Applicazioni genetica umana e molecolare II parteDr. Stefania [email protected] 4319
BIOTECNOLOGIE MOLECOLARIPrincipi e tecnicheTerry A. BrownBIOTECNOLOGIA MOLECOLAREPrincipi e applicazioni del DNA ricombinanteBernard R. Glick Jack J.PasternakGENETICA UMANA E MOLECOLAREStracan T. Read A.P.
Che cos’è la clonazione dei geni?
1. Frammento di DNA con il gene da clonare viene inserito in un Vettore2. Il vettore trasporta il gene all’interno della cellula ospite3. Il vettore si moltiplica all’interno della cellula ospite producendonumerose copie uguali non solo a se stesso ma anche del gene chetrasporta4. Quando la cellula ospite si divie, alla progenie vengono passate copie della molecola di DNA ricombinante ed il vettore simoltiplica ulteriormente5. Dopo un grande numero di divisioni cellulari, si produce una colonia, o clone costituita da cellule identiche.
La PCR
Espressione genicacon promotori forti e regolabili
Vettori per l’espressione dei geni
ptac: ibrido funzionale dai promotori trp (-35) e lac (-10)
Integrazione del geneclonato nel sito cromosomico
b. subtilis
Vettore di espressione eucariotico
p:unità di trascrizione eucariotica
Metodo per ottenere sequenze di cDNA a lunghezza completa
Saggio di protezione dalla nucleasi S1
SAGE
Screening multiplo dell’espressione genica
Immunoblotting(Western blotting)
Immunocitochimica
Espressione della -tubulina in uncervello di un embrione di topo di 12, 5 giorni
Immunofluorescenza
Proteina a fluorescenza verde come etichetta fornisce un modo utile perseguire l’espressione delle proteine
Identificazione di sequenze di regolazione mediante l’uso di geni Indicatori e le interazioni tra DNA e proteine
Analisi delle delezioni nella regionie promotore del gene umano per Il fattore VIII
Footprinting mediante DnasiI
Saggio di ritardo nel gel
I sistemi “a doppio ibrido”e a “singolo ibrido”in lievito
Phage display
Preparazione di topi transgenici mediante microiniezione nei pronuclei
La mutagenesi mirata mediante ricombinazione omologa puo’inattivare un predeterminato gene cromosomico all’internodi una cellula integra“Hit and run”
La mutagenesi mirata con doppia sostituzione può essere usata per introdurre nel DNA piccole mutazioni
“Tag and exchange”
Il metodo knock-in consente di sostituire l’attività di un gene di undato cromosoma con quella di un altro gene appositamente introdotto
Struttura della sequenza di riconoscimento di loxP
Gene trapping
Clonazione animale