Cours UE 7 n° 2
Professeur N. Charnaux
Ronéotypeurs :
- partie 1 : Chériaux Laura
- partie 2 : Lumbu Hermann
Fonctions des protéoglycanes à héparane sulfate
Quelques abréviations pour ce cours :
IC intracellulaire
EC extracellulaire
GAG glycosaminoglycane
PG protéoglycanes
Aa acide aminé
Structure et fonction PG et GAG
Quand on regarde une cellule on se rend
compte que beaucoup de composants du
milieu EC sont susceptibles d’avoir un effet
sur la cellule. Ces composants jouent un rôle
particulièrement important car ils induisent
des effets biologiques sur une cellule (ex :
prolifération, migration, communication
cellulaire). Les protéoglycanes à héparane
sulfate membranaires sont des molécules
susceptibles de lier de nombreux ligands entre
autre par des interactions avec des chaines
glycosaminoglycaniques.
Ils peuvent êtres des récepteurs de ligand EC
avec un effet biologique sous jacents.
Les PG sont constitués d’un corps protéique sur lequel sont Oliés par O glycosylation des chaines
glycosaminoglycaniques. On retrouve plusieurs types de PG dans la matrice EC mais nous ne parlerons ici
que des PG membranaires qui expriment des chaines héparane sulfate
Un GAG est une chaine polysaccharidique non ramifiée composée d’une répétition d’un disaccharide (n
répétitions). Le disaccharide est constitué de deux monosaccharides :
- un acide uronique : soit l’acide D glucuronique soit l’acide L iduronique
- ose simple aminé de type D acétylé : soit N acétyl glucosamine (obtenu par acétylation du glucose)
soit N acétyl galactosamine
Ose aminé : ose dans lequel on a remplacé un groupement hydroxyle par un groupement amine
Acétylation : par réaction avec une molécule d’acide acétique on a un groupement NH2 acétylé
Les glycosaminoglycannes ou GAG
RAPPEL
glucose
C
C
C
C
C
C
OHH
OHH
HO H
OHH
H O
OHH
H
ose
acidification
acide uronique
C
C
C
C
COOH
C
OHH
OHH
H OH
OHH
H O
acide glucuronique
O
OHNH2
CH2OH
HO
HO
glucosamine
O
OHNH
CH2OH
HO
HO
C O
CH3
N-acétyl-glucosamine
(GlcNAc)
Osamines : remplacement d’un grpt –OH par –NH2
Acétylation de l’osamine
On trouve différentes familles de GAG :
- acide hyaluronique
- chondroitine sulfate/dermatane sulfate (globalement la même famille)
- héparine/héparane sulfate
- kératane sulfate
Biosynthèse des héparanes sulfates
Les molécules d’héparane sulfate sont chargées négativement :
1) du fait de la présence de groupements carboxyliques COOH qui deviennent COO- en solution
2) car les chaines de type héparane sulfate sont fréquemment sulfatées
BIOSYNTHÈSE DES HÉPARANES SULFATE
1- attachement d’un tétrasaccharide de liaison (Ser, Thr)
2- polymérisation d’un dissacharide [glycosyltransférases]
20 à 80 disaccharides
3- modifications des disaccharides : épimérisation,
sulfatation
Motifs de liaison uniques
Reconnaissance spéficique de ligand
Quand on s’intéresse à la biosynthèse des PG en particulier à l’association de chaines de type héparane
sulfate sur un corps protéique on s’aperçoit qu’il y a différentes étapes :
1) Oglycosylation : liaison covalente d’un tétrasaccharide (xylose galactose acide glycuronique) sur une
serine thréonine dans le golgi
2) Polymérisation du disaccharide par une glycosyltransferase
Le nombre de disaccharides est très variable d’une chaine héparane sulfate à l’autre : entre 20 et 80
répétitions de disaccharides.
Il existe des modifications très importantes des disaccharides en termes :
- d’épimérisation (acide D glycuronique peut être épimérisé en acide L iduronique)
- de sulfatation (possibilité d’avoir des 2-O sulfatases, 6-Osulfatases qui vont sulfater les sucres et
donc donner globalement à ces GAG une charge négative)
Les GAG de type héparane sulfate sont composés à l’origine d’un même disaccharide mais sont modifiés par
épimérisation ou sulfatation. Ces modifications vont générer le long de la chaine des motifs de disaccharides
uniques. L’existence de ces motifs uniques rend les GAG susceptibles de lier des facteurs de croissances ou
chimiokine (la liaison semble être spécifique). On parle ainsi d’héparanome (sorte de code moléculaire). On
essaye de séquencer les motifs disaccharidiques qui vont spécifiquement lier tel ou tel facteur de croissance
ou chimiokines mais il se pose un problème méthodologique : séquencer des sucres est très difficile.
Diversité structurale des héparanes sulfates
Les chaines héparanes sulfate présentent
une diversité structurale très importante :
- elles portent une information
considérable
- une séquence est en théorie égale
à un site d’interaction
- cependant il se pose une
difficulté méthodologique =on
séquence très mal les sucres
contrairement aux protéines et à
l’ADN
Néanmoins on arrive globalement à appréhender qu’une 2-O sulfatation, une 6-Osulfatation est nécessaire à
la reconnaissance de ces chaines héparanes sulfate par un facteur de croissance de type FGF2.
De la même manière une 3-O sulfatation est nécessaire dans la reconnaissance d’une molécule de type
antithrombine. A l’inverse si on a un déficit enzymatique de type 2-O transférase on pourra avoir une
anomalie de la signalisation du FGF2.
HS
n = 20 to 100
O
DIVERSITÉ STRUCTURALE DES HÉPARANES SULFATE
N-Ac
OHOO O
OOH
HOOH
COO-
N-SO3-2-O-SO3
-
6-O-SO3-
3-O-SO3-
1) Une information considérable
2) Une séquence = Un site d’interaction
3) Une difficulté méthodologique
Exemples : - 2-O sulfatation et 6-O sulfatation reconnaissance FGF-2
- 3-O sulfatation reconnaissance anti-thrombine
- Déficit en 2-O sulfotransférase : anomalie de la signalisation du FGF-2
Syndécanes :
Les syndécanes sont des protéoglycanes à héparane
sulfate membranaires, présentant également des chaines
chondroitine sulfate. Il existe 4 familles de syndecanes
chez les vertébrés.
Structure :
- un domaine cytoplasmique
- un domaine transmembranaire
- un domaine extracellulaire
domaine cytoplasmique
Domaine court avec 2 régions conservées d’un membre à l’autre de la même
famille : C1 et C2 et une région variable V
Régions conservées :
- C1 : région adjacente à la membrane, impliquée dans la dimérisation
des syndécanes. C1 est capable d’interagir avec de nombreuses
molécules et notamment de se lier avec des protéines IC comme :
ezrine, tubuline ou Src kinase. C1 est identique dans les 4
syndécans
- C2 : présente des sites de liaison PDZ avec des protéines comme :
syntenine, synectine, synbindine, calcium/calmoduline-dépendant
serine proteine kinase SAR kinase
Région variable V : région moins conservée, hétérogène, mais intéressante car
présente un site de liaison PIP2. Cette liaison PIP2 va permettre l’interaction
avec des effecteurs moléculaires de type PKC → le site de liaison PIP2 joue un
rôle important dans la liaison et l’activation de la PKC. Les syndécanes sont
donc des molécules capables d’émettre une signalisation IC
domaine TM
Domaine hydrophobe très conservé. Ce domaine est impliqué dans le
dimérisation des syndécanes
domaine extracellulaire
Ce domaine porte majoritairement des chaines héparanes sulfate mais
également pour certains PG comme syndécane 1 porte des chaines de type
chondroitine sulfate avec une séquence consensus d’attachement de GAGs)
→ce domaine EC est le siège de modifications post-traductionnelles +++. Ce
domaine présente un degré de similitude dans les ectodomaines relativement
éloignés d’un syndécane à un autre.
Il existe aussi 2 autres grandes familles
de PG à héparane sulfate membranaires :
- glypicane (5 membres chez
l’homme → glypicane est une
protéine intrinsèque liée de façon
covalente au feuillet EC de la
membrane plasmique par ancre GPI
donc n’est pas une protéine
transmembranaire)
- βglycane
V : 1 site de liaison PIP2
Régulation de l’expression des syndecannes par les facteurs de croissance
Expression :
SD-1 : tissus épithéliaux et mésenchymateux
SD-2: cellules neuronales et épithéliales
SD-3 : tissu neuronal
SD-4 : ubiquitaire
Régulation de l’expression par des facteurs de croissance :
TNF-alpha SD-2 ↓ SD-1 dans les cellules épithéliales
TGF beta SD-4 ↓ SD-1 dans les cellules épithéliales
FGF2 SD-4 dans les cellules musculaires
SD-4 lors de processus de réparation cellulaire (IDM, affections artérielles)
SD-3 et développement
Pr appréhender la fonction d’une protéine on peut utiliser :
- un KO de gènes in vivo
- une technique in vitro appelée ARN interférence. Cela permet d’éteindre un gène ou d’en diminuer
l’expression : on intercale de petits ARN (de 19 nucléotides) qui vont se fixer sur un gène d’intérêt
→ conséquence : le gène d’intérêt qui aura fixé ces ARN interférents sera soit dégradé soit aura sa
traduction diminuée
Gene Mutant Species Developmental processes affected Signaling
Processes
affected
SD-1 KO Mouse Viable and fertile
slow re-epithalization during wound healing; leukocyte–
endothelial interactions
Wnt1
SD-2 Anti-SD2
oligonucléotidesZebra
-fish
Intersegmental vessel formation VEGF
SD-3 KO Mouse Viable and fertile; feeding behavior; hippocampus-
dependent memory function; muscular dystrophy
HGF, FGF2
SD-4 KO Mouse Viable and fertile; postnatal angiogenesis during wound
healing; focal adhesion formation; sensitivity to infection.
HGF, FGF2,
TNF beta
Syndecans functions in animal models
Expériences : on utilise soit un KO soit des oligonucléotides anti syndécane 2
Résultats : On s’est aperçu que globalement les souris étaient viables et que surtout un certain nombre de
processus de signalisation Wint, EGF, FGF2 étaient perturbés avec un phénotype particulier affecté
Ex : la souris KO syndécane 4 est viable mais présente des problèmes d’angiogénèse, des problèmes au cours
de la réparation tissulaire, des problèmes de formation de contact focaux et des sensibilités aux infections
→ Ce phénotype particulier est lié à un processus de signalisation du HGF, du FGF2 ou du TNFβ affecté
Ces molécules qui lient des ligands EC sont donc susceptibles de jouer un rôle dans la signalisation
cellulaire.
A quoi servent les PG à héparane sulfate ? (mécanismes d’action)
Ex du FGF2
La famille FGF est une famille de facteurs de croissance héparin-binding protéine (protéine monomérique
susceptibles de lier des chaines héparane sulfate). Ces facteurs de croissance interviennent largement dans
l’angiogénèse, dans la réparation tissulaire, dans le développement, dans l’athérosclérose… Classiquement
ce sont des molécules qui vont se lier à des récepteurs de type tyrosine kinase (récepteurs membranaire) mais
également à des chaines héparanes sulfate.
Quelques ligands des héparanes sulfate:
• Cytokines• Chimiokines
• Facteurs de croissance• Morphogènes• Récepteurs
• Molécules d’adhésion• Matrice extracellulaire
• Enzymes• Inhibiteurs• Lipoproteines
• Pathogènes
• Inflammation/Réponse immune
• Prolifération/Différentiation
• Adhésion cellulaire/migration
• Métabolisme/Homéostasie
• Adsorption/Entrée
DIVERSITÉ FONCTIONNELLE DES HÉPARANES SULFATE
> 300 Protéines La plupart des fonctions biologiques
?
Structure de FGF2 :
Dans FGF2 on trouve une région cœur
avec des acides aminés conservés et 12
feuillet béta → on regarde d’un peu plus
près (en rose au niveau du feuillet béta 1-2
et béta 10-11 on trouve des zones
d’interaction avec chaines héparanes
sulfate (liaison à l’héparine Kd = 10-9
M)
→ donc cela implique qu’il existe des
acides aminés impliqués dans la liaison
avec les chaines héparane sulfate. Cela
concerne les acides aminés positifs :
lysines, arginine, histidine (aa basiques)
On cherche la région protéique qui interagit spécifiquement avec les chaines GAG :
Pour identifier les aa qui interagissent avec les chaines GAG on fait de la mutagénèse dirigée, c'est-à-dire
qu’on transforme par ex une arginine en alanine dans la séquence (on change un aa basique par un aa plus
neutre ex alanine), puis on met en contact avec le GAG et si on n’a plus de liaison cela signifie que l’aa était
impliqué dans la liaison.
Technique d’interaction entre 2 protéines ou d’un sucre avec une protéine :
On utilise la résonance plasmonique de surface : on fixe sur une surface d’or une molécule d’intérêt et on
fait passer dans un système de fluide une deuxième molécule pour voir si elles interagissent. Lorsqu’on
bombarde notre puce d’or avec de l’infra rouge, on constate qu’il y a un angle de diffraction et que cet angle
peut varier en fonction de l’interaction ou non de la molécule → cela donne directement le Kd
Modulation de l’activité du FGF par les PG à héparane sulfate
Modulation of activity of fibroblast growth factor (FGF)
by heparan sulfate proteoglycans
(Pool de réserve de FGF-2)
(Complexe de haute
affinité)
(changement de
conformation)
Il existe 2 rôles majeurs de l’interaction FGF2 avec syndecane 4 :
1) présentation de FGF2 à son récepteur Tyrosine kinase : pour qu’il y ait transduction de signal et
présentation optimale du FGF2 à son récepteur membranaire il faut qu’il y ait en amont une liaison à
des chaines glycosaminoglycaniques portées par le syndécane 4 → cela forme un complexe de
haute affinité
Il existe aussi pour le FGF2 des interactions avec des PG de type matriciel qui vont constituer un
pool de réserve de FGF2 qui pourront être libérés à la demande
2) signalisation propre
Signalisation propre
Volk, R. et al. J. Biol. Chem. 1999;274:24417-24424
Syndecan-1, syndecan-4, glypican-1, and syndecan/glypican chimera constructs
SIGNALISATION
Construction de chimères :
On prend l’ADN complémentaire qui code un PG héparane sulfate qui est lié par une ancre GPI (ex
glypicane 1) et on prend l’ADN complémentaire qui code pour le syndécane 4.
On construit au labo 2 chimères c'est-à-dire qu’on obtient un ADN complémentaire qui va se transformer en
protéine qui contiendra soit :
- toute la partie EC du glypicane 1 (ectodomaine) et la partie IC du syndécane → protéine
membranaire
- le domaine EC de syndécane 4 (ectodomaine) et la partie Cterm de la protéine qui correspondra à
l’ancre GPI du glypicane
Une dois cette construction au labo réalisée, on transfecte puis on induit la croissance des cellules avec du
FGF2.
Observations : On remarque que seules les cellules qui ont été transfectées et qui surexpriment le
syndécane 4 ou la protéine chimérique de type glypicane 1 EC/syndécane 4 IC vont avoir une réponse
augmentée au FGF2 en terme de prolifération. Les cellules infectées avec un plasmide qui vont surexprimer
la protéine chimérique syndécane 4 EC et ancre GPI du glypicane 1 ne vont pas proliférer sous FGF2.
Déduction : la partie IC du syndécane 4 est importante dans la signalisation du FGF2
Effet de syndécane :
Volk, R. et al. J. Biol. Chem. 1999;274:24417-24424
Effect of syndecan-1, syndecan-4, glypican-1, and syndecan/glypican chimera construct expression on bFGF-induced growth in vitro
-Only cells expressing S4 and G1-S4 constructs
demonstrated an enhanced responsiveness to FGF2
-Removal of syndecan-4 HS chains also blocked
enhanced FGF2 responsiveness
Horowitz
On construit des mutants de l’ADNc
codant pour le syndécane 4. On délète la
région d’interaction avec les PIP2 dans la
portion variable de la partie ICyt. Cette
région PIP2 est nécessaire à l’interaction
avec PKC
On transfecte ces mutants dans des
cellules endothéliales et on introduit ces
cellules dans un matrigel (MEC
reconstituée)
Dans une MEC reconstituée les cellules
endothéliales vont reformer une structure
qui ressemble à des vaisseaux c'est-à-dire
qu’on aura formation de tube/structure
vasculaire.
Alors qu’avec l’ADN complémentaire codant pour un mutant PIP2- (haut droite) on a des cellules
endothéliales qui expriment une protéine mutée. On ne forme donc pas de tube vasculaire quand on met du
FGF2.
Il y a donc une implication majeure de la zone PIP2 et de l’interaction avec la PKC.
Horowitz et al, J Cell Biol 2002,157
Introduction of syndecan-4 constructs
with a mutated PDZ- or PIP-2binding regions
inhibited FGF-2 but not serum-induced endothelial
ability to form vascular structures on matrigel
1- FGF2 binding to its high affinity tyrosine kinase receptor induces the activation of a phosphatase (PP1/2A)
which is associated with the cytoplasmic tail of syndecan-4 through a PDZ adaptor protein
2- PP1/2A dephosphorylates Ser183 of the syndecan-4 cytoplasmic tail, which is normally maintained
at a high basal phosphorylation level.
3- Dephosphorylation fo syndecan-4 increases its affinity to PIP-2. In turn PIP-2 binding facilitates
the multimerization of syndecan-4. The complex PIP-2-syndecan-4 activates PKC alpha
Il existe une signalisation propre du syndécane 4 qui est un corécepteur du FGF2 même si le récepteur
classique est un récepteur de type tyrosine kinase
Les chimiokines
Nous allons voir le rôle des Protéoglycanes à Héparane Sulfate dans les
chimiokines.
Ce sont des cytokines chimioattractantes jouant un rôle notamment dans
l’inflammation.
- Ce sont des molécules qui vont établir des gradients à la surface d’un endothélium. Par des
mécanismes de type patteming, angiogénèse, diapédèse…, de faire passer des leucocytes à travers
l’endothélium.
- Les cytokines vont guider ces leucocytes à travers un gradient de chimiokines, établi grâce à
l’endothélium qui exprime des protéoglycanes (PG), ce qui permet des liaisons de type héparane
sulfate entre les protéoglycanes et les chimiokines.
- Elles expriment des récepteurs couplés aux protéines G (à 7 domaines transmembranaires). Plus
l’on s’éloigne de la liaison, plus l’action des cytokines est faible.
Endothélium PGP
P
Chimiokine
PGP
P Liaisons de type héparane
sulfate
Famille des CXC :
La principale protéine étant SDF-1α (CXCL12), dont le récepteur est CXCR4, corécepteur du VIH
Famille des CC :
Un représentant important : RANTES dont le récepteur classique est CCR5, autre corécepteur du
VIH
Remarques :
1) une chimiokine est une heparin biding protein
2) une chimiokine peut lier plusieurs récepteurs, et un récepteur peut fixer plusieurs chimiokines (il
s’agit de liaisons avec un système dégénéré)
Elles dépendent
d’un motif conservé
contenant des
cystéines dans la
région N-terminale
4 sous-groupes :
C, CC, CXC, CX3C
Voici les rôles de la liaison des chimiokines aux chaînes à héparane sulfate :
la dimérisation (indispensable pour la fixation de la chimiokine à son récepteur) : il existe une
liaison spécifique des chimiokine à une chaîne héparane sulfate.
GAG dependant binging of SDF1 to SD4
La liaison de SDF-1 aux molécules de syndecan-4 est fortement diminuée par un traitement des protéines
électrotransferées par des heparitinases I et III. Ces données expérimentales démontrent que SDF-1 se lie
directement au syndecan-4 et que cette liaison est, au moins partiellement GAG-dépendante.
Les données expérimentales obtenues
sur des cellules HeLa ont été
complétées par des données apportées
par des expériences de double
marquage en microscopie confocale
et en microscopie électronique.
L’analyse en microscopie confocale
met en évidence un haut niveau de
colocalisation de plus de 75% des
molécules de syndecan-4 et de SDF-1.
Ces données sont confirmées par
microscopie électronique où l’on
retrouve une colocalisation de
molécules de syndecan-4 (petite bille
d’or colloidal de 6 nm) et de SDF-1
(grosse bille d’or colloidal de 15 nm).
Pour rechercher si SDF-1 se lie directement au syndecan-4 sur des cellules HeLa, les
protéoglycannes, enrichis par chromatographie sur DEAE Sephacel sont électrotransférés.
Dans ces conditions, SDF-1 biotinylé se lie à du syndecan-4 qui migre en smear avec une
masse moléculaire apparente de 150-250 kDa alors qu’il ne se lie pas aux autres
protéoglycannes.
Approche en microscopie confocale :
Une expérience a été faite par immunofluorescence indirecte avec un anticorps anti SDC-4 (syndecan 4),chez
la souris, pour mettre en évidence la colocalisation des molécules de syndecan-4 (marquage rouge) et de
SDF1 (marquage vert). La colocalisation se voit par un marquage jaune.
Bien sûr, il faut faire un contrôle isotypique (utilisation de lames sériés : on y pose l’anticorps anti SDC4
(fait chez une souris) et juste à côté dans la manipulation, on y pose un anticorps de la même sous classe
(isotype), utilisé à la même concentration de la même espèce, mais la souris n’a pas été immunisée contre
des cellules humaines, donc elle n’est pas censée reconnaître un antigène humain).
Ainsi, si la manipulation ne montre pas de marquage membranaire, alors on peut confirmer que le
marquage avec un anticorps spécifique est spécifique.
Approche en microscopie
confocale :
La lame fait 100nm de
longueur. Si la colocalisation
est inférieure à 15nm, on
considère que les molécules
sont proches (et donc qu’elles
entrent en interaction l’une
avec l’autre)
Autre approche pour
démontrer cette interaction :
On prend des cellules que
l’on incube avec du SDF en
condition douce non
dénaturante, et on fait une co-
immunoprécipitation
Rappel :
Isoler une protéine d’intérêt à partir d’un lysat cellulaire
Utiliser un Ac spécifique de la protéine d’intérêt
Précipiter le complexe Protéine-Ac avec une forme insoluble de protéines se liant à des anticorps
(ex: Protein G)
Centrifuger la suspension: la protéine d’intérêt est séparée
Ensuite un Western Blot est fait pour révéler l’interaction entre SDF1 et SDC4
Souvent avec du sel on détache SDF1, on récupère le diluat, on le dépose sur un gel et on fait un Western-
Blot, et on a un signal qui correspond au poids moléculaire de CXCR4, car SDF1 se lie sur CXCR4. Avec un
ligand de type SDC4, on a également un signal.
La piste 7 (IgG2a), c’est le contrôle isotypique fait chez la souris, car SDF-1 est aussi un anticorps anti
IgG2a chez la souris. Mais pour la protéine IgG2a, on n’obtient aucun signal. Si ça avait été, le cas, on
n’aurait pas pu conclure sur l’interaction en SDF1 et SDC4.
Autre approche : rôle de SDC4 dans la signalisation de SDF1 (ARN interférent : SiRNA)
Conseil : voir le premier
cours du lundi 17/10
pour mieux comprendre.
On diminue l’expression de SDC4 et on va regarder la transduction du signal dans les cellules humaines
induites par SDF1 (dont une des voies classiques est la MAP kinase). Les cellules non traitées sont
transfectées avec un plasmide vide et on a une phosphorylation de base assez faible. Or les protéines
(p42/p44/MAPK) sont activées lorsqu’elles sont phosphorylées.
Lorsqu’on incube ces cellules transfectées avec un plasmide vide, on a une activation du signal : SDF1 induit
la transduction du signal (car 100% d’expression de SDC4).
Quand on éteint par RNAinterférence (SDC4 DS RNA) l’expression de SDC4 qui passe de 100% à 30%,
alors la cellule répond moins à la signalisation de SDF1
Donc SDC4 joue un rôle dans la signalisation induite par SDF1
Pour ce qui est du contrôle, 2 types :
Utilisation d’un anticorps qui va reconnaître des formes phosphorylées, mais ici on n’a pas le
droit de dire que SDF1 augmente la phosphorylation de p42/p44 par rapport à JNK/SAPK, car on est
en expérimental et on n’est pas sûr de la quantité de protéine qu’on a mis dans chaque « puits ». Pour
s’en assurer on utilise un anticorps dirigé contre les formes totales de p42/p44 puis on fait le
rapport forme phosphorylée/forme totale. Et on voit que l’expression de p42/p44 totales est plus
forte que dans l’expression de JNK/SAPK totales
Contrôle de l’ARN interférent. En amont, on a gardé dans les banques de données que les
oligonucléotides se fixent spécifiquement sur SDC4 et vont éteindre son expression. Néanmoins,
nous sommes en expérimental et les oligonucléotides peuvent se fixer sur d’autres ARNs de manière
non spécifiques. Donc un contrôle de l’ARN interférent est indispensable
Au final, on montre que le SDC4 est un corécepteur de la chimiokine SDF1, qui se lie à CXCR4
d’un côté, à SDC4 de l’autre. SDC4 joue un rôle dans la signalisation de SDF1.
La migration cellulaire
Le SDC4 peut-il jouer un rôle dans les effets biologiques induits par SDF1 ?
1ère
technique : la migration dite « en blessure »
On prend une boîte, dans laquelle on fait pousser nos cellules, et avec un cône de pipette, on enlève toute une
partie de nos cellules au milieu. On attend 24 ou 48 heures (en pratique, il faut éviter de se mettre dans le
temps de doublement des cellules, sinon, c’est la prolifération. Donc se mettre dans un temps pour lequel
elles ne proliféreront pas), et on regarde le fond de migration.
2ème
technique : la chambre de Boyden modifiée (fréquent)
On a une chambre supérieure, qui présente des pores dans lesquels on met des cellules, et en dessous on met
une cellule chimioattractante (SDF1). On attend un certain temps (si possible, inférieur au temps de
doublement des cellules), puis on va compter le nombre de cellules, au microscope, après coloration à
l’hématoxyline.
Remarque :
si on utilise la fibronectine, on dit qu’on est dans un cadre de migration cellulaire
si on utilise une matrice reconstituée (PG, fibronectine…), on parle d’invasion, c’est-à-dire que la
protéine doit a priori sécréter des métalloprotéases (MMP) matricielles.
Ex : on éteint par ARN
interférence l’expression
de SDC4, et on va
regarder la migration
induite par SDF1 en
chambre de Boyden.
Les cellules transfectées avec le plasmide vide ont 100% d’expression et une bonne migration.
Dans les cellules où l’expression de SDC4 est éteinte, la migration est bien réduite.
Donc SDC4 joue un rôle très important dans les effets biologiques induits par SDF1
Cette approche est utilisée dans le travail du développement de thérapies : pour inhiber l’action de SDF1, il
existe des antagonistes de SDF1, le plus connu étant la MD3100 (car SDF1 se fixe sur CXCR4, corécepteur
du VIH), le but étant d’intérioriser le récepteur CXCR4 et empêcher l’entrée de VIH.
Il y a toute un développement de recherches qui ciblent les liaisons de SDF1 avec les chaînes de type
héparane sulfate. Ex : l’utilisation des polymères de Dextran (+/- carboxyméthylées, +/- sulfatées),
mimétiques des glycosaminoglycanes, et capables d’inhiber fortement la migration induite par SDF1.
Il y a un problème, dû à une approche méthodologique difficile : c’est que ces molécules ne sont pas
entièrement spécifiques au jour d’aujourd’hui. Elles peuvent aussi inhiber d’autres interactions (par exemple,
de type FGF2).
Le but de la recherche ici, c’est séquencer spécifiquement les zones d’interaction avec SDF1, pour
développer les mimétiques des glycosaminoglycanes spécifiques (aujourd’hui, le plus spécifique est
l’héparine, avec l’antithrombine).