Génétique et évolution des systèmes de compatibilité de croisement dans le complexe
d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé
Pierre AbadieUMR 1202 BIOGECOEquipe de Génétique
INRA Bordeaux – AquitaineSite de Recherche de Pierroton
33612 CESTAS
Présentation des travaux de thèse Vendredi 10 Avril 2009LRBB
Co-directeurs:Pauline Garnier-GéréAntoine Kremer
Septembre 2007 – Août 2010
Plan de l’exposé
I. Présentation du sujet – ProblématiqueSpéciation sympatrique et flux de gènes
Le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculéDes divergences phénotypiques
Une faible divergence moléculaire
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Objectif et principeLe dispositif
Réalisation des croisementsMesures cytologiques
RésultatsPerspectives
III. A la recherche des gènes de spéciation
ObjectifChoix des GC
RésultatsLe cas du locus S
Perspectives
Plan de l’exposé
I. Présentation du sujet – Problématique
Spéciation sympatrique et flux de gènes
Concept d’espèce biologique basé sur l’isolement reproducteur
Spéciation : augmentation de la divergence des génomes conduisant à des génomes distincts et indépendants
Mise en place de barrières reproductives
Importance de la géographie dans les processus de spéciation:
Spéciation allopatrique Spéciation sympatrique
I. Présentation du sujet – Problématique
(en rouge: barrières reproductives)
Spéciation sympatrique et flux de gènes
Concept d’espèce biologique basé sur l’isolement reproducteur
Spéciation : augmentation de la divergence des génomes conduisant à des génomes distincts et indépendants
Mise en place de barrières reproductives
Importance de la géographie dans les processus de spéciation:
Spéciation allopatrique Spéciation sympatrique
I. Présentation du sujet – Problématique
(en rouge: barrières reproductives)
Interaction entre flux de gènes et divergence
Spéciation sympatrique et flux de gènes
Différents types de barrières à l’hybridation:
I. Présentation du sujet – Problématique
From Lepais 2008 (PhD)
Spéciation sympatrique et flux de gènes
Comment évoluent les génomes au cours d’une spéciation sympatrique?
Modèle d’un génome en « mosaïque » proposé par Wu :
I. Présentation du sujet – Problématique
spéci
ati
on
Espèce 1
Espèce 2 Existence de régions du génome différenciées
Alternant avec zones « perméables » aux flux de
gènes
Augmentation des zones différenciées jusqu’à divergence
totale des génomes
Spéciation sympatrique et flux de gènes
Comment évoluent les génomes au cours d’une spéciation sympatrique?
Modèle d’un génome en « mosaïque » proposé par Wu :
I. Présentation du sujet – Problématique
spéci
ati
on
Espèce 1
Espèce 2 Existence de régions du génome différenciées
Alternant avec zones « perméables » aux flux de
gènes
Augmentation des zones différenciées jusqu’à divergence
totale des génomes
Vision génique de la spéciation:Existence de gènes de spéciation, responsables de la divergence des
espècesCes gènes contrôlent les barrières reproductives
Spéciation sympatrique et flux de gènes
I. Présentation du sujet – Problématique
Vision génique de la spéciation:Existence de gènes de spéciation, responsables de la divergence des
espècesCes gènes contrôlent les barrières reproductives
Quelques résultats en accord avec ce modèle:
Nosil & al., 2009Savolainen & al., 2009
Spéciation sympatrique et flux de gènes
I. Présentation du sujet – Problématique
- Etude de l’interaction entre les flux de gènes et la sélection divergente
- Quelles en sont les bases physiologiques et moléculaires ?
Modèle d’étude: le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé
Le complexe d’espèces chêne sessile – chêne pédonculé
I. Présentation du sujet – Problématique
Chêne sessile (Quercus petraea) et chêne pédonculé (Quercus robur)
Aire de répartition sympatrique:
Potentiel « hotspot » d’hybridation
Atlas Florae Europaeae 1999
Hybridation asymétrique: sessile (pollen) pédonculéBacilieri & al., 1996: Analyses de parentéKleinschmit & al., 2000: Croisements contrôlésExpérience de Guy Roussel à l’INRA
A la base d’un modèle de migration:
Un modèle de migration d’espèces
: Q. robur = espèce pionnière
: Q. petreae = espèce en introgression
of sessile
From Lepais 2008 (PhD)Petit & al 2004
Des divergences interspécifiques
Divergences morphologiques
Divergences écologiques
Types de solsSessilePédonculé
Wet
Dry
pH
Kremer et al. 2002
From Lepais (PhD)
I. Présentation du sujet – Problématique
Rameau & al. 1994
Une différenciation moléculaire très faible…
•Etude de la différenciation inter-espèces avec 389 marqueurs (isozymes, AFLP, µsat, SNPs)
•Faible différenciation pour des marqueurs nucléaires : Gst < 3%
•Pas de différenciation des marqueurs chloroplastiques : « partage cytoplasmique »
I. Présentation du sujet – Problématique
Une différenciation moléculaire très faible…
Toutefois, forte différenciation pour quelques marqueurs
Scotti-Saintagne et al., 2004
Ces marqueurs ont été cartographiés
•Etude de la différenciation inter-espèces avec 389 marqueurs (isozymes, AFLP, µsat, SNPs)
•Faible différenciation pour des marqueurs nucléaires : Gst < 3%
•Pas de différenciation des marqueurs chloroplastiques : « partage cytoplasmique »
I. Présentation du sujet – Problématique
…mais des « hotspots » de différenciation
Scotti-Saintagne et al., 2004
Cartographie des marqueurs:
Existence de régions génomiques (~15cM) plus différenciées entre les deux espèces
En accord avec la vision génique de la spéciation proposant un modèle de génome en mosaïque structuré en régions différenciées et perméables aux flux de gènes, dans le cadre d’un processus de spéciation sympatrique
I. Présentation du sujet – Problématique
…mais des « hotspots » de différenciation
I. Présentation du sujet – Problématique
Limites des données actuelles:
• Etudes anciennes avec marqueurs peu informatifs
• Peu de données sur les fonctions des gènes dans les clusters différenciés
• Au final, peu de données biologiques précises sur la compatibilité de l’hybridation
• A quel niveau se situe ce complexe d’espèces dans le modèle de Wu ?
Stratégie de recherche
Objectif général:Mieux comprendre l’interaction entre flux de gènes et sélection divergente
Focalisation sur les barrières à la reproduction inter-spécifique
I. Présentation du sujet – Problématique
Stratégie de recherche
I. Présentation du sujet – Problématique
Objectif général:Mieux comprendre l’interaction entre flux de gènes et sélection divergente
Focalisation sur les barrières à la reproduction inter-spécifique
2 approches parallèles:
- Croisements contrôlés inter-spécifiquesEtude de la compatibilité d’hybridation entre différents génotypes
- Recherche des gènes de « spéciation » impliqués dans la divergenceApproche gènes candidats
Etude de la diversité moléculaire et de la différenciation
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Objectif et principe des croisements
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Objectif : Etudier la compatibilité d’hybridation entre les deux espèces
Principe : Caractérisation de croisements hybrides en fonction de différents génotypes
Croisements dans le sens le plus favorable: sessile vers pédonculé
Le dispositif
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Parcelle expérimentale de l’INRA à Bourran (Lot-et-Garonne)
2196 individus pédonculés âgés de 7 à 10 ans
Arbres « plein-frères »: Descendants F1 du croisement intra-pédonculé 3P x A4
352 génotypes, présents de 7 à 10 copies (clones)
Nombreuses données disponibles sur ces arbres (taille, croissance, débourrement, etc)
Les arbres du croisement
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
♀
30 arbres mères pédonculés
10 génotypes représentatifs de la variabilité du pédigrée
3 clones par génotypes
♂
Mélange pollinique sessile
4 individus sessiles en proportion 25% de grains
viables(Qs27, Qs30, Qs31, Qs32)
Les arbres du croisement
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Localisation des arbres sur la parcelle
Les étapes des croisements
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Protocole mis au point à l’INRA par Guy Roussel
Les étapes des croisements
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
L’empochage des arbres Isoler les arbres-mères du pollen environnant
Les étapes des croisements
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
L’empochage des arbres Isoler les arbres-mères du pollen environnant
Les étapes des croisements
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Les piqûres de pollen Avril-Mai: 4 injections de mélange pollinique
Les étapes des croisements
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Les piqûres de pollen Avril-Mai: 4 injections de mélange pollinique
Les étapes des croisements
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Dépochage, mesures, prélèvements De Mai à Septembre
Mesures cytologiques
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Objectif : Observation des tubes polliniques en croissance dans les styles
Protocole fourni par Adrienne RessayreBasé sur une coloration au bleu d’aniline (callose)Microscopie à fluorescence (UV)
Prélèvements et conservation dans le FAA
Croisements contrôlés : Variables mesurées
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Identification
Morphologie
Phénologie
Succès des croisements
Cytologie
Croisements contrôlés : Analyses de variance
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
4 modèles d’analyse de variance utilisés:
•« Effet génotype seul »
Yij = µ + Gi + Eij Valeur moyenne effet génotype erreur
•« Effet génotype + bloc »
Yij = µ + Gi + Bj + Eijk Valeur moyenne effet génotype effet bloc erreur
•« Analyse de covariance »
Yik = µ + Gi + β COVik + Eik Valeur moyenne effet génotype covariance erreur
•« Analyse de covariance hiérarchisée »
Yik = µ + Gi + βi COVik + Eik Valeur moyenne effet génotype covariance erreur
: Effet génotype
: Effet environnement
Croisements contrôlés : Analyses de variance
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Effet génotype significatif
Croisements contrôlés : Analyses de variance
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Nécessité de déclarer des covariables représentant les hétérogénéités de l’environnement pour mettre en évidence
les effets génotypes Augmentation de la puissance des tests
Croisements contrôlés : Analyses de variance
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Contribution des effets sur la somme des carrés d’écarts totaux sur la moyenne finale
Croisements contrôlés : Résultats
Comparaison avec les témoins naturels
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
• Plus d’inflorescences pour les arbres empochés Influence de la poche qui favoriserait la floraison?
• Plus de grains de pollen sur les fleurs pour les témoins naturelsPlus longue exposition au pollen chez les témoins?
Comparaison avec les témoins naturels
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
•Pour la même date de prélèvement, les tubes polliniques sont plus développés chez les témoins naturels
•Ralentissement de la croissance des tubes
Existence de barrière pré-zygotique ?
Corrélations entre variables
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
•Relations positives, artificiellement créées ?
•Manque de points intermédiaires
•A confirmer en 2009 Augmentation des mesures
•Pas de conclusions possibles à ce stade
(116)
(116)
(140)
Et côté paternel ?
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
•Génotypage des glands obtenus pour déterminer le père de chaque gland
•336 glands génotypés avec 12 microsatellites
•Pas de résultats à présenter aujourd’hui (il manque un parent)
•Type de résultats attendus:
•Objectif : Données sur de possibles différences de compatibilité selon le génotype de chêne sessile
Croisements contrôlés : Conclusions
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
•Différences significatives entre les génotypes d’arbres mères pour les variables mesurées
Différences entre les génotypes pour la compatibilité d’hybridation
•Moins bonne croissance des tubes polliniques lors des croisements hybrides
Détection de barrières pré-zygotiques
•A confirmer: corrélations entre variables cytologiques et « macrovariables »
Détection de barrières pré-zygotiques ?
Croisements contrôlés : en 2009
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
•Génotypage des glands•Suivi des glands Données sur barrières post-zygotiques?
•Les croisements et les mesures cytologiques réalisés en 2008 ont bien fonctionné et nous ont apporté des infos
Nouveaux croisements 2009 à plus grande échelle:
Augmentation du nombre de croisements hybrides
19 génotypes * 3 clones2 génotypes « ponts »
Croisements intra-pédonculés Témoins empochés
10 génotypes * 1 clone
Croisements intra-pédonculésSuivi de témoins naturels
19 génotypes * 3 clones
Pollen sessile Pollen pédonculé Pollen naturel
Croisements contrôlés : en 2009
II. Croisements contrôlés inter-spécifiques
Suivi de 124 arbres, dont 66 empochés la semaine dernière :
Merci à Guy, Benjamin, et à l’Unité Expérimentale de Bourran
Plan de l’exposé
II. A la recherche des gènes de spéciation
Analyse de séquences nucléotidiques de gènes candidats
A la recherche des gènes de spéciation
Objectif :
Détection de gènes candidats potentiellement impliqués dans la divergence entre les deux espèces
Principe :
•Analyse de séquences nucléotidiques : diversité et différenciation inter-spécifique
•Focalisation sur les gènes potentiellement impliqués dans les barrières à l’hybridation
•Détection de gènes « outliers » par rapport à une référence expérimentale « neutre » basée sur l’étude d’un grand nombre de fragments (projet de reséquençage)
III. A la recherche des gènes de spéciation
Choix des gènes candidats
III. A la recherche des gènes de spéciation
MECHANISME GENERAL
FONCTION STRATEGIE
NOMBRE D’EST
SELECTIONNE
OK / TESTED
Interspecific incompatibility
-pollen/pistil interaction-pollen germination-pollen tube growth-pollen tube guidance
-Keywords search in Arabidopsis, Populus and Prunus databases
-Blast against own oak EST database
38 3 / 5
Flowering-phase transition-flowering 9 0 / 0
Strong Gst-pollen cytosqueletton-pollen glycoproteins-pollen-specific proteins
-Oak genome scanning for strong Gst ESTs-Selection by function annotation
11 2 / 5
Auto-incompatibility
-S locus proteins
-Direct design of degenerated primers according to Prunus sequences alignements
2 0 / 2
Fragments séquencés
III. A la recherche des gènes de spéciation
•Gene Pop2: •Précurseur d’une sous-unité de la gamma-aminobutyrate transaminase•Contrôle du guidage du tube pollinique•Longueur du gène chez At = 5,3kb, 13 introns•1 fragment obtenu sur 13 testés
•Gene Tub8: •Sous unité alpha de la tubuline 8•Longueur du gène chez At = 1,8kb•2 fragments obtenus sur 4 testés
•Gene H8: •Récepteur glycoprotéique•Screené avec un fort Gst dans la banque•2 fragments obtenus sur 2 testés
Fragments séquencés
III. A la recherche des gènes de spéciation
•Gene Feronia: •Récepteur à activité kinase exprimé dans les synergides•Contrôle de l’interaction pollen-pistil chez At•3 paralogues détectés chez le chêne, 1 séquencé•1 fragment obtenu sur 4 testés
•Gene ROS: •Récepteur exprimé dans le pollen•Screené avec fort Gst dans la banque•1 fragment obtenu sur 1 testé
Résultats: Diversité & Différenciation
III. A la recherche des gènes de spéciation
Résultats: Diversité & Différenciation
III. A la recherche des gènes de spéciation
Calcul des statistiquesFst / Nst par une AMOVA sur des matrices de distance entre les haplotypes
D de TajimaFs de Fu
Reconstitution des phases avec ArlequinAlgorithme ELB (Excoffier & al., 2003)
POP2 : p>0,8 pour 10 individus sur 19 TUB8 : p>0,8 pour 9 individus sur 22 H8 : p>0,8 pour 8 individus sur 16Feronia : p>0,8 pour 9 individus sur 14
ROS : p>0,8 pour 11 individus sur 14
Résultats: Diversité & Différenciation
III. A la recherche des gènes de spéciation
Résultats: Diversité & Différenciation
III. A la recherche des gènes de spéciation
Nst (2)
13,5%
10,1%
14%
-0.04%
12%
Nst (2): Autre méthode dans Arlequin pour estimer le Nst« Locus by locus Amova »
Se base sur le calcul du Fst à chaque SNPAvantage: ne dépend pas de la phase, et moins dépendant des données manquantes
Résultats: Diversité & Différenciation
III. A la recherche des gènes de spéciation
*** ***
***
Ecarts entre Fst et Nst
Résultats: Diversité & Différenciation
III. A la recherche des gènes de spéciation
*** ***
***
Forte différenciation des locus POP2 et H8
Résultats: Diversité & Différenciation
III. A la recherche des gènes de spéciation
*** ***
***
Forte diversité des locus POP2 et ROS
Résultats: Diversité & Différenciation
III. A la recherche des gènes de spéciation
*** ***
***
D de Tajima < 0 pour Tub8 et Feronia
Interprétation des tests
III. A la recherche des gènes de spéciation
D de Tajima < 0 pour Tub8 et FeroniaFs de Fu < 0 pour les 5 gènes
Θs : estimateur de diversité basé sur le nombre de sites polymorphesΘπ : estimateur de diversité basé sur le nombre moyen de différences entre séquences
•Sous hypothèse de neutralité sélective et d’équilibre démographique, tous les estimateurs de diversité sont égaux à 4 Ne µ•Ici, un D < 0 correspond à un excès de mutations rares (θs y est + sensible que θπ)
•S’interprète comme de la sélection directionnelle ou une expansion démographique
(ERREUR DANS LE RAPPORT)
avec K = nbre d’haplotypes attendukobs = haplotypes observés
•Si kobs > K = excès d’allèles en faible fréquence S’ est faible Fs < 0
•S’interprète comme de la sélection directionnelle ou une expansion démographique
Analyse le long des fragments
III. A la recherche des gènes de spéciation
A faire : estimer les taux de recombinaisons et les DL
Analyse le long des fragments
Gène Tub8
Gène entier 1,8kb
Intron de 100pbconnu comme
très différencié(Porth & al,
soumis)
Analyse le long des fragments
Intron de 100pbconnu comme
très différencié(Ilga Porth,
comm. perso.)
Gène entier 1,8kb
Baisse de la diversité et de la différenciation de 5’ vers 3’
Gène Tub8
• zone en 5’ différenciée
• zone fonctionnelle soumise à sélection purificatrice?
Résultats: Diversité & Différenciation
III. A la recherche des gènes de spéciation
•L’étude de ces gènes candidats révèle des patterns de diversité et de différenciation intéressants:
•Diversité importante pour les gènes POP2 et ROS•Forte différenciation des gènes POP2, H8 et TUB8 (10 à 16%)
•D de Tajima < 0 pour TUB8 et FERONIA
• Ce sont des gènes homologues de gènes impliqués dans les barrières aux croisements
Bons candidats de gènes de « spéciation »
Est-ce que ce sont des « outliers » ?
Recherche d’« outliers »•40000 simulations réalisées avec le logiciel FDIST2 (M. Beaumont)•Détermination des quantiles 5% et 95% correspondant aux enveloppes inférieures et supérieures de la distribution des points
Quantile 95%Median
Quantile 5%
Hétérozygotie
Paramètres des simulations:
•2 populations•2 dèmes•Fst = 3%•40000 simulations
Fst
III. A la recherche des gènes de spéciation
Recherche d’« outliers »
Fst
Fst des 5 gènes
H des 5 gènes
Pas de gène outlier détecté avec ces simulations
Recherche de SNP outliers Réalisation des simulations avec d’autres logiciels (SIMCOAL) (méthodes ABC)
Recherche d’outliers avec le Nst et non le Fst
Hétérozygotie
III. A la recherche des gènes de spéciation
Le locus S d’auto-incompatibilité
III. A la recherche des gènes de spéciation
• Système gamétophytique à deux composantes (♀ S-RNase et ♂ SFB)
• Individus 100% hétérozygotes
• Association d’allèles des 2 gènes S-RNase et SFB
• Qu’est-ce qui se passe au niveau inter-espèces pour la différenciation génétique ?
• Mécanisme favorisant les croisements entre individus différents
Favorise l’hybridation ?
• Acquisition de données en 2009, nécessiter de passer par des étapes de clonage
Perspectives
III. A la recherche des gènes de spéciation
•Obtention de données sur un plus grand nombre de gènes candidats
•Résultats du projet de reséquençage allélique (2009) Obtention de statistiques sur 300 ESTs aléatoires A utiliser comme référence neutre pour la recherche d’outliers
•Augmentation du nombre d’individus séquencés pour les gènes qui seront les plus intéressants
Perspectives
•Chercher un meilleur estimateur de la différenciation ?Fst et Nst = indices de fixationCreuser au niveau des types de polymorphismes (exclusifs /
partagés) ?
Aparté sur les types de polymorphismes
Gène Haplotypes exclusifs
Haplotypes partagés
Pop2 32 1
Tub8 37 1
H8 16 3
Feronia 23 0
ROS 25 0
(basés sur les reconstitutions de phase d’Arlequin)
Calcul d’autres paramètres pour estimer la différenciation ?
Dst = absolute differentiation (Nei 1973) Gst = relative differentiation (Nei 1973) Hst = between-subpopulation heterozygosity (Aczel & Daroczy 1975; Tsallis & Brigatti 2004) Δst = between-subpopulation component of diversity, or the effective number of distinct subpopulations (Jost 2008) D = actual differentiation (Jost 2008) This is NOT the same thing as Dest. Hs/Ht = proportion intra-population heterozygosity vs total heterozygosity (Jost 2008) Δs/Δt = proportion of total diversity that is contained in the average subpopulation (Jost 2008)
Jost 2008
Perspectives
•Chercher un meilleur estimateur de la différenciation ?Fst et Nst = indices de fixationCreuser au niveau des types de polymorphismes (exclusifs /
partagés) ?
•Développer une recherche d’outliers basée sur le Nst ou autre ?Test de type Beaumont & NicholsRéalisation d’une routine permettant de simuler des enveloppes
neutres et de placer des gènes / SNPs par rapport à ces enveloppes, à partir d’entrées fasta par exemple. Utilisation de R ou de SIMCOAL
•Tester le sens des flux de gènes dans ce complexe d’espèces ?Méthode développée par M. Navascues (ENS Ulm), basée sur les types
de polymorphismes
•Où se situe ce complexe d’espèces dans le processus de spéciation ?Un équilibre entre flux de gènes et sélection divergente est-il
possible ?Modélisation des données dans un modèle de spéciation sympatriqueGavrilets & al., 2007
Merci de votre attention