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Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le
transfert de gène dans le Système Nerveux Central
LGN - UMR 7091sous la direction du Docteur Jacques MALLET
Lahouari AMAR
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• Le transfert de gène dans le SNC• Les vecteurs lentiviraux
- caractéristiques
- avantages et méthode de production
- applications• Résultats
Développement d’un seul vecteur lentiviral pour:
1) l’expression régulée d’un facteur protéique
2) l’expression régulée de shARN• Conclusion générale et perspectives
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Transfert de gène dans le SNC
Gène thérapeutique: protéine ou séquence nucléotidique (siARN)
In vivo
Ex vivo
Cellules transduites
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Spécificités du système nerveux central relatives au transfert de
gène• Présence de la barrière hématoencéphalique
– Limite le passage de molécules thérapeutiques» Nécessité du transfert de gène…
• La majorité des cellules du SN sont quiescentes– Possibilité d’utilisation de vecteurs intégratifs ou épisomaux– Vecteurs non viraux peu efficaces à long terme
» préférentiellement viral…
• Diversité cellulaire– Nécessité d’expression restreinte ou élargie du facteur thérapeutique– Possibilité de ciblage d’une structure ou noyau particulier dans le SN– Transport rétrograde ou antérograde dans les neurones
» avec un vecteur dont le tropisme est modulable.
Vecteurs lentiviraux particulièrement adaptés
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Avantages des vecteurs lentiviraux
• Transduction des cellules quiescentes et en division
• Expression stable et à long terme du transgène dans le SNC
• Faible toxicité• Facilité de production à haut titre dénuée
de RCR• Pseudotypage aisé
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Vecteurs lentiviraux : méthode de production
Particules virales pseudotypées avec la protéine G du virus de la stomatite vésiculaire (VSV-G)
VSV-G
PhCMV VSV-G pAPlasmide d’enveloppe
Plasmide transcomplémentant
PhCMV pAgag
Pro polΨ
rev
tat
Plasmide vecteur 5’LTR 3’LTRRRE cPPT Pro Transgène
U3
PPT
Ψ
WPRE
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Applications des vecteurs lentiviraux
• Thérapie génique
• Production d’animaux transgéniques (modèles de maladies…)
• Etude de fonction de gènes (surexpression ou inhibition par siARN)
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Nécessité d’un système régulable
• Etudes cliniques– Moduler l’expression du facteur thérapeutique– Arrêt du traitement en cas de complication
grave
• Etudes fondamentales– Contrôle temporel du transgène – Contrôle du niveau d’expression
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Le système de régulation inductible par la Tetracycline
(Tet-on)
PGK rTetR rTetR
VP16
VP16rtTA
Tet
Tet
Tet+
rTetR
VP16Tet
7TetO CMVmin Transgène 7TetO CMVmin Transgène
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1. Développement d’un seul vecteur lentiviral pour l’expression régulée
d’une protéine thérapeutique
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Nécessité d’un vecteur unique
• Réduction de la quantité de vecteur administrée:– Réduction du risque de mutagenèse
insertionnelle– Réduction du risque d’immunogénicité lié au
vecteur
• Permettre l’expression du transgène et du transactivateur dans la même cellule
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Un vecteur lentiviral unique pour l’expression régulée d’un
transgène
5’LTR 3’LTRcPPT Pcmv min Transgène
U3
PPT
Ψ
WPREInsStufferPPGKrtTA2-M2BGH polyA
- Luciférase - Tyrosine hydroxylase
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Expression régulée de la luciférase in vitro
Transduction d’une culture primaire d’astrocytes
+ Dox
- Dox
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Réversibilité in vitro Dose optimale in vitro
Effet de la doxycycline sur l’activité luciférase
Cinétique d’induction in vitro
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Injection du vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la luciférase dans le
striatum de rat
+ Dox
- Dox
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Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase
+ Dox - Dox
Evaluation in vitro
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Un vecteur lentiviral exprimant de façon régulée la tyrosine hydroxylase
Evaluation in vivo
+ Dox - Dox Contrôle non injecté
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Résumé
• Construction d’un seul vecteur lentiviral portant un système de régulation Tet-on
• Validation in vitro et in vivo
• Niveau d’induction fort
• Fuite non détectable en absence d’inducteur
• Dose d’inducteur élevée in vivo
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Applications, limites et voies d’amélioration
• Application de ce vecteur Tet-on • Utilisation in vitro • Utilisation chez l’animal
» Exemple : stratégie de neuroprotection» Limites dans une stratégie de remplacement?
• Utilisation en clinique exclue
• Nombre faible de cellules exprimant le transgène in vivo après induction• Quantité de vecteur utilisée sous optimale• Défaut de retrotranscription d’un génome vecteur long• Co-expression du transactivateur et du transgène
Un vecteur versus deux vecteurs?
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2. Développement d’un seul vecteur lentiviral permettant
l’expression régulée de shARN
![Page 21: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/21.jpg)
L’ARN interférence
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Expression des siARN
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Pol III
+1
Un promoteur d’ARN Polymérase III
Le promoteur U6 L’expression des shARN nécessite l’utilisation d’un promoteur d’ARN polymérase III
- Débute la transcription à un nucléotide défini (G)- Arrêt de la transcription par 5 thymidines
Site de démarrage de la transcription
ESD ESP TATA
-24-29-47-66-149-244
G
TTTTT
core
SNAPc TBPSTAF1 Oct1
shARN
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Sans inducteur : inhibition de la synthèse des siARN
Stratégie négative : encombrement stérique inductible d’un promoteur polymérase III
Protéine
ESD ESP shARNTATA
SNAPc TBPPol III
Avec inducteur : synthèse des siARN
inducteur
Pol III
ESD ESP shARNTATA
SNAPc TBP
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Pol III
Avec Doxycycline : synthèse des siARN
doxycycline
Sans Doxycycline : inhibition de la synthèse des siARN
Encombrement stérique inductible du promoteur U6 par le système tétracycline
répresseur Tet
ESD ESP shARNTATATet0
SNAPc
ESD ESP shARNTATATetO
SNAPc TBP
TBPPol III
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Un promoteur U6 régulable :Stratégie négative
ESD ESP TetOTetOTetOTetO TATA TetO
ESD ESP TetOTATA
ESD ESP TetO TATA
ESD ESP TetO TATA TetO
ESD TATA
+1-24-29-47-66-149-244
ESP
ESD ESP TetOTetO TATA TetO
ESD ESP TetOTetOTetO TATA TetO
![Page 27: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/27.jpg)
Inhibition de l ’expression de la GFP dans des cellules HEK 293T-GFP
inhibition de la GFP par un vecteur lentiviral exprimant un siGFP régulable
0,00
20,00
40,00
60,00
80,00
100,00
120,00
293T-GFP LVsiGFP - Dox LVsiGFP+Dox
% d
e ce
llule
s G
FP
posi
tive
s%
de
cell
ule
s G
FP
pos
itiv
es
![Page 28: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/28.jpg)
Stratégie positive : adaptation du système Tet-on à un promoteur d’ARN polymérase III
• Utilisation d’un transactivateur de l’ARN polymerase III
• Utilisation d’un promoteur polymérase III minimal inductible par la tétracycline
![Page 29: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/29.jpg)
Développement d’un transactivateur de promoteur polymérase III inductible par la
doxycycline
Un nouveau transactivateur rtTA-Oct2
rtTA
Domaine de liaison à l’ADN du rtTA2-M2
VP16
Domaine transactivateur VP16 du virus HSV
Domaine transactivateur
Q18III(QA) Q18III(QA) Q18III(QA) Q18III(QA)
![Page 30: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/30.jpg)
Un nouveau promoteur
ESP Boîte TATA
Développement d’un promoteur U6 minimal inductible par la doxycycline
DSE
7 TetO
![Page 31: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/31.jpg)
Pol III
Un promoteur d’ARN Polymérase III inductible par la doxycycline
ESP Boîte TATA
7 TetO
+1SNAPc TBP
sens boucle
antisens TTTTT
19 pb 19 pb9 pb
antisenssens5’
UUshARN
Oct-2
rtTADox
![Page 32: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/32.jpg)
Un vecteur lentiviral pour l’expression régulée de shARN
dirigé contre la GFP
5’LTR 3’LTRcPPT
U3
PPT
Ψ
PPGK rtTA-Oct2 WPREP
U6 min shGFP
- dox
+ dox
Pas d’expression de shGFP Synthèse de la GFP
Expression de shGFP Inhibition de la GFP
![Page 33: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/33.jpg)
Une expression de shGFP régulée
+ Dox
- Dox
Northern Blot
Transduction de cellules HEK293T-GFP avec différentes quantités de vecteur lentiviral exprimant de façon régulée un shGFP
![Page 34: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/34.jpg)
Expression de shGFP en fonction de la concentration de
doxycycline
- Dox + Dox
![Page 35: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/35.jpg)
Cinétique d’expression du shARN
- Dox
+ Dox+ Dox- Dox
![Page 36: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/36.jpg)
Application du système pour la régulation d’un gène endogène :
p53 HEK293T
A549
MCF-7
![Page 37: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/37.jpg)
Résumé
• Construction d’un système de régulation qui permet une expression contrôlée par la doxycycline de shARN
• Validation du contrôle d’un gène endogène
• Forte inductibilité
• Système réversible
• Forte concentration de doxycycline
![Page 38: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/38.jpg)
Limites et perspectives
• Dose de doxycycline
• Validation in vivo
Expression de shARN par promoteur pol III versus promoteur pol II
![Page 39: Développement de vecteurs lentiviraux régulables pour le transfert de gène dans le Système Nerveux Central LGN - UMR 7091 sous la direction du Docteur](https://reader037.vdocuments.fr/reader037/viewer/2022110117/551d9d82497959293b8bb91f/html5/thumbnails/39.jpg)
Conclusion générale
• Construction d’un seul vecteur lentiviral pour l’expression régulée par le système Tet-on d’une protéine thérapeutique.
• Développement d’un système de régulation de l’expression de shARN inductible par la tétracycline et sa vectorisation.
Problème de l’immunogénicité du transactivateur pour utilisation clinique
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Perspectives pour une utilisation clinique
• Se tourner vers un système de régulation d’origine humaine ou « humanisé » pour la clinique–Rapamycine–ZFP synthétique
• Régulation Physiologique
• La régulation en cas de complication–Alternatives :excision du vecteur ou suicide des cellules transduites