AA ... ..T ... ... G.. ... ... ..A ... ..A ... ..T .A. GTC ... ..A ... ..G T.G ..G ..T G.A ... ..C .AT ..C C.. ..A ..G ... ... A.T ... ..G
Soudan_Maleo ... . AG .G. CTT A.C C.. C.C ..A ..G ..C A.A ... AA. ..T CGA .AA .GC ..T ... ... G.. ... ..C ..C ... T.A ..T ... .AG G.C ... ... ..G ..T T.G ..T ..T G.G AC. ..C ... ..T ... G.A ..A .CA ..G A.T ... C.G
Reston_Philippine ... . AG .G. .TC AAC T. C.C ..A ..G ... ..G ..A ..T ..T CGT .AA ..T ..G ... ..A G.A ... ... ..C ... ..C ... ..G C.. G.. A.C ... ..G ..G ... ..T A.A G.G ACA ... ... ..T C.C A.A .CA .CA ..A A.T ..T C..
Marburg_67 A TGA ..A C.. CAT G.. .C. T.A .CA ..C .. ... T.A A.. ... G .G .T. AAA A.T C.. ..T A.. TT. .AG ..A GCT .G. .A. .AT C .A CCC CAA A.. ..G ..T
Mayinga_76 CTA GTT TGT CGT GAC AAA CTG TCA TCC ACA AAT CAA TTG AGA TCA GTT GGA CTG AAT CTC GAA GGG AAT GGA GTG GCA ACT GAC GTG CCA TCT GCA ACT AAA AGA TGG GGC TTC AGG TCC GGT GTC CCA CCA AAG GTG GTC AAT TAT GAA
Mekouka_94 ..G ... ..C ... ... ... ... ... ... .. G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ..G ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ..G ... ..C ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ..G ... ..C ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ..G ... ..C ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ..G ... ..C ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ..G ... .. C ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ...
Makokou_dec01 ..G ... ..C ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ..G ... ..C ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ..G ... ..C ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ..G ... ..C ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Ekata_nov01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ...
CH_Lossi_fev 03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Mbandza_jun03
GOR1_Odz_jun05
GOR2_Odz_jun05
Côte d’Ivoire T.T ..G ..C ..A ... ... ..C ..T ..A ..T .GC ... ... . AG ... ..C ..G T.. ..C T.G ..G ..C ... ... ..A ... ... ..T ..A ... A.G ... ..C ... ... ... ..T ..T C.A G.T ... ..T ... ... ... ... ..A ... ..C ...
Soudan_Maleo ... ..C ..C AAG ..T C.T ..T G.. ..A ..T G.C ..G C.. .A. ... ... ..T ..C ..C ... .. G ... .GC ... ..A T.T ... ..T A.C ... ... ..G ..A ..G C.T ... ... ... ..A ..T ... ..G ..T ..C C.A ... ... .GC ... ...
Reston_Philippine T.G ... ... .. G ... ... ... ... ..A ..C .G. ..G C.C .AG ..T ..G ..G ... ... ..G ..G ..A ... ... A.T ... ..C ..T ..C ... ..A ... ..A ... C.C ... ..A ..T C.T ..A ... ..G ..T ..C ... ... ... .GC ... ...
Marburg_ 67 TCG ..A ..C TCC .GA .CT ..C CAG AAG ... G.A G.T G.C CAT CTG A.G ... T.C .CA ..G AGT ... C.A AA. ..T ..T GA. TC. CCT TTG GAG ... T.C ..G C.. ... .CT ... ... A.A ... ..A ..T ..C ... AAT ..T G.G ... AC.
Figure 23: Alignement des séquences partielles et totales codant pour la glycoprotéine (GP, 538 et 2031 nt). Les substitutions de nucléotides sont surlignées en jaune.
Trois groupes peuvent être distingués : en vert, le groupe A composé de souches humaines apparues entre 1976 et 1996 ; en rouge, le groupe B contenant les souches isolées
de carcasses animales et les souches responsables des deux dernières épidémies humaines ; en bleu, le groupe R composé de souches humaines isolées entre 2001 et 2003.
En noir sont les séquences d’autres espèces (MARV, REBOV, CIEBOV et SEBOV). Les points correspondent aux identités de nucléotides. Les changements entraînés par
les substitutions de nucléotides dans la séquence aminoacide prédite sont signalés au dessus de l’alignement et indiquent la position de l’acide aminé changé.
Résultats
143
Figure 23 : suite
Mayinga_76 GCT GGT GAA TGG GCT GAA AAC TGC TAC AAT CTT GAA ATC AAA AAA CCT GAC GGG AGT GAG TGT CTA CCA GCA GCG CCA GAC GGG ATT CGG GGC TTC CCC CGG TGC CGG TAT GTG CAC AAA GTA TCA GGA ACG GGA CCG TGT GCC GGA GAC
Mekouka_94 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Makokou_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Ekata_nov01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
CH_Lossi_fev03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Mbandza_jun03
GOR1_Odz_jun05
GOR2_Odz_jun05
Côte d’Ivoire ... ..A ... ... ... ..G ... ..T ..T ..C ..G .CT ..A ..G ... GT. ..T ..T ... ... ..C ... ... .A. ..C ..T ..G ..A G.G A.. .AT ..T ... ..T ... ..C ... ..A ... ... ..C ... ... ..T ... ..A ..C C.A ... .GA
Soudan_Maleo ..A ..A ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ..A ..G ... ..G ... ... ..C ..A ..C T.. ..C C.. C.. ..G ..T ..T G.C A.A ... ..T ..A A.. ... ..C ... ..T ... ... .CC CA. ... ..C ..G ..C ..C C.G ..T ...
Reston_Philippine ..C ..A ... ... ..A ... ... ... ... ... ..G ..G ... ... ..G T.A ... .. A ... ..A ..C ..C ..T CTC C.T ..C ... ..T G.A ..A ..A ... ..T A.A ..T ..C ... ..C ... ... ..T CA. ... ..A ..T ..C ... C.. ..T ...
Marburg_67 .AA ..G ..G GAA ..C A.. .CA ... ... ... A.A AGT G.A .CG G.T ..C TCT ..A .AA TCC .TG ..G TTG .AT C.T ..T AC. AAC ..C ..T .A. .AT ..T AAA ... AAA AC. A.C ..T C.T A.T CA. ..T CAA AAC ..T CA. ..A CA. .GG
Mayinga_76 TTT GCC TTC CAT AAA GAG GGT GCT TTC TTC CTG TAT GAT CGA CTT GCT TCC ACA GTT ATC TAC CGA GGA ACG ACT TTC GCT GAA GGT GTC GTT GCA TTT CTG ATA CTG CCC C AA GCT AAG AAG GAC TTC TTC AGC TCA CAC CCC TTG AGA
Mekouka_94 ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 . .. ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ..C ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ...
Makokou_dec01 ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ...
Mvoula_jan03 ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Ekata_nov01 ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
CH_Lossi_fev0 3 ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Mbandza_jun03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR2_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Côte d’Ivoire C.C ... ..T ..C ... ..A ..A ..C ... ... ... ... ..C ... ..C ..A ..A ... A.C ..T ..T ..G ..T ..A ..C ..T ..C ... ..A ..T A.. ... ... ... . .C T.. ..T A.G ..G CGA ... ..T ..T ... CAG ..T .CT ..A ... CAT
Soudan_Maleo .A. ... ..T ..C ..G ..T ..A ... ... ... .. C ... ..C A.G ..G ... ..A ..T ..A ..T ... A.. ... GTC .A. ..T ... ..G ..G ..A A.C ... ..C T.. ... T.. G.T A.. C.A ... G.A ACG ... C.T CAA ... .C. ... A.T C..
Reston_Philippine C.A ... ... ..C ... A.T ..G ... .. T ... T.. ... ... A.. T.G ..C ..A ..T ..C ... ... ..T ..G ..A ... ..T A.. ... ... ... ..A ..T ... T.A ..T ... T.A G.G C.C ... ... C.T ..T .GG .AG G.T ACA ..A GCT CAT
Marburg_6 7 A.C ... C.. ... TTG TG. ..A ..A ..T ... ... ... ... ..C A.. ..C ... ... ACA ..G ... ... ..C .GA GTC ... A.. ... ..G AA. A.A ... GC. A.. ..T G.C AAT A.G A.A GT. C.C A.A A.G A.T TT. ..G AGG .AA GGA CAG
Résultats
144
Figure 23 : suite
Mayinga_76 GAG CCG GTC AAT GCA ACG GAG GAC CCG TCT AGT GGC TAC TAT TCT ACC ACA ATT AGA TAT CAG GCT ACC GGT TTT GGA ACC AAT GAG ACA GAG TAC TTG TTC GAG GTT GAC AAT TTG ACC TAC GTC CAA CTT GAA TCA AGA TTC ACA CCA
Mekouka_94 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
Makokou_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ...
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ..R ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ..C C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
GOR_Ekata_nov01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
GOR1_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
CH_Lossi_fev03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
GOR_Mbandza_jun03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
GOR1_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
GOR2_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
Côte d’Ivoire ... ..T .C. ..C ATG ..C AC. ..T ..C ..C ... TA. ..T C.C A.G ..A ... ..A .AC ..C GT. .T. GAT AA. ... ... ... ..C ACC ... ... .TT C.. ... C.A ..C ..T C.. ... ..G ..T ..G ..G ..C ..G G.. ... ... ... ...
Soudan_Maleo ... G.A .CA ..C TAC ..T ..A A.T A.A ..A ... TA. ..T GCC A.A T.. TAC T.G GAG ..C G.A ATC GAA AA. ... ..T G.T C.A C.C T.C AC. AC. C.T ... A.A A.. A.. ... AAT ..T .TT ..T .TT ..G ..C AGG CCC CA. ..G ..T
Reston_Philippine ..A ... .. G ..C A.. ..A ..T ... T.C A.A ..C TA. ... ATG A.C CTG ... C.C ..C ..C G.. ATG T.A AA. ... ... GG. ..G ..A .GT A.C AC. C.T ..T A.. ..A ... ..C CAC ..A ..T ..G ... ..A ..T CGT CC. CA. ..T ..G
Marburg_67 .G. TAC CGT C.C ATG .AT CT. ACT T.T A.. .A. AAA ..T .GG A.A .TA ... ..G GA. C.C .A A.G .AT .AC AC. ... TG. TTC .GT G.T CTT C.A GAA .A. A.C ACG A.G ... CAA ..A .GT .CT .CG TCC A.. AT. CCC .C. ..T ...
T 262 A
Mayinga_76 CAG TTT CTG CTC CAG CTG AAT GAG ACA ATA TAT ACA AGT GGG AAA AGG AGC AAT ACC ACG GGA AAA CTA ATT TGG AAG GTC AAC CCC GAA ATT GAT ACA ACA ATC GGG GAG TGG GCC TTC TGG GAA ACT AAA AAA AAC CTC ACT AGA AAA
Mekouka_94 ... ... C.. ... ... ... ... ... ... .G. ... A.. ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... C.. A.. ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... C.. A.. ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... C.. G.. ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Makokou_dec01 ... ... C.. A.. ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... C.. A.. ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Entsiami _jan02 ... ... C.. A.. ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ... ... C.. A.. ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Ekata_nov01 ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ...
CH_Lossi_fev03 ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Mbandza_jun03 ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Odz_jun05 ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR2_Odz_jun05 ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Côte d’Ivoire ..A ..C ..T G.. .TC ..A ... ..A ..C ..C ..C T.T GA. AAC CGC ..A ..T ..C ..A ..A ... ... ... ..C ... ..A A.A ..T ... ACT G.. ... ..C .GC ..G ..T ... ... ..T ... ... ... .A. ... ... ... T.. ..A .A. .CC
Soudan_Maleo ... ..C ..T T.. ... ... ... ..T ..C ..T C.A CTT CAC CAA C.G TT. ... ..C ..A ..T ..G ... ... ... ... .CA C.A G.T G.T A.T ..C A.. G.T GAT ..T ..T ..A ... ..T ..T ... ... .A. ... ... ..T ... T.C GA. C..
Reston_Philippine ... ..C ..T G.T ... .. C ... ..A ... C.T CGA .G. .A. AAT CGC CTT ... ..C .GT ..T ..G .G. T.G .C. ... .CA T.G G.T ..T A.. ... ..A C.. GAT G.T ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.T T.C CA. C..
Marburg_67 ... CCC G.C .AG AGA TCA ..C ACA .GC .CC CCA ..T GA. .CC .CC .CA CT. ..C ... ..A .AC ... .A. TGA ..A TGA .GA CCT .AT A.C ..C .G. T.. GGG TC. ..A ..A CA. .AA CC. .AT AC. ... TC. G.T GGG TCA CTA ..C ..G
Résultats
145
Figure 23 : suite
N 317 D G 3 31 E N 333 Y
Mayinga_76 ATT CGC AGT GAA GAG TTG TCT TTC ACA GTT GTA TCA AAC GGA GCC AAA AAC ATC AGT GGT CAG AGT CCG GCG CGA ACT TCT TCC GAC CCA GGG ACC AAC ACA ACA ACT GAA GAC CAC AAA ATC ATG GCT TCA GAA AAT TCC TCT GCA ATG
Mekouka_94 . .. ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... A.. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ... ... . C. ... ... ... A.. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... A.. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... A.. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... A.. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... A.. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... A.. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Makokou_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... A.. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... . .. .C. ... ... ... A.. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... A.. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... A.. ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... G.. ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ...
GOR_Ekata_nov01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_de c02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... T.. ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... . .. ... .C. ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ..G T.. ... ... T.. .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
CH_Lossi_fev03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Mbandza_jun03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ...
GOR1_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ...
GOR2_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .A. ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... A.. ...
Côte d’Ivoire C.. TCA ... ... ... ... ... ... GT. CC. ... C.. G.A ACC CAG ..C C.G G.. CT. .AC AC. .CA G.. A.. GTC T.. C.. C.. AT. T.C .CC CA. ... CAC G.. GGC ... ... ... ... GAA T.. .T. ... ..G G.. ... A.. C.. G..
Soudan_Maleo C.A ..T G.A ... ... C.. ... ... GA. AC. T.. ..G CT. AAC .AG .C. G.A GA. GA. .A. GC. .CA T.. T.. A.. ... A.A AAG .GA AG. ATC T.. G.. CGG G.C ..C AGG A.G T.T TCG GA. C.. .T. C.. A.G G.. ... C.. .GG ...
Reston_Philippine C.. .AT G.A ... A.C ... C A. ... CA. A.. C.. ... .C. CAC A.. ..C ... TC. TCA .A. ... ..C ... ... G.. ... GTC CAA .GA AA. ATT .G. T.. CAC C.. C.C ACC A.. A.. TCC GAG C.. .T. C.. ACG G.. ... C.. C.. G..
Marburg_67 GGC TTT CA. C.. C.A .GC CAC CCA CTC CC. CAC CA. .C. AAG CA. GCC .CA GCA ..A A.G A.A CAA .AC AGA .C. TTC C.A AGG T.. TGT .AC TGA .C. CA. CA. C.A AC. ACT GCA C.. CCA TGC C.C C.C AC. .CA C.A CTG CA. T
Mayinga_76 GTT CAA GTG CAC AGT CAA GGA AGG GAA GCT GCA GTG TCG CAT CTA ACA ACC CTT GCC ACA ATC TCC ACG AG T CCC CAA TCC CTC ACA ACC AAA CCA GGT CCG GAC AAC AGC ACC CAT AAT ACA CCC GTG TAT AAA CTT GAC ATC TCT GAG
Mekouka_94 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .C. ... ... ... ... ... ... ... ... . TT .G. C.. .C. .T. ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... C.. .C. ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ..C ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .C. ... . C. ... ... ... ... ... ... .TT ... C.. .C. ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .C. ... ... ... ... ... ... ... ... .TT ... C.. .C. ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .C. ... .C. ... ... ..A ... ... ... .TT ... C.. .C. ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ..G .C. ... .C. ... ... ..A ... ... ... .TT ... C.. .C. ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .C. ... . C. ... ... ..G ... ... ... .TT ... C.. .C. ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Makokou_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .C. ... . C. ... ... ..A ... ... ... .TT ... C.. .C. ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .C. ... .C. ... ... ..A ... ... ... .TT ... C.. .C. ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ..A ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .C. ... .C. ... ... ..A ... ... ... .TT ... C.. .C. ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .C. ... .C. ... ... ..G ... ... ... .TT ... C.. .C. ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... .. . .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .T. ... ... ... ... ... ... G.. ... ..T ... ... .CT ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ..G .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .C. ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Ekata_nov01 ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. G .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .CT ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. G .T. ... T.. ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .CT ... ... ... ... ... .A. ... ... ... .GG GC. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... . A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .T. ... T.. ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .CT ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
CH_Lossi_fev03 ... ... ... ... . A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... .CT ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Mbandza_jun03 ... ... ... ... .G. ... ..
GOR1_Odz_jun05 ... ... .. . ... .A. ... ..
GOR2_Odz_jun05 ... ... ... ... . A. ... ..
Côte d’Ivoire ... .. G A.. ..A .AC ATC AAG G.A A.G .AC A.. A.. C.A AC .AC .GG ..G GG. .TA C.. .CA A.. ..A CCC T.T .C. .TT .CA .TC .AT GCT .GC AAC A.T ..T C.T .C. .AA TCA TT. .TC GG. C.. G.G GGG .CC C.A GAA GAC C.C
Soudan_Maleo ... TC. T.. ... GTA .C. .A. G.. ... A.A A.. T.. C.. TC. .AG .AG ..A GAA .GT CG. .GA GT A GA. GTG AAT ..T CA G G.. A.T ATC A.A ..G .CA .CT G.A ACA .TC .T. GG. ACT A.C GGT AAC A.. ..G CAG ATC
Reston_Philippine ... TC. ... .T. .C. GC. ... C.. AC. .AG .A. A.. ... ACC .A. GG. ..T AAC .GA GAG .CA AT. ..A G.. TT. ACC G.G AA. C.. .TG .C. A.C ACC ATT .C. CCA ..T C.A ACC .TG ... AG. .A. GT. G.T AAC A.T G.A C.A AGT
Marburg_67 C.C T.C TAA ..A CAC .TC CA. GAA C.. CT. CAG CAC C.T .TC TGT ..T ..A AAA CA. CAC CAA .TA CGA CAC A.A G.G CA. AG. CAC TGA ... ... .TG ..C CCT CGA .AA CAA .CC TGC CTC .AA CA. G.A .TC T.A CCA CAG CAA AGA
Résultats
146
Figure 23 : suite
Mayinga_76 GCA ACT CAA GTT GAA CAA CAT CAC CGC AGA ACA GAC AAC GAC AGC ACA GCC TCC GAC ACT CCC TCT GCC ACG ACC GCA GCC GGA CCC CCA AAA GCA GAG AAC ACC AAC ACG AGC AAG AGC ACT GAC TTC CTG GAC CCC GCC ACC ACA ACA
Mekouka_94 ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... .C. ... ... A.. ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... .C. ... ... ... ... G.. A.. ... CT. ... ... ... ... ... ..A ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... G.T A.C ... CT. ... ... ... ... ... ..A ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... .C. ... ... A.. ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... .C. ... ... ... ... G.. A.. ... CT. ... ... ... ... ... ..A ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... .C. ... ... A.. ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... .C. ... ... ... ... G.. A.. ... CT. ... ... ... ... ... ..A ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... T.. .C. ... ... A.. ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... .C. ... ... ... ... G.. A.. ... CT. ... ... ... ... ... ..A ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... T.. .C. ... ... A.. ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... .C. ... ... ... ... G.. A.. ... CT. ... ... ... ... ... ..A ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... T.. .C. ... ... A.. ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... .C. ... ... ... ... G.. A.. ... CT. ... ... ... ... ... ..A ...
Makokou_dec01 ... ..C ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... T.. .C. ... ... A.. ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... .C. ... ... ... ... G.. A.. ... CT. ... ... ... ... ... ..A ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... T.. .C. ... ... A.. ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... .C. ... ... ... ... G.. A.. ... CT. ... ... ... ... ... ..A ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... T.. .C. ... ... A.. ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... .C. ... ... ... ... G.. A.. ... CT. ... ... ... ... ... ..A ...
Mvoula_jan03 ... .T. ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... C.. .C. ... ... A.. ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... .C. ... ... ... ... G.. A.. ... CT. ... ... ... ... ... ..A ...
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... G.. ... .C. ... ... ... ... ... ..G ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... G.. ... .C. ... ... ... ... ... ..G ...
GOR_Ekata_nov01 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... G.. ... .C. ... ... ... ... ... ..G ...
GOR1_Lossi_d ec02 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... G.. ... .C. ... ... ... ... ... ..G ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... G.. ... .C. ... ... ... ... ... ..G ...
CH_Lossi_fev03 ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .T. ... ... ... ... ... G.. ... .C. ... ... ... ... ... ..G ...
GOR_Mbandza_jun03
GOR1_Odz_jun05
GOR2_Odz_jun05
Côte d’Ivoire AGC ..C AC. CAG CCT GCC A.G AC. AC. ..C CA. CCA .C. A.. ... ... .AA ..G ACG ..A .TA AAC C. AA CAT CAG AG. CCT ..A GT. G.G ... CG. G. .. .T. CA. CC. C.C G.T C.C C.A CA. .AC AGA AA ... ..G C CG.
Soudan_Maleo T.C ..C ATC .GG AC. GG. .TG AG. TC. ..C CA. AT. CTG AGT TC. T.. C.G A.. ATG G.A ..A AGC C.T GA. ..T CAG A.. TCC A.A A.C T.C A.. CCA ..A .T .C. .GT GAT G.C CA. CGA .GA AC. AAC A.. A.. A.. GAG .A. CTC
Reston_Philippine G .AC A.C CGA AC. AC. ..G .. TC. .TT GA. ... TC. CC. CCA T.G ..G AG. A.. GAG A.A AT. .A. CAC T.. .AG ATG AAT ..G ATC C.. .GC TC. .. . ... T.C GC. C.. ... C.A C.G AC. AA. AC. A. ... .G. ..C CAC
Marburg_67 ... CAA AC. ACA CG. A.G GCC .CA .CA CA. CGG C.. C.A ATA T.A CA. TGG G.A TTT .AC .AG ..C C.. CAC C.. CA. C.. .AC .A. A.. .C. T.T TGT .TA TT TCA GAA ..A ..C GAA GTA TC. .CT GGA .GG AAG ..G ..A TGT TTC
Mayinga_76 AGT CCC CAA AAC CAC AGC GAG ACC GCT GGC AAC AAC AAC ACT CAT CAC CAA GAT ACC GGA GAA GAG AGT G CC AGC AGC GGG AAG CTA GGC TTA ATT ACC AAT ACT ATT GCT GGA GTC GCA GGA CTG ATC ACA GGC GGG AGA AGA ACT CGA
Mekouka_94 ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ..G ... G.. ...
Booue_96 ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. A.. ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... C .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. A.. ... ... ... ..A ... .GA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. A.. ... ... ... ..A ... .GA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. A.. A.. ... ... ... ..A ... .GA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Makokou_dec01 ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. A.. ... ... ... ..A ... .GA . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. A.. ... ... ... ..A ... . GA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. A.. ... ... ... ..A ... .AA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. A.. ... ... ... ..A ... . GA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... . .. T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ..G ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ..G ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Ekata_nov01 ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... G.. ... ... ... ..G ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ..G ... . .G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ..G ... ..G ... G.. ... ... ... ... ... ... . .. ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ...
CH_Lossi_fev03 ... ... ... ... T.. ... .?. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ... ..G ... ..G ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... . .. ...
GOR_Mbandza_jun03
GOR1_Odz_jun05
GOR2_Odz_jun05
Côte d’Ivoire .C. TGG ... G.. A.. CC. A.C CA. T.C CAG ... .G. C.. TGC .GC ..G TGC AT. C.A A.. .CC .T. CAC C.. GA. GA. A.T GGA .CT ... ..C C.G ..G ..C ..A ..A CGG ..G ..G A.. AAT ..C C.G ... ..A TCC ... ... .GC ..
Soudan_Maleo TCC TGG .TC ... A.. .. A.. C.. A.. CT. .C. .C. C.G .GA ATA T.A ... . CG GTT AA. ACT .TT T.G ..A CAA GA. ACA .GC AAC ..T C.. ..A ..T TCA ..A G.A A.A ..T A.T CTT ..G AGC C.T GG. CTT C. .A. .CG .GC A..
Reston_Philippine ..C AT. . CC G.T G.. CC AG. C.. ..A A.A G.. GG. ... .GC AGC A.A . . .GA ... A.C CC. .GA ..C ..A GC. GAA A.T C.. .CC ..A ..C .C. .TA ... ..A G.A AG. AAG ..A ..T .AT TCA C.G .GT CC. ACC ..G .A. .AA A.C
Marburg_67 CT. TT. TGG .CG GGT TAA T.T G.T C.A ATT G.T TTG .T. CAG TTC ..A AC. A.G ..G ATC TTT ..T GAA T.T TCT .CT ..T GCT TCG .CT GA. .GA T.A .CA TGC C.C C.C CA. TAT CAG TTT AAC T.T .TC CTA CTA .T. TA. TGA AA.
Résultats
147
Figure 23 : suite
Mayinga_76 AGA GAA GCA ATT GTC AAT GCT CAA CCC AAA TGC AAC CCT AAT TTA CAT TAC TGG ACT ACT CAG GAT GAA GGT GCT GCA ATC GGA CTG GCC TGG ATA CCA TAT TTC GGG CCA GCA GCC GAG GGA ATT TAC ATA GAG GGG CTA ATG CAC AAT
Mekouka_94 . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ..T ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ..G ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ..G ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ..G ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... T.. ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ..G ... ... ..A
Mendemba_B_oct01 ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... T.. ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ..G ... ... ..A
Etakangaye_dec01 ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... T.. ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ..G ... ... ..A
Makokou_dec01 ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... T.. ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ..G ... ... ..A
Olloba_dec01 ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ..G ... ... ..A
Entsiami_jan02 ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ..G ... ... ..A
Mvoula_jan03 ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ..G ... ... ..G
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... T.. ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. . .. ... ... ... ... ...
GOR_Ekata_nov01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_de c02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ..C ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
CH_Lossi_fev03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... C.. ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
GOR_Mbandza_jun03
GOR1_Odz_jun05
GOR2_Odz_jun05
Côte d’Ivoire ..G ..T .TC .C. CC. ... A.A ... ... ... ... ... .. A ..C C.G ..C ..T ... ..A G.C TT. ... ..G ... ... ..C ..A ..T T.A ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ..T ... ... ... ... .CT ..A ..C A.. ... G.G ...
Soudan_Maleo ... C.. .TT .AC AC. .GG ..C ACG GGT ... ... ..T ..C ..C ... ..C ... ... ... G.A ..A ..A C.. CA. AA. ..T GCT ..G A.T ... ... ..C ..G ..C ..T ..A ..G .GT ..A ..A ..C ..A ... .CT ..A ..C ..T ... ... ..C
Reston_Philippine GAT CGG TTC GAC AA ..C A .C GCT AAT ... ..T ... ..A G.. C.T ..C ..T ... ..A G.. GTT ... ..G ..G ..A ... G.A ... T.. ..A ... ..T ... ... ..T ..A ..T ... ..A ..A ..C ..C ... ..T ... ..T G.. ... ..T ...
Marburg_67 CAC TGC CT. C.C TGG ..A ATG AG. A.G .TT GTG .TG .AG .G. .A. G .A .TT G.A G.G TTC AG. AGG ATG ACC TGG CAG CAG ..C TCA .TT G.A TAC .GT .T. ..G .CC .TG .A. T.G A.. .AC T.. ATA C.G CT. .TT TA. T.A A.A .CC
Mayinga_76 CAA GAT GGT TTA ATC TGT GGG TTG AGA CAG CTG GCC AAC GAG ACG ACT CAA GCT CTT CAA CTG TTC CTG AG A GCC ACA ACT GAG CTA CGC ACC TTT TCA ATC CTC AAC CGT AAG GCA ATT GAT TTC TTG CTG CAG CGA TGG GGC GGC ACA
Mekouka_94 ... ... ... ... ... ... ..G ... ..A ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ..G ... ..A ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ..G ... .. A ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ..G ... ..A ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... .. . ... ..G ... ..A ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ..G ... ..A ... ... ... ..C .. . ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... .. G ... ..A ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Makokou_dec01 ... ... ... ... ... ... ..G ... ..A ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ..G ... ..A ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ..G ... ..A ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. .
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... ..G ... ..A ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... .. . ... ... ..A ... ..G ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ..A ... ..G ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Ekata_nov01 ... ... ... ... ... ... ..A ... .. G ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ..A ... ..G ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ..A ... .. G ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
CH_Lossi_fev03 ... ... ... ... ... ... .. A ... ..G ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Mbandza_jun03
GOR1_Odz_jun05
GOR2_Odz_jun05
Côte d’Ivoire ... A.. ..A ..G ... ... ..A ... ..G ... ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... T.. ... T.A ..G ..A ..T ... ... T.G ..T ..A ..C ..T ..A ..A ..T ..G ..A ... ..A ..C ... ... ..C ..A A.. ... ..A ..A ...
Soudan_Maleo ... A.. .CC ... G.. ... ..A C.C ... ..A ..T ..A ..T ..A ..A ... ... ... ..G ..G ..T ... T.A ..G ... ..G ..G ... ..G .. G ..A .A. A.C ..A ... ..T A.G ... ..C ..A ... ... C.T ... .GA ... ... ... ..G ...
Reston_Philippine ..G A.. ..G C.T ..T ..C ... C.A C.T ... ..A ... ..T ..A ..T ... ..G ... ... ... T.A ..T ... C.G ... ... ..A ..A ..G A.G ..T .AC ... C.T ..T ... A.A ..A ..T ... ... ..T C.T ..T ..A ... ... ..A ..T ..C
Marburg_67 A.. ACA AT. .GG TCT GCA ..T .GA G.C GTC TA. C.A .T. A.A CT. C.A A.T C.. TGG A.C TCT .AT TAA GAG T.A CA. C.G AG. AA. G.A CAT ... C.T TAA T.A .TA GAC .T. C.. T.G AC. ... .AC TCA ..A G.T G.. .AG .AA CAT
Résultats
148
Figure 23 : suite
Mayinga_76 TGC CAC ATT CTG GGA CCG GAC TGC TGT ATC GAA CCA CAT GAT TGG ACC AAG AAC ATA ACA GAC AAA ATT GAT CAG ATT ATT CAT GAT TTT GTT GAT AAA ACC CTT CCG GAC CAG GGG GAC AAT GAC AAT GG TGG ACA GGA TGG AGA CAA
Mekouka_94 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..A ... ... ... ..G
Kikwit_95 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..A ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..A ... ... ... ..G
Mayibout_96 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..A ... ... ... ..G
Mendemba_A_oct01 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..A ... ... ... ..G
Mendemba_B_oct01 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..A ... ... ... ..G
Etakangaye_dec01 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..A ... ... ... .. G
Makokou_dec01 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..A ... ... ... ..G
Olloba_dec01 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..A ... ... ... ..G
Entsiami_jan02 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..A ... ... ... ..G
Mvoula_jan03 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... .. G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..A ... ... ... ..G
Mbandza_nov03 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..T ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..T ... ... ... ...
GOR_Ekata_nov01 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..T ... ... ... ...
GOR1_Lossi_d ec02 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..T ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..T ... ... ... ...
CH_Lossi_fev03 ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ..T ... ... ... ...
GOR_Mbandza_jun03
GOR1_Odz_jun05
GOR2_Odz_jun05
Côte d’Ivoire ..T ... ... ..A ..G ..T ..T ..T ..C ..T ... ..C ..A ... ... ... ..A ..T ..C ..T ..T ... ... ... .. A ..A ..C ... ..C ... ..C ... ..T .AT ... ..A A.T ... AAT ..T GGC AG. ..C T.. ... ..T ... ... .A. ...
Soudan_Maleo ..T AGG ..C ... ... ..A ..T ..T ..C ..T ..G ... ... ... ... ... ..A ... ..C ..T ..T ... ..C A.C ..A ..C ..C ... ... ..C A.C ..C ..C C.T T.A ..C A.T ... .AT A.T G.. ..T ... T.. ... ..G ..C ... ... ..G
Reston_Philippine ..T .GA ..C ..A ... ..A TCT ..T ..C ..T ..G ... ... ... ... ..A ..A ..T ..T ..T ..T G.. ... A.C ..A ... .AA ... ..C ... A.. ..C ..T C.. ..A ..A ... ..C ..A ..T G.. CTT ... CTA ... ... ..T ... ... ...
Marburg_67 GCA A.G TGC T.. .AC .T. ATT GTT GCA T.G ... TAG A.G AC. ..T C.A GGA .TA T.T CGG A.. ... T.G ACC A.A TCA .AA A.G A .GA ACA A.A .G. GGG GAC TG. TT GG. .TC T.G GTG .TA ... G.T G.A CAG ACT G.. GTG TTC
Mayinga_76 TGG ATA CCG GCA GGT ATT GGA GTT ACA GGC GTT ATA ATT GCA GTT ATC GCT TTA TTC TGT ATA TGC AAA T TT GTC TTT TAG TTT TTC TTC AGA TTG CTT CAT GGA AAA GCT CAG CCT CAA ATC AAT GAA ACC AGG ATT TAA TTA TAT GGA
Mekouka_94 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... .CC ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... .CC ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... . CC ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... .CC ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... .CC ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... .CC ... ... ... ... ... ...
Makokou_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... .CC ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... . .. ... ... .CC ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... .CC ... ... ... ... ... . ..
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... .CC ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..G .TT ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... .
GOR_Ekata_nov01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..G .TT ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..G .TT ... ... ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ..G .TT ... ... ... ... ... ...
CH_Lossi_fev03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..G .TT ... ... ... ... . .. ...
GOR_Mbandza_jun03
GOR1_Odz_jun05
GOR2_Odz_jun05
Côte d’Ivoire ... G.T ..T ..T ..A ..A ... A.C ... ..A ..A ..C ... ..T A.. ..T ... ..G C.G ..C ..T ... ... ..C A.G C.. .GA AC. AAT A.A GC. .CA TAC TT. C T ..T AT. .CC ..A AT. TGA .T. TTG TTT TC. ... .T. ..T A.. .AT
Soudan_Maleo ... ..C ..T ... ..A ..A ..C A.. ..T ..A A.. ..T ... ... A.C ..T ... C.T C.T ..C G.C ... .. G C.G C.T .G. .GA A.A .CA ACT T.. A.C A.. A.. T T ... .T. G.T A.A TTT C.A .CA TT. TAA .TT ..A ATC .G. ... TA
Reston_Philippine ... ..C ... ..T ..A ... .. G A.. .TT ..A ... ... ... ..T A.A ..A ..C C.. C.T ... ... ..T ..G A.. T.G .G. .GA
Marburg_67 .TA C.. A.T TGG .CA T.. T.C TAC TAT TAT CCA TAG C.G T.T TGA T.G CTC .AT CCT GTA T.T GT. GT. .C. T.A CCA A.T A.A .CG GGT .A
Résultats
149
Figure 23 : fin
Mayinga_76 TTA CTT GAA TCT AAG ATT ACT TGA C AA ATG ATA ATA TAA
Mekouka_94 .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
Mayibout_96
Mendemba_A_oct01 .T. ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ..G ...
Mendemba_B_oct01 .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
Etakangaye_dec01 .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
Makokou_dec01 .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
Olloba_dec01 CT. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
Entsiami_jan02 .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
Mvoula_jan03 .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ...
Mbandza_nov03 .C. ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ...
Etoumbi_mai05
GOR_Ekata_nov01 .C. ... ... .T. ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR2_Lossi_dec02 .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
CH_Lossi_fev03 .C. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_Mbandza_jun03
GOR1_Odz_jun05
GOR2_Odz_jun05
Côte d’Ivoire A.. TCC TCT GTA C.C C.C ... AAT GT. C.C GAG CAT A.T
Soudan_Maleo A.. ... ... AA. ... GC. .A. GCC A.. T.C TGT GCC A..
Reston_Philippine
Marburg_67
Résultats
150
b. Cas des gorilles de Lossi
En décembre 2002, deux carcasses de gorilles ont été trouvées dans la forêt du
Sanctuaire de Lossi. Elles étaient situées à quelques mètres l’une de l’autre et appartenaient
certainement au groupe de gorilles qui habite cette partie de la forêt. Leur état de
décomposition suggérait des dates de décès très proches, et par conséquent des infections
simultanées.
Lors de l’alignement des séquences codant le gène de la GP partielle de toutes les
séquences (Figure 23), des substitutions nucléotidiques ont été observées entre les
séquences issues de ces deux carcasses. L’alignement des deux séquences met en évidence
11 substitutions qui entraînent 5 modifications dans les séquences prédites d’acides aminés
(Tableau IX et Figure 24).
La présence de deux souches différentes dans les carcasses suggère que les animaux
n’ont pas été contaminés par la même source.
Tableau IX : Substitutions nucléotidiques et aminoacides entre les deux séquences de la GP issues des
gorilles 1 et 2 de Lossi, RC.
Nucléotide* GO1 GO2
849 ACA Thr T ACT Thr T
867 GCC Pro P GCT Pro P
886 AAC Asn N TAC Tyr Y (296)
996 ACC Thr T ACG Thr T
1006 ACT Thr T TCT Ser S (336)
1163-64 AGG Arg R ACC Thr T (388)
1165-66 GCT Ala A CAT His H (389)
1447 ACC Thr T GCC Ala A (483)
1998 ATC Ile I ATT Ile I
*Numérotation à partir du 1er nucléotide de l’amplicon et du 1er acide aminé de la séquence prédite.
Résultats
151
Figure 24 : alignement des séquences nucléotidiques des gorilles 1 et 2 de Lossi. Les substitutions sont
surlignées en jaune. Les changements d’acides aminés sont indiqués au-dessus des séquences.
GOR1_Lossi_dec02 ATG GGT ATT ACA GGA ATA TTG CAG TTA CCT CGT GAT CGA TTC AAG AGG ACA TCA
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 TTC TTT CTT TGG GTA ATT ATC CTT TTC CAA AGA ACA TTT TCC ATC CCA CTT GGA
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 ATC ATC CAC AAT AGC ACA TTA CAA GTT AGT GAT GTC GAC AAA CTA GTT TGT CGT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GAC AAA CTG TCA TCC ACA AAT CAA TTG AGA TCA GTT GGA CTG AAT CTC GAA GGG
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 AAT GGA GTG GCA ACT GAC GTG CCA TCT GCA ACT AAA AGA TGG GGC TTC AGG TCC
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GGT GTC CCT CCA AAG GTG GTC AAT TAT GAA GCT GGT GAA TGG GCT GAA AAC TGC
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 TAC AAT CTT GAA ATC AAA AAA CCT GAC GGG AGT GAG TGT CTA CCA GCA GCG CCA
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GAC GGG ATT CGG GGC TTC CCC CGG TGC CGG TAT GTG CAC AAA GTA TCA GGA ACG
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GGA CCG TGT GCC GGA GAC TTT GCC TTC CAC AAA GAG GGT GCT TTC TTC CTG TAT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GAT CGA CTT GCT TCC ACA GTT ATC TAC CGA GGA ACG ACT TTC GCT GAA GGT GTC
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GTT GCA TTT CTG ATA CTG CCC CAA GCT AAG AAG GAC TTC TTC AGC TCA CAC CCC
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 TTG AGA GAG CCG GTC AAT GCA ACG GAG GAC CCG TCC AGT GGC TAC TAT TCT ACC
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 ACA ATT AGA TAT CAG GCT ACC GGT TTT GGA ACC AAT GAG ACG GAG TAC TTG TTC
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GAG GTT GAC AAT TTG ACC TAC GTC CAA CTT GAA TCA AGA TTC ACG CCA CAG TTT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 TTG CTC CAG CTG AAT GAG ACA ATA TAT GCA AGT GGG AAA AGG AGC AAC ACC ACG
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
N 296 Y
GOR1_Lossi_dec02 GGA AAA CTA ATT TGG AAG GTC AAC CCC GAA ATT GAT ACA ACA ATC GGG GAG TGG
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ...
Résultats
152
Figure 24 : suite T 336 S
GOR1_Lossi_dec02 GCC TTC TGG GAA ACT AAA AAA AAC CTC ACT AGA AAA ATT CGC AGT GAA GAG TTG
GOR2_Lossi_dec02 ..T ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 TCT TTC ACA GCT GTA TCA AAC GGA GCC AAA GAC ATC AGT GGT CAG AGT CCG GCG
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 CGA ACT TCT TCC GAC CCA GAG ACC TAC ACA ACA ACT GGA GAC CAC AAA ATC ATG
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GCT TCA GAA AAT TCC TCT GCA ATG GTT CAA GTG CAC AAT CAA GGA AGG GAA GCT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GCA GTG TCG CAT CTG ATA ACC TTT GCC ACA ATC TCC ACG AGT CCT CAA TCC CCT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
RA 388-9 TH
GOR1_Lossi_dec02 ACA ACC AAA CCA GGT CAG GAC AAC AGC AGG GCT AAT ACA CCC GTG TAT AAA CTT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... .CC CA. ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GAC ATC TCT GAG GCA ACT CAA GTT GAA CAA CAT CAT CGC AGA ACA GAC AAC GAC
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 AGC ACA GCC TCC GAC ACT CCC CCC GCC ACG ACC GCA GCC GGA CCC CCA AAA GCA
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GAG AAC ATC AAC ACG AGC AAG AGC GCT GAC TCC CTG GAC CCC GCC ACC ACG ACA
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 AGT CCC CAA AAC TAC AGC GAG ACC GCT GGC AAC AAC AAC ACT CAT CAC CAA GAT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
T 483 A
GOR1_Lossi_dec02 ACC GGA GAA GAG AGT GCC GGC AGC GGG AAG CTG GGC TTG ATT ACC AAT ACT ATT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GCT GGA GTC GCA GGG CTG ATC ACA GGC GGG AGA AGA ACT CGA AGA GAA GCA ATT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GTC AAT GCT CAA CCC AAA TGC AAC CCC AAT CTA CAT TAC TGG ACT ACT CAG GAT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GAA GGT GCT GCA ATC GGA TTG GCC TGG ATA CCA TAT TTC GGG CCA GCA GCC GAG
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GGA ATT TAC ACA GAG GGG CTA ATG CAC AAT CAA GAT GGT TTA ATC TGT GGA TTG
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 AGG CAG CTG GCC AAT GAG ACG ACT CAA GCT CTT CAA CTG TTC CTG AGA GCC ACA
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 ACT GAG CTA CGC ACC TTT TCA ATC CTC AAC CGT AAG GCA ATT GAT TTC TTG CTG
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Résultats
153
Figure 24 : fin
GOR1_Lossi_dec02 CAG CGA TGG GGC GGC ACA TGC CAC ATT TTG GGA CCG GAC TGC TGT ATC GAA CCA
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 CAT GAT TGG ACC AAG AAC ATA ACA GAC AAA ATT GAT CAG ATT ATT CAT GAT TTT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GTT GAT AAA ACC CTT CCG GAC CAG GGG GAC AAT GAC AAT TGG TGG ACT GGA TGG
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 AGA CAA TGG ATA CCG GCA GGT ATT GGA GTT ACA GGC GTT ATA ATT GCA GTT ATC
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
GOR1_Lossi_dec02 GCT TTA TTC TGT ATA TGC AAA TTT GTC TTT TAG TTT TTC TTC AGA TTG CTT CAT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GGC AAA GCT CAG CCT CAA ATC AAT GAG ATT AGG ATT TAA TTA TAT GGA TCA CTT
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR1_Lossi_dec02 GAA TCT AAG ATT ACT TGA CAA ATG ATA ATA TAA
GOR2_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Résultats
154
III.2. Séquences du gène codant la nucléoprotéine
Un autre fragment (1448 des 2216 nt) a été amplifié et séquencé. Il se situe dans la
région codante de la NP, gène moins variable que celui de la GP et exprimé en plus grande
quantité.
Les séquences inédites de la NP ont été déposées dans la banque de gènes sous les
numéros d’accession suivants : EU051639 (Mayibout_96) ; EU05164
(Mendemba_A_oct01) ; EU051641 (Mendemba_B_oct01) ; EU051642
(Etakangaye_dec01) ; EU051643 (Olloba_dec01) ; EU051645 (Mvoula_jan03) ;
EU051644 (Entsiami_jan03) ; EU051646 (Yembelengoye_jan03) ; EU051647
(Etoumbi_mai05) ; EU051648 (Mbandza_nov03) ; EU051649 (GOR1_Lossi_dec02) ;
EU051650 (GOR2_Odz_jun05)
La comparaison deux à deux des séquences codant pour la NP montre que toutes les
souches sont différentes, ainsi qu’on l’a vu avec les séquences de la GP. De même,
l’alignement des séquences met en évidence des substitutions communes à toutes les
souches d’un groupe comparé à la substitution commune aux souches de l’autre groupe
(Figure 25). Sur l’alignement de la figure 25, les signatures nucléotidiques sont surlignées,
et les modifications d’acide aminé consécutives sont indiquées au-dessus des séquences.
Ainsi, 15 substitutions nucléotidiques qui entraînent 5 modifications d’acides aminés
peuvent être recensées (Tableau X).
Cependant, la composition des groupes a changé. En effet, les séquences composant le
groupe A qui partagent le même nucléotide à un site donné sont restreintes pour le gène de
la NP aux seules séquences humaines isolées entre 1976 et 1996 (en vert sur la figure). Les
séquences issues des épidémies humaines de 2001 à 2003 (en bleu) partagent maintenant
les mêmes substitutions que les séquences d’origine animale (en rouge). Un troisième
groupe est donc formé, le groupe R, qui est composé des séquences humaines
Mendemba_A_oct01, Mendemba_B_oct01, Makokou_dec01, Etakangaye_dec01,
Entsiami_jan02, Olloba_dec01 et Mvoula_jan03.
Résultats
155
Tableau X : Signatures moléculaires nucléotidiques entre les séquences du groupe A et les séquences des
groupes B et R.
Nucléotide* Groupe A Groupes B + R
231 GTA Val V GTC Val V
291 ACC Thr T ACT Thr T
468 AGT Ser S AGC Ser S
507 CAA Gln Q CAG Gln Q
528 GAG Glu E GAA Glu E
558 GAG Glu E GAA Glu E
717 GCG Ala A GCA Ala A
981 AAT Asn N AAC Asn N
986 TCG Ser S TTG Leu L (329)
1082 CAC His H CGC Arg R (361)
1122 AAT Asn N AAC Asn N
1129 AGA Arg R GGA Gly G (377)
1224 AGC Ser S AGT Ser S
1268 GGA Gly G GAA Glu E (423)
1356 CAA Gln Q CAG Gln Q
Numérotation à partir du 1er nucléotide de l’amplicon et 1er acide aminé de la séquence
prédite.
Résultats
156
Figure 25 : Alignement des séquences partielles codant pour la nucléoprotéine (NP, 1448 nt). Les substitutions de nucléotides sont surlignées en jaune. Trois groupes
peuvent être distingués : en vert, le groupe A composé de souches humaines apparues entre 1976 et 1996 ; en rouge, le groupe B contenant les souches isolées de
carcasses animales et les souches responsables des deux dernières épidémies humaines ; en bleu, le groupe R composé de souches humaines isolées entre 2001 et
2003. En noir sont les séquences d’autres espèces (REBOV et SEBOV). Les points correspondent aux identités de nucléotides. Les changements entraînés par les
substitutions de nucléotides dans la séquence aminoacide prédite sont localisés au dessus de l’alignement et indiquent la position de l’acide aminé muté. Mayinga_76 AGG CAA ATT CA A GTA CAT GCA GAG CAA GGA CTG ATA CAA TAT CCA ACA GCT TGG CAA TCA GTA GGA CAC ATG ATG GTG ATT TTC CGT TTG ATG CGA ACA AAT TTT CTG ATC AAA TTT CTC CTA ATA CAC CAA GGG ATG CAC ATG GTT GCC
Mekouka_94 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Yembelengoye_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... A.. ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Et oumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_A_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_B_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... T.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Soudan ... ..G ... .. G ..C ... ... ..A ... ..G ..C ..T ... ... ... ..T T.C ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... A.. ... ..C ... T.A ... ..G ..C ..A ... ... ..T ..G ... ... ... ... ..C ..A
Reston C.A ... ... ..G ..T ... ... ..A ..G ..T T.A ..T ... ... ..C ..T ..A ... ... ... ..T ... ... ... ... ..A ..C ... A.A ... ... A.G ..T ... ..C T.. ..T ... .A. T.A ..G ..C ... ..G ..T ... ..T ... ..A ..T
Mayinga_76 GGG CAT GAT GCC AAC GAT GCT GTG ATT TCA AAT TCA GTG GCT CAA GCT CGT TTT TCA GGC TTA TTG ATT GTC AAA ACA GT A CTT GAT CAT ATC CTA CAA AAG ACA GAA CGA GGA GTT CGT CTC CAT CCT CTT GCA AGG ACC GCC AAG GTA
Mekouka_94 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... .. A ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ..T ... ...
Kikw it_95 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ...
Entsiam i_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ...
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ...
Yembelengoye_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ...
GOR_A_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... .. C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ...
GOR_B_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ...
Soudan ..C ... ... ..G ..T ..C A.A ..A ..A ..T ... ..T ..T ..C ... ..A A.G ..C ..T ..T C.T C.. ... ..A ..G ..T ..T ..G ..C ..C ... ... ... ..A ... ..T .TT ... ..A ..A ..T ... ..A ..G ..C ... ..A ..A ..A ..C
Reston ..C ..C ... ... .. T ... ... ..C ... G.T ... ... ..T ... ..G ... ..C ... ... ..A C.C C.A ... ... ... ..C ..T ... ... ... ..T ..G ..G ..A ..C ..C .A. ... ..A A.A ..T ..C ... T.G ..C C.A ..A ... ..A ..G
Mayinga_76 AAA AAT GAG GTG AAC TCC TTT AAG GCT GCA CTC AGC TCC CTG GCC AAG CAT GGA GAG TAT GCT CCT TTC GCC CGA CTT TTG AAC CTT TCT GGA GTA AAT AAT CTT GAG CAT GGT CTT TTC CCT CAA CTA TCG GCA ATT GCA CTC GGA GTC
Mekouka_94 ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ...
Yembelengoye_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ... . .. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_A_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_B_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Soudan ..G ... ... ..C .GT ..A ..C ... ..A ..T ..T G.. ..A ..T ... ... ... ... ..A ... ... ..A ..T ..A ..T ..C C.C ..T ... ... ... .. C ..C ..C T.G ..A ... ..G ... .AT ..A ... ..C ..A ..C ... ..T T.G ..T ..T
Reston CGT ... ... ..T ..T G.A ... ... ..C ..C ..A ... ..A ..T ..T ... ... ..G ... ... ..C ... ..T ..T ..C ... C.C ..T ..C ..G ... ..T ..C ..C ..A ..A ... ... .. C .A. ..A ..G T.. ..A ... ... ..T ..T ... ..T
Résultats
157
Figure 25 : suite
Mayinga_76 GCC ACA GCA CAC GGG AGT ACC CTC GCA GGA GTA AAT GTT GGA GAA CAG TAT CAA CAA CTC AGA GAG GCT GCC ACT GAG GCT GAG AAG CAA CTC CAA CAA TAT GCA GAG TCT CGC GAA CTT GAC CAT CTT GGA CTT GAT GAT CAG GAA AAG
Mekouka_94 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Yembelengoye_jan03 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_A_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_B_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Soudan ..A ..T ..C ... ... ..C ..G ..G .. T ..T ..T ... ..A ..G ..G ..A ... ..G ... ..G C.T ... ... ..T ... ..A ... ..A ... ... ... ... ... ... ..T ..A A.A ..T ..G T.G ... A.C ... ..G ... ... ..A ... ... ...
Reston ... ... ... ..T ..T ..C ... ..T ... ... ..T ... ... ..T ..G ... ... ..G ..G ..T ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ..C A.A ... ..C ... AGC ..A ..C ..A ..C ... ... ... .GA
Mayinga_76 AAA ATT CTT ATG AAC TTC CAT CAG AAA AAG AAC GAA ATC AGC TTC CAG CAA ACA AAC GCT ATG GTA ACT CTA AGA AAA GAG CGC CTG GCC AAG CTG ACA GAA GCT ATC ACT GCT GCG TCA CTG CCC AAA ACA AGT GGA CAT TAC GAT GAT
Mekouka_94 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .AG ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .AG ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Yembelengoye_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_A_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_B_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Soudan ..G ... ..C ... .G. ... ..C ... .. G ... ..T ..G ... ... ... ... ... ..T ... ..A ... ... ..C ..G ..G ... ... ..G ... ... ..A ... ..C ... ..C ... ..G A.. ..A ... AA. AT. ..G GTT G.A .AT .G. ..T CC. ...
Reston .G. ..A ..A ... ... ... ... ... ..G ..A ..T ... ..T ..T ... ... ..G ..C ..T ..A ... ... ..C ..T ..G ... ... ..A ... ..T ..A T.A ... ... ... ..A ..G CTG ..C ... AGA ..T ..C CTC G.G TCT AGA C.A ..C ..C
Mayinga_76 GAT GAC GAC ATT CCC TTT CCA GGA C CC ATC AAT GAT GAC GAC AAT CCT GGC CAT CAA GAT GAT GAT CCG ACT GAC TCA CAG GAT ACG ACC ATT CCC GAT GTG GTG GTT GAT CCC GAT GAT GGA AGC TAC GGC GAA TAC CAG AGT TAC TCG
Mekouka_94 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ..A ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Yembelengoye_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ... .. . ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_A_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_B_Odz_jun05 ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Soudan ..C A.T ..T ... ..A ... ..C ..G .. G ... T.. ... ..A AC. C.C ..C AA. .C. TCT ... ... A.. ..T GA. ..T ... .GT ... ..A ..T ..C ..A .G. .GT ..T ... ..C ..G T.. ... .AT GAG AGT AAT A.T ..T .CT GAC ... G-A
Reston ..C A.T ..A ..A ..G ..C ..T ..G ..T ..A .GC A.C A.. CCA G.C .AA .AT ... .TG ..G ... ... ..T .GA ... ..C AGA ..C ..T .T. ... ..T A.. AGT .CA A.. ..C ... ..G ... ..T GAT .TT .AA A.T ... A.T G.C ..T CAT
Résultats
158
Figure 25 : suite
S502L
Mayinga_76 GAA AAC GGC ATG AAT GCA CCA GAT GAC TTG GTC CTA TTC GAT CTA GAC GAG GAC GAC GAG GAC ACT AAG CCA GTG CCT AAT AGA TCG ACC AAG GGT GGA CAA CAG AAG AAC AGT CAA AAG GGC CAG CAT ATA GAG GGC AGA CAG ACA CAA
Mekouka_94 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ..T ... .C. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ..T ... .CA ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ..T ... .C. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ... ... ..T ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ..T ... .C. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... .T. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... .T. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... .T. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... .T. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... .T. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... .T. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Yembelengoye_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... .T. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... .T. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ..T ... .C. ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... .T. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
GOR_A_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... .T. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
GOR_B_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... .T. ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ...
Soudan .G. TT. ... -.. ..G ... ... .GA .. T C.T .AT ..C ... A.. T.G ... ..C ... ..T ..C ... .GC C.A ... .GA ..- .CC ... CA. G-- -G. .CA .AG ... GGA ... .G. G.C TCG G.C ACA TG. .C. CC. AGA TC. GAC .G. ..G G.G
Reston ..T G.T .AA G.T GGG A.G G.. .G. ... ... ... T.G ... ... ..T ... ..T C.T ..G ..T ... .A. ..A G.T TGA G.. .CA G.. CA. CT. .CC ACA ATC .C. A.. GGA ..T ..- --. G.. A.A A.. AT. .AT TCA TC. .CC ... G.. AC.
H534R R550G
Mayinga_76 TCC AGG CCA ATT CAA AAT GTC CCA GGC CCT CAC AGA ACA ATC CAC CAC GCC AGT GCG CCA CTC ACG GAC AAT GAC AGA AGA AAT GAA CCC TCC GGC TCA ACC AGC CCT CGC ATG CTG ACA CCA ATT AAC GAA GAG GCA GAC CCA CTG GAC
Mekouka_94 ... ... ... .C. ... ... A.. ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ..A ... ..C ... ... ... ... ..T ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ...
Kikwit_95 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ..T ..T ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ...
Booue_96 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ..T ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ...
Mayibout_96 ... ... ... .C. ... ... A.. ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ..A ... ..T ... ... ... ... ..T ... ... A.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_A_oct01 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ..C ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mendemba_B_oct01 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ..C ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etakangaye_dec01 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ..C ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Olloba_dec01 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ..C ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Entsiami_jan02 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ..C ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mvoula_jan03 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ..C ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Yembelengoye_jan03 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ..C ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Mbandza_nov03 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ..C ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Etoumbi_mai05 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ..C ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_A_Lossi_dec02 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ..C ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
GOR_B_Odz_jun05 ... ... ... .C. ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ..C ... ... G.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
Soudan CGA .AA AGG TGC .GG .G. AC. ... . . T T.C ... CA. C.. .A. .T. ... AT. .CC AA. ..G GGT T.A A.. .CC A.. CA. CC. C.A .G- --. AAT ATG ... T.T .CT .TC .AG .GT A.. ..C ..T ..A C.G ... ..A T.. ..G ..C GAT ..T
Reston A.A ... A.G .C- --. .TC .C. T.. .A. AAC A.T CA. CA. --T ..G ..G ATT CTG AG. AAC AAG .A. .T. ... A.A CAG GC. CCG AGG ... AGA ACG ..G ... GC. AA. ..A .GA ..C T.. ... G.G C.. ... ... .AC AC. ..T A.A ..T
G596E
Mayinga_76 GAT GCC GAC GAC GAG ACG TCT AGC CTT CCG CCC TTG GAG TCA GAT GAT GAA GAG CAG GAC AGG GAC GGA ACT TCC AAC CGC ACA CCC ACT GTC GCC CCA CCG GCT CCC GTA TAC AGA GAT CAC TCT GAA AAG AAA GAA CTC CCG CAA GAC
Mekouka_94 ... ... ... ... ..A ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... ... .G. ..C ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
Kikwit_95 ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... C.. ... ... ..C ... ... ..A ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .G. ... ... ... ... ..T
Booue_96 ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ... ... .G. .G. ..C ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
Mayibout_96 ... ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ... ... ... ... ... ..A ... ..A ... ... ... ... .G. ..C ... ..T ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
Mendemba_A_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ..A ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
Mendemba_B_oct01 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ..A ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
Etakangaye_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ..A ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... .GT
Olloba_dec01 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ..A ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
Entsiami_jan02 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ..A ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
Mvoula_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ..A ... ... ... ... .A. ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
Yembelengoye_jan03 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ..A ... ... ... ... .A. ..C ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
Mbandza_nov03 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ..A ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
Etoumbi_mai05 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ..A ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
GOR_A_Lossi_dec02 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ..A ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
GOR_B_Odz_jun05 ... ... ... ... ... ... ... ..T ... ... ... ... ... ... ..C ... ... ..A ... ... ... ... .A. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ..T
Soudan C.G AAA ..T ..T ..T GAC GAG ..T ..C A.A T.. C.T ..C ..T ..A .G. ..C ..A G.T .TT GA. AG. .T. T.A GGG G.G AA. .AC ..A ... ..A ..T ... .. A ..A ..A ..C ... .A. ... - .. .G - ..G T.. .C. CT. A.. A- . ... A.T
Résultats
159
Figure 25 : fin
Mayinga_76 GAG CAA CAA GAT CAG GAC CAC ACT CAA GAG GCC AGG AAC CAG GAC AGT GAC AAC ACC CAG TCA GAA CAC TCT TTT GAG GAG ATG TAT CGC CAC ATT
CT
Mekouka_94 ... .GA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
Kikwit_95 ... ..A ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
Booue_96 ... .GA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
Mayibout_96 ... .GA ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
Mendemba_A_oct01 ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
Mendemba_B_oct01 ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
G.
Etakangaye_dec01 ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
Olloba_dec01 ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
Entsiami_jan02 ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... G.. ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
Mvoula_jan03 ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
Yembelengoye_jan03 ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
Mbandza_nov03 ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
Etoumbi_mai05 ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
GOR_A_Lossi_dec02 ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
GOR_B_Odz_jun05 ... ..G ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... C.. ... ... ... ... ... ... ... ... ... ... ...
..
Soudan .GA .C. AGC A.. GCT .TA G.T GG. .. . .GT T.T GAA .GT G.A .CT CTC AT. ... C.. G.A AAG .G. TCT G.A C.G ..A ..A .CA ... TAT ..T C.C
..
Reston CCT .G. ACG AGC ... CTG A.A CA. ..C A.T TGT GAA G.. .CT ..T .TC .T. ..T -.A A.. ..T ATG ..A AAA ..A .GA ... .CA ... .A. ..T C.G
..
Résultats
160
IV. Analyses phylogénétiques
Enfin, les relations phylogénétiques des souches ont été comparées par la construction
d’arbres basés sur les gènes de la GP puis de la NP (Figure 26) selon 4 méthodes
différentes : les méthodes bayésienne, du maximum de vraissemblance (ML), du maximum
de parcimonie (MP) et du plus proche voisin (NJ). Toutes les méthodes aboutissaient à des
arbres similaires.
L’arbre A de la figure 26 est construit à partir des séquences totales de la GP grâce au
logiciel MrBayes. Il fait ressortir la séparation des souches en deux lignées dont la
composition est celle déterminée par les signatures moléculaires : les souches humaines
composent le groupe A, toutes les souches descendent les unes des autres en fonction du
temps (date de prélèvement) et de la plus ancienne, Mayinga_76 ; les souches d’origine
animale et celles des deux dernières épidémies humaines forment un nouveau groupe
distinct dans l’espèce Zaïre. A l’intérieur de ce nouveau groupe, les trois souches
originaires de carcasses trouvées à Lossi (les deux gorilles GOR_Lossi_dec02 et
CH_Lossi_fev03) se groupent ensemble, les souches des deux gorilles étant plus proches.
La séparation entre les deux lignées est soutenue par les fortes probabilités postérieures
bayésiennes et les valeurs de bootstrap en ML indiqués au niveau des nœuds.
L’arbre B a été construit selon la méthode NJ à partir des séquences partielles de la GP.
La topologie est similaire à celle obtenue avec les autres méthodes (arbre A). La séparation
en deux groupes est également retrouvée. Les trois séquences GOR1_Odz_jun05,
GOR2_Odz_jun05 et GOR_Mbandza_jun03, dont la totalité de la GP n’est pas disponible,
se situent avec les autres souches d’origine animale. Ces séquences partielles sont plus
proches des souches issues des dernières épidémies humaines que des souches de Lossi qui
forment un cluster à part.
L’arbre C de la figure 26 est quand à lui basé sur les séquences de la NP. En accord
avec l’arbre basé sur la GP, les souches issues des deux dernières épidémies humaines et
d’origine animale forment un groupe phylogénétiquement distinct des souches isolées entre
1976 et 1996. Toutefois, les positions des souches humaines isolées entre 2001 et 2003
(constituant le groupe R, en bleu) diffèrent entre les deux arbres. Alors que les souches du
Résultats
161
groupe R étaient apparentées aux souches du groupe A dans l’arbre basé sur la GP (Figure
26A, B), elles se positionnent avec les souches du groupe B dans l’arbre basé sur la NP
(Figure 26C). L’incongruence des souches du groupe R suggère fortement l’existence d’un
événement de recombinaison entre les souches des groupes A et B, dont les positions dans
les arbres sont stables, et qui se serait produit entre 1996 et 2001.
La topologie des arbres fait ressortir un ordre temporel des séquences. En effet, les
souches de la lignée A ont été isolées entre 1976 et 1996, celles du groupe R sont
responsables d’épidémies humaines entre 2001 et début 2003. Dans la lignée B, les gorilles
de Lossi ont été découverts fin 2002-début 2003, les autres souches ont été isolées à partir
de novembre 2003.
Résultats
162
Figure 26 : Arbres phylogénétiques basés sur
les séquences de la GP totale (A) ou partielle
(B) et de la NP (C) mettant en évidence les
relations entre les souches Zaire ebolavirus.
Les valeurs indiquées au dessus des branches
correspondent aux probabilités postérieures
bayesiennes et aux bootstraps selon les
méthodes du maximum de vraissemblance (A
et C) ou du plus proche voisin (B). L’arbre B
est à titre indicatif pour positionner les 3
souches animales, marquées d’un astérisque,
pour lesquelles seules la séquence partielle de
la GP est disponible. Les couleurs soulignent
les trois groupes génétiques : groupe A en
vert, groupe B en rouge, et un groupe
recombinant R en bleu.
Résultats
163
V. Etude de la variabilité
Les diversités génétiques ont été calculées sur la base des gènes GP et NP par
comparaison des séquences par paires.
Les diversités génétiques obtenues à l’intérieur d’un groupe sont plus faibles que les
diversités obtenues par comparaison de deux groupes (Tableau XI). Ainsi, les divergences
nucléotidiques et aminoacides basées sur la GP à l’intérieur des groupes A et B (1,02 et
2,23 % pour le groupe A ; 0,53 et 0,94 % pour le groupe B) sont plus faibles que les
divergences entre les deux groupes (2,86 et 6,1% entre A et B). On observe également que
la diversité du groupe R comparé au groupe A est plus faible que sa diversité comparée au
groupe B (1,18 et 2,73% entre R et A contre 3,56 et 8,15 % entre R et B). Ce résultat
confirme la distribution des signatures moléculaires, qui groupait les séquences du groupe
R avec celles du groupe A.
Bien que ces différences soient plus subtiles sur la base de la NP, les divergences
suivent la même tendance. Les divergences à l’intérieur des groupes A et B (1,29 et 1,12 %
pour A ; 0,25 et 0,34 % pour B) sont plus faibles que les divergences entre les deux
groupes (2,23 et 1,70 %). De même, la divergence plus faible entre les groupes R et B
(0,25 et 0,32 %) comparée à la divergence entre les groupes A et R (2,15 et 1,62 %)
confirme les signatures moléculaires communes aux séquences R et B.
La différence observée entre les divergences à l’intérieur des groupes et les divergences
entre les groupes confirme l’existence de trois groupes de séquences.
Résultats
164
Tableau XI : Divergences génétiques à l’intérieur et entre les groupes de séquences aux niveaux
nucléotidique et aminoacide basées sur les séquences de la GP (partielle) et de la NP. La
moyenne, la gamme et l’erreur standard (ES) sont indiquées pour chaque groupes. Les calculs
ont été menés sur les alignements de séquences présentés en figures 22 et 24.
VI. Datation de la séparation des groupes
Les âges de séparation des différents groupes et clusters observés dans les arbres
phylogénétiques ont été estimés en combinant une analyse phylogénétique bayésienne
basée sur une horloge moléculaire et les dates d’échantillonnage (Figure 26).
L’âge de la séparation des deux lignées suggéré par la topologie de l’arbre
phylogénétique est confirmé par l’analyse. Les lignées A et B se seraient séparées en 1975
(intervalle de confiance entre 1972 et 1976), peu de temps avant la première apparition du
virus. L’estimation sur la base de la NP aboutit à une date similaire : 1971 (intervalle entre
1955 et 1976).
Nucléotides Acides aminés
Moyenne Mini-Maxi ES Moyenne Mini -Maxi ES
Groupe A 1,02 0,19-1,77 0,14 2,23 0,35-3,49 0,38
Groupe B 0,53 0,18-1,48 0,12 0,94 0,16-3,20 0,27
Groupe R 0,22 0,05-0,42 0,06 0,41 0,16-0,83 0,16
A vs R 1,18 0,42-2,24 1,8 2,73 1,16-4,82 0,52
A vs B 2,86 2,04-3,46 0,36 6,1 3,20- 7,69 0,98
GP
R vs B 3,56 3,15-3,92 0,44 8,15 7,64-8,97 1,19
Groupe A 1,29 0,55-1,86 0,20 1,12 0,62-1,66 0,32
Groupe B 0,25 0,07-0,34 0,10 0,34 0,21-0,62 0,19
Groupe R 0,15 0,07-0,27 0,06 0,22 0,21-0,42 0,12
A vs R 2,15 1,79-2,55 0,33 1,62 1,04-2,08 0,42
A vs B 2,23 1,86-2,55 0,33 1,70 1,04-2,29 0,43
NP
R vs B 0,25 0,14-0,35 0,08 0,32 0,21-0,62 0,13
Résultats
165
La période de recombinaison avancée à partir de l’analyse phylogénétique est confirmée
par l’intervalle de confiance estimé. Que ce soit basé sur la GP ou la NP, la recombinaison
daterait des années 1998-2000, la date moyenne associée à l’ancêtre commun le plus récent
la situant fin 1999.
Plus récemment, à l’intérieur de la lignée B, l’ancêtre commun des souches Lossi et des
autres souches animales daterait du début de l’année 2000.
Figure 26 : Estimation de l’âge des nœuds critiques, représentant les ancêtres communs les plus récents de
certains groupes de séquences. Les dates ont été estimées pour les gènes GP (A) et NP (B) grâce à une
méthode bayésienne à horloge moléculaire. L’intervalle de confiance (95% de probabilité) est indiqué entre
crochets sous la date moyenne associée à l’ancêtre commun le plus récent.
Discussion
166
DISCUSSION
Discussion
167
Depuis la première apparition de la fièvre hémorragique à virus Ebola, chaque épidémie
humaine a été associée à une souche virale. Afin de mieux comprendre l’évolution du
virus, il est nécessaire de caractériser les souches responsables de nouvelles épidémies.
D’autre part, les populations de grands singes sont durement touchées par ZEBOV, dont
les épizooties ont décimé plus de la moitié des effectifs [31]. L’observation de
l’augmentation de la mortalité animale avant une épidémie humaine [33] a entraîné la
création en 2001 d’un réseau de surveillance des mortalités animales en collaboration avec
les ministères gabonais et congolais de la forêt et de l’environnement et les organismes
Wildlife Conservation Society (WCS) et Programme de Conservation et Utilisation
Rationnelle des Écosystèmes Forestiers en Afrique Centrale (ECOFAC) [32]. Toutes les
carcasses non tuées par prédation trouvées dans les parcs nationaux gérés par ces
organismes sont prélevées et les échantillons sont envoyés au CIRMF pour diagnostic.
Cette étude a pour but de caractériser les nombreux échantillons humains et animaux
obtenus à partir de 2001 lors des épidémies et grâce au réseau de surveillance des
mortalités animales. Les résultats obtenus éclairent d’un jour nouveau les connaissances
sur l’évolution et l’épidémiologie de ZEBOV.
I. Mise au point d’un outil diagnostic
Lorsque l’épicentre d’une épidémie de FHVE est proche du CIRMF, une équipe de
l’Unité des Maladies Virales Émergentes part sur le terrain. L’équipe collecte des
prélèvements et les achemine à Franceville où le diagnostic sera réalisé dans les
laboratoires du CIRMF. Cependant, les flambées ne sont pas toujours proches d’un centre
de référence, et un outil de diagnostic adapté aux conditions de terrain serait un atout
majeur dans la détection rapide des cas. La mise au point du diagnostic par
immunofiltration répond à cette attente.
Bien que moins sensible que la RT-PCR, la méthode par immunofiltration montre une
sensibilité équivalente à la détection d’antigènes par ELISA [101, 107], avec l’avantage de
la rapidité et de la facilité d’exécution. Cette méthode est basée sur une technique
Discussion
168
précedemment évaluée pour la détection d’anticorps [395] et de protéines du sérum [396].
Ce test s’est révélé spécifique pour les antigènes ZEBOV. Il permet également de détecter
les antigènes SEBOV, et ne présente que très peu voire aucune réaction croisée avec les
antigènes REBOV et CIEBOV. Il est important de rappeler que les espèces ZEBOV et
SEBOV étant les seules responsables des victimes humaines de FHVE, à l’exception du
cas unique causé par CIEBOV [10], la détection des antigènes de ces deux espèces est
majeure pour la santé publique.
La limite de détection du test par immunofiltration observée lors de la mise au point est
en accord avec la virémie moyenne détectée en phase symptomatique (106 pfu/ml, avec des
pics à 108 ou 109 pfu/ml) [105]. La concordance de la sensibilité et de la virémie moyenne,
ainsi que les essais de diagnostic effectués lors de l’épidémie de 2003 en RC suggèrent que
cette méthode pourrait apporter une solution aux difficultés de diagnostic pour les
épidémies éloignées des centres de référence [29]. De plus, l’inactivation des échantillons
biologiques par le SDS a montré une meilleure sensibilité par rapport aux échantillons
natifs. Les conditions de biosécurité étant difficilement adaptées au terrain, une méthode de
diagnostic sur échantillons inactivés possède un avantage considérable sur les autres
méthodes de détection de l’antigène.
Le dernier avantage de l’immunofiltration réside dans sa compatibilité avec les modes de
prélèvements non-invasifs. En effet, lors des épidémies passées au Gabon et en RC, les
populations sont devenues de plus en plus réticentes au prélèvement sanguin. Les
croyances culturelles, la peur de la sorcellerie ou du risque d’infection nosocomial par la
réutilisation de seringues contaminées amenèrent les populations à dénigrer les
prélèvements sanguins [397]. La mise en évidence de EBOV dans les fluides séminal et
vaginal, dans les larmes et la salive [58, 398] ouvre la voie du diagnotsique aux
prélèvements non-invasifs, obtenus plus facilement dans de meilleures conditions
sécuritaires. De plus, grâce à la possibilité d’utiliser l’immunofiltration sur de gros
volumes (jusqu’à 10ml), la sensibilité de la technique pourrait être élevée, même si la
concetration d’EBOV est généralement plus faible dans l’urine et la salive que dans le
sérum.
En conclusion, un outil de diagnostic rapide et adapté aux conditions de terrain a été
developpé. Cette technique implique une inactivation simple des échantillons biologiques
Discussion
169
et des résultats précis sont disponibles en 30 minutes, sans équipement lourd ni électricité.
Avec les avancées dans la recherche d’un traitement contre la FHVE [154, 399, 400], le
diagnostic et le suivi précoces deviennent plus importants. Ce test pourrait se révéler utile
pour le diagnostic précoce lors des épidémies futures et pourrait être adapté pour la
détection d’autres agents pathogènes tels que MARV.
II. Caractérisation de nouvelles souches virales
Au commencement de cette étude, seules 12 séquences de la GP étaient disponibles dans
les banques de gènes, ainsi que 6 séquences de la NP. Sept d’entre elles furent
caractérisées par l’Unité des Maladies Virales Émergentes du CIRMF. Toutes étaient
issues de prélèvements humains obtenus lors d’épidémies entre 1976 et 2003.
Entre octobre et décembre 2003, puis entre avril et juin 2005, deux nouvelles épidémies
de FHVE furent déclarées en République du Congo (RC). L’appartenance de ces isolats
viraux à l’espèce Ebolavirus zaïre fut confirmée par plusieurs méthodes de diagnostic,
dont l’amplification et le séquençage du gène codant la GP.
D’autre part, la surveillance des mortalités animales entre 2001 et 2006 a permis de
prélever 47 animaux morts, dont 18 gorilles et 5 chimpanzés. Les méthodes de diagnostic
ont identifié 12 gorilles et 3 chimpanzés infectés par ZEBOV (Tableau III et [32]).
Cependant, les conditions de température et d’humidité de la forêt équatoriale entraînent
une décomposition rapide des carcasses et du matériel génétique. De ces grands singes
positifs, seules les souches de 6 gorilles et un chimpanzé ont pu être séquencées.
Les séquences totales et partielles codant la GP et la NP viennent augmenter les données
disponibles pour l’étude de l’évolution du virus Ebola. Parmi elles sont les premières
séquences d’origine animale à être publiées.
Discussion
170
III. Les souches de ZEBOV sont divisées en deux lignées
génétiques
Jusqu’à ce jour, les connaissances sur l’évolution de ZEBOV étaient exclusivement
basées sur les données moléculaires obtenues à partir d’infections humaines et
impliquaient le seul gène de la GP. Les souches representaient une seule lignée avec une
relation de descendance en fonction du temps [25, 392].
La caractérisation des souches d’origine animale fait apparaître une deuxième lignée
génétique, composée des séquences animales et des deux épidémies humaines les plus
récentes.
La séparation est marquée par la présence de signatures moléculaires (nucléotides
communs aux séquences d’une lignée et différents des nucléotides communs à l’autre
lignée au même site). Trente signatures nucléotidiques (soit 13 acides aminés spécifiques)
sont présentes dans la séquence codant la GP ainsi que 15 signatures nucléotidiques (soit 4
modifications d’acides aminés) dans la séquence de la NP.
Cette séparation est également appuyée par la diversité observée entre les séquences de la
lignée A (d’origine humaine) et celles de la lignée B nouvellement décrite. En effet, la
distance moyenne entre les lignées est nettement supérieure à la distance moyenne à
l’intérieur de chaque lignée. De plus, la distance minimale pour le gène de la GP entre les
lignées A et B (2,04 et 3,20% aux niveaux nt et aa, respectivement) est supérieure à la
distance maximale à l’intérieur de chaque lignée (1,77 et 1,48% au niveau nt A et B ; 3,49
et 3,20% au niveau aa). Cette tendance est moins marquée mais présente pour le gène de la
NP.
Les divergences calculées sur les séquences GP et NP entre les différentes souches
ZEBOV paraissent faibles par rapport aux distances observées chez le VIH et le virus de la
fièvre de Crimée-Congo. Pour ce dernier, les segments M (codant la glycoprotéine) de
différentes souches virales présentent 31% de différences dans leurs séquences
nucléotidiques et 27% dans les séquences déduites d’acides aminés [244]. D’un autre côté,
les divergences calculées dans cette étude correspondent aux distances observées pour le
Discussion
171
virus de la fièvre de la Vallée du Rift, où les séquences nucléotidiques diffèrent au
maximum de 4,5% [238].
Des distances aussi faibles sont pourtant significatives lorsque les génomes viraux sont
très stables. En effet, une étude précédente centrée sur une zone variable du gène de la
glycoprotéine (GP) a montré que ZEBOV isolé pendant l’épidémie de 1995 à Kikwit est
génétiquement stable au cours de l’épidémie et des chaînes de transmission [58]. De
même, il n’y a aucune variation dans les séquences nucléotidiques de la GP et la NP parmi
des isolats de patients convalescents, décédés ou asymptomatiques [25]. Ainsi, la séquence
de Booué_96 diverge de seulement 1 à 1,7% avec les séquences antérieures, pourtant
séparées d’environ 3 000km et de près de 20 ans [25].
Enfin, l’analyse des séquences couplée à leur date d’échantillonnage supporte la
séparation en deux lignées et confirme la datation de cet événement avant la première
apparition de ZEBOV en 1976. Supposant que le virus évolue à un taux constant, le taux
d’évolution correspondant de 8 10-4 substitutions/site/an déduit des analyses
phylogénétiques est similaire aux taux généralement trouvés chez les virus à ARN [84,
401]
III.1. Évolution des virus à ARN responsables de fièvres
hémorragiques
Plusieurs lignées phylogénétiques sont également retrouvées chez les autres virus
responsables de fièvres hémorragiques chez l’homme.
L’étude de la séquence du petit fragment révèle trois lignées phylogénétiques dans le
groupe antigénique des Arenavirus du Nouveau Monde, et plusieurs lignées distinctes
parmi les isolats du virus Pirital (Vénézuela) [402, 403]. Selon le virus étudié, l’évolution
peut ou pas être liée à la géographie, l’hôte rongeur ou le potentiel épidémique chez
l’homme [404].
De même, les séquences des Hantavirus (famille Bunyaviridae) Tula et Puumala sont
divisées en 2 et 7 lignées groupées selon une distribution géographique [257, 405]. Le
Discussion
172
virus de la fièvre hémorragique de Crimée-Congo (Nairovirus) est lui aussi divisé en
lignées géographiques [244].
Les exemples de plusieurs lignées phylogénétiques existent aussi chez les
Mononégavirales, virus dont l’ARN n’est pas segmenté. Les lyssavirus (Rhabdoviridae)
d’une même zone géographique tendent à se grouper ensemble, de même que les virus
isolés de la même espèce hôte [406].
Plus récemment, les séquences des génomes complets de Marburgvirus issus de
multiples cas confirmés lors de l’épidémie Angola_2005 et d’une protéine virale issue de
l’épidémie RDC_1998 ont été comparées aux séquences déjà connues. Ces études ont
montré la séparation des séquences en deux lignées. La première lignée est composée des
séquences d’Angola, l’autre des séquences de RDC. Ces dernières se divisent en 9 groupes
phylogénétiques [278, 407].
La mise en évidence de plusieurs lignées phylogénétiques n’est donc pas une nouveauté
parmi les virus à fièvre hémorragique ou les Filoviridae.
Cependant, les lignées précédemment décrites sont pour la plupart des lignées
géographiques ou fonction de l’espèce hôte. Les lignées décrites pour l’espèce ZEBOV
sont particulières car isolées dans la même zone géographique, à partir de carcasses
animales ou de cas humains infectés auprès d’une source animale. Elles n’ont pas de
relation avec les dimensions spatiale ou d’hôte. L’analyse phylogénétique montre au
contraire une séparation des souches en fonction du temps.
III.2. Plusieurs lignées suggérées par les données épidémiologiques
sans pouv oir être démontrées
Les différentes enquêtes de séroprévalence menées depuis les premières épidémies
indiquent la circulation du virus Ebola en l’absence de cas cliniques. En effet, dans des
régions sans passé épidémiques telles que le Cameroun, la République de Centreafrique
(RCA) ou des villages non touchés de RDC, les enquêtes ont observé des taux d’anticorps
IgG dirigés contre ZEBOV allant de 5,9 à 37,5% [36, 38-41].
Discussion
173
De même, de fortes séroprévalences en anticorps dirigés contre ZEBOV ont été
retrouvées dans les populations primates captives et exportées (43% d’anticorps réagissant
aux filovirus REBOV, ZEBOV, et MARV) ou sauvages (12,9% des chimpanzés du Gabon,
du Cameroun et de RCA ont des anticorps anti-EBOV) [408, 409].
La présence de taux de séroprévalence non nuls (voire élevés selon le groupe ethnique)
suppose que les chimpanzés et les villageois vivent au contact du virus, ou de son réservoir
naturel. L’absence de cas clinique suppose soit des cas isolés non reconnus, soit des
infections non létales ou asymptomatiques chez les chimpanzés. L’infection
asymptomatique a été démontrée chez l’homme lors d’épidémies due à l’espèce Zaïre ou
d’épizooties dues à l’espèce Reston [3, 211].
Plusieurs souches moins virulentes ou non pathogènes pourraient circuler et former une
(ou des) lignée(s) distinctes des souches hautement pathogènes. Un exemple de souches
moins virulentes pourrait être ces souches dites « atypiques ». En effet, la chaîne
épidémiologique dans laquelle a été isolé la souche atypique humaine ne présentait que
50% de mortalité dans une épidémie au taux de mortalité moyen de 80%. Leur profil
particulier (positif pour la capture d’antigènes, mais négatif en amplification par PCR)
suggère des mutations au niveau de la zone d’hybridation des amorces. Cependant,
l’infection asymptomatique chez l’homme ne résulte pas de mutations, au moins dans les
deux gènes testés [211].
En conclusion, les taux de séroprévalence d’anticorps dirigés contre ZEBOV dans des
régions sans aucun passé épidémique supposent l’existence de souches peu ou pas
pathogènes infectant les hommes et les grands singes.
III.3. Composition de la lignée B
Nous avons vu précédemment que d’autres virus à ARN peuvent être séparés en lignées
phylogénétiques basées sur la géographie ou leur potentiel épidémique.
Dans le cadre de notre étude, toutes les souches ont été isolées dans la même zone
géographique : les forêts et villages du nord-est du Gabon et de la Cuvette Ouest du
Congo. D’autre part, le potentiel épidémique pour l’homme ou les grands singes ne peut
être pris en compte. En effet, les épidémies humaines ont pour la plupart une source
Discussion
174
animale. Les souches isolées lors d’épidémies humaines ont aussi infecté un ou plusieurs
animaux avant de passer à l’homme.
Pourtant, toutes les souches d’origine animale se groupent dans cette lignée
nouvellement décrite. Pourrait-il y avoir une corrélation entre la lignée génétique, l’espèce
sensible et la virulence ? La lignée B contiendrait alors des souches de moindre
pathogénicité dont l’existence est supposée par les études de séroprévalence. Si des
différences de virulence chez les grands singes ne peuvent être étudiées, la lignée B
comporte également deux souches responsables d’épidémies humaines. Or, ces deux
épidémies étaient caractérisées par des taux de mortalité similaires aux épidémies
précédentes (85% pour Mbandza_03 et 75% pour Etoumbi_05, comparés au 80% de
moyenne pour cette espèce virale). Au niveau de l’infection chez l’homme, aucune
différence de virulence n’est observée entre les souches des deux lignées.
Les souches de la lignée A pourraient-elles être moins pathogènes pour les grands
singes ? Outre le fait que les épidémies humaines aient pour la plupart une source animale,
les souches virales utilisées dans les protocoles de vaccination appartiennent à la lignée A
(principalement la souche Mayinga_76). Or l’infection expérimentale de singes macaques
par Mayinga_76 est mortelle dans 100% des cas [173]. Le fait qu’aucune souche de la
lignée A n’ait été retrouvée dans une carcasse animale pourrait être imputé à un biais
d’échantillonnage, la mortalité animale n’étant pas surveillée lors des premières épidémies.
III.4. Pourquoi la lignée B n’est-elle détectée qu’après 2001 ?
Les analyses phylogénétiques montraient que les deux lignées se seraient séparées avant
la première apparition de ZEBOV en 1976. L’estimation de l’âge du nœud confirme cette
hypothèse en datant de 1975 l’ancêtre commun le plus récent entre les deux lignées
(l’intervalle de confiance allant de 1955 à 1976).
Pourquoi la lignée B n’est-elle détectée qu’après 2001, alors que les souches existent
depuis plus de 30 ans ?
Discussion
175
Là encore, un biais d’échantillonnage peut être invoqué. Cependant, une hypothèse plus
plausible serait la non pathogénicité de l’ancêtre commun de la lignée. Les souches de
cette lignée seraient devenues pathogènes suite à une accumulation de mutations
ponctuelles. L’acquisition de la pathogénicité a été démontrée sur le modèle animal. En
effet, des souches ZEBOV non létales pour des cochons d’Inde peuvent devenir mortelles
lorsqu’elles subissent plusieurs passages sur les animaux [96]. Les souches non pathogènes
peuvent alors facilement circuler sans être détectées, puisque toutes les souches identifiées
à ce jour sont issues de cas cliniques ou de carcasses infectées.
Ces changements phénotypiques pourraient avoir eu lieu en relation avec la transmission
du virus Ebola entre les espèces de chauve-souris supposées réservoir. En effet, les
analyses phylogénétiques font apparaître un groupement des souches virales en fonction du
temps. Les changements phénotypiques auraient pu se produire avant l’introduction de
ZEBOV dans l’espèce (les changements génétiques entraînent le changement d’espèce
hôte) ou après l’introduction (les changements génétiques sont la conséquence du
changement d’hôte). Cependant, l’analyse des séquences partielles obtenues à partir de
sérums de chauve-souris ont permis de remonter à un ancêtre commun récent, c’est-à-dire
une récente séparation des lignées génétiques, et non une espèce réservoir ancestrale [84].
L’existence d’un ancêtre commun à toutes les séquences dérivées des chauves-souris
frugivores est surprenante. L’origine commune des séquences de chauve-souris, et par là
même la récente apparition des souches de la lignée B, pourraient être la conséquence d’un
entonnoir génétique subit par le virus.
Une première possibilité émise lors d’une étude précédente [84] serait une diminution
drastique du nombre de chauve-souris infectées vers 1999, qui entraînerait la perte de
toutes les souches virales sauf une. Ceci pourrait expliquer l’apparition de la lignée B à
partir de 2001, mais ne prend pas en compte les souches humaines apparues entre 2001 et
2003, qui, d’après l’arbre phylogénétique construit sur le gène de la GP, descendent des
souches humaines plus anciennes de 1976 à 1996. Cette hypothèse serait plausible si la
diminution de la population infectée était située vers le milieu de l’année 2003, puisque la
dernière souche humaine de la lignée A a été isolée en janvier, et l’épidémie suivante a été
causée par une souche de la lignée B (Mbandza, en novembre).
Discussion
176
Bien qu’elle apporte des preuves complétant les études épidémiologiques précédentes et
la mise en évidence d’une virémie transitoire lors d’infections expérimentales [28, 75], les
trois espèces de chauve-souris frugivores identifiées pourraient ne pas être le seul réservoir
de ZEBOV. L’existence d’une ancêtre commun pourrait alors être expliquée par
l’introduction simultanée du virus à partir d’un réservoir encore inconnu dans les
populations de chauves-souris frugivores et d’autres espèces animales, concomitant avec
l’émergence du virus chez l’homme.
Cette hypothèse, qui n’exclue pas une espèce chauve-souris comme réservoir primaire,
est supportée par l’étude des virus de la rage en Europe. En effet, il a été démontré que le
passage d’une espèce réservoir à une autre peut être causé par de petits changements
génétiques dans les séquences des Lyssavirus. Bien que le rôle déclencheur d’une pression
environnementale ne soit pas encore clair, une forte densité d’hôte susceptible et la
proximité d’une espèce donneuse pourraient être des facteurs écologiques majeurs dans le
changement d’hôte des virus de la rage [406]. Le changement d’espèce pourrait être,
comme nous l’avons vu précédemment, précédé ou suivi de mutations ponctuelles qui
auraient permis aux souches de la lignée B d’acquérir leur pathogénicité. Dans cette
hypothèse, les virus de la lignée B nouvellement introduits dans la populations
domineraient les virus de la lignée A. Ceci pourrait expliquer pourquoi les humains et
primates infectés depuis 2001 l’ont été avec des souches de la lignée B et des souches
recombinantes.
IV. Évènement de recombinaison entre les lignées
Les arbres phylogénétiques construits sur les gènes de la GP et de la NP montrent une
incongruence dans la topologie des souches isolées à partir des épidémies humaines entre
2001 et 2003 (nommées groupe R). La suspicion de recombinaison est appuyée par les
distances génétiques entre les groupes. La distance entre les souches A et R est plus faible
que la distance entre R et B dans le cadre de la GP. Sur la base de la NP, la distance entre
A et R est au contraire plus grande que la distance entre R et B, impliquant que les souches
du groupe R sont plus proches pour ce gène des souches de la lignée B. De même, les
Discussion
177
signatures moléculaires sont communes aux séquences NP du groupe R et de la lignée B ;
pour les séquences GP, le groupe R partage les mêmes signatures que la lignée A.
Ces éléments sont les premiers indices d’un événement de recombinaison au sein de la
famille des Filoviridae. Le génome d’Ebolavirus étant constitué de 7 gènes disposés
comme suit : 5’-leader-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-trailer-3’, la recombinaison
pourrait se dérouler dans la région comprise entre les gènes NP et GP.
La recombinaison de l’ARN est un processus qui joue un rôle important dans l’évolution
de virus animaux ou de plantes par la génération de variabilité génétique, par élimination
des mutations létales ou délétères, par la création de nouveaux génotypes, ou par
l’acquisition de la pathogénicité [410, 411].
Contrairement à la recombinaison de l’ADN, qui implique généralement un ADN
double-brin et qui se produit par coupure-jonction, ou plus rarement par changement de
brin matrice lors de la réplication [412, 413], la recombinaison de l’ARN n’a été
démontrée majoritairement que sur des ARN simple brins. Le mécanisme impliqué serait
un saut de la polymérase d’un brin à un autre lors de la synthèse d’ARN [411]. La
recherche d’incongruences dans les arbres phylogénétiques construits sur 79 gènes de 35
virus à ARN négatif a mis pour la première fois en évidence des évènements de
recombinaison chez certains virus étudiés [414]. La fréquence de recombinaison des virus
ARN est faible, soit car ce processus serait gêné par la présence d’un complexe
ribonucléoprotéique, soit car la sélection naturelle éliminerait les variants les moins
adaptés [415].
Toutefois, la recombinaison de l’ARN peut se produire en absence de réplication virale.
La cotransfection de fragments d’ARN de poliovirus a conduit à l’assemblage d’un
génome avant la génération de l’ARN polymérase virale. Les mécanismes impliqués ici
seraient une ligation des extrémités ou des cross-overs internes au niveau de séquences
chevauchantes [416]. Une autre étude a de même montré la génération d’un génome
pestiviral suite à la recombinaison de deux fragments incapables de se répliquer seuls
[417].
La recombinaison a fréquemment été démontrée chez les virus à ARN positif. Par
exemple l’alphavirus de l’encéphalite équine occidentale (Western Equine Encephalitis
virus) serait dérivé d’une recombinaison entre une souche orientale et une souche
Discussion
178
apparentée au virus Sindbis [418]. De même, de forts indices de recombinaison ont été
trouvés parmi les souches du sérotype DEN-1 du virus de la Dengue (Flaviviridae) [419].
Cela reste cependant un événement rare chez les virus à ARN négatif, qui n’a été
démontré pour la première fois qu’en 1999 sur Tulavirus (genre Hantavirus, famille
Bunyaviridae) [405]. Depuis, de nombreuses recombinaisons intra-segment ont été mises
en évidence chez des virus à ARN segmenté ambisens. Dans le genre Hantavirus, des
évènements de recombinaison ont été démontrés entre les lignées génétiques que forment
les virus Puumala [257]. Une autre étude suggère que 3 Arenavirus du Nouveau Monde
(Whitewater Arroyo, Tamiami et Bear Canyon) dériveraient d’un ancêtre commun issu de
la recombinaison entre des virus de 2 des 3 lignées phylogénétiques séparant les
Arenavirus sud-américains [402, 404].
Lors d’une épidémie de fièvre de la Vallée du Rift en Afrique de l’Est, deux nouveaux
virus du groupe Bunyamwera (famille des Bunyaviridae, virus à ARN segmenté négatif),
jusqu’alors non pathogènes pour l’homme, ont été associés à des cas cliniques. Ces deux
virus seraient issus d’un réassortiment du segment M [420]. Toujours chez les
Bunyaviridae, mais dans le genre Nairovirus, de multiples évènements de recombinaison
ont été suggérés entre les différentes souches virales de la fièvre hémorragique de Crimée-
Congo [421].
Un autre événement de recombinaison concerne le gène de l’hémagglutinine (HA,
protéine dont le rôle est majeur dans la pathogénicité) de l’Orthomyxovirus Influenza
(ARN négatif simple brin). La HA de la souche virale responsable de la pandémie de
« grippe espagnole » de 1918 serait issue d’une recombinaison entre les HA de virus
humains et porcins [422]. Cependant, ce résultat est controversé par une seconde analyse
qui attribue le profil d’évolution particulier de cet isolat à une variation du taux de
substitution nucléotidique entre les différentes régions du gène de la HA [423].
Enfin, chez les virus à ARN non segmenté négatif, des évènements de recombinaison ont
été démontrés pour deux Rubulavirus (famille des Paramyxoviridae) : les virus Mumps et
de la maladie de Newcastle [414].
Nous venons de voir que la recombinaison est possible et existe à faibles taux chez
différents virus à ARN. Cependant, pour qu’il y ait recombinaison, plusieurs conditions
sont requises.
Discussion
179
Tout d’abord, il faut que plusieurs lignées co-circulent dans une même région. Or, cette
étude vient de montrer l’existence de 2 lignées phylogénétiques distinctes qui circulent
dans la forêt de la région frontalière Gabon-Congo.
Ensuite, les souches virales doivent infecter un même hôte, dont le système immunitaire
préviendrait toute infection secondaire et élimination du virus. Bien que non démontrée
directement, cette condition est en théorie remplie. En effet, la faible virémie observée
dans 3 espèces de chauve-souris frugivores suggère une infection persistante par le virus
Ebola. Ces espèces partagent la même niche écologique et vivent à proximité les unes des
autres, créant des opportunités de super-infection. Par ailleurs, plusieurs souches virales
ont été détectées dans ces espèces [83].
Enfin, une fois dans l’hôte, les virus des différentes lignées doivent infecter une même
cellule et s’y répliquer. Les souches virales et l’espèce hôte doivent accepter l’infection des
cellules par plusieurs virus. Aucune étude de sur-infection n’a été menée sur le virus Ebola.
Cependant, la proximité génétique des lignées A et B est compatible avec ce critère.
En conclusion, cette étude présente les premiers indices d’un événement de
recombinaison au sein de la famille des Filoviridae. Ce résultat est d’une importance
capitale dans le développement d’un vaccin. A cause de l’utilisation de souches virales
atténuées pour la recherche de vaccin [137, 143], la possibilité d’une recombinaison entre
ces souches atténuées et des souches sauvages pourrait avoir de très graves répercussions
sur la santé publique.
V. Multi-émergence ou propagation ?
L’hypothèse de la propagation de ZEBOV repose sur la transmission du virus d’individu
à individu dans les populations de grands singes. La surveillance du sanctuaire de Lossi
permet de suivre l’évolution de l’épizootie de FHVE qui décime la population de gorilles
et suggère la transmission de ZEBOV à l’intérieur du groupe familial et entre groupes
voisins [33]. De ce point de vue, et en raison de la grande stabilité génétique de ZEBOV
déjà étudiée [25, 58], les individus d’un même groupe ou localité devraient être infectés
par des souches virales très fortement apparentées. Au contraire, les résultats présentés ici
montrent que les séquences du gène de la glycoprotéine (GP) de deux gorilles découverts à
Discussion
180
Lossi, appartenant au même groupe et probablement contaminés au même moment,
différaient pour 11 sites nucléotidiques. De plus, ces deux séquences se groupent dans
l’arbre phylogénétique avec une troisième issue d’un chimpanzé. Ces résultats contredisent
l’hypothèse de la propagation et étayent celle de la multi-émergence par des évènements de
contamination indépendants à partir de différentes sources réservoir [26].
D’un autre côté, si les données sont analysées du seul point de vue spatial, le nouveau
groupe génétique mis en évidence par cette étude n’est retrouvé que dans une petite zone
(qui ne chevauche presque pas celle des autres groupes génétiques) située à l’est de la
région affectée quelques années plus tôt par les virus du groupe R. Si on ne tient compte
que des données spatio-temporelles des épidémies humaines de 2003 et 2005, le profil
correspond à la propagation vers l’est de ZEBOV [392]. Cependant, les données
moléculaires montrent que ces récentes épidémies sont causées non pas par des virus
descendant des virus isolés auparavant, mais par une nouvelle lignée génétique. Les
flambées épidémiques ne peuvent donc pas être liées épidémiologiquement. Ce résultat
contredit la notion d’une seule lignée virale propagée à travers la région Gabon-Congo
depuis quelques années.
Les résultats obtenus lors de cette étude convergent vers des émergences multiples et
indépendantes de ZEBOV et une longue persistance du virus dans la forêt de la région
frontalière du Gabon-Congo. Toutefois, la faible divergence génétique entre les séquences
virales implique une évolution parallèle récente et la même origine pour les lignées de
ZEBOV. Bien que les virus de la nouvelle lignée B soient différents de ceux de la lignée
A, la séparation des lignées est estimée avoir eu lieu dans les années 1970, et l’ancêtre
commun au souches de la lignée B est daté de 1998. Forts de ces données temporelles, il
devient difficile d’expliquer comment ZEBOV résiderait à long-terme dans les forêts
équatoriales de la zone d’endémie. Non seulement les émergences des virus des lignées A
et B se seraient directement suivies temporellement et spatialement, mais encore, les
épidémies, qu’elles soient dues aux souches de la lignée A ou de la lignée B, suivraient le
motif de diffusion vers l’est. Cela suggère l’existence de facteurs écologiques qui lieraient
toutes les épidémies indépendamment du type génétique viral.
En conclusion, cette étude ne privilégie pas une hypothèse par rapport à l’autre. Un
scénario plausible ferait intervenir une propagation des souches virales à l’intérieur de
Discussion
181
l’espèce réservoir et la contamination des grands singes auprès de ce réservoir par de
multiples contacts indépendants dans des conditions environnementales particulières. En
effet, les mortalités animales ainsi que les flambées épidémiques apparaissent souvent à la
fin de la saison sèche. Pendant cette période, les ressources alimentaires sont de plus en
plus rares, et les populations de chauve-souris et de grands singes se retrouvent en
compétition pour les mêmes fruits. C’est aussi pendant cette période que des changements
comportementaux et physiologiques sont observés chez les trois espèces de chauve-souris
suspectes. La rareté de la nourriture, les compétitions entre mâles et les mises bas groupées
des femelles modifieraient la réponse immunitaire et favoriseraient la réplication du virus.
La contamination des grands singes interviendrait alors au contact de la salive sur les
fruits, du sang ou des tissus placentaires des chauve-souris [82, 83].
Discussion
182
V. Perspectives
Nous venons de démontrer, pour la première fois, l’existence de deux lignées évolutives
distinctes au sein de l’espèce zaïre du virus Ebola. Ces lignées auraient évolué de manière
parallèle depuis leur séparation, estimée vers 1975, avant la première apparition de la
fièvre hémorragique à virus Ebola. La particularité de la lignée nouvellement décrite réside
dans sa composition : elle contient toutes les souches d’origine animale séquencées.
Les épidémies de 2001 à 2005 dans la région frontalière du Gabon et de la République du
Congo se distinguent des autres flambées par de multiples chaînes épidémiques
indépendantes et des épizooties concomitantes dans les populations de grands singes. La
découverte de carcasses de gorilles et chimpanzés infectées par Ebolavirus zaire ouvre une
nouvelle piste vers une meilleure connaissance de l’évolution de ZEBOV. Dans cette
optique, les souches prélevées lors des dernières épidémies humaines, et celles prélevées
sur des carcasses animales trouvées en forêt ont été caractérisées. Des fragments longs
(2030 nt) du gène codant la glycoprotéine (GP) ou plus courts (538 nt) correspondant à une
zone variable ont été amplifiés et séquencés, ainsi qu’un fragment (1448 nt) du gène
codant la nucléoprotéine (NP).
Les analyses phylogénétiques menées par trois méthodes, la présence de signatures
moléculaires et les distances génétiques calculées sur ces deux gènes font apparaître une
séparation des souches avant la première apparition du virus. Basé sur le gène de la GP,
l’arbre phylogénétique regroupe toutes les séquences d’origine animale dans la lignée
nouvellement décrite, la lignée B, avec les séquences issues de victimes humaines des deux
dernières épidémies. La lignée A comporte les séquences humaines déjà identifiées qui
descendent les unes des autres en fonction du temps. Cependant, la topologie des souches
d’origine humaine isolées entre 2001 et 2003 est différente pour l’arbre phylogénétique
basé sur le gène de la NP. L’incongruence observée suggère fortement un événement de
recombinaison entre les souches des deux lignées qui se serait produit il y a quelques
années.
Discussion
183
Ces données permettent de dégager plusieurs thèmes de recherche :
1. Afin de mieux comprendre l’évolution de ZEBOV, le génome complet des
différentes souches pourra être séquencé. A ce jour, seules des souches de la lignée A
(Mayinga et Kikwit) ont été entièrement caractérisées. Le séquençage de l’ensemble
du génome de souches d’origine animale appartenant à la lignée B et de souches
humaines recombinantes permettra d’améliorer les connaissances actuelles en
génomique.
2. Les génomes des souches « atypiques » pourront également être séquencés dans leur
ensemble. Pour cela, il est nécessaire d’isoler ces souches sur lignées cellulaires plus
sensibles que les cellules Véro. En effet, les espèces REBOV et SEBOV infectent
plus facilement les cellules MA104 et les monocytes sont des cibles primaires
d’EBOV in vivo. Si le virus est isolé, le séquençage complet pourra être réalisé. La
comparaison de leurs séquences avec celles de souches responsables d’épidémies au
taux de mortalité plus élevé pourrait se révéler essentiel pour la compréhension des
mécanismes de pathogénicité et la recherche d’une thérapie.
3. A partir des séquences complètes des génomes, le (ou les) point(s) de recombinaison
pourra être déterminé grâce à des logiciels tels que SlimPlot. Cet outil informatique
permet de comparer des séquences recombinées à des séquences parents. La
séquence recombinée change de groupe parental au point de recombinaison. Les
études préliminaires suggèrent un seul événement de recombinaison entre les gènes
NP et GP, mais d’autres points de recombinaison pourraient exister dans le reste du
génome.
4. L’existence d’une recombinaison est essentielle pour la recherche d’un vaccin. En
effet, une recombinaison entre une souche virale atténuée exprimant la GP et une
souche EBOV sauvage pourrait avoir de graves implications en santé publique. La
détermination du point de recombinaison permettra, grâce aux connaissances des
mécanismes de recombinaison, de limiter les risques lors de la production d’un
vaccin.
Discussion
184
5. Une étude pourra être menée afin de comparer les séquences obtenues sur carcasses
animales avec les séquences issues de chauve-souris. En effet, les séquences codant
la polymérase (gène L) de prélèvements de chauve-souris sont phylogénétiquement
liées aux séquences isolées sur des prélèvements humains [84]. L’origine et la
composition de la lignée B pourraient être élucidées grâce à la comparaison des
souches de chauve-souris avec les souches de grands singes.
Annexe
185
ANNEXE
Annexe
186
Transport des produits biologiques Document validé par les auteurs le 01.01.1997 guide sur la sécurité du transport des matières infectieuses et des échantillons de diagnostic
Genève - 1997 - ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTÉ - Division des Maladies Émergentes et autres maladies transmissibles - Surveillance et Lutte Document préparé par les Directeurs des Centres Collaborateurs pour la Biosécurité et par d'autres conseillers Introduction Les lignes directrices qui vont suivre s'appliquent au transport national et international des matières infectieuses et des échantillons Elles donnent des informations sur l'identification et le classement des marchandises à transporter ainsi que la méthode pour assurer un emballage et un transport sans danger. Elles soulignent l'importance d'établir de bonnes relations de travail entre les intervenants - l'expéditeur, le transporteur et le destinataire - afin de transporter le matériel dans de bonnes conditions de sécurité et de célérité. Le personnel des postes, des compagnies aériennes et des sociétés de transport en général est préoccupé par la possibilité de se contaminer à la suite de l'exposition à des micro-organismes infectieux qui pourraient s'échapper de colis qui fuient, qui sont cassés ou mal emballés. L'emballage des matières infectieuses doit donc tenir compte de ces inquiétudes et être conçu pour minimiser les risques de dommages au cours du transport. En outre, l'emballage sert à assurer l'intégrité du matériel transporté et le traitement en temps utile des échantillons. On n'a jamais signalé de cas de maladies imputables à la fuite d'échantillons pendant le trajet bien qu'on ait rapporté des incidents concernant l'emballage extérieur pour des produits convenablement emballés. L'expédition de matières infectieuses non étiquetées, non identifiées comme telles et mal emballées augmente à l'évidence les risques d'exposition pour toutes les personnes qui interviennent. Le règlement international pour le transport des matières infectieuses, quel que soit le moyen de transport, repose sur les Recommandations du Comité d'experts des Nations Unies en matière de transport des marchandises dangereuses. L'Union postale universelle (UPU) reprend ces recommandations dans ses règlements, notamment en ce qui concerne l'emballage. L'Organisation de l'aviation civile internationale (OACI) et l'Association du transport aérien international (IATA) ont également intégré les recommandations des Nations Unies dans leurs réglementations respectives, ainsi que l'ont fait d'autres organisations internationales de transport. L'Organisation mondiale de la Santé joue un rôle consultatif auprès de ces organismes. Le présent document se veut un guide pratique pour faciliter l'observance des règlements internationaux actuels. Si, dans le futur, des modifications étaient apportées aux Recommandations des Nations Unies relatives au
Annexe
187
transport des marchandises dangereuses dans le chapitre traitant des matières infectieuses et des échantillons de diagnostic, le présent guide serait modifié en conséquence. Définitions Pour la description des mesures de sécurité à appliquer au transport, les termes "matières infectieuses" et "produits infectieux" sont considérés comme synonymes. Le présent document utilisera le terme "matières infectieuses" Matières infectieuses Par matières infectieuses on entend les matières contenant des micro-organismes viables (bactéries, virus, rickettsies, parasites ou champignons), dont on sait ou dont on a des raisons de penser qu'ils provoquent des maladies infectieuses chez l'animal ou chez l'homme*. En ce qui concerne l'emballage et les conditions de transport, les matières infectieuses comprennent : 1 . toutes les cultures qui contiennent ou qu'on soupçonne contenir un agent pouvant provoquer des infections ; 2. les échantillons humains ou animaux qui renferment un tel agent dans des quantités suffisantes pour provoquer l'infection si, en cas d'incident pendant le transport une exposition à ces échantillons survenait ; 3. les échantillons provenant d'un malade atteint d'une maladie grave d'origine inconnue ; 4. tous les échantillons, autres que ceux définis ci-dessus, qu'une personne qualifiée, par exemple un médecin, un chercheur, une infirmière, etc., désigne comme infectieux. * Cette définition est extraite des Recommandations de l'ONU relatives au transport des marchandises dangereuses. Elle ne couvre pas les prions, bien qu'ils soient considérés comme des agents infectieux. Échantillons de diagnostic Par échantillons de diagnostic on entend toute matière humaine ou animale (y compris, mais pas exclusivement, les excréta, le sang et ses composants, les tissus et liquides tissulaires), prélevée à des fins de diagnostic, à l'exclusion des animaux vivants infectés. On considère que les échantillons de diagnostic provenant de la pratique médicale ou de la recherche représentent une menace négligeable pour la santé publique. Les échantillons de diagnostic prélevés sur des patients chez qui l'on soupçonne une maladie infectieuse peuvent contenir des quantités limitées d'agents pathogènes. Très peu d'agents sont susceptibles de provoquer une infection à la suite d'un incident pendant le transport. Si l'exposition accidentelle à l'échantillon durant le transport peut provoquer une infection, l'échantillon de diagnostic doit être emballé, étiqueté et transporté comme matière infectieuse. Les échantillons de diagnostic recueillis au cours de l'enquête sur une flambée épidémique d'une maladie grave d'origine inconnue doivent être manipulés comme des matières infectieuses. Emballage, étiquetage et documents de transport A cause de la différence des risques inhérents aux matières infectieuses et aux échantillons de diagnostic, les prescriptions pour l'emballage, l'étiquetage et les documents de transport ne sont pas les mêmes. Les prescriptions pour l'emballage sont fixées par l'ONU et figurent dans les réglementations de l'OACI et de l'IATA au titre des Instructions d'emballage 602 et 650. Ces prescriptions sont sujettes à des modifications et à des remises à jour par ces organisations. Des emballages agréés par l'ONU sont disponibles dans le commerce.
Annexe
188
Système de base du triple emballage Ce système se compose de 3 couches successives telles qu'elles sont décrites ci-dessous : 1. Récipient primaire. Il contient la matière; il doit être étanche (ne pas fuir) et étiqueté. Il est enveloppé de suffisamment de matériau absorbant pour pouvoir absorber tout le liquide s'il venait à se casser. 2. Emballage secondaire. Il s'agit d'un deuxième récipient résistant, étanche (ne fuyant pas), destiné à renfermer et à protéger le(s) récipients) primaire(s). Plusieurs récipients primaires enveloppés peuvent être mis dans un récipient secondaire. Il faut alors utiliser suffisamment de matériau absorbant et de rembourrage pour caler les récipients primaires. 3. Un emballage extérieur. Le récipient secondaire est mis dans un emballage extérieur qui le protège ainsi que son contenu contre les détériorations externes (chocs ou eau) pendant le transit.
Figure 1 : Le triple emballage On collera sur la paroi externe de l'emballage secondaire les formulaires donnant des indications sur l'échantillon, les lettres et toutes les informations identifiant ou décrivant l'échantillon ainsi que les informations identifiant l'expéditeur et le destinataire Conditions requises pour les matières infectieuses Le système du triple emballage s'utilise accompagné des spécifications, de l'étiquetage et de la documentation complémentaire suivante. Les matières infectieuses ne peuvent être transportées que dans des emballages répondant aux normes de la classe 6.2 de l'ONU, conformément aux instructions d'emballage 602. Ceci garantit que les emballages ont passé avec succès les épreuves requises comportant des chutes libres d'une hauteur de 9 m et des tests de perforation. L'emballage extérieur doit porter le marquage spécifique de l'ONU (figure 2). Il est possible d'obtenir, auprès des
Annexe
189
transporteurs, du ministère ou de l'administration nationale concernée (par exemple le ministère des transports, etc.), la liste des fournisseurs d'emballages agréés par l'ONU Marquage spécifique pour les emballages le marquage comprend : le symbole des Nations unies pour les emballages le type d'emballage la mention "CLASSE 6.23 Les 2 derniers chiffres de l'année de fabrication de l'emballage le nom de l'État ayant donné l'autorisation Le code du fabricant Les compagnies aériennes interdisent strictement le transport des matières infectieuses dans les bagages à main ou la valise diplomatique. La quantité maximale nette de matières infectieuses que peut contenir un emballage extérieur est de 50 ml ou 50 g si le transport est effectué par un avion de passagers. Autrement, la limite est fixée à 4 l ou 4 kg par colis pour les transports par avion cargo ou par d'autres moyens. Les récipients primaires dépassant 50 ml dans des emballages combinés doivent être placés de façon à ce que les fermetures soient vers le haut, et des étiquettes (flèches) indiquant "UP'" (HAUT) doivent être apposées sur 2 côtés opposés du colis. Les limites spécifiées pour le transport par avion de passagers ne s'appliquent pas au sang ou aux produits sanguins pour lesquels il n'y a pas de raison de croire qu'ils contiennent des matières infectieuses. Les récipients ne doivent cependant pas dépasser une contenance de 5OO ml chacun et le volume total de l'emballage extérieur ne doit pas être supérieur à 4 Étiquettes de risque pour les marchandises dangereuses Des étiquettes de risque spécifiques doivent être apposées sur la paroi externe de chaque emballage extérieur pour toutes les marchandises dangereuses expédiées par fret aérien. Les étiquettes suivantes sont importantes pour les organismes collectionnant les cultures et
les institutions expédiant des produits biologiques. Étiquette de risque pour les matières infectieuses et pour les micro-organismes génétiquement modifiés répondant à la définition de l'IATA pour les matières infectieuses : Nom :Infectious Substance (Matière infectieuse) Dimensions minimales : 100 x 100 mm Pour les petits colis : 50 x 50 mm (noir et blanc) Étiquette de risque pour les micro-organismes génétiquement modifiés non infectieux et pour le dioxyde de carbone à l'état solide (neige carbonique) : Nom : Miscellaneous (Divers) Dimensions minimales : 100 x 100 mm Pour les petits colis : 50 x 50 mm (noir et blanc)
Annexe
190
Étiquette de risque pour l'azote liquide Nom : Non-flammable gas (Gaz ininflammable) Dimensions minimales : 100 x 100 min Pour les petits colis : 50 x 50 mm (vert et blanc) Les colis renfermant des cultures en milieu liquide d'organismes infectieux ou d'organismes génétiquement modifiés doivent être placés de façon à ce que le(s) système(s) de fermeture du (des) récipient(s) interne(s) soi(en)t tourné(s) vers le haut. La position verticale du colis sera indiquée par 2 étiquettes de "sens du chargement" (flèches noires ou rouges). Celles-ci doivent être apposées sur 2 côtés opposés de l'emballage. Il est également permis de fixer une étiquette "THIS SIDE UP" (Haut) ou "THIS END UP" (Tenir debout) sur la face supérieure du colis Nom : Sens du chargement Dimensions minimales: 74 x 105 mm (noir ou rouge et blanc) Pour les petits colis de matières infectieuses, on peut réduire les dimensions de moitié. Au cas où les expéditions ne renfermeraient que des produits lyophilisés, la quantité doit être indiquée en g ou en mg et pas en ml. On apposera les étiquettes de "SENS DU CHARGEMENT"' pour éviter tout retard. Pour l'expédition de matières infectieuses, l'étiquetage de l'emballage extérieur doit comporter les éléments figurant dans la liste suivante. 1. L'étiquette internationale des matières infectieuses. 2. Une plaque-étiquette avec les renseignements suivants : nom, adresse et numéro de téléphone du destinataire (ou du consignataire) nom, adresse et numéro de téléphone de l'expéditeur (ou de son agent) désignation officielle ONU de transport (Matières infectieuses pour l'homme, ou pour les animaux selon le cas), suivie du nom scientifique du produit numéro ONU (Homme - UN2814, Animaux - UN2900) température de conservation (éventuellement). Si l'emballage extérieur est placé dans un suremballage (avec de la neige carbonique par exemple), le suremballage comme l'emballage extérieur doivent porter les informations mentionnées ci-dessus. Le suremballage doit porter une étiquette avec la mention suivante "INNER PACKAGES COMPLY WITH PRESCRIBED SPECIFICATIONS" (L'EMBALLAGE INTÉRIEUR CORRESPOND AUX NORMES REQUISES). 3 - Documents d'expédition obligatoires - ils sont fournis par le transporteur et apposés sur l'emballage extérieur: la déclaration de l'expéditeur pour les marchandises dangereuses (la figure 4 en donne un exemple) une liste de colisage ou une facture pro-forma comportant l'adresse du destinataire, le nombre de colis, le contenu détaillé, le poids, la valeur (remarque: déclarer "no commercial value" [sans valeur commerciale] si les articles sont fournis gratuitement) la lettre de transport aérien, le cas échéant. 4 - L'autorisation d'importation/ d'exportation et/ou la déclaration si nécessaire.
Annexe
191
5 - Si l'emballage extérieur renferme des récipients primaires de capacité cumulée dépassant 50 ml, au moins 2 étiquettes de "sens du chargement" (flèches) doivent être apposées sur des côtés opposés du colis afin de montrer sa position correcte. Conditions requises pour les échantillons de diagnostic Le système de base du triple emballage est utilisé avec les dispositions et normes d'étiquetage suivantes. Les échantillons de diagnostic peuvent être transportés dans des emballages répondant aux instructions d'emballage 650. Le marquage spécifique ONU n'est pas requis. Les récipients primaires peuvent contenir jusqu'à 500 ml chacun, le volume total du colis ne devant pas excéder 4 l. L'étiquetage de l'emballage extérieur pour l'expédition d'échantillons de diagnostic doit comporter les éléments suivants. 1. Une plaque-étiquette avec les informations suivantes : nom, adresse et numéro de téléphone du destinataire (ou du consignataire) nom, adresse et numéro de téléphone de l'expéditeur (ou de son agent) la déclaration suivante "Diagnostic Specimen Not Restricted, Packed in Compliance with Packing Instruction 650" (Échantillon de diagnostic, non réglementé, emballé conformément aux instructions d'emballage 650). 2. Documents d'expédition obligatoires - ils sont fournis par le transporteur et apposés sur l'emballage extérieur: une liste de colisage ou une facture pro-forma comportant l'adresse du destinataire, le nombre de colis, le contenu détaillé, le poids, la valeur (remarque: déclarer "no commercial value" [sans valeur commerciale] si les articles sont fournis gratuitement) la lettre de transport aérien, le cas échéant 3. L'autorisation d'importation et/ou d'exportation et/ou la déclaration si nécessaire. Remarque : l'étiquette pour les matières infectieuses et la déclaration de l'expéditeur pour les marchandises dangereuses ne sont pas obligatoires pour les échantillons de diagnostic Conditions requises pour la poste aérienne Les matières infectieuses et les échantillons de diagnostic peuvent être envoyés en recommandé par la poste aérienne. On utilise alors le système de base du triple emballage avec les mêmes normes que pour les autres moyens de transport. La mention "LETTRE" doit figurer à côté de l'adresse, de même que l'étiquette verte de déclaration de douane, requise pour les envois internationaux. Les échantillons de diagnostic doivent être identifiables au moyen de l'étiquette violette de l'UPU "PERISHABLE BIOLOGICAL PRODUCTS" (PRODUITS BIOLOGIQUES PÉRISSABLES). Les matières infectieuses doivent être identifiables au moyen de l'étiquette internationale pour les matières infectieuses (voir la figure 3). Elles doivent également s'accompagner du formulaire de déclaration de l'expéditeur pour les marchandises dangereuses (voir figure 4 à la fin du présent document). A cause des restrictions locales ou internationales, il convient de prendre tout d'abord contact avec le bureau de poste local afin de s'assurer que les matières emballées seront bien acceptées par le service postal.
Annexe
192
Réfrigérants La neige carbonique ou la glace utilisées éventuellement lors d'une expédition doivent être mises à l'extérieur de l'emballage secondaire. Si l'on a recours à de la glace, celle-ci doit se trouver dans un conteneur étanche et l'emballage extérieur doit être étanche également. A l'intérieur de l'emballage extérieur, l'emballage secondaire doit résister aux dommages qui pourraient éventuellement résulter de la fonte ou de la dissipation du réfrigérant. On ne doit pas mettre de neige carbonique à l'intérieur des récipients primaires ou secondaires à cause des risques d'explosion. Un suremballage (emballage extérieur isolant spécialement conçu à cet effet) peut être utilisé pour garder la neige carbonique. Dans ce cas, il doit permettre au dioxyde de carbone gazeux de s'échapper. Il faut alors observer les instructions d'emballage 904 de l'ONU. Si l'on utilise de la neige carbonique pour les matières infectieuses, les détails doivent figurer sur la déclaration de l'expéditeur pour les marchandises dangereuses. L'emballage le plus extérieur doit en particulier porter l'étiquette de risque "MISCELLANEOUS" (DIVERS) pour la neige carbonique (voir figure 3). Si l'on utilise de l'azote liquide comme réfrigérant, il convient de prendre à l'avance des dispositions spéciales avec le transporteur. Les récipients primaires doivent pouvoir résister à des températures extrêmement basses et il faut respecter les conditions d'emballage imposées par le transporteur. En particulier, l'emballage le plus extérieur doit porter l'étiquette "NON-FLAMMABLE GAS" (GAZ ININFLAMMABLE) (voir fig 3). Transport local de surface Les transports de spécimens du cabinet d'un médecin à un laboratoire, d'un hôpital à un laboratoire, ou d'un laboratoire à un autre sont des exemples de ce type de transport. Celui-ci peut être assuré par un hôpital, un laboratoire, un service de santé ou tout autre organisme ou bureau agréé. Les principes de sécurité qui s'appliquent alors sont les mêmes que pour le transport aérien ou international - les matières ne doivent avoir aucune possibilité de s'échapper du colis dans les conditions normales de transport. On observera les points suivants : 1. Les récipients contenant les spécimens doivent être étanches. 2. Si ces récipients sont des tubes, ils doivent être bouchés et mis sur des supports qui les maintiennent en position verticale. 3. Les récipients contenant les spécimens et les supports doivent être mis dans des boîtes en plastique ou en métal robustes et étanches, munies de couvercles fermant hermétiquement. 4. Le colis doit être calé dans le véhicule de transport. 5. Chaque colis doit être étiqueté conformément à son contenu. 6. Les formulaires de renseignements sur les spécimens et d'identification doivent accompagner chaque colis. 7. Dans chaque véhicule de transport doit se trouver un équipement pour intervenir en cas de déversement accidentel et comprenant : du matériau absorbant, un désinfectant chloré, une poubelle étanche et des gants ménagers réutilisables. Remarque : Les points 1 à 7 décrits ci-dessus ne se substituent pas aux prescriptions locales ou nationales.
Annexe
193
Planification du transport L'expéditeur a la responsabilité d'assurer pour toutes les matières infectieuses et les échantillons de diagnostic l'exactitude de la désignation, de l'emballage, de l'étiquetage et de la documentation. Le transport et le transfert efficaces des matières infectieuses exigent une bonne coordination entre l'expéditeur, le transporteur et le destinataire (le laboratoire qui reçoit l'envoi), pour assurer la sécurité des matières transportées et leur arrivée à destination en temps utile et en bon état. Cette coordination dépend de communications bien établies et d'une relation de partenariat entre les 3 parties en présence. Chacun a des responsabilités spécifiques dans la réalisation du transport. L'expéditeur 1 . Il conclut au préalable des arrangements avec le destinataire ; il se renseigne notamment pour savoir si un permis d'importation est requis. 2. Il conclut au préalable des arrangements avec le transporteur pour s'assurer que : l'expédition sera acceptée et le colis transporté de manière appropriée l'expédition (sans transbordement si possible) se fera par la voie la plus directe, en évitant une arrivée en fin de semaine. 3. Il prépare les documents nécessaires comprenant les autorisations, les documents de transport et d'expédition. 4. Il notifie au destinataire les arrangements pris pour le transport une fois qu'ils ont été conclus, suffisamment en avance par rapport à la date d'arrivée prévue. Le transporteur 1. Il fournit à l'expéditeur les documents et les instructions d'expédition pour leur mise en œuvre. 2. Il conseille l'expéditeur pour emballer correctement les marchandises. 3. Il aide l'expéditeur à trouver la voie la plus directe qu'il confirme ensuite. 4. Il garde puis archive la documentation relative à l'expédition et au transport. 5. Il surveille que, pendant le transit, les colis expédiés sont bien maintenus dans les conditions requises. 6. Il notifie à l'expéditeur tout retard prévu (ou enregistré) dans le transit. Le destinataire 1. Il obtient les autorisations nécessaires auprès des autorités nationales pour l'importation des matières. 2. Il fournit à l'expéditeur le(s) permis d'importation obligatoire(s), les autorisations et tous les autres documents requis par les autorités nationales. 3. Il s'organise pour réceptionner les colis efficacement et dans les meilleurs délais. 4. Il accuse immédiatement réception à l'expéditeur. Les expéditions ne doivent pas partir avant que : les arrangements aient été conclus à l'avance entre l'expéditeur, le transporteur et le destinataire le destinataire ait eu la confirmation auprès des autorités nationales que les marchandises pouvaient légalement être importées le destinataire ait confirmé qu'il n'y aurait aucun retard au moment de la livraison du colis à destination.
Annexe
194
On trouvera des informations détaillées sur la conduite à tenir et les mesures de sécurité à prendre d'urgence en cas d'accident de transport dans le Manuel de sécurité biologique en laboratoire, deuxième édition (à paraître). Genève : Organisation mondiale de la Santé (pages 56 à 58)
Publications
195
PUBLICATIONS
Publications
196
Publications
197
Footnote
(1) The authors either do not have a commercial or other association that might pose a
conflict of interest
Peter Miethe works for Senova GmbH, Winzerlaer Straße 2,D- 07745 Jena, Germany
(2) Financial support was received from the following sources:
Bundesministerium der Verteidigung [Sonderforschungsauftrag 23Z1-S-439902]
Deutsche Forschungsgemeinschaft [Sonderforschungsbereiche 593 (B3) & 535 (A13]
Canadian Institutes of Health Research [MOP-43921]
Public Health Agency of Canada
(3) All or part of this information has been presented at the following conferences:
Filoviruses: Recent Advances and Future Challenges Symposium (September 2006).
(4) Correspondence and requests for reprints should be addressed to:
Name: Andreas Lucht, Pivitsteich 15,D-32791 Lage, Germany
Tel.: +495232/61647
Fax: +495221/126-163
E-mail: [email protected]
(5) The current affiliations and addresses of the authors have NOT changed since the
completion of the study
Publications
198
Abstract
Ebola virus (EBOV) causes severe viral hemorrhagic fever (EHF) in regions of Central Africa
where medical facilities are ill equipped and diagnostic capabilities are limited. To obtain a
reliable test that can be easily implemented under these conditions, monoclonal antibodies to
the EBOV matrix protein (VP40), which had previously been found to work in a conventional
ELISA, were used to develop an immunofiltration assay for the detection of EBOV antigen in
chemically inactivated clinical specimens. The assay was evaluated using defined virus stocks
and specimens from experimentally infected animals. Its field application was tested during
an EHF outbreak in 2003. Although the original goal was to develop an assay that would
detect all EBOV species, in practice only the Zaire and Sudan species were detected. The
assay represents a first generation rapid field test for the detection of EBOV antigen that can
be performed in 30 minutes without electrical power or expensive or sensitive equipment.
Keywords: Ebola virus, viral haemorrhagic fever, monoclonal antibodies, antigen detection,
immunofiltration assay
Publications
199
INTRODUCTION
Four different species of the genus Ebolavirus (EBOV),family Filoviridae, have been
identified: Zaire ebolavirus (ZEBOV), Sudan ebolavirus (SEBOV), Cote d’Ivoire ebolavirus
(CIEBOV), and Reston ebolavirus (REBOV) [1]. SEBOV and ZEBOV strains cause a severe
form of viral hemorrhagic fever (VHF) with case fatality rates ranging from 53-90%. In
contrast, CIEBOV has only been implicated in a single clinical case of Ebola hemorrhagic
fever (EHF) and REBOV seems of low virulence for humans [2,3].
At present, acute filovirus diagnostics are mainly based on RT-PCR technology and antigen
capture enzyme-linked immunosorbent assays (ELISA), which can be supplemented by
antibody detection assays [summarized in 3, 4, 5]. These assays are established in national
and international reference laboratories equipped with the necessary biocontainment.
However, rapid and less sophisticated methods are urgently needed for diagnostics in the field
under rural or technically demanding conditions. In addition, cultural beliefs make the
collection of blood difficult in many communities. Therefore, diagnostic tests that utilize
more culturally acceptable clinical specimen such as urine are highly desirable.
The goal of this study was the development of a rapid, safe and reliable antigen-detecting
assay for blood and urine. The assay was based on the immunofiltration technology using
previously characterized EBOV-specific monoclonal antibodies (mAbs) directed against the
matrix protein VP40 of all known EBOV species and had previously been found to work in a
conventional ELISA [6]. In this newly developed assay one monoclonal antibody is bound to
the column matrix to immobilize EBOV VP40; the second monoclonal antibody is biotin-
labeled and used for detection of the bound viral antigen. VP40 is one of the most abundant
proteins in viral particles [7] and, therefore an appropriate target for antigen detecting assays.
MATERIAL AND METHODS
Viral antigens: ZEBOV, strain Mayinga; SEBOV, strain Boniface; CIEBOV, strain Cote
d’Ivoire; REBOV, strain Reston; and MARV, strains Musoke and Angola were grown in
Vero E6 cells under biosafety level 4 (BSL4) conditions [8]. The titer of most virus stock was
determined by TCID50 (infectious dose causing cytopathogenic effect (CPE) in 50% of
Publications
200
infected cultures) to be 4 x 107 TCID50/ml for ZEBOV, 1 x 105 TCID50/ml for SEBOV, 1 x
106 TCID50/ml for REBOV, and 5 x 106 TCID50/ml for MARV, strains Musoke and
Angola). We were unable to determine a titer for CIEBOV as this stock did not produce
visible CPE and a focus forming unit assay has not been developed. However, based on a RT-
PCR assay using EBOV generic primers the titer was estimated to be approximately one
log10 lower than REBOV (approx. 1 x 105 TCID50/ml). Viral stocks were inactivated either
by boiling for 10 min in 1% sodium dodecylsulfate (SDS) or gamma-irradiation (10 Mrad)
and were used to spike human serum and urine samples. In addition, antigen was prepared
from infected animals. Balb/c mice (female, 5 weeks of age) were infected intraperitoneally
with 1.5 x 103 plaque forming units (pfu) of the mouse-adapted strain of ZEBOV [9] in
BSL4; Mock-infected BALB/c mice served as control animals. EDTA blood was collected
from anaesthetized animals prior to euthanasia on days 2, 4 and 5 post infection by heart
puncture and virus was inactivated by gamma-irradiation (10 Mrads). All animal experiments
were performed in Winnipeg under an approved ‘Animal Use Document’ and following the
guidelines of the ’Canadian Council on Animal Care’.
Monoclonal antibodies: Murine hybridoma cell lines producing mAbs directed to ZEBOV
antigen had previously been used in an ELISA format [6]. Based on previous characterization,
the mAbs 5F6 and 2C4 were selected for large scale production in the Tecnomouse system
(Integra Biosciences, Lowell, MA, USA) using protein-free medium supplemented with high
glucose (4.5 g/l), high glutamine (4 mM) and 150 mg/l gentamycin (all Life Technologies,
Pairley, Scotland). The purification of the mAbs by protein G was performed using the mAb
Trap GII Kit (Amersham Pharmacia, Freiburg, Germany). Subsequently, the mAb 5F6 was
labeled with biotin using a Biotin Labelling Kit (Boehringer Mannheim GmbH, Mannheim,
Germany).
Clinical specimens: Clinical specimens were collected during an EHF outbreak in Mbomo
and Mbandza/RC, in December 2003 [10]. Samples were taken from two EHF cases (death at
days 7 and 8 after onset of symptoms), which were confirmed by RT-PCR and antigen
capture ELISA, thirteen suspected cases (days 6 to 20 after onset of symptoms), and five
asymptomatic contacts (table 1). In total, the specimens collection included 20 sera, 14 urine,
five saliva, two sweat and a one tear sample. In addition, 99 serum and 104 urine samples
from healthy German donors and 88 serum samples from African donors (kindly provided by
Publications
201
Herbert Schmitz, Bernhard-Nocht-Institut Hamburg, Germany) were used as negative
controls. Specimens were inactivated for serological testing by adding SDS to a final
concentration of 1% and for RT-PCR analysis as described below (see RNA isolation).
Immunofiltration assay: A detailed description of the assay and the test performance is
provided as Supplemental Online Material. Briefly, the column matrix was coated with 750 µl
mAb 2C4 (20 µg/ml in carbonate buffer - 0,1 M Na2CO3/NaHCO3, pH 9.0). Serum
specimens were incubated for 30 min with 1% SDS and diluted 1:4 (v/v) in sample dilution
buffer (0.01 M PBS/5% BSA/0.05% Tween 20). Urine specimens were mixed 9:1 (v/v) with
10 x urine buffer (0.1 M PBS/50% BSA/0.5% Tween 20) and cleared through a 1.2 m
syringe filter (Sartorius, Göttingen, Germany). The diluted specimens were applied to the
column matrix. The matrix was washed with 750 µl of wash buffer (0.01 M PBS/0.1%
BSA/0.05% Tween 20/0.1% BND), incubated with 500 µl of biotin-labeled second mAb 5F6
(10 µg/ml, diluted in 100 mM potassium phosphate buffer/1.5% casein/0.05% Tween 20/0.1%
BND) followed by 500 µl of streptavidin-HRP40 (Senova, Jena, Germany, 2 µg/ml, diluted in
100 mM potassium phosphate buffer/1,5% casein/0.05% Tween 20). The column was washed
three times (2 x wash buffer and 1 x substrate buffer - 100 mM NaCl/0.03% BND) and HRP
detection was initiated by adding 500 µl of TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine membrane
peroxidase substrate; KPL, Gaithersburg, Maryland, USA). The entire assay was performed in
approximately 30 minutes with all reagents supplied ready-to-use.
Confirmatory assays – IgG ELISA, antigen detection ELISA and RT-PCR: All clinical
specimens collected in Mbomo and Mbandza, RC, were shipped to Franceville/Gabon where
they were tested for EBOV-specific antigen and antibodies using established assays based on
ELISA format [11, 12, 13]. For RT-PCR, RNA from both cell-cultured derived material and
clinical specimens (140 µl) was isolated using the Viral RNA minikit from Qiagen
(Mississauga, Ontario, Canada) according to the manufacturer’s instructions.
Specimens/samples were analyzed using generic filovirus RT-PCRs targeted to the
nucleoprotein (NP) and polymerase (L) genes using the SYBR Green I amplification kit
(Roche, Laval, PQ) as described previously [5].
RESULTS
Publications
202
Assay sensitivity. The general assay cut-off was set to an OD510 of 0.4, calculated by the
mean of 99 negative human serum samples (m = OD 0.134) plus three standard deviations (s
= OD 0,094).
The sensitivity of the immunofiltration assay was determined using ZEBOV, strain Mayinga,
antigen serially diluted in human serum or urine in the absence or presence of 1% SDS. The
detection limit of the assay in the absence of SDS was 1 x 105 and 2 x 105 TCID50/ml for
urine and serum, respectively. In the presence of 1% SDS and 5% BSA (sample dilution
buffer), the assay showed greater sensitivity with a detection limit determined to be 1.25 x
104 TCID50/ml for both specimen sources (figure 1A). The sensitivity of the assay was
further evaluated by comparing our ZEBOV, strain Mayinga, antigen (stock 4 x 107
TCID50/ml) with a positive control antigen from an antigen detection ELISA (kindly
provided by TG Ksiazek and PE Rollin, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta,
Georgia, USA). Both specimens were run in parallel in the presence of 1% SDS and 5% BSA,
the serial dilution was 1:2 in the immunofiltration assay (figure 1B). Both antigens were
equally well detected in this assay and the detection limit was approximately 1.5 x 104
TCID50/ml.
The sensitivity of an assay could become more important for clinical specimens where
antigen might be diluted due to the larger volume. Accordingly, the immunofiltration system
was evaluated for the detection of ZEBOV and MARV antigen in 10 ml urine samples. Prior
to use, urine samples were filtered to avoid clogging of the column by urine sediment. Only
ZEBOV was detected in the urine samples, no signal was obtained from samples containing
MARV. The use of larger sample volumes significantly increased the OD values (ZEBOV
antigen) without
leading to higher background (MARV antigen) (figure 2). Thus, the use of larger urine
volumes can maximize the sensitivity of the assay.
Assay specificity. In order to determine the specificity of the assay, negative human control
serum (99 from German and 80 from African donors) and urine samples (104 samples from
German donors) were spiked with 1 x 105 TCID50/ml ZEBOV and compared to identical
nonspiked samples. The mean value and standard deviation was calculated for each group.
The viral antigen was well detected in the spiked sera and urines. Statistical analysis was
Publications
203
performed using student’s t-test. Significantly higher OD values were found in the spiked
samples compared with the corresponding non-spiked samples (p<0.01). No significant
differences were detected between non-spiked German and African serum samples, whereas
the slightly higher ODs for the spiked African sera might be explained by hemolysis after
repeated freezing and thawing of these samples leading to a reduced flow velocity and
therefore longer incubation time on the column (figure 3A).
Subsequently, the immunofiltration assay was tested for its cross-reactivity to antigen derived
from different EBOV species as well as from MARV. The monoclonal antibodies 5F6 and
2C4 had previously been shown to cross-react in immunoblot assays with strains of all four
known EBOV species but not MARV [6]. Thus, different levels of cross-reactivity were
expected with the different EBOV species but not MARV antigens. Viral antigen preparations
were treated with 1% SDS and 5% BSA and were run either undiluted or diluted in sample
buffer. The detection limits for SEBOV, REBOV, and ICEBOV antigens were <1 x 105
TCID50/ml, 1 x 106 TCID50/ml and >1 x 105 TCID50/ml, respectively (Fig. 3B) and, thus,
between 0.5-2 log10 higher than compared with ZEBOV antigen (figures 1 and 3B). Even
though the mAbs were able to recognize VP40 of REBOV and CIEBOV, the assay effectively
failed to detect these viruses. All MARV antigens (strain Musoke shown in figure 3B and
strain Angola not shown) remained negative even when applied undiluted indicating no cross-
reactivity with antigens from a different genus of the family Filoviridae.
Assay application. In order to evaluate the usefulness of the immunofiltration assay on
clinical specimens, we first tested serum samples from experimentally infected mice. The
blood specimens were inactivated by gamma-irradiation and run in the immunofiltration assay
at starting dilutions of 1:100. ZEBOV antigen was barely detectable on day 2 post infection
with increasing levels of viremia on the following days. The day 4 specimen remained
antigenpositive up to a dilution of 10-5 indicating viremia levels of approximately 109
TCID50/ml (data not shown).
The assay was first tested on human specimens during an outbreak of EHF in Central Africa
in 2003 [10]. A limited number of human specimens (serum, urine, saliva, sweat, tears) were
collected from probable (subsequently confirmed by RT-PCR and antigen detection ELISA)
and suspected EHF cases and contacts in families and the community. The immunofiltration
Publications
204
assay detected EBOV antigen in blood samples taken by heart puncture from two deceased
probable cases (table 1; figure 4). All clinical samples including serum, urine, saliva, sweat
and tear specimens from suspected cases and contacts were EBOV antigen negative even at
dilution as low as 1:4. To further confirm the results of the immunofiltration assay, all clinical
specimens were also tested by RT-PCR in the field or by antigen and antibody detection
ELISAs performed at the Centre Internationale Recherches Médicales de Franceville
(CIRMF) in Franceville (table1). Confirmatory testing fully supported the laboratory results
obtained by the immunofiltration assay (table 1). Subsequent sequence determination of the
amplicon of the only PCR-positive sample (table 1, No 2; figure 4) identified the causative
agent as a strain of ZEBOV. Epidemiological follow-up investigations of the lab tested
suspect EHF cases or contacts did not reveal any EHF symptoms or unexplained deaths,
further supporting the laboratory test results (table 1).
DISCUSSION
The development of this new immunoflitration assay for the detection of EBOV antigen will
provide future field response to EHF with a novel and long awaited tool. Despite being less
sensitive than RT-PCR, the immunofiltration assay demonstrated a similar sensitivity than the
widely used antigen detection ELISA [11, 12] but is rapid and far less prone to technical
complications. The detection of ZEBOV antigen in specimens derived from animals and
humans demonstrates its usefulness in human field diagnosis as well the detection of EBOV
in animal species such as the great apes.
The assay was based on a technique, which has previously been evaluated for the detection of
antibodies [14] and serum proteins [15]. Here we demonstrated for the first time the
applicability of the immunofiltration system to detect viral antigen. The assay is specific for
ZEBOV antigen but also detected SEBOV antigen with slightly lower sensitivity. Only weak
or no crossreactivity was observed with REBOV and CIEBOV antigens (Fig. 3B). In this
regard, it is important to note that with the exception of a single CIEBOV case [16], all
human EHF cases have been caused by ZEBOV and SEBOV making these two EBOV
species most important for public health response.
During the symptomatic stage of EHF viremia levels reach far beyond 106 pfu/ml with peak
levels of up to 108 or 109 pfu/ml [17]. Thus, it seems very reasonable that the
Publications
205
immunofiltration assay developed here, with detection limits of 1.25 x 104 TCID50/ml for
ZEBOV and < 1 x 105 TCID50/ml for SEBOV (TCID50 and pfu numbers may differ
approximately 2-10 fold; authors unpublished data), will be sufficiently sensitive to diagnose
a symptomatic ZEBOV or SEBOVinfected patient. This conclusion is supported by the
successful use of the assay to diagnose patients during the EHF outbreak in RC in 2003 [18]
as well as the detection of ZEBOV antigen in experimentally infected animals starting on day
2 post infection (this study). The usefulness of this assay to detect REBOV and CIEBOV in
clinical specimens is questionable, but the high viremia levels, which could be expected
during infection, may overcome the lower sensitivity for REBOV and CIEBOV and result in
a detectable reaction.
Biosafety is an important consideration in the diagnosis of VHFs such as EHF, particularly in
the field. Therefore, diagnostics should preferentially be performed on inactivated specimens.
The immunofiltration assay described here did not only perform well with SDS-treated and
thus inactivated serum and urine samples, but was superior over the use of native clinical
specimens. This is clearly an advantage over currently used antigen detection assays based on
ELISA format. However, it should be remembered that BSA needs to be added to SDS-
treated clinical specimens with low endogenous protein concentrations such as urine, saliva
and swabs. Under such low protein concentrations SDS might otherwise denature the
monoclonal antibodies.
During past EHF outbreaks in Gabon and RC [19, 20], the population has become
increasingly reluctant to blood sampling for reasons such as cultural beliefs, witchcraft, and
fear of infection through invasive manipulations such as bleeding. For example, cooperation
with the international teams ceased completely when the teams were accused of being the
source of the infection. In 2002, a similar belief and behaviour in the population forced a
WHO team to leave the region of an outbreak investigation [21]. In addition, nosocomial
infections, mainly via re-use of contaminated needles and syringes, are a well documented
and well known infection route during EHF outbreaks, leading to objection in the population
to invasive procedures such as venipuncture and vaccination [22]. Currently, aid agencies and
response personnel are looking into alternative clinical specimens for laboratory diagnosis,
which are non-invasive procedures and, thus, are more safely to obtain [23]. In the past,
EBOV had been detected in vaginal, rectal and conjunctival swabs, as well as in seminal fluid
Publications
206
[24]. Likely more acceptable by the population are urine samples, however the use of urine
samples in human EBOV diagnostics is not established. It was shown that urine of primates
experimentally infected with EBOV contained virus concentrations of up to 103-105 pfu/ml
[25]. Additionally, epidemiological studies suggest that contact with urine might play a role in
human-to-human transmission [26]. Using the immunofiltration assay we were able to detect
ZEBOV antigen in spiked human urine samples with a sensitivity of approximately 1.25 x
104pfu/ml. Since the column format allows for the application of larger volumes (up to 10
ml), the sensitivity of the assay may well be sufficiently high even if concentrations in urine
are in general lower than in serum.
Finally, the experience with the immunofiltration assay during the EHF outbreak in RC in
2003 demonstrated its field applicability in an extremely remote, infrastructure-poor
geographical region. Using this assay we were able to correctly diagnose two EHF cases and
exclude suspected cases and contacts, confirmed by the current gold standard assays for acute
diagnosis of EBOV; RT-PCR and antigen detection ELISA. Thus, in this outbreak the field
diagnostics played an important role in case patient management and contact tracing. The
rapid provision of results to the community may actually lessen cultural fears for invasive
procedures such as venipuncture as may have been the case in the EHF outbreak in Mbomo
where venipuncture was much more accepted [27]. A more extensive evaluation of this assay
under field conditions using larger specimen numbers is still missing, but the current results
are quite promising.
In conclusion, a rapid fieldable immunoflitration assay for the detection of EBOV antigen was
developed. The assay allowed for simple inactivation of specimens by SDS and accurate
results were provided in 30 minutes without the need for electrical power or technically
demanding equipment. Due to its simplicity, local staff was readily trained to perform this
assay. With the possibility of future treatment options for EHF patients [28, 29, 30, 31, 32,
33], early and followup on-site diagnosis becomes even more important. This test format may
fill a gap in future EHF outbreak management and might be adaptable for MARV infections
detection as well as infections caused by other related pathogens. In addition, the assay has
potential for application on wildlife species, in particular the great apes, which is affected by
EBOV infections in Central Africa (16, 34).
Publications
207
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank Ella Zeman (Bundeswehr Institute of Microbiology, Munich, Germany)
and Daryl Dick and Michael Garbutt (National Microbiology Laboratory, Public Health
Agency of Canada, Winnipeg, Canada) for excellent technical assistance. We are very
thankful to all those colleagues who supported our work in Mbomo, especially Phillippe
Yaba, Sebastiao Nkunku, André Salemo, Alain Epelboin, Derek Hardy, Kamel Ait-Ikhlef,
and Gerard Eon.
REFERENCES
1. Feldmann H, Geisbert TW, Jahrling PB, Klenk HD, Netesov SV, Peters CJ, Sanchez A,
Swanepoel R, Volchkov VE. Filoviridae. In: Virus Taxonomy, VIIIth Report of the ICTV
(Fauquet, CM, Mayo MA, Maniloff J, Desselberger U, Ball LA, eds). Elsevier/Academic
Press, London, 2005; 645-653.
2. Feldmann H, Jones S, Klenk HD, Schnittler HJ. Ebola virus: from discovery to vaccine.
Nat Rev Immunol 2003; 3 (8): 677-685.
3. Sanchez A, Feldmann H. Filoviridae: Marburg and Ebola Viruses. In: Knipe DM, Howley
PM, eds. Fields Virology. Fifth ed. Vol. 2. Philadelphia: Lippincott Williams & Wilkins,
2006. 1409-1448.
4. Grolla A., Lucht A, Dick D, Strong JE, Feldmann H. Laboratory diagnosis of Ebola and
Marburg hemorrhagic fever. Bull Soc Pathol Exot 2005; 98:205-209.
5. Strong JE, Grolla A, Jahrling PB; Feldmann H. Filoviruses and Arenaviruses. In: Manual
of Molecular and Clinical Laboratory Immunology (Detrick B, Hamilton RG, Folds JD, eds.).
ASM Press 2006. 774-790.
6. Lucht A, Grunow R, Möller P, Feldmann H, Becker S. Development, characterization and
use of monoclonal antibodies for the detection of Ebola virus. J. Virol Meth 2003; 111:21-28.
7. Elliott LH, Kiley MP, McCormick JB. Descriptive analysis of Ebola virus proteins.
Virology 1985; 147:169-176.
Publications
208
8. Becker S, Feldmann H, Will C, Slenczka W. Evidence for occurrence of filovirus antibodie
in humans and imported monkeys: do subclinical filovirus infections occur worldwide? Med
Microbiol Immunol 1992; 181:43-55.
9. Bray M, Davis K, Geisbert T, Schmaljohn C, Huggins J. A mouse model for evaluation of
prophylaxis and therapy of Ebola haemorrhagic fever. J. Infect Dis 1998; 78:651-661
10. World Health Organization. Ebola haemorrhagic fever, Republic of Congo. Weekl
Epidem Rec 2003; 78:405.
11. Ksiazek TG, Rollin PE, Jahrling PB, Johnson E, Dalgard DW, Peters CJ. Enzyme
immunosorbent assay for Ebola virus antigens in tissues of infected primates. J Clin
Microbiol 1992; 30:947-950.
12. Ksiazek TG, Rollin PE, Williams AJ, Bressler DS, Martin ML, Swanepoel R, Burt FJ,
Leman PA, KhanAS, Rowe AK, Mukunu R, Sanchez A, Peters CJ. Clinical virology of Ebola
hemorrhagic fever (EHF): virus, virus antigen, and IgG and IgM antibody findings among
EHF patients in Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 1995. J Infect Dis 1999; 79 Suppl
1:177-187.
13. Ksiazek TG, West CP, Rollin PE, Jahrling JB, Peters CJ. ELISA for the detection of
antibodies to Ebola viruses. J Infect Dis 1999; 179 Suppl 1: 192-198.
14. Schell D. Fast quantification of mouse IgG from cell culture supernatants. Animal Cell
Technology 1994; 94:366-368.
15. Hartmann H, Lübbers B, Cararetto M, Bautsch W, Klos A, Köhl J. Rapid quantification of
C3a and C5a using a combination of chromatographic and immunoassay procedures. J
Immunol Meth 1993; 166:35-44.
16. LeGuenno B, Formenty P, Wyers M, Gounon P, Walker F, Boesch C. Isolation and partial
characterization of a new strain of Ebola virus. Lancet 1995; 345:1271-1274.
17. Towner JS, Rollin PE, Bausch DG, Sanchez A, Crary SM, Vincent M, Lee WF,
Spiropoulou CF, KsiazekTG, Lukwiya F, Kaducu F, Downing R, Nichol ST. Rapid diagnosis
of Ebola haemorrhagic fever by reverse transcription – PCR in an outbreak setting and
assessment of patient viral load as a predictor of outcome. J Virol 2004; 78 (8): 4330-4341.
18. Boumandouki P, Formenty P, Epelboin A, Campbell P, Atsangandoko C, Allangarar Y,
Leroy EM, Kone MI, Molamou A, Dinga-Longa O, Salemo A, Kounkou RY, Mombouli V,
Ibara JR, Gaturuku P, Nkunku S, Lucht A, Feldmann H. Clinical management of patients and
deceased during the Ebola outbreak from October to December 2003 in Republic of Congo.
Bull Soc Pathol Exot 2005; 98:218-223.
Publications
209
19. World Health Organization. Ebola haemorrhagic fever, Congo – update. Weekl Epidem
Rec 2003; 78:49.
20. World Health Organization. Ebola, Gabon (update). Ebola, Congo (update). Weekl
Epidem Rec 2002; 77:97.
21. World Health Organization. Ebola, Gabon and Congo (update). Weekl Epidem Rec 2002;
77:9.
22. Peters CJ, LeDuc JW. An introduction to Ebola: The virus and the disease. J Infect Dis
1999; 178:ix-xvi.
23. Formenty P, Leroy EM, Epelboin A, Libama F, Lenzi M, Sudeck H, Yaba P, Allarangar
Y, Boumandouki P, Nkounkou VB, Drosten C, Grolla A, Feldmann H, Roth C. Detection of
Ebola virus in oral fluid specimens during outbreaks of Ebola virus Hemorrhagic Fever in the
Republic of Congo. Clin Infect Dis 2006; 42:1521-26.
24. Rodriguez, LL, De Roo A, Guimard Y, Trappier SG, Sanchez A, Bressler D, Williams AJ,
Rowe AK, Bertolli J, Khan AS, Ksiazek TG, Peters CJ, Nichol ST. Persistence and genetic
stability of Ebola virus during the outbreak in Kikwit, Democratic Republic of the Congo,
1995. J Infect Dis 1999; 179 Suppl 1:S170-S176
25. Fisher-Hoch SP, Platt GS, Neild GH, Southee T, Baskerville A, Raymond RT, Lloyd G,
Simpson DIH. Pathophysiology of shock and hemorrhage in a fulminating viral infection
(Ebola). J Infect Dis 1985; 152:887-894.
26. Dowell S, Mukunu FR, Ksiazek TG, Khan AS, Rollin PE, Peters CJ. Transmission of
Ebola hemorrhagic fever: a study of risk factors in family members, Kikwit, Democratic
Republic of the Congo, 1995. J Infect Dis 1999; 179 Suppl 1:S87-S91.
27. Hewlett BS, Epelboin A, Hewlett BL, Formenty P. Medical anthropology and Ebola in
Congo: cultural models and humanistic care. Bull Soc Pathol Exot 2005; 98:230-236.
28. Stroeher U, Feldmann H. Progress towards the treatment of Ebola haemorrhagic fever.
Expert Opin Investig Drugs. 2006; 15(12):1523-1535.
29. Feldmann H, Jones SM, Schnittler HJ, Geisbert T. Therapy and prophylaxis of Ebola
virus infections. Curr Opin Investig Drugs 2005; 6(8):823-30.
30. Enterlein S, Warfield KL, Swenson DL, Stein DA, Smith JL, Gamble CS, Kroeker AD,
Iversen PL, Bavari S, Mühlberger E. VP35 knockdown inhibits Ebola virus amplification and
protects against lethal infection in mice. Antimicrob Agents Chemother 2006; 50 (3):984-993.
Publications
210
31. Geisbert TW, Hensley LE, Jahrling PB, Larsen T, Geisbert JB, Paragas J, Young HA,
Fredeking TM, Rote WE, Vlasuk GP. Treatment of Ebola virus infection with a recombinant
inhibitor of factor VIIa/tissue factor: a study in rhesus monkeys. Lancet 2003; 362:1953-58.
32. Paragas J, Geisbert TW. Development of treatment strategies to combat Ebola and
Marburg viruses. Expert Rev Anti Infect Ther 2006; 4 (1):67-76.
33. Bray M, Paragas J. Experimental therapy of filovirus infections. Antiviral Res 2002;
54(1):1-17.
34. Leroy EM, Rouquet P, Formenty P, Souquiere S, Kilbourne A, Froment JM, Bermejo M,
Smit S, Karesh W, Swanepoel R, Zaki SR, Rollin PE. Multiple Ebola virus transmission
events and rapid decline of central African wildlife. Science 2004; 303:387-390.
Publications
211
FIGURE LEGENDS
Figure 1: Sensitivity testing. (A) Influence of inactivation. The figure shows a line plot of
titration of gamma-inactivated ZEBOV, strain Mayinga, antigen diluted in serum or urine
with and without the addition of 1% SDS. Key, (○) = ZEBOV in serum; (●) = ZEBOV in
serum with 1% SDS; (∆) = ZEBOV in urine; (▲) = ZEBOV in urine with 1% SDS and 5%
BSA. (B) Comparison with standard positive control from an antigen detection ELISA.
The figure shows a line plot of a comparative titration in the immunofiltration assay between
gammainactivated ZEBOV, strain Mayinga, antigen and a defined positive control antigen
from a widely used antigen detection ELISA (provided by T.G. Ksiazek and P.E. Rollin,
CDC, Atlanta). Both antigens were treated with 1% SDS and 5% BSA prior their dilution.
Key: OD510 = optical density at a wavelength of 510 nm; TCID50 = tissue culture infectious
dose 50; dotted line = cut-off of the assay as determined by the mean of the OD of 99
negative control sera plus three standard deviations.
Figure 2: Sensitivity testing using larger volumes of urine samples. Dilutions of ZEBOV
(strain Mayinga) and MARV (strain Musoke) antigens (previously treated with 1% SDS and
5% BSA) in different volumes of urine were loaded on the column for antigen detection.
Note, increasing volume of urine spiked with MARV antigen did not result in false-positives.
Key: ZEBOV = Zaire ebolavirus, strain Mayinga; MARV = Lake Victoria marburgvirus,
strain Musoke; OD510 = optical density at a wavelength of 510 nm; TCID50 = tissue culture
infectious dose 50; dotted line = cut-off of the assay as determined by the mean of the OD of
99 negative control sera plus three standard deviations.
Figure 3: Specificity testing. (A) Comparison of spiked and non-spiked serum and urine
samples. In order to test the specificity of the immunofiltration assay, negative control sera
from 99 German and 80 African donors as well as urine samples from 104 German donors
were spiked with ZEBOV (approx. 1 x 105 TCID50/ml) and compared to the corresponding
non-spiked samples. The mean values (minus and plus one standard deviation) are shown for
each group of non-spiked and spiked samples. Statistical analysis revealed significantly
higher values for the spiked serum and urine samples in comparison with the non-spiked
samples. Regarding the sample matrix, significant differences were detected between serum
Publications
212
and urine with lower values for unspiked and higher positive values for spiked urine samples
in comparison with serum. (B) Cross-reactivity with other Ebola and Marburg antigens.
Different EBOV and MARV antigen preparations (5 x 104 – 2 x 106 TCID50/ml) were
applied to the column in the presence of 1% SDS. Key: white bars = high antigen
concentrations; black bars = diluted (1:2 in sample buffer) antigen concentrations; numbers
above the bars = TCID50/ml (tisue culture infectious dose 50); OD510 = optical density at a
wavelength of 510 nm; ZEBOV = Zaire ebolavirus, strain Mayinga; SEBOV = Sudan
ebolavirus, strain Boniface; REBOV = Reston ebolavirus, strain Reston; CIEBOV = Cote
d’Ivoire ebolavirus, strain Cote d’Ivoire; MARV = Lake Victoria marburgvirus, strain
Musoke.
Figure 4: Immunofiltration assay. (A) Field set up. This figure shows the photometer and a
rack with immunofiltration columns as it was run in the field. (B) Results of a field test. A
representative test result from Mbomo, Republic of the Congo is shown. Key: N = negative
control serum; P = Zaire ebolavirus (ZEBOV), strain Mayinga, positive control; 1 to 9 =
different patient sera. Patient sera 1 and 6 were ZEBOV antigen-positive (see also table 1,
patients 1 and 2); all other sera were ZEBOV antigen-negative. The visual results were
confirmed by photometric determination.
Publications
213
Table 1: Laboratory results from the outbreak investigation in Mbomo,
RC, 2003
Publications
214
F = female; M = male; a RT-PCR was performed in the field by the authors; b
antigen and antibody detection ELISAs were performed at the Centre
Internationale Recherches Médicales de Franceville (CIRMF) in Franceville.
Publications
215
Publications
216
Publications
217
Publications
218
Supplemental Online Material
Immunofiltration assay: Principle: The mAbs 2C4 and 5F6 were used to develop an
immunofiltration assay based on the ABICAP� technology (Antibody Immuno Column for
Analytical Processes, Senova GmbH, Jena, Germany). The columns (5.5 cm in height with a
porous matrix of 40 cm2) operate as a flow-through ELISA being driven by gravity at a
velocity of 350 µl/min. The enzymatic detection is based on precipitation of
tetramethylbenzidine (TMB), which results in a blue staining of the filter elements. The
quantification is done using a batteryoperated, handheld photometer designed for read-out of
dyes on ABICAP columns in transmission mode and displayed in optical density units OD =
log Io/I (Io = light intensity of non-stained reference column (or column before substrate
addition), I = light intensity after staining). Column preparation: The polyethylene filter
elements in the columns, were treated with successive washes of 750 µl 96% ethanol, 750 µl
50% ethanol and 750 µl carbonate buffer (0,1 M Na2CO3/NaHCO3, pH 9.0). The elements
were then coated with 750 µl mAb 2C4 in carbonate buffer (20 µg/ml) and the remaining
binding sites were blocked by 750 µl of 0.01 M PBS/1.5% BSA. Finally, the outlets of the
columns were blocked by stoppers and 750 µl of storage buffer [0.01 M PBS/1.5% BSA,
0.05% BND (5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane; Senova, Jena, Germany] was added to the matrix
prior to covering the top of the column with a plastic lid. The columns were stored for up to 9
months at 4°C. Alternatively, the coated columns were dried allowing storage for up to one
year at room temperature or 3 months at tropical temperatures (35°C). Sample preparation:
Clinical specimens (serum and urine) were incubated for 30 min with 1% SDS to denature
and inactivate virus particles. Specimens were then diluted 1:4 (v/v) in sample dilution buffer
(0.01 M PBS/5% BSA/0.05% Tween 20). Alternatively, to avoid the dilution step for urine,
prior to use, urine specimens and 10 x urine buffer (0.1 M PBS/50% BSA/0.5% Tween 20)
were mixed 9:1 (v/v). Before urine was applied to the column, the specimens were filtered
through a 1.2 m syringe filter (Sartorius, Göttingen, Germany). Assay performance: The
diluted specimens were applied to the column matrix and washed with 750 µl of wash buffer
(0.01 M PBS/0.1% BSA/0.05% Tween 20/0.1% BND). Subsequently, 500 µl of biotin labeled
antibody 5F6 (10 µg/ml, diluted in 100 mM potassium phosphate buffer/1.5% casein/0.05%
Tween 20/0.1% BND, pH 4.9) was loaded followed by 500 µl of streptavidin-HRP40
(Senova, Jena, Germany, 2 µg/ml, diluted in 100 mM potassium phosphate buffer/1,5%
casein/0.05% Tween 20). The column was washed twice with 750 µl of wash buffer and one
time with substrate buffer (100 mM NaCl/0.03% BND). HRP detection was initiated with the
Publications
219
addition of 500 µl of TMB (3,3′,5,5′-tetramethylbenzidine membrane peroxidase substrate;
KPL, Gaithersburg, Maryland, USA) and the reaction was stopped with 750 µl substrate
buffer. The optical density (OD) of the precipitated TMB, which is proportional to the VP40
concentration of the sample, was measured at 510 nm. The cut-off was determined to be the
mean of 99 negative control sera plus three standard deviations and also used for urine
samples. The entire assay was performed in approximately 30 minutes with all reagents
supplied ready-to-use.
Publications
220
Microbes and Infection 7 (2005) 1005-1014
www.elsevier.com/locate/micinf
Review
The natural history of Ebola virus in Africa
Xavier Pourrut a,b, Brice Kumulungui a, Tatiana Wittmann a, Ghislain Moussavou a, André Délicat a, Philippe Yaba a, Dieudonné Nkoghe c, Jean-Paul Gonzalez d,
Eric Maurice Leroy a,b,*
Centre International de Recherches médicales de Franceville, BP769 Franceville, Gabon Institut de Recherche pour le Développement (IRD), UT178, BP769 Franceville, Gabon
c Programme National Tuberculose, BP5879 Libreville, Gabon d Institut de Recherche pour le Développement (IRD), UT178, Mahidol University at Salaya, Phutthamonthon 4, Nakhonpathom 73170, Thailand
b
a
Available online 16 May 2005
Abstract
Several countries spanning the equatorial forest regions of Africa have had outbreaks of Ebola hemorrhagic fever over the last three decades. This article is an overview of the many published investigations of how Ebola virus circulates in its natural environment, focusing on the viral reservoir, susceptible animal species, environmental conditions favoring inter-species transmission, and how the infection is trans- mitted to humans. Major breakthroughs have been made in recent years but many outstanding questions must be dealt with if we are to prevent human outbreaks by interfering with the viral life cycle. © 2005 Elsevier SAS. All rights reserved.
Keywords: Ebola; Human; Viral reservoir; Bat; Primate; Zoonosis
1. Introduction
Ebola hemorrhagic fever is caused by a negative-strand RNA virus. The viral genome encodes seven structural pro- teins and one non-structural protein (soluble glycoprotein) [1]. Morphologically, the virus consists of a linear genome entirely enclosed in an envelope, which is coated by the mem- brane glycoprotein, organized in homotrimers [2]. Genetic and antigenic characterization of Ebola virus (EBOV) iso- lates during human outbreaks has led to the identification of four subtypes [3]—Ebola Sudan, E. Zaire, E. Ivory Coast and E. Reston. In contrast to Ebola Reston, which originates in Asia and has never been reported to cause human disease [4,5], the other three subtypes circulate on the African sub- continent and are pathogenic for humans, causing a specific febrile hemorrhagic disease. After an incubation period of about a week, victims rapidly develop high fever, diarrhea,
* Corresponding author. Tel.: +241 67 70 92; fax: +241 67 72 95. E-mail address: [email protected] (E.M. Leroy).
1286-4579/$ - see front matter © 2005 Elsevier SAS. All rights reserved. doi:10.1016/j.micinf.2005.04.006
vomiting, respiratory disorders and hemorrhaging. Death ensues within a few days. The case fatality rates are about 80% with E. Zaire [6,7] and 50% with E. Sudan [8,9].
Ebola virus hemorrhagic fever is a zoonotic disease trans- mitted accidentally by direct contact with infected live or dead animals. Since the first recorded human outbreak in 1976, many teams have attempted to unravel the natural history of EBOV in Africa. In this setting the natural history can be defined as the sum of the different ways in which the virus circulates in its natural environment, from its natural host(s) to susceptible intermediate animal species (i.e. those which develop fatal infection), and then to humans, either directly via the natural host or through an intermediate species.
This article reviews many previous studies designed to elu- cidate the natural history of EBOV. We describe current knowledge and outstanding questions in the following order: first, result from studies of human outbreaks, which help to throw light on the ecological context of EBOV emegence and to identify sources of infection; second, the way in which the virus infects humans; third, naturully infected intermedi- ate animal species (how they are infected by the reservoir and how the infection spreads within their populations); and finally, attempt to identify the EBOV reservoir.
Publications
221
1006 X. Pourrut et al. / Microbes and Infection 7 (2005) 1005-1014
2. Human outbreaks
2.1. 1976-1979: The first recorded Ebola outbreaks
EBOV first emerged in the form of two nearly simulta- neous outbreaks, one due to E. Sudan and the other to E. Zaire. The first outbreak was due to Ebola Sudan (Fig. 1). As its name implies, it occurred sn Sudan, near the border with the Democratic Republic of the Congo (DRC) (formerly Zaire), mainly affecting the towns of Nzara and Maridi [8], between June and Novembe 1976. The mortality rate was 53% (150 of 284 victims), which is characteristic of the Sudan subtype.
The seocnd outbreak was due to E. Zaire (Fig. 1). It occured in DRC, near the borders with Sudan and the Cen- tral African Republic (CAR), between August and Novem- ber 1976 [10]. The epicenter was in Yambuku, about 800 km from Nzara. This previously unknown disease was named for the river Ebola, which flows past Yambuku. The mortality rate was 89% (284 deaths among 318 declared victims).
EBOV made its third appearance in June 1977, infecting a 9-year-old girl living in Tandala, a DRC town close to the border with CAR [11], 325 km from Yambuku (Fig. 1). She
died with typical critical manifestations of hemorrhagic fever due to E. Zaire. No secondary cases were identified.
The third outbreak (the second due to E. Sudan) occurred between July and october 1979 in the same region as the first, i.e. in Nzara, Sudan [9]. As in 1976, the first persons to be infected worked in the Nzara cotton factory. This outbreak was less extensive than the first, affecting 34 people and kill- ing 22 (mortality 65%).
2.2. 1994-1997: Ebola resurgence
After a 15-year period in which no further cases were recorded, Ebola re-emerged in 1994 for a 3-year period. This new phase was marked by the identification of a new sub- type, E. Ivory Coast, and by an escalation of outbreaks due to E. Zaire.
The first human case to be diagnosed in Africa during this period occurred in June 1994, when a female Swiss ethnolo- gist became ill a few days after autopsying a chimpanzee found dead in Tai National Park (Fig. 1) located in Ivory Coast, not far from the border with Liberia [12,13,14]. EBOV infec- tion was confirmed in both them woman and the chimpanzee.
Fig. 1. Human EBOV outbreaks in Africa. RC: Republic of Congo; DRC: Democratic Republic of Congo.
Publications
222
X. Pourrut et al. / Microbes and Infection 7 (2005) 1005-1014 1007
Although this case occurred in a biotope similar to that of the first outbreaks, and at the same distance from the equator (about 5° north), it was the first and only human case observed in West Africa, and the only case clearly attributed to E. Ivory Coast.
The first outbreak during this period (the fourth in total) occurred in the town of Kikwit, situated about 500 km south- east of the DRC capital, Kinshasa [15] (Fig. 1). Between Janu- ary and July 1995, the virus killed 256 of its 315 victims, a mortality rate (81%) characteristic of the Zaire subtype. Despite the use of more sophisticated scientific and medical resources than those available in 1976, this outbreak was as large as the 1976 outbreak, probably because it affected a town of several hundred thousand inhabitants where person- to-person transmission was occurring primarily in two of the hospitals in the town.
Finally, three further outbreaks, all due to E. Zaire, occurred in northeast Gabon [16] (Fig. 1), the first in Mek- ouka between 1994 and 1995, the second in Mayibout in early 1996, and the third in Booué between 1996 and 1997.
The first of these three outbreaks occurred in northeastern Gabon, close to the border with Cameroon, between Decem- ber 1994 and February 1995 [17]. It took place in two suc- cessive waves: the first affected three gold-miners' camps located in the heart of the forest, in December 1994, with 32 recorded clinical cases. Some of the victims left the camps for the nearest hospital, located in Makokou, where they infected other patients and caused a second wave. Sixteen cases were retrospectively identified in neighboring villages. In total, 49 clinical cases and 29 deaths were recorded (mor- tality rate 59%). Epidemiological data in this outbreak are somewhat imprecise, and not all clinical cases were recorded: EBOV infection was diagnosed retrospectively, and only in patients whose stored clinical samples were available.
In February 1996 the second outbreak hit the villages of Mayibout I and II, located about forty kilometers south of Mekouka along the river Ivindo [16]. The first victims were 18 children in Mayibout II village who had helped to carry and butcher a chimpanzee carcass found in the forest. These 18 children infected their families and friends, who in turn transmitted the disease to neighboring villages—Mayibout I to the south and Mvadi to the north. In total, this outbreak affected 31 people and caused 21 deaths (mortality rate 67.7%).
The third outbreak, the Booué outbreak, occurred between October 1996 and March 1997. Officially, it began on 5 Octo- ber 1996, when the first patients tested positive by antigen capture [16]. However, epidemiological investigations indi- cated that it in fact began 2 months earlier; the index case was a hunter who died with hemorrhagic fever. Several car- casses of chimpanzees were found in the surrounding forest at the same time, and the CDC in Atlanta detected EBOV antigens in tissue samples taken from one of them. At the end of the same month, a second hunter died with similar symp- toms, while one of his friends fell ill 12 days later and was taken to Booué hospital. This patient left the hospital for a
village close to Booué, where he received traditional treat- ment, including scarification, from a nganga. The traditional healer, his assistant and some of his subsequent patients also became infected and in turn transmitted the disease to inhab- itants of several towns and villages in Gabon. Fifteen cases and 11 deaths were recorded in Libreville, together with three cases in Lastourville, 130 km southeast of Booué. This out- break also caused a case in South Africa: a Gabonese physi- cian working in Libreville, unaware that he was infected by EBOV, traveled to Johannesburg for treatment, where he infected a nurse, who died a few days later. This outbreak, with 60 cases and 45 deaths occurring over a 6-month period, was noteworthy for its wide geographic range (which also probably explains its size).
2.3. 2000-2004: An emerging geographic pattern of E. Zaire and resurgence of E. Sudan
This period saw multiple outbreaks of E. Zaire in a rela- tively limited area (the border region of Gabon and the Repub- lic of Congo), and by the resurgence of E. Sudan in Sudan and Uganda (Fig. 1). The other outstanding feature of this period is the occurrence of Ebola outbreaks in large animal species (mainly gorillas and chimpanzees).
2.3.1. E. Zaire outbreaks The first outbreak during this period was the Mekambo
outbreak, which occurred between October 2001 and May 2002 [18] (Figs. 2 and 3). The Mekambo outbreak was in fact a series of independent outbreaks [19]. The first occurred in the village of Mendemba on 25 October 2001 (Fig. 3). This was the most severe, and generated several secondary foci (in Mekambo, and also the RC villages of Ntolo, Ilahounene, Ekata and Olloba). The secondary focus in Mekambo itself generated a tertiary focus in Makokou, following the evacu- ation of a patient from Mekambo to the Makokou hospital. This outbreak appears to have started when hunters manipu- lated an antelope carcass they had found. Two other out- breaks occurred more or less simultaneously (on 28 Novem- ber 2001 and 1 December 2001) in the villages of Ekata and Olloba in the other side of the border, in the Congo. These outbreaks apparently started when local hunters found and manipulated the carcasses of an antelope (Ekata) and a gorilla (Olloba). Two other outbreaks occurred 3 weeks later, some distance apart: the first on 22 December 2001 in Ekata vil- lage located on the road leading south from Mekambo towards RC, and the second on 29 December 2001 in Etakangaye vil- lage located on the northern axis. The source of the first out- break has not been identified, while the second resulted from the handling of a chimpanzee carcass. The last clearly iden- tified outbreak occurred on 27 March 2002 when hunters from Grand-Etoumbi village (on the northern axis) butchered and ate a gorilla carcass they had found in the forest. The out- breaks that occurred on the Mekambo-Olloba axis then spread to the other side of the border, as far as the RC town of Mbomo, located about 80 km from Olloba.
Publications
223
1008 X. Pourrut et al. / Microbes and Infection 7 (2005) 1005-1014
Fig. 2. EBOV outbreaks in the border region of Gabon and the Republic of Congo. RC: Republic of Congo; DRC: Democratic Republic of Congo; CAR: Central African Republic.
Simultaneously, a second outbreak occurred in mid- January in the RC villages of Entsiami, Abolo and Ambomi, located close to the Gabonese border, and nearly 200 km south of Olloba (Fig. 3). The disease then spread to the town of Kelle about 65 km away (Fig. 2). The origin of this outbreak is unknown. Sequencing of viral isolates confirmed the exist- ence of several concurrent outbreaks.
The third outbreak, confirmed by laboratory tests, again affected the region of Mbomo in RC, between December 2002 and May 2003 [20] (Fig. 3). This outbreak had two inde- pendent sources, one in Yembelengoye (near Entsiami) and one in Mvoula, a gold-mining camp located further east, fol- lowing the handling of animal carcasses. The Mvoula focus mainly affected Mbomo, while the Yembelengoye focus
Fig. 3. EBOV outbreaks in the border region of Gabon and the Republic of Congo.
Publications
224
X. Pourrut et al. / Microbes and Infection 7 (2005) 1005-1014 1009
mainly affected Kelle. This outbreak involved 143 cases and 128 deaths.
The last outbreak to occur during this period again affected the region of Mbomo, between October and December 2003 [21]. The first cases occurred in Mbanza, a village located about 30 km north of Mbomo (Fig. 3). No animal source was clearly identified. There were 35 cases and 29 deaths.
Simultaneously with these human outbreaks, major Ebola outbreaks also affected animal species, including gorillas, chimpanzees and duikers, apparently accounting for the sharp population declines observed in these regions [22,19,23].
2.3.2. E. Sudan outbreaks Two outbreaks of E. Sudan occurred during this period
(Fig. 1). The site of the first was in Uganda between October 2000 and January 2001, causing 173 deaths among its 425 vic- tims (mortality rate 40.7%) [24]. This was numerically the largest of all recorded outbreaks, and comprised three foci, one in the immediate area of Gulu, one in the town of Mas- indi, and another smaller outbreak in Mbarara, where a mili- tary patient carried the outbreak.
In contrast, the second outbreak was the smallest ever recorded, with 17 cases and seven deaths during May and June 2004; this mortality rate (41%) is characteristic of E. Sudan [25]. The outbreak occurred in Sudan, in a town called Yambio, located only a few dozen kilometers from Nzara and Maridi, which had been the sites of outbreaks in 1976 and 1979.
Thus, since the discovery of EBOV in 1976, there have been 13 outbreaks in Africa (nine due to E. Zaire and four to due to E. Sudan) and two isolated cases (due to E. Zaire and E. Ivory Coast). These outbreaks took place during three dis- tinct periods (three between 1976 and 1979, four between 1994 and 1997, and six between 2000 and 2004). In total, EBOV-infected about 1850 people and caused nearly 1300 deaths. The different EBOV subtypes showed a certain geo- graphic pattern, E. Ivory Coast affecting West Africa, E. Sudan east Africa, and E. Zaire central Africa. In contrast, the ecological circumstances of human outbreaks due to the three African EBOV subtypes were very similar, all involv- ing forest regions located near the equator. These regions share a number of climatic and ecological characteristics, such as dense vegetation and a tropical climate, with two peaks of rainfall separated by dry seasons.
In contrast, several other outbreaks were clearly linked to animal carcasses. As mentioned above, a Swiss ethnologist became infected by E. Ivory Coast in 1994 while autopsying a chimpanzee (this remains the only recorded case of human infection by this subtype). The animal was found to be infected by the same EBOV strain as the ethnologist [12]. Similarly, the 1996 Mayibout outbreak in Gabon started among chil- dren who had found and butchered a chimpanzee carcass in the forest [16]. Similar sources have been reported for Mar- burg virus, the other member of the Filoviridae family: the 1967 outbreak in Marburg and Belgrade was linked to the handling of organs and tissues from vervet monkeys imported from Uganda [26,27].
The sources of the outbreaks that occurred in the border region of Gabon and RC between 2001 and 2003 are well documented. All these outbreaks (some of which had mul- tiple sources) occurred after people had handled animal car- casses found in the forest (mainly gorillas, chimpanzees and duikers) [19]. We use the term "epidemic chain" to designate all human cases of infection arising from a given index case and thus from a given animal carcass. Gorilla carcasses were the source ot the epidemic chains in Olloba 2001, Grand- Etoumbi 2002, Entsiami 2002 and Yembelengoye 2002. Chimpanzee carcasses appear to have been the source of the epidemic chains in Etakangaye 2001 and Olloba 2002. Finally, duiker carcasses apparently caused the epidemic chains in Mendemba 2001, Ekata 2001 and Mvoula 2003.
3.2. Transmission from the reservoir
There is currently no firm proof that humans can be directly infected by the (unknown) EBOV reservoir species, but sev- eral lines of evidence support this possibility.
3.2.1. Bats: epidemiological evidence Bats were noted in several occasions in the warehouses of
the cotton factory, which employed the first people to be infected during the 1976 and 1979 outbreaks in Nzara, Sudan. No other likely source of infection was identified in either outbreak.
It is also noteworthy that the Australian who was infected by Marburg virus (and subsequently infected two other people in Johannesburg in 1975) had just returned from a trip to Zim- babwe, during which he had slept frequently in the open and once in an abandoned house, the loft of which was inhabited by numerous bats.
A few days before becoming ill, the French engineer who was infected by Marburg virus in Kenya in 1980 (and who subsequently infected his doctor) had visited caves contain- ing large bat populations [28]. However, when baboons and vervet monkeys were placed in cages inside the same caves, none became infected [29].
Two families of viruses (the Rhabdoviridae and Paramyx- oviridae) are genetically related to the Filoviridae [30]. The order Mononegavirales encompasses all viruses with genomes consisting of a single negative-strand of non-segmented RNA.
3. EBOV transmission to humans
3.1. Transmission from infected animals
In most outbreaks the source of the human index case was not identified. This includes all the outbreaks occurring from 1976 to 1979, the outbreaks of Mekouka (Gabon) in 1995, Booué (Gabon) in 1996, Kikwit (DRC) in 1995, and all the outbreaks of E. Sudan in Sudan (1976, 1979 and 2004) and Uganda (2000).
Publications
225
1010 X. Pourrut et al. / Microbes and Infection 7 (2005) 1005-1014
The other two principal families in this order are the Paramyx- oviridae (Hendra virus, Nipah encephalitis virus, measles virus, etc.) and the Rhabdoviridae (including rabies virus). Sequencing studies of the EBOV genes encoding the RNA polymerase (protein L) and nucleoprotein (NP) revealed that the Paramyxoviridae and Rhabdoviridae share many nucle- otide stretches [30,31], supporting the genetic relatedness of these two viral families with the Filoviridae. Several studies have raised the possibility of direct human infection by bats carrying some of these viruses. For example, Hendra virus and Nipah virus can apparently be transmitted directly to humans by the consumption of fruit contaminated with fruit bat saliva [32]. Similarly, some rabies virus variants can be transmitted directly to humans by the bites of insect-eating bats [33,34].
3.2.2. Arthropods: several epidemiologial clues Although arthropods have never been successfully infected
following inoculation [35,36], several observations suggest they can transmit Ebola virus to humans. A study done in 1968 showed that Marburg virus would persist for more than 3 weeks in Aedes mosquitoes after experimental inoculation [37]. It is also noteworthy that the Australian patient infected by Marburg virus in 1975 in Zimbabwe had been bitten, 6 days before symptom onset, by an arthropod (a spider, scorpion, ant, or wasp).
4. EBOV-susceptible animals: species, transmission and spread
4.1. Species natuarlly infected by EBOV
Numerous dead animals were found in the surrounding forest during the outbreaks in Gabon and RC between 2001 and 2004 [38]. To date, we have analyzed a total of 34 carcasses at the Centre International de Recherches Médi- cales de Franceville (CIRMF), Gabon, between 2001 and 2003. The carcasses were in a state of decomposition such that we could only sample muscle and skin and, in some cases, only bone tissue. We used a panel of highly sensitive tech- niques, including detection of EBOV-specific IgG and viral antigens in homogenized soft tissues (skin and muscle); virus isolation on soft-tissue cell lines; detection of RNA frag- ments by gene amplification from soft tissue and bone; and viral protein detection by immunohistochemistry on soft tis- sues fixed in 10% formalin.
Fourteen of the 34 animals (10 gorillas, three chimpan- zees and one duiker) tested positive for Ebola infection, indi- cating that these three animal species can be naturally infected by EBOV. Most infected animals probably die rapidly, as sug- gested by the rapidly fatal nature of experimental EBOV infec- tion in a variety of non-human primate species. However, dis- ease severity and progression after experimental inoculation both depend on the dose, the portal of entry, and the viral subtype. In general, symptoms are more severe and long last-
ing when the inoculum is large [39,40]. Moreover, african EBOV subtypes are more pathogenic than E. Reston (the only Asian subtype) in macaque monkeys [41]: the mortality rate is higher, symptoms are more severe, hemorrhaging is more frequent and more generalized, and death is more rapid. E. Sudan shows intermediate pathogenicity between E. Reston and the other two African subtypes (Zaire and Ivory Coast): macaques inoculated with E. Sudan often survive, while almost all those inoculated with E. Zaire succumb [39,41].
Analyses of animal carcasses show that the great apes of the central African forests are particularly at risk from Ebola. This was confirmed by a serologic survey based on 790 samples taken from about 20 primate species in Cam- eroon, Gabon and RC [42]: for example, 12.9% of wild chim- panzees in Cameroon, Gabon and RC were found to have anti-EBOV IgG. Interestingly, some positive samples largely preceded the first human outbreaks in these regions. Together, the results suggest that these animals are in regular contact with the EBOV reservoir, that some of them survive the infec- tion, and that EBOV has probably been present for a very long time in the central African forest region. EBOV-specific antibodies were also found in other monkey species (five drills, one baboon, one mandrill and one Cercopithecus mon- key), suggesting that EBOV circulation may be very com- plex, involving far more than simple direct passage from the reservoir to gorillas and chimpanzees. It is also possible that there are several reservoir species, and that many other ani- mal species are susceptible to the virus and thereby partici- pate in the natural EBOV life cycle.
4.2. Spread of Ebola in wild animal populations
As stated above, the different outbreaks that occurred between 2001 and 2003 in Gabon and RC were the first to be linked to concurrent animal mortality, mainly affecting goril- las, chimpanzees and duikers. The discovery of EBOV- infected corpses of these three species strongly suggests a major role of the virus in the observed deaths. Between 2001 and 2003 the carcasses of 50 gorillas, 15 chimpanzees and 14 duikers were found in the outbreak areas of Gabon and RC. Given that a carcass disappears completely in less than 3 weeks in the rain forest, and that most of these car- casses were discovered within 3-4 h walking distance of vil- lages, it is largely possible that several hundreds or even thou- sands of animals perished during this 2-year period in the border region of northeast Gabon and RC. Furthermore, cal- culated numbers of animal populations in certain areas, based on signs such as excreta, paw imprints, broken vegetation and nests, revealed a large increase in the mortality of some ani- mal species, just before and also during human outbreaks. Gorilla and duiker populations are estimated to have fallen by 50% between 2002 and 2003 n the Lossi sanctuary (320 km2) situated in RC, while chimpanzee populations fell
by 88% [19]. Even if these are only approximations—for example, the demise of a dominant male gorilla provokes the dispersal of the group, making the remaining members diffi-
Publications
226
X. Pourrut et al. / Microbes and Infection 7 (2005) 1005-1014 1011
cult to count—they strongly suggest that EBOV provoked massive outbreaks in these animals, with hundreds or even thousands of deaths during a very short period (note that the possibility of such massive population declines due to EBOV may have major implications for animal conservation).
These recent studies showing an increase in animal mor- tality coinciding with human outbreaks, and providing bio- logical confirmation of EBOV infection of animal carcasses, confirm the results of other studies conducted some years pre- viously in other regions. First, a team of primatologists showed that gorilla and chimpanzee population densities fell strongly between 1994 and 1998 in the forest block of Minkebe to the northeast of Gabon, near the border with Cam- eroon [23]. The occurrence of human Ebola outbreaks in 1995 and 1996 in the same areas (Mekouka and Mayibout outbreaks) suggests that this marked decline in gorilla and chimpanzee populations may have been due to EBOV. Simi- larly, another study conducted in the Tai Forest of Ivory Coast showed the disappearance of 11 members (26%) of a group of 43 chimpanzees during the month of November 1994 [43]. The occurrence of the only human case of infection by E. Ivory Coast, together with the immunohistochemical positiv- ity of tissues taken from a chimpanzee carcass, both events taking place in the same area and during the same period, suggests that the deaths in this group of chimpanzees may also have been due to EBOV.
4.3. EBOV emergence in animals
The chronological and geographic characteristics of the different outbreaks in Gabon and DRC between 1995 and 2003 point to a drift from northeast Gabon towards DRC. This raises the possibility that gorillas and chimpanzees are succumbing to a single outbreak that has been devastating animal populations for about 10 years, spreading along a northwest/southeast axis [22].
The EBOV genome is particularly stable. For example, the rate of mutations between strains Booué 96 (Gabon) and Zaire 76 was only 1.7% in the membrane glycoprotein gene (GP), 1.3% in the nucleoprotein (NP), 1.2% in the 40-kDa structural protein VP40, and 0.9% in the 22-kDa structural protein VP24, even though these strains were isolated more than 1000 km, and 20 years apart [44]. Similar genetic dif- ferences were found between the 2001 and 2003 outbreak strains and the strains Mekouka 94 (Gabon) and Zaire 76 [19]. Moreover, sequencing of a 249-nucleotide stretch in the most variable part of the GP gene showed no genetic differences between isolates recovered from nine patients (five of whom survived) who were samped during the 1995 Kikwit out- break in Zaire (DRC) [45].
In light of these results, and in order to understand how great apes are infected, we amplified and systematically sequenced the coding part of the GP gene (the most variable gene of the EBOV genome) in samples from all gorilla and chimpanzee carcasses. We found a distinct viral sequence in each carcass [19], even in carcasses belonging to the same
species (gorilla or chimpanzee) that had been discovered at the same time and only a few hundred meters apart (Leroy and Wittmann, personal data). As we had previously shown that a given outbreak strain undergoes no genetic variations, even after several human passages, these results argued against intraspecies transmission. On the contrary, the observed genetic diversity suggests that great ape infection results from simultaneous but independant transmission events from the reservoir species [19]. In this scenario the sequence varia- tions probably result from viral adaptation to the natural host, which likely consists of several subspecies of genetically dis- tinct groups. Thus, Ebola outbreaks in great apes appear to result not from the propagation of a single outbreak from one individual to another, but rather from massive simultaneous infection by the aninal reservoir in particular environmental conditions (outbreaks always occur at the same times of the year, during the transitional periods between the dry and rainy seasons). Human infection occurs secondarily, and is gener- ally linked to handling of infected animal corpses. Unfortu- nately, the precise environmental conditions required for EBOV to emerge from its reservoir are unknown, and the res- ervoir species remain(s) to be identified.
5. The reservoir species: 30 years of fruitless research?
The reservoirs (natural hosts) of Ebola virus and Marburg virus remain a mystery. Since the first recorded human out- break in 1976, several laboratory and field studies have been conducted to identify the animal(s)—vertebrate or invertebrate—that can harbor the virus asymptomatically.
5.1. Wild animal capture studies
The first field study dates back to the Yambuku outbreak in 1976 in DRC (Table 1). An attempt was made to infect EBOV-permissive cell lines with samples of arthropods cap- tured in and near patients' homes. The arthropods were pooled and crushed, and the resulting suspension was used to inocu- late monkey kidney epithelial cells (Vero cells). Vero cells were also inoculated with centrifuged serum prepared from whole-blood samples of vertebrates captured near the homes and villages [10]. No viruses were isolated, despite the cap- ture of 818 bedbugs, 1500 mosquitoes, 10 domestic pigs, one cow, seven bats, 123 rodents, eight squirrels, six Cercopith- ecus monkeys, and three small antelopes. A similar study of samples from 499 vertebrates obtained at the time of the 1976 outbreak in Sudan also gave negative results [46].
After the isolated case of E. Zaire infection in Tandala, DRC, in 1977 [11], intensive investigations were undertaken in 1979 in a very large northern region of DRC, including Tandala and Yambuku, which are about 300 km apart (Table 1). This study, conducted between June and August 1979, during the dry season, focused on two regions: the first centered on Yambuku and covered an area of 2800 km2 with
about 50,000 inhabitants, while the second, of roughly the
Publications
227
1012 X. Pourrut et al. / Microbes and Infection 7 (2005) 1005-1014
Table 1 Animals captured in field studies designed to identify the EBOV reservoir
Yambuku 1976 (OMS 1978)
7
Megachiroptera
Microchiroptera
Rodents
Insectivores
Carnivores
Primates
Pholidotes
Artiodactyles
Birds
Reptiles and amphibians
Total vertebrates
Arthropods
Arthropods: bedbugs, mosquitoes, ticks, lice, flies.
131
Nzara 1976 (OMS 1978)
4
174
309
7
Cam-Zaïre 1979-80 (Breman 1999)
41
422
661
53
27
267
66
27
67
33
1664
Kikwitt 1995 (Leirs 99, Reiter 99)
125
414
1759
114
28
12
29
22
184
127
2814
27,843
Taï RCA 1999 1994-1997 (Morvan (Formenty 99) 99)
652
19
4
283 163
398 56
27
Total
Mammals Chiroptera
13
5
499 157
2318
282
1642 242
189
1014
3306
628
55
312
95
62
533
165
7018
30,161
same size and with 80,000 inhabitants, centered on Tandala [47]. the animals captured in this study comprised 267 pri- mates, 462 bats, 661 rodents, 173 other mammals, 67 birds, and 33 reptiles and amphibians. Once again, no viruses were isolated.
Two other field studies were performed in 1995 near Kik- wit, immediately after the outbreak (Table 1). A total of 2814 vertebrates [48] and 27,843 arthropods [49] were cap- tured during respective periods of 3 and 6 months after the end of the outbreak. Viral isolation was attempted from both categories of animals, and vertebrates were also tested for E. Zaire-specific IgG. No positive IgG reactions were obtained, and no viruses were isolated on Vero cells. The vertebrates included 1759 rodents, 539 bats, 114 insectivores, 184 birds, and 127 reptiles and amphibians. The arthropods included
15,118 mosquitoes, 124 blood-sucking flies, 6538 bedbugs, 144 fleas, 103 lice, and 5816 ticks.
In Tai Forest, Ivory Coast, 1642 vertebrates (652 bats, 283 rodents, 398 insectivores, 27 monkeys and 282 birds) were captured and autopsied between 1996 and 1997 [50]. Organs were analyzed with the same methods as those described above. Except for a colobe bai monkey (red colo- bus, Colobus badius) that was seropositive for EBOV, no spe- cific IgG reactions were detected and no viruses were iso- lated on cell lines (Table 1).
Finally, 242 vertebrates (24 bats, 163 rodents and 56 insec- tivàres) were captured in CAR in 1998 [51] (Table 1). Small EBOV-specific genetic sequences were amplified from organs of six mice (Mus setulosus and Praomys sp) and a shrew (Sylvisorex ollula). However, although these results consti- tute the only biological evidence that EBOV may be present in healthy animals, no firm conclusions as to the EBOV res- ervoir status of these animals can be drawn, given the lack of specific serologic responses, the lack of nucleotide specifici- ties in the amplified viral sequences, the failure of virus iso- lation, and the non-reproducible nature of the results.
5.2. Experimental infection
Attempts have also been made to infect various plant and animal species [35,36], including rodents (mice, shrews, rats, guinea pigs, etc.). Bats, birds (mainly pigeons), reptiles (tor- toises, snakes, geckos, frogs), mollusks (mainly snails), arthro- pods (spiders, cockroaches, ants, centipedes, mosquitoes and butterflies) and more than 33 plant varieties belonging to 24 species (tomatoes, cucumbers, wheat, cotton, lupin, corn, tobacco, etc.).
All attempts to inoculate rodents, birds, reptiles, mollusks and plants failed to yield evidence of virus replication. Like- wise, intrathoracic inoculation of arthropods with Ebola Zaire and Ebola Reston led to no detectable viral replication.
In contrast, some bat species belonging to the genera Epo- mophorus and Tadarida developed transient viremia lasting nearly 4 weeks after intravenous inoculation. However, given the non-reproducibility of these experiments, and the very particular conditions of inoculation (dose and route), these results fail to prove that bats are indeed the EBOV reservoir. They nonetheless open up new research perspectives, nota- bly for field studies.
5.3. Conclusion
The natural reservoirs of Ebola and Marburg viruses remain elusive, as the only positive results are fragmentary and non-reproducible, and were obtained in questionable condi- tions. However, a trail of epidemiological clues (see above) makes bats the most likely candidates. Furthermore, several viruses belonging to virus families that are genetically related to the Filoviridae, such as Rhabdoviridae and Para- myxoviridae—rabies virus [52], Hendra virus [53] and Nipah virus [54]—are known to have bat reservoirs.
6. Conclusion
This article reviews all available data on the natural his- tory of Ebola virus in Africa. Although several questions
Publications
228
X. Pourrut et al. / Microbes and Infection 7 (2005) 1005-1014 1013
remain, our knowledge of how the virus circulates in its natu- ral environment has improved markedly in recent years. Despite the apparent geographic disparity of human out- breaks and the marked genetic diversity of the three "Afri- can" EBOV subtypes, all three subtypes circulate within a homogeneous ecological entity composed of the African equa- torial forest block. The virus reservoir has not yet been iden- tified, but many of the steps leading to human outbreaks are now fairly well understood. Several animal species, includ- ing great apes, are naturally infected by the virus, probably directly from the reservoir. These intermediate animal spe- cies develop a disease, which is usually fatal. Their carcasses remain infectious for humans, who may in turn transmit the disease through the community. These infected animals thus spread the virus to other ecological niches linked to their envi- ronment and behaviors. The large number of EBOV- permissive animal species, their variable sensitivity to the dis- ease, and their very different patterns of behavior suggest that EBOV transmission cycles within its natural environment are highly complex. Identification of the reservoir and of the natu- ral life cycle of the virus should help in the development of strategies for preventing human outbreaks and for reducing the impact of EBOV on animal species such as great apes, whose wild populations are very seriously threatened in endemic regions.
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
[17]
References [18]
[1] A. Sanchez, M.P. Kiley, B.P. Holloway, D.D. Auperin, Sequence analysis of the Ebola virus genome: organization, genetic elements, and comparison with the genome of Marburg virus, Virus Res. 29 (1993) 215-240. V.E. Volchkov, Processing of the Ebola virus glycoprotein, in: H.-D. Klenk (Ed.), Current Topics in Microbiology and immunology: Marburg and Ebola Viruses, vol. 235, Springer-Verlag, Berlin, 1999, pp. 35-47. H. Feldmann, H.D. Klenk, A. Sanchez, Molecular biology and evolu- tion of filovirures, Arch. Virol. Suppl. 7 (1993) 81-100. P.E. Rollin, R.J. Williams, D.S. Bressler, S. Pearson, M. Cottingham, G. Pucak, A. Sanchez, S.G. Trappier, R.L. Peters, P.W. Greer, S. Zaki, T. Demarcus, K. Hendricks, M. Keyley, D. Simpson, T.W. Geisbert, P.B. Jahrling, C.J. Peters, T.G. Ksiazek, Ebola (subtype Reston) virus among quarantined nonhuman primates recently imported from the Philippines to the United States, J. Infect. Dis. 179 (1999) S108-S114. C.G. Hayes, J.P. Burans, T.G. Ksiazek, R.A. Del Rosario, M.E.G. Miranda, C.R. Manaloto, A.B. Barrientos, C.G. Robles, M.M. Dayrit, C.J. Peters, Outbreak of fatal illness among captive macaques in the Philippines caused by an Ebola-related filovirus, Am. J. Trop. Med. Hyg. 46 (1992) 664-671. M.A. Bwaka, M.-J. Bonnet, P. Calain, R. Colebunders, A. De Roo, Y. Guimard, K.R. Katwiki, K. Kibadi, M.A. Kipasa, K.J. Kuvula, B.B. Mapanda, M. Massamba, K.D. Mupapa, J. Muyembe-Tamfum, E. Ndaberey, C.J. Peters, P.E. Rollin, E. Van den Enden, Ebola hem- orrhagic fever in kiwit, Democratic Republic of the Congo: clinical observations in 103 patients, J. Infect. Dis. 179 (1999) S1-S7. D. Nkoghé, P. Formenty, S. Nnégué, M. Toung Mvé, I. Hypolite, P. Léonard, E.M. Leroy, Recommandations pratiques pour la prise en charge sur le terrain des patients infectés par le virus Ebola, Med. Trop. 64 (2004) 199-204. D.I.H. Smith, Ebola haemorrhagic fever in Sudan, 1976, Bull. WHO 56 (1978) 247-270.
[19]
[2]
[20]
[3]
[4] [21]
[22]
[5]
[23]
[6]
[24]
[7] [25]
[26]
[27] [8]
R.C. Baron, J.B. McCormick, O.A. Zubeir, Ebola virus disease in southern Sudan: hospital dissemination and intrafamilial spread, Bull. WHO 61 (1983) 997-1003.
K.M. Johnson, Ebola haemorrhagic fever in Zaire, 1976, Bull. WHO 56 (1978) 271-293.
D.L. Heymann, J.S. Weisfeld, P.A. Webb, K.M. Johnson, T. Cairns, H. Berquist, Ebola hemorrhagic fever: Tandala, 1977-1978, J. Infect. Dis. 142 (1980) 372-376.
B. Le Guenno, P. Formenty, M. Wyers, P. Gounon, F. Walker, C. Boe- sch, Isolation and partial characterisation of a new strain of Ebola, Lancet 345 (1995) 1271-1274.
B. Le Guenno, P. Formenty, C. Boesch, Ebola virus outbreaks in Ivory Coast and Liberia, 1994-1995, in: H.-D. Klenk (Ed.), Current Topics in Microbiology and Immunology: Marburg and Ebola viruses, vol. 235, Springer-Verlag, Berlin, 1999, pp. 77-84.
P. Formenty, C. Hatz, B. Le Guenno, A. Stoll, P. Rogenmosen, A. Wild- mer, Human infection due to Ebola virus, subtype côte d'ivoire: clinical and biologic presentation, J. Infect. Dis. 179 (1999) S48-S53. A.S. Khan, F.K. Tshioko, D.L. Heymann, B. Le Guenno, P. Nabeth, D.L. Kerstiëns, Y. Fleerackers, P.H. Kilmarx, G.R. Rodier, O. Nkulu, P.E. Rollin, A. Sanchez, S.R. Zaki, R. Swanepoel, O. Tomori, S.T. Nichol, C.J. Peters, J.J. Muyembe-Tamfum, T.G. Ksiazek, The reemergence of Ebola hamorrhagic fever, Democratic Republic of the Congo, 1995, J. Infect. Dis. 179 (1999) S76-S86.
A.J. Georges, E.M. Leroy, A.A. Renaut, C. Tevi Benissan, R.J. Nabias, M. Trinh Ngoc, P.I. Obiang, J.P.M. Lepage, E.J. Ber- therat, D.D. Bénoni, E.J. Wickings, J.P. Amblard, J.M. Lansoud- Soukate, J.M. Milleliri, S. Baize, M.-C. Georges-Courbot, Ebola hemorrhagic fever outbreaks in Gabon, 1994-1997: epidemiologic and Health control issues, J. Infect. Dis. 179 (1999) S65-S75.
J. Amblard, P. Obiang, S. Edzang, C. Prehaud, M. Bouloy, B. Le Guenno, Identification of the Ebola virus in Gabon in 1994, Lancet 349 (1997) 181-182. E.M. Leroy, S. Souquière, P. Rouquet, D. Drevet, Re-emergence of Ebola haemorrhagic fever in Gabon, Lancet 359 (2002) 712.
E.M. Leroy, P. Rouquet, P. Formenty, S. Souquière, A. Kilbourne, J.-M. Froment, M. Bermejo, S. Smit, W. Karesh, R. Swanepoel, S.R. Zaki, P.E. Rollin, Multiple Ebola virus transmission events and rapid decline of central African wildlife, Science 303 (2004) 387-390.
P. Formenty, F. Libama, A. Epelboin, Y. Allarangar, E.M. Leroy, H. Moudzeo, P. Tarangonia, A. Molamou, M. Lenzi, K. Ait-Ikhlef, B. Hewlett, C. Rott, T. Grein, L'épidémie de fièvre hemorragique à virus Ebola en République du Congo, 2003: une nouvelle stratégie? Med. Trop. 63 (2003) 291-295.
World Health Organization, Ebola haemorrhagic fever—fact sheet revised in May 2004, Wkly. Epidemiol. Rec. 79 (2004) 435-439.
P.D. Walsh, K.A. Abernethy, M. Bermejo, R. Beyers, P. De Wachter, M. Ella Akou, B. Huijbregts, D. Idiata Mambounga, A. Kamdem Toham, A.M. Kealbourn, S.A. Lahm, S. Latour, F. Maisels, C. Mbina, Y. Mihindou, S. Ndong Obiang, E. Ntsame Effa, M.P. Starkey, P. Telfer, M. Thibault, C.E.G. Tutin, L.J.T. White, D.S. Wilkie, Cata- strophic ape decline in western equatorial Africa, Nature 422 (2003) 611-614.
B. Huijbregt, P. De Wachter, S. Ndong Obiang, M. Akou Ella, Ebola and the decline of gorilla Gorilla gorilla and chimpanzee Pan troglo- dytes populations in Minkebe forest, north-eastern Gabon, Oryx 37 (2003) 437-443.
World Health Organization, Outbreak of Ebola haemorrhagic fever, Uganda, august 2000—January 2001, Wkly. Epidemiol. Rec. 76 (2001) 41-48.
World Health Organization, Ebola haemorrhagic fever in south Sudan—update, Wkly. Epidemiol. Rec. 79 (2004) 253.
G.A. Martini, Marburg agent disease in man, Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. 63 (1969) 295-302. C.E.G. Smith, D.I.H. Simpson, E.T.W. Bowen, Fatal human disease from vervet monkeys, Lancet II (1967) 1119-1121.
Publications
229
1014 X. Pourrut et al. / Microbes and Infection 7 (2005) 1005-1014
[43] P. Formenty, C. Boesch, M. Wyers, C. Steiner, F. Donati, F. Dind, F. Walker, B. Le Guenno, Ebola virus outbreak among wild chimpan- zees living in a rain forest of Cote d'Ivoire, J. Infect. Dis. 179 (Suppl. 1) (1999) S120-S126.
[44] E.M. Leroy, S. Baize, J. Lansoud-Soukate, E. Mavoungo, C. Apetrei, Sequence analysis of GP, NP, VP40 and VP24 genes of Ebola virus from deceased, survival and asymptomatic infected individuals during 1996 outbreak in Gabon. Comparative studies and phylogenetic char- acterization, J. Gen. Virol. 83 (2002) 67-73.
[45] L.L. Rodriguez, A. De Roo, Y. Guimard, S.G. Trappier, A. Sanchez, D. Bressler, A.J. Williams, A.K. Rowe, J. Bertolli, A.S. Khan, T.G. Ksiazek, C.J. Peters, S.T. Nichol, Persistence and genetic stabil- ity of Ebola virus during the outbreak in Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 1995, J. Infect. Dis. 179 (1999) S170-S176.
[46] A.A. Arata, B. Johnson, Approaches towards studies in potential reservoirs of viral haemorrhagic fever in southern Sudan, in: S.R. Pat- tyn (Ed.), Ebola Virus Haemorrhagic Fever, Elsevier/Netherland Bio- medical, Amsterdam, 1977, pp. 191-202 (1978).
[47] J.G. Breman, K.M. Johnson, G. van der Groen, C.B. Robbins, M.V. Szczeniowski, K. Ruti, et al., A search for Ebola virus in animals in the Democratic Republic of the Congo and Cameroon: ecologic, virologic, and serologic surveys, 1979-1980, J. Infect. Dis. 179 (1999) S139-S147.
[48] H. Leirs, J.N. Mills, J.W. Krebs, J.E. Childs, D. Akaibe, N. Woolen, G. Ludwig, C.J. Peters, T.G. Ksiazek, Search for the Ebola virus reservoir in Kikwit, Democratic Republic of the Congo: reflections on a vertebrate collection, J. Infect. Dis. 179 (1999) S155-S163.
[49] P. Reiter, M. Turell, R. Coleman, B. Miller, G. Maupin, J. Liz, A. Kuehne, J. Barth, J. Geisbert, D. Dohm, J. Glick, J. Pecor, R. Rob- bins, P. Jahrling, C.J. Peters, T.G. Ksiazek, Field investigations of an outbreak of Ebola hemorrhagic fever, Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 1995: arthropod studies, J. Infect. Dis. 179 (1999) S148- S154.
[50] P. Formenty, P. Jahrling, C. Rossi, H. Artsob, R. Swanepoel, B. LeGuenno, K. Steele, N. Woolen, M. Gartshore, C. Boesch, C. Noé, P. Barriere, O. Perpete, N. Jaax, A. Kuhene, C. Akoua-Koffi, M. Colyn, Search for the Ebola virus reservoir in Taï forest, Cote d'Ivoire: 1996-1997, preliminary results, in: XIth International Con- gress of Vitrology, Sydney, Australia, 1999.
[51] J.M. Morvan, V. Deubel, P. Gounon, E. Nakoune, P. Barriere, S. Murri, O. Perpete, B. Selekon, D. Coudrier, A. Gautier-Hion, M. Colyn, V. Volchkov, Identification of Ebola virus sequences present as RNA or DNA in organs of terrestrial small mammals of the Central African Republic, Microbes Infect. 1 (1999) 1193-1201.
[52] B. Amengual, J.E. Whitby, A. King, J.S. Cobo, H. Bourhy, Evolution of European bat lyssaviruses, J. Gen. Virol. 78 (Pt. 9) (1997) 2319- 2328.
[53] K. Halpin, P.L.Young, H.E. Field, J.S. Mackenzie, Isolation of Hendra virus from pteropid bats: a natural reservoir of Hendra virus, J. Gen. Virol. 81 (2000) 1927-1932.
[54] M.Y. Johara, H.E. Field, A.M. Rashdi, C. Morissy, B. van der Heide, P. Rota, A.B. Adzhar, J. White, P. Daniels, A. Jamaluddin, T.G. Ksiazek, Nipah virus infection in bats (order chiroptera) in peninsular Malaysia, Emerg. Infect. Dis. 7 (2001) 439-441.
[28] D.H. Smith, M. Isaacson, K.M. Johnson, A. Bagshawe, B.K. Johnson, R. Swanapoel, M. Killey, T. Siongok, W. Koinange Keruga, Marburg- virus disease in Kenya, Lancet I (1982) 816-820.
[29] B. Johnson, in: Communication personnelle, 1996.
[30] E. Mühlberger, A. Sanchez, A. Randolf, C. Will, M.P. Kiley, H.-D. Klenk, H. Feldmann, The nucleotide sequence of the L gene of Marburg virus, a filovirus: homologies with paramyxoviruses and rhabdovirures, Virology 187 (1992) 534-547.
[31] A. Sanchez, M.P. Killey, H.-D. Klenk, H. Feldmann, Sequence analy- sis of the Marburg virus nucleoprotein gene: comparison to Ebola virus and other non-segmented negative-strand RNA viruses, J. Gen. Virol. 73 (1992) 347-357.
[32] J.S. Mackenzie, H.E. Field, Emerging encephalitogenic viruses: lys- saviruses and henipaviruses transmitted by frugivorous bats, Arch. Virol. Suppl. 18 (2004) 97-111.
[33] R.V. Gibbons, R.C. Holman, S.R. Mosberg, C.E. Rupprecht, Knowl- edge of bat rabies and human exposure among United States cavers, Emerg. Infect. Dis. 8 (2002) 532-534.
[34] M. Favi, C.A. de Mattos, V. Yung, E. Chala, L.R. Lopez, C.C. de Mattos, First case of human rabies in Chile caused by an insectivorous bat virus variant, Emerg. Infect. Dis. 8 (2002) 79-81.
[35] M.J. Turell, D.S. Bressler, C.A. Rossi, Lack of virus replication in arthropods after intrathoracic inoculation of Ebola Reston virus, Am. J. Trop. Med. Hyg. 55 (1996) 89-90.
[36] R. Swanepoel, P.A. Leman, F.J. Burt, Experimental inoculation of plants and animals with Ebola virus, Emerg. Infect. Dis. 2 (1996) 321-325.
[37] C. Kunz, H. Hofmann, H. Aspöck, Propagation of "Marburg-virus" (vervet monket disease agent) in Aedes aegypti, Zentralbl. Bakteriol. Parasitol. Orig. 208 (1968) 347-349.
[38] P. Rouquet, J.-M. Froment, M. Bermejo, A. Kilbourne, W. Karesh, P. Reed, B. Kumulungui, P. Yaba, A. Délicat, P.E. Rollin, E.M. Leroy, Wild animal mortality monitoring and human Ebola outbreaks, Gabon and Republic of Congo, 2001-2003, Emerg. Infect. Dis. 11 (2005) 283-290.
[39] E.T. Bowen, G.S. Platt, G. Lloyd, R.T. Raymond, D.I. Simpson, A comparative study of strains of Ebola virus isolated from southern Sudan and northern Zaire in 1976, J. Med. Virol. 6 (1980) 129-138.
[40] P.B. Jahrling, T.W. Geisbert, N.K. Jaax, M.A. Hanes, T.G. Ksiazek, C.J. Peters, Experimental infection of cynomolgus macaques with Ebola-Reston filoviruses from the 1989-1990 US epizootic, Arch. Virol. 11 (1996) 115-134.
[41] S.P. Fisher-Hoch, T.L. Brammer, S.G. Trappier, L.C. Hutwagner, B.B. Farrar, S.L. Ruo, B.G. Brown, L.M. Hermann, G.I. Perez- Oronoz, C.S. Goldsmith, M.A. Hanes, J.B. McCormick, Pathogenic potential of filoviruses: role of geographic origin of primate host and virus strain, J. Infect. Dis. 166 (1992) 753-763.
[42] E.M. Leroy, P. Telfer, B. Kumulungui, P. Yaba, P. Rouquet, P. Roques, P. Gonzalez, T.G. Ksiazek, P.E. Rollin, E. Nerrienet, A serological survey of Ebola virus infection in central African nonhuman primates, J. Incfect. Dis. 190 (2004) 1895-1899.
Publications
230
Isolates of Zaire ebolavirus from wild apes reveal genetic lineage and recombinants
Publications
231
Tatiana J. Wittmann †, Roman Biek ‡, Alexandre Hassanin §, Pierre Rouquet †, Patricia Reed ¶, Philippe Yaba †, Xavier Pourrut † , Leslie A. Real ‡, Jean-Paul Gonzalez ††‡‡, and Eric M. Leroy † §§
†Centre International de Recherches Médicales de Franceville, BP 769 Franceville, Gabon; ‡Department of Biology and Center for Disease Ecology, Emory ́University, 1510 Clifton Road, Atlanta, GA 30322; §Museum National d'Histoire Naturelle/Centre National de la Recherche Scientifique, Unite Mixte ́de Recherche 5202, 75005 Paris, France; ¶Wildlife Conservation Society, 2300 Southern Boulevard, Bronx, NY 10460; Institut de Recherches pour le Developpement, UR178, Centre International de Recherches Medicales de Franceville, BP 769 Franceville, Gabon; and ††Institut de Recherche ́ ́pour le Developpement, UR178, Mahidol University at Salaya, Phutthamonthon 4, Nakhonpathom 73170, Thailand ́
Edited by Rita R. Colwell, University of Maryland, College Park, MD, and approved August 30, 2007 (received for review May 2, 2007)
Over the last 30 years, Zaire ebolavirus (ZEBOV), a virus highly pathogenic for humans and wild apes, has emerged repeatedly in Central Africa. Thus far, only a few virus isolates have b een characterized genetically, all belonging to a single genetic lineage and originating exclusively from infected human patients. Here, we describe the first ZEBOV sequences isolates from great ape carcasses in the Gabon/Congo region that belong to a previously unrecognized genetic lineage. According to our estimates, this lineage, which we also encountered in the two most recent human outbreaks in the Republic of the Congo in 2003 and 2005, diverged from the previously known viruses around the tim e of the first documented human outbreak in 1976. These results suggest that virus spillover from the reservoir has occurred more than once, as predicted by the multiple emergence hypothesis. However, the young age of both ZEBOV lineages and the spatia l and temporal sequence of outbreaks remain at odds with the idea that the virus simply emerged from a long -established and widespread reservoir population. Based on data from two ZEBOV genes, we also dem - onstrate, within the family Filoviridae , recom bination between the two lineages. According to our estimates, this event took place between 1996 and 2001 and gave rise to a group of recombinant viruses that were responsible for a series of outbreaks in 2001 - 2003. The potential for recombination ad ds an additional level of complexity to unraveling and potentially controlling the emer - gence of ZEBOV in humans and wildlife species.
Phylogeny emergence Filoviridae nucleoprotein glycoprotein
some authors to suggest that outbreaks are epidemiologically linked and occur at the front of an advancing wave that emerged ca. 1976 in the Democratic Republic of the Congo (9). However, the identification of multiple strains during the 2001 Gabon/ Republic of the Congo (RC) outbreak led other authors to deduce that ZEBOV repeatedly and independently spilled over from the reservoir species (most likely bats) (10) into wildlife and human populations (3). In this multiemergence hypothesis, Ebola outbreaks would occur episodically in certain ecological conditions caused by habitat disturbances or climatic phenom- ena (11, 12). Further implicit is the idea that ZEBOV was present in the affected area of Central Africa long before the first documented outbreak in 1976.
Given the constant risk of new human outbreaks and the disastrous consequences that outbreaks mean for endangered great ape populations, there is an urgent need to test the competing models of ZEBOV emergence against more data to develop better predictions and potential control strategies. Ar- guably the most important piece of information missing in our understanting of ZEBOV epidemiology and evolution is a characterization of the viral strains circulating among susceptible wildlife species. Based on a unique data set collected during a 5-year period, we describe the first isolates of ZEBOV from great ape carcasses in the Gabon/RC region, as well as two recent human outbreaks. We also provide additional sequence data from previous outbreaks. Together these data permit a critical reevaluation of the existing models of ZEBOV emergence nd shed new light on the evolutionary dynamics of the virus.
Results Between 2001 and 2006, we discovered 47 dead animals, of which 23 were great apes (18 gorillas, 5 chimpanzees), in the Gabon/RC
Author contributions: E.M.L. designed research; T.J.W., P. Rouquet, P. Reed, P.Y., X.P., and E.M.L. performed research; P. Rouquet, P. Reed, X.P., and E.M.L. contributed new reagents/ analytic tools; T.J.W., R.B., A.H., L.A.R., J.-P.G., and E.M.L. analyzed data; and T.J.W., R.B., and E.M.L. wrote the paper.
The authors declare no conflict of interest.
This article is a PNAS Direct Submission.
Abbreviations: CP, codon position; ML, maximum likelihood; RC, Republic of the Congo; ZEBOV, Zaire ebolavirus.
Data deposition: The sequences reported in this paper have been deposited in the GenBank database [accession nos. EU051634 and EU051647 (Etoumbi may05), EU051635 ad EU051648 (Mbandza nov03), EU051630 and EU051649 (GOR1_Lossi_dec02), EU051631 (GOR2_Lossi_dec02), EU051632 (GOR_Ekata_nov01), EU051633 (CH_Lossi_feb03), EU051636 (GOR_Mbandza_jun03), EU051637 (GOR1_odz_june05), EU051638 and EU051650 (GOR_odz_jun05), EU51639 (Mayibout 96), EU05164 (Mendemba A oct01), EU051641 (Mendemba B oct01) EU051642 (Etakangaye dec01), EU051643 (Olloba dec01), EU051645 (Mvoula jan03), EU051644 (Entsiami jan03), and EU051646 (Yembelengoye jan03)].
‡‡Present
A mong the recognized souches of ebolavirus (family Filoviri- dae), the Zaire ebolavirus (ZEBOV) is the most virulent,
causing acute hemorrhagic fever that can lead to death in a matter of days, with case fatality rates ≤88%. Only 10 recog- nized ZEBOV outbreaks among humans have occurred to date, and all of these took place in west-central Africa during three distinct periods: 1976-1977, 1994-1997, and 2001-2005 (1). Outbreaks have been shown to coincide with significant mor- tality among wildlife in surrounding areas (2, 3), and it is thought that people first acquire infection through the handling of infected animal carcarsses (1, 4, 5). Ecological survey data indicate that the detrimental effects of ZEBOV infection in wildlife populations, mainly chimpanzees and gorillas, over the last two decades have been much more dramatic and widespread than the frequency and geographic scale of human outbreaks alone would suggest (2, 6-8).
Despite numerous studies of human and animal infection, attempts to reconstruct the history and evolution of ZEBOV have been hindered by the small number of isolates available. Only 12 glycopropein (GP) gene sequences have been published to date, and all correspond to human isolates recovered between 1976 and 2002. Phylogenetic analysis shows that these sequences belong to a single lineage with time-dependent evolutionary changes. This tree topology, combines with the temporal-spatial pattern of ZEBOV emergence over the last two decades, led
address: Division of Environmental and Evolutionary Biology, University of Glasgow, Glasgow G12 8QQ, United Kingdom.
whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected]. §§To
This article contains supporting information online at www.pnas.org/cgi/content/full/ 0704076104/DC1. © 2007 by The National Academy of Sciences of the USA
www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0704076104 PNAS October 23, 2007 Vol. 104 no. 43 17123-17127
MIC
RO
BIO
LOG
Y
Publications
232
Fig. 1. Phylogenetic trees inferred from GP gene (A) and NP gene (B) sequences that show relationships among all of the ZEBOV isolates. Viruses derived from wild ape carcasses are shown in bold. Values above branches represent Bayesian posterior probabilities and ML bootstrap scores (both at percentages). Colors identify three genetic groups of ZEBOV: green, group A; red, group B; blue, recombinant group R.
region [supporting information (SI) Table 2]. Using a combina- tion of diagnostic tests, we confirmed infection with ZEBOV for 13 gorillas, 3 chimpanzees, and 1 duiker. Because of the ad- vanced decomposition of several carcasses, we only succeeded in amplifying and sequencing full-length GP gene sequences [2,031 nucleotides (nt)] from three gorillas and one chimpanzee, but
shorter GP sequences (538 nt) could be obtained from another three gorillas. Phylogenetic analysis of the full GP revealed that these ape-derived sequences represent a new, distinct ZEBOV lineage (group B) that is 2-3% divergent from the lineage containing all GP sequences described to date (groups A and R) (Fig. 1A). Analysis of the partial GP data set containing the additional three sequences from gorillas confirmed this result (SI Fig. 4). In addition to the virus from ape carcasses, GP sequences generated from the two most recent human outbreaks in Mbandza (2003) and Etoumbi (2005) in RC also fell into the new group B (Fig. 1 A).
Three full GP sequences that originated from ape carcasses located in the Lossi sanctuary in RC (GOR1 Lossi dec02, GOR2 Lossi dec02, and CH Lossi feb03) grouped together in the phylogeny, with the two sequences from gorillas clustering most closely (Fig. 1 A). In December 2002, two gorilla carcasses were found together, a few meters from each other and in the same state of decomposition, indicating that they were infected and dead around the same time. They probably belonged to the same group because a single group of gorillas was known to inhabit this part of the sanctuary. Despite this finding, GP sequences from these carcasses differed substantially at both the nucleotide and amino acid levels (11 nt and 5 aa differences) (SI Table 3), suggesting that they had not been infected by the same source.
We also obtained partial sequence data (1,448 nt) from the nucleoprotein (NP) gene from all human outbreaks since 2001, including two most recent ones in Mbandza and Etoumbi, as well as from two gorilla carcasses discovered in the Lossi and Odzala sanctuaries. Consistent with results for GP, sequences from apes and the two recent human outbreaks clustered together (group B) and were genetically distinct from viruses found in the 1976-1997 outbreaks (group A) (Fig. 2B). Similar to GP, both groups were ≈2% divergent. However, the phylogenetic position of viruses detected in October 2001 to January 2003 differed markedly for the two tree topologies: Whereas for GP, these viruses fell into group A and represented direct descendents of viruses seen during previous outbreaks (Fig. 1A), their NP sequences clustered in a more basal position in the tree together with group B viruses, from which they were not genetically distinct (Fig. 1). This result was highly suggestive of a recom- bination event between group A and group B viruses, which both occupied stable positions in the GP and NP trees. To further examine the evidence for recombination, we statistically evalu- ated the observed level of incongruence between the two tree topologies. Shimodaira-Hasegawa tests identified the GP and NP topologies as significantly incongruent regardless of how the comparison was made (in all cases, P 0.001) (see Materials and Methods).
A molecular clock-based analysis estimated that the root of all ZEBOV sequences just barely predated the first observed outbreak in 1976. Estimates based on GP sequences placed this most recent common ancestor at 1975 (highest posterior density interval: 1972-1976), whereas NP data produced a similar point
Table 1. Estimates ages of critical nodes, representing the most recent common ancestors for certain groups of sequences, in the ZEBOV phylogenies (see Fig. 1)
Glycoprotein (GP)
MRCA
Groups A and B Group B Group R Lossi gorillas
Date
Sep. 1995 Jan. 2000 Sep. 1999 July 2001
Upper
May 1972 March 1998 May 1998 March 2000
Lower
Sep. 1976 April 2001 Oct. 2000 April 2002
Date
Nov. 1971 Dec. 1998
ND
Nucleoprotein (NP)
Upper
March 1955 April 1995
Same as group B ND
Lower
Aug. 1976 Dec. 2000
ND
Dates were estimated for two viral genes using a Bayesian molecular clock-based approach. MRCA, most recent common ancestor; Date, median date associated with the MRCA; Upper/Lower, upper/lower 95% highest posterior density interval; ND, no data.
17124 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0704076104 Wittmann et al.
Publications
233
Fig. 2. Timing and longitudinal location of all ZEBOV outbreaks from 2001 onward that were included in the phylogenetic analysis. Blue and red symbols indicate outbreaks caused by group B and group R viruses, respectively. Squares, human outbreaks; circles, ape carcasses.
estimate of 1971, but with a wider internal (1955-1976). Ances- tors of groups B and R, as well as those of the viruses from two Lossi gorillas, were estimated to be of an even younger age (Table 1).
Plotting the month of emergence for all ZEBOV isolates since 2001 included in the genetic analysis against their longitudinal distribution revealed a positive relationship, consistent with outbreaks spreading east at a fairly regular rate, regardless of the genetic type of virus involved (R2=0.859, P 0.001) (Fig. 2).
Discussion Up to now, our understanding of ZEBOV epidemiology and evolution has been exclusively based on molecular data from human infections and largely involved only a single vital gene (GP). By presenting new genetic data from infected ape car- casses and recent human outbreaks for the GP and NP genes, we are able to provide a more complete, but also more complex, picture of the history and conditions of ZEBOV emergence in central Africa.
The existence of additional ZEBOV lineages in the African rainforests, other than those known from previous human outbreaks, has been suspected for some time. Although IgG prevalence rates in some great ape (5) and human populations with no history of hemorrhagic fever (2, 13) suggested the presence of apathogenic lineages, our data demonstrate the existence of another ZEBOV lineage capable of causing signif- icant mortality in human and wildlife populations. Spatially, this new genetic group has so far only been found in a small area that shows almost no overlap with other groups, but that is situated immediately to the east of the area affected by the group R viruses a few years earlier (Fig. 3). In fact, ignoring the molecular data and considering solely the temporal and spatial sequence of outbreaks between 2001 and 2005, the pattern appears highly consistent with ZEBOV continuously spreading eastward (Fig. 2). However, our new genetic data reveal that the more recent outbreaks are not caused by genetic descendents of previously emerging viruses, as seen in previous data, but instead involve a genetically different type of ZEBOV. Thus, because outbreaks do not appear to be epidemiologically linked in a consistent fashion, these findings challenge the notion of ZEBOV emer- gence in recent years being driven by a single viral lineage spreading through the affected area of Gabon/RC (9).
A key aspect of ZEBOV epidemiology that is still poorly understood is the role and extent of animal-animal transmission along susceptible species like gorillas and chimpanzees (8). Recent data from habituated gorillas in the Lossi sanctuary that experienced mass mortality due to ZEBOV strongly suggest
Wittmann et al.
efficient transmission within family groups, as well as repeated spread to neighboring groups (6). If these gorillas indeed ac- quired infection predominantly from contact with infected con- specifics, diseased individuals from one group or locality would be expected to harbor highly related viruses. For example, several studies have found no genetic changes during chains of transmission involving human-human passage of ebolavirus for several weeks or months (14, 15). In contrast, we found that the two gorillas from Lossi, which were found next to each other in December 2002 and were likely infected and died around the same time, yielded viruses for which GP gene sequences differed at 11 sites (SI Table 3). Our molecular clock-based analysis indicates that this level of divergence implies independent evolution for a minimum of 8 months (Table 1). Thus, it seems most likely that the two gorillas became infected from different sources. Both sequences tightly grouped with each other and with a third Lossi sequence from a chimpanzee, still suggesting that all three animals were infected by the same local ZEBOV variant (Fig. 1 A). Whether divergence among sequences reflects variability of a local virus in its reservoir or whether these changes accumulated during prolonged animal-animal trans- mission remains unresolved.
Results discussed so far point to a multiple independent emergence of ZEBOV in the Gabon/RC border area over the last decade. However, in line with previous studies (9, 16), we also continued to find low divergence among viral sequences, implying a recent common evolutionary origin for all ZEBOV lineages discovered so far. Despite the new group B viruses being clearly distinct from the longer known group A viruses, the two lineages are estimated to have split only in the early 1970s and thus just before the first recognized outbreak of ZEBOV in 1976, which was in the Democratic Republic of the Congo, 2,000 km from the Gabon/RC region. Similarly, the common ancestor of all group B viruses is estimated to date back to further than 1998 (Table 1). These dates are clearly at odds with the virus being a long-term resident in the affected area while being maintained by a widespread reservoir, mostly likely some fruit bat species: Hypsignathus monstrosus, Epomops franquetti, and Myonycteris torquata (1, 10).
PNAS Octobor 23, 2007 vol. 104 no. 43 17125
Fig. 3. Location of sources of all ZEBOV isolates genetically identified in humans and great apes from the first 1976 outbreak to the present. The source (GOR, gorilla; CH, chimpanzee), location, and month of sampling are speci- fied. Colors relect virus groups (Fig. 1).
MIC
RO
BIO
LOG
Y
Publications
234
Furthermore, it remains suspicious that groups A and B viruses emerged in such direct temporal and spatial succession and then the distribution of outbreaks from either type exhibited the same pattern consistent with eastward spread (Fig. 2). This finding suggests the existence of some underlying ecological factor that connects all outbreaks regardless of the genetic type of virus involved. Movement and contact processes among animals involving either reservoir or susceptible species, or both, may by potential mechanisms for this (8, 9).
Our comparative phylogenetic analysis of two viral genes produced a strong indication that a recombination event has occurred in the recent evolutionary history of ZEBOV (Fig. 1). All GP sequences from the putative recombinants are estimated to have shared a common ancestor in 1999 (Table 1), suggesting that a single incident gave rise to the recombinant lineage around this time. Where this event took place, in terms of both the geographic context and the post species, and how recombination affected viral fitness cannot be discerned at this point. However, it is interesting to note that all of the recombinant GP sequences contained a stop codon in amino acid position 481, which would be predicted to result in a 29% shorter translated protein product. Despite a truncated GP, the virus obviously remained viable, because members of this group were involved in a series of outbreaks. In future research, we hope to address the potential fitness benefits (or costs) of recombination in ZEBOV, as well as to describe the molecular mechanisms underlying it. Our finding represents the first evidence of a recombination event within the Filoviridae family (Ebola and Marburg viruses) and one of only a few examples of such an event in negative-strand RNA viruses (17). This result has important implications for vaccine development (18, 19) because it raised the possibility of recombination between a live attenuated vaccine strain and wild-type strains, a scenario that could have grave public health repercussions.
In conclusion, our results demonstrate that ZEBOV was likely introduced into susceptible wildlife and human popula- tions repeatedly in the last 30 years, as evidenced by the emergence of different genetic lineages. What remains unclear as how often such introductions have occurred and to what extent transmission among susceptible animal hosts, such as great apes, may have subsequently contributed to the spatial propagation of outbreaks. Similarly, it remains to be resolved whether the temporal-spatial patterns of ZEBOV emergence, which are in many ways suggestive of a spreading process, could be the result of transmission processes in the reservoir species or whether other factors could have generated such patterns. In addition, our study reveals an unanticipated role of recombination in ZEBOV evolution. Besides raising a number of important questions about the biology of the virus, recombination is likely to further complicate efforts to under- stand the history of ZEBOV emergence by using molecular epidemiological approaches.
Materials and Methods Investigations of Animal Mortality. Animal carcasses were found by
the Centre In ternat ional de Recherches Me ´dicales de Franceville, using RT-PCR and antigen capture assays as de- scribed in ref. 5.
Investigations of Human Outbreaks. The two most recent ZEBOV outbreaks occurred in RC (20). One originated in Mbandza and was associated with 35 human cases (29 deaths) between October
and December 2003, and the other originated in Etoumbi, where 12 human cases (9 deaths) were reported between April and June 2005 (Fig. 3). Blood samples from acutely ill patients from Mbandza (n=10) and Etoumbi (n=1) were collected on EDTA with the patients' oral informed consent, adhering to World Health Organization guidelines on viral hemorrhagic fever agents in Africa.
Reverse Transcription, DNA implicication, and Nucleotide Sequenc - ing. Samples of animal carcasses wer fragmented and homog- enized in the lysis buffer supplied with the RNeasy kit (Qiagen). Total RNA was extracted from the final supernatant with the RNeasy kit. For human samples, total RNA was extracted from plasma with the QIAamp viral RNA kit (Qiagen). First-strand cDNA was synthesized and then submitted to amplification with the primers and conditions described below. The amplicons were sequenced by GeneCust (Evry, France).
We attempted to amplify fragments of the ORF of the GP and NP genes from all human and animal samples, using nested PCR. For long GP fragments (2,031 nt), the first round (55°C) was ampl i f ied wi th sense pr imer 5 ’-GTGAGCGTAATCT- TCATCTC-3’ and antisense primer 5’-TTGTTCAACTT- GAGTTGCCT-3’, and the second round (55°C) was amplified with sense primer 5’-CAAGGAAGGGAAGCTGCAG-3’ and antisense primer 5’-GAATCACATTGGCTATGTTT-3’. For short GP fragments (538 nt), the first round (54°C) was amplified with sense primer 5’-GAAGGTGTCGTKGCATTTCTGAT-3’ and antisense primer 5’-CCTTGAYTGTGCACTTGAACCA- 3’, and the second round (60°C) was amplified with sense primer 5’ -TGAGAGAGCCGGTCAATGCAAC-3’ and antisense primer 5’-GAGGAATTTTCTGAAGCCATG-3’. The NP gene from human and animal samples was amplified in two fragments: first (55°C) by using sense primer 5’-TTTGCAAGTCTATTC- CTTCCG-3’ and antisense primer 5’-CCGTTTTCCGAGTA- ACTCT-3’ and second (55°C) by using sense primer 5’- GATCCGACTGACTCACAGGATA-3’ and antisense primer 5’-GGCTCATCCTTCATCATATGAT-3’.
Phylogenetic Analyses. Data sets used for the analyses included 21
ourselves and/or local villagers in the forested areas of north- eastern Gabon and northwestern RC (Gabon/RC) during human Ebola outbreaks occurring between 2001 and 2005. Dead ani- mals were rarely seen in the forest owing to their rapid decom- position and the small number of nonpredatory deaths. Over he 5-year study period, we found and tested 47 animal carcasses in the Gabon/RC human outbreak region. Necropsy specimens (skin, muscle, liver, or bone) were either placed in cryovials and immediately frozen in dry nitrogen or placed at room temper- ature in vials containing RNA Later solution (Qiagen, Valencia, CA). Laboratory tests were performed at the Centre Interna- tional de Recherches Me ´dicales de Franceville, Gabon. Tissues were tested for ZEBOV in the high-level security laboratory at
17126 www.pnas.org/cgi/doi/10.1073/pnas.0704076104
sequences of the complete GP gene (2,031 nt), 24 sequences of partial GP (538 nt), and 18 sequences of the partial NP gene (1,448 nt). All previously published ebolavirus sequences were included in the analyses, and ebolavirus-Reston, -Sudan, and -Ivory Coast were included as outgroups to root the ZEBOV trees. For NP, sequences were translated and aligned at the amino acid level by using the ClustalW algorithm implemented in the MegAlign program (Lasergene software; DNASTAR, Madison, WI) before converting data bank to nucleotides. The same approach introduced no gaps in the NP alignment.
Phylogenetic relationships were determined by using Bayesian and maximum likelihood (ML) methods. Adequate substitution models were selected based on Akaike's information criterion from a broad suite of evolutionary models (21, 22), using BASEML in PAML (23) and PAUP* 4.0b10 (24). The best model for both genes was a codon position (CP) model (22), which distinguished two partitions, the first of which grouped all sites in the first and second CP and the second of which contained all sites in the third CP. Each partition also had its own transition/transversion ratios, base frequencies, γ-rate distribu- tions, and relative rates. This model was implimented in all analyses if possible. However, CP models are currently not
Wittmann et al.
Publications
235
1. Pourrut X, Kumulungui B, Wittmann T, Moussavou G, Dé
´licat A, Yaba P, Nkoghe D, Gonzalez JP, Leroy EM (2005) Microbes Infect 7:1005-1014. ´
2. Lahm SA, Kombila M, Swanepoel R, Barnes RF (2007) Trans R Soc Trop Med Hyg 101:64-68.
3. Leroy EM, Rouquet P, Formenty P, Souquie S, Kilbourne A, Froment J-M, `re Bermejo M, Smit S, Karesh W, Swanepeol R, et al. (2004) Science 303:387-390.
4. Rouquet P, Froment JM, Bermejo M, Kilbourn A, Karesh W, Reed P, Kumulungui B, Yaba P, Delicat A, Rollin PE, Leroy EM (2005) Emerg Infect Dis 11:283-290.
5. Leroy EM, Telfer P, Kumulungui B, Yaba P, Rouquet P, Roques P, Gonzalez JP, Ksiazek TG, Rollin PE, Nerrienet E (2004) J Infect Dis 190:1895-1899.
6. Bermejo M, Rodriguez-Teijeiro JD, Illera G, Barroso A, Vila C, Walsh PD (2006) Science 314:1564.
7. Walsh PD, Abernethy KA, Bermejo M, Beyers R, De Wachter P, Ella Akou M, Huijbregts B, Idiata Mambounga D, Kamdem Toham A, Kealbourn AM, et al. (2003) Nature 422:611-614.
8. Caillaud D, Levrero F, Cristescu R, Gatti S, Dewas M, Douadi M, Gautier- Hion A, Raymond M, Menard N (2006) Curr Biol 16:R489-R4891.
9. Walsh PD, Biek R, Real LA (2005) PLoS Biol 3:1-8. 10. Leroy EM, Kumulungui B, Pourrut X, Rouquet P, Hassanin A, Yaba P, Delicat
A, Paweska JT, Gonzalez JP, Swanepoel R (2005) Nature 438:575-577. 11. Peterson AT, Bauer JT, Mills JN (2004) Emerg Infect Dis 10:40-47. 12. Pinzon JE, Wilson JM, Tucker CJ, Arthur R, Jahrling PB, Formenty P (2004)
Am J Trop Med Hyg 71:664-674.
13. Gonzalez JP, Herbreteau V, Morvan J, Leroy EM (2005) Bull Soc Pathol Exot 98:210-217.
14. Leroy EM, Baize S, Lansoud-Soukate J, Mavoungou E, Apetrei C (2002) J Gen Virol 83:67-73.
15. Rodriguez LL, de Roo A, Guimard Y, Trappier SG, Sanchez A, Bressler D, Williams AJ, Rowe AK, Bartolli J, Khan AS, et al. (1999) J Infect Dis 179:S170-S176.
16. Biek R, Walsh PD, Leroy EM, Real LA (2006) PLoS Pathog 2:885-886. 17. Chare ER, Gould EA, Holmes EC (2003) J Gen Virol 84:2691-2703. 18. Jones SM, Feldmann H, Stroher U, Geisbert JB, Fernando L, Grolla A, Klenk
HD, Sullivan NJ, Volchkov VE, Fritz EA, et al. (2005) Nat Med 11:786-790. 19. Sullivan NJ, Geisbert TW, Geisbert JB, Xu L, Yang Z-Y, Roederer M, Koup
RA, Jahrling PB, Nabel GJ (2003) Nature 424:681-684. 20. Formenty P, Leroy EM, Epelboin A, Libama F, Lenzi M, Sudeck H, Yaba P,
Al larangar Y, Boumandouki P, Nkounkou VB, et al. (2006) Clin Infect Dis 42:1521-1526.
21. Posada D, Crandall KA (1998) Bioinformatics 14:817-818. 22. Shapiro B, Rambaut A, Drummond AJ (2006) Mol Biol Evol 23:7-9. 23. Yang Z (1997) Comput Appl Biosci 13:555-556. 24. Swofford DL (2003) Phylogenetic Analysis Using Parsimony (Sinauer Associates,
Sunderland, MA), Version 4.0b10. 25. Ronquist F, Huelsenbeck JP (2003) Bioinformatics 19:1572-1574. 26. Drummond AJ, Rambaut A (2006) BEAST, Version 1.4. Available at www.
beast.bio.edu.ac.uk.
Wittmann et al. PNAS October 23, 2007 vol. 104 no. 43 17127
supported by programs that use ML to estimate phylogenies. Therefore, all ML analyses were carried out by using the next best non-CP model.
Bayesian analyses were conducted with MrBayes software, Version 3.1 (25), using two independent Markov Chain Monte Carlo runs with 10 million generations each, sampling trees every 1,000 generations and with a burn-in of 1,000 trees. A final standard deviation of 0.01 for the split frequency was taken as an indication that convergence had been achieved. ML analyses were carried out with PAUP* by using a heuristic search algorithm. Bootstrap proportions were obtained from 1,000 replicates.
We performed two types of analysis in PAUP* to elimine whether the data provided evidence for recombination among different ZEBOV lineages. First, we tested whether the tree topologies for GP and NP were different when considering only outbreaks that are common to both trees. Unrooted ML trees of all ZEBOV sequences (i.e., excluding the outgroup) were found for each of the two genes, and isolates represented in just one of the data sets were pruned from the tree, resulting in both trees containing sequences from the same set of 14 isolates. Trees were then compared by using the Shimodaira-Hasegawa test. Second, we formulated topological constraints based on the relative position of the three groups (A, B, and R) in the phylogenies. In the GP tree, for example, group R formed a clade that was nested with a larger clade together with group A (Fig.
1 A). Enforcing this topological constraint while heuristically searching for the ML tree for NP produced a tree that could subsequently be compared with the original ML tree with a Shimodaira-Hasegawa test. In the NP tree, group A formed a clada (Fig. 1B), providing the corresponding topological con- straint for the analysis of GP.
The age of the split between the two ZEBOV lineages and other tree nodes was estimated with BEAST software, Version 1.4 (26), using only ZEBOV sequences and their dates of isolation. Implementing the aforementioned CP model, the analysis in BEAST was run under a constant population size coalescent model for 11 million states, of which the first 1 million were removed as burn-in. Estimating parameters under an exponential growth model produced virtually identical results (data not shown).
The partial GP and NP sequences obtained in this study are listed in SI Materials and Methods.
We thank all those involved in the field collections, D. Young for help in preparing the manuscript, T. G. Ksiazek and P. Rollin (Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA) for generously providing reagents, and W. Karesh (Wildlife Conservation Society) for his con- tinuous support. This work was supported by the government of Gabon, Total-Fina-Elf Gabon, the Ministe de la Coope `re ´ration Francaise, and ¸ Minist des Affaires Etrangères de la France (Fonds de Solidarité ère `re ´ Prioritaire Grant 2002005700).
MIC
RO
BIO
LOG
Y
Bibliographie
236
RÉFÉRENCES
BIBLIOGRAPHIQUES
Bibliographie
237
1 Jahrling P.B. Geisbert T.W., Dalgard D.W., Johnson E.D., Ksiazek T.G., Hall W.C., Peters C.J.: Preliminary Report : Isolation of Ebola Virus from Monkeys Imported to USA. Lancet, 1990; 335(3):502-5
2 Hayes C.G. Burans J.P., Ksiazek T.G., Del Rosario R.A., Miranda M.E., Manaloto C.R., Barrientos A.B., Robles C.G., Dayrit M.M., Peters C.J.: Outbreak of fatal illness among captive macaques in the Philippines caused by an Ebola-related filovirus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1992; 46(664-71
3 Miranda M.E. White M.E., Dayrit M.M., Hayes C.G., Ksiazek T.G., Burans J.P.: Seroepidemiological study of filovirus related to Ebola in the Philippines. Lancet, 1991; 337(425-6
4 Organisation World Health: Interim guidelines for handling nonhuman primates during transit and quarantine. Wkly Epidem Rec, 1990; 65(7):45-52
5 Organisation World Health: Viral haemorrhagic fever in imported monkeys. Wkly Epidem Rec, 1992; 67(19):137-44
6 Organisation World Health: Viral haemorrhagic fever in imported monkeys. Wkly Epidem Rec, 1992; 67(24):177-84
7 Rollin P.E. Williams R.J., Bressler D.S., Pearson S., Cottingham M., Pucak G., Sanchez A., Trappier S.G., Peters R.L., Greer P.W., Zaki S., Demarcus T., Hendricks K., Kelley M., Simpson D., Geisbert T.W., Jahrling P.B., Peters C.J., and Ksiazek T.G.: Ebola (Subtype Reston) Virus among Quarantined Nonhuman Primates Recently Imported from the Philippines to the United States. Journal of Virology, 1999; 179(suppl 1):108-14
8 Miranda M.E. Ksiazek T.J., Retuya T.J., Khan A.S., Sanchez A., Fulhorst C.F., Rollin P.E., Calaor A.B., Manalo D.L., Roces M.C., Dayrit M.M., Peters C.J.: Epidemiology of Ebola (subtype Reston) virus in the Philippines, 1996. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):115-9
9 Formenty P. Hatz C., Le Guenno B., Stoll A., Rogenmoser P., Widmer A.: Human Infection Due to Ebola Virus, Subtype Coˆte d’Ivoire: Clinical and Biologic Presentation. J. Infect. Dis., 1999; 179(suppl1):S48-S53
10 LeGuenno B. Formenty P., Wyers M., Gounon P., Walker F., Boesch C.: Isolation and partial characterization of a new strain of Ebola virus. Lancet, 1995; 345(1271-4
11 LeGuenno B. Formenty P., Boesch C.: Ebola virus outbreaks in the Ivory Coast and Liberia, 1994-1995. Current Topics on Microbiology and Immunology, 1999; 235(77-84
12 Formenty P. Boesch C., Wyers M., Steiner C., Donati F., Dind F., Walker F., LeGuenno B.: Ebola virus outbreak among wild chimpanzee living in a rain
Bibliographie
238
forest of Côte d'Ivoire. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):120-6
13 Smith: Ebola Haemorrhagic Fever in Sudan, 1976. Bull. World Health Organ. , 1978; 56(2):247-70
14 Baron R.C. McCormick J.B., Zubeir O.A.: Ebola virus disease in southern Sudan: hospital dissemination and intrafamilial spread. Bull. World Health Organ. , 1983; 61(997-1003
15 Organisation World Health: Outbreak of Ebola haemorrhagic fever, Uganda, August 2000 - January 2001. Wkly Epidem Rec, 2001; 76(6):41-8
16 Organisation World Health: Ebola haemorrhagic fever in South Sudan - Update. Wkly Epidem Rec, 2004; 79(28):253-64
17 Johnson K.M.: Ebola Haemorrhagic Fever in Zaire, 1976. Bull. World Health Organ. , 1978; 56(2):271-93
18 Emond R.T.D. Evans B., Bowen E.T.W., Lloyd G.: A case of Ebola virus infection. BMJ, 1977; 2(541-4
19 Heymann D.L. Weisfeld J.S., Webb P.A., Johnson K.M., Cairns T., Berquist H.: Ebola hemorrhagic fever: Tandala, Zaire, 1977-1978. J. Infect. Dis., 1980; 142(3):372-6
20 Muyembe-Tamfum J.J. Kipasa M., Kiyungu C., Colebunders R.: Ebola outbreak in Kikwit, Democratic Republic of the Congo: Discovery and control measures. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):259-62
21 Khan A.S. Tshioko F.K., Heymann D.L., LeGuenno B., Nabeth P., Kerstiëns B., Fleerackers Y., Kilmarx P.H., Rodier G.R., Nkuku O., Rollin P.E., Sanchez A., Zaki S.R., Swanepoel R., Tomori O., Nichol S.T., Peters C.J., Muyembe-Tamfum J.J., Ksiazek T.G. for the Commission de Lutte contre les épidémies à Kikwit: The reemergence of Ebola Hemorrhagic fever, Democratic Republic of the Congo, 1995. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):76-86
22 Georges A.J. Leroy E.M., Renaut A.A., Tevi Benissan C., Nabias R.J., Trinh Ngoc M., Obiang P.I., Lepage J.P.M., Bertherat E.J., Bénoni D.D., Wickings E.J., Amblard J.P., Lansoud-Soukate J.M., Milleliri J.M., Baize S., Georges-Courbot M.C.: Ebola hemorrhagic fever outbreaks in Gabon, 1994-1997: Epidemiologic and health control issues. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):65-75
23 Nkoghe D. Nnegue S., Toung Mve M., Formenty P., Thompson G., Iba Ba J., Okome Nkoumou M., Leroy E.: Cas isolé de fièvre hémorragique survenu au Gabon en 2002 pendant l'épidémie d'Ebola mais distant des régions épidémiques. Med. Trop., 2005; 65(349-54
24 Nkoghe D. Formenty P., Leroy E.M., Nnegue S., Obame Edou S.Y., Iba Ba J., Allarangar Y., Cabore J., Bachy C., Andraghetti R., de Benoist A.C.,
Bibliographie
239
Galanis E., Rose A., Bausch D., Reynolds M., Rollin P., Choueibou C., Shongo R., Gergonne B., Koné L.M., Yada A., Roth C., Mve Toung M.: Plusieurs épidémies de fièvre hémorragique due au virus Ebola au Gabon, d'octobre 2001 à avril 2002. Bull. Soc. Pathol. Exot., 2005; 98(3):224-9
25 Leroy E.M. Baize S., Mavoungou E., Apetrei C.: Sequence analysis of the GP, NP, VP40 and VP24 genes of Ebola virus isolated from deceased, surviving and asymptomatically infected individuals during the 1996 outbreak in Gabon: Comparative studies and phylogenetic characterization. Journal of General Virology, 2002; 83(67-73
26 Leroy E.M. Rouquet P. Formenty P., Souquière S., Kilbourne A., Froment J-M, Bermejo M., Smit S., Karesh W., Swanepoel R., Zaki S.R., Rollin P.E.: Multiple ebola virus transmission events and rapid decline of central african wildlife. Science, 2004; 303(16 january 2004):387-90
27 Organisation World Health: Ebola haemorrhagic fever in Republic of Congo - Update. Wkly Epidem Rec, 2003; 78(48):409-16
28 Pourrut X. Kumulungui B., Wittmann T., Moussavou G., Délicat A., Yaba P., Nkoghe D., Gonzalez J-P., Leroy E.M.: The natural history of Ebola virus in Africa. Microbes and infection, 2005; 7(1005-14
29 Boumandouki P. Formenty P., Epelboin A., Campbell P., Atsangandoko C., Allarangar Y., Leroy E.M., Kone M.L., Molamou A., Dinga-Longa O., Salemo A., Kounkou R.Y., Mombouli V., Ibara J.R., Gaturuku P., Nkunku S., Lucht A., Feldmann H.: Prise en charge des malades et des défunts lors de l'épidémie de fièvre hémorragique due au virus Ebola d'octobre à décembre 2003 au Congo. Bull. Soc. Pathol. Exot., 2005; 98(3):218-23
30 Wittmann T.J. Biek R., Hassanin A., Rouquet P., Reed P., Yaba Ph., Pourrut X., Real L., Gonzalez J-P., Leroy E.M.: First isolates of zaire ebolavirus from wild apes reveal new genetic lineage and recombinants. PNAS, 2007; (sous presse)(
31 Walsh P.D. Abernethy K.A., Bermejo M., Beyers R., De Watcher P., Ella Akou M., Huijbregts B., Mambounga D.I., Kamdem Toham A., Kilbourn A.M., Lahm S.A., Latour S., Maisels F., Mbina C., Mihindou Y., Ndong Obiang S., Ntsame Effa E., Starkey M.P., Telfer P., Thibault M., Tutin C.E.G., White L.J.T., and Wilkie D.S.: Catastrophic ape decline in western equatorial Africa. Nature, 2003; 422(611-3
32 Rouquet P. Froment J-M., Bermejo M., Kilbourne A., Karesh W., Reed P., Kumulungui B., Yaba P., Delicat A., Rollin P.E., Leroy E.M.: Wild animal mortality monitoring and human Ebola outbreaks, Gabon and Republic of Congo, 2001-2003. Emerging Infectious Diseases, 2005; 11(2):283-90
33 Bermejo M. Rodriguez-Teijeiro J.D., Ilera G., Barroso A., Vila C., Walsh P.D.: Ebola outbreak killed 5000 gorillas. Science, 2006; 314(5805):1564
Bibliographie
240
34 Peterson A.T. Bauer J.T., Mills J.N.: Ecologic and geographic distribution of filovirus disease. Emerging Infectious Diseases, 2004; 10(1):40-7
35 Monath T.P.: Ecology of Marburg and Ebola viruses: Speculations and directions for future research. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):127-38
36 Talani P. Konongo J.D., Gromyko A., Nanga-Maniane J., Yala F., Bodzongo D.: Prevalence des anticorps anti-fièvres hemorragiques d'origine virale dans la région du Pool (Congo-Brazzaville). Médecine d'Afrique Noire, 1999; 46(8-9
37 Busico K.M. Marshall K.L., Ksiazek T.G., Roels T.H., Fleerackers Y., Feldmann H., Khan A.S., Peters C.J.: Prevalence of IgG antibodies to Ebola virus in individuals during an Ebola outbreak, Democratic Republic of the Congo, 1995. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):102-7
38 Bouree P. Bergmann J.F.: Ebola virus infection in man: a serological and epidemiological survey in the Cameroons. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1983; 32(6):1465-6
39 Johnson E.D. Gonzalez J-P., Georges A.: Haemorrhagic fever virus activity in equatorial Africa: distribution and prevalence of filovirus reactive antibody in the Central African Republic. Transaction of the Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 1993; 87(530-5
40 Johnson E.D. Gonzalez J-P., Georges A.: Filovirus activity among selected ethnic groups inhabiting the tropical forest of equatorial Africa. Transactions of Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 1993; 87(536-8
41 Nakounné E. Selekon B., Morvan J.: Veille microbiologique : les fièvres hémorragiques virales en République centrafricaine ; données sérologiques actualisées chez l’homme. Santé publique, 1999; Manuscrit n°2035(
42 Gualde Norbert: Epidémies, la nouvelle carte. Desclée de Bouwer ed. 2002. 237p.
43 Tonda J.: La guérison divine en Afrique centrale (Congo, Gabon). Paris,
Karthala ("Hommes et sociétés") ed. 2002. 243p. 44 Epelboin A.: Approche anthropologique de l'épidémie de fièvre
hémorrhagique à virus Ebola sévissant dans le district de Kéllé (Cuvette ouest Congo). Rapport intermédiaire. 2003;
45 Hewlett B.S. Epelboin A., Hewlett B.W., Formenty P.: Medical anthropology and Ebola in Congo: Cultural models and humanistic care. Bull. Soc. Pathol. Exot., 2005; 98(3):230-6
46 Rowe A.K. Bertolli J., Khan A.S., Mukunu R., Muyembe-Tamfum J.J, Bressler D., Williams A.J., Peters C.J., Rodriguez L., Feldmann H., Nichol
Bibliographie
241
S.T., Rollin P.E., Ksiazek T.G., for the Commission de Lutte contre les Epidémies à Kikwit: Clinical, virologic, and immunologic follow-up of convalescent Ebola hemorrhagic fever patients and their household contacts, Kikwit, Democratic Republic of the Congo. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):28-35
47 Kibadi K. Mupapa K., Kuvula K., Massamba M., Ndaberey D., Muyembe-Tamfum J.J., Bwaka M.A., DeRoo A., Colebunders R.: Late ophtalmologic manifestations in survivors of the 1995 Ebola virus epidemic in Kikwit, Democratic Republic of the Congo. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):13-4
48 Hewlett B.S. Amola R.P.: Cultural contexts of Ebola in Northern Uganda. Emerging Infectious Diseases, 2003; 9(10):1242-8
49 Dowell S.F. Mukunu R., Ksiazek T.G., Khan A.S., Rollin P.E., Peters C.J., for the Commission de Lutte contre les Epidémies à Kikwit: Transmission of Ebola Hemorrhagic Fever: A study of risk factors in family members, Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 1995. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):87-91
50 Dowell S.F.: Ebola haemorrhagic fever: why were children spared ? . Pediatr. Infect. Dis. J., 1996; 15(189-91.
51 Francesconi P. Yoti Z., Declich S., Onek P.A., Fabiani M., Olango J., Andraghetti R., Rollin P.E., Opira C., Greco D., Salmaso S.: Ebola hemorrhagic fever transmission and risk factors of contacts, Uganda. Emerging Infectious Diseases, 2003; 9(11):1430-7
52 Roels T.H. Bloom A.S., Buffington J., Muhungu G.L., MacKenzie W.R., Khan A.S., Ndambi R., Noah D.L., Rolka H.R., Peters C.J., Ksiazek T.G.: Ebola hemorrhagic fever, Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 1995: Risk factors for patients without a reported exposure. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):92-7
53 Georges A.J. Baize S., Leroy E.M., Georges-Courbot M.C.: Virus Ebola: L'essentiel pour le praticien. Med. Trop., 1998; 58(2):177-86
54 Fisher-Hoch S.P. Brammer T.L., Trappier S.G., Hutwagner L.C., Farrar B.B., Ruo S.L., Brown B.G., Hermann L.M., Perez-Oronoz G.I., Goldsmith C.S., Hanes M.A., McCormick J.B.: Pathogenic potential of filoviruses: Role of geographic origin of primate host and virus strain. Journal of Infectious Diseases, 1992; 166(753-63
55 Fisher-Hoch S.P. McCormick J.B.: Experimental filovirus infection. Current Topics in Microbiology and Immunology, 1999; 235(117-43
56 Jahrling P.B. Geisbert T.W., Jaax N.K., Hanes M.A., Ksiazek T.G., Peters C.J.: Experimental infection of cynomolgus macaques with Ebola-Reston filoviruses from the 1989-1990 U.S. epizootic. Arch Virol Suppl, 1996; 11(115-34
Bibliographie
242
57 Fisher-Hoch S.P. Platt G.S., Neild G.H., Southee T., Baskerville A., Raymond R.T., Llyod G., Simpson D.I.H.: Pathophysiology of shock and hemorrhage in a fulminating viral infection (Ebola). Journal of Infectious Diseases, 1985; 152(5):887-94
58 Rodriguez L.L. De Roo A., Guimard Y., Trappier S.G., Sanchez A., Bressler D., Williams A.J., Rowe A.K., Bertolli J., Khan A.S., Ksiazek T.G., Peters C.J., and Nichol S.T.: Persistence and Genetic Stability of Ebola Virus during the Outbreak in Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 1995. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):170-6
59 Zaki S.R. Shieh W-J., Greer P.W., Goldsmith C.S., Ferebee T., Katshitshi J., Tshioko F.K., Bwaka M.A., Swanepoel R., Calain P., Khan A.S., Llyod E., Rollin P.E., Ksiazek T.G., and Peters C.J., for the Commission de Lutte contre les Épidémies à Kikwit: A Novel Immunohistochemical Assay for the Detection of Ebola Virus in Skin: Implications for Diagnstic, Spread, and Surveillance of Ebola Hemorrhagic Fever. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):36-47
60 Dalgard D.W. Hardy R.J., Pearson S.L., Pucak G.J., Quander R.V., Zack P.M., Peters C.J., Jahrling P.B.: Combined simian hemorrhagic fever and Ebola virus infection in cynomolgus monkeys. Lab Anim Sci, 1992; 42(2):152-7
61 Jaax N. Jahrling P., Geisbert T., Geisbert J., Steele K., McKee K., Nagley D., Johnson E., Jaax G., Peters C.: Transmission of Ebola virus (Zaire strain) to uninfected control monkeys in a biocontanment laboratory. Lancet, 1995; 346(1669-71
62 Peters C.J. Jahrling P.B., Khan A.S.: Patients infected with high-hazard viruses: scientific basis for infection control. Arch. Virol. Suppl., 1996; 11(141-68
63 Jaax N.K. Davis K.J., Geisbert T.J., Vogel P., Jaax G.P., Topper M., Jahrling P.B.: Lethal experimental infection of rhesus monkeys with Ebola-Zaire (Mayinga) virus by the oral and conjonctival route of exposure. Arch Pathol Lab Med, 1996; 120(2):140-55
64 Johnson E. Jaax N., White J., Jahrling P.: Lethal experimental infections of rhesus monkeys by aerosolized Ebola virus. Int J Exp Pathol, 1995; 76(4):227-36
65 Bazhutin N.B. Belanov E.F., Spiridonov V.A., Voitenko A.V., Krivenchuk N.A., Krotov S.A., Omel'chenko N.I., Tereshchenko AIu, Khomichev V.V.: The effects of the methods for producing an experimental Marburg virus infection on the characteristics of the course of the disease in green monkeys. Vopr Virusol, 1992; 37(3):153-6
Bibliographie
243
66 Geisbert T.W. Jahrling P.B., Hanes M.A., Zack P.M.: Association of Ebola-related Reston virus particles and antigen with tissue lesions of monkeys imported to the United States. J Comp Pathol, 1992; 106(2):137-52
67 Cheprunov A.A. Chuev Y.P., P'yankov O.V., Efimova I.V.: Effects of some physical and chemical factors of inactivation of Ebola virus. Vopr. Virusol., 1995; 2(74-6
68 Martini G.A. Siegert R.: Marburg virus disease. 1971, New York: Springer. 69 Arata A.A. Johnson B.: Approaches towards studies on potential
reservoirs of viral haemorrhagic fever in southern Sudan (1977). Ebola virus haemorrhagic fever ed. Pattyn SR. Amsterdam E.N.b. 1978. pp 191-202.
70 Breman J.G. Johnson K.M., van der Groen G., Robbins C.B., Szczeniowski
M.V., Ruti K., Webb P.A., Meier F., Heymann D.L.: A search for Ebola virus in animals in the Democratic Republic of the Congo and Cameroon: Ecologic, virologic, and serologic surveys, 1979-1980. . J. Infect. Dis., 1999; 179(Suppl. 1):S139-S47
71 Leirs H. Mills J.N., Krebs J.W., Childs J.E., Akaibe D., Woollen N., Ludwig G., Peters C.J., Ksiazek T.G., and other study group members: Search for the Ebola virus reservoir in Kikwit, Democratic Republic of the Congo: Reflections on a vertebrate collection. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):155-63
72 Reiter P. Turell M., Coleman R., Miller B., Maupin G., Liz J., Kuehne A., Barth J., Geisbert J., Dohm D., Glick J., Pecor J., Robbins R., Jahrling P., Peters C., Ksiazek T.: Field investigations of an outbreak of Ebola hemorrhagic fever, Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 1995: Arthropods studies. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):148-54
73 Allela L. Bourry O., Pouillot R., Delicat A., Yaba P., Kumulungui B., Rouquet P., Gonzales J-P., Leroy E.M.: Ebola virus antibody prevalence in dogs and human risk. Emerging Infectious Diseases, 2005; 11(3):385-90
74 Turell M.J. Bressler D.S., Rossi C.A.: Short report: Lack of virus replication on arthropods after intrathoracic inoculation of Ebola Reston virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1996; 55(1):89-90
75 Swanepoel R. Leman P.A., Burt F.J., Zachariades N.A., Braack L.E.O., Ksiazek T.G., Rollin P.E., Zaki S.R., Peters C.J.: Experimental inoculation of plants and animals with Ebola virus. Emerging Infectious Diseases, 1996; 2(4):321-5
Bibliographie
244
76 Haydon D.T. Cleaveland S., Taylor L.H., Laurenson M.K.: Identifying reservoirs of infection: A conceptual and practical challenge. Emerging Infectious Diseases, 2002; 8(12):1468-73
77 Peterson A.T. Caroll D.S., Mills J.N., Johnson K.M.: Potential mammalian filovirus reservoirs. Emerging Infectious Diseases, 2004; 10(12):2073-81
78 Gear J.S.S. Cassel G.A., Gear A.J., trappler B., Clausen L., Meyers A.M., Kew M.C., Bothwell T.H., Sher R., Miller G.B., Schneider J., Koornhof H.J., Gomperts E.D., Isaäcson M., Gear J.H.S.: Outbreak of Marburg virus disease in Johannesburg. Br. Med. J., 1975; 4(489-93
79 Smith D.H. Johnson B.K., Isaacson B.K., Swanapoel R., Johnson K.M., Killey M., Bagshawe A., Siongok T., Keruga W.K.: Marburg-virus disease in Kenya. Lancet, 1982; 1(816-20
80 Leroy E.M.: Infection Asymptomatique de l’Homme par le Virus Ebola, 2000, Spécialité : Immunologie, Université Pierre et Marie Curie ((Paris VI))
81 Kunz C. Hofmann H., Aspöck H.: Propagation of "Marburg-virus" (vervet monkey disease agent) in Aedes aegypti. Zentralbl. Bakteriol. Parasitol. Orig., 1968; 208(347-9
82 Leroy E. Pourrut X., Gonzalez J-P.: Les chauves-souris, réservoirs du virus Ebola. Le mystère se dissipe. . Medecine/Science, 2006; 22(78-80
83 Leroy E.M. Kumulungui B., Pourrut X., Rouquet P., Hassanin A., Yaba Ph., Délicat A., Paweska J.T., Gonzalez J-P., Swanepoel R.: Fruit bats as reservoirs of Ebola virus. Nature, 2005; 438(575-6
84 Biek R. Walsh P.D., Leroy E.M., Real L.A.: Recent common ancestry of Ebola Zaire virus found in a bat reservoir. PLoS Pathog., 2006; 2(10):e90
85 Sureau P.H.: Firsthand clinical observations of hemorrhagic manifestations in Ebola hemorrhagic fever in Zaire. Reviews of Infectious Diseases, 1989; 11(suppl 4):790-3
86 Ndambi R. Akamituna P., Bonnet M-J., Tukadila A.M., Muyembe-Tamfum J.J., Colebunders R.: Epidemiologic and clinical aspects of the Ebola virus epidemic in Mosango, Democratic Republic of the Congo, 1995. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):8-10
87 Mupapa K. Mulundu W., Bwaka M.A., Kipasa M., De Roo A., Kuvula K., Kibadi K., Massamba M., Ndaberey D., Colebunders R., Muyembe-Tamfum J.J.: Ebola hemorrhagic fever and pregnancy. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):11-2
88 Kalongi Y. Mwanza K., Tshisuaka M., Lusiama N., Ntando E., Kanzake L., Shieh W-J., Zaki S.R., Llyod E.S., Ksiazek T.G., Rollin P.E.: Isolated case of Ebola hemorrhagic fever with mucormycosis complications, Kinshasa, Democratic Republic of the Congo. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):15-7
Bibliographie
245
89 Jahrling P.B.: Filoviruses and Arenaviruses. 1995; 1068-81 90 Geisbert T.W. Jahrling P.B.: Use of immunoelectron microscopy to show
Ebola virus during the 1989 United States epizootic. J. Clin. Pathol., 1990; 43(813-6
91 Ellis D.S. Simpson D.I.H., Francis D.P., Knobloch J., Bowen E.T.W., Lolik P., Deng I.M.: Ultrastructure of Ebola virus particles in human liver. J. Clin. Pathol., 1978; 31(201-8
92 Geisbert TW Jahrling P.B.: Differentiation of filoviruses by electron microscopy. Virus Res., 1995; 39(129-50
93 Kolesnikova L. Mühlberger E., Ryabchikova E., Becker S.: Ultrastructural organization of recombinant Marburg virus nucleoprotein: Comparison with Marburg virus inclusions. Journal of Virology, 2000; 74(8):3899-904
94 Noda T. Ebihara H., Muramoto Y., Fujii K., Takada A., Sagara H., Kim J.H., Kida H., Feldmann H., Kawaoka Y.: Assembly and budding of Ebolavirus. PLoS Pathog., 2006; 2(9):e99
95 Wyers M. Formenty P., Cherel Y., Guigand L., Fernandez B., Boesch C., LeGuenno B.: Histopathological and immunohistochemical studies of lesions associated with Ebola virus in a naturally infected chimpanzee. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):54-9
96 Volchkov V.E. Chepurnov A.A., Volchkova V.A., Ternovoj V.A., Klenk H-D.: Molecular characterization of Guinea Pig-adapted variants of Ebola virus. Virology, 2000; 277(147-55
97 McCormick J.B. Bauer S.P., Elliott L.H., Webb P.A., Johnson K.M.: Biologic Differences Between Strains of Ebola Virus from Zaire and Sudan. Journal of Infectious Diseases, 1983; 147(2):164-7
98 Harcourt B.H. Sanchez A., Offermann M.K.: Ebola inhibits induction of genes by double-stranded RNA in endothelial cells. Virology, 1998; 252(179-88
99 Baskerville A. Bowen E.T., Platt G.S., McArdell L.B., Simpson D.I.: The pathology of experimental Ebola virus infection in monkeys. J. Pathol., 1978; 125(3):131-8
100 Moe J.B. Lambert R.D., Lupton H.W.: Plaque assay for Ebola virus. Journal of Clinical Microbiology, 1981; 13(4):791-3
101 Ksiazek T.G. Rollin P.E., Williams A.J., Bressler D.S., Martin M.L., Swanepoel R., Burt F.J., Leman P.A., Khan A.S., Rowe A.K., Mukunu R., Sanchez A., Peters C.J.: Clinical virology of Ebola Hemorrhagic Fever (EHF): Virus, virus antigen, and IgG and IgM antibody findings among EHF patiens in Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 1995. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):177-87
102 Drosten C. Göttig S., Schilling S., Asper M., Panning M., Schmitz H., Günther S.: Rapid detection and quantification of RNA of Ebola and
Bibliographie
246
Marburg viruses, Lassa virus, Crimean-Congo Hemorrhagic Fever virus, Rift Valley Fever virus, Dengue virus, and Yellow Fever virus by real-time reverse-transcription-PCR. Journal of Clinical Microbiology, 2002; 40(7):2323-30
103 Weidmann M. Mühlberger E., Hufert F.T.: Rapid detection protocol for filoviruses. Journal of Clinical Virology, 2004; 30(94-9
104 Kurosaki Y. Takada A., Ebihara H., Grolla A., Kamo N., Feldmann H., Kawaoka Y., Yasuda J.: Rapid and simple detection of Ebola virus by reverse transcription-loop-mediated isothermal amplification. J Virol Methods, 2007; 141(1):78-83
105 Towner J.S. Rollin P.E., Bausch D.G., Sanchez A., Crary S.M., Vincent M., Lee W.F., Spiropoulou C.F., Ksiazek T.G., Lukwiya M., Kaducu F., Downing R., Nichol S.T.: Rapid diagnosis of Ebola hemorrhagic fever by reverse transcription-PCR in an outbreak setting and assessment of patient viral load as a predictor of outcome. Journal of Virology, 2004; 78(8):4330-41
106 Günther S. Asper M., Röser C., Luna L.K.S., Drosten C., Becker-Ziaja B., Borowski P., Chen H-M., Hosmane R.S.: Application of real-time PCR for testing antiviral compounds against Lassa virus, SARS coronavirus and Ebola virus in vitro. Antiviral Research, 2004; 63(209-15
107 Ksiazek T.G. Rollin P.E., Jahrling P.B., Johnson E., Dalgard D.W., Peters C.J.: Enzyme Immunosorbent Assay for Ebola virus antigens in tissues of infected primates. Journal of Clinical Microbiology, 1992; 30(4):947-50
108 Yu J.S. Liao H.X., Gerdon A.E., Huffman B., Scearce R.M., McAdams M., Alam S.M., Popernack P.M., Sullivan N.J., Wright D., Cliffel D.E., Nable G.J., Hayes B.F.: Detection of Ebola virus envelope using monoclonal and polyclonal antibodies in ELISA, surface plasmon resonance and a quartz crystal microbalance immunosensor. J Virol Methods, 2006; 137(2):219-28
109 Lucht A. Grunow R., Möller P., Feldmann H., Becker S.: Development, characterization and use of monoclonal VP40-antibodies for the detection of Ebola virus. Journal of Virological Methods, 2003; 11(21-8
110 Sanchez A. Ksiazek T.G., Rollin P.E., Miranda M.E.G., Trappier S.G., Khan A.S., Peters C.J., Nichol S.T.: Detection and molecular characterization of Ebola viruses causing disease in human and nonhuman primates. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):164-9
111 Leroy E.M. Baize S., Lu C.Y., McCormick J.B., Georges A.J., Georges-Courbot M-C., Lansoud-Soukate J., and Fisher-Hoch S.P.: Diagnosis of ebola haemorrhagic fever by RT-PCR in an epidemic setting. Journal of Medical Virology, 2000; 60(463-7
112 Zhai J. Palacios G., Towner J.S., Jabado O., Kapoor V., Venter M., Grolla A., Briese T., Paweska J., Swanepoel R., Feldmann H., Nichol S., Lipkin
Bibliographie
247
W.I.: Rapid molecular strategy for filovirus detection and characterization. J Clin Microbiol., 2007; 45(1):224-6
113 Wulff H. Lange J.V.: Indirect immunofluorescence for the diagnosis of Lassa fever infection. Bull. World Health Organ., 1975; 52(429-35
114 Johnson K.M. Elliott L.H., Heymann D.L.: Preparation of Polyvalent Viral Immunofluorescent Intracellular Antigens and Use in Human Serosurveys. J. Clin. Microbiol., 1981; 14(5):527-9
115 Ivanoff B. Duquesnoy P., Languillat G., Saluzzo J.F., Georges A., Gonzalez J-P., McCormick J.: Haemorrhagic fever in Gabon. I. Incidence of Lassa, Ebola and Marburg viruses in Haut-Ogooué. Transactions of Royal Society of Tropical Medicine and Hygiene, 1982; 76(6):719-20
116 Ksiazek T.G. West C.P., Rollin P.E., Jahrling P.B., Peters C.J.: ELISA for the detection of antibodies to Ebola viruses. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):192-8
117 Ivanov A.P. Tkachenko E.A., van der Groen G., Butenko A.M., Konstantinov O.K.: Indirect immunoenzyme method for the laboratory diagnosis of Lassa en Ebola hemorrhagic fevers. Vopr. Virusol., 1986; 31(2):186-90
118 Elliott L.H. Bauer S.P., Perez-Oronoz G., Lloyd E.S.: Improved specificity of testing methods for filovirus antibodies. J. Virol. Methods, 1993; 43(1):85-9
119 Richman D.D. Cleveland P.H., McCormick J.B., Johnson K.M.: Antigenic analysis of strains of Ebola virus: Identification of two Ebola virus serotypes. J. Infect. Dis., 1983; 147(2):268-71
120 Kerstiëns B. Matthys F.: Interventions to control virus transmission during an outbreak of Ebola hemorrhagic fever: Experience from Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 1995. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):263-7
121 Lloyd E.S. Zaki S.R., Rollin P.E., Tshioko K., Bwaka M.A., Ksiazek T.G., Calain P., Shieh W-J., Kondé M.K., Verchueren E., Perry H.N., Manguindula L., Kabwau J., Ndambi R., Peters C.J.: Long-Term Disease Surveillance in Bandundu Region, Democratic Republic of
the Congo: A Model for Early Detection and Prevention of Ebola Hemorrhagic Fever. J. Infect. Dis., 1999; 179(suppl1):S271-S80 122 Guimard Y. Bwaka M.A., Colebunders R., Calain P., Massamba M., DeRoo A.,
Mupapa K.D., Kibadi K., Kuvula K.J., Ndaberey B.B., Nkuku O.B., Fleerackers Y., Van den Enden E., Kipasa M.A.: Organization of patient care during the Ebola hemorrhagic fever epidemic in Kikwit, Democratic Republic of the Congo, 1995. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):268-73
123 Sanchez A. Trappier S.G., Mahy B.W.J., Peters C.J., Nichol S.T.: The virion glycoproteins of Ebola viruses are encoded in two reading frames
Bibliographie
248
and are expressed through transcriptional editing. PNAS, 1996; 93(3602-7
124 Bray M. Davis K., Geisbert T., Schmaljohn C., Huggins J.: A mouse model for evaluation of prophylaxis and therapy of Ebola hemorrhagic fever. Journal of Infectious Diseases, 1998; 178(651-61
125 Gupta M. Mahanty S., Bray M., Ahmed R., Rollin P.E.: Passive transfer of antibodies protects immunocompetent and immunodeficient mice against lethal Ebola virus infection without complete inhibition of viral replication. Journal of Virology, 2001; 75(10):4649-54
126 Wilson J.A. Bray M., Bakken R., Hart M.K.: Vaccine potential of Ebola virus VP24, VP30, VP35 and VP40 proteins. Virology, 2001; 286(2):384-90
127 Jahrling P.B. Geisbert J., Swearengen J.R., Jaax G.P., Lewis T., Huggins J.W., Schmidt J.J., LeDuc J.W., Peters C.J.: Passive immunization of Ebola virus-infected cynomolgus monkeys with immunoglobulin from hyperimmune horses. Arch Virol. Suppl., 1996; 11(135-40
128 Ulmer J.B. Donnelly J.J., Parker S.E., Rhodes G.H., Felgner P.L., Dwarki V.J., Gromkowski S.H., Deck R.R., DeWitt C.M., Friedman A., et al.: Heterologous protection against influenza by injection of DNA encoding a viral protein. Science, 1993; 259(5102):1745-9
129 Sedegah M. Hedstrom R., Hobart P., Hoffman S.L.: Protection against malaria by immunization with plasmid DNA encoding circumsporozoite protein. PNAS, 1994; 91(9866-70
130 Tascon R.E. Colston M.J., Ragno S., Stavropoulos E., Gregory D., Lowrie D.B.: Vaccination against tuberculosis by DNA injection. Nat. Med., 1996; 2(8):888-92
131 Xu L. Sanchez A., Yang Z-Y., Zaki S.R., Nabel E.G., Nichol S.T., Nabel G.J.: Immunization for Ebola virus infection. Nature Medicine, 1998; 4(1):37-42
132 Warfield K.L. Bosio C.M., Welcher B.C., Deal E.M., Mohamadzadeh M., Schmaljohn A., Aman M.J., Bavari S.: Ebola virus-like particles protect from lethal Ebola virus infection. PNAS, 2003; 100(26):15889-94
133 Dowling W. Thompson E., Badger C., Mellquist J.L., Garrison A.R., Smith J.M., Paragas J., Hogan R.J., Schmaljohn C.: Influences of glycosylation on antigenicity, immunogenicity, and protective efficacy of Ebola virus GP DNA vaccines. J Virol., 2007; 81(4):1821-37
134 Wang D. Raja N.U., Trubey C.M., Juompan L.Y., Luo M., Woraratanadharm J., Deitz S.B., Yu H., Swain B.M., Moore K.M., Pratt W.D., Hart M.K., Dong J.Y.: Development of a cAdVax-based bivalent Ebola virus vaccine that induces immune responses against both the Sudan and Zaire species of Ebola virus. Journal of Virology, 2006; 80(6):2738-46
Bibliographie
249
135 Geisbert T.W. Pushko P., Anderson K., Smith J., Davis K.J., Jahrling P.B.: Evaluation in nonhuman primates of vaccines against Ebola virus. Emerging Infectious Diseases, 2002; 8(5):503-7
136 Yang Z-Y. Wyatt L.S., Kong W-P., Moodie Z., Moss B., Nabel G.J.: Overcoming immunity to a viral vaccine by DNA priming before vector boosting. Journal of Virology, 2003; 77(1):799-803
137 Sullivan N.J. Geisbert T.W., Geisbert J.B., Xu L., Yang Z-Y., Roederer M., Koup R.A., Jahrling P.B., Nabel G.J.: Accelerated vaccination for Ebola virus haemorrhagic fever in non-human primates. Nature, 2003; 424(681-4
138 Sullivan N.J. Sanchez A., Rollin P.E., Yang Z-Y, Nabel G.J.: Development of a preventive vaccine for Ebola virus infection in primates. Nature, 2000; 408(605-9
139 Manicassamy B. Wang J., Jiang H., Rong L.: Comprehensive analysis of Ebola virus GP1 in viral entry. Journal of Virology, 2005; 79(8):4793-805
140 Sullivan N.J. Geisbert T.W., Geisbert J.B., Shedlock D.J., Xu L., Lamoreaux L., Custers J.H.H.V., Popernack P.M., Yang Z-Y., Pau M.G., Roederer M., Koup R.A., Goudsmit J., Jahrling P.B., Nabel G.J.: Immune protection of nonhuman primates against Ebola virus with single low-dose adenovirus vectors encoding modified GPs. PLoS Medicine, 2006; 3(6):e177
141 Geisbert T.W. Jones S., Fritz E.A., Shurtleff A.C., Geisbert J.B., Liebscher R., Grolla A., Ströher U., Fernando L., Daddario K.M., Guttieri M.C., Mothé B.R., Larsen T., Hensley L.E., Jahrling P.B., Feldmann H.: Development of a new vaccine for the prevention of Lassa Fever. PLoS Med, 2005; 2(6):e183
142 Garbutt M. Liebscher R., Wahl-Jensen V., Jones S., Möller P., Wagner R., Volchkov V., Klenk H-D., Feldmann H., Ströher U.: Properties of replication-competent vesicular stomatitis virus vectors expressing glycoproteins of Filoviruses and Arenaviruses. Journal of Virology, 2004; 78(10):5458-65
143 Jones S.M. Feldmann H., Ströher U., Geisbert J.B., Fernando L., Grolla A., Klenk H.D., Sullivan N.J., Volchkov V.E., Fritz E.A., Daddario K.M., Hensley L.E., Jahrling P.B., Geisbert T.W.: Live attenuated recombinant vaccine protects nonhuman primates against Ebola and Marburg viruses. Nat. Med., 2005; 11(7):786-90
144 Pushko P. Parker M., Ludwig G.V., Davis N.L., Johnston R.E., Smith J.F.: Replicon-helper systems for attenuated Venezuelan equine encephalis virus: expression of heterologous genes in vitro and immunization against heterologous pathogens in vivo. Virology, 1997; 239(389-401
Bibliographie
250
145 Pushko P. Geisbert J., Parker M., Jahrling P., Smith J.: Individual and bivalent vaccines based on Alphavirus replicons protects guinea pigs against infection with Lassa and Ebola viruses. Journal of Virology, 2001; 75(23):11677-85
146 Bukreyev A. Yang L., Zaki S.R., Shieh W-J., Rollin P.E., Murphy B.R., Collins P.L., Sanchez A.: A single intranasal inoculation with a Paramyxovirus-vectored vaccine protects Guinea Pigs against a lethal-dose Ebola virus challenge. Journal of Virology, 2006; 80(5):2267-79
147 Bukreyev A.A. Rollin P.E., Tate M.K., Yang L., Zaki S.R., Shieh W.J., Murphy B.R., Collins P.L., Sanchez A.: Successful topical respiratory tract immunization of primates against Ebola virus. J. Virol., 2007; 81(12):6379-88
148 Martin J.E. Sullivan N.J., Enama M.E., Gordon I.J., Roederer M., Koup R.A., Bailer R.T., Chakrabarti B.K., Bailey M.A., Gomez P.L., Andrews C.A., Moodie Z., Gu L., Stein J.A., Nabel G.J., Graham B.S., and the VRC 204 Study Team: A DNA vaccine for Ebola virus is safe and immunogenic in a phase I clinical trail. Clin. Vaccine Immunol., 2006; 13(11):1267-77
149 Huggins J.W.: Prospects for treatment of viral hemorrhagic fevers with Ribavirin, a broad-spectrum antiviral drug. Reviews of Infectious Diseases, 1989; 11(suppl 4):750-61
150 Huggins J. Zhang Z-X., Bray M.: Antiviral drug therapy of filovirus infection: S-Adenosylhomocysteine hydrolase inhibitors inhibit Ebola virus in vitro and in a lethal mouse model. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):240-7
151 Geisbert T.W. Young H.A., Jahrling P.B., Davis K.J., Kagan E., Hensley L.E.: Mechanisms underlying coagulation abnormalities in Ebola hemorrhagic fever: Overexpression of tissue factor in primate monocytes/macrophages is a key event. Journal of Infectious Diseases, 2003; 188(1618-29
152 Vlasuk G.P. Rote W.E.: Inhibition of factor VIIa/tissue factor with nematode anticoagulant protein c2: from unique mechanism to a promising new clinical anticoagulant. Trends Cardiovasc Med, 2002; 12(8):325-31
153 Moons A.H. Peters C.J., Bijsterveld N.R., Piek J.J., Prins M.H., Vlasuk G.P., Rote W.E., Büller H.R.: Recombinant nematode anticoagulant protein c2, an inhibitor of the tissue factor/factor VIIa complex, in patients undergoing elective coronary angioplasty. J. Am. Coll. Cardiol., 2003; 41(12):2147-53
154 Geisbert T.W. Hensley L.E., Jahrling P.B., Larsen T., Geisbert J.B., Paragas J., Young H.A., Fredeking T.M., Rote W.E., Vlasuk G.P.: Treatment of Ebola virus infection with a recombinant inhibitor of factor VIIa/tissue factor: A study in rhesus monkeys. Lancet, 2003; 362(1953-8
Bibliographie
251
155 Deas T.S. Binduga-Gajewska I., Tilgner M., Ren P., Stein D.A., Moulton H., Iversen P.L., Kauffman E.B., Kramer L.D., Shi P-Y: Inhibition of Flavivirus Infections by Antisense Oligomers Specifically Suppressing Viral Translation and RNA Replication. J. Virol., 2005; 79(8):4599-609
156 Kinney R.M. Huang C.Y.H., Rose B.C., Kroeker A.D., Dreher T.W., Iversen P.L., Stein D.A.: Inhibition of Dengue Virus Serotypes 1 to 4 in Vero Cell Cultures with Morpholino Oligomers. J. Virol., 2005; 79(8):5116-28
157 Warfield K.L. Swenson D.L., Olinger G.G., Nichols D.K., Pratt W.D., Blouch R., Stein D.A., Aman M.J., Iversen P.L., Bavari S.: Gene-specific countermeasures against Ebola virus based on antisense phosphorodiamidate morpholino oligomers. PLoS Pathog, 2006; 2(1):e1
158 Sergeev A.N. Lub M.I., P'iankova O.G., Kotliarov L.A.: [The efficacy of the emergency prophylactic and therapeutic actions of immunomodulators in experimental filovirus infections]. Antibiot. Khimioter, 1995; 40(5):24-7
159 Jahrling P.B. Geisbert T.G., Geisbert J.B., Swearengen J.R., Bray M., Jaax N.K., Huggins J.W., LeDuc J.W., Peters C.J.: Evaluation of immune globulin and recombinant interferon-alpha2b for treatment of experimental Ebola virus infections. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):224-34
160 Kudoyarova-Zubavichene N.M. Sergeyev N.N., Chepurnov A.A., Netesov S.V.: Preparation and use of hyperimmune serum for prophylaxix and therapy of Ebola virus infections. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):218-23
161 Mupapa K. Massamba M., Kibadi K., Kuvula K., Bwaka A., Kipasa M., Colebunders R., Muyembe-Tamfum J.J. on behalf of the International Scientific and Technical Committee: Treatment of Ebola hemorrhagic fever with blood transfusion from convalescent patients. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):18-23
162 Isaacson M. Surreau P., Courteille G., Pattyn S.R.: Clinical aspects of Ebola virus disease at the Ngaliema Hospital, Kinshasa, Zaire, 1976, in Ebola virus haemorrhagic fever. Ebola virus infection., S.R. P., Editor. 1978, Elsevier/North-Holland
Amsterdam. p. 15-20. 163 Wilson J.A. Hevey M., Bakken R., Guest S., Bray M., Schmaljohn A.L., Hart
M.K.: Epitopes involved in antibody-mediated protection from Ebola virus. Science, 2000; 287(1664-6
164 Maruyama T. Rodriguez L.L., Jahrling P.B., Sanchez A., Khan A.S., Nichol S.T., Peters C.J., Parren P.W.H.I., Burton D.R.: Ebola virus can be effectively neutralized by antobidy produced in natural human infection. Journal of Virology, 1999; 73(7):6024-30
Bibliographie
252
165 Parren P.W.H.I. Geisbert T.W., Maruyama T., Jahrling P.B., Burton D.R.: Pre- and postexposure of Ebola virus infection in an animal model by passive transfer of a neutralizing human antibody. Journal of Virology, 2002; 76(12):6408-12
166 Takada A. Ebihara H., Jones S., Feldmann H., Kawaoka Y.: Protective efficacy of neutralizing antibodies against Ebola virus infection. Vaccine., 2007; 25(6):993-9
167 Oswald W.B. Geisbert T.W., Davis K.J., Geisbert J.B., Sullivan N.J., Jahrling P.B., Parren P.W.H.I., Burton D.R.: Neutralizing antibody fails to impact the course of Ebola virus infection in Monkeys. PLoS Pathog., 2007; 3(1):e9
168 Daddario-DiCaprio K.M. Geisbert T.W., Ströher U., Geisbert J.B., Grolla A., Fritz E.A., Fernando L., Kagan E., Jahrling P.B., Hensley L.E., Jones S.M., Feldmann H.: Postexposure protection against Marburg haemorrhagic fever with recombinant vesicular stomatitis virus vectors in non-human primates: an efficacy assessment. Lancet, 2006; 367(9520):1399-404
169 Daddario-DiCaprio K.M. Geisbert T.W., Geisbert J.B., Ströher U., Hensley L.E., Grolla A., Fritz E.A., Feldmann F., Feldmann H., Jones S.M.: Cross-protection against Marburg virus strains by using a live, attenuated recombinant vaccine. J. Virol., 2006; 80(19):9659-66
170 Feldmann H. Jones S.M., Daddario-DiCaprio K.M., Geisbert J.B., Ströher U., Grolla A., Bray M., Fritz E.A., Fernando L., Feldmann F., Hensley L.E., Geisbert T.W.: Effective post-exposure treatment of Ebola infection. PLoS Pathog., 2007; 3(1):e2
171 Bowen E.T.W. Platt G.S., Simpson D.I.H., McArdell L.B., Raymond R.T.: Ebola haemorrhagic fever: Experimental infection of monkeys. Transaction of Royal Society, 1978; 72(2):188-91
172 Baskerville A. Fisher-Hoch S.P., Neild G.H., Dowsett A.B.: Ultrastructural pathology of experimental Ebola haemorrhagic fever virus infection. J. Pathol., 1985; 147(3):199-209
173 Geisbert T.W. Hensley L.E., Larsen T., Young H.A., Reed D.S., Geisbert J.B., Scott D.P., Kagan E., Jahrling P.B., Davis K.J.: Pathogenesis of Ebola hemorrhagic fever in cynomolgus Macaques: Evidence that dendritic cells are early and sustained targets of infection. American Journal of Pathology, 2003; 163(6):2347-70
174 Connolly B.M. Steele K.E., Davis K.J., Geisbert T.W., Kell W.M., Jaax N.K., Jahrling P.B.: Pathogenesis of experimental Ebola virus infection in Guinea pigs. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):203-17
Bibliographie
253
175 Gibb T.R. Bray M., Geisbert T.W., Steele K.E., Kell W.M., Davis K.J., Jaax N.K.: Pathogenesis of experimental Ebola Zaire virus infection in BALB/c mice. J. Comp. Path., 2001; 125(233-42
176 Bray M. Hatfill S., Hensley L., Huggins J.W.: Haematological, biochemical and coagulation changes in mice, guinea-pigs and monkeys infected with a mouse-adapted variant of Ebola Zaire virus. J. Comp. Path., 2001; 125(243-53
177 Ryabchikova E.I. Kolesnikova L.V., Luchko S.V.: An analysis of features of pathogenesis in two animal models of Ebola virus infection. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):199-202
178 Fisher-Hoch S.P. Platt G.S., Llyod G., Simpson D.I.H., Neild G.H., Barrett A.J.: Haematological and biochemical monitoring of Ebola infection in rhesus monkeys: implications for patient management. Lancet, 1983; 2(1055-8
179 Cosgriff: Viruses and hemostasis. Reviews of Infectious Diseases, 1989; 11(suppl 4):672-88
180 Ryabchikova E. Kolesnikova L., Smolina M., Tkachev V., Pereboeva L., Baranova S., Grazhdantseva A., Rassadkin Y.: Ebola virus infection in guinea pigs: presumable role of granulomatous inflammation in pathogenesis. Arch. Virol., 1996; 141(909-21
181 Geisbert T.W. Young H.A., Jahrling P.B., Davis K.J., Larsen T., Kagan E., Hensley L.E.: Pathogenesis of Ebola hemorrhagic fever in primate models: Evidence that hemorrhage is not a direct effect of virus-induced cytloysis of endothelial cells. American Journal of Pathology, 2003; 163(6):2371-82
182 Schnittler H.J. Mahner F., Drenckhahn D., Klenk H-D., Feldmann H.: Replication of Marburg virus in human endothelial cells. J. Clin. Invest., 1993; 91(1301-9
183 Feldmann H. Bugany H., Mahner F., Klenk H-D., Drenckhahn D., Schnittler H-J: Filovirus-induced endothelial leakage triggered by infected monocytes/macrophages. Journal of Virology, 1996; 70(4):2208-14
184 Ströher U. West E., Bugany H., Klenk H-D., Schnittler H-J., Feldmann H.: Infection and activation of monocytes by Marburg and Ebola viruses. Journal of Virology, 2001; 75(22):11025-33
185 Sanchez A. Lukwiya M., Bausch D., Mahanty S., Sanchez A.J., Wagoner K.D., Rollin P.E.: Analysis of human peripheral blood samples from fatal and nonfatal cases of Ebola (Sudan) hemorrhagic fever: Cellular responses, virus load, and nitric oxide levels. Journal of Virology, 2004; 78(19):10370-7
Bibliographie
254
186 Gupta M. Mahanty S., Greer P., Towner J.S., Shieh W-J., Zaki S.R., Ahmed R., Rollin P.E.: Persistent infection with Ebola virus under conditions of partial immunity. Journal of Virology, 2004; 78(2):958-67
187 Warfield K.L. Perkins J.G., Swenson D.L., Deal E.M., Bosio C.M., Aman M.J., Yokoyama W.M., Young H.A., Bavari S.: Role of natural killer cells in innate protection against lethal Ebola virus infection. Journal of Experimental Medicine, 2004; 200(2):169-79
188 Simmons G. Reeves J.D., Grogan C.C., Vandenberghe L.H., Baribaud F., Whitbeck J.C., Burke E., Buchmeier M.J., Soilleux E.J., Riley J.L., Doms R.W., Bates P., Pohlmann S.: DC-SIGN and DC-SIGNR bind Ebola glycoproteins and enhance infection of macrophages and endothelial cells. . Virology, 2003; 305(1):115-23
189 Alvarez C.P. Lasala F., Carrillo J., Muñiz O., Corbi A.L., Delgado R.: C-type lectins DC-SIGN and L-SIGN mediate cellular entry by Ebola virus in cis and in trans. J. Virol., 2002; 76(13):6841-4
190 Lin G. Simmons G., Pöhlmann S., Baribaud F., Ni H., Leslie G.J., Haggarty B.S., Bates P., Weissman D., Hoxie J.A., Doms R.W.: Differential N-linked glycosylation of Human Immunodeficiency Virus and Ebola virus envelope glycoproteins modulates interactions with DC-SIGN and DC-SIGNR. Journal of Virology, 2003; 77(2):1337-46
191 Marzi A. Akhavan A., Simmons G., Gramberg T., Hofmann H., Bates P., Lingappa V.R., Pöhlmann S.: The signal peptide of the Ebolavirus glycoprotein influences interaction with the cellular lectins DC-SIGN and DC-SIGNR. Journal of Virology, 2006; 80(13):6305-17
192 Martinez O. Valmas C., Basler C.F.: Ebola virus-like particle-induced activation of NF-kappaB and Erk signaling in human dendritic cells requires the glycoprotein mucin domain. Virology, 2007; 364(2):342-54
193 Marzi A. Gramberg T., Simmons G., Möller P., Rennekamp A.J., Krumbiegel M., Geier M., Eisemann J., Turza N., Saunier B., Steinkasserer A., Becker S., Bates P., Hofmann H., Pöhlmann S.: DC-SIGN a,d DC-SIGNR interact with the glycoprotein of Marburg virus and the S protein of Severe Acute Respiratory Syndrome Coronavirus. Journal of Virology, 2004; 78(21):12090-5
194 Gutcher I. Burkhard B.: APC-derived cytokines and T cell polarization in autoimmune inflammation. J. Clin. Invest., 2007; 117(5):1119-27
195 Kaser A. Brandacher G., Steurer W., Kaser S., Offner F.A., Zoller H., Theurl I., Widder W., Molnar C., Ludwiczek O., Atkins M.B., Mier J.W., Tilg H.: Interleukin-6 stimulates thrombopoiesis through thrombopoietin: role in inflammatory thrombocytosis. Blood, 2001; 98(9):2720-5
Bibliographie
255
196 Ishibashi T. Kimura H., Uchida T., Kariyone S., Friese P., Burstein S.A.: Human interleukin 6 is a direct promoter of maturation of megakaryocytes in vitro. PNAS, 1989; 86(5953-7
197 Fernandez E.J. Lolis E.: Structure, function, and inhibition of chemokines. Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol., 2002; 42(469-99
198 Cocchi F. DeVico A.L., Garzino-Demo A., Arya S.K., Gallo R.C., Lusso P.: Identification of RANTES, MIP-1 alpha, and MIP-1 beta as the major HIV-suppressive factors produced by CD8+ T cells. Science, 1995; 270(5243):1811-5
199 Garzino-Demo A. Moss R.B., Margolick J.B., Cleghorn F., Sill A., Blattner W.A., Cocchi F., Carlo D.J., DeVico A.L., Gallo R.C.: Spontaneous and antigen-induced production of HIV-inhibitory b-chemokines are associated with AIDS-free status. PNAS, 1999; 96(21):11986-91
200 Loetscher M. Gerber B., Loetscher P., Jones S.A., Piali L., Clark-Lewis I., Baggiolini M., Moser B.: Chemokine receptor specific for IP10 and mig: structure, function, and expression in activated T-lymphocytes. J. Exp. Med., 1996; 184(3):963-9
201 Sozzani S. Ghezzi S., Iannolo G., Luini W., Borsatti A., Polentarutti N., Sica A., Locati M., Mackay C., Wells T.N.C., Biswas P., Vicenzi E., Poli G., Mantovani A.: Interleukin 10 Increases CCR5 Expression and HIV Infection in Human Monocytes. J. Exp. Med., 1998; 187(3):439-44
202 Murdoch C. Finn A.: Chemokine receptors and their role in inflammation and infectious diseases. Blood, 2000; 95(10):3032-43
203 Volchkov V.E. Blinov V.M., Netesov S.V.: The envelope glycoprotein of Ebola virus contains an immunosuppressive-like domain similar to oncogenic retroviruses. FEBS, 1992; 305(3):181-4
204 Yaddanapudi K. Palacios G., Towner J.S., Chen I., Sariol C.A., Nichol S.T., Lipkin W.I.: Implication of a retrovirus-like glycoprotein peptide in the immunopathogenesis of Ebola and Marburg viruses. FASEB J., 2006; 20(14):2519-30
205 Gupta M. Mahanty S., Ahmed R., Rollin P.E.: Monocyte-derived human macrophages and peripheral blood mononuclear cells infected with Ebola virus secrete MIP-1alpha and TNF-alpha and inhibit poly-IC-induced IFN-alpha in vitro. Virology, 2001; 284(20-5
206 Basler C.F. Wang X., Mühlberger E., Volchkov V.E., Paragas J., Klenk H-D., Garcia-Sastre A., Palese P.: The Ebola virus VP35 protein functions as a type I IFN antagonist. PNAS, 2000; 97(22):12289-94
207 Kash J.C. Mühlberger E., Carter V., Grosch M., Perwitasari O., Proll S.C., Thomas M.J., Weber F., Klenk H-D., Katze M.G.: Global suppression of hte host antiviral response by Ebola- and Marburgviruses: Increased
Bibliographie
256
antagonism of the Type I interferon response is associated with enhanced virulence. Journal of Virology, 2006; 80(6):3009-20
208 Gunn M.D. Nelken N.A., Liao X., Williams L.T.: Monocyte cheoattractant protein-1 is sufficient for the chemotaxis of monocytes and lymphocytes in transgenic mice but requires an additional stimulus for inflammatory activation. J. Immunol. , 1997; 158(1):376-83
209 Taub D.D. Conlon K., Lloyd A.R., Oppenheim J.J., Kelvin D.J.: Preferential migration of activated CD4+ and CD8+ T cells in response to MIP-1 alpha and MIP-1 beta. Science, 1993; 260(5106):355-8
210 Hutchinson K.L. villinger F., Miranda M.E., Ksiazek T.G., Peters C.J., Rollin P.E.: Multiplex analysis of cytokines in the blood of cynomolgus macaques naturally infected with Ebola virus (Reston subtype). Journal of Medical Virology, 2001; 65(561-6
211 Leroy E.M. Baize S., Volchkov V.E., Fischer-Hoch S.P., Georges-Courbot M.C., Lansoud-Soukate J., Capron M., Debre P., McCormick J.B., Georges A.: Human asymptomatic Ebola infection and strong inflammatory response. Lancet, 2000; 355(9222):2178-9
212 Villinger F. Rollin P.E., Brar S.S., Chikkala N.F., Winter J., Sundstrom J.B., Zaki S.R., Swanepoel R., Ansari A.A., Peters C.J.: Markedly elevated levels of interferon (IFN)-gamma, IFN-alpha, Interleukin (IL)-2, IL-10, and Tumor Necrosis Factor-alpha associated with fatal Ebola virus infection. Journal of Infectious Diseases, 1999; 179(suppl 1):188-91
213 Kägi D. Vignaux F., Ledermann B., Bürki K., Depraetere V., Nagata S., Hengartner H., Golstein P.: Fas and perforin pathways as major mechanisms of T cell-mediated cytotoxicity. Science, 1994; 265(5171):528-30
214 Lowin B. Hahne M., Mattmann C., Tschopp J.: Cytolytic T-cell cytotoxicity is mediated through perforin and Fas lytic pathways. Nature, 1994; 370(6491):650-2
215 Berke G.: The binding and lysis of target cells by cytotoxic lymphocytes: molecular and cellular aspects. Annu. Rev. Immunol., 1994; 12(735-73
216 Nagata S. Golstein P.: The Fas death factor. Science, 1995; 267(5203):1449-56
217 Hensley L.E. Young H.A., Jahrling P.B., Geisbert T.W.: Proinflammatory response during Ebola virus infection of primate mogels: possible involvment of the tumor necrosis factor receptor superfamily. Immunology Letters, 2002; 80(169-79
218 Maruyama T. Parren P.W.H.I., Sanchez A., Rensink I., Rodriguez L.L., Khan A.S., Peters C.J., Burton D.R.: Recombinant Human Monoclonal Antibodies to Ebola Virus. J. Infect. Dis., 1999; 179(suppl1):S235-S9
Bibliographie
257
219 Geisbert T.W. Hensley L.E., Geisbert J.B., Jahrling P.B.: Evidence against an important role for infectivity-enhancing antibodies in Ebola virus infections. Virology, 2002; 293(15-9
220 Takada A. Watanabe S., Okazaki K., Kida H., Kawaoka Y.: Infectivity-enhancing antibodies to Ebola virus glycoprotein. Journal of Virology, 2001; 75(5):2324-30
221 Leroy E.M. Baize S., Debre P., Lansoud-Soukate J., Mavoungou E.: Early immune responses accompanying human asymptomatic Ebola infections. Clin. Exp. Immunol., 2001; 124(453-60
222 Peters C.J. Liu C-T., Anderson Jr G.W.,Morril J.C., Jahrling P.B.: Pathogenesis of viral hemorrhagic fevers: Rift Valley Fever and Lassa Fever contrasted. Reviews of Infectious Diseases, 1989; 11(suppl 4):743-9
223 LeDuc: Epidemiology of hemorrhagic fever viruses. Reviews of infectious diseases, 1989; 11(suppl 4):730-5
224 Bowen M.D. Peters C.J., Nichol S.T.: Phylogenetic analysis of the Arenaviridae: patterns of virus evolution and evidence for cospeciation between arenaviruses and their rodent hosts. Mol. Phylogenet. Evol., 1997; 8(3):301-16
225 Bishop: Infection and coding strategies of Arenaviruses, Phleboviruses, and Nairoviruses. Reviews of Infectious Diseases, 1989; 11(suppl 4):722-9
226 McCormick J.B. King I.J., Webb P.A., Johnson K.M., O'Sullivan R., Smith E.S., Trippel S., Tong T.C.: A case-control study of the clinical diagnosis and course of Lassa fever. J. Infect. Dis., 1987; 155(3):445-55
227 Monath T.P.: Lassa fever: review of epidemiology and epizootiology. Bull. World Health Organ., 1975; 52(577-92
228 Richmond J.K. Baglole D.J.: Lassa fever: epidemiology, clinical feartures, and social consequences. BMJ, 2003; 327(1271-5
229 Maiztegui J.I.: Clinical and epidemiological patterns of Argentine haemorrhagic fever. Bull. World Health Organ., 1975; 52(567-75
230 Mills J.N. Ellis B.A., McKee K.T., Calderon G.E., Maiztegui J.I., Nelson G.O., Ksiazek T.G., Peters C.J., Childs J.E.: A longitudinal study of Junin virus activity in the rodent reservoir of Argentine hemorrhagic fever. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1992; 47(6):749-63
231 Charel R.N. de Lamballerie: Arenaviruses other than Lassa virus. Antiviral Res., 2003; 57(1-2):89-100
232 Meegan J.M. Khalil G.M., Hoogstraal H., Adham F.K.: Experimental transmission and field isolation studies implicating Culex pipiens as a vector of Rift Valley fever virus in Egypt. Am. J. Trop. Med. Hyg., 1980; 29(6):1405-10
Bibliographie
258
233 Linthicum K.J. Davies F.G., Kairo A., Bailey C.L.: Rift Valley fever virus (family Bunyaviridae, genus Phlebovirus). Isolations from Diptera collected during an inter-epizootic period in Kenya. J. Hyg (Lond.), 1985; 95(1):197-209
234 Organisation World Health: Rift Valley fever, Egypt. Wkly Epidem Rec, 2003; 78(36):313-20
235 Sall A.A. de A Zanotto P.M., Vialat P., Sene O.K., Bouloy M.: Origin of the 1997-98 Rift Valley fever outbreak in East Africa. Lancet, 1998; 352(1596-7
236 Anonyme: Rift Valley fever outbreak, Kenya, November 2006 - January 2007. Morb. Mortal. Wkly. Rep., 2007; 56(4):73-6
237 Organisation World Health: An outbreak of Rift Valley fever, eastern Africa, 1997-1998. Wkly Epidem Rec, 1998; 73(15):105-12
238 Battles J.K. Dalrymple J.M.: Genetic variation among geographic isolated of Rift Valley Fever virus. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1988; 39(6):617-31
239 Wilson M.L. Chapman L.E., Hall D.B., Dykstra E.A., Ba K., Zeller H.G., Traore-Laminzana M., Hervy J-P., Linthicum K.J., Peters C.J.: Rift Valley Fever in rural northern Senegal: Human risk factors and potential vectors. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1994; 50(6):663-75
240 Digoutte J.P. Jouan A., LeGuenno B., Riou O., Philippe B., Meegan J., Ksiazek T.G., Peters C.J.: Isolation of the Rift Valley fever virus by inoculation into Aedes pseudoscutellaris cells: comparison with other diagnostic methods. Res. Virol., 1989; 140(1):31-41
241 Linthicum K.J. Bailey C.L., Davies F.G., Tucker C.J.: Detection of Rift Valley Fever viral activity in Kenya by satellite remote sensing imagery. Science, 1987; 235(1656-9
242 Linthicum K.J. Anyamba A., Tucker C.J., Kelley P.W., Myers M.F., Peters C.J.: Climate and satellite indicators to forecast Rift Valley Fever epidmics in Kenya. Science, 1999; 285(397-400
243 Swanepoel R. Struthers J.K., Shepherd A.J., McGillivray G.M., Nel M.J., Jupp P.G.: Crimean-Congo hemorrhagic fever in South Africa. American Journal of Tropical Medicine and Hygiene, 1983; 32(6):1407-15
244 Deyde V.M. Khristova M.L., Rollin P.E., Ksiazek T.G., Nichol S.T.: Crimean-Congo hemorrhagic fever virus genomics and global diversity. J. Virol., 2006; 80(17):8834-42
245 Jauréguiberry S. Tattevin P., Tarantola A., Legay F., Tall A., Nabeth P., Zeller H., Michelet C.: Imported Crimean-Congo hemorrhagic fever. J. Clin. Microbiol., 2005; 43(9):4905-7
246 Ahmeti S. Raka L.: Crimean-Congo Haemorrhagic Fever in Kosova : a fatal case report. Virology Journal, 2006; 3(85
Bibliographie
259
247 Midilli K. Gargili A., Ergonul O., Sengöz G., Ozturk R., Bakar M., Jongejan F.: Imported Crimean-Congo hemorrhagic fever cases in Istanbul. BMC Infectious Diseases, 2007; 5(54
248 Fisher-Hoch S.P. Khan J.A., Rehman S., Mirza S., Khurshid M., McCormick J.B.: Crimean-Congo haemorrhagic fever treated with oral ribavirin. Lancet, 1995; 346(8973):472-5
249 Ali J. Besharat S., Abbasi A., Moradi A., Kalavi K.: Crimean-Congo hemorrhagic fever: case series from a medical center in Golestan province, northeast of Iran (2004-2006). Indian J Med Sci, 2006; 60(8):327-9
250 Lee H.W. Lee P.W., Johnson K.M.: Isolation of the etiologic agent of Korean Hemorrhagic fever. J. Infect. Dis., 1978; 137(3):298-308
251 LeDuc J.W. Smith G.A., Childs J.E., Pinheiro F.P., Maiztegui J.I., Niklasson B., Antoniades A., Robinson D.M., Khin M., Shortridge K.F., Wooster M.T., Elwell M.R., Ilbery P.L.T., Koech D., Rosa E.S.T., Rosen L.: Global survey of antibody to Hantaan-related viruses among peridomestic rodents. Bull. World Health Organ., 1986; 64(1):139-44
252 Nichol S.T. Spiropoulou C.F., Morzunov S., Rollin P.E., Ksiazek T.G., Feldmann H., Sanchez A., Childs J., Zaki S., Peters C.J.: Genetic identification of a hantavirus associated with an outbreak of acute respiratory illness. Science, 1993; 262(914-7
253 Engelthaler D.M. Mosley D.G., Cheek J.E., Levy C.E., Komatsu K.K., Ettestad P., Davis T., Tanda D.T., Miller L., Frampton J.W., Porter R., Bryan R.T.: Climatic and environmental patterns associated with Hantvairus pulmonary syndrome, Four Corner region, United States. Emerging Infectious Diseases, 1999; 5(1):87-94
254 Mills J.N. Ksiazek T.G., Peters C.J., Childs J.E.: Long-term studies of Hantavirus reservoir populations in the southwestern United States: A synthesis. Emerging Infectious Diseases, 1999; 5(1):135-42
255 Mills J.N. Yates T.L., Ksiazek T.G., Peters C.J., Childs J.E.: Long-term studies of Hantavirus reservoir populations in the southwestern United States: Rationale, potential, and methods. Emerging Infectious Diseases, 1999; 5(1):95-101
256 Monroe M.C. Morzunov S.P., Johnson A.M., Bowen M.D., Artsob H., Yates T., Peters C.J., Rollin P.E., Ksiazek T.G., Nichol S.T.: Genetic diversity and distribution of Peromyscus-borne Hantaviruses in North America. Emerging Infectious Diseases, 1999; 5(1):75-86
257 Sironen T. Vaheri A., Plyusnin A.: Molecular evolution of Puumala Hantavirus. Journal of Virology, 2001; 75(23):11803-10
258 Vapalahti O. Lundkvist A., Federov V., Conroy C.J., Hirvonen S., Plyusnina A., Nemirov K., Fredga K., Cook J.A., Niemimaa J., Kaikusalo A., Henttonen
Bibliographie
260
H., Vaheri A., Plyusnin A.: Isolation and characterization of a Hantavirus from Lemmus sibiricus: Evidence for host switch during Hantavirus evolution. Journal of Virology, 1999; 73(7):5586-92
259 Hart C.A. Bennett M.: Hantavirus infections: Epidemiology and pathogenesis. Microbes and infection, 1999; 1(1229-37
260 Organisation World Health: The Yellow Fever situation in Africa and South America in 2004. Wkly Epidem Rec, 2005; 80(29):249-56
261 Lhuillier M. Sarthou J.L., Cordellier R., Gershy-Damet G.M., Monteny N., Bouchite B., Calen P.: Epidémie rurale de fièvre jaune avec transmission interhumaine en Côte d'Ivoire en 1982. Bull. World Health Organ. , 1985; 63(3):527-36
262 Organisation World Health: Yellow fever, Senegal - update. Wkly Epidem Rec, 2002; 77(42):349-56
263 Organisation World Health: Yellow fever situation in Africa and South America, 2005. Wkly Epidem Rec, 2006; 81(33):317-24
264 Organisation World Health: Progress in the control of yellow fever in Africa. Wkly Epidem Rec, 2005; 80(6):49-60
265 Carey D.E. Myers R.M., Reuben R., Rodrigues F.M.: Studies on dengue in Vellore, South India. Bull. World Health Organ., 1966; 35(1):61
266 Monath T.P.: Dengue: The risk to developed and developing countries. PNAS, 1994; 91(2395-400
267 Senanayake S.: Dengue fever and dengue haemorrhagic fever: A diagnostic challenge. Australian Family Physician, 2006; 35(8):609-12
268 Organisation World Health: Dengue haemorrhagic fever, Timor-Leste - update. Wkly Epidem Rec, 2005; 80(10):85-92
269 Samuel P.P. Tyagi B.K.: Diagnostic methods for detection & isolation of dengue viruses from vector mosquitoes. Indian J Med Res, 2006; 123(615-28
270 Venugopal K. Gritsun T., Lashkecivh V.A., Gould E.A.: Analysis of the structural protein gene sequence shows Kyasanur Forest disease virus as a distinct member in the tick-borne encephalitis virus serocomplex. J. Gen. Virol., 1994; 75(227-32
271 Charrel R.N. Zaki A.M., Fakeeh M., Yousef A.I., de Chesse R., Attoui H., de Lamballerie X.: Low Diversity of Alkhurma Hemorrhagic Fever Virus, Saudi Arabia, 1994–1999. Em. Inf. Dis., 2005; 11(5):683-8
272 Li L. Rollin P.E., Nichol S.T., Shope R.E., Barrett A.D.T., Holbrook M.R.: Molecular determinants of antigenicity of two subtypes of the tick-borne flavivirus Omsk haemorrhagic fever virus. J. Gen. Virol., 2004; 85(1619-24
273 Martini G.A.: Marburg agent disease in man. Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg. , 1969; 63(295-302.
Bibliographie
261
274 Kiley M.P. Bowen T.W., Eddy G.A., Isaacson M., Johnson K.M., McCormick J.B., Murphy F.A., Pattyn S.R., Peters D., Prozesky O.W., Regnery R.L., Simpson D.I.H., Slenczka W., Sureau P., Van der Groen G., Webb P.A., Wulff H.: Filoviridae: taxonomic home for Marburg and Ebola viruses ? . Intervirology, 1982; 18(24-32.
275 Smith C.E.G. Simpson D.I.H., Bowen E.T.W.: Fatal human disease from vervet monkeys. Lancet, 1967; II(1119-21.
276 Organisation World Health: Viral haemorrhagic fever / Marburg, Democratic Republic of the Congo. Wkly Epidem Rec, 1999; 74(20):157-64
277 Organisation World Health: Marburg fever, Democratic Republic of the Congo. Wkly Epidem Rec, 1999; 74(19):145-56
278 Towner J.S. Khristova M.L., Sealy T.K., Vincent M.J., Erickson B.R., Bawiec D.A., Hartman A.L., Comer J.A., Zaki S.R., Ströher U., Gomes da Silva F., del Castillo F., Rollin P., Ksiazek T.G., Nichol S.T.: Marburgvirus genomics and associaton with a large hemorrhagic fever outbreak in Angola. Journal of Virology, 2006; 80(13):6497-516
279 Bausch D.G. Borchert M., Grein T., Roth C., Swanepoel R., Libande M.L., Talarmin A., Bertherat E., Muyembe-Tamfum J-J., Tugume B., Colebunders R., Kondé K.M., Pirard P., Olinda L.L., Rodier G.R., Campbell P., Tomori O., Ksiazek T.G., Rollin P.E.: Risk factor for Marburg hemorrhagic fever, Democratic Republic of the Congo. Emerging Infectious Diseases, 2003; 9(12):1531-7
280 Cox N.J. McCormick J.B., Johnson K.M., Kiley M.P.: Evidence for two subtypes of Ebola virus based on oligonucleotide mapping of RNA. Journal of Infectious Diseases, 1983; 147(2):272-5
281 Murphy: Marburg and Ebola viruses. Virology ??, 1985; 282 Feldmann H. Klenk H-D.: Marburg and Ebola viruses. Adv. Virus Res., 1996;
47(1-52 283 Becker S. Rinne C., Hofsäss U., Klenk H-D., Mühlberger E.: Interactions of
Marburg virus nucleocapsid proteins. Virology, 1998; 249(406-17 284 Mitchell S.W. McCormick J.B.: Physicochemical inactivation of Lassa,
Ebola, and Marburg viruses and effect on clinical laboratory analyses. Journal of Clinical Microbiology, 1984; 20(3):486-9
285 Elliott L.H. McCormick J.B., Johnson K.M.: Inactivation of Lassa, Marburg, and Ebola viruses by gamma irradiation. Journal of Clinical Microbiology, 1982; 16(704-8
286 Sanchez A. Rollin P.E.: Complete genome sequence of an Ebola virus (Sudan species) responsible for an 2000 outbreak of human disease in Uganda. Virus Res., 2005; 113(16-25
287 Sanchez A. Kiley M.P., Holloway B.P., and Auperin D.D.: Sequence Analysis of the Ebola Virus Genome: Organization, Genetic Elements, and
Bibliographie
262
Comparison with the Genome of Marburgh Virus. Virus Research, 1993; 29(215-40
288 Mühlberger E. Löftering B., Klenk H-D., Becker S.: Three of the four nucleocapsid proteins of Marburg virus, NP, VP35, and L, are sufficient to mediated replication and transcription of Marburg virus-specific monocistronic minigenomes. Journal of Virology, 1998; 72(11):8756-64
289 Wool-Lewis R.J. Bates P.: Characterization of Ebola virus entry by using pseudotyped viruses: identification of receptor-deficient cell lines. Journal of Virology, 1998; 72(4):3155-60
290 Chan S.Y. Speck R.F., Ma M.C., Goldsmith M.A.: Distinct mechanisms of entry by envelope glycoproteins of Marburg and Ebola (Zaire) viruses. Journal of Virology, 2000; 74(10):4933-7
291 Bär S. Takada A., Kawaoka Y., Alizon M.: Detection of cell-cell fusion mediated by Ebola virus glycoproteins. Journal of Virology, 2006; 80(6):2815-22
292 Ruiz-Argüello M.B. Goñi F.M., Pereira F.B., Nieva J.L.: Phosphatidylinositol-dependent membrane fusion induced by a putative fusogenic sequence of Ebola virus. Journal of Virology, 1998; 72(3):1775-81
293 Chan S.Y. Empig C.J., Welte F.J., Speck R.F., Schmaljohn A., Kreisberg J.F., Goldsmith M.A.: Folate receptor-alpha is a cofactor for cellular entry by Marburg and Ebola viruses. Cell., 2001; 106(1):117-26
294 Empig C.J. Goldsmith M.A.: Association of the caveola vesicular system with cellular entry by filoviruses. Journal of Virology, 2002; 76(10):5266-70
295 Simmons G. Rennekamp A.J., Chai N., Vandenberghe L.H., Riley J.L., Bates P.: Folate receptor alpha and caveolae are not required for Ebola virus glycoprotein-mediated viral infection. Journal of Virology, 2003; 77(24):13433-8
296 Gallaher W.R.: Similar structural models of the transmembrane proteins of Ebola and avian sarcoma viruses. Cell, 1996; 85(477-8
297 Takada A. Fujioka K., Tsuiji M., Morikawa A., Higashi N., Ebihara H., Kobasa D., Feldmann H., Irimura T., Kawaoka Y.: Human macrophage C-type lectin specific for galactose and N-acetylgalactosamine promotes filovirus entry. Journal of Virology, 2004; 78(6):2943-7
298 Chandran K. Sullivan N.J., Feldor U., Whelan S.P., Cunningham J.M.: Endosomal proteolysis of the Ebola virus glycoprotein is necessary for infection. Science, 2005; 308(5728):1643-5
299 Schornberg K. Matsuyama S., Kabsch K., Delos S., Bouton A., White J.: Role of endosomal cathepsins in entry mediated by the Ebola Virus Glycoprotein. Journal of Virology, 2006; 80(8):4174-8
Bibliographie
263
300 Shimojima M. Takada A., Ebihara H., Neumann G., Fujioka K., Irimura T., Jones S., Feldmann H., Kawaoka Y.: Tyro3 family-mediated cell entry of Ebola and Marburg viruses. J. Virol., 2006; 80(20):10109-16
301 Yonezawa A. Cavrois M., Greene W.C.: Studies of Ebola virus glycoprotein-mediated entry and fusion by using pseudotyped human immunodeficiency virus type 1 virions: Involvment of cytoskeletal proteins and enhancement by Tumor Necrosis Factor Alpha. Journal of Virology, 2005; 79(2):918-26
302 Han Z. Licata J.M., Paragas J., Harty R.N.: Permeabilization of the plasma membrane by Ebola virus GP2. Virus Genes., 2006; 34(3):273-81
303 Mpanju O.M. Towner J.S., Dover J.E., Nichol S.T., Wilson C.A.: Identification of two amino acid residues on Ebola virus glycoprotein 1 critical for cell entry. Virus Res., 2006; 121(2):205-14
304 Sanchez A. Kiley M.P.: Identification and analysis of Ebola virus messenger RNA. Virology, 1987; 157(2):414-20
305 Weik M. Enterlein S., Schlenz K., Mülhberger E.: The Ebola virus genomic replication promoter is bipartite and follows the rule of six. Journal of Virology, 2005; 79(16):10660-71
306 Muller S. Moller P., Bick M.J., Wurr S., Becker S., Gunther S., Kummerer B.M.: Inhibition of filovirus replication by the zinc finger antiviral protein. J Virol., 2007; 81(5):2391-400
307 Noda T. Aoyama K., Sagara H., Kida H., Kawaoka Y.: Nucleocapsid-like structures of Ebola virus reconstructed using electron tomography. J. Vet. Med. Sci., 2005; 67(3):325-8
308 Huang Y. Xu L., Sun Y., Nabel G.J.: The assembly of Ebola virus nucleocapsid requires virion-associated proteins 35 and 24 and posttranslational modification of nucleoprotein. Mol. Cell, 2002; 10(2):307-16
309 Johnson R.F. McCarthy S.E., Godlewski P.J., Harty R.N.: Ebola virus VP35-VP40 interaction is sufficient for packaging 3E-5E minigenome RNA virus-like particles. Journal of Virology, 2006; 80(11):5135-44
310 McCarthy S.E. Licata J.M., Harty R.N.: A luciferase-based budding assay for Ebola virus. J Virol Methods, 2006; 137(1):115-9
311 Licata J.M. Johnson R.F., Han Z., Harty R.N.: Contribution of Ebola virus glycoprotein, nucleoprotein, and VP24 to budding of VP40 virus-like particles. Journal of Virology, 2004; 78(14):7344-51
312 Sänger C. Mühlberger E., Ryabchikova E., Kolesnikova L., Klenk H-D., Becker S.: Sorting of Marburg virus surface protein and virus release take place at opposite surfaces of infected polarized epithelial cells. Journal of Virology, 2001; 75(3):1274-83
Bibliographie
264
313 Malashkevich V.N. Schneider B.J., McNally M.L., Milhollen M.A., Pang J.X., Kim P.S.: Core structure of the envelope glycoprotein GP2 from Ebola virus at 1.9 A resolution. PNAS, 1999; 96(2662-7
314 Strack B. Calistri A., Accola M.A., Palù G., Göttlinger H.G.: A role for ubiquitin ligase recruitment in retrovirus release. PNAS, 2000; 97(24):13063-8
315 Terrell J. Shih S., Dunn R., Hicke L.: A function for monoubiquitination in the internalization of a G protein-coupled receptor. Mol. Cell, 1998; 1(2):193-202
316 Shih S.C. Sloper-Mould K.E., Hicke L.: Monoubiquitin carries a novel internalization signal that is appended to activated receptors. EMBO J., 2000; 19(2):187-98
317 Hicke L.: Ubiquitin-dependent internalization and downregulation of plasma membrane proteins. FASEB J., 1997; 11(14):1215-26
318 Patnaik A. Chau V., Wills J.W.: Ubiquitin is part of the retrovirus budding machinery. PNAS, 2000; 97(24):13069-74
319 Freed E.O.: Viral late domains. Journal of Virology, 2002; 76(10):4679-87 320 Martin-Serrano J. Perez-Cabalerro D., Bieniasz P.D.: Context-dependent
effects of L-domains and ubiquitination on viral budding. Journal of Virology, 2004; 78(11):5554-63
321 Harty R.N. Brown M.E., Wang G., Huibregtse J., Hayes F.P.: A PPxY motif within the VP40 protein of Ebola virus interacts physically and functionally with a ubiquitin ligase: Implications for filovirus budding. PNAS, 2000; 97(25):13871-6
322 Bryant N.J. Stevens T.H.: Vacuole biogenesis in Saccharomyces cerevisiae: Protein transport pathways to the yeast vacuole. . Microbiol. Mol. Biol. Rev., 1998; 62(1):230-47
323 Harty R.N. Brown M.E., McGettigan J.P., Wang G., Jayakar H.R., Huibregtse J.M., Whitt M.A., Schnell M.J.: Rhabdoviruses and the Cellular Ubiquitin-Proteasome System: a Budding Interaction. J. Virol., 2001; 75(22):10623-9
324 Timmins J. Schoehn G., Ricard-Blum S., Scianimanico S., Vernet T., Ruigrok R.W.H., Weissenhorn W.: Ebola virus matrix protein VP40 interaction with human cellular factors Tsg101 and Nedd4. Journal of Molecular Biology, 2003; 326(493-502
325 Yasuda J. Nakao M., Kawaoka Y., Shida H.: Nedd4 regulates egress of Ebola virus-like particles from host cells. Journal of Virology, 2003; 77(18):9987-92
326 Garrus J.E. von Schwedler U.K., Pornillos O.W., Morham S.G., Zavitz K.H., Wang H.E., Wettstein D.A., Stray K.M., Côté M., Rich R.L., Myszka D.G.,
Bibliographie
265
Sundquist W.I.: Tsg101 and the Vacuolar Protein Sorting Pathway Are Essential for HIV-1 Budding. Cell., 2001; 107(55-65
327 Martin-Serrano J. Zang T., Bieniasz P.D.: HIV-1 and Ebola virus encode small peptide motifs that recruit Tsg101 to sites of particle assembly to facilitate egress. Nat. Med., 2001; 7(12):1313-9
328 Bavari S. Bosio C.M., Wiegand E., Ruthel G., Will A.B., Geisbert T.W., Hevey M., Schmaljohn C., Schmaljohn A., Aman M.J.: Lipid raft microdomains: A gateway for compartmentalized trafficking of Ebola and Marburg viruses. Journal of Experimental Medicine, 2002; 195(5):593-602
329 Kolesnikova L. Berghöfer B., Bamberg S., Becker S.: Multivesicular bodies as a platform for formation of the Marburg virus envelope. Journal of Virology, 2004; 78(22):12277-87
330 Kolesnikova L. Bamberg S., Berghöfer B., Becker S.: The matrix protein of Marburg virus is transported to the plamsa membrane along cellular membranes: Exploiting the retrograde late endosomal pathway. Journal of Virology, 2004; 78(5):2382-93
331 Sanchez A. Kiley M.P., Holloway B.P., McCormick J.B., Auperin D.D.: The nucleoprotein gene of Ebola virus: cloning, sequencing, and in vitro expression. Virology, 1989; 170(81-91
332 Elliott L.H. Kiley M.P., McCormick J.B.: Descriptive analysis of Ebola virus proteins. Virology, 1985; 147(1):169-76
333 Elliott L.H. Sanchez A., Holloway B.P., Kiley M.P., McCormick J.B.: Ebola protein analyses for the determination of genetic organization. Arch Virol., 1993; 133(3-4):423-36
334 Becker S. Huppertz S., Klenk H-D., Feldmann H.: The nucleoprotein of Marburg virus is phosphorylated. J. Gen. Virol., 1994; 75(809-18
335 Sanchez A. Kiley M.P., Klenk H-D., Feldmann H.: Sequence analysis of the Marburg virus nucleoprotein gene: comparison to Ebola virus and other non-segmented negatice-strand RNA viruses. Journal of General Virology, 1992; 73(347-57
336 Mühlberger E. Weik M., Volchkov V.E., Klenk H-D., Becker S.: Comparison of the transcription and replication strategies of Marburg virus and Ebola virus by using artificial replication systems. Journal of Virology, 1999; 73(3):
337 Ebihara H. Takada A., Kobasa D., Jones S., Neumann G., Theriault S., Bray M., Feldmann H., Kawaoka Y.: Molecular determinants of Ebola virus virulence in mice. PLoS Pathog, 2006; 2(7):e73
338 Watanabe S. Noda T., Kawaoka Y.: Functional mapping of the Nucleoprotein of Ebola virus. Journal of Virology, 2006; 80(8):3743-51
Bibliographie
266
339 Noda T. Watanabe S., Sagara H., Kawaoka Y.: Mapping of the VP40-binding regions of the Nucleoprotein of Ebola virus. J Virol., 2007;
340 Bukreyev A.A. Volchkov V.E., Blinov V.M., Netesov S.V.: The VP35 and VP40 proteins of filoviruses. FEBS Lett., 1993; 322(1):41-6
341 Basler C.F. Mikulasova A., Martinez-Sobrido L., Paragas J., Mühlberger E., Bray M., Klenk H-D., Palese P., Garcia-Sastre A.: The Ebola virus VP35 protein inhibits activation of Interferon Regulatory Factor 3. Journal of Virology, 2003; 77(14):7945-56
342 Cardenas W.B. Loo Y-M., Gale Jr M., Hartman A.L., Kimberlin C.R., Martinez-Sobrido L., Ollmann Saphire E., Basler C.F.: Ebola virus VP35 protein binds double-stranded RNA and inhibits alpha/beta interferon production induced by RIG-I signaling. Journal of Virology, 2006; 80(11):5168-78
343 Feng Z. Cerveny M., Yan Z., He B.: The VP35 protein of Ebola virus inhibits the antiviral effect mediated by double-stranded RNA-dependent protein kinase PKR. J Virol., 2007; 81(1):182-92
344 Hartman A.L. Dover J.E., Towner J.S., Nichol S.T.: Reverse genetic generation of recombinant Zaire Ebola viruses containing disrupted IRF-3 inhibitory domains results in attenuated virus growth in vitro and higher levels of IRF-3 activation without inhibiting viral transcription or replication. Journal of Virology, 2006; 80(13):6430-40
345 Kiley M.P. Cox N.J., Elliott L.H., Sanchez A., DeFries R., Buchmeier M.J., Richmann D.D., McCormick J.B.: Physicochemical properties of Marburg virus: Evidence for three distinct virus strains and their relationship to Ebola virus. Journal of General Virology, 1988; 69(1957-67
346 Noda T. Sagara H., Suzuki E., Takada A., Kida H., Kawaoka Y.: Ebola virus VP40 drives the formation of virus-like filamentous particles along with GP. Journal of Virology, 2002; 76(10):4855-65
347 Hoenen T. Volchkov V., Kolesnikova L., Mittler E., Timmins J., Ottmann M., Reynard O., Becker S., Weissenhorn W.: VP40 octamers are essential for Ebola virus replication. Journal of Virology, 2005; 79(3):1898-905
348 Neumann G. Ebihara H., Takada A., Noda T., Kobasa D., Jasenosky L.D., Watanabe S., Kim J.H., Feldmann H., Kawaoka Y.: Ebola virus VP40 late domains are not essential for viral replication in cell culture. Journal of Virology, 2005; 79(16):10300-7
349 Urata S. Noda T., Kawaoka Y., Morikaa S., Yokosawa H., Yasuda J.: Interaction of Tsg101 with Marburg virus VP40 depends on the PPPY motif, but not the PT/SAP motif as in the case of Ebola virus, and Tsg101 plays a critical role in the budding of Marburg virus-like particles induced by VP40, NP, and GP. J. Virol., 2007; 81(9):4895-9
Bibliographie
267
350 Hartlieb B. Muziol T., Weissenhorn W., Becker S.: Crystal structure of the C-terminal domain of Ebola virus VP30 reveals a role in transcription and nucleocapsid association. Proc Natl Acad Sci USA, 2007; 104(2):624-9
351 Han Z. Boshra H., Sunyer J.O., Zwiers S.H., Paragas J., Harty R.N.: Biochemical and functional characterization of the Ebola virus VP24 protein: implications for a role in virus assembly and budding. Journal of Virology, 2003; 77(3):1793-800
352 Watanabe S. Watanabe T., Noda T., Takada A., Feldmann H., Jasenosky L.D., Kawaoka Y.: Production of novel Ebola virus-like particles from cDNAs: An alternative to Ebola virus generation by reverse genetics. Journal of Virology, 2004; 78(2):999-1005
353 Hoenen T. Groseth A., Kolesnikova L., Theriault S., Ebihara H., Hartlieb B., Bamberg S., Feldmann H., Ströher U., Becker S.: Infection of naïve target cells with virus-like particles: Implications for the function of Ebola virus VP24. Journal of Virology, 2006; 80(14):7260-4
354 Reid S.P. Leung L.W., Hartman A.L., Martinez O., Shaw M.L., Carbonnelle C., Volchkov V.E., Nichol S.T., Basler C.F.: Ebola virus VP24 binds karyopherin alpha-1 and blocks STAT1 nuclear accumulation. Journal of Virology, 2006; 80(11):5156-67
355 Volchkov V.E. Volchkova V.A., Chepurnov A.A., Blinov V.M., Dolnik O., Netesov S.V., Feldmann H.: Characterization of the L gene and 5' trailer region of Ebola virus. Journal of General Virology, 1999; 80(355-62
356 Mühlberger E. Sanchez A., Randolf A., Will C., Kiley M.P., Klenk H-D., Feldmann H.: The nucleotide sequence of the L gene of Marburg virus, a filovirus: Homologies with Paramyxoviruses and Rhabdoviruses. Virology, 1992; 187(534-47
357 Volchkov V.E. Becker S., Volchkova V.A., Ternovoj V.A., Kotov A.N., Netesov S.V., Klenk H-D.: GP mRNA of Ebola virus is edited by the Ebola virus polymerase and by T7 and Vaccinia Virus polymerases. Virology, 1995; 214(421-30
358 Volchkov V.E.: Processing of the Ebola virus glycoprotein. Current Topics in Microbiology and Immunology, 1999; 235(35-47
359 Volchkov V.E. Volchkova V.A., Mühlnerger E., Kolesnikova L.V., Weik M., Dolnik O., Klenk H-D.: Recovery of infectious Ebola virus from complementary DNA: RNA editing of the GP gene and viral cytotoxicity. Science, 2001; 291(1965-9
360 Feldmann H. Will C., Schikore M., Slenczka W., Klenk HD.: Glycosylation and oligomerization of the spike protein of Marburg virus. Virology, 1991; 182(1):353-6
Bibliographie
268
361 Becker S. Klenk H-D., Mühlberger E.: Intracellular transport and processing of the Marburg virus surface protein in Vertebrate and Insect cells. Virology, 1996; 225(145-55
362 Feldmann H. Volchkov V.E., Volchkova V.A., Ströher U., Klenk H-D.: Biosynthesis and role of filoviral glycoproteins. Journal of General Virology, 2001; 82(2839-48
363 Jeffers S.A. Sanders D.A., Sanchez A.: Covalent modifications of the Ebola virus glycoprotein. Journal of Virology, 2002; 76(24):12463-72
364 Volchkov V.E. Feldmann H., Volchkova V.A., Klenk H-D.: Processing of the Ebola virus glycoprotein by the proprotein convertase furin. PNAS, 1998; 95(5762-7
365 Wool-Lewis R.J. Bates P.: Endoproteolytic processing of the Ebola virus envelope glycoprotein: cleavage is not required for function. Journal of Virology, 1999; 73(2):1419-26
366 Neumann G. Feldmann H., Watanabe S., Lukashevich I., Kawaoka Y.: Reverse genetics demonstrates that proteolytic processing of the Ebola virus glycoprotein is not essential for replication in cell culture. Journal of Virology, 2002; 76(1):406-10
367 Neumann G. Geisbert T.W., Ebihara H., Geisbert J.B., Daddario-Dicaprio K.M., Feldmann H., Kawaoka Y.: Proteolytic processing of the Ebola virus glycoprotein is not critical for Ebola virus replication in nonhuman primates. J Virol., 2007; 81(6):2995-8
368 Weissenhorn W. Carfi A., Lee K-H., Skehel J.J., Wiley D.C.: Crystal structure of the Ebola virus membrane fusion subunit, GP2, from the envelope glycoprotein ectodomain. Molecular Cell, 1998; 2(605-16
369 Malashkevich V.N. Chan D.C., Chutkowski C.T., Kim P.S.: Crystal structure of the simian immunodeficiency virus (SIV) gp41 core: Conserved helical interactions underlie the broad inhibitory activity of gp41 peptides. PNAS, 1998; 95(9134-9
370 Weissenhorn W. Calder L.J., Wharton S.A., Skehel J.J., Wiley D.C.: The central structural feature of the membrane fusion protein subunit from the Ebola virus glycoprotein is a long triple-stranded coiled coil. PNAS, 1998; 95(6032-6
371 Watanabe S. Takada A., Watanabe T., Ito H., Kida H., Kawaoka Y.: Functional importance of the coiled-coil of the Ebola virus glycoprotein. Journal of Virology, 2000; 74(21):10194-201
372 Adam B. Lins L., Stroobant V., Thomas A., Brasseur R.: Distribution of hydrophobic residues is crucial for the fusogenic properties of the Ebola virus GP2 fusion peptide. Journal of Virology, 2004; 78(4):2131-6
373 Freitas M.S. Gaspar L.P., Lorenzoni M., Almeida F.C., Tinoco L.W., Almeida M.S., Maia L.F., Degrève L., Valente A.P., Silva J.L.: Structure of the Ebola
Bibliographie
269
fusion peptide in a membrane-mimetic environment and the interaction with lipid rafts. J. Biol. Chem., 2007; xxxx(xxxx):xxxx
374 Ito H. Watanabe S., Sanchez A., Whitt M.A., Kawaoka Y.: Mutational analysis of the putative fusion domain of Ebola virus glycoprotein. Journal of Virology, 1999; 73(10):8907-12
375 Brindley M.A. Hughes L., Ruiz A., McCray P.B., Sanchez A., Sanders D.A., Maury W.: Ebola virus glycoprotein 1: identification of residues important for binding and post binding events. J. Virol., 2007; 81(14):7702-9
376 Wahl-Jensen V.M. Afanasieva T.A., Seebach J., Ströher U., Feldmann H., Schnittler H-J.: Effects of Ebola virus glycoproteins on endothelial cell activation and barrier function. Journal of Virology, 2005; 79(16):10442-50
377 Yang Z-Y. Delgado R., Xu L., Todd R.F., Nabel E.G., Sanchez A., Nabel G.J.: Distinct cellular interactions of secreted and transmembrane Ebola virus glycoproteins. Science, 1998; 279(1034-7
378 Ito H. Watanabe S., Takada A., Kawaoka Y.: Ebola virus glycoprotein: Proteolytic processing, acylation, cell tropism, and detection of neutralizing antibodies. Journal of Virology, 2001; 75(3):1576-80
379 Chan S.Y. Ma M.C., Goldsmith M.A.: Differential induction of cellular detachment by envelope glycoproteins of Marburg and Ebola (Zaire) viruses. Journal of General Virology, 2000; 81(2155-9
380 Simmons G. Wool-Lewis R.J., Baribaud F., Netter R.C., Bates P.: Ebola virus glycoproteins induce global surfce protein down-modulation and loss of cell adherence. Journal of Virology, 2002; 76(5):2518-28
381 Sullivan N.J. Peterson M., Yang Z-Y., Kong W-P., Duckers H., Nabel E., Nabel G.J.: Ebola virus glycoprotein toxicity is mediated by a dynamin-dependant protein-trafficking pathway. Journal of Virology, 2005; 79(1):547-53
382 Kindzelskii A.L. Yang Z-Y., Nabel G.J., Todd III R.F., Petty H.R.: Ebola virus secretory glycoprotein (sGP) diminishes FcgammaRIIIB-to-CR3 proximity on neutrophils. Journal of Immunology, 2000; 164(2):953-8
383 Volchkov V.E. Volchkova V.A., Slenczka W., Klenk H-D, Feldmann H.: Release of viral glycoproteins during Ebola virus infection. Virology, 1998; 245(110-9
384 Sanchez A. Yang Z-Y., Xu L., Nabel G.J., Crews T., Peters C.J.: Biochemical analysis of the secreted and virion glycoproteins of Ebola virus. Journal of Virology, 1998; 72(8):6442-7
385 Volchkova V.A. Feldmann H., Klenk H-D., Volchkov V.E.: The nonstructural small glycoprotein sGP of Ebola virus is secreted as an antiparallel-orientated homodimer. Virology, 1998; 250(408-14
Bibliographie
270
386 Falzarano D. Krokhin O., Wahl-Jensen V., Seebach J., Wolf K., Schnittler H.J., Feldmann H.: Structure-function analysis of the soluble glycoprotein, sGP, of Ebola virus. Chembiochem., 2006; 7(10):1605-11
387 Dolnik O. Volchkova V., Garten W., Carbonnelle C., Becker S., Kahnt J., Ströher H-D., Volchkov V.: Ectodomain shedding of the glycoprotein GP of Ebola virus. EMBO Journal, 2004; 23(2175-84
388 Volchkova V.A. Klenk H-D., Volchkov V.E.: Delta-peptide is the carboxy-terminal cleavage fragment of the nonstructural small glycoprotein sGP of Ebola virus. Virology, 1999; 265(1):164-71
389 Wahl-Jensen V. Kurz S.K., Hazelton P.R., Schnittler H.J., Stroher U., Burton D.R., Feldmann H.: Role of Ebola virus secreted glycoproteins and virus-like particles in activation of human macrophages. Journal of Virology, 2005; 79(4):2413-9
390 Georges-Courbot M.C. Sanchez A., Lu C.Y., Baize S., Leroy E., Lansout-Soukate J., Tevi-Benissan C., Georges A.J., Trappier S.G., Zaki S.R., Swanepoel R., Leman P.A., Rollin P.E., Peters C.J., Nichol S.T., Ksiazek T.G.: Isolation and phylogenetic characterization of Ebola viruses causing different outbreaks in Gabon. Emerging Infectious Diseases, 1997; 3(1):59-62
391 Suzuki Y. and Gojobori T.: The origin and evolution of Ebola and marburg viruses. Mol. Biol. Evol., 1997; 14(8):800-6
392 Walsh P.D. Biek R., Real L.A.: Wave-like spread of Ebola Zaire. PLoS Biology, 2005; 3(11):e371
393 Kumar S. Tamura K., Nei M.: MEGA3: Integrated software for Molecular Evolutionary Genetics Analysis and sequence alignment. Briefings in Bioinformatics, 2004; 5(150-63
394 Ronquist F. Huelsenbeck J.P.: MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models. Bioinformatics, 2003; 19(12):1572-4
395 Schell D.: Fast quantification of mouse IgG from cell culture supernatants. Animal Cell Technology 1994; 94(366-8
396 Hartmann H. Lübbers B., Cararetto M., Bautsch W., Klos A., Köhl J. : Rapid quantification of C3a and C5a using a combination of chromatographic and immunoassay procedures. J. Immunol. Meth., 1993; 166(35-44
397 Peters C.J. LeDuc J.W.: An introduction to Ebola: The virus and the disease. J Infect Dis, 1999; 178(ix-xvi
398 Formenty P. Leroy E.M., Epelboin A., Libama F., Lenzi M., Sudeck H., Yaba P., Allarangar Y., Boumandouki P., Nkounkou V.B., Drosten C., Grolla A., Feldmann H., Roth C.: Detection of Ebola virus in oral fluid specimens during outbreaks of Ebola virus Hemorrhagic Fever in the Republic of Congo. Clin Infect Dis, 2006; 42(1521-26
Bibliographie
271
399 Stroher U. Feldmann H.: Progress towards the treatment of Ebola haemorrhagic fever. Expert Opin Investig Drugs., 2006; 15(12):1523-35
400 Feldmann H. Jones S.M., Schnittler H.J., Geisbert T.: Therapy and prophylaxis of Ebola virus infections. Curr Opin Investig Drugs 2005; 6(8):823-30
401 Jenkins G.M. Rambaut A., Pybus O.G., Holmes E.C.: Rates of molecular evolution in RNA viruses: a quantitative phylogenetic analysis. J. Mol. Evol., 2002; 54(2):156-65
402 Charrel R.N. Feldmann H., Fulhorst C.F., Khelifa R., de Chesse R., de Lamballerie X.: Phylogeny of New World arenaviruses based on the complete coding sequences of the small genomic segment identified an evolutionary lineage produced by intrasegmental recombination. BBRC, 2002; 296(1118-24
403 Weaver S.C. Salas R.A., de Manzione N., Fulhorst C.F., Travasos da Rosa A.P.A., Duno G., Utrera A., Mills J.N., Ksiazek T.G., Tovar D., Guzman H., Kang W., Tesh R.B.: Extreme genetic diversity among Pirital virus (Arenaviridae) isolates from western Venezuela. Virology, 2001; 285(110-8
404 Archer A.M. Rico-Hesse R.: High genetic divergence and recombination in Arenaviruses from the Americas. Virology, 2002; 304(274-81
405 Sibold C. Meisel H., Krüger D.H., Labuda M., Lysy J., Kozuch O., Pejcoch M., Vaheri A., Plyusnin A.: Recombination in Tula Hantavirus evolution: Analysis of genetic lineages from Slovakia. Journal of Virology, 1999; 73(1):667-75
406 Bourhy H. Kissi B., Audry L., Smreczak M., Sadkowska-Todys M., Kulonen K., Tordo N., Zmudzinski J.F., Holmes E.C.: Ecology and evolution of rabies virus in Europe. Journal of General Virology, 1999; 80(2545-57
407 Bausch D.G. Nichol S.T., Muyembe-Tamfum J.J., Borchert M., Rollin P.E., Sleurs H., Campbell P., Tshioko F.K., Roth C., Colebunders R., Pirard P., Mardel S., Olinda L.A., Zeller H., Tshomba A., Kulidri A., Libande M.L., et al.: Marburg Hemorrhagic Fever associated with multiple genetic lineages of virus. N Engl J Med, 2006; 355(909-19
408 Becker S. Feldmann H., Will C., Slenczka W.: Evidence for occurrence of filovirus antibodies in human and imported monkeys: do subclinical filovirus infections occur worldwide ? Med Microbiol Immunol, 1992; 181(43-55
409 Leroy E.M. Telfer P., Kumulungui B., Yaba P., Rouquet P., Roques P., Gonzalez J-P., Ksiazek T.G., Rollin P.E., Nerrienet E.: A serological survey of Ebola virus infection in central african nonhuman primates. Journal of Infectious Diseases, 2004; 190(1895-9
410 Jarvis T.C. Kirkegaard K.: Poliovirus RNA recombination: mechanistic studies in the absence of selection. EMBO J., 1992; 11(8):3135-45
Bibliographie
272
411 Lai M.M.C.: RNA recombination in animal and plant viruses. Microbiol. Rev., 1992; 56(1):61-79
412 Brunier D. Michel B., Ehrlich S.D.: Copy choice illegitimate DNA recombination. Cell., 1988; 52(6):883-92
413 Meselson M. Weigle J.J.: Chromosome breakage accompanying genetic recombination in bacteriophage. PNAS, 1961; 47(857-68
414 Chare E.R. Gould E.A., Holmes E.C.: Phylogenetic analysis reveals a low rate of homologous recombination in negative-sense RNA viruses. Journal of General Virology, 2003; 84(2691-703
415 Worobey M. Holmes E.C.: Evolutionary aspects of recombination in RNA viruses. Journal of General Virology, 1999; 80(2535-43
416 Gmyl A.P. Korshenko S.A., Belousov E.V., Khitrina A.V., Agol V.I.: Nonreplicative homologous RNA recombinaison: Promiscuous joining of RNA pieces ? RNA, 2003; 9(1221-31
417 Gallei A. Pankraz A., Thiel H-J., Becher P.: RNA recombination in vivo in the absence of viral replication. Journal of Virology, 2004; 78(12):6271-81
418 Hahn C.S. Lustig S., Strauss E.G., Strauss J.H.: Western equine encephalitis virus is a recombinant virus. PNAS, 1988; 85(5997-6001
419 Holmes E.C. Worobey M., Rambaut A.: Phylogenetic evidence for recombination in Dengue Virus. Mol. Biol. Evol., 1999; 16(3):405-9
420 Bowen M.D. Trappier S.G., Sanchez A.J., Meyer R.F., Goldsmith C.S., Zaki S.R., Dunster L.M., Peters C.J., Ksiazek T.G., Nichol S.T., and the RVF Task Force: A reassortant Bunyavirus isolated from acuter hemorrhagic fever cases in Kenya and Somalia. Virology, 2001; 291(185-90
421 Lukashev A.N.: Evidence for recombination in Crimean-Congo hemorrhagic fever virus. J. Gen. Virol., 2005; 86(2333-8
422 Gibbs M.J. Armstrong J.S., Gibbs A.J.: Recombination in the hemagglutinin gene of the 1918 "Spanish Flu". Science, 2001; 293(1842-5
423 Worobey M. Rambaut A., Pybus O.G., Robertson D.L.: Questioning the Evidence for Genetic Recombination in the 1918 "Spanish Flu" Virus. Science, 2002; 296(211a