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Centre de Lutte contre le Cancer d'Auvergne Clermont-Ferrand - France -

Centre Jean Perrin

Un  test  décentralisé  apporte  t  il  une  valeur  ajoutée  aux  équipes  d’oncologie  médicale  dans  les  cancers  du  sein  en  

situa8on  adjuvante  ?  Reproduc8bilité  et  fiabilité  des  résultats

Frédérique Penault-Llorca, MD, PhD

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CENTRALIZED  APPROACH  

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The  Oncotype  DX®  Assay  

Genomic  Health,  Inc.  

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OncotypeDX (Genomic Health, USA)

HR+ / HER2- , T1-3, N-/N+ FFPE specimens

qRT-PCR 21 GENES

PROLIFERATION, OESTROGENE, HER2, INVASION (16 GENES) + REFS (5 GENES)

« CENTRALIZED » TEST

(recurrence score) RS Late recurrence (10 years)

Benefit from adjuvant TT PROGNOSTIC AND PREDICTIVE

LOW RISK :

+ HORMONOTHERAPY / - CHEMOTHERAPY

INTERMEDIATE RISK : DISCUSSION

HIGH RISK : + HORMONOTHERAPY / + CHEMOTHERAPY

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5  

The  Oncotype  DX®  assay  is  analy3cally  validated  

Elements  of  analy8c  valida8on  •  Analy3cal  sensi3vity    (limits  of  detec3on  and  quan3ta3on)  

•  Assay  precision  and  linear  dynamic  range  •  Analy3cal  reproducibility  •  PCR  amplifica3on  efficiency  •  Sample  and  reagent  stability  •  Reagent  calibra3on  •  Instrument  valida3on  and  calibra3on  

Chau CH, et al. Clin Cancer Res. 2008;14(19):5967-5976.

Analytical validation is the assessment of assay performance characteristics and the optimal conditions to

generate accuracy, precision and reproducibility

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MammaPrint®  

Agendia,  Inc.  

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MammaPrint (Agendia, NL)

HR+ ET HR - / HER2- , T < 5cm, N ≤ 3

Fresh frozen=> FFPE DNA array

70 GENES CELL CYCLE/ PROLIFERATION

SIGNAL TRANSDUCTION INVASION, METASTASIS, ANGIOGENESIS

« CENTRALIZED » TEST

RECENTLY ADAPTATED TO FFPE

Group of genes (« signatures »)

EARLY RECURRENCE (Dg < 5 ans) PROGNOSTIC

GOOD SIGNATURE : LOW RISK

POOR SIGNATURE : HIGH RISK

HR+&  HR-­‐  

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70  Gene  Assay  FFPE  Uncertainty    •  FFPE  tumor  3ssue  fixa3on  

causes  RNA  to  degrade,  the  accuracy  of  microarray  tes3ng  depends  on  keeping  the  tumor  RNA  intact  

•  The  70  gene  assay  analy3cal  validity  tests  were  performed  on  fresh  frozen  3ssue  (current  method  in  the  FDA  label)  

•  The  70  gene  assay  is  now  available  in  paraffin  as  part  of  the  SYMPHONY  tests;  however,  adequate  valida3on  of  this  method  is  not  documented  in  the  public  literature  

h\p://www.agendia.com  Scicchitano  MS,  et  al.  J.  Histochem.  Cytochem.  2006;  54  (11):  1229–1237.   8  

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Procedure    

•  FFPE  •  Fill  the  form  •  Send  block,  slides  or  tumor  

sample  to  the  central  lab  with  a  dedicated  box  

•  Results  within  8  days  via  e-­‐mail  

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DECENTRAL  GENE  EXPRESSION  ANALYSIS  

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Prosigna  PAM50  ROR    NanoString  nCounter®  

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Development of Prosigna™ is Based on PAM50 Gene Signature

2000 Researchers first describe

breast cancer intrinsic subtypes based on microarray

experiments

2009 Researchers first describe “PAM50” gene expression

signature

2010 NanoString exclusively licenses

PAM50 gene expression signature

2012/13 Prosigna launches after receiving CE Mark for Europe & Israel; FDA 510k clearance in US

PAM50  developed  by  a  consor3um  of  four  academic  breast  cancer  experts  ●  Charles  Perou,  PhD,  University  of  North  Carolina  

●  Dr.  Ma\  Ellis,  Washington  University  School  of  Medicine  

●  Torsten  Nielsen,  MD,  PhD,  Pathologist,  BC  Cancer  Agency  

●  Philip  Bernard,  MD,  University  of  Utah  /  Huntsman  Cancer  Ins3tute  

 Source:  Molecular  portraits  of  breast  cancer.  Nature.  2000  May  25;.  Source:  Supervised  Risk  Predictor  of  Breast  Cancer  Based  on  Intrinsic  Subtypes,  JCO.2009  

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Overview of Principles: Design Advantages of nCOUNTER •  Direct  detec8on  (no  amplifica3on  of  target)  

•  Designed  for  short  sequences  ~100  bp  

 

•  Digital  coun8ng  results  in  excellent  analy8cal  performance  

–  Highly  sensi3ve  and  precise  – Wide  dynamic  range    (5  logs)  

 •  Automated  processing  

•  Internal  controls  • Mul8plexed  

Capture Probe

Reporter Probe

Target

Target-Probe Complex

SOLUTION HYBRIDIZATION

REMOVE EXCESS PROBE IMMOBILIZE/ALIGN

DIGITAL COUNT

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Intrinsic Subtype: Organizing Framework for Breast Cancer

Supported  by  The  Cancer  Genome  Atlas  Study1  

●  Endocrine  therapy  alone  Luminal  A  

1.  Comprehensive  molecular  portraits  of  breast  cancer.  Nature.  2012  Oct  4;490(7418):61-­‐70.  2.  Personalizing  the  treatment  of  women  with  early  breast  cancer:  highlights  of  the  St  Gallen  InternaQonal  Expert  Consensus  on  the  Primary  

Therapy  of  Early  Breast  Cancer  2013  Annals  of  Oncology  Advance  Access  published  August  4,  2013  

Diverse genetic and epigenetic alterations converge phenotypically into the four main breast

cancer subtypes defined by PAM50

Endorsed  in  2013  St.  Gallen  Guidelines2  

●  If  HER2―,  endocrine  +/-­‐  cytotoxic  therapy  ●  If  HER2+,  cytotoxics  +  an3-­‐HER2  +  

endocrine  ●  Could  include  anthracyclines  and  taxanes  

Luminal  B  

●  Cytotoxics  +  an3-­‐HER2  ●  Could  include  anthracyclines  and  taxanes  

HER2  enriched  

●  Cytotoxics  therapy  alone,  poten3ally  including  anthracyclines,  taxanes  and  analkyla3ng  agent  

●  Do  not  rou3nely  use  cispla3n  or  carbopla3n  

Basal-­‐like  

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Three Elements of Prosigna™ Breast Cancer Assay

Hardware:  nCounter  Analysis  System  

Consumable:  Prosigna  Kits  

SoYware:  Prosigna  Report  

Prep  Sta8on  

Digital  Analyzer  

Includes:  ● 50  gene-­‐based  CodeSet  with  8  controls  ● Other  consumables  required  for  assay  ● CE  Marked  Roche  RNA  isola3on  kit  sold  separately  

nCounter  Analysis  System  and  Prosigna  Breast  Cancer  Assay  Kit  received  FDA  510K  clearance  in  2013  and  CE  Marked  in  2012  

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Prosigna™ Tests Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Samples

H&E  stain  to  iden3fy  tumor  area  and  

cellularity  

Tumor  area  transposed  to  unstained  slides  and  macrodissected  

RNA  extracted  Block  selected  

Specimen Attribute Requirement Tissue input Viable invasive breast carcinoma (ductal, lobular, mixed, or NOS/NST)

Tissue input format Macrodissected 10-micron-thick slide-mounted tissue sections

Minimum tumor size 4 mm2 tumor area

Minimum tumor cellularity 10% within tumor area

Minimum RNA amount 125 ng (12.5 ng/µl)

Tissue area ≥100mm2 1 slides required

20 – 99mm2 3 slides required

4 – 19mm2 6 slides required

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Simple and fast workflow is well suited for qualified clinical laboratories

Simple  Prosigna™  Workflow  Enables  Decentralized  Tes3ng  Model    

1

nCounter® Prep Station nCounter® Digital Analyzer

Hybridize   2 Purify   3 Count  

Step 3 3 – 4.5 HOURS, AUTOMATED

5  min

HANDS-ON Step 2 2.5 – 3.0 HOURS, AUTOMATED

5  min

HANDS-ON Step 1 12 HOURS OR OVERNIGHT

5  min

HANDS-ON

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PAM50  ROR  by  NanoString  nCounter®  

Extract  RNA  from  FFPE  

 tumor  sample  

Run  RNA  &  PAM50  CodeSet  on  nCounter  Analysis  System  

Capture  paQent    expression  profile  

Calculate  Risk  of    Recurrence  (ROR)  Score  

Determine  Intrinsic  Subtype  through  Pearson’s  CorrelaQon  to  Centroids  

4 or 10 samples Overnight incubation

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PAM50 Algorithm Generates a Prosigna Score for Each Patient

●  Gene  expression  data  are  weighted  with  clinical  variables  to  determine  an  integer  score  from  0  through  100  (ROR/Prosigna  Score)  indica3ve  of  the  probability  of  distant  recurrence  

●  ROR  is  based  on  the  similarity  of  the  gene  expression  profile  to  intrinsic  subtypes,  prolifera3on  score,  and  tumor  size    

●  Assay  requires  input  of  gross  tumor  size  and  nodal  status      Determine  intrinsic  subtype  through    Pearson’s  correla8on  to  centroids  

ROR        =  aRLumA+        

                                                                           bRLumB+  

                                                                           cRHer2e+    

                         dRBasal+  

                         eP+      

                         fT    

Pearson’s  correla3on  to  centroids  

Calcula8ng  ROR  (Prosigna  Score)  

Pa8ent    expression  profile  

Prosigna  centroids  

Prolifera3on  score  Gross  tumor  size  >2cm  

Gnant M, et al. SABCS 2012; poster P2-10-02.

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Patient Report Output: Page 1

Patient report: Identifying information

Assay description: Describes components of the Prosigna assay

Risk of Recurrence: Patient specific ROR is reports based on Prosigna algorithm. The ROR ranges from 0 to 100

Probability of distant recurrence: This section provides the correlation of the ROR with a specific likelihood of distant recurrence at 10 years, based on the average 10-year distant recurrence rate for that ROR in the clinical trial population. The probability of distant recurrence at 10 years increases continuously with an increase in ROR

Designed  as  a  tool  for  pa8ent/oncologist  communica8on  

CE-­‐IVD-­‐marked  

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Patient Report Output: Page 2

Description of validation studies

Distant recurrence by subtype

Risk curves by study

Provided  as  detailed  background  on  valida8on  studies  for  oncologist  

CE-­‐IVD-­‐marked  

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Highlights of Prosigna™ Report

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Prosigna™  Output:  Risk  Interpreta3on  and    Categoriza3on  by  Nodal  Status  

•  Risk  classifica3on  guidelines  are  provided  based  on  cutoffs  related  to  clinical  outcome  in  the  tested  pa3ent  popula3ons:  

•  10-­‐year  probability  of  distant  recurrence  of  <  10%  is  considered  low  risk  •  10-­‐year  probability  of  distant  recurrence  of  >  20%  is  considered  high  risk  •  Prosigna  score  discriminates  risk  groups  within  pa3ents  with    

node-­‐nega3ve  disease    

23

Nodal  Status   Prosigna  Score  Range  

Risk  Categoriza8on  

Node-­‐nega3ve  

0  -­‐  40     Low  

41  -­‐  60     Intermediate  

61  -­‐  100     High  

Node-­‐posi3ve  (1  -­‐  3  nodes)  

0  -­‐  40   Low  

41  -­‐  100   High  

Prosigna Package Insert.

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Risk  Categories  Map  to  Clinical  Risk  by  Nodal  Status  (0-­‐10%,  10-­‐20%,  >20%  10  year  DR)  

10-Y

ear P

roba

bility

of D

istan

t Rec

urre

nce

ROR Score

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

0 20 40 60 80 100

Rate 95% CI

Node Negative

10-Y

ear P

roba

bility

of D

istan

t Rec

urre

nce

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90

100

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100

Rate

ROR Score

Node Positive (1-3 nodes) Low                                        Int  High  0-­‐10  10-­‐20  <20  

Low                      Int    High  0-­‐10                    10-­‐20  <20  

Nodal  status  

ROR  range  

Risk  categoriza8on  

Node-­‐nega3ve  

0-­‐40   Low  

41-­‐60   Intermediate  

61-­‐100   High  

Node-­‐posi3ve  (1-­‐3  nodes)  

0-­‐15   Low  

16-­‐40   Intermediate  

41-­‐100   High  

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Prosigna™  Analytical Validation :  Reproducibility  and  Precision  Evaluated  in  Two  Studies  :    

25

Study  1:  Reproducibility  from  8ssue  

Extract RNA from FFPE tumor sample

Study  2:  Precision  from  RNA  

Prosigna Score

Run Prosigna on nCounter Dx Analysis

System

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26

Analytical validation

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27

Prosigna™ Analytically Validated for Decentralized Testing

Reproducibility  from  43  FFPE  Tissue  Samples,  Replicates  across  3  different    sites  &  n-­‐counters  1  

Precision  from  108  replicates  of  5  Pooled  RNA  samples,    at  3  differents  sites,  2  operators  at  each  site,  each  with  3  differents  reagants  lots,    9  runs  per  operator  1  

●  For  intrinsic  subtype  classifica8ons,  the  average  concordance  between  sites  was  97%  

●  Prosigna  Score  Standard  Devia8on  =  2.9  (scale  0-­‐100)  

●   100%    concordance  between  the  subtype  &  risk  groups  

●   Site-­‐to-­‐site  or  operator-­‐to-­‐operator  <1%  of  variance  

●   Prosigna  Score  Standard  Devia8on  =  0.67  (scale  0-­‐100)  1   AnalyQcal  Reproducibility  of  the  Breast  Cancer  Intrinsic  Subtyping  Test  and  nCounter®  Analysis  System  Using  Formalin-­‐Fixed  Paraffin-­‐Embedded  (FFPE)  Breast  

Tumor  Specimens.    T  Nielsen  et  al.,  S  McDonald,  S  Kulkarni,  J  Storhoff,  C  Schaper,  B  Wallden,  S  Ferree,  S  Liu,  V  Hucthagowder,  K  Deschryver,  V  Holtschlag,  G  Barry,  M  Evenson,  N  Dowidar,  M  Maysuria,  D  Gao  USCAP  2013  

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 Assay Robust Against Non-tumor Tissue

RO

R C

hang

e

Percent Non-tumor

" Objective : o  Assess impact of adjacent non-tumor tissue

on ROR. " Design:

o  Slide mounted sections from 24 FFPE blocks were tested with vs. without macrodissection of adjacent non-tumor tissue.

o  The difference in ROR between the macrodissected vs. unmacrodissected tissue was determined.

" Result: o  The NanoString test result was robust

against the inclusion of up to 50% adjacent non-tumor tissue into the assay.

1   AnalyQcal  Reproducibility  of  the  Breast  Cancer  Intrinsic  Subtyping  Test  and  nCounter®  Analysis  System  Using  Formalin-­‐Fixed  Paraffin-­‐Embedded  (FFPE)  Breast  Tumor  Specimens.    T  Nielsen  et  al.,    USCAP  2013  

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ENDOPREDICT  (MYRIAD  GENETICS)  

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EndoPredict (Myriad genetics)

HR+ / HER2- , T1-2, N0

FFPE qRT-PCR

7 GENES SIGNATURE PROLIFERATION, OESTROGENES

« LOCAL » TEST (SPECIAL EQUIPMENT IS REQUIRED)

SCORE OF RECURRENCE EP SCORE

LATE AND EARLY RECURRENCES (5 & 10 YEARS) PROGNOSIS

LOW RISK

HIGH RISK

UBE2C BIRC5 DHCR7

STC2 AZGP1 IL65T

RBBP8 MGP

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Analytical validation according to CLSI guidelines is published in peer-reviewed journal  

Peer-­‐reviewed  publica8on   CE-­‐IVD-­‐marked  

IVDD 98/79/EG  

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Analytical Performance Characteristics Core biopsies and surgical specimen can be used for EndoPredict

•  Comparable  results  between  core  biopsies  and  surgical  sec3ons  •  Inflammatory  changes  induced  by  presurgical  biopsies  had  no  significant  

effect  on  the  EndoPredict-­‐based  risk  assessment  in  surgical  specimens  

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CONCLUSION  

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Central  versus  local  •  Pros      

–  Central      •  Standardiza3on    •  High  volume  •  High  turnaround  3me    •  Easy  shipping    

–  Local    •  Independency  from  large  

companies  •  Ins3tu3onal  based  result  •  Cross  lab  valida3on  •  Fits  into  the  INCa’s  plaxorms  

model  •  The  automate    is  flex  can  be  

used  for  research  

•  Cons    –  Central    

•  Usually  Abroad  •  Absence  of  cross  lab  valida3on  

–  Local    •  Quality  assurance  •  Turnaround  3me  vs  cost  

effec3veness  (30  samples/round)  

•  Implementa3on  in  a  path  lab  rou3ne  


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