Brossard , Mailloux CNRHP
Dec.2006
IMMUNO-HEMATOLOGIE CHEZ LA
FEMME ENCEINTE Incompatibilités Foeto-Maternelles
Diagnostic, Suivi, Prévention
Actualités 2005-2006
40èmes journées de
Biologie Praticienne
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Dec.2006
HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
• INDICATIONS
1- Adaptation posologique des Ig anti-D chez la femme RHD
négatif enceinte ou accouchée
2- Diagnostic étiologique d’une anémie fœtale ou néonatale, ou
d’une mort fœtale
3- Dépistage et suivi d’une HFM spontanée ou induite par des
gestes obstétricaux (amniocentèse, version par manœuvre
externe, ponction sang fœtal), indépendant du groupe rhésus
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• REACTIFS DISPONIBLES POUR LE TEST DE KLEIHAUER
- SureTech Fœtal hemoglobin , Oxytele
- Labo Moderne
- Techniques maisons (exemple : CNRHP)
HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
• TEST DE KLEIHAUER : TEST DE REFERENCE Kleihauer et al , 1957
Test cytochimique sur frottis sanguin fixé à l’éthanol
- Elimination sélective de l’hémoglobine adulte sous l’action d’une solution tampon pH acide, tout en préservant le contenu en hémoglobine fœtale des hématies.
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HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
• RESULTAT DU TEST DE KLEIHAUER
Erythrocytes adultes ayant
perdu Hb = formes
cellulaires fantomatiques,
sphériques , incolores
Erythrocytes avec Hb
fœtale fixant phloxine :
rose vif et réfringent
RESULTAT : 500 HF /10 000 HA : soit 250 ml de sang fœtal (gros passage)
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• INCONVENIENTS DU TEST DE KLEIHAUER (1)
Technique souvent décriée
- Technique manuelle, non standardisée, nécessitant un
personnel formé et entraîné
- Difficulté dans le décompte des cellules (grande variation
inter-individuelle)
HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
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• MISE EN PLACE EXPERIMENTALE D’UN CONTRÔLE DE QUALITE DU TEST DE KLEIHAUER
Simonet et al, 2002
20 laboratoires participants
1 lame colorée (45 HF /10 000 HA)
72 opérateurs
Grande dispersion des résultats :
- Inter-laboratoire 14 122
- Inter-opérateur 0 140
Difficulté de lecture
Erreur de comptage
HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
LAME
(valeur de référence : 45 HF/10000 HA)
0
1
2
3
4
5
6
14 26 44 62 86
Nom
bre
de labora
toires
-1 sd Moyenne +1 sd
Val.Réf.
110 122
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• INCONVENIENTS DU TEST DE KLEIHAUER (2)
Technique souvent décriée
- Difficultés dans l’interprétation des frottis :
Problème des hématies maternelles avec un contenu élevé en HbF
Fcells liés à la grossesse ou hémoglobinopathie
Considérés à tort comme des tests de Kleihauer positifs
Cellules ininterprétables
HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
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HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
• DIFFICULTES DU KLEIHAUER
NEGATIF POSITIF
ININTERPRETABLES
ININTERPRETABLES
Réaliser un témoin positif et négatif
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• FREQUENCE DES RESULTATS ININTERPRETABLES
Septembre 2005 à Novembre 2006 :
6490 tests de Kleihauer réalisés au CNRHP
NOMBRE FREQUENCE
0 HF /10 000 HA 4899 76 %
< 1 - 273 HF/10 000 HA 1369 21 %
HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
Cellules ininterprétables 222 3 %
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• ALTERNATIVE POUR LES KLEIHAUER
ININTERPRETABLES
Réalisation du test Immuno Gold Silver Staining : IGSS
Détection des globules rouges RHD+, en utilisant un anticorps IgG
anti-D et une anti-IgG marquée à l’or colloïdal (GR RHD positif
apparaissent brillants en lumière polarisée )
HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
Test long et difficile
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• AUTRES TECHNIQUES DE DETECTIONS ET DE QUANTIFICATION DES HFM
- Technique des rosettes (dépistage)
- Mesure de la consommation en anti-D : (FMH Screening-test sur gel Diamed)
- Techniques de comptage par cytométrie de flux des hématies fœtales immunomarquées :
- anti-HbF
- anti-RHD
- anti-HbF et anti-anhydrase carbonique : (Fetal cell Count Kit,
distribué par Jacques Boy)
HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
UNIQUEMENT FEMME RHD NEG
UNIQUEMENT FEMME RHD NEG
UNIQUEMENT FEMME RHD NEG
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• DETECTION ET QUANTIFICATION DES HFM RHD+ CHEZ LA FEMME RHD NEG PAR IMMUNOCYTOMETRIE
HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
APPROCHE INTERESSANTE
Utilisation d’un compteur d’hématologie pourvu d’un canal mesurant les réticulocytes par fluorescence
Technique très simple d’Immunomarquage anti-RHD marqué FITC.
Technique validée sur le Cell-Dyn 4000 (Little et al ,2005, Clin. Lab, Haem.)
BUT DU TRAVAIL EN COURS
ADAPTATION de la TECHNIQUE sur le CELL-DYN SAPPHIRE ABBOTT
Confirmation de la Validation technique et validation sur des échantillons cliniques positifs
HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
Aspiration 1
32194
0.102% D+
Aspiration 2
31159
0.112% D+
Aspiration 3
26265 0.098% D+
Aspiration 4
29565 0.118% D+
119183 évènements
131 D+ (0.109%)
CV 8 %
EXEMPLE : Kleihauer à 10 HF/10 000 HA
RHD +
RHD -
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I- VALIDATION TECHNIQUE (gamme sang RHD- enrichi en
hématies fœtales RHD+)
Corrélation Cell-Dyn valeur trouvée / Kleihauer
HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
CV = 16 % pour HFM de 24HF/10 000 HA
0 10 20 30 40 50 600
10
20
30
40
50
60
Résultat Cell-Dyn Sapphire
Résu
ltat
kle
ihau
er
r² = 0,9892
Y = 1.070 – 2.272
80 180 280 380 480 580 68080
180
280
380
480
580
680
Résultat Cell-Dyn Sapphire
Résu
ltat
kle
ihau
er
Y = 1.079 – 1.51
r² = 0,9562
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0 10 20 30 40 50 60 70 800
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Cell-Dyn sapphire
Test
de k
leih
au
er
0 50 100 150 200 2500
100
200
300 Slope 1.103 ± 0.05490
Y-intercept when X=0.0 0.3896 ± 4.879
r² 0,9735
N = 13
Cell-Dyn sapphire
Test
de k
leih
au
er
HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION
II- Corrélation Celldyn Sapphire / Kleihauer sur des
échantillons cliniques positifs
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HEMORRAGIE FOETOMATERNELLE
DETECTION ET QUANTIFICATION PERSPECTIVES
Besoin de Contrôles de qualités internes
Nécessité de Contrôles de qualités externes
Faciliter la formation à la technique de Kleihauer
(réalisation, interprétation et comptage)
Développer des techniques immunocytométriques