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8/18/2019 Cours TD Gen Pro

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GENETIQUE DES PROCARYOTES

Cours proposés par Dr SAIDI

Niveau L3


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• V- Expression et régulation de l’information génétique chez les bactéries et bactériophages

• V.1. La transcription chez les procaryotes : Définition, l’ARN polymérase, les promoteurs bactériens,déroulement de la transcription.

• V.2. La traduction chez les procaryotes : Initiation, élongation, terminaison• V-3. Régulation de l’expression génétique

• V.3.1. Au niveau transcriptionnel

• - Notion de force du promoteur•

- La reconnaissance du promoteur (rôle des facteurs sigma dans la régulation)• - Disponibilité du promoteur (modèle de variation de phase chez les bactéries)• Régulation par les facteurs de transcription : régulation positive et négative• Modes d’action des différentes classes de répresseurs et d’activateurs • Régulation négative inductible : opéron lactose• Régulation négative répressible : opéron tryptophane• Régulation positive par l’activateur CAP/AMPc, cas de l’opéron lactose • Régulation positive et négative : opéron arabinose• - Régulation par l’atténuation : opéron tryptophane • - Régulation par antiterminaison de la transcription : bactériophage lambda •

V.3.2. Au niveau traductionnel• - Initiation de la traduction, atténuation de la traduction, terminaison de la traduction• Mode d’évaluation :

• Contrôle continu et Examen semestriel

Génétique des procaryotes 2015-2016


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Chapitre I

Structure, organisation et réplication du matériel

génétique bactérien

• Chromosome

•

Plasmide• bactériophage



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Structure de l’ADN Bactérien

• Structure primaire del’ADN

Structure primaire de l’ADN résulte de la condensation denucléotidesmonophosphates, par desliaisons phosphodiéstersentre le carbone 3’ d’unpremier nucléotide et lerésidu phosphorylé porté parle carbone5’ du nucléotide

suivant La structure est formée de 2chaînes de polynucléotidesorientées dans le sens 5’ 3’,antiparallèles.



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La structure secondaire

Une Hélice formée de deux chaines hybridées deux àdeux. Caractéristiques

1/ antiparallèles : l’extrémité 5’ d’une chaine est du côtéde l’extrémité 3’ de l’autre chaine.

2/ complémentaires : les nucléotides d’une chaîne sontcomplémentaires aux nucléotides de la 2ème chaine.

Les règles de complémentarité universelles : en face labase A on trouve la base T, en face la base C on trouve labase G. rapports A/T, C/G constants. Cettecomplémentarité est due à la conjonction de deuxphénomènes :

Des contraintes sériques : la complémentarité purine-pyrimidine fait que chaque paire de base ayant la mêmedimension, la structure d’ADN est très régulière.

La création de liaisons d’hydrogènes: entre les bases

complémentaires., 2 liaisons entre A-T et de 3 entre C-G.Ce nombre influe sur la stabilité de l’appariement.

Pour rompre l’appariement A-T, il faut une énergie de 21kj,et 63kj pour rompre C-G.

3/ Chaines hélicoïdales : l’ADN s’enroule autour d’un axecentral imaginaire en formant une double hélice droiteADN A, ADNB) . Le pas de l’hélice est de 34Â (10pb), la

distance entre deux bases voisine est de 3.4Â et lediamètre de 20Â. Génétique des procaryotes 2015-2016


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La Réplication

Définition: La réplication est un mécanisme de

synthèse de l’acide désoxyribonucléique(reproduction exact du génome)

• mode semi-conservatif: l’ADN contient un brindérivée de la molécule mère (matrice) et un brinnéosynthétisé (expérience de Meselson et Stahl,

1958)• sens de la synthèse: 5’ vers 3’.



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La réplication du chromosome bactérien Le chromonème possède uneorigine de réplication (oriC); à ceniveau se fait la séparation desdeux brins:Formation de fourches deréplication (2 fourches quiprogressent dans les deux sensopposés/ bidirectionnelle).Les deux fourches fusionnent.La réplication s’achève au point(terC).

• Remarque : le chromonèmeest un réplicon.

Un réplicon est toute moléculed’ADN avec une origine deréplication.



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Eléments impliqués dans la

réplication 1- ADN matrice,2- désoxyribonucléotides (dATP, dGTP,dCTP, dTTP) ,

3- ions Mg2+ 4-Topoisomérases (DnaA): élimine les contraintes de surenroulementcrées par l’hélicase (DnaB).5 - Hélicase (DnaB) additionné de DnaC: sépare les brins d’ADN 6- SSB (Single Strand Binding) : protéines qui stabilise l’ADNmonocaténaire7- ADN polymérase III : polymérise les désoxyribonucléotides dans le

sens 5’ 3’ (composé de sous unités α2 ε2 β4 γ δ δ’ χ et ψ)8- Primase (DnaG) : synthétise les amorces d’ARN nécessaire à lapolymérase9- ADN ligase : attache les fragments d’Okazaki sur le brin retardé.



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• Eléments dumécanismede réplicationchez E.coli



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1- Initiation de laréplication

1)formation de la fourche de réplication :au niveau d’une origine de réplication (oriC).

a) oriC: composé de trois régions riche en

A-T (TTATCCACA) et de 4boites DnaA. De 10à 12 molécule de protéines DnaA se lientaux boites DnaA et forme le complexe.

Le déroulement se fait dans les deux senspar ce complexe DnaA (topoisomérases)b)Le complexe dissocie la région riche en

A-T et ouvre la double hélice.

2) Séparation des deux brins : par l’actiond’une enzyme (hélicase/ DnaB), maintenuséparés par des protéines, SSB (singletrand binding)

c) Une fois ouvert, DnaC se lie au DnaBhélicase) pour démêler encore ce

domaine.

d) Finalement DnaG primase initiecommence) la synthèse par polymérisation

d’un brin d’ARN. Génétique des procaryotes 2015-2016


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2- Elongation

Après l’initiation, sur un fragment (matrice) de la fourche, l’élongation est continue (brin précose), sur l’autre matrice,l’élongation est discontinue (fragments d’Okazaki). L’avancée de la réplication illustrée est de droite vers la gauche. Surle brin continu la synthèse se fait par DNA Pol III, liée à DnaQ qui fourni la fonction editing. Le domaine C-terminal deDnaQ se lie à la DNApol III et le domaine N-terminal contient l’activité exonucléasique ( editing function). Le brinretardé est synthétisé en fragments d’ADN (Okazaki) qui sont liés ensemble par la ligase après avoir enlevé le brind’ARN par la DNA Poly I.

Correction des paires de bases dépareillées: editing function



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3-terminaisonLa terminaison de laréplication se fait quand les

deux fourches de réplicationfusionne au point opposé àOriC, le site (ter C)sousl’action de la DNA determinaison de la réplication(Dnat).

La séparation des deuxmolécules filles d’ADN se faitgrâce à l’action de la DNAgyrase (topoisomérase II)



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Mécanismes d’action destopoisomérases

a) Les topoisomérasescatalysent la conversion

interne des molécules d’ADNcirculaires. Les moléculesd’ADN peuvent êtrerelâchées ou superenroulées,nouées ou dénouées,caténaire ou non, par l’actiondes topoisomérases.

b) b) Deux types de

topoisomérases classées enfonction du nombre decoupure faite sur l’ADN.

Topo I : une cassure sur une desdeux molécules.Topo II : cassures faites sur lesdeux molécules.



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ADN polymérase I et fragment deKlenow

• L’enzyme est composé : D’un petit domaine central avec une activité

exonucléasique orientée de 3'->5' qui constituel'activité de correction d'épreuves (édition). C'estgrâce à cette activité que l'enzyme effectue uneréplication fidèle, avec un taux d'erreursextrêmement faible.Le gros domaine C-terminal possède l'activité depolymérisation, orientée de 5'->3'.Une protéolyse ménagée par la subtilisine permetde détacher très spécifiquement le petit domaineN-terminal.

Les deux autres domaines restent liés et constituentle "fragment de Klenow" dépourvu d'activité exo 5'->3' (les nombres rouges indiquent les positions desacides aminés).Le fragment de Klenow est très largement utilisé aulaboratoire dans les expériences de réplication invitro.



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Plasmides naturels

Les plasmides:

éléments génétiquesextrachromosomiquescapables d’uneréplication autonome(le terme plasmide est donné parLederberg, 1952).

A côté du chromosome, labactérie peut contenir des

plasmides de petite taille (0,5à 5 % du chromosomebactérien ou 5 à 4000 fois pluspetit que le chromosome).



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* Le plasmide peut s’intégrer dans un chromosomebactérien (épisome).

• détecté lorsque les gènes qu'ils transportent

confèrent à la bactérie de nouvelles propriétés.• Les plus connus de ces plasmides sont:

- Le facteur sexuel ou facteur F

Le facteur sexuel ou facteur F assure le transfert defragments de chromosome bactérien parconjugaison.

- Les plasmides de résistance aux antibiotiques (ou

facteurs R)



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Classification des plasmides 1. Propriétés de transfert

a) Plasmides conjugatifs- permettent la conjugaison.

- généralement grands (65Md)

- la réplication est de type strict : sa

réplication est synchronisée avec celle duchromosome

- En petit nombre (1-3 copies/ cellule)

- Plasmides : R1, R6, EntP 307Génétique des procaryotes 2015-2016


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• b) Plasmides non-conjugatifs

- ne peuvent pas médier la conjugaison.

- généralement petits (4 à 6 Md)

- ils leur manquent un ou plusieurs gènesnécessaires pour le transfert d’ADN.

- Un plasmide non-conjugatif peut être transférépar conjugaison si la cellule porte aussi unplasmide conjugatif.

- Le contrôle de la réplication est de type relâché(en l’absence de protéine cellulaire)

Exemple de Plasmides conjugatifs: ColE1,RSF1030, cloDF13



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2-Effets phénotypiques

a) Plasmide de fertilité (Facteur F)b) Plasmides bactériocinogéniques [gènes de bactériocines ou colicines]c) Plasmides de résistance (facteursR) gènes de résistance auxantibiotiques, confèrent auxbactéries la résistance à diversantibiotiques (RSF1030).

• Les gènes peuvent être organisésdans le plasmide au sein detransposons (Tn)

Déterminant R- porte lesgènes de résistance. Les gènesde résistance sont souvent desparties de transposons.

RTF (Facteur de RésistanceTransfert)- porte les gènes detransfert.



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Exemples

Les staphylocoques portent un gène qui codepour la production d'une pénicillinase qui inactive

la pénicilline G et les pénicillines du groupe A(ampicilline) ce qui rend la bactérie résistante àces pénicillines (idem chez E.coli , gonocoque,...).



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Réplication des plasmides

La synthèse d’ADN plasmidiquese fait à partir de l’origine deréplication est soit:a) unidirectionnelle (a): Pt181

synthétise un brin d’ADN dansune direction à partir de’origine, puis son brin

complémentaire.b)Bidirectionnelle (b) R1 initiea synthèse d’un brin et juste

après le second brin.

pT181: Staphylococcus aureusR1: Salmonella paratyphi



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Structure de l’ADN au niveau de l’origine de réplication des plasmides

• Deux exemples destructure d’ADN auniveau de l’origine(ori):

a) Origine contiennantune région riche enA-T et des sites deliaison de protéined’initiation ou RNA.

b) P1 code uneprotéine initiatriceRepA qui se conjugue

avec DnaA au niveaude l’ADN pour ouvrirla région A-T etcommencé laréplication



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Plasmide RSF1010

• code toutes les

protéinesinitiatrices(RepA, RepB etRepC) etn’utilise pas les

protéines del’hôte pourcommencer saréplication.



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utilise une

moléculed’ARN pourouvrir etinitier lasynthèsed’ADN.

Plasmide ColE1



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Stratégies de répartition du nombre decopies de plasmide

a) la Répartitioninégale d’un nombreélevé de copies auhasard dans les

cellules filles serarésolu par laréplication



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Stratégies de répartition du nombre decopies de plasmide

• b)Certains plasmides à

nombre de copies élevécontiennent unmécanisme pour résoudreles dimères de plasmide

en monomères qui serontrépartit indépendamment



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Stratégies de répartition du nombre de copies deplasmide

c) système de répartition utilisé pour les plasmides à nombre decopies faibled) Chez P1 la région par code pour deux protéines Par A et Par B.Le complexe ParA-ParB se lie en position cis, au niveau d’un siteappelé site S ceci va dirigé toutes les molécules du plasmide aumilieu de la cellules jusqu’à ce que les cellules filles soient biendistinctes, ainsi les copies seront répartit équitablement



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Plasmides incompatibles

• Deux plasmides

sont ditsincompatibles s’ilsportent la mêmeorigine deréplication et dansce cas la cellule fillefinira par n’engardé qu’un desdeux.



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LES BACTERIOPHAGES

• Un phage est une particule qui infecte une

bactérie.• Le phage est composée essentiellement d’un

matériel génétique (ADN ou ARN) protégé parune enveloppe appelé capside constituée de

protéines.



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Le phage lambda

• Le phage lambda(λ) est un phage qui

infecte Ecoli• La tête du phage

renferme l’ADNviral.

• La queue renfermedes protéines. Elle

permet la fixationdu phage sur lacellule-hôtebactérienne(protéine J).



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• L’ADN du phage est un DNA double brin, linéaire,

de longueur 48.5kb. Plusieurs dizaine de gènes.Extrémité simple brin de 12 nucléotides,complémentaires. Extrémités cohésives (boutcollant).



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Les cycles du phage λ

• Le phage se multiplie selon deux modes:

- multiplication lytique

- multiplication lysogénique.



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La multiplication lytique1- Infection : liaison du phage à E.coli par la protéine J, qui se lie à uneporine à la membrane d’E.coli.

2- Adsorption et pénétration : injection de l’ADN phagique par diffusionpassive à travers la membrane. L’ADN virale se circulariseimmédiatement par complémentarité des extrémités cohésives(séquences cohésives) formant un site cos. Une ligase bactérienne scelleles brins.



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3- La multiplication duphage expression desgènes codants divers

protéines pour laréplication de l’ADNphagique, pour lasynthèse des protéinesde la tête et la queue.

Formation d’unconcatémère.



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4-Empaquetage d’unemolécule d’ADN dans la

tête puis assemblagetête et queue.

5-Libération des phages :lyse bactérienne paraction de deux protéines

du phage (endolysine etholine), 200 phages sontproduits par bactérie.



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La multiplication lysogénique

• L’ADN viral s’intègre à l’ADN bactérien par recombinaison

spécifique de site et sera répliqué en même temps quelui.• Les gènes qui codent les protéines de la tête et de la

queue ainsi que les gènes du cycle lytique sont répriméspar un répresseur codé par le gène viral Ci.



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Le bactériophage M13 • Infecte E.coli• Le matériel génétique du phage:

- un simple brin de DNA circulaire,- de longueur 6.4kb appelé brin +.- Il comprend 10 gènes et 2petites

régions « intergéniques ».- Le DNA est recouvert de

protéines donnant un phage enforme de batonnêt « filamenteux» .



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La transfection

• La transfection des bactéries par M13 et

l’expression du phage dépendent de laprésence d’un chromosome surnumérairebactérien (épisome F’): la présence de cetépisome permet le cycle normal du phage :synthèse d’un brin d’ADN complémentaire,

réplication et en fin de cycle synthèsespécifique d’un seul des deux brins de l’ADN(brin +) qui sera pourvu d’une membrane etsécrété hors de la cellule.



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Le cycle lytique du phage M13

divisé en trois étapes :

1- Entrée dans l’hôte: Le phage M13 entre dans la bactérievia le pilus F codé par un plasmide F (facteur de fertilité).2- Multiplication: une fois dans le cytoplasme le brin+ estrépliqué en une forme double brin dite « RF » (replicativeform). Après 100 à 200 RF la synthèse de DNA devientasymétrique. Seul le brin+ est produit.3- Expulsion : à travers la membrane cytoplasmique (sansproduire de plage mais de petite dépression dans la couchede milieu solide) les phages M13 sont expulsés revêtu deprotéines. Comme M13 n’est pas enfermé dans une tête(comme λ), il n’y a pas de stricte limite à la longueur deDNA expulsé.



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Cycle lytique du phage M13Génétique des procaryotes 2015-2016


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Cycle lysogénique

• Lorsque l’épisome ne contient pas les gènes

permettant le cycle lytique (épisome F’), l’ADNdu phage s’incorpore sous la forme d’un ADNdouble brin capable d’exprimer les gènes qu’ilcontient



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résumé

• Les procaryotes (bactéries) possèdent un matériel nucléaireappelé le chromonème et des éléments génétiquesextrachrachromosomiques que sont les plasmides. Lesbactéries sont infectées par des bactériophages qui sontdes particules virales constituées d’ADN ou d’ARN protégéspar une enveloppe, la capside. Le chromonème, leplasmide et le bactériophage, peuvent échanger desfragments d’ADN par des mécanismes de transfertattribuant à la bactérie de nouveaux phénotypes

contribuant à la diversité chez les procaryotes. Lesplasmides et les phages sont modifiés par les chercheurs(géni génétique) et servent de vecteurs de transfert dematériel génétique.



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UNIVERSITE DES SCIENCES ET DE LA TECHNOLOGIE MB. FACULTE SNV. DEPARTEMENT GMA

GENETIQUE DES PROCARYOTES

3ème année licence

SAIDI-OUAHRANI Nadjia

2015-2016

Matériel génétique- mutation réparation- transfert-régulation


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USTO (MB). FSNV. Département GMA. L3. Matière : Génétique des procaryotes. 2015-2016

Dr SAIDI Page 1

Exercice 2 : Que peut représenter ce schéma, à condition de le compléter ?

Exercice 1 : Que représente la figure ci-dessous ? Donner un maximum d’information.


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Dr SAIDI Page 2

Exercice 4 :Expérience de Meselson et Stahl (1958)

Des bactéries E.coli sont cultivées dans un milieu de culture contenant l’isotope lourd de

l’azote (N15). Après un grand nombre de division tout l’ADN de ces cellules est marqué par

l’isotope lourd. Les bactéries sont ensuite transférées dans un milieu normal à N14. Des

échantillons bactériens sont prélevés toutes les demi-heures. L’ADN des bactéries est extrait

des cellules et dissout dans une solution de chlorure de césium (CsCl) puis introduit dans une

centrifugeuse. Lorsque le CsCl est centrifugé à très haute vitesse (50000 rpm) pendant

plusieurs heures, les ions césium et chlorure migrent vers le font du tube sous l’effet de la

force centrifuge. Un gradient d’ions s’établit avec une concentration plus élevée dans le fond.

Les molécules d’ADN sont également poussées vers le fond mais les repoussent vers le haut

en raison de leur densité de flottaison. Le trajet de l’ADN s’arrête à l’endroit du gradient ou la

force centrifuge compense exactement la densité de flottaison qui dépend elle-même de sa

densité. L’isotope lourd augmente la densité de l’ADN. L’ADN normal peut être donc

distingué aisément de l’ADN marqué N15 grâce aux positions qu’ils occupent dans le gradient

de chlorure de césium. Les résultats expérimentaux sont schématisés dans la figure suivante.

Exercice 3 :

J. Cairns (1963) a prouvé que l’’ADN d’E.coli est circulaire (fermé) et que le mode de réplication est semi

conservatif en utilisant la thymidine tritiée.R Rodriguez a utilisé la méthode de Cairns et observa que la réplication est bidirectionnelle. Les bactéries

sont placées pendant un temps variable dans un milieu contenant de la thymidine tritiée à faible niveau de

radioactivité puis à fort niveau de radioactivité.

D’après vos connaissances, actuelles schématiser les chromosomes observés par les deux chercheurs.


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Dr SAIDI Page 4

Exercice 6

La figure ci-dessous représente un mécanisme ayant lieu in vivo ou in vitro. De quel

mécanisme s’agit-il ? Compléter la légende en citant les éléments indispensables intervenant

dans ce mécanisme.

Exercice 7

Certaines souches bactériennes ont développé une résistance à un antibiotique (gentamycine).

Quel est le mécanisme classiquement évoqué pour expliquer cette résistance ? Un tel

mécanisme est-il envisageable dans le cas ou la résistance est très rapidement acquise d’une

part et d’autre part elle s’accompagne de résistance à trois autres types d’agent antibactériens

(le chloramphénicol, l’ampicilline et la sulfamide) ?

Exercice 8

Analyser les propriétés de certains plasmides résumés dans le tableau suivant. Que pouvez-

vous déduire ?


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Dr SAIDI Page 5

plasmide Taille

(mégadaltons)

Intervient dans

la conjugaison

ou non

Nombre de

copies de

plasmides

/cellule

Phénotypes

R 1 65 + 1-3 Résistance à de

multiples drogues

R 6 65 + 1-3 Résistance à de

multiples drogues

Ent P 307 65 + 1-3 Production

d’entérotoxines

Col E 1 4.2 - 10-15 Production de colicine

E1

RSF 1030 5.6 - 20-40 Résistance à

l’ampicilline

Clo DF 13 6 - 10 Production de

cloacine

Exercice 9 : Dans quel état topologique est chaque plasmide schématisé ci – dessous ? a quelle

bande, sur le gel d’agarose, correspondre chaque état ?


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Exercice 10 : donner la légende de la figure suivante montrant une représentation schématique

des deux cycles possibles de λ dans E.coli.

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