UE1 Biologie Cellulaire Pr CHOMIENNE Vendredi 16 novembre 2018 de 10h30 à 12h30 Ronéotypeurs : Marie Fontaine / Julien Eliat Ronéoficheurs : Marie Fontaine / Julien Eliat
Ronéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !1 12
Cours n° 2: Etude de la prolifération/différenciation (2)
Le cours n’a pas changé par rapport à l’année dernière. Il prend comme exemple la cellule thyroïdienne pour mettre en pratique les acteurs intervenant dans la différenciation d’une cellule. L’essentiel est de comprendre le raisonnement du cours afin de pouvoir le mettre en pratique sur un autre exemple de cellule le jour du partiel.
Plan du cours :
I. Introduction
II. Étude de l’action de l’acide rétinoïque sur les cellules thyroïdiennes
A. Confirmation de l’action B. Le mode d’action de l’AR C. Fonctionnement de l’effet différenciant de l’AR sur les cellules cancéreuses thyroïdiennes D. Conclusion
III. Modèle de résistance des cellules de cancer de la thyroïde
A. Intérêt des rétinoïdes dans les Cancers Thyroïdiens Différenciés (CTD) B. Causes du défaut d’expression de RARβ dans les cellules de métastases FTC238 par l’AR C. Conclusion
Ronéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !2 12
I. Introduction
II. Etude de l’action de l’acide rétinoïque sur les cellules thyroïdiennes
Etapes de la synthèse des
hormones thyroïdiennes
❏ La glande thyroïde, et donc les cellules thyroïdiennes, ont pour mission essentielle de fabriquer, synthétiser les hormones thyroïdiennes (T3 et T4), avant de les sécréter dans la circulation sanguine.
❏ Pour pouvoir synthétiser ces hormones, il va y avoir un certain nombre d’acteurs, situés dans le noyau : ce sont des protéines spécifiques de la cellule thyroïdienne (synthétisées grâce à l’expression de différents gènes) → Thyroglobuline, TPO et NIS.
❏ Présence de protéines transcriptionnelles en 5’ (dans la région promotrice), qui vont autoriser la transcription des gènes (→TTF1, TTF2, et les séquences de récepteurs de l’acide rétinoïque).
❏ La cellule thyroïdienne a d’abord besoin d’Iode. Il se trouve dans la circulation sanguine (apport exogène par l’alimentation), est capté par un transporteur, qui fait également passer le sodium = Symporteur NIS (N= Sodium ; I= Iode ; S= Symporteur).
❏ Puis l’iode se fixe sur la thyroglobuline (TG) ❏ Plusieurs étapes dont des oxydations deiodisations ❏ Dernière étape catalysée par la 5’-deiodase ⇒ on arrive à la fabrication des hormones
thyroïdiennes.
⇒
❏ Pour étudier les facteurs de la différenciation, on utilise des cellules cancéreuses (cellules malignes). Elles possèdent des parties altérées mais aussi des parties normales. On remarque notamment un blocage de la différenciation, une augmentation de la prolifération, ainsi que de la survie cellulaire.
❏ L’utilisation d’agents différenciants permet aux cellules malignes de reprendre leur différenciation. ❏ On peut donc en déduire quels sont les acteurs de la différenciation par l’observation de l’arrêt de la
prolifération et de la mort cellulaire.
Ronéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !3 12
A. Confirmation de l’action
❏ La plupart des cancers thyroïdiens sont dus à des problèmes de captation d’iode. ⇒ Défaut d’expression des gènes → Blocage de la différenciation. ❏ Cela s’explique par le fait que le transporteur NIS ne soit pas exprimé.
!
❏ On cherche ensuite à mettre en évidence le rôle de l’acide rétinoïque (AR), dérivé de la vitamine A, comme agent différenciant. ❏ Mesure de la différenciation de la cellule par la mesure de l’augmentation de NIS, pour restaurer une des fonctions de la cellule thyroïdienne → capter l’iode. ⇒ Proposition de thérapeutiques en augmentant le NIS chez des patients ne pouvant capter l’iode.
!
Ronéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !4 12
❏ Etude par RT-PCR quantitative ou l’on mesure le taux d’expression de l’ARNm du gène NIS. ⇒ Défaut d’expression du gène qui code pour le transporteur d’iode NIS dans les cellules thyroïdiennes tumorales.
❏ On traite des cellules cancéreuses thyroïdiennes avec de l’AR → on observe l’expression des marqueurs de différenciation: les ARNm de la 5’-deiodase et du NIS, ainsi que la sécrétion de la TG par la cellule.
❏ Après observations, on en déduit que l’AR augmente les paramètres d e l a c e l l u l e t h y r o ï d i e n n e différenciée.
B. Le mode d’action de l’AR
❏ Lors d’études chez des patients atteints d’un cancer thyroïdien, on remarque l’absence de RAR β. ❏ On en déduit que les RAR β ont un rôle potentiel dans les cancers : en l’absence d’une quantité suffisante de RAR β, pouvant se fixer sur la région promotrice du NIS ou de la 5’deiodase, ces gènes ne sont pas exprimés.
❏ L’acide rétinoïque (AR) agit par l’intermédiaire de protéines transcriptionnelles: les récepteurs de l’AR (famille des récepteurs nucléaires aux hormones).
❏ Ces récepteurs sont ligands dépendants, c’est-à-dire qu’ils sont spécifiques à une séquence d’ADN située dans la région promotrice des gènes NIS et 5DI : RARE
!❏ Plusieurs types de récepteurs de l’acide rétinoïque: → 3 RXR : α, β, γ → 3 RAR : α, β, γ ⇒ S’assemblent et agissent sous forme d’hétérodimères. ❏ On aboutit à la formation de différentes combinaisons de récepteurs de l’AR → importance dans la différenciation des tissus → spécificité de l’action de l’acide rétinoïque dans les tissus
❏ On se demande alors quels récepteurs sont spécifiques de la cellule thyroïdienne pour contrôler les 2 gènes de la cellule thyroïdienne qui sont le NIS et la 5’DI?
❏ On étudie alors l’expression des différents récepteurs dans la cellule thyroïdienne normale.
!
!
Ronéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !5 12
❏ On étudie alors l’expression des 3 gènes RXR α, β, γ et des 3 gènes RAR α, β, γ par quantification de leurs ARNm après traitement des cellules thyroïdiennes par l’AR.
❏ La différenciation induite par l’AR est liée à une augmentation de l’expression de RAR β. ❏ L’expression des gènes RAR est induite par les récepteurs à l’AR eux-mêmes. Ainsi l’ajout d’une quantité forte d’AR n’agit pas seulement sur RAR β mais aussi sur les autres gènes. → On parle d’autorégulation.
C. Fonctionnement de l’effet
différenciant de l’AR sur les
cellules cancéreuses
thyroïdiennes
❏ Marquage des cellules avec un anticorps anti-RAR β. ❏ On confirme l’augmentation de l’expression de l’ARNm de R A R β d a n s l e s c e l l u l e s thyroïdiennes traitées par l’AR mais aussi de protéines RAR β.
D. Conclusion
❏ RAR β est exprimé dans les cellules thyroïdiennes normales. → RAR β contrôle l’expression des gènes de la cellule thyroïdienne (NIS, 5 DI) par l’intermédiaire des séquences RAREs dans la région promotrice. ❏ RAR β n’est pas exprimé dans les cellules de certains cancers de la thyroïde. ❏ L’expression de RAR β est induite par l’acide rétinoïque (AR) (ARNm et protéine). → AR est un agent de différenciation de la cellule thyroïdienne normale et maligne.
�
Ronéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !6 12
III. Modèle de résistance des cellules de cancer de la thyroïde
A. Intérêt des rétinoïdes dans les Cancers Thyroïdiens Différenciés (CTD)
Cancers Thyroïdiens Différenciés
(CTD)
❏ Le cancer de la thyroïde provoque des métastases, notamment des métastases osseuses. ❏ Au lieu de tuer les cellules du cancer de la thyroïde par de la chimiothérapie, de la
radiothérapie, on peut proposer comme alternative thérapeutique la différenciation de la cellule cancéreuse.
❏ Ces cellules métastatiques peuvent capter l’iode, comme les cellules thyroïdiennes normales. On utilise l’Iode radioactif (Iode-131) pour leur visualisation en imagerie nucléaire et pour compléter le traitement.
❏ Un certain nombre de patients ne peuvent pas capter l’iode et donc ne peuvent pas être traités par l’iode radioactif.
❏ Les scientifiques ont trouvé un autre traitement par Acide rétinoïque (AR) pour les CTD, ce qui a permis :
• Expression du gène NIS • Différenciation des cellules tumorales en cellules thyroïdiennes fonctionnelles
captant de nouveau l’iode • Reprise du traitement par l’Iode-131 et sa visualisation en imagerie.
Scintigraphie avant et après le traitement par
Acide rétinoïque
❏ Nous sommes dans le cas d’un modèle de résistance des cellules de cancer de la thyroïde : identification du rôle des modifications épigénétiques. Si deux cellules se différencient, c’est qu’elles n’ont pas le même génome. Donc, la différenciation étant automatiquement issu d’un mécanisme transcriptionnel, les modifications épigénétiques y ont un rôle important.
❏ Pour mettre en avant cette résistance, nous allons étudier 2 lignées de carcinomes folliculaires de la thyroïde, isolées à partir d’un même patient :
• FTC133 : issue de la tumeur primitive → lignée sensible • FTC238 : issue de métastases pulmonaires → lignée résistante
� On observe davantage les métastases après traitement. Cependant, ce traitement par AR ne fonctionne que chez 30% des patients.
Question : Quelle est la cause de l’absence de différenciation de la cellule thyroïdienne chez les 70% restants ?
4
ChomienneBiolCell 2017
Confirmation de l’induction de RARE dans les cellules thyroïdiennes traitées par l’acide rétinoïque
Non traitées Traitées par l’AR
Marquage des cellules avecun anti-corps anti-RARE
RXR RAR RARmRNA
Protéine RAR
Conclusion
ChomienneBiolCell 2017
RARE est exprimé dans les cellules thyroïdiennes RARE contrôle l’expression des gènes de la cellule thyroïdienne(NIS, 5 DI) par l’intermédiaire de RAREs
L’expression de RARE est induite par l’acide rétinoïque (AR)(ARNm et protéine)
AR est un agent de différenciation de la cellule thyroïdienne normale et maligne
RARE n’est pas exprimé dans les cellulesde certains cancers de la thyroïde
Intérêt des rétinoïdes dans les CTD(Cancers Thyroidiens Différenciés)
Différenciation des cellules tumorales en thyrocytes fonctionnels captant de nouveau l’iode o Reprise du traitement par l’iode‐131
CTD métastatiques présentant une fixation de l’iode-131
insuffisante et traités par l’AR 13-cis
Induction de la fixation de l’iode au niveau des
métastases chez 30% des patients
Avant AR Après AR
Folliculaire T3 N2 M1
ChomienneBiolCell 2017
Rôle des modifications épigénétiques
ChomienneBiolCell 2017
Modèle de résistance des cellules de cancer de la thyroïde à l’action différenciatrice de l’AR
Ronéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !7 12
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
Sensibilité à l’ATRA (=AR)
Expression de RARβ
❏ Les deux lignées ont une expression faible de RARβ par rapport aux autres récepteurs.
❏ Mais en augmentant l’échelle, on remarque que l’expression de RARβ est nettement plus importante dans la lignée FTC133 que dans la lignée FTC238.
❏ La sensibilité de l’ATRA est corrélée à l’expression de RARβ.
!
! ❏ Ce Westernblot montre qu’il n’y a pas d’induction de l’expression
de RARβ en présence ou non d’ATRA dans la lignée FTC238.
5
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
Lignées de carcinome folliculaire de la thyroïde isolées à partir du même patient (Goretzki, 1990) :
FTC133 tumeur primitiveFTC238 métastases pulmonaires
Induction de l'expression des marqueursde différenciation après ATRA 10‐6M
0
10
20
30
40
50
60
NIS 5DI Tg TPO TSHR PAX8
mR
NA
exp
ress
ion
(fol
d in
crea
se)
FTC133FTC238
Sensibilité différente à l’ATRA
SENSIBLERESISTANTE
ChomienneBiolCell 2017
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
RARD RARE RARJ RXRD RXRE RXRJ0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Rel
ativ
e m
RN
A e
xpre
ssio
n FTC133FTC238
++ +++ ++ + + ‐Tissu sain
Perte d’expression de RARE
Expression relative des RAR et RXR par qPCR
ChomienneBiolCell 2017
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
Induction de l'expression de RARE après traitement par l’ATRA
La sensibilité à l’ATRA est corrélée à l’expression et à l’induction de
l’expression du RARE
mRN
A expressio
n (fo
ld increase)
ChomienneBiolCell 2017
ChomienneBiolCell 2017
RARE
Gènes ciblesNIS - 5’DI
RXR RARE
ARCellules normales
Cellules cancéreuses sensibles à l’AR: induction de RARb et induction de NIS et 5DI
Cellules cancéreuses résistantes à l’AR: pas d’induction de RARb et pas de NIS et 5DI
RARE
ARPas d’expression des Gènes ciblesNIS - 5’DI, pas de captation d’iode
Cellules cancéreuses: pas de RARE
5
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
Lignées de carcinome folliculaire de la thyroïde isolées à partir du même patient (Goretzki, 1990) :
FTC133 tumeur primitiveFTC238 métastases pulmonaires
Induction de l'expression des marqueursde différenciation après ATRA 10‐6M
0
10
20
30
40
50
60
NIS 5DI Tg TPO TSHR PAX8
mR
NA
exp
ress
ion
(fol
d in
crea
se)
FTC133FTC238
Sensibilité différente à l’ATRA
SENSIBLERESISTANTE
ChomienneBiolCell 2017
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
RARD RARE RARJ RXRD RXRE RXRJ0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Rel
ativ
e m
RN
A e
xpre
ssio
n FTC133FTC238
++ +++ ++ + + ‐Tissu sain
Perte d’expression de RARE
Expression relative des RAR et RXR par qPCR
ChomienneBiolCell 2017
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
Induction de l'expression de RARE après traitement par l’ATRA
La sensibilité à l’ATRA est corrélée à l’expression et à l’induction de
l’expression du RARE
mRN
A expressio
n (fo
ld increase)
ChomienneBiolCell 2017
ChomienneBiolCell 2017
RARE
Gènes ciblesNIS - 5’DI
RXR RARE
ARCellules normales
Cellules cancéreuses sensibles à l’AR: induction de RARb et induction de NIS et 5DI
Cellules cancéreuses résistantes à l’AR: pas d’induction de RARb et pas de NIS et 5DI
RARE
ARPas d’expression des Gènes ciblesNIS - 5’DI, pas de captation d’iode
Cellules cancéreuses: pas de RARE
❏ Ces 2 lignées ont des sensibilités différentes à l’ATRA.
! Dans les cellules de la lignée FTC133 (lignée de la tumeur primitive), on observe une induction de l’expression des gènes de différenciation thyroïdienne, alors que dans les cellules de la lignée FTC238 (lignée des métastases pulmonaires), il n’y a pas d’induction de ces gènes.
5
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
Lignées de carcinome folliculaire de la thyroïde isolées à partir du même patient (Goretzki, 1990) :
FTC133 tumeur primitiveFTC238 métastases pulmonaires
Induction de l'expression des marqueursde différenciation après ATRA 10‐6M
0
10
20
30
40
50
60
NIS 5DI Tg TPO TSHR PAX8
mR
NA
exp
ress
ion
(fol
d in
crea
se)
FTC133FTC238
Sensibilité différente à l’ATRA
SENSIBLERESISTANTE
ChomienneBiolCell 2017
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
RARD RARE RARJ RXRD RXRE RXRJ0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Rel
ativ
e m
RN
A e
xpre
ssio
n FTC133FTC238
++ +++ ++ + + ‐Tissu sain
Perte d’expression de RARE
Expression relative des RAR et RXR par qPCR
ChomienneBiolCell 2017
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
Induction de l'expression de RARE après traitement par l’ATRA
La sensibilité à l’ATRA est corrélée à l’expression et à l’induction de
l’expression du RARE
mRN
A expressio
n (fo
ld increase)
ChomienneBiolCell 2017
ChomienneBiolCell 2017
RARE
Gènes ciblesNIS - 5’DI
RXR RARE
ARCellules normales
Cellules cancéreuses sensibles à l’AR: induction de RARb et induction de NIS et 5DI
Cellules cancéreuses résistantes à l’AR: pas d’induction de RARb et pas de NIS et 5DI
RARE
ARPas d’expression des Gènes ciblesNIS - 5’DI, pas de captation d’iode
Cellules cancéreuses: pas de RARERonéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !8 12
B. Hypothèses des causes du défaut d’expression de RARβ dans les cellules de métastases FTC238 par l’AR
☞ Rappels
Cellules normales
Cellules cancéreuses
Sensibles à l’AR ❏ Induction de RARβ ❏ Induction de NIS et 5’DI
Résistantes à l’AR ❏ Pas d’induction de RARβ ❏ Pas de NIS et 5’DI
! ❏ Pas d’expression des gènes cibles (NIS, 5’DI) ❏ Pas de captation de l’iode.
5
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
Lignées de carcinome folliculaire de la thyroïde isolées à partir du même patient (Goretzki, 1990) :
FTC133 tumeur primitiveFTC238 métastases pulmonaires
Induction de l'expression des marqueursde différenciation après ATRA 10‐6M
0
10
20
30
40
50
60
NIS 5DI Tg TPO TSHR PAX8
mR
NA
exp
ress
ion
(fol
d in
crea
se)
FTC133FTC238
Sensibilité différente à l’ATRA
SENSIBLERESISTANTE
ChomienneBiolCell 2017
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
RARD RARE RARJ RXRD RXRE RXRJ0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Rel
ativ
e m
RN
A e
xpre
ssio
n FTC133FTC238
++ +++ ++ + + ‐Tissu sain
Perte d’expression de RARE
Expression relative des RAR et RXR par qPCR
ChomienneBiolCell 2017
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
Induction de l'expression de RARE après traitement par l’ATRA
La sensibilité à l’ATRA est corrélée à l’expression et à l’induction de
l’expression du RARE
mRN
A expressio
n (fo
ld increase)
ChomienneBiolCell 2017
ChomienneBiolCell 2017
RARE
Gènes ciblesNIS - 5’DI
RXR RARE
ARCellules normales
Cellules cancéreuses sensibles à l’AR: induction de RARb et induction de NIS et 5DI
Cellules cancéreuses résistantes à l’AR: pas d’induction de RARb et pas de NIS et 5DI
RARE
ARPas d’expression des Gènes ciblesNIS - 5’DI, pas de captation d’iode
Cellules cancéreuses: pas de RARE�
❏ Expression des gènes de la différenciation thyroïdienne.
5
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
Lignées de carcinome folliculaire de la thyroïde isolées à partir du même patient (Goretzki, 1990) :
FTC133 tumeur primitiveFTC238 métastases pulmonaires
Induction de l'expression des marqueursde différenciation après ATRA 10‐6M
0
10
20
30
40
50
60
NIS 5DI Tg TPO TSHR PAX8
mR
NA
exp
ress
ion
(fol
d in
crea
se)
FTC133FTC238
Sensibilité différente à l’ATRA
SENSIBLERESISTANTE
ChomienneBiolCell 2017
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
RARD RARE RARJ RXRD RXRE RXRJ0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4
Rel
ativ
e m
RN
A e
xpre
ssio
n FTC133FTC238
++ +++ ++ + + ‐Tissu sain
Perte d’expression de RARE
Expression relative des RAR et RXR par qPCR
ChomienneBiolCell 2017
Modèle cellulaire d’étude de la réponse aux rétinoïdes
Induction de l'expression de RARE après traitement par l’ATRA
La sensibilité à l’ATRA est corrélée à l’expression et à l’induction de
l’expression du RARE
mRN
A expressio
n (fo
ld increase)
ChomienneBiolCell 2017
ChomienneBiolCell 2017
RARE
Gènes ciblesNIS - 5’DI
RXR RARE
ARCellules normales
Cellules cancéreuses sensibles à l’AR: induction de RARb et induction de NIS et 5DI
Cellules cancéreuses résistantes à l’AR: pas d’induction de RARb et pas de NIS et 5DI
RARE
ARPas d’expression des Gènes ciblesNIS - 5’DI, pas de captation d’iode
Cellules cancéreuses: pas de RARE
① Anomalies des protéines
transcriptionnelles RAR ou RXR endogènes ?
Etude de la voie de transactivation de l’AR dans les
cellules résistantes FTC238
Conclusion❏ Le complexe transcriptionnel (RXR-RAR) est fonctionnel dans
les cellules FTC238. ❏ Pas d’anomalie de RAR ou RXR endogène.
!
6
ChomienneBiolCell 2017
Causes du défaut d’expression de RARE�dans les cellules de métastases FTC238 par l’AR
RARE
mRNARARE
RXR RAR
AR
Anomalies des protéines transcriptionnellesRAR ou RXR endogènes?
Anomalies épigénétiques:Anomalies du promoteur de RARE?
Anomalies de synthèse ou durée de viedu messager ou de la protéine RARE"
RARE
ChomienneBiolCell 2017
Etude de la voie de transactivation de l’ARdans les cellules résistantes FTC238
¾ L’AR est capable de transactiver les séquences RARE d’un gène rapporteur
¾ Donc le complexe transcriptionnel (RAR, RXR etc…) est fonctionnel dans
les cellules FTC238
Capacité de transactivation mesurées 16 h après transfection par le
RAREbéta-Luc et traitement par l’AR
Fold induction
0
100
200
300
400
Control ATRA
RXR RAR
RARE luc
Mesure de la luciférase
ChomienneBiolCell 2017
Transactivation efficace avec un gène rapporteur RARE
RARE
mRNARARE
RXR RAR
AR
Pas d’ anomalies de RAR ou RXR endogènesAnomalies du promoteur de RARE?Anomalies de synthèse ou durée de viedu messager ou de la protéine RARE"
RARE
Méthylation de l’ADN au niveau des promoteurs
Modification épigénétique
9Modulation de la structure de la chromatine9Méthylation de l’ADN9Déacétylation des histones9 Régulation de la transcription des gènes
DNMTDNMT
MBDMBDMeCPMeCP
HDACHDAC HDACHDAC
FTGFTG HATHAT
HMT
Transcription OFF
Cellules cancéreusesHyperméthylation des ilôts CpG de gènes
spécifiques
Répression transcriptionelle des gènes suppresseurs de tumeurs
ChomienneBiolCell 2017
❏ On se sert d’un gène rapporteur pour étudier la fonction transcriptionnelle endogène.
❏ Ce gène rapporteur (fabriqué de façon synthétique) code pour une enzyme : la luciférase, qui va émettre de la lumière.
❏ On introduit le gène dans les cellules FTC238 et on la traite avec de l’AR.
! ! ❏ On observe une émission de lumière ainsi que l’expression de la
luciférase. ❏ Les récepteurs se sont fixés sur la séquence RARE et ont induit
l’expression de luciférase.
6
ChomienneBiolCell 2017
Causes du défaut d’expression de RARE�dans les cellules de métastases FTC238 par l’AR
RARE
mRNARARE
RXR RAR
AR
Anomalies des protéines transcriptionnellesRAR ou RXR endogènes?
Anomalies épigénétiques:Anomalies du promoteur de RARE?
Anomalies de synthèse ou durée de viedu messager ou de la protéine RARE"
RARE
ChomienneBiolCell 2017
Etude de la voie de transactivation de l’ARdans les cellules résistantes FTC238
¾ L’AR est capable de transactiver les séquences RARE d’un gène rapporteur
¾ Donc le complexe transcriptionnel (RAR, RXR etc…) est fonctionnel dans
les cellules FTC238
Capacité de transactivation mesurées 16 h après transfection par le
RAREbéta-Luc et traitement par l’AR
Fold induction
0
100
200
300
400
Control ATRA
RXR RAR
RARE luc
Mesure de la luciférase
ChomienneBiolCell 2017
Transactivation efficace avec un gène rapporteur RARE
RARE
mRNARARE
RXR RAR
AR
Pas d’ anomalies de RAR ou RXR endogènesAnomalies du promoteur de RARE?Anomalies de synthèse ou durée de viedu messager ou de la protéine RARE"
RARE
Méthylation de l’ADN au niveau des promoteurs
Modification épigénétique
9Modulation de la structure de la chromatine9Méthylation de l’ADN9Déacétylation des histones9 Régulation de la transcription des gènes
DNMTDNMT
MBDMBDMeCPMeCP
HDACHDAC HDACHDAC
FTGFTG HATHAT
HMT
Transcription OFF
Cellules cancéreusesHyperméthylation des ilôts CpG de gènes
spécifiques
Répression transcriptionelle des gènes suppresseurs de tumeurs
ChomienneBiolCell 2017
6
ChomienneBiolCell 2017
Causes du défaut d’expression de RARE�dans les cellules de métastases FTC238 par l’AR
RARE
mRNARARE
RXR RAR
AR
Anomalies des protéines transcriptionnellesRAR ou RXR endogènes?
Anomalies épigénétiques:Anomalies du promoteur de RARE?
Anomalies de synthèse ou durée de viedu messager ou de la protéine RARE"
RARE
ChomienneBiolCell 2017
Etude de la voie de transactivation de l’ARdans les cellules résistantes FTC238
¾ L’AR est capable de transactiver les séquences RARE d’un gène rapporteur
¾ Donc le complexe transcriptionnel (RAR, RXR etc…) est fonctionnel dans
les cellules FTC238
Capacité de transactivation mesurées 16 h après transfection par le
RAREbéta-Luc et traitement par l’AR
Fold induction
0
100
200
300
400
Control ATRA
RXR RAR
RARE luc
Mesure de la luciférase
ChomienneBiolCell 2017
Transactivation efficace avec un gène rapporteur RARE
RARE
mRNARARE
RXR RAR
AR
Pas d’ anomalies de RAR ou RXR endogènesAnomalies du promoteur de RARE?Anomalies de synthèse ou durée de viedu messager ou de la protéine RARE"
RARE
Méthylation de l’ADN au niveau des promoteurs
Modification épigénétique
9Modulation de la structure de la chromatine9Méthylation de l’ADN9Déacétylation des histones9 Régulation de la transcription des gènes
DNMTDNMT
MBDMBDMeCPMeCP
HDACHDAC HDACHDAC
FTGFTG HATHAT
HMT
Transcription OFF
Cellules cancéreusesHyperméthylation des ilôts CpG de gènes
spécifiques
Répression transcriptionelle des gènes suppresseurs de tumeurs
ChomienneBiolCell 2017
Ronéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !9 12
① ③
②
② Anomalies épigénétiques: Anomalies du promoteur de
RARβ ?
Méthylation de l’ADN au niveau des promoteurs
Conclusion ❏ La résistance à l’ATRA de la lignée FTC238 n'est pas due à une hyperméthylation de l’ADN au niveau du promoteur de RARβ2.
Rappel des différents types de modifications épigénétiques : • Modulation de la structure de la chromatine • Méthylation de l’ADN • Déacétylation des histones • Régulation de la transcription des gènes
❏ La plupart des cellules cancéreuses sont hyperméthylées au niveau des ilots CpG des gènes suppresseurs de tumeurs, ce qui induit la répression de leur transcription.
❏ Etudions la méthylation de l’ADN codant pour RARβ grâce à la réaction d’amplification génique (PCR) :
1. Modification de l'ADN par le bisulfite de sodium → conversion des cytosines non méthylées en uracile
2. PCR avec des amorces spécifiques de la séquence contenant des cytosines méthylées et non méthylées
!
!
7
Etude de la méthylation de l'ADN du promoteur RARβ2
Methylation specific PCR
1 ‐Modification de l'ADN par le bisulfite de sodium o conversion des cytosines non méthylées en
uracile
2 ‐ PCR avec des amorces spécifiques de la séquence contenant des cytosines méthylées
et non méthylées
La résistance à l’ATRA de la lignée FTC238 n'est pas due à une
hyperméthylation de l’ADN au niveau du promoteur de RARE2
0
1
2
3
4
ATRA AZA ATRA + AZA
FTC133FTC238
Fold
incr
ease
Effet de la 5‐aza‐deoxycytidine (inhibiteur de DNMT) sur l'expression de RARE2Primers
UnmethylatedPrimers
Methylated
ChomienneBiolCell 2017
Chromatine Immunoprécipitation assay: permet de déterminer les complexes protéiques (complexes protéiques,
histones, protéines transcriptionnelles) liées sur le promoteur (chromatine)
Blocage des protéinesFixées sur la chromatine (ADN)
Casser (couper) la chromatine
Fixation d’anticorps contrela protéine fixée sur la chromatineImmunoprécipitation, séparationProtéine-ADN, purification ADN
Amplification des séquencesADN sur lesquelles les protéinessont fixées par PCR
ChomienneBiolCell 2017
ChomienneBiolCell 2017
Acétylation des histones H3 et H4RAR RXR Désacétylation
AR
RAR RXR
RAREE
REPRESSION ACTIVATION
RAREE
• Etudes des histones acétylés liés au promoteur: •Chromatine Immunoprécipitation: ChIP
Chromatine avec protéines fixéesImmunoprécipitation avec anti-corps antiprotéines (anti-H3 ou H4 acétylés)Puis amplification de la région promotrice à l’aide d’amorces spécifiques (RAREE)
Absence d’acétylation des histones
012345678
6 h 16 h 6 h 16 h
Ac-H3 Ac-H4
Fold
incr
ease
Time
FTC133FTC238
Taux faibled’ acétylation histonesdans FTC238
Intérêt d’une association ATRA et thérapie épigénétique
DNMTDNMT
RARRARRXRRXR
HDACHDAC HDACHDAC
Transcription OFF
Inhibiteur d’HDACTrichostatine A
RARRARRXRRXR
Transcription ON
ATRA+ iHDCA
ATRATSAATRA + TSA
012345678
6 h 16 h 6 h 16 h
Ac-H3 Ac-H4
FTC238
Fold
incr
ease
Time
Effet de la trichostatine A, un inhibiteur des HDAC, sur l’acétylation des histones
Ac Ac Ac
ChomienneBiolCell 2017
7
Etude de la méthylation de l'ADN du promoteur RARβ2
Methylation specific PCR
1 ‐Modification de l'ADN par le bisulfite de sodium o conversion des cytosines non méthylées en
uracile
2 ‐ PCR avec des amorces spécifiques de la séquence contenant des cytosines méthylées
et non méthylées
La résistance à l’ATRA de la lignée FTC238 n'est pas due à une
hyperméthylation de l’ADN au niveau du promoteur de RARE2
0
1
2
3
4
ATRA AZA ATRA + AZA
FTC133FTC238
Fold
incr
ease
Effet de la 5‐aza‐deoxycytidine (inhibiteur de DNMT) sur l'expression de RARE2Primers
UnmethylatedPrimers
Methylated
ChomienneBiolCell 2017
Chromatine Immunoprécipitation assay: permet de déterminer les complexes protéiques (complexes protéiques,
histones, protéines transcriptionnelles) liées sur le promoteur (chromatine)
Blocage des protéinesFixées sur la chromatine (ADN)
Casser (couper) la chromatine
Fixation d’anticorps contrela protéine fixée sur la chromatineImmunoprécipitation, séparationProtéine-ADN, purification ADN
Amplification des séquencesADN sur lesquelles les protéinessont fixées par PCR
ChomienneBiolCell 2017
ChomienneBiolCell 2017
Acétylation des histones H3 et H4RAR RXR Désacétylation
AR
RAR RXR
RAREE
REPRESSION ACTIVATION
RAREE
• Etudes des histones acétylés liés au promoteur: •Chromatine Immunoprécipitation: ChIP
Chromatine avec protéines fixéesImmunoprécipitation avec anti-corps antiprotéines (anti-H3 ou H4 acétylés)Puis amplification de la région promotrice à l’aide d’amorces spécifiques (RAREE)
Absence d’acétylation des histones
012345678
6 h 16 h 6 h 16 h
Ac-H3 Ac-H4
Fold
incr
ease
Time
FTC133FTC238
Taux faibled’ acétylation histonesdans FTC238
Intérêt d’une association ATRA et thérapie épigénétique
DNMTDNMT
RARRARRXRRXR
HDACHDAC HDACHDAC
Transcription OFF
Inhibiteur d’HDACTrichostatine A
RARRARRXRRXR
Transcription ON
ATRA+ iHDCA
ATRATSAATRA + TSA
012345678
6 h 16 h 6 h 16 h
Ac-H3 Ac-H4
FTC238
Fold
incr
ease
Time
Effet de la trichostatine A, un inhibiteur des HDAC, sur l’acétylation des histones
Ac Ac Ac
ChomienneBiolCell 2017
Ronéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !10 12
❏ Dans cette expérience, on observe qu’un inhibiteur de DNMT (AZA) n’induit pas de changement d’expression de RARβ dans les deux lignées.
❏ On peut observer une absence de méthylation des séquences promotrices des gènes codants pour RARβ que ce soit dans les c e l l u l e s F T C 2 3 8 o u FTC133.
③ Anomalies de synthèse ou durée
de vie du messager ou de la protéine RARβ ?
Étude des complexes
protéiques liés sur le promoteur
❏ Etude qui permet de voir si les histones sont sous une forme hypoacétylée.
❏ On ne regarde plus l’ADN mais ses protéines fixées. On va donc effectuer une immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) pour identifier les complexes protéiques liés sur les promoteurs :
! Blocage des protéines fixées sur la chromatine (ADN)
↓ Casser (couper) la chromatine
↓ Fixation d’anticorps contre la protéine fixée sur la chromatine,
immunoprécipitation, séparation protéine-ADN, purification ADN ↓
Amplification des séquences ADN sur lesquelles les protéines sont fixées par PCR
Rappel : L’immunoprécipitation est la technique qui permet la précipitation d’un antigène (protéine) en solution par un anticorps qui agglutine spécifiquement une protéine particulière.
7
Etude de la méthylation de l'ADN du promoteur RARβ2
Methylation specific PCR
1 ‐Modification de l'ADN par le bisulfite de sodium o conversion des cytosines non méthylées en
uracile
2 ‐ PCR avec des amorces spécifiques de la séquence contenant des cytosines méthylées
et non méthylées
La résistance à l’ATRA de la lignée FTC238 n'est pas due à une
hyperméthylation de l’ADN au niveau du promoteur de RARE2
0
1
2
3
4
ATRA AZA ATRA + AZA
FTC133FTC238
Fold
incr
ease
Effet de la 5‐aza‐deoxycytidine (inhibiteur de DNMT) sur l'expression de RARE2Primers
UnmethylatedPrimers
Methylated
ChomienneBiolCell 2017
Chromatine Immunoprécipitation assay: permet de déterminer les complexes protéiques (complexes protéiques,
histones, protéines transcriptionnelles) liées sur le promoteur (chromatine)
Blocage des protéinesFixées sur la chromatine (ADN)
Casser (couper) la chromatine
Fixation d’anticorps contrela protéine fixée sur la chromatineImmunoprécipitation, séparationProtéine-ADN, purification ADN
Amplification des séquencesADN sur lesquelles les protéinessont fixées par PCR
ChomienneBiolCell 2017
ChomienneBiolCell 2017
Acétylation des histones H3 et H4RAR RXR Désacétylation
AR
RAR RXR
RAREE
REPRESSION ACTIVATION
RAREE
• Etudes des histones acétylés liés au promoteur: •Chromatine Immunoprécipitation: ChIP
Chromatine avec protéines fixéesImmunoprécipitation avec anti-corps antiprotéines (anti-H3 ou H4 acétylés)Puis amplification de la région promotrice à l’aide d’amorces spécifiques (RAREE)
Absence d’acétylation des histones
012345678
6 h 16 h 6 h 16 h
Ac-H3 Ac-H4
Fold
incr
ease
Time
FTC133FTC238
Taux faibled’ acétylation histonesdans FTC238
Intérêt d’une association ATRA et thérapie épigénétique
DNMTDNMT
RARRARRXRRXR
HDACHDAC HDACHDAC
Transcription OFF
Inhibiteur d’HDACTrichostatine A
RARRARRXRRXR
Transcription ON
ATRA+ iHDCA
ATRATSAATRA + TSA
012345678
6 h 16 h 6 h 16 h
Ac-H3 Ac-H4
FTC238
Fold
incr
ease
Time
Effet de la trichostatine A, un inhibiteur des HDAC, sur l’acétylation des histones
Ac Ac Ac
ChomienneBiolCell 2017
❏ On observe les protéines histones acétylées dans la région promotrice de RARβ, permettant la transcription du gène.
❏ On utilise des anticorps spécifiques (anti-H3 acétylé ou anti-H4 acétylé) et une amplification de la région promotrice à l’aide d’amorces spécifiques.
❏ On observe un taux faible d’acétylation des histones dans les cellules FTC238.
!
7
Etude de la méthylation de l'ADN du promoteur RARβ2
Methylation specific PCR
1 ‐Modification de l'ADN par le bisulfite de sodium o conversion des cytosines non méthylées en
uracile
2 ‐ PCR avec des amorces spécifiques de la séquence contenant des cytosines méthylées
et non méthylées
La résistance à l’ATRA de la lignée FTC238 n'est pas due à une
hyperméthylation de l’ADN au niveau du promoteur de RARE2
0
1
2
3
4
ATRA AZA ATRA + AZA
FTC133FTC238
Fold
incr
ease
Effet de la 5‐aza‐deoxycytidine (inhibiteur de DNMT) sur l'expression de RARE2Primers
UnmethylatedPrimers
Methylated
ChomienneBiolCell 2017
Chromatine Immunoprécipitation assay: permet de déterminer les complexes protéiques (complexes protéiques,
histones, protéines transcriptionnelles) liées sur le promoteur (chromatine)
Blocage des protéinesFixées sur la chromatine (ADN)
Casser (couper) la chromatine
Fixation d’anticorps contrela protéine fixée sur la chromatineImmunoprécipitation, séparationProtéine-ADN, purification ADN
Amplification des séquencesADN sur lesquelles les protéinessont fixées par PCR
ChomienneBiolCell 2017
ChomienneBiolCell 2017
Acétylation des histones H3 et H4RAR RXR Désacétylation
AR
RAR RXR
RAREE
REPRESSION ACTIVATION
RAREE
• Etudes des histones acétylés liés au promoteur: •Chromatine Immunoprécipitation: ChIP
Chromatine avec protéines fixéesImmunoprécipitation avec anti-corps antiprotéines (anti-H3 ou H4 acétylés)Puis amplification de la région promotrice à l’aide d’amorces spécifiques (RAREE)
Absence d’acétylation des histones
012345678
6 h 16 h 6 h 16 h
Ac-H3 Ac-H4
Fold
incr
ease
Time
FTC133FTC238
Taux faibled’ acétylation histonesdans FTC238
Intérêt d’une association ATRA et thérapie épigénétique
DNMTDNMT
RARRARRXRRXR
HDACHDAC HDACHDAC
Transcription OFF
Inhibiteur d’HDACTrichostatine A
RARRARRXRRXR
Transcription ON
ATRA+ iHDCA
ATRATSAATRA + TSA
012345678
6 h 16 h 6 h 16 h
Ac-H3 Ac-H4
FTC238
Fold
incr
ease
Time
Effet de la trichostatine A, un inhibiteur des HDAC, sur l’acétylation des histones
Ac Ac Ac
ChomienneBiolCell 2017
Ronéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !11 12
Dédicace à la team BU P12 : Mailys mais aussi Aude qui nous a malheureusement quitté pour le club des plantes mais qu’on aime quand même. A Clara D, Clara E, Baya, Joséphine, Auréliane et Tom qui égayent au quotidien nos journées BU. A nos D1 adorés : Nico (fantômas dans nos coeurs), Margot et Bibi de la fanf. Et bien sûr Louise, à qui on donne tout le courage et la force pour majorer le concours cette année (t’as pas le choix t’as les meilleurs coaches du monde).
③ Anomalies de synthèse ou durée
de vie du messager ou de la protéine RARβ ?
(suite)
Étude des complexes
protéiques liés sur le promoteur
(suite)
Conclusion❏ L’association de l’ATRA à un inhibiteur d’HDAC permet de
restaurer la sensibilité à l’ATRA et d’induire une différenciation des cellules tumorales.
C. Conclusion
Les cellules de cancer de la thyroïde résistantes à l’AR : ❏ Pas d’expression des gènes cibles de RARb dans la cellule thyroïdienne (NIS, 5 DI, TG) ❏ Pas d’induction du gène RARb par l’AR dans la cellule résistante ❏ Promoteur de RARb non permissif à la transcription (pas de recrutement des histones
acétylées) dans la cellule résistante ❏ Association d’un inhibiteur d’HDAC à l’AR restaure l’expression de RARb et par
conséquent des gènes cibles NIS et 5 DI
❏ Des drogues sont utilisées pour permettre l’acétylation des histones comme la Trichostatine A, qui est un inhibiteur des HDAC.
❏ On observe une augmentation de l’acétylation des histones des cellules résistantes.
! ❏ On induit la transcription du gène RARβ en présence de
Trichostatine A et d’ATRA, dans les cellules de la lignée FTC238.
!
8
Intérêt de l’association de l’ATRA et d’un inhibiteur d’HDAC
0
5
10
15
20
25
2 h 6 h 12 h 24 h
ATRATSAATRA + TSA
Fold increase
0
200
400
600
800
1000
2 h 6 h 12 h 24 h
ATRATSAATRA + TSA
Expression du RARE Expression du NIS
L’association de l’ATRA à un inhibiteur d’HDAC permet de restaurer la sensibilité à l’ATRA et d’induire une différenciation des cellules tumorales
FTC238 FTC238
ChomienneBiolCell 2017
Conclusion• Les cellules de cancer de la thyroïde résistantes à l’AR- pas d’expression des gènes cibles de RARb dans la cellule
thyroïdienne (NIS, 5 DI, TG)- pas d’induction du gène RARb par l’AR dans la cellule
résistante- Promoteur de RARb non permissif à la transcription (pas
de recrutement des histones acétylés) dans la cellule résistante
- Association d’un inhibiteur d’HDAC à l’AR restaure l’expression de RARb et par conséquent des gènes cibles NIS et 5 DI
ChomienneBiolCell 2017
Ronéo n°8 - UE1 BioCell - Cours n°2 Page ! sur !12 12