Analyse de liaison, dose-Analyse de liaison, dose-effeteffet
2 sites différents, coopérativité positive?
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Courbes dose-effet, courbes Courbes dose-effet, courbes de liaisonde liaison
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Calcul de la ECCalcul de la EC5050 et de la IC et de la IC5050
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Conclusion:Conclusion:
•La EC50 dépend uniquement du dénominateur, qui décrit Rtot
•La IC50 dépend uniquement du dénominateur, qui décrit Rtot
•Si on mesure dans les mêmes conditions d’incubation la courbe de liaison et la courbe dose effet, EC50 et IC50 doivent être identiques.
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Liaison ligand-récepteur : Liaison ligand-récepteur : rappelrappel
• Compétition: • Saturation:
[ ]50 *
*(1 )i
D
LIC K
K= +
[ ][ ]
[ ][ ]
50
0 50
100%%
oB IB
IC I
IBB IC I
=+
æ ö÷ç =÷ç ÷ç ÷ +è ø
[ ][ ]
[ ][ ][ ] [ ] [ ]
[ ][ ]
[ ]
0
0
0
0
**
*
* * * *
**
*
* 1( *)
*
D
D
D
D
R FB
K F
B F B K R F
BK R B
F
BR B
F K
=+
+ =
= -
æ ö÷ç = -÷ç ÷çè ø
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Liaison « coopérative »Liaison « coopérative »
. n n nn H R R H
[ ][ ]
[ ][ ]
50
0 50
100%%
no
nn
n
nn
B IB
IC I
IBB IC I
=+
æ ö÷ç =÷ç ÷ç ÷ +è ø
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Correspondance ICCorrespondance IC5050-EC-EC5050 absolue?absolue?
•Voir fichier « Excell »! (« Binding-Effet.xls »)
Structures des récepteurs et Structures des récepteurs et activationactivation
Une ou plusieurs conformations actives?
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Familles de récepteursFamilles de récepteurs
• Transmembranaires:o Canaux ioniques contrôlés par les ligands
Signalisation très rapide, plusieurs Sous Unités(4-5),plusieurs TM (4-5 par sous unité)
o G-protein coupled receptors Signalisation rapide (msec), 7 TM, vraisemblablement dimères
o Récepteurs à activité enzymatique ou recrutant des enzymes
1TM dimères ou multimères
• Nucléaires et cytoplasmiques Protéines solubles, Homo- or hétéro-dimères
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Canaux: Au moins 3 “super Canaux: Au moins 3 “super families” avec plusieurs families” avec plusieurs
hélices TMhélices TM
Vraisemblablement: 3 Sous Unités 4 Sous Unités 5 Sous Unités
Récepteurs canaux ioniquesRécepteurs canaux ioniques
2 (ou 3) états:OuvertFerméDésensibilisé
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Récepteurs de l’acetylcholine Récepteurs de l’acetylcholine (nicotinique):(nicotinique):
•Canal Na+, ouvert en réponse à la liaison d’ AcetylCholine
•5 Sous-Unités, chacune 4 hélices TM
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Liaison, effet biologiqueLiaison, effet biologiqueR AcCh R Glycine
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Deux ou trois états?Deux ou trois états?
(α7-AcChR-L247T) (α7-AcChR-wt)
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Effecteurs allostériques?Effecteurs allostériques?
Reconnaissent de préférence état ouvert et le stabilisent
Reconnaissent de préférence état désensibilisé et augmentent l’ouverture
Effet sur la liaison d’agoniste?
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1 234
2
22
2
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Extracellular ring
Central ring(selectivity filter)
Intermediate ring
Gate
D
E/Q
S
L
E/Q
Intracellular ring
2 2
22
2
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Acetylcholine Binding Protein: empty or antagonist-bound
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Acetylcholine Binding Protein: empty or agonist-bound
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Structure 3-D Récepteur AcChStructure 3-D Récepteur AcCh
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Acetylcholine Binding ProteinAcetylcholine Binding Protein
AcChol
AcChol
AcCholAcChol
AcC
ho
l
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Activation of acetylcholine RActivation of acetylcholine R
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Conclusion:Conclusion:
•Nombre limité de conformations: ouvert, fermé, désensibilisé
•La conformation ouverte est « sur le chemin » entre la conformation fermée et désensibilisée.
•Le passage direct entre la conformation fermée et la conformation désensibilisée semble (généralement) très improbable. (forte barrière énergétique?)
Récepteurs cytosoliques et Récepteurs cytosoliques et nucléairesnucléaires
Conformation dépendante du ligand(“Main dans un gant”)
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GR
HSP90
HSP90
p59
Protein synthesis
Preinitiationcomplex
GR
GR GR
GR
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Structure modulaire:Structure modulaire:
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PCAF
CBP/p300
Sp1 Sp1c-Junc-Fos
RNAPII
TBP
TFIIF
TFIIA
TFIIBTFIIE
TFIID
TFIIH
RNAPII
TBP
Two mechanisms of ERtranscriptional activation
Direct(Binding to ERE)
Indirect(Binding to other TF’s)
ERE
AP1 GC TATA
TFIIF
TFIIA
TFIIBTFIIE
TFIID
TFIIH
TATA
ER
ER
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DNA Binding?DNA Binding?
Minor groove
Major groove
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DNA Binding domain:DNA Binding domain:
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Ligand Binding Domain:Ligand Binding Domain:
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Estrogen-receptor recognition:Estrogen-receptor recognition:
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Laszlo Nagy and John W.R. Schwabe, TRENDS in Biochemical Sciences Vol.29 No.6 June 2004
Empty, inactive and active ligand-bound receptorsEmpty, inactive and active ligand-bound receptors
Of Cours 3Slide 37
Cinétiques de liaison?Cinétiques de liaison?Courbes dose-effet?Courbes dose-effet?
Albers et al, JBC 2006
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Conclusion:Conclusion:
•Il y a autant de conformations « actives » que de ligands
•L’activité biologique de chaque ligand dépend de l’affinité relative des coactivateurs et des corépresseurs pour le complexe ligand-récepteur.
•Un composé peut être agoniste partiel soit parce qu’il reconnaît les coactivateurs avec une mauvaise affinité, soit parce qu’il reconnaît également coactivateurs et coinhibiteurs
Récepteurs de l’insulineRécepteurs de l’insuline
Tyrosine kinase, 1 TM helix;Coopérativité négative,
Relations liaison – activation?
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Surinya, K. H. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:16718-16725
Courbes de compétition, de Courbes de compétition, de saturationsaturation
1 site ou 2 sites ?1 site ou 2 sites ?
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Surinya, K. H. et al. J. Biol. Chem. 2002;277:16718-16725
Cinétique de dissociation avec Cinétique de dissociation avec ou sans excès d’insulineou sans excès d’insuline
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S S
Y1146
Y1151
Y960
Y1316
Y1322
Kin
as
e
Y1150
SS
Y1146
Y1151
Y960
Y1316
Y1322
Kin
as
e
Y1150
SS
Insulin Receptorα – Binding β – tyrosine kinase
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Insulin: two binding sitesInsulin: two binding sites
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SNIINS
InsulinR InsulinR αα subunit subunit
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Insulin
INSULIN RECEPTOR
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Insulin
INSULIN RECEPTOR
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Insulin
INSULIN RECEPTOR
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Dose-effetDose-effet
[Insuline] (log M)-10 -9 - 8 -7 -6 -5
[Physiologiques]
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pY699ST
AT
5
Insulin Receptor SignalingEffects on gene expression
Y1146
Y1151
Y960
Y1316
Y1322
Kin
as
e
Y1150
Y1146
Y1151
Y960
Y1316
Y1322
Kin
as
e
Y1150
SH2
PTB
PH
RAS
Y699
ST
AT
5B
STAT 5B pathway
Y
Y
IRS-1/2
pY
pY
pY
PH
ST
AT
5
pY699
pY699ST
AT
5 ST
AT
5
pY699
RAF
AP-1
Insulin
S SSS S
S
TCFFOXO1
PPProlinerich
PKB mTORPDK
p70S6K GSK3β
BAD
Caspase 9
p27KIP
NFκB
IKK
CRE
SOSPP GRB2
PI3K
MEK1/2
ERK1/2
aPKC
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ConclusionConclusion
•2 états du R insuline:o Au repos, en l’absence d’insuline: hélices TM
mal placées donc TyrKinase inactive,o En présence d’insuline: Tyr kinase active,
autophosphorylation, recrutement de protéines de signalisation.
•Liaison: Possibilité de liaison simultanée de 2 insulines/R. Coopérativité négative entre les deux sites de liaison.