UNIVERSITE KASDI MARBAH OUARGLA
Faculté des Sciences et Technologie et Sciences de la matière
Département de Génie des Procédés
Mémoire
MASTER ACADEMIQUE
Domaine : Sciences et Techniques
Filière : Génie des Procédés
Spécialité : Analyse et contrôle de qualité
Présenté Par : BOURAS Fatima Zohra et HOUCHI Abdelbassset
Thème
Devant le jury :
Le 23/06/2013
CHAOUCH Noura MAA UKMO Présidente
RAHMANI Zehour MAA UKMO Examinatrice
KENDOUR Zaouia MAA UKMO Encadreur
Année Universitaire : 2012 /2013
ETUDE DE L’ACTIVITE ANTIOXYDANTE
DE LA PLANTES Rumex Vesicarius L
En premier lieu, nous tenons à remercier notre DIEU, notre créateur
pour nous avoir donné la force pour accomplir ce travail.
Nous tenons à exprimer nos vifs remerciements à tous nos professeurs qui
ont contribués à notre formation
Nous désirons exprimer notre profonde et vive reconnaissance à notre
encadreur, Melle
Kendour Zaouia,
Qui a mis toute sa compétence à notre disposition, pour ces directives et
Conseils judicieux et pour son suivi régulier à l’élaboration de
Ce modeste travail.
Nous voudrons aussi exprimer toute notre gratitude et nos remerciements
à tous les enseignants
Existés pendant le travail en laboratoire VPRS
(Laboratoire de valorisation et promotion de ressources sahariennes)
Pour les orientations et les conseils ainsi que le support documentaire
Nous remercions les membres du jury : Mell e
:Rahmani Zehour et
Melle
:Chaouche Noura d’avoir accepté de juger notre modeste travail.
Nous remercions également tous les membres de laboratoire de VPRS
qui nous ont beaucoup aidés à réaliser ce travail dans des bonnes
conditions
Nos derniers remerciements et ce ne sont pas les moindres, vont
À tous ceux qui ont contribué de près ou de loin pour
l’aboutissement de ce travail.
Dédicace A Ceux qui sont les plus chères au monde, nos
parents que dieu protège :
En témoignage de nos profondes affectations. Qu’ils
sachent que ce travail est en partie
Le fruit de leurs soutien ; nous leurs sommes très
reconnaissants. Leurs fiertés à nos
égard aujourd’hui est pour nous la meilleure des
récompenses.
A tous nos frères et toutes nos
Sœurs
Qui sont très chère.
A tous nos amis et à tous ceux Qui nous ont témoigné
leur affectation et leur soutien durant Ces longues
années
Liste des abréviations
A : Absorption.
AEAC : Ascorbique acide équivalent antioxydant capacité.
BHA: Butyl hydroxyanizole.
BHT: Butylhydroxytoluène.
DPPH : 1 ,1-diphényle-2-picrylhydrazyl.
λ max : longueur d’onde.
TCA : Acide trichlorure acétique.
Tris :(hydroxymethyl) aminomethanehydrochloride.
TBHQ : tertiobutyl-hydroxyquinone.
mg/g : milligramme par gramme.
g: gramme.
ml: millilitre.
min : minute.
nm : nanomètre.
μl: microlitre.
UV: Ultra-violet.
l:litre.
FRAP: Ferric Reducing Antioxidant Power.
I%: pourcentage d’inhibition.
IC50 : concentration inhibitrice IC50.
VC : vitamine C ou acide ascorbique
D : nombre de dilution
C : concentration
φ : phase.
m : masse.
0C : degré.
R : rendement.
% : pourcentage.
M : molaire.
mg/ml : milligramme par millilitre.
g/l : gramme par litre.
Liste des tableaux
Tableau I-1 : Classification des composés phénoliques 07
Tableau I-2 : Quelques exemples de coumarines 08
Tableau III-1 : les produits chimiques et les réactifs 21
Tableau III-2 : appareils et instruments 22
Tableau IV-1 : tableau récapitulatif regroupant les rendements des différents extraits 29
Tableau IV-2 : Quantité des phénols totaux dans les extraits 30
Tableau IV-3 : Quantité des flavonoïdes dans les extraits 32
Tableau IV-4: Les valeurs d’AEAC des différents extraits étudiés 33
Tableau IV-5 : les valeurs d’IC50 de différents extraits étudié 36
Liste des figures
Figure I-1 : Structure de base des coumarines. 08
Figure I-2 : Squelette de base des flavonoïdes. 09
Figure I-3 : Structures de quelques classes de flavonoïdes. 10
Figure II-1 : Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de
l’oxygène impliqué en biologie. 14
FigureIII-1: La plante de Rumex vesicarius. 20
Figure III-2 : le protocole d’extraction de différentes phases. 23
Figure III-3 : structure de l'acide gallique. 24
Figure III-4 : Quercétine. 26
Figure IV-1 : histogramme rendement de l’extraction. 29
Figure IV-2 : Courbe d'étalonnage de l’acide gallique. 30
Figure IV-3 : Histogramme de dosage des phénols totaux dans les extraits. 31
Figure IV-4 : Courbe d’étalonnage du Quercétine. 31
Figure IV-5 : histogramme de dosage de flavonoïdes. 32
Figure IV-6 : Courbe d’étalonnage d’acide ascorbique. 34
Figure IV-7 : Courbes représentants le pouvoir réductrice des différents extraits. 34
Figure IV-8 : évaluation de l’activité antioxydant par la méthode de FRAP de différents
extraits. 35
Figure IV-9 : Réaction d’un antioxydant avec le DPPH. 35
Figure IV-10 : Courbes représentants le pouvoir d’inhibition des différents extraits. 37
Figure IV-11 : histogramme représente le pouvoir d’inhibition des différents extraits. 37
Sommaire
Remerciements
Liste des abréviations
Liste des tableaux
Liste des figures
Introduction générale
Partie I : Etude bibliographique
01
Chapitre I : Généralités sur les plantes médicinales
I-1 Historique des plantes médicinales 03
I-2 Domaines d’application des plantes médicinales 04
I-3 Les composés phénoliques 06
I-3-1 Définition 06
I-3-2 Classification 06
I-3-2-1 Les coumarines 07
I-3-2-2 Les flavonoïdes 09
I-3-2-2-1 Flavonoïdes hétérosides 10
I-3-2-2-2 Les flavonoïdes aglycones 10
I-3-2-3 les tanins 10
I-3-2-3-1 Les tanins hydrolysables 11
I-3-2-3-2 Les tanins non hydrolysables 11
I-3-3 Rôle et intérêt des composés 11
Chapitre II : L’activité Antioxydante
II- Les antioxydants 12
II-1 Radicaux libres 12
II-1-1 Définition 12
II-1-2 Origine des radicaux libres 12
II-1-3 Nature des radicaux libres 13
II-1-3-1 Espèces réactives dérivées de l’oxygène (ERO) 13
II-1-3-2 Espèces libres non oxygénées 14
II-2 Antioxydants 15
II-2-1Définition
II-2-2 Mécanisme d’action 15
II-2-3 Utilisation des antioxydants 15
II-2-4 Classification des antioxydants 16
II-2-4-1 Antioxydants synthétiques 16
II-2-4-2 Substances synergiques 16
II-2-4-3 Antioxydants d’origine végétale 16
Partie I : Etude Expérimentale
Chapitre III : Matériel et Méthode
III-1 Matériel végétale 19
III-1-1 Présentation de plante 19
III-1-1-2 Origine et répartition géographique 19
III-1-1-3 Usages 19
III-1-1-4 Botanique 19
III-1-1-5 Ecologie 20
III-1-1-6 Gestion 20
III-1-1-7 Ressources génétiques et sélection 20
III-1-1-8 Perspectives 20
III-2 études chimiques 21
III-2-1 Appareils et Produits 21
III-2-1-1 Produits 21
III-2-1-2 Appareils 22
III-2-2 Méthode d'extraction 22
III-2-3 Analyse quantitative des composés phénoliques 24
III-2-3-1 Dosage des composés phénoliques totaux 24
III-2-3-2 Dosage de flavonoïdes 25
III-3 Évaluation de pouvoir antioxydant 27
III-3-1 le pouvoir réducteur des composés phénoliques (Reducing Power Assay) 27
III-3-2 Effet scavenger du radical DPPH 28
Chapitre IV : Résultats et discussion
IV-1 Détermination de rendement d’extraction 29
IV-2 Quantification des composés phénoliques 30
IV-2-1 Dosage des composés phénoliques totaux 30
IV-2-2 Dosage des flavonoïdes 31
IV-3 L’étude du pouvoir antioxydant 33
IV-3-1 le pouvoir réducteur des composés phénoliques ( Reducing Power Assay) 33
IV-3-2 Effet scavenger du radical DPPH 35
Conclusion
Références bibliographiques
Introduction générale
1
Introduction générale
A l’origine, la nature constituée d’êtres végétaux, servait d’alimentation aux animaux et aux
hommes peuplant la terre. Mais à côté de cette fonction nutritionnelle, l’homme découvrit
bien d’autres fonctions que pouvaient lui procurer les plantes, notamment le pouvoir de
guérison. En effet cette faculté de guérison des plantes fut connue longtemps de nos ancêtres
depuis les temps reculés. Elle deviendra plus tard la médecine traditionnelle avec toutes les
avancées notoires qu’on peut lui attribuer.
L’homme est toujours émerveillé par la beauté de leurs couleurs, la forme de leurs fleurs ou
de leurs fruits. Il les considère comme des compagnes fidèles vers lesquelles il se retourne en
raison des bienfaits qu’elles procurent et pour leur grande utilité, ce sont de vraies panacées et
de véritables pharmacies naturelles. [1]
On a longtemps employé des remèdes traditionnels à base de plantes sans savoir à quoi étaient
dues leurs actions bénéfiques, il est difficile de définir les molécules responsables de l’action
pharmacologique. [2]
Actuellement plus de 80 % de la population africaine ont recours aux drogues faites
Essentiellement de matières végétales qui poussent autour de leur ville. En plus dans le
monde, près de 25% des prescriptions sont à base de plantes et 60 à 70% des médicaments
antibactériens et anticancéreux sont des substances d’origine naturelle. [3]
Pour le besoin de la présente étude, nous avons choisi l’Rumex vesicarius.L parmi les plantes
médicinales qui est le moins fréquemment employé dans notre pays à cause de l’ignorance de
sa valeur nutritionnelle et médicale. Les extraits de cette plantemédicinale sont utilisés
traditionnellement comme anti abcès et l’acnée, anti constipation et anti-ictère.Notre travail
s’inscrit dans le cadre d’une contribution à une meilleure connaissance de cette plante
médicinale de la région de El-Goléa et de découvrir certains constituants chimiques et l’étude
l'activité antioxydante, les composes phénoliques totaux, les flavonoïdes et l’étude de
l'activité antioxydante des certaines extraits.
Dans ce présent travail, nous avons fixé les objectifs suivants :
Analyse quantitative et du contenu en polyphénols et en flavonoïdes des deux extraits
de la plante (fraction chloroformique et d'acétate d'éthyle).
Etude de l’activité antioxydante par la méthode réduction de fer.
Introduction générale
2
Evaluation du pouvoir piégeur (scavenger) des extraits vis-à-vis d’un radical libre
relativement stable (DPPH).
Chapitre I Généralités sur les plantes médicinales
3
I-1 Historique des plantes médicinales :
Des plantes médicinales ont été employées pendant des siècles comme remèdes pour les
maladies humaines parce qu'elles contiennent des composants de valeur
thérapeutique.Récemment, l'acceptation de la médecine traditionnelle comme forme
alternative de santé etle développement de la résistance microbienne aux antibiotiques
disponibles a mené des auteurs à étudier l'activité antimicrobienne des plantes médicinales et
en raison d'une conscience croissante des effets secondaires négatifs infligés par les
droguesmodernes, beaucoup cherchent les remèdes normaux sans effets secondaires et bien
sûr coût élevé de médecine conventionnelle.
Depuis toujours les plantes ont constitué la source majeure de médicaments grâce à la richesse
de ce qu'on appelle le métabolisme secondaire. Cependant, l'homme n’à découvert les vertus
bénéfiques des plantes que par une approche progressive, facilitée par l'organisation des
rapports sociaux, en particulier à partir du néolithique. L'observationliée à l'expérience et la
transmission des informations glanées au cours du temps font que certains hommes
deviennent capables de poser un diagnostic, de retrouver la plante qui soigneet finalement de
guérir le malade.
Dans les civilisations chinoise, indienne (médecine ayurvédique) ou aztèque, on trouve la
trace d'utilisations médicinales très anciennes. Le premier livre de matière médicale, le Shen
Nung Ben Caojing, futrédigé vers 2900 avant J.-C. 4000 ans avant J.-C., les populations
babyloniennes et sumériennes utilisaient les plantes pour se soigner : 600 tablettes d'argiles
mentionnent 1000plantes pour leurs vertus curatives et plus de 800 remèdes sont décrits par
les Egyptiens. Le soin de la peau a commencé 3.000 ans avant naissance du Christ,quand les
Egyptiens ont enregistré en forme hiéroglyphique le soin de la peau sur des peintures de mur
de temple.
Les grands médecins grecs, dont le plus célèbre est Hippocrate, utilisaient couramment les
narcotiques, les laxatifs ou des émétiques (vomitifs). Théophraste classe les plantes dans son
ouvrage Historia plantarum.
A l'apogée de l'empire arabe (dont les frontières allaient de l'Inde à l'Espagne), tous les
documents écrits furent réunis à Bagdad dans la plus grande bibliothèque de l'époque. Les
Arabes avaient aussi leurs spécialistes en médecine et en pharmacie : AbuBakr al-Razi ou
Rhazès (865-925), fut l'un des grands médecins de son temps et aussi le précurseur de la
Chapitre I Généralités sur les plantes médicinales
4
psychothérapie. Il fut suivi par Ibn Sina ou Avicenne (980-1037) qui écrivit le "Canon de la
médecine". Ce livre servira de base à l'enseignement de la médecine dans les universités de
Louvain et de Montpellier jusqu'aux environs de 1650. Ibn al Baytar (1197-1248) rédigea le
très complet Somme des Simples : ce livre contenait une liste de 1400 préparations et plantes
médicinales dont un millier était connues des auteurs grecs. [4]
I-2 Domaines d’application des plantes médicinales :
Les substances naturelles issues des végétaux ont des intérêts multiples mis à profit dans
l’industrie : en alimentation, en cosmétologie et en pharmacie. Parmi ces composés on
retrouve dans une grande mesure les métabolites secondaires qui se sont surtout illustrés
enthérapeutique. La pharmacie utilise encore une forte proportion de médicaments d’origine
végétale et la recherche trouve chez les plantes des molécules actives nouvelles, ou des
matières premières pour la semi synthèse.
Il y a eu donc un réveil vers un intérêt progressif dans l'utilisation des plantes médicinales
dans les pays développés comme dans les pays en voie de développement, parceque les
herbes fines guérissent sans effet secondaire défavorable. Ainsi, une recherche de nouvelles
drogues est un choix normal. Utilisation
-en médecines en tant que médicament pour l’homme ; exemple :
*en urologie, dermatologie, gastrites aigues, toux, ulcères d’estomac, laxatifs,
*sommeil et désordres nerveux.
*systèmes cardiovasculaires, ex : Flavoce est un médicament constitué par la flavonenon
substitué en combinaison avec la rutine et isoquercetine est utile dans le traitement de
l’athérosclérose.
*drogues immunostimulantes,antispasmodiques et anti-inflammatoires (Melaleucaalternifolia,
Echinaceaangustifolia, Chrysantenumparthenium, Achilleamillefolium,...etc.).
*contre le diabète (Azadirachtaindica).
Chapitre I Généralités sur les plantes médicinales
5
*les maladies du stress, des activités antioxydantes ; tels le thé noir, le thé vert et lecacao sont
riches en composé phénoliques, parmi lesquels theaflavine, le resveratrol, le gallate et
epigallocathechine procyanidine, très étudié en raison de leur rôle en tant qu’agent
chemopreventifs basés sur leurs capacités antioxydantes. D’excellentes capacités à inhiber les
réactions oxydatives ont été mises en évidence pour les huiles essentielles de romarin, sauge,
thym, origan, sarriette, clou de girofle, gingembre et curcuma.
*Activité antimicrobienne, antivirale, antiparasitaire: Les produits naturelsdes plantes depuis
des périodes très anciennes ont joué un rôle important dans la découverte de nouveaux agents
thérapeutiques ex: la quinine obtenue à partir du quinquina "Cinchona" a été avec succès
employée pour traiter le malaria , l’arbre de thé (Melaleucaalternifolia) est renommé pour ses
propriétés :antibactériennes, anti-infectieux, antifongiques, antivirales , aussi comme antiviral
(Azadirachtaindica,Aloevera,Andrographispaniculata, Withaniasomnifera,
Astragalusmembranaceus, Curcuma longa…etc.). mais aucune plante n’est aussi efficace que
les médicaments antirétroviraux pour arrêter la réplication du VIH, antibacterienne
(Azadirachtaindica), antifongiques (Adenocalymaalleaceum, Allium ampeloprasum, Allium
ramosum, Allium sativum,Tulbaghiaviolacea, Capsicumannuum, Capsicumchinense,
Capsicumfrutescens).
-En Agriculture exemple : l'arbre Azadirachtaindica, qui se développe dans tout le
subcontinent indien, est une des plantes médicinales les plus importantes au Bangladesh, de
12 à 18 mètres de hauteur avec un périmètre atteignant jusqu'à 1,8 à2,4 mètres. Les huiles de
cet arbre ont des utilisations dans l'agriculture dans le contrôle de divers insectes et nématodes
(vers parasites).
-En alimentation
Assaisonnements, des boissons, des colorants et des composés aromatiques. Les épices et les
herbesaromatiques utilisées dans l’alimentation sont pour une bonne part responsable des
plaisirs de la table, considérée comme condiments et aromates.La popularité des épices et
herbes aromatiques a été et reste très liée à leurs propriétés organoleptiques. La notion de
flaveur des épices et aromates recouvre l’ensemble des perceptions olfacto-gustatives. Ces
perceptions résultent de stimuligénérés par une multitude de composés organiques dont
certains sont volatils et constituent ce qu’on appelle en général l’huile essentielle, les autres
non volatils,sont plus particulièrement responsables de la saveur et de la couleur.
Chapitre I Généralités sur les plantes médicinales
6
-En cosmétique
Des produits de beauté, parfums et articles de toilette, produits d’hygiène.
-Des suppléments diététiques. [4]
I-3 Les composés phénoliques :
I-3-1 Définition :
Les composants phénoliques sont des métabolites secondaires caractérisés par la présence
d’un cycle aromatique portant des groupements hydroxyles libres ou engagés avec des
glucides.
Ils sont présents dans toutes les parties des végétaux (racines, tiges, feuilles, fleurs, pollens,
fruits, graines et bois) ; et sont impliqués dans de nombreux processus physiologiques comme
la croissance cellulaire, la rhizogénèse, la germination des graines et la maturation des fruits.
Les principales classes des composants phénoliques sont les acides phénoliques (acide
caféique, acide hydroxycinnamique, acide ferulique, acide chlorogenique…), les flavonoïdes,
les tanins, et les coumarines.
Les composants phénoliques sont des molécules biologiquement actives, ils sont largement
utilisés en thérapeutique comme vasoconstricteurs, anti-inflammatoires, inhibiteurs
enzymatiques, antioxydants et antiradicalaires, antimicrobiens. [5]
I-3-2 Classification :
Le terme de composés phénoliques couvre un groupe très vaste et diversifié de produits
chimiques. Ces composés peuvent être classés dans un certain nombre de façons.Harborne et
Simmonds (1964) ont classé ces composés dans les groupes en fonction du nombre d'atomes
de carbone dans la molécule.
Chapitre I Généralités sur les plantes médicinales
7
Tableau I-1 : Classification des composés phénoliques
Structure Classe
C6 Phénols simple
C6-C1 Acides phénoliques et composés dérivés
C6-C2 Acétophénone et acides phénylacétiques
C6-C3 Acides cinnamiques, coumarines, isocoumarines,
chromones
C15 Flavanols, flavonones, anthocyanines et anthocyanidines
C30 Biflavonyles
C6– C1– C6,C6– C1– C6 Benzophénones, xanthones et stilbéne
C6, C10, C14 Quinones
C18 Bétacyanines
Lignanes ,neolignanes Dimères ou oligomères
Lignine Polymères
Tanins Condensé et hydrolysable
Une autre classification a été utilisée par Swain et Bate-Smith(1962). Ils ont regroupé les
phénols dans les catégories "commune" et "moins fréquent". Ribéreau-Gayon (1972) a
regroupé les phénols en trois familles comme suit:
1. Phénols largement distribués - omniprésente à toutes les plantes, ou de importance dans une
usine spécifique
2. Phénols qui sont moins largement distribués - nombre limité de composés connus
3. Constituants phénoliques présents dans les polymères. [6]
I-3-2-1 Les coumarines :
Elles sont issues du métabolisme de la phénylalanine via un acide cinnamique, l’acide
P-coumarique.
Les coumarines libres sont solubles dans les alcools et les solvants organiques tels que l’éther
ou les solvants chlorés dans lesquels ils sont extractibles. Les formes hétérosidiques sont plus
ou moins solubles dans l’eau. Elles ont un spectre UV caractéristique, fortement influencé par
Chapitre I Généralités sur les plantes médicinales
8
la nature et la position des substituants. En lumière ultra-violette, les CCM présentent des
tâches dont la coloration varie du bleu au pourpre en passant par le jaune.
Les coumarines sont cytotoxiques, antivirales, immunostimulantes, tranquillisantes,
vasodilatatrices, anticoagulantes (au niveau du cœur), hypotensives ; elles sont également
bénéfiques en cas d’affections cutanées.
L'odeur de foin fraîchement coupé de la coumarine est très utilisée en parfumerie .Elles est
aussi utilisée dans les produits cosmétiques. [7]
Figure I-1 : Structure de base des coumarines
Tableau I-2 : Quelques exemples de coumarines
R1 R2 R3
Coumarine non phénolique H H H
Ombelliférone H OH H
Herniarine H OCH3 H
Esculétol OH OH H
Scopolétol OCH3 OH H
Scopanone OCH3 OCH3 H
Fraxétol OCH3 OCH3 OH
OO
R3
R2
R1
Chapitre I Généralités sur les plantes médicinales
9
I-3-2-2 Les flavonoïdes :
Les flavonoïdes désignent une très large gamme de composés naturels appartenant à la famille
des polyphénols.
Ces molécules sont considérées comme des pigments quasiment universels des végétaux ;ils
sont responsables de la coloration des fleurs, des fruits et parfois des feuilles. Ils existent le
plus souvent à l’état naturel sous forme d’hétérosides.
Les flavonoïdes sont des dérivés benzo-γ-pyran. Leur structure de base est celle d’un
diphénylpropane à 15 atomes de carbone (C6-C3 -C6), constitué de deux noyaux aromatiques
(ou anneaux) que désignent les lettres A et B, reliés par un hétérocycle oxygénés, qui désigne
la lettre C.
La classe des flavonoïdes comporte à elle seule plus de 4000 substances qui ont été isolées et
identifiées à partir des milliers des plante (Forkmann et Martens, 2001), qu’endivise en
plusieurs catégories : Les flavones, les flavonols et les dihydroflavonols, les isoflavonoïdes,
les biflavonoides, les flavanones, les flavanols, les flavanediols(leucocyanidines), les
anthocyanidines, les chalcones et les dihydrochalcones, les aurones. [5]
Figure I-2 :Squelette de base des flavonoïdes.
Chalcone Aurone
O
O
O
O
O
2
3
45
7
6
8
4'
5'
6'
2'
3'
A
B
C
Chapitre I Généralités sur les plantes médicinales
10
Isovlavonol Isoflavone
Figure I-3 :Structures de quelques classes de flavonoïdes.
I-3-2-2-1 Flavonoïdes hétérosides : la partie osidique peut être mono, di ou
trisaccharidique. En général, les hétérosides sont hydrosolubles et solubles dans les alcools,
bon nombre d’entre eux ont une hydrosolubilité plutôt faible (rutoside, hespéroside).
I-3-2-2-2 Les flavonoïdes aglycones : Les génines sont, pour la plupart, solubles dans les
solvants organiques apolaires.les lipophiles des tissus superficiels des feuilles (ou des frondes)
sont directement extraits par des solvants moyennement polaires (dichlorométhane) ; il faut
ensuite les séparer des cires et des graisses extraites simultanément (on peut certes laver
d’abord àl’hexane, mais la sélectivité de ce solvant n’est pas absolue) [6].
I-3-2-3 les tanins :
Les tanins sont très répandus dans le règne végétal, ils sont particulièrement abondants chez
les Conifères, les Fagacée, les Rosacée. Tous les organes végétaux peuvent en renfermer
(l’écorce, le bois, les feuilles, lesfruits, les racines, les graines). Les tanins sont présents dans
une variété de plantes utilisées dans l’alimentation notamment les céréales et les légumineuses
et les fruits [5] Ils ont la propriété de précipiter les protéines (fongiques ou virales) et les
métaux lourds. Ils favorisent la régénération des tissus et la régulation de la circulation
veineuse, tonifient la peau dans le cas des rides. Deux groupes de tanins différents aussi bien
par leur structure que par leur origine biogénétique sont distingués : les tanins hydrolysables
et les tanins vrais. [7]
O OH
O
O
O
Chapitre I Généralités sur les plantes médicinales
11
I-3-2-3-1 Les tanins hydrolysables :
Les tanins hydrolysables sont des esters du glucose et d’acides phénols que sont l’acide
gallique (tanins galliques) et l’acide éllagique (tanins éllagiques). Leurs polymères sont
appelés des tannoïdes. Ils sont caractéristiques des Angiospermes dicotylédones.
I-3-2-3-2 Les tanins non hydrolysables :
Les tanins vrais, non hydrolysables sont des polymères de flavonols (catéchols) et de
proanthocyanidols qui donnent par ébullition avec les acides minéraux dilués des composés
insolubles amorphes et de couleurs rouges appelés phlobaphènes ou rouge de tanins. [7]
I-3-3 Rôle et intérêt des composés phénoliques :
Le rôle des composes phénoliques est maintenant reconnu dans différents aspects de la vie de
la plante et dans l'utilisation que fait l'homme des végétaux. Ils peuvent en effet intervenir:
Dans certains aspects de la physiologie de la plante (lignification. régulation de la
croissance, interactions moléculaires avec certains microorganismes symbiotiques ou
parasites...).
Dans les interactions des plantes avec leur environnement biologique et physique
(relations avec les bactéries, les champignons, les insectes, résistance aux UV), soit
directement dans la nature soit lors de la conservation après récolte de certains
végétaux.
Dans les critères de qualité (couleur, astringence, amertume, qualités nutritionnelles...)
qui orientent les choix de l'homme dans sa consommation des organes végétaux
(fruits, légumes, tubercules...) et des produits qui en dérivent par transformation.
Dans les variations de certaines caractéristiques des végétaux lors des traitements
technologiques (préparation des jus de fruits, des boissons fermentent...) pendant
lesquels apparaissent fréquemment des brunissements enzymatiques qui modifient la
qualité du produit fini.
Dans la protection de l'homme vis-à-vis de certaines maladies en raison de leur
interaction possible avec de nombreuses enzymes et de leurs propriétés antioxydantes.
[8]
Chapitre II L’activité Antioxydante
12
II- Les antioxydants :
II-1 Radicaux libres :
II-1-1 Définition :
Un radical est une molécule ou un fragment moléculaire qui contient un électron (ou plus)
non apparié. De par sa structure particulière, il a tendance à attirer les électrons d’autres
atomes et molécules pour gagner sa stabilité. Plusieurs éléments peuvent être à l’origine de
radicaux libres. Les sources des radicaux libres sont nombreuses. [9]
II-1-2 Origine des radicaux libres :
Ils sont produits par divers mécanismes physiologiques (Figure II-1) afin de détruire des
bactéries au sein des cellules phagocytaires (macrophages, polynucléaires) ou pour réguler
des fonctions cellulaires létales telle la mort cellulaire programmée ou apoptose.
Toutefois, au contact entre l'oxygène et certaines protéines du système de la respiration, une
production d'anions superoxydes se produit lors du fonctionnement de la chaîne respiratoire
mitochondriale.
Des sources importantes de radicaux libres sont les mécanismes de cycles redox que produit
dans l’organisme l'oxydation de molécules comme les quinones. Ce cycle redox a lieu soit
spontanément, soit surtout lors de l'oxydation de ces composés au niveau du cytochrome
. Les rayonnements UV sont capables de générer des radicaux libres et les particules inhalées
(amiante, silice) sont aussi des sources de radicaux libres.
L'ingestion d'alcool est suivie de la formation de radicaux libres selon divers mécanismes,
également des antibiotiques, des anticancéreux L’infection au VIH a pour effet d’accroître la
production de radicaux libres dans l’organisme. [4]
Chapitre II L’activité Antioxydante
13
II-1-3 Nature des radicaux libres :
II-1-3-1 Espèces réactives dérivées de l’oxygène (ERO) :
L’oxygène doit sa grande réactivité à sa structure particulière. En effet, il possède deux
électrons célibataires non appariés sur sa couche orbitale externe. Cette molécule est
essentielle au bon Fonctionnement de l’organisme. [4]
a- Ion superoxyde : -O2.
L’ion super oxyde -O2.est un dérivé très réactif de l’oxygène, relativement stable, il n’est
pas très toxique pour l’organisme, mais il est à l’origine de cascades de réactions
conduisant à la production de molécules très nocives. [9]
b- Radical libre hydroxyle : (OH.)
Le radical libre hydroxyle (OH.) est très réactif. Il peut réagir avec de nombreuses molécules
comme l’ADN, les glucides, les nucléotides, les protéines et être à l’origine de lésions de
nécrose. C’est un dérivé de l’ion super oxyde. [9]
c- Oxygène singulet: 1O2
Lorsque de l’énergie est apportée à l’oxygène, celui-ci passe à l’état singulet qui représente la
forme activée. C’est une forme très énergétique de grande réactivité qui peut oxyder de
nombreuses molécules. Il est formé à partir de l’ion superoxyde selon la réaction suivante :
.O-O
.
1O2 (sous l’action de la lumière). [9]
Chapitre II L’activité Antioxydante
14
Figure II-1 : Origine des différents radicaux libres oxygénés et espèces réactives de
l’oxygène impliqué en biologie [4]
II-1-3-2 Espèces libres non oxygénées :
Les espèces libres non oxygénées sont les produits des réactions de certaines molécules avec
les espèces réactives dérivées de l’oxygène.
Ils peuvent à leur tour réagir avec d’autres molécules et être à l’origine de la multiplication
des réactions d’oxydation et de la propagation de dommages oxydatifs. Nous citerons, par
Exemple :
Les acides gras peroxydés, résultats de l’action des espèces oxygénées sur les membranes
biologiques.
Les fractions protéiques, les acides aminés et les acides nucléiques peuvent aussi réagir avec
les ERO générant des molécules réactives et nocives. [9]
1/2 O2 O2
Oxygène
NOO2
HOCl
Monoxyde d'azoteAnion super oxyde
peraxynitriteRadical hydroxyle
Nitration desproteines
Activationdes cascadesde kinases
Oxydationdes proteines
Peroxydationlipidique
Oxydation del' ADN
Arginine
Peroxyded'oxygène
Fe3+
Cycles redoxNADPH oxmitochoderie
Superoxydedismutases
myéloperoxidase
Fe2+
Cl-
OH
H2O2
Oxygène singulier
Lumière UV Oxydases
ONOO
Chapitre II L’activité Antioxydante
15
II-2 Antioxydants :
II-2-1 Définition :
Les antioxydants sont des composés chimiques capables de minimiser efficacement les
rancissements, retarder la peroxydation lipidique, sans effet sur les propriétés sensorielle et
nutritionnelle du produit alimentaire. Ils permettent le maintien de la qualité et d’augmenter la
durée de conservation du produit
En outre, l’antioxydant alimentaire idéal, doit être soluble dans les graisses, efficace à faible
dose, et non toxique, n’entraine ni coloration, ni d’odeur, ni saveur indésirable, résistantaux
processus technologiques, il est stable dans le produit fin. [10]
II-2-2 Mécanisme d’action :
D’une manière générale, un antioxydant peut empêcher l’oxydation d’un autre substrat en
s’oxydant lui-même plus rapidement que celui-ci. Un tel effet résulte d’une structure de
donneurs d’atome d’hydrogène ou d’électrons souvent aromatiques cas de dérivés du phénol.
En plus leurs radicaux intermédiaires sont relativement stables du fait de la délocalisation par
résonance et par manque de positions appropriées pour être attaqué par l’oxygène
moléculaire.
Les antioxydants sont en fait des agents de prévention, ils bloquent l’initiation en complexant
les catalyseurs, en réagissant avec l’oxygène, ou des agents de terminaison capables de dévier
ou de piéger les radicaux libres, ils agissent en formant des produits finis non radicalaires.
D’autres en interrompant la réaction en chaine de peroxydation, en réagissant rapidement avec
un radical d’acide gras avant que celui-ci ne puissent réagir avec un nouvel acide gras. Tandis
que d’autres antioxydants absorbent l’énergie excédentaire de l’oxygène singulet pour la
transformer en chaleur. [10]
II-2-3 Utilisation des antioxydants :
Dans l'industrie chimique : pour éviter le durcissement du caoutchouc ou en
métallurgie pour protéger les métaux de l’oxydation.
Dans l'industrie agro-alimentaire : pour éviter le rancissement des corps gras.
Dans l'industrie teinturerie : pour éviter l'oxydation des colorants au soufre ou des
colorants de cuve lors de la teinture. [9]
Chapitre II L’activité Antioxydante
16
II-2-4 Classification des antioxydants :
Les antioxygènes sont classés dans trois catégories différentes :
Les antioxydants synthétiques.
Les substances synergiques.
Les antioxydants d’origine végétale. [9]
II-2-4-1 Antioxydants synthétiques:
Parmi les antioxydants phénoliques de synthèse qui sont autorisés dans certains aliments : le
BHT 321 (3,5-ditertiobutyl-4-hydroxytoluéne), BHA 320 (3-tertiobutyl-4-hydroxyanisole),
sont l’un et l’autre soluble dans les lipides et résistent bien à la chaleur. Ils ont une action
synergique, ils présentent l’inconvénient d’avoir une odeur désagréable et s’évapore
rapidement. Le TBHQ (tertiobutyl-hydroxyquinone) est moins soluble dans les graisses et le
PG (gallate de propyle) à l’avantage d’être relativement soluble dans l’eau, mais
l’inconvénient d’être peu soluble dans les lipides, peu résistant à la chaleur et de donner avec
le fer des sels de couleur foncée. Le nitrite présent des propriétés anti oxydantes, il peut aussi
former des nitrosamines cancérigènes. Les chélateurs de métaux utilisés et plus efficaces sont
les polyphosphates et les dérivés d’acide citrique. [10]
II-2-4-2 Substances synergiques :
Ce sont des molécules qui améliorent l’action de certains antioxydants. Ce qui se traduit
souvent par un accroissement de la période de protection, parmi eux se trouvent : Les acides
lactique, tartrique et ortho phosphorique et leurs sels de sodium, potassium ou calcium. Leurs
propriétés peuvent s'expliquer par un effet chélatant de métaux comme le fer ou le cuivre,
dont on connaît bien l'effet pro-oxydant à faible dose. Cependant, ce n'est peut-être pas la
seule explication, car plusieurs de ces produits sont d'assez mauvais chélatants. [9]
II-2-4-3 Antioxydant d’origine végétale :
Les plantes constituent des sources très importantes d’antioxydants. Les antioxydants naturels
dont l’efficacité est la plus reconnue aussi bien dans l’industrie agroalimentaire que pour la
santé humaine sont : les tocophérols, les caroténoïdes et les polyphénols. [9]
Chapitre II L’activité Antioxydante
17
a- Tocophérols :
La grande stabilité des huiles végétales, dans les conditions d’oxydation, est due à la présence
d’un taux élevé d’antioxydants naturels dont les plus importants sont les tocophérols qui se
présentent sous quatre formes isométriques : α, β, δ et γ. Les tocophérols protègent contre
l’oxydation naturelle des acides gras, en particulier les acides gras polyinsaturés (AGPI). Ont
signalé qu’une molécule de tocophérol peut protéger 103 à 106 molécules d’AGPI. [9]
Exemple de tocophérol :
La vitamine E :
.La vitamine E est un antioxydant majeur liposoluble. C’est un composé amphiphile, capable
de s’insérer dans les membranes cellulaires : globules rouges, cellules endothéliales, cellules
musculaires, neurones (c’est le seul antioxydant du système nerveux central).
Il existe dans la nature plusieurs dérivés de la vitamine E à activités différentes (α-, β-, γ -, δ-
tocophérol, tocotriénols, …). Ils sont différenciés par les substituants du noyau chromanol
(noyau benzyle associé à un hétérocycle à six carbones substitués par un hydroxyle et par une
chaine latérale ramifiée saturée s’il s’agit de tocophérol ou insaturée s’il s’agit de
tocotriénols).
b- Caroténoïdes :
Les caroténoïdes sont, avec la chlorophylle et les anthocyanes, les pigments les plus répandus
dans la nature. A ce jour, plus de 600 caroténoïdes ont été identifiés, mais seule une
quarantaine est retrouvée régulièrement dans l’alimentation humaine. Une trentaine de
caroténoïdes et de leurs métabolites a été identifiée dans le plasma et les tissus humains, mais
6 caroténoïdes sont majoritaires : le β-carotène, le lycopène, la lutéine, la β-cryptoxanthine,
l’α- Carotène, et la zéaxanthine. [9]
Le plus important et le plus connu des caroténoïdes est le β-carotène. Il a longtemps été étudié
pour son activité de provitamine A. Cependant, tous les caroténoïdes ne peuvent pas être
convertis en vitamine A. Ils intéressent de plus en plus les chercheurs pour leur pouvoir
antioxydant que n’a pas la vitamine A.
Les caroténoïdes peuvent agir en tant qu’antioxydants selon plusieurs mécanismes:
Chapitre II L’activité Antioxydante
18
Ils sont capables de bloquer les chaînes de réactions radicalaires, selon les équations suivantes
:
BC + ROO.
BC.
BC. + O2
BC-OO
.
BC + ROO.
Produits inactifs BC : βcarotène
Chapitre III Matériel et Méthode
19
III-1 Matériel végétale :
III-1-1 Présentation de plante :
Rumex vesicarius L.
Règne : plantae
Division : Magnoliophyta
Classe : Magnoliopsida
Ordre : Caryophyllale
Famille : Polygonacée
Genre : Rumex
Espèce : Rumex vesicarius
Noms vernaculaires : Sorrel, Bladder dock, Rosy dock
III-1-1-2 Origine et répartition géographique
En Afrique, on trouve Rumex vesicarius dans les régions sèches Mauritanie et du
Mali jusqu'au Soudan, l'Ethiopie et la Somalie en, dehors de l’Afrique il est présent de la
méditerranée jusqu'en Inde. On a parfois essayé de le cultiver avec succès dans des zones
humides par ex : en Tanzanie. Dans d'autres régions, par ex. en Australie, il est devenu un
adventice difficile à éradiquer depuis son introduction. [11]
III-1-1-3 Usages
Dans plusieurs régions du Sahara et du Sahel, Rumex vesicarius est consommé
comme légume, par ex. en Mauritanie, au Maliet au Soudan, en Inde, il est considéré comme
aliment de famine et les feuilles sont d’abord, bouillies. Il est brouté par le bétail. En soude
d'Alger Les racines de Rumex permettent de fabriquer un extrait qui, non dilué, permettra de
traiter en pulvérisation les concombres, les pommiers et la mâche contre l'oïdium. [11]
III-1-1-4 Botanique
Plante herbacée annuelle ou vivace. Buissonnante, rhizomateuse, atteignant 50 cm de
haut fortement ramifiée à partir de la base, avec de jeunes tiges vertes herbacées de venant
brunes et ligneuses avec l'âge. Feuilles alternes, simples ; ochréa en entonnoir« atteignant 8
mm de long ; pétiole environ aussi long que le limbe ; limbe triangulaire à oblong-
triangulaire, atteignant 7 cm x 4 cm, cunéiforme à tronqué à la base, glabre mais avec de
petites verrues sur toute sa surface. Inflorescence : panicule dense axillaire ou terminale.
Chapitre III Matériel et Méthode
20
Fleurs bi• sexuées ou mâles ; tépales 6, les 3 intérieurs cordés, d’environ 3 mm de long lors de
la floraison, s’élargissant ٠ 2 cm chez le fruit et montrant alors de spectaculaires veines
rouges en réseau. 2 des tépales de chaque fleur munis d'un tubercule (veine médiane enflée).
Fruit : nucule trigone de 3-5 mm de long, brune. [11]
Le genre Rumex comprend environ 200 espèces nombre d'entre elles étant originaires des
régions tempérées de l’hémisphère nord. [11]
III-1-1-5 Ecologie
Rumex vesicarius pousse dans des zones sèches parmi les pierrailles, sur des pentes
herbeuses ou caillouteuses, du niveau de la mer jusqu’à 1150 m d’altitude. [11]
III-1-1-6 Gestion
Rumex vesicarius est récolté dans la nature et n’
est pas cultivé. Parfois il est devenu un
adventice gênant. [11]
III-1-1-7 Ressources génétiques et sélection
Rumex vesicarius est répandu et n’est pas menacé d'érosion génétique. Une collection
importante de ressources génétiques est conservée à Gâtersleben (Allemagne). [11]
III-1-1-8 Perspectives
Rumex vesicarius restera un légume intéressant pour les régions sèches où d’autres aliments
sont rares. Il faut mener des recherches pour évaluer sa valeur nutritionnelle. [11]
Figure III-1:La plante de Rumex vesicarius
Chapitre III Matériel et Méthode
21
III-2 études chimiques :
III-2-1 Appareils et Produits :
III-2-1-1 Produits : Tableau III-1 : les produits chimiques et les réactifs
Produits Propriétés
Méthanol.(CH3-OH) M=32.04 g/mol, 99%
Ether de pétrole.(R-O-R) d=0.65, 65%
Acétate d'éthyle.(CH3COOCH2CH3) D=88.1, 99.8%
Chloroforme (CHCl3) M=119.4, 99%
TCA ou acide
trichloracétique(CCl3COOH)
M=163.39
Potassium ferricyannateK3Fe(CN)6 M=329g/mol
Acide gallique monohydrate (C7H6O5H2O) M=188.14
Carbonate de sodium(Na2CO3) M=105.99g/mol
chlorure ferrique FeCl3 M=162.21g/mol
NaHPO4 (2H2O) M=156g/mol
Na2H PO4 (12H2O) M=358.13
Sulfate de Sodium.Na2SO4 M=142.04g/mol
Eau distillée.(H2O) M=18g/mol
n-Butanol. M=76g/mol
acétate de sodium M=82.03g/mol
Chlorure d’aluminium(AlCl3) M=241.43 g/mol
Acide ascorbique M=152g/mol
Solution de Folin. d =1.22
BHA M=180.25g/mol
BHT M=220.35g/mol
DPPH. M = 394.3g/mol
Quercitrine. M=302 g/mol
TRIS M=121.14g/mol
HCl M=36 g/mol
Chapitre III Matériel et Méthode
22
III-2-1-2 Appareils et instruments :
Tableau III-2 : appareils et instruments
Appareils et matériels Caractéristiques
Rota vapeur R-210 Buchi
Ampoule à decanter. 250 ml
Ballons pour le rota-vapeur. (250ml→1000ml)
Etuve. LDO-080N, Tmax=320°C
Balance électronique. OHAUS,0.0001 g , m max=210g
Broyeur
Spectrophotomètre ultraviolet-visible Spectro Scan 80DV
Micropipette SL-plus 100
III-2-2 Méthode d'extraction :
Après séchage dans un endroit sec et aéré, à l’abri de la lumière du soleil, la plante est broyée
entièrement, puis pesée (M=10g). La matière végétale obtenue est mise à macération dans un
mélange hydroalcoolique (Méthanol / eau ; 80 / 20 ; V / V). Cette macération est répétée 2
fois avec renouvellement du solvant chaque 24 heure.
Après filtration, la solution a subi des extractions successives de type liquide-liquide en
utilisant des solvants de polarité croissante en commençant par le chloroforme puis l’acétate
d’éthyle.
Les deux phases organiques ainsi obtenues (faiblement polaire : chloroforme, moyennement
polaire : acétate d’éthyle) sont concentrées à sec sous pression réduite, pesées, puis les extraits
sont repris avec du méthanol.
Chapitre III Matériel et Méthode
23
Filtration
Figure III-2 : le protocole d’extraction de différentes phases
10 g de matière végétale
sèche
Macération pendant 24h
(2 fois) Méthanol 80%/ Eau20%
Filtrat obtenue
Evaporation sous pression réduite à 50°C de solvant
(MeOH)
Solution aqueuse
Extraction liq-liq par l’éther de pétrole
Solution aqueuse délipidée
Extraction liq-liq par chloroforme (x3)
Phase organique Phase aqueuse
Extraction par l’acétate d’éthyle (x1) Séchage par Na2SO4 + Filtration
Filtrat
Phase aqueuse Phase organique
Séchage par Na2SO4 + Filtration
Filtrat
Evaporation d’acétate d’éthyle sous
pression réduite à 50°C
Résidus
Solubilisation dans le méthanol
Extrait d’acétate d’éthyle brut
Résidus
Extrait brut
Chloroformique
Evaporation de chloroforme sous pression
réduite à 50°C
Solubilisation dans le méthanol
Chapitre III Matériel et Méthode
24
III-2-3 Analyse quantitative des composés phénoliques :
Cette analyse permet d’avoir une estimation sur la teneur en phénols totaux de l’échantillon
.Le dosage des phénols totaux a été effectué par une méthode adaptée de Singleton et Rossi en
utilisant le réactif de Folin-Siocalteu, tandis que les flavonoïdes ont été quantifiés par le
dosage direct par le trichlorure d’aluminium d’après une méthode adaptée de Lamaiosn et
Carnat. [6]
III-2-3-1 Dosage des composés phénoliques totaux :
Le dosage des composés phénoliques totaux a été effectué par une méthode adaptée de
singleton et Ross (en 1965) avec le réactif de folin-Ciocalteu.En milieu basique, le réactif de
folin-Ciocalteu qui est formé d’acide phosphotungstique H3PW12O40et l’acide
phosphomolybdique H3PMO12O4 oxyde les groupements oxydables des composés
polyphénoliques présents dans l’échantillon. Les produits de réduction (oxydes métalliques
W8O23/Mo8O23) de couleur bleue, présentent un maximum d’absorption dont l’intensité est
proportionnelle à la quantité des composés phénoliques présents dans l’échantillon. La
concentration massique des constituants utilisés dans la préparation des réactifs, a été
optimisée pour obtenir la réponse analytique la plus linéaire possible en respectant le rapport
réactifs/composés phénoliques totaux. Dans cette méthode on a utilisé l’acide gallique comme
étalon. [12]
Figure III-3 : structure de l'acide gallique
-Courbe d’étalonnage de l’acide gallique :
La courbe d’étalonnage standard a été obtenue à partir des solutions d’acide gallique de
différentes concentrations (0.01-0.3mg/ml). On prend 100μl de chaque solution ont été
introduit à l’aide d’une micropipette dans des tubes à essai, suivi de l’addition de 500μl du
réactif de folin-Ciocalteu (diluée 10 fois). Après incubation pendant 2 minutes, 2 ml de
COOH
OH
OH
HO
Chapitre III Matériel et Méthode
25
carbonates de sodium Na2CO3 à 20% ont été ajoutées, puis maintenues dans l’obscurité
pendant 30 minutes à température ambiante. L’absorbance de chaque solution a été
déterminée à 760 nm contre un blanc préparé de la même manière sauf qu’il ne contient pas
d’acide gallique (l’extrait phénolique).Les lectures de la densité optique à 760 nm, des
solutions ainsi préparées ont permis de tracer la courbe d’étalonnage de l’acide gallique.
L’analyse quantitative des phénols totaux des extraits phénoliques a été réalisée par la même
procédure. [13]
Les concentrations des polyphénols a été déterminé par la formule suivante :
C : concentration de polyphénols en mg/g.
A : l’absorbance à λ = 760 nm.
K : tangente de l’acide gallique. (nm*ml/mg)
D : nombre de dilution.
V : volume de récupération de l’extrait. (ml).
P : le poids d’initial de la plante (10 g).
III-2-3-2 Dosage de flavonoïdes :
Le chlorure d’aluminium (AlCl3) forme un complexe très stable avec les groupements
hydroxydes OH des phénols. Ce complexe jaune absorbe la lumière visible à une
longueurd’onde 415 nm.Les phénols sont estimés par une spectroscopie UV, dont la
Quercetine est utilisé comme un standard à une longueur d’onde λ =415 nm. [14]
- Courbe d’étalonnage :
Un standard de calibration a été préparé en utilisant des solutions de Quercetine des
différentes concentrations de 0.004 jusqu'à 0.04 g/l.0.5 ml de la solution diluée a été mélangé
avec 1.5 ml de méthanol 95%, est mis à réagir avec0.1 ml de chlorure aluminium 10%, suivie
de 0.1 ml d’acétate de sodium 1M et 2.8 ml d’eau distillé puis laissé 30 minutes dans
l’obscurité .L’absorbance de chaque solution a étédéterminée à 415 nm.
p
VD
K
AC ...
Chapitre III Matériel et Méthode
26
En utilisant les valeurs des absorbances obtenues pour les différentes solutions de
Quercetineainsi préparées nous avons tracé la courbe d’étalonnage.
FigureIII-4 : Quercétine
L’analyse quantitative des flavonoïdes totaux des extraits a été réalisée en adaptant la même
procédure utilisée pour l’établissement de la courbe d’étalonnage, en remplaçant l’acide
gallique par des délutions des extraits jusqu'à une appropriée concentration.La teneur en
flavonoïdes totaux de chaque extrait a été calculée et exprimé en équivalentQuercetine en
milligramme par 1g de la matière végétale (mg/g) [14]. par la formule suivante :
C : concentration de flavonoïdes en mg/g.
A : l’absorbance à λ = 415 nm.
K : tangente de Quercitine. (nm*ml/mg).
D : nombre de dilution.
V : volume de récupération de l’extrait. (ml)
P : le poids d’initial de la plante (10 g).
C
O
OH
OH
OH
OH
HO
O
p
VD
K
AC ...
Chapitre III Matériel et Méthode
27
III-3 Évaluation de pouvoir antioxydant
Des nombreuses méthodes sont utilisées pour l’évaluation de l’activité antioxydante des
composés phénoliques purs ou des extrais. La plupart de ces méthodes sont basées sur la
coloration ou décoloration d’un réactif dans le milieu réactionnel. Dans notre étude nous
avons utilisé deux différents tests chimiques à savoir : le test Feric Reducing/antioxydant
power assay qui mesure les pouvoir de réduction des ions de fer et l’effet (scavanger) sur le
radical 2,2diphényl1-1-picrylhydrazyl (DPPH).
III-3-1 le pouvoir réducteur des composés phénoliques (Reducing Power Assay) :
Ce test est découvre par Oyaizu 1896[15] .Ce test est considéré comme un test direct et rapide
dont est utilisé pour mesurer le pouvoir des antioxydants non enzymatiques, et utiliser pour
déterminer l’activité antioxydant des extraits étudies dans un milieu neutre .Ce test est basé
sur la réduction des ions [Fe (CN)6]3-
à des ions de [Fe (CN)6]4-
, qui peut être mesurer leur
absorbanceà une longueur d’onde λ= 700 nm.L’activité antioxydante est mesuré avec un
nouveau terme appelé AEAC : qui présente l’activité antioxydante en équivalant de l’acide
ascorbique des extraits étudiés (Ascorbic Acid Equivalent Antioxydant Capacity).L’évolution
de l’activité antioxydante de nos extraits est comparée par rapport à l’acideascorbique
(vitamine C) et cela en traçant une courbe d’étalonnage.
On prépare des solutions d’acide ascorbique (vitamine C) de concentration de 0.01 jusqu'à0.1
g/l. 1 ml de chaque solution ont été introduits à l’aide d’une pipette dans des tubes à essai,
suivis de l’addition de 2.5 ml d’une solution K3Fe(CN) 6 (1%), 2.5 ml de solution tampon
phosphaté (PH=6.6 C=0.2M). Les solutions ont été secouées immédiatement et bien
mélangées, puis ils sont maintenus dans un bain marie pendant 30 minutes à une température
de 50 °C. Ensuite, on ajoute 2.5 ml de l’acide trichloracétique (TCA 10%). On prend de
chaque tube 2.5 ml et on introduit dans un autre tube à essai et on ajoute 2.5 ml de l’eau
distillé, 0.5 ml de solution de FeCl3 (0.1 %).L’absorbance de chaque solution a été déterminée
à 700 nm contre un blanc. Les lectures de la densité optique à700 nm, des solutions ainsi
préparées ont permis de tracer la courbe d’étalonnage de l’acide ascorbique (Vitamine C).
[16]
Chapitre III Matériel et Méthode
28
III-3-2 Effet scavenger du radical DPPH :
Dans ce test, les antioxydants réduisent le diphényle picryl hydrazyl ayant une couleur
violette en un composé jaune, le diphényle picryl hydrazyl, dont l’intensité de la couleur est
inversement proportionnelle à la capacité des antioxydants présents dans le milieu à donner
des protons.
1ml de chaque extrait phénolique dilué (et les standards) acide ascorbique et le 3-tertiobutyl-
4-hydroxyanisole dans le tampon Tris HCl (100 mM, pH=7.4) est additionné à 1ml d’une
solution de DPPH• (500μM) préparé dans le méthanol. Le mélange réactionnel a été secoué
immédiatement, puis il est maintenu à l’obscurité pendant 30 minutes à une température
ambiante pour que la réaction accomplisse. L’absorbance du milieu réactionnel a été mesurée
à 517 nm .
L’activité antiradicalaire est estimée selon l’équation suivante :
Calcule des pourcentages d’inhibitions :
Nous calculons ainsi les pourcentages d’inhibition par la formule suivante :
I (%) : pouvoir d’inhibition en %.
A0: absorbance de la solution de DPPH en absence de l’extrait
A1: absorbance de la solution de DPPH en présence de l’extrait. [17]
Calcule des IC50:
IC50 est la concentration de l’échantillon testé nécessaire pour réduire 50 % de
radical DPPH , Les IC50 sont calculées graphiquement par les régressions linéaires des
graphes tracés ; pourcentages d’inhibition en fonction de différentes concentrations des
fractions testées et les standards
Chapitre IV Résultats et discussion
29
IV-1 Détermination de rendement d’extraction :
Le rendement d’extraction ont été déterminés par la formule suivants :
é
é é
Pour chaque échantillon, nous avons calculé le rendement de l’extraction, les résultats obtenus
sont présentes dans le tableau suivant :
Tableau IV-1 : tableau récapitulatif regroupant les rendements des différents extraits
Matériel végétale Extrait m (g) Rendement
Rumex vesicarius Chloroforme
Acétate d’éthyle
0.1128
0.2147
1.128
2.147
Figure IV-1 : histogramme rendement de l’extraction
Les résultats obtenus montrent que parmi les différentes fractions de l’extrait brut,
l’extrait d’acétate d’éthyle représente le rendement le plus élevé (2.147%), suivi par le
chloroforme (1.128%).
0
0,5
1
1,5
2
2,5
acétate chloroforme
rendement
%
Chapitre IV Résultats et discussion
30
IV-2 Quantification des composés phénoliques :
IV-2-1 Dosage des composés phénoliques totaux :
La quantification des composés phénoliques a été faite en fonction d’une courbe d’étalonnage
linéaire (y=ax) réalisé par une solution étalon (l’acide gallique) à différents concentration.
Figure IV-2 : Courbe d'étalonnage de l’acide gallique
La teneur en composés phénoliques de chaque extrait a été alors calculée à partir de la courbe
d’étalonnage et exprimée en milligrammes équivalent en acide gallique par 100 gramme de la
matière sèche, la mesure de la densité optique a été effectuée à la longueur d'onde de 760 nm.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant :
Tableau IV-2 : Quantité des phénols totaux dans les extraits
Phase la quantité (mg/100g)
φ chloroformique 69.6 mg /100 g
φ acétate d’éthyle 452 mg /100 g
Total 521.6 mg/100 g
R² = 0,9996
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
concentration de l'acide gallique g/l
ab
sorb
an
ce à
y=
76
0 n
m
Chapitre IV Résultats et discussion
31
Figure IV-3 : Histogramme de dosage des phénols totaux dans les extraits
On remarque d’après les résultats du tableau ci-dessus que la quantité des composés
phénoliques varie entre 69.6 et 452 mg/100g de la matière sèche. Le taux des composés
phénolique le plus élevé ont été détecté dans l’extrait par l’acétate d’éthyle (452 mg/100g),
cependant il est 6 fois supérieur à celle rapportée par le chloroforme (69.6 mg/100g).
IV-2-2 Dosage des flavonoïdes :
La quantification de flavonoïdes a été faite en fonction d’une courbe d’étalonnage linéaire
(y=ax) réalisé par une solution étalon (Quercitine) à différents concentration.
Figure IV-4 : Courbe d’étalonnage du Quercitine
R² = 0,9983
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05
ab
sorb
an
ce à
ʎ=
41
5n
m
concentration de quercitine g/l
0
100
200
300
400
500
acétate chloroforme
la quantité
des phénols mg/100g
Chapitre IV Résultats et discussion
32
La teneur en flavonoïdes de chaque extrait a été alors calculée à partir de la courbe
d’étalonnage et exprimée en milligrammes équivalent en Quercitine par 100 gramme de la
matière sèche, la mesure de la densité optique a été effectuée à la longueur d'onde de 415 nm.
Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau suivant :
Tableau IV-3 : Quantité des flavonoïdes dans les extraits
Figure IV-5 : histogramme de dosage de flavonoïdes
On remarque d’après les résultats du tableau ci-dessus que la quantité de flavonoïdes varie
entre 4.28 et 25.2 mg/100g de la matière sèche. Le taux de flavonoïdes le plus élevé ont été
détecté dans l’extrait d’acétate d’éthyle (25.2 mg/100g), cependant il est 6 fois supérieur à
celle rapportée par le chloroforme (4.28 mg/100g).
Phase la quantité (mg/g)
φ chloroformique 4.28 mg/100g
φ acétate d’éthyle 25.2 mg/100g
Total 29.48
0
5
10
15
20
25
30
acétate chloroforme
la
quantité
de
flavonoide
s mg/g
Chapitre IV Résultats et discussion
33
IV-3 L’étude du pouvoir antioxydant :
IV-3-1 le pouvoir réducteur des composés phénoliques ( Reducing Power Assay):
Les différents extraits sont traités de la même façon que ceux des solutions standards
del’acide ascorbique (V.C). Nous avons tracé les courbes représentants la variation du
pouvoirréducteur exprimée en absorbance en fonction de l’inverse du nombre de dilution
On résume les résultats des tests du pouvoir réductrice dans le tableau :
Tableau IV-4: Les valeurs d’AEAC des différents extraits étudiés
Phase AEAC mM
φ chloroformique 7.64
φ acétate d’éthyle 48.08
BHT 1.52
BHA 1.03
Les résultats d’activité réductrice exprimés en AEAC montrent clairement que l’extrait de
l’acétate d’éthyle présente le pouvoir de réduire l’ion Fe+3
le plus intéressant (le potentiel
antioxydant le plus fort), par contre l’extrait de chloroforme montre un pouvoir réducteur
moins fort.
Ces résultats pourront expliqués que l’extrait de l’acétate d’éthyle présentant un pouvoir
réducteur important renferme des molécules ayant un potentiel réducteur donneur d’électron
plus fort, tandis que l’extrait chloroformique qui est montré un pouvoir réducteur moins fort
peut renfermer des substances à potentiel réducteur donneur d’électron aussi moins fort.
Chapitre IV Résultats et discussion
34
Figure IV-6 : Courbe d’étalonnage d’acide ascorbique
Figure IV-7 : Courbes représentants le pouvoir réductrice des différents extraits
Chapitre IV Résultats et discussion
35
Figure IV-8 : évaluation de l’activité antioxydant par la méthode de FRAP de différents
extraits
IV-3-2 Effet scavenger du radical DPPH :
Pour détecter l’activité antiradicalire des différents extraits de rumex vesicarius, nous avons
utilisé le 2,2-diphényl-2-picrylhydrazyle(DPPH), un radical stable, violet en solution et
présentant un maximum d’absorption caractéristique à 517 nm. Le protocole appliqué en
routine en repose sur la disparition de ce maximum lorsque le DPPH est réduit par un
composé à propriété antiradicalaire , entrainant ainsi une décoloration selon la réaction
suivante :
Figure IV-9 : Réaction d’un antioxydant avec le DPPH
Les profils d’activité antiradicalaire obtenus révèlent que les extraits possèdent une activité
antiradicalaire dose dépendante, les IC50 de chacun des différents extraits ont été
déterminées.
DPPH + AH DPPH-H + A
Chapitre IV Résultats et discussion
36
Tableau IV-5 : les valeurs d’IC50 de différents extraits étudié
Phase IC50(mg/ml)
φ acétate d’éthyle 0.25
φ chloroformique 0.034
BHA 0.013
VC 0.01
A des fins comparatives, deux antioxydants standards sont utilisés, l’acide ascorbique et le
BHA, ils ont montré une activité antiradicalaire puissante avec des IC50 de l’ordre de
0.01mg/ml et 0,013 mg/ml et l’acide ascorbique respectivement dont le pouvoir antioxydant
de l’acide ascorbique est presque le même que celui de BHA.
Parmi les deux extraits de notre plante, l’extrait chloroformique représente l’extrait le plus
actif avec une IC50 de l’ordre de 0.034 mg /ml suivi par l’extrait d’acétate d’éthyle avec une
IC50 de 0.25 mg/ml. En comparaison avec les antioxydants standards, l’extrait d’acétate
d’éthyle est moins actif.
Chapitre IV Résultats et discussion
37
Figure IV-10 : Courbes représentants le pouvoir d’inhibition des différents extraits
Figure IV-11 : histogramme représente le pouvoir d’inhibition des différents extraits
Conclusion
38
Conclusion
Les plantes aromatiques et médicinales sont la source de la majorité des antioxydants naturels
et elles restent encore sous exploitées dans le domaine médicale. Dans l’industrie
pharmaceutique, sachant que les antioxydants sembleraient de manière significative à la
prévention des maladies, le développement de nouveaux médicaments à base d’antioxydants
d’origine naturelle doit être à l’ordre de jour.
Dans le cadre de notre travail, nous nous sommes intéressés à l’étude phytochimique et du
pouvoir antioxydant de différents extraits de Rumex vesicarius la famille Polygonacea de la
région d’El-Goléa.
La première étape qui consiste à l'extraction des composés phénoliques par le méthanol 80%
par la macération à froid et fractionnée par deux (faction chloroforme, fraction d'acétate
d'éthyle) nous a permis de calculer le rendement de chaque extrait ou chaque fraction.
La teneur des phénols totaux, adaptant par la méthode de Singleton et Ross. La teneur la plus
élevée des polyphénols est constatée dans la fraction d'acétate d'éthyle 452 mg GAE/100 g,
puis la fraction de chloroforme 69.60 mg GAE/g. la quantité totales est 521.60 mg
GAE/100g.
En parallèle, La quantification des flavonoïdes a été effectuée par la méthode du trichlorure
d'aluminium qui donne une couleur jaune avec les flavonoïdes.
Nous avons observé le même résultat qui nous remarquons par les polyphénols, la teneur la
plus élevée 25.2mg QE/g.
Concernant l’activité antioxydante, nous avons étudié le pouvoir antioxydant par la capacité
de piégeage de radical DPPH● et de réduction de fer, afin de localiser la fraction qui
représente l’activité la plus élevé. Nous avons constaté pour l’activité antioxydante par la
méthode réduction de fer, que tous les extraits de la plante étudiée ont la capacité de réduire le
fer qui augmente en fonction de la concentration. Comme nous avons remarqué que les
extraits présentent une capacité intéressante pour réduire le fer par rapport aux BHA et BHT.
L'activité antioxydante de la plante (les deux fractions) supérieures 55 fois l'activité de BHA
et BHT.
Conclusion
39
Cependant, pour le piégeage du radical libre DPPH●
et en comparant les IC50 des différents
extraits testés par rapport l’acide ascorbique et BHA, nous avons remarqué une activité
antioxydante très importante
Selon les résultats obtenus dans cette étude, nous pouvons dire que la Rumex vesicarius est
riche en Phénols Totaux et en Flavonoïdes. Les extraits donnes une bonne activité
antioxydante soit une capacité de piégeage de radicaux libres et la réduction de fer .Notre
perspective d’avenir est d’étudier chaque extrait séparément puis isoler et identifier les
différents composés qui existent.
Enfin, nous recommandons une culture des plantes médicinales et alimentaires pour permettre
à la population d’avoir des médicaments et des denrées alimentaires moins chers et d’éviter la
disparition de certaines espèces intéressantes.
Références bibliographiques
40
Références bibliographiques
[1] A. Beloued (1998). Plantes medicinales d'algérie. Dép De Botanique A L'institut
Nationalagronomique d'El-Harrch-Algérie.P:277.
[2] T. Bahorun (1997). Substances naturelles actives. La flore Mauricienne .une source
d’approvisionnement potentielle. Food and Agricultural Research council Mauritius. pp 83-
94.
[3] A-M. Diallo (2005). Etude des plantes médicinales de niafunke (region Tombouctou)
Photochimie et pharmacologie de Maerua crassifolia Forsk. (Capparidacée).Thèse de
Doctorat. Université de Bamako.125p
[4] Z.Mohammedi (2005), Etude du pouvir antimicrobien et antioxydant des huiles
essentieelles et falvonoides de quelques plantes de la région du Tlemcen , Thèse de magistère
, Université-Abou Bakr Belkaid-Telemcen .
[5] S.Djemai Zoughlache (2008), Etude de l’activité biologique des extraits du fruit de
Zizyphus lotus L, mémoire magister, Université -El Hadj Lakhder –Batna.
[6] M.Belguidoum (2012), Une approche phytochimique pour différencier deux espèces de
genre Zygophyllum, mémoire de master, Université Kasdi Merbah Ourgla.
[7] M. M. R. Kansole, Etude ethnobotanique, phytochimique et activités biologiques de
quelques Lamiaceae du Burkinafaso : cas de Leucas Martinicensis(Jacquin) R. Brown,
hoslundia opposita vahl et orthosiphon pallidus Royle ex Benth. Diplôme d’Etudes
Approfondies, Université d’Ouagadougou.
[8] K. Benarous (2006), Effets des extraits de quelques plantes medicinales locales sur les
enzymes alpha amylase, trypsine et lipase, mémoire d’Ingénieur d’état, Université Amar
Telidji Laghouat, Algérie.
[9] K. Bouhadjra (2011), étude de l’effet des antioxydants naturels et de synthèse sur la
stabilité oxydative de l’huile d’olive vierge, thèse pour l’obtention du diplôme de magister,
Université Mouloud Mammeri, Tizi-Ouzou.
[10] Z.Hellal (2011), Contribution à l’étude des propriétés antibactériennes et antioxydantes
de certaines huiles essentielles extraites des Citrus. Application sur la sardine (Sardina
pilchardus). Mémoire de Magister, Universite Mouloud Mammeri De Tizi-Ouzou.
Références bibliographiques
41
[11] M. Chauvet, J.S.Siemonsma (2004), Ressource Végétales de l’Afrique tropicale 2,
Légumes.fondation PROTA / Backhuys Publishers / CTA Wageningen, Pays-Bas.P
[12] S. Dendougui (2010), contribution à l’étude phytochimique et l’activité antioxydante de
Cleome Arabica, mémoire de master, Université Kasdi Merbah Ouargla.
[13] S. Maamri (2008), étude de Pistacia atlantica de deux regions de sud Algérien: dosage
des lipids, dosage des polyphénols, essays antileishmaniens, mémoire magister, Université De
Boumerdes.
[14]C.Chia-chi et al(2002), estimation total flavonoid content in propolis by two
complementary colorimetric methods , journal of food and drug analysis , vol 10, no. 3, pages
178-182.
[15] Latifou lagnika (2005),étude photochimique et activité biologique de substances
naturelles isolées de plantes béninoises, thèse de Doctorat, Université Louis Pasteur
Strasbourg
[16] H.jrah harz allah (2010), antioxydant and antigenotoxic activities of Globularia
alypum leaves extracts, journal of medicinal plants research vol.4 (19), pp.2048-2053.
[17]A.djeridane (2006), phenolic extracts from varius Algerian plants as strong inhibiors of
porcine liver carboxylesterase. J enzym inhib med chem 21 :719-726 .
مـلـخـص
تهدف دراستنا الى تثمين النباتات الطبية الموجودة في الجزائر وذلك بتقدير كمية المركبات الفينولية
والفاعلية المضادة لألكسدة وتمت الدراسة على عينة من الجنوب الجزائري تسمى نبتة الحميض
suisa isRm xemuR
الفينولية باستعمال مذيبين هما الكلوروفورم وأول خطوة في هذا العمل متمثلة في استخالص المركبات
والفالفونيدات بطريقة Folin قمنا بالتقدير الكمي للفينوالت الكلية بطريقة ذلك بعد, اإليثيلخالت و
AlCl3ذلك باستعمال المطيافية فوق البنفسجية وVU.تم تحديد فاعلية المضادة لألكسدة لهذه ثم
طريقة ارجاع الحديد الثالثي, DPPHطريقة تثبيط الجذور الحرة ةالمستخلصات بواسطة طرق كيميائي
.BHT , BHA, Vitamine Cومقارنتها بمركبات قياسية
ومقدار ارجاع الحديد الثالثي بطريقة AEACحيث تم تحديد نسب التثبيط بداللة التراكيز وحساب مقدار
IC50 بطريقةDPPH حيث تحصلنا على نتائج جيدة.
الفعالية المضادة ,المركبات الفينولية,الفالفونيدات ,الحميض ,إستخالص : تاحيةالكلمات المف
.DPPHطريقة ارجاع الحديد الثالثي طريقة تثبيط الجذور الحرة .لألكسدة
Résumé:
Notre étude a pour objectif de valorisation des plantes médicinales en Algérie et en évaluant
la quantité des composés phénoliques et de l'étude de l'efficacité antioxydante a un
échantillon de sud d'Algérie appelée moût oseille( Rumex vesicarius).Notre travail porte sur
l’étude de la phytochimie et des activités antioxydantes de la plante Rumex vesicarius.
La première étape de ce travail représentée dans l'extraction des composés phénoliques en
utilisant deux solvants : chloroforme et l'acétate d'éthyle et la quantification des composes
phénoliques par la méthode de folin et la quantification des flavonoïdes par la méthode de
AlCl3nous avons estimé ces composés par spectroscopie UV -VIS.
L’activité antioxydante des différents extraits a été évaluée par deux méthodes ; la réduction
du fer et le piégeage du radical libre DPPH et comparé avec des standards BHA-Vitamine C.
Mots-clés: Extraction, Oseille, flavonoïdes, composés phénoliques, activité antioxydante, le
piégeage du radical libre DPPH, la réduction du fer,