N° d’ordre 2008-ISAL-0123 Année 2008
THESE
Présentée devant
L’INSTITUT NATIONAL DES SCIENCES APPLIQUEES DE LYON
Pour obtenir
LE GRADE DE DOCTEUR
Formation doctorale : Biochimie Ecole Doctorale Interdisciplinaire Sciences-Santé
Par
Jérôme BOUVIER
Bis(Monoacylglycéro)Phosphate, acide docosahexaénoïque et cholestérol :
Relations métaboliques et fonctionnelles dans les macrophages
Soutenance prévue le 18 décembre 2008
JURY
RECORD Michel Directeur de recherche Rapporteur VISIOLI Francesco Professeur Rapporteur BUCHET René Professeur Examinateur DIONISI Fabiola Docteur Examinatrice KOBAYASHI Toshihide Directeur de recherche Examinateur LAGARDE Michel Professeur Directeur de thèse VANDENBROUCKE Isabelle Maître de conférences Co-directrice de thèse
INSA Direction de la Recherche - Ecoles Doctorales – Quadriennal 2007-2010
SIGLE ECOLE DOCTORALE NOM ET COORDONNEES DU RESPONSABLE
CHIMIE CHIMIE DE LYON http://sakura.cpe.fr/ED206
M. Jean Marc LANCELIN. Université Claude Bernard Lyon 1, bât. CPE 43 bd du 11 novembre 1918, 69622 VILLEURBANNE Cedex. Tél : 04.72.43.13.95, email : [email protected]
E.E.A. ELECTRONIQUE, ELECTROTECHNIQUE, AUTOMATIQUE http://www.insa-lyon.fr/eea
M. Alain NICOLAS. Ecole Centrale de Lyon, bât. H9 36 av. Guy de Collongue 69134 ECULLY. Tél : 04.72.18.60.97, Fax : 04.78.43.37.17, email : [email protected]
E2M2 EVOLUTION, ECOSYSTEMES, MICROBIOLOGIE, MODELISATION http://biomserv.univ-lyon1.fr/E2M2
M. Jean-Pierre FLANDROIS. CNRS UMR 5558 Université Claude Bernard Lyon 1, bât. G. Mendel 43 bd du 11 novembre 1918, 69622 VILLEURBANNE Cedex. Tél : 04.26.23.59.50, Fax : 04.26.23.59.49, email : [email protected]
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M. Alain MILLE. Université Claude Bernard Lyon 1, LIRIS – EDIIS, bât. Nautibus 43 bd du 11 novembre 1918, 69622 VILLEURBANNE Cedex. Tél : 04.72.44.82.94, Fax : 04.72.44.80.53, emails : [email protected] - [email protected]
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M. Didier REVEL. Hôpital Cardiologique de Lyon, bât. Central 28 av. Doyen Lépine, 69500 BRON. Tél : 04.72.68.49.09, Fax : 04.72.35.49.16, email : [email protected]
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M. Jean Marc PELLETIER. INSA de Lyon MATEIS, bât. Blaise Pascal 7 av. Jean Capelle, 69621 VILLEURBANNE Cedex. Tél : 04.72.43.83.18, Fax : 04.72.43.85.28, email : [email protected]
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M. Pascal KOIRAN. Ecole Normale Supérieure de Lyon, 46 allée d’Italie, 69364 LYON Cedex 07. Tél : 04.72.72.84.81, Fax : 04.72.72.89.69, email : [email protected]
MEGA MECANIQUE, ENERGETIQUE, GENIE CIVIL, ACOUSTIQUE http://mega.ec-lyon.fr
M. Jean Louis GUYADER. INSA de Lyon, Laboratoire de Vibrations et Acoustique, bât. Antoine de Saint Exupéry 25 bis av. Jean Capelle, 69621 VILLEURBANNE Cedex. Tél : 04.72.18.71.70, Fax : 04.72.18.87.12, email : [email protected]
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*ScSo : Histoire, Géographie, Aménagement, Urbanisme, Archéologie, Science politique, Sociologie, Anthropologie
RESUME
Le bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP) est un phospholipide localisé quasi exclusivement
dans les endosomes tardifs. Il est impliqué dans le transport de macromolécules qui transitent
via ce compartiment cellulaire. Nous montrons qu’un anticorps anti-BMP ainsi que
l’accumulation de BMP dans des macrophages en culture altère les flux du cholestérol issu
des lipoprotéines, depuis les endosomes tardifs vers la membrane plasmique et le réticulum
endoplasmique. Par ailleurs, le BMP incorpore sélectivement l’acide docosahexaénoïque
(DHA, 22:6n-3) dont les bénéfices cardiovasculaires ont été rapportés chez l’Homme. Notre
étude indique qu’un apport élevé de DHA in vitro ou in vivo stimule la formation de l’espèce
moléculaire 22:6/22:6-BMP. Cette molécule présente une grande sensibilité à la peroxydation,
ce qui lui confère un rôle protecteur vis-à-vis de l’oxydation du cholestérol. Nous proposons
que le 22:6/22:6-BMP puisse agir comme un anti-oxydant local au niveau des endosomes
tardifs.
SUMMARY
Bis(monoacylglycero)phosphate (BMP) is a unique phospholipid preferentially found in late
endosomes of mammalian cells. BMP is involved in the transport of macromolecules that
transit through this compartment. We show that an anti-BMP antibody or the accumulation of
BMP in cultured macrophages alters the redistribution of lipoprotein-derived cholesterol from
late endosomes to plasma membrane and endoplasmic reticulum. Moreover, BMP selectively
incorporates docosahexaenoic acid (DHA, 22:6n-3) whose cardiovascular benefits have been
reported in Humans. We here report that high supplementation of DHA both in vitro and in
vivo stimulate the formation of the 22:6/22:6-BMP molecular species. This molecule is very
prone to peroxidation, and as such, is able to protect cholesterol against oxidation. We
therefore propose that 22:6/22:6-BMP could act as a potential anti-oxidant in its immediate
vicinity in endosomal membranes.
AVANT PROPOS Le travail présenté dans ce mémoire a fait l’objet de publications scientifiques et a été présenté par communications orales ou affichées lors de congrès scientifiques. Publications scientifiques avec comité de lecture : BOUVIER J., ZEMSKI BERRY K. A., HULLIN-MATSUDA F., MAKINO A., MICHAUD S., GELOEN A., MURPHY R. C., KOBAYASHI T., LAGARDE M., DELTON-VANDENBROUCKE I. Selective decrease of bis(monoacylglycerol)phosphate (BMP) in macrophages by high supplementation with docosahexaenoic acid. Journal of Lipid Research, 2007, Sous presse. DELTON-VANDENBROUCKE I., BOUVIER J., MAKINO A., BESSON N., PAGEAUX J. F., LAGARDE M. et KOBAYASHI T. Anti-bis(monoacylglycero)phosphate antibody accumulates acetylated LDL-derived cholesterol in cultured macrophages. Journal of Lipid Research, 2007, vol. 48, n°3, pp. 543-552. Publications scientifiques (abstracts) : BOUVIER J., ZEMSKI BERRY K. A., MURPHY R. C., LAGARDE M., KOBAYASHI T., DELTON-VANDENBROUCKE I. High docosahexaenoic acid content in bis(monoacylglycerol)phosphate is associated with oxidative degradation of this phsopholipid. Chemistry and Physics of Lipids, 2007, vol. 149 Supplement, p. S57 BOUVIER J., BESSON N., MAKINO A., PAGEAUX J. F., LAGARDE M., KOBAYASHI T., DELTON-VANDENBROUCKE I. Characterization of lysobisphosphatidic acid issued from phosphatidylglycerol in RAW macrophages. Chemistry and Physics of Lipids, 2005, vol. 136 Supplement, p. S132 Communications orales: BOUVIER J., LAGARDE M., DELTON-VANDENBROUCKE I. First evidence for the biocellular significance of very high docosahexaenoic acid enrichment in Bis(Monoacylglycero)Phosphate. Séminaire doctorant 2008-2009 de l’IFR62, novembre 2008, Faculté de Médecine RTH Laennec, Lyon. BOUVIER J., ZEMSKI BERRY K. A., HULLIN-MATSUDA F., MICHAUD S., MURPHY R. C., KOBAYASHI T., LAGARDE M., DELTON-VANDENBROUCKE I. Selective decrease of bis(monoacylglycerol)phosphate (BMP) in macrophages by high supplementation with docosahexaenoic acid. Groupe d'Etude et de Recherche en Lipidomique (GERLI) : 4ème Congrès de Lipidomique, octobre 2007, Toulouse.
Communications affichées : HULLIN-MATSUDA F., BOUVIER J., DELTON-VANDENBROUCKE I. MAKINO A., LAGARDE M., KOBAYASHI T. Cholesterol metabolism and transport are affected by the late endosome lipid, bis(monoacylglycero)phosphate. The American Society for Biochemistry and Molecular Biology : ASMBM Special Symposio, octobre 2008, Canmore, CANADA. BOUVIER J., ZEMSKI BERRY K. A., MURPHY R. C., LAGARDE M., KOBAYASHI T., DELTON-VANDENBROUCKE I. High docosahexaenoic acid content in bis(monoacylglycerol)phosphate is associated with oxidative degradation of this phsopholipid. International Conference on the Bioscience of Lipids : the 48th ICBL, septembre 2007, Turku, FINLANDE. BOUVIER J., PAGEAUX J. F., KOBAYASHI T., LAGARDE M., DELTON-VANDENBROUCKE I. Modifications of Bis(Monoacylglycero)Phosphate content in RAW macrophages as a new approach to study its cellular role in cholesterol homeostasis. Institut Multidisciplinaire de Biochimie des Lipides (IMBL) : 7ème journée scientifique, septembre 2006, Lyon.
BOUVIER J., BESSON N., MAKINO A., PAGEAUX J. F., LAGARDE M., KOBAYASHI T., DELTON-VANDENBROUCKE I. Characterization of lysobisphosphatidic acid issued from phosphatidylglycerol in RAW macrophages. Groupe d'Etude et de Recherche en Lipidomique (GERLI) : 3ème Congrès de Lipidomique, mai 2006, Marseille. BOUVIER J., BESSON N., MAKINO A., PAGEAUX J. F., LAGARDE M., KOBAYASHI T., DELTON-VANDENBROUCKE I. Characterization of lysobisphosphatidic acid issued from phosphatidylglycerol in RAW macrophages. International Conference on the Bioscience of Lipids : the 46th ICBL, septembre 2005, Ajaccio.
SOMMAIRE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
7
SOMMAIRE LISTE DES FIGURES ...................................................................................... 13
LISTE DES TABLEAUX ................................................................................. 16
LISTE DES ABREVIATIONS ........................................................................ 17
INTRODUCTION GENERALE ..................................................................... 18 RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES ................................................................ 21
Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol......................... 22 1.1 Le cholestérol ........................................................................................................ 22
1.1.1 Structure du cholestérol .................................................................................. 22 1.1.2 Distribution cellulaire du cholestérol ............................................................. 23 1.1.3 Les microdomaines riches en cholestérol ....................................................... 23
1.2 Métabolisme cellulaire du cholestérol ................................................................ 25 1.2.1 Biosynthèse du cholestérol ............................................................................. 25 1.2.2 Régulation de la quantité cellulaire de cholestérol ......................................... 27 1.2.3 Cycle d’hydrolyse et d’estérification du cholestérol ...................................... 28 1.2.4 Oxydation du cholestérol - les oxystérols ....................................................... 29
1.2.4.1 Formation des oxystérols ...................................................................... 30 1.2.4.2 Implication des oxystérols au cours de l’athérogenèse ......................... 31 1.2.4.3 Régulation du métabolisme intracellulaire du cholestérol par les
oxystérols : LXR et OSBP .................................................................... 31 1.3 Le transport intracellulaire du cholestérol ........................................................ 33
1.3.1 Les différents modes de transport intracellulaire du cholestérol .................... 33 1.3.2 Généralités sur les lipoprotéines ..................................................................... 35 1.3.3 Endocytose des LDL par les macrophages ..................................................... 36
1.3.3.1 Les LDL et LDL oxydées ..................................................................... 36 1.3.3.2 Endocytose des LDL : les différents récepteurs et mécanismes ........... 37 1.3.3.3 La voie endocytique .............................................................................. 39
1.3.4 Le transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs............................. 40 1.3.5 Le transport du cholestérol à partir de la membrane plasmique ..................... 41 1.3.6 Le transport du cholestérol à partir du réticulum endoplasmique .................. 42 1.3.7 Efflux du cholestérol ...................................................................................... 42
1.3.7.1 Efflux médié par les transporteurs ABCA1, ABCG1 et ABCG4 ......... 43 1.3.7.2 Efflux médié par le récepteur SR-BI .................................................... 45
Chapitre 2 : Généralités sur les acides gras et les phospholipides ................................ 47
2.1 Les acides gras ..................................................................................................... 47 2.2 Les phospholipides : classes, sous-classes et composition en acides gras ....... 52 2.3 Métabolisme des phospholipides ........................................................................ 55
2.3.1 Biosynthèse des phospholipides ..................................................................... 55 2.3.2 Remodelage des phospholipides ..................................................................... 58
2.3.2.1 Les phospholipases ............................................................................... 58 2.3.2.2 Voies de dé-acylation/ré-acylation ....................................................... 60 2.3.2.3 Voies de transacylation ......................................................................... 61
SOMMAIRE
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8
Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA) ............................................................ 62 3.1 Généralités sur le DHA ........................................................................................ 62
3.1.1 Origine du DHA ............................................................................................. 62 3.1.2 Distribution du DHA ...................................................................................... 62 3.1.3 Incorporation du DHA dans les phospholipides in vitro et in vivo ................ 63
3.2 Rôle des acides gras oméga-3 dans l’incidence des maladies cardiovasculaires ................................................................................................. 64
3.2.1 Les études épidémiologiques .......................................................................... 65 3.2.2 Les études cliniques ........................................................................................ 65 3.2.3 Les mécanismes physiologiques mis en jeu ................................................... 66
3.3 Rôles cellulaires du DHA ..................................................................................... 67 3.3.1 Structure et dynamique moléculaires du DHA dans les membranes .............. 67 3.3.2 Modification des propriétés membranaires .................................................... 68 3.3.3 DHA et microdomaines membranaires .......................................................... 68 3.3.4 Le DHA comme médiateur lipidique et activateur de gènes .......................... 69 3.3.5 Rôle du DHA dans le métabolisme intracellulaire du cholestérol .................. 70
Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP) .............................................. 71
4.1 Découverte, distribution et localisation subcellulaire du BMP........................ 71 4.1.1 Découverte et distribution du BMP ................................................................ 71 4.1.2 Localisation subcellulaire du BMP ................................................................. 71
4.2 Structure du BMP ................................................................................................ 72 4.2.1 Le squelette glycérophosphate ........................................................................ 72 4.2.2 La position des chaînes acyles ........................................................................ 74 4.2.3 La composition en acides gras ........................................................................ 75
4.3 La voie de biosynthèse du BMP .......................................................................... 75 4.4 Métabolisme du BMP .......................................................................................... 79
4.4.1 Modifications pathologiques et induites du BMP .......................................... 79 4.4.2 Dégradation enzymatique et remodelage des acyles gras du BMP ................ 81
4.5 Le rôle cellulaire du BMP ................................................................................... 82
Chapitre 5 : La peroxydation lipidique ........................................................................... 86 5.1 Les espèces réactives dérivées de l’oxygène (ROS) ........................................... 86 5.2 Mécanismes de la peroxydation lipidique non-enzymatique ........................... 86
5.2.1 Les différentes phases ..................................................................................... 87 5.2.2 Les anti-oxydants ............................................................................................ 88
5.3 Les produits d’oxydation des AGPI ................................................................... 89 5.3.1 Oxydation enzymatique des AGPI ................................................................. 89 5.3.2 Oxydation non-enzymatique des AGPI .......................................................... 91
5.3.2.1 Conservation de la structure de l’acide gras ......................................... 91 5.3.2.2 Altération de la structure de l’acide gras .............................................. 92
MATERIELS ET METHODES ...................................................................... 94
1. Produits spécifiques .................................................................................................... 95 1.1 Standards lipidiques ............................................................................................ 95 1.2 Molécules radioactives et consommables ........................................................... 95 1.3 Consommables pour la culture cellulaire .......................................................... 96
SOMMAIRE
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9
1.4 Produits spécifiques pour la microscopie à fluorescence ................................. 96 1.5 Produits divers ..................................................................................................... 96
2. Matériels Biologiques ................................................................................................. 97
2.1 La lignée cellulaire RAW 264.7 .......................................................................... 97 2.2 La lignée cellulaire BHK 21 ................................................................................ 97 2.3 Les lipoprotéines .................................................................................................. 98
2.3.1 Préparation des lipoprotéines .......................................................................... 98 2.3.2 Acétylation des LDL ...................................................................................... 98 2.3.3 Marquage des LDL avec du [3H]cholestéryl oléate ou du [3H]cholestérol .... 99
2.4 Animaux et traitements ....................................................................................... 99
3. Préparation des liposomes de phosphatidylglycérol (PG) .................................... 100
4. Traitements des cellules et protocoles expérimentaux .......................................... 101 4.1 Incubation en présence de l’anticorps anti-BMP ............................................ 101 4.2 Incubation en présence de U18666A et de F1394 ............................................ 101 4.3 Incubation en présence de liposomes de PG +/- vitamine E........................... 102 4.4 Incubation en présence de DHA non estérifié +/- vitamine E ........................ 102 4.5 Culture des cellules dans des conditions oxydantes ........................................ 102
5. Etude du métabolisme et du transport intracellulaire du cholestérol ................. 103
5.1 Mesure de l’accumulation de cholestérol libre et d’esters de cholestérol ..... 103 5.2 Mesure de la captation des LDL et de l’hydrolyse des esters de
cholestérol ........................................................................................................... 103 5.3 Mesure de l’estérification du cholestérol dérivé de la captation des LDL .... 104
5.3.1 Première méthode : utilisation de [3H]FC-LDL ........................................... 104 5.3.2 Deuxième méthode : utilisation du [3H]oléate ............................................. 104
5.4 Mesure de l’efflux médié par les HDL ou la méthyl-β-cyclodextrine ........... 105 5.5 Traitement des cellules avec la cholestérol oxydase ........................................ 105 5.6 Mesure de la sensibilité des cellules avec l’amphotéricine B ......................... 106
6. Oxydation du BMP et du cholestérol en système acellulaire ................................ 106
7. Analyse des lipides .................................................................................................... 107
7.1 Extraction des lipides totaux ............................................................................. 107 7.1.1 Extraction à partir des cellules RAW 264.7 et BHK 21 ............................... 107 7.1.2 Extraction à partir de foie de souris .............................................................. 108
7.2 Séparation des classes de lipides et des classes de phospholipides par chromatographie sur couche mince (CCM) .................................................... 109
7.2.1 Séparation des classes de lipides .................................................................. 109 7.2.2 Séparation des classes de phospholipides par CCM en 2 dimensions .......... 109 7.2.3 Traitements des plaques après élution .......................................................... 110
7.3 Purification du BMP et des PE par HPLC ...................................................... 111 7.4 Analyse des acides gras par chromatographie gazeuse (GC) ........................ 112
7.4.1 Préparation des échantillons ......................................................................... 112 7.4.2 Appareillage et conditions d’analyse ............................................................ 112 7.4.3 Identification des acides gras et quantification ............................................. 113
7.5 Quantification du cholestérol libre par GC-MS ............................................. 113
SOMMAIRE
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7.6 Analyse des espèces moléculaires du BMP par ESI-MS ................................ 114
8. Analyse de la radioactivité ....................................................................................... 115 8.1 L’analyseur de radioactivité linéaire (Berthold) ............................................. 115 8.2 Le compteur à scintillation ................................................................................ 115
9. Dosage du dialdéhyde malonique (MDA)............................................................... 115
10. Dosage de la vitamine E ........................................................................................... 116
11. Fractionnement cellulaire sur les cellules BHK ..................................................... 117
12. Isolement des radeaux lipidiques riches en cholestérol ......................................... 118
13. Microscopie à fluorescence ...................................................................................... 119
13.1 Localisation du BMP par immuno-détection .................................................. 119 13.2 Localisation de l’anticorps anti-BMP accumulé dans les cellules ................. 120 13.3 Localisation du cholestérol cellulaire ............................................................... 120 13.4 Internalisation des DiI-LDL et DiI-acLDL ...................................................... 120 13.5 Observation de la fluorescence ......................................................................... 121
14. Analyses statistiques ................................................................................................. 121
RESULTATS ................................................................................................... 122
PREMIERE PARTIE...................................................................................................... 123
Introduction ..................................................................................................................... 124
1.1 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la distribution intracellulaire du cholestérol ........................................................................................................... 125
1.2 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’accumulation de cholestérol libre induite par la captation des acLDL ................................................................. 127
1.3 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’estérification du cholestérol .................. 129 1.4 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la captation des acLDL ............................ 132 1.5 Effet de l’anticorps anti-BMP sur le cholestérol libre de la membrane
plasmique ........................................................................................................... 133 1.5.1 Mesure de la sensibilité des cellules à l’amphotéricine B ............................ 133 1.5.2 Mesure de l’oxydabilité du cholestérol membranaire par la cholestérol
oxydase ......................................................................................................... 135 1.5.3 Mesure de l’extraction du cholestérol cellulaire par la cyclodextrine
(MβCD) ........................................................................................................ 136 1.6 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’efflux du cholestérol stimulé par les
HDL .................................................................................................................... 137 1.7 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la répartition du cholestérol entre les
différents domaines membranaires.................................................................. 138
Discussion ......................................................................................................................... 140
SOMMAIRE
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11
DEUXIEME PARTIE ..................................................................................................... 144
Introduction ..................................................................................................................... 145
2.1 Caractérisation et dosage du BMP dans les macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ........................................................................... 146
2.1.1 Rappel de la méthode ................................................................................... 146 2.1.2 Quantification des PC, PE et du BMP dans les macrophages RAW
cultivés dans des conditions contrôles ......................................................... 149 2.1.3 Composition en acides gras des PC, PE et du BMP dans les
macrophages RAW ...................................................................................... 149 2.2 Effets du 18:1/18:1-PG sur la quantité et la composition en acides gras
du BMP dans les macrophages RAW .............................................................. 151 2.2.1 Augmentation spécifique de la quantité de BMP dans les macrophages
RAW après supplémentation par du 18:1/18:1-PG ...................................... 151 2.2.2 Localisation du BMP dans les macrophages RAW après
supplémentation avec du 18:1/18:1-PG ....................................................... 156 2.2.3 Fractionnement cellulaire réalisé sur les cellules BHK après
supplémentation avec du 18:1/18:1-PG ....................................................... 157 2.3 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur le
trafic intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL ...................................... 158 2.3.1 Colocalisation du BMP et des LDL endocytées ........................................... 159 2.3.2 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la
captation des LDL ........................................................................................ 160 2.3.3 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur
l’hydrolyse des esters de cholestérol dérivés des LDL ................................ 161 2.3.4 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la ré-
estérification du cholestérol libre dérivé de la captation des LDL et des acLDL ........................................................................................................... 164
2.3.5 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur l’efflux du cholestérol stimulé par les HDL et la MβCD ............................. 165
2.3.6 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la quantité cellulaire d’esters de cholestérol après incubation en présence de acLDL ...................................................................................................... 167
Discussion ......................................................................................................................... 168
TROISIEME PARTIE .................................................................................................... 175
Introduction ..................................................................................................................... 176
3.1 Effets d’une supplémentation des macrophages RAW avec des liposomes de 22:6/22:6-PG ................................................................................ 177
3.2 Effets d’une supplémentation des macrophages RAW avec des concentrations croissantes de DHA non estérifié ........................................... 184
3.3 Analyse des espèces moléculaires du BMP ...................................................... 190 3.4 Formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP in vitro et in vivo ........... 193
SOMMAIRE
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12
3.4.1 Formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP dans les macrophages RAW cultivés en routine dans un milieu supplémenté en vitamine E ................... 194
3.4.2 Formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP in vivo dans le foie de souris placées sous un régime alimentaire enrichi en DHA ................................... 195
3.5 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA sous l’action d’un stress oxydant ..................................................................................................... 197
3.5.1 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA dans les macrophages RAW ............................................................................................................. 198
3.5.2 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA dans un système acellulaire ..................................................................................................... 199
3.6 Le BMP riche en DHA protège partiellement le cholestérol de l’oxydation dans un système acellulaire .......................................................... 200
Discussion ......................................................................................................................... 203
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES................................... 214
REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES ...................................................... 218
ANNEXES ........................................................................................................ 255
ANNEXE 1 ....................................................................................................................... 257
ANNEXE 2 ....................................................................................................................... 270
ANNEXE 3 ....................................................................................................................... 274
ANNEXE 4 ....................................................................................................................... 276
LISTE DES FIGURES
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LISTE DES FIGURES Figure 1 : Structure du cholestérol et du linoléoyl-cholestérol. ............................................... 22 Figure 2 : Représentation schématique des radeaux lipidiques et des cavéoles. ...................... 25 Figure 3 : Voie de biosynthèse du cholestérol. ........................................................................ 26 Figure 4 : Régulation de la quantité cellulaire de cholestérol par SREBP. .............................. 28 Figure 5 : Formation des oxystérols. ........................................................................................ 30 Figure 6 : Transport intracellulaire du cholestérol. .................................................................. 33 Figure 7 : Les différents modes de transport du cholestérol. ................................................... 34 Figure 8 : Représentation schématique d’une particule de LDL. ............................................. 36 Figure 9 : Endocytose des LDL, représentation schématique de la voie endocytique. ............ 39 Figure 10 : Représentation schématique de l’efflux du cholestérol médié par SR-BI,
ABCA1, ABCG1 et par diffusion passive. ............................................................ 46 Figure 11 : abréviation symbolique et structure du DHA ........................................................ 48 Figure 12 : Structures et représentations de quelques acides gras. .......................................... 50 Figure 13 : Synthèse des acides gras oméga-6 et oméga-3 à partir de l’acide linoléique
(18:2n-6) et l’acide linolénique (18:3n-3) respectivement. ................................... 51 Figure 14 : Structures et représentations des phospholipides. ................................................. 54 Figure 15 : Biosynthèse des principaux phospholipides. ......................................................... 56 Figure 16 : Sites d’action des différentes phospholipases ........................................................ 60 Figure 17 : Cycle de dé-acylation-ré-acylation (cycle de Lands) ............................................ 61 Figure 18 : Représentation en 3 dimensions du 18:1/18:1-BMP ............................................. 74 Figure 19 : Structures du phosphatidylglycérol et du bis(monoacylglycéro)phosphate. ......... 74 Figure 20 : Voie de biosynthèse du BMP à partir du PG exogène. .......................................... 79 Figure 21 : Mécanismes de la peroxydation lipidique non-enzymatique. ................................ 88 Figure 22 : Les principaux médiateurs lipidiques issus de l’oxydation enzymatique
des acides gras polyinsaturés AA, EPA et DHA. .................................................. 90 Figure 23 : Structures du DHA et de 3 docosanoïdes : le 17S-HydroxyDHA,
la protectine D1 et la résolvine D1. ....................................................................... 90 Figure 24 : Les produits d’oxydation non-enzymatique du DHA. ........................................... 93 Figure 25 : Schéma représentatif du gradient discontinu de sucrose (%) utilisé pour isoler
les endosomes tardifs et les endosomes précoces à partir de cellules BHK. ....... 118 Figure 26 : Schéma représentatif du gradient discontinu de saccharose utilisé pour isoler
les radeaux lipidiques. ......................................................................................... 119 Figure 27 : Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’accumulation de cholestérol libre dans les
macrophages THP-1. ........................................................................................... 126 Figure 28 : Colocalisation de l’anticorps anti-BMP et des DiI-acLDL dans les
macrophages RAW. ............................................................................................. 127 Figure 29 : Accumulation du cholestérol libre (FC) stimulée par les acLDL dans les
macrophages RAW.. ............................................................................................ 128 Figure 30 : Accumulation des esters de cholestérol (CE) stimulée par les acLDL dans les
macrophages RAW. ............................................................................................. 130 Figure 31 : Estérification du cholestérol stimulée par les acLDL. ......................................... 131 Figure 32 : Mesure de la sensibilité des macrophages RAW à l’amphotéricine B. ............... 135 Figure 33 : Efflux du [3H]cholestérol dérivé des acLDL stimulé par la MβCD dans les
macrophages RAW. ............................................................................................. 137 Figure 34 : Efflux du [3H]cholestérol dérivé des acLDL stimulé par les HDL dans les
macrophages RAW. ............................................................................................. 138
LISTE DES FIGURES
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Figure 35 : Séparation sur gradient de saccharose des radeaux lipidiques dans des macrophages RAW. ............................................................................................. 140
Figure 36 : Profil de migration des classes de phospholipides en CCM-2D .......................... 147 Figure 37 : Protocole d’extraction et de purification des PC, des PE et du BMP. ................. 148 Figure 38 : Chromatogrammes HPLC d’un standard commercial de 18:1/18:1-BMP et de
BMP extrait de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles. ...... 149 Figure 39 : Variation des quantités cellulaires de BMP, de PC et de PE après
supplémentation des macrophages RAW avec différentes concentrations de 18:1/18:1-PG. ...................................................................................................... 153
Figure 40 : Profil d’élution des lipides marqués avec le [3H]oléate après la première migration en CCM. .............................................................................................. 153
Figure 41 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG. ...................................................................................... 154
Figure 42 : Chromatogrammes en HPLC des PE et du 18:1/18:1-PG ................................... 154 Figure 43 : Localisation subcellulaire du BMP. ..................................................................... 156 Figure 44 : Analyse de la composition en phospholipides des différentes fractions
isolées à partir de fibroblastes BHK. ................................................................... 158 Figure 45 : Colocalisation du BMP et des LDL endocytées dans les macrophages RAW. ... 159 Figure 46 : Captation des [3H]CO-LDL dans les macrophages RAW.. ................................. 161 Figure 47 : Effet du F1394 sur l’estérification du cholestérol stimulé par les LDL dans
les macrophages RAW. ....................................................................................... 162 Figure 48 : Variation de la quantité de radioactivité associée au cholestérol libre ([3H]FC)
et aux esters de cholestérol ([3H]CO) en présence de [3H]CO-LDL. .................. 163 Figure 49 : Taux d’hydrolyse du [3H]CO dérivé de la captation des [3H]CO-LDL dans
les macrophages RAW. ....................................................................................... 163 Figure 50 : Taux de ré-estérification du cholestérol dérivé des [3H]FC-LDL et des
[3H]FC-acLDL dans les macrophages RAW. ..................................................... 165 Figure 51 : Efflux du cholestérol stimulé par les HDL et la MβCD dans les macrophages
RAW. ................................................................................................................... 166 Figure 52 : Accumulation d’esters de cholestérol stimulée par les acLDL dans les
macrophages RAW. ............................................................................................. 168 Figure 53 : Variation des quantités cellulaires de BMP, de PC et de PE en présence de
22:6/22:6-PG.. ..................................................................................................... 178 Figure 54 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de
macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E. ......................................................... 182
Figure 55 : Variation des quantités de MDA dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. ...................................................................................................... 183
Figure 56 : Variation de la proportion de DHA dans les PC, les PE et le BMP des macrophages RAW en présence de DHA non estérifié....................................... 185
Figure 57 : Variation des quantités cellulaires de BMP dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. ........................................................................... 189
Figure 58 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de DHA non estérifié +/- vitamine E. ................................................. 190
Figure 59 : Spectres de masse en ESI-MS du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E. ......................................................... 192
LISTE DES FIGURES
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Figure 60 : Variation de la quantité de BMP et de la proportion de OA et DHA dans les macrophages RAW cultivés en routine dans un milieu supplémenté en vitamine E. ........................................................................................................... 195
Figure 61 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de foie de souris nourries avec un régime alimentaire standard (contrôle) ou enrichi en DHA. .................................................................................................. 197
Figure 62 : Variation de la quantité de BMP en fonction de son enrichissement en 18:1 ou 22:6 dans les macrophages RAW soumis à un stress oxydant. .............. 199
Figure 63 : Oxydation du 18:1/18:1-BMP et du 22:6/22:6-BMP dans un système acellulaire. ........................................................................................................... 200
Figure 64 : Oxydation du cholestérol en système acellulaire en présence de 18:1/18:1-BMP ou de 22:6/22:6-BMP. ............................................................... 202
Figure 65 : Oxydation du cholestérol en système acellulaire en présence de 18:1/18:1-BMP ou de 22:6/22:6-BMP. ............................................................... 203
Figure 66 : Nombre de décès liés aux maladies cardiaques ischémiques par pays en 1990 (pour 100000 habitants) .............................................................................. 258
Figure 67 : Représentation schématique de la paroi artérielle saine. ..................................... 260 Figure 68 : Schéma du métabolisme des lipoprotéines : le transport du cholestérol
dans l’organisme. ................................................................................................. 266 Figure 69 : Représentation schématique de l’évolution et la constitution d’une plaque
d’athérome de type fibreuse. ............................................................................... 269 Figure 70 : Chromatogrammes des acides gras. ..................................................................... 270 Figure 71 : Localisation subcellulaire du BMP dans les macrophages RAW incubés
dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E. ..................................................................................................... 274
Figure 72 : Marquage des endosomes tardifs par des LDL et acLDL fluorescentes. ............ 275
LISTE DES TABLEAUX
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LISTE DES TABLEAUX Tableau 1 : Caractéristiques et composition des différentes classes de lipoprotéines. ............ 35 Tableau 2 : Classification et nomenclature des principaux acides gras. .................................. 49 Tableau 3 : Composition en acides gras des régimes alimentaires standard (A03) et
enrichi en DHA. .................................................................................................. 100 Tableau 4 : Composition en nutriments des régimes alimentaires ......................................... 100 Tableau 5 : Composition en acides gras des esters de cholestérol cellulaires et associés
aux acLDL. .......................................................................................................... 131 Tableau 6 : Captation des [3H]CO-acLDL par les macrophages RAW et distribution
de la radioactivité cellulaire entre le cholestérol libre (FC) et les esters de cholestérol (CE). .................................................................................................. 132
Tableau 7 : Composition en acides gras des PC, PE et du BMP dans les macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles. ..................................................... 150
Tableau 8 : Composition en acides gras du BMP, des PC et des PE dans les macrophages RAW cultivés en présence de 18:1/18:1-PG. ..................................................... 155
Tableau 9 : Variation de la composition en acides gras du BMP dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. ................................................................... 179
Tableau 10 : Variation de la composition en acides gras des PE dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. ................................................................. 180
Tableau 11 : Variation de la composition en acides gras des PC dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. ................................................................. 181
Tableau 12 : Variation de la composition en acides gras du BMP dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. ......................................................... 186
Tableau 13 : Variation de la composition en acides gras des PE dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. ......................................................... 187
Tableau 14 : Variation de la composition en acides gras des PC dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. ......................................................... 188
Tableau 15 : Variation de la composition des espèces moléculaires du BMP dans les macrophages RAW en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG. .......................... 193
Tableau 16 : Composition en acides gras du BMP, des PC et des PE dans le foie de souris nourries avec un régime alimentaire standard (contrôle) ou enrichi en DHA ............................................................................................................. 196
Tableau 17 : Classification des lésions de l’athérosclérose selon Stary................................. 267
LISTE DES ABBREVIATIONS
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LISTE DES ABREVIATIONS AA : acide arachidonique ACAT : acyl-CoA cholestérol acyl transférase AG : acide gras AGPI : acides gras polyinsaturés ALA : acide alpha-linolénique BMP : Bis(monoacylglycéro)Phosphate CCM (CCM-2D) : chromatographie sur couche mince (en deux dimension) CE : esters de cholestérol CL : cardiolipines CO : cholestéryl-oléate DHA : acide docosahexaénoïque DMA : diméthylacétals EDTA : acide éthylène-diamine-tétra-acétique EE : « early endosomes », endosomes précoces EPA : acide eicosapentaénoïque FC : « free cholesterol », cholestérol libre FCS : « fœtal calf serum », sérum de veau fœtal GC : chromatographie gazeuse HDL : « high density lipoprotein», lipoprotéine de haute densité HPLC : chromatographie liquide haute performance IDL : « intermediate density lipoprotein », lipoprotéine de densité intermédiare LA : acide linoléique LDL : « low density lipoprotein», lipoprotéine de faible densité LE : « late endosomes », endosomes tardifs LPDS : « lipoprotein deficient serum », sérum déficient en lipoprotéines MDA : dialdéhyde malonique MβCD : méthyl-β-cyclodextrine NPC : Niemann-Pick de type C OA : acide oléique PA : acide phosphatidique PBS : « Phosphate-buffered saline », tampon phosphate PC : phosphatidylcholines PE : phosphatidyléthanolamines PG : phosphatidylglycérols PI : les phosphatidylinositols PL/GPL : phospholipides/glycérophospholipides PLA / PLC / PLD : phospholipase A / phospholipase C / phospholipase D PM : membrane plasmique PS : phosphatidylsérines RE : réticulum endoplasmique Rf : référence frontale ROS : espèces réactives dérivées de l’oxygène SM : sphingomyélines TAG/TG : Triacylglycérols VLDL : « very low density lipoprotein », lipoprotéine de très faible densité
INTRODUCTION GENERALE
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18
INTRODUCTION GENERALE
L’athérosclérose est une pathologie majeure en santé publique. Dans le monde, et
plus particulièrement dans les pays industrialisés, les deux premières causes de mortalité sont
des complications de l'athérosclérose : les ischémies cardiaques et les accidents vasculaires
cérébraux. L’athérosclérose est définie par l’Organisation Mondiale de la Santé comme « une
association de remaniements de l’intima des artères de gros et moyen calibre consistant en
une accumulation focale de lipides, de glucides complexes, de sang et de dépôts calcaires
avec remaniement de la média » (Toussaint et al., 2003). Elle se caractérise notamment par
une dérégulation de l’homéostasie du cholestérol au niveau du plasma sanguin et des cellules
vasculaires. Les monocytes du sang périphérique peuvent traverser l’endothélium et se
différencier en macrophages résidents dans l’espace sous endothélial. Au cours de
l’athérogenèse et en présence de lipoprotéines de faible densité (LDL) oxydées les
macrophages résidents accumulent de grandes quantités de cholestérol et d’esters de
cholestérol. Ceci conduit à la formation de cellules spumeuses qui constituent les premiers
dépôts lipidiques dans l’intima des artères et participent ainsi à l’apparition et au
développement de la plaque d’athérome (Vainio et Ikonen, 2003).
L’accumulation de cholestérol dans les macrophages spumeux résulte d’une
perturbation du métabolisme et du transport intracellulaire du cholestérol. Les macrophages
acquièrent du cholestérol principalement par endocytose des LDL. Après avoir été captées, les
LDL suivent la voie endocytique et aboutissent aux endosomes tardifs où les esters de
cholestérol qu’elles contiennent sont hydrolysés. Les endosomes tardifs constituent alors le
point de départ du transport intracellulaire du cholestérol et assurent sa redistribution vers les
autres compartiments cellulaires, principalement vers le réticulum endoplasmique où le
cholestérol est ré-estérifié, et vers la membrane plasmique dans laquelle le cholestérol est
incorporé et à partir de laquelle il peut être exporté hors de la cellules par différents
mécanismes d’efflux stimulés par des accepteurs extracellulaires comme les lipoprotéines de
haute densité (HDL) (Simons et Ikonen, 2000 ; Soccio et Breslow, 2004).
Les endosomes tardifs sont des compartiments multi-vésiculaires et multi-
lamellaires jouant un rôle de stockage et de redistribution de différentes molécules. Les
membranes internes des endosomes tardifs contiennent une forte proportion du phospholipide
bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP), parfois appelé acide lyso-bis-phosphatidique
INTRODUCTION GENERALE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
19
(LBPA). Le BMP est un isomère structural du phosphatidylglycérol (PG) qui constitue par
ailleurs le précurseur principal dans la voie de biosynthèse du BMP (Amidon et al., 1995). Le
BMP représente généralement une faible proportion des phospholipides cellulaires mais est
localisé presque exclusivement dans les endosomes tardifs/lysosomes où il forme des
microdomaines spécialisés (Kobayashi et al., 2001a ; Kobayashi et al., 2002).
Le BMP présente des caractéristiques originales sur le plan structural et
métabolique (Huterer et Wherrett, 1979 ; Joutti et Renkonen, 1979a ). En particulier,
d’anciennes études ont montré que le BMP possède une forte propension à incorporer l’acide
docosahexaénoïque (DHA, 22:6n-3), un acide gras polyinsaturé à longue chaîne de la série n-
3 (Huterer et Wherrett, 1986). Le DHA est un constituant majeur des huiles de poissons dont
le rôle cardio-protecteur a été rapporté par de nombreuses études épidémiologiques et
cliniques (Lee et al., 2008 ; von Schacky et Harris, 2007). A ce titre le DHA a fait l’objet de
nombreux travaux dans notre unité (Delton-Vandenbroucke et al., 2001 ; Lagarde et al.,
2003) et c’est dans ce cadre que nous avons commencé à nous intéresser au BMP notamment
d’un point de vue structural (Luquain et al., 2000 ; Luquain et al., 2001) et métabolique
(Besson et al., 2006).
Les premières données sur la fonction du BMP proviennent de travaux réalisés par
le Dr. Toshihide Kobayashi grâce à un anticorps monoclonal dirigé spécifiquement contre le
BMP. Des études réalisées sur des fibroblastes et des cellules endothéliales ont montré que
l’anticorps anti-BMP, après internalisation par endocytose, modifie l’organisation des
membranes internes des endosomes tardifs et entraîne une accumulation de cholestérol dans
ces structures (Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi et al., 1999). Dans le cadre des maladies
cardiovasculaires qui constituent le contexte physiopathologique de notre projet de recherche
et grâce à une collaboration entreprise avec l’institut RIKEN au Japon, nous nous sommes
également intéressés au rôle cellulaire du BMP dans les macrophages. Dans un premier temps
nous avons cherché à étudier en détail les conséquences sur le métabolisme et le transport
intracellulaire du cholestérol d’une perturbation de la fonction du BMP induite par
l’accumulation de l’anticorps anti-BMP dans les endosomes tardifs des macrophages THP-1
et RAW. Les résultats obtenus, publiés dans « Journal of Lipid Research » (Delton-
Vandenbroucke et al., 2007), sont présentés dans la première partie des résultats.
Afin de mieux comprendre le rôle des microdomaines à BMP dans le métabolisme
et le transport intracellulaire du cholestérol dans les macrophages nous avons ensuite cherché
INTRODUCTION GENERALE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
20
à étudier les conséquences d’une augmentation spécifique de la quantité cellulaire de BMP.
Pour cela notre stratégie a consisté à incuber les cellules en présence de liposomes
reconstitués avec du di-oléoyl-phosphoglycérol (18:1/18:1-PG) qui est efficacement converti
en BMP par les macrophages RAW (Amidon et al., 1995). Nous avons montré qu’il était
possible de cette manière d’augmenter la quantité de BMP dans les macrophages RAW d’un
facteur 4, puis nous avons étudié les conséquences fonctionnelles de cette accumulation de
BMP sur le transport intracellulaire du cholestérol. Nos résultats, encore préliminaires, sont
présentés dans la deuxième partie des résultats.
L’une des priorités de notre projet de recherche consistait également à déterminer
la signification biologique de l’enrichissement du BMP en DHA. En nous appuyant sur
l’approche développée avec le précurseur 18:1/18:1-PG nous avons supplémenté les
macrophages RAW avec du di-docosahexaénoyl-phosphoglycérol (22:6/22:6-PG). Nous
avons ainsi pu mettre en évidence la formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP qui
présente une très grande sensibilité à la peroxydation lipidique. Nos résultats indiquent
également que dans un modèle membranaire in vitro, l’espèce 22:6/22:6-BMP qui constitue
une cible privilégiée des espèces radicalaires dérivées de l’oxygène, protège partiellement le
cholestérol de l’oxydation. Ainsi pour la première fois nous avons mis en évidence une
conséquence fonctionnelle de l’avidité du BMP pour le DHA et nous proposons que l’espèce
22:6/22:6-BMP pourrait jouer un rôle anti-oxydant spécifiquement dans les endosomes
tardifs, notamment vis-à-vis du cholestérol dérivé des LDL. Le BMP enrichi en DHA pourrait
ainsi prévenir la formation intracellulaire d’oxystérols qui participent à l’évolution des
macrophages en cellules spumeuses (Brown et Jessup, 1999 ; Clare et al., 1995). Les résultats
obtenus, publiés dans « Journal of Lipid Research » (Bouvier et al., 2008), sont présentés
dans la troisième partie des résultats.
La première partie de ce mémoire est consacrée aux rappels bibliographiques
comportant cinq chapitres. Le premier concerne le transport intracellulaire du cholestérol puis,
après un chapitre de généralités sur les différentes classes de lipides, nous présentons plus en
détail les données de la littérature sur le BMP et le DHA. Enfin le dernier chapitre traite de la
peroxydation lipidique. Nous présentons ensuite une partie de Matériels et Méthodes puis
l’ensemble des résultats expérimentaux obtenus au cours de cette étude. Ce mémoire se
termine par une conclusion générale et par l’exposé des perspectives qui découlent de notre
étude.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
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21
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
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Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
1.1 Le cholestérol
1.1.1 Structure du cholestérol
Le cholestérol fut identifié pour la première fois, sous sa forme solide, dans des
calculs biliaires par François Poulletier de la Salle en 1769. Toutefois sa découverte est
généralement attribuée au chimiste français Eugène Chevreul en 1815 qui lui donna le nom de
cholestérine. Sa formule empirique (C27H46O) ne fut établie qu’en 1888 par Reinitzer. Enfin
sa structure correcte, formulée par Wieland et Dane, fut rapportée en 1932 (Vance et Van den
Bosch, 2000).
Le cholestérol est un lipide de la famille des stéroïdes. Sa structure est caractérisée
par quatre cycles notés A, B, C et D et une chaîne hydrocarbonée branchée. Les atomes de
carbone sont numérotés de 1 à 27. Le cholestérol possède également une double liaison entre
les carbones 5 et 6 (cycle B), et un groupement hydroxyle (alcool secondaire) sur le carbone 3
en position β (au dessus du plan du cycle A) (Figure 1).
Au niveau cellulaire le cholestérol existe de manière stable principalement sous
deux formes : une forme libre et une forme estérifiée où la fonction hydroxyle est estérifiée
par un acide gras (Figure 1). Le cholestérol libre est un constituant majeur des membranes
cellulaires et intervient dans différentes voies de signalisation, alors que le cholestérol
estérifié est davantage une forme de stockage pour la cellule.
cholestérollinoléoyl-cholestérol (18:2n-6-cholestérol)
Figure 1 : Structure du cholestérol et du linoléoyl-cholestérol.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
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23
1.1.2 Distribution cellulaire du cholestérol
Les différents compartiments des cellules de mammifères présentent des
compositions lipidiques et protéiques distinctes. Ceci est particulièrement vrai pour le
cholestérol. En effet sa concentration est très faible dans le réticulum endoplasmique (RE)
mais augmente progressivement dans l’appareil de Golgi, du cis- au trans-Golgi, pour
atteindre son niveau le plus élevé dans la membrane plasmique. Ainsi, la membrane
plasmique contient environ 70% du cholestérol cellulaire total (Maxfield et Wustner, 2002).
La concentration en cholestérol varie également beaucoup entre les différents compartiments
de la voie endocytique (Kobayashi et al., 1998a). Les endosomes de recyclage et les vésicules
internes des endosomes précoces apparaissent relativement riches en cholestérol
contrairement aux endosomes tardifs/lysosomes (Mobius et al., 2003).
De plus, les feuillets internes et externes des membranes biologiques présentent
aussi des compositions lipidiques différentes. Toutefois, concernant le cholestérol, sa
répartition entre les deux feuillets est encore mal connue. Plusieurs études ont pour le moment
fourni des résultats divergents (Maxfield et Wustner, 2002).
Enfin, les membranes biologiques présentent une grande hétérogénéité latérale.
Contrairement au modèle de la mosaïque fluide proposée par Singer et Nicholson en 1972, il
se forme dans les membranes biologiques des microdomaines membranaires appelés
« radeaux lipidiques » ou « rafts » qui se distinguent du reste de la membrane par leur
composition et leurs propriétés.
1.1.3 Les microdomaines riches en cholestérol
Notre vision de la membrane plasmique des cellules a beaucoup évoluée ces vingt
dernières années. D’abord considérée comme un assemblage homogène de lipides et de
protéines en libre diffusion, la membrane plasmique est aujourd’hui décrite comme une
mosaïque de microdomaines qui présentent différentes compositions en lipides et en protéines
(Maxfield, 2002 ; Mishra et Joshi, 2007 ; Schmitz et Grandl, 2008 ). Certains microdomaines
ont des structures très particulières et spécifiques comme les puits recouverts de clathrine ou
les cavéoles en forme d’invagination (Figure 2) (Conner et Schmid, 2003). Les radeaux
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
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24
lipidiques constituent un autre type de microdomaines dont l’assemblage met en jeu de fortes
interactions lipides-lipides et lipides-protéines. En effet ils sont riches en cholestérol,
sphingolipides, glycosphingolipides et en phospholipides contenant des acyles gras saturés à
longues chaînes. Cet environnement lipidique spécifique génère une région localement plus
ordonnée et plus compacte (phase liquide ordonnée ou Lo) que les membranes environnantes
(phase liquide désordonnée ou Ld), et attire certaines protéines notamment celles possédant
une ancre GPI ou des groupements palmitoyles comme les Src-kinases (Figure 2). Les
radeaux lipidiques représentent cependant un groupe hétérogènes de microdomaines (Pike,
2004). De plus, leur composition peut être modifiée dans certaines conditions physiologiques
(de Mello Coelho et al., 2004) ou après la liaison de ligands sur leurs récepteurs (Magee et
al., 2002). La caractérisation des radeaux lipidiques a très souvent été basée sur leur résistance
à la solubilisation dans les détergents comme le triton (Babiychuk et Draeger, 2006). Bien que
cette technique biochimique soit controversée (Lichtenberg et al., 2005 ; Ostrom et Liu,
2007), l’analyse des membranes résistantes aux détergents (DRM) reste un outil très utile en
particulier pour des études comparatives. La membrane plasmique n’est pas la seule à être
constituée de microdomaines, les membranes internes notamment celles du réticulum
endoplasmique (Browman et al., 2006), de l’appareil de Golgi (Eberle et al., 2002) et des
endosomes tardifs (Kobayashi et al., 2002 ; Sobo et al., 2007 ) sont constituées de
microdomaines spécifiques.
Les microdomaines membranaires sont impliqués dans certaines voies de
signalisation (Magee et al., 2002), et mécanismes d’endocytose (Parton et Richards, 2003)
ainsi que dans le transport intracellulaire du cholestérol. En effet la plupart des protéines
jouant un rôle de transporteurs du cholestérol sont associées à des microdomaines (Orlowski
et al., 2007). Les cavéoles en particulier jouent un rôle important dans le transport
intracellulaire du cholestérol (Ikonen et al., 2004), notamment dans l’efflux du cholestérol
aux HDL (Chao et al., 2003) et dans le transport du cholestérol à partir du réticulum
endoplasmique vers la membrane plasmique (Smart et al., 1996). De plus les cavéoles sont
associés à une protéine membranaire, la cavéoline, qui possède des sites de liaison au
cholestérol. D’autres protéines impliquées dans le transport du cholestérol sont associées aux
microdomaines riches en cholestérol. Il s’agit entre autres du récepteur « scavenger » SR-BI,
impliqué dans la captation des LDL oxydées par les macrophages (Rhainds et al., 2004), et du
transporteur ABCG1 impliqué dans l’efflux du cholestérol aux HDL (Vaughan et Oram,
2006).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
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25
1.2 Métabolisme cellulaire du cholestérol
1.2.1 Biosynthèse du cholestérol
Les cellules de mammifères possèdent toutes les enzymes nécessaires à la
synthèse de novo du cholestérol. Le foie et l’intestin sont les lieux principaux de la synthèse
du cholestérol mais les cellules périphériques, notamment les macrophages, synthétisent
également une partie de leur cholestérol.
Le cholestérol est synthétisé dans le réticulum endoplasmique à partir d’acétate et
via une série d’environ 30 réactions enzymatiques successives (Figure 3). Une étape
importante en raison de son ciblage pharmacologique par les statines fait intervenir l’enzyme
hydroxyméthylglutaryl CoA réductase (HMG-CoA réductase) qui génère du mévalonate.
L’HMG-CoA réductase est l’enzyme limitante dans la voie de biosynthèse du cholestérol. A
partir du mévalonate la cellule synthétise de l’isopentényl pyrophosphate puis du farnésyl
pyrophosphate et enfin du squalène. La première molécule de stérol produite dans cette voie
Figure 2 : Représentation schématique des radeaux lipidiques et des cavéoles. Modifié à partir de Chang et al. (2006)
protéine àancre GPI
protéine palmitoylée
radeau lipidique cavéole
cavéoline
cholestérol
SM PC PS phospholipide insaturé
GSL PE PI phospholipide saturé
feuillet externe
feuillet interne
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de biosynthèse est le lanostérol, formé à partir du squalène par l’enzyme squalène cyclase. Le
lanostérol est ensuite converti en cholestérol lors d’un processus complexe composé de 19
étapes au cours desquelles les doubles liaisons sont réduites, leurs positions modifiées et les
groupements méthyles supprimés (Berg et al., 2002).
Acétate
Mévalonate
Farnésyl pyrophosphate
Squalène
Lanostérol
Cholestérol
Isopentényl pyrophosphate
Figure 3 : Voie de biosynthèse du cholestérol.
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27
1.2.2 Régulation de la quantité cellulaire de cholestérol
Le facteur de transcription SREBP (Sterol Regulatory Element Binding Protein)
est l’élément principal du mécanisme homéostatique par lequel le cholestérol cellulaire exerce
un rétrocontrôle négatif sur sa propre synthèse (Bengoechea-Alonso et Ericsson, 2007 ;
Eberle et al., 2004 ; Yang et al., 2002). La protéine SREBP est présente sous forme inactive
dans la membrane du réticulum endoplasmique (RE), associée aux protéines SCAP (SREBP
Cleavage Activating Protein) et Insig. La protéine SCAP possède un domaine particulier
appelé « Sterol Sensing Domain » (SSD) lui permettant d’évaluer la quantité de cholestérol
présente dans le RE. Lorsque celle-ci est importante, le complexe SREBP-SCAP reste associé
à Insig dans le RE. Mais dès que la quantité de cholestérol diminue, cela induit une
modification conformationnelle du SSD de SCAP permettant au complexe SREBP-SCAP de
se dissocier de Insig et de rejoindre le Golgi. Deux protéases (S1P et S2P) présentes dans le
Golgi clivent SREBP et libèrent sa partie active N-terminale qui migre vers le noyau de la
cellule. Le facteur de transcription SREBP se lie alors à une séquence d’ADN spécifique, le
SRE (Sterol Regulatory Element), et active la transcription de gènes cibles. Parmi ces gènes
cible se trouvent ceux codant l’enzyme HMG-CoA réductase et le récepteur au LDL. Ainsi,
lorsque la quantité de cholestérol diminue, SREBP active la synthèse de ces deux protéines
qui vont respectivement accélérer la synthèse de cholestérol et augmenter la quantité de
cholestérol capté par endocytose des LDL (Figure 4).
La synthèse du cholestérol est également régulée de manière post-
transcriptionnelle. En effet il a été montré que lorsque la quantité de cholestérol dans le RE
diminue, la protéine Insig est rapidement ubiquitinée et dégradée dans le protéasome. De plus,
l’enzyme HMG-CoA réductase possède elle aussi un SSD capable de fixer le lanostérol, un
intermédiaire dans la voie de biosynthèse du cholestérol. Ainsi, dans des cellules appauvries
en cholestérol, la dégradation de l’HMG-CoA réductase est très lente. En revanche, lorsque la
quantité de cholestérol dans le RE est trop élevée, cela induit l’association de l’HMG-CoA
réductase avec la protéine Insig et active sa translocation vers le protéasome pour être
dégradée (Goldstein et al., 2006 ; Sever et al., 2003).
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28
1.2.3 Cycle d’hydrolyse et d’estérification du cholestérol
Dans la cellule, la fonction –OH du cholestérol peut être estérifiée par un acide
gras (principalement l’acide oléique) grâce à l’action d’une enzyme appelée acyl-
CoA:cholestérol acyltransférase (ACAT). Chez les macrophages, cette enzyme est localisée
Golgi
Noyau
gènes cibles
Diminution de la quantité de
cholestérol
RE RE
RE
Stabilisation du complexe Insig-SCAP-SREBP
Dissociation de SCAP-SREBP et de InsigTranslocation de SCAP-SREBP vers le Golgi
Activation protéolytique de SREBPMigration de la partie activée de SREBP vers le noyau
Dégradation de HMG-CoA réductaseDiminution de la synthèse de cholestérol
Dégradation de InsigDéstabilisation de Insig-SCAP-SREBP
Grande quantité de cholestérol
Activation de gènes cibles(HMG-CoA réductase, LDL-R)
Figure 4 : Régulation de la quantité cellulaire de cholestérol par SREBP. (Bengoechea-Alonso et Ericsson, 2007).
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29
dans le réticulum endoplasmique (Sakashita et al., 2000) où elle catalyse l’estérification du
cholestérol provenant de la membrane plasmique, de la biosynthèse de novo, ou de
l’endocytose des lipoprotéines de faible densité (LDL). L’activité de l’ACAT est régulée de
manière allostérique par le cholestérol, c’est-à-dire que son activité augmente en présence de
grandes quantités de cholestérol libre (Chang et al., 1998). De plus il a été montré que lorsque
la quantité de cholestérol atteint un certain seuil l’activité ACAT augmente dramatiquement,
participant à l’évolution des macrophages en cellules spumeuses (Xu et Tabas, 1991). Ainsi
l’ACAT produit des esters de cholestérol qui sont stockés dans des gouttelettes lipidiques
cytoplasmiques. Ces gouttelettes sont formées par des extensions du RE selon un mécanisme
faisant intervenir la protéine cavéoline-1 (Robenek et al., 2004). Des échanges peuvent
également se produire entre les gouttelettes lipidiques et le RE via des protéines de transport
(Prinz, 2007).
Les esters de cholestérol stockés dans les gouttelettes lipidiques peuvent être
hydrolysés pour former à nouveau du cholestérol libre qui rejoint alors la membrane
plasmique. Cette réaction est catalysée par la cholestéryl ester hydrolase neutre (nCEH)
présente dans le cytoplasme (Ghosh, 2000). Ainsi les gouttelettes lipidiques sont des
compartiments dynamiques dont le cholestérol subit un cycle permanant d’hydrolyses et
d’estérifications. La régulation de ce cycle est essentielle pour le maintien de l’homéostasie
cellulaire du cholestérol (Soccio et Breslow, 2004).
1.2.4 Oxydation du cholestérol - les oxystérols
Les cellules périphériques comme les macrophages ne peuvent pas cataboliser le
cholestérol excédentaire qui doit donc être transporté jusqu’au foie pour être transformé en
acides biliaires et sécrété dans la bile. Le cholestérol peut également être éliminé dans les
selles par l’intestin ou servir de précurseur dans la synthèse des hormones stéroïdes par les
tissus stéroïdogènes. Toutefois, les macrophages peuvent convertir le cholestérol en
oxystérols par différents mécanismes d’oxydation. Ces oxystérols jouent un rôle important
dans la régulation de l’homéostasie cellulaire du cholestérol dans les macrophages et ont été
associés au développement des lésions d’athérosclérose (Brown et Jessup, 1999 ; Gill et al.,
2008 ; Javitt, 2008 ).
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30
1.2.4.1 Formation des oxystérols
L’oxydation du cholestérol génère des groupements hydroxy-, céto- ou époxy- à
différents endroits de la molécule de cholestérol (Figure 5). Certains oxystérols sont générés
dans la cellule grâce à des enzymes spécifiques qui appartiennent à la famille du cytochrome
P450 (Russell, 2000). Les macrophages sont capables de convertir le cholestérol en 27-
hydroxycholestérol (27-OHC) grâce à la 27-hydroxylase (CYP27). D’autres oxystérols sont
également produits de manière enzymatique. Il s’agit du 24-OHC que l’on trouve
exclusivement dans le cerveau, du 7α-OHC que l’on retrouve dans le foie et qui sert
d’intermédiaire dans la synthèse des acides biliaires, du 25-OHC et du 24(S),25-époxy-
cholestérol qui sont générés lors de la biosynthèse du cholestérol (Olkkonen et Lehto, 2004).
Des oxystérols peuvent également être générés de manière non-enzymatique, par
un processus radicalaire appelé « auto-oxydation du cholestérol ». Il s’agit principalement du
7-cétocholestérol (7-KC), des 25-, 7α- et 7β-OHC, et du 5,6-époxy-cholestérol. Ces composés
peuvent être générés à l’intérieur de la cellule (Wen et Leake, 2007) ou provenir de la
captation de LDL oxydées. Ils sont également en partie apportés par l’alimentation
(Leonarduzzi et al., 2002).
ROS / Enz
ROSROSROS
EnzEnz
Enzcholestérol
7α–, 7β–OHC
7α–OHC
25–OHC
27–OHC
24,25–époxy-cholestérol
5,6–époxy-cholestérol
7–KC
Figure 5 : Formation des oxystérols. ROS : oxydation radicalaire. Enz : oxydation enzymatique.
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1.2.4.2 Implication des oxystérols au cours de l’athérogenèse
La plupart des oxystérols, notamment ceux générés de manière non-enzymatique,
sont décrits comme des composés cytotoxiques et proathérogènes. En effet le 7-KC possède
un effet cytotoxique et proapoptotique sur les macrophages en culture, ainsi que sur d’autres
cellules vasculaires comme les cellules musculaires lisses et les cellules endothéliales (Clare
et al., 1995 ; Lemaire-Ewing et al., 2005). Ces résultats restent cependant controversés car il a
été montré qu’un mélange de plusieurs oxystérols annule l’effet cytotoxique du 7-KC seul
(Biasi et al., 2004). L’oxydation des LDL in vitro par action du cuivre (Cu2+) génère de
grandes quantités d’oxystérols, notamment du 7-KC et du 7α-OHC (Brown et al., 1996). Or
l’incubation de macrophages en culture en présence de LDL oxydées induit une forte
accumulation d’oxystérols à l’intérieur des lysosomes et stimule la transformation des
macrophages en cellules spumeuses (Brown et al., 2000 ; Colles et al., 2001 ). De plus, des
quantités importantes d’oxystérols ont été mesurées in vivo chez l’homme dans les lésions
d’athérosclérose et les macrophages spumeux (Carpenter et al., 1995 ; Garcia-Cruset et al.,
2001). L’ensemble de ces observations réalisées in vitro et in vivo suggère donc que les
oxystérols jouent un rôle important au cours de l’athérogenèse et participent au
développement des lésions.
1.2.4.3 Régulation du métabolisme intracellulaire du cholestérol par les
oxystérols : LXR et OSBP
Les récepteurs nucléaires LXR (Liver X Receptors) sont des facteurs de
transcription fortement impliqués dans le contrôle de l’homéostasie du cholestérol. (Millatt et
al., 2003 ; Olkkonen et Lehto, 2004). Alors que le cholestérol n’a pas d’effet sur l’activité des
LXRs certains oxystérols apparaissent comme des ligands et activateurs naturels des LXRs.
Chez les macrophages, notamment, il a été montré que le 27-OHC est un ligand endogène des
LXRs (Fu et al., 2001). En présence de son ligand le récepteur LXR migre à l’intérieur du
noyau et se fixe sur des éléments de réponse LXREs (LXR response elements) présents dans
les promoteurs de gènes cibles. Les LXRs régulent ainsi de nombreux gènes impliqués dans le
métabolisme des lipides. Dans les macrophages, l’activation des LXRs diminue l’expression
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de gènes impliqués dans la biosynthèse du cholestérol, notamment le gène codant pour
l’enzyme HMG-CoA réductase (Song et al., 2001). L’activation des LXRs dans les
macrophages augmente également l’expression des transporteurs ABCA1 et ABCG1 qui
stimulent l’efflux du cholestérol. (Schwartz et al., 2000 ; Zanotti et al., 2008). Enfin, des
études ont montré que l’activité des LXRs in vivo, et notamment dans les macrophages, réduit
le développement des lésions d’athérosclérose (Joseph et al., 2002 ; Tangirala et al., 2002).
De nombreux travaux ont également montré que la protéine OSBP (Oxysterol
Binding Protéine) et les protéines ORPs (OSBP-related proteins) jouent un rôle important
dans la régulation de l’homéostasie du cholestérol (Fairn et McMaster, 2008 ; Lehto et
Olkkonen, 2003 ; Olkkonen et Lehto, 2004). OSBP est une protéine cytosolique ayant pour
ligands naturels différents oxystérols dont le 25-OHC et le 7-KC. La fixation du 25-OHC sur
le site de liaison de OSBP induit un changement conformationnel de la protéine et stimule sa
translocation vers l’appareil Golgi. Des études fonctionnelles ont montré que la surexpression
de OSBP dans les cellules CHO induit une diminution de l’activité ACAT et une
augmentation de la transcription des gènes codant pour le récepteur aux LDL et pour
l’enzyme HMG-CoA réductase, stimulant ainsi la biosynthèse du cholestérol (Lagace et al.,
1997). La surexpression de ORP2 dans des cellules en culture stimule le transport du
cholestérol à partir du réticulum endoplasmique, diminue l’estérification du cholestérol et
augmente l’efflux du cholestérol sur différents accepteurs extracellulaires (Laitinen et al.,
2002). Il a également été montré que la surexpression de ORP4 perturbe le transport du
cholestérol dérivé de la captation des LDL (Wang et al., 2002). Enfin, la protéine ORP8,
exprimée dans les macrophages, a récemment été identifiée comme un régulateur négatif de
l’expression d’ABCA1 et donc de l’efflux du cholestérol (Yan et al., 2008).
Toutefois, les mécanismes précis par lesquels les ORPs influencent le
métabolisme du cholestérol restent encore très peu connus. Différentes études ont montré que
les ORPs pourraient jouer directement un rôle dans le transport du cholestérol entre les
différents compartiments cellulaires, soit en fonctionnant comme des protéines de transport
(Im et al., 2005), soit en permettant la formation de sites de contact entre les membranes
(Olkkonen et Levine, 2004). OSBP, ORP1 et ORP2 seraient également impliqués dans le
transport vésiculaire du cholestérol, notamment entre le réticulum endoplasmique et l’appareil
de Golgi (Wyles et al., 2002 ; Xu et al., 2001). Enfin, il a été proposé que les ORPs soient
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
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33
simplement des protéines de détection des stérols associées aux différents systèmes de
régulation du métabolisme du cholestérol (Olkkonen et al., 2006).
1.3 Le transport intracellulaire du cholestérol
De nombreuses revues générales sont disponibles dans la litérature sur le transport
intracellulaire du cholestérol (Liscum et Munn, 1999 ; Maxfield et Wustner, 2002 ; Simons et
Ikonen, 2000 ; Soccio et Breslow, 2004 ; Vainio et Ikonen, 2003). Un schéma global des
différentes voies de transport est présenté dans la Figure 6.
1.3.1 Les différents modes de transport intracellulaire du cholestérol
En raison de sa grande hydrophobicité, la diffusion passive du cholestérol dans le
cytoplasme est très lente. Ainsi, le transport du cholestérol d’un compartiment cellulaire à
Figure 6 : Transport intracellulaire du cholestérol. FC : cholestérol libre, CE : esters de cholestérol, LE : endosomes tardifs, EE : endosomes précoces, ER : réticulum endoplasmique.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
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l’autre s’effectue principalement grâce à des mécanismes vésiculaires et des protéines de
transport, ou directement au niveau de sites de contact membranaires (Figure 7) (Maxfield et
Wustner, 2002 ; Soccio et Breslow, 2004).
Les vésicules qui transitent entre les différents compartiments cellulaires
transportent les constituants des membranes à partir desquelles elles se sont formées jusqu’à
celles où elles sont dirigées. L’inclusion du cholestérol dans les vésicules en formation
dépendrait en partie de son affinité pour les microdomaines. Le transport vésiculaire nécessite
également un cytosquelette intact et consomme de l’énergie sous forme d’ATP. Il a toutefois
été montré que le transport intracellulaire du cholestérol n’est pas totalement inhibé lorsqu’on
bloque les mécanismes vésiculaires, mettant en évidence l’existence d’autres mécanismes de
transport non-vésiculaires (Maxfield et Mondal, 2006).
Le transport non-vésiculaire est possible grâce à différentes protéines
cytoplasmiques capables d’extraire le cholestérol des membranes « donneuses », de fixer le
cholestérol à l’intérieur d’un domaine hydrophobe présent dans leur structure
tridimensionnelle, et de le réinsérer dans les membranes cibles (Prinz, 2007). Il existe de
nombreuses protéines pouvant ainsi jouer le rôle de transporteurs du cholestérol. Il s’agit
notamment de la protéine StAR (Steroidogenic Acute Regulatory) et des protéines associées
possédant le même domaine de fixation du cholestérol appelé START (StAR-Related Lipid
Transfer domain), de la protéine NPC2 (Niemann-Pick Type C) impliquée dans le transport
Figure 7 : Les différents modes de transport du cholestérol. Le cholestérol peut transiter d’une membrane I à une membrane II par diffusion passive (A), par des mécanismes vésiculaires (B), grâce à des protéines de transport (C) ou via des contacts membranaires (D). (Maxfield et Wustner, 2002).
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du cholestérol à partir des endosomes tardifs, de la protéine SCP-2 (Sterol Carrier Protein 2),
de la cavéoline ainsi que de certaines protéines appartenant à la famille des ORPs.
Enfin, il existe dans la cellule des sites de contact membranaire, notamment entre
le RE et les autres compartiments cellulaires, qui peuvent faciliter le transfert de cholestérol
entre les deux membranes, soit par diffusion, soit à l’aide de protéines spécifiques (Levine et
Loewen, 2006).
1.3.2 Généralités sur les lipoprotéines
Les lipoprotéines sont des complexes solubles de haute masse moléculaire
constitués d’un cœur de lipides hydrophobes (triacylglycérol (TG) et esters de cholestérol
(CE)) entourés d’une monocouche de phospholipides (PL) et de cholestérol ainsi que de
différentes apoprotéines. Cette architecture macromoléculaire permet aux lipides très
hydrophobes d’être transportés dans la circulation sanguine. Il existe plusieurs types de
lipoprotéines qui se différencient par leur densité, leur taille, leur composition en lipides et en
protéines, et par leur fonction (Tableau 1).
Le rôle des lipoprotéines est de transporter les lipides exogènes (provenant de
l’alimentation) et endogènes (synthétisés par l’organisme) entre les différents organes et
tissus. Le métabolisme des lipoprotéines au niveau de l’organisme est complexe et dépend de
mécanismes faisant intervenir de nombreux récepteurs et enzymes. On distingue trois voies de
transport très interconnectées : la voie de transport des lipides exogènes (à partir de l’intestin
Diamètre Apolipoprotéine(s)(nm) TG Chol CE PL (APO)
Chylomicrons 75-1200 80-95 1-3 2-4 3-6 B48, E, C
VLDL 30-80 45-65 4-8 16-22 15-20 B100, E, C
IDL 27-35 25-35 4-8 20-30 20-24 B100, E, C
LDL 18-27 4-8 6-8 45-50 18-24 B100
HDL 7-12 2-7 3-5 15-20 26-32 AI, AII, C
préβHDL <7 (disque) - - - - AI
Type de lipoprotéinesComposition lipidique (% massiques)
Tableau 1 : Caractéristiques et composition des différentes classes de lipoprotéines.
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36
vers les tissus périphériques), la voie de transport des lipides endogènes du foie vers les tissus
périphériques et la voie de transport retour des lipides endogènes des tissus vers le foie (voir
annexe 1). S’agissant du cholestérol cette dernière voie de transport est appelée « transport
inverse du cholestérol » (Cuchel et Rader, 2006 ; Toussaint et al., 2003).
Les lipoprotéines jouent donc un rôle majeur dans le métabolisme du cholestérol
dans l’organisme. Au niveau des macrophages les LDL provenant du foie constituent une
source exogène de cholestérol et les HDL stimulent l’efflux du cholestérol hors de la cellule
en jouant le rôle d’accepteurs extracellulaires du cholestérol.
1.3.3 Endocytose des LDL par les macrophages
1.3.3.1 Les LDL et LDL oxydées
Les lipoprotéines de faible densité (LDL) sont des particules sphériques de taille
variable (entre 18 et 25 nm de diamètre). Elles sont composées d’un cœur hydrophobe
contenant principalement des esters de cholestérol et présentent à leur surface une
apolipoprotéine B-100 (ApoB-100) (Figure 8). Les LDL en circulation dans le sang
transportent le cholestérol du foie vers les tissus périphériques. En effet, en plus de la
biosynthèse de novo, les cellules peuvent acquérir du cholestérol par endocytose des LDL.
Figure 8 : Représentation schématique d’une particule de LDL. (Berg et al., 2002)
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Il est admis qu’au cours de l’athérogenèse les LDL natives circulantes traversent
l’endothélium vasculaire puis sont retenues dans l’intima où elles subissent des modifications
oxydatives. Les LDL oxydées sont beaucoup plus athérogènes que les LDL natives car elles
induisent une forte accumulation de cholestérol et d’oxystérols dans les macrophages présents
dans l’espace sous endothélial (Jessup et al., 2002 ; Stocker et Keaney, 2005). Ainsi, les LDL
oxydées jouent un rôle majeur in vivo dans l’évolution des macrophages en cellules
spumeuses et donc dans les premières phases de l’athérogenèse.
De nombreuses études réalisées in vitro on montré que l’oxydation des LDL altère
à la fois leur composition lipidique et la structure de l’apoB-100. Les acides gras poly-
insaturés (AGPI) constituent les premières cibles de la peroxydation lipidique. Cette étape
génère différents aldéhydes, dont le dialdéhyde malonique (MDA) et les hydroxyalkénals, qui
vont alors former des adduits sur l’apoprotéine B-100 en se liant aux groupements aminés. De
plus le cholestérol va également s’oxyder et générer différentes molécules d’oxystérols
(Esterbauer et al., 1992 ; Young et McEneny, 2001).
De nombreux travaux ont permis de mettre en évidence que l’oxydation des LDL
se produit in vivo (Young et McEneny, 2001). En effet des LDL extraites de lésions
d’athérosclérose chez l’Homme ont montré des modifications oxydatives de l’apoB-100 et
des concentrations élevées de produits de peroxydation lipidique comme les oxystérols (Yla-
Herttuala et al., 1989). De plus, il a été montré que l’oxydation des LDL in vivo est stimulée
par les macrophages résidents et s’effectue grâce à différents systèmes oxydants,
enzymatiques ou non (Morel et al., 1984 ; Parthasarathy et al., 1986 ; Parthasarathy et al.,
2008).
1.3.3.2 Endocytose des LDL : les différents récepteurs et mécanismes
Les macrophages internalisent les LDL par un mécanisme d’endocytose
dépendant de la clathrine. L’ApoB-100 des particules de LDL est reconnue par le récepteur
aux LDL (LDL-R) présent à la surface de la cellule au niveau de puits tapissés de clathrine.
La fixation du ligand sur son récepteur provoque l’invagination de la membrane et la
formation d’une vésicule d’endocytose (Brown et Goldstein, 1986 ; Ungewickell et
Hinrichsen, 2007 ). Le complexe LDL-récepteur est ainsi internalisé puis dirigé vers les
endosomes précoces.
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La transcription du gène codant pour le LDL-R est régulée par la quantité
cellulaire de cholestérol grâce à un mécanisme de rétrocontrôle faisant intervenir le facteur de
transcription SREBP (voir paragraphe 1.2.2). Ainsi, lorsque la quantité de cholestérol
augmente, l’expression du LDL-R diminue ce qui entraîne une diminution de la quantité de
cholestérol captée par la cellule. Ce mécanisme de régulation explique pourquoi les LDL
natives seules n’induisent pas une forte accumulation de cholestérol dans les macrophages
(Brown et Goldstein, 1997).
Lorsque les LDL sont modifiées elles ne sont plus reconnues par le LDL-R.
Toutefois, Goldstein et Brown ont identifié dès 1979 un autre type de récepteur permettant la
captation des LDL modifiées. Ce récepteur a été nommé « scavenger receptor » (SR)
(Goldstein et Brown, 1977 ; Goldstein et al., 1979). Dans ces études, Goldstein et Brown ont
utilisé des LDL acétylées. Ce sont des LDL modifiées in vitro qui ne se forment pas
naturellement dans l’organisme mais qui sont souvent utilisées comme modèle expérimental
pour induire une forte accumulation de cholestérol dans les macrophages en culture. En effet,
contrairement au LDL-R, l’expression des SR n’est pas régulée par la quantité de cholestérol
(Brown et Goldstein, 1983). Il a ensuite été montré que les LDL oxydées sont également des
ligands des SR et qu’elles peuvent être internalisées par cette voie de la même manière que les
LDL acétylées (Steinbrecher et al., 1989).
De nombreux récepteurs « scavenger » contribuant à l’endocytose des LDL
oxydées par les macrophages ont depuis été identifiés (Murphy et al., 2005 ; Steinbrecher,
1999). Il s’agit entre autres des récepteurs SR-AI, SR-AII et CD36 qui jouent un rôle critique
au cours de l’athérogenèse (Kunjathoor et al., 2002) ainsi que des récepteurs SR-BI et SR-
BII. Tous ces récepteurs possèdent de nombreux ligands autres que les LDL modifiées et sont
impliqués dans différents mécanismes cellulaires (Moore et Freeman, 2006). Il a notamment
été montré que SR-BI, en plus d’être un ligand pour les LDL modifiées, possède une affinité
pour les HDL et stimule ainsi le transfert d’esters de cholestérol à l’intérieur de la cellule, ce
qui constitue un autre mécanisme de captation du cholestérol par les macrophages (Rinninger
et al., 1994).
Enfin, il a été montré que dans l’intima des artères les LDL oxydées peuvent
s’agréger pour former de plus gros complexes (Maor et al., 2000). Ces complexes sont alors
internalisés par les macrophages grâce à un mécanisme de phagocytose indépendant des
récepteurs aux LDL (Khoo et al., 1988 ; Kruth, 2002).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
39
1.3.3.3 La voie endocytique
La voie endocytique est composée de différents compartiments présentant des
structures, des propriétés physico-chimiques et des compositions en protéines et lipides
distinctes (Gruenberg, 2003 ; Perret et al., 2005). Une fois internalisé, le complexe
LDL/récepteur est dirigé vers les endosomes précoces où le pH légèrement plus acide
provoque la dissociation du récepteur et de la particule de LDL. Le récepteur est alors dirigé
vers les zones tubulaires des endosomes précoces puis vers les endosomes de recyclage avant
d’être réincorporé dans la membrane plasmique où il pourra être réutilisé. La particule de
LDL est dirigée vers les zones vésiculaires des endosomes précoces qui vont former par
invagination des corps multi-vésiculaires également appelés vésicules de transport
endosomales (ECV/MVB). Après s’être formées et détachées des endosomes précoces, ces
vésicules de transport sont dirigées vers les endosomes tardifs avec lesquels elle fusionnent.
Figure 9 : Endocytose des LDL, représentation schématique de la voie endocytique.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
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40
Les endosomes tardifs sont des corps multi-vésiculaires et multi-lamellaires
constitués d’une membrane limitante et d’un réseau de membranes internes (Russell et al.,
2006). Dans les endosomes tardifs les esters de cholestérol dérivés de la captation des LDL
sont hydrolysés par la cholestérol ester hydrolase acide (CEH acide). Le cholestérol libre ainsi
formé est redistribué vers le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. En
revanche, les protéines et lipides destinés à la dégradation sont dirigés vers les lysosomes,
considérés comme le point final de la voie endocytique (Figure 9). Il a été montré récemment
que l’enzyme CEH acide est également présente dans les endosomes précoces, indiquant que
l’hydrolyse des esters de cholestérol dérivés des LDL commence rapidement après
l’internalisation des LDL (Sugii et al., 2003).
1.3.4 Le transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs
Les endosomes tardifs possèdent une structure membranaire très dynamique. Il a
été montré que les membranes internes des endosomes tardifs contiennent une forte
proportion du phospholipide bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP) qui forme des
microdomaines spécialisés (Kobayashi et al., 2001a ; Kobayashi et al., 2002). Comme nous le
verrons au chapitre 4 des rappels bibliographiques, le BMP joue un rôle important dans la
structuration et la dynamique des membranes internes des endosomes tardifs ainsi que dans le
transport intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL (Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi
et al., 1999). Deux protéines jouent également un rôle central dans le transport du cholestérol
à partir des endosomes tardifs. Il s’agit de NPC1 et NPC2 qui sont localisées dans les
endosomes tardifs et présentent des domaines de liaison au cholestérol. De nombreuses études
ont montré que l’apparition de mutations sur les gènes codant les protéines NPC1 et NPC2
chez les patients atteints de la maladie neurodégénérative de Niemann-Pick de type C induit
une altération de l’homéostasie cellulaire du cholestérol (Chang et al., 2005 ; Garver et
Heidenreich, 2002 ; Wojtanik et Liscum, 2003).
A partir des endosomes tardifs (LE) le cholestérol dérivé des LDL peut rejoindre
la membrane plasmique (PM) à partir de laquelle il peut soit être efflué hors de la cellule
grâce à différents accepteurs, soit retourner au réticulum endoplasmique (RE) où il pourra être
estérifié par l’ACAT et stocké sous forme d’esters dans des gouttelettes lipidiques (Lange et
al., 1997 ; Lange et al., 1998 ; Neufeld et al., 1996). Il a été montré qu’à partir des LE,
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
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41
environ 70% du cholestérol dérivé des LDL rejoint le RE en transitant par la PM, mais qu’il
peut également être transporté directement des LE vers le RE (Underwood et al., 1998).
Des mécanismes à la fois vésiculaires et non-vésiculaires semblent être impliqués,
voire coopèrent, dans le transport endosomal du cholestérol (Holtta-Vuori et Ikonen, 2006).
En effet il a été montré que le transport du cholestérol des LE vers la PM était dépendant de
l’appareil de Golgi (Neufeld et al., 1996) suggérant un transport vésiculaire le long de la voie
de sécrétion. De plus, des inhibiteurs des GTPases « Rab », qui sont impliquées dans le
transport vésiculaire, induisent une accumulation de cholestérol dans les LE en bloquant sa
redistribution vers les autres organites (Holtta-Vuori et al., 2000) alors que leur surexpression,
au contraire, réduit cette accumulation (Walter et al., 2003). Par ailleurs, différentes protéines
localisées dans les LE et possédant un site de liaison au cholestérol ont été proposées pour
jouer un rôle dans le transport non-vésiculaire du cholestérol à partir des LE. Il s’agit entre
autres des protéines MLN64 (Alpy et al., 2001), ORP1 (Johansson et al., 2003), ABCA1
(Neufeld et al., 2004) et SR-BI (Ahras et al., 2008). Enfin, le rôle précis des protéines NPC1
et NPC2 comme protéines de transport ou comme régulateurs dans le transport vésiculaire du
cholestérol à partir des LE reste encore à préciser (Ko et al., 2001 ; Ko et al., 2003).
1.3.5 Le transport du cholestérol à partir de la membrane plasmique
Le cholestérol membranaire est continuellement ré-internalisé dans la cellule
notamment vers le RE pour être estérifié par l’ACAT mais aussi pour participer aux
régulations transcriptionnelles contrôlées par SREBP. Certains agents pharmacologiques
connus pour détruire le cytosquelette inhibent le transport du cholestérol de la PM vers le RE
suggérant un mécanisme de transport vésiculaire (Liscum et Munn, 1999). De plus, il a été
montré qu’entre la PM et le RE, le cholestérol peut transiter via les endosomes ou l’appareil
de Golgi (Soccio et Breslow, 2004). Des études récentes semblent indiquer que les
microdomaines riches en cholestérol jouent un rôle important dans la redistribution
intracellulaire du cholestérol à partir de la membrane plasmique (Lange et al., 1999 ; Lange et
Steck, 2008) et que des mécanismes non-vésiculaires sont également impliqués dans cette
voie de transport (Prinz, 2007).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
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42
1.3.6 Le transport du cholestérol à partir du réticulum endoplasmique
Le cholestérol nouvellement synthétisé dans le réticulum endoplasmique est
rapidement transporté à la membrane plasmique. Plusieurs voies et mécanismes semblent être
impliqués. D’une part, le cholestérol peut être transporté par un processus vésiculaire
classique via l’appareil de Golgi (Kaplan et Simoni, 1985). D’autre part des sites de contact
entre les membranes du RE et des autres compartiments cellulaires, notamment la membrane
plasmique, peuvent faciliter le transfert du cholestérol (Levine et Loewen, 2006). Enfin, des
protéines de transport semblent également être impliquées, notamment les protéines SCP-2, la
cavéoline et ORP2, mais leur rôle exact dans cette voie de transport reste encore mal connu
(Hynynen et al., 2005 ; Prinz, 2007 ; Soccio et Breslow, 2004).
1.3.7 Efflux du cholestérol
Le rôle athéro-protecteur des lipoprotéines de haute densité (HDL) provient entre
autres de leur capacité à capter le cholestérol excédentaire des tissus périphériques,
notamment des macrophages, et de le transporter jusqu’au foie pour être éliminé dans la bile
(Feig et al., 2008 ; Tall, 2008). Ce processus, appelé transport inverse du cholestérol (voir
annexe 1), est initié par l’efflux du cholestérol à partir des cellules. Cet efflux se caractérise
par un transfert du cholestérol libre de la membrane plasmique sur différents accepteurs
extracellulaires (Jessup et al., 2006 ; Jessup et Kritharides, 2008 ; Tall et al., 2002 ; Yancey et
al., 2003).
Malgré sa grande hydrophobicité il a été montré que le cholestérol peut quitter la
membrane plasmique par diffusion aqueuse jusqu’à rencontrer un accepteur dans le plasma
sanguin (Phillips et al., 1987). Toutefois il s’agit d’un phénomène trop lent pour exporter
efficacement le cholestérol hors de la cellule. Ainsi, différentes protéines membranaires
permettent de stimuler l’efflux du cholestérol. Chez les macrophages il s’agit principalement
des transporteurs ABC (ATP-Binding Cassette), notamment ABCA1, ABCG1 et ABCG4,
ainsi que du récepteur « scavenger » SR-BI.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
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43
1.3.7.1 Efflux médié par les transporteurs ABCA1, ABCG1 et ABCG4
Chez l’Homme, des mutations délétères présentes sur le gène codant pour ABCA1
sont responsables de la maladie de Tangier qui se caractérise par un niveau plasmatique de
HDL très faible, une accumulation de cholestérol dans les macrophages et un développement
rapide des lésions d’athérosclérose (Kolovou et al., 2006). Les modèles animaux fournissent
également de nombreux résultats indiquant que l’absence de ABCA1 et ABCG1, notamment
chez les macrophages, accélère le processus d’athérogenèse (Out et al., 2008 ; Yvan-Charvet
et al., 2007).
ABCA1 est un transporteur composé de deux parties similaires liées de manière
covalente et composées chacune de six domaines transmembranaires, d’une boucle
extracellulaire et d’une partie intracellulaire contenant un domaine ABC. Au contraire,
ABCG1 et ABCG4 sont des « demi » transporteurs (Figure 10) qui fonctionnent
probablement sous la forme d’homo- ou hétéro-dimères (Cserepes et al., 2004 ; Vaughan et
Oram, 2006). ABCA1 permet un transfert unidirectionnel de cholestérol et de phospholipides
de la membrane plasmique vers une apolipoprotéine A-I (apoA-I) délipidée qui évolue ainsi
en HDL « naissante » (Duong et al., 2006). Au contraire, ABCG1 et ABCG4 permettent
uniquement de transférer du cholestérol sur une particule de HDL déjà formée (Wang et al.,
2004). Il a ainsi été proposé que ABCA1 et ABCG1 fonctionnent de manière séquentielle,
ABCA1 générant à partir d’apoA-I une particule de HDL qui va alors stimuler l’efflux du
cholestérol via ABCG1 (Gelissen et al., 2006). ABCA1 et ABCG1 contribueraient ensemble
à la majorité de l’efflux du cholestérol à partir des macrophages (Jessup et Kritharides, 2008).
Différentes études semblent indiquer que ABCA1 interagit directement avec
apoA-I au niveau de ses boucles extracellulaires (Fitzgerald et al., 2002 ; Wang et al., 2000)
et que cette liaison est nécessaire au mécanisme de transfert des lipides (Chroni et al., 2004 ;
Fitzgerald et al., 2004). Il a été montré récemment sur des macrophages en culture que le
transfert de cholestérol et de phospholipides par ABCA1 sur ApoA-I s’effectue
simultanément, par un mécanisme de microsolubilisation, plutôt que de manière séquentielle
comme cela avait été proposé (Gillotte et al., 1998a ; Gillotte et al., 1999 ; Smith et al., 2004 ;
Yancey et al., 2003). Un autre mécanisme a également été proposé selon lequel les apoA-I
pourraient être internalisées par les cellules puis re-sécrétées après lipidation via un
mécanisme de rétroendocytose (Denis et al., 2008 ; Faulkner et al., 2008).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
44
Récemment, de nombreux travaux ont mis en lumière le rôle important joué par
les microdomaines membranaires (voir paragraphe 1.1.3 des rappels bibliographiques) dans
l’efflux du cholestérol stimulé par ABCA1 et ABCG1. Cependant, les premières études
indiquaient que apoA-I acquiert plus difficilement du cholestérol à partir des microdomaines
que des membranes plus fluides (Lund-Katz et al., 1988 ; Mendez et al., 2001) et que le
récepteur ABCA1 lui-même ne semble pas associé aux microdomaines insolubles dans le
Triton X-100 (Mendez et al., 2001). D’autres auteurs ont toutefois proposé un modèle
(Yancey et al., 2003) selon lequel ABCA1 modifierait l’organisation des membranes
environnantes en créant autour de lui des domaines lipidiques spécifiques (Drobnik et al.,
2002 ; Wang et al., 2000). ApoA-I interagirait alors avec ces domaines générés par ABCA1
avant de se lier au transporteur (Chambenoit et al., 2001 ; Lin et Oram, 2000). ABCA1 a en
effet été retrouvé associé à des microdomaines insolubles dans le Lubrol qui est un détergent
moins fort que le Triton X-100 (Drobnik et al., 2002). Plus récemment, il a été montré que
ABCA1 désorganise les microdomaines riches en cholestérol, redistribuant le cholestérol dans
des membranes plus fluides pour lesquelles apoA-I possède une plus grande affinité (Landry
et al., 2006). Un mécanisme similaire a également été rapporté pour ABCG1 (Vaughan et
Oram, 2005).
L’équipe de Gaus a proposé un autre modèle selon lequel l’efflux du cholestérol
sur apoA-I s’effectuerait à partir de deux « réservoirs » membranaires distincts, et de manière
séquentielle (Gaus et al., 2001 ; Gaus et al., 2004). Selon ces auteurs, ApoA-I interagirait
d’abord avec les microdomaines qui constituent un réservoir restreint de cholestérol mais avec
lesquels s’opèrent des échanges rapides de cholestérol. Puis, progressivement, apoA-I
acquerrait aussi du cholestérol provenant des domaines fluides de la membrane plasmique qui
constitueraient finalement la principale source de cholestérol.
Enfin, certaines études indiquent que la cavéoline-1, présente dans les
microdomaines appelés cavéoles, est impliquée dans l’efflux du cholestérol stimulé par
ABCA1. Toutefois ces résultats restent encore controversés (Ikonen et al., 2004 ; Lin et al.,
2007 ; Storey et al., 2007).
Il a été montré que l’expression des gènes codant pour les récepteurs ABCA1 et
ABCG1 est faible à l’état basal chez les macrophages mais qu’elle augmente lorsqu’ils
accumulent du cholestérol (Kielar et al., 2001 ; Venkateswaran et al., 2000). Il a également
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
45
été montré que l’expression de ces gènes est régulée par le facteur de transcription LXR ainsi
qu’indirectement par PPARγ via l’induction de LXR (Schmitz et Langmann, 2005 ; Zhang et
al., 2002). L’excès de cholestérol dans les macrophages entraîne la formation d’oxystérols. Or
ces oxystérols jouent un rôle important dans l’efflux du cholestérol car ils activent les LXR et
stimulent ainsi l’efflux du cholestérol via ABCA1 et ABCG1. De plus, il a récemment été
montré que ABCG1 stimule aussi l’efflux des oxystérols modifiés sur la position 7,
protégeant ainsi les cellules contre l’effet délétère des oxystérols (Engel et al., 2007 ;
Terasaka et al., 2007). Enfin, des mécanismes post-transcriptionnels régulent aussi la stabilité,
le trafic intracellulaire et l’activité de ABCA1 (Oram et Heinecke, 2005).
1.3.7.2 Efflux médié par le récepteur SR-BI
Les récepteurs « scavenger » SR-BI participent également à l’efflux du
cholestérol en stimulant son transport entre la membrane plasmique et les HDL. Il ne s’agit
pas d’un transport actif mais d’une diffusion dont le flux est bidirectionnel. Ainsi l’échange
de cholestérol entre la cellule et l’accepteur s’effectue globalement dans le sens du gradient de
concentration en cholestérol (de La Llera-Moya et al., 2001).
SR-BI est composé d’un large domaine extracellulaire ancré dans la membrane
par deux domaines transmembranaires, ainsi que deux courtes chaînes N- et C- terminales
intracellulaires (Rigotti et al., 1997). De plus il a été montré que SR-BI forme des dimères et
tétramères par homo-oligomérisation (Sahoo et al., 2007). SR-BI stimule le transfert de
cholestérol entre la membrane plasmique et une particule de HDL selon un mécanisme
biphasique (Jessup et al., 2006). Dans un premier temps SR-BI accélère la diffusion du
cholestérol en maintenant l’accepteur à proximité de la membrane grâce à une liaison directe
avec la particule de HDL (Gu et al., 2000 ; Liu et al., 2002). Dans un second temps SR-BI
accélère la diffusion du cholestérol indépendamment de sa liaison avec les HDL mais en
modifiant simplement la distribution et la disponibilité du cholestérol dans les membranes
environnantes (de la Llera-Moya et al., 1999 ; Kellner-Weibel et al., 2000).
SR-BI est exprimé dans de nombreux tissus et organes notamment dans les
macrophages. On le retrouve également exprimé chez l’Homme dans les lésions
d’athérosclérose (Chinetti et al., 2000 ; Hirano et al., 1999). Toutefois il a été montré que son
niveau d’expression dans des macrophages issus de patients atteint d’athérosclérose est
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 1 : Métabolisme et transport intracellulaires du cholestérol
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46
identique par rapport à des patients sains (Svensson et al., 2005). De plus, des études réalisées
in vitro indiquent que l’accumulation de cholestérol dans les macrophages diminue
l’expression de SR-BI selon un mécanisme indépendant de LXR et SREBP (Yu et al., 2004)
et que les LDL oxydées tendent également à diminuer l’expression de SR-BI (Han et al.,
2001).
Il a été montré que des souris déficientes en SR-BI développent plus rapidement
des lésions d’athérosclérose (Braun et al., 2002 ; Zhang et al., 2003). Il a été proposé que SR-
BI puisse jouer un rôle antiathérogène (Covey et al., 2003). Cependant des études plus
récentes ont indiqué que SR-BI ne jouerait qu’un rôle mineur dans l’efflux du cholestérol
chez les macrophages in vitro (Adorni et al., 2007) et in vivo (Wang et al., 2007).
SR-BI ABCG1 ABCA1
apoA-1HDL naissante
discoïdaleHDL sphérique
diffusion passive
milieuintracellulaire
milieuextracellulaire
cholestérolphospholipides
Figure 10 : Représentation schématique de l’efflux du cholestérol médié par SR-BI, ABCA1, ABCG1 et par diffusion passive.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
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47
Chapitre 2 : Généralités sur les acides gras et les phospholipides
Depuis quelques années, le projet LIPID MAPS (LIPID Metabolites and
Pathways Strategy ; http://lipidmaps.org) développe un système très complet de classification,
de nomenclature et de représentation chimique des lipides (Fahy et al., 2005 ; Schmelzer et
al., 2007). LIPID MAPS propose de classer les lipides en huit catégories, elles-mêmes
subdivisées en classes et sous-classes : les acides gras (AG), les glycérolipides (GL), les
glycérophospholipides ou phospholipides (GPL ou PL), les sphingolipides (SL), les stérols,
les prénols, les saccharolipides et les polyketides. Le cholestérol, dont nous avons décrit le
métabolisme et le transport intracellulaire dans le chapitre 1, fait partie des stérols. Ce
deuxième chapitre apporte des rensignements généraux sur les acides gras ainsi que sur les
phospholipides.
2.1 Les acides gras
Les acides gras sont des acides carboxyliques formés d’une chaîne
hydrocarbonée. Leur chaînes carbonées linéaires possèdent différentes longueurs et degrés
d'insaturation correspondant au nombre de doubles liaisons carbone-carbone. Leurs atomes de
carbone sont numérotés à partir du groupement carboxyle portant le N°1 et le dernier carbone
étant noté ω (oméga) ou n (Figure 11).
Les acides gras saturés ne possèdent aucune double liaison carbone-carbone alors
que les acides gras mono- et poly-insaturés possèdent respectivement une et plusieurs doubles
liaisons. Chaque double liaison est représentée par le symbole Δ (delta) suivi d'un chiffre
indiquant sa position sur la chaîne. Par exemple Δ9 symbolise la présence d'une double liaison
entre les atomes de carbone 9 et 10. Les positions des doubles liaisons peuvent également être
déterminées à partir du carbone ω. Ainsi, on dit qu'un acide gras appartient à la famille des
oméga-3 (ω-3) ou n-3 lorsque sa dernière double liaison est présente sur la 3ème liaison
carbone-carbone en partant du carbone ω, de même pour les acides gras ω-6 (ou n-6), ω-9 (ou
n-9), etc...
Dans la nature les doubles liaisons des acides gras poly-insaturés possèdent
majoritairement une configuration cis, ce qui induit une courbure de la chaîne carbonée. Les
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
48
acides gras possédant des doubles liaisons trans sont souvent produits de manière industrielle
et sont associées à des situations pathologiques comme l’athérosclérose (Dalainas et Ioannou,
2008). De plus, les doubles liaisons des acides gras polyinsaturés naturels sont presque
toujours non conjuguées (Figure 12).
Chaque acide gras possède un nom IUPAC (International Union of Pure and
Applied Chemists ; http://www.chem.qmul.ac.uk/iupac/) et souvent un nom commun. Par
exemple l'acide gras saturé possédant 18 atomes de carbone est appelé acide octadécanoïque
ou acide stéarique. Enfin, les acides gras sont souvent définis par leur formule ou
l’abréviation de leur nom. Par exemple l’acide docosahexaénoïque est défini plus simplement
par 22:6n-3 ou par DHA (Tableau 2).
22 : 6 n-3 Δ4,7,10,13,16,19
Position des doubles liaisonsPosition de la dernière double liaison (ici Δ19 )
Nombre de doubles liaisonsNombre d’atomes de carbone
22 20 19 17 16 14 13 11 10 8 7 5 4 2
21 18 15 12 9 6 31ω
double liaisonn-3 ou ω-3
Figure 11 : abréviation symbolique et structure du DHA
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
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49
CATEGORIE formule nom commun ou IUPAC abréviation4:0 acide butyrique6:0 acide caproïque8:0 acide caprylique10:0 acide caprique12:0 acide laurique14:0 acide myristique16:0 acide palmitique18:0 acide stéarique20:0 acide arachidique22:0 acide béhénique
16:1n-7 acide 9-cis-hexadecénoïque16:1n-9 acide palmitoléique18:1n-7 acide 11-cis-octadecénoïque18:1n-9 acide oléique OA20:1n-9 acide eicosénoïque18:2n-6 acide linoléique LA18:3n-6 acide γ-linolénique GLA18:3n-3 acide α-linolénique ALA20:2n-6 acide eicosadiénoïque20:3n-6 acide di-homo-gamalinolénique DHLA/DGLA20:4n-6 acide arachidonique AA20:5n-3 acide eicosapentaénoïque EPA22:5n-3 acide docosapentaénoïque DPA n-322:6n-3 acide docosahexaénoïque DHA
SATURÉS
MONO-INSATURÉS
POLY-INSATURÉS
Tableau 2 : Classification et nomenclature des principaux acides gras.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
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50
Le produit majeur de l’enzyme « fatty acid synthase » est l’acide palmitique
(16:0). Les autres acides gras sont ensuite formés par des réactions d’élongation catalysées
par des élongases et des réactions de désaturation catalysées par des désaturases. Toutefois,
les mammifères ne possèdent pas les enzymes capables d’introduire une double liaison après
le carbone C-9 et ne peuvent donc synthétiser ni l’acide linoléique (18:2n-6, LA), ni l’acide
linolénique (18:3n-3, ALA). Ainsi, ces deux acides gras sont dits essentiels car ils doivent être
apportés par l’alimentation.
Acide palmitique16:0
Acide linoléique18:2n-6
Acide oléique18:1n-9
Acide docosahexaénoïque22:6n-3
Acide arachidonique20:4n-6
Doubles liaisons : cis trans cis - non conjuguées
16:0 18:1n-9 18:2n-6 20:4n-6 22:6n-3
Représentations 3D de différents acides gras
Figure 12 : Structures et représentations de quelques acides gras.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
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51
L’acide linoléique est le précurseur des acides gras oméga-6 et l’acide linolénique
le précurseur des acides gras oméga-3. En effet, les mammifères ne possèdent pas non plus de
désaturase capable de former un acide gras oméga-3 à partir d’un acide gras oméga-6. Comme
indiqué dans la Figure 13, la synthèse des acides gras oméga-6 et celle des acides gras oméga-
3 utilise les mêmes enzymes. Il existe donc une compétition entre ces deux familles d’acides
gras. La synthèse des acides gras polyinsaturés n-3 à longues chaînes, EPA et DHA, sera
détaillée dans le chapitre 3.
Figure 13 : Synthèse des acides gras oméga-6 et oméga-3 à partir de l’acide linoléique (18:2n-6) et l’acide linolénique (18:3n-3) respectivement.
18:2n-6 (LA) 18:3n-3 (ALA)
18:3n-6 18:4n-3
20:3n-6 20:4n-3
20:4n-6 (AA) 20:5n-3 (EPA)
22:4n-6 22:5n-3
élongase
Δ6 désaturase
Δ5 désaturase
élongase
22:5n-6 22:6n-3 (DHA)
24:5n-3
24:5n-3
élongase
Δ6 désaturase
β-oxydation
Δ4 désaturase
[alimentation]
[alimentation]
[alimentation]
Oméga-6 Oméga-3
rétr
ocon
vers
ion
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
52
2.2 Les phospholipides : classes, sous-classes et composition en acides gras
Un phospholipide est constitué d’un résidu glycérol dont les carbones sont notés
sn-1, sn-2 et sn-3, de deux résidus d’acides gras (acyles) et d’un groupement phosphate sur
lequel est estérifié une tête polaire. Les chaînes acyles reliées au glycérol au niveau des
positions sn-1 et sn-2 constituent la partie hydrophobe du phospholipide alors que le
phosphate et la tête plaire, estérifiés en position sn-3, constituent la partie hydrophile. Les
phospholipides sont donc des molécules très amphiphiles et des constituants majeurs des
membranes cellulaires (Figure 14). Les phospholipides présentent une très grande diversité de
structure. Ils sont dans un premier temps subdivisés en classes selon la nature de leur tête
polaire puis en sous-classes selon la nature de la liaison chimique entre le glycérol et la chaîne
grasse en position sn-1 (Figure 14). Enfin il existe un grand nombre d’espèces moléculaires
différentes de chaque phospholipide en fonction de la nature des chaînes acyles.
Les principales classes de phospholipides sont les phosphatidylcholines (PC), les
phosphatidyléthanolamines (PE), les phosphatidylsérines (PS), les phosphatidylinositols (PI),
les phosphatidylglycérols (PG) et l’acide phosphatidique (PA). Ce dernier ne possède pas de
groupement alcool estérifié sur le phosphate. Les phosphoinositides sont des dérivés
phosphatés des PI qui sont fortement impliqués dans différentes voies métaboliques et de
signalisation. Il s’agit principalement des phosphatidylinositol-4-phosphate (PIP), -4,5-
diphosphates (PIP2) et -3,4,5-triphosphates (PIP3). Il existe également des poly-glycéro-
phospholipides dont les plus abondants sont les cardiolipines (CL) qui correspondent à des di-
PG. Le bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP) est un phospholipide quantitativement mineur
possédant une structure très particulière qui sera décrite plus en détail dans le chapitre 4 des
rappels bibliographiques. Enfin, certains phospholipides sont présents sous forme de lyso-
phospholipides c’est-à-dire ne possédant qu’une seule chaîne acyle.
Les phospholipides représentent environ 80% des lipides membranaires dont les
PC (35 à 50%), les PE (25 à 30%), les PS (10 à 15%) et les PI (5 à 8%). Toutefois il existe
une grande hétérogénéité de distribution des phospholipides entre les différents organes des
mammifères, entre les différents compartiments cellulaires et au sein même des membranes.
Par exemple les cardiolipines sont principalement présentes dans le cœur où elles représentent
jusqu’à 15% des phospholipides totaux (Hatch, 1998). Le PG, qui représente généralement
moins de 1% des phospholipides cellulaires, est très enrichi dans le surfactant pulmonaire
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
53
(Rooney et al., 1974 ; Sadana et al., 1988). Au niveau cellulaire, les cardiolipines sont
principalement localisées dans les membranes internes des mitochondries (Hatch, 1998) et le
BMP dans les endosomes tardifs (Kobayashi et al., 2001a). Enfin, alors que les PC sont
davantage localisées dans le feuillet externe de la membrane plasmique, les PE et surtout les
PS sont généralement enrichies dans le feuillet interne (Yamaji-Hasegawa et Tsujimoto,
2006).
Les phospholipides se distinguent également par la nature de la liaison chimique
qui relie la chaîne grasse au résidu glycérol en position sn-1. Il existe trois types de chaînes :
les chaînes acyles (liaisons esters), les chaînes alkyles (liaisons éthers) et les chaînes alkényles
(liaisons vinyl-éthers) (Figure 14). Dans les membranes biologiques, les phospholipides sont
majoritairement présents sous la forme de diacyl-PL. Au niveau de la position sn-2 il s’agit
toujours d’une chaîne acyle. Ainsi les phospholipides sont également présents dans les
cellules sous forme de 1-alkyl-2-acyl-PL et de 1-alkényl-2-acyl-PL, ces derniers étant appelés
plasmalogènes. Les plasmalogènes-PE ont été détectés dans la plupart des organes de
mammifères et types cellulaires, et représentent parfois jusqu’à 50% des PE totales
notamment dans le cerveau, les plaquettes et les macrophages (Diagne et al., 1984 ;
Nakagawa et al., 1985 ; Takamura et al., 1989). Les chaînes alkényles reliées au glycérol en
position sn-1 sont principalement le 16:0, le 18:0 et les 18:1n-7 et 18:1n-9, alors que les
chaînes acyles en position sn-2 des plasmalogènes-PE sont principalement polyinsaturés
comme l’AA, l’EPA et le DHA (Akoh et Chapkin, 1990 ; Kikuchi et al., 1999 ; Zemski Berry
et Murphy, 2004). Des études ont également montré que les plasmalogènes-PE seraient
impliqués dans le métabolisme du DHA (Gaposchkin et Zoeller, 1999) et agiraient comme
des réservoirs d’acides gras polyinsaturés (Nagan et Zoeller, 2001).
Enfin les phospholipides se distinguent par leur composition en acides gras. Il est
connu que les acides gras saturés sont davantage estérifiés en position sn-1 et les acides gras
insaturés, notamment l’AA et le DHA, en position sn-2. La composition en acides gras des
phospholipides varie en fonction des organes et des tissus mais aussi de la sous-classe de
phospholipide considérée. Par exemple, par rapport aux autres organes, les phospholipides du
cerveau et de la rétine sont plus riches en DHA (Breckenridge et al., 1972 ; Wiegand et
Anderson, 1983). De plus, les PC contiennent généralement une plus grande proportion
d’acides gras saturés (16:0 et 18:0) par rapport aux PE et aux PS qui contiennent plus d’acides
gras insaturés (Glomset, 2006).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
54
Figure 14 : Structures et représentations des phospholipides.
16:0,18:1 phosphatidylcholine (PC) 16:0 lyso-phosphatidylcholine (LysoPC)
16:0,18:1 phosphatidyléthanolamine (PE) 16:0p,18:1 phosphatidyléthanolamine(Plasmalogène PE)
16:0,18:1 phosphatidylsérine (PS) 16:0,18:1 phosphatidylglycérol (PG)
16:0,18:1 phosphatidylinositol (PI)16:0,18:1 phosphatidylinositol-4,5-diphosphates (PIP2)
acide 16:0,18:1 phosphatidique (PA)
18:2 cardiolipine (CL)
acide gras
acide gras
glycérol phosphate alcool
sn-1
sn-3
sn-2
partie hydrophobe partie hydrophile
di18:1 bis(monoacylglycéro)phosphate (BMP)
CHAÎNE ACYLE CHAÎNE ALKYLE CHAÎNE ALKENYLE
R = acide gras
Structure générique d’un glycérophospholipidefaisant apparaître le nom des composants initiaux
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
55
2.3 Métabolisme des phospholipides
2.3.1 Biosynthèse des phospholipides
La biosynthèse des phospholipides a été décrite par Kennedy et Weiss en 1956.
L’acide phosphatidique (PA) est l’intermédiaire commun à la synthèse de tous les
phospholipides (Figure 15). Le PA est formé à partir du glycérol-3-phosphate grâce à une
première acylation qui forme du lysoPA et une deuxième acylation qui aboutit à la formation
de diacyl-PA. Le PA est alors hydrolysé par une PA-phosphohydrolase pour former un DAG
qui est le précurseur commun des PC et des PE. Celles-ci sont formées par condensation du
DAG avec une CDP-choline ou une CDP-éthanolamine. Le PA peut également réagir avec la
cytidine triphosphate (CTP) pour former de la cytidine diphosphate-DAG (CDP-DAG) qui est
le précurseur commun des PI et du PG (Berg et al., 2002 ; Kennedy et Weiss, 1956 ; Kent,
1995 ; Vance et Vance, 1996).
Les PC et les PE sont principalement synthétisées via la voie faisant intervenir
une CDP-choline ou une CDP-éthanolamine mais il existe également des voies alternatives
mineures. Les PC peuvent être formées à partir des PE grâce à trois méthylations successives
de leur groupement amine primaire (Vance et Schneider, 1981) et les PE peuvent être formées
à partir des PS grâce à une réaction de décarboxylation (McMaster et Choy, 1992). Chez les
animaux les PS ne peuvent être formées que par un échange de base avec une PE (Hubscher et
al., 1959 ; Vance et Vance, 1996).
Les PI sont synthétisés directement à partir du CDP-DAG et de l’inositol grâce à
l’enzyme PI-synthase. De même la synthèse du PG s’effectue à partir du CDP-DAG, mais en
deux étapes. Le CDP-DAG réagit d’abord avec un glycérol-3-phosphate pour former du PG-
phosphate qui est alors hydrolysé pour former du PG (Kiyasu et al., 1963). Les cardiolipines
sont formées dans les mitochondries à partir de PG et de CDP-DAG (Hatch, 1998). Cette
réaction est catalysée par l’enzyme cardiolipine-synthase présente dans les mitochondries
(Schlame et Hostetler, 1997). Les cardiolipines peuvent également être converties en PG +
PA par action d’une phospholipase D (Astrachan, 1973). Enfin, la biosynthèse du BMP à
partir du PG sera décrite dans le chapitre 4 des rappels bibliographiques.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
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56
DAG
PAlysoPAGlycérol-3-phosphate
PC
CDP-Ethanolamine CDP-choline
PE
PS
éthanolamine
sérine
3 S-Adenosylmethionine
3 S-Adenosylhomocystéine
Figure 15 : Biosynthèse des principaux phospholipides.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
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57
PI
CDP-DAG
PG-phosphatePG
inositol
Glycérol-3-phosphate
CDP-DAG
PA
cardiolipine
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
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58
2.3.2 Remodelage des phospholipides
Les phospholipides qui sont synthétisés de novo possèdent la même composition
en acides gras que les PA ayant servi de précurseurs. Mais une fois formés, les phospholipides
cellulaires subissent un remodelage constant de leurs chaînes acyles. Dès 1963, Lands et
Merkel proposaient un mécanisme de remodelage des phospholipides par un cycle de dé-
acylation/ré-acylation (cycle de Lands) (Lands et Merkl, 1963). Un autre mécanisme de
remodelage des PL implique des réactions de transacylation dépendantes ou indépendantes du
coenzyme A. Ces mécanismes de remodelage des phospholipides font intervenir un grand
nombre d’enzymes dont certaines possèdent des spécificités de substrat pour les acides gras
saturés ou poly-insaturés, ainsi que pour les différentes sous-classes de phospholipides.
2.3.2.1 Les phospholipases
Les phospholipases constituent un groupe d’enzymes capables d’hydrolyser les
phospholipides. Leur classification principale est basée sur leur site d’action sur les
phospholipides. Les phospholipases A hydrolysent les chaînes acyles en position sn-1 (PLA1)
ou en position sn-2 (PLA2). Certaines enzymes, appelées phospholipases B, ont la capacité
d’hydrolyser les deux chaînes acyles. A celles-ci s’ajoutent également des lysophospholipases
qui hydrolysent l’unique acide gras estérifié dans un lysoPL. Les phospholipases C et D sont
des phosphodiestérases. Les PLC hydrolysent la liaison glycérophosphate et génère ainsi un
DAG et la tête polaire du PL. Les PLC sont principalement impliquées dans l’hydrolyse du
phosphatidylinositol-2-phosophate (PIP2) qui libère de l’inositol-triphosphate (IP3) impliqué
dans différentes voies de signalisation (Berridge, 1993). Enfin, les PLD hydrolysent la liaison
entre le phosphate et le résidu alcool de la tête polaire du phospholipide, générant l’acide
phosphatidique (PA) (Figure 16).
Les PLA1 sont principalement présentent dans les lysosomes de foie de rat où
elles participent à la dégradation non spécifique des phospholipides (Franson et al., 1971).
Toutefois des PLA1 spécifiques de certains phospholipides comme les PS, les PI ou le PA ont
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
59
été décrites (Aoki et al., 2002 ; Sonoda et al., 2002 ; Ueda et al., 1993). Ces PLA1 participent
ainsi au remodelage des acyles gras en position sn-1 des phospholipides.
Les PLA2 constituent un groupe d’enzymes très diversifiées au regard de leur
fonction, localisation, régulation et spécificité de substrat (Kudo et Murakami, 2002). On
distingue selon la classification de Dennis (Dennis, 1994) neuf groupes de PLA2 qui peuvent
être regroupés en trois grandes classes : les PLA2 sécrétées (sPLA2) et les PLA2 cytosoliques
(cPLA2) qui sont toutes les deux calcium-dépendantes, et les PLA2 calcium-indépendantes
(iPLA2).
Les PLA2 sécrétées tirent leur nom du fait qu’elles ont d’abord été découvertes
dans les fluides digestifs du pancréas et de l’estomac ainsi que dans les venins de serpent.
Toutefois, des enzymes associées aux sPLA2 ont été découvertes depuis dans la plupart des
organes de mammifères et types cellulaires. Les sPLA2 ne possèdent pas de forte spécificité
de substrat vis-à-vis de la nature de l’acide gras mais il a été montré que certaines sPLA2
agissent préférentiellement sur les phospholipides anioniques comme les PE, les PS et le PG
par rapport aux phospholipides neutres comme les PC.
Les PLA2 cytosoliques (cPLA2) sont exprimées de manière constitutive dans la
majorité des tissus et cellules de mammifères (Hirabayashi et Shimizu, 2000). Ce sont des
enzymes solubles, présentes dans le cytoplasme des cellules, et qui peuvent être transloquées
vers la membrane plasmique en réponse à une augmentation de la concentration de calcium
(Diez et Mong, 1990). Il a été montré que les cPLA2 libèrent préférentiellement les acyles
gras à longues chaînes et polyinsaturés (Clark et al., 1991 ; Diez et al., 1992). Elles jouent
ainsi un rôle important dans la libération de l’acide arachidonique (AA) et donc dans
l’initiation des voies de signalisations dépendantes des différents composés bioactifs
synthétisés à partir de l’AA comme les prostaglandines, les leukotriènes ou le thromboxane
(Dennis, 1997).
Les PLA2 calcium-indépendantes (iPLA2) sont également présentes dans la
majorité des tissus et cellules de mammifères (Larsson Forsell et al., 1999) et sont impliquées
dans de nombreux mécanismes cellulaires comme la prolifération ou l’apoptose. De plus, les
iPLA2 semblent être les principales phospholipases impliquées dans le remodelage des
phospholipides (Balsinde et al., 1997 ; Ramanadham et al., 1999 ; Winstead et al., 2000). Des
études ont montré que certaines iPLA2 sont spécifiquement associées à la libération du DHA
présent en position sn-2 des phospholipides, notamment dans le cerveau où le DHA joue un
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
60
rôle métabolique important (Green et al., 2008 ; Strokin et al., 2003). D’autres iPLA2 ont été
décrites comme spécifiques des plasmalogènes (Capper et Marshall, 2001 ; Yang et al.,
1996).
2.3.2.2 Voies de dé-acylation/ré-acylation
Cette voie de remodelage des phospholipides, également appelée cycle de Lands
(Figure 17), nécessite au préalable la libération d’un des deux acyles gras par une PLA1 ou
une PLA2 générant ainsi un lysoPL. L’estérification d’un nouvel acide gras dans ce lysoPL se
déroule alors en deux temps. L’acide gras doit d’abord être activé sous forme d’acyl-CoA.
Cette réaction est catalysée par une acyl-CoA synthétase et nécessite la présence d’ATP et de
Mg2+. Il a été montré que dans la majorité des tissus, l’activité acyl-CoA synthétase est plus
forte pour l’acide arachidonique (AA, 20:4n-6) que pour les autres acides gras (MacDonald et
Sprecher, 1991 ; Reddy et Bazan, 1984a ). Une activité DHA-CoA synthétase a été mesurée
dans des extraits de cerveaux de rats (Reddy et Bazan, 1985) et de rétines (Reddy et Bazan,
1984b). Une autre enzyme, l’acyl-CoA hydrolase, catalyse la dissociation de l’acide gras et du
coenzyme A. La deuxième étape correspond au transfert de l’acide gras activé (acyl-CoA)
vers un lysoPL. Cette étape est catalysée par une acyl-CoA : lysoPL acyltransférase.
L’activité acyl-CoA : 1-acyl-2-lysoPC acyltransférase a été décrite dans les fractions
cytosoliques, microsomales et mitochondriales de nombreux tissus et types cellulaires
(Yamashita et al., 1997). Dans les plaquettes cette activité acyltransférase présente une large
préférence pour les acyl-CoA contenant des AGPI comme le 18:2, le 18:3 ou le 20:4
(McKean et Silver, 1985). En revanche, l’acyl-CoA : 2-acyl-1-lysoPC est plus spécifique des
PLA1
PLA2PLC
PLD
Figure 16 : Sites d’action des différentes phospholipases
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 2 : Généralités sur les lipides
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
61
acides gras saturés (Lands et Hart, 1965). Une activité DHA-CoA : lysoPC acyltransférase a
été mesurée dans des extraits membranaires de photorécepteurs (Guisto et al., 1986) et de
neutrophiles (Tou, 1986).
2.3.2.3 Voies de transacylation
La ré-acylation des lysoPL peut également s’effectuer par un mécanisme de
transacylation utilisant des phospholipides comme donneurs d’acides gras. Cette réaction est
catalysée par différentes enzymes appelées transacylases qui possèdent aussi des spécificités
de substrat vis-à-vis de l’acide gras transféré et vis-à-vis des phospholipides « donneurs » ou
« accepteurs ». Deux processus de transfert on été décrits, l’un étant dépendant du coenzyme
A, l’autre non. La transacylation CoA-dépendante a été mise en évidence la première fois
dans les microsomes de foie de rat et a depuis été retrouvée dans la plupart des tissus et types
cellulaires (Sugiura et al., 1988). Cette activité ne présente pas de forte spécificité de substrat.
En revanche, la transacylation CoA-indépendante, mise en évidence par Kramer et Deykin en
1983, est plus spécifique des acides gras polyinsaturés à longue chaîne comme l’AA, l’EPA et
le DHA (Kramer et Deykin, 1983 ; MacDonald et Sprecher, 1991 ; Robinson et al., 1985). Il a
notamment été montré que dans les macrophages alvéolaires de lapin et le cerveau de rat, les
transacylases CoA-indépendantes transfèrent de manière très sélective le DHA en position sn-
2 des lyso-plasmalogènes-PE (Masuzawa et al., 1989 ; Sugiura et al., 1985).
Figure 17 : Cycle de dé-acylation-ré-acylation (cycle de Lands)
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA)
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
62
Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA)
3.1 Généralités sur le DHA
3.1.1 Origine du DHA
Comme nous l’avons vu, le DHA (22:6n-3) est le plus long et le plus insaturé des
acides gras retrouvé en quantité substantielle dans les tissus humains. Il appartient à la famille
des oméga-3 (ω-3 ou n-3) avec, majoritairement, l’ALA (18:3n-3) et l’EPA (20:5n-3). L’ALA
est l’acide gras oméga-3 majoritaire apporté par l’alimentation. On le retrouve en grande
quantité dans les huiles végétales, notamment l’huile de lin, l’huile de colza ou l’huile de soja
ainsi que dans la plupart des produits agricoles (Whelan et Rust, 2006). L’ALA peut être
converti en EPA et DHA après avoir été consommé, grâce à une série d’élongations et de
désaturations (Figure 13). Toutefois, le pourcentage d’ALA converti en DHA dans
l’organisme humain est relativement faible (Brenna, 2002 ; Burdge et Calder, 2005), si bien
que la principale source d’EPA et de DHA reste l’alimentation (Abedin et al., 1999). Ces
acides gras ne sont présents que dans les produits animaux et principalement marins comme
les poissons gras des eaux froides (maquereau, saumon, thon…) ou les algues. Ainsi, les
huiles de poisson sont très riches en EPA et DHA et constituent leur principale forme d’apport
(Whelan et Rust, 2006). Le DHA ne peut pas être synthétisé directement à partir d’EPA,
nécessitant une double élongation de l’EPA en 24:5n-3 qui est désaturé en 24:6n-3 puis β-
oxydé en DHA. Un mécanisme de rétroconversion permet également la synthèse d’EPA à
partir du DHA (Conquer et Holub, 1997 ; Gronn et al., 1991). Une étude réalisée par Astorg a
montré qu’en France les quantités moyennes d’ALA, d’EPA et de DHA consommées par les
hommes adultes sont respectivement de 940 mg/jour, 150 mg/jour et 273 mg/jour (Astorg et
al., 2004).
3.1.2 Distribution du DHA
Chez les mammifères le DHA est retrouvé dans tous les tissus et types cellulaires
mais il représente en général moins de 5% des chaînes acyles des phospholipides. Toutefois, il
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA)
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
63
est très présent dans le cerveau, les spermatozoïdes et la rétine (plus précisément dans les
segments externes des bâtonnets) où il peut représenter jusqu’à 50% des acides gras
(Breckenridge et al., 1972 ; Neill et Masters, 1973 ; Wiegand et Anderson, 1983). Les espèces
moléculaires des phospholipides contenant du DHA sont principalement les 16:0/22:6,
18:0/22:6, 18:1/22:6 et 18:2/22:6 (Hicks et al., 2006). Toutefois, dans les tissus naturellement
riches en DHA, des espèces à di-DHA (22:6/22:6) ont également été détectées,
principalement dans la rétine (Delton-Vandenbroucke et al., 1998 ; Miljanich et al., 1979 ;
Wiegand et Anderson, 1983).
De plus, le DHA n’est pas réparti de manière homogène parmi les différentes
classes de phospholipides. Les PE et notamment les plasmalogènes-PE ainsi que les PS sont
généralement plus riches en DHA que les PC (Anderson et Sperling, 1971 ; Farooqui et
Horrocks, 2001 ; Glomset, 2006). Le DHA exogène s’incorpore également de manière
préférentielle dans ces phospholipides, généralement en position sn-2 et dans le feuillet
interne des membranes biologiques (Knapp et al., 1994 ; Morisaki et al., 1985 ; Zerouga et
al., 1996).
3.1.3 Incorporation du DHA dans les phospholipides in vitro et in vivo
Dans la plupart des cellules en culture, lorsque du DHA sous forme libre est
apporté de manière exogène il s’incorpore très rapidement dans l’ensemble des
phospholipides (Besson et al., 2006 ; Champeil-Potokar et al., 2004 ; Delton-Vandenbroucke
et al., 2001 ; Guillot et al., 2008 ; Wiesenfeld et al., 2001).
De plus, de nombreuses études d’incorporation ont été menées in vivo chez
l’animal et chez l’Homme. Bien que certains auteurs aient utilisé des infusions directes de
DHA, sous forme de microémulsions, dans la circulation sanguine (Yamazaki et al., 1991), en
règle générale, les supplémentations en DHA sont réalisées via le régime alimentaire. Le
DHA peut être apporté sous forme de triglycérides (TAG) dans les huiles de poisson
(EPA+DHA) ou les huiles de DHA pures, ou sous forme d’esters éthyliques. Une fois
consommés, les TAG ou les esters éthyliques subissent une hydrolyse enzymatique. Le DHA
libéré et les 2-MAG (dont ceux contenant le DHA en position sn-2 où il est majoritairement
estérifié) sont alors absorbés au niveau intestinal où ils re-forment rapidemment des TAG.
Ces TAG nouvellement formés sont sécrétés dans la lymphe sous forme de chylomicrons,
puis rejoignent la circulation sanguine. Les chylomicrons sont alors transportés vers les tissus
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA)
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
64
périphériques, notamment le foie et les tissus adipeux, où les TAG qu’ils contiennent sont
hydrolysés par la lipoprotéine lipase (LPL) liée à l’endothélium des capillaires. Les acides
gras libérés sont rapidement captés par les cellules puis ré-estérifiés dans les triglycérides ou
les phospholipides pour servir de forme de stockage d’énergie ou de constituants structurels
des membranes (Banno et al., 2002 ; Kroes et al., 2003 ; Krokan et al., 1993).
Ainsi, il a été montré chez l’animal qu’un régime alimentaire enrichi en DHA
induit une augmentation de la proportion de DHA associé aux phospholipides et aux TAG de
la plupart des organes et types cellulaires (McLennan et al., 1993 ; Robinson et al., 1993 ;
Sierra et al., 2008 ; Tamai et al., 2007). Des études menées chez l’Homme ont également
montré qu’une supplémentation en DHA induit une augmentation de la quantité de DHA dans
les cellules sanguines et le plasma (Katan et al., 1997 ; Milte et al., 2008 ; Thies et al., 2001 ;
Vidgren et al., 1997). En effet le DHA ingéré s’incorpore dans les phospholipides et les esters
de cholestérol qui ultérieurement circulent dans les lipoprotéines (communication personnelle
– projet « docoredox »). Le DHA qui est ainsi incorporé dans les éléments circulants se
retrouve également dans les plaques d’athérosclérose retirées de patients lors
d’endartérectomies (Rapp et al., 1991). Enfin, une étude clinique et chirurgicale menée chez
l’Homme a montré que le DHA ingéré sous forme d’huile de poisson s’incorpore dans les
phospholipides des cellules cardiaques (Metcalf et al., 2007).
3.2 Rôle des acides gras oméga-3 dans l’incidence des maladies cardiovasculaires
Depuis les années 70 le rôle bénéfique des acides gras polyinsaturés (AGPI)
oméga-3 a été rapporté pour un grand nombre de troubles et de pathologies humaines. Il s’agit
pour les principales des maladies cardiovasculaires, du cancer, des troubles de l’immunité et
même de certaines maladies du comportement comme la schizophrénie ou la dépression. Les
acides gras oméga-3 joueraient également un rôle majeur dans l’acuité visuelle et le
développement cérébral ainsi que dans les troubles liés au vieillissement comme la maladie
d’Alzheimer (Stillwell et Wassall, 2003 ; Stillwell, 2008).
De nombreuses revues générales concernant le rôle des acides gras oméga-3, et du
DHA en particulier, sur l’incidence des maladies cardiovasculaires ont été publiées ces
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA)
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65
dernières années (Breslow, 2006 ; Harris et al., 2008 ; Lee et al., 2008 ; von Schacky et
Harris, 2007).
3.2.1 Les études épidémiologiques
Des études épidémiologiques ont été mené afin d’établir un lien de cause à effet
entre la consommation d’acides gras oméga-3 et l’incidence des maladies cardiovasculaires.
La première de ces études concernait les Eskimos du Groenland possédant un très faible taux
de mortalité due aux maladies cardiovasculaires malgré un régime riche en lipides. Il a alors
été proposé que ceci était dû à la grande quantité d’acides gras oméga-3 à longues chaînes
(EPA+DHA) présents dans leur régime alimentaire constitué presque exclusivement de
poissons (Bang et al., 1976 ; Din et al., 2004 ; Dyerberg et al., 1975).
Depuis, de nombreuses études d’observation et des méta-analyses ont mis en
évidence une corrélation inverse entre la consommation de poissons ou la concentration en
acides gras oméga-3 à longues chaînes dans la circulation sanguine, et le risque de décès lié à
un accident cardiovasculaire (Albert et al., 1998 ; Albert et al., 2002 ; Gillum et al., 2000 ; He
et al., 2004 ; Nagata et al., 2002).
3.2.2 Les études cliniques
Au delà de ces études épidémiologiques, des études cliniques ont cherché à tester
l’hypothèse selon laquelle une supplémentation du régime alimentaire en acides gras oméga-3
pourrait protéger les individus contre les maladies cardiovasculaires. La plupart de ces études
a été réalisée chez des individus ayant connu un premier accident cardiovasculaire non mortel.
On parle alors de prévention secondaire. En règle générale, au cours de ces études, les
individus sont divisés en deux groupes : un groupe contrôle (placebo) et un groupe « traité ».
Ce dernier est composé de patients ayant reçu des conseils diététiques sur leur consommation
de poissons ou ayant été placé sous supplémentation en acides gras oméga-3 à l’aide de
capsules d’huile de poisson. Les doses utilisées vont généralement de 800 mg/jour à 1,8 g/jour
selon les études.
Trois grandes études ont ainsi mis en évidence un rôle bénéfique des acides gras
oméga-3 sur le risque cardiovasculaire. Il s’agit des études DART (the Diet and Reinfarction
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA)
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66
Trial) (Burr et al., 1989 ; Ness et al., 2002), GISSI-Prevenzione (Gruppo Italiano per lo
Studio della Sopravvivenza nell’Infarto Miocardico Prevenzione) (sans auteur, 1999 ;
Marchioli et al., 2002) et JELIS (Japan EPA Lipid Intervention Study) (Tanaka et al., 2008 ;
Yokoyama et Origasa, 2003). Dans cette dernière étude les auteurs ont étudié uniquement le
rôle de l’EPA, indépendamment du DHA.
Toutefois, d’autres études n’ont pas réussi à mettre en évidence ces mêmes effets
(Burr et al., 2003 ; Nilsen et al., 2001). Les conditions expérimentales de ces études ainsi que
l’analyse et l’interprétation des résultats ont parfois été critiquées. Ainsi, le rôle bénéfique des
acides gras oméga-3 à longues chaîne sur l’incidence des maladies cardiovasculaires restent
encore controversé (He et Song, 2006 ; Hooper et al., 2006 ; von Schacky et Harris, 2007).
3.2.3 Les mécanismes physiologiques mis en jeu
Malgré les nombreuses études suggérant un rôle protecteur des acides gras oméga-
3 contre les maladies cardiovasculaires, les mécanismes d’action par lesquels ils confèrent ces
bénéfices ne sont pas encore très bien compris.
Au niveau clinique il a été montré que les acides gras oméga-3 préviennent la
survenue d’arythmies fatales en diminuant le risque de fibrillation ventriculaire (Anand et al.,
2008 ; Calo et al., 2005), et augmentent la stabilité de la plaque d’athérosclérose en la rendant
moins vulnérable à la rupture (Rapp et al., 1991 ; Thies et al., 2003). De plus, chez des
patients ayant passé une angiographie coronarienne, Von Schacky et al. (1999) ont montré
qu’une supplémentation en EPA+DHA pendant plusieurs mois ralentit la progression de la
plaque.
Les acides gras oméga-3 à longues chaînes (EPA+DHA) affectent favorablement
plusieurs des facteurs de risque associés aux maladies cardiovasculaires. Notamment, ils
induisent une diminution du taux de triglycérides plasmatiques (Harris, 1997 ; Milte et al.,
2008), de la pression sanguine (Geleijnse et al., 2002), du rythme cardiaque (Mozaffarian et
al., 2005), de l’agrégation plaquettaire (Din et al., 2008), de l’inflammation (Calder, 2008) et
du stress oxydant (Mori, 2004).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA)
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
67
Enfin, il a été montré que les LDL enrichies en oméga-3 ont des propriétés
physiques, chimiques et biologiques qui les rendent moins athérogènes (Lada et al., 2003 ;
Lada et Rudel, 2004 ; Parks et Gebre, 1991 ; Wu et al., 2002), notamment leur oxydabilité est
diminuée (communication personnelle – projet « docoredox »). En revanche, un
enrichissement physiologique des HDL en oméga-3 ne modifie pas leur capacité à stimuler
l’efflux du cholestérol des macrophages (Buonacorso et al., 2007 ; Gillotte et al., 1998b).
Bien que le rôle bénéfique des acides gras oméga-3 sur la santé cardiovasculaire
soit largement documenté, la question des doses recommandées pour la prévention des
maladies cardiovasculaires reste encore aujourd’hui un sujet de discussions (Deckelbaum et
Akabas, 2006). Notamment des études ont montré que le DHA a un effet anti-oxydant à
faibles doses mais devient pro-oxydant à des concentrations plus élevées (Vericel et al.,
2003). l’AHA (American Heart Association) a publiée ses recommandations concernant la
consommation d’oméga-3 (Kris-Etherton et al., 2003). Il est conseillé d’apporter une
supplémention en oméga-3 sous forme de capsules d’huiles de poissson uniquement pour les
personnes présentant un risque de maladie cardiovasculaire ou souffrant
d’hypertriglycéridémie.
3.3 Rôles cellulaires du DHA
3.3.1 Structure et dynamique moléculaires du DHA dans les membranes
De nombreux travaux ont été réalisés afin de déterminer la structure et la
conformation du DHA estérifié dans les phospholipides membranaires. Il a ainsi été montré
grâce à la résonnance magnétique nucléaire (RMN), la diffraction à rayon-X et la
modélisation moléculaire que les six doubles liaisons cis non conjuguées confèrent au DHA
une très grande flexibilité par rapport aux acides gras saturés. Le DHA possède donc un grand
nombre de conformères possibles avec une vitesse de transition très élevée entre ces
différentes conformations (Feller, 2008 ; Gawrisch et Soubias, 2008). Il a toutefois été
proposé que dans les membranes, le DHA adopte préférentiellement une forme très recourbée
voire en hélice (Huber et al., 2002).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA)
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68
3.3.2 Modification des propriétés membranaires
Le DHA estérifié en position sn-2 des phospholipides induit de fortes
modifications des propriétés membranaires (Stillwell et Wassall, 2003). La présence de six
doubles liaisons modifie le compactage moléculaire des phospholipides membranaires,
induisant une diminution de la température de transition entre les phases gel et cristal liquide
(Niebylski et Salem, 1994). Le DHA augmente également la fluidité (Hashimoto et al., 1999 ;
Kamada et al., 1986) et la perméabilité des membranes vis-à-vis de l’eau, des ions et de
molécules plus grosses comme le glucose, le glycérol ou des substances thérapeutiques
(Brand et al., 1994 ; Burns et Spector, 1990 ; Huster et al., 1997). Il a été montré que le DHA,
ainsi que les autres acides gras polyinsaturés, induisent une courbure de la membrane qui
présente alors une plus forte propension à former des vésicules et à fusionner (Ehringer et al.,
1990 ; Talbot et al., 1997). Enfin, le DHA augmente le « flip-flop », c’est-à-dire qu’il stimule
le mouvement des molécules membranaires entre les deux feuillets de la bicouche de
phospholipides (Armstrong et al., 2003).
3.3.3 DHA et microdomaines membranaires
Les membranes cellulaires des cellules eucaryotes contiennent des domaines
membranaires résistant aux détergents. Ces microdomaines, également appelées radeaux
lipidiques, sont composés principalement de cholestérol, de sphingolipides et de
phospholipides contenant des acides gras saturés, et servent de plateformes pour un certain
nombre de protéines impliquées dans des voies de signalisation (voir chapitre 1 des rappels
bibliographiques).
Récemment, de nombreuses études ont montré que l’incorporation de DHA dans les
membranes modifie l’organisation des microdomaines membranaires et la fonction des
protéines associées (Chapkin et al., 2008 ; Chen et al., 2007 ; Duraisamy et al., 2007 ; Fan et
al., 2003 ; Ma et al., 2004 ; Stillwell et al., 2005).
Il a été montré que le cholestérol possède une plus grande affinité pour les acides
gras saturés et monoinsaturés que pour les acides gras polyinsaturés. En effet, la flexibilité du
DHA gênerait l’association proche avec une molécule de cholestérol beaucoup plus rigide.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA)
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69
Ainsi, la présence de DHA réduit considérablement la solubilité du cholestérol dans les
membranes (Brzustowicz et al., 2002a ; Brzustowicz et al., 2002b ; Pitman et al., 2004 ;
Shaikh et al., 2003 ) et affecterait également l’orientation de la molécule de cholestérol au
sein de la bicouche de phospholipides (Harroun et al., 2006 ; Marrink et al., 2008).
Wassal et Stillwell ont émis l’hypothèse que la faible affinité du DHA vis-à-vis du
cholestérol constitue un mécanisme capable de créer des domaines membranaires spécifiques,
riches en DHA et pauvres en cholestérol (Soni et al., 2008 ; Wassall et al., 2004 ; Wassall et
Stillwell, 2008). Contrairement aux microdomaines riches en cholestérol, les domaines riches
en DHA seraient plus larges et hautement désorganisés mais pourraient fournir un
environnement nécessaire à l’activité de certaines protéines membranaires comme la
rhodopsine (Bennett et Mitchell, 2008).
3.3.4 Le DHA comme médiateur lipidique et activateur de gènes
Les acides gras polyinsaturés tels que l’AA, l’EPA et le DHA servent de
précurseurs à la synthèse, par oxydation enzymatique, d’un grand nombre de médiateurs
lipidiques (voir chapitre 5). Le DHA en particulier est utilisé comme précurseur pour la
synthèse de médiateurs bioactifs appelés docosanoïdes (composés de 22 atomes de carbone).
Il s’agit entre autres des résolvines de la série D (RvD) et des protectines de la série D (PD)
également appelées neuroprotectines (Serhan, 2005 ; Serhan et al., 2007). Il a été montré que
ces médiateurs lipidiques issus du DHA jouent un rôle important dans le processus de
terminaison de l’inflammation (Ariel et Serhan, 2007 ; Serhan et al., 2008). La
neuroprotectine D1 est également impliquée dans le maintien de l’intégrité des cellules
neuronales et de la rétine (Bazan, 2005 ; Lukiw et al., 2005).
Le DHA ainsi que d’autres AGPI peuvent également modifier l’expression de
certains gènes en se liant à des récepteurs nucléaires (Jump, 2002 ; Sampath et Ntambi, 2005).
Ainsi, il a été montré in vivo qu’un régime alimentaire enrichi en huile de poisson entraîne des
modifications de l’expression de gènes impliqués dans l’oxydation, la synthèse, le transport et
le métabolisme des lipides. Les récepteurs nucléaires et facteurs de transcriptions impliqués
sont, entre autres, les PPAR, LXR/RXR et SREBP (de Urquiza et al., 2000 ; Kim et al., 1999
; Lee et Hwang, 2002 )
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 3 : L’acide docosahexaénoïque (DHA)
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
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3.3.5 Rôle du DHA dans le métabolisme intracellulaire du cholestérol
Certaines études se sont plus particulièrement intéressées au rôle des AGPI n-3, et
du DHA en particulier, sur le métabolisme cellulaire du cholestérol. Toutefois, des effets
divergents ont souvent été rapportés probablement car les mécanismes de régulation mis en
jeu dépendent des modèles cellulaires, du type d’acides gras utilisé ainsi que des
concentrations.
Il a été montré que l’efflux du cholestérol est augmenté dans des cellules en
culture préalablement enrichies en AGPI n-3 (Dusserre et al., 1995 ; Pal et Davis, 1990). Yu-
Poth et al. (2005) ont montré que le DHA stimule l’expression du gène codant le récepteur
aux LDL indépendamment de l’ACAT et de SREBP-1. Des études plus anciennes réalisées
par l’équipe de Davis avaient indiqué qu’une supplémentation en acides gras oméga-3
diminuait l’activité ACAT par rapport à une supplémentation en acides gras oméga-6 ou
oméga-9 (Davis, 1992 ; Pal et Davis, 1991). Certaines études ont montré, dans des
monocytes/macrophages en culture, que les AGPI n-3 (EPA+DHA) stimulent la transcription
du gène codant pour le récepteur « scavenger » CD36 (Vallve et al., 2002) alors que d’autres
ont mis en évidence un effet opposé (Pietsch et al., 1995).
De plus, les acides gras oméga-3 ou leur dérivés sont des ligands des facteurs de
transcription PPAR (Gani, 2008) et LXR/RXR (de Urquiza et al., 2000) qui régulent
l’expression de nombreux gènes impliqués dans le métabolisme intracellulaire du cholestérol.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
71
Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
4.1 Découverte, distribution et localisation subcellulaire du BMP
4.1.1 Découverte et distribution du BMP
Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP), parfois appelé acide lyso-bis-
phosphatidique (LBPA), est un phospholipide quantitativement mineur découvert pour la
première fois dans les macrophages des alvéoles pulmonaires (PAM) de lapin, de rat et de
porcs par Body et Gray en 1967 (Body et Gray, 1967). Il a ensuite été mis en évidence dans
de nombreux tissus de mammifères où il ne représente généralement que 1 à 2 % des
phospholipides totaux (Baxter et al., 1969 ; Rouser et al., 1969 ; Siakotos et al., 1969 ; Simon
et Rouser, 1969). Toutefois, dans les PAM, le BMP représente plus de 15% des
phospholipides totaux (Huterer et Wherrett, 1979 ; Mason et al., 1972).
Le BMP a également été détecté dans de nombreuses cellules en cultures comme
les fibroblastes BHK (Brotherus et Renkonen, 1974), les cellules PC12 (Holbrook et al.,
1992), les cellules CHO (Hullin-Matsuda et al., 2007), les cellules utérines stromales UIII
(Luquain et al., 2000) et les macrophages RAW et THP-1 (Besson et al., 2006 ; Waite et al.,
1990).
4.1.2 Localisation subcellulaire du BMP
Des études anciennes, utilisant différentes techniques de fractionnement cellulaire,
ont mis en évidence que le BMP était très concentré dans les fractions lysosomales extraites
de foie de rat sains (Bleistein et al., 1980 ; Kamrath et al., 1984 ; Wherrett et Huterer, 1972)
et de cellules BHK (Brotherus et Renkonen, 1977a, b). Le BMP a également été retrouvé
enrichi dans les vésicules d’endocytose des macrophages alvéolaires (Mason et al., 1972).
Plus récemment l’équipe de Gruenberg et Kobayashi a produit et utilisé un
anticorps monoclonal (6C4) anti-BMP pour étudier en immunofluorescence la localisation
subcellulaire du BMP. Il s’agit d’un anticorps monoclonal obtenu par la technique des
hybridomes. Après injection chez des souris de fractions membranaires d’endosomes isolées
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
72
de cellules BHK, des plasmocytes ont été isolés à partir de la rate des souris et fusionnés avec
des myélomes. Ces cellules hybrides, appelées hybridomes, après sélection et multiplication
dans un milieu de culture approprié, produisent des anticorps monoclonaux. Les travaux du
Dr Toshihide Kobayashi ont par la suite permis d’isoler un anticorps particulier nommé 6C4
dont l’antigène reconnu spécifiquement est le BMP (Kobayashi et al., 1998b). Ainsi, des
études d’immunofluorescence réalisées avec cet anticorps anti-BMP sur des cellules BHK ont
révélé une distribution ponctuée et périnucléaire du BMP, et colocalisée avec les protéines
rab7 et lgp120 qui sont des marqueurs des endosomes tardifs (Kobayashi et al., 1998b). Des
résultats similaires ont été obtenus sur des fibroblastes de peau (Kobayashi et al., 1999) et sur
des macrophages THP-1 (Besson et al., 2006). Le BMP est maintenant considéré comme un
marqueur des endosomes tardifs (Schmid et Cullis, 1998).
Enfin, une technique de fractionnement cellulaire utilisée sur des BHK a
également permis de montrer que le BMP est localisé quasi-exclusivement dans les
endosomes tardifs où il représente environ 15% des phospholipides (Kobayashi et al., 1998b).
Des études plus précises de fractionnement cellulaire ont montré que le BMP est localisé
uniquement dans les membranes internes des endosomes tardifs et qu’il forme des
microdomaines spécifiques où il représente environ 80% des phospholipides (Kobayashi et
al., 2001a ; Kobayashi et al., 2001b ; Kobayashi et al., 2002). Ces domaines riches en BMP se
distinguent d’un autre type de domaine également présent dans les membranes internes des
endosomes tardifs mais qui présente au contraire un enrichissement en PC (Kobayashi et al.,
2002).
4.2 Structure du BMP
4.2.1 Le squelette glycérophosphate
Le BMP est un isomère structural du phosphatidylglycérol (PG). Ces deux
phospholipides sont constitués de deux résidus glycérols reliés par un groupement phosphate
et de deux chaînes acyles. Les deux chaînes acyles du PG sont estérifiées sur le même
glycérol qui est appelé glycérol primaire, en opposition au glycérol secondaire constituant la
partie hydrophile du phospholipide. Au contraire, pour le BMP, une seule chaîne acyle est
estérifiée au glycérol primaire, l’autre étant estérifiée au glycérol secondaire (Figure 19).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
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D’un point de vue structural, ceci confère au BMP une symétrie et une forme conique. De
plus, la partie hydrophile du BMP n’est alors composée que du groupement phosphate, ce qui
explique que le BMP soit l’un des phospholipides les plus hydrophobe (Figure 18).
La singularité du BMP réside toutefois dans la stéréoconfiguration de son
squelette glycérophosphate. Comme pour tous les phospholipides, les carbones du glycérol
primaire du PG et du BMP sont notés sn-1, sn-2 et sn-3 alors que les carbones du glycérol
secondaire sont numérotés sn-1’, sn-2’ et sn-3’. Les carbones sn-2 et sn-2’ sont asymétriques.
Tous les phospholipides naturels synthétisés in vivo à partir du glycérol-3-phosphate
(principalement les PC, PE, PS, PI et PG) possèdent une configuration R sur le carbone sn-2.
De manière conventionnelle, ceci correspond à une structure où les deux chaînes acyles sont
estérifiées en positions sn-1 et sn-2, et le groupement phosphate en position sn-3. En
revanche, le carbone sn-2’ du glycérol secondaire du PG possède une configuration S. Ceci
correspond donc à une structure où le glycérol secondaire est relié au phosphate au niveau du
carbone sn-1’. La formule exacte du PG naturel qui possède une stéréoconfiguration (R,S) est
donc 1-acyl-2-acyl-sn-glycéro-3-phospho-sn-1’-glycérol ou plus simplement sn-3:sn-1’PG
(Itabashi et Kuksis, 1997).
Contrairement à tous les autres phospholipides, le carbone sn-2 du BMP possède
une configuration S. Ainsi, afin de respecter la convention d’écriture des phospholipides, le
groupement phosphate est relié au carbone sn-1 du glycérol primaire. Comme pour le PG, le
carbone asymétrique sn-2’ possède une configuration S. Le BMP naturel possède donc une
stéréoconfiguration (S,S) et est noté sn-1:sn-1’BMP. Cette stéréoconfiguration (S,S), qui est
unique au BMP, a été décrite pour la première fois par Brotherus en 1974 à partir de BMP
isolé de cellules BHK (Brotherus et al., 1974). Par la suite cette même stéréoconfiguration a
été retrouvée pour du BMP isolé de foie de rat, de poumon de lapin et de porc (Joutti et al.,
1976 ; Joutti et Renkonen, 1979b) ainsi que de la lignée macrophagique RAW 264.7 (Waite et
al., 1990).
Deux autres phospholipides mineurs, beaucoup moins étudiés, possèdent
également une stéréoconfiguration (S,S). Il s’agit de l’acide bisphosphatidique (BPA) et de
l’acide semi-lyso-bisphosphatidique (SLBPA). Ces deux phospholipides possèdent donc le
même squelette glycérophosphate que le BMP mais avec respectivement 4 et 3 chaînes
acyles, ce qui semble mettre en évidence une relation métabolique proche entre ces deux
composés et le BMP (Somerharju et al., 1977).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
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Enfin, l’isomère sn-3:sn-1’ du BMP, correspondant à la configuration (R,S), a
également été détecté dans les cellules BHK grâce à des traceurs radioactifs (Joutti, 1979).
L’existence de cet isomère a ensuite été confirmée dans les macrophages RAW (Amidon et
al., 1996) et les cellules UIII (Luquain et al., 2000). Toutefois, l’ensemble de ces études
indique que seul le sn-1:sn-1’BMP s’accumule dans la cellule, suggérant que l’énantiomère
sn-3:sn-1’ ne serait qu’un intermédiaire dans la voie de biosynthèse du BMP.
4.2.2 La position des chaînes acyles
La question de la position des chaînes acyles sur le BMP est très controversée en
raison des difficultés expérimentales dues à la migration des chaînes acyles au cours de
l’analyse (Pluckthun et Dennis, 1982). En effet, Mason et al. indiquaient en 1972 que les
chaînes acyles du BMP extrait de macrophages alvéolaires étaient estérifiés en position sn-2
et sn-2’ alors que, plus tard, d’autres études ont montré que les chaînes acyles étaient, au
moins en partie, estérifiés en position sn-3 et sn-3’ (Cochran et al., 1987 ; Wherrett et Huterer,
Figure 19 : Structures du phosphatidylglycérol et du bis(monoacylglycéro)phosphate.
Figure 18 : Représentation en 3 dimensions du 18:1/18:1-BMP
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
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1973). Toutefois, dans une étude plus récente, Kobayashi et al. (2002) ont montré que la
majorité du BMP in vivo possède ses deux chaînes acyles estérifiées en position sn-2 et sn-2’
bien que cette position soit thermodynamiquement instable. Il est finalement probable que le
BMP endogène soit en réalité un mélange d’isomères possédant différentes
stéréoconfigurations et positions d’acyles gras avec des proportions variables selon les
organes et types cellulaires (Luquain et al., 2000).
4.2.3 La composition en acides gras
La composition en acides gras du BMP est très variable selon les tissus et types
cellulaires. L’acide oléique (OA, 18:1n-9) est l’acide gras majoritaire du BMP dans les
macrophages alvéolaires (Mason et al., 1972), dans les cellules PC12 (Holbrook et al., 1992),
dans les cellules BHK (Kobayashi et al., 2002) et dans les monocytes/macrophages THP-1
(Besson et al., 2006). Dans de nombreux tissus et types cellulaires, le BMP est retrouvé
particulièrement riche en AGPI par rapport aux autres phospholipides. En effet, le DHA
(22:6n-3) est l’acide gras majoritaire dans les cellules utérines UIII (Luquain et al., 2000) et le
foie de rat et de souris sains (communications personnelles). De grandes proportions de DHA
ont également été retrouvées dans les cellules PC12 (Holbrook et al., 1992) et les
macrophages THP-1 (Besson et al., 2006). En revanche, ce sont principalement des AGPI de
la série n-6, dont le 18:2n-6 et le 20:4n-6, que l’ont retrouve dans le BMP des macrophages
alvéolaires (Mason et al., 1972) et le BMP extrait de testicules de rats où l’acide gras
majoritaire est le 22:5n-6 (Luquain et al., 2000).
4.3 La voie de biosynthèse du BMP
Le BMP est principalement synthétisé à partir du PG qui joue le rôle de
précurseur dans la voie de biosynthèse du BMP. Les cellules peuvent utiliser soit du PG
endogène qui est produit dans les mitochondries, soit du PG exogène capté à partir du milieu
extracellulaire.
De nombreuses études se sont intéressées à caractériser la voie de biosynthèse du
BMP utilisant du PG exogène comme précurseur. Poorthuis et Hostetler ont montré pour la
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
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76
première fois que le PG pouvait être converti en BMP in vitro par la fraction lysosomale
isolée de foie de rat, et que cette conversion était d’origine enzymatique. Ces résultats
suggèrent que la synthèse in vivo du BMP à partir du PG à lieu dans les lysosomes, à pH
acide. Ces études montrent également que du BMP peut être produit directement à partir du
lyso-PG, et qu’une partie du PG est aussi convertie en acyl-PG. Les auteurs suggèrent que ces
deux composés pourraient être des intermédiaires dans la voie de biosynthèse du BMP qui
nécessiterait donc l’action de phospholipases et de transacylases (Poorthuis et Hostetler, 1975
; Poorthuis et Hostetler, 1976). Les cardiolipines peuvent également être converties en BMP
par la fraction lysosomale isolée de foie de rat, probablement via la formation de lyso-PG qui
est le produit majoritaire de l’hydrolyse des CL par les lysosomes (Poorthuis et Hostetler,
1978). Matsuzawa et al. (1978) ont ensuite isolé, à partir de lysosomes de foie de rat, une
fraction protéique soluble capable de catalyser la conversion du PG en BMP. Il a également
été montré que cette activité nécessite la présence de PI comme donneur d’acyles dans les
réactions de transacylation. Enfin, Joutti et Renkonen ont montré pour la première fois que le
BMP formé à partir du sn-3:sn-1’PG exogène possède bien la stéréoconfiguration unique sn-
1:sn-1’ (Joutti et Renkonen, 1979a) et qu’il se produit donc une inversion de la
stéréoconfiguration du squelette glycérophosphate du PG.
En 1980, Somerharju et Renkonen ont observé la conversion du PG et des CL
exogènes en BMP par des cellules BHK en culture et in vivo dans le foie de rat après injection
de ces deux précurseurs dans la circulation sanguine (Somerharju et Renkonen, 1980). Dans
cette étude, il a également été montré que le BMP nouvellement formé possède
majoritairement une stéréoconfiguration sn-1:sn-1’ et que ce changement de
stéréoconfiguration met en jeu un mécanisme de réarrangement intramoléculaire du squelette
glycérophosphate du PG (Somerharju et Renkonen, 1980). Frentzen-Bertrams et Debuch ont
montré que lors de la conversion du PG exogène en BMP par la fraction lysosomale isolée de
foie de rat et par des cellules BHK en culture, le squelette glycérophosphate entier du PG est
conservé ainsi qu’une chaîne acyle sur les deux présentes initialement (Frentzen-Bertrams et
Debuch, 1981).
La voie de biosynthèse complète du BMP à partir de PG exogène et les enzymes
associées ont ensuite été largement étudiées par l’équipe de Waite grâce à des macrophages
en culture ou isolés des alvéoles pulmonaires de rat ou de lapin. Les macrophages alvéolaires
de lapin ne synthétisent pas de BMP de novo mais peuvent utiliser du PG exogène comme
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
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77
précurseur. Il a été montré que lors de cette conversion, le squelette glycérophosphate est
conservé et que la coupure de la chaîne acyle en position sn-1 est une étape nécessaire. Ces
résultats suggèrent notamment que la richesse du surfactant pulmonaire en PG (Rooney et al.,
1974 ; Sadana et al., 1988) serait à l’origine de la grande quantité de BMP retrouvée dans les
macrophages alvéolaires in vivo (Waite et al., 1987).
L’utilisation de techniques de fractionnement cellulaire sur des macrophages
RAW 264.7 en culture a permis de montrer que le BMP nouvellement synthétisé à partir du
PG exogène est associé aux fractions cellulaires « légères » contenant la majeure partie du
BMP endogène (Waite et al., 1990). De plus, le BMP nouvellement synthétisé présente bien
la stéréoconfiguration sn-1:sn-1’ (Thornburg et al., 1991). Il a été montré dans cette étude que
la stéréoconversion du carbone asymétrique sn-2 du PG résulte d’une réorientation directe du
squelette glycérophosphate pendant laquelle le carbone sn-1 du glycérol primaire, initialement
lié à une chaîne acyle, vient se lié au groupement phosphate. Les auteurs ont donc suggéré
l’existence d’une enzyme de réorientation stéréosélective possédant une activité PLA1
(Thornburg et al., 1991).
En 1995, Amidon et al. ont proposé une voie de biosynthèse complète du BMP à
partir du PG faisant intervenir une série complexe de réactions enzymatiques. D’après les
auteurs de cette étude, le PG est d’abord hydrolysé par une PLA2 pour former le 1-acyl-
lysoPG qui est alors ré-acylé sur le glycérol secondaire pour former le sn-3:sn-1’BMP. Cet
énantiomère du BMP, qui ne s’accumule pas dans la cellule, subit rapidement une
stéréoconversion de son squelette glycérophosphate accompagnée d’une perte de l’acide gras
estérifié en position sn-1, comme décrit précédemment (Thornburg et al., 1991). Cette
réaction génère du sn-1:sn-1’ lysoPG avec un acide gras estérifié sur le glycérol secondaire.
Enfin, ce composé est ré-acylé sur le glycérol primaire pour former le sn-1:sn-1’BMP (Figure
20). Différentes études ont ensuite cherché à caractériser les enzymes intervenant dans cette
voie de biosynthèse.
La première et la deuxième étape de cette voie de biosynthèse impliquent
respectivement une PLA2 et une transacylase. Il avait déjà été montré que les macrophages et
le foie de rat contiennent des PLA2 lysosomales (Franson et al., 1971 ; Franson et Waite,
1973) et que le lysoPG peut être ré-acylé par un mécanisme de transacylation faisant
intervenir un autre phospholipide comme donneur d’acyle (Hostetler et al., 1992 ; Huterer et
Wherrett, 1989 ; Huterer et al., 1993 ; Matsuzawa et al., 1978). A partir de macrophages
RAW, Amidon et al. (1996) ont réussi à distinguer par chromatographie les activités
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
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78
phospholipases (PLA1 + PLA2) et transacylases présentes dans la fraction lysosomale.
Indépendamment, ces enzymes partiellement purifiées ne peuvent pas convertir le sn-3:sn-
1’PG en sn-3:sn-1’BMP alors que la recombinaison de leur activité restaure cette synthèse.
Une purification plus poussée de l’activité phospholipase a permis à la même équipe d’isoler
une PLA2 lysosomale Ca2+-indépendante spécifique du PG. Cette PLA2 présente également
une activité PLA1 ce qui la classe dans la famille des phospholipases B. De plus, cette
phospholipase présente une activité hydrolytique plus importante vis-à-vis de l’acide oléique
et de l’acide linoléique par rapport à l’acide arachidonique (Shinozaki et Waite, 1999).
L’activité transacylase, quant à elle, ne présente pas de spécificité vis-à-vis des positions sn-1
ou sn-2 de l’acide gras sur le lysoPG, mais semble catalyser préférentiellement le transfert du
deuxième acide gras en position sn-2’ (Amidon et al., 1996). Plus tard, la même équipe a
montré que l’enzyme qui catalyse la transacylation du lysoPG utilise un deuxième lysoPG
comme donneur d’acyle (Heravi et Waite, 1999).
Les étapes suivantes de la voie de biosynthèse proposée par Amidon et al. (1995)
n’ont jamais été étudiées plus en détail ou sans résultats probants, notamment l’enzyme de
réorientation n’a jamais été clairement identifiée.
En comparaison, la synthèse du BMP à partir de PG endogène (Kiyasu et al.,
1963) n’a été que très peu étudiée. Toutefois, il a été montré que dans la lignée cellulaire
CHO une mutation sur la PGP synthase entraîne une diminution de la synthèse de PG mais
aussi de celle du BMP (Hullin-Matsuda et al., 2007 ; Ohtsuka et al., 1993). De plus, lorsque
ces cellules déficientes sont transfectées avec l’ADNc correspondant au gène codant pour la
PGP synthase, la synthèse du PG ainsi que celle du BMP sont restaurées. Ces résultats
indiquent clairement que le PG endogène est utilisé par les cellules comme précurseur à la
synthèse du BMP (Hullin-Matsuda et al., 2007). Dans les lymphoblastes humains provenant
de patients souffrant du syndrome de Barth (BTHS) la synthèse et le métabolisme des CL sont
altérés (Schlame et Ren, 2006). Or, il a été montré que dans ces cellules la synthèse du BMP
n’est pas modifiée, suggérant que les CL ne sont pas utilisées comme précurseurs endogènes
pour la biosynthèse du BMP (Hullin-Matsuda et al., 2007).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
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79
4.4 Métabolisme du BMP
4.4.1 Modifications pathologiques et induites du BMP
Très tôt il a été montré que le BMP s’accumule dans le foie et la rate de patients
atteints de phospholipidoses ou de désordres métaboliques d’origine lysosomale comme la
maladie de Niemann-Pick de type C (NPC) (Harder et al., 1984 ; Rouser et al., 1968 ; Weisz
et al., 1994 ; Yamamoto et al., 1970). Des quantités importantes de BMP ont également été
retrouvées dans différents tissus de souris présentant de tels désordres métaboliques d’origine
lysosomale (Jabs et al., 2008 ; Nakashima et al., 1984). Toutefois, toutes les lipidoses
affectant les lysosomes ne présentent pas d’accumulation significative de BMP (Kahma et al.,
1976). Une étude réalisée sur des fibroblastes en culture issus de patients souffrant de
différents désordres affectant les lysosomes a montré une augmentation de la quantité
Figure 20 : Voie de biosynthèse du BMP à partir du PG exogène.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
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80
cellulaire de BMP dans certaines pathologies, mais beaucoup moins importante que celle
observée précédemment dans les organes de patients. De plus, dans cette étude, les
fibroblastes NPC en culture ne présentent pas d’accumulation significative de BMP mais
simplement une augmentation de la proportion de l’espèce 18:1/18:1 par rapport à l’espèce
22:6/22:6 (Meikle et al., 2008). Il est connu cependant que les quantités cellulaires de BMP
peuvent évoluer selon les conditions de culture. Par exemple, la déplétion du milieu en sérum
entraine une prolifération des lysosomes et une augmentation de la quantité de BMP
(Brotherus et al., 1977). Il est donc possible que les conditions qui entraînent une
accumulation de BMP in vivo dans les organes de patients soient absentes des fibroblastes en
culture.
Certains agents pharmacologiques, principalement des drogues cationiques
amphiphiles comme la 4,4’-diethylaminoethoxyhexéstérol, la chloroquine, l’amiodarone, la
gentamicine, l’amantadine et le triton, induisent des phospholipidoses chez l’animal qui
miment le phénotype observé au niveau des lysosomes dans les lipidoses humaines d’origine
pathologique. Or il a été montré que ces agents pharmacologiques provoquent une très forte
accumulation de BMP, ainsi que d’autres phospholipides acides, dans les lysosomes de foie
de rats traités (Adachi et al., 1972 ; Huterer et al., 1975 ; Matsuzawa et Hostetler, 1980 ;
Tjiong et Debuch, 1978 ; Yamamoto et al., 1976). De plus, le BMP qui s’accumule lors de ces
lipidoses induites présente un enrichissement important en acides gras polyinsaturés,
notamment en DHA (Harder et Debuch, 1982 ; Ito et al., 2002 ; Tjiong et al., 1978). Ces
mêmes observations ont également été réalisées chez des patients traités au 4,4’-
diethylaminoethoxyhexéstérol (Kasama et al., 1974 ; Yamamoto et al., 1971). Ainsi, il a été
proposé que le BMP, et notamment le 22:6/22:6-BMP, pourrait servir de marqueur pour
certaines lipidoses (Baronas et al., 2007 ; Mortuza et al., 2003).
Les mécanismes mis en jeu dans ces lipidoses induites n’ont pas été clairement
identifiés. Toutefois, il a été montré que les agents pharmacologiques utilisés s’accumulent
dans les lysosomes de foie de rats traités. Certains auteurs ont ainsi proposé que les effets
seraient dus à une inhibition des phospholipases lysosomales via la formation de complexes
entre les phospholipides et les agents pharmacologiques (Harder et al., 1980 ; Harder et al.,
1981 ; Hostetler et Richman, 1982 ; Hostetler et al., 1985 ; Pappu et Hostetler, 1984). De plus,
il a été montré que la fraction lysosomale isolée du foie de rats traités présente un taux de
conversion in vitro du PG en BMP beaucoup plus important que la fraction lysosomale isolée
du foie de rats sains (Frentzen-Bertrams et Debuch, 1981).
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81
4.4.2 Dégradation enzymatique et remodelage des acyles gras du BMP
Différentes lipases lysosomales ont été décrites comme catalysant la dégradation
complète des phospholipides (Franson et al., 1971 ; Mellors et Tappel, 1967 ; Stoffel et
Greten, 1967). Toutefois, il a été montré que dans les cas de lipidoses induites chez le rat,
l’accumulation du BMP dans les lysosomes du foie persiste longtemps après l’arrêt du
traitement, suggérant pour la première fois une dégradation beaucoup plus lente du BMP que
des autres phospholipides (Yamamoto et al., 1971).
Différentes études réalisées in vitro ont montré que la fraction lysosomale extraite
de foie de rat contient des enzymes capables de dégrader le BMP. Une activité
phosphodiestérase générant du lysoPA et du monoacylglycérol (MAG) a été mesurée, ainsi
qu’une activité phospholipase A générant du lysoPG et un acide gras (Huterer et Wherrett,
1982 ; Matsuzawa et Hostetler, 1979). Dans ces études, il a cependant été noté que le taux de
dégradation du BMP par rapport aux autres phospholipides est très lent. Il a été suggéré que la
stéréoconfiguration particulière sn-1:sn-1’ du BMP pourrait lui conférer cette résistance vis-à-
vis des enzymes hydrolytiques. De plus, le lysoPG généré lors de l’hydrolyse du BMP
pourrait être rapidement reconverti en BMP (Poorthuis et Hostetler, 1976) résultant en un
cycle futile (Matsuzawa et Hostetler, 1979). Toutefois, en 2002, Ito et al. ont extrait des
testicules de rat une PLA2 capable d’hydrolyser efficacement le BMP à pH acide.
Des études d’incorporation d’acides gras et de phosphate radioactifs dans les
différentes classes de phospholipides cellulaires ont montré que le BMP incorpore rapidement
les acides gras exogènes par rapport aux autres phospholipides, et qu’il possède un
remodelage très rapide de ses acides gras par rapport à celui de son squelette
glycérophosphate (Huterer et Wherrett, 1979). De plus, il a été montré dans les macrophages
alvéolaires que le BMP incorpore plus rapidement et plus efficacement l’acide arachidonique
(AA, 20:4n-6) par rapport à l’acide oléique (OA, 18:1n-9) et à l’acide palmitique (16:0),
suggérant l’importance du BMP dans le métabolisme de cet acide gras et la génération des
différents eicosanoïdes (Cochran et al., 1985 ; Cochran et al., 1987 ; Huterer et Wherrett,
1979). Les auteurs suggèrent également, au vu de la résistance du BMP aux PLA1 et PLA2
classiques, que le remodelage rapide des acyles gras du BMP impliquerait des mécanismes de
transacylation (Cochran et al., 1987 ; Waite et al., 1992).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
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Enfin, il a été montré que le DHA s’incorpore très rapidement et de manière
hautement sélective dans le BMP des macrophages alvéolaires (Huterer et Wherrett, 1986),
des fibroblastes (Huterer et Wherrett, 1986), des cellules utérines UIII (Luquain et al., 2000),
des cellules BHK et des macrophages THP-1 (Besson et al., 2006). Il a ainsi été proposé que
cette propriété soit commune à l’ensemble des cellules de mammifère (Besson et al., 2006).
De plus, dans cette dernière étude, il a été montré que l’incorporation du DHA dans le BMP
des macrophages THP-1 est beaucoup plus importante que celle de l’AA ou de l’EPA
suggérant un rôle essentiel du BMP dans le métabolisme du DHA.
4.5 Le rôle cellulaire du BMP
Le rôle cellulaire du BMP n’a été étudié que tardivement. Le premier outil utilisé
pour des études fonctionnelles a été l’anticorps monoclonal anti-BMP. Il a été montré sur des
cellules BHK que l’anticorps anti-BMP ajouté dans le milieu de culture est internalisé dans
les cellules par endocytose et qu’il s’accumule dans les endosomes où il se fixe à son
antigène. Ce traitement altère les propriétés et la structure des endosomes tardifs qui
présentent un réseau de membranes internes plus dense et plus compacte que dans les cellules
non traitées. De plus, la désorganisation des membranes internes par l’anticorps anti-BMP
altère le recyclage normal du récepteur IGF2/MPR (insulin-growth factor 2/mannose-6-
phosphate) lorsqu’il transite via les endosomes tardifs (Kobayashi et al., 1998b ; Kornfeld,
1992).
Les endosomes tardifs constituent un important compartiment de stockage, de tri
et de redistribution de différentes molécules dont le récepteur IGF2/MPR ainsi que le
cholestérol dérivé de la captation des lipoprotéines de faible densité (voir chapitre 1). Or, il a
également été montré qu’un traitement avec l’anticorps anti-BMP sur des cellules en culture
entraîne une forte accumulation de cholestérol libre dans les endosomes tardifs, comme
observé dans des fibroblastes NPC (Liscum et Klansek, 1998) ou traités avec l’agent
pharmacologique U18666A connu pour altérer le transport intracellulaire du cholestérol
(Kobayashi et al., 1999). L’ensemble de ces résultats indique que les domaines riches en BMP
jouent un rôle majeur dans la dynamique des membranes internes des endosomes tardifs, et
donc dans le maintien et la régulation des différentes fonctions endosomales dont le transport
intracellulaire du cholestérol.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
83
Par ailleurs, une étude utilisant un système acellulaire pour mesurer le transfert du
cholestérol d’une membrane à une autre a permis de montrer que le BMP stimule le transfert
de cholestérol par la protéine endosomale NPC2 (Babalola et al., 2007 ; Cheruku et al., 2006).
Le syndrome antiphospholipide se caractérise par diverses manifestations
cliniques et est associé à la présence, dans la circulation sanguine, d’anticorps humoraux anti-
phospholipides. Les cibles de ces anticorps n’ont pas été clairement identifiées. Il a d’abord
été proposé qu’il s’agisse des cardiolipines ou de complexes phospholipides-protéines (Cines
et McCrae, 1995 ; Rauch et Janoff, 1996 ; Triplett, 2003). Cependant, il a été montré que les
anticorps isolés du plasma de patients souffrant de ce syndrome sont capables de se lier au
BMP et, une fois endocytés dans des cellules en culture, perturbent les membranes des
endosomes tardifs et le métabolisme du cholestérol, comme l’anticorps monoclonal anti-BMP
6C4 (Galve-de Rochemonteix et al., 2000 ; Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi et al., 1999).
Ceci suggère que ce syndrome est associé, au moins en partie, à une altération du
fonctionnement endosomal régulé par les domaines membranaires riches en BMP.
Il a également été montré que l’agent pharmacologique D-threo-1-phenyl-2-
décanoylamino-3-morpholino-1-propanol (D-PDMP) s’accumule dans les endosomes tardifs
des cellules BHK en culture et qu’il altère la structure et l’organisation des membranes riches
en BMP, indépendamment de son effet inhibiteur sur la synthèse des glycosphingolipides. De
plus, comme pour l’anticorps anti-BMP, le D-PDMP altère le fonctionnement des membranes
endosomales et l’homéostasie cellulaire du cholestérol. En effet, alors que le BMP stimule
l’activité lipase acide in vitro, l’accumulation de D-PDMP dans les endosomes tardifs inhibe
l’hydrolyse des esters de cholestérol dérivés de la captation des LDL, ce qui entraîne une
accumulation de cholestérol dans les endosomes tardifs (Makino et al., 2006).
Ces différentes études fonctionnelles réalisées sur des cellules en culture ont
toutes nécessité l’utilisation de l’anticorps anti-BMP ou d’agents pharmacologiques modifiant
de manière globale la structure et le fonctionnement des endosomes tardifs. En 2004, Matsuo
et al. ont montré que le BMP possède une capacité intrinsèque à stimuler la formation de
vésicules à l’intérieur de liposomes préparés in vitro et donc à générer des structures
semblables aux régions multi-vésiculaires des endosomes tardifs observées dans les cellules
en culture. De plus, il a été montré que cette capacité à former des vésicules dépend du
gradient de pH entre l’intérieur des liposomes qui doit être acide et l’extérieur qui doit être
neutre, comme c’est le cas pour les endosomes tardifs. Enfin, la présence de l’anticorps anti-
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
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84
BMP inhibe la formation des vésicules internes (Matsuo et al., 2004). Ainsi, ces résultats
suggèrent que le BMP participe à l’évolution des endosomes précoces en corps multi-
vésiculaires et en endosomes tardifs. Toutefois, les mécanismes mis en jeu n’ont pas été
clairement identifiés. Le BMP est un phospholipide chargé négativement avec une tête polaire
très réduite et qui présente une structure spatiale en forme de cône. Il a donc été proposé que
ces propriétés structurales très particulières du BMP pourraient conférer aux microdomaines
riches en BMP la capacité d’induire une asymétrie au sein des membranes et de favoriser ainsi
le processus d’invagination et donc la formation de vésicules internes (Burger, 2000 ; Dikic,
2004 ; Matsuo et al., 2004).
Dans leur étude, Matsuo et al. (2004) ont également isolé une protéine cytosolique
appelée ALIX qui a la propriété d’être recrutée in vitro à l’intérieur des liposomes contenant
du BMP et formant des vésicules internes. Il est intéressant de noter qu’ALIX est associée à
certaines protéines du complexe ESCRT (« Endosomal Sorting Complex Required for
Transport ») impliqué dans l’invagination des membranes endosomales et la formation des
corps multi-vésiculaires (Hurley, 2008 ; Saksena et al., 2007), et que l’homologue d’ALIX
chez la levure, appelé Bro1, participe à la formation des endosomes multi-vésiculaires
(Odorizzi et al., 2003). Il a été montré que lorsque la protéine ALIX est ajoutée en excès, la
formation de vésicules internes dans les liposomes contenant du BMP est inhibée. De plus,
sur des cellules en culture, lorsque l’expression du gène codant pour ALIX est bloquée par
des siRNA, la quantité cellulaire de BMP diminue ainsi que le nombre d’endosomes tardifs et
le nombre de vésicules internes dans les endosomes tardifs. (Matsuo et al., 2004). Ainsi, ces
résultats indiquent que la protéine ALIX participe à la régulation du processus d’invagination
stimulé par le BMP et contrôle l’organisation des endosomes tardifs dans les cellules en
culture. Les auteurs suggèrent également que les membranes internes des endosomes tardifs
interagissent dynamiquement avec la membrane limitante grâce à des mécanismes de
fusion/fission contrôlés par le BMP et ALIX, probablement via une interaction directe avec
des complexes protéiques présents dans le cytosol (Dikic, 2004 ; Matsuo et al., 2004). De
plus, il a été montré que ces mécanismes de fusion membranaire qui impliquent le BMP et la
protéine ALIX à l’intérieur des endosomes tardifs sont essentiels à la libération de la
nucléocapside du VSV (Vesicular Stomatis Virus) dans le cytoplasme, étape qui initie
l’infection (Le Blanc et al., 2005). Dans les cellules où la protéine ALIX est sous-exprimée,
en plus de la diminution de la quantité de BMP, on observe une diminution de la quantité de
cholestérol qui est réversible par supplémentation des cellules avec du BMP exogène
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 4 : Le Bis(Monoacylglycéro)Phosphate (BMP)
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(Chevallier et al., 2008). Les auteurs suggèrent dans cette étude que la capacité des
endosomes tardifs à stocker le cholestérol dépend directement de la quantité de BMP.
L’équipe d’Hayakawa a utilisé des membranes reconstituées et des modélisations
moléculaires pour étudier la structure et les propriétés physiques des membranes contenant du
BMP. Il a ainsi été montré que le BMP forme des domaines compacts et irréguliers par
rapport au PG qui forme des domaines plus circulaires. De plus, les propriétés physiques de
ces membranes à BMP, telle la température de transition de phase et l’enthalpie molaire,
suggèrent l’existence de fortes liaisons hydrogène entre les molécules de BMP. En effet, les
groupements hydroxyles (–OH) et phosphate interagissent avec ceux des molécules
adjacentes. Ainsi, les têtes polaires de chaque molécule de BMP s’arrangent de telle façon que
les chaînes acyles soient très proches les unes des autres. (Hayakawa et al., 2006 ; Hayakawa
et al., 2007a). Ces mêmes auteurs ont également observé, à l’aide de membranes
reconstituées, que l’association du BMP avec le ganglioside GM1 génère, à pH acide, des
structures lamellaires très compactées (Hayakawa et al., 2007b).
Enfin, il a été montré que le BMP stimule la dégradation enzymatique des
sphingolipides et glycosphingolipides dans les endosomes tardifs/lysosomes (Kolter et
Sandhoff, 2005 ; Wilkening et al., 2000). Les enzymes impliquées dans cette dégradation sont
des exohydrolases solubles nécessitant la présence de cofacteurs appelés SAPs (sphingolipid
activator proteins) ou saposines. Il a été montré que le BMP interagit directement avec la
saposine C et que cette interaction est impliquée dans le processus de dégradation des
sphingolipides (Chu et al., 2005 ; Linke et al., 2001).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 5 : La peroxydation lipidique
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Chapitre 5 : La peroxydation lipidique
Le stress oxydant peut être décrit comme un déséquilibre entre la production de
radicaux libres et leur destruction par les systèmes de défenses anti-oxydantes. Le stress
oxydant, lié à une augmentation de la concentration de radicaux libres dans la cellule,
provoque diverses altérations telles que l’oxydation de l’ADN (Cooke et al., 2003) et des
protéines (Davies, 2003), la perturbation de l’homéostasie du calcium intracellulaire (Farber
et al., 1990) ou la peroxydation des lipides. Dans ce dernier cas il faut toutefois distinguer la
peroxydation lipidique enzymatique faisant intervenir entre autre les cyclooxygénases (COX)
et les lipoxygénases (LOX), et conduisant à la formation de divers eicosanoïdes et
docosanoïdes biologiquement actifs, et la peroxydation lipidique non-enzymatique faisant
intervenir les espèces réactives dérivées de l’oxygène (ROS) et qui s’avère le plus souvent
néfaste.
5.1 Les espèces réactives dérivées de l’oxygène (ROS)
Les radicaux libres sont des atomes ou des molécules contenant un électron non
apparié (identifié par •), ce qui explique leur très grande réactivité. Les ROS incluent tous les
radicaux oxygénés tels que l’anion superoxyde (O2•-), le radical hydroxyle (OH•), les
peroxyles (ROO•), les alkoxyles (RO•) et le monoxyde d’azote (NO•) ainsi que les espèces
non radicalaires dérivés de l’oxygène comme l’oxygène singulet (1O2) ou le peroxyde
d’hydrogène (H2O2). Les ROS se forment dans la cellule par des voies enzymatiques
(NAD(P)H oxydase, xanthine oxydase…) ou non. Les ROS sont des molécules très réactives
capables d’initier la peroxydation lipidique. Les métaux de transition (Fe2+/Fe3+, Cu+/Cu2+)
sont également des activateurs de l’oxydation (Bacot, 2004).
5.2 Mécanismes de la peroxydation lipidique non-enzymatique
Les acides gras polyinsaturés (AGPI) sont des cibles privilégiées des ROS en
raison de leurs hydrogènes bis-allyliques facilement oxydables. Plus l’acide gras est insaturé,
comme l’acide arachidonique (20:4n-6) ou l’acide docosahexaénoïque (22:6n-3), plus il est
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 5 : La peroxydation lipidique
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
87
peroxydable (Cosgrove et al., 1987). Le cycle d’auto-oxydation des AGPI comporte trois
phases : une phase d’initiation, une phase de propagation et une phase de terminaison (Pre,
1991). Les AGPI peuvent être peroxydés lorsqu’ils sont sous forme libre ou estérifiés dans un
phospholipide, un ester de cholestérol ou un triglycéride. Bien qu’il soit beaucoup moins
sensible, le cholestérol peut également être la cible de ROS et former ainsi diverses molécules
de cholestérol oxydé appelés oxystérols (voir chapitre 1).
5.2.1 Les différentes phases
- La phase d’initiation
La peroxydation lipidique est initiée lorsqu’une espèce radicalaire (ROS) arrache un atome
d’hydrogène à un groupement méthylène (–CH2–) d’un AGPI (RH), aboutissant à la
formation d’un radical d’acide gras (R•) stabilisé par un phénomène de résonance (Figure 21).
- La phase de propagation
Dans cette étape d’amplification, le radical d’acide gras (R•) réagit avec l’oxygène (O2) pour
former un radical peroxyle (ROO•). Ce dernier est capable de réagir avec un autre AGPI
(R’H) entrainant la formation d’un hydroperoxyde d’acide gras (ROOH) et d’un nouveau
radical d’acide gras (R’•) qui assure la propagation de la réaction.
- La phase de terminaison
Cette étape conduit à la formation de composés stables soit par association de deux espèces
radicalaires qui se neutralisent, soit par l’intervention de molécules anti-oxydantes qui jouent
le rôle de piégeurs de radicaux.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 5 : La peroxydation lipidique
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
88
5.2.2 Les anti-oxydants
Pour se protéger contre les processus radicalaires de la peroxydation lipidique, la
cellule dispose d’un puissant système de défense faisant intervenir des enzymes spécifiques
ainsi que des molécules anti-oxydantes produites par la cellule ou apportées par
l’alimentation. Les enzymes anti-oxydantes sont principalement les superoxydes dismutases
(SOD) (Brawn et Fridovich, 1980), les catalases (CAT) (Kirkman et al., 1999) et les
glutathion peroxydases (GPx) (Arthur, 2000).
L’action protectrice de ces enzymes est complétée par des molécules anti-
oxydantes comme l’α-tocophérol (vitamine E), les caroténoïdes, le glutathion, l’acide
ascorbique (vitamine C), l’acide lipoïque et de nombreux flavonoïdes. Ces molécules
bloquent ou ralentissent la propagation de la peroxydation lipidique en réagissant avec les
différents radicaux produits (RO•, ROO•…). Pendant cette réaction les anti-oxydants
s’oxydent et forment des composés beaucoup moins réactifs que les peroxydes lipidiques,
voire des composés stables (Toussaint et al., 2003). La vitamine E, en particulier, possède un
très fort pouvoir anti-oxydant. Elle est capable de réduire les peroxydes lipidiques en alcool
correspondant, tandis qu’elle-même est transformée en radical tocophéryle puis régénérée par
différents mécanismes. De plus c’est une molécule lipophile capable de s’incorporer dans les
membranes cellulaires (Wang et Quinn, 1999).
OH•
H2O
R•
ROO•
O2
R’H
ROOH
Phase d’initiation Phase de propagation
résonnance
R• + R’OO•
ROOR’
R• ROO•
RH ROOH ROH
antioxydant
Phase de terminaison
Figure 21 : Mécanismes de la peroxydation lipidique non-enzymatique. (Pre, 1991)
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 5 : La peroxydation lipidique
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89
5.3 Les produits d’oxydation des AGPI
5.3.1 Oxydation enzymatique des AGPI
L’oxydation enzymatique des AGPI estérifiés en position sn-2 des phospholipides
s’effectue après leur libération par action d’une PLA2. Les AGPI deviennent alors des
substrats pour les cyclooxygénases (COX), les lipoxygénases (LOX) ainsi que pour les
époxygénases appartenant à la famille du cytochrome P450 (CYP), qui générèrent un ensemble
de composés oxydés bioactifs (Figure 22 etFigure 23).
L’acide arachidonique (AA, 20:4n-6) sert de précurseur à la synthèse de composés
bioactifs appelés eicosanoïdes (composés de 20 atomes de carbone). Il s’agit des
prostaglandines (PGs) et des thromboxanes (TXs) de la série 2 synthétisés par action de la
COX, des leukotriènes (LTs) de la série 4 synthétisés par action de la 5-LOX et des composés
époxylés (EETs) synthétisés par action des CYP (Samuelsson, 1987 ; Vance et Vance, 1996).
Des composés mono-hydroxylés (12-HETE, 15-HETE) sont également produits par action de
la 12-LOX et de la 15-LOX (Spector et al., 1988), ainsi que des lipoxines (LXs) de la série 4
(Romano, 2006).
De la même manière l’acide eicosapentaénoïque (EPA, 20:5n-3) peut servir de
précurseur à la synthèse d’eicosanoïdes. Il s’agit de PGs et de TXs de la série 3, de LTs de la
série 5, de composés mono-hydroxylés comme le 15-HEPE et de lipoxines (LXs) de la série 5
(Grimminger et al., 1997 ; Lam et Wong, 1988 ; Needleman et al., 1979).
Il existe d’autres éicosanoïdes, moins bien décrits, comme les hépoxylines, les
trioxlines, les clavulones et les lévuglandines. Ces dernières sont des céto-aldéhydes non
cycliques, formées par fragmentation et réarrangement des PGH2 et PGH3.
L’acide docosahexaénoïque (DHA, 22:6n-3), quant à lui, sert de précurseur à la
synthèse de docosanoïdes (composés de 22 atomes de carbone). Comme le DHA n’est pas
substrat de la COX il ne se forme pas de docosanoïdes analogues aux prostaglandines. En
revanche des composés mono-hydroxylés comme le 17S-HDHA sont synthétisés par action
des LOX (Sawazaki et al., 1994).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 5 : La peroxydation lipidique
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
90
Plus récemment, il a été découvert deux nouvelles familles de composés bioactifs
oxygénés synthétisés de manière enzymatique à partir de l’EPA et du DHA et appelées
résolvines et protectines (Serhan et al., 2004 ; Serhan, 2005 ; Serhan et al., 2007). Les
composés tri-hydroxylés synthétisés à partir de l’EPA ont été nommés résolvines de la série E
(RvE) et ceux synthétisés à partir du DHA, résolvines de la série D (RvD). Le DHA peut
également servir de précurseur à la synthèse de composés di-hydroxylés appelé docosatriènes
ou protectines. Le 10R,17S-docosatriène a été nommé neuroprotectine D1 (NPD1) en raison
de sa forte implication in vivo dans le système neuronal (Hong et al., 2003 ; Hong et al.,
2007). Le DHA peut également être oxydé par les CYP en composés hydroxylés ou époxydés
(Ye et al., 2002).
Acide arachidonique(AA, 20:4n-6)
Acide eicosapentaénoïque(EPA, 20:5n-3)
Acide docosahexaénoïque(DHA, 22:6n-3)
Eicosanoïdes
Prostaglandines / Thromboxanes série 2Leucotriènes série 4
Lipoxines série 4HETEs
Eicosanoïdes
Prostaglandines / Thromboxanes série 3Leucotriènes série 5
Lipoxines série 5HEPEs
Résolvines série E
DocosanoïdesRésolvines série DDocosatriènes / Protectines(Neuroprotectine D1)
HDHAs
DHA 17S-HDHA
Résolvine D1Protectine D1
Figure 22 : Les principaux médiateurs lipidiques issus de l’oxydation enzymatique des acides gras polyinsaturés AA, EPA et DHA.
Figure 23 : Structures du DHA et de 3 docosanoïdes : le 17S-HydroxyDHA, la protectine D1 et la résolvine D1.
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 5 : La peroxydation lipidique
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91
5.3.2 Oxydation non-enzymatique des AGPI
L’oxydation non-enzymatique des AGPI produit un nombre importants de
composés avec soit une préservation (même nombre d’atomes de carbones), soit une
dégradation de la structure de l’acide gras. Comme nous l’avons vu dans les mécanismes,
l’oxydation non-enzymatique des AGPI commence par la formation d’une forme radicalaire
instable de l’acide gras (R•) qui réagit rapidement avec l’oxygène pour former des
hydroperoxydes (ROOH). Contrairement à l’oxydation enzymatique, l’attaque radicalaire
peut toucher un acide gras estérifié sur un phospholipide. Les phospholipides contenant des
acyles gras peroxydés provoquent des modifications structurales des membranes cellulaires et
des lipoprotéines en altérant les interactions hydrophobes lipides/lipides et lipides/protéines
(Bacot, 2004).
5.3.2.1 Conservation de la structure de l’acide gras
Les hydroperoxydes estérifiés sur les phospholipides sont instables. Ils peuvent
induire une cyclisation de l’acide gras qui conserve ainsi sa structure. Cette cyclooxygénation
non-enzymatique produit des composés qui sont des isomères des prostaglandines (générées
enzymatiquement par la COX). Ces composés sont appelés isoprostanes (IsoPs). Des études
menées chez l’Homme ont montré qu’il se forme in vivo, à partir de l’AA, des isoprostanes de
la série 2 (Montuschi et al., 2007 ; Morrow et al., 1990 ; Taber et al., 1997) ainsi que des
isothromboxanes de la série 2 (Morrow et al., 1996). De la même manière la peroxydation
non-enzymatique de l’EPA et du DHA peut conduire respectivement à la formation des
isoprostanes de la série 3 et de la série 4 (Nourooz-Zadeh et al., 1997 ; Nourooz-Zadeh et al.,
1998). Les isoprostanes issus de la peroxydation du DHA sont également appelés
neuroprostanes car il a été montré qu’ils se forment principalement dans le cerveau (Roberts
et al., 1998).
Comme les prostaglandines peuvent générer des lévuglandines par coupure du
cycle, les isoprostanes peuvent de la même façon générer des isolévuglandines. En 1999,
Brame et al. (1999) ont mis en évidence, pour la première fois, la formation in vivo de ces
composés issus de la peroxydation de l’AA, qui ont alors été renommés isokétals. Le même
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 5 : La peroxydation lipidique
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92
type d’aldéhydes peut être formé à partir de l’EPA et du DHA pour lequel on parle alors de
neuroketals (Bernoud-Hubac et al., 2001).
Plus récemment, il a été montré que les hydroperoxydes pouvaient former, par
cyclisation, une autre famille de composés appelés isofuranes (IsoFs). Comme précédemment,
la peroxydation non-enzymatique de l’AA, de l’EPA et du DHA peut conduire respectivement
à la formation des isofuranes de la série 2, de la série 3 et de la série 4, ces derniers étant
également appelés neurofuranes (Fessel et al., 2002 ; Taber et al., 2004 ; Taber et Jackson
Roberts, 2005).
Une fois formés, ces isoprostanes, isokétals et isofuranes peuvent être libérés
grâce à l’action d’une phospholipase (Morrow et al., 1992).
Enfin, la réduction des hydroperoxydes peut également générer des acides gras
mono- ou di-hydroxylés. Contrairement à la LOX qui génère uniquement des acides gras
hydroxylés avec une stéréoconfiguration S, la peroxydation non-enzymatique génère des
acides gras hydroxylés avec une stéréoconfiguration R ou S.
5.3.2.2 Altération de la structure de l’acide gras
Les hydroperoxydes estérifiés dans les phospholipides peuvent également subir
une dégradation spontanée qui génère différents alcanes et alcènes ainsi que des aldéhydes.
Les principaux aldéhydes stables formés sont le dialdéhyde malonique (MDA) et les 4-
hydroxyalkénals, notamment le 4-hydroxynonénal (4-HNE) provenant de l’oxydation des
AGPI de la série n-6 (Porter et al., 1995) et le 4-hydroxyhexénal (4-HHE) provenant de
l’oxydation des AGPI de la série n-3 (van Kuijk et al., 1986).
Tous ces aldéhydes, ainsi que les isokétals, sont très réactifs et ont une durée de
vie beaucoup plus longue que les radicaux libres. Ils agissent donc comme des seconds
messagers toxiques de la peroxydation lipidique. La toxicité de ces aldéhydes réside
principalement dans le fait qu’ils peuvent former des adduits avec des protéines ou d’autres
macromolécules contenant des amines comme l’ADN, les protéines ainsi que certains
phospholipides (PE et PS). Ces produits d’addition ont été identifiés comme des adduits de
Michael et des bases de Schiff (Ascherio et al., 1995 ; Bacot et al., 2007 ; Bernoud-Hubac et
al., 2004 ; Guichardant et al., 1998 ; Stone et al., 2008 ; Uchida, 2003).
RAPPELS BIBLIOGRAPHIQUES Chapitre 5 : La peroxydation lipidique
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
93
Ainsi, lorsqu’un AGPI estérifié en position sn-2 d’un phospholipide subi une
dégradation radicalaire, il génère un certain nombre d’aldéhydes mais laisse également un
phospholipide tronqué contenant différents résidus oxygénés de l’acide gras en position sn-2
(Zhang et Salomon, 2005). Il a été montré que l’oxydation in vitro de PC-DHA génère un
grand nombre de phospholipides tronqués (Gu et al., 2003 ; Gugiu et al., 2006). La même
équipe a ensuite détecté dans la rétine des composés analogues formés par dégradation
radicalaire des PE-DHA.
DHA
Radical DHA
Peroxyl DHA
Alcanes / Alcènes Aldéhydes
MDA
4-HHE
Neuroprostanes
Neuroketals
Neurofuranes Mono/di-hydroxy DHA
O2
17-hydroxy DHA
10, 17-dihydroxy DHA
Conservation de la structureDégradation de la structure
O2•- / H2O2
Figure 24 : Les produits d’oxydation non-enzymatique du DHA.
MATERIELS ET METHODES
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MATERIELS ET METHODES
MATERIELS ET METHODES
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1. Produits spécifiques
1.1 Standards lipidiques
sn-(3-oléoyl-2-hydroxy)-glycérol-1-phospho-sn-3'-(1'-oléoyl-2'-hydroxy)-glycérol (18:1/18:1-
BMP) : Avanti polar lipids
sn-(3-pentadécanoyl-2-hydroxy)-glycérol-1-phospho-sn-1'-(3’-pentadécanoyl-2’-hydroxy)-
glycérol (15:0/15:0-BMP) : Synthétisé par notre équipe selon le protocole décrit
précédemment (Hayakawa et al., 2006)
sn-(3-docosahexaénoyl-2-hydroxy)-glycérol-1-phospho-sn-1'-(3’-docosahexaénoyl-2’-
hydroxy)-glycérol (22:6/22:6-BMP) : Synthétisé par notre équipe selon le protocole
décrit précédemment (Hayakawa et al., 2006)
1,2,3-tri(docosahexaénoyl)glycérol (22:6/22:6/22:6-TAG) : Polaris
1,2-dioléoyl-sn-glycéro-3-phospho-rac-(1-glycérol) (18:1/18:1-PG) : Sigma
1,2-didocosahexaénoyl-sn-glycéro-3-phospho-rac-(1-glycérol) (22:6/22:6-PG) : Avanti polar
lipids
Acide Cis-4,7,10,13,16,19-docosahexaénoïque (DHA, 22:6n-3) : Sigma
1,2-dipalmitoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (16:0/16:0-PC) : Sigma
1,2-diheptadécanoyl-sn-glycéro-3-phosphoethanolamine (17:0/17:0-PE) : Sigma
1,2-diheptadécanoyl-sn-glycéro-3-phosphocholine (17:0/17:0-PC) : Avanti polar lipids
Acides méthyl-heptadécanoïque (17:0-Me) et méthyl-pentadécanoïque (15:0-Me) : Sigma
Stigmastérol, cholestérol et cholestéryl heptadécanoate (17:0-CE) : Sigma
1.2 Molécules radioactives et consommables
[1α,2α -3H]cholestéryl oléate (45 Ci/mmol) : GE Healthcare
[1α,2α-3H]cholestérol (43 Ci/mmol) : GE Healthcare
[9,10-3H]oléate (23 Ci/mmol) : Perkin-Elmer Life Science
Scintillant liquide Pico Fluor 15 : Packard
MATERIELS ET METHODES
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1.3 Consommables pour la culture cellulaire
Milieux nutritifs liquides MEM et DMEM : Eurobio
Pénicilline/streptomycine, L-Glutamine, tampon PBS et tripsine-EDTA : Eurobio
Sérum de veau fœtal (FCS) et sérum de veau fœtal déficient en lipoprotéines : Eurobio
1.4 Produits spécifiques pour la microscopie à fluorescence
Anticorps anti-IgG de souris couplés aux fluorochromes Alexa 488 et 546 : Molecular Probes
Filipine et Mowiol : Sigma
Perchlorate de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3',3'-tétraméthylindocarbocyanine DiI-LDL et DiI-
acLDL : Molecular Probes
Immunoglobuline de souris (IgG) : Sigma
1.5 Produits divers
Anticorps monoclonal anti-BMP (6C4): Fourni par le Dr. Kobayashi (Supra-Biomolecular
System Research Group, RIKEN Frontier Research System, Saitama, Japon)
U18666A (3-β-[2-(diethylamino)ethoxy]androst-5-en-17-one) : Biomol
F1394 : Fourni par le Pr. Yamashita, Université d’Osaka, Japon
Amphotericine B : Calbiochem
Méthyl-β-cyclodextrine, Cholestérol oxydase, Mévinoline et Mévalonolactone : Sigma
Vitamine E (α-tocophérol) : Sigma
Kit de prolifération cellulaire (MTT) : Roche diagnostics
Kit de dosage des protéines Bradford : Bio-Rad laboratories
Régime alimentaire standard A03 et poudre alipidique : Safe
1,1,3,3-tétraméthoxypropane (TMP) : Fluka
Acide thiobarbiturique (TBA) : Sigma
Tocol : C.I.L. Cluzeau
Acide méthylphosphonique : Alfa Aesar
MATERIELS ET METHODES
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97
2. Matériels Biologiques
2.1 La lignée cellulaire RAW 264.7
La lignée cellulaire RAW 264.7 est une lignée de macrophages murins établie par
Raschke et al. (1978) à partir d’ascites d’une tumeur induite chez une souris mâle par
injection intrapéritonéale du virus A-MuLV (Abselon Leukaemia Virus). Il s’agit de petites
cellules adhérentes d’environ 25 µm de diamètre.
Les macrophages RAW sont cultivés en routine dans des boîtes de 100 mm de
diamètre en milieu nutritif liquide MEM supplémenté par des acides aminés non essentiels,
10% de sérum de veau fœtal (« fœtal calf serum » ou FCS), 2 mM de L-glutamine, 100
UI/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. Les cellules sont maintenues à 37°C
sous atmosphère humide à 5% de CO2. Le milieu de culture est changé tous les deux jours.
Pour effectuer des sous-cultures le milieu nutritif est éliminé puis les cellules sont lavées au
PBS et incubées 5 minutes à 37°C dans une solution de trypsine-EDTA afin de les décoller.
Les cellules sont ensuite centrifugées pendant 5 minutes à 200 g puis le culot cellulaire est
resuspendu dans un volume approprié de milieu de culture. La viabilité des cellules, estimée
par exclusion de bleu trypan, est d’au moins 95%. Les cellules sont finalement ensemencées
dans de nouvelles boîtes de 100 mm de diamètre (ratio 1:4).
Dans certaines expériences les cellules sont cultivées en routine dans un milieu de
culture supplémenté avec 5 µM de vitamine E. Une quantité adéquate de vitamine E en
solution dans l’éthanol est transférée dans un tube en plastique puis le solvant est évaporé
sous azote. Le résidu sec est alors repris dans un volume de sérum FCS. L’ensemble est
« vortexé » pendant 5 min puis laissé sous agitation douce à 37°C pendant une nuit. Le sérum
supplémenté en vitamine E est alors utilisé pour constituer le milieu nutritif liquide qui est
filtré avant utilisation. Les cellules sont cultivées dans ce milieu supplémenté en vitamine E
pendant au moins une semaine (2 passages) avant le début de l’expérience.
2.2 La lignée cellulaire BHK 21
La lignée cellulaire BHK 21 (« baby hamster kidney ») est une lignée de
fibroblastes établie en 1961 par Macpherson et Stoker à partir de reins de hamsters âgés de 1
MATERIELS ET METHODES
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98
jour. Ce sont des cellules adhérentes cultivées en routine dans des boîtes de 100 mm de
diamètre en milieu nutritif liquide DMEM supplémenté par 10% de sérum de veau fœtal
(FCS), 10% de bouillon de tryptose phosphate, 2 mM de L-glutamine, 100 UI/mL de
pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine. Les cellules sont maintenues à 37°C sous
atmosphère humide à 5% de CO2. Le milieu de culture est changé tous les deux jours. Les
sous-cultures sont réalisées de la même manière que pour les macrophages RAW.
2.3 Les lipoprotéines
2.3.1 Préparation des lipoprotéines
Les prélèvements sanguins sont effectués sur des donneurs sains par ponction
veineuse (Etablissement Français du Sang de Lyon). Le plasma est obtenu par centrifugation à
900 g pendant 20 min. Les VLDL, LDL et HDL sont isolées du plasma par ultracentrifugation
différentielle. La première étape consiste à isoler les VLDL par ultracentrifugation à 180000 g
pendant 18 h à 10°C. Les VLDL qui flottent et forment un anneau à la surface sont éliminées.
Afin d’isoler les LDL, le plasma dépourvu de VLDL est ajusté à la densité de 1,063 par
addition de bromure de potassium (KBr) (85,7 mg de KBr par mL de plasma) puis centrifugé
à 180000 g pendant 20 h à 4°C. Les LDL sont alors recueillies et dialysées dans un tampon
TRIS (Tris-base 10 mM ; NaCl 150 mM ; pH ajusté à 7,4 par ajout de HCl) contenant 2 mM
d’EDTA. La concentration en protéines-LDL est estimée par la méthode de Bradford et les
LDL sont conservées à -80°C. Les HDL sont préparées de façon similaire à partir du plasma
dépourvu de VLDL et de LDL après ajustement de la densité à 1,21 (237,5 mg de KBr par
mL de plasma) et centrifugation à 180000 g pendant 48 h à 4°C. Les HDL sont recueillies,
dialysées et conservées comme décrit pour les LDL.
2.3.2 Acétylation des LDL
Les LDL acétylées sont préparées extemporanément à l’expérience à partir de
LDL natives conservées à -80°C selon la méthode de Basu et al. (1976). Un volume d’acétate
de sodium saturé est ajouté à un volume de la solution de LDL. une masse d’anhydride
MATERIELS ET METHODES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
99
acétique égale à 1,5 fois la masse de protéines-LDL est ajoutée, à raison de 1 mg toutes les 10
minutes, à 4°C sous agitation. Avant utilisation les LDL acetylées (acLDL) sont dialysées une
nuit à 4°C dans un tampon TRIS contenant 2 mM d’EDTA.
2.3.3 Marquage des LDL avec du [3H]cholestéryl oléate ou du [3H]cholestérol
Selon l’expérience à réaliser les LDL sont marquées soit avec du [3H]cholestéryl
oléate ([3H]CO-LDL) soit avec du [3H]cholestérol ([3H]FC-LDL). Le [3H]CO est marqué sur
le cholestérol (carbone 1 et 2), ainsi son hydrolyse génère du [3H]FC (« Free Cholesterol »).
La reconstitution des LDL avec l’un de ces deux traceurs radioactifs est effectuée de manière
identique, à raison de 40 µCi par mg de protéines-LDL. Une quantité adéquate du traceur
radioactif en solution dans le toluène est transférée dans un tube en verre. Après évaporation
du solvant sous courant d’azote, le résidu sec est repris dans un volume de diméthylsulfoxyde
(DMSO) tel qu’il soit inférieur à 10% de celui de la solution de LDL et incubé à 40°C
pendant 10 minutes. La solution de LDL est ensuite ajoutée directement à celle du traceur
radioactif dissout dans le DMSO puis l’ensemble est incubé une nuit à 40°C. Les LDL
marquées sont ré-isolées par ultracentrifugation comme décrit précédemment afin d’éliminer
les molécules radioactives qui n’ont pas été incorporées aux particules de LDL puis dialysées
dans un tampon TRIS contenant 2 mM d’EDTA avant utilisation. Des fractions aliquotes sont
également prélevées afin de déterminer la concentration en protéines-LDL par la méthode de
Bradford, et la quantité de radioactivité incorporée grâce au compteur à scintillation. Afin de
préparer des [3H]CO-acLDL l’acétylation des LDL est réalisée après le marquage.
2.4 Animaux et traitements
Toutes les expériences et installations ont été approuvées par le ministère de
l’agriculture français et l’agence vétérinaire départementale du Rhône. Tous les animaux ont
été traités au sein de l’animalerie de l’unité INSERM U870 sur le site de l’INSA de Lyon en
accord avec les réglementations approuvées par l’ECC (« European Communities Council »,
24 Novembre 1986, 86/609/EEC).
MATERIELS ET METHODES
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100
Des souris mâles âgées de 3 semaines (ICR, Harlan) ont été placées pendant 32
jours sous un régime alimentaire standard A03 disponible dans le commerce (conditions
contrôles) contenant 5% de lipides ou sous un régime alimentaire enrichi en DHA. Le régime
enrichi en DHA est préparé à partir d’une poudre alipidique commerciale à laquelle sont
ajoutés 4,5% d’huile de tournesol (Lesieur) et 0,5% de 1,2,3-tri(docosahexaénoyl)glycérol.
Ces deux régimes sont isocaloriques et leur composition en nutriments sont similaires
(Tableau 4). Les compositions en acides gras des deux régimes sont présentées dans le
Tableau 3. Après 32 jours les souris ont été sacrifiées par injection intrapéritonéale d’une dose
létale de pentobarbital. Les foies ont été immédiatement prélevés, stockés dans de l’azote
liquide et conservés à -80°C jusqu’à analyse.
3. Préparation des liposomes de phosphatidylglycérol (PG)
Une quantité adéquate de 18:1/18:1-PG ou de 22:6/22:6-PG en solution dans le
chloroforme est transférée dans un tube en verre. Lorsque cela est indiqué, la vitamine E en
solution dans l’éthanol est ajoutée au 22:6/22:6-PG à raison de 1 molécule de vitamine E pour
100 insaturations. Le solvant est ensuite évaporé sous dessiccateur pendant 30 minutes. Le
résidu lipidique sec (+/- vitamine E) est repris dans un volume de PBS tel que la concentration
finale en phospholipides soit de 5 mM, et homogénéisé au vortex pendant 15 minutes à 4°C.
Nutriments
LipidesCarbohydrates (sucres)MinérauxFibresProtéinesHumidité
51,75
Régimes alimentaires
% massiques
12,221,43,95,7
Standard (A03) enrichi en DHAAcides gras
16:0 22 516:1 2 tr18:0 11 318:1 26 3918:2 38 4118:3 tr tr22:6 nd 10
Régimes alimentaires
mol %
Tableau 3 : Composition en acides gras des régimes alimentaires standard (A03) et enrichi en DHA. tr : traces. nd : non détecté
Tableau 4 : Composition en nutriments des régimes alimentaires
MATERIELS ET METHODES
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101
Cette étape permet de former de larges vésicules multi-lamellaires. Des petits liposomes
unilamellaires sont alors obtenus grâce à un sonicateur (Bioblock Scientific - vibracell 75043,
750 W, 20 kHz) relié à une sonde CV33 (Sonics & Materials Inc.) de 32 mm de diamètre. La
sonication (pulse on : 5 secondes, pulse off : 1 seconde, power : 100%) est réalisée sous
courant d’eau froide pendant 20 minutes.
4. Traitements des cellules et protocoles expérimentaux
4.1 Incubation en présence de l’anticorps anti-BMP
L’anticorps anti-BMP que nous avons utilisé dans ces expériences nous a été
fourni par le Dr. Kobayashi après purification par chromatographie. Le milieu de culture est
directement supplémenté avec l’anticorps anti-BMP à la concentration finale de 50 µg/mL.
Les cellules sont ainsi incubées en présence de l’anticorps pendant 24 heures. Lorsque les
cellules pré-traitées avec l’anticorps sont ensuite incubées en présence de LDL ou de HDL
l’anticorps est maintenu.
4.2 Incubation en présence de U18666A et de F1394
L’agent pharmacologique U18666A est une amine hydrophobe qui perturbe le
transport intracellulaire du cholestérol en bloquant le cholestérol dérivé de la captation des
LDL dans les endosomes tardifs/lysosomes (Liscum et Faust, 1989 ; White et al., 2006).
L’agent pharmacologique F1394 est un inhibiteur de l’ACAT qui catalyse l’estérification du
cholestérol dans le réticulum endoplasmique. Les cellules sont incubées en présence de
U18666A (3 µg/mL) ou de F1394 (2 µg/mL) pendant 24 heures. Lorsque les cellules pré-
traitées avec l’un de ces inhibiteurs sont ensuite incubées en présence de LDL ou de HDL les
inhibiteurs sont maintenus.
MATERIELS ET METHODES
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102
4.3 Incubation en présence de liposomes de PG +/- vitamine E
La solution de liposomes de PG à 5 mM dans le PBS est préparée
extemporanément à l’expérience en cours puis diluée directement dans un volume adéquat de
milieu de culture afin d’atteindre une concentration en PG connue. Les concentrations
inférieures sont alors obtenues par dilutions successives. Les cellules sont ainsi incubées
pendant 24 heures dans un milieu supplémenté avec des liposomes de 18:1/18:1-PG ou de
22:6/22:6-PG +/- vitamine E. Lorsque les cellules pré-traitées avec des liposomes de PG sont
ensuite incubées en présence de LDL ou de HDL la présence des liposomes de PG est
conservée.
4.4 Incubation en présence de DHA non estérifié +/- vitamine E
Pour les supplémentations en DHA non estérifié la concentration maximale dans
le milieu de culture a été fixée à 100 µM. Le ratio entre la quantité d’albumine présente dans
le sérum et le DHA est alors inférieure à 2. Une quantité adéquate de DHA en solution dans
l’éthanol est transférée dans un tube en verre. Lorsque cela est indiqué la vitamine E en
solution dans l’éthanol est ajoutée à raison de 1 molécule de vitamine E pour 100
insaturations. Le solvant est évaporé sous azote et le résidu lipidique sec (+/- vitamine E) est
repris dans un volume de sérum. L’ensemble est « vortexé » pendant 5 min puis laissé sous
agitation douce à 37°C pendant une nuit. Le sérum supplémenté en DHA +/- vitamine E est
alors utilisé pour constituer le milieu nutritif liquide comme décrit dans le chapitre 2.1
(concentration finale en DHA de 100 µM). Ce milieu supplémenté est filtré et dilué pour
obtenir les concentrations en DHA de 60, 30, 15 et 5 µM. Les cellules sont ainsi incubées
pendant 24 heures en présence de concentrations croissantes de DHA +/- vitamine E.
4.5 Culture des cellules dans des conditions oxydantes
Des solutions concentrées de cuivre cuivrique (Cu2+) à 10 mM et d’ascorbate à 0,1
M sont respectivement préparées par dissolution dans l’eau d’une masse adéquate de poudre
MATERIELS ET METHODES
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103
de sulfate de cuivre (CuSO4) ou de poudre d’ascorbate. Une solution concentrée de peroxyde
d’hydrogène (H2O2) à 9 mM est préparée à partir de la solution mère à 9 M. L’incubation des
cellules en conditions oxydantes est alors réalisée dans un milieu de culture sans vitamine E
supplémenté avec 1 mM de H2O2, 0,1 mM de Cu2+ et 1 mM d’ascorbate par dilution des
solutions concentrées ci-dessus.
5. Etude du métabolisme et du transport intracellulaire du cholestérol
Les milieux de culture supplémentés avec des lipoprotéines (LDL, acLDL ou
HDL) sont préparés par ajout d’une quantité connue de lipoprotéines en solution dans un
tampon TRIS+EDTA dans un milieu appauvri ou déficient en lipoprotéines contenant
respectivement 1% de sérum FCS ou 5% de sérum déficient en lipoprotéines (LPDS).
5.1 Mesure de l’accumulation de cholestérol libre et d’esters de cholestérol
Les LDL acétylées (acLDL) sont préparées extemporanément à l’expérience et
ajoutées au milieu de culture à raison de 100 µg/mL. Le cholestérol libre (« Free
Cholesterol » ou FC) et les esters de cholestérol (« Cholesterol Esters » ou CE) sont quantifiés
comme décrit dans le chapitre 7 après incubation des cellules pendant des temps variables en
présence de acLDL.
5.2 Mesure de la captation des LDL et de l’hydrolyse des esters de cholestérol
La captation des LDL et l’hydrolyse des esters de cholestérol issus des LDL sont
estimés à l’aide de LDL radio-marquées avec du [3H]cholestéryl oléate ([3H]CO). Les
expériences sont réalisées sur des puits de 35 mm (ensemencement : 106 cellules par puit).
Les cellules sont incubées pendant des temps variables en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-
LDL ou de [3H]CO-acLDL. A la fin de l’incubation, le milieu est éliminé, les cellules sont
rincées 3 fois au PBS puis récupérées et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le culot sec
est conservé à -20°C jusqu'à l’analyse.
MATERIELS ET METHODES
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Les cellules sont décongelées et homogénéisées dans de l’eau contenant 0,1% de
triton. Pour chaque échantillon la quantité de protéines est déterminée sur des fractions
aliquotes par la méthode de Bradford. La quantité de radioactivité est mesurée sur des
fractions aliquotes grâce au compteur à scintillation. Le taux de captation des LDL est
exprimé en µCi/mg de protéines ou en µg-LDL/mg de protéines connaissant la quantité de
radioactivité contenue dans les LDL (µCi/µg-LDL).
Les lipides cellulaires sont ensuite analysés comme décrit dans le paragraphe 7.
Brièvement les classes de lipides sont séparées par CCM et la radioactivité associée au
cholestérol libre (FC) et aux esters de cholestérol (CE) est mesurée au compteur à
scintillation. L’hydrolyse des CE issus des LDL est estimée en mesurant la conversion du
[3H]CO en [3H]FC dans les cellules. Elle est exprimée en pourcentage de la radioactivité
associée au FC par rapport à la radioactivité totale ([3H]FC + [3H]CE).
5.3 Mesure de l’estérification du cholestérol dérivé de la captation des LDL
5.3.1 Première méthode : utilisation de [3H]FC-LDL
L’estérification du cholestérol issu des LDL est estimée à l’aide de LDL radio-
marquées avec du [3H]cholestérol ([3H]FC). Les expériences sont réalisées sur des puits de 35
mm (ensemencement : 106 cellules par puit). L’incubation des cellules en présence de
[3H]FC-LDL ou de [3H]FC-acLDL et l’analyse des lipides sont réalisées comme décrit dans le
paragraphe 5.2. L’estérification est estimée en mesurant la conversion du [3H]FC en [3H]CE
dans les cellules. Elle est exprimée en pourcentage de la radioactivité associée aux CE par
rapport à la radioactivité totale ([3H]FC + [3H]CE).
5.3.2 Deuxième méthode : utilisation du [3H]oléate
L’estérification du cholestérol issu des LDL est dans ce cas estimée en mesurant
la synthèse des esters de cholestérol qui est stimulée suite à l’endocytose des LDL acétylées.
Les cellules sont incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL et de 0,5 µCi/mL de
[3H]oléate (22 nM). Le traceur radioactif est ajouté dans le milieu de culture à partir d’une
MATERIELS ET METHODES
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105
solution éthanolique avec une concentration finale en éthanol inférieure à 0,1%. Les lipides
cellulaires sont analysés comme décrit dans le paragraphe 7. Les lipides marqués sont ceux
qui ont incorporés le [3H]oléate. Il s’agit principalement des PL, des DAG et des TAG ainsi
que des CE. Le taux d’estérification du cholestérol est exprimé en pourcentage de la
radioactivité associée aux CE par rapport à la radioactivité totale.
5.4 Mesure de l’efflux médié par les HDL ou la méthyl-β-cyclodextrine
Les expériences sont réalisées sur des puits de 35 mm (ensemencement : 106
cellules par puit). Les cellules sont dans un premier temps incubées pendant 8 heures en
présence de 50 µg/mL de [3H]CO-LDL ou de [3H]CO-acLDL. A l’issue de cette incubation,
le milieu est éliminé, les cellules sont rincées 3 fois au PBS et incubées pendant des temps
variables en présence de HDL (100 µg/mL) ou de MβCD (5 mM ou 10 mM) pour stimuler
l’efflux de cholestérol dans le milieu de culture. Ce dernier est ensuite récolté et centrifugé 10
min à 300 g pour éliminer les débris cellulaires. Les cellules sont rincées 3 fois au PBS puis
récupérées et centrifugées à 300 g pendant 5 minutes. Le culot sec est conservé à -20°C
jusqu'à l’analyse.
La radioactivité est mesurée dans le milieu et dans les cellules grâce au compteur
à scintillation. L’efflux du cholestérol est exprimée en pourcentage de la radioactivité dans le
milieu de culture par rapport à la radioactivité totale (radioactivité dans le milieu +
radioactivité dans les cellules). La radioactivité totale mesurée dans les cellules correspond à
la somme du [3H]FC et des [3H]CE. La radioactivité totale mesurée dans le milieu est associée
à plus de 95% au cholestérol libre, excluant une contamination par des débris cellulaires.
5.5 Traitement des cellules avec la cholestérol oxydase
Les expériences sont réalisées sur des puits de 35 mm (ensemencement : 106
cellules par puit). Les cellules sont dans un premier temps incubées pendant 8 heures en
présence de 50 µg/mL de [3H-CO]acLDL. A l’issue de cette incubation, le milieu est éliminé
et les cellules sont rincées 3 fois au PBS. Les cellules sont ensuite fixées avec 1% (v/v) de
glutaraldéhyde dans le PBS (10 min à température ambiante) puis rincées au PBS. Enfin les
MATERIELS ET METHODES
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cellules sont incubées pendant 30 min dans un milieu MEM contenant 2 U/mL de cholestérol
oxydase qui catalyse la transformation du [3H]cholestérol dérivé des acLDL et présent dans la
membrane plasmique en [3H]cholesténone. Après cette période d’incubation le milieu est
retiré, les cellules sont rincées 3 fois au PBS puis récupérées et centrifugées à 300 g pendant 5
minutes. Le culot sec est conservé à -20°C. Les lipides cellulaires sont extraits grâce à un
mélange : hexane/alcool isopropylique (3:2 ; v/v) et le [3H]cholestérol est séparé du
[3H]cholesténone par CCM en utilisant un mélange : hexane/éther éthylique/acide acétique
(65:15:1 ; v/v/v) comme solvant d’élution. La radioactivité associée au cholestérol (Rf = 0,10)
et à la cholesténone (Rf = 0,23) est mesurée au compteur à scintillation. La formation de
[3H]cholesténone est exprimée en pourcentage de la radioactivité totale ([3H]cholestérol +
[3H]cholesténone).
5.6 Mesure de la sensibilité des cellules avec l’amphotéricine B
Les expériences sont réalisées sur des plaques 96 puits (ensemencement : 10000
cellules par puit). Les cellules sont incubées pendant 24 heures en présence de 100 µg/mL de
acLDL. A l’issue de cette incubation, le milieu est éliminé puis les cellules sont rincées 3 fois
au PBS et incubées pendant 3 heures dans un milieu supplémenté avec 1% de FCS et
contenant 25 ou 50 µg/mL d’amphotéricine B. La viabilité des cellules est ensuite évaluée
grâce à un test colorimétrique commercial au MTT (Cell Proliferation kit I MTT, Roche). Ce
test est basé sur la transformation du sel de tétrazolium MTT en cristaux de formazan violet
uniquement par les cellules métaboliquement actives. Les cristaux de formazan ainsi formés
sont solubilisés et l’absorption de la solution colorée obtenue est quantifiée par
spectrophotométrie. La viabilité cellulaire, qui est proportionnelle à la différence des densités
optiques mesurées à 550 et 690 nm (DO550nm-DO690nm), est exprimée en pourcentage de la
viabilité maximale mesurée sur des cellules non traitées à l’amphotéricine B.
6. Oxydation du BMP et du cholestérol en système acellulaire
Des liposomes de PC/BMP/cholestérol (75:20:5, mol%) sont préparés en
transférant 75 µg de 16:0/16:0-PC, 15 µg de 18:1/18:1-BMP ou de 22:6/22:6-BMP, et 2 µg de
MATERIELS ET METHODES
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cholestérol dans un tube en verre. Lorsque cela est indiqué, 0,9 µg de vitamine E ou une dose
traceuse de [3H]cholestérol (0,5 µCi) sont également ajoutés. Le solvant est ensuite évaporé
sous dessiccateur pendant 30 minutes. Le résidu lipidique est repris dans 400 µL de PBS et
homogénéisé au vortex pendant 10 minutes à 4°C. L’oxydation est réalisée par incubation à
37°C en présence de CuSO4 (2 mM final) et H2O2 (70 mM final) pendant des temps
croissants. La réaction est stoppée en plongeant les tubes dans la glace et par addition de 200
µM de BHT. Les lipides sont alors immédiatement extraits par la méthode de Bligh et Dyer.
Pour analyser la quantité de BMP présente dans l’échantillon après oxydation, les
lipides sont séparés par CCM sur des plaques HPTLC en utilisant un mélange de solvants :
chloroforme/méthanol/acétone/acide acétique/eau (50:10:20:12,5:5 ; v/v/v/v/v). Le BMP est
ensuite visualisé par pulvérisation d’acide et chauffage.
Pour suivre l’oxydation du [3H]cholestérol et la formation des [3H]oxystérols, les
lipides sont séparés par CCM sur des plaques TLC en utilisant un mélange : hexane/éther
éthylique/méthanol/acide acétique (50:50:5:1 ; v/v/v/v) comme solvant d’élution. Le profil
d’élution des différents composés radio-marqués est visualisé grâce au lecteur de radioactivité
linéaire Berthold. La radioactivité associée au cholestérol (Rf = 0,6) et aux oxystérols (Rf
= 0,47) est mesurée au compteur à scintillation. La formation des [3H]oxystérols est exprimée
en pourcentage de la radioactivité associée aux oxystérols par rapport à la radioactivité totale
([3H]cholestérol + [3H]oxystérols).
7. Analyse des lipides
7.1 Extraction des lipides totaux
7.1.1 Extraction à partir des cellules RAW 264.7 et BHK 21
Les lipides totaux sont extraits des cellules selon la méthode de Bligh et Dyer
(Bligh et Dyer, 1959). Les culots cellulaires conservés à sec à -20°C sont décongelés à 4°C et
homogénéisés dans un 1,5 mL d’eau contenant 0,1% de triton. La concentration en protéines
de l’homogénat cellulaire est déterminée sur des fractions aliquotes par la méthode de
Bradford. Un volume connu de l’homogénat cellulaire est transféré dans un tube à vis en verre
puis des quantités précises des différents standards internes nécessaires aux dosages effectués
MATERIELS ET METHODES
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sont ajoutées à chaque échantillon. Afin de quantifier le BMP, les PC, les PE, le cholestérol
libre et les esters de cholestérol, les standards internes utilisés sont respectivement le
15:0/15:0-BMP, le 17:0/17:0-PC, le 17:0/17:0-PE, le stigmastérol et le 17:0-CE. Du méthanol
et du chloroforme sont alors ajoutés de façon à obtenir un rapport : eau/méthanol/chloroforme
de 0,8:2:1 (v/v/v). Un volume de BHT en solution dans l’éthanol est également ajouté dans
chaque échantillon en tant qu’anti-oxydant à la concentration finale de 60 µM. L’échantillon
est homogénéisé et conservé à 4°C pendant au moins 10 min puis de l’eau et du chloroforme
sont à nouveau ajoutés pour atteindre le rapport final : eau/méthanol/chloroforme de
1,8:2:2 (v/v/v). La solution est « vortexée » puis centrifugée à 800 g pendant 10 min à 4°C. La
phase organique inférieure est prélevée, transférée dans un tube en verre et la phase aqueuse
est extraite à nouveau par un volume de chloroforme. Après centrifugation les phases
organiques sont regroupées et le solvant est évaporé sous courant d’azote. Les lipides
cellulaires totaux sont remis en solution dans un volume connu de chloroforme/méthanol
(2:1 ; v/v) et conservés sous azote à -20°C.
7.1.2 Extraction à partir de foie de souris
L’extraction des lipides totaux est réalisée à partir de 250 mg de foie de souris
conservé à -80°C puis décongelé à 4°C et homogénéisé au Potter dans 2 mL d’eau à 4°C.
Environ 10 allers-retours sont effectués jusqu’à l’homogénéisation complète des tissus.
L’homogénat est alors transféré dans un Erlen Meyer puis complété à 5 mL avec de l’eau. Du
méthanol et du chloroforme sont ajoutés à l’homogénat de façon à obtenir le rapport :
eau/méthanol/chloroforme de 0,8:2:1 (v/v/v). Un volume de BHT en solution dans l’éthanol
est également ajouté dans chaque échantillon en tant qu’anti-oxydant à la concentration
finale de 60 µM. La solution est gardée une nuit sous agitation magnétique à 4°C puis filtrée
et transférée dans un tube à vis en verre. De l’eau et du chloroforme sont à nouveau ajoutés
pour atteindre le rapport final : eau/méthanol/chloroforme de 1,8:2:2 (v/v/v). Les lipides
totaux sont ensuite récupérés dans la phase organique après centrifugation et conservés
comme indiqué dans le paragraphe précédent.
MATERIELS ET METHODES
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109
7.2 Séparation des classes de lipides et des classes de phospholipides par
chromatographie sur couche mince (CCM)
La séparation des classes de lipides et des classes de phospholipides est réalisée
par chromatographie sur couche mince (CCM). Selon les expériences réalisées, deux sortes de
plaques sont utilisées : des petites plaques en verre à haute performance (HPTLC Silica gel
60, 10x10, Merck) et des grandes plaques en verre (TLC Silica gel 60, 200x200, Merck) ayant
un pouvoir séparateur moins important mais sur lesquelles il est possible d’éluer une plus
grande quantité de lipides.
7.2.1 Séparation des classes de lipides
Les extraits lipidiques totaux sont déposés à 2 cm ou 1,5 cm du bord inférieur des
plaques TLC ou HPTLC respectivement. La migration est effectuée dans le mélange :
hexane/éther éthylique/acide acétique (80:20:1 ; v/v/v) qui permet de séparer les principales
classes de lipides. Les plaques sont retirées des cuves lorsque le front de solvant se trouve à 2
cm du bord supérieur de la plaque. Les phospholipides qui sont parmi les lipides les plus
polaires restent à l’origine (Rf=0). Les références frontales des différents lipides sont les
suivantes, diacylglycérols : Rf=0,09, cholestérol : Rf=0,14, acides gras libres : Rf=0,25,
triacylglycérols : Rf=0,56 et esters de cholestérol : Rf=0,94.
7.2.2 Séparation des classes de phospholipides par CCM en 2 dimensions
Les extraits lipidiques totaux sont déposés dans le coin inférieur gauche à 2,5 cm
ou 1,5 cm des bords des plaques TLC ou HPTLC respectivement. La première migration
s’effectue dans un mélange basique : chloroforme/méthanol/ammoniaque à 28% dans l’eau
(65:35:5 ; v/v/v). Les plaques sont retirées de la cuve lorsque le front de solvant se trouve à 2
cm du bord supérieur puis elles sont séchées sous dessiccateur pendant 3 heures. La deuxième
migration s’effectue perpendiculairement à la première dans le mélange acide :
MATERIELS ET METHODES
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110
chloroforme/méthanol/acétone/acide acétique/eau (50:10:20:12,5:5 ; v/v/v/v/v). Les plaques
sont retirées de la cuve lorsque le front de solvant se trouve à 2 cm du bord supérieur.
7.2.3 Traitements des plaques après élution
Afin de ne visualiser que le profil d’élution des différents lipides, les plaques sont
pulvérisées avec une solution aqueuse d’acétate de cuivre à 3% et d’acide phosphorique à 8%
puis chauffées dans un four à 180°C pendant 10 minutes. Cependant, ce procédé détruit la
structure des lipides. Ainsi, afin de pouvoir récupérer et analyser les différents lipides
d’intérêt les plaques sont pulvérisées avec une solution de primuline à 0,1% dans le méthanol
puis observées sous UV à 365 nm. Les différentes classes de lipides sont identifiées grâce à
leur référence frontale (Rf) par rapport à des standards. Après identification des zones de
migration des lipides d’intérêts, différents protocoles sont utilisés en fonction du type
d’analyse à réaliser :
- Comptage de la radioactivité associé à un lipide :
Le gel de silice correspondant à la zone de migration du lipide d’intérêt est récupéré puis
transféré dans un pot de comptage de 10 mL. La radioactivité est alors mesurée au compteur à
scintillation comme décrit dans le paragraphe 8.2.
- Analyse de la composition en acides gras d’un lipide (PL ou CE) :
Le gel de silice correspondant à la zone de migration du lipide d’intérêt est récupéré et
transféré dans un tube à vis en verre. L’hydrolyse et la méthylation des acyles gras des
phospholipides (PL) ou des esters de cholestérol (CE) sont réalisées directement sur le gel de
silice comme décrit dans le paragraphe 7.4.
- Purification du BMP et des PE en HPLC :
Le gel de silice correspondant aux zones de migration du BMP et des PE est récupéré et
transféré dans un tube à vis en verre. Les phospholipides sont ensuite extraits de la silice par
le mélange de solvants : chloroforme/méthanol/eau (5:5:1 ; v/v/v). Après agitation les tubes
sont centrifugés pendant 10 minutes à 800 g et le surnageant est récupéré. De l’eau est ajoutée
pour atteindre un rapport : chloroforme/méthanol/eau de 2:2:1,8 (v/v/v). Après agitation et
MATERIELS ET METHODES
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111
centrifugation 10 minutes à 800 g, la phase chloroformique inférieure est récupérée et
évaporée sous azote.
- Quantification du cholestérol en GC-MS
Le gel de silice correspondant à la zone de migration du cholestérol est récupéré et transféré
dans un tube à vis en verre. Le cholestérol est extrait du gel de silice par le mélange de
solvants : chloroforme/méthanol (2:1 ; v/v). Après agitation et centrifugation 10 minutes à
800 g, le surnageant est récupéré et évaporé sous azote.
7.3 Purification du BMP et des PE par HPLC
Après l’élution en CCM-2D et extraction du gel de silice, le BMP peut encore être
contaminé par des traces de CL, et les PE ne sont pas séparées du PG. Le BMP et les PE sont
donc purifiés dans une seconde étape par un système HPLC. La méthode utilisée est adaptée
de celle décrite par (Luquain et al., 2001). Le système consiste en une pompe quaternaire (HP
1100), un injecteur manuel et une colonne de silice-NH2 (Nucléosil 5NH2, 250x4.6 mm).
L’élution est réalisée par le mélange de solvants acétonitrile/méthanol/eau (730:250:15)
contenant également 0,3 mL d’acide méthylphosphonique à 50% dans l’eau. Le pH est ajusté
à 6,3 par ajout d’ammoniaque à 28%. Le débit est fixé à 1,0 mL/min. La densité optique de
l’éluât est enregistrée en continu à 205 nm par un détecteur UV à barrette de diodes HP 1100.
Les temps de rétention des phospholipides d’intérêt sont déterminés à l’aide de standards.
Dans ce système le BMP est élué en trois pics dont les temps de rétention sont compris entre
10 et 15 minutes. Les CL ne sont pas éluées à ces temps de rétention. Les PE qui sont éluées
en 21 minutes sont bien séparées du PG qui est élué en 31 minutes.
Les phospholipides en solution dans le chloroforme sont injectés manuellement
puis récoltés en sortie de colonne. Le solvant d’élution est ensuite évaporé à sec sous azote.
Le BMP et les PE sont ré-extraits selon la méthode de Bligh et Dyer afin d’éliminer les sels
d’acide méthylphosphonique contenus dans le solvant d’élution.
MATERIELS ET METHODES
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112
7.4 Analyse des acides gras par chromatographie gazeuse (GC)
7.4.1 Préparation des échantillons
La composition en acides gras des phospholipides et des esters de cholestérol est
analysée par séparation en chromatographie gazeuse de leurs chaînes grasses sous forme
d’esters méthyliques obtenus par une réaction de transméthylation (hydrolyse + méthylation).
Celle-ci est réalisée par ajout, sur l’extrait lipidique sec ou directement sur le gel de silice
contenant le lipide séparé par CCM, de 1 mL de méthanol contenant 5% d’acide sulfurique
concentré. Les tubes sont ensuite fermés sous azote et placés 90 minutes dans un bain sec à
90°C. La réaction est arrêtée en laissant les tubes 5 minutes dans la glace et par ajout de 2 mL
de carbonate de potassium à 5% dans l’eau. Les esters méthyliques d’acide gras (« fatty acid
methyl esters » ou FAME) ainsi que les diméthylacétals (DMA) formés respectivement par
transméthylation des chaînes acyles et alkényles sont extraits par 3 mL d’isooctane. Après
agitation et centrifugation à 800 g pendant 10 minutes la phase organique supérieure est
prélevée et évaporée sous azote. Des standards d’esters méthyliques d’acides gras sont
également ajoutés à chaque échantillon juste avant l’injection (du 15:0-Me pour les PC, les PE
et les CE, et du 17:0-Me pour le BMP). Le résidu sec est repris dans un volume connu
d’isooctane et injecté en chromatographie gazeuse.
7.4.2 Appareillage et conditions d’analyse
Les FAME et les DMA sont analysés par chromatographie gazeuse en utilisant un
système Hewlett Packard (HP6890 G1530) et une colonne capillaire SGE BPX 70 (60m x
0,22mm). Les composés sont injectés dans la colonne grâce à un injecteur automatique
(T=230°C) et sont entraînés dans la colonne par le gaz vecteur (Hélium). La température du
four augmente selon un gradient programmé (1,5°C/min) de 80°C à 245°C. Les différents
acides gras sont séparés en fonction du nombre d’atomes de carbone et de doubles liaisons
ainsi que de la position des doubles liaisons. Les composés sont détectés en sortie de colonne
par un détecteur à ionisation de flamme (FID) alimenté par un mélange d’air et d’hydrogène.
MATERIELS ET METHODES
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113
7.4.3 Identification des acides gras et quantification
Les FAME et les DMA sont identifiés sur les chromatogrammes par comparaison
de leur temps de rétention à ceux de standards connus. La surface de chaque pic est
proportionnelle à la masse de l’acide gras présent dans l’échantillon. Ainsi le pourcentage
molaire (mol%) de chaque acide gras est calculé par rapport à sa masse molaire et à la somme
des surfaces de tous les acides gras identifiés. Le rapport des aires entre le pic correspondant
au premier étalon interne (issu de la transméthylation du standard interne ajouté à
l’homogénat cellulaire avant la première extraction lipidique) et le pic correspondant au
deuxième étalon interne (15:0-Me ou 17:0-Me) ajouté juste avant l’injection permet de
calculer le rendement total de toutes les étapes d’extraction, purification et réactions
chimiques réalisées. La quantité de chaque acide gras présent dans l’échantillon est calculée
par rapport au premier standard interne. La quantité totale d’acides gras permet ainsi de
déterminer la quantité de phospholipides ou d’esters de cholestérol sachant que pour un
phospholipide chaque molécule possède deux résidus d’acides gras et un seul pour les esters
de cholestérol. Les résultats sont exprimés en nmol/mg de protéines ou en µg/mg de protéines.
7.5 Quantification du cholestérol libre par GC-MS
L’analyse du cholestérol est réalisée par chromatographie gazeuse couplée à la
spectrométrie de masse (GC-MS). Le stigmastérol est utilisé comme standard interne. Après
purification par CCM et extraction du gel de silice comme décrit dans le paragraphe 7.2, le
résidu lipidique sec est repris par 100 µL de bis(triméthylsilyl)trifluoro-acetamide (BSTFA)
afin de dériver les groupements hydroxylés du cholestérol et du stigmastérol en éthers
triméthylsilylés. Cette dérivation s’effectue à 37°C pendant 20 minutes. Les échantillons sont
alors dilués dans un volume adéquat d’hexane avant injection.
Les stérols sont analysés par chromatographie gazeuse en utilisant un système
Hewlett Packard (HP-6890) et une colonne capillaire J&W 122-4762 (60m x 0,25mm). Les
composés sont injectés dans la colonne grâce à un injecteur automatique (T=260°C) en mode
« Pulsed Splitless » et sont entraînés dans la colonne par le gaz vecteur (Hélium). La
température du four est maintenue à 57°C pendant 5 min puis augmente jusqu’à 200°C à
raison de 40°C/min. Elle augmente ensuite jusqu’à 310°C à raison de 10°C/min puis est
MATERIELS ET METHODES
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114
maintenue à cette température pendant 20 min. Les composés élués sont détectés en sortie de
colonne par un spectromètre de masse (Hewlett Packard MS-5973). L’ionisation chimique est
réalisée en mode positif avec du méthane comme gaz réactant. Les ions m/z 369 et 395
correspondant respectivement au cholestérol et au stigmastérol après la perte du groupement
TMS-OH [M-90]+ sont mesurés en mode SIM (« selected ion monitoring »).
Les stérols sont identifiés sur les chromatogrammes par comparaison de leur
temps de rétention à ceux de standard connus. Dans ces conditions le cholestérol présente un
temps de rétention de 26,20 min et le stigmastérol de 28,35 min. La masse de cholestérol est
calculée grâce au rapport des surfaces des deux pics et à la masse de stigmastérol connue
ajoutée à l’échantillon, et grâce à un facteur de réponse déterminé en traçant une gamme
d’étalonnage.
7.6 Analyse des espèces moléculaires du BMP par ESI-MS
Le BMP est extrait à partir de cellules RAW et purifié comme décrit
précédemment par CCM-2D et HPLC. Les espèces moléculaires du BMP ont été analysées
par spectrométrie de masse par l’équipe du professeur Robert C. Murphy au département de
pharmacologie de l’Université du Colorado. L’échantillon de BMP en solution à 100 nM dans
un mélange : méthanol/dichlorométhane (1:1 ; v/v) est injecté par infusion en mode
« nanoelectrospray » grâce à un robot automatique NanoMate 100 (Advion BioSciences,
Ithaca, NY) avec un débit de 200 nL/min. Le spectromètre de masse utilisé possède un
analyseur hybride API 4000 Q TRAP constitué d’un triple quadripôle et d’une trappe d’ions
linéaire montés en série (PE Sciex, Toronto, Canada). Au niveau de la buse d’injection on
applique à l’échantillon une pression d’azote de 0,15 psi et une tension de nébulisation de
-1,32 kV. Lorsque l’acquisition spectrale est réalisée en mode balayage (« full scan ») ou en
mode « Enhanced Product Ion » (EPI) un potentiel de « declustering » de -80V est appliqué
entre le cône d’échantillonnage et le « skimmer ». Dans les expériences réalisées en EPI avec
un mode d’ionisation négatif, la dissociation activée par collision (« Collision-Activated
Dissociation » ou CAD) est effectuée avec une énergie de collision de 40V et sous une forte
pression de gaz. Les pourcentages molaires (mol%) des différentes espèces moléculaires du
BMP sont calculés en fonction de l’abondance relative de chaque ion moléculaire et après
MATERIELS ET METHODES
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115
correction effectuée en tenant compte des isotopes naturellement présents dans l’échantillon
(Roberts et al., 2005).
8. Analyse de la radioactivité
8.1 L’analyseur de radioactivité linéaire (Berthold)
Après séparation des classes de lipides ou de phospholipides par CCM, le profil
d’élution des différentes espèces radio-marquées peut être obtenu grâce à un analyseur de
radioactivité linéaire (Berthold LB 2820-1) couplé à un radio-imageur/intégrateur (Berthold-
LB511). Ce dispositif permet donc de déterminer, en pourcentage, la distribution de la
radioactivité entre les différents lipides radioactifs.
8.2 Le compteur à scintillation
La quantité de radioactivité contenue dans un échantillon peut être déterminée sur
une fraction aliquote grâce à un compteur à scintillation bêta (Packard Tricarb 460) qui
permet, après étalonnage, de déterminer directement l’activité de l’échantillon en dpm
(désintégrations par minutes). Une fraction aliquote des solutions aqueuses (milieux de
culture et homogénats cellulaires) ou le gel de silice correspondant à la zone de migration
d’un lipide radioactif d’intérêt sont transférés dans des pots de comptage puis 5 mL de
scintillant sont ajoutés. Pour chaque échantillon le temps de comptage est de 3 minutes.
9. Dosage du dialdéhyde malonique (MDA)
Le MDA est un aldéhyde issu de la peroxydation des acides gras polyinsaturés. La
méthode de quantification est basée sur la réaction du MDA avec deux molécules d’acide
thiobarbiturique (TBA). Le complexe MDA-TBA ainsi formé est alors quantifié en HPLC en
phase inverse selon la méthode décrite par Therasse et Lemonnier (1987). Les cellules sont
MATERIELS ET METHODES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
116
homogénéisées dans un volume d’eau ultra-pure puis la quantité de protéines est déterminée
sur des fractions aliquotes par la méthode de Bradford. Un volume d’homogénat cellulaire
correspondant à 150 µg de protéines est transféré dans un tube en verre. Une gamme étalon
est réalisée en parallèle avec des quantités croissantes (0-100 pmol) de 1,1,3,3-
tétraméthoxypropane (TMP). Chaque tube (gamme et échantillons) est complété à 400 µL
avec de l’eau puis sont ajoutés 40 µL de BHT à 5 mM dans l’éthanol, 100 µL d’acide acétique
16,5 N et 200 µL de TBA en solution à 10 mM dans un tampon phosphate (0,1 M ; pH 3). Les
tubes sont alors fermés sous azote, « vortexés » et placés dans un bain sec à 100°C pendant 1
heure. La réaction est stoppée en plongeant les tubes dans la glace pendant 5 min. Le milieu
réactionnel est acidifié par 10 µL d’HCl 6 N. Le complexe MDA-TBA est alors extrait par 2
mL d’acétate d’éthyle. Après agitation et centrifugation 10 min à 800 g la phase supérieure est
récupérée puis évaporée sous courant d’azote. L’extrait est alors repris par 250 µL d’un
mélange : eau/méthanol (1:1 ; v/v). La quantification du complexe MDA-TBA est réalisée par
un système HPLC en phase inverse composé d’une colonne Nucléosil greffée C18 (250 mm x
4,6 mm ; granulométrie 5 µm) et d’un détecteur fluorimétrique (λ excitation = 515 nm ; λ
émission = 553 nm). L’élution est réalisée par un mélange : eau/méthanol (80:20 ; v/v) dont le
débit est fixé à 0,8 mL/min. Pour chaque échantillon le volume d’injection est fixé à 100 µL.
Dans ces conditions le temps de rétention du complexe MDA-TBA est de 4,5 minutes. La
droite étalon obtenue permet de calculer à partir de la surface de chaque pic la quantité de
MDA présente dans chaque échantillon. Les résultats sont alors exprimés en pmoles de
MDA/mg de protéines.
10. Dosage de la vitamine E
La vitamine E est un anti-oxydant liposoluble majeur piégeant les radicaux libres
alkoxyles et peroxyles des chaînes de peroxydation lipidiques. La quantification d’un des
isomères de la vitamine E, l’α-tocophérol, est réalisée par HPLC en phase inverse (Vericel et
al., 2003). Les cellules sont homogénéisées dans un volume d’eau ultra-pure puis la quantité
de protéines est déterminée sur des fractions aliquotes par la méthode de Bradford. Un volume
connu d’homogénat est transféré dans un tube en verre et 200 pmoles de tocol sont ajoutées
pour la standardisation interne. Chaque échantillon est complété à 500 µL avec de l’eau et la
vitamine E est extraite par ajout de 500 µL d’éthanol et 2 mL d’hexane. Après agitation et
MATERIELS ET METHODES
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117
centrifugation 10 min à 800 g la phase organique supérieure est récupérée et évaporée sous
courant d’azote. L’extrait est alors repris par 300 µL d’un mélange : méthanol/eau (85:15 ;
v/v). La quantification de l’α-tocophérol est réalisée par un système HPLC en phase inverse
composé d’une colonne Nucléosil greffée C18 (150 mm x 4,6 mm ; granulométrie 5 µm) et
d’un détecteur fluorimétrique (λ excitation = 295 nm ; λ émission = 340 nm). L’élution est
réalisée par un mélange : méthanol/eau (95:5 ; v/v) dont le débit est fixé à 1 mL/min. Pour
chaque échantillon le volume d’injection est fixé à 100 µL. Dans ces conditions les temps de
rétention sont de 6,2 min pour le tocol et de 10,2 min pour l’α-tocophérol. La quantité d’α-
tocophérol présente dans chaque échantillon est calculée par rapport à la quantité connue de
standard interne. Les résultats sont exprimés en pmoles d’α-tocophérol/mg de protéines.
11. Fractionnement cellulaire sur les cellules BHK
Le fractionnement cellulaire est réalisé sur des cellules à confluence à partir
d’environ 100 millions de cellules suivant le protocole décrit par Kobayashi et al. (1998b).
Après avoir éliminé le milieu de culture, les cellules sont rincées 3 fois au PBS et décollées
doucement par grattage. Les cellules sont collectées dans un tube de 15 mL et centrifugées
pendant 5 minutes à 200 g à 4°C. Le surnageant est éliminé et les cellules sont resuspendues
lentement dans 2,5 mL d’un tampon d’homogénéisation (HB ; 250 mM de sucrose dans un
tampon imidazole-HCl à 3 mM, pH 7,4). Les cellules sont alors centrifugées pendant 10
minutes à 900 g à 4°C. Le surnageant est éliminé et les cellules sont reprises dans 1,4 mL de
tampon HB par aspiration-refoulement avec à une seringue 22G ce qui provoque la lyse des
cellules (moins de 20% de cellules restent intactes). La suspension est alors centrifugée
pendant 8 minutes à 900 g à 4°C. Le surnageant post-nucléaire (« post nuclear supernatant »
ou PNS) est collecté puis ajusté à 42% de sucrose, 3 mM imidazole-HCl, pH 7,4. Cette
fraction est alors transférée dans un tube à centrifugation (SW41, Beckman) de 12 mL puis
recouvert d’un gradient discontinu de sucrose. Le gradient est réalisé par dépôts successifs
(2,7 mL) de solutions à 35% et 25% de sucrose, 3 mM imidazole-HCl, pH 7,4 puis de tampon
HB. Le gradient est alors centrifugé 1 heure à 200000 g avec un rotor à godets oscillant (type
SW41 Kontron). Les endosomes tardifs sont collectés à l’interface des fractions HB et 25% et
les endosomes précoces à l’interface des fractions 25% et 35% (Figure 25). A l’interface des
MATERIELS ET METHODES
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118
fractions 35% et 42% se trouvent les membranes dites «lourdes» (réticulum, golgi,
mitochondries…). Ces 3 fractions sont dialysées dans un tampon PBS avant analyse.
La quantité de protéines dans chaque fraction est déterminée grâce au kit de
dosage commercial BCA (Thermo Scientifique). Les lipides de chaque fraction sont ensuite
extraits par la méthode de Bligh et Dyer pour analyse.
12. Isolement des radeaux lipidiques riches en cholestérol
Le protocole utilisé est celui décrit pour la préparation des microdomaines de
lymphocytes par Diaz et al. (2002). On utilise l’insolubilité des microdomaines dans les
détergents non ioniques (ici le triton X100) à 4°C et leur propriété de flottaison sur un
gradient de densité conférée par leur enrichissement lipidique.
Environ 20-25 millions de macrophages RAW sont homogénéisés au potter verre-
verre dans un tampon Tris 25 mM, NaCl 150 mM, EDTA 5 mM, pH 7,6, contenant un
mélange d’inhibiteurs de protéases (Inhibitor Cocktail, Sigma). L’homogénat est ensuite
centrifugé à 900 g pendant 5 min à 4°C. Le surnagent post-nucléaire (PNS) est récupéré et la
concentration en protéines est déterminée par la méthode de Bradford. Un volume connu du
PNS est incubé avec du triton X-100 (1% final) pendant 1 heure à 4°C sous agitation douce
dans un volume final de 1,5 mL. Un même volume de solution de saccharose à 2,6 M est
ensuite ajouté afin d’obtenir une concentration finale de 1,3 M de saccharose. Le gradient
discontinu de saccharose est réalisé par dépôts successifs de solutions de saccharose de
concentrations croissantes (0,2 à 0,9 M). Chaque fraction de 1 mL est déposée au fond du tube
Endosomes tardifs
Endosomes précoces
Membranes lourdes
HB
25%
35%
42%
Figure 25 : Schéma représentatif du gradient discontinu de sucrose (%) utilisé pour isoler les endosomes tardifs et les endosomes précoces à partir de cellules BHK. HB : tampon d’homogénéisation.
MATERIELS ET METHODES
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119
(tubes SW41, Beckmann) à l’aide d’une aiguille. Les 3 mL de l’homogénat sont déposés en
dernier (Figure 26). L’ultracentrifugation est réalisée à 200000 g pendant 16 heures à 4°C
avec un rotor à godets oscillants (type SW41 Kontron). A l’issue de l’ultracentrifugation, des
fractions de 1 mL sont collectées à partir du fond du tube (fractions 1 à 11).
Le pourcentage de saccharose de chacune des fractions est déterminé à l’aide d’un
réfractomètre portable et 250 µL de chaque fraction sont prélevés pour le dosage du
cholestérol libre. Une quantité connue de stigmastérol est ajouté comme étalon interne puis
0,9 mL de méthanol et 1,3 mL d’hexane. Après agitation et centrifugation à 800 g pendant 10
minutes, le cholestérol et le stigmastérol sont récupérés dans la phase organique supérieure.
Le cholestérol est quantifié selon la méthode décrite au paragraphe 7.5.
13. Microscopie à fluorescence
13.1 Localisation du BMP par immuno-détection
Les expériences sont réalisées sur des puits de 35 mm contenant au fond une
lamelle de verre (ensemencement : 500000 cellules par puit). Toutes les étapes suivantes sont
réalisées à température ambiante. Les cellules sont fixées par une solution de
paraformaldéhyde à 3% dans le PBS pendant 20 min, incubées en présence de 50 mM de
NH4Cl pendant 10 minutes, puis dans une solution de BSA à 0,1% dans le PBS pendant 20
Fraction n° 1110987654321
0,2 M de saccharose
0,4 M0,3 M
0,5 M0,6 M0,7 M0,8 M0,9 M
1,33 M(PNS)
radeauxlipidiques
Figure 26 : Schéma représentatif du gradient discontinu de saccharose utilisé pour isoler les radeaux lipidiques.
MATERIELS ET METHODES
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120
min. Elles sont ensuite perméabilisées par une solution de saponine à 50 µg/mL dans le PBS
pendant 5 minutes. Les cellules sont alors incubées pendant 30 minutes en présence de
l’anticorps anti-BMP (dilution 1/10). Après rinçage au PBS, elles sont incubées pendant 30
minutes en présence d’un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à un fluorochrome
Alexa 488 (dilution 1/1000) puis rincées au PBS.
13.2 Localisation de l’anticorps anti-BMP accumulé dans les cellules
Les cellules sont fixées et imperméabilisées comme décrit ci-dessus. Elles sont
ensuite incubées pendant 1 heure, à température ambiante, en présence d’un anticorps anti-
IgG de souris couplé soit à un fluorochrome Alexa 546 (dilution 1/1000), soit à un
fluorochrome Alexa 488 (dilution 1/1000). Les cellules sont ensuite lavées au PBS.
13.3 Localisation du cholestérol cellulaire
Les cellules sont fixées et imperméabilisées comme décrit ci-dessus. Elles sont
ensuite incubées pendant 30 min, à température ambiante, en présence de 50 µg/mL de
filipine dans le PBS, puis lavées au PBS.
13.4 Internalisation des DiI-LDL et DiI-acLDL
Nous avons également utilisé des LDL et des LDL acétylées couplées à un
fluorochrome (DiI-LDL et DiI-acLDL). Afin de cibler les endosomes tardifs les macrophages
RAW ont été incubés dans un milieu contenant 10 µg/mL de DiI-LDL ou de DiI-acLDL
pendant 1 heure. Ensuite les cellules sont rincées au PBS et incubées pendant 2 heures en
absence de LDL fluorescentes (« pulse/chase »). La localisation de la fluorescence peut alors
être directement observée au microscope optique à fluorescence. Les cellules peuvent
également être fixées et imperméabilisées comme décrit précédemment afin de réaliser un
double marquage. La distribution de la fluorescence est alors observée au microscope
confocal.
MATERIELS ET METHODES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
121
13.5 Observation de la fluorescence
Les lamelles de verres sont récupérées et montées sur des lames de verre avec un
liquide de montage (mowiol à 13% et glycérol à 3% dans un tampon Tris 0,2 M pH 8,5). La
distribution de la fluorescence est observée soit grâce à un microscope optique à fluorescence
Olympus BX60 équipé d’un objectif UPIanFi 100x, soit grâce à un microscope confocal Zeiss
LSM 510 équipé d’un objectif C-Apochromat 63XW Korr (ouverture numérique 1,2). La
longueur d’onde d’excitation pour les DiI-LDL et Di-acLDL est 543 nm. La distribution de la
filipine est observée en UV (bleu).
14. Analyses statistiques
Toutes les analyses statistiques ont été réalisées à l’aide du logiciel JMP 5.0.1.2
(SAS Institute, Inc). Les comparaisons multiples ont été réalisées grâce à des ANOVA à 1 ou
2 facteurs. Chaque facteur peut prendre plusieurs modalités. Lorsque cela est indiqué les
moyennes de chaque paire de modalités sont comparées entre elles par un test de Tukey-
Kramer HSD basé sur l’ANOVA avec un risque α=0,05. Les modalités significativement
différentes sont indiquées sur les figures par des lettres capitales différentes. Les moyennes
expérimentales exprimées en pourcentage des valeurs contrôles sont comparées à la valeur
théorique du contrôle (100%) par un test de Student à 1 échantillon. Les différences
significatives avec p≤0,05 ou p≤0,01 sont respectivement indiquées par * ou **. Les
comparaisons de deux moyennes expérimentales entre elles ont été réalisées par un test de
Student à 2 échantillons. Les différences significatives avec p≤0,05 sont indiquées par a, b, #
ou † selon les figures.
RESULTATS
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
122
RESULTATS
RESULTATS PREMIERE PARTIE
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123
PREMIERE PARTIE
Etude des effets d’un anticorps anti-BMP sur le métabolisme
intracellulaire du cholestérol dans des macrophages en culture
RESULTATS PREMIERE PARTIE
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124
Introduction
Au cours de l’athérogenèse, les macrophages présents dans l’espace sous
endothélial captent de grandes quantités de LDL modifiées, notamment des LDL oxydées.
Ceci peut provoquer une forte accumulation intracellulaire d’esters de cholestérol et de
cholestérol libre induisant la formation de cellules spumeuses qui jouent un rôle important
dans l’apparition et l’évolution des lésions d’athérosclérose.
Après endocytose par les macrophages, les LDL natives et modifiées suivent la
voie endocytique jusqu’aux endosomes tardifs où les esters de cholestérol sont hydrolysés. Le
cholestérol libre est alors redistribué dans les différents compartiments cellulaires notamment
le réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. Lorsque les fonctions endosomales
sont altérées comme dans la maladie de Niemann-Pick de type C (NPC) ou après un
traitement avec des agents pharmacologiques qui miment le phénotype NPC, on observe une
accumulation de cholestérol dans les endosomes tardifs.
Les endosomes tardifs sont des corps multi-vésiculaires et multi-lamellaires dont
les membranes internes sont très riches en BMP. L’équipe du Dr. Jean Gruenberg a produit un
anticorps monoclonal qui reconnait spécifiquement le BMP. Il a été montré que cet anticorps
anti-BMP peut être internalisé par des fibroblastes et qu’il s’accumule dans les endosomes
tardifs où il se fixe à son antigène. L’accumulation de l’anticorps anti-BMP modifie
l’organisation des membranes internes des endosomes tardifs et altère le trafic des molécules
qui transitent via les endosomes tardifs, notamment le cholestérol dérivé des LDL qui
s’accumule alors dans ces structures (Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi et al., 1999). Ces
résultats suggèrent que le réseau de membranes internes des endosomes tardifs, riche en BMP,
participe à la régulation du transport intracellulaire du cholestérol.
Dans cette première partie nous avons cherché à étudier plus en détail l’effet de
l’anticorps anti-BMP sur le métabolisme et les différentes voies du transport intracellulaire du
cholestérol dérivé des LDL dans les macrophages.
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
125
1.1 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la distribution intracellulaire du cholestérol
Dans un premier temps nous avons cherché à vérifier que l’anticorps anti-BMP
est capté par les macrophages en culture et qu’il s’accumule dans les endosomes tardifs. Les
expériences ont été réalisées sur les macrophages murins RAW ainsi que sur les macrophages
issus de la lignée monocytique humaine THP-1 (Besson et al., 2006). Les cellules sont
cultivées en présence de l’anticorps anti-BMP pendant 48 heures puis la localisation
intracellulaire de l’anticorps est déterminée par immunofluorescence.
Dans les macrophages THP-1 la distribution de la fluorescence est ponctuelle et
périnucléaire, similaire à celle du BMP (Besson et al., 2006), suggérant bien une
accumulation endosomale de l’anticorps (Figure 27). Toutefois le degré d’accumulation de
l’anticorps anti-BMP est très hétérogène, certaines cellules accumulant de grandes quantités
d’anticorps et d’autres non. Les cellules ayant le plus accumulé l’anticorps présentent
également une forte accumulation de cholestérol libre révélée par la filipine. De plus, cette
accumulation de cholestérol libre est colocalisée avec l’anticorps.
Dans les macrophages RAW, on observe une distribution similaire de la
fluorescence mais contrairement aux macrophages THP-1 la majorité des cellules accumulent
l’anticorps anti-BMP. Toutefois, nous n’avons pas pu observer de différence de marquage
avec la filipine après le traitement avec l’anticorps, probablement en raison d’un marquage
déjà trop fort dans les cellules contrôles (résultats non montrés).
Ces observations indiquent que l’anticorps anti-BMP est capté par les
macrophages en culture et que son accumulation dans les endosomes tardifs entraîne une
accumulation de cholestérol dans ces mêmes structures. En revanche les quantités cellulaires
totales de cholestérol et d’esters de cholestérol ne sont pas modifiées (résultats non montrés).
Cette observation avait déjà été rapportée sur des fibroblastes par Kobayashi et al. (1999). Les
auteurs avaient alors postulé que l’accumulation de cholestérol révélée par la filipine se
produit très localement dans les endosomes tardifs et ne représente qu’une faible proportion
du cholestérol cellulaire total.
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
126
A la suite de ces observations nous avons cherché à identifier quelles voies de
transport du cholestérol pouvaient être altérées après traitement avec l’anticorps. Comme nous
nous intéressons en particulier au transport depuis les endosomes tardifs où est localisé le
BMP, nous avons focalisé nos études sur le devenir du cholestérol issu des LDL. Dans les
conditions de culture en routine telles qu’utilisées dans les expériences présentées ci-dessus,
les cellules sont incubées dans un milieu supplémenté avec 10% de sérum de veau fœtal
(FCS) qui fournit une quantité relativement faible de LDL (8,6 µg/mL de LDL). Dans les
expériences suivantes, les cellules ont été incubées en présence de LDL acétylées (acLDL,
entre 50 et 100 µg/mL) connues pour induire une forte accumulation de cholestérol libre (FC)
mais aussi d’esters de cholestérol (CE) dans les macrophages (Kritharides et al., 1998).
L’incubation est réalisée dans un milieu à 1% de FCS, afin d’apporter une quantité
négligeable de LDL comparativement aux acLDL. De plus, l’apport en HDL est aussi
appauvri (1,6 µg/mL), de telle sorte que l’efflux de cholestérol est mineur.
La plupart des expériences a été réalisée à la fois sur les macrophages THP-1 et
les macrophages RAW. Toutefois, par souci de simplification, nous ne présenterons que les
résultats obtenus avec les macrophages RAW. Par ailleurs, comme ces macrophages
accumulent l’anticorps de façon beaucoup plus homogène comparativement aux THP-1, les
effets de l’anticorps ont souvent été plus faciles à observer sur ces cellules.
Figure 27 : Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’accumulation de cholestérol libre dans les macrophages THP-1. Les cellules sont cultivées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 48 heures puis fixées et marquées avec un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à un fluorochrome afin de visualiser l’anticorps anti-BMP internalisé, et avec la filipine pour révéler le cholestérol libre.
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
127
1.2 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’accumulation de cholestérol libre induite par
la captation des acLDL
Dans un premier temps, nous avons vérifié que les acLDL captées et internalisées
par les macrophages sont bien transportées vers les endosomes tardifs où s’accumule
l’anticorps anti-BMP. Nous avons ainsi comparé la distribution de l’anticorps anti-BMP et de
acLDL fluorescentes (DiI-acLDL).
Une proportion importante de la fluorescence correspondant aux DiI-acLDL est
détectée dans des structures ayant également accumulé l’anticorps anti-BMP (Figure 28). On
remarque cependant que certains compartiments qui ont accumulé l’anticorps ne contiennent
pas de DiI-acLDL, probablement en raison de l’hétérogénéité des endosomes tardifs (White et
al., 2006) ou de la dégradation des acLDL dans ces compartiments. Ces résultats suggèrent
que, au moins en partie, les acLDL et l’anticorps suivent la même voie endocytique et
atteignent les mêmes compartiments.
Nous avons ensuite quantifié le cholestérol libre qui s’accumule suite à
l’incubation avec les acLDL dans des cellules contrôles ou traitées avec l’anticorps anti-BMP.
Les résultats montrent qu’en présence de acLDL (100 µg/mL), la quantité cellulaire de
cholestérol libre augmente en fonction du temps (Figure 29B). Cette augmentation est
d’environ 40% après 8 heures d’incubation et 120% après 24 heures dans les cellules
Figure 28 : Colocalisation de l’anticorps anti-BMP et des DiI-acLDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 heures. Les cellules sont cultivées en présence de 10 µg/mL de DiI-acLDL pendant 1 h puis rincées et cultivées dans des conditions contrôles pendant 2 h. Les cellules sont alors fixées et marquées avec un anticorps secondaire anti-IgG de souris couplé à un fluorochrome afin de visualiser l’anticorps anti-BMP internalisé. Barre : 10 µm.
RESULTATS PREMIERE PARTIE
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128
contrôles. A tous les temps d’incubation on remarque que la quantité de cholestérol libre est
d’autant plus augmentée, d’environ 30%, dans les cellules pré-traitées avec l’anticorps anti-
BMP. Le traitement des cellules avec des IgG de souris purifiées à partir de sérum n’a en
revanche aucun effet (Figure 29A) indiquant que les effets observés précédemment sont dû à
la spécificité de l’anticorps envers le BMP. L’agent pharmacologique U18666A est connu
pour inhiber presque complètement le transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs
vers la membrane plasmique et le réticulum endoplasmique (Liscum et al., 2002 ; Underwood
et al., 1996). Nous avons donc utilisé le U18666A pour pouvoir comparer ses effets avec ceux
observés dans les cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP. Lorsque les cellules ont été pré-
traitées avec le U18666A l’accumulation de cholestérol libre stimulée par les acLDL est
augmentée de 90% par rapport aux cellules non traitées (contre 30% dans les cellules traitées
avec l’anticorps anti-BMP).
Ces résultats indiquent que l’anticorps anti-BMP, en s’accumulant dans les
endosomes tardifs, induit une augmentation de l’accumulation de cholestérol libre stimulée
par les LDL acétylées.
Figure 29 : Accumulation du cholestérol libre (FC) stimulée par les acLDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-traitées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP, de 3 µg/mL de U18666A ou de 50 µg/mL d’IgG de souris pendant 24 h, puis incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL pendant 8 h (A, moyennes ± SD, n=3) ou pendant des temps croissants (B, moyennes de 3 puits, n=1). Les conditions basales sont obtenues pour des cellules non traitées et incubées en absence de acLDL. Le cholestérol libre (FC) est quantifié comme décrit dans Matériels et Méthodes et les résultats sont exprimés en µg/mg de protéines ; a : p≤0,05 par rapport aux conditions basales ; b : p≤0,05 par rapport aux cellules incubées uniquement en présence de acLDL (test de Student à 2 échantillons).
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
129
1.3 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’estérification du cholestérol
Nous avons ensuite quantifié, dans les mêmes conditions d’incubation, les esters
de cholestérol. Lorsque les macrophages RAW sont incubés en présence de 100 µg/mL de
acLDL pendant 8 heures, la quantité cellulaire d’esters de cholestérol (CE) est multipliée par
4 (Figure 30). Contrairement au cholestérol libre nous n’observons pas de modification
significative de la quantité cellulaire de CE dans les cellules pré-traitées avec l’anticorps anti-
BMP. En revanche l’incubation des cellules en présence de U18666A inhibe presque
totalement l’accumulation de CE stimulée par les acLDL.
La quantification des esters de cholestérol totaux ne permet pas de distinguer les
esters de cholestérol issu de la ré-estérification du cholestérol issu des acLDL et les esters de
cholestérol apportés par les acLDL et non hydrolysés. Afin de s’assurer que l’accumulation
des CE mesurée dans les cellules reflète principalement la ré-estérification du cholestérol,
nous avons analysé la composition en acides gras des CE. En effet, il est connu que les CE
des LDL contiennent surtout de l’acide linolénique (18:2) alors que les CE cellulaires
s’enrichissent en acide oléique (18:1) en raison de la spécificité de substrat que présente
l’enzyme ACAT vis-à-vis des acides gras (Seo et al., 2001). Le Tableau 5 indique la
composition en acides gras des CE extraits de macrophages RAW ainsi que celle des acLDL.
On retrouve bien une majorité de 18:2 dans les CE isolés des acLDL. Dans les cellules
incubées en présence de acLDL, les proportions d’acide oléique (18:1) et d’acide
arachidonique (20:4) sont significativement augmentées, au contraire du 18:2, ce qui suggère
que les CE qui s’accumulent dans ces cellules proviennent de la ré-estérification par l’ACAT
du cholestérol libre dérivé des acLDL. Ceci est aussi le cas pour les CE qui s’accumulent dans
les cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP.
Afin d’étudier plus précisément la ré-estérification par l’ACAT du cholestérol
libre dérivé des acLDL, les cellules ont été traitées comme précédemment mais en présence
également de [3H]oléate pendant la période d’incubation avec les acLDL. L’incorporation
totale du [3H]oléate est identique dans les cellules contrôles et les cellules traitées avec
l’anticorps anti-BMP (résultats non montrés). Ainsi, l’incorporation du [3H]oléate dans les
CE, exprimée en pourcentage de la radioactivité totale, représente le taux d’estérification du
cholestérol libre. Dans les cellules incubées en absence de acLDL seules des traces de
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
130
radioactivité associée aux CE ont été détectées, indiquant un taux d’estérification basal très
faible (Figure 31). Dans les cellules contrôles incubées en présence de acLDL l’incorporation
du [3H]oléate dans les CE est très fortement augmentée et représente donc principalement la
ré-estérification du cholestérol libre dérivé des acLDL. L’estérification du cholestérol en
présence de acLDL est stimulée de façon identique dans les cellules pré-traitées avec
l’anticorps. En revanche, en présence de U18666A l’estérification du cholestérol est presque
complètement inhibée. Ceci est cohérent avec le rôle connu de cet agent pharmacologique qui
bloque le transport du cholestérol des endosomes tardifs vers le réticulum endoplasmique où
est localisée l’ACAT. L’ensemble de ces résultats montre que l’anticorps anti-BMP ne
modifie pas la ré-estérification du cholestérol dérivé des acLDL et donc que le transport du
cholestérol dérivé des LDL vers le réticulum endoplasmique n’est pas altéré.
Figure 30 : Accumulation des esters de cholestérol (CE) stimulée par les acLDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-traitées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP, de 3 µg/mL de U18666A ou de 50 µg/mL d’IgG de souris pendant 24 h, puis incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL pendant 8 h. Les conditions basales sont obtenues pour des cellules non traitées et incubées en absence de acLDL. Les CE sont quantifiés comme décrit dans Matériels et Méthodes et les résultats sont exprimés en µg/mg de protéines (moyennes ± SD, n=3) ; a : p≤0,05 par rapport aux conditions basales ; b : p≤0,05 par rapport aux cellules incubées uniquement en présence de acLDL (test de Student à 2 échantillons).
RESULTATS PREMIERE PARTIE
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131
Figure 31 : Estérification du cholestérol stimulée par les acLDL. Les cellules sont pré-traitées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP ou de 3 µg/mL de U18666A pendant 24 h, puis incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL et de 0,5 µCi/mL de [3H]oléate pendant 8 h. Les conditions basales sont obtenues pour des cellules non traitées et incubées en absence de acLDL. La radioactivité associée aux CE est mesurée comme décrit dans Matériels et Méthodes et les résultats sont exprimés en % de la radioactivité cellulaire totale (moyennes ± SD, 4 puits sur n=2) ; a : p≤0,05 par rapport aux conditions basales ; b : p≤0,05 par rapport aux cellules incubées uniquement en présence de acLDL (test de Student à 2 échantillons).
Tableau 5 : Composition en acides gras des esters de cholestérol (CE) cellulaires et associés aux acLDL. Les cellules sont pré-traitées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 h, puis incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL pendant 8 h. Les conditions basales sont obtenues pour des cellules non traitées et incubées en absence de acLDL. Les CE sont isolés des cellules et des acLDL puis leur composition en acides gras est analysée comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en mol% (moyennes ± SD, n=3) ; a : p≤0,05 par rapport aux conditions basales (test de Student à 2 échantillons).
Acides gras Basal AcLDL AcLDL + anti-BMP CE associés aux acLDL
14:0 6,70 ± 1,55 5,39 ± 1,27 5,49 ± 1,48 0,43 ± 0,116:0 41,71 ± 4,31 25,30 ± 2,44a 25,25 ± 1,72a 11,8 ± 0,518:0 8,42 ± 2,53 7,97 ± 2,22 8,25 ± 1,29 0,6 ± 0,118:1 19,90 ± 2,86 37,52 ± 3,64a 36,68 ± 3,65a 20,9 ± 0,218:2 25,91 ± 5,56 19,88 ± 4,29 20,99 ± 5,02 55,2 ± 0,920:4 1,20 ± 0,50 3,94 ± 1,39a 3,33 ± 1,43a 7,4 ± 0,1
mol%
esters de cholestérol (CE) cellulaires
RESULTATS PREMIERE PARTIE
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132
1.4 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la captation des acLDL
L’augmentation de l’accumulation de cholestérol libre dans les cellules traitées
avec l’anticorps anti-BMP pourrait être due à une augmentation de la quantité de acLDL
captée par les cellules. Afin de mesurer la captation des acLDL, les cellules ont été incubées
pendant 24 heures en présence de acLDL reconstituées avec du cholestéryl oléate tritié
([3H]CO-acLDL). A la fin de cette période d’incubation la radioactivité cellulaire totale est
mesurée ce qui nous permet de calculer la quantité de acLDL qui a été captée par les cellules.
Comme indiqué dans le Tableau 6, la captation des acLDL n’est pas modifiée par
l’anticorps anti-BMP. De plus, la répartition de la radioactivité entre le cholestérol libre (FC)
et les esters de cholestérol (CE) n’est pas modifiée. La radioactivité associée aux CE est
constituée à la fois de [3H]CO contenu dans les acLDL et non hydrolysé ainsi que des [3H]CE
issus de la ré-estérification du [3H]FC formé par hydrolyse du [3H]CO. Comme nous avons
montré précédemment que l’estérification du cholestérol dérivé des acLDL n’est pas modifiée
par l’anticorps anti-BMP, ces résultats suggèrent également que l’hydrolyse des esters de
cholestérol associés aux acLDL n’est pas modifiée.
Tableau 6 : Captation des [3H]CO-acLDL par les macrophages RAW et distribution de la radioactivité cellulaire entre le cholestérol libre (FC) et les esters de cholestérol (CE). Les cellules sont pré-incubées dans des conditions contrôles ou en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 h puis en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-acLDL pendant 8 h. La quantité de acLDL captée est déterminée en mesurant la radioactivité cellulaire totale et est exprimée en µg de acLDL/mg de protéines cellulaires (moyennes ± SD, n=3). La radioactivité associée au FC et aux CE est mesurée comme décrit dans Matériels et Méthodes et les résultats sont exprimés en % de la radioactivité totale ([3H]FC+[3H]CE).
Contrôle anti-BMP
Captation (µg acLDL/mg protéine) 9,2 ± 0,9 9,9 ± 1,7Radioactivité (% du total) FC 34,8 ± 2,8 33,6 ± 6,0 CE 65,2 ± 2,8 66,4 ± 6,0
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
133
1.5 Effet de l’anticorps anti-BMP sur le cholestérol libre de la membrane plasmique
Nous avons montré que l’accumulation de l’anticorps anti-BMP dans les
endosomes tardifs ne modifie pas l’estérification du cholestérol dérivé des acLDL, suggérant
que le transport du cholestérol vers le réticulum endoplasmique n’est pas altéré. Il est admis
que la majorité du cholestérol issu des LDL transite par la membrane plasmique avant
d’atteindre le réticulum endoplasmique, bien qu’une voie directe, mais mineure, ait aussi été
décrite. Nous avons donc voulu déterminer si l’accumulation de l’anticorps anti-BMP dans les
endosomes tardifs altère le transport du cholestérol dérivé des acLDL vers la membrane
plasmique. La quantité ou la proportion de cholestérol associé à la membrane plasmique a été
estimée selon 3 méthodes différentes : la sensibilité des cellules à l’amphotéricine B,
l’oxydation du cholestérol membranaire par la cholestérol oxydase et l’extraction du
cholestérol membranaire par la méthyl-β-cyclodextrine (MβCD). Ces méthodes de
quantification indirectes ont été utilisées comme alternative à une quantification directe du
cholestérol dans la membrane plasmique, dans la mesure où nous n’avons pas réussi à isoler
ces membranes de façon satisfaisante.
1.5.1 Mesure de la sensibilité des cellules à l’amphotéricine B
L’amphotéricine B est un antifongique de la famille des polyènes qui se fixe aux
régions membranaires riches en cholestérol et forme des pores causant la mort cellulaire. La
sensibilité des cellules à l’amphotéricine B, qui peut être mesurée par un test de viabilité
cellulaire, représente donc une mesure semi-quantitative de la quantité de cholestérol associée
à la membrane plasmique. Des travaux antérieurs ont montré que la sensibilité à
l’amphotéricine B est augmentée dans des cellules incubées avec des LDL, en conséquence de
l’accumulation de cholestérol dans la membrane plasmique (Liscum et al., 2002).
Dans nos expériences, la viabilité des cellules est mesurée avec un test MTT
commercial et les résultats sont exprimés en pourcentage de la viabilité maximale mesurée
dans les groupes de référence respectifs (traitements des cellules identiques mais en absence
d’amphotéricine B). La viabilité maximale est identique pour les cellules contrôles et les
cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP, dans les deux conditions analysées (absence ou
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
134
présence de acLDL, résultats non montrés). Dans des conditions basales, l’amphotéricine B
aux concentrations 25 et 50 µg/mL induit une diminution de la viabilité de 25% et 40%
respectivement (Figure 32A). Après incubation avec les acLDL, le pouvoir cytolytique de
l’amphotéricine B est significativement augmenté, en accord avec une augmentation du
cholestérol membranaire rendant les cellules plus sensibles à la toxine. Dans les cellules
traitées avec l’anticorps, cette augmentation de sensibilité est encore plus forte, suggèrant une
quantité de cholestérol membranaire plus importante que dans les cellules non traitées avec
l’anticorps.
Nous avons ensuite cherché à déterminer si cette apparente accumulation de
cholestérol membranaire dans les cellules traitées avec l’anticorps reflète une augmentation de
la synthèse de novo de cholestérol. Pour cela la même série d’expériences a été menée sur des
cellules traitées avec un inhibiteur de la synthèse de cholestérol (mévinoline 20 µM +
mévalonate 0,5 mM). Les cellules sont alors presque deux fois plus résistantes à
l’amphotéricine B (+mev) que les cellules contrôles (-mev) (Figure 32B). Ce résultat était
attendu puisque l’inhibition de la synthèse de cholestérol entraîne une diminution de la
quantité cellulaire totale de cholestérol et notamment membranaire. Dans la condition où la
synthèse de cholestérol est inhibée (+mev) on observe que suite à l’incubation avec les
acLDL, les cellules traitées avec l’anticorps sont toujours plus sensibles à l’amphotéricine B
que les cellules non traitées. Ces résultats suggèrent que le cholestérol qui s’accumule dans la
membrane plasmique des cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP provient effectivement
des acLDL.
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
135
1.5.2 Mesure de l’oxydabilité du cholestérol membranaire par la cholestérol oxydase
La cholestérol oxydase est une enzyme qui oxyde le cholestérol en cholesténone.
Lorsque les cellules sont fixées et incubées en présence de cholestérol oxydase, seul le
cholestérol présent dans la membrane plasmique est accessible à l’enzyme (Lange et Ramos,
1983). Ainsi, la proportion du cholestérol issu des acLDL retrouvée dans la membrane
plasmique peut être estimée en utilisant des acLDL radiomarquées et en déterminant le
pourcentage de cholestérol cellulaire converti en cholesténone. Nous avons ainsi comparé
l’oxydation du cholestérol membranaire par la cholestérol oxidase dans des cellules contrôles
et des cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP suite à une incubation en présence de
[3H]CO-acLDL.
Dans les cellules contrôles, 56 ± 1 % du [3H]cholestérol dérivé des acLDL est
converti en [3H]cholesténone. Ce pourcentage augmente jusqu’à 64 ± 1,5 % dans les cellules
traitées avec l’anticorps anti-BMP (p≤0,01, n=3). Ce résultat indique que l’anticorps anti-
Figure 32 : Mesure de la sensibilité des macrophages RAW à l’amphotéricine B. Les cellules sont pré-traitées en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 h, puis incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL pendant une nuit. Les conditions basales sont obtenues pour des cellules non traitées et incubées en absence de acLDL. Les cellules sont ensuite traitées avec l’amphotéricine B comme décrit dans Matériels et Méthodes. A : La viabilité cellulaire est mesurée par un test au MTT après un traitement avec 25 ou 50 µg/mL d’amphotéricine B. B : La viabilité cellulaire est mesurée par un test au MTT après un traitement avec 50 µg/mL d’amphotéricine B en absence ou en présence d’un inhibiteur de la synthèse de cholestérol (mev). Les résultats sont exprimés en % de la viabilité maximale mesurée dans des groupes de référence traités de manière identique mais en absence d’amphotéricine B (moyennes ± SD, n=3) ; a : p≤0,05 par rapport aux conditions basales ; b : p≤0,05 par rapport aux cellules incubées uniquement en présence de acLDL (test de Student à 2 échantillons).
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
136
BMP induit une augmentation de la proportion du cholestérol dérivé des acLDL et associé à la
membrane plasmique par rapport au cholestérol présent dans les différents compartiments
intracellulaires.
1.5.3 Mesure de l’extraction du cholestérol cellulaire par la cyclodextrine (MβCD)
La méthyl-β-cyclodextrine (MβCD) est une « molécule-cage » possédant une très
forte affinité pour le cholestérol. Il a été montré que l’incubation de cellules en culture en
présence de MβCD pendant des temps courts et à des concentrations de l’ordre du milli-
molaire permet d’extraire le cholestérol de la membrane plasmique sans mobiliser les
réservoirs internes de cholestérol. La proportion du cholestérol issu des acLDL retrouvée dans
la membrane plasmique peut donc être estimée avec la MβCD en utilisant des acLDL
radiomarquées.
Après incubation en présence [3H]CO-acLDL, les cellules ont été incubées en
présence de 5 et 10 mM de MβCD pendant 5 et 10 minutes, puis la quantité de radioactivité
présente dans le milieu de culture et dans les cellules a été mesurée. L’efflux de cholestérol
est exprimé en pourcentage de la radioactivité associée à la MβCD (dans le milieu de culture)
par rapport à la radioactivité totale (cellules + milieu). Ce paramètre représente indirectement
la proportion de [3H]cholestérol associé à la membrane plasmique par rapport au
[3H]cholestérol intracellulaire.
La MβCD stimule l’efflux du [3H]cholestérol à la fois en fonction de la
concentration et du temps d’incubation (Figure 33). Pour tous les temps et toutes les
concentrations utilisés on remarque que le pourcentage de [3H]cholestérol capté par la MβCD
est augmenté dans les cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP. Ce résultat est cohérent
avec une augmentation de la proportion du cholestérol dérivé des acLDL asssocié à la
membrane plasmique par rapport au cholestérol présent dans les différents compartiments
intracellulaires.
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
137
L’ensemble de ces résultats indique qu’une quantité importante de cholestérol issu
des acLDL se retrouve associée à la membrane plasmique (plus de la moitié selon les
expériences avec la cholestérol oxidase). De plus, cet enrichissement de la membrane
plasmique en cholestérol est accentué de façon significative dans les cellules traitées avec
l’anticorps anti-BMP.
1.6 Effet de l’anticorps anti-BMP sur l’efflux du cholestérol stimulé par les HDL
Nous avons aussi cherché à déterminer si l’anticorps anti-BMP altère l’efflux du
cholestérol stimulé par les HDL. Après incubation en présence de [3H]CO-acLDL, les cellules
ont été incubées en présence de HDL puis la quantité de radioactivité présente dans le milieu
de culture et dans les cellules a été mesurée. Comme précedemment, l’efflux de cholestérol
est exprimé en pourcentage de la radioactivité associée aux HDL (dans le milieu de culture)
par rapport à la radioactivité totale (cellules + milieu).
Figure 33 : Efflux du [3H]cholestérol dérivé des acLDL stimulé par la MβCD dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées dans des conditions contrôles ou en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 h puis en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-acLDL pendant 8 h. L’efflux du cholestérol est ensuite stimulé par incubation des cellules en présence de 5 ou 10 mM de MβCD pendant 5 ou 10 min. Les résultats sont exprimés en % de la radioactivité mesurée dans le milieu par rapport à la radioactivité totale (cellules + milieu) (moyennes ± SD, n=3). a : p≤0,05 par rapport aux contrôles respectifs (test de Student à 2 échantillons).
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
138
La Figure 34 montre que l’efflux de cholestérol augmente en fonction du temps
d’incubation avec les HDL. Après 24 heures les HDL ont capté environ 20% du
[3H]cholestérol cellulaire. Pour tous les temps analysés, l’efflux de cholestérol est diminué
dans les cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP (réduction de 15% par rapport aux
contrôles à 24 heures).
1.7 Effet de l’anticorps anti-BMP sur la répartition du cholestérol entre les différents
domaines membranaires
Nous avons montré que dans les cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP, la
quantité de cholestérol dérivé des acLDL est augmentée dans la membrane plasmique mais
que l’efflux du cholestérol stimulé par les HDL est diminué. Des études ont montré que le
cholestérol n’est pas réparti de manière homogène dans la membrane plasmique. Il existe en
effet de nombreux domaines, plus ou moins riches en cholestérol et possédant des propriétés
différentes (voir chapitre 1 des rappels bibliographiques). Il a été montré notamment que
Figure 34 : Efflux du [3H]cholestérol dérivé des acLDL stimulé par les HDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées dans des conditions contrôles ou en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 h puis en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-acLDL pendant 8 h. L’efflux du cholestérol est ensuite stimulé par incubation des cellules en présence de 100 µg/mL de HDL pendant des temps croissants. Les résultats sont exprimés en % de la radioactivité mesurée dans le milieu par rapport à la radioactivité totale (cellules + milieu) (moyennes ± SD, n=3) ; a : p≤0,05 par rapport aux contrôles respectifs (test de Student à 2 échantillons).
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
139
l’efflux est modifié selon la répartition du cholestérol entre ces différents domaines de la
membrane plasmique et que le transporteur ABCG1 redistribue le cholestérol vers des
domaines accessibles aux HDL (Vaughan et Oram, 2005). Nous avons donc cherché à
déterminer si le traitement des macrophages RAW avec l’anticorps anti-BMP modifie la
répartition du cholestérol entre les différents domaines de la membrane plasmique.
Après traitement des cellules en présence de acLDL, les différentes fractions de la
membrane plasmique ont été isolées par ultracentrifugation sur gradient de saccharose après
homogénéisation des cellules en présence d’un détergent (triton X-100). Cette technique
utilise l’insolubilité des radeaux lipidiques dans les détergents et leur propriété de flottaison
sur gradient de saccharose en fonction de leur densité. Après la centrifugation on récupère des
fractions de 1 mL numérotées de 1 à 11 à partir du fond du tube. Les pourcentages de
saccharose mesurés dans chacune de ces fractions sont reportés dans la Figure 35A. La
fraction 1, la plus dense, contient 37,5% de saccharose, puis ce pourcentage diminue
progressivement jusqu'à la fraction 11 contenant 10% de saccharose. Les pourcentages de
saccharose dans les différentes fractions sont identiques pour les trois conditions testées,
assurant ainsi la reproductibilité de la séparation. Le cholestérol libre (FC) est ensuite
quantifié dans chaque fraction.
Le cholestérol des cellules cultivées dans des conditions basales (sans traitement
avec l’anticorps et sans acLDL) se répartit en deux populations distinctes (Figure 35B) de
manière similaire à ce qui a été rapporté dans les macrophages THP-1 (Gaus et al., 2005). Sur
la base du pourcentage de saccharose (Figure 35A) et de la distribution du GM1 (résultats non
montrés), la fraction « lourde » (fractions 2 et 3) est définie comme correspondant aux
domaines fluides de la membrane plasmique et la fraction « légère » (fractions 8 et 9) comme
correspondant aux radeaux lipidiques riches en cholestérol et résistants au triton (Diaz et al.,
2002). Dans les cellules incubées en présence de acLDL, la quantité de cholestérol augmente
dans toutes les fractions par rapport aux conditions basales. On observe notamment une
augmentation importante de la quantité de cholestérol dans les fractions de densité
intermédiaire (fractions 5, 6 et 7). Dans les macrophages pré-traités avec l’anticorps anti-BMP
on remarque que la répartition du cholestérol dans les différentes fractions est légèrement
modifiée. En effet la quantité de cholestérol est augmentée dans les fractions 5 et 6, et
diminué dans les fractions 7 et 8 par rapport aux cellules non traitées. Ces résultats suggèrent
que l’anticorps anti-BMP modifie la répartition du cholestérol issu des acLDL entre les
différents domaines de la membrane plasmique.
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
140
Discussion
Les premières études fonctionnelles concernant le BMP ont été réalisées sur une
lignée cellulaire de fibroblastes à l’aide de l’anticorps monoclonal anti-BMP. Il a été montré
que cet anticorps s’accumule dans les endosomes tardifs des cellules en se fixant au BMP et
qu’il altère l’organisation, la dynamique et la fonction des membranes endosomales
contrôlées par les domaines riches en BMP (Kobayashi et al., 1998b). Il a notamment été
montré que l’anticorps anti-BMP induit une accumulation de cholestérol libre dans les
endosomes tardifs (Kobayashi et al., 1999). Toutefois, l’effet de l’anticorps anti-BMP sur les
différentes voies métaboliques et le transport du cholestérol dérivé des LDL n’a jamais été
précisément étudié.
Figure 35 : Séparation sur gradient de saccharose des radeaux lipidiques dans des macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées dans des conditions contrôles ou en présence de 50 µg/mL de l’anticorps anti-BMP pendant 24 h puis en présence de 100 µg/mL de acLDL pendant 12 h. Les cellules sont récoltées et homogénéisées en présence de triton X-100. Les différentes fractions membranaires sont isolées par ultracentrifugation sur gradient discontinu de saccharose comme décrit dans Matériels et Méthodes. A : Le pourcentage de saccharose est déterminé pour chaque fraction à l’aide d’un réfractomètre portable. B : Le cholestérol libre (FC) est quantifié dans chaque fraction et les résultats sont exprimés en µg/mg protéines (moyennes de 2 déterminations sur n=1).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
% s
acch
aros
e
N° fraction
basalacLDLacLDL + anti-BMP
A
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11
FC (µ
g/m
g pr
otéi
ne)
N° fraction
basalacLDLacLDL + anti-BMP
B
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
141
Dans cette étude nous avons dans un premier temps montré que l’anticorps anti-
BMP s’accumule dans deux lignées de macrophages en culture, les THP-1 et les RAW, et que
ceci altère la distribution intracellulaire du cholestérol. Nous nous sommes ensuite intéressés
aux effets de l’anticorps anti-BMP sur le métabolisme et le transport intracellulaires du
cholestérol dérivé des LDL.
Sur des cellules cultivées dans un milieu contenant 10% de FCS qui apporte une
quantité faible de LDL, l’anticorps anti-BMP ne modifie pas la quantité cellulaire totale de
cholestérol. Au contraire, lorsque les cellules sont supplémentées en acLDL, le cholestérol
libre s’accumule davantage dans les cellules traitées avec l’anticorps que dans les cellules
contrôles.
De nombreuses études ont montré que l’agent pharmacologique U18666A bloque
le transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs vers la membrane plasmique et le
réticulum endoplasmique, induisant une inhibition presque totale de l’estérification du
cholestérol dérivé des LDL et une accumulation de cholestérol libre dans les endosomes
tardifs (Liscum et al., 2002 ; Underwood et al., 1996). Nous avons confirmé ces effets de
l’U18666A dans les macrophages RAW (et THP-1, non montré). Contrairement à
l’U18666A, l’anticorps anti-BMP n’altère pas la ré-estérification du cholestérol dérivé des
acLDL. Ceci suggère que le cholestérol n’est pas totalement retenu dans les endosomes tardifs
ou qu’il peut rejoindre le réticulum endoplasmique par une voie indépendante des endosomes
tardifs où s’accumule l’anticorps anti-BMP. A ce titre Sugii et al. (2003) ont montré qu’une
partie des esters de cholestérol contenus dans les LDL est hydrolysée dans un compartiment
différent des endosomes tardifs. Il est donc possible que le cholestérol libre ainsi formé puisse
rejoindre le réticulum endoplasmique ou la membrane plasmique sans transiter par les
endosomes tardifs.
Nous nous sommes ensuite intéressés à la voie de transport du cholestérol des
endosomes tardifs vers la membrane plasmique. Nous avons montré que l’anticorps anti-BMP
induit une augmentation de la quantité cellulaire de cholestérol libre dans la membrane
plasmique après incubation des cellules en présence de acLDL. Cet enrichissement de la
membrane plasmique en cholestérol ne provient ni d’une augmentation de la synthèse de
novo, ni d’une hydrolyse des esters de cholestérol formés dans le réticulum endoplasmique
car la quantité d’esters de cholestérol accumulée dans les cellules n’est pas modifiée par
l’anticorps anti-BMP.
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
142
Récemment il a été montré que l’agent pharmacologique D-PDMP s’accumule
dans les endosomes tardifs, modifiant fortement la structure des domaines riches en BMP et
inhibant l’activité de la lipase acide responsable de l’hydrolyse des esters de cholestérol
dérivé des LDL (Makino et al., 2006). Les résultats présentés dans notre étude indiquent que
contrairement au D-PDMP, l’anticorps anti-BMP ne modifie pas l’hydrolyse des esters de
cholestérol contenus dans les acLDL.
Une autre conséquence de l’accumulation de l’anticorps anti-BMP dans les
endosomes tardifs est la diminution de l’efflux du cholestérol stimulé par les HDL, malgré
une augmentation de la quantité de cholestérol libre dans la membrane plasmique. L’équipe
de Tabas a montré qu’une accumulation massive de cholestérol libre dans des macrophages
péritonéaux de souris induit une diminution modérée de l’efflux du cholestérol stimulé par les
HDL (Feng et al., 2003 ; Shiratori et al., 1994). Dans ces études, l’augmentation du
cholestérol libre obtenue en supplémentant les cellules avec des acLDL en présence d’un
inhibiteur de l’ACAT est environ d’un facteur 6 et s’accompagne d’une induction de la mort
cellulaire (Tabas, 2002). Dans nos conditions expérimentales, l’augmentation de cholestérol
libre induite par l’anticorps anti-BMP en présence de acLDL est beaucoup plus faible et
n’induit pas de diminution significative de la viabilité cellulaire. Il parait donc peu probable
que la diminution de l’efflux de cholestérol soit une conséquence de l’accumulation de
cholestérol libre.
La MβCD possède une très forte affinité pour le cholestérol et capte de manière
non spécifique le cholestérol présent dans la membrane plasmique. Ainsi, l’efflux de
cholestérol stimulé par la MβCD est étroitement corrélé à la quantité de cholestérol présent
dans la membrane plasmique. L’augmentation d’efflux à la MβCD observée dans les cellules
traitées avec l’anticorps suggère donc un enrichissement du cholestérol dans la membrane
plasmique de ces cellules. A l’inverse, l’efflux de cholestérol vers les HDL est diminué après
traitement avec l’anticorps. Toutefois, la littérature indique que l’efflux vers les HDL est
régulé de façon plus complexe car il dépend en outre de l’activité du transporteur
membranaire ABCG1 et du récepteur SR-BI (Drobnik et al., 2002 ; Vaughan et Oram, 2005).
De plus, des études récentes ont mis en évidence l’existence de domaines riches en cholestérol
dans la membrane plasmique qui sont différemment régulés selon les mécanismes mis en jeu
RESULTATS PREMIERE PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
143
dans l’efflux de cholestérol, HDL- ou apoA1-dépendant. Les résultats de nos études sur les
microdomaines membranaires, bien que préliminaires, suggèrent que l’anticorps anti-BMP
modifie la répartition du cholestérol entre des domaines membranaires possédant des densités
différentes. Ainsi, l’anticorps anti-BMP pourrait modifier spécifiquement le transport du
cholestérol dérivé des acLDL vers certains types de microdomaines utilisés comme réservoirs
par ABCG1 ou SR-BI et réduire de cette manière l’efflux du cholestérol stimulé par les HDL.
A ce titre, il serait aussi intéressant d’évaluer les conséquences de l’accumulation de
l’anticorps sur l’expression/activité du transporteur ABCG1.
En conclusion, les résultats de cette étude confirment que le BMP est impliqué
dans la régulation du transport endosomal du cholestérol dérivé de la captation des LDL. De
plus nous montrons que le BMP semble contribuer à la régulation de l’homéostasie cellulaire
du cholestérol, bien qu’il soit localisé de manière très spécifique dans les endosomes tardifs.
En effet, dans des conditions où l’acccumulation de cholestérol est stimulée, le BMP semble
contrôler la quantité de cholestérol dans la membrane plasmique ainsi que l’efflux du
cholestérol par les HDL. Ainsi, le BMP pourrait jouer un rôle important lors des phases
précoces de l’athérogenèse, notamment pour prévenir l’accumulation de cholestérol libre dans
les macrophages qui est considérée comme la première étape dans la formation des cellules
spumeuses et l’évolution des plaques d’athérome (Tabas, 2002).
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
144
DEUXIEME PARTIE
Etude des effets d’une accumulation du BMP sur le transport et le
métabolisme intracellulaire du cholestérol dans les macrophages
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
145
Introduction
L’étude présentée dans la première partie ainsi que celles réalisées par le Dr.
Kobayashi (Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi et al., 1999) indiquent que le BMP participe
à l’organisation des membranes internes des endosomes tardifs et à la régulation du transport
intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL. Ces études ont reposé sur l’utilisation de
l’anticorps anti-BMP qui a été l’un des premiers outils utilisé pour des études fonctionnelles.
Des études en microscopie ont indiqué que l’anticorps anti-BMP altère la structure des
endosomes qui devient plus compacte (Kobayashi et al., 1998b). On ignore cependant si
l’anticorps qui s’accumule dans les endosomes tardifs reconnait directement le BMP ou un
environnement membranaire spécifique des membranes internes des endosomes tardifs riches
en BMP. Afin de mieux comprendre le rôle cellulaire du BMP et les mécanismes mis en jeu
nous nous sommes intéressés à définir qu’elles sont les propriétés du BMP (structure,
quantité, composition en acides gras…) importantes pour sa fonction au sein des membranes
des endosomes tardifs. Le métabolisme cellulaire du BMP (synthèse, remodelage des acides
gras, dégradation…), et en particulier les enzymes spécifiquement impliquées, ne sont que
partiellement connues, ce qui limite les possibilités et les outils de biologie cellulaire
permettant de modifier le BMP.
Bien qu’il reste de nombreuses interrogations sur les voies de synthèse du BMP, il
a été clairement établi que le PG exogène peut être utilisé comme précurseur par les cellules
en culture et notamment par les macrophages RAW (Amidon et al., 1995 ; Waite et al., 1990).
A partir de cette observation, nous avons envisagé d’induire une augmentation de la quantité
de BMP dans les macrophages en supplémentant les cellules avec du PG exogène, et d’en
mesurer les conséquences sur l’homéostasie du cholestérol intracellulaire.
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
146
2.1 Caractérisation et dosage du BMP dans les macrophages RAW cultivés dans des
conditions contrôles
2.1.1 Rappel de la méthode
Les différentes étapes d’extraction et de purification des phospholipides d’intérêt
(BMP, PC et PE) sont schématisées dans la Figure 37. Dans notre étude nous avions besoin
pour chaque échantillon de déterminer à la fois la quantité de BMP et sa composition en
acides gras. Nous avons donc choisi de quantifier le BMP par le dosage de ses acyles gras en
chromatographie gazeuse (GC) grâce à un standard interne synthétisé par notre équipe. Ce
standard interne est une molécule de BMP dont les deux chaînes acyles sont du
pentadécanoate (15:0/15:0-BMP). Cet acide gras n’existe pas naturellement dans les cellules
et il est possible de le séparer des autres acides gras en GC. De plus nous avons vérifié que le
15:0/15:0-BMP est co-extrait et co-purifié avec le BMP endogène lors de toutes les étapes de
séparation. Afin de quantifier de la même façon les phosphatidylcholines (PC) et les
phosphatidyléthanolamines (PE) nous avons utilisé deux autres standards internes disponibles
dans le commerce, le 17:0/17:0-PC et le 17:0/17:0-PE.
Après extraction de l’ensemble des lipides cellulaires, la première étape de
purification des PC, des PE et du BMP consiste en une chromatographie sur couche mince en
deux dimensions (CCM-2D) au cours de laquelle les PC sont bien séparées des autres classes
de phospholipides. Un profil d’élution en CCM-2D est présenté dans la Figure 36. Le gel de
silice correspondant à la zone de migration des PC est récupéré puis leur composition en
acides gras est analysée par GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. En revanche les
PE co-migrent avec le PG et nécessitent donc une étape supplémentaire de purification
réalisée par HPLC comme décrit dans Matériels et Méthodes. De même, le BMP migre très
proche des cardiolipines (CL). Afin d’éviter tout risque de contamination, le BMP est donc
également purifié par HPLC.
En HPLC les PE et PG sont élués respectivement en 21 et 31 minutes. En accord
avec les données de la littérature, les macrophages RAW cultivés dans des conditions
contrôles contiennent une quantité très faible de PG, inférieure au seuil de détection dans nos
conditions d’analyses en HPLC. Ainsi, sur les chromatogrammes seul le pic correspondant
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
147
aux PE est observé (Figure 42A). Dans notre système HPLC, un standard commercial de
18:1/18:1-BMP est élué en 3 pics dont les temps de rétention sont compris entre 10 et 15
minutes. Le BMP extrait de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles est
également élué en trois pics distincts aux mêmes temps de rétention (Figure 38). Luquain et
al. (2000) ont montré que les trois pics correspondent tous à du BMP mais qu’ils diffèrent par
la composition en acides gras, la position des acyles gras sur les résidus glycérols ainsi que
par la stéréoconfiguration du squelette glycérophosphate.
Les PE et le BMP sont récoltés en sortie de colonne puis extraits du solvant
d’élution et leur composition en acides gras est analysée en GC comme décrit dans Matériels
et Méthodes. Afin de pouvoir calculer pour chaque échantillon le rendement d’extraction, une
quantité connue d’un deuxième standard interne est ajoutée juste avant l’injection en GC. Il
s’agit d’un ester méthylique d’acide gras à 17 atomes de carbones (17:0-Me) pour le BMP et
d’un ester méthylique d’acide gras à 15 atomes de carbones (15:0-Me) pour les PC et les PE.
En moyenne, les rendements d’extraction des PC sont d’environ 75-80%. En raison d’une
étape supplémentaire de purification en HPLC le rendement d’extraction des PE et du BMP
sont d’environ 60-65%. Sur les chromatogrammes, chaque pic correspondant à un acide gras
est identifié en fonction de son temps de rétention. Les quantités et les compositions en acides
gras des différents phospholipides sont calculées comme décrit dans Matériels et Méthodes.
Des exemples de chromatogrammes des acides gras sont présentés dans l’annexe 2.
Figure 36 : Profil de migration des classes de phospholipides en CCM-2D. O : origine ; PI : phosphatidylinositols ; PS : phosphatidylsérines ; SM : sphingomyélines ; PC : phosphatidylcholines ; PE : phosphatidyléthanolamines ; CL : cardiolipines ; BMP : bis(monoacylgycérophosphate ; AG : acides gras non estérifiés ; LN : lipides neutres
1. b
asiq
ue
2. acide
PI / PS / SM
PE
PC
BMP
CL
LN
AG
O
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
148
Figure 37 : Protocole d’extraction et de purification des PC, des PE et du BMP.
Culot cellulaireEnv. 100 x 106 cellules8 mg de prot.
1) Ajout des premiers standards internes80 µg de 17:0/17:0-PC25 µg de 17:0/17:0-PE7 µg de 15:0/15:0-BMP
2) Extraction lipidique
Lipides totaux
Séparation des classes de phospholipides
par CCM-2D
PC PE/PG BMP
Le gel de silice est gratté et
transféré dans un tube en verre
Purification par HPLC
BMP purifié
Transméthylation Transméthylation
Esters méthyliques d’acides gras
+ 35 µg de15:0-Me
+ 15 µg de15:0-Me
+ 5 µg de17:0-Me
Ajout du 2ème standard interne
Homogénéisation dans 1,5 ml d’eau + triton 0,1%
Dosage des protéines sur une fraction aliquote
Analyse en chromatographie gazeuseVolume d’injection : 1 µl
Dilution dans un volume d’isooctane
1100 µl 400 µl 100 µl
PE purifiées
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
149
2.1.2 Quantification des PC, PE et du BMP dans les macrophages RAW cultivés
dans des conditions contrôles
Dans des conditions contrôles les macrophages RAW contiennent 51,3 ± 6,9
nmol/mg-prot de PC, 27,8 ± 4,5 nmol/mg-prot de PE et 3,2 ± 0,9 nmol/mg-prot de BMP. Il est
possible de quantifier en parallèle les phospholipides totaux sur une fraction aliquote de
l’extrait lipidique total. Ainsi nous avons déterminé que les PC, les PE et le BMP représentent
respectivement 49%, 26% et 3% des phospholipides totaux. Dans la plupart des tissus et types
cellulaires le BMP représente moins de 1% des phospholipides totaux. Ainsi, en comparaison,
il apparait que les macrophages RAW contiennent une proportion relativement importante de
BMP.
2.1.3 Composition en acides gras des PC, PE et du BMP dans les macrophages RAW
L’acide oléique (OA, 18:1n-9) est l’acide gras majoritaire dans les trois
phospholipides étudiés, notamment dans le BMP où il représente plus de 50% du total des
chaînes grasses (Tableau 7). Les PC contiennent une grande proportion d’acides gras saturés
(40%) alors que les PE sont plus riches en acides gras polyinsaturés (AGPI). Le BMP est
Figure 38 : Chromatogrammes HPLC d’un standard commercial de 18:1/18:1-BMP et de BMP extrait de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles.
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
150
composé de 14% d’acides gras saturés et de 12 % d’AGPI. Contrairement aux PE qui
contiennent davantage d’AGPI de la série n-6 dont l’acide arachidonique (AA, 20:4n-6), le
BMP contient davantage d’AGPI de la série n-3. Le DHA représente 7% des chaînes acyles
du BMP et constitue l’AGPI majoritaire.
Tableau 7 : Composition en acides gras des PC, PE et du BMP dans les macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles. Les PC, les PE et le BMP sont extraits et purifiés par CCM/HPLC à partir de cellules cultivées dans des conditions contrôles. Leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=6). tr : traces. nd : non détecté. AG : acides gras. DMA : dimethylacétals.
Acides gras BMP PC PE
14:0 0,5 ± 0,2 3,1 ± 0,4 0,3 ± 0,1
16:0 7,7 ± 1,4 28,0 ± 1,8 7,3 ± 1,0
18:0 5,9 ± 0,8 8,0 ± 0,4 14,6 ± 1,0
Total des AG saturés 14,1 ± 2,4 39,1 ± 2,6 22,2 ± 2,116:1n-9/n-7 4,4 ± 0,8 10,2 ± 0,7 3,9 ± 0,7
18:1n-9 51,2 ± 3,0 35,0 ± 2,1 25,4 ± 1,9
18:1n-7 16,8 ± 2,9 11,5 ± 1,1 6,3 ± 0,9
Total des AG mononinsaturés 72,4 ± 6,7 56,7 ± 3,9 35,6 ± 3,518:2n-6 1,2 ± 0,2 1,2 ± 0,2 1,4 ± 0,2
20:2n-6 tr tr 4,3 ± 0,7
20:3n-6 tr tr 1,3 ± 0,2
20:4n-6 0,7 ± 0,1 1,0 ± 0,1 9,5 ± 1,4
Total des AG polyinsaturés n-6 1,9 ± 0,3 2,2 ± 0,3 16,5 ± 2,520:5n-3 tr tr 1,1 ± 0,2
22:5n-3 2,1 ± 0,6 0,4 ± 0,1 3,7 ± 0,6
22:6n-3 7,4 ± 2,7 0,6 ± 0,1 3,9 ± 0,6
Total des AG polyinsaturés n-3 9,5 ± 3,3 1,0 ± 0,2 8,7 ± 1,4 Total des AG polyinsaturés 11,4 ± 3,6 3,2 ± 0,5 25,2 ± 3,916:0-DMA nd nd 10,5 ± 1,5
18:0-DMA nd nd 5,6 ± 0,6
18:1-DMA nd nd 3,1 ± 0,5
Total des DMA nd nd 19,2 ± 2,6
mol %
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
151
Les DMA sont obtenus par dérivation des chaînes alkényles en position sn-1 des
plasmalogènes. Nous n’avons pas pu détecter de plasmalogènes-PC, ni d’ailleurs de
plasmalogènes-BMP qui n’ont jamais été décrits. Les macrophages RAW contiennent
uniquement des plasmalogènes-PE en quantités significatives. Les DMA détectés dans les PE
sont le 16:0-DMA, le 18:0-DMA et le 18:1-DMA (18:1n-9-DMA + 18:1n-7-DMA). Les
DMA représentent près de 20% du total des chaînes grasses analysées, ce qui indique que les
espèces alkényl-acyl-PE (plasmalogènes-PE) représentent environ 40% des PE totales.
2.2 Effets du 18:1/18:1-PG sur la quantité et la composition en acides gras du BMP
dans les macrophages RAW
Les précédentes études sur la conversion du PG en BMP ont été réalisées à l’aide
de doses traceuses de PG radioactif. Ainsi, il n’a jamais été clairement établi que la
supplémentation des cellules avec de fortes concentrations de PG exogène pouvaient
augmenter spécifiquement la quantité cellulaire de BMP. Les études de cinétique réalisées par
Waite et al. (1990) indiquent que la conversion du PG en BMP par les macrophages RAW
atteint un plateau à partir de 24 h d’incubation. Nous avons donc fixé nos temps d’incubation
à 24 h. Afin de favoriser l’endocytose et le transport du PG exogène vers les endosomes
tardifs où la synthèse du BMP a lieu (Waite et al., 1990) nous avons apporté le PG sous forme
de petits liposomes unilamellaires. Il a été montré que de tels liposomes sont endocytés par les
cellules et transportés vers des structures possédant un pH acide et présentant une organisation
multi-vésiculaire et multi-lamellaire caractéristique des endosomes tardifs (Daleke et al., 1990
; Muller et al., 1995 ; Poelma et al., 2004).
2.2.1 Augmentation spécifique de la quantité de BMP dans les macrophages RAW
après supplémentation par du 18:1/18:1-PG
Après incubation des cellules en présence de liposomes de 18:1/18:1-PG pendant
24 h, la quantité cellulaire de BMP augmente de manière dose-dépendante jusqu’à la plus
forte concentration testée (Figure 39). Par rapport au contrôle (valeur théorique de 100%) la
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
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152
quantité de BMP est doublée en présence de 5 µM de 18:1/18:1-PG et multipliée par un
facteur 4 à 60 µM. Toutefois, au-delà de 30 µM de 18:1/18:1-PG on remarque que la quantité
cellulaire de BMP tend vers une saturation. Pour la suite de notre étude nous avons donc
choisi de n’utiliser que la concentration de 30 µM.
Cette augmentation de la quantité de BMP peut être visualisée après la première
élution en CCM lorsque les cellules sont marquées avec 0,2 µCi/mL de [3H]oléate. En effet,
lorsqu’on réalise une lecture linéaire de la distribution de la radioactivité on remarque que la
proportion de [3H]BMP est augmentée par rapport aux autres phospholipides radioactifs dans
les cellules incubées en présence de 18:1/18:1-PG (Figure 40). Toutefois cette mesure n’est
pas directement proportionnelle à la quantité de BMP.
Au niveau des chromatogrammes HPLC on remarque également que dans les
cellules incubées en présence de 18:1/18:1-PG les 3 pics caractéristiques du BMP sont
augmentés dans les mêmes proportions. Ceci suggère que les propriétés structurales du BMP
ne sont pas profondément modifiées dans les cellules enrichies (Figure 41).
Nos résultats indiquent également que cette augmentation est spécifique du BMP
par le fait que nous n’observons aucune différence significative entre les cellules contrôles et
les cellules traitées concernant les quantités cellulaires de PC et de PE, même aux plus fortes
concentrations. Nous avons également vérifié qu’en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG la
quantité de cardiolipines n’est pas modifiée (résultats non montrés).
Enfin nous avons montré que le 18:1/18:1-PG ne s’accumule pas dans les cellules
traitées. En effet, comme dans les cellules contrôles, aucun pic correspondant au PG n’a été
détecté en HPLC lors de l’étape de purification des PE en HPLC (Figure 42). Une troisième
condition a été utilisée comme contrôle afin de s’assurer que le 18:1/18:1-PG est détectable
dans nos conditions d’analyse. Pour cela des cellules ont été cultivées dans des conditions
contrôles puis 100 µg de 18:1/18:1-PG ont été ajoutés directement sur le culot cellulaire avant
la première extraction lipidique. Dans ces conditions nous observons un pic correspondant au
18:1/18:1-PG indiquant que celui-ci est bien co-extrait et co-élué en CCM-2D avant d’être
séparé des PE en HPLC. L’ensemble de ces résultats indique qu’après internalisation des
liposomes, le 18:1/18:1-PG est rapidement et exclusivement converti en BMP.
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
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153
Figure 40 : Profil d’élution des lipides marqués avec le [3H]oléate après la première migration en CCM. Les macrophages RAW sont cultivés en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG ainsi qu’en présence de 0,2 µCi/mL de [3H]oléate pendant 24 h. La distribution de la radioactivité est analysée grâce au lecteur linéaire après la 1ère migration dans le système en CCM-2D comme décrit dans Matériels et Méthodes.
Figure 39 : Variation des quantités cellulaires de BMP, de PC et de PE après supplémentation des macrophages RAW avec différentes concentrations de 18:1/18:1-PG. Les cellules sont cultivées en absence ou en présence de concentrations croissantes de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Les PL (PC, PE et BMP) sont extraits, purifiés en CCM/HPLC et quantifiés comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les quantités de PL sont mesurées en nmol/mg de protéines et exprimées en % des valeurs contrôles (moyennes ± SD, n=3 au minimum). A, B, C, D : groupes significativement différents (ANOVA et test de Tukey-Kramer avec α=0,05). * : p≤0,05 et ** : p≤0,01 par rapport à la valeur théorique du contrôle de 100% (test de Student à 1 échantillon).
0
100
200
300
400
500
600
0 10 20 30 40 50 60
quan
tités
de
PL (%
des
con
trôl
es)
18:1/18:1-PG (µM)
BMP
PC
PE**
**
*
*A
DC
B
Contrôle 18:1/18:1-PG (30µM)
PC PCPE PEPI/PS/SM
PI/PS/SMCL/AG
CL/AG
BMP
BMP
LNLN
dépôt dépôtfront front
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
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Concernant la composition en acides gras des différents phospholipides nous
avons observé, en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG, une augmentation de la proportion
d’acide oléique (18:1n-9) dans l’ensemble des phospholipides et notamment dans le BMP où
le pourcentage passe de 51,2 % à 73,8% (Tableau 8). L’augmentation du pourcentage d’acide
Figure 41 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG.
Figure 42 : Chromatogrammes en HPLC des PE et du 18:1/18:1-PG. Les PE/PG sont extraits et purifiés par CCM-2D à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles (A), en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h (B), ou dans des conditions contrôles avec ajout de 18:1/18:1-PG sur le culot cellulaire juste avant analyse (C). Les PE/PG sont ensuite injectés en HPLC comme décrit dans Matériels et Méthodes.
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
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155
oléique dans le BMP est compensée par une diminution du pourcentage de l’ensemble des
autres acides gras. De plus, la conversion du pourcentage d’acide oléique en quantité d’acide
oléique associée au BMP suggère qu’à partir du 18:1/18:1-PG les cellules synthétisent
principalement du 18:1/18:1-BMP (résultats non montrés) et donc que les chaînes acyles sont
majoritairement préservées lors de la conversion du PG en BMP. La proportion d’acide
oléique augmente également dans les PC et PE mais cette augmentation est surtout compensée
par une diminution du pourcentage du 18:1n-7 et du 16:1. Ceci suggère que l’acide oléique
apporté via le 18:1/18:1-PG s’incorpore dans ces deux phospholipides par des mécanismes de
dé-acylation/ré-acylation ou des mécanismes de transacylation.
Tableau 8 : Composition en acides gras du BMP, des PC et des PE dans les macrophages RAW cultivés en présence de 18:1/18:1-PG. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Les PC, les PE et le BMP sont extraits, purifiés en CCM/HPLC et leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=3 au minimum). † : p≤0,05 par rapport aux contrôles respectifs (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 18:1n-9. tr : traces. nd : non détecté. DMA : dimethylacétals.
Contrôle 18:1/18:1-PG Contrôle 18:1/18:1-PG Contrôle 18:1/18:1-PG
Acides gras (30µM) (30µM) (30µM)
14:0 0,5 ± 0,2 0,2 ± 0,1 3,1 ± 0,4 3,3 ± 0,4 0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1
16:0 7,7 ± 1,4 2,7 ± 0,8 28,0 ± 1,8 26,2 ± 1,9 7,3 ± 1,0 6,1 ± 0,6
18:0 5,9 ± 0,8 2,6 ± 0,5 8,0 ± 0,4 6,4 ± 1,0 14,6 ± 1,0 15,3 ± 2,0
16:1n-9/n-7 4,4 ± 0,8 2,3 ± 0,4 10,2 ± 0,7 7,7 ± 1,0 3,9 ± 0,7 2,4 ± 0,3
18:1n-9 51,2 ± 3,0 73,8 ± 0,4 † 35,0 ± 2,1 47,1 ± 2,8 † 25,4 ± 1,9 31,9 ± 4,8 †
18:1n-7 16,8 ± 2,9 5,8 ± 1,7 11,5 ± 1,1 6,9 ± 1,0 6,3 ± 0,9 4,2 ± 0,1
18:2n-6 1,2 ± 0,2 1,0 ± 0,5 1,2 ± 0,2 0,7 ± 0,1 1,4 ± 0,2 1,0 ± 0,1
20:2n-6 tr tr tr tr 4,3 ± 0,7 7,3 ± 2,4
20:4n-6 0,7 ± 0,1 0,7 ± 0,2 1,0 ± 0,1 1,0 ± 0,2 9,5 ± 1,4 8,7 ± 0,3
20:5n-3 tr tr tr tr 1,1 ± 0,2 0,8 ± 0,1
22:5n-3 2,1 ± 0,6 1,9 ± 0,9 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,04 3,7 ± 0,6 2,8 ± 0,1
22:6n-3 7,4 ± 2,7 4,7 ± 1,7 0,6 ± 0,1 0,4 ± 0,0 3,9 ± 0,6 2,8 ± 0,1
16:0-DMA nd nd nd nd 10,5 ± 1,5 9,1 ± 1,0
18:0-DMA nd nd nd nd 5,6 ± 0,6 4,6 ± 0,7
18:1-DMA nd nd nd nd 3,1 ± 0,5 3,9 ± 0,8
PEPCBMP
mol %
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
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156
2.2.2 Localisation du BMP dans les macrophages RAW après supplémentation avec
du 18:1/18:1-PG
Nous avons ensuite cherché à déterminer la localisation subcellulaire du BMP
dans les macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ainsi qu’en présence de
18:1/18:1-PG. Pour cela nous avons utilisé l’anticorps anti-BMP et un anticorps secondaire
couplé à un fluorochrome comme décrit dans Matériels et Méthodes.
Le profil de distribution du BMP est identique dans les cellules incubées en
présence de 18:1/18:1-PG par rapport aux cellules contrôles. En effet, la fluorescence est
distribuée de manière ponctuée et périnucléaire (Figure 43) ce qui est caractéristique des
endosomes tardifs/lysosomes (Kobayashi et al., 1998b). Ainsi ces résultats suggèrent que le
18:1/18:1-PG ne modifie pas la distribution intracellulaire du BMP et que le BMP
nouvellement synthétisé est bien localisé dans les endosomes tardifs où a lieu la conversion
du PG en BMP. Toutefois nous ne pouvons pas exclure la possibilité que l’anticorps anti-
BMP ne reconnaisse que le BMP endogène et pas le BMP nouvellement synthétisé à partir du
PG. De plus, il est très difficile, par cette méthode, de juger de l’intensité de la fluorescence
comme indicateur de la quantité cellulaire de BMP car pour une même condition il existe une
variabilité importante de l’intensité de fluorescence entre les cellules.
Figure 43 : Localisation subcellulaire du BMP. Les macrophages RAW sont cultivés en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Les cellules sont fixées, perméabilisées puis incubées en présence de l’anticorps anti-BMP et d’un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome comme décrit dans Matériels et Méthodes. La distribution de la fluorescence est observée au microscope confocal.
contrôle 18:1/18:1-PG (30µM)
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
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157
2.2.3 Fractionnement cellulaire réalisé sur les cellules BHK après supplémentation
avec du 18:1/18:1-PG
Kobayashi et al. (1998b) ont mis au point et publié un protocole de
fractionnement cellulaire sur les cellules BHK permettant d’isoler par ultracentrifugation sur
gradient de sucrose les endosomes tardifs et les endosomes précoces des autres compartiments
cellulaires désignés alors comme des « membranes lourdes » (voir Matériels et Méthodes,
paragraphe 11). Nous avons donc utilisé cette lignée dans notre étude pour confirmer que le
BMP nouvellement synthétisé à partir du 18:1/18:1-PG s’accumule dans les mêmes
compartiments que le BMP endogène, les endosomes tardifs.
Dans un premier temps nous avons montré que dans les cellules BHK incubées en
présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG la quantité cellulaire de BMP est doublée (résultats non
montrés). Ensuite nous avons réalisé un fractionnement cellulaire sur des cellules contrôles et
des cellules supplémentées puis nous avons récupéré les fractions correspondant aux
endosomes tardifs, aux endosomes précoces et aux membranes lourdes. Sur chacune de ces
trois fractions, les phospholipides ont été séparés par CCM-2D sur des plaques HPTLC puis
révélés par pulvérisation d’acide et chauffage.
Conformément à la littérature, dans les cellules contrôles le BMP est retrouvé en
très grande majorité dans la fraction correspondant aux endosomes tardifs (Figure 44). On
retrouve également dans cette fraction la plupart des phospholipides majeurs comme les PC,
PE, PI, PS ainsi que des sphingomyélines (SM). En revanche, les endosomes tardifs et
précoces ne contiennent pas de cardiolipines (CL) qui ne sont présentes que dans les
membranes « lourdes » probablement en raison de la présence des mitochondries où sont
principalement localisées les CL. Dans les cellules incubées en présence de 18:1/18:1-PG la
quantité de BMP associée aux endosomes tardifs augmente de manière très claire alors que la
quantité de protéines n’est pas modifiée (résultats non montrés). De plus on ne retrouve du
BMP qu’à l’état de traces dans les endosomes précoces et les membranes « lourdes ». Ces
résultats indiquent que dans les cellules BHK le BMP nouvellement synthétisé à partir du PG
exogène est bien localisé, comme le BMP endogène, au niveau des endosomes tardifs.
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
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158
2.3 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur le trafic
intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL
Dans cette partie nous avons étudié les conséquences de l’accumulation de BMP
suite à l’incubation des macrophages RAW en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG sur le
métabolisme et le transport intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL. Lorsque cela est
indiqué nous avons utilisé deux agents pharmacologiques dont les effets sont connus afin de
pouvoir les comparer avec ceux observés dans les cellules ayant accumulé du BMP. Il s’agit
du U18666A qui bloque presque totalement le transport du cholestérol à partir des endosomes
tardifs et le F1394 qui inhibe presque totalement l’activité ACAT (>98%, Figure 47)
responsable de la ré-estérification du cholestérol libre dans le réticulum endoplasmique.
Figure 44 : Analyse de la composition en phospholipides des différentes fractions isolées à partir de fibroblastes BHK. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Les 3 fractions (endosomes tardifs, endosomes précoces et « membranes lourdes ») sont isolées sur gradient de sucrose par ultracentrifugation comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les phospholipides sont extraits et séparés par CCM-2D puis révélés par pulvérisation d’acides et chauffage.
contrôle
endosomestardifs
endosomesprécoces
membranes« lourdes »
BMP
PE
PC
PSPI
SM
BMP
PE
PC
PSPI
SM
BMP
PE
PC
PS
PI
SM
BMP
PE
PC
PS
PI
SM
BMP
PE
PC
PS
PI
SM
CL
BMP
PE
PC
PS
PI
SM
CL18:1/18:1-PG(30µM)
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
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159
2.3.1 Colocalisation du BMP et des LDL endocytées
Dans un premier temps nous avons vérifié qu’après endocytose les LDL
rejoignent bien les endosomes tardifs où le BMP est localisé. Pour cela des cellules contrôles
ont été incubées pendant 1 heure (« pulse ») en présence de LDL fluorescentes (DiI-LDL),
puis pendant 2 heures (« chase ») en absence de DiI-LDL. La localisation du BMP est
déterminée avec l’anticorps anti-BMP. Malgré une variabilité entre les cellules selon les
champs d’observation au microscope, on observe pour la majorité une colocalisation entre les
LDL fluorescentes et le BMP (Figure 45). Ceci indique que les LDL captées par les
macrophages RAW suivent la voie endocytique et aboutissent dans les endosomes
tardifs/lysosomes où est localisé le BMP.
Figure 45 : Colocalisation du BMP et des LDL endocytées dans les macrophages RAW. Les cellules sont incubées pendant 1 h en présence de 10 µg/mL de DiI-LDL (« pulse »), rincées puis incubées pendant 2 h en absence de DiI-LDL (« chase »). Les cellules sont fixées, perméabilisées puis incubées en présence de l’anticorps anti-BMP et d’un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome comme décrit dans Matériels et Méthodes. La distribution de la fluorescence est observée au microscope confocal. « Merge » : association de la fluorescence des DiI-LDL et du BMP.
DiI-LDL BMP
merge
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
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160
2.3.2 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la captation
des LDL
Dans une première expérience les macrophages RAW ont été pré-incubés dans
des conditions contrôles ou en présence des agents pharmacologiques U18666A ou F1394.
Les cellules sont ensuite incubées pendant 12 heures en présence de LDL reconstituées avec
du cholestéryl oléate radiomarqué ([3H]CO-LDL) afin de mesurer le taux de captation des
LDL comme décrit dans Matériels et Méthodes. La quantité de LDL radioactives captée par
les cellules est estimée en DPM/mg de protéines.
On remarque que la quantité de [3H]CO-LDL captée est augmentée dans les
cellules pré-incubées en présence de U18666A et diminuée dans les cellules pré-incubées en
présence de F1394 par rapport aux contrôles (Figure 46A). Ces deux résultats peuvent
s’expliquer en fonction des effets connus de ces deux agents pharmacologiques. Le U18666A
bloque le transport intracellulaire du cholestérol à partir des endosomes tardifs. Ainsi la
quantité de cholestérol diminue dans le réticulum endoplasmique ce qui induit une
augmentation de la synthèse des récepteurs aux LDL par le mécanisme de rétrocontrôle
dépendant du complexe SREBP (voir chapitre 1 des rappels bibliographiques) et donc une
augmentation de la captation des [3H]CO-LDL. Au contraire le F1394 est un inhibiteur de
l’enzyme ACAT responsable de l’estérification du cholestérol dans le réticulum
endoplasmique. Ainsi la quantité de cholestérol libre augmente dans le réticulum
endoplasmique ce qui induit, toujours grâce au rétrocontrôle exercé par SREBP, une
diminution de la synthèse des récepteurs aux LDL et donc une diminution de la captation des
[3H]CO-LDL.
Dans une deuxième expérience, les macrophages RAW ont été pré-incubés dans
des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG. Les cellules ont ensuite
été incubées pendant des temps croissants en présence de [3H]CO-LDL. On remarque que la
quantité de LDL captées par les cellules augmente en fonction du temps jusqu’à 18 heures
d’incubation. En revanche il n’y a pas de différence entre les cellules contrôles et les cellules
pré-incubées en présence de 18:1/18:1-PG. Ces résultats indiquent que l’accumulation de
BMP ne modifie pas la captation des LDL.
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
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161
2.3.3 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur l’hydrolyse
des esters de cholestérol dérivés des LDL
Afin de mesurer l’hydrolyse des esters de cholestérol (CE) contenus dans les
LDL, les cellules sont incubées pendant des temps croissants en présence de [3H]CO-LDL.
Après endocytose des LDL marquées, le [3H]CO est hydrolysé dans les endosomes tardifs
pour former du cholestérol libre radiomarqué ([3H]FC). Après extraction des lipides totaux, le
cholestérol libre et les esters de cholestérol sont séparés par CCM. La radioactivité associée
est mesurée et le taux d’hydrolyse est exprimé en pourcentage de [3H]FC par rapport à la
radioactivité totale. Toutefois le [3H]FC formé par hydrolyse du [3H]CO peut être ré-estérifié
dans le réticulum endoplasmique et former ainsi des esters de cholestérol radiomarqués
([3H]CE). Dans nos conditions de séparation en CCM, les [3H]CE nouvellement formés ne
peuvent être distingués du [3H]CO qui n’a pas encore été hydrolysé. C’est pourquoi nous
Figure 46 : Captation des [3H]CO-LDL dans les macrophages RAW. A : Les cellules sont pré-incubées en absence (contrôle) ou en présence de U18666A (3 µg/mL) ou de F1394 (2 µg/mL) pendant 24 h, puis incubées en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-LDL (moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1). B : Les cellules sont pré-incubées en absence (contrôle) ou en présence de30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h, puis incubées en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-LDL pendant des temps croissants (moyennes ± SD, n=3). Après rinçage, la radioactivité associée aux cellules est mesurée au compteur à scintillations comme décrit dans Matériels et Méthodes et les résultats sont exprimés en DPM / mg de protéines.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
1600
contrôle U18666A F1394
DPM
/ m
g pr
otéi
nes
A
0
500
1000
1500
2000
2500
6 h 12 h 18 hD
PM /
mg
prot
éine
sTemps (heures)
contrôle
18:1/18:1-PG
B
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
162
avons utilisé un inhibiteur de l’ACAT, le F1394, pour bloquer la ré-estérification du [3H]FC.
Ainsi la radioactivité associée aux CE que nous mesurons correspond uniquement au [3H]CO
initialement contenu dans les [3H]CO-LDL et qui n’a pas encore été hydrolysé.
Dans un premier temps nous avons voulu nous assurer que le F1394 induit bien
une inhibition totale ou presque de la ré-estérification du FC dans les macrophages RAW. Les
cellules ont été incubées en présence de LDL non marquées et de [3H]oléate qui est utilisé par
l’ACAT pour former du cholestéryl-[3H]oléate. Les lipides totaux sont extraits des cellules et
séparés par CCM. La distribution de la radioactivité entre les différentes classes de lipides est
alors déterminée grâce au lecteur de radioactivité linéaire. Comme indiqué dans la Figure 47
les phospholipides (PL) constituent la classe de lipides la plus fortement radiomarquée par le
[3H]oléate. On distingue également des diacyl- et des triacyl-glycérols, du [3H]oléate non
estérifié et des esters de cholestérol. On remarque que dans les cellules traitées avec le F1394
l’estérification du cholestérol est presque totalement inhibée (>98%).
Nous avons donc mesuré le taux d’hydrolyse du [3H]CO dérivé des LDL
radiomarquées en présence de F1394 dans des cellules contrôles et des cellules enrichies en
BMP. A tous les temps d’incubation la quantité totale de radioactivité présente dans les
cellules n’est pas modifiée (résultats non montrés), confirmant que l’accumulation de BMP ne
modifie pas la captation des [3H]CO-LDL. Après extraction et séparation par CCM la
Figure 47 : Effet du F1394 sur l’estérification du cholestérol stimulé par les LDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées en absence ou en présence de F1394 (2 µg/mL) pendant 24 h puis incubées en présence de LDL (50 µg/mL) et de [3H]oléate (0,5 µCi/mL) pendant 12 h. Les classes de lipides sont séparées par CCM et le profil d’élution des lipides radio-marqués est observé au lecteur de plaques Berthold. PL : phospholipides, DAG : diacyl-glycérosl, TG : triacyl-glycérols, AG : acides gras non estérifiés, CE : esters de cholestérol.
PL
DAG AG TG
CE
PL
DAG AG TG CE
- F1394 + F1394
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
163
radioactivité associée au FC et aux CE est mesurée. Dans les cellules contrôles, on remarque
que le [3H]CO est très rapidement hydrolysé après internalisation des LDL car le [3H]FC
devient majoritaire dès 2 heures d’incubation (Figure 48). A partir de 3 heures seule la
radioactivité associée au FC augmente, devenant largement majoritaire. Les mêmes
observations ont été faites dans les cellules enrichies en BMP (résultats non montrés).
Pour chaque temps d’incubation le pourcentage de [3H]FC par rapport à la
radioactivité totale ([3H]FC + [3H]CO) représente le taux d’hydrolyse du [3H]CO. Comme
indiqué dans la Figure 49, l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW ne modifie
pas l’hydrolyse des esters de cholestérol dérivés des LDL.
Figure 49 : Taux d’hydrolyse du [3H]CO dérivé de la captation des [3H]CO-LDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG ainsi qu’en présence de F1394 (2 µg/mL) pendant 24 h. Les cellules sont ensuite incubées en présence de [3H]CO-LDL (50 µg/mL) pendant des temps croissants. Après extraction et séparation des classes de lipides par CCM, la radioactivité associée au cholestérol libre ([3H]FC) et aux esters de cholestérol ([3H]CO) est mesurée au compteur à scintillation comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de [3H]FC par rapport à la radioactivité totale ([3H]FC + [3H]CO) (moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1).
0
100
200
300
400
500
600
700
800
0 2 4 6 8 10 12
DPM
/ m
g pr
otéi
nes
Temps (heures)
[3H]FC
[3H]CO
Figure 48 : Variation de la quantité de radioactivité associée au cholestérol libre ([3H]FC) et aux esters de cholestérol ([3H]CO) en présence de [3H]CO-LDL. Les macrophages RAW sont pré-incubés en présence de F1394 (2 µg/mL) pendant 24 h puis incubées en présence de [3H]CO-LDL (50 µg/mL) pendant des temps croissants. Après extraction et séparation des classes de lipides par CCM, la radioactivité associée au cholestérol libre ([3H]FC) et aux esters de cholestérol ([3H]CO) est mesurée au compteur à scintillation comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en DPM/mg de protéines (moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
0 2 4 6 8 10 12
% [3
H]F
C
Temps (heures)
contrôle
18:1/18:1-PG (30µM)
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
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164
2.3.4 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la ré-
estérification du cholestérol libre dérivé de la captation des LDL et des acLDL
Nous avons ensuite cherché à mesurer le taux de ré-estérification du cholestérol
libre dérivé des LDL dans des cellules contrôles et des cellules enrichies en BMP. Pour cela
nous avons utilisé des LDL et des acLDL reconstituées avec du [3H]FC ([3H]FC-LDL et
[3H]FC-acLDL). Au même titre que le cholestérol libre issu de l’hydrolyse des esters de
cholestérol, le [3H]FC présent dans les LDL captées par les cellules peut rejoindre le
réticulum endoplasmique à partir des endosomes tardifs et être ré-estérifié en [3H]CE. Après
incubation des cellules en présence de [3H]FC-LDL ou de [3H]FC-acLDL, le [3H]FC et les
[3H]CE cellulaires sont extraits et séparés par CCM. Le pourcentage de [3H]CE par rapport à
la radioactivité totale ([3H]FC + [3H]CE) permet d’estimer le taux de ré-estérification du FC.
Nous avons également mesuré l’effet du U18666A et du F1394 dans des cellules contrôles.
On retrouve comme attendu une inhibition presque totale de l’estérification du
[3H]FC par le F1394 qui est un inhibiteur de l’ACAT et par le U18666A qui bloque le
transport du FC des endosomes tardifs vers le réticulum endoplasmique où se trouve l’ACAT
(Figure 50). De plus, on observe une diminution d’environ 15% de l’estérification du [3H]FC
dérivé des LDL et des acLDL dans les cellules pré-incubées en présence de 30 µM de
18:1/18:1-PG. Ces résultats suggèrent que l’accumulation de BMP dans les cellules induit un
blocage partiel du transport du [3H]FC des endosomes tardifs vers le réticulum
endoplasmique.
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
165
2.3.5 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur l’efflux du
cholestérol stimulé par les HDL et la MβCD
L’efflux du cholestérol stimulé par les HDL et la méthyl-β-cyclodextrine (MβCD)
a ensuite été mesuré dans des cellules contrôles et des cellules enrichies en BMP. Nous avons
utilisé ici le même protocole que celui décrit dans les paragraphes 1.5.3 et 1.6 de la première
partie des résultats.
Le pourcentage de [3H]FC capté par les HDL augmente en fonction du temps
jusqu’à 8 heures d’incubation (Figure 51A). A tous les temps d’incubation on remarque que
dans les cellules pré-incubées en présence de 18:1/18:1-PG le pourcentage d’efflux est
significativement diminué par rapport aux cellules contrôles. Après 8 heures d’incubation
cette diminution est d’environ 30%.
Figure 50 : Taux de ré-estérification du cholestérol dérivé des [3H]FC-LDL et des [3H]FC-acLDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Des cellules contrôles sont également pré-incubées en présence de U18666A (3 µg/mL) ou de F1394 (2 µg/mL) pendant 24 h. Les cellules sont ensuite incubées pendant12 heures en présence de [3H]FC-LDL ou de [3H]FC-acLDL (50 µg/mL). Après extraction et séparation des classes de lipides par CCM, la radioactivité associée au cholestérol libre ([3H]FC) et aux esters de cholestérol ([3H]CE) est mesurée au compteur à scintillation comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentage de [3H]CE par rapport à la radioactivité totale ([3H]FC + [3H]CE) (moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1 représentatif de deux déterminations indépendantes).
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
[3H]FC-LDL [3H]FC-acLDL [3H]FC-LDL + U18666A
[3H]FC-LDL + F1394
% [3
H]C
Econtrôle
18:1/18:1-PG (30µM)
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
166
Dans nos conditions expérimentales la MβCD stimule rapidement l’efflux du
cholestérol. En effet, en absence de MβCD le pourcentage d’efflux est inférieur à 2% mais
passe à 15% après 5 minutes d’incubation en présence de 5 mM de MβCD et à 20% en
présence de 10 mM de MβCD (Figure 51B). Les résultats indiquent qu’en présence de
18:1/18:1-PG l’efflux du cholestérol stimulé par la MβCD est diminué d’environ 15% par
rapport aux contrôles.
L’ensemble de ces résultats suggère que l’accumulation de BMP dans les cellules
bloque partiellement le transport du cholestérol libre dérivé des LDL vers la membrane
plasmique à partir de laquelle il peut être efflué hors de la cellule grâce aux accepteurs que
sont les HDL et la MβCD.
Figure 51 : Efflux du cholestérol stimulé par les HDL et la MβCD dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Les cellules sont ensuite incubées pendant 8 heures en présence de 50 µg/mL de [3H]CO-LDL. Après rinçage l’efflux du [3H]FC est stimulé par incubation des cellules en présence de 100 µg/mL de HDL pendant des temps croissants (A, moyennes ± SD, n=3) ou en présence de 5 ou 10 mM de MβCD pendant 5 min. (B, moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1 représentatif de deux détermination indépendantes). Après la période d’efflux la radioactivité est comptée dans le milieu de culture et dans les cellules. L’efflux est exprimé en pourcentage de la radioactivité présente dans le milieu par rapport à la radioactivité totale (milieu + cellules). * p≤0,05 par rapport au contrôle respectif (test de Student à 2 échantillons).
0
5
10
15
20
25
0 mM 5 mM 10 mM
% E
fflux
(mβC
D)
[MβCD]
contrôle
18:1/18:1-PG (30µM)
0
5
10
15
20
25
30
35
0 2 4 6 8
% E
fflux
(HD
L)
Temps (heures)
contrôle
18:1/18:1-PG (30µM)
*
*
**
A B
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
167
2.3.6 Effets de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW sur la quantité
cellulaire d’esters de cholestérol après incubation en présence de acLDL
Nous avons montré que l’accumulation de BMP ne modifie pas la captation des
LDL ni l’hydrolyse des esters de cholestérol mais altère la redistribution du cholestérol vers le
réticulum endoplasmique et la membrane plasmique. Nous avons donc cherché à déterminer
si ces effets observés avec des traceurs radioactifs ont des conséquences sur les quantités de
cholestérol libre (FC) et d’esters de cholestérol (CE) qui s’accumulent dans les cellules
incubées en présence de LDL acétylées (acLDL).
Comme indiqué précédemment dans la première partie des résultats, la quantité
cellulaire de CE augmente en fonction du temps d’incubation des cellules en présence de
acLDL (Figure 52). Le cholestérol libre s’accumule également dans les cellules mais dans une
moindre mesure (résultats non montrés). On observe dans la Figure 52 une diminution
significative de la quantité d’esters de cholestérol dans les cellules pré-incubées en présence
de 18:1/18:1-PG. Ces résultats sont cohérents avec la diminution de l’estérification observée
précédemment et semble confirmer que l’accumulation de BMP dans les cellules altère le
transport du cholestérol dérivé des LDL vers le réticulum endoplasmique où il est ré-estérifié.
En revanche, les quantités cellulaires de FC ne sont pas modifiées dans les cellules enrichies
en BMP par rapport aux contrôles (résultats non montrés).
Après 12 heures d’incubation en présence de 100 µg/mL de acLDL, les CE
extraits des cellules contrôles contiennent 48% d’acide oléique (18:1) contre 58% dans les CE
extraits des cellules pré-incubées en présence de 18:1/18:1-PG (résultats non montrés). Cette
différence significative indique que l’oléate provenant du 18:1/18:1-PG est utilisé lors de
l’estérification du FC en CE par l’ACAT.
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
168
Discussion
Nous avons montré que dans les macrophages RAW cultivés dans des conditions
contrôles le BMP constitue un phospholipide mineur notamment par rapport aux PC et aux
PE. Le BMP représente en effet 3% des phospholipides totaux ce qui est toutefois supérieur à
ce qui a été décrit pour d’autres types cellulaires comme les BHK (Brotherus et Renkonen,
1974) ou les macrophages THP-1 (Besson et al., 2006) et la plupart des tissus animaux
(Rouser et al., 1969 ; Simon et Rouser, 1969), mais inférieur aux macrophages des alvéoles
pulmonaires où le BMP représente plus de 15% des phospholipides totaux (Mason et al.,
1972). La composition en acides gras du BMP dans les macrophages RAW est similaire à
celle observée dans les BHK (Kobayashi et al., 2002) et les macrophages THP-1 (Besson et
al., 2006) avec une grande proportion d’acide oléique (18:1n-9). De plus, comme pour les
macrophages THP-1 (Besson et al., 2006) et les cellules utérines UIII (Luquain et al., 2000), le
DHA est l’acide gras polyinsaturé majoritaire dans le BMP. Enfin nous avons montré à l’aide
de l’anticorps anti-BMP que dans les macrophages RAW le BMP est localisé dans des
structures intracellulaires péri-nucléaires et ponctuées caractéristiques des endosomes
Figure 52 : Accumulation d’esters de cholestérol stimulée par les acLDL dans les macrophages RAW. Les cellules sont pré-incubées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG pendant 24 h. Les cellules sont ensuite incubées en présence de 100 µg/mL de acLDL pendant des temps croissants. Les esters de cholestérol (CE) sont extraits, séparées des autres classes de lipides par CCM et quantifiés en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés nmol / mg de protéines (moyennes ± SD, n=3). * p≤0,05 par rapport au contrôle respectif (test de Student à 2 échantillons).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
0 2 4 6 8
CE
(nm
ol/m
g pr
otéi
nes)
Temps (heures)
contrôle
18:1/18:1-PG (30µM)
*
*
*
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
169
tardifs/lysosomes comme cela a été montré dans d’autres types cellulaires (Besson et al., 2006
; Kobayashi et al., 1998b).
Il a été clairement établi dans de nombreuses études menées par l’équipe de Waite
que le PG exogène peut être converti en BMP notamment par les macrophages RAW. Nous
avons montré qu’une supplémentation des cellules avec 30 µM de 18:1/18:1-PG sous forme
de liposomes entraîne une augmentation d’un facteur 4 de la quantité cellulaire de BMP. De
plus, Amidon et al. (1995) ont montré à l’aide de PG radiomarqué que les seules espèces qui
se forment sont le lyso-PG, l’acyl-PG et le BMP qui est le seul à s’accumuler dans les
cellules, les autres espèces étant des intermédiaires dans la conversion du PG en BMP. Nos
observations semblent confirmer ces résultats car les quantités de PC et de PE ne sont pas
modifiées en présence de 18:1/18:1-PG et ce dernier ne s’accumule pas dans les cellules.
De plus nous avons montré qu’à partir du 18:1/18:1-PG les cellules synthétisent
principalement du 18:1/18:1-BMP suggérant que les chaînes acyles sont conservées lors de la
conversion du PG exogène en BMP. Dans ses études sur la voie de biosynthèse du BMP à
partir du PG exogène l’équipe de Waite a proposé que la première étape mette en jeu une
PLA2 qui hydrolyse le résidu acyle estérifié en position sn-2 du PG (Amidon et al., 1995 ;
Amidon et al., 1996). Une PLA2 lysosomale spécifique du PG a été purifiée à partir de
macrophages RAW et caractérisée (Shinozaki et Waite, 1999). Cette PLA2 possède une
grande affinité vis-à-vis de l’oléate. Ceci pourrait expliquer l’efficacité de la synthèse de BMP
à partir du 18:1/18:1-PG avec une augmentation d’un facteur 2 de la quantité de BMP à
seulement 5 µM de 18:1/18:1-PG. Il a également été postulé que la deuxième étape dans la
voie de biosynthèse du BMP nécessite la ré-acylation du produit intermédiaire, le lyso-PG,
par une réaction de transacylation impliquant d’autres phospholipides comme donneurs
d’acyles (Huterer et Wherrett, 1989 ; Matsuzawa et al., 1978 ; Waite et al., 1987). Il avait été
initialement proposé une voie de biosynthèse dans laquelle le squelette glycérophosphate du
PG était conservé mais pas les chaînes acyles. Toutefois, la même équipe a par la suite décrit
dans les macrophages RAW une transacylase qui utilise deux molécules de lyso-PG pour
former du BMP, une comme donneuse d’acyle, l’autre comme accepteuse (Heravi et Waite,
1999). Cette activité est cohérente avec nos résultats qui semblent indiquer que le PG exogène
fournit à la fois le squelette glycérophosphate et les chaînes acyles pour la synthèse du BMP.
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
170
Le PG a aussi été décrit comme un précurseur des cardiolipines (CL) (Ohtsuka et
al., 1993 ; Schlame et Hostetler, 1997). Dans notre étude nous n’avons pas observé de
modification de la quantité de CL dans les macrophages RAW cultivés en présence de
18:1/18:1-PG (résultats non montrés). Ceci est toutefois cohérent avec les résultats de
plusieurs études qui ont mis en évidence une régulation complexe de la synthèse des CL qui
ne dépend pas seulement de la quantité de précurseur disponible. En effet il a été montré
qu’une très forte augmentation de la quantité de PG dans les cellules CHO n’induit pas
d’accumulation de CL (Esko et Raetz, 1980). Plus récemment il a été observé dans les cellules
CHO que l’augmentation de la synthèse de PG par surexpression de la PGP synthase n’est pas
associée à une augmentation de la synthèse de CL (Hullin-Matsuda et al., 2007).
Dans cette étude, notre objectif de départ consistait à réaliser des études
fonctionnelles sur le métabolisme et le transport intracellulaire du cholestérol dans des
cellules enrichies en BMP afin de mieux comprendre son rôle dans les fonctions endosomales.
Il était donc important que dans les cellules enrichies le BMP nouvellement synthétisé
présente la stéréoconfiguration particulière sn-1:sn-1’ (Matsuo et al., 2004). Or il a été montré
que lors de la conversion du sn-3:sn-1’ PG en BMP la stéréoconfiguration du carbone
asymétrique présent dans le glycérol primaire est inversée et que le BMP qui s’accumule
possède donc la stéréoconfiguration sn-1:sn-1’ (Thornburg et al., 1991). De plus, l’utilisation
du 18:1/18:1-PG comme précurseur permet de ne pas trop modifier la composition en acide
gras du BMP par rapport aux cellules contrôles. En effet, dans les cellules supplémentées
l’acide gras majoritaire du BMP reste l’acide oléique. Enfin, il était également nécessaire de
vérifier que le BMP nouvellement synthétisé est bien localisé dans les mêmes structures que
le BMP endogène. Nous avons ainsi montré à l’aide de l’anticorps anti-BMP que dans les
macrophages RAW supplémentés avec le 18:1/18:1-PG la distribution intracellulaire du BMP
n’est pas modifiée par rapport aux cellules contrôles. De plus, dans les cellules BHK où la
présence de 18:1/18:1-PG induit également une augmentation de la quantité de BMP nous
avons montré par fractionnement cellulaire que le BMP reste associé presque exclusivement à
la fraction correspondant aux endosomes tardifs. Ces résultats peuvent s’expliquer par le fait
que la synthèse du BMP à partir du 18:1/18:1-PG a lieu dans les endosomes tardifs/lysosomes
et utilise les enzymes présentes dans les cellules. Le BMP nouvellement synthétisé se retrouve
ainsi associé aux membranes contenant le BMP endogène.
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
171
Dans cette partie nous avons également présenté nos résultats préliminaires
concernant l’étude des conséquences de l’accumulation de BMP dans les macrophages RAW
sur le métabolisme et le transport intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL.
L’enrichissement des cellules en BMP ne modifie pas la captation des LDL ni l’hydrolyse des
esters de cholestérol (CE) de ces LDL. En revanche, la ré-estérification du cholestérol libre
dérivé des LDL est diminuée d’environ 15%. Nous avons également observé une diminution,
de 15 à 20%, de l’efflux du cholestérol libre dérivé des LDL stimulé par les HDL ou la
MβCD. Contrairement aux LDL natives, les LDL acétylées (acLDL) permettent d’induire une
forte accumulation de cholestérol dans les cellules, principalement sous forme estérifiée. Nous
avons montré que la quantité d’esters de cholestérol qui s’accumule dans les cellules enrichies
en BMP est inférieure à celle qui s’accumule dans les cellules contrôles en présence de
acLDL, en accord avec une diminution de la ré-estérification du cholestérol. Ainsi, l’ensemble
de ces résultats suggère que l’accumulation de BMP dans les macrophages altère à la fois la
redistribution du cholestérol libre des endosomes tardifs vers le réticulum endoplasmique où il
peut être ré-estérifié, et vers la membrane plasmique où il peut être efflué hors de la cellule
grâce aux accepteurs HDL et MβCD. Une partie du cholestérol dérivé des LDL resterait donc
bloqué dans les endosomes tardifs des cellules ayant accumulé du BMP. Chevallier et al.
(2008) ont très récemment décrit des effets similaires avec une approche différente. En effet
dans cette étude les auteurs ont montré qu’une diminution de la quantité de BMP induite par
la sous-expression de la protéine ALIX induit également une diminution de la quantité de
cholestérol dans les endosomes tardifs. De plus cette diminution est réversible par
supplémentation des cellules avec du BMP exogène. Ces résultats suggèrent que la quantité
de BMP joue un rôle direct dans la capacité des endosomes tardifs à stocker le cholestérol.
Une augmentation de la quantité de BMP dans les endosomes tardifs augmenterait alors leur
capacité à stocker et à retenir le cholestérol dérivé des LDL, ce qui est en accord avec nos
observations.
A ce stade de l’étude il est important de noter que certains des résultats présentés
ci-dessus sont des résultats préliminaires (n=1) que nous devrons confirmer et consolider par
différents contrôles. Nous devrons notamment nous assurer que les effets observés dans les
cellules supplémentées en 18:1/18:1-PG résultent de l’accumulation de BMP et non de la
présence de liposomes dans le milieu ou de l’apport accru en oléate. A ce titre, des études ont
montré que l’oléate peut modifier l’activité ACAT, ce qui pourrait expliquer les effets sur
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
172
l’estérification du cholestérol dans les cellules supplémentées avec le 18:1/18:1-PG.
Toutefois, les auteurs rapportent plutôt une augmentation de l’estérification du cholestérol en
présence d’oléate (McCloskey et al., 1988 ; Rumsey et al., 1995) alors que nous observons un
effet inverse en présence de 18:1/18:1-PG. Pour confirmer que le transport du cholestérol vers
la membrane plasmique est altéré dans les cellules ayant accumulé du BMP, il serait
intéressant d’utiliser les techniques décrites dans la première partie qui utilisent
l’amphotéricine B et la cholestérol oxydase pour évaluer la quantité de cholestérol présente
dans la membrane plasmique.
La mesure du cholestérol cellulaire total n’a pas permis de montrer
d’accumulation de cholestérol libre (FC) dans les cellules enrichies en BMP. Toutefois, cela
n’exclut pas la possibilité que la quantité de FC soit effectivement augmentée dans les
endosomes tardifs, cette augmentation pouvant être masquée du fait que la fraction de FC
libre contenue dans les endosomes tardifs est certainement mineure par rapport au FC total. Il
serait donc intéressant de pouvoir observer directement une augmentation de la quantité de
cholestérol libre dans les endosomes tardifs des cellules supplémentées par rapport aux
cellules contrôles. La méthode de marquage du cholestérol intracellulaire avec la filipine est
difficile à envisager car la fluorescence est déjà très forte dans les cellules contrôles (non
montré), ne permettant probablement pas de distinguer une augmentation dans les cellules
enrichies en BMP. En revanche il serait possible de mettre au point un protocole de
fractionnement cellulaire sur les macrophages RAW permettant d’isoler des fractions
enrichies en BMP voire d’isoler une fraction pure d’endosomes tardifs. Nous pourrions alors
vérifier, soit par dosage du cholestérol libre en GC-MS soit en étudiant la répartition entre les
différentes fractions du [3H]FC dérivé de LDL marquées, si le cholestérol reste en partie
bloqué dans les endosomes tardifs des cellules ayant accumulé du BMP.
Si l’accumulation de BMP perturbe l’organisation et la dynamique des
membranes internes des endosomes tardifs, il pourrait être intéressant de déterminer si le
recyclage du récepteur au mannose-6-phosphate (M6P) via les endosomes tardifs est aussi
altéré, comme cela a été montré dans des cellules traitées avec l’anticorps anti-BMP
(Kobayashi et al., 1998b). De plus il a été montré sur des fibroblastes en culture que la perte
de récepteur au M6P induit une accumulation de BMP dans les endosomes tardifs et la
formation de structures membranaires aberrantes (Reaves et al., 2000).
Enfin, nous pourrions envisager d’augmenter la quantité cellulaire de BMP par un
autre moyen que le 18:1/18:1-PG et de vérifier que si induit les mêmes effets sur le transport
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
173
du cholestérol à partir des endosomes tardifs. Une possibilité serait de surexprimer la PGP
synthase dans les macrophages RAW pour augmenter la synthèse de PG endogène et donc
celle de BMP comme cela a été montré sur les cellules CHO (Hullin-Matsuda et al., 2007).
Selon une étude réalisée sur des liposomes, le BMP semble jouer un rôle
important dans la structuration multi-vésiculaire des endosomes tardifs (Matsuo et al., 2004).
De plus les études réalisées avec l’anticorps anti-BMP ont suggéré que le BMP est essentiel à
la redistribution du cholestérol dérivé des LDL à partir des endosomes tardifs. Les présents
résultats semblent indiquer qu’une augmentation de la quantité cellulaire de BMP altère
également la sortie du cholestérol depuis les endosomes tardifs vers le réticulum
endoplasmique et la membrane plasmique. Dans le cas de l’anticorps, des altérations
structurales des endosomes tardifs ont été observées (Kobayashi et al., 1999). Bien que nous
ne disposions pas de données à ce sujet, il est possible qu’une accumulation excessive de
BMP dans les endosomes tardifs modifie également l’organisation des membranes
endosomales. On peut ainsi avancer l’hypothèse que la fonction du BMP dans l’organisation
et la dynamique des membranes internes des endosomes tardifs dépend du maintien de la
proportion de BMP dans ces membranes.
Si on s’intéresse plus précisément aux effets induits par l’accumulation de BMP,
on peut se demander si une augmentation non contrôlée du BMP dans les endosomes tardifs
des macrophages présents dans l’espace sous-endothélial pourrait contribuer aux processus
d’athérosclérose en limitant l’efflux de cholestérol. Bien que cette perspective soit prématurée
au stade de nos observations, il serait intéressant de comparer les quantités de BMP présentes
dans des macrophages spumeux isolés de plaques d’athéromes à différents stades d’évolution.
Il existe par ailleurs des pathologies pour lesquelles il a été décrit une forte
accumulation de BMP. Il s’agit de certaines phospholipidoses caractérisées par des désordres
métaboliques d’origine lysosomale comme la maladie de Niemann-Pick de type C (NPC)
(Harder et al., 1984 ; Nakashima et al., 1984 ; Rouser et al., 1968). En plus de l’accumulation
de BMP, le syndrome NPC se caractérise par une altération du transport du cholestérol à
partir des endosomes tardifs et par une accumulation de cholestérol libre (Vance, 2006). Ce
syndrome est causée par des mutations sur les protéines NPC1 et NPC2 présentes dans les
endosomes tardifs et qui participent au transport du cholestérol à partir des endosomes tardifs
RESULTATS DEUXIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
174
(Cheruku et al., 2006 ; Garver et Heidenreich, 2002 ; Ko et al., 2001). Nos résultats suggèrent
que l’accumulation de BMP observée chez des patients atteints de la maladie NPC pourrait
également participer à la dérégulation du transport intracellulaire du cholestérol et accentuer
l’accumulation de cholestérol dans les endosomes tardifs. Alternativement l’équipe du Dr.
Jean Gruenberg à récemment proposé un mécanisme opposé (Chevallier et al., 2008). En effet
il a été montré que la supplémentation avec du BMP exogène de fibroblastes NPC présentant
une accumulation de cholestérol dans les endosomes tardifs, facilite l’efflux du cholestérol à
partir des endosomes tardifs. Les auteurs proposent que le BMP soit un facteur limitant dans
la maladie de Niemann-Pick de type C et que l’augmentation du BMP associée au phénotype
NPC soit due à un mécanisme compensatoire, mais insuffisant, visant à faciliter le stockage
du cholestérol retenu dans les endosomes tardifs en raison des mutations des protéines NPC1
et NPC2.
RESULTATS TROISIEME PARTIE
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
175
TROISIEME PARTIE
Dégradation sélective du BMP en présence de fortes
concentrations de DHA
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
176
Introduction
Il a été montré dans de nombreux types cellulaires en culture que le DHA
s’incorpore très rapidement et de manière hautement sélective dans le BMP par rapport aux
autres phospholipides. Il a ainsi été proposé que cette propriété soit commune à l’ensemble
des cellules de mammifères. Le BMP présente un métabolisme rapide de ses chaînes acyles
mais il a également été montré que l’incorporation du DHA dans le BMP est beaucoup plus
rapide et plus forte que celle de l’AA (20:4n-6) ou de l’EPA (22:6n-3) suggérant un rôle
essentiel du BMP dans le métabolisme du DHA (voir chapitre 4 des rappels
bibliographiques). Toutefois, ni les mécanismes ni les conséquences fonctionnelles de
l’avidité du BMP pour le DHA n’ont été précisément étudiés.
Dans un tout autre contexte, de nombreuses études menées chez l’Homme ont
rapporté le rôle bénéfique des acides gras oméga-3 et du DHA en particulier dans la
prévention des pathologies cardiovasculaires comme l’athérosclérose (voir chapitre 3 des
rappels bibliographiques). Cependant les bases cellulaires de cet effet protecteur du DHA,
notamment dans les macrophages, ne sont pas encore bien comprises.
Les résultats présentés dans les deux parties précédentes indiquent que le BMP est
impliqué dans la régulation du métabolisme intracellulaire du cholestérol dérivé des LDL et
qui transite via les endosomes tardifs. Nous nous sommes donc intéressés à mettre en
évidence un éventuel lien, au niveau cellulaire, entre le BMP, son avidité pour le DHA, et le
métabolisme du cholestérol.
Lorsque le DHA est apporté sous forme non estérifiée aux cellules il s’incorpore
dans l’ensemble des phospholipides. En nous appuyant sur les résultats obtenus avec le
18:1/18:1-PG, nous avons envisagé qu’un apport en DHA sous forme de liposomes de PG
possédant deux résidus DHA (22:6/22:6-PG) pourraient favoriser un enrichissement
spécifique du BMP en DHA. Notre hypothèse était que les cellules pourraient ainsi
synthétiser et accumuler du BMP riche en DHA. Contrairement à cette hypothèse nous avons
d’abord remarqué qu’en présence de 22:6/22:6-PG l’enrichissement en DHA n’était pas
spécifique du BMP car l’ensemble des phospholipides incorporait du DHA de manière non
négligeable. De plus, nous avons observé qu’en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG la
quantité cellulaire de BMP était diminuée par rapport aux cellules contrôles. Ce résultat très
inattendu nous a amené à nous intéresser plus précisément à ce phénomène qui a également
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
177
été observé en présence de fortes concentrations de DHA non estérifié et qui est apparu
réversible par addition de vitamine E comme anti-oxydant. L’ensemble des résultats de cette
étude nous a conduit à proposer un rôle anti-oxydant du BMP riche en DHA spécifiquement
dans les endosomes tardifs notamment vis-à-vis du cholestérol.
3.1 Effets d’une supplémentation des macrophages RAW avec des liposomes de
22:6/22:6-PG
Les macrophages RAW ont été incubés en présence 10 et 30 µM de 22:6/22:6-PG
sous forme de liposomes. A 10 µM le 22:6/22:6-PG induit seulement une faible augmentation
de la quantité cellulaire de BMP. Contrairement aux résultats obtenus avec le 18:1/18:1-PG
nous avons observé qu’à la concentration de 30 µM, le 22:6/22:6-PG induit une forte
diminution (environ 50%) de la quantité cellulaire de BMP (Figure 53). Nous avons vérifié
que dans ces conditions la viabilité cellulaire n’est pas affectée (98 ± 4 % par rapport aux
cellules contrôles, évalué avec un test au MTT, n=3) suggérant qu’à la concentration de 30
µM le 22:6/22:6-PG ne présente pas d’effet toxique sur les cellules.
Par rapport à l’acide oléique (18:1n-9) qui ne contient qu’une seule insaturation, le
DHA est décrit pour être hautement sensible à la peroxydation lipidique (Cosgrove et al.,
1987) (voir chapitre 5 des rappels bibliographiques). Nous avons donc incubé les cellules en
présence de 22:6/22:6-PG (30 µM) et de vitamine E (α-tocophérol) comme anti-oxydant. La
vitamine E est incorporée dans les liposomes à raison de 1 molécule pour 100 insaturations.
Comme indiqué dans la Figure 53 on observe que la vitamine E prévient la diminution de la
quantité cellulaire de BMP et induit une augmentation d’un facteur 3, proche de celle
observée précédement avec le 18:1/18:1-PG.
En revanche les quantités cellulaires de PC et de PE ne sont pas fortement
modifiées en présence de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E.
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
178
Ces variations de la quantité de BMP sont également associées à des variations de
sa composition en acides gras. L’incubation des cellules en présence de 10 µM de 22:6/22:6-
PG induit une augmentation modérée, d’un facteur 2, du pourcentage de DHA dans le BMP
(résultats non montrés). En revanche, dans les cellules incubées en présence de 30 µM de
22:6/22:6-PG le pourcentage de DHA dans le BMP atteint 50%, malgré la diminution de la
quantité de BMP (Tableau 9). L’augmentation du pourcentage de DHA dans le BMP est
principalement compensée par une diminution du pourcentage d’acide oléique. En effet, le
pourcentage des acides gras saturés (principalement 16:0 et 18:0) n’est pas modifié voire
légèrement augmenté. La présence de vitamine E induit une augmentation encore plus
importante de la proportion de DHA dans le BMP. Celui-ci représente alors 85% de
l’ensemble des acides gras.
Comme indiqué dans les Tableau 10 Tableau 11, l’incubation des cellules en
présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG induit également une augmentation du pourcentage de
Figure 53 : Variation des quantités cellulaires de BMP, de PC et de PE en présence de 22:6/22:6-PG. Les cellules sont cultivées en absence ou en présence de 10 ou 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les PC, les PE et le BMP sont extraits, purifiés et quantifiés comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les quantités de phospholipides sont mesurées en nmol/mg de protéines et exprimées en % des valeurs contrôles (moyennes ± SD, n=3 au minimum). A, B, C : groupes significativement différents (ANOVA et test de Tukey-Kramer avec α=0,05). * p≤0,05 et ** p≤0,01 par rapport à la valeur théorique du contrôle de 100% (test de Student à 1 échantillon).
0
50
100
150
200
250
300
350
400
BMP PC PE
quan
tités
de
PL (%
des
con
trôl
es)
22:6/22:6-PG (10µM)
22:6/22:6-PG (30µM)
22:6/22:6-PG (30µM) + vitamine E
B
C
**
**
*A
* *
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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179
DHA dans les PE et les PC, mais dans une moindre mesure. En effet celui-ci atteint 26 %
dans les PE et 7 % dans les PC. De plus, la présence de vitamine E n’induit pas de
modification significative de la composition en acides gras de ces deux phospholipides.
L’augmentation du pourcentage de DHA est compensée dans les PC et les PE par une
diminution de l’acide oléique ainsi que des autres acides gras polyinsaturés comme l’acide
arachidonique (20:4n-6).
Tableau 9 : Variation de la composition en acides gras du BMP dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Le BMP est extrait, purifié et sa composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle (test de Student à 2 échantillons). # : p≤0,05 par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3.
Acides gras- vitamine E + vitamine E
14:0 0,5 ± 0,2 0,9 ± 0,2 0,2 ± 0,1
16:0 7,7 ± 1,4 8,9 ± 1,4 1,7 ± 0,4
18:0 5,9 ± 0,8 6,8 ± 1,1 1,1 ± 0,3
16:1n-9/n-7 4,4 ± 0,8 1,9 ± 0,5 0,7 ± 0,1
18:1n-9 51,2 ± 3,0 23,0 ± 4,2 5,8 ± 0,8
18:1n-7 16,8 ± 2,9 7,4 ± 2,3 1,4 ± 0,3
18:2n-6 1,2 ± 0,2 1,6 ± 0,8 0,5 ± 0,2
20:4n-6 0,7 ± 0,1 0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1
22:5n-3 2,1 ± 0,6 0,9 ± 0,6 1,7 ± 0,8
22:6n-3 7,4 ± 2,7 48,5 ± 7,1 † 84,7 ± 4,7 †, #
22:6/22:6-PGContrôle
mol %
BMP
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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180
Tableau 10 : Variation de la composition en acides gras des PE dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les PE sont extraites, purifiées et leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle (test de Student à 2 échantillons). ns : non significatif par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3. tr : traces. DMA : dimethylacétals.
Acides gras- vitamine E + vitamine E
14:0 0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1
16:0 7,3 ± 1,0 6,5 ± 0,8 6,1 ± 0,9
18:0 14,6 ± 1,0 17,9 ± 1,4 17,6 ± 2,3
16:1n-9/n-7 3,9 ± 0,7 2,3 ± 0,5 1,8 ± 0,1
18:1n-9 25,4 ± 1,9 13,3 ± 1,5 13,3 ± 1,6
18:1n-7 6,3 ± 0,9 4,0 ± 0,5 3,8 ± 0,3
18:2n-6 1,4 ± 0,2 0,9 ± 0,2 0,8 ± 0,0
20:2n-6 4,3 ± 0,7 tr tr
20:4n-6 9,5 ± 1,4 6,0 ± 0,7 6,1 ± 0,7
20:5n-3 1,1 ± 0,2 0,7 ± 0,1 0,8 ± 0,1
22:5n-3 3,7 ± 0,6 2,0 ± 0,2 2,1 ± 0,3
22:6n-3 3,9 ± 0,6 26,3 ± 1,4 † 25,7 ± 0,9 †, ns
16:0-DMA 10,5 ± 1,5 9,8 ± 1,4 11,2 ± 1,3
18:0-DMA 5,6 ± 0,6 5,7 ± 0,7 5,9 ± 0,5
18:1-DMA 3,1 ± 0,5 3,4 ± 0,8 2,6 ± 0,3
mol %
Contrôle22:6/22:6-PG
PE
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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181
Dans notre système HPLC la détection du BMP est réalisée par une lecture de
l’absorption en UV à 205 nm. L’intensité du signal dépend donc à la fois de la quantité de
BMP et du nombre de doubles liaisons de ces chaînes acyles. Ainsi une augmentation du
pourcentage de DHA dans le BMP induit une augmentation du signal même en l’absence
d’une d’augmentation de la quantité de BMP. On remarque que dans les cellules incubées en
présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG, le BMP migre toujours en 3 pics avec une intensité de
signal légèrement plus importante (Figure 54). Dans les cellules incubées en présence de 30
µM de 22:6/22:6-PG + vitamine E, le BMP migre en 3 pics mais avec une intensité du signal
Tableau 11 : Variation de la composition en acides gras des PC dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les PC sont extraites, purifiées et leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle (test de Student à 2 échantillons). ns : non significatif par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3.
Acides gras- vitamine E + vitamine E
14:0 3,1 ± 0,4 3,0 ± 0,2 3,0 ± 0,3
16:0 28,0 ± 1,8 36,1 ± 2,1 37,1 ± 2,6
18:0 8,0 ± 0,4 8,1 ± 0,3 8,1 ± 0,5
16:1n-9/n-7 10,2 ± 0,7 7,1 ± 0,0 6,8 ± 0,6
18:1n-9 35,0 ± 2,1 22,4 ± 2,9 22,9 ± 3,1
18:1n-7 11,5 ± 1,1 9,1 ± 0,9 8,6 ± 0,8
18:2n-6 1,2 ± 0,2 1,4 ± 0,2 4,4 ± 0,1
20:4n-6 1,0 ± 0,1 1,7 ± 0,1 2,0 ± 0,2
22:5n-3 0,4 ± 0,1 0,7 ± 0,1 0,6 ± 0,1
22:6n-3 0,6 ± 0,1 6,9 ± 1,7 † 8,0 ± 1,6 †, ns
mol %
Contrôle22:6/22:6-PG
PC
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
182
très fortement augmentée, ce qui est cohérent avec à la fois une augmentation de la quantité
de BMP et un très fort enrichissement en DHA. Les 3 pics caractéristiques du BMP sont
augmentés de manière quasi proportionnelle entre les cellules contrôles et les cellules traitées.
Ceci suggère que la structure du BMP n’est pas profondément modifiée en présence de
22:6/22:6-PG et que les 3 pics sont composés d’espèces moléculaires du BMP contenant du
DHA.
L’effet protecteur de la vitamine E qui est un puissant anti-oxydant suggère que la
diminution de la quantité de BMP en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG est due à un
mécanisme de peroxydation lipidique. Le dialdéhyde malonique (MDA) peut être considéré
comme un marqueur global de la peroxydation lipidique (Vericel et al., 2003). Nous avons
Figure 54 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E.
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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183
montré que dans les cellules incubées en présence de 22:6/22:6-PG la quantité cellulaire de
MDA est augmentée d’un facteur 1,6 par rapport aux cellules contrôles (Figure 55). En
comparaison, dans les cellules incubées en présence de 22:6/22:6-PG + vitamine E on
retrouve une quantité cellulaire de MDA correspondant au niveau basal. Ces résultats
supportent notre hypothèse que l’effet protecteur de la vitamine E sur la diminution de la
quantité de BMP est dû à son action anti-oxydante plutôt qu’à d’autres effets décrits (Azzi et
Stocker, 2000).
Les plasmalogènes-PE, en raison de la chaîne alkényle en position sn-1, sont
décrits comme des phospholipides particulièrement sensibles à la peroxydation lipidique.
Notre méthode de quantification des PE par dosage de ses acyles gras nous permet de
déterminer la quantité de plasmalogènes-PE en ne tenant compte dans nos calculs que des
Figure 55 : Variation des quantités de MDA dans les macrophages RAW en présence de 22:6/22:6-PG. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les quantités cellulaires de MDA sont déterminées par HPLC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pmol/mg de protéines (moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1 représentatif de 3 déterminations indépendantes). A, B : groupes significativement différents (ANOVA et test de Tukey-Kramer avec α=0,05).
0
50
100
150
200
contrôle - vitamine E + vitamine E
MD
A (p
mol
/mg
prot
éine
s)
B
A
A
22:6/22:6-PG (30 µM)
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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184
DMA identifiés sur les chromatogrammes obtenus en GC. Les quantités cellulaires de
plasmalogènes-PE ne sont pas significativement modifiées lorsque les cellules sont incubées
en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG (13,4 ± 3,1 nmol/mg-prot) ou en présence de 30 µM
de 22:6/22:6-PG + vitamine E (14,2 ± 2,3 nmol/mg-prot) par rapport aux cellules contrôles
(10,7 ± 2,2 nmol/mg-prot). Ces résultats indiquent que les différents traitements n’induisent
pas de peroxydation des plasmalogènes-PE.
3.2 Effets d’une supplémentation des macrophages RAW avec des concentrations
croissantes de DHA non estérifié
Lorsque les cellules sont supplémentées avec 30 µM de 22:6/22:6-PG en présence
de vitamine E elles accumulent du BMP riche en DHA. Au contraire, en absence de vitamine
E on observe une diminution de la quantité de BMP, mais également associée à un
enrichissement en DHA. Nous avons donc cherché à déterminer si cette diminution de la
quantité cellulaire de BMP était due à un fort enrichissement du BMP en DHA ou si cet effet
était lié à l’apport très particulier du DHA via le 22:6/22:6-PG sous forme de liposomes. En
effet, d’après la littérature, ces liposomes sont supposés être captés par les cellules et suivre la
voie endocytique jusqu’aux endosomes tardifs/lysosomes où le PG peut être converti en BMP.
Les cellules ont donc été incubées en présence de concentrations croissantes de
DHA non estérifié, de 5 à 100 µM. Celui-ci est apporté sous forme liée à l’albumine présente
dans le sérum de veau fœtal utilisé pour supplémenter le milieu de culture des cellules.
Dans ces conditions, on observe une augmentation dose-dépendante du pourcentage de DHA
dans l’ensemble des phospholipides étudiés (Figure 56). Dans les PC où le DHA représente
moins de 1% de l’ensemble des acides gras à l’état basal, le pourcentage de DHA augmente
de manière quasi linéaire pour atteindre 25% à la plus forte concentration (Figure 56 et
Tableau 14). Dans les PE, le pourcentage de DHA augmente plus rapidement mais atteint un
plateau autour de 60 µM où le DHA représente alors 40% de l’ensemble des acides gras
(Figure 56 et Tableau 13). On observe cependant que le DHA s’incorpore beaucoup plus
efficacement et fortement dans le BMP. En effet le pourcentage de DHA dans le BMP
dépasse 50% à seulement 15 µM (Figure 56 et Tableau 12). La forte incorporation du DHA
dans le BMP avait déjà été rapportée dans différents modèles de cellules en culture dont les
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
185
macrophages THP-1 (Besson et al., 2006 ; Huterer et Wherrett, 1986). Très rapidement à
partir de 30 µM et jusqu'à la plus forte concentration (100 µM) le pourcentage de DHA dans
le BMP atteint un plateau à 60%. En présence de vitamine E (1 molécule de vitamine E pour
100 insaturations) on observe également un plateau mais le pourcentage de DHA dans le
BMP est alors augmenté jusqu’à 75% du total des acides gras. Aux concentrations inférieures
à 30 µM la vitamine E n’a pas d’effet sur l’incorporation du DHA dans le BMP. La vitamine
E ne modifie pas non plus l’incorporation du DHA dans les PC et PE même aux plus fortes
concentrations.
Figure 56 : Variation de la proportion de DHA dans les PC, les PE et le BMP des macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. Les cellules sont cultivées en absence ou en présence de concentrations croissantes de DHA non estérifié +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les PC, les PE et le BMP sont extraits, purifiés et la proportion de DHA qu’ils contiennent est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=3 au minimum). # : p≤0,05 par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons).
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
DH
A (m
ol%
)
DHA (µM)
BMP
- vitamine E
+ vitamine E
# # #
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
DH
A (m
ol%
)
DHA (µM)
PE
- vitamine E
+ vitamine E
0
20
40
60
80
100
0 20 40 60 80 100
DH
A (m
ol%
)
DHA (µM)
PC
- vitamine E
+ vitamine E
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
186
Tableau 12 : Variation de la composition en acides gras du BMP dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de DHA non estérifié +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Le BMP est extrait, purifié et sa composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle (test de Student à 2 échantillons). # : p≤0,05 par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3.
Acides gras- vitamine E + vitamine E
14:0 0,5 ± 0,2 0,7 ± 0,3 0,5 ± 0,1
16:0 7,7 ± 1,4 8,4 ± 1,3 4,9 ± 1,2
18:0 5,9 ± 0,8 5,5 ± 0,7 4,5 ± 1,9
16:1n-9/n-7 4,4 ± 0,8 1,5 ± 0,7 1,1 ± 0,1
18:1n-9 51,2 ± 3,0 16,7 ± 2,4 11,1 ± 3,9
18:1n-7 16,8 ± 2,9 3,1 ± 0,4 3,3 ± 1,6
18:2n-6 1,2 ± 0,2 1,3 ± 0,3 0,7 ± 0,1
20:4n-6 0,7 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,3 ± 0,1
22:5n-3 2,1 ± 0,6 0,9 ± 0,3 2,0 ± 1,3
22:6n-3 7,4 ± 2,7 59,4 ± 3,8 † 71,1 ± 3,1 †, #
mol%
ContrôleDHA non estérifié
BMP
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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187
Tableau 13 : Variation de la composition en acides gras des PE dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de DHA non estérifié +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les PE sont extraites, purifiées et leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle (test de Student à 2 échantillons). ns : non significatif par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3. DMA : dimethylacétals.
Acides gras- vitamine E + vitamine E
14:0 0,3 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,3 ± 0,1
16:0 7,3 ± 1,0 6,9 ± 0,4 6,9 ± 1,1
18:0 14,6 ± 1,0 17,4 ± 1,5 17,9 ± 2,8
16:1n-9/n-7 3,9 ± 0,7 1,8 ± 0,3 1,4 ± 0,4
18:1n-9 25,4 ± 1,9 14,3 ± 2,2 13,9 ± 2,7
18:1n-7 6,3 ± 0,9 3,6 ± 0,6 3,3 ± 0,6
18:2n-6 1,4 ± 0,2 0,4 ± 0,1 0,8 ± 0,1
20:2n-6 4,3 ± 0,7 0,8 ± 0,1 0,9 ± 0,2
20:4n-6 9,5 ± 1,4 5,7 ± 1,4 6,3 ± 1,4
20:5n-3 1,1 ± 0,2 0,7 ± 0,1 0,5 ± 0,2
22:5n-3 3,7 ± 0,6 1,9 ± 0,3 1,8 ± 0,5
22:6n-3 3,9 ± 0,6 30,1 ± 2,6 † 28,9 ± 5,2 †, ns
16:0-DMA 10,5 ± 1,5 9,3 ± 1,5 8,6 ± 0,6
18:0-DMA 5,6 ± 0,6 4,7 ± 0,1 4,8 ± 0,3
18:1-DMA 3,1 ± 0,5 2,6 ± 0,4 2,2 ± 0,3
mol %
ContrôleDHA non estérifié
PE
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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188
En présence de 5 et 15 µM de DHA, la quantité de BMP dans les macrophages
n’est pas modifiée mais on observe une diminution significative à partir de 30 µM (Figure
57). Comme dans les expériences avec le 22:6/22:6-PG, l’addition de vitamine E prévient la
diminution de la quantité cellulaire de BMP. Des exemples des chromatogrammes obtenus en
HPLC sont présentés à la Figure 58.
Tableau 14 : Variation de la composition en acides gras des PC dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de DHA non estérifié +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Les PC sont extraites, purifiées et leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle (test de Student à 2 échantillons). ns : non significatif par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3.
Acides gras- vitamine E + vitamine E
14:0 3,1 ± 0,4 4,0 ± 0,7 4,1 ± 0,8
16:0 28,0 ± 1,8 38,4 ± 2,6 33,1 ± 2,7
18:0 8,0 ± 0,4 8,8 ± 0,9 9,8 ± 1,0
16:1n-9/n-7 10,2 ± 0,7 6,2 ± 0,4 5,3 ± 1,1
18:1n-9 35,0 ± 2,1 18,9 ± 1,4 21,4 ± 3,1
18:1n-7 11,5 ± 1,1 5,9 ± 0,7 6,7 ± 1,7
18:2n-6 1,2 ± 0,2 1,4 ± 0,2 1,6 ± 0,1
20:4n-6 1,0 ± 0,1 2,0 ± 0,4 2,3 ± 0,6
22:5n-3 0,4 ± 0,1 0,8 ± 0,1 1,1 ± 0,2
22:6n-3 0,6 ± 0,1 11,8 ± 3,3 † 13,5 ± 3,3 †, ns
ContrôleDHA non estérifié
mol %
PC
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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189
En comparaison, les quantités cellulaires de PC et PE ne sont pas modifiées pas la
supplémentation en DHA ni en absence, ni en présence de vitamine E (résultats non montrés).
Comme indiqué dans le Tableau 13, en présence de 30 µM de DHA non estérifié les
pourcentages de DMA dans les PE ne sont pas modifiés même en présence de vitamine E,
indiquant qu’à cette concentration il n’y a pas de peroxydation des plasmalogènes-PE.
Ces résultats ainsi que ceux obtenus avec le 22:6/22:6-PG semblent indiquer que
le BMP est spécifiquement dégradé dans les macrophages RAW lors d’une supplémentation
avec des concentrations en DHA supérieures à 30 µM, probablement comme une
conséquence de la très forte incorporation de DHA dans ce phospholipide. De plus la
réversibilité de ce phénomène par la vitamine E suggère qu’il s’agit d’un mécanisme lié à la
peroxydation lipidique.
Figure 57 : Variation des quantités cellulaires de BMP dans les macrophages RAW en présence de DHA non estérifié. Les cellules sont cultivées en absence ou en présence de concentrations croissantes de DHA non estérifié +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Le BMP est extrait, purifié et quantifié comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les quantités de BMP sont mesurées en nmol/mg de protéines et exprimées en % des valeurs contrôles (moyennes ± SD, n=3 au minimum). A, B : groupes significativement différents (ANOVA et test de Tukey-Kramer avec α=0,05). * : p≤0,05 par rapport à la valeur théorique du contrôle de 100% (test de Student à 1 échantillon). # : p≤0,05 par rapport à la condition équivalente sans vitamine E (test de Student à 2 échantillons).
0
20
40
60
80
100
120
140
160
5 15 30 60 100
quan
tités
de
BM
P (%
des
con
trôl
es)
DHA (µM)
- vitamine E
+ vitamine E
B BB
A A
* **
#
##
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
190
3.3 Analyse des espèces moléculaires du BMP
Lorsque les macrophages RAW sont supplémentés avec 30 µM de 22:6/22:6-PG
en absence de vitamine E le pourcentage de DHA dans le BMP ne dépasse pas 50%. Au
contraire, en présence de vitamine E, le BMP accumule près de 85% de DHA (Tableau 9)
indiquant la formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP. Nous avons donc étudié la
possibilité d’une relation directe entre la formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP en
Figure 58 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de DHA non estérifié +/- vitamine E.
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
191
présence de fortes concentration de DHA et la diminution de la quantité de BMP observée en
absence de vitamine E. Les espèces moléculaires du BMP ont été analysées par spectrométrie
de masse par l’équipe du Professeur Robert C. Murphy au département de pharmacologie de
l’Université du Colorado. Les spectres de masses obtenus sont présentés à la Figure 59.
Dans les cellules contrôles l’espèce majoritaire est le 18:1/18:1-BMP ce qui est
cohérent avec nos résultats obtenus en chromatographie gazeuse indiquant que le 18:1 est
l’acide gras majoritaire du BMP (Tableau 15). Le DHA est principalement retrouvé dans
l’espèce moléculaire 18:1/22:6-BMP qui représente 10% de l’ensemble des espèces
moléculaires. L’espèce 22:6/22:6-BMP n’est présente qu’à l’état de traces dans les cellules
contrôles mais représente l’espèce majoritaire dans les cellules supplémentées avec 30 µM de
22:6/22:6-PG en absence et en présence de vitamine E. Dans ces deux conditions les
pourcentages des espèces 18:1/22:6-BMP et 22:5/22:6-BMP sont également augmentés par
rapport au contrôle. Lorsqu’on compare les résultats obtenus pour les cellules supplémentées
avec le 22:6/22:6-PG en absence et en présence de vitamine E on remarque que la proportion
de l’espèce 22:6/22:6-BMP est fortement augmentée en présence de vitamine E ainsi que,
dans une moindre mesure, l’espèce 22:5/22:6-BMP. En revanche, le pourcentage de l’espèce
18:1/22:6-BMP n’est pas modifié par la présence de vitamine E.
La conversion des pourcentages en quantités de chaque espèce moléculaire du
BMP indique que l’addition de vitamine E en présence de 22:6/22:6-PG induit une très forte
accumulation de l’espèce 22:6/22:6-BMP (+4,4 nmol/mg-prot par rapport au traitement avec
le 22:6/22:6-PG sans vitamine E) par rapport aux espèces 22:5/22:6-BMP (+1,4 nmol/mg-
prot) et 18:1/22:6-BMP (+2,0 nmol/mg-prot).
Ces résultats suggèrent que la vitamine E protège spécifiquement l’espèce
moléculaire 22:6/22:6-BMP. La diminution de la quantité cellulaire de BMP observée en
absence de vitamine E pourrait ainsi être due à la dégradation par un processus de
peroxydation lipidique de l’espèce 22:6/22:6-BMP formée en grande quantité par les
macrophages RAW cultivés en présence de 22:6/22:6-PG.
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
192
Figure 59 : Spectres de masse en ESI-MS du BMP extrait et purifié à partir de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E.
700 800 900 1000 1100m/z, amu
9.0e4
1.8e5
773.618:1/18:1-BMP
819.618:1/22:6-BMP
865.622:6/22:6-BMP
700 800 900 1000 1100m/z, amu
6.00e5
1.20e6In
tens
ity, c
ps773.6
18:1/18:1-BMP
819.618:1/22:6-BMP
745.616:0/18:0-BMP
799.618:1/20:2-BMP
700 800 900 1000 1100m/z, amu
1.1e6
2.2e6
773.618:1/18:1-BMP
819.618:1/22:6-BMP
865.622:6/22:6-BMP
Inte
nsity
, cps
Inte
nsity
, cps
Contrôle
22:6/22:6-PG (30µM)
22:6/22:6-PG (30µM)+ vitamine E
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
193
3.4 Formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP in vitro et in vivo
A ce stade de l’étude il est important de vérifier que la formation de l’espèce
22:6/22:6-BMP n’est pas limitée à nos conditions particulières de supplémentation. Dans un
premier temps nous avons utilisé des macrophages RAW cultivés en routine dans un milieu
supplémenté en vitamine E puis nous nous sommes intéressés à la formation du 22:6/22:6-
BMP in vivo, dans le foie de souris nourries avec un régime alimentaire enrichi en DHA.
Tableau 15 : Variation de la composition des espèces moléculaires du BMP dans les macrophages RAW en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG. Les cellules sont cultivées en absence (contrôle) ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E (1 molécule / 100 insaturations) pendant 24 h. Le BMP est extrait, purifié et la proportion de chaque espèce moléculaire est déterminée par ESI-MS comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires et sont représentatifs de deux déterminations indépendantes.
BMP - espèces moléculaires - vitamine E + vitamine E
16:1/18:1 5,2 1,8 0,016:0/18:1 4,4 1,5 0,018:1/18:2 6,0 1,8 0,618:1/18:1 32,8 10,3 4,018:0/18:1 8,0 3,1 1,016:1/22:6 1,2 2,0 1,618:0/22:6 et 18:1/22:5 1,7 2,6 2,018:1/20:4 et 16:0/22:5 2,7 1,7 0,718:1/20:3 4,0 1,5 0,018:1/20:2 6,1 1,9 0,718:1/20:1 4,5 1,8 0,018:1/22:6 10,0 22,5 21,318:1/22:5 6,6 6,6 6,518:1/22:4 3,0 1,7 0,922:6/22:6 1,5 29,2 44,822:5/22:6 1,3 8,0 14,022:5/22:5 et 22:4/22:6 1,2 2,0 2,1
Contrôle22:6/22:6-PG
mol%
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
194
3.4.1 Formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP dans les macrophages RAW cultivés en
routine dans un milieu supplémenté en vitamine E
Par rapport aux conditions retrouvées in vivo, les cellules en culture in vitro sont
souvent déficientes en vitamine E et sont donc plus sensibles aux stress oxydant (Kelley et al.,
1995). Nous avons donc cultivé des macrophages RAW pendant plusieurs jours (au moins
deux passages) dans un milieu supplémenté avec 5 µM de vitamine E, ce qui constitue un
apport efficace et physiologique de vitamine E aux cellules (Baoutina et al., 1998).
La vitamine E est quantifiée dans les cellules par HPLC en phase inverse couplée
à un détecteur de fluorescence. Dans les macrophages RAW non supplémentés la quantité
cellulaire de vitamine E est inférieure au seuil de détection. Nous pouvons évaluer que ces
cellules contiennent alors moins de 1 pmole de vitamine E par mg de protéines. Après une
semaine de supplémentation la quantité cellulaire de vitamine E est fortement augmentée et se
stabilise à 34 ± 4 pmoles/mg-prot (n=4). Dans les cellules ainsi supplémentées la quantité et la
composition en acides gras du BMP ne sont pas modifiées indiquant que la vitamine E seule
ne suffit pas à générer une quantité significative de BMP riche en DHA. Les PC et les PE ne
sont pas non plus modifiées (résultats non montrés).
Lorsque ces cellules supplémentées en vitamine E sont incubées en présence de
liposomes de 22:6/22:6-PG on observe une augmentation de la quantité de BMP et un
enrichissement en DHA similaire à celui observé précédemment lorsque la vitamine E était
incorporée directement dans les liposomes (Figure 60). En outre, lorsque les cellules
supplémentées en vitamine E sont incubées en présence de liposomes de 18:1/18:1-PG on
retrouve une augmentation de la quantité de BMP et un enrichissement en acide oléique
(18:1n-9) similaires à ce que nous avions observé en absence de vitamine E (voir deuxième
partie des résultats). Ceci suggère que la vitamine E permet de protéger spécifiquement le
BMP riche en DHA de la dégradation oxydative.
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
195
3.4.2 Formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP in vivo dans le foie de souris placées
sous un régime alimentaire enrichi en DHA
De nombreuses études ont montré qu’une supplémentation du régime alimentaire
en DHA chez l’animal induisait un enrichissement en DHA dans les phospholipides de la
plupart des organes. Toutefois aucune donnée n’a été rapportée spécifiquement pour le BMP.
Nous avons donc voulu déterminer si le fort enrichissement du BMP en DHA observé sur des
cellules en culture se produit également in vivo et si il peut conduire à la formation de l’espèce
0
100
200
300
400
500
600
contrôle 22:6/22:6-PG 18:1/18:1-PG
quan
tités
de
BM
P (%
du
cont
rôle
)
18:1n-9 (OA) 52% 8% 72%
22:6n-3 (DHA) 9% 77% 6%
Figure 60 : Variation de la quantité de BMP et de la proportion de OA et DHA dans les macrophages RAW cultivés en routine dans un milieu supplémenté en vitamine E. Les cellules cultivées en routine dans un milieu supplémenté avec 5 µM de vitamine E sont incubées en absence ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG ou de 22:6/22:6-PG. Les PC, les PE et le BMP sont extraits, purifiés et quantifiés par analyse de leur composition en acides gras comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les quantités de phospholipides sont mesurées en nmol/mg de protéines et exprimées en % des valeurs contrôles. Les proportions d’acide oléique (OA) et de DHA sont exprimées en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=3).* : p≤0,05 par rapport à la valeur théorique du contrôle de 100% (test de Student à 1 échantillon).
* *
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
196
22:6/22:6-BMP. Des souris ont été nourries pendant 32 jours avec un régime alimentaire
standard (condition contrôle) ou enrichi en DHA grâce à une huile composée de tri-DHA-TG.
Ni le poids des souris ni le poids du foie n’est modifié par le régime alimentaire. Les
compositions en acides gras des PC, des PE et du BMP extraits du foie ont été analysées.
Comme indiqué dans le Tableau 16, le DHA est l’acide gras majoritaire du BMP
dans le groupe contrôle où il représente 32% de l’ensemble des acides gras. L’acide
arachidonique (20:4n-6) est l’acide gras majoritaire des PE (26%) et l’acide palmitique (16:0)
Tableau 16 : Composition en acides gras du BMP, des PC et des PE dans le foie de souris nourries avec un régime alimentaire standard (contrôle) ou enrichi en DHA. Des souries ont été nourries pendant 32 jours avec un régime alimentaire standard (contrôle) ou enrichi en DHA. Les PC, les PE et le BMP sont extraits à partir des foies de souris, purifiés et leur composition en acides gras est déterminée en GC comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les résultats sont exprimés en pourcentages molaires (moyennes ± SD, n=4). † : p≤0,05 par rapport au contrôle respectif (test de Student à 2 échantillons). Les résultats des tests ne sont indiqués que pour le 22:6n-3. nd : non détecté. DMA : dimethylacétals.
Acides grascontrôle DHA contrôle DHA contrôle DHA
14:0 0,5 ± 0,01 0,2 ± 0,1 tr tr 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1
16:0 15,2 ± 2,6 6,6 ± 1,8 17,4 ± 0,5 20,4 ± 0,6 28,8 ± 1,4 32,9 ± 0,9
18:0 8,2 ± 1,0 3,3 ± 1,0 17,1 ± 2,5 16,5 ± 1,6 11,9 ± 2,2 9,6 ± 0,6
16:1n-9 1,6 ± 0,3 0,5 ± 0,1 0,6 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,9 ± 0,2 1,1 ± 0,1
18:1n-9 12,5 ± 1,3 7,7 ± 1,2 7,8 ± 0,9 6,6 ± 0,5 5,5 ± 0,6 7,3 ± 0,7
18:1n-7 1,4 ± 0,3 0,8 ± 0,3 1,4 ± 0,3 0,9 ± 0,3 1,9 ± 0,4 1,1 ± 0,2
18:2n-6 14,9 ± 1,7 5,1 ± 1,4 6,5 ± 0,9 5,3 ± 0,7 19,1 ± 1,9 20,7 ± 1,7
20:3n-6 1,3 ± 0,2 0,6 ± 0,1 0,8 ± 0,1 0,9 ± 0,1 1,8 ± 0,3 3,0 ± 0,2
20:4n-6 10,3 ± 2,0 2,0 ± 0,5 25,7 ± 0,6 12,6 ± 0,3 21,3 ± 2,0 8,5 ± 2,5
20:5n-3 0,3 ± 0,1 0,5 ± 0,1 0,1 ± 0,1 1,8 ± 0,5 0,1 ± 0,1 0,9 ± 0,2
22:5n-3 0,8 ± 0,3 1,2 ± 0,3 0,5 ± 0,1 0,4 ± 0,1 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1
22:6n-3 31,9 ± 3,4 70,7 ± 4,2 † 19,5 ± 0,5 32,3 ± 0,5 † 7,5 ± 0,4 14,3 ± 0,6 †
16:0-DMA nd nd 0,3 ± 0,1 0,3 ± 0,1 nd nd
18:0-DMA nd nd 0,1 ± 0,1 0,1 ± 0,1 nd nd
18:1-DMA nd nd 0,2 ± 0,1 0,2 ± 0,1 nd nd
BMP PE PC
mol %
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
197
est l’acide gras majoritaire des PC (29%). On remarque que le DHA s’incorpore dans les 3
phospholipides étudiés. Il passe de 20 à 32% dans les PE et de 7,5 à 14% dans les PC. Comme
pour les cellules en culture, c’est dans le BMP qu’il s’incorpore le plus fortement. En effet, il
représente alors 71% de l’ensemble des acides gras. Ce pourcentage largement supérieur à
50% indique la formation et l’accumulation in vivo de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP.
Des exemples des chromatogrammes obtenus en HPLC sont présentés dans la Figure 61. De
plus, des résultats similaires ont été retrouvés dans le foie de souris nourries seulement 4 jours
avec le régime enrichi en DHA (résultats non montrés), indiquant une incorporation rapide du
DHA dans le BMP. Dans les autres organes étudiés (cerveau, rate et cœur) nous n’avons pas
réussi à déterminer avec suffisamment de précision la composition en acides gras du BMP en
raison d’une trop faible quantité du phospholipide.
3.5 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA sous l’action d’un stress
oxydant
Nos résultats suggèrent que la capacité du BMP à accumuler de grandes quantités
de DHA peut induire, in vitro et in vivo, la formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP. Cette
espèce moléculaire, supposée être particulièrement sensible à la peroxydation lipidique en
raison de son nombre élevé d’insaturations, pourrait constituer une cible privilégiée du stress
oxydant. Ceci pourrait expliquer ainsi la diminution de la quantité cellulaire de BMP observée
Figure 61 : Chromatogrammes en HPLC du BMP extrait et purifié à partir de foie de souris nourries avec un régime alimentaire standard (contrôle) ou enrichi en DHA.
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
198
dans les macrophages RAW non supplémentés en vitamine E et cultivés en présence de fortes
concentrations de DHA ou en présence de 22:6/22:6-PG. Nous avons donc cherché à évaluer
directement la sensibilité à la peroxydation lipidique du BMP riche en DHA par rapport au
BMP riche en acide oléique, dans les macrophages RAW d’une part et dans un système
acellulaire d’autre part grâce à des liposomes reconstitués avec un standard de 22:6/22:6-BMP
synthétisé chimiquement.
3.5.1 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA dans les macrophages RAW
Des macrophages RAW cultivés en routine dans un milieu supplémenté avec 5
µM de vitamine E ont été incubés pendant 24 heures en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG
ou de 22:6/22:6-PG puis rincés et incubés dans des conditions contrôles ou pro-oxydantes (1
mM de H202, 0,1 mM de CuSO4 et 1 mM d’ascorbate pendant 4 heures).
Conformément aux expériences précédentes, la quantité cellulaire de BMP est
augmentée d’environ 4 fois dans les cellules supplémentées en 18:1/18:1-PG ou 22:6/22:6-PG
(Figure 62, conditions contrôles), et le BMP contient alors respectivement 72% d’acide
oléique et 80% de DHA. Lorsque les cellules pré-incubées avec le 22:6/22:6-PG sont
soumises à des conditions pro-oxydantes, la quantité de BMP diminue significativement
jusqu’à la valeur basale de 100% (Figure 62, conditions pro-oxydantes). Le DHA ne
représente alors plus que 50% de l’ensemble des acyles gras du BMP. Au contraire, les
conditions pro-oxydantes ne modifient ni la quantité, ni la composition en acides gras du
BMP dans les cellules pré-incubées avec le 18:1/18:1-PG. Ces résultats suggèrent que le BMP
riche en DHA est beaucoup plus sensible au stress oxydant que le BMP riche en acide oléique
et qu’il peut être spécifiquement dégradé par un mécanisme de peroxydation lipidique non-
enzymatique.
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
199
3.5.2 Dégradation préférentielle du BMP riche en DHA dans un système acellulaire
Nous avons également étudié la sensibilité du BMP au stress oxydant dans un
système acellulaire en constituant des liposomes de 16:0/16:0-PC/BMP/cholestérol (75:20:5,
mol%). Nous avons utilisé soit du 18:1/18:1-BMP, soit du 22:6/22:6-BMP en absence ou en
présence de vitamine E. Ces liposomes ont alors été soumis à des conditions pro-oxydantes
(10 mM de H202 et 0,1 mM de CuSO4 à 37°C) pendant des temps variables. Le BMP est
extrait et séparé par CCM puis révélé par chauffage.
Au temps t=0 tous les échantillons contiennent 15 µg de 18:1/18:1-BMP ou de
22:6/22:6-BMP. Dans nos conditions d’oxydation nous n’observons pas de dégradation
importante du 18:1/18:1-BMP même après 6 heures d’incubation (Figure 63). Il faut attendre
Figure 62 : Variation de la quantité de BMP en fonction de son enrichissement en 18:1 ou 22:6 dans les macrophages RAW soumis à un stress oxydant. Les cellules cultivées en routine dans un milieu supplémenté avec 5 µM de vitamine E sont incubées en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG ou de 22:6/22:6-PG pendant 24 h puis incubées pendant 4 h dans des conditions contrôles ou pro-oxydantes (1 mM de H202, 0,1 mM de CuSO4 et 1 mM d’ascorbate). Le BMP est extrait, purifié et quantifié comme décrit dans Matériels et Méthodes. Les quantités de BMP sont mesurées en nmol/mg de protéines et exprimées en % des valeurs contrôles (moyennes ± SD, n=3). **: p≤0.01 par rapport à la valeur théorique du contrôle de 100% (test de Student à 1 échantillon). # : p≤0.05 par rapport à la condition équivalente dans des cellules non stressées (test de Student à 2 échantillons).
0
100
200
300
400
500
22:6/22:6-PG (30µM) 18:1/18:1-PG (30µM)
quan
tités
de
BM
P (%
du
cont
rôle
s)
conditions contrôles
conditions pro-oxydantes
**
#
****
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
200
24 heures d’incubation pour commencer à distinguer une diminution (résultats non montrés).
En revanche on remarque une diminution importante de la quantité de 22:6/22:6-BMP dès 2
heures d’incubation et presque complète après 6 heures. De plus, l’ajout de vitamine E dans
les liposomes ralentit la dégradation du 22:6/22:6-BMP. Ces résultats, bien qu’attendus,
indiquent clairement que dans des conditions pro-oxydantes le 22:6/22:6-BMP est dégradé
beaucoup plus rapidement que le 18:1/18:1-BMP et que la vitamine E protège efficacement le
22:6/22:6-BMP de l’oxydation.
3.6 Le BMP riche en DHA protège partiellement le cholestérol de l’oxydation dans
un système acellulaire
Les molécules anti-oxydantes comme la vitamine E protègent les membranes en
terminant le processus de propagation de la peroxydation lipidique (voir chapitre 5 des rappels
bibliographiques). Pour cela elles réagissent avec les espèces radicalaires en devenant elles-
mêmes oxydées. Ainsi, il est admis que c’est en constituant les premières cibles de la
peroxydation lipidique que les molécules anti-oxydantes agissent comme des
Figure 63 : Oxydation du 18:1/18:1-BMP et du 22:6/22:6-BMP dans un système acellulaire. Des liposomes de 16:0/16:0-PC/BMP/cholestérol (75:20:5, mol%) contenant soit du 18:1/18:1-BMP, soit du 22:6/22:6-BMP +/- vitamine E (1 molécule pour 100 insaturations) sont soumis à des conditions pro-oxydantes (10 mM de H202 et 0,1 mM de CuSO4 à 37°C) pendant des temps variables. Suite à la période d’oxydation, la réaction est stoppée par ajout d’un anti-oxydant. Le BMP est extrait, séparé des autres classes de lipides par CCM et visualisé par pulvérisation d’acides et chauffage comme décrit dans Matériels et Méthodes. L’intensité des taches est proportionnelle à la quantité de BMP présente dans l’échantillon.
18:1/18:1-BMP
22:6/22:6-BMP+ vitamine E
temps d’incubation 0 h 2 h 4 h 6 h
22:6/22:6-BMP
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
201
« paratonnerres » et protègent les lipides à proximité. Toute molécule préférentiellement
oxydée pourrait de cette manière jouer un rôle anti-oxydant comme cela a été proposé pour les
plasmalogènes-PE. Ces derniers sont connus pour être plus sensibles au stress oxydant que les
diacyl-PE en raison de la présence de la liaison vinyl-éther de la chaîne alkényle en sn-1
(Engelmann, 2004 ; Hahnel et al., 1999 ; Reiss et al., 1997).
Une hypothèse intéressante serait que le BMP riche en DHA, en étant une cible
privilégiée de la peroxydation lipidique, agisse comme un anti-oxydant local et protège ainsi
les molécules avoisinantes dans les endosomes tardifs. Dans le cadre de notre étude nous nous
sommes particulièrement intéressés au cholestérol qui est associé à ce compartiment au cours
de l’endocytose des LDL ou s’y accumule dans certaines conditions pathologiques. Pour
tester cette hypothèse nous avons réalisé une série d’expériences dans un système acellulaire
visant à comparer le niveau d’oxydation du cholestérol en présence de 18:1/18:1-BMP ou de
22:6/22:6-BMP dans des liposomes reconstitués comme précédemment (16:0/16:0-PC / BMP
/ cholestérol) avec également une dose traceuse de [3H]cholestérol (5 µCi). L’oxydation du
cholestérol est estimée en mesurant la conversion du [3H]cholestérol en [3H]oxystérols. Les
liposomes sont soumis à des conditions pro-oxydantes (10 mM de H202 et 0,1 mM de CuSO4
à 37°C) pendant des temps variables. Après la période d’oxydation, les oxystérols sont
séparés du cholestérol par CCM (Figure 64A). Le niveau d’oxydation du cholestérol est
déterminé comme le pourcentage de la radioactivité associée aux oxystérols par rapport à la
radioactivité totale ([3H]oxystérols + [3H]cholestérol).
. Comme attendu, au temps t=0 (en absence d’oxydation) on ne détecte que du
[3H]cholestérol (Figure 64B). En revanche, au cours de l’incubation des liposomes dans des
conditions pro-oxydantes le [3H]cholestérol est oxydé en [3H]oxystérols qui sont détectés
comme deux pics très rapprochés. La référence frontale du pic principal correspond à celle du
7-KC (Figure 64B). Après 6 heures d’incubation environ 15% du [3H]cholestérol est converti
en [3H]oxystérols (Figure 64B etFigure 65). Dans les liposomes reconstitués avec du
22:6/22:6-BMP l’oxydation du cholestérol est significativement ralentie par rapport à celle
observée dans les liposomes reconstitués avec du 18:1/18:1-BMP (Figure 65). Ces résultats
indiquent que dans un système acellulaire, le 22:6/22:6-BMP qui constitue une cible
privilégiée du stress oxydant protège partiellement le cholestérol présent dans les liposomes
de la peroxydation lipidique.
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
202
Figure 64 : Oxydation du cholestérol en système acellulaire en présence de 18:1/18:1-BMP ou de 22:6/22:6-BMP. A : Profil de migration du cholestérol (chol), du 25-hydroxycholestérol (25-OHC) et du 7-céto-cholestérol (7-KC) en CCM avec le mélange de solvant hexane/éther/méthanol/acide acétique (50 :50 :5 :1 ; v/v/v/v). B : Des liposomes de 16:0/16:0-PC/BMP/cholestérol (75:20:5, mol%) sont reconstitués avec du 18:1/18:1-BMP ou du 22:6/22:6-BMP ainsi que 0,5 µCi de [3H]cholestérol. La moitié des échantillons est récupérée pour analyse (t=0), l’autre moitié est incubée pendant 6 h dans des conditions pro-oxydantes (10 mM de H202 et 0,1 mM de CuSO4 à 37°C). Les composés radio-marqués sont extraits, séparés par CCM avec le mélange de solvant indiqué ci-dessus et visualisés au lecteur de radioactivité linéaire.
18:1
/18:
1-B
MP
22:6
/22:
6-B
MP
t = 0 t = 6 heures
[3H]cholestérol
[3H]oxystérols
25-OHC 7-KC chol
A B
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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203
Discussion
Comme observé précédemment dans les macrophages THP-1 (Besson et al.,
2006) et d’autres types cellulaires (Huterer et Wherrett, 1986 ; Luquain et al., 2000), nous
avons montré que dans les macrophages RAW, le DHA apporté de manière exogène
s’incorpore plus rapidement et en plus grande quantité dans le BMP que dans les PC et les PE.
Nous avons également montré pour la première fois que cette avidité du BMP pour le DHA se
retrouve aussi in vivo dans le foie de souris placées sous un régime alimentaire enrichi en
DHA. Grâce à des analyses en spectrométrie de masse nous avons pu mettre en évidence la
formation et l’accumulation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP dans les macrophages
Figure 65 : Oxydation du cholestérol en système acellulaire en présence de 18:1/18:1-BMP ou de 22:6/22:6-BMP. Des liposomes de 16:0/16:0-PC/BMP/cholestérol (75:20:5, mol%) reconstitués avec du 18:1/18:1-BMP ou du 22:6/22:6-BMP ainsi que 0,5 µCi de [3H]cholestérol sont incubés pendant des temps croissants dans des conditions pro-oxydantes (10 mM de H202 et 0,1 mM de CuSO4 à 37°C). Les composés radio-marqués sont extraits et séparés par CCM comme décrit dans Matériels et Méthodes. La radioactivité associée au cholestérol et aux oxystérols est quantifiée au compteur à scintillations et les résultats sont exprimés en pourcentage de [3H]oxystérols par rapport à la radioactivité totale ([3H]cholestérol + [3H]oxystérols) (moyennes ± SD, quadruplicate sur n=1 représentatif de trois déterminations indépendantes). *: p≤0.05 par rapport au temps d’incubation respectif pour les liposomes reconstitués avec du 22:6/22:6-BMP (test de Student à 2 échantillons).
0
5
10
15
20
0 1 2 3 4 5 6
[3H
] oxy
ster
ols
(% d
e la
radi
oact
ivité
tota
le)
Temps (h)
18:1/18:1-BMP
22:6/22:6-BMP ##
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
204
RAW supplémentés en DHA. Cette espèce moléculaire se forme aussi dans le foie de souris.
Cette caractéristique semble être propre au BMP car même dans les tissus naturellement très
riches en DHA ou qui accumulent cet acide gras lors de supplémentations, comme la rétine,
les espèces 22:6/22:6-PC, 22:6/22:6-PE et 22:6/22:6-PS ne sont retrouvées qu’en très faible
proportion (Delton-Vandenbroucke et al., 1998 ; Miljanich et al., 1979 ; Wiegand et
Anderson, 1983).
Les mécanismes responsables de la forte accumulation de DHA dans le BMP et
conduisant à la formation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP n’ont pas encore été
déterminés. Il est toutefois possible que ce phénomène soit lié à la structure très particulière
du BMP. En effet, contrairement aux autres phospholipides, les deux résidus acyles du BMP
sont estérifiés sur des groupements glycérols différents, en positions sn-2 et sn-2’. Or le DHA
est un acide gras long et très recourbé possédant un encombrement stérique important. Il est
donc possible que deux résidus DHA soient plus facilement estérifiés en même temps sur les
positions sn-2 et sn-2’ du BMP que sur les positions sn-1 et sn-2 des autres phospholipides.
De nombreuses enzymes impliquées dans le remodelage des acyles gras des phospholipides
présentent une spécificité vis-à-vis de la nature des chaînes acyles. Il est donc également
possible que des enzymes impliquées dans le remodelage des chaînes acyles du BMP soient
hautement spécifiques du DHA comme cela a été montré pour certaines phospholipases A
(Green et al., 2008 ; Strokin et al., 2003), acyl-CoA synthétases (Reddy et Bazan, 1984b,
1985), acyl-CoA : lyso-PL acyltransférases (Guisto et al., 1986 ; Tou, 1986) ainsi que pour
certaines transacylases (Masuzawa et al., 1989 ; Sugiura et al., 1985). De plus, il a été montré
que certaines enzymes spécifiques des AGPI présentent également une spécificité vis-à-vis de
la position sn-2 (MacDonald et Sprecher, 1991). Ces spécificités d’enzymes pourraient
expliquer, au moins en partie, le faible taux de formation des espèces à di-DHA des
phospholipides, à l’exception du BMP où les deux chaînes acyles sont estérifiées sur les
positions sn-2 et sn-2’ qui sont équivalentes du fait de la symétrie de structure de la molécule
de BMP.
Il a été montré que le BMP s’accumule dans les organes et les cellules de patients
atteints de désordres métaboliques des lysosomes, ou chez l’animal traité avec des agents
pharmacologiques induisant des phospholipidoses (Harder et al., 1984 ; Jabs et al., 2008 ;
Mortuza et al., 2003). D’anciennes études avaient indiqué que le BMP qui s’accumule dans
ces pathologies est particulièrement enrichi en acides gras polyinsaturés, notamment en DHA
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
205
(Nakashima et al., 1984). Plus récemment il a été montré en particulier que l’espèce
22:6/22:6-BMP s’accumule dans ces lipidoses pathologiques ou induites (Kakela et al., 2003 ;
Meikle et al., 2008 ) dont elle pourrait constituer un marqueur (Baronas et al., 2007).
Indépendamment de nos résultats, ces études mettent en lumière l’importance de l’espèce
moléculaire 22:6/22:6-BMP pour les fonctions endosomales dans le contexte pathologique
des phospholipidoses.
Les résultats présentés dans le chapitre précédent indiquent qu’en présence de 30
µM de 18:1/18:1-PG les macrophages RAW accumulent du BMP enrichi en acide oléique
(18:1). De manière inattendue nous avons observé qu’en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG
la quantité cellulaire de BMP est diminuée de moitié. Cette diminution a également été
retrouvée en présence de DHA non estérifié à des concentrations supérieures à 30 µM. Dans
ces deux conditions, la composition en acides gras du BMP a révélé une très forte proportion
de DHA (environ 50%). En ajoutant de la vitamine E dans les liposomes de 22:6/22:6-PG la
quantité de BMP n’est plus diminuée mais au contraire augmentée d’environ 4 fois, comme
dans le cas de la supplémentation en 18:1/18:1-PG, et le pourcentage de DHA s’élève à 85%.
La vitamine E prévient également la diminution de BMP en présence de fortes concentrations
de DHA non estérifié et favorise son enrichissement en DHA. En présence de 22:6/22:6-PG
sans vitamine E, la quantité cellulaire de MDA, un marqueur global de la peroxydation
lipidique, est augmentée et retrouve une valeur basale lorsque la vitamine E est ajoutée. Ainsi,
les effets de la vitamine E suggèrent que la diminution de la quantité cellulaire de BMP qui
accompagne son enrichissement en DHA est due à un processus de peroxydation lipidique. A
ce titre nous avons confirmé dans les macrophages RAW et dans un système acellulaire que le
BMP riche en DHA (22:6/22:6-BMP) est beaucoup plus sensible à la péroxydation lipidique
que le BMP riche en oléate (18:1/18:1-BMP).
Ces modifications observées en présence de DHA semblent être spécifiques du
BMP car celles-ci n’ont pas été observées pour les PC et les PE malgré l’incorporation du
DHA dans ces deux phospholipides majoritaires des macrophages RAW. La sous-classe des
plasmalogènes-PE présente un intérêt particulier car ces derniers sont décrits comme des
cibles privilégiées de la peroxydation lipidique (Engelmann, 2004). La quantité de DMA (les
DMA dérivent des chaînes grasses alkényles lors de la réaction de transméthylation des PE)
reflète directement la quantité de plasmalogènes-PE. Nous avons ainsi pu montrer que la
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
206
quantité de plasmalogènes-PE n’est pas modifiée en présence de 30 µM de DHA, indiquant
l’absence de peroxydation de cette sous-classe de PE. En revanche nous n’avons pas analysé
les autres phospholipides cellulaires tels les PI et les PS. A ce titre, plusieurs travaux de
l’équipe du Dr. Kim ont montré que les PS constituent un réservoir de DHA et que leur
biosynthèse est régulée par le DHA (Kim et al., 2004 ; Garcia et al., 1998). Toutefois cette
propriété semble être spécifique des cellules neuronales (Guo et al., 2007 ; Hamilton et al.,
2000). De plus, des études d’incorporation de DHA radiomarqué réalisées notamment sur des
macrophages THP-1 en culture ont mis en évidence une incorporation du DHA beaucoup
moins importante dans les PS que dans le BMP (Besson et al., 2006 ; Huterer et Wherrett,
1986).
L’hypothèse originale qui découle de l’ensemble de ces résultats est qu’en
présence de concentrations élevées de DHA, contrairement aux autres phospholipides, la forte
propension du BMP à incorporer le DHA génère des quantités significatives de l’espèce
moléculaire 22:6/22:6-BMP. Cette espèce moléculaire est formée encore plus efficacement
lorsque les cellules sont incubées en présence du précurseur 22:6/22:6-PG à partir duquel elles
peuvent directement synthétiser du 22:6/22:6-BMP. Toutefois, en raison de sa très grande
sensibilité à la peroxydation lipidique, le 22:6/22:6-BMP formé dans les macrophages RAW
est rapidement dégradé. Ainsi, la quantité cellulaire de BMP diminue au fur et à mesure qu’il
incorpore le DHA exogène. Au contraire, en présence de vitamine E le 22:6/22:6-BMP est
protégé et peut donc s’accumuler.
Il est généralement admis que la sensibilité des acides gras à l’oxydation est
directement proportionnelle à leur degré d’insaturation. Ainsi, l’augmentation de la proportion
de DHA dans les lipides augmenterait leur vulnérabilité vis-à-vis de la peroxydation lipidique
(Alexander-North et al., 1994 ; Song et Miyazawa, 2001; Esterbauer et al., 1992). Toutefois,
d’autres études semblent indiquer que la relation entre le degré d’insaturation d’un acide gras
et sa sensibilité à l’oxydation n’est pas toujours aussi directe. Visioli et al. (1998) ont montré
qu’en soumettant différents acides gras à un stress oxydant in vitro, la génération de produits
de peroxydation ne reflète pas directement leur degré d’insaturation. Des études chez
l’Homme réalisées par Higdon et al. (2000) et Mori (2004) indiquent également qu’une
supplémentation du régime alimentaire avec des acides gras oméga-3 (EPA et DHA) issus
d’huile de poisson n’est pas associée à une augmentation de la peroxydation lipidique.
Dans nos conditions de supplémentation, la dégradation du BMP semble
spécifique de l’espèce 22:6/22:6-BMP. Or il a été montré que la présence de DHA à toutes les
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
207
positions des TAG ou des PC augmente leur oxydabilité par rapport aux espèces ne possédant
qu’un résidu DHA (Lyberg et al., 2005) et que dans les membranes des photorécepteurs de
rats, les phospholipides possédant deux résidus DHA sont sélectivement dégradés par un
stress oxydant généré par la lumière (Wiegand et al., 1995). Ainsi, l’hypothèse d’une
dégradation peroxydative du 22:6/22:6-BMP est en accord avec ces observations.
Par ailleurs, il est probable que le précurseur 22:6/22:6-PG soit également plus
sensible au stress oxydant que le précurseur 18:1/18:1-PG. Il n’est donc pas exclu qu’en
absence de vitamine E le 22:6/22:6-PG soit lui-même dégradé et devienne de cette manière
moins disponible pour la synthèse de BMP, ce qui pourrait expliquer les différences observées
sur les quantités de BMP en absence et en présence de vitamine E. Toutefois cette hypothèse
ne peut expliquer la diminution de la quantité de BMP que nous avons par ailleurs également
observée dans les cellules supplémentées avec du DHA non estérifié. De plus, si le précurseur
22:6/22:6-PG était significativement dégradé en absence de vitamine E on pourrait s’attendre
à observer également une incorporation moins importante de DHA dans les PC et les PE par
rapport à celle mesurée dans les cellules incubées en présence de 22:6/22:6-PG + vitamine E,
ce qui n’est pas le cas.
Une autre hypothèse serait que le BMP estérifié avec du DHA soit spécifiquement
dégradé par une enzyme hydrolytique et non pas par un processus de peroxydation lipidique.
A ce titre il a été montré qu’une PLA2 lysosomale possède une activité hydrolytique sur le
BMP et notamment sur le BMP contenant du DHA (Ito et al., 2002). Toutefois, le rôle
protecteur de la vitamine E serait alors plus difficile à expliquer à moins de suggérer que cette
enzyme soit activée dans des conditions pro-oxydantes. Mais à ce stade de l’étude, ceci reste
purement spéculatif et peu probable car nous avons par ailleurs montré que dans des
conditions pro-oxydantes le BMP cellulaire riche en acide oléique n’est pas dégradé et aucune
lipase strictement spécifique du BMP estérifié avec du DHA n’a encore été identifiée.
Dans cette étude nous n’avons pas cherché à décrire plus précisément le
mécanisme ni à caractériser les produits potentiels de peroxydation spécifiques du BMP riche
en DHA, bien que cela soit d’un grand intérêt notamment pour valider notre hypothèse que la
diminution de la quantité de BMP est bien due à la peroxydation de l’espèce 22:6/22:6-BMP.
L’équipe de Salomon a décrit en détail les produits de peroxydation des PC et PE contenant
du DHA en position sn-2 (Gu et al., 2003 ; Gugiu et al., 2006). Les auteurs ont observé la
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
208
formation de nombreux phospholipides tronqués possédant en position sn-2 des résidus
oxydés du DHA de différentes longueurs avec des fonctions aldéhydes, carboxyle, hydroxyle
ou époxyde. La formation de ces composés a d’abord été étudiée dans un système acellulaire
à partir de standards puis confirmée in vivo dans la rétine. Ainsi, il est probable que la
peroxydation du BMP riche en DHA génère dans un premier temps du BMP estérifié avec un
ou deux DHA hydroxylés puis, dans un second temps, un mélange complexe de différentes
molécules de BMP tronquées de manière similaire à ce qui a été décrit précédemment pour les
PC-DHA et les PE-DHA.
Afin de vérifier expérimentalement cette hypothèse nous pourrions commencer
par identifier les produits de dégradation du 22:6/22:6-BMP générés dans un système
acellulaire et pouvant être considérés comme spécifiques du 22:6/22:6-BMP. Ensuite nous
devrions vérifier si ces molécules de BMP tronquées sont formées dans les macrophages
RAW incubés en présence de 22:6/22:6-PG sans vitamine E et que leur production est
diminuée en présence de vitamine E au profit d’une molécule de 22:6/22:6-BMP intacte.
Toutefois, il est évident qu’il s’agit là d’une étude analytique longue et difficile. Une autre
approche consisterait à synthétiser du 22:6/22:6-PG radioactif et d’identifier l’ensemble des
molécules radioactives formées après incubation sur des macrophages RAW.
La vitamine E est un puissant anti-oxydant lipophile. De nombreuses études ont
mis en évidence une corrélation entre le taux de vitamine E et le statut redox des cellules
(Wagner et al., 1996). Dans les monocytes, il a été montré que la vitamine E diminue la
production d’espèces radicalaires dérivées de l’oxygène (ROS) ainsi que la peroxydation
lipidique (Singh et al., 2005). Par rapport aux conditions observées in vivo, les cellules en
culture sont généralement déficientes en vitamine E ce qui induit une augmentation de la
sensibilité des lipides membranaires à la peroxydation (Kelley et al., 1995). Nous avons
effectivement retrouvé une quantité très faible de vitamine E dans les macrophages RAW
cultivés dans des conditions contrôles. Cette déficience apparaît, au moins en partie,
responsable de la dégradation du BMP riche en DHA dans les cellules non supplémentées en
vitamine E. Lorsque les macrophages RAW sont cultivés en routine dans un milieu
supplémenté avec 5 µM de vitamine E, la quantité cellulaire de vitamine E retrouve un niveau
physiologique en comparaison des quantités observées dans les monocytes et macrophages
isolés directement à partir de souris (Baoutina et al., 1998). La normalisation du contenu
cellulaire en vitamine E permet une accumulation de BMP riche en DHA lorsque ces cellules
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
209
sont supplémentées avec du 22:6/22:6-PG. Nous avons également montré par une approche
nutritionnelle chez la souris que le BMP peut présenter un très fort enrichissement en DHA
sans diminution de masse associée. Or le foie de souris contient des niveaux élevés de
vitamine E, particulièrement dans les endosomes tardifs/lysosomes (Azzi et Stocker, 2000).
Ces résultats suggèrent que les protections anti-oxydantes présentes in vivo sont suffisantes
pour permettre la formation et l’accumulation de BMP riche en DHA, et de l’espèce
moléculaire 22:6/22:6-BMP en particulier, malgré sa grande vulnérabilité au stress oxydant.
Il est important de discuter la pertinence de ces observations en relation avec la
quantité apportée de DHA. La formation de l’espèce 22:6/22:6-BMP dans les macrophages en
culture nécessite la présence de concentrations en DHA non estérifié supérieures à 30 µM. Il
existe dans la littérature de nombreuses études de supplémentation de cellules en culture avec
du DHA à des concentrations variant de 5 µM à parfois plus de 200 µM. La définition de
faibles versus fortes concentrations n’est donc pas clairement établie. Afin d’être au plus
proche des conditions physiologiques, le DHA est d’abord lié à l’albumine avant d’être
apporté aux cellules. On admet qu’un apport en acides gras n’est pas trop élevé lorsque le
rapport entre la quantité d’acides gras et la quantité d’albumine reste inférieur à 2. Compte
tenu de la quantité connue d’albumine présente dans le sérum de veau fœtal représentant 10%
du milieu de culture, la concentration en DHA de 30 µM représente un rapport largement
inférieur à 2 (≈0,6). D’autre part, bien que la quantité cellulaire de BMP ne soit pas modifiée
aux concentrations en DHA inférieures à 30 µM, il est probable que l’espèce 22:6/22:6-BMP
se forme, en particulier à la concentration de 15 µM pour laquelle le DHA atteint près de 40%
de l’ensemble des acides gras.
Il est plus difficile de discuter de la pertinence nutritionnelle de résultats
obtenus sur un modèle de cellules en culture. Pour la prévention cardiovasculaire, la dose de
DHA recommandée est comprise entre 0,5 et 1 g/jour (Din et al., 2004). Alors que la
consommation habituelle dans les pays industrialisés se situe plutôt autour de 200 mg/jour, un
apport supplémentaire en DHA peut être obtenu par une consommation plus importante de
poisson ou par des compléments alimentaires. Chez des adultes hyperlipidémiques
supplémentés avec 1 g/jour de DHA, le pourcentage de DHA dans les PL totaux des globules
rouges passe de 4% à 8% après 4 mois de supplémentation (Arterburn et al., 2006). Chez des
adultes sains supplémentés avec des doses croissantes de DHA (200 mg, 400 mg, 800 mg puis
1600 mg sur des périodes successives de 2 semaines, étude docoredox) le pourcentage de
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
210
DHA dans les PL totaux des monocytes et des plaquettes passe respectivement de 3,25% à
5,5% (Mebarek et al., 2008) et de 3% à 6% (communication personnelle). Dans les
macrophages RAW cultivés en présence de 30 µM de DHA non estérifié le pourcentage de
DHA dans les PL totaux passe de 3% à 15% (résultats non montrés), ce qui est donc supérieur
à ce qui est observé in vivo dans des conditions de supplémentation nutritionnelle. L’étude de
supplémentation nutritionnelle chez la souris apporte dans ce contexte des informations
importantes. En effet nous avons montré que l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP se forme
dans le foie de souris nourries avec un régime alimentaire riche en DHA respectant les
recommandations selon lesquelles le DHA peut représenter jusqu’à 10% de l’apport
énergétique dû aux lipides (Gebauer et al., 2006). A ce stade de l’étude il serait intéressant de
vérifier, dans le cadre de supplémentations nutritionnelles en DHA, si l’espèce moléculaire
22:6/22:6-BMP se forme chez l’Homme dans les cellules sanguines.
Dans des conditions pathologiques où le stress oxydant est augmenté le BMP
riche en DHA pourrait constituer une cible priviliée de la peroxydation lipidique. Notre étude
suggère que la sensibilité particulière du BMP riche en DHA à la peroxydation lipidique
pourrait avoir dans ce contexte un rôle bénéfique pour la cellule. En effet, en constituant une
cible privilégiée pour les espèces radicalaires, le BMP riche en DHA pourrait protéger les
autres lipides à proximité. Les résultats expérimentaux obtenus dans un système acellulaire
nous ont permis de montrer que la présence de 22:6/22:6-BMP ralentit l’oxydation du
cholestérol et donc la génération d’oxystérols. Il serait intéressant de rechercher si le
cholestérol dérivé des LDL est davantage protégé de l’oxydation dans des macrophages RAW
enrichis en 22:6/22:6-BMP. En effet, après avoir été captés par les cellules, les esters de
cholestérol contenus dans les LDL sont hydrolysés dans les endosomes tardifs et le
cholestérol libre se trouve ainsi associé avec le BMP. Or, Wen et Leake (2007) ont montré
que le cholestérol dérivé des LDL peut être oxydé à l’intérieur des lysosomes de
macrophages.
Indépendamment de son incorporation dans le BMP, de nombreuses études ont été
réalisées pour évaluer l’impact des acides gras polyinsaturés oméga-3 et du DHA en
particulier sur le status redox des cellules. Vericel et al. (2003) ont décrit un phénomène
biphasique dans les plaquettes avec un effet anti-oxydant du DHA à faible concentration et
pro-oxydant à forte concentration. De plus, il a été montré sur des cellules en culture qu’une
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
211
supplémentation avec des acides gras polyinsaturés oméga-3 réduit la production de ROS et
RNS (espèces radiacalaires dérivées de l’azote) par des cellules endothéliales d’aorte humaine
(Richard et al. 2008) et que le DHA en particulier réduit la peroxydation lipidique généré par
H2O2 dans les lymphocytes humains (Bechoua et al., 1999). In vivo, un traitement à base
d’huile de poisson réduit la production de l’anion superoxyde dans le myocarde et les artères
coronaires chez le singe (Supari et al., 1995) mais n’induit pas d’effet détectable sur la
production de l’anion superoxyde dans l’aorte de rat (Lopez et al., 2001). Enfin des études
chez l’Homme ont montré une réduction de la peroxydation lipidique après une
supplémentation en acides gras oméga-3, notamment en DHA (Mori et al., 2003 ; Mori et al.,
2000).
D’un point de vue mécanistique, en plus d’agir comme un « piégeur » des ROS, il
a été montré par Massaro et al. (2006) que le DHA inhibe l’activité de l’enzyme NADP(H)
oxydase dans les cellules endothéliales en diminuant la translocation de la sous-unité p47phox à
la membrane plasmique, et réduit ainsi la production intracellulaire de ROS. Les ROS ainsi
générés par les macrophages entretiennent la propagation de la peroxydation lipidique dans
les cellules et participent aux processus biochimiques de l’inflammation. De plus, les ROS
sécrétés par les macrophages participent à l’oxydation des LDL qui constituent alors une
source supplémentaire d’oxystérols pour les macrophages. Les travaux récents de Meikle et
al. (2008) ainsi que des expériences préliminaires de notre équipe (non communiqué) ont mis
en évidence la présence de BMP dans les LDL. L’enrichissement des LDL en acides gras
oméga-3 (EPA et DHA) diminue leur sensibilité à l’oxydation (Wander et al., 1998). Il serait
ainsi intéressant de mesurer in vivo l’enrichissement du BMP en DHA dans les LDL, et
d’évaluer l’effet antioxydant du BMP riche en DHA sur le cholestérol des LDL.
Sur le modèle des études fonctionnelles présentées dans la deuxième partie des
résultats il serait également intéressant d’étudier les conséquences de l’accumulation de
l’espèce 22:6/22:6-BMP sur le métabolisme du cholestérol qui transite via les endosomes
tardifs. Nous avons réalisé des expériences préliminaires d’immunofluorescence à l’aide de
l’anticorps anti-BMP sur des cellules incubées en présence de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E.
Les images obtenues sont présentées dans l’annexe 3. Lorsque les cellules sont marquées avec
l’anticorps anti-BMP et un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome, le profil de
distribution de la fluorescence n’est pas modifié dans les cellules incubées en présence de
22:6/22:6-PG seul. En effet, on retrouve une distribution du BMP ponctuée et périnuclaire
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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212
caractéristique des endosomes tardifs, comme dans les cellules contrôles. En revanche, dans
les cellules incubées en présence de 22:6/22:6-PG + vitamine E nous n’observons aucun
signal de fluorescence, ce qui indique que les cellules ne sont pas marquées par l’anticorps
anti-BMP. Ce résultat est reproductible mais difficilement explicable car le ou les antigènes
reconnus par l’anticorps n’ont jamais été précisément caractérisés. De plus la vitamine E seule
n’induit pas cet effet. Nous pouvons supposer que l’anticorps ne reconnait pas le BMP lorsque
celui-ci est trop enrichi en DHA ou que l’accumulation de 22:6/22:6-BMP modifie la
structure des endosomes tardifs et rend les domaines riches en BMP inaccessibles à
l’anticorps dans ces conditions de marquage.
Une autre série d’expériences a été menée en utilisant des LDL et des LDL
acétylées fluorescentes (DiI-LDL et DiI-acLDL) afin de marquer les endosomes tardifs et
observer éventuellement une modification de leur structure. Les images obtenues sont
également présentées dans l’annexe 3. Les résultats ne sont pas faciles à analyser en raison
d’une variabilité importante entre les cellules. Toutefois il semble que dans les cellules
incubées en présence de 22:6/22:6-PG sans vitamine E les compartiments marqués par les
LDL fluorescentes sont plus larges par rapport aux cellules contrôles. Dans les cellules
incubées en présence de 22:6/22:6-PG + vitamine E on observe des compartiments en forme
de petits filaments péri-nucléaires. Ces résultats très préliminaires suggèrent que
l’accumulation de l’espèce 22:6/22:6-BMP pourrait entraîner des modifications de tailles
et/ou de structures des endosomes tardifs.
Enfin nous avons mené des études préliminaires visant à évaluer les conséquences
de l’accumulation de 22:6/22:6-BMP sur le métabolisme du cholestérol dérivé de la captation
des LDL. Sur des cellules incubées en présence de 22:6/22:6-PG + vitamine E, nous avons
observé, comme dans les cellules incubées en présence de 18:1/18:1-PG, une diminution de
l’estérification et de l’efflux. Cependant les résultats sont plus difficiles à interpréter en raison
des effets induits par le DHA lui-même sur le métabolisme du cholestérol. En effet, en
présence de 22:6/22:6-PG, le DHA s’incorpore de façon non négligeable dans les autres
phospholipides cellulaires et il est connu que le DHA modifie la captation des LDL (Seo et
al., 2002 ; Shichiri et al., 1993) ainsi que l’estérification (Davis, 1992 ; Pal et Davis, 1991) et
l’efflux du cholestérol (Dusserre et al., 1995 ; Pal et Davis, 1990). Il semble donc difficile,
d’un point de vue expérimental, de s’affranchir des effets du DHA pour ne mesurer que les
effets de l’accumulation du 22:6/22:6-BMP. C’est la raison pour laquelle nous n’avons pas
poursuivi l’étude en ce sens.
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
213
Des études fonctionnelles sur le BMP ont été récemment réalisées in vitro.
L’équipe d’Hayakawa a étudié les propriétés biophysiques de membranes reconstituées avec
du BMP et a également réalisé des modélisations moléculaires de bicouches membranaires
constituées de BMP (Hayakawa et al., 2006 ; Hayakawa et al., 2007a). Toutefois les auteurs
ont utilisé dans ces études du 14:0/14:0-BMP et du 16:0/16:0-BMP qui ne semblent pas se
former en grande quantité in vivo. Matsuo et al. (2004) ont montré sur des liposomes
reconstitués que la présence de BMP induit la formation de liposomes multi-vésiculaires. Pour
cela les auteurs ont utilisé du 18:1/18:1-BMP qui est l’espèce moléculaire majoritaire dans
plusieurs types cellulaires. Dans le cadre de notre projet il serait intéressant de réaliser le
même type d’expériences avec le standard de 22:6/22:6-BMP. Ceci pourrait nous permettre de
mieux comprendre les conséquences fonctionnelles de l’accumulation de BMP riche en DHA
sur l’organisation et la dynamique des membranes des endosomes tardifs.
CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
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CONCLUSION GENERALE ET PERSPECTIVES
Le contexte physiopathologique de notre projet de recherche concerne les
maladies cardiovasculaires et notamment l’athérosclérose. L’une des premières étapes de
l’athérogenèse est l’évolution des macrophages résidents dans l’intima des artères en cellules
spumeuses suite à une dérégulation de l’homéostasie du cholestérol dans ces cellules. Dans ce
contexte nous avons étudié les relations métaboliques et fonctionnelles entre le BMP, le DHA
et le cholestérol dans des macrophages en culture.
Notre premier objectif était de mieux comprendre le rôle cellulaire du BMP sur le
métabolisme et le transport intracellulaire du cholestérol dans les macrophages. Nous nous
sommes tout d’abord inspiré des travaux réalisé par le Dr. Kobayashi qui a utilisé un anticorps
anti-BMP pour altérer spécifiquement la fonction du BMP. Comme rapporté précédemment
dans ses travaux sur des fibroblastes en culture (Kobayashi et al., 1998b ; Kobayashi et al.,
1999), nous avons montré que l’anticorps anti-BMP s’accumule dans les endosomes tardifs
des macrophages et induit une accumulation de cholestérol dans ces mêmes structures. Nous
avons par ailleurs montré que l’anticorps altère spécifiquement le transport et la distribution
du cholestérol issu des LDL dans la membrane plasmique ainsi que l’efflux de cholestérol
vers les HDL.
Nous avons ensuite développé une approche expérimentale permettant
d’augmenter spécifiquement et jusqu’à 4 fois la quantité cellulaire du BMP dans les
macrophages RAW, ceci afin d’en évaluer les conséquences sur l’homéostasie du cholestérol.
Cette approche consiste à stimuler la synthèse et l’accumulation de BMP en incubant les
cellules avec le précurseur phosphatidylglycérol (18:1/18:1-PG). Nos résultats, bien que
préliminaires, semblent indiquer que l’accumulation de BMP dans les cellules bloque
partiellement la redistribution du cholestérol dérivé des LDL depuis les endosomes tardifs
vers les autres compartiments cellulaires. Ainsi, le BMP accumulé dans les endosomes tardifs
retiendrait le cholestérol dans ce compartiment.
L’accumulation de l’anticorps et l’accumulation de BMP dans les endosomes
tardifs semblent conduire à des effets similaires, caractérisés par une modification de la
répartition du cholestérol dérivé des LDL et notamment par une accumulation de cholestérol
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dans les endosomes tardifs. Il est possible que dans ces deux conditions expérimentales
l’organisation des microdomaines riches en BMP (Kobayashi et al., 2002 ; Sobo et al., 2007)
soit altérée, ce qui perturberait l’organisation et la dynamique des membranes internes des
endosomes tardifs. La relation fonctionnelle entre le BMP et l’homéostasie du cholestérol
serait alors directement dépendante de l’intégrité des microdomaines riches en BMP.
Il est également intéressant de remarquer qu’une étude récente, réalisée par
l’équipe du Dr. Gruenberg, a mis en avant l’importance de l’équilibre entre la quantité de
cholestérol et la quantité de BMP dans le transport endosomal du cholestérol, cet équilibre
étant lui-même régulé par la protéine Alix (Chevallier et al., 2008). Cette étude montre qu’un
déficit en BMP diminue la capacité des endosomes tardifs à stocker le cholestérol ce qui est
cohérent avec nos propres observations. Toutefois cette même étude indique que dans des
conditions pathologiques comme la maladie de Niemann-Pick de type C (NPC) où le
cholestérol est accumulé de façon massive dans les endosomes tardifs, un apport exogène de
BMP permet d’améliorer la redistribution du cholestérol notamment vers la membrane
plasmique. Le rôle précis du BMP dans la régulation de l’homéostasie du cholestérol semble
donc complexe et pourrait dépendre de nombreux facteurs comme ceux qui sont affectés dans
les syndromes métaboliques qui entraînent une accumulation endosomale/lysosomale de
cholestérol (Frolov et al., 2001 ; Puri et al., 1999). Il serait donc particulièrement intéressant
d’étudier plus en détail le rôle du BMP dans le cadre précis de ces pathologies, et l’approche
que nous avons développée avec du PG pour modifier spécifiquement la quantité cellulaire de
BMP pourrait s’avérer un outil très utile. L’identification des enzymes métaboliques du BMP
pourrait alors fournir de nouvelles stratégies biomédicales pour lutter contre ces lipidoses
affectant les lysosomes.
Un autre aspect particulier du BMP est sa très forte propension à incorporer le
DHA (Besson et al., 2006 ; Luquain et al., 2000), un acide gras polyinsaturé d’intérêt
nutritionnel dont les bénéfices cardiovasculaires ont été rapportés chez l’Homme (Lee et al.,
2008). Les mécanismes de cette incorporation sélective et la signification biologique de
l’avidité du BMP pour le DHA restent toutefois inconnus. Nous avons montré que
l’incorporation massive du DHA dans le BMP peut induire, in vitro et in vivo, la formation et
l’accumulation de l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP. La présence de DHA dans les
phospholipides modifie fortement les propriétés membranaires (Stillwell et Wassall, 2003)
notamment dans les processus de formation des microdomaines (Chapkin et al., 2008).
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Comme nous l’avons vu, le BMP est lui-même impliqué dans la formation de microdomaines
spécifiques dans les membranes internes des endosomes tardifs (Kobayashi et al., 2002 ; Sobo
et al., 2007). Une hypothèse intéressante serait que le 22:6/22:6-BMP modifie fortement les
propriétés de ces microdomaines riches en BMP. Si ces propriétés sont déterminantes, comme
nous le proposons ci-dessus, la composition en acides gras du BMP pourrait alors intervenir
directement dans la relation fonctionnelle qui existe entre le BMP et l’homéostasie du
cholestérol. Par ailleurs il a été proposé que certaines lipidoses affectant les lysosomes soient
dues à une accumulation de microdomaines dans les endosomes tardifs/lysosomes (Simons et
Gruenberg, 2000). De plus, l’espèce moléculaire 22:6/22:6-BMP a été retrouvée en grande
quantité chez des rats traités avec des drogues mimant le phénotype de ces lipidoses (Baronas
et al., 2007). Ainsi, l’enrichissement spécifique du BMP en DHA pourrait être impliqué dans
ces pathologies. Des études plus précises sur les relations métaboliques et fonctionnelles entre
le BMP, le DHA et le cholestérol pourraient permettre de développer de nouvelles approches
thérapeutiques originales.
Notre étude a également permis de montrer que l’espèce moléculaire 22:6/22:6-
BMP, fortement insaturée, présente une grande sensibilité à la peroxydation lipidique qui peut
la rendre vulnérable dans un contexte pathologique où le stress oxydant cellulaire est
augmenté. De cette propriété découle l’un de nos résultats les plus originaux. Il s’agit de
l’action anti-oxydante du 22:6/22:6-BMP vis-à-vis du cholestérol que nous avons mise en
évidence sur un modèle membranaire in vitro. Nous proposons en effet que le 22:6/22:6-
BMP, en étant une cible privilégiée du stress oxydant, puisse protéger les autres molécules
présentes dans son environnement membranaire proche, notamment le cholestérol dérivé des
LDL. Il serait intéressant de mettre en évidence cet effet protecteur au niveau cellulaire en
vérifiant par exemple que les macrophages enrichis en 22:6/22:6-BMP génèrent moins
d’oxystérols (Wen et Leake, 2007). En effet les oxystérols sont très délétères pour les cellules
(Clare et al., 1995) et ils participent à l’apparition et au développement des plaques
d’athérome (Leonarduzzi et al., 2002). Ainsi, l’enrichissement du BMP en DHA pourrait être
un mécanisme en partie responsable de l’effet bénéfique du DHA sur les maladies
cardiovasculaires et dont les bases cellulaires ne sont encore que très peu comprises.
Le BMP a été identifié pour la première fois en 1973. Pendant près de 10 ans sa
structure très particulière a alors fait l’objet de nombreux travaux puis son métabolisme
(remodelage des acides gras, biosynthèse…) a été largement étudié. Depuis 1998 et les
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premiers travaux du Dr. Kobayashi, l’ensemble des études fonctionnelles sur le BMP mettent
en lumière son rôle essentiel au sein des membranes endosomales et ouvrent des perspectives
nouvelles, à plus ou moins long terme, pour des applications médicales notamment dans le
cadre de l’athérosclérose ainsi que des lipidoses affectant les lysosomes comme la maladie de
Niemann-Pick de type C.
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ANNEXES
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255
ANNEXES
ANNEXES LISTES DES ANNEXES
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
256
LISTE DES ANNEXES
ANNEXE 1 : L’athérosclérose
ANNEXE 2 : Chromatogrammes des acides gras analysés par
chromatographie gazeuse
ANNEXE 3 : Etude en microscopie à fluorescence des macrophages RAW
en présence de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E
ANNEXE 4 : Publications scientifiques
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
257
ANNEXE 1
L'athérosclérose
Le contexte physiopathologique du travail présenté dans ce manuscrit concerne
les maladies cardiovasculaires et l’athérosclérose en particulier. Dans cette annexe sont
présentées des informations complémentaires sur l’épidémiologie de l’athérosclérose, sur les
principaux éléments impliqués dans l’athérogenèse notamment les macrophages et les
lipoprotéines, ainsi que sur le processus athéromateux. La majorité des informations
proviennent de l’ouvrage L’athérosclérose : Physiopathologie, diagnostics, thérapeutiques de
J-F Toussaint (Toussaint et al., 2003).
L’athérosclérose est une lésion anatomique touchant les grosses et moyennes
artères, principalement l’aorte et les carotides, les artères coronaires, les artères cérébrales et
les artères des membres inférieurs. De façon générale, le terme « sclérose » désigne toute
dégénérescence fibreuse d’un tissu ou d’un organe. L’athérome correspond à un remaniement
de l’intima des artères par accumulation locale de lipides, de polysaccharides, de sang et de
produits sanguins, de tissus fibreux et de dépôts calcaires. A ceci s’ajoute également des
modifications de la media des parois artérielles. A la différence de l’artériosclérose qui est un
phénomène naturel lié au vieillissement physiologique des artères, l'athérosclérose est un
processus évolutif pathologique qui reste pendant très longtemps asymptomatique avant d’être
révélé par un accident grave dû à l’une de ses nombreuses complications (sténose, ischémie,
thrombose, hémorragie…), par exemple un infarctus du myocarde, une embolie pulmonaire,
un accident vasculaire cérébral (AVC)…
1. Epidémiologie et facteurs de risque
Dans le monde, les deux premières causes de mortalité sont des complications de
l'athérosclérose : les ischémies cardiaques et les accidents vasculaires cérébraux avec
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
258
respectivement 7,4 millions et 5,1 millions de décès en 1998 (sur un total mondial de 53,8
millions de décès selon le rapport sur la santé dans le monde de l’OMS de 1999). La « Global
Burden of Disease Study » avait déjà rapporté cette tendance pour l’année 1990 (Figure 66)
(Murray et Lopez, 1997a). Toujours d’après cette étude, les prévisions réalisées jusqu’en 2020
indiquent que les accidents cardiovasculaires devraient rester la première cause de décès dans
le monde (Murray et Lopez, 1997b).
Le projet MONICA (« monitoring trends and determinants in cardiovascular
disease ») a suivi l’évolution de la fréquence des maladies cardiovasculaires sur une période
longue (1983-1985 à 1992-1994) et simultanément dans 37 régions appartenant à 21 pays
différents (sans auteur, 1988). Cette étude a montré qu’il existe une très grande disparité de
l’incidence de la maladie suivant les pays. Alors que celle-ci est très élevée dans les pays de
l’Europe du Nord et de l’Amérique du Nord, notamment aux Etats-Unis, elle est beaucoup
plus faible dans les zones méditerranéennes, les pays asiatiques et le tiers monde.
En France, les maladies cardiovasculaires sont à l’origine d’environ 40% des
décès et restent ainsi la première cause de mortalité (Ducimetiere et al., 2006). Les données
de l’étude MONICA pour la France ont également montré que l’incidence de l’athérosclérose
est plus élevée dans le Nord de la France que dans le Sud (Cambou et al., 1996).
Figure 66 : Nombre de décès liés aux maladies cardiaques ischémiques par pays en 1990 (pour 100000 habitants)
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
259
Les facteurs de risque de l'athérosclérose sont multiples. On peut en distinguer
deux sortes :
- les facteurs de risque non modifiables :
L’âge est le premier facteur de risque associé l'athérosclérose. Le sexe, également, puisque les
hommes sont plus touchés que les femmes qui bénéficient d’une protection hormonale jusqu’à
la ménopause. Enfin il existe aussi un terrain héréditaire favorisant le développement de la
maladie.
- les facteurs de risques modifiables :
La prévalence de l’athérosclérose est corrélée avec le stade d’industrialisation d’un pays ou
d’une région. En effet le mode de vie et les habitudes alimentaires ont des effets importants
sur l’incidence de l'athérosclérose. Le tabagisme, l’alcool, la sédentarité, le stress ainsi qu’une
alimentation trop riche en glucides et matières grasses (cholestérol et acides gras saturés) et
pauvre en fibres alimentaires et vitamines C et E, favorisent la survenue de troubles
métaboliques comme l’obésité, le diabète, l’hypertension artérielle et un taux élevé de LDL
plasmatiques. Ces troubles métaboliques augmentent le risque associé au développement de
complications liées à l'athérosclérose.
2. La paroi vasculaire
Les artères sont toutes constituées de trois couches concentriques qui, de la
lumière du vaisseau vers l’extérieur, sont : l’intima, la média et l’adventice (Figure 67).
L’intima est la couche la plus interne et la plus fine. C’est à ce niveau que se
développe la plaque d’athérome. Elle est constituée d’une couche unique de cellules
endothéliales (l’endothélium) formant une couverture étanche. La zone sous endothéliale est
composée de fibres conjonctives, d’élastine, de collagène et de protéoglycanes formant un
tissu conjonctif lâche. Cette zone renferme également de nombreuses cellules du système
immunitaire.
La média est principalement constituée de cellules musculaires lisses qui assurent
un remodelage permanent des vaisseaux en réponse aux variations physiologiques de
l’organisme. Elle contient également des fibres de collagène et d’élastine. Son épaisseur est
variable suivant le type d’artère.
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
260
L’adventice est un tissu conjonctif formant la couche externe des artères. Elle est
très riche en collagène et en fibres élastiques, et contient des fibroblastes et des adipocytes.
Elle assure l’ancrage de l’artère à son environnement.
3. Les macrophages
3.1 Origine et morphologie
Les macrophages sont de grosses cellules mononuclées dérivées de la
différenciation des monocytes. Les monocytes, dérivés de la moelle osseuse à partir de
cellules souches myéloïdes, sont présents dans la circulation sanguine. Ainsi les monocytes
peuvent migrer vers les différents organes et infiltrer les tissus en traversant l’endothélium
vasculaire. Ils subissent alors leur différenciation terminale en macrophages résidents.
Il existe une grande diversité de macrophages selon les tissus où ils se trouvent.
Par exemple on les nomme cellules de Kupffer dans le foie, ostéoclastes dans les tissus
osseux, cellules microgliales dans le tissu nerveux, macrophages alvéolaires dans les
poumons, etc. Ils ont néanmoins quelques caractéristiques communes : ce sont de grosses
cellules (20-50 µm de diamètre) possédant un noyau relativement important et excentré, un
système de Golgi très développé et de nombreux granules cytoplasmiques. De plus les
macrophages expriment un grand nombre de récepteurs membranaires. Certains macrophages
ont la capacité de former des pseudopodes pour se déplacer au sein d’un tissu.
Figure 67 : Représentation schématique de la paroi artérielle saine.
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
261
3.2 Fonctions des macrophages et implications en pathologie humaine
Les macrophages appartiennent à la famille des cellules immunitaires. Ils jouent
un rôle essentiel dans l’immunité innée en tant que défense non-spécifique notamment grâce à
leur capacité de phagocytose. Ils participent également à l’immunité adaptative via le
phénomène d’opsonisation. En effet, après avoir phagocyté et digéré des débris cellulaires ou
des pathogènes ils peuvent se comporter comme des cellules présentatrices d’antigènes
permettant l’activation des lymphocytes T et ainsi l’amplification immunitaire. De plus les
macrophages sécrètent une grande variété de médiateurs comme des cytokines pro-
inflammatoires (IL-1α et β, TNF α et IL-6), des facteurs de croissances (PDGF…), des
chimiokines (IL-8, MCP…) ainsi que des prostaglandines et leucotriènes.
Les macrophages résidents sont des cellules complètement différenciées qui ne se
divisent plus et qui peuvent demeurer plusieurs mois dans un tissu. Ils résident à des endroits
stratégiques susceptibles d’accumulation de débris ou d’invasion microbienne comme les
poumons, le foie, les tissus nerveux ou les tissus conjonctifs. En cas de besoin les monocytes
circulants peuvent également être recrutés sur le lieu d’une inflammation. Ils sont attirés par
chimiotactisme grâce à des signaux d’appel dérivés de cellules endommagées (par nécrose ou
apoptose), de pathogènes ou de cellules présentes sur le lieu d’inflammation comme les
macrophages eux-mêmes.
Les macrophages résidents dans l’espace sous endothélial (intima) jouent un rôle
important au cours de l’athérogénèse. En effet ces derniers ont la capacité de capter, par
endocytose, les lipoprotéines de faible densité (LDL) natives ou modifiées, principalement par
oxydation. Or, dans un contexte pathologique où les macrophages accumulent de nombreuses
vésicules lipidiques riches en esters de cholestérol, ils évoluent en cellules spumeuses
constituant une partie essentielle des lésions athéromateuses.
4. Le métabolisme des lipoprotéines
Le métabolisme des lipoprotéines est complexe. Il dépend de mécanismes faisant
intervenir de nombreux récepteurs et enzymes et permet le transport des lipides exogènes et
endogènes dans l’organisme entier. On distingue trois voies de transport qui sont très
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
262
interconnectées notamment car se produisent entre elles de nombreux échanges de lipides et
de protéines. Il s’agit de la voie de transport des lipides exogènes issus de l’alimentation (à
partir de l’intestin vers les tissus périphériques), la voie de transport des lipides endogènes du
foie vers les tissus périphériques et la voie de transport retour des lipides endogènes des tissus
vers le foie ou « transport inverse du cholestérol ».
4.1 Transport des lipides exogènes : voie entéro-hépatique
Cette voie de transport permet d’amener les lipides alimentaires de l’intestin vers
les tissus périphériques notamment aux muscles pour la production d’énergie et aux tissus
adipeux pour le stockage d’énergie. Les lipides alimentaires sont hydrolysés et absorbés au
niveau intestinal. Les acides gras et le cholestérol sont alors ré-estérifiés en triglycérides (TG)
et esters de cholestérol (CE) puis assemblés à l’aide de l’apo B-48 pour former des
chylomicrons. Les chylomicrons, riches en TG, sont sécrétés dans la lymphe par les
entérocytes avant de rejoindre la circulation sanguine. La protéine MTP (« Microsomal
Triglycéride Transfer Protein ») joue un rôle essentiel dans l’assemblage et la sécrétion des
chylomicrons. Une fois sécrétés, les chylomicrons acquièrent rapidement les apolipoprotéines
A-I, A-II, A-IV, C et E.
Les chylomicrons sont transportés vers les tissus périphériques où les TG qu’ils
contiennent sont hydrolysés par la lipoprotéine lipase (LPL) liée à l’endothélium des
capillaires. Les acides gras libérés sont rapidement captés par les tissus. Au cours de
l’hydrolyse des TG le rapport CE/TG augmente et une partie des apoA-I se dissocie et
contribue à l’émergence de nouvelles particules de préβHDL. Ces particules HDL, riches en
protéines et pauvres en lipides, jouent un rôle essentiel dans l’efflux du cholestérol des tissus
périphériques et le transport inverse du cholestérol (voir paragraphe 4.3). Les particules
résiduelles de chylomicrons (« remnants ») retournent au foie où elles sont captées par les
hépatocytes. Le récepteur des LDL et le récepteur LRP contribuent à la reconnaissance et à
l’internalisation des résidus de chylomicrons qui subissent alors une lipolyse et une protéolyse
quasi complète. Le cholestérol sera excrété sous forme d’acides biliaires ou utilisé pour la
formation de nouvelles lipoprotéines, les VLDL.
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
263
4.2 Transport des lipides endogènes du foie vers les tissus
Quelques heures suivant un repas, lorsque la quantité de chylomicrons en
circulation est faible, l’apport en TG aux tissus périphériques est assuré par une autre famille
de lipoprotéines : les lipoprotéines de très faible densité (VLDL). Les VLDL sont synthétisées
par le foie à partir des TG et CE hépatiques, ainsi que de l’apoB-100, puis sécrétées dans la
circulation sanguine.
Dans la circulation les VLDL naissantes s’enrichissent en apoC et E provenant
des HDL. Comme les chylomicrons, les TG contenus dans les VLDL sont hydrolysés par la
LPL au niveau des tissus périphériques. En s’appauvrissant en TG les VLDL évoluent
progressivement en lipoprotéines de densité intermédiaire (IDL). Les IDL continuent de
s’appauvrir en TG sous l’action d’une autre enzyme lipolytique, la lipase hépatique (HL), et
perdent les apolipoprotéines, soit par échange, soit par libération dans le plasma. Ainsi, les
IDL évoluent en lipoprotéines de faible densité (LDL) riches en CE et ne contenant qu’une
apolipoprotéine B-100. Chez l’homme, les VLDL et les IDL acquièrent également des CE
contre des TG par échange avec les HDL. Ce transfert est réalisé grâce à la protéine de
transfert des esters de cholestérol (CETP). C’est donc la combinaison des activités LPL (sur
les VLDL) et HL (sur les IDL), induisant une perte progressive des TG, et de l’activité CETP
(sur les VLDL et IDL), induisant un enrichissement en CE, qui conduit à la formation de LDL
(CE>TG) à partir des VLDL hépatiques (TG>CE).
Les LDL en circulation sont alors captées par les cellules des tissus périphériques
dont les cellules hépatiques ainsi que les macrophages présents dans l’espace sous-endothélial
des artères. La reconnaissance et l’endocytose des LDL se produit grâce à leur interaction
avec différents récepteurs cellulaires spécifiques ou non. Les LDL assurent ainsi un apport en
cholestérol aux tissus périphériques.
4.3 Transport des lipides endogènes des tissus vers le foie : « transport inverse du
cholestérol »
La plupart des tissus périphériques sont incapables de cataboliser le cholestérol.
Le foie est le principal organe capable d’éliminer le cholestérol excédentaire de l’organisme
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
264
par excrétion dans la bile, soit sous forme native, soit après conversion en acide biliaire. Ainsi
on appelle « transport inverse du cholestérol » (en anglais « reverse cholesterol transport » ou
RCT) la voie de transport qui permet de ramener le cholestérol des tissus périphériques au
foie, par l’intermédiaire des lipoprotéines de haute densité (HDL) (Cuchel et Rader, 2006 ;
Ohashi et al., 2005 ; Tall, 2008). Cette voie a été proposée pour la première fois par Glomset
en 1968 (Glomset JLR 1968).
Les HDL sont synthétisées principalement par le foie sous forme « native » ou
« naissante ». Les HDL natives (aussi appelées préβHDL en opposition aux particules de
HDL de type α plus riches en lipides neutres) sont constituées d’apolipoprotéines A-I
associées à quelques molécules de phospholipides et de cholestérol. Ces particules pauvres en
lipides ont une forme discoïdale et une densité élevée. Des particules de préβHDL peuvent
également être synthétisées par l’intestin ou provenir du métabolisme intravasculaire des
lipoprotéines. En effet les chylomicrons d’origine intestinale, lors de l’hydrolyse de leur TG
par la LPL, perdent des apoA-I qui vont pouvoir reformer des préβHDL grâce à l’activité de
la protéine de transfert des phospholipides (PLTP). De plus, comme nous le verrons plus loin,
les particules de αHDL subissent dans le compartiment plasmatique un remodelage qui
aboutit à la régénération de préβHDL natives.
La capacité des HDL, et notamment des préβHDL, à stimuler l’efflux du
cholestérol des tissus périphériques pour le ramener au foie est l’étape clé du transport inverse
du cholestérol. Les HDL sont capables de capter le cholestérol excédentaire à partir de
l’ensemble des tissus périphériques de l’organisme mais il est généralement admis que c’est
l’efflux du cholestérol à partir des cellules des parois artérielles, principalement des
macrophages, qui est directement pertinent dans la physiopathologie de l’athérosclérose. En
effet les macrophages présents dans l’espace sous endothélial acquièrent de grandes quantités
de cholestérol par endocytose des LDL modifiées. Or l’accumulation de cholestérol sous
forme libre et estérifiée peut mener à la formation de macrophages spumeux jouant un rôle
important dans le développement de la plaque d’athérome. Les mécanismes d’efflux du
cholestérol à partir des macrophages sont décrits en détail dans le chapitre 1 des rappels
bibliographiques.
En captant le cholestérol présent dans la membrane plasmique des macrophages,
les préβHDL s’enrichissent progressivement en cholestérol libre. Ce cholestérol est alors
estérifié par l’enzyme lécithine-cholestérol-acyltransférase (LCAT). Les esters de cholestérol
ainsi formés migrent vers le cœur hydrophobe de la particule qui évolue progressivement en
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
265
HDL3 (αHDL), sphérique et moins dense que les préβHDL. L’activité LCAT, en consommant
le cholestérol libre et les phospholipides des HDL, restaure une certaine avidité des particules
HDL pour le cholestérol libre membranaire.
Les HDL3 circulantes évoluent alors en HDL2 en échangeant leurs esters de
cholestérol avec les VLDL contre des TG. Cette réaction, catalysée par la protéine de transfert
des esters de cholestérol (CETP), permet de rediriger les esters de cholestérol synthétisés par
la LCAT vers les lipoprotéines contenant l’apoB100 (VLDL et LDL). Celles-ci rapportent
alors les esters de cholestérol au foie grâce à leur interaction avec le récepteur aux LDL (R-
LDL), terminant ainsi le transport inverse du cholestérol.
Lors de ce transfert catalysé par la CETP, les HDL3 s’enrichissent en TG et
évoluent donc progressivement en HDL2, plus grosses et moins denses. Les TG contenus dans
ces particules vont alors être hydrolysés par la lipase hépatique (HL). L’action combinée des
enzymes CETP (qui échange les CE contre des TG) et HL (qui hydrolyse ces TG) appauvrit le
cœur des HDL2 en lipides neutres. Il apparaît alors une instabilité de la particule qui se divise
en une particule HDL de petite taille pauvre en lipides neutres et en une nouvelle particule de
préβHDL.
Les HDL3 évoluent également en HDL2 grâce à l’action de la protéine de transfert
des phospholipides (PLTP) qui permet la fusion de deux HDL3 de taille intermédiaire pour
former une particule HDL2 de grande taille. Lors de cette fusion des particules de préβHDL
sont également régénérées.
Comme nous l’avons vu les esters de cholestérol contenus dans les HDL sont
rapportés au foie après leur transfert aux VLDL. Toutefois les αHDL sont également capables
de transférer le cholestérol et les esters de cholestérol qu’elles contiennent dans les cellules du
foie grâce à leur interaction avec le récepteur SR-B1. Le cholestérol est alors transféré par un
processus sélectif durant lequel la particule de HDL n’est pas endocytée et pouvant donc être
réutilisée pour accepter le cholestérol des tissus périphériques. Une partie mineure du
cholestérol des HDL est également délivrée aux reins et aux tissus stéroïdogènes.
La majorité du cholestérol des HDL entrant dans l’hépatocyte est métabolisé par
voie extralysosomale et est directement éliminé dans la bile. En revanche le cholestérol des
VLDL et LDL internalisées est métabolisé par voie intralysosomale et est éliminé sous forme
de sels biliaires.
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
266
Figure 68 : Schéma du métabolisme des lipoprotéines : le transport du cholestérol dans l’organisme. VLDL : lipoprotéines de très faible densité. IDL : lipoprotéines de densité intermédiaire. LDL : lipoprotéines de faible densité. HDL : lipoprotéines de haute densité. LPL : lipoprotéine lipase. HL : lipase hépatique. CETP : protéine de transfert des esters de cholestérol. LCAT : lécithine-cholestérol-acyltransférase. CE : esters de cholestérol. FC : cholestérol libre. TG : triglycérides.
cholestérol
cholestérol
LPL
LPL
CHYLOMICRONS
TG CE
CHYLOMICRONSREMNANT
VLDL
IDL LDL
preβHDL
HDLCE
FCLCAT
HDL
HL
CETP
Cellules du foie
Cellules périphériques(macrophages)
Intestin
Capillaires
Capillaires
LIPIDES ALIMENTAIRESVo
ie d
e tr
ansp
ort e
xogè
neVo
ie d
e tr
ansp
ort e
ndog
ène
Tran
spor
t inv
erse
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
267
5. Le processus athéromateux
La lésion d’athérosclérose passe par différents stades dont chacun est l’évolution
du précédent. La description anatomopathologique moderne de l’athérosclérose retient trois
stades évolutifs de la plaque d’athérome : la strie lipidique (lésions précoces), la lésion fibro-
lipidique ou fibro-athérome (lésions avancées) et la lésion compliquée. Une classification plus
détaillée a été proposée par Stary (Stary et al., 1994) divisant l’évolution de la plaque en sept
stades de gravité croissante (Tableau 17 et Figure 69).
La genèse de la plaque d’athérome, ou athérogenèse, dépend d’un grand nombre
de mécanismes. L’apparition de la plaque au stade précoce de son développement est
principalement due à l’accumulation de LDL dans l’espace sous endothélial où elles vont
subirent des modifications, principalement par oxydation, conduisant à leur internalisation par
les macrophages résidents. Ces macrophages, suite à l’accumulation intracellulaire de
gouttelettes d’esters de cholestérol, vont évoluer en cellules spumeuses et se déposer au sein
de la paroi artérielle. Cette série d’évènements est essentielle au cours des phases précoces de
l’athérogenèse mais aussi au cours de la progression de la plaque d’athérosclérose car ces
mêmes mécanismes se poursuivent dans la plaque constituée.
TYPE DELESIONS
Lésions précocesI Macrophages spumeux isolésII Stries lipidiquesIII Préathérome
Lésions avancéesIV AthéromeV Plaque athéoscléreuse
Lésions compliquéesVI Plaque athéroscléreuse compliquéeVII Plaque fibreuse
TERME PROPOSE
Tableau 17 : Classification des lésions de l’athérosclérose selon Stary. La plaque d’athérome évolue en passant par différents stades, des lésions précoces (types I à III) aux lésions avancées (types IV et V) puis aux lésions compliquées (VI). A ceux-ci s’ajoute un VIIème type de lésion caractérisé par un épaississement massif de l’intima et un noyau lipidique très réduit voire absent.
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
268
La strie lipidique (types I, II et III)
La lésion initiale est uniquement caractérisée par la présence de
macrophages spumeux isolés dans l’intima des artères (type I). Ces lésions initiales peuvent
survenir très tôt dans la vie, chez de jeunes enfants, voire des nourrissons. Le nombre de
macrophages spumeux augmentent progressivement. Ils s’accumulent en couche dans l’intima
des artères, juste sous l’endothélium (type II). On voit ensuite apparaître, en faible quantité,
des lipides extracellulaires (principalement des esters de cholestérol et du cholestérol libre)
qui s’accumulent sous les cellules spumeuses (type III). A ce stade il n’y a pas encore de
véritable centre lipidique. A aucun de ces trois types lésionnels précoces n’est associée de
manifestation clinique.
La lésion fibro-lipidique (types IV et V)
En général après 40 ans les lésions précoces commencent à évoluer en
lésions avancées. Dans un premier temps ces lésions se caractérisent par l’accumulation d’une
grande quantité de lipides extracellulaires formant un centre lipidique sous le groupement de
cellules spumeuses (type IV). Ensuite, le centre lipidique se recouvre d’une chape fibreuse
(fibrose) constituée de matrice extracellulaire (collagène, glycoprotéines, glycosamino-
glycanes…) ainsi que de cellules musculaires lisses, de macrophages, de cellules
endothéliales et de lymphocytes T (type Va). La lésion fibro-lipidique peut également
présenter des calcifications (type Vb) ou être caractérisée par un centre lipidique très petit
voire absent (type Vc). Les lésions fibro-lipidiques, surtout de type V, peuvent entraîner une
sténose (réduction de la lumière artérielle) partielle mais symptomatique des petites artères
comme les coronaires.
La lésion compliquée (type VI) – manifestations cliniques
Les lésions compliquées sont des évolutions des lésions fibro-lipidiques de
types IV ou V liées à un phénomène d’ulcération (type VIa), d’hémorragie intraplaque (type
VIb) ou de thrombose (type VIc). Le type VIa se caractérise par une perte de substance à la
surface de la plaque. La profondeur de l’ulcération est variable et peut parfois n’être que
superficielle, on parle alors d’érosion. Le type VIb correspond à l’entrée de sang à l’intérieur
du noyau lipidique de la plaque, aboutissant à une augmentation rapide de son volume. Le
type VIc ou thrombose est la complication majeure de l’athérosclérose. Elle se caractérise par
ANNEXES ANNEXE 1 : L’athérosclérose
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
269
une rupture ou une érosion de la plaque qui expose alors du matériel lipidique thrombogène
au sang circulant. Ceci entraîne la formation d’un thrombus obstruant la lumière artérielle.
Lorsque la thrombose se développe jusqu’à occlusion complète de l’artère elle conduit à des
accidents ischémiques aigus comme un angor instable, un infarctus du myocarde ou un
accident vasculaire cérébral. Ces lésions de type VI peuvent entraîner d’autres types de
complications comme des embolies (migration du thrombus dans les artères de moyen et petit
calibre entraînant leur occlusion) ou des anévrysmes de l’aorte (dilatation du calibre artériel
associé à un amincissement de la paroi).
Figure 69 : Représentation schématique de l’évolution et la constitution d’une plaque d’athérome de type fibreuse.
ANNEXES ANNEXE 2 : Chromatogrammes des acides gras analysés par chromatographie gazeuse
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
270
ANNEXE 2
Chromatogrammes des acides gras analysés par
chromatographie gazeuse
Figure 70 : Chromatogrammes des acides gras. Exemples de chromatogrammes obtenus par chromatographie gazeuse lors de l’analyse de la composition en acides gras des PC, des PE et du BMP extraits de macrophages RAW cultivés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 18:1/18:1-PG ou 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E.
ANNEXES ANNEXE 2 : Chromatogrammes des acides gras analysés par chromatographie gazeuse
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
271
14:0
15:0
17:0
16:0
16:1
n-9
16:1
n-7
18:0
18:1
n-9
18:2
n-6
18:1
n-7
20:2
n-6
20:3
n-6
20:4
n-6
20:5
n-3
22:6
n-3
22:5
n-3
PC(cellules contrôles)
14:0
15:0
17:0
16:0
16:1
n-9 16
:1n-
7
18:0
18:1
n-9
18:2
n-6
18:1
n-7
20:2
n-6
20:3
n-6
20:4
n-6
20:5
n-3 22
:6n-
322
:5n-
3
16:0
DM
A
18:0
DM
A18
:1n-
9 D
MA
18:1
n-7
DM
A
PE(cellules contrôles)
ANNEXES ANNEXE 2 : Chromatogrammes des acides gras analysés par chromatographie gazeuse
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
272
20:2
n-6
20:3
n-6
20:4
n-6
16:1
n-9
16:1
n-7
18:1
n-7
20:5
n-3
22:6
n-3
22:5
n-3
18:2
n-6
14:0
18:0
15:0
16:0
17:0 18
:1n-
9
BMP(cellules contrôles)
20:2
n-6
20:3
n-6
20:4
n-6
16:1
n-9
16:1
n-7
18:1
n-7
20:5
n-3
22:6
n-3
22:5
n-3
18:2
n-6
14:0
18:0
15:0
16:0
17:0
18:1
n-9
BMP(cellules supplémentées en
18:1/18:1-PG)
ANNEXES ANNEXE 2 : Chromatogrammes des acides gras analysés par chromatographie gazeuse
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
273
20:2
n-6
20:3
n-6
20:4
n-6
16:1
n-9
16:1
n-7 18
:1n-
7
20:5
n-3
22:6
n-3
22:5
n-3
18:2
n-6
14:0
18:0
15:0
16:0
17:0
18:1
n-9
BMP(cellules supplémentées en
22:6/22:6-PG)
20:2
n-6
20:3
n-6
20:4
n-6
16:1
n-9
16:1
n-7
18:1
n-7
20:5
n-3
22:6
n-3
22:5
n-3
18:2
n-6
14:0
18:0
15:0
16:0
17:0
18:1
n-9
BMP(cellules supplémentées en22:6/22:6-PG + vitamine E)
ANNEXES ANNEXE 3 :Etude en microscope à fluorescence des macrophagess RAW
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
274
ANNEXE 3
Etude en microscopie à fluorescence des macrophages
RAW en présence de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E
1. Localisation subcellulaire du BMP à l’aide de l’anticorps anti-BMP
Contrôle 22:6/22:6-PG 22:6/22:6-PG+ vitamine E
Figure 71 : Localisation subcellulaire du BMP dans les macrophages RAW incubés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E. Le marquage est réalisé grâce à l’anticorps anti-BMP et à un anticorps secondaire couplé à un fluorochrome comme décrit dans Matériels et Méthodes.
ANNEXES ANNEXE 3 :Etude en microscope à fluorescence des macrophagess RAW
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
275
2. Marquage des endosomes tardifs/lysosomes à l’aide de LDL et acLDL
fluorescentes
A
Contrôle
22:6/22:6-PG22:6/22:6-PG+ vitamine E
Contrôle 22:6/22:6-PG 22:6/22:6-PG+ vitamine E
B
Figure 72 : Marquage des endosomes tardifs par des LDL et acLDL fluorescentes. Les macrophages RAW sont pré-incubés dans des conditions contrôles ou en présence de 30 µM de 22:6/22:6-PG +/- vitamine E puis incubés en présence de DiI-LDL (A) ou de DiI-acLDL (B) comme décrit dans Matériels et Méthodes.
ANNEXES ANNEXE 4 :Publications scientifiques
Jérôme Bouvier Institut National des Sciences Appliquées Mémoire de thèse (2008)
276
ANNEXE 4
Publications scientifiques