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En vue de l'obtention du

DOCTORAT DE L'UNIVERSITÉ DE TOULOUSEDélivré par :

Institut National Polytechnique de Toulouse (INP Toulouse)Discipline ou spécialité :

Chimie Organométallique et de Coordination

Présentée et soutenue par :Mme HELENE EURY

le lundi 16 décembre 2013

Titre :

Unité de recherche :

Ecole doctorale :

ETUDE DE L'INTERACTION DE LA THIOFLAVINE T ET DECOMPLEXES DE RU (II) AVEC LE PEPTIDE AMYLOÏDE BÊTA DANS LE

CADRE DE LA MALADIE D'ALZHEIMER.

Sciences de la Matière (SM)

Laboratoire de Chimie de Coordination (L.C.C.)Directeur(s) de Thèse :MME ISABELLE SASAKI

M. OLIVIER SAUREL

Rapporteurs :M. FEDERICO CISNETTI, UNIVERSITE CLERMONT-FERRAND 2

M. OLIVIER SENEQUE, CEA GRENOBLE

Membre(s) du jury :1 M. ERIC BENOIST, UNIVERSITE TOULOUSE 3, Président2 M. ALAIN MILON, UNIVERSITE TOULOUSE 3, Membre2 Mme CHRISTINA SIZUN, CNRS GIF SUR YVETTE, Membre2 Mme ODILE DECHY CABARET, INP TOULOUSE, Membre2 M. PETER FALLER, CNRS TOULOUSE, Membre2 M. RICHARD ORTEGA, UNIVERSITE BORDEAUX 1, Membre

Remerciements Une thèse demande un investissement personnel important. Pendant trois ans, nous mangeons, dormons et ne pensons qu’à notre thèse. Mais la thèse est avant tout une aventure humaine faite de rencontres et surtout d’amitiés qui je l’espère perdureront au-délà de ces trois ans. Le doctorat aura été la période la plus difficile mais aussi l’une des plus belles de ma vie. Je souhaite remercier toutes les personnes qui ont participé de près ou de loin à son écriture…. Merci au Dr Olivier Sénèque et au Dr Federico Cisnetti qui ont référé ce travail avec beaucoup d’attention et de rapidité. Je tiens également à remercier les différents membres du jury pour l’intérêt qu’ils ont porté à ce travail ainsi que pour la discussion scientifique qui a eu lieu au cours de ma soutenance. Ce travail est le fruit d’une collaboration entre le Laboratoire de Chimie de Coordination et l’Institut de Pharmacologie et de Biologie Structurale sous la direction d’Isabelle Sasaki, Chargée de Recherches au CNRS, que je remercie pour sa complétude dans l’encadrement de ma thèse, et d’Olivier Saurel, Ingénieur de Recherche au CNRS que je tiens à remercier pour ses remarques pertinentes, sa disponibilité et la patience dont il a fait preuve au cours de ces trois dernières années et qui a été nécessaire pour m’initier à la RMN. Côté IPBS, je tiens à exprimer ma profonde gratitude à l’ensemble des membres, présents et passés, de l’équipe RMN pour leur accueil et leur soutien au cours de mes séjours plus ou moins prolongés. Un merci tout particulier à Virginie pour ton soutien et les discussions shopping dans ton bureau. Greg, merci pour ce séjour inoubliable à Lisbonne on y retourne quand ? Merci au docteur Cala pour la bonne ambiance dans le bureau. Merci à Muriel pour les papotages et les soirées jeux de sociétés. Je n’oublie pas non plus Parth et le futur Dr Bichet….. Côté LCC, je tiens tout particulièrement à remercier le Professeur Peter Faller pour m’avoir accueilli au sein de son équipe il y a quatre ans lors de mon stage de Master 2. Merci pour ta disponibilité, les discussions scientifiques mais surtout pour ton soutien et ta confiance. Un énorme merci à Manu pour m’avoir accueilli dans son bureau durant la période de rédaction mais également pour sa constante bonne humeur et sa gentillesse. Une pensée particulière pour Viviane et Martine. Merci à vous deux, vous avez été d’un soutien énorme pendant ces derniers mois. Je ne trouve pas les mots pour remercier comme il se doit Christelle. Cette thèse n’aurait pu aboutir sans ta patience, ton soutien, tes conseils, ta disponibilité constante (physique, par mail ou téléphone) et ton investissement dans cette thèse. Merci pour avoir pris le temps de lire et corriger mon travail et plus particulièrement le chapitre III. Je souhaite à tout étudiant d’avoir la chance de travailler avec toi. Je tiens également à remercier Laurent qui a dû subir ma thèse à la maison ! Des tonnes de chocolats ne seraient pas suffisantes pour vous remercier ! Merci également à tous les étudiants de l’équipe : Olivia, Pascal, Maud, Minh, Suzanna, Thais, Samantha, Maureen, Marie, Antoine, Sabrina, Clémence et tous les étudiants qui ont passés quelques mois ou semaines dans notre équipe et ont largement contribué à la bonne ambiance qui y règne.

La plupart des résultats présentés dans ce manuscrit n’auraient pu voir le jour sans l’aide précieuse de -Fabrice Colin pour la spectro de masse, merci de t’être acharné sur ces complexes de Ru(II) qui n’en font qu’à leurs têtes mais aussi pour les vacances passées à l’ESRF, -Lionel Rechignat pour la RPE, promis les séries de 20 tubes c’est fini !, -Christian Bijani pour la RMN, merci pour ta gentillesse et surtout pour m’avoir écouté râler pendant des heures. Je souhaite également remercier l’ESRF qui a largement contribué à la rédaction de cette thèse ! Ainsi que l’ensemble du personnel administratif ou non de l’IPBS et du LCC avec une pensée particulière pour Michel (le gardien) pour ta gentillesse et ta bonne humeur même très tôt le matin et Michel (du magasin) pour avoir relier ma thèse en un temps record et m’avoir soutenu pendant ces dernières années. Au cours de ces trois ans, j’ai eu la chance de rencontrer des gens formidables et j’espère n’oublier personne ! Lors de mon arrivée au laboratoire il y a 4 ans, je me suis retrouvée perdue au milieu de garçons d’apparence sérieuse mais j’ai vite appris que l’habit ne fait pas le moine… Merci à Bruno pour les discussions sans fin, ton soutien mais surtout pour la Bruno touch qui est indescriptible. Merci aux fameux Aurélien Honreadt et Gilles Caillot pour les soirées moutons célestes, suit up et surtout pour les dimanches matins dans mon canapé, les chansons de Glee et le théâtre des rêves. Merci d’avoir été là, votre amitié m’est précieuse. Merci à Fabien, le beau gosse de l’Ariège parti s’exiler à Marseille, pour m’avoir soutenu tous les jours au cours de la rédaction. Tu es et resteras mon chouchou. Un énorme merci à ma chieuse préférée Emelyne ! Je m’attends toujours à te voir quand quelqu’un ouvre la porte. Tu me manques énormément et j’ai hâte de te voir sur Paris. Merci d’avoir été là dans les bons et les moins bons moments. Merci à Sarah pour ta gentillesse et ton sourire. On se retrouve quand tu veux pour une bière au De Danu ! Je te souhaite d’avoir trouvé ta voie mais ne nous oublie pas. Merci à Anna ou plutôt Mme Bastien ! Tu entres dans la période difficile de la rédaction et si tu as besoin je suis là ! Sabrina, il m’est très difficile d’écrire ces mots sans pleurer. Je ne sais pas par où commencer… Ton arrivée dans l’équipe a été une bouffée d’oxygène. Merci pour tes blagues pourries : qu’est –ce t’a mangé ? du cassoulet !, pour m’avoir fait goûter du cheval, pour m’avoir fait traverser Toulouse parce que ce n’était pas chronodrive mais auchan drive, pour les bières du vendredi et aussi du samedi soir, pour m’avoir appris à jouer à la belotte,…. Et j’en passe. Merci pour tout ! J’ai beaucoup de chance de t’avoir rencontré et encore plus de faire partie de tes amis. Je n’oublie pas non plus ton Thibaud d’amour….. Merci à vous deux. Dr Dib, comment te dire à quel point tu as été un soutien ces dernières années… Alors merci pour les pauses cafés à la bibliothèque, les fous rires lors de mes nombreux passages dans le bureau G072, pour avoir essayer de m’apprendre l’anglais, pour m’avoir écoutée et soutenue mais surtout merci pour avoir fait de moi une addict à la cuisine libanaise et particulièrement aux gâteaux. Merci pour cet été, sans toi la rédaction n’aurait pas été la même. Tu as été mon mari du labo et plus que tout un ami ! Un dernier merci pour m’avoir permis de connaître mon Nabilou…

Nabil ou le prince du Maroc, comme on le dit souvent il n’y a pas de merci entre nous mais je tiens quand même à te dire merci. Merci pour créer l’ambiance, pour ta gentillesse et ton humour. J’ai perdu les 2 ans pendant lesquels on ne se parlait pas mais j’ai maintenant le privilège de te connaître. Je tiens également à remercier Dieu Grec pour être venu m’aider à répéter et je lui souhaite bon courage pour me supporter lors des TP de chimie analytique. Je ne t’échangerais pas contre un autre cette fois-ci et j’espère avoir la chance de faire partie de tes amis. Certains jeudi soirs, les lumières du labo restent allumées plus longtemps que d’habitude… et à y regarder de plus près, il s’agit de l’apéro du LCC. Grâce à ces apéros j’ai eu la chance de rencontrer mes chagasses d’amour : Pauline, la méchante chagasse : merci pour les quizzs au Killarney, les discussions dans mon bureau : radio LCC ne serait pas la même sans toi ! Merci d’être mon amie tout simplement ! Aurélie, l’ultimate chagasse : merci pour le petit poney, pour cet été (le tournoi de foot aura définitivement scellé notre amitié), pour ton naturel et pour m’avoir donné envie de porter du vernis à ongle. Nadia, la chagasse blonde : tu es l’une des personnes les plus adorables que je connaisse. Merci pour le poulet au citron et les papotages entre filles. Merci de m’avoir soutenue et d’être mon amie. Marlène, la gentille chagasse : pour moi tu représentes la gentillesse incarnée. Tu t’énerves parfois ???? Justine, la chagasse junior : merci d’être inutile….. Il te reste pas mal de progrès à faire avant de faire partie des chagasses du LCC mais je te fais confiance pour y arriver. Mais aux apéros du LCC, il n’y a pas que les chagasses , il y a aussi : Maître Hameau, c’est toi le grand méchant ! Merci de me supporter au quotidien et promis je vais me faire plus discrète dans l’équipe M. Yohan, merci d’être toujours de bonne humeur et de t’occuper de ma méchante chagasse. Merci de mettre la misère à mon chéri au squash. Tous les deux, vous m’impressionnez par votre détermination et votre implication au travail. J’espère vous ressemblez un peu… mais pas trop ! Le beau gosse de l’équipe D, Kévin, merci d’être le tyran de mon cœur ! Merci d’avoir cru que j’étais une jeune permanente du labo. Merci pour ta franchise et ton amitié. Bien évidemment dans l’équipe D, il y a la star internationale de foot et sa femme chanteuse reconnue de son labo : merci à Clève et Amelle pour votre sourire quotidien ! Vous être trop mimis ne changez rien. Merci à Carine pour m’avoir soutenue au quotidien ces derniers mois sur facebook. Merci pour ta gentillesse et ta franchise. Merci pour l’aventure parisienne au Palais de la Découverte ! Promis quand je viens en Belgique je t’amène des crayons ! Je n’oublie pas non plus Joëlle, Rémy, Jérémy, Khaldoun, Mahmoud et Bahjat. Je vous souhaite de réussir tout ce que vous entreprendrez dans le futur. Un merci tout particulier pour mes coupines de D-Smart : Alison et Juliette ! Merci pour les déjeuners entre filles, de m’avoir écouter me plaindre et d’avoir été là ces derniers mois. La langue française est riche et je suis connue pour mon débit de paroles mais là je sèche. Alors je vous dirais simplement Merci !

Un énorme merci à mes amis d’ici ou d’ailleurs qui même si ils n’ont pas toujours compris en quoi consistait mon travail ont toujours été là pour moi : Mélanie, on se connaît depuis plus de 15 ans et nos vies ont pris des chemins différents et pourtant nous sommes toujours aussi complices que lorsqu’on avait 12 ans (le papotage téléphonique hebdomadaire y est pour beaucoup). Tu es une personne merveilleuse qui a toujours été là pour moi et j’espère que notre amitié continuera pour les 15 prochaines années. Tu es bien plus qu’une amie. J’en profite pour remercier Benoit : merci d’avoir rendu ma meilleure amie heureuse et de lui avoir offert le plus cadeau du monde Noa. Yann, même si je ne suis pas la fille la plus chaude que tu connaisse, merci d’être mon ami. Nos bières du samedi me manquent beaucoup ! Tu es parti pour la capitale et que je ne te vois pas aussi souvent que je le voudrais, mais tu es un des mes amis les proches et je ne te remercierais jamais assez pour ton soutien. Une pensée particulière pour Guich, les vendredis matins sur les bancs de la fac resteront à jamais gravés dans ma mémoire. Greg, merci pour les week-ends du 14 juillet, la semaine parisienne qui a été plus qu’extraordinaire et même si tu es l’ami de Kévin j’espère que tu es aussi un peu le mien. Chloé et Clément, merci pour votre soutien depuis Lamalou les bains et pour les week-ends à vos côtés qui m’ont toujours aidé à décompresser. Merci à Nolan et Briguite d’être mes amis. Une spéciale dédicace Mickaël : tu es l’une des personnes qui comptent le plus pour moi. Merci d’être là tous les jours du petit-déjeuner au diner ! Merci à mes parents, mes grands-parents, mon adorable petit frère Bertrand et ma « belle-sœur » Marina. Sans vous je ne serais pas là aujourd’hui. Vous m’avez toujours poussé à me dépasser et m’avez donné les moyens d’y arriver. Merci pour tout ! J’ai une pensé pour ma famille, Hélène et Gilbert, Stéphanie, Jean-Marie et Nathan, Julien et Lama, et ma belle-famille , Véronique, Zaza, James , Laëtitia, Axelle, Jade , Eliot et Valérian : vous m’avez soutenu et encouragé pendant 3 ans ! Je pense en particulier à mes filleules Clara et Sara. Je souhaite également remercier Karima qui me connaît depuis toujours et qui a toujours su me motiver. Tu es un exemple pour moi. Je tiens à remercier celui qui a toujours cru en moi, Kévin. Cette thèse n’aurait pu aboutir sans toi, ton soutien sans faille et ta confiance en moi. Je ne trouve pas les mots pour te dire à quel point tu as contribuer à ce travail. Merci pour avoir supporter ces trois ans qui n’ont pas été faciles tous les jours. Cette thèse est aussi la tienne. Merci infiniment pour tout ce que tu m’apportes.

Résumé :

La maladie d’Alzheimer est caractérisée par la présence de dégénérescences

neurofibrillaires et l’accumulation de plaques amyloïdes dans le cerveau. Ces plaques

contiennent principalement un peptide nommé amyloïde-β (Aβ) sous forme agrégée. Le

processus d’agrégation des peptides Aβ en plaques amyloïdes représente une étape clé dans

l’apparition de la pathologie, la coordination du cuivre, et également du zinc, favorisant la

formation d’espèces agrégées impliquées dans la neurotoxicité. Notre objectif consiste à

concevoir des complexes bifonctionnels avec d’une part un analogue de la Thioflavine T

(ThT) et d’autre part un complexe de Ru(II). Ce travail de thèse s’articule donc selon ces deux

axes.

I- Nous nous sommes d’abord intéressés à l’interaction entre le peptide Aβ et la

Thioflavine T (ThT), fluorophore classiquement utilisé pour étudier l’agrégation du peptide

Aβ. Cette interaction a été étudiée principalement par spectroscopie RMN. Les résultats

obtenus ont permis d’identifier le site d’interaction de la ThT au peptide Aβ. Par la suite, les

effets de la ThT et du Zn(II) sur l’agrégation du peptide Aβ ont été évalués en combinant la

spectroscopie RMN et de fluorescence. A partir des données obtenues, nous avons montré que

la ThT et le Zn(II) ne sont pas inertes sur la cinétique d’agrégation du peptide Aβ. Les

résultats ont également révélé des différences importantes concernant les informations

apportées par la fluorescence et la RMN.

II- La coordination du cuivre et du zinc implique principalement les noyaux

imidazoles des résidus histidines. Afin d’empêcher la coordination de ces ions métalliques

aux peptides Aβ, une stratégie thérapeutique innovante consiste en l’utilisation de complexes

platinoïdes comportant des sites labiles et capables de se lier aux résidus histidines du Aβ. En

raison de la toxicité des complexes de Pt(II), nous avons envisagé la synthèse de complexes

de Ru(II), principalement basés sur le motif fac-Ru(CO)32+. Différents complexes avec des

ligands de type glycinate, hydroxyquinolinate et éthylenediamine ont été synthétisés. L’étude

de leur interaction avec le peptide Aβ a été réalisée par différentes techniques

spectroscopiques (RMN, RPE, fluorescence, spectrométrie de masse). Les résultats obtenus

ont montré, en particulier, que les complexes sont capables d’inhiber l’agrégation du peptide

Aβ induite par le zinc.

Abstract :

The Alzheimer's disease is characterized by the presence of neurofibrillary tangles and

amyloid plaques in the brain. These plaques are formed by aggregated amyloid-β (Aβ)

peptide. The Aβ aggregation represents a key event in the appearance of the pathology,

copper and zinc coordination favoring the formation of aggregated species involved in the

neurotoxicity. Our objective consists in designing bifonctional complexes with, on one hand,

a Thioflavine T (ThT) analog and, on the other hand, a Ru(II) complex : this thesis is thus

centered around these two axes.

I- In this context, we first investigated the interaction between Aβ and ThT, which is a

classical dye commonly used to study the aggregation process. This interaction was mainly

studied by NMR spectroscopy. Our first results allowed us to identify the interaction site of

the ThT with the Aβ peptide. Then, the ThT and Zn(II) effects on the aggregation process

were assessed by NMR and fluorescence spectroscopy. From the obtained data, we showed

that ThT and Zn (II) are involved in the aggregation kinetic. The results also revealed

important differences concerning the information brought by fluorescence and NMR.

II- Copper and zinc coordination mainly implies imidazole ring of the histidine

residues. In order to prevent the coordination of these metallic ions to Aβ, an innovative

therapeutic strategy consists of the use of platinoid complexes containing labile sites which

are able to bind the Aβ histidine residues. Because of Pt(II) complexes toxicity, we envisaged

the synthesis of Ru(II) complexes, mainly based on fac-Ru(CO)32+ motive. Different

complexes with glycinate, hydroxyquinolinate or ethylenediamine ligand were synthesized.

The study of their interaction with the Aβ peptide was realized by various spectroscopy

techniques (RMN, RPE, fluorescence, mass spectrometry and demonstrated that the

complexes are able to prevent the Aβ aggregation induced by zinc.

Abréviations

Unité de mesure

M molaire mM millimolaire

nM nanomolaire pM picomolaire

μM micromolaire

mg milligramme

g gramme

μl microlitre

ml millilitre m mètre

cm centimètre Da dalton

PM poids moléculaire K kelvin

°C degré Celcius

s seconde

h heure éq équivalent

�Peptides, protéines, acides aminés

Aβ amyloïde-bêta ADN acide désoxyribonucléique

AICD « APP intracellular domain » Ala alanine

APP « amyloid precursor protein » Arg arginine

ARN acide ribonucléique Asn asparagine

Asp aspartate

BACE « beta site APP cleaving enzyme » CCO cytochrome c oxydase

CCS « copper chaperon superoxide dismutase » C83 fragment C83 (possédant 83 acides aminés) de l’APP

C99 fragment C99 (possédant 99 acides aminés) de l’APP Gln glutamine

Gly glycine Glu glutamate

hCtr1 « human Copper transporter » His histidine

Im imidazole Leu Leucine

Lys Lysine Phe phénylalanine

Ser sérine SOD superoxyde dismutase

Trp tryptophane Tyr Tyrosine

Val Valine

Métaux

Au or

Ag argent

Bi bismuth

Cu cuivre

Fe fer

Ga gallium

Gd gadolinium

Ir iridium

Os osmium

Pd palladium

Pt platine

Rh rhodium

Ru ruthénium

Tc technetium

Ti titane

V vanadium

Méthodes

DC dichroïsme circulaire

ESI-MS « electrospray ionization mass spectrometry » HPLC « High Performance Liquid chromatography »

IR infra-rouge IRM imagerie par résonance magnétique

RMN résonance magnétique nucléaire RPE résonance paramagnétique électronique

TEM microscopie à transmission électronique TEP tomographie à émission de positrons

UV-Vis ultra-violet visible XANES « X-Ray Absorption Near Edge Structure »

XAS « X-Ray Absorption Spectroscopy »

Divers

ACN acétonitrile

AINS Anti-Inflammatoires Non-Stéroïdiens

ANS 1-anilinonaphtalène-8-sulfonate

BHE Barrière Hémato-Encéphalique

CORM « CO Realeasing Molecules »

CQ clioquinol DO densité optique

DMSO diméthylsulfoxide DOSY « Diffusion Ordered SpectroscopY »

DTPA acide diéthylenetriaminepentaacétique ε coefficient d’extinction molaire

EDTA acide éthylènediamine tetraacetique EMA agence européenne des médicaments

EtOH éthanol

Hepes acide 2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)ethanesulfonique HQ hydroxyquinoline

IC50 concentration d'inhibition 50 % Ka constante d’association

Kd constante de dissociation MA maladie d’Alzheimer

MeOH méthanol MM masse molaire

NAMI « New Anti-Tumor Metastasis Inhibitor » NMDA N-Méthyl-D-Aspartate

NOESY « Nuclear Overhauser SpectroscopY » PIPES acide 1,4-piperazinediethane sulfonique

ROS “Reactive oxygen species” SDS sodium deodecyl sulfate

ThT thioflavine T TFE trifluoroéthanol

TOCSY « Total Correlation SpectroscopY » TSP sodium 3-(triméthylsilyl)propionate

Tris Tris(Hydroxymethyl)aminomethane ZnT « Zinc Transporter »

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SOMMAIRE �

INTRODUCTION GENERALE ............................................................................................. 6 �

CHAPITRE I. INTRODUCTION ......................................................................................... 8 I-A LA MALADIE D'ALZHEIMER ............................................................................................... 8

I-A-1-a Une démence neurodégénérative ....................................................................... 9 I-A-1-a-i Les signes cliniques .................................................................................... 9 I-A-1-a-ii Les signes histopathologiques .................................................................. 10

I-A-1-b Le diagnostic .................................................................................................... 11 I-A-1-b-i Les tests neuropsychologiques ................................................................. 11 I-A-1-b-ii L’imagerie cérébrale ................................................................................ 12

I-A-1-c Les facteurs de risque ....................................................................................... 13 I-A-1-c-i L’âge et le sexe ......................................................................................... 13 I-A-1-c-ii Le cholestérol ........................................................................................... 13 I-A-c-1-iii Les mutations génétiques ........................................................................ 14

I-A-1-d Un enjeu de santé publique ............................................................................. 14 I-A-2 Plaques amyloïdes .................................................................................................. 15

I-A-2-a Le peptide Aβ ................................................................................................. 16 I-A-2-a-i Origine du peptide Aβ : la protéine APP .................................................. 16 I-A-2-a-ii Génération du peptide Aβ : clivage de l’APP ......................................... 16 I-A-2-a-iii Le peptide Aβ ......................................................................................... 17

I-A-2-b Les fibres amyloïdes ....................................................................................... 18 I-A-2-b-i Structure des fibres amyloïdes .................................................................. 18 I-A-2-b-ii Toxicité des espèces agrégées ................................................................. 20 I-A-2-b-iii Espèces amorphes ou fibrillaires ............................................................ 20

I-A-2-c L’hypothèse de la cascade amyloïde ............................................................... 20 I-A-3 Les voies thérapeutiques actuelles .......................................................................... 22

I-A-3-a Prévention de la production d’Aβ ................................................................... 22 I-A-3-a-i Stimulation de l’α-sécrétase ..................................................................... 22 I-A-3-a-ii Inhibition des β et γ-sécrétases ................................................................ 23

I-A-3-b Dégradation du peptide Aβ ............................................................................. 25 I-A-3-c Inhibition de l’agrégation d’Aβ ...................................................................... 25 I-A-3-d Autres approches envisagées .......................................................................... 26

I-B THIOFLAVINE T ET LA MALADIE D’ALZHEIMER .............................................................. 28 I-B-1 Agrégation et fluorophores .................................................................................... 28

I-B-1-a Présentation des principaux fluorophores utilisés ............................................ 28 I-B-1-a-i ANS et bis-ANS ........................................................................................ 29 I-B-1-a-ii Le Nile Red .............................................................................................. 30 I-B-1-a-iii Le Congo Red ......................................................................................... 30

I-B-1-b Fluorophores et caractérisation des protéines .................................................. 31 �

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I-B-2 La Thioflavine T (ThT) ........................................................................................... 31

I-B-2-a Généralités ........................................................................................................ 32 I-B-2-b ThT et fibres amyloïdes ................................................................................... 32

I-B-2-c-i Interaction ThT-fibres amyloïdes .............................................................. 33 I-B-2-c-i Site d’interaction ....................................................................................... 33

I-B-2-c ThT et agrégation ............................................................................................. 34 I-B-2-c-i La nucléation ............................................................................................. 34 I-B-2-c-ii L’élongation ............................................................................................. 34

I-C LES METAUX EN BIOLOGIE .............................................................................................. 36

I-C-1 Les métaux : indispensables pour l’organisme ...................................................... 36 I-C-1-a Les métaux essentiels ...................................................................................... 36

I-C-1-a-i Le cuivre ................................................................................................... 37 I-C-1-a-ii Le Zinc ..................................................................................................... 38 I-C-1-a-iii Le Fer ....................................................................................................... 39

I-C-1-b Dérégulation des métaux et maladies ............................................................. 40

I-C-2 Les métaux en chimie médicinale .......................................................................... 42 I-C-2-a Outils diagnostics ............................................................................................. 42 I-C-2-b Agents thérapeutiques ...................................................................................... 43

I-C-2-b-i Le Platine (Pt) ........................................................................................... 43 I-C-2-b-ii Le Ruthénium (Ru) .................................................................................. 45

I-D LES METAUX ET LA MALADIE D’ALZHEIMER .................................................................. 49

I-D-1 Le rôle des métaux dans la maladie d’Alzheimer .................................................. 49 I-D-1-a Stress oxydant et MA ...................................................................................... 49

I-D-1-a-i Définition du stress oxydant ..................................................................... 49 I-D-1-a-ii Stress oxydant et MA ............................................................................... 50

I-D-1-b Métaux et MA .................................................................................................. 51

I-D-2 Les métaux et le peptide Aβ ................................................................................... 53

I-D-2-a Cuivre et Aβ ..................................................................................................... 53 I-D-2-a-i Coordination ............................................................................................. 53 I-D-2-a-ii Effet sur l’agrégation ............................................................................... 55 I-D-2-a-iii Effet sur la toxicité ................................................................................. 56

I-D-2-b Zinc et Aβ ........................................................................................................ 56 I-D-2-b-i Coordination ............................................................................................. 56 I-D-2-b-ii Effet sur l’agrégation et la toxicité .......................................................... 57

I-D-2-c L’hypothèse de la cascade amyloïde et les métaux ......................................... 57

I-D-3 Les métaux : une nouvelle cible thérapeutique ? ................................................... 58 I-D-3-a Chélateurs d’ions métalliques .......................................................................... 58

I-D-3-a-i Les premiers chélateurs ............................................................................ 58 I-D-3-a-ii Le clioquinol et ses dérivés ...................................................................... 59 I-D-3-a-iii Des chélateurs vectorisés ........................................................................ 61

I-D-3-b Complexes de Pt, Ru et autres métaux de transition ....................................... 63 I-D-3-b-i Des complexes de Pt… ............................................................................. 63 I-D-3-b-ii … ou de Ru comme anti-MA .................................................................. 64 I-D-3-b-iii Vers l’utilisation d’autres métaux de transition ..................................... 65

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CONCLUSION ......................................................................................................................... 66

BIBLIOGRAPHIE ..................................................................................................................... 68

CHAPITRE II. TECHNIQUES UTILISEES ET MODELE D’ETUDE ........................ 74 INTRODUCTION ..................................................................................................................... 74

II-A SPECTROSCOPIE DE FLUORESCENCE .............................................................................. 74 II-A-1 Généralités ............................................................................................................ 74

II-A-2 Paramètres caractéristiques de la spectroscopie de fluorescence ....................... 76 II-A-2-a Le rendement quantique de fluorescence ...................................................... 76 II-A-2-b L'intensité de fluorescence ........................................................................... 76 II-A-2-c La durée de vie de fluorescence ..................................................................... 78 II-A-2-d Fluorescence de la Thioflavine T ................................................................... 78 II-A-2-e Les avantages et inconvénients de la fluorescence ......................................... 80

II-B LA RESONNANCE MAGNETIQUE NUCLEAIRE (RMN) .................................................... 80 II-B-1 La TOCSY (Total Correlation SpectroscopY) ...................................................... 81

II-B-2 La NOESY (Nuclear Overhauser SpectroscopY) .................................................. 82

II-C PEPTIDE Aβ28 ET CONDITIONS EXPERIMENTALES ........................................................ 87

II-C-1 Le peptide Aβ28 et fixation du Zn(II) ................................................................... 87

II-C-2 Attribution des résonance 1H-RMN du peptide Aβ28 ........................................... 88 II-C-2-a Méthodologie d’attribution ............................................................................ 89

II-C-2-a-i Préparation de l’échantillon ..................................................................... 89 II-C-2-a-ii Identification du système de spin (TOCSY) ........................................... 90 II-C-2-a-iii Détermination de la structure primaire .................................................. 91

II-C-2-b Attribution du peptide Aβ28 .......................................................................... 92 II-C-2-b-i Séquence du peptide Aβ28 ...................................................................... 93 II-C-2-b-ii Tableau d’attribution .............................................................................. 94

BIBLIOGRAPHIE ..................................................................................................................... 96

CHAPITRE III. INTERACTION DE LA THT AVEC LE PEPTIDE Aββ28 SOUS FORME MONOMERIQUE .................................................................................................. 97

INTRODUCTION ..................................................................................................................... 97

PUBLICATION ....................................................................................................................... 99 INFORMATIONS SUPPLEMENTAIRES .................................................................................... 101

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CHAPITRE IV. AGREGATION DU PEPTIDE Aββ28 : RMN VS FLUORESCENCE DE LA THT. .......................................................................................................................... 115

INTRODUCTION ................................................................................................................... 115

IV-A PARAMETRES INFLUENÇANT LA CINETIQUE D’AGREGATION DU PEPTIDE Aβ28 .......... 116

IV-A-1 Rappel sur le mécanisme d’agrégation et utilisation de la fluorescence de la ThT ........................................................................................................................................ 116 IV-A-2 Traitement du peptide Aβ28 à haut pH : vers une monomérisation ................... 118 IV-A-3 Dépendance de la concentration en peptide Aβ28 sur la cinétique d’agrégation ........................................................................................................................................ 119 IV-A-4 Dépendance du pH sur l’agrégation du peptide Aβ28 ....................................... 120 IV-A-5 Effet de la nature du tampon et de sa concentration sur l’agrégation du peptide Aβ28 ................................................................................................................................ 121 IV-A-6 Effet de la température sur l’agrégation du peptide Aβ28 ................................. 122 IV-A-7 Effet de l’agitation sur l’agrégation du peptide Aβ28 ........................................ 124 IV-A-8 Importance de l’interface air-liquide ................................................................. 125 Conclusions : .................................................................................................................. 127

IV-B AGREGATION DU PEPTIDE Aβ28 EN PRESENCE DE ZN(II) ........................................... 128 IV-B-1 Suivi d’agrégation par spectroscopie de fluorescence de la ThT ..................... 128 IV-B-2 Agrégation du peptide Aβ28 suivie par spectroscopie RMN 1H ......................... 131

IV-B-2-a En version 1D ............................................................................................. 132 IV-B-2-b Analyse des cartes NOESY ........................................................................ 135

IV-B-3 Agrégation du peptide Aβ28 caractérisée par RMN : conclusion ................... 141

IV-C EFFET DE LA THT SUR L’AGREGATION D’Aβ28 ......................................................... 142 IV-C-1 Etude par spectroscopie de fluorescence .......................................................... 142 IV-C-2 Etude par spectroscopie RMN 1H ...................................................................... 144 IV-C-3 Effet de la ThT sur la cinétique d’agrégation du peptide Aβ28 : conclusion ... 146

IV-D CONCLUSION : RMN VS FLUORESCENCE DANS L’AGREGATION DU PEPTIDE Aβ28 EN PRESENCE DE THT ............................................................................................................... 147 BIBLIOGRAPHIE : ................................................................................................................. 155

CHAPITRE V. VERS DES COMPLEXES DE RU(II) ACTIFS CONTRE LA MALADIE D’ALZHEIMER. ............................................................................................. 157

INTRODUCTION : .................................................................................................................. 157

V-A SYNTHESE ET CARACTERISATION DES COMPLEXES DE RU(II) ..................................... 161 V-A-1 Choix des ligands ................................................................................................ 161

V-A-1-a Glycine ........................................................................................................ 161 V-A-1-b 8-hydroxyquinoline et ses dérivés ............................................................... 162 V-A-1-c Ethylène diamine .......................................................................................... 162

V-A-2 Synthèse et caractérisation des complexes de Ru(II) .......................................... 164

V-A-2-a Synthèse des complexes ............................................................................... 164 V-A-2-b Structures cristallographiques ...................................................................... 165

V-B-1 Conditions expérimentales .................................................................................. 167

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V-B-1-a Choix du fluorophore .................................................................................... 167 V-B-1-b Effet du DMSO ............................................................................................ 170

V-B-2 Effet des complexes Ru(CO)3Cl(L) sur la cinétique d’agrégation du peptide Aβ28 ........................................................................................................................................ 171

V-B-2-a Par spectroscopie de fluorescence : résultats ................................................ 171 V-B-2-b Discussion .................................................................................................... 173

V-C EFFET DES COMPLEXES DE RU(II) SUR LA COORDINATION DU CU(II) AU PEPTIDE Aβ28. ............................................................................................................................................ 174

V-C-1 Rappel sur la coordination du Cu(II) au peptide Aβ .......................................... 174 V-C-2 Effet des complexes de Ru(II) sur la coordination du Cu(II) au peptide Aβ28 .. 175 V-C-3 Effet des complexes de Ru(II) sur l’agrégation induite par le Zn(II) et la coordination du Cu(II) au peptide Aβ28 : bilan ............................................................. 178

V-D COORDINATION DES COMPLEXES AU PEPTIDE Aβ ....................................................... 179 V-D-1 Etude par RMN 1H et masse de l’interaction des complexes hydrosolubles avec le peptide Aβ28 ................................................................................................................... 179

V-D-1-a Etude par spectroscopie RMN 1H ................................................................ 179 V-D-1-a Etude par spectrométrie de masse : HPLC/MS ............................................ 182

V-D-2 Etude par RMN 1H et masse des complexes solubilisés dans le DMSO avec le peptide Ab28 ................................................................................................................... 186

V-D-2-a Etude par RMN 1H ....................................................................................... 186 V-D-2-b Etude par spectrométrie de masse : HPLC/MS ............................................ 188

V-E BILAN ......................................................................................................................... 192 CONCLUSION ET PERSPECTIVES ........................................................................................... 194

BIBLIOGRAPHIE ................................................................................................................... 196

CONCLUSION GENERALE .............................................................................................. 198

ANNEXE I ............................................................................................................................ A-1 ARTICLE 1 ........................................................................................................................... A-4 ARTICLE 2 ......................................................................................................................... A-10 ARTICLE 3 ......................................................................................................................... A-21 ARTCILE 4 ......................................................................................................................... A-31

ANNEXE II: MATERIELS ET METHODES ................................................................ A-34

ANNEXE III: SYNTHESES ............................................................................................. A-39

ANNEXE IV: STRUCTURES CRISTALLOGRAPHIQUES ...................................... A-48

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Introduction

Introduction Générale �

La mémoire est définie comme étant une activité biologique et psychique qui permet

d’emmagasiner, de conserver et de restituer des informations. Chez plus de 35 millions de

personnes à travers le monde, cette capacité à se souvenir d’événements passés s’altère

jusqu’à devenir inexistante à cause d’une dégénérescence neuronale. Ces personnes souffrent

de la forme de démence la plus répandue dans le monde : la maladie d’Alzheimer. Avec

l’allongement de l’espérance de vie, le nombre de patients atteints par la maladie d’Alzheimer

va augmenter au cours des prochaines décennies. Cette pathologie a été décrite pour la

première fois en 1907 et depuis de nombreuses avancées ont permis de mieux comprendre les

mécanismes conduisant à cette neurodégénérescence. Cependant, ces mécanismes ne sont pas

encore élucidés ce qui rend cette maladie incurable à l’heure actuelle et en fait un enjeu

majeur de santé publique.

La présence de plaques amyloïdes dans le cerveau des patients Alzheimer est l’un des

principaux marqueurs de la maladie. Ces plaques sont constituées principalement d’un peptide

sous forme agrégée appelé peptide amyloïde-β (Aβ). Ce peptide est présent dans tous les

cerveaux sains sous forme monomérique. Le passage de cette forme soluble à un état agrégé

représente donc une étape charnière de la maladie qu’il est nécessaire comprendre.

En plus du peptide Aβ, les plaques amyloïdes contiennent également une concentration

élevée en ions métalliques tels que le Cu(II) et le Zn(II). Il est proposé que ces ions jouent un

rôle clé dans le processus d’agrégation ainsi que dans la production d’espèces réactives de

l'oxygène (ROS) qui sont létales pour les cellules. Il n’existe à ce jour aucun traitement actif

contre la maladie d’Alzheimer malgré de très nombreuses recherches en ce sens.

Notre étude se place dans ce contexte. Deux parties complémentaires sont présentées

dans ce manuscrit. La première partie a pour objectif d’apporter des éléments de réponse

quant au mécanisme d’agrégation du peptide Aβ étudié par spectroscopie RMN et de

fluorescence. Elle traite aussi de l’interaction du fluorophore ThT (marqueur fluorescent des

fibres amyloïdes) avec le peptide Aβ. La seconde partie présente l’utilisation de complexes de

Ru(II) comme inhibiteur/ralentisseur de l’agrégation du peptide Aβ, ouvrant ainsi une

potentielle nouvelle voie thérapeutique dans le cadre de la maladie d’Alzheimer.

Le chapitre I présente la maladie d’Alzheimer de façon générale : du développement

de la maladie aux traitements actuellement disponibles. Le rôle des ions métalliques en

biologie et par rapport à la maladie d’Alzheimer sont également brièvement exposés. La

détection des fibres amyloïdes par des marqueurs fluorescents est également abordée dans ce

chapitre.

Le chapitre II décrit des études menées principalement par spectroscopie RMN sur

l’interaction entre le peptide Aβ28 sous forme monomérique et la Thioflavine T (ThT). La

ThT est un fluorophore très largement utilisé comme marqueur de la formation des fibres

amyloïdes en général, et en particulier des fibres d'amyloïdes-β. Ce chapitre est présenté sous

la forme d'un article soumis à publication.

Le chapitre III concerne l’agrégation du peptide Aβ28 étudiée par spectroscopies de

fluorescence et RMN 1H. Après une brève introduction des spectroscopies de fluorescence et

RMN, les différents facteurs influençant l’agrégation du peptide Aβ sont présentés. L’effet du

Zn(II) et de la ThT sur l'agrégation du peptide Aβ sont plus particulièrement détaillés.

Enfin, le chapitre IV présente la synthèse et les études physico-chimiques en présence

du peptide Aβ28, de complexes de Ru(II) potentiellement actifs contre l’agrégation du

peptide Aβ liée à la maladie d’Alzheimer. La coordination au peptide Aβ28 des différents

systèmes de Ru(II), de formule générale Ru(CO)3Cl(L)0/+ avec L un ligand bidente, est

étudiée par spectroscopie RMN et spectrométrie de masse. Des facteurs influençant le taux de

complexation sont proposés. Par ailleurs, l'effet de la coordination des complexes de Ru(II)

sur la modification du site de coordination du Cu(II) est déduit directement d'études par

spectroscopie RPE. De même, l'effet sur la coordination du Zn(II), est obtenu indirectement

d'après des études d'agrégation du peptide induite par le Zn(II).

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Chapitre I : Introduction

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�Chapitre I. A-La maladie d’Alzheimer

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Chapitre I. Introduction

I-A La maladie d’Alzheimer

La première partie de ce chapitre a pour objectif de présenter la maladie d’Alzheimer

(MA) et montrer à quel point cette maladie encore incurable à ce jour est complexe. Les

différents aspects de la maladie seront abordés allant des symptômes au développement de la

maladie. Les traitements ainsi que les méthodes de diagnostic actuels seront brièvement

présentés.

I-A-1 Une démence neurodégénérative

Les maladies neurodégénératives sont des pathologies progressives liées à un

dysfonctionnement au sein du tissu nerveux conduisant à la mort des neurones et à la

destruction du système nerveux. Ces maladies touchent différentes régions du système

nerveux et selon ces régions les fonctions affectées peuvent concerner la motricité comme

dans la sclérose latérale amyotrophique (SLA) ou la maladie de Parkinson, la perception et le

langage comme dans la maladie de Pick. Dans certaines de ces maladies plusieurs régions du

cerveau sont touchées ce qui conduit à des anomalies motrices mais également psychiques

comme dans la chorée de Huntington ou la maladie de Creutzfeld-Jakob.

La plupart de ces maladies neurodégénératives sont qualifiées de démences. En effet,

selon l’Organisation Mondiale de la Santé, la démence est « une altération progressive de la

mémoire et de l’idéation, suffisamment marquée pour handicaper les activités de la vie

quotidienne, apparue depuis au moins 6 mois et avec la présence d’au moins un trouble

suivant : langage, calcul, jugement, altération de la pensée abstraite ou modification de la

personnalité ». La plus fréquente de ces démences est la maladie d’Alzheimer (MA) qui

affecte la mémoire de plusieurs millions de personnes à travers le monde et touche plus

particulièrement les personnes de plus de 65 ans comme nous le verrons plus loin dans ce

chapitre.

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I-A-1-a Les symptômes

I-A-1-a-i Les signes cliniques [1]

La MA se caractérise par une perte progressive des fonctions cognitives dont les

premiers symptômes sont la perte de la mémoire à court terme et des altérations

comportementales comme l’apathie, le désintérêt ou l’irritabilité. Cette phase de la maladie

peut facilement passer inaperçue ou être interprétée, à tort, comme la conséquence d’un état

dépressif.

Au cours du développement de la maladie, d’autres troubles vont apparaître comme

les difficultés de langage, de motricité ainsi que la désorientation des repères temporels et

parfois même spatiaux et la perte des souvenirs plus anciens accompagnée d’une incapacité à

reconnaître son entourage. Il découle de ces symptômes une altération de la personnalité avec

des comportements délirants (agitation, hallucinations, fugues,…).

Au stade final de la maladie, la perte d’autonomie est totale : la marche devient

impossible entraînant un alitement continu avec un état grabataire. La communication est

difficile puisqu’elle ne peut se faire que par le toucher ou le regard. Le décès survient 8 à 12

ans en moyenne après l’apparition des premiers symptômes. Ces différentes étapes sont

résumées dans la figure I-1.

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Figure I-1: Evolution au cours du temps et principaux symptômes de la maladie d'Alzheimer.

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I-A-1-a-ii Les signes histopathologiques

La taille du cerveau [2]

Les patients atteints de la MA présentent des altérations neuropathologiques incluant

notamment une atrophie du cerveau (Fig. I-2) et la perte de synapses dans le cortex cérébral.

L’une des régions les plus touchées est l’hippocampe qui joue un rôle primordial dans les

mécanismes de la mémoire. Il existe une relation directe entre l’évolution de la maladie et la

taille du cerveau chez les personnes souffrant de la MA.

Les plaques amyloïdes et les dégénérescences neurofibrillaires

L’un des marqueurs caractéristiques de la MA est la présence anormale de plaques

amyloïdes au niveau extracellulaire dans le cerveau des patients décédés (Fig. I-3, (c)). Ces

plaques ont été observées pour la première fois par Alois Alzheimer en 1906 [3], au

microscope après coloration à l’argent de Bielschowsky (nitrate d’argent) de section du cortex

cérébral d’une patiente décédée. Elles sont majoritairement constituées d’un peptide de 40 à

42 acides aminés appelé peptide amyloïde β (Aβ). La formation de ces plaques ainsi que leur

rôle dans la MA seront abordés dans le paragraphe I-A-2 (cf p. 15).

Le second marqueur de la MA décrit par Alois Alzheimer est la présence au niveau

intracellulaire d’enchevêtrements neurofibrillaires (Fig. I-3, (b)). Ces enchevêtrements sont

constitués de la protéine tau hyperphoshorylée [4]. Ce second marqueur n’est pas spécifique de

Figure I-2: Comparaison de cerveaux de personnes saines et atteintes par la maladie d'Alzheimer par images obtenus par IRM (à gauche) et TEP révélant le

glucose (au milieu et à droite).Les patients atteints d’Alzheimer montrent une forte diminution du métabolisme énergétique (crédit photo : Institut Douglas) .

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la maladie d’Alzheimer. Il est retrouvé dans d’autres maladies neurodégénératives aussi

appelées « taupathies ».

La protéine tau est responsable de l’assemblage et de la stabilisation des microtubules

qui sont des constituants essentiels du cytosquelette des neurones et joue un rôle important

dans le transport cellulaire [5]. Sous forme hyperphosphorylée, la protéine tau se dissocie des

microtubules modifiant ainsi leur stabilisation et conduisant à la dégénérescence neuronale [6].

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I-A-1-b Le diagnostic

Le seul diagnostic définitif de la MA ne peut être établi que lors de l’autopsie du

cerveau du patient décédé basé sur la présence des plaques amyloïdes et des enchevêtrements

neurofibrillaires. Toutefois, la combinaison de signes cliniques, de tests neuropsychologiques

et de techniques d’imageries cérébrales comme l’IRM ou la tomographie à émission de

positrons (TEP) permettent d’établir un premier diagnostic chez les personnes vivantes.

I-A-1-b-i Les tests neuropsychologiques

Dans les années 80, un groupe américain spécialiste de la MA, le NINCDS-ADRDA, a

proposé les premiers critères de diagnostic de la maladie qui sont regroupés autour de 4 axes :

des tests cognitifs, une évaluation fonctionnelle, une évaluation comportementale et des

échelles de classification globale de sévérité.

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Figure I-3: Section du cortex du cerveau d'un patient révélée à l'argent de Bielschowsky (a) mettant en évidence la présence de neurofibrilles (b) et de plaques amyloïdes (c) (d’après la

référence [3]).

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Actuellement ces tests sont toujours pratiqués car il n’existe pas encore de marqueur

spécifique de la MA et sont accompagnés d’examens complémentaires (cf § I-A-1b-ii) [7].

D’autres pathologies possèdent les mêmes symptômes que la MA comme la dépression ou la

démence vasculaire qui conduit à la détérioration des capacités cognitives et de la mémoire

due à une anomalie de la circulation sanguine qui provoque un manque d’oxygénation de

certaines zones du cerveau.

I-A-1-b-ii L’imagerie cérébrale

Les examens pratiqués en parallèle des tests neuropsychologiques sont en général le

scanner cérébral ou l’IRM. Cependant, ces examens ne permettent pas de mettre en évidence

les lésions spécifiques de la MA. En effet, l’amincissement du cortex cérébral est visible dans

d’autres pathologies de la personne âgée mais ils permettent d’éliminer d’autres causes

comme la présence d’une tumeur ou d’un hématome intra-cérébral.

L’imagerie cérébrale ne peut détecter les stades précoces de la maladie. Or une

détection précoce de la maladie permettrait de retarder son évolution. Les techniques

d’imagerie nucléaire telles que le TEP ou la tomographie par émission monophotonique

(SPECT) sont en cours de développement. Ces techniques non-invasives possèdent de

nombreux avantages parmi lesquels celui de pouvoir établir une cartographie fonctionnelle in

vivo des systèmes neuronaux avec une excellente résolution spatiale (5 à 10 mm pour la TEP).

En 2012, l’EMA (Agence Européenne des Médicaments) a approuvé l’utilisation d’un

radiotraceur, le Florbetapir 18F (ou Amyvid), en imagerie TEP [8-10] (Fig. I-4). Cette molécule

possède une forte affinité pour le peptide Aβ (Kd = 3,7 nM) [9] et montre une bonne

corrélation entre les images TEP in vivo et la présence histologique post mortem du peptide

Aβ. Ce dépistage précoce va faciliter la prise en charge des malades et permettre un

allongement de la durée de vie du patient.

La découverte d’un tel composé représente une avancée majeure de la recherche dans

la lutte contre la MA.

Figure I-4: Structure du radiotraceur Florbetapir 18F.

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I-A-1-c Les facteurs de risque

La présence des plaques amyloïdes et des dégénérescences neurofibrillaires sont les

marqueurs histologiques de la maladie. Cependant, les causes exactes de leurs formations

restent floues. Il semblerait que certains facteurs, également appelés facteurs de risque, aient

une influence sur la progression et l’apparition de la maladie.

I-A-1-c-i L’âge et le sexe

Avoir un âge avancé est le premier facteur qui rentre en ligne de compte dans le

développement de la MA. En effet, 5% des personnes de 65 ans et 15% des plus de 85 ans

souffrent d’Alzheimer. De plus, le risque d’être diagnostiqué Alzheimer double tous les 5 ans

après 65 ans (www.alz.co.uk/research/statistics).

L’espérance de vie des femmes étant plus longue que celle des hommes, la MA touche

plus de femmes que d’hommes. Un autre facteur pourrait expliquer cette différence : la

diminution du taux d’oestrogènes chez les femmes suite à la ménopause. Des essais cliniques

réalisés en présence d’hormone ainsi que des analyses génétiques de la biosynthèse des

oestrogènes liée à la MA semblent confirmer cette hypothèse et indiquent un possible rôle de

ces dernières dans la pathologie [11].

I-A-1-c-ii Le cholestérol

Le clivage de la protéine APP (Amyloid Precursor Protein) en peptide

Aβ, constituant principal des plaques amyloïdes (cf § I-A-2-a-ii, p. 16), a lieu dans des

domaines riches en cholestérol [12]. Ainsi un taux élevé de cholestérol favoriserait le dépôt de

plaques amyloïdes au niveau du tissu nerveux [13] et une faible concentration en cholestérol

empêcherait la formation de peptide Aβ [14]. Par ailleurs, le cholestérol est un constituant

essentiel des membranes cellulaires et est donc nécessaire au bon fonctionnement des

neurones (développement et plasticité). Dans la MA son transport est altéré. Il semblerait

donc qu’il y ait une relation entre MA et cholestérol. Cependant, l’effet du taux de cholestérol

sur la MA reste controversé.

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I-A-c-1-iii Les mutations génétiques

L’origine génétique de la MA représente 5% des cas. Cette forme de la maladie est

liée à un facteur héréditaire et est appelée « maladie d’Alzheimer familiale ». La plupart des

personnes atteintes du syndrome de Down (ou trisomie 21) souffrent de démence de type

Alzheimer de façon précoce (aux alentours de 40 ans). Ils expriment 1,5 fois plus l’APP que

les individus sains du fait d’une mutation codant pour cette protéine sur le chromosome 21.

D’autres mutations sont à l’origine du développement de la MA avant 60 ans [15]. Ces

mutations vont affecter des gènes codant pour des protéines impliquées dans le transport du

cholestérol ou dans l’activité des enzymes responsables du clivage de l’APP. Ainsi des

mutations sur deux gènes situés sur les chromosomes 1 et 14, codant respectivement pour les

protéines présénilines 2 et 1 (ces protéines s’associent aux γ-sécrétases responsables de la

génération de peptide Aβ à partir de l’APP, cf § I-A-2-a-ii, p. 17) ont été identifiées. A ce

jour, plus de 150 mutations génétiques ont été identifiées et semblent responsables de la

transmission génétique de la maladie.

I-A-1-d Un enjeu de santé publique

La MA est la forme de démence la plus répandue dans le monde avec plus de 35

millions de personnes touchées. En France, elle touche environ 860 000 personnes et

constitue donc la quatrième cause de décès après le cancer, les maladies cardio-vasculaires et

les accidents de la route. Avec le vieillissement de la population et sans traitement efficace à

l’heure actuelle, le nombre de malades devrait atteindre deux millions en France à l’horizon

2020.

Actuellement, la majorité des patients sont à la charge de leur famille. La dépense

moyenne pour la prise en charge d’un patient est d’environ 2000 euros par mois dont 50% à la

charge du patient et de sa famille. Ce qui représente un budget annuel d’une dizaine de

milliards d’euros pour la France.

La MA affectant au moins une personne sur 20 à l’âge de la retraite et au moins un

octogénaire sur 4, l’évolution démographique promet à cette maladie une prévalence

importante. Il est donc nécessaire de trouver rapidement un traitement efficace pour lutter

contre ce problème majeur de santé publique.

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I-A-2 Plaques amyloïdes

Il existe de nombreuses maladies associées à la formation de dépôts amyloïdes

extracellulaires, constituées par des enchevêtrements de fibres, à partir de protéines

normalement solubles. Ces maladies sont regroupées sous le nom d’amyloses et elles sont

classées en trois groupes distincts : les maladies neurodégénératives, comme la MA, dans

lesquelles l’agrégation a lieu dans le cerveau. Les amyloïdoses non neuropathiques localisées

dans lesquelles l’agrégation a lieu dans un type de tissu précis autre que le cerveau. Par

exemple, l’agrégation de l’amyline dans le foie entraine l’apparition d’un diabète de type II.

Puis les amyloïdoses non neuropathiques systémiques dont les dépôts sont retrouvés dans

différents tissus de l’organisme comme la polyneuropathie amyloïde familiale (rare) qui est

causée par l’agrégation de la protéine Transthyrétine mutée.

Dans de rares cas, la formation de fibres amyloïdes a été conservée par l’évolution

pour générer des nanostructures naturelles exploitées par l’organisme [16,17]. Par exemple, chez

l’araignée, les fibres de spidroïne forment la soie de la toile de la Nephila Edulis [18]. Chez

l’être humain, un fragment de la glycoprotéine Pmel17 polymérise en fibres amyloïdes afin de

séquestrer la mélanine, durant la biogenèse des mélanosomes [19].

Dans le cas de la MA, les dépôts amyloïdes sont des agrégats denses de peptide Aβ

organisés en fibrilles.

I-A-2-a Le peptide Aβ

I-A-2-a-i Origine du peptide Aββ : la protéine APP [20]

L’APP est une protéine exprimée de façon ubiquitaire dans l’organisme mais ses

fonctions physiologiques ne sont pas encore bien connues. De nombreuses études ont montré

que l’APP joue un rôle important dans l’homéostasie des ions métalliques comme le cuivre, le

fer ou le calcium. Elle semble également intervenir dans différents processus comme

l’adhésion cellulaire, la restauration des fonctions neuronales après une lésion ou encore dans

la croissance neuritique.

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I-A-2-a-ii Génération du peptide Aββ : clivage de l’APP

L’APP est métabolisée via deux voies biologiques : la voie amyloïdogénique

(production de peptide amyloïde) et non-amyloïdogénique [21]. Ces deux voies se distinguent

par les enzymes intervenant dans le clivage de la protéine et par la nature des métabolites

formés lors de ce clivage (Fig. I-5).

Dans la voie non-amyloïdogénique, l’enzyme responsable de la coupure de l’APP est

l’α-sécrétase. Cette enzyme va cliver la protéine près du domaine transmembranaire pour

générer un large ectodomaine soluble : α-APPS et laisser un fragment dans la membrane de

83 acides aminés : C83. La voie amyloïdogénique fait intervenir une β-sécrétase qui produit

l’ectodomaine β-APPS et un fragment de 99 résidus ou C99. Ce dernier est le substrat d’une

troisième enzyme la γ-sécrétase. L’hydrolyse de C99 par cette enzyme va conduire à la

formation des peptides Aβ40 et Aβ42. Le fragment C83 peut également être clivé par la γ-

sécrétase et générer une forme tronquée du peptide Aβ au niveau de sa partie N-terminale, le

p3 (Aβ17-40 ou Aβ17-42) et le domaine AICD (APP IntraCellular Domain).

Dans le cas de la MA, les modifications du métabolisme de l’APP et en particulier

l’augmentation de l’activité de la β-sécrétase vont conduire à la surproduction de peptide Aβ.

Ces changements d’activité peuvent avoir plusieurs origines comme une augmentation du

stress oxydant ou une perturbation de l’homéostasie des métaux.

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Figure I-5: Formation du peptide Aββ issu du clivage de l'APP par les ββ - et γγ-sécrétases.

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I-A-2-a-iii Le peptide Aββ

La coupure de l’APP par les enzymes β- et γ-sécrétases conduit principalement à un

peptide Aβ de 40 acides aminés (Aβ40). Cependant, d’autres formes plus ou moins longues

sont également produites et notamment le peptide Aβ42 qui représente environ 5 à 10% des

peptides Aβ. Ces deux peptides, Aβ40 et Aβ42, sont présents sous forme soluble chez les

individus sains (Fig. I-6). Cependant, une augmentation de la production de peptides Aβ va

conduire à son accumulation formant ainsi des dépôts amyloïdes, ou plaques séniles, dans le

cerveau des malades d’Alzheimer [22].

Le peptide Aβ est généré tout au long de la vie sans forcément déclencher de

pathologie. Il doit certainement posséder un rôle physiologique mais ce dernier est encore

largement méconnu. Une hypothèse actuelle propose un rôle dans l’homéostasie des

métaux[23].

I-A-2-b Les fibres amyloïdes [24]

Les peptides Aβ ont tendance à agréger. C’est la raison pour laquelle ils sont

majoritairement retrouvés sous forme de fibres dans le cerveau des malades. Ces fibres ont

tendance à interagir entre elles pour former les plaques amyloïdes.

De façon générale, les peptides Aβ sont des peptides majoritairement hydrophobes. Le

peptide Aβ42, plus hydrophobe, possède une solubilité dans l’eau faible et par conséquent sa

capacité à agréger est plus forte (environ 70 fois plus que le peptide Aβ40 in vitro). Cela

pourrait expliquer que le peptide Aβ42 soit retrouvé en quantité plus importante dans les

plaques amyloïdes que le peptide Aβ40 [25].

Ce phénomène d’agrégation dépend donc de la nature du peptide mais est également

sensible à de nombreux facteurs environnementaux tels que le pH, la concentration du peptide

ou encore la présence d’ions métalliques.

Figure I-6: Séquence peptidique des peptides Aββ40 et Aββ42 (code à 1 lettre).

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I-A-2-b-i Structure des fibres amyloïdes

Le processus d’agrégation du peptide consiste au passage d’un peptide non-structuré

soluble à une structure en feuillets-β. Ces feuillets-β vont interagir entre eux principalement

par des interactions hydrophobes conduisant à la formation de fibres [24-26].

Des études cinétiques ont montré que la fibrillation comporte deux étapes : une étape

lente de nucléation suivie d’une étape rapide d’élongation [27]. La formation de ces fibres se

ferait alors par un mécanisme de nucléation [28] dans lequel un noyau, formé de plusieurs

monomères de peptide Aβ, va croitre pour former de longs protofilaments qui vont s’enrouler

pour former des fibres amyloïdes matures (Fig. I-7).

Un modèle proposé pour la structure des fibres formées in vitro est bien décrit dans la

littérature. Ce modèle structural a pu être obtenu à partir de données expérimentales (RMN du

solide, diffraction des rayons X et microscopie électronique) [30-35].

Figure I-7: Représentation schématique du processus de formation des fibres amyloïdes (adaptée de la réf. [29]).

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Dans la structure obtenue par RMN du solide [32], les peptides sont organisés en

couche de deux feuillets-β, orientés perpendiculairement à l’axe de la fibre (Fig. I-8). Dans

cette structure, les premiers acides aminés (1 à 11) n’ont pas de structure définie, puis les

résidus 12-24 ainsi que 30-40/42 sont impliqués dans la formation des feuillets-β. Les résidus

25-29 forment une boucle entre les feuillets. La formation des feuillets-β est favorisée par la

présence d’une liaison électrostatique entre l’aspartate 23 (chargé négativement) et la lysine

28 (chargée positivement) [36]. Cependant, il existe des différences entre les modèles

structuraux proposés qui peuvent s’expliquer, entre autre, par le fait que la structure dépend

du mécanisme d’agrégation : les peptides Aβ40 et Aβ42 n’agrègent pas selon les mêmes

mécanismes [28].

I-A-2-b-ii Toxicité des espèces agrégées

L’agrégation du peptide en plaques amyloïdes représente une étape importante dans la

maladie d’Alzheimer puisqu’elles sont l’un des marqueurs de la maladie. Au cours de

l’agrégation du peptide, plusieurs formes co-existent en équilibre. Il est donc difficile de

déterminer laquelle de ces formes est responsable de la toxicité : oligomérique ?

fibrillaire ?[37,38]

Figure I-8: Modèle structural des fibres d'Aββ40, (a) représentation en ruban, (b) représentation atomique (en vert les résidus hydrophobes, en violet les résidus polaires, en bleu les résidus chargés

positivement et en rouge ceux chargés négativement). Le cercle noir correspond à la liaison électrostatique entre l’Asp23 et la Lys28 (d’après la réf. [32]111).

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I-A-2-b-iii Espèces amorphes ou fibrillaires

Le terme d’agrégat sera utilisé de manière indifférenciée pour désigner tout type

d’agrégats, qu’il s’agisse d’agrégats fibrillaires ou amorphes. Une fibre amyloïde est

constituée d’un empilement de peptides organisés en feuillets-β. Au contraire, un agrégat

amorphe n’aura pas de structure tridimensionnelle bien définie et aura plus tendance à

précipiter que les agrégats de type fibrillaire.

I-A-2-c L’hypothèse de la cascade amyloïde

En résumé, les plaques amyloïdes sont retrouvées dans tous les cerveaux des patients

atteints de la MA. Ces plaques sont principalement constituées du peptide Aβ sous forme

agrégée. Ce peptide est présent sous forme monomérique soluble chez les individus sains. Le

passage de la forme soluble à agrégée représente alors une étape clé dans la maladie qu’il est

nécessaire de comprendre.

A partir des différents éléments décrits précédemment, une explication liant la MA à la

formation des plaques amyloïdes a été envisagée : l’hypothèse de la cascade amyloïde [37]. Le

peptide Aβ est issu du clivage par les β et γ-sécrétases de l’APP. Les peptides sont alors sous

forme monomérique soluble et non toxique pour les cellules. Au cours du développement de

la maladie, les peptides Aβ sont produits en plus grande quantité et/ou subissent une

diminution de leur dégradation. Ces deux événements conduisent à leur accumulation. Les

peptides ne sont plus sous forme monomérique soluble mais sous forme oligomérique. Ils

vont alors se structurer en feuillets-β stabilisés par des interactions électrostatiques. Ces

feuillets-β vont alors interagir entre eux pour former des protofibrilles, des fibres et par la

suite des plaques amyloïdes qui sont toxiques pour les neurones (Fig. I-9).

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Plusieurs éléments indiquent que les espèces les plus toxiques vis-à-vis des neurones

seraient les espèces oligomériques c’est-à-dire les espèces intermédiaires entre le peptide

monomérique et les fibres amyloïdes [40-42]. En effet, les plaques amyloïdes semblent

relativement inertes comparativement à des formes plus petites. Cependant, la difficulté

rencontrée à isoler ce type d’intermédiaires ne permet pas d’apporter une réponse précise à ce

jour. Malgré de nombreuses recherches, les mécanismes de l’agrégation et de la toxicité liés à

ce processus ne sont pas encore clairement définis.

I-A-3 Les voies thérapeutiques actuelles

A ce jour, il n’existe aucun traitement curatif efficace contre la maladie d’Alzheimer.

En France, quatre molécules sont administrées aux patients souffrant de la MA dont 3

appartiennent à la famille des anticholinestérases (Donépézil, Galantamine et Rivastigmine),

le quatrième est un anti-glutamate (Mémantine). Les lésions caractéristiques de la MA, les

plaques amyloïdes et les dégénérescences neurofibrillaires, sont accompagnées d’une

diminution de l’acétylcholine qui un neurotransmetteur impliqué dans la communication entre

les neurones. Les anticholinestérasiques ont pour action d’empêcher la dégradation de cette

molécule. La Mémantine a pour but de bloquer les récepteurs du glutamate, molécule

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Figure I-9: Hypothèse de la cascade amyloïde (d’après la réf. [39]).

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responsable d’une excitation toxique du système nerveux. Ces quatre molécules ont montré

une efficacité dans les domaines de la cognition. Cependant, ces traitements sont des

traitements symptomatiques qui vont ralentir la progression de la maladie mais ne peuvent pas

guérir les patients. D’autres approches thérapeutiques sont envisagées basées sur l’hypothèse

de la cascade amyloïde qui ciblent directement le peptide Aβ.

I-A-3-a Prévention de la production d’Aβ

L’une des approches thérapeutiques consiste à prévenir la production du peptide Aβ.

Le peptide Aβ est issu du clivage de l’APP par les enzymes β et γ-sécrétases. Développer des

molécules capables d’agir sur les fonctions catalytiques de ces enzymes sans modifier leurs

autres fonctions physiologiques semble une stratégie intéressante. De plus, l’APP est

également un substrat de l’enzyme α-sécrétase qui ne produit pas de peptide Aβ natif mais

des formes tronquées. Une autre approche consisterait donc à stimuler l’activité de l’α-

sécrétase de façon à empêcher la libération du peptide Aβ.

I-A-3-a-i Stimulation de l’αα-sécrétase

L’α-sécrétase, métalloprotéase à zinc, intervient dans le métabolisme non

amyloïdogène de l’APP en la transformant en α-APPs qui est un fragment soluble aux

propriétés neurotrophiques et neuroprotectrices. La stimulation de cette voie se fait au

détriment de la production de peptide Aβ par la voie amyloïdogénique. En effet, des études

pré-cliniques ont montré que EHT0202 protège les neurones corticaux contre le peptide Aβ42

du fait de l’induction du fragment α-APPS. De plus, son administration régulière réduit les

quantités de peptide Aβ42 dans le cerveau et le liquide céphalo-rachidien du rat. La molécule

EHT0202, en phase clinique IIA, est capable de stimuler l’activité de l’α-sécrétase [43].

I-A-3-a-ii Inhibition des β et γ-sécrétases

Cibler spécifiquement ces enzymes pourrait permettre de contrôler directement la

production de peptide Aβ à partir de l’APP.

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Inhibiteurs de la β-sécrétase

La β-sécrétase ou BACE-1 (β site APP Cleaving Enzyme 1) est une cible privilégiée

des thérapies actuellement en cours de développement. En effet, non seulement cette enzyme

est directement impliquée dans la libération du peptide Aβ mais la structure de son domaine

protéase est connue ce qui facilite la conception d’inhibiteurs.

Ainsi la molécule KMI-429 (Fig. I-10) a montré une inhibition totale de la BACE 1 à

de faible concentration [44] impliquant une réduction de la quantité de peptide Aβ40/42

soluble mais également insoluble chez des souris transgéniques (modèles de la MA). D’autres

molécules [45-48] ont été développées et montrent une excellente inhibition de l’enzyme.

Cependant, la taille imposante du site actif de l’enzyme impose de concevoir des molécules

de haut poids moléculaire qui ne franchiront que très difficilement la barrière hémato-

encéphalique (BHE). De plus, ces inhibiteurs nécessitent une sélectivité pour la BACE-1. La

BACE-2, son homologue, intervient dans la vascularisation des tissus. Son inhibition aurait

alors de graves conséquences.

Inhibiteurs de la γ-sécrétase

Le Semagacestat ou LY-450139 [49], testé en phase III, est un inhibiteur de la γ-

sécrétase qui a montré, in vitro et in vivo, une réduction significative du taux de plaques

amyloïdes. Malgré ce résultat encourageant, aucune amélioration des symptômes dont

souffraient les patients n’a été observée. Au contraire, dans certains cas une aggravation des

problèmes de mémoire et des difficultés dans l’exécution des tâches quotidiennes ont été

constatées. Le développement d’inhibiteur de la γ-sécrétase semble interférer avec d’autres

voies de transduction du signal nerveux et ne représente donc pas une cible thérapeutique

exploitable.

Figure I-10: Structure de l'inhibiteur KMI-429.

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Modulation des sécrétases

Les AINS (Anti-Inflammatoires Non Stéroïdiens) sont une alternative en tant que

candidat anti-amyloïde. Ces molécules agissent comme « bithérapie » puisqu’ils sont capables

d’inhiber à la fois la γ-sécrétase et diminuer l’expression de la BACE 1.

Certains AINS, comme le naproxène (Fig. I-11) ont montré une réduction de la

production d’Aβ42 avec la libération de peptides Aβ plus courts et moins toxiques comme le

peptide Aβ38 [50]. Ces molécules modifient l’activité de la γ-sécrétase mais ne sont pas des

l’inhibiteur de cette dernière. Cependant la plupart des études cliniques menées n’ont montré

aucune amélioration significative des fonctions cognitives.

Les sécrétases représentent une cible thérapeutique de premier choix. Cependant, le

manque de spécificité des molécules développées ou encore le rôle de ces enzymes dans

d’autres processus physiologiques rendent difficile la mise un point d’un traitement efficace.

I-A-3-b Dégradation du peptide Aβ

L’accumulation de peptide Aβ dans le cerveau semble être le résultat de deux

événements : une surproduction de peptide mais également une diminution de la dégradation

du peptide. Une autre approche thérapeutique consiste donc à favoriser la dégradation du

peptide Aβ par stimulation des protéases telles que la plasmine [51,52]. En effet, cette dernière

est supposée participer au métabolisme extracellulaire du peptide Aβ sous la régulation du

plasminogène PAI. Les agrégats d’Aβ peuvent stimuler l’expression de PAI et activer la

formation de plasmine qui en retour hydrolyse le peptide. Ce processus d’auto-régulation est

naturellement présent dans le cerveau sain. Cependant, dans les cerveaux Alzheimer, PAI est

Figure I-11: Structure de l'AINS naproxène.

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faiblement exprimé ce qui pourrait être à l’origine de la diminution de dégradation du peptide

Aβ et donc de son accumulation dans le cerveau.

PAZ-417 a été identifiée comme une molécule stimulant la production de plasmine.

Son administration chez des souris transgéniques (modèles de la MA) entraine une réduction

du taux d’Aβ et des déficits cognitifs. La molécule est actuellement en cours d’évaluation

clinique en essai de phase I.

I-A-3-c Inhibition de l’agrégation d’Aβ

Une alternative à la prévention de la production et à la dégradation de peptide Aβ est

d’inhiber l’agrégation du peptide en formes oligomériques toxiques. Des recherches menées

dans ce sens ont montré que l’utilisation de peptide mimétiques de Aβ [53], porteurs de

modifications comme la présence de résidu proline, défavorise la formation de feuillets-β.

Cependant, leur utilisation reste difficile. En effet, malgré leur hydrophobicité et leur faible

solubilité dans l’eau, ces peptides traversent difficilement la BHE et peuvent être à l’origine

de réponses immunologiques indésirables de par leurs propriétés antigéniques.

Des recherches s’orientent vers l’utilisation de molécules plus petites comme le DAPH

(Fig. I-12) qui réduit la quantité de fibrilles et la toxicité in vitro [54]. Il est proposé que

certains polyphénols, qui ont des propriétés antioxydantes, agissent comme des inhibiteurs de

la fibrillation comme la curcumine (Fig. I-12) qui réduit le taux de plaques amyloïdes chez la

souris transgénique [55,56].

L’utilisation de ces molécules est toutefois limitée dans l’hypothèse où les espèces les

plus toxiques ne sont pas les plaques amyloïdes mais les espèces oligomériques.

Figure I-12: Représentation des inhibiteurs de l'agrégation : le DAPH (à gauche) et la

curcumine (à droite).

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I-A-3-d Autres approches envisagées

D’autres approches plus ou moins controversées sont également en cours de

développement comme l’immunisation contre Aβ. A la fin des années 90, Solomon a montré

que des anticorps monoclonaux dirigés contre le peptide Aβ42 inhibent à la fois son

agrégation in vitro mais peuvent aussi resolubiliser des précipités fibrillaires d’Aβ42 [57].

Depuis, des essais cliniques explorent la piste vaccinale (immunisation active),

l’immunisation passive (sérothérapie) ou spécifique [58-60].

Des essais cliniques d’immunisation active avec le peptide Aβ42 pré-agrégé ont

montré que 6% des patients ont développé des encéphalites méningées graves suite aux essais

de vaccination. Ils ont donc été interrompus. De plus, dans la mesure où le peptide peut

franchir la BHE, il faut garder à l’esprit que l’immunisation pourrait être responsable de

l’accélération des processus de formation de plaques dans le cerveau [61].

L’immunisation passive avec des anticorps anti-Aβ devrait être moins toxique que

l’immunisation active car associée à un risque plus faible de réponse auto-immune [61].

Comme dans le cas de l’immunisation active, plusieurs études montrent que les anticorps

permettent de réduire les plaques chez des souris transgéniques [62,63]. Certains de ces

anticorps sont actuellement testés cliniquement comme le Bapineuzumab, en phase d’essai

clinique II et le Solanezumab en phase III [64] .

L’immunisation spécifique doit encore faire ses preuves. En effet, les études cliniques

en phase III du Gammagard viennent récemment d’être stoppées. Cette molécule n’apportait

aucune amélioration cognitive (www.alzforum.org).

Différentes pistes thérapeutiques sont en cours de développement. Malgré le nombre

important d’essais cliniques, aucune molécule n’est suffisamment spécifique ou efficace pour

empêcher l’agrégation du peptide Aβ sans affecter d’autres fonctions physiologiques. La

recherche d’un médicament efficace contre la MA nécessite d’explorer de nouvelles voies

thérapeutiques. C’est la raison pour laquelle de plus en plus d’études s’intéressent aux rôles

des métaux dans la maladie. Ces derniers pouvant alors représenter une voie thérapeutique

innovante.

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�Chapitre I. B- Thioflavine T et la maladie d’Alzheimer

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I-B Thioflavine T et la maladie d’Alzheimer

Cette seconde partie de l’introduction aborde l’utilisation de la Thioflavine T (ThT)

comme sonde fluorescente pour étudier l’agrégation du peptide Aβ. Après une brève

présentation des fluorophores habituellement utilisés pour suivre l’agrégation de manière

générale, nous verrons pourquoi la ThT est particulièrement adaptée à l’étude du processus

d’agrégation du peptide Aβ.

I-B-1 Agrégation et fluorophores

La cascade amyloïde, une des origines possibles de la MA, correspond au passage du

peptide Aβ sous forme monomérique soluble à une forme agrégée, insoluble. La

caractérisation de ce processus d’agrégation et des différents types d’agrégats formés en terme

de taille, de forme ou de morphologie nécessite l’utilisation de plusieurs méthodes

complémentaires. Idéalement, ces techniques doivent être capables de détecter d’important

changement conformationnel du peptide en fonction de son état d’agrégation. La

spectroscopie de fluorescence répond à ce critère, c’est une méthode très sensible qui est

largement utilisée dans l’analyse des protéines.

I-B-1-a Présentation des principaux fluorophores utilisés [65]

En 1965, Stryer a montré que l’interaction du fluorophore ANS (1-anilinonaphtalène-

8-sulfonate) avec une cavité hydrophobe était accompagnée d’une augmentation de sa

fluorescence ainsi qu’un déplacement de son pic d’émission vers les plus hautes énergies.

Depuis l’ANS et son analogue dimérique, le bis-ANS, sont largement utilisés dans la

caractérisation des protéines. Le Nile Red a été utilisé pour la première fois pour la détection

de lipides intracellulaires et pour suivre les changements conformationnels de diverses

protéines. Dans le cadre de l’agrégation et caractérisation des fibres amyloïdes le Congo Red

et la ThT sont les fluorophores les plus utilisés. Ces fluorophores (Fig. I-13) vont être

succinctement présentés dans le tableau (Tableau I-1). Les caractéristiques spectroscopiques

et l’utilisation de la ThT seront détaillées dans la suite du chapitre.

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I-B-1-a-i ANS et bis-ANS

Les propriétés de fluorescence du ANS et bis-ANS (Fig. I-13) sont très sensibles à

l’environnement (polarité, viscosité et température). Le pic d’émission de ces deux

fluorophores ainsi que leur rendement quantique est fonction de la constante diélectrique du

solvant utilisé mais également de leur interaction avec les protéines. En effet, il est proposé

que l’ANS et le bis-ANS se lient aux protéines via des interactions hydrophobes et

électrostatiques. Plus précisément, l’interaction avec les protéines se fait entre les charges

négatives, portées par les groupements sulfonates des fluorophores, et les charges positives

portées par les acides aminés de la protéine comme l’histidine, l’arginine ou la lysine.

Cependant, des interactions de type Van der Waals sont également nécessaires pour stabiliser

cette interaction

Par ailleurs, la différence de taille entre l’ANS et le bis-ANS va conduire à des

différences au niveau du nombre et de l’affinité des sites de liaison aux protéines. Plusieurs

protéines montrent une plus grande affinité pour le bis-ANS et de ce fait une augmentation de

la fluorescence plus importante que pour l’ANS. Ces deux fluorophores vont être utilisés

comme senseur des changements conformationnels des protéines (formation de surface

hydrophobe) au cours de l’agrégation de ces dernières.

Figure I-13: Représentation des fluorophores couramment utilisés: ANS, bis-ANS, Nile Red et Congo Red.

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I-B-1-a-ii Le Nile Red

Comme pour l’ANS et le bis-ANS, les propriétés de fluorescence du Nile Red (Fig. I-

13) dépendent fortement de la polarité du solvant utilisé et plus son environnement est

polaire, plus la fluorescence du Nile Red va être importante. C’est pour cette raison que le

Nile Red est utilisé comme sonde des changements conformationnels des protéines et plus

particulièrement sur la formation de surfaces hydrophobes qui peuvent se créer au cours de

l’agrégation ou de la structuration de protéines de la même façon que l’ANS.

I-B-1-a-iii Le Congo Red

Le Congo Red (Fig. I-13) est très utilisé pour colorer les fibres amyloïdes présentes

dans les tissus via des interactions non-ioniques. L’interaction avec les fibres amyloïdes

provoque un déplacement du maximum d’absorbance en UV (490 à 540 nm) et induit du

dichroïsme circulaire entre 300 et 600 nm. De nombreux modèles d’interaction entre le Congo

Red et les fibres amyloïdes ont été proposés et sont résumés dans la revue de Frid [66].

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Tableau I-1: Propriétés spectroscopiques et application du ANS, bis-ANS, Nile Red et Congo Red.

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I-B-1-b Fluorophores et caractérisation des protéines

L’utilisation de ce type de fluorophores est particulièrement informative lors des

études de dénaturation/structuration des protéines et permet de mettre en évidence l’absence

ou non de passages par des intermédiaires plus ou moins structuré (ou molten intermediates).

En présence de tels intermédiaires, l’intensité de fluorescence ainsi que la position du

maximum d’émission sont modifiées reflétant ainsi la formation de surfaces hydrophobes.

Ces fluorophores sont très utilisés dans l’étude de l’agrégation des protéines. Par

exemple, l’ANS et le bis-ANS sont révélateurs des premiers états d’agrégation qui sont

présents à de très faible concentration et ont une durée de vie très courte.

D’autres applications peuvent nécessiter l’utilisation de ces sondes fluorescentes

comme dans la visualisation des protéines par microscopie de fluorescence qui permet

d’obtenir des informations sur l’état agrégé ou non des protéines.

La principale application de ces fluorophores concerne la détection des fibres

amyloïdes avec la ThT comme fluorophore privilégié de par ses propriétés de fluorescence

très adaptées en présence de ces fibres.

I-B-2 La Thioflavine T (ThT)

Beaucoup de molécules organiques, en présence de fibres amyloïdes, présentent des

changements au niveau de leur absorbance ou de leur fluorescence ce qui permettrait de les

utiliser en tant que sonde optique pour mettre en évidence l’existence de ces fibres dans les

tissus humains ou dans des échantillons tests. Cependant, la plupart de ces molécules ont

tendance à inhiber la formation des fibres amyloïdes.

Historiquement, la ThT est utilisée comme colorant pour détecter la présence de fibres

amyloïdes dans les coupes histologiques des cerveaux de patients décédés [67]. Depuis, grâce à

sa solubilité dans l’eau et son affinité pour les fibres amyloïdes, la ThT est utilisée in vitro

pour suivre l’agrégation du peptide Aβ en fibres amyloïdes [39]. Elle est connue dans la

littérature pour interagir spécifiquement avec les fibres amyloïdes et est considérée comme

inerte vis-à-vis de la formation de ces dernières.

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I-B-2-a Généralités [39,68,69]

La ThT, molécule chargée positivement, est composée d’un noyau de type aniline et

d’un fragment de type benzothiazole (Fig. I-14). Dans cette conformation « libre », les

longueurs d’onde d’excitation et d’émission de la ThT sont 385 et 485 nm respectivement. En

présence de fibres amyloïdes, la ThT va former un complexe fluorescent avec les fibres qui ne

possède pas les mêmes caractéristiques spectroscopiques : les pics d’excitation et d’émission

en fluorescence sont à 440 et 490 nm. Les caractéristiques spectroscopiques ainsi que les

propriétés d’interaction dans les fibres de la ThT sont plus explicitées dans le chapitre II (cf §

II-A-2-d, p. 78).

I-B-2-b ThT et fibres amyloïdes

La ThT possède une bonne affinité pour les fibres amyloïdes (Kd∼1µM) [70] et elle

n’interagit pas avec les espèces monomériques du peptide Aβ qui ne sont pas ou très peu

structurées. Elle interagit cependant avec les espèces oligomériques mais dans ce cas son

augmentation de fluorescence ne sera pas aussi importante (multipliée par 1.5) qu’en présence

de fibres (>>100 fois plus) [71]. De nombreuses études sont menées pour connaître l’origine de

ces propriétés uniques, elles visent à comprendre au niveau moléculaire et thermodynamique

le mode d’interaction de la ThT avec les fibres amyloïdes.

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SN

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CH3

CH3H3C

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Figure I-14: Représentation de la ThT avec en rouge le fragment benzothiazole et en bleu le fragment aniline.

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I-B-2-c-i Interaction ThT-fibres amyloïdes

Différentes études ont proposé que l’interaction entre la ThT et les fibres amyloïdes se

ferait au niveau de cœur hydrophobe du peptide, entre la Leu17 et l’Asp23 par des

interactions de type π-stacking avec les résidus aromatiques (Phe). Par ailleurs, la ThT serait

orientée de façon parallèle à l’axe des fibres formées d’un empilement de feuillets β (Fig. I-

15) [72,73]. Cependant aucune structure du complexe ThT-fibres amyloïdes n’a été résolue à ce

jour.

I-B-2-c-i Site d’interaction

La résolution structurale du complexe ThT-fibre permettrait en effet de déterminer

avec précision le mode d’interaction de la ThT. Récemment, l’équipe de Turoverov a montré

que la ThT aurait deux modes d’interaction possibles aux fibres amyloïdes. Chacun de ce

mode est caractérisé par un coefficient d’extinction molaire, une constante d’affinité ainsi

qu’un nombre de site de liaison et un rendement quantique [68]. Une autre étude propose que la

ThT possède trois sites de fixation distincts aux fibres amyloïdes [70]. Il est également proposé

que 5 résidus hydrophobes ou aromatiques consécutifs soient nécessaires pour la liaison de la

ThT au peptide Aβ ce qui expliquerait le ratio 1:4 à 1:35 de ThT:Aβ monomérique détecté

dans les fibres [74].

La ThT est un fluorophore utilisé depuis le début des années 60 pour caractériser la

présence de fibres amyloïdes. Cependant cette interaction est encore mal décrite à ce jour et

plusieurs questions restent sans réponse. Connaître précisément le mode d’interaction de la

Figure I-15: Représentation de l'orientation supposée de la ThT de façon parallèle à l'axe des feuillets-ββ.

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ThT n’est pas seulement important d’un point de vue fondamental, les dérivés de la ThT sont

des molécules intéressantes en tant que marqueurs (imagerie) mais également en tant que

vecteurs de molécules actives contre la MA (cf § I-D-3-a-iii, p. 61).

I-B-2-c ThT et agrégation

L’agrégation du peptide Aβ en fibres amyloïdes est un processus multi-étape. Des

facteurs thermodynamiques et cinétiques sont impliqués dans l’agrégation du peptide Aβ et

les différents intermédiaires formés au cours de ce processus peuvent coexister à chaque étape

de l’agrégation. Un mécanisme communément admis pour la formation et la croissance des

fibres est un processus en deux étapes successives : la nucléation et l’élongation. La cinétique

de la réaction est dépendante des constantes de vitesse de nucléation et d’élongation [29].

I-B-2-c-i La nucléation

Le peptide Aβ est non-structuré sous forme monomérique et en solution les

monomères vont s’associer de façon à former des noyaux. La formation de ces noyaux

nécessite plusieurs étapes d’association qui ne sont pas thermodynamiquement favorisées à

cause du coût énergétique nécessaire à cette association. La formation de ces noyaux

représente donc l’étape limitante dans la formation des fibres.

Dans cette étape de nucléation, les peptides ne sont pas structurés au départ. La

proportion de feuillets-β va augmenter au cours du temps. Par conséquent aucun changement

de fluorescence de la ThT ne sera observé dans les toutes premières étapes de l’agrégation.

I-B-2-c-ii L’élongation

Une fois les noyaux générés, les assemblages fibrillaires vont commencer à se former

ce qui correspond à la phase d’élongation énergétiquement favorisée. Ceci va se traduire par

une brusque et rapide augmentation de la fluorescence de la ThT indiquant la formation de

feuillets-β. En effet, cette phase correspond à l’étape durant laquelle les espèces

intermédiaires de l’agrégation vont se structurer en feuillets-β puis en fibres amyloïdes. A

partir du moment où les fibres se forment, la fluorescence ne va plus augmenter et un plateau

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sera alors observé. Les changements de fluorescence observés au cours de l’agrégation sont

représentés de façon schématique par une sigmoïde (Fig. I-16) dans laquelle l’intensité de

fluorescence est proportionnelle au nombre de fibres formées si la concentration en ThT n’est

pas limitante.

Figure I-16: Courbe théorique du processus d'agrégation qui possède une allure de sigmoïde

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�Chapitre I. C- Les métaux en biologie

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I-C Les métaux en biologie

Les métaux, présents sous forme ionique, ont un rôle essentiel en biologie. La

troisième partie de ce chapitre consiste en une présentation de ces ions métalliques ainsi que

leurs rôles dans les systèmes biologiques et comment leur dérégulation peut avoir de graves

conséquences. Dans ce manuscrit, les termes métaux et ions métalliques sont utilisés de façon

indifférenciée tout en sachant qu’il s’agit ici d’un abus de langage.

I-C-1 Les métaux : indispensables pour l’organisme

En biologie, les métaux peuvent être classés en deux catégories :

-les métaux essentiels qui ont une fonction physiologique au sein de l’organisme tels que le

calcium, le cuivre, le zinc, le fer, le manganèse, etc.

-les métaux non-essentiels (ou toxiques) comme le cadmium, le mercure ou le plomb. Ces

métaux ne possèdent pas de rôles biologiques connus et présentent, le plus souvent, une forte

toxicité pour les organismes vivants. Il est alors nécessaire pour ces organismes de développer

des processus qui vont limiter l’accumulation de ces métaux ou qui vont les modifier de façon

à les rendre moins toxiques.

I-C-1-a Les métaux essentiels

Les métaux essentiels interviennent dans de nombreuses fonctions biologiques. Les

métaux les plus répandus dans le corps humain sont le sodium, le magnésium, le potassium et

le calcium. Ils sont nécessaires à la conduction du signal nerveux, la contraction musculaire,

la stabilisation des acides nucléiques et interviennent dans une multitude de processus

biologiques. D’autres métaux sont présents sous forme de traces c’est-à-dire qu’ils

représentent moins de 0.01% de la masse corporelle. Ces métaux traces sont principalement

représentés par les métaux de transitions de la première ligne : le cuivre (Cu), le zinc (Zn) et

le fer (Fe), leur rôle est détaillé dans la suite de ce sous-chapitre.

Ces métaux sont indispensables au bon fonctionnement des fonctions physiologiques.

Cependant, à de fortes concentrations, ils peuvent devenir toxiques. De même, une carence de

ces éléments peut être létale (Fig. I-17) [75].

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Les organismes vivants doivent donc mettre en œuvre des processus de régulation afin

de maintenir l’homéostasie de ces métaux essentiels nécessaires au bon fonctionnement des

systèmes biologiques.

I-C-1-a-i Le cuivre [76]

Généralités

Le cuivre (Cu) est présent à l’état de trace dans le corps humain avec une concentration

comprise entre 1.4 et 2.1 mg/kg. Malgré sa faible concentration, le Cu est extrêmement

important a niveau de l’activité redox de la cellule. En effet, le cuivre existe sous deux états

d’oxydation : Cu(I) et Cu(II). La majorité des enzymes qui utilisent le Cu sont impliquées

dans des processus d’oxydation/réduction (galactose oxydase, nitrile reductase, …), dans la

chaine respiratoire (cytochrome c oxydase) et également dans le métabolisme du Fer

(ceruloplasmine) ou la production d’espèces réactives de l’oxygène (SuperOxyde Dismutase

ou SOD). Les centres actifs d’enzymes à base de Cu peuvent être classés dans trois familles

selon la sphère de coordination du Cu :

- le Type I ou protéines à cuivre « bleues » dans lesquelles le Cu est coordiné par 2

atomes d’azote et 2 atomes de soufre. Ces enzymes permettent le transfert d’électron

comme les cupredoxines.

- le Type II où la sphère de coordination du Cu est composée de 2 atomes d’azote et/ou

2 atomes d’oxygène. Ce type d’enzyme est généralement impliqué dans la catalyse de

la production d’espèces oxygénées.

Figure I-17: Effet de la concentration en ions métalliques sur le métabolisme

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- le Type III dont le centre est un dimère de Cu où les deux ions sont liés par un pont

oxo ou hydroxo. Ces enzymes sont des oxydases à centres multiples.

Rôle du cuivre dans la neurotransmission [77]

Le transport du cuivre jusqu’au cerveau requiert le passage de la BHE via des

transporteurs transmembranaires du cuivre. L’entrée du cuivre, au préalable réduit en

Cu(I), dans les cellules neuronales se fait par la protéine hCtr1 (pour Human Copper

Transporter). Une fois dans la synapse, le cuivre est pris en charge par différentes

protéines, connue sous le nom de protéines chaperonnes du cuivre, comme Atox1, CCS

(Copper Chaperon Superoxide Dismutase) ou Cox17. Ces protéines chaperonnes vont

transférer le Cu(I) jusqu’à des protéines spécifiques que sont la SOD, la CCO

(Cytochrome C Oxidase) ou l’ATP7A.

L’ATP7A transfère le Cu(I) à l’ATP7B qui va le libérer dans la fente synaptique, le

Cu(I) est alors oxydé en Cu(II). Sous cette forme, le Cu(II) va venir activer les récepteurs

NMDA (N-méthyl-D-aspartate). Ces récepteurs régulent la consolidation des souvenirs

mais également la mort du neurone.

I-C-1-a-ii Le Zinc [76,78]

Généralités

Le zinc est essentiel à toutes formes de vie. Il est retrouvé à hauteur de 2 g dans le

corps humain. L’ion Zn(II) n’est pas redox actif c’est-à-dire qu’il ne peut intervenir dans des

réactions oxydo-réduction comme le Cu car il n’existe pas sous différents états d’oxydation

(son orbitale d est complète). De ce fait, il est généralement considéré comme étant moins

toxique que le cuivre ou le fer.

Le zinc est connu pour participer à plus de 300 réactions enzymatiques dans lesquelles

sa présence est requise pour assurer la fonction enzymatique. Un certain nombre de protéases

peuvent se lier au zinc comme les carboxypeptidases qui sont des enzymes impliquées dans la

digestion ou les métalloprotéases matricielles qui ont un rôle dans le développement

embryonnaire, la motilité cellulaire, la cicatrisation et la reproduction.

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Rôle dans la neurotransmission [79]

La protéine ZnT3, présente dans le cerveau, est responsable du transport du Zn du

cytoplasme vers les vésicules synaptiques des terminaisons glutamatergiques. Ces vésicules

vont ensuite être transportées vers la terminaison présynaptique. Le glutamate et le zinc

qu’elles contiennent vont être libérés dans la fente synaptique par exocytose. Le Zn(II) va

alors jouer un rôle dans la modulation des récepteurs NMDA. Le Zn(II) semble également

jouer un rôle dans la plasticité synaptique et particulièrement dans la potentialisation et la

dépression à long terme qui sont supposés être les mécanismes responsables de

l’apprentissage et de la mémoire.

I-C-1-a-iii Le Fer [76]

Le corps humain contient 3-4 g de Fer dont la majorité est complexée par

l’hémoglobine présente dans les globules rouges du sang. Le fer possède des états

d’oxydation allant de –II à +VI. D’un point de vue biologique, les deux états d’oxydation les

plus retrouvés sont le Fe(II) et Fe(III). Le Fe(III) est facilement réduit en Fe(II) par des

réducteurs présents dans le milieu tels que l’ascorbate. Le Fe(IV) et Fe(V) sont seulement

présent sous forme d’intermédiaires dans les mécanismes catalytiques de certaines enzymes à

Fer. Le Fer est retrouvé dans trois différentes classes de protéines :

-les protéines hémiques comme l’hémoglobine, la myoglobine les cytochromes

- combiné au soufre, le Fer forme des cofacteurs Fe/S. Ces clusters Fe/S peuvent ensuite

s’insérer dans des apoprotéines de type ferredoxines, nitrogénase et hydrogénase.

-les protéines non-hémiques telles que la ribonucléotide réductase intervenant dans la

synthèse de l’ADN, des oxidases et oxygénases qui catalysent les étapes essentielles à la

biosynthèse d’antibiotiques comme l’isopenicilline.

Le Fer est redox actif comme le Cu et de ce fait possède la capacité de catalyser la

formation de radicaux libres (espèces réactives de l’oxygène) en présence d’oxygène. Le Fer

est retrouvé dans les vésicules synaptiques mais sont rôle dans la synapse n’est pas encore

élucidé [79].

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I-C-1-b Dérégulation des métaux et maladies [76]

Les ions métalliques décris précédemment ont tous des fonctions biologiques

spécifiques essentielles à la vie. Le moindre problème dans la régulation de leur réservoir

intracellulaire peut conduire à la formation d’espèces toxiques comme les radicaux libres

létales pour les cellules. La cellule doit mettre en œuvre des systèmes complexes pour

maintenir l’équilibre entre l’importance des ions métalliques et leur capacité à devenir

toxiques.

Une mauvaise régulation du fer peut conduire à une anémie par un manque de fer dans

l’hémoglobine ou à cause d’une diminution de nombre de globules rouges dans le sang. Ce

manque de fer va se traduire principalement par de la fatigue qui peut également être le signe

d’une autre pathologie, l’hémochromatose. Cette dernière correspond à un excès de fer

principalement au niveau du foie, du cœur et du système endocrinien. Le fer est impliqué dans

de nombreuses maladies neurodégénératives comme la maladie de Parkinson ou

neuroferritinopathie qui affecte les fonctions cognitives et motrices des malades.

La maladie de Menkes est une maladie génétique liée au chromosome X associée à un

manque de cuivre. Cette carence en Cu va se traduire par un retard de croissance, des

problèmes neurologiques et une hypopigmentation. Un excès de cuivre dans le foie et le

cerveau est le principal symptôme de la maladie de Wilson entrainant cirrhose, défaillances

hépatiques et neurologiques ainsi que des problèmes psychiatriques. La céruloplasmine est

une oxidase à centre multiple qui lie 95% du cuivre présent dans le sang et qui est responsable

du transport du cuivre dans le corps humain. Des mutations sur le gène responsable de sa

biosynthèse vont entrainer une acéruloplaminémie qui est caractérisée par une dégénérescence

de la rétine, du diabète, des tremblements, ….

Comme le fer, une modification de l’homéostasie du cuivre est retrouvée dans de

nombreux désordres neurodégénératifs comme la maladie du prion ou de Huntington qui ont

pour conséquence une détérioration des fonctions motrices, cognitives et psychiatriques.

A cause de son implication dans de nombreux processus biologiques, les symptômes

d’une carence en zinc vont être variés allant de la perte des cheveux à des désordres

psychologiques. Le zinc est également important pour le développement du système

immunitaire. Un manque de zinc va donc altérer la résistance aux bactéries et aux virus. Une

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insuffisance en zinc contribuerait aux décès d’environ 800 000 enfants de moins de 5 ans à

travers le monde. Un excès de zinc est très rarement rencontré et le plus souvent, il résulte

d’une consommation de nourriture contaminée par des containers galvanisés. Un surplus en

zinc va se traduire par de la fatigue, de la fièvre et des irritation intestinales mais va également

interférer avec les taux de cuivre et de fer.

Le cuivre, le fer et le zinc jouent des rôles importants dans un grand nombre de

processus biologiques malgré leur faible concentration dans l’organisme. Leur mauvaise

régulation peut devenir extrêmement toxique comme montré précédemment (Fig. I-18). Leurs

mécanismes d’assimilation sont largement connus. Cependant, il reste de nombreux points à

élucider concernant les mécanismes responsables de leur régulation intracellulaire nécessaire

pour maintenir l’équilibre entre nécessité et toxicité.

Figure I-18: Rôle des ions métalliques dans le métabolisme cellulaire et les conséquences de leur dérégulation

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I-C-2 Les métaux en chimie médicinale [80,81]

Avec la découverte du cisplatine, cis-Pt(NH3)2Cl2, comme molécule active contre le

cancer, la place des métaux dans la chimie médicinale devient de plus en plus importante. En

effet, comparativement aux molécules purement organiques, les métaux offrent une diversité

structurale considérable. Un carbone avec quatre substituants différents va exister sous la

forme de deux énantiomères. Tandis qu’un métal de géométrie octaédrique avec six

substituants possède 30 stéréoisomères différents. De par leur capacité à perdre ou gagner des

électrons, les métaux sont le siège de transferts électroniques. Cette activité redox peut être

bénéfique d’un point de vue activité thérapeutique avec notamment l’activation du complexe

par réduction de son état d’oxydation. Une autre propriété intéressante à l’utilisation de

complexes métalliques en chimie médicinale est leur capacité à échanger leur ligand. Cette

caractéristique peut se révéler très précieuse notamment dans la préparation des complexes.

Dans la suite de ce paragraphe, différents exemples de métaux utilisés en chimie

médicinale dans le cadre d’une application thérapeutique ou comme outils au diagnostic vont

être présentés. L’utilisation de complexes à base de Ruthénium sera plus détaillée.

I-C-2-a Outils diagnostiques [82]

Diagnostiquer le plus précocement et rapidement possible une pathologie est l’un des

objectifs de la chimie médicinale. Une détection à un stade précoce de la maladie permet de

mettre en place des traitements efficaces et de réduire les coûts de traitement (hospitalisation,

médicaments,…). L’imagerie médicale est l’une des techniques les plus utilisées dans

l’établissement d’un diagnostic. En effet, elle est non-invasive pour le patient et permet une

évaluation rapide du fonctionnement d’un organe.

Les sondes radioactives permettent de visualiser une cible spécifique tout en exposant

le malade à une radioactivité comparable à celle reçue lors d’une radiographie. L’un des

isotopes le plus couramment utilisé est le Technetium 99 (99mTc) [83,84]. Une des alternatives à

son utilisation est le gallium (Ga) qui possède deux isotopes radioactifs : le 67Ga et le 68Ga [83,85]. Contrairement à ces métaux, le gadolinium (Gd) n’est pas utilisé en médecine nucléaire

mais comme agent de contraste pour l’IRM (Imagerie par Résonance Magnétique) [86-88].

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Les métaux, cités ici, ne représentent que les métaux les plus couramment utilisés dans

l’imagerie. Cette liste n’est pas exhaustive et de nouvelles sondes à base de métaux comme le

bismuth [89], le titane [90]ou l’or [91] sont en cours de développement.

I-C-2-b Agents thérapeutiques

En plus de leur utilisation pour l’imagerie médicale, les métaux de transition sont

également développés dans un but thérapeutique avec comme chef de file le Platine et le

Ruthénium. La grande majorité de ces complexes sont actifs contre le cancer (platine,

ruthénium, or, titane, bismuth, ….) [89,90,92]. Les métaux de transition ont également des

activités anti-bactériennes (sels d’argent), anti-parasitaires (ferrocényle) et sont utilisés dans

le traitement contre le diabète (vanadium) ou l’arthrite (or) [81,93,94]. Les propriétés

thérapeutiques de certains de ces métaux sont résumées dans le tableau I-2.

I-C-2-b-i Le Platine (Pt)

En 1964, Barnett Rosenberg a découvert les propriétés anti-tumorales du cisplatine,

cis-Pt(NH3)2Cl2, lors de ces travaux sur l’influence du champ électrique sur la croissance

bactérienne [95]. Malgré les réticences à utiliser des métaux lourds en tant qu’agent

thérapeutique, le cisplatine est rapidement entré en phase d’essai clinique et a montré de très

bons effets sur des tumeurs à un stade avancé. Il est utilisé dans le traitement de nombreux

Tableau I-2: Propriétés thérapeutiques de certains métaux de transition

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cancers comme le cancer des ovaires, des testicules ou de la langue. Il contribue également au

traitement contre le cancer de l’œsophage ou du cou [96].

Cependant, il reste inactif contre certains cancers. Un inconvénient supplémentaire est

l’apparition de forme de résistance après l’administration du complexe. De plus, les effets

secondaires rencontrés sont sévères et limitent donc la dose injectée.

De nouveaux composés anti-cancéreux à base de Pt ont donc été développés [97] et

certains sont actuellement utilisés dans les traitements anti-cancéreux [98]. Une approche

consiste à modifier les propriétés chimiques et biologiques du platine via son état

d’oxydation. Les complexes de Pt les plus actifs sont des complexes de Pt(II). Il est admis que

les complexes de Pt(IV) sont cinétiquement plus inertes comparativement au Pt(II), c’est-à-

dire que les complexes de Pt(IV) vont pouvoir atteindre la cible désirée sans subir de

modification. Par exemple, un complexe de Pt(IV) est administré. Une fois dans le milieu

physiologique, il va être activé par réduction passant de l’état d’oxydation +IV à +II dans les

cellules cancéreuses et ainsi jouer son rôle de molécule thérapeutique. Les molécules

cancéreuses sont connues pour avoir un niveau élevé de glutathion par rapport au tissu sain

créant ainsi un environnement réducteur. Si le complexe de Pt(II) quitte cet environnement, il

sera facilement oxydé en Pt(IV) par l’oxygène moléculaire ou des enzymes oxydantes

présentes dans les cellules saines et ainsi redevenir inerte pour les tissus sains. Le complexe

de Pt est donc activé par réduction. Il s’agit de la stratégie prodrug.

La réduction du Pt(IV), cinétiquement inerte, par des réducteurs biologiques en Pt(II),

actif va entrainer, entre autre, une modification des propriétés pharmacocinétiques du

complexe. Le complexe JM-216 (Fig. I-19) est un complexe de Pt(IV) activé par réduction en

Pt(II) et actuellement en phase clinique III [99].

Figure I-19: Représentation des complexes cisplatine, carboplatine et oxaliplatine utilisés dans le traitement contre le cancer ainsi que du

complexe JM216 qui est au degré d'oxydation +IV et qui pourra être activé par réduction.

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Malgré, l’approche prodrug, les complexes de Pt peuvent présenter une cytotoxicité

élevée contre les cellules saines et ne sont pas actifs contre tous les types de cancer. Une

alternative est de développer des complexes métalliques analogues au Pt en terme de

réactivité mais présentant une cytotoxicté moins importante. Pour ces différentes raisons, des

complexes à base de ruthénium sont en cours de développement.

I-C-2-b-ii Le Ruthénium (Ru)

Introduction

Le Ruthénium (Ru) a été découvert en 1844 par le chimiste russe Karl Karlovich

Klaus. Il est très rare, 74ème élément le plus abondant sur terre, et il est retrouvé dans des

minerais. Il peut être obtenu à partir de pentlandite (sulfure de Fer et de Nickel) qui contient

de petites quantités de Ru ou il peut être extrait de combustible nucléaire où il contiendra des

isotopes radioactifs. Le Ru a 26 isotopes dont 7 sont stables : 96Ru, 98Ru, 99Ru, 100Ru, 101Ru, 102Ru et 104Ru. L’isotope le plus abondant est le 102Ru (31.6%). Le Ru est généralement utilisé

pour ses propriétés catalytiques mais également pour augmenter la résistance du titane face à

la corrosion.

Caractéristiques chimiques

Le Ru est l’élément du tableau périodique qui possède le plus grand nombre de degré

d’oxydation : de –II à +VIII. Il adopte plusieurs géométries en fonction de son état

d’oxydation qui sont une bipyramide trigonale (Ru(0) et Ru(II)), un octaèdre (Ru(II) et

Ru(III)) ou un tétraèdre (Ru(VI), Ru(VII) et Ru(VIII)). La majorité des complexes de Ru

utilisés sont aux degrés d’oxydation +II, +III et +IV.

La capacité du Ru à exister sous différents degrés d’oxydation et différentes

géométries lui confèrent des propriétés uniques en fonction de son degré d’oxydation : forte

aptitude au transfert d’électron, acide fort de Lewis ainsi qu’un potentiel redox relativement

bas.

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Propriétés du Ruthénium pour une application en biologie [100-102]

Le Ru possède trois propriétés importantes qui en font un candidat innovant pour une

application thérapeutique : sa vitesse d’échange de ligand (similaire à celle du Pt), ses divers

états d’oxydation disponibles et sa capacité à mimer le fer dans sa liaison avec certaines

molécules biologiques.

L’échange de ligand est un facteur très important pour une application biologique.

Très peu de médicaments atteignent leur cible sans avoir subit de modifications. Par ailleurs,

l’échange de ligand peut être une étape d’activation permettant d’obtenir les propriétés

thérapeutiques attendues mais peut également conduire à une désactivation du complexe.

Le Ru peut exister sous trois degré d’oxydation en milieu physiologique : II, III et IV.

Les complexes de Ru(III) sont généralement plus inertes d’un point de vue biologique que les

complexes de Ru(II) ou Ru(IV). Les réducteurs biologiques tels que l’ascorbate ou le

glutathion peuvent facilement réduire le Ru(III) ou le Ru(IV) et l’oxygène moléculaire ainsi

que le cytochrome c peuvent oxyder le Ru(II). Ce caractère redox peut être exploité pour

améliorer l’efficacité du Ru en tant qu’agent thérapeutique comme dans le cas du platine, les

complexes de Ru peuvent être activés par réduction.

Il est proposé que la faible toxicité du Ru soit due à sa capacité à mimer le fer dans sa

liaison avec des molécules biologiques comme l’albumine ou la transferrine [100,101].

L’activation par réduction du Ru(III) en Ru(II) contribue également à la faible toxicité des

complexes de Ru(II) étant donné que le Ru(III) est plus inerte cinétiquement que le

Ru(II)[102].

Ru et applications biologiques

Les complexes organométalliques à base de Ru présentent une forte activité en tant

qu’immunosuppresseur, contre de nombreuses maladies parasitaires telles que la malaria ou la

maladie de Chagas. De plus, coordiné à un antibiotique organique, le Ru permet d’augmenter

son activité qui peut être due à la capacité du Ru à se lier de la même façon que le fer aux

protéines présentes dans la cellule [100].

Le Ru est principalement utilisé en biologie pour ses propriétés anti-cancer. En effet,

plusieurs complexes de Ru(II), Ru(III) ou Ru(IV) possédant des ligands de type amine,

diméthylsulfoxide (DMSO), imine ou N-hétérocycliques sont capables de se lier à l’ADN.

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Cependant, la plupart de ces complexes sont très peu solubles dans l’eau ce qui est nécessaire

pour permettre une efficacité et un transport vers les cellules cancéreuses. Afin d’augmenter

l’hydrosolubilité des complexes de Ru, une solution consiste à utiliser des complexes

possédant une charge globale non-nulle comme le NAMI-A (New Anti-tumour Metastasis

Inhibitor ; -A signifiant qu’il s’agit du premier de la série) ou trans-[RuCl4(DMSO)Im]-ImH

(Im=imidazole). (Fig. I-20).

Le NAMI-A, premier complexe de Ru(III) a être entré en phase d’essais cliniques, est

une molécule en phase clinique II [103]. Ce complexe est caractérisé par une cytotoxicité de

l’ordre de 0,1 mM, une sélectivité pour le cancer de la langue, efficace sur les différents stade

de croissance des métastases et une meilleure activité que le cisplatine sur les métastases

responsables du cancer de la langue [104,105]. Le NAMI-A est facilement hydrolysable en

solution aqueuse à pH 7.4 et il est proposé que son activité anti-métastatique soit due à la

formation de l’espèce trans-[RuIII(Cl)4(H2O)(Im)]- [106]. Ce qui ferait du NAMI-A une prodrug

qui est activée par réduction du Ru(III) en Ru(II) dans les cellules cancéreuses.

Un dérivé du NAMI-A plus stable, le KP1019 [107], également en phase d’essai

clinique II, a montré une bonne réactivité contre des tumeurs modèles du cancer du colon

ainsi que sur des tumeurs primaires (Fig. I-20). Le KP1019 interagit avec l’ADN de façon

similaire au cisplatine mais de façon 15 fois moins intense que ce dernier en terme de liaison

avec l’ADN.

Les complexes RM175, RAPTA-T et RDC11 (Fig. I-21) « cassent » la règle

d’activation par réduction [104]. En effet, ces complexes sont à base de Ru(II) et n’ont pas

besoin d’être réduits pour être activés. Seuls les complexes RM175 et RDC11 sont présentés

ici.

Figure I-20: Représentation du NAMI-A (à gauche) et de KP1019 (à droite).

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Le complexe RM175 est un complexe organométallique possédant une liaison métal-

carbone directe qui devrait être actif face aux cancers résistants au cisplatine. L’activité de ce

complexe reposerait sur son mode de coordination à l’ADN. En effet, RM175 possède un

ligand bicyclique de type arène. En plus, de la liaison conventionnelle aux résidus guanine de

l’ADN, le complexe RM175 peut également interagir avec l’ADN par une intercalation du

ligand arène. Ceci a été confirmé par le groupe de Brabec qui a montré des « dommages »

plus prononcés de l’ADN pour des complexes possédant un ligand arène bicyclique

comparativement aux complexes avec un seul cycle [108,109]. Le complexe RM175 semble actif

contre le cancer du sein in vitro mais à ce jour il n’existe aucune étude clinique sur ce

composé.

En se focalisant sur les propriétés anti-tumorales du complexe RDC11 (RDC pour

Ruthenium Derived Compound), il semblerait que ce complexe empêche la croissance de

diverses tumeurs implantées chez la souris. Contrairement au cisplatine, ce complexe ne cause

pas d’effets secondaires sévères au niveau du foie, des reins ou du système neuronal sensoriel.

De plus ce complexe a montré une bonne activité face aux lignées cellulaires résistantes au

cisplatine. Il semblerait qu’en modifiant les ligands des complexes de type RDC, il serait alors

possible de générer un complexe anticancéreux qui puisse cibler différents types de cancers [110] .

L’utilisation de molécules inorganiques est une approche de plus en plus utilisée en

chimie médicinale que se soit au niveau diagnostique ou thérapeutique de par leurs propriétés

redox, leur activité ainsi que leur toxicité qui peuvent être contrôlées. A l’heure actuelle, les

métaux de transitions sont largement utilisés dans le traitement contre le cancer mais leur

domaine d’activité peut s’étendre à d’autres pathologies. En effet, plusieurs études ont montré

que des complexes de Pt(II) sont des molécules actives contre la maladie d’Alzheimer [111-113]

et très récemment, une publication décrit l’interaction d’un complexe de Ru(II) avec le

peptide Aβ [114].

Figure I-21: Représentation des complexes RM175, RAPTA-T et RDC11.

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�Chapitre I. D- Les métaux et la maladie d’Alzheimer

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I-D Les métaux et la maladie d’Alzheimer

Dans la dernière partie de cette introduction, le rôle des ions métalliques dans la MA

et plus particulièrement avec le peptide Aβ va être présenté. Ces derniers ne sont pas inertes

vis-à-vis de la toxicité et de l’agrégation du peptide Aβ ce qui a amené à les inclure dans

l’hypothèse de la cascade amyloïde. De plus, leur présence ouvre de nouvelles cibles

thérapeutiques contre la MA qui seront présentées à la fin de cette partie.

I-D-1 Le rôle des métaux dans la maladie d’Alzheimer

La perte progressive des neurones et l’accumulation anormale de dépôts de protéines

conduisent à la neurodégénération du cerveau. L’origine des maladies neurodégénératives est

multifactorielle : génétique, environnementale, … mais leurs causes premières sont toujours

débattues. De nombreuses études indiquent qu’une altération de l’homéostasie des métaux

pourrait accélérer voir induire le processus de neurodégénération.

I-D-1-a Stress oxydant et MA

I-D-1-a-i Définition du stress oxydant

Les maladies neurodégénératives sont des pathologies liées à l’âge, la majorité des

malades ont plus de 65 ans. Ceci est directement relié au stress oxydatif (peroxydation des

lipides, oxydation des protéines, de l’ADN et de l’ARN) qui est l’une des principales

hypothèses pour expliquer le processus de vieillissement et qui joue un rôle important dans les

mécanismes de neurodégénération [115,116]. Le stress oxydatif peut être défini comme une

perturbation de l’équilibre entre la production de radicaux libres et l’activité antioxydante de

la cellule. Lors de cette perturbation, les molécules oxydées vont s’accumuler et entrainer des

dysfonctionnements. Dans le cas des cellules très sensibles comme les neurones, l’absence de

défense vis-à-vis de la production de radicaux libres va conduire à la mort neuronale. Dans les

conditions physiologiques, les radicaux libres, produits à partir de l’oxygène moléculaire

présent dans les cellules, sont le superoxyde (O2.-), le radical hydroxyle (HO.) et l’oxyde

nitrique (NO.).

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Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) et le peroxynitrite (ONOO-) ne sont pas des radicaux

libres mais sont des oxydants de la cellule et peuvent conduire à la formation de radicaux

libres via différentes réactions chimiques (Fig. I-22) [117].

I-D-1-a-ii Stress oxydant et MA

Le stress oxydant semble jouer un rôle important dans la MA [38]. L’un des marqueurs

de la maladie est la présence de plaques amyloïdes constituées du peptide Aβ et certaines

preuves indiquent qu’il y aurait une corrélation entre le stress oxydatif et la formation des

plaques amyloïdes. En effet, la production de peptide Aβ est considérée comme une réponse à

l’augmentation du stress oxydant au niveau du cerveau. Par ailleurs, une fois que le peptide

Aβ a atteint une concentration suffisante, il va induire la production de radicaux libres liée à

la complexation des ions métalliques possédant un caractère redox. Donc plus il y de peptide

et plus il y a de radicaux libres qui entrainent la production de peptide Aβ générant ainsi un

cycle sans fin [117,118].

Figure I-22 : Espèces réactives de l'oxygène responsable du stress oxydatif et leur réactivité sur les molécules biologiques.

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I-D-1-b Métaux et MA

Le vieillissement est caractérisé par une altération de l’homéostasie des métaux et de

leur distribution dans les différents organes. Les mécanismes responsables de cette

perturbation ne sont encore clairement établis mais une explication possible est qu’avec l’âge,

des failles apparaissent dans les systèmes de régulation des ions métalliques. En effet, la

concentration en ions métalliques augmente dans de nombreux tissus, en particulier dans le

cerveau, avec l’âge [119]. De nombreuses études ont montré que le métabolisme des ions

métalliques est altéré chez les malades Alzheimer et les concentrations en cuivre, zinc et fer

sont plus élevées que la normale, plus particulièrement au niveau des plaques amyloïdes et

dans leur environnement immédiat comme au niveau des neuropiles (Tableau I-3) [119,120]. Les

neuropiles correspondent au tissu nerveux de la substance grise situé entre les neurones.

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Tableau I-3: Concentration en ions métalliques dans les plaques amyloïdes et neuropiles des patients atteints de la MA et le contrôle sain (d’après la réf. [119]).

De plus, comme indiqué sur la figure I-23, l’agrégation du peptide Aβ a lieu dans la

fente synaptique dans laquelle une concentration élevée en Zn(II) (200 à 300µM

comparativement à une concentration de l’ordre du nano/micromolaire dans le fluide

cérébrospinal ou CSF) peut être transitoirement présente suite à l’excitation neuronale (cf § I-

C-1-a-ii). Les neurones « riches » en Zn(II) font partie de la famille des neurones

glutamatergiques situés dans l’hippocampe qui est une région du cerveau impliquée dans les

mécanismes de la mémoire et l’une des premières touchées par la MA.

Le Zn(II) libéré dans la fente synaptique n’est pas fortement lié aux ligands

biologiques, principalement le glutamate. Il est donc considéré comme étant labile « labile Zn

pool ». Il est donc capable d’interagir avec le peptide Aβ, même si l’affinité du Zn pour le

peptide Ab est de l’ordre du micromolaire. Concernant le cuivre, la situation est moins claire

mais certaines études indiquent qu’il est également labile et présent à des concentrations

élevées (10 à 100µM comparées à une concentration de l’ordre du micromolaire dans le CSF)

dans la fente synaptique et il est retrouvé dans certains neurones glutamatergiques.

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Le cuivre et le fer sont capables de catalyser la production d’espèces réactives

oxygénées (ou ROS) de par leur capacité à exister sous différents états d’oxydation dans le

milieu physiologique (cf § I-C-1-a-i, p. 37 et I-C-1-a-iii, p. 39). Dans la cellule, le fer est

principalement lié à la ferritine. Il est supposé être peu lié au peptide Aβ [121]. Son implication

dans la MA ne sera donc pas abordé dans ce manuscrit.

Le Cu(II) va être réduit en Cu(I) par l’ascorbate, principal réducteur biologique

extracellulaire. Le Cu(I) va rapidement transférer son électron à l’oxygène moléculaire pour

former le superoxyde et revenir à l’état Cu(II). Ce cycle va continuer tant que la quantité de

réducteur et d’oxydant est suffisante. La réduction du Cu(II) en Cu(I) mène également à la

formation de peroxyde d’hydrogène et du radical hydroxyl (Fig. I-24) [118].

Les ions métalliques présentent une forte activité redox dans les conditions

physiologiques. Leur forte présence dans les plaques amyloïdes permet d’anticiper qu’ils

jouent un rôle dans le processus d’agrégation du peptide Aβ mais également sur la toxicité qui

en résulte.

Figure I-23: Représentation de la fente synaptique où le Zn, le Cu et le peptide Aββ sont retrouvés en concentration anormalement élevée.

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I-D-2 Les métaux et le peptide Aββ

Le peptide Aβ est capable de complexer les ions métalliques qui sont présents dans les

plaques amyloïdes à des concentrations élevées. Identifier les sites de fixation de ces métaux

et comprendre en quoi ils peuvent influencer l’agrégation et la toxicité du peptide Aβ vont

ouvrir de nouvelles perspectives thérapeutiques.

Les sites de fixation des métaux se situent sur les 16 premiers acides aminés (Aβ16)

de la séquence (cf Fig. I-6) [122-124]. Les études d’interaction peptide-métal sont généralement

réalisées sur ce peptide car en plus de contenir les sites de fixation des métaux, il n’agrège pas

ce qui facilite grandement ces études.

I-D-2-a Cuivre et Aβ

I-D-2-a-i Coordination [121]

Cu(II) et peptide Aβ

Le Cu(II) possède deux sites de fixation sur le peptide Aβ avec des constantes

d’affinité) différentes indiquant la présence d’un site de forte affinité (condKa ∼10-10 M-1) et un

site d’affinité plus faible ( condKa ∼5.10-7-10-8 M-1). Le site de forte affinité se situe sur la partie

N-terminale du peptide allant des résidus 1 à 16 [125].

Figure I-24: Catalyse de la production de ROS par le cuivre (adaptée de la réf. [94])

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Des études d’interaction du Cu(II) avec des peptides plus longs comme le peptide

Aβ28 (qui contient les 28 premiers acides aminés) ont permis de mettre en évidence le second

site de fixation du Cu(II). Cependant, il est très difficile de l’identifier de par sa faible affinité

(100 fois moins affin que le premier site). Par ailleurs, le Cu(II) est présent dans les plaques

amyloïdes en sous-stoechiométrie par rapport au peptide Aβ, ce second site d’affinité ne

présente donc pas d’intérêt biologique. Dans la suite du manuscrit, seul le site de forte affinité

est décrit.

Les nombreuses études sur la coordination du Cu(II) au peptide Aβ ont montré la

coexistence de deux espèces au pH physiologique usuellement appelées composante I

(majoritaire à bas pH) et composante II (majoritaire à haut pH). Ces deux espèces possèdent

des signatures spectroscopiques différentes ce qui a permis de pouvoir identifier leur mode de

coordination au Cu(II). En plus des études spectroscopiques, des études de potentiométrie et

calorimétrie ont montré que la composante II résulte d’une déprotonation de la composante I.

La composante I est un complexe pyramidale à base carrée qui fait intervenir dans le

plan équatorial une amine (Asp1), deux imidazoles (His6 et His13/His14) et la fonction

carbonyle d’une liaison peptidique. En ce qui concerne la position apicale, le site de

coordination est toujours débattue mais il est proposé que la coordination implique une

fonction carboxylate (Asp1, Glu3, Asp7 ou Glu11). La composante II possède un

environnement très similaire à la composante I : dans le plan équatorial on retrouve l’amine

(Asp1), un imidazole (His6, His13 ou His14), une fonction amide déprotonnée (Asp1-Ala2) et

un groupement carbonyle (Ala2-Glu3). La position apicale est occupée par la fonction

carboxylate de l’aspartate 1 (Fig. I-25).

Figure I-25: Représentation schématique des composantes I et II proposées pour la coordination du Cu(II) au peptide Aββ.

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Cu(I) et peptide Aβ

Le cuivre possède un caractère redox. Il peut également exister sous la forme Cu(I).

L’effet du caractère redox du cuivre en présence de peptide Aβ sera abordé dans le

paragraphe I-D-2-a-iii (cf p. 56). L’affinité du Cu(I) pour le peptide Aβ n’est pas aussi

étudiée que celle du Cu(II). Il n’existe à l’heure actuelle que peu études, contradictoires, quant

à la valeur de la constante d’affinité ( ∼10-8/10-7 M-1) du Cu(I) pour le peptide Aβ [126-128].

Le mode de coordination du Cu(I) pour le peptide Aβ a pu être déterminé à partir des données

obtenues par RMN et XAS (Spectroscopie d’Absorption des Rayons-X) [129]. Le complexe

formé est de géométrie linéaire dans laquelle le Cu(I) est lié via les deux résidus histidines 13

et 14 (Fig. I-26).

I-D-2-a-ii Effet sur l’agrégation

La coordination du cuivre au peptide Aβ n’est pas inerte vis-à-vis du processus

d’agrégation. Cependant son effet sur l’agrégation est toujours débattu. Le Cu(II) est

considéré comme un promoteur de l’agrégation. En présence d’une quantité sous-

stoechiométrique de Cu(II), le peptide Aβ42 va former des fibres amyloïdes [130-132].

Cependant, la présence d’un excès de Cu(II) par rapport au peptide Aβ40/42 va conduire à la

formation d’oligomères sphériques (10-20 nm) ainsi que d’agrégats amorphes insolubles qui

ne pourront s’organiser en fibres par la suite [131,133,134]. A contrario, d’autres études montrent

que la présence de Cu(II) aurait un effet inhibiteur sur l’agrégation du peptide Aβ [135,136].

L’effet du cuivre sur l’agrégation semble dépendre des conditions expérimentales.

Figure I-26: Représentation schématique de la coordination du Cu(I) au peptide Aββ

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I-D-2-a-iii Effet sur la toxicité [137-139]

Le stress oxydant, responsable de la toxicité liée à la MA peut être induit par la

présence de cuivre qui est capable de catalyser la production de ROS (cf § I-C-1-b, p. 40). Il

est donc supposé que le complexe Cu-Aβ peut contribuer à la production de ROS dans la MA.

Le cuivre ne va pas seulement catalyser l’oxydation des lipides ou des protéines, responsable

de la mort neuronale mais il peut également être responsable de l’oxydation des chaines

latérales du peptide Aβ ajoutant des atomes d’oxygène pour former la methionine sulfoxide

ou sulfone en position 35, modifiant les lysines en position 16 et 28 [138]. La tyrosine en

position 10 est également visée puisque de nombreuses modifications ont été observées

comme la formation de dityrosine ou nitrotyrosine [139]. Très récemment, il a été montré que

les résidus Asp 1 forme, après décarboxylation et déamination, un résidu pyruvate ou

isocyante [137]. De plus, les résidus His 13 et 14 sont également touchés en formant des oxo-

histidines [137]. Par ailleurs, des produits d’oxydation des histidines ont pu être isolés des

plaques amyloïdes. Ces résidus sont directement impliqués dans la coordination du Cu(II) et

du Zn(II), leur oxydation va donc conduire à une modification de cette coordination. Il est

attendu un effet sur l’agrégation du peptide.

I-D-2-b Zinc et Aβ

I-D-2-b-i Coordination [29,140,141]

Contrairement au cuivre, le zinc forme majoritairement un complexe 1:1 avec le

peptide Aβ avec une constante d’affinité de ∼ 10-6 M-1. Classiquement, la coordination du

Zn(II) implique 4 à 6 ligands. De par sa structure électronique (d10), la coordination du Zn(II)

ne peut être étudiée que par RMN, via le déplacement chimique des acides aminés

directement impliqués dans sa sphère de coordination, et par XAS. Des études RMN sur la

formation du complexe Zn(II)-Aβ ont démontré l’implication des 3 résidus histidines (His6,

His13 et His14) dans la coordination du centre métallique. Cependant, l’identification des

ligands additionnels reste controversée : Asp1, Arg5, Glu11, ou une molécule d’eau exogène.

Etant donné l’implication des résidus histidines, le Glu11 semble être le candidat le plus

probable [142]. La coordination d’un quatrième voire cinquième ligand peut dépendre de la

longueur du peptide ainsi que des conditions expérimentales. Ces facteurs peuvent influencer

le mode de coordination du Zn(II). Par ailleurs, il n’est pas à exclure que différents complexes

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Zn(II)-Aβ avec 4 ou 5 ligands peuvent coexister. Un possible modèle du complexe Zn(II)-Aβ

est obtenu à partir de ces différents éléments (Fig. I-27).

I-D-2-b-ii Effet sur l’agrégation et la toxicité [143]

Contrairement au cuivre et au fer, le Zn(II) ne possède pas d’activité redox et n’induit

donc pas de production de ROS. Cependant, la présence de Zn(II), même à de faible

concentration accélère l’agrégation du peptide en formant des agrégats de type amorphe qui

sont supposés moins toxiques que les agrégats formés sans Zn(II). Le caractère cytoprotecteur

du Zn(II) n’est pas clairement établi. En effet, certaines études ont montré que le Zn(II) peut

induire des agrégats toxiques sous certaines conditions [144,145].

Il faut donc retenir que le Zn(II) ne va pas intervenir directement au niveau du stress

oxydatif mais peut largement contribuer à la formation des plaques amyloïdes.

I-D-2-c L’hypothèse de la cascade amyloïde et les métaux

Les ions métalliques sont présents dans les plaques amyloïdes à des concentrations élevées.

Etant données les propriétés redox du cuivre et du fer qui vont favoriser la production de ROS

et la capacité du zinc à promouvoir l’agrégation, leur présence a été intégrée dans l’hypothèse

de la cascade amyloïde (Fig. I-28) [146].

En effet, les espèces les plus toxiques sont supposées être les espèces oligomériques

qui vont pouvoir produire des ROS suite à leur métallation avec les ions cuivre et/ou fer. De

la même façon, la complexation au zinc va favoriser la formation des plaques amyloïdes.

Figure I-27: Représentation du modèle proposé pour la coordination du Zn(II) au peptide Aββ .

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I-D-3 Les métaux : une nouvelle cible thérapeutique ?

La présence des ions métalliques et leur rôle dans la MA ouvrent de nouvelles

perspectives thérapeutiques pour lutter contre cette maladie. Plusieurs stratégies, présentées

dans ce paragraphe, sont en cours de développement et certaines des molécules conçues

montrent une très bonne activité in vitro et in vivo.

I-D-3-a Chélateurs d’ions métalliques [147]

Etant donnés les effets négatifs de la coordination des ions métalliques (Cu, Fe et Zn)

au peptide Aβ (production de ROS et modification des propriétés d’agrégation), il n’est pas

surprenant que la première stratégie thérapeutique envisagée soit la chélation de ces ions

métalliques.

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Figure I-28: Hypothèse de la cascade amyloïde revisitée et tenant compte du rôle des métaux.

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I-D-3-a-i Les premiers chélateurs

A la fin des années 90, il a été montré que l’agrégation du peptide Aβ induit par le

Cu(II) et le Zn(II) était réversible en présence des chélateurs d’ions métalliques. Ces résultats

encourageants ont permis d’envisager un traitement avec de chélateurs d’ions métalliques qui

pourraient permettre la solubilisation des dépôts amyloïdes. Dans ce but, la capacité de

chélateurs d’ions métalliques connus comme l’EDTA (acide éthylène diaminetetraacétique),

le DTPA (acide diéthylène triaminepentaacétique) et leurs dérivés (Fig. I-29) à solubiliser les

plaques amyloïdes dans le cerveau de patients décédés a été évaluée [148-150]. Cependant,

l’utilisation de ces chélateurs in vivo est très limitée puisqu’ils ne peuvent franchir la BHE et

qu’ils ne sont pas spécifiques pour les métaux visés [147].

Peu de temps après, le clioquinol, petite molécule capable de lier le Cu(II) et le Zn(II),

a semblé particulièrement adaptée pour une utilisation en tant que chélateur des ions

métalliques dans la MA [151] .

Figure I-29: Représentation des ligands EDTA et DTPA ainsi que quelques dérivés.

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I-D-3-a-ii Le clioquinol et ses dérivés

Le clioquinol (CQ)

A l’origine, le CQ (Fig. I-30) est utilisé comme antibiotique pour traiter les désordres

intestinaux. Mais sa capacité à passer la BHE et son affinité pour le Cu(II) et Zn(II) ont fait de

lui un candidat potentiel comme traitement contre la MA. En effet, le clioquinol forme les

complexes Cu(CQ)2 et Zn(CQ)2 avec des constantes de stabilité de 1,2x10-10 et 7,0x10-8 M-2 [152]. De plus, le clioquinol est une molécule qui a déjà été évaluée et approuvée comme

traitement dans les années 70.

Afin de prouver son efficacité thérapeutique vis-à-vis de la MA, le CQ a été

administré à des modèles de souris transgéniques pour la MA qui ont montré une diminution

de 50% des dépôts amyloïdes par comparaison avec des souris non-traitées sans signe de

toxicité [151]. Ces résultats prometteurs ont permis au CQ d’être évaluer en phase d’essai

clinique I puis en phase II. Le CQ n’est pas allé plus loin dans les essais cliniques à cause de

ses effets néfastes (altération du métabolisme de la vitamine B12, modification de la

distribution en fer provoquant douleurs abdominales et décoloration verte de la langue) et de

son inefficacité à améliorer les fonctions cognitives des malades [153]. L’une des hypothèses

avancée est que du fait de la présence de l’iode, le clioquinol n’est pas stable avec formation

de produits de dégradation toxiques [154]. De nouvelles molécules ont été développées à partir

du squelette 8-hydroxyquinoline (8-HQ) du CQ (Fig. I-30).

Figure I-30: Représentation du clioquinol (CQ) avec le squelette 8-HQ en bleu.

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Le Bis-8HQ et dérivés

En présence d’ions métalliques (Cu(II), Zn(II) et Fe(III)) et de peptide Aβ42, le bis-

8HQ (Fig. I-31) montre une meilleure inhibition de l’agrégation du peptide comparativement

au CQ ainsi qu’une inhibition de la production de ROS in vitro. A partir de ces données, des

dérivés du bis-8HQ ont été synthétisés (Fig. I-31) et leur capacité anti-agrégation et anti-ROS

évaluées par rapport au CQ et au bis-8HQ [155].

Tous les composés sont de meilleurs chélateurs du Cu(II) et du Zn(II) que le CQ mais

les études physico-chimiques en présence de peptide ont montré que les modifications

apportées n’ont pas fortement amélioré les propriétés anti-agrégation et anti-ROS du composé

original bis-8HQ. L’une de ces molécules, PA1637, a été testée sur un modèle de souris non-

transgéniques auxquelles des oligomères d’Aβ42 ont été injectés par voie

intracérébroventriculaire afin de provoquer des déficits cognitifs de la MA. Le composé

PA1637 a montré qu’il était capable, après 3 semaines de traitement, d’empêcher les pertes de

mémoire épisodiques provoquées par l’injection des oligomères d’Aβ42 �� . Ce résultat très

encourageant fait du PA1637 un candidat potentiel comme molécule active contre la MA.

Le PBT2 [157-159]

Le chélateur le plus avancé en terme d’essai clinique est le PBT2, actuellement en

phase d’essai clinique II, qui possède un squelette basé sur le 8HQ mais dont la structure

exacte n’est pas connue. Cependant, à partir des brevets publiés, Orvig �� a pu établir que le

PBT2 ne possédait pas d’iode mais un groupement diméthylaminométhyle ainsi que deux

chlores. La position de ces substituants sur les deux cycles aromatiques n’a pu être

déterminée. Des études in vitro de ce ligand ont montré qu’il est capable d’empêcher la

production de ROS ainsi que la formation d’agrégats induit par le Cu(II) ou le Zn(II). Son

administration à des souris transgéniques a permis de diminuer la présence de plaques

Figure I-31: Représentation du bis-8HQ et des ses dérivés

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amyloïdes et une amélioration des fonctions cognitives. Le PBT2 est un ionophore c’est-à-

dire qu’il n’est pas seulement capable de chélater le Cu(II) et le Zn(II) mais il peut également

les transporter à l'intérieur de la cellule. En effet, la présence de Zn(II) et également de Cu(II)

au niveau intracellulaire a des effets bénéfiques sur la régulation de l’activité synaptique.

I-D-3-a-iii Des chélateurs vectorisés

Dans le but d’améliorer l’efficacité des chélateurs et de les adresser spécifiquement au

peptide Aβ, une approche envisagée est d’utiliser des dérivés de molécules connues pour leur

affinité avec le peptide Aβ.

La Thioflavine T (ThT) est un fluorophore utilisé pour caractériser la formation de

fibres amyloïdes (cf § I-B-2, p. 31). Cette propriété fait de la ThT une molécule d’adressage

idéale (Fig. I-32).

Une stratégie a consisté à combiner les propriétés chélatantes du CQ à la ThT. A l’aide

d’études in silico, deux molécules ont été sélectionnées : HBX (2-(2-

hydroxyphenyl)benzoxazole) et HBT (2-(2-hydroxyphenyl)benzothiazole) (Fig. I-32). Ces

molécules présentent des constantes d’affinité pour le Cu(II) et le Zn(II) similaire au CQ en

présence de peptide Aβ40 soluble [160] .

Figure I-32: Représentation de le ThT (en haut à droite) et des ligands HBX et HBT combinaison du CQ (rouge) et de la ThT (bleu)

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Les molécules décrites ne représentent qu’une partie des molécules en cours de

développement en tant que chélateur des ions métalliques. D’autres ligands à base de

phénantroline, salen, salan, hydroxamates, etc montrent également de bonnes propriétés anti-

ROS et anti-agrégation [147].

La chélation des ions métalliques est une stratégie viable mais qui présente certaines

limites dont la plus importante concerne l’affinité pour les métaux. Le chélateur ne doit pas

être trop « fort » : les ions métalliques sont indispensables à de nombreux processus

biologiques. De plus, il est nécessaire que le chélateur soit spécifique d’un ion métallique

afin de ne pas interférer dans d’autres processus biologiques impliquant le calcium ou le

sodium par exemple.

I-D-3-b Complexes de Pt, Ru et autres métaux de transition [161]

La coordination des ions métalliques au peptide Aβ se fait principalement via les

noyaux imidazoles des résidus histidines (cf § I-D-2-a-i, p. 53 et I-D-2-b-i, p. 56). Concevoir

des molécules qui vont pouvoir venir se lier spécifiquement à ses résidus représente une

stratégie innovante. En effet, en empêchant la coordination des ions métalliques (Cu, Fe et

Zn) par d’autres ions/complexes métalliques (Pt, Ru), l’oligomérisation et donc l’agrégation

du peptide Aβ seraient alors affectées voire empêchées. Etant donné l’importance des résidus

histidines, cibler les noyaux imidazoles représente une stratégie innovante.

I-D-3-b-i Des complexes de Pt…

Afin de valider cette approche, une série de complexes de Pt possédant des ligands de

type phénantroline (Fig. I-33), connu pour interagir avec le peptide, ont été synthétisés et leur

activité vis-à-vis de l’agrégation et de la production de ROS évaluée [111].

Les études en présence de peptide Aβ, de Cu(II) et des complexes de Pt ont montré

que ces derniers sont capables de modifier la coordination du Cu(II) au peptide Aβ en se

fixant aux résidus histidines du peptide, d’inhiber la formation d’agrégats ainsi que la

production de ROS en présence de Cu(II). Des études in vivo, réalisées sur des souris, ont

montré que la présence de ces complexes permettait de rétablir la plasticité synaptique inhibée

par la présence de peptide Aβ. D’autres complexes de Pt(II) ont été développés [112,113] comme

par exemple le complexe Pt(phényl-méthylpyridine)(DMSO)Cl qui a été synthétisé dans

l’équipe (Fig. I-33). Ce complexe a montré une bonne réactivité vis-à-vis de l’agrégation

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induite par le Zn(II) en étant capable de l’inhiber cependant il ne peut inhiber la production de

ROS alors qu’il est capable de modifier la coordination du Cu(II) au peptide [162]. Ce type de

complexe permet donc d’obtenir un effet spécifique du métal (Cu ou Zn).

I-D-3-b-ii … ou de Ru comme anti-MA

Les complexes de Pt(II) pouvant présenter une certaine cytotoxicité, des complexes à

base de Ru ont été mis au point. En plus d’être moins toxique, le Ru possède une forte affinité

pour les noyaux imidazoles [163].

L’étude de l’interaction entre le complexe Ru(CO)3Cl2(thiazole) [114] (Fig.I-34) et le

peptide Aβ28 a montré la formation d’un complexe Aβ-Ru via les résidus histidines après

libération des ligands thiazole et chlorures. En effet, l’ajout du complexe

Ru(CO)3Cl2(thiazole) sur le peptide Aβ28 se traduit sur le spectre RMN du peptide par

l’apparition des signaux du ligand thiazole « libre » et un élargissement sélectif des pics des

trois histidines ainsi que de la Tyr10. La même expérience a été réalisée avec le peptide

amyloïde murin. Ce peptide possède trois mutations dont une sur l’histidine 6. Les résultats

obtenus indiquent que l’histidine 6 n’est pas essentielle à la coordination du Ru(II). La liaison

du centre métallique au peptide de fait principalement via les histidines 13 et 14.

De plus, une étude par spectrométrie de masse après addition du complexe sur les

peptides Aβ28 et Aβ42 a mis en évidence une augmentation de 185 Da des différents états de

protonation du peptide. Cette augmentation de masse correspond au fragment

Ru(CO)32+suggérant que c’est ce fragment qui est lié aux résidus histidines 13 et 14 après

libération des ligand thiazole et chlorures. Cette coordination laisse supposer que la

coordination du Cu(II) ainsi que du Zn(II) au peptide Aβ va être fortement modifiée. En dépit

N NPt

Cl Cl

N

PtS Cl

O

Figure I-33: Représentation des complexes Pt(4,7-diphényl-1,10-phénantroline)Cl2 (à gauche) et Pt(phényl-méthylpyridine)(DMSO)Cl (à droite)

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de ces résultats encourageants, aucune étude en présence de complexe sur l’agrégation et la

production de ROS n’a été réalisée.

Un complexe binucléaire Pt/Ru, [(bpy)2Ru(dpp)PtCl2]Cl2 (Fig. I-34) a montré une

sélectivité pour le peptide Aβ. Il est également capable d’inhiber l’agrégation du peptide ainsi

que la production de ROS [164].

Ces deux études indiquent que l’utilisation de complexes à base de Ru semble une

voie thérapeutique viable.

I-D-3-b-iii Vers l’utilisation d’autres métaux de transition

Une récente étude a montré que des complexes à base de rhodium (Rh) et d’iridium

(Ir) (Fig. I-35) sont capables d’empêcher l’agrégation du peptide Aβ40 [165]. Ces complexes

semblent être de potentiels agents thérapeutiques contre la MA.

Les études par microscopie de fluorescence et TEM ont montré que ces complexes

ralentissaient fortement le processus d’agrégation. Les complexes les plus efficaces sont ceux

contenant un ligand phénylpyridine. Cette efficacité est certainement due à un effet stérique.

Et de façon surprenante, les complexes à base de Rh semblent plus efficaces que les

complexes d’Ir laissant supposer que la liaison au peptide est très dépendante de la capacité

du centre métallique à se lier aux résidus histidines.

Ru

NN

N

N

NN

NN

PtCl

Cl

Cl2 Ru

Cl

OC

OC

Cl

NCO

S

Figure I-34 : Représentation du complexe binucléaire Pt/Ru (à gauche) et du complexe Ru(CO)3Cl2(thiazole) (à droite)

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La présence des ions métalliques ouvre de nouvelles voies thérapeutiques

prometteuses. De façon à optimiser l’activité de ces nouvelles molécules contre la MA, il est

nécessaire de comprendre les mécanismes du processus d’agrégation.

Figure I-35: Complexes de Rh et Ir potentiellement actifs contre la MA

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�Chapitre I. Conclusion

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Conclusion

La maladie d’Alzheimer est une pathologie complexe qui est toujours incurable à

l’heure actuelle. Les mécanismes de formation des plaques amyloïdes n’étant pas clairement

élucidés, il est très difficile de concevoir un traitement efficace, les médicaments actuels ne

traitant pas directement les causes de la maladie mais seulement ces effets. Il est donc

nécessaire de comprendre comment le peptide Aβ passe d’une forme monomérique soluble

dans le cerveau des patients sains à une forme agrégée dans le cerveau des patients

Alzheimer.

La Thioflavine T (ThT) est le fluorophore classiquement utilisé pour étudier la

cinétique d’agrégation du peptide Aβ. La ThT possède des propriétés spectroscopiques à peu

près uniques en présence de fibres amyloïdes. En présence de peptide monomérique,

l’intensité de fluorescence de la ThT ne change pas. Cependant, en présence de fibres

amyloïdes, la fluorescence de la ThT va être exaltée. Cette interaction n’est pas clairement

élucidée. Il est suggéré que la ThT interagit peu voire pas du tout avec les espèces

monomériques qui ne sont pas ou très peu structurées. Cependant, ne pas observer

d’augmentation de fluorescence de la ThT en présence du peptide monomérique ne signifie

pas forcément qu’il n’existe aucune interaction entre eux. Le chapitre III présente les résultats

obtenus lors de l’étude, principalement par spectroscopie RMN 1H, de l’interaction entre la

ThT et le peptide Aβ28 sous forme monomérique (peptide modèle contenant à la fois les sites

de fixation de ions métalliques et une partie plus hydrophobe responsable de l’agrégation).

Le chapitre IV consiste en l’étude de l’agrégation du peptide Aβ28. En effet, les

structures du peptide Aβ monomérique et sous forme de fibres amyloïdes sont bien décrites

dans la littérature mais il existe peu d’informations concernant les espèces oligomériques

intermédiaires. Le peptide monomérique ne possède pas de structure particulière tandis que

les fibres amyloïdes sont organisées en feuillets-β. Il est proposé qu’au cours de l’agrégation,

le peptide va progressivement se structurer en feuillets-β. Ces feuillets-β vont par la suite

interagir entre eux pour former des fibres amyloïdes dont l’accumulation conduit à la

formation des plaques séniles. Une partie de mon travail de thèse s’inscrit dans ce contexte.

L’étude de l’agrégation du peptide Aβ28 par spectroscopie de fluorescence et RMN a pour

but de caractériser les espèces oligomériques intermédiaires de l’agrégation. Après une étape

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�Chapitre I. Conclusion

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d’optimisation des conditions expérimentales principalement réalisée par spectroscopie de

fluorescence de la ThT, l’agrégation du peptide Aβ28 a été étudiée par spectroscopie RMN 1H. Ces travaux m’ont amené à étudier de plus près l’influence de la ThT sur la cinétique

d’agrégation. Cette dernière est supposée inerte sur la cinétique d’agrégation cependant il

n’existe aucune donnée expérimentale confirmant ou infirmant cette hypothèse.

Plusieurs données indiquent que les ions métalliques (Cu, Zn et Fe) jouent un rôle

important dans la maladie d’Alzheimer, en particulier le Cu et le Zn qui favoriseraient

l’agrégation du peptide Aβ. De plus, le Cu semble être impliqué dans la toxicité lié à

l’agrégation du peptide Aβ par sa capacité à catalyser la production d’espèces réactives de

l’oxygène (ROS). L’implication de ces ions métalliques dans la maladie d’Alzheimer ouvre

de nouvelles perspectives thérapeutiques. Une de ces stratégies consiste en l’utilisation de

complexes métalliques qui vont être capables de se lier au peptide Aβ via les résidus

histidines qui sont les sites de coordinations privilégiés du Cu et du Zn. Ainsi la coordination

du Cu et du Zn serait empêchée et par la suite l’agrégation du pepide Aβ ainsi que la

production de ROS. L’un des objectifs de ma thèse a été de concevoir des complexes de

Ru(II) possédant des propriétés anti-agrégation et anti-ROS et pouvant être facilement

vectorisés par la suite par des dérivés de la ThT. En effet, la ThT est connue pour interagir

spécifiquement avec les fibres amyloïdes et des modifications structurales peuvent la rendre

plus affine pour les espèces plus précoces de l’agrégation. La synthèse de ces complexes ainsi

que les études physico-chimiques réalisées en présence de peptide Aβ28 sont présentées dans

le chapitre IV.

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�Chapitre I. Bibliographie

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�

�


��

��

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�

Chapitre II : Techniques utilisées

et modèle d’étude

�

�

�Chapitre II. A-Spectroscopie de fluorescence

��

��

Chapitre II. Techniques utilisées et modèle d’étude

Introduction :

Dans ce chapitre, nous présentons les techniques spectroscopiques principalement

utilisées au cours de cette thèse que sont la spectroscopie de fluorescence et la spectroscopie

RMN (Résonance Magnétique Nucléaire). Après un bref rappel des principes fondamentaux,

les différentes expériences utilisées seront présentées et illustrées d’exemples en relation avec

notre étude. L’attribution du peptide Aβ28 dans des conditions proches du milieu

physiologiques est également détaillée ici.

II-A Spectroscopie de fluorescence

II-A-1 Généralités

La fluorescence s’opère souvent sur des molécules polyaromatiques ou

hétérocycliques appelées fluorophores. Suite à l’absorption d’un photon, les électrons du

fluorophore passent d’un état fondamental à un état excité. Le retour à l’état fondamental se

fait via une désactivation radiative. Ce processus est illustré par le diagramme d’états

électroniques ou diagramme de Jablonski (Fig. II-1).

��)

��1 ��'�

��1 ��'

��

��

�υ1�υ

λ��

��

/� ��!��

/

�

�


��

��

Le fluorophore, à température ambiante, est essentiellement dans son état électronique

de plus basse énergie, l’état fondamental S0. Durant la phase d’excitation, un photon d’énergie

hυex est appliqué à partir d’une source externe (comme un laser). Ce photon va être absorbé

par la molécule la faisant passer à un état électronique excité Sn en 10-15 secondes environ.

Cet état excité à une durée de vie limitée, 10-11 à 10-9 s. Durant cette phase, l’énergie

de l’état S2 peut se dissiper partiellement par vibrations et donner lieu à un état relaxé S1. Un

photon d’énergie hυem, d’énergie plus faible que celle du photon absorbé et donc de longueur

d’onde plus grande (λem>λex), sera émis faisant revenir le fluorophore à son état fondamental

en émettant de la lumière appelée fluorescence.

La différence d’énergie ou de longueur d’onde observée est appelée déplacement de

Stokes ou « Stoke’s shift » (Fig. II-2). La détection d’une espèce fluorescente est d’autant

plus facile que le déplacement de Stokes est grand.

Un fluorophore est caractérisé par des longueurs d’onde d’émission et d’excitation

(Fig. II-2) mais également par un rendement quantique de fluorescence (�), un coefficient

d’extinction molaire (ε) ainsi qu’une intensité de fluorescence (If) et une durée de vie (τf).

Figure II-2: Représentation de la différence d'énergie entre l'état excité et l'état d'émission ou déplacement de Stokes.

"�%&��

λ��λ��

λ�

Δλ� ��

��

�

�


��

��

II-A-2 Paramètres caractéristiques de la spectroscopie de fluorescence

II-A-2-a Le rendement quantique de fluorescence : ��

L’efficacité de fluorescence pour une molécule (�) donnée est déterminée par le

rendement quantique (��). Ce rendement traduit l’efficacité relative de la fluorescence

comparée aux autres voies de désexcitation pour un fluorophore donné et correspond au

rapport entre le nombre de photons émis (��) et le nombre de photons absorbés par le

fluorophore (��) (Eq.1).

��

��

��

(Eq.1)

La valeur du rendement quantique est comprise entre 0 et 1 et les meilleurs

fluorophores ont un rendement quantique proche de 1. Par ailleurs, le rendement quantique

varie en fonction de l’environnement (concentration, pH, polarité, présence d’espèces

extinctives).

II-A-2-b L’intensité de fluorescence : If M

L’intensité de fluorescence, ��, est donc proportionnelle au rendement quantique

(��) ainsi qu’à l’intensité absorbée, �� (cf Eq.1). L’efficacité avec laquelle la lumière est

absorbée est caractérisée par l’absorbance qui suit la loi de Beer-Lambert (Eq.2).

��

��

�� (Eq.2)�

avec �� l’intensité lumineuse incidente, �� l’intensité lumineuse transmise, �� le coefficient

d’extinction molaire de la molécule M correspondant à la longueur d’onde d’excitation , [M]

sa concentration et � le trajet optique.

Quand � est très petit, l’équation 2 devient (Eq.3) :

��

�� (Eq.3)

�

�


��

��

et par la suite l’intensité de fluorescence �� (Eq.4) est donnée en remplaçant �� dans

l’équation 1.�

��

� ��

� �� (Eq.4)��

Soit une relation linéaire entre la concentration du fluorophore et l’intensité de fluorescence.

Cette relation est vraie dans le cas où l’absorbance du fluorophore à la longueur d’onde

d’excitation ou d’émission est faible (A ≤ 0.05). Cependant, dans le cas où l’absorbance n’est

pas faible, l’intensité de lumière �� diminue à travers l’échantillon et l’intensité de

fluorescence n’est plus directement proportionnelle à la concentration. Le même effet est

observé en présence de molécules qui absorbent à la longueur d’onde d’excitation ou

d’émission du fluorophore. Cet effet est appelé inner filter effect et l’expression de l’intensité

de fluorescence devient alors (Eq.5) :

�� (Eq.5)

avec �� et ��

��

��

où �� correspond à l’intensité aux points � et � , �� à l’intensité maximale, ��

��

�� et ��

��

�� (��et �� sont les dimensions de la cuvette parallèles

et perpendiculaires au rayon d’excitation).

Finalement, pour une molécule M, l’intensité de fluorescence s’exprime de la façon suivante

en tenant compte de l’inner filter effect (Eq.6) :

��

� � � �� avec ��

� (Eq.6)

D’autres phénomènes peuvent influencer l’intensité de fluorescence. En solution, des

molécules peuvent entrer en collision avec le fluorophore, l’énergie électronique sera alors

convertie en énergie cinétique et de vibrations (désactivation non-radiative). Il s’agit dans ce

cas de quenching dynamique. Lorsque le fluorophore entre en collision avec lui-même, on

parle d’auto-quenching. Par ailleurs, le fluorophore peut former un complexe non-fluorescent,

le quenching est alors statique. Une faible concentration de fluorophore est généralement

utilisée de façon à s’affranchir des problèmes d’inner filter effect et d’auto-quenching.

L’absorbance due à d’autres phénomènes (par exemple la turbidité) contribue

également à l’inner filter effect.

�

�


��

��

II-A-2-c La durée de vie de fluorescence : τf

Une autre caractéristique importante en fluorescence est le temps de vie de

fluorescence (τf). Il correspond à la durée de vie moyenne de l’état excité. Dans la plupart des

cas, ce temps de vie est de l’ordre de la nanoseconde. La durée de vie dépend de

l’environnement du fluorophore et peut donc être un moyen pour suivre les changements

subtils de cet environnement.

II-A-2-d Fluorescence de la Thioflavine T

Comme nous l’avons vu dans l’introduction, la Thioflavine T (ThT) est un fluorophore

largement utilisé pour étudier l’agrégation du peptide Aβ à cause de sa spécificité pour les

fibres amyloïdes (Kd ∼µM) [1]. En effet, la ThT possède des caractéristiques de fluorescence

presque uniques en présence de fibres amyloïdes.

La ThT, molécule chargée positivement, est composée d’un noyau de type aniline et

d’un fragment de type benzothiazole qui tournent librement autour de la liaison C-C qu’ils

partagent (Fig. II-3, A). Dans cette conformation « libre », la ThT absorbe à 412 nm (ε =

33000 M-1.cm-1) (Fig. II-3, D) et ses longueurs d’onde d’excitation et d’émission sont 385 et

485 nm (Fig. II-3-B et C) respectivement associées à un rendement quantique (�) de 0.0001

dans l’eau (Fig. II-3, E). En présence de fibres amyloïdes, la ThT va voir sa fluorescence

exaltée à cause de la restriction de la rotation de la liaison C-C entre les deux fragments de la

ThT une fois liée aux fibres amyloïdes. La ThT ne possède plus les mêmes caractéristiques

spectroscopiques : le maximum d’absorbance est à 440 nm (Fig. II-3, D) et les pics

d’excitation et d’émission en fluorescence sont à 440 et 490 nm (Fig. II-3, B et C). Ces

changements sont accompagnés d’une forte augmentation du rendement quantique, multiplié

par 4400 soit �=0.44 (Fig. II-3, E) [2,3].

�

�


��

��

Cependant, de nombreuses questions concernant la ThT restent sans réponse. En effet,

il est proposé dans la littérature que la ThT possède plusieurs sites de fixation pour le peptide

Aβ mais l’identification de ces sites est toujours débattue. Par ailleurs, son interaction avec les

fibres est encore mal décrite à ce jour. En effet, comment et à quelle vitesse s’insère-t-elle

dans les fibres ?

N

SN

CH3

CH3

CH3H3C

Cl

'�(

'�(

'�(

'�(

'�(��

��

��

��

��

��

��

Figure II-3: (A) Représentation de la ThT avec en rouge le fragment benzothiazole, en bleu le fragment aniline et en noir la liaison C-C autour de laquelle se fait la rotation. (B) et (C) Spectre d'excitation et

d’émission de la ThT seule (spectre noir) et en présence de fibres (spectre rouge) dans l’eau [4]. (D) Spectre d’absorbance de la ThT seule (1) et en présence de fibres (2) dans l’eau [5]. (E) Fluorescence de la ThT en

absence et en présence de fibres reflétant l’augmentation du rendement quantique [3].

�

�

�Chapitre II. B- La Résonance magnétique nucléaire

��

��

II-A-2-e Les avantages et inconvénients de la fluorescence

Dans l’étude de l’agrégation du peptide Aβ, la spectroscopie de fluorescence présente

de nombreux avantages. En effet, cette technique est facile à utiliser et elle est peu

consommatrice de matériel, dans notre cas, de peptide Aβ. Elle permet d’effectuer des

mesures in situ car il est admis, généralement, que la présence de ThT ne module ni la

cinétique d’agrégation ni la structure des agrégats. La fluorescence va permettre de visualiser

les changements conformationnels du peptide Aβ entre la forme monomérique et la forme

fibrillaire.

Cependant malgré ses nombreuses qualités, la spectroscopie de fluorescence présente

des limites dans l’étude de l’agrégation. En effet, l’intensité de fluorescence de la ThT va

dépendre de nombreux paramètres comme les conditions expérimentales telles que le pH, la

température, la présence de solvant polaire comme le DMSO, etc mais également de la nature

des agrégats formés (amorphes ou fibrillaires). La ThT présente une forte spécificité pour les

fibres amyloïdes et interagit peu avec les espèces amorphes [6]. De plus, la fluorescence va

nous renseigner sur la présence de fibres amyloïdes mais ne permet pas d’accéder à la

quantité de fibres formées et à leur taille. Il est donc nécessaire d’utiliser des techniques

spectroscopiques complémentaires pour accéder à ces informations.

II-B La Résonance Magnétique Nucléaire (RMN)

Pour notre étude, nous avons utilisé deux séquences à deux dimensions du type

TOCSY (Total Correlation SpectroscopY) [7,8] et NOESY (Nuclear Overhauser Effect

SpectroscopY) [9]. La RMN bidimensionnelle est composées de quatre phases : la préparation

de spins, le temps d’évolution, le temps de mélange et la période de détection (Fig. II-4).

Ces phases sont détaillées pour chacune des expériences présentées dans la suite du

paragraphe.

�

�

�


��

��

�

�

�

�

�

�

�

�

�

II-B-1 La TOCSY (Total Correlation SpectroscopY)

L’expérience TOCSY consiste en un transfert d’aimantation entre les protons d’un

même système de spin créant ainsi des corrélations entre ces protons. Ces corrélations sont

détectées tant qu’il existe un couplage scalaire entre chaque proton. En effet, le transfert

d’aimantation peut se faire jusqu’à 5 ou 6 liaisons, selon le temps de mélange et est

interrompu en cas de couplage trop petit ou nul. La séquence TOCSY est représentée sur la

figure II-5 (a).

�

Figure II-5: (a) Séquence d'impulsion de la TOCSY, (b) exemple de carte TOCSY obtenue après la transformée de Fourier.

Figure II-4: Principe de la RMN à deux dimensions. Durant la période d’évolution, l’expérience est répétée un grand nombre de fois en faisant varier

régulièrement t1.

�

�


��

��

La période de préparation de cette séquence est constituée d’un délai permettant le

retour à l’équilibre de l’aimantation et d’une impulsion à 90° qui bascule l’aimantation proton

dans le plan transversal. La période d’évolution est un délai t1. Pendant cette durée, les spins

évoluent librement sous l’effet du déplacement chimique et du ou des couplage(s) scalaire 1H-1H. La durée de t1 est incrémentée régulièrement permettant de générer la seconde dimension

en plus de la dimension d’acquisition (t2) en fin de séquence. La phase de mélange correspond

à un spin-lock constitué de plusieurs impulsions à 180°. Durant cette phase, un transfert de

polarisation, via les couplages J, s’opère vers les protons appartenant au même système de

spins. Prenons l’exemple d’un système AMX : si les spins A sont excités, l’aimantation sera

d’abord transférée de A vers M. Puis, si le spin lock est appliqué pendant une durée

suffisamment longue, l’aimantation passera de M vers X. Ainsi l’aimantation de A diffusera

vers tous les déplacements chimiques appartenant au même système de spins. Enfin, au cours

de la période de détection le signal est physiquement enregistré. Les déplacements chimiques

et les couplages 1H-1H sont détectés pendant t2. Sur la carte RMN obtenue, la diagonale

correspond à la projection dans le plan du spectre 1D. Les taches hors diagonales

correspondent aux corrélations TOCSY (Fig. II-5, (b)). Les taches hors-diagonale sont

symétriques par rapport à celle-ci.

Le spectre TOCSY présente plusieurs avantages : cette séquence conduit à des raies en

absorption pure et positives ce qui permet une résolution maximale.

II-B-2 La NOESY (Nuclear Overhauser SpectroscopY)

L’expérience NOESY est basée sur l’effet NOE. Afin d’expliquer cet effet, nous

allons considérer une molécule contenant deux protons non-équivalents et sans couplage

scalaire, A et B. Le spectre RMN 1H de la molécule consiste alors en deux singulets à δA et

δB ppm (Fig.II-6, a). Supposons, que pendant l’enregistrement du spectre, les spins A sont

saturés par l’application d’un champ radiofréquence à la fréquence de résonnance de A. Le

premier effet de la saturation est la disparition du signal du proton A. Le second effet est la

possible variation d’intensité du proton B, si les deux spins ont une interaction dipolaire non

négligeable. Comme le montre la figure II-10, le signal de B peut être plus fort (Fig. II-6, b),

plus faible (Fig. II-6, c) ou inversé (Fig. II-6, d).

�

�


��

��

Ce phénomène est connu sous le nom d’effet nucléaire Overhauser (NOE). Le NOE

est un aspect de la relaxation nucléaire qui ne peut avoir lieu que si une interaction dipolaire

existe entre deux noyaux proches dans l’espace. L’interaction dipolaire dépend du

mouvement moléculaire et donc de la viscosité de la solution. Ce mécanisme de relaxation est

proportionnel à 1/r6 avec r la distance entre deux noyaux. L’interaction dipolaire diminue très

rapidement avec la distance et elle va donc être observée pour des noyaux qui sont proches

dans l’espace (∼5 Å).

La NOESY est la version à deux dimensions de la mesure de l’effet NOE dont la

séquence est représentée sur la figure II-7. L’effet NOE décrit précédemment concerne la

répartition des populations après saturation d’un spin. Dans l’expérience NOESY, il n’y a pas

de saturation de spin mais une inversion des spins ce qui crée une aimantation longitudinale

exclusivement et donc une inversion des populations de spins des différents niveaux

énergétiques.

Figure II-6: Spectre RMN schématique montrant les différents effets NOE possibles.

�

�


��

��

�

Figure II-7: (a) Séquence d'implusion de la NOESY. (b) Exemple de carte NOESY obtenue après la transformée de Fourier.

Les périodes de préparation, d’évolution et de détection sont les mêmes que pour

l’expérience TOCSY. La différence avec cette dernière se situe au niveau de la période de

mélange qui est constituée de deux impulsions à 90° séparée par un délai TM (entre 200 ms et

1s). Durant la période de mélange, les aimantations sont orientées suivant l’axe z. Si le délai

TM est convenablement choisi, il permet à l’aimantation de passer partiellement sur d’autres

sites protons par un processus de relaxation croisée. Comme pour la TOCSY, le spectre

obtenu est symétrique par rapport à la diagonale et présente des taches de corrélation

indiquant une proximité spatiale. Les taches de corrélations peuvent également être observées

suite à un échange chimique pendant le temps de mélange.

L’intensité relative I de l’effet NOE se quantifie par la mesure du volume du pic de

corrélation et peut être modélisée par la relation suivante (Eq.7):

��

�� (Eq.7)

�

avec TM le temps de mélange, �� le temps de corrélation et r la distance entre les deux

noyaux. L’intensité des NOE peut alors être modélisée par la courbe représentée sur la figure

II-8. Selon le temps de corrélation et la fréquence du spectromètre RMN, il n’est pas possible

de détecter les corrélations NOE.

�

�


��

��

� �

Figure II-8: Intensité des taches de corrélation NOE en fonction du temps de corrélation et de la fréquence du champs magnétique.

�

L’intensité relative de la tache NOE est également dépendante du temps de corrélation

des protons observés qui caractérise la mobilité relative des deux protons voisins dans

l’espace. Ce temps de corrélation dépend donc du poids moléculaire de la molécule, de la

viscosité du milieu ainsi que de la température. L’accroissement maximal est de 50% dans le

cas d’un temps de corrélation de l’ordre de 10-9 s soit une très forte mobilité (Fig.II-14). Pour

des temps de corrélation plus long que 1.10-9 s, l’accroissement sera de -1 indiquant une

mobilité moins importante.

Cependant, l’intensité relative des taches NOE n’est pas linéaire avec l’augmentation

du temps de mélange (Fig.II-9, gauche). Cette non-linéarité provient de la diffusion de spin.

En effet, dans certaines conditions, les chemins de relaxation indirects sont plus efficaces que

les chemins directs. Par exemple, la relaxation passant de A à B puis à C est plus efficace que

celle allant directement de A à C (Fig. II-9, droite). C’est ce qu’on appelle la diffusion de spin

et dans ce cas une tache de corrélation est observée et son intensité ne reflète en aucun cas la

distance entre les deux noyaux. Ce phénomène de diffusion de spin est généralement observé

lors de l’utilisation de temps de mélange long. Pour contourner ce problème, il faut utiliser un

temps de mélange plus court.

NO

E m

axim

al

Pas de NOE

��

�

�


��

��

Au niveau structural, l’interprétation des carte NOESY, d’un point de vue qualitatif

(présence ou non de NOE) et quantitatif (intensité relative des pics) va permettre de

déterminer la conformation d’une molécule. En effet, la présence d’une tache de corrélation

entre deux protons indique qu’ils sont distants de 5 Å au maximum et, de façon simplifiée,

plus la tache sera intense et plus ils seront proches. Il est alors possible d’établir des

contraintes sur les distances et ainsi déterminer la conformation d’une molécule. Cette

séquence est très utilisée en biologie structurale afin de caractériser le repliement de protéines

(hélice α, feuillet β). Cet aspect de la NOESY sera abordé dans la suite du chapitre.

Figure II-9: A gauche, graphique représentant l’intensité des pics NOE en fonction du temps de mélange illustrant la diffusion de spin schématisé par la figure de droite.

B

A C

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�Chapitre II. C- Peptide Aβ28 et conditions expérimentales

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II-C Peptide Aβ28 et conditions expérimentales

La troisième partie de ce chapitre présente le modèle de l’étude c’est-à-dire le peptide

Aβ28 ainsi que l’utilisation du Zn(II). En effet, dans le chapitre IV, l’effet du Zn(II) sur

l’agrégation sera présenté. Dans ce contexte, l’attribution des résonances des protons du

peptide Aβ28 a été réalisée. La méthodologie d’attribution sera présentée et appliquée au

peptide Aβ28.

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II-C-1 Le peptideAββ28 et fixation du Zn(II)

Comme décrit dans le premier chapitre, l’agrégation du peptide Aβ est un processus

central du développement de la MA dont le mécanisme est encore obscur à ce jour. De plus, il

semblerait que les espèces intermédiaires oligomériques de l’agrégation soient les espèces

intervenant dans la neurotoxicité liée à la MA. Plusieurs intermédiaires de l’agrégation du

peptide Aβ ont été observés allant du dimère à de larges agrégats. Cependant, la nature exacte

des espèces entrainant la mort neuronale (dimère ? trimère ? n-mère ?) n’est pas connue à ce

jour. L’étude des conditions influençant l’agrégation et la formation d’intermédiaires est donc

d’un grand intérêt, et en ce sens nous nous sommes intéressés à l’influence du zinc présent en

concentration importante dans les plaques amyloïdes. Le cuivre est également présent en

quantité importante dans les plaques amyloïdes mais son effet sur l’agrégation reste

controversé, contrairement au zinc qui semble être favorable. De plus le zinc est capable de se

lier à d’autres protéines comme α-synucléine (maladie de Parkinson) ou le prion (maladie de

Creutzfeld-Jacob) [10]. L’étude de l’influence du zinc sur l’agrégation de peptide et/ou

protéine amyloïdogénique dépasse largement le cadre de la MA. L’agrégation ou l’auto-

assemblage de peptides via l’utilisation d’ions métalliques comme modulateur est aussi un

sujet d’intérêt pour les bio/nanotechnologies.

Il est clair que le site de fixation du zinc est localisé dans la partie N-terminale du

peptide Aβ (acides aminés 1 à 16) et implique principalement les résidus histidines [11], mais

la coordination exacte reste inconnue. Le peptide Aβ16 (Fig. II-10) représente un bon modèle

pour étudier la coordination des ions métalliques mais il n’agrège pas.

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DAEFRHDSGYEVHHQK Figure II-10 : Séquence peptidique du peptide Aββ16 (code à une lettre). Les résidus histidines, impliqués

dans la coordination du Zn(II) sont en rouge

Le but du chapitre IV est d’évaluer l’effet du zinc et de la ThT sur la cinétique

d’agrégation du peptide Aβ par différentes techniques spectroscopiques (fluorescence et

RMN 1H, principalement) afin d’apporter des éléments de réponse quant à son mécanisme. Il

est donc nécessaire d’utiliser un peptide capable d’agréger. Nous avons choisi de travailler

avec le peptide Aβ28 (Fig. II-11), contenant le site de fixation du zinc dans sa partie N-

terminale et une partie plus hydrophobe qui est responsable de l’agrégation. Le peptide Aβ28

forme des fibres amyloïdes classiques et étant plus court que les peptides natifs Aβ40 et

Aβ42, il agrège beaucoup plus lentement et à plus forte concentration, rendant ainsi possible

les études spectroscopiques avec un suivi dans le temps [12]. De surcroit, les expériences

d’agrégation sont reproductibles entre différentes préparation de peptide Aβ28 (fournisseur,

lot, manipulateur,…) ce qui n’est pas le cas pour Aβ40.

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK Figure II-11 : Séquence peptidique du peptide Aβ28 (code à une lettre)

Une partie de l’étude de l’influence du zinc et de la ThT a été réalisée par RMN 1H. Il

a donc été nécessaire de réaliser l’attribution du peptide Aβ28.

II-C-2 Attribution des résonance 1H-RMN du peptide Aβ28

La structure du peptide Aβ (40/42) a été résolue dans différents milieux tels que des

micelles mimant les membranes cellulaires [13-17] ou dans un mélange TFE/eau [18-21] ou

encore dans le DMSO [22]. La grande majorité de ces études est réalisée à pH acide (pH∼3) [19,21,23]. En effet, à ce pH le peptide est sous forme monomérique et n’agrège pas. Ces

conditions n’étant pas celles du milieu physiologique, nous avons travaillé dans des

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conditions plus proches du milieu physiologique c’est-à-dire dans 10 mM de tampon

phosphate, pH 7.4.

II-C-2-a Méthodologie d’attribution

L’attribution des signaux RMN de peptides se déroule en plusieurs étapes, dont la

stratégie a été définie par Wüthrich [24]: un échantillon de peptide (ou protéine) est solubilisé à

une concentration suffisante (0.1 à 0.5 mM) dans des conditions de pH et de température

fixées. La première étape consiste en l’attribution de tous les protons du peptide par acide

aminé (un système de spin) à l’aide de la TOCSY. Les taches de corrélation détectées sont

exclusivement intra-résidus. En effet, la présence du C=O empêche le transfert de

aimantation. La seconde étape permet de relier les acides aminés entre eux en fonction de leur

emplacement dans la chaîne peptidique et donc d’accéder à la structure primaire du peptide.

Ces données sont obtenues grâce à la NOESY.

II-C-2-a-i Préparation de l’échantillon

Comme expliqué précédemment, l’attribution du peptide n’étant pas connue dans des

conditions physiologiques, nous avons travaillé dans 10 mM de tampon phosphate à pH 7,4

de façon à être le plus proche possible du pH physiologique. Les conditions de pH et de

tampon étant fixées, il a fallu optimiser les conditions de température. L’observation des

protons amides est importante lors de l’attribution, il est donc nécessaire de ralentir au

maximum l’échange de ces derniers avec l’eau en jouant sur la température (la température

influence fortement le phénomène d’échange). Des spectres RMN ont donc été enregistrés à

différentes températures allant de 5 à 30°C (Fig. II-12). Les résultats montrent que 10°C est la

température idéale pour observer le maximum de protons amides et différencier les protons

aromatiques comparativement aux autres températures.

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De la même façon, différentes concentrations en peptide ont été essayées. Le peptide

Aβ28 est un peptide qui agrège au cours du temps. L’enregistrement des données RMN

nécessite un certain temps. Il faut alors déterminer la concentration idéale en peptide

permettant à la fois d’avoir un peptide stable dans le temps et suffisante pour pouvoir détecter

toutes les corrélations nécessaires à l’attribution du peptide. Des spectres entre 100 et 500µM

de peptide ont été enregistrés et les résultats obtenus ont montré qu’une concentration de

500µM permettait d’obtenir des spectres résolus en un temps raisonnable sans que le peptide

n’agrège.

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L’attribution du peptide a donc été réalisée dans les conditions suivantes : 500µM en

peptide Aβ28 dans 10mM de tampon phosphate à pH 7,4, 90/10 H2O/D2O à 10°C.

II-C-2-a-ii Identification du système de spin (TOCSY)

Dans le paragraphe II-B-1, nous avons vu que le transfert d’aimantation qui a lieu dans

l’expérience TOCSY permet de créer des corrélations entre les protons d’un même système

de spin. Dans le cas d’un peptide (ou d’une protéine), un système de spin correspond à un

acide aminé (Fig. II-13, à gauche). Par les données TOCSY, nous allons pouvoir identifier les

différents acides aminés de la séquence peptidique.

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Figure II-12: Effet de la température sur le spectre RMN du peptide Aββ28. Conditions expérimentales: [Aβ28]=500µM, 10 mM de tampon phosphate pH

7,4, 90/10 H2O/D2O.

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Etant donné la symétrie de la carte 2D, les taches verticales et horizontales sont

identiques et permettent d’identifier tous les systèmes de spins grâce à leur chemin de

corrélation spécifique (Fig. II-13, à droite). En effet, les acides aminés ont des systèmes de

spins différenciables en fonction de leurs chaînes latérales.

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II-C-2-a-iii Détermination de la structure primaire

Après avoir identifié les différents systèmes de spins, la seconde étape consiste à relier

les acides aminés entre eux de façon à déterminer la structure primaire du peptide (ou de la

protéine). Pour cela l’expérience NOESY est utilisée. Cette expérience donne des

informations de distance par la corrélation des interactions spin-spin directe entre le proton

Hα d’un résidu (i) et le proton amide du résidu (i+1) comme le montre la figure II-14.

Figure II-13: Exemple d'un système de spin, la leucine, avec les corrélations de type HN-Hx détectées (à gauche) et l'allure de son spectre TOCSY (à droite).

Figure II-14: Corrélations détectées par l'expérience NOESY.

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δ�

δ�

)*

)α�

)β�

)γ�

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Lorsque l’attribution séquentielle est achevée, il reste les taches de corrélations

renseignant sur la proximité dans l’espace à i+2, i+3, i+4 des résidus identifiés. L’examen des

effets NOE participe à la détermination de la structure secondaire en informant sur l’existence

de motifs ou d’éventuels repliements de la protéine [25]. L’analyse du spectre NOESY du

peptide Aβ28 dans 10 mM de tampon phosphate à pH 7,4 n’a pas révélé de structure

secondaire particulière : le peptide est sous forme « random coil ».

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II-C-2-b Attribution du peptide Aβ28

II-C-2-b-i Séquence du peptide Aββ28

Pour plus de clarté, la séquence du peptide Aβ28 est représentée sur la figure II-15

dans laquelle chaque proton de chaque acide aminé est identifié selon la nomenclature

classiquement utilisée en RMN structurale.

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Aβ28

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�Chapitre II. C-Peptide Aβ28 et conditions expérimentales

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II-C-2-b-ii Tableau d’attribution

Comme le montre le tableau II-1, la grande majorité des signaux ont pu être attribués à

l’aide du logiciel CARA (version 1.8). L’attribution du peptide est une étape essentielle.

Grâce à ces données, nous allons pouvoir étudier l’évolution des pics de chaque acide aminé

au cours de la cinétique d’agrégation.

Résidu HN Hαα Hββ Hγγ Hδδ Hεε Asp1 Non vu 4.13 2.68-2.80 Ala2 Non vu 4.29 1.36-1.37 Glu3 8.52 4.20 1.83-1.92 2.17-2.19 Phe4 8.35 4.56 3.01 7.16 (2,6H) 7.25 (3,5H) Arg5 8.19 4.27 1.62-1.74 1.49 3.12 His6 Non vu 4.54 3.05-3.10 7.88 (2H) 7.03 (4H) Asp7 8.40 4.62 2.66 Ser8 8.46 4.37 3.87-3.91 Gly9 8.59 3.88-3.94

Tyr10 8.01 4.52 2.94-3.03 7.06 (2,6H) 6.78 (3,5H) Glu11 8.44 4.18 1.89-1.92 2.12-2.21 Val12 8.13 3.94 1.95 0.78-0.87 His13 Non vu 4.53 3.04 7.83 (2H) 6.94 (4H) His14 Non vu 4.59 3.01-3.08 7.85 (2H) 6.96 (4H) Gln15 8.44 4.26 1.97-2.06 2.32 Lys16 8.44 4.27 1.67-1.74 1.37 1.44 2.97 Leu17 8.31 4.32 1.57-1.61 1.45 0.85-0.91 Val18 8.04 4.02 1.90 0.75-0.83 Phe19 8.31 4.58 2.91-2.99 7.30 (2,6H) 7.17 (3,5H) Phe20 8.27 4.57 2.94-3.09 7.32 (2,6H) 7.24 (3,5H) Ala21 8.29 4.22 1.36-1.37 Glu22 8.42 4.21 1.92-2.04 2.27 Asp23 8.48 4.65 2.63-2.74 Val24 8.20 4.15 2.19 0.96 Gly25 8.59 3.98 Ser26 8.22 4.46 3.88 Asn27 8.54 4.74 2.77-2.85 Lys28 7.96 4.16 1.71-1.83 1.39 1.66 2.99

Tableau II-1: Attribution du peptide Aββ28 dans 10 mM de tampon phosphate, pH 7.4, T=10°C. �

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�Chapitre II. C-Peptide Aβ28 et conditions expérimentales

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� La spectroscopie de fluorescence ainsi que la spectroscopie RMN sont deux

techniques complémentaires qui vont nous permettre d’étudier à la fois la cinétique

d’agrégation du peptide Aβ28 mais également la coordination des complexes de Ru(II)

synthétisés au peptide Aβ28 ainsi que leurs effets sur sa cinétique d’agrégation.

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�Chapitre II. Bibilographie

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Bibliographie

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Chapitre III : Interaction de la ThT

avec le peptide Aβ28 sous forme

monomérique

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�Chapitre III. Interaction de la ThT avec le peptide Aβ28 sous forme monomérique

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Chapitre III. Interaction de la ThT avec le peptide Aββ28 sous forme

monomérique

Introduction :

La Thioflavine T (ThT) est un marqueur très utilisé, à la fois in vitro et en milieu

biologique, pour la détection par spectroscopie de fluorescence, des structures fibrillaires de

peptides amyloidogéniques. En effet, lors de l'interaction avec les fibres, le rendement

quantique de fluorescence de la ThT est amplifié d'un facteur ~ 104.

Dans cet article, nous décrivons l'étude par spectroscopie RMN de l'interaction de la

ThT avec le peptide amyloïde-β, Aβ28, sous forme monomérique. Le peptide Aβ28 est un

modèle des peptides natifs Aβ40 et Aβ42, impliqués dans la maladie d'Alzheimer. Bien

qu'étant plus court (28 acides aminés vs. 40 et 42), ce peptide a conservé la capacité

d'agrégation des peptides natifs, puisqu'il contient le cœur central hydrophobe (séquence

LVFFA) impliqué dans le processus de nucléation, première phase du mécanisme

d'agrégation. Néanmoins, sa propension à l'agrégation est faible (surtout en l'absence d'ions

métalliques) et permet donc d'étudier les formes monomériques à des concentrations

relativement élevé.

Nous avons donc mis en évidence une interaction de la ThT avec le cœur hydrophobe

(résidus LVFFA) d’Aβ28, et ce, en particulier par la détection de l'apparition de taches NOes

intermoléculaires. De plus, cette interaction est confirmée par des mesures du coefficient de

diffusion, qui a aussi permis d'évaluer la constante de dissociation ThT-Aβ28 qui est de

l'ordre de 2 mM. Enfin, une simulation par dynamique moléculaire a permis d'obtenir une

description du mode de liaison ThT - Aβ28, confirmant l'interaction privilégiée avec le cœur

hydrophobe. Il est a noté que toutes les études expérimentales et théoriques pointent vers une

interaction assez dynamique avec plusieurs sites de fixation, avec des échanges relativement

rapides, principalement situés autour des résidus LVFFA.

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�Chapitre III. Interaction de la ThT avec le peptide Aβ28 sous forme monomérique

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Cette étude démontre clairement que, contrairement à ce qu'il est généralement admis,

la ThT est capable d'interagir avec des structures peptidiques non fibrillaires. Néanmoins,

dans ce cas, son rendement de fluorescence n'est pas amplifié et dans notre cas l’affinité est

moins forte. Par ailleurs, ce travail ouvre la voie vers de nouvelles perspectives

thérapeutiques. En effet, des analogues de ThT pourraient inspirer des molécules soit de

ciblage des monomères soit dédiées à la détection des formes précoces du processus

d'agrégation.

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Cite this: DOI: 10.1039/x0xx00000x

Received 00th January 2012, Accepted 00th January 2012

DOI: 10.1039/x0xx00000x

www.rsc.org/

Thioflavine T does interact with monomeric Amyloid-β peptide

H. Eury,a,b,c G. Czaplicki,b,c I. Sasaki, P. Faller,a A. Milon,b,c C. Hureau,a and O. Saurelb,c*

While the fluorescent dye Thioflavin T (ThT) is widely used for monitoring amyloid fibril formation, NMR data and molecular dynamics simulations obtained here give the first structural characterization of an interaction between ThT and monomeric amyloid-β peptide. ThT binds transiently to the hydrophobic stretch LVFFA, a key domain for oligomerization. Amyloid deposits occur in several diseases, in particular in neurodegenerative disorders like Alzheimer’s disease or Parkinson disease1. At molecular level, amyloid fibrils are constituted by a peptide oligomer with cross-β sheets perpendicular to the long fibril axis (cross-β-motif). In the specific case of amyloid-β fibrils, Tycko and coll. described an in-register, parallel structure maximizing contacts between hydrophobic side chains2. The molecular determinants of amyloid fibril formation are poorly understood, but a general kinetic mechanism has been proposed. The kinetics is characterized by a typical sigmoidal time course, with a lag phase (which corresponds to the nucleation step) followed by a steep increase (elongation phase) and a plateau (thermodynamic equilibrium) (ESI, Fig. S1)3.The nucleation phase corresponds to the formation of a nucleus (the highest energy state) of unknown number of Aβ molecules and is considered to be the rate limiting step. Small and soluble oligomers (with 2 to 20-mers) have been assumed to be the most toxic species and hence responsible for the pathological processes of amyloid diseases4. The most widely used method to follow Aβ fibrillization is based on thioflavin T (ThT, Fig. 1, top) fluorescence. ThT fluorescence is very sensitive and specific to interaction with amyloid fibrils5 and is assumed to have a moderate impact on the aggregation kinetics and aggregate structures6. However, the molecular details of the interaction between ThT andamyloid fibrils are still largely unknown and controversial. More recently, it has been proposed that ThT can also interact with entities before elongation, such as oligomers and monomers without the dramatic increase of the fluorescence intensity characteristic of the interaction with fibrils7,8. Nevertheless the NMR study was performed at pH 4.07, a value quite far from physiological pH.

In the present communication, we provide the first clear evidence and structural characterization of Aβ28 monomer – ThT interaction at pH 7.4 using NMR and molecular dynamics simulations.

Figure 1: Illustration of ThT molecule and 1D 1H NMR spectra of a) ThT

alone, b) ThT in presence of Aβ28 at t=0h and c) at t=12h. Compared to the full-length peptides Aβ40 and Aβ42, Aβ28 is more soluble and its aggregation kinetic is slower and more reproducible. Nevertheless, its fibrils have a very similar structure to those of Aβ40/429. We first characterized the aggregation kinetics by ThT fluorescence and NMR spectroscopies of a 500 µM solution of Aβ28 to ensure that Aβ28 did not aggregate significantly over the first 24 hours. At 12 hours, we detected by fluorescence only a very low fraction of fibrils that represented �2% compared to the control experiment performed in presence of 0.5 equivalent of Zn(II), a known trigger of Aβ28 fibrillization10 (ESI Fig. S2a). In addition, no line broadening was observed on the proton spectrum, indicating that before 12 hours the sample is composed of monomers or small

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oligomers (< 6-mers) (ESI Fig. S2b). Consequently, all the NMR experiments were performed within less than 12 hours.

Then, interaction between ThT and Aβ28 were probed by 1D and 2D NMR at pH 7.4. A seen in Figure 1, bottom, no modification of either the ThT or the Aβ28 signals is observed in the 1D NMR spectrum within 12 hours. In contrast, in the 2D NOESY spectra of ThT with Aβ28 we observed intramolecular transferred NOes within ThT resonances at pH 7.4 (ESI, Fig. S3) in line with the previous report of Benaki et al.7. Several intermolecular contacts could be identified unambiguously (for full assignment of Aβ28 in the same conditions, see ESI Table 1); the most obvious ones were between the methyl group (Me) of the benzothiazole ring, M1 at 2.56 ppm, and the peptide side chain’s Me of L17, V18, A21, V24 and aromatic protons of F19 and F20 (Fig. 2a). We could also observe intermolecular crosspeaks between the benzamine ring Me and the same peptide residues (Fig. 2b). Finally, intermolecular NOes were observed between ThT aromatic protons (i.e. H1 on the benzothiazole and H4 on the benzamine) with L17, V18 and F19 (Fig. 2c). Taken together, these data show that ThT binds to the hydrophobic core of the Aβ28 around the LVFFA motif. The NOe pattern indicates that the bound state cannot be described by one single structure but rather by a set of ThT complexes around the LVFFA sequence.

Figure 2: 2D NOESY spectrum of ThT (140µM) in the presence of Aβ28 (500µM) in a 10 mM phosphate buffer pH 7.4 at 25°C. The panels a), b) and c) show NOes cross peaks with the methyls M1, M3 and aromatic signals of ThT respectively. Intermolecular NOes are annotated explicitly on the spectrum while intramolecular NOes are annotated by an asterisk.

Then, we measured the translational diffusion coefficients by

gradient echo spectroscopy. We obtained 1.5.10-10 ± 0.1 m2/s for

Aβ28 at 25°C, in agreement with the value reported by Benaki et al. 7 for the same monomeric peptide at pH 4.0 (1.66.10-10 m2/s). Concerning ThT, we found 5.2.10-10 ± 0.1 m2/s for ThT alone, and 4.5.10-10 ± 0.1 m2/s immediately upon addition of Aβ28, in line with the interaction of the ThT with the monomeric peptide (ESI, Fig. S4). The intensity decay for the ThT – Aβ complex is fitted by a single diffusion coefficient, whose value is intermediate between those of ThT and Aβ monomer. This indicates fast exchange between a ThT-bound and ThT-free form, and a 20% bound fraction. This corresponds to a dissociation constant, Kd, of about 2 mM, between ThT and monomeric Aβ28. This is the first report on the affinity between ThT and Aβ monomers. Maezawa et al. determined by Surface Plasmon Resonance that ThT binds to Aβ40/42 oligomers with a Kd of about 0.5 µM8, while a Kd of 0.75 µM was determined on Aβ40 by fluorescence11. The 3 orders of magnitude difference in binding affinity is in part due to the difference in peptide length but most likely to the difference between monomer and aggregated states which provide a stronger binding pocket to ThT.

In order to get a dynamic description of the binding mode at

atomic resolution, we performed molecular dynamic (MD) simulations. Two 10 ns long dynamics were performed, starting with two different ThT positions with respect to Aβ28. In the first one, the ThT center of gravity was placed 5 Å away from F19. In the second run, ThT was moved 4 residues towards the peptide N-terminus, thus near N15 (see ESI materiel and methods). In the first MD, the peptide rapidly unfolded to random coil while the ThT molecule established stable contacts over the entire simulation with the LVFFA cluster, with multiple and transient hydrophobic interactions between Me M1, M3 and Me of L, V and A residues. To check whether the MD depended on the starting ThT position, ThT was shifted toward N15: Figure 3a shows the average distance between ThT and Aβ residues at three times along the MD run. Within 2 ns of MD, the ThT molecule clearly shifted towards the hydrophobic cluster (i.e. grey bar), where it remained for the last 8 ns, establishing hydrophobic contacts in line with the intermolecular NOes observed (Fig. 3). A detailed analysis of the MD simulations indicated that the ThT flipped and adopted the following privileged contacts: methyl group M1 of the benzothiazole moiety with A21, the benzamine moiety with F20 for aromatic protons and with L17 for methyl groups M3 (ESI, Fig S5a-c). This privileged orientation is illustrated in ESI, Fig. 5d-e with Me-Me hydrophobic contact and possible transient π - π stacking between the aromatic rings of the benzamine moiety and F19. These views should be considered as instantaneous pictures among other conformers, nevertheless the binding epitope described by the hydrophobic core L17 to A21 is clearly demonstrated.

Our data on the monomeric Aβ28 are consistent with MD

simulations on Aβ(16-22) composed of eight in-register anti-parallel β-strands. Authors demonstrated that ThT could bind to two major binding sites, the central channel of the lower and upper sheet layers delimited respectively by F19-F19 and V18-F2012. In addition, it has been shown that in large excess of ThT with respect to Aβ42, ThT

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inhibited oligomers formation, especially small oligomers with a molecular mass of 18-36 kDa13. In line with this result, it has also been recently shown that ThT can interfere with Aβ40 aggregation promoting fibrils formation.14 In this context, ThT could prevent the early stage of oligomers formation considering the importance of the hydrophobic core in the aggregation mechanism15. To the best of our knowledge, beside this simulation no structural data was reported in the literature about the binding site of ThT with monomeric Aβ peptides. The results described herein are therefore the first experimental evidence about the binding interaction of ThT with central hydrophobic core of the monomeric Aβ.

Figure 3: a) ThT shift towards the hydrophobic cluster of Aβ28 (gray bar) illustrated by the average distance between ThT molecule and Aβ28 residues at three distinct running times (i.e. 0.1, 0.5 and 2.0 ns) of a MD simulation.

Conclusions We have demonstrated, based on NMR experimental evidence,

that ThT binds specifically to Aβ28 peptide in its monomeric form at pH 7.4, although with a weak affinity (Kd in the mM range). This questions the common believe that ThT binds only to amyloid fibrils in line with its wide use to monitor fibrils formation by fluorescence. Based on specific intermolecular NOE contacts and molecular dynamics simulations we have established a model of the ThT – Aβ interaction, which involves exchange between several transient species. Although the interactions involved in the ThT - Aβ adduct are weak, they are expected to have an impact on the aggregation process, as ThT binds to the region proposed to make the first peptide-peptide contacts. Future ongoing studies will be dedicated to the study of ThT interaction with small oligomers (forms prior to elongation) since several reports demonstrated the role of oligomers rather than fibrils or monomers in neurodegeneration process and cognitive deficits4, 16. In this context, analogs of ThT could be considered as starting points to design molecules which specifically target Aβ monomers or oligomers in a curative strategy against AD. ThT could also inspire the design of new molecular probes specific of the early stages of the aggregation mechanism aiming at developing early diagnosis tool against AD17.

Notes and references a CNRS; LCC (Laboratoire de Chimie de Coordination) ; 205, route de Narbonne, F-31077 Toulouse, France and bUniversité de Toulouse; UPS, INPT ; LCC ; F-31077 Toulouse, France c Institute of Pharmacology and Structural Biology, Université de Toulouse, UPS, 205 route de Narbonne, 31077 Toulouse, France

d IPBS, UMR 5089, CNRS, 205 route de Narbonne, BP 64182, 31077 Toulouse, France

† Footnotes: NMR experiments were performed on the PICT - Genotoul platform of Toulouse and funded by CNRS, Université de Toulouse-UPS, Ibisa, European structural funds and the Midi-Pyrénées region. The PRES of the Toulouse University and the Region Midi-Pyrenees are acknowledged for the financial support of the doctoral fellowship of H. E.. Electronic Supplementary Information (ESI) available: []. See DOI: 10.1039/c000000x/ 1. F. Chiti and C. M. Dobson, Annu. Rev. Biochem., 2006, 75, 333-366. 2. R. Tycko, Biochemistry, 2003, 42, 3151-3159. 3. P. Faller, C. Hureau and O. Berthoumieu, Inorg. Chem., 2013, DOI:

10.1021/ic4003059. 4. C. Glabe, J. Biol. Chem., 2008, 283, 29639-29643. 5. N. Amdursky, Y. Erez and D. Huppert, Acc. Chem. Res., 2013, 45,

1548-1557. 6. A. I. Sulatskaya, I. M. Kuznetsova and K. K. Turoverov, J. Phys.

Chem. B., 2012, 116, 2538-2544. 7. D. Benaki, K. Stathopoulou, L. Leondiadis, N. Ferderigos, M.

Pelecanou and E. Mikros, J. Pept. Sci., 2009, 15, 435-441. 8. I. Maezawa, H. S. Hong, R. Liu, C. Y. Wu, R. H. Cheng, M. P. Kung,

H. F. Kung, K. S. Lam, S. Oddo, F. M. Laferla and L. W. Jin, J. Neurochem., 2008, 104, 457-468.

9. D. A. Kirschner, H. Inouye, L. K. Duffy, A. Sinclair, M. Lind and D. J. Selkoe, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 1987, 84, 6953-6957.

10. F. Collin, I. Sasaki, H. Eury, P. Faller and C. Hureau, Chem. Commun., 2013, 49, 2130-2132.

11. C. Wu, Z. Wang, H. Lei, W. Zhang and Y. Duan, J. Am. Chem. Soc., 2007, 129, 1225-1232.

12. C. Wu, Z. Wang, H. Lei, Y. Duan, M. T. Bowers and J. E. Shea, J. Mol. Biol., 2008, 384, 718-729.

13. M. Necula, R. Kayed, S. Milton and C. G. Glabe, J. Biol. Chem., 2007, 282, 10311-10324.

14. M. D'Amico, M. G. Di Carlo, M. Groenning, V. Militello, V. Vetri and M. Leone, J. Phys. Chem. Lett., 2012, 3, 1596-1601.

15. A. T. Petkova, Y. Ishii, J. J. Balbach, O. N. Antzutkin, R. D. Leapman, F. Delaglio and R. Tycko, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2002, 99, 16742-16747.

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7747-7762.

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102

Thioflavine T does interact with monomeric Amyloid-ββ peptide

H. Eury, G. Czaplicki, P. Faller, I. Sasaki, A. Milon, C. Hureau and O. Saurel*

Electronic Supplementary Information (ESI)

Table of content

Materiel and Methods p. 103

ESI table 1: p. 106

ESI Figure S1: p. 106

ESI Figure S2: P. 108




ESI References: p. 114

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103

Materiel and Methods

Chemical and samples preparation

Peptides: Aβ28 peptide (sequence DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK) was bought from

GeneCust (Dudelange, Luxembourg) with purity grade > 98%.

Stock solutions of peptide were prepared by dissolving the powder in milliQ water or D2O (resulting

pH ~ 2). Peptide concentration was then determined by UV-visible absorption of Tyr10 considered as

free tyrosine (ε276-ε296) = 1410 M-1cm-1 at pH∼2. The stock solution was adjusted at pH∼12. Then, the

solutions were diluted down to the appropriate concentration in peptide during sample preparation. All

pH values are given with a ± 0.2 pH unit error.

Zinc solutions: Zn(II) used was from ZnSO4 .H2O and purchased from Sigma. Stock solution of Zn(II)

(~0.1M) was prepared in H2O.

Phosphate buffer were bought from Sigma-Aldrich.

ThioflavinT (ThT) was bought from Acros organics. Stock solution of ThT (10mM) were prepared in

in H2O.

Fluorescence measurements

ThT, Aβ28, and Zn(II) were mixed in a 10 mM phosphate buffer pH 7.4 and placed in a 384-well

microplate. The final concentrations were 500µM for Aβ28, 10 to 140µM for ThT and 0 or 250 μM

for Zn(II). The time course of ThT fluorescence was then measured with a FLUOstar Optima (BMG

Labtech) multiplate reader (excitation, 440 nm; emission, 490 nm; bandwidth for emission and

excitation, 10 nm) at T=25°C.

Nuclear Magnetic Resonance (NMR) measurements

Aβ28 samples were freshly prepared from a D2O stock solution and diluted to about 500µM in 90/10

H2O/D2O or in pure D2O at pH 7.4. ThT was directly added to the NMR tube at the final concentration

of 140 µM. In D2O, the pD was measured using a classical glass electrode according to pD= pHreading+

0.4 1. Experiments were performed on a Bruker Avance 600 MHz spectrometer equipped with a

cryoprobe (1H, 13C, 15N). All chemical shifts were referenced at 0.00 ppm relative to internal TSP

(sodium 3-(trimethylsilyl)propionate-2,2,3,3-d4). Proton 1D-NMR and 2D-NMR spectra were

collected at 25°C in pure D2O, except for the sample dedicated to resonance assignment of Aβ28 in

90/10 (H2O:D2O).

Aβ28 peptide assignments were performed using 2D TOCSY with a mixing time of 80 ms at 10 KHz

of radiofrequency field (DIPSI-2) and two 2D NOESY with mixing times of 140 and 400 ms. Both

experiments were recorded with 4k x 512 complex data points and with a recycle delay of 2 s and 32

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104

scans. NOESY spectra in the presence of ThT were acquired within 12 hours, with mixing times of

150 and 400 ms and using 4k x 512 data points and with 32 repetition scans.

The diffusion coefficient (D) were obtained using stimulated echo experiment with bipolar gradient

and Watergate experiment 2. The pseudo 2Ds were acquired with a gradient ramp from 2 % to 95 % in

16 linear steps, a diffusion time (Δ) of 0.2 s, and diffusion gradient lengths (δ) of 0.9 and 1.6 ms for

ThT alone and in presence of Aβ peptide respectively. The gradients were calibrated at 57.15 G/cm

relatively to the self-diffusion coefficient of water.

All NMR data were processed using TopSpin 2.1 software (Bruker). Aβ28 assignment was performed

using Cara 1.3v8 software (www.nmr.ch) and diffusion coefficients were determined using the T1/T2

package of Topspin 2.1 by fitting the raw data with a single coefficient diffusion entity.

Molecular Dynamic simulations

Molecular dynamics (MD) simulations were performed with the Amber 9 package3,4. A periodic box

has been created with the sizes of 50 x 50 x 115 Å, in the center of which a 28-residue peptide was

placed in the extended conformation. One ThT molecule was added to the system and positioned near

the peptide, with the M1 methyl group oriented toward the decreasing residue numbers. The box was

solvated with 7175 H2O molecules (TIP3P model), and finally two Na+ ions were added at random

positions to compensate the global charge of the system. We have performed two runs of MD

simulations, each of them 10 ns long. The initial position of the ThT molecule was different in each of

the two runs. In the first one, the ligand was placed at the distance of 5 Å between the center of gravity

of ThT and that of F19. In the second run, ThT was moved 4 residues towards the N-terminal of the

peptide.

Each run started with energy minimization of the solvent using the Steepest Descent algorithm for

1000 iterations, during which the Cartesian coordinates of the atoms of the remainder of the system

were restrained using a harmonic potential with the force constant equal to 100 kcal/mol/Å2. Next,

1500 iterations of the Conjugate Gradients algorithm followed, with weakly restrained solute (10

kcal/mol/Å2). Then, a 20 ps MD run was performed with constant volume, while temperature was

varied linearly between 0 and 300 K, the integration step was 1 fs. This was followed by a 100 ps MD

run with constant pressure at 300 K. The temperature control was achieved using the Langevin

dynamics with the collision frequency parameter γ equal to 1.0 ps−1. The pressure was controlled by

the anisotropic Berendsen barostat with the pressure relaxation time τp = 2 ps. Bonds involving

hydrogen atoms were constrained with the SHAKE algorithm 5. Throughout the calculations a cutoff

of 12 Å was used for electrostatic interactions. At the end of this step the system was equilibrated,

with constant values of the total energy, volume, pressure and density. Finally, a production run of 10

ns was performed with the integration step of 2 fs, with atomic coordinates saved every 10 ps. After

the run the resultant trajectory was visualized and analyzed.

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105

The data shown in Figure 3a have been extracted from the second MD run. We have calculated the

distance between the center of gravity of the ThT molecule and that of each of the residues in the

peptide, as represented by the N, CA and C atoms, for each frame of the trajectory. Then, the distances

have been averaged over 10 consecutive frames, centered on three selected simulation times: 0.1 ns,

0.5 ns and 2 ns.

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106

ESI table 1 Primary sequence of Aββ28 peptide:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK

1H chemical shifts of Aβ28 at pH 7.4 All the 1H signals were assigned on the basis of chemical shifts by using 1H-1H TOCSY and 1H-1H

NOESY experiments for Aβ28 (500µM) in 10 mM phosphate buffer pH 7.4, 90/10 H2O/D2O at 10°C.

All chemical shifts were referenced at 0.00 ppm relative to internal TSP.

Résidu HN Hαα Hββ Hγγ Hδδ Hεε

Asp1 4.13 2.68-2.80

Ala2 4.29 1.36-1.37

Glu3 8.52 4.20 1.83-1.92 2.17-2.19

Phe4 8.35 4.56 3.01 7.16 7.25

Arg5 8.19 4.27 1.62-1.74 1.49 3.12

His6 4.54 3.05-3.10 7.88 7.03

Asp7 8.40 4.62 2.66

Ser8 8.46 4.37 3.87-3.91

Gly9 8.59 3.88-3.94

Tyr10 8.01 4.52 2.94-3.03 7.06 6.78

Glu11 8.44 4.18 1.89-1.92 2.12-2.21

Val12 8.13 3.94 1.95 0.78-0.87

His13 4.53 3.04 7.83 6.94

His14 4.59 3.01-3.08 7.85 6.96

Gln15 8.44 4.26 1.97-2.06 2.32

Lys16 8.44 4.27 1.67-1.74 1.37 1.44 2.97

Leu17 8.31 4.32 1.57-1.61 1.45 0.85-0.91

Val18 8.04 4.02 1.90 0.75-0.83

Phe19 8.31 4.58 2.91-2.99 7.30 7.17

Phe20 8.27 4.57 2.94-3.09 7.32 7.24

Ala21 8.29 4.22 1.36-1.37

Glu22 8.42 4.21 1.92-2.04 2.27

Asp23 8.48 4.65 2.63-2.74

Val24 8.20 4.15 2.19 0.96

Gly25 8.59 3.98

Ser26 8.22 4.46 3.88

Asn27 8.54 4.74 2.77-2.85

Lys28 7.96 4.16 1.71-1.83 1.39 1.66 2.99

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107

ESI figure S1

Figure S1: Illustration of the kinetic mechanism of amyloid peptide aggregation probed by

fluorescence spectroscopy (top). Experimental aggregation kinetic on Ab28 peptide triggered by zinc

(II) addition (dashed line without Zn and plain line with 250µM Zn(II)) : 10µM ThT, 500 µM Aβ28,

10 mM, phosphate buffer pH 7.4, 25°C.

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108

ESI figure S2

Sample characterizationA) ESI figure S2a

Aggregation kinetic of a solution of Aβ28 (500µM) solution in 10 mM phosphate buffer pH 7.4 and

25 °C reported by ThT fluorescence at different ThT concentrations: 10 µM (plain line), 50 µM

(diamonds), 100 µM (circles) and 140µM (dashed line)

This experiment indicated that in our conditions, Aβ28 peptide is mainly monomeric or oligomeric

since the fluorescence intensity at 12 hours is only about 2% of the fluorescence intensity in the same

conditions but with 250 µM of Zn(II), known to promote aggregation as illustrated in the inset (plain

line).

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109

B) ESI figure S2b

Figure 2b, Time evolution of 1D 1H NMR spectra over 12 hours. Figure I) represents a

superimposition of spectra at t=0 (i.e. immediately after the sample preparation) and at 12 hours

respectively in blue and red colors, in green the difference between the two spectra. Figure II)

corresponds to superposition of the spectra at times 0 and 12 hours (blue and red) zoomed in the

methyl region of Aβ28 amino acids.

Neither signal loss nor line broadening could be observed during 12 hours on Aβ28 demonstrating the

stability of the sample during the experiment. The fairly low fraction of aggregated species detected by

fluorescence spectroscopy is below the limit of sensitivity by NMR spectroscopy.

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110

ESI figure S3

Transferred Noes

Figure 3 represents NOESY spectra of solutions of ThT at 140 µM in 10 mM phosphate buffer pH 7.4

and 25 °C without, panel a), and with 500µM of Ab28, panel b). Figure 4a) displays intra-molecular

NOes for ThT with cross-peaks of opposite sign compared to diagonal peaks, characteristic of positive

Noes, as expected for a molecule of this molecular weight. In presence of Aβ28, we observed

transferred NOes since the sign of the intermolecular ThT cross peaks (asterisk marks) became

positive, acquiring the NOe sign of Aβ28 peptide.

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111

ESI figure S4

Diffusion coefficient measurement

Figure 4 represents NMR signal decay of as function of gradient strength during a stimulated echo

experiment with bipolar gradients; a) Aβ28 (-CH3 of Val24) alone, b) ThT (M1 signal) alone and c)

ThT (M1 signal) in presence of Aβ28. The diffusion coefficient reported within each panel was

determined by fitting the experimental points with a single component exponential decay. We

measured a ThT diffusion coefficient in presence of Aβ28 of 4.5.10-10 m2/s significantly slower than

ThT alone (5.5.10-10 m2/s) but far from the value of Aβ28 at only 1.5.10-10 m2/s (DAβ28). The diffusion

coefficient of the ThT is decreased by its interaction with Aβ28, therefore we measured an apparent

diffusion coefficient (DThT*) due to a fast exchange between ThT free and ThT bound to Aβ28 during

the diffusion delay. Assuming a single diffusing entity for the ThT free, ThT bound and Aβ28 peptide

and that the diffusion coefficient of Aβ is not affected upon ThT binding (DTHTb = DAβ28), we could

calculate a fraction of ThT bound equal to 20 ± 5% using the relation [ThTf]*DThTf + [ThTb]*DThTb =

DThT*.We could thus determine a dissociation constant Kd of ~2 mM.

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112

ESI figure S5

Molecular Dynamic simulations

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113

Figures 5 a-c) represent the trajectory of the molecular dynamic simulation illustrated by t� the

temporal fluctuations of the distance along the 10ns of simulations between: a) the centers of gravity

of ThT methyl group M1 and methyl protons of V18 and A21 residues of Aβ28, b) the centers of

gravity of ThT methyl protons M3 of and methyl protons of Leu17 and V18 residues of Aβ28 and c)

the centers of gravity of the ThT benzothiazole and benzamine aromatic cycles with the aromatic side

chain of F20 and F19 respectively. This trajectory corresponded to the second run where the initial

position of the ThT molecule was placed at the distance of 5 Å between the center of gravity of ThT

and that of 15N, four residues toward the N terminus from the center of the hydrophobic core LVFFA

of Aβ28. The dashed line at 5 Å illustrated the distance compatible with experimental observation of

NOes by NMR spectroscopy. During both simulations, ThT molecule flipped and moved toward the

hydrophobic core LVFFA within 2 ns and remained located at the same region. This is illustrated by

figures 5 d) and e) which represents two snapshots at 2.56 ns and 9.95 ns respectively; the localization

with respect to the hydrophobic cluster (brown color) is stable during 8 ns of simulation but highly

dynamic due to the flexibility of the random coil Aβ28 peptide with transient methyl-methyl or

aromatic- aromatic hydrophobic contacts.

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114

ESI REFERENCES

(1) Glasoe, P. K.; Long, F. A. The Journal of Physical Chemistry 1960, 64, 188. (2) Wu, D. H.; Chen, A. D.; Johnson, C. S. Journal of Magnetic Resonance, Series A 1995, 115, 260. (3) Case, D. A.; Cheatham, T. E.; Darden, T.; Gohlke, H.; Luo, R.; Merz, K. M.; Onufriev, A.; Simmerling, C.; Wang, B.; Woods, R. J. Journal of Computational Chemistry 2005, 26, 1668. (4) Salomon-Ferrer, R.; Case, D. A.; Walker, R. C. Wiley Interdisciplinary Reviews: Computational Molecular Science 2013, 3, 198. (5) Kräutler, V.; van Gunsteren, W. F.; Hünenberger, P. H. Journal of Computational Chemistry 2001, 22, 501.

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Chapitre IV : Agrégation du peptide Aβ28 : RMN vs Fluorescence

de la ThT

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�Chapitre IV. Introduction

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Chapitre IV. Agrégation du peptide Aββ28 :

RMN vs fluorescence de la ThT.

Introduction :

L’une des caractéristiques principales de la maladie d’Alzheimer est le passage du peptide

Aβ sous forme monomérique soluble à une forme agrégée insoluble. L’agrégation du peptide

Aβ est influencée par la présence d’ions métalliques tels que le Zn(II) et le Cu(II) [1-5]. In vivo,

le rôle des ions métalliques est encore à l’état d’hypothèse mais leur influence est clairement

démontré par des expériences in vitro. Par contre, il n’existe pas de consensus dans la

littérature quant à l’impact des ions métalliques sur l’agrégation. Autrement dit, selon les

conditions (pH, concentration, nature du peptide) les ions métalliques peuvent accélérer ou

ralentir l’agrégation et changer les structures ainsi que les quantités relatives des agrégats

formés. Généralement, l’effet du Zn(II) sur la formation des fibres amyloïdes est présent sur

l’étape de nucléation et touche peu l’étape d’élongation (cf § I-D-2-b-ii, p. 57) [5].Un cas bien

étudié dans notre groupe est celui du peptide amyloïdogénique Aβ11-28 où le Zn(II)

déclenche l’agrégation en favorisant l’étape de nucléation [6-8].

Une des techniques spectroscopiques les plus utilisées pour étudier l’agrégation du

peptide Aβ est la fluorescence de la Thioflavine T (ThT) [9-11]. La fluorescence de la ThT est

exaltée lorsqu’elle se fixe sur des agrégats fibrillaires. Cette technique a l’avantage d’être très

simple (addition d’un fluorophore extrinsèque), sensible et peu coûteuse. Cependant, cette

technique a ses limites puisqu’elle ne permet pas, entre autre, d’identifier clairement les

espèces intermédiaires de l’agrégation. Pour pallier à ce manque d’information, la RMN est

un outil bien adapté. En effet, la RMN a permis de caractériser le peptide Aβ sous forme

monomérique (RMN liquide) [12,13] ainsi que sous forme fibrillaire (RMN solide) [14,15].

Cependant, ces différentes études ont été réalisées dans des conditions différentes de celles

du milieu physiologique (pH∼3, présence de détergents, TFE ou DMSO, etc). De plus, qu’en

est-il des espèces oligomériques intermédiaires ? Il n’existe que peu d’informations

structurales concernant ces espèces.

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�Chapitre IV. A-Paramètres influençant la cinétique d’agrégation du peptide Aβ28

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Dans ce chapitre, nous allons étudier l’influence du Zn(II) sur l’agrégation du peptide

Aβ28 par spectroscopie de fluorescence de la ThT. Une fois les conditions expérimentales

optimisées, l’agrégation du peptide a été étudiée par RMN 1H afin d’obtenir des éléments de

réponse quant au mécanisme de l’agrégation et de les corréler à ce qui est observé par

fluorescence. Par ailleurs, l’influence de la ThT, proposée ou supposée inerte dans la

littérature, sur la cinétique d’agrégation a également été étudiée par fluorescence et RMN 1H.

IV-A Paramètres influençant la cinétique d’agrégation

du peptide Aβ28

L’agrégation est dépendante de nombreux facteurs tels que le pH ou la température. Il

est donc important d’étudier les différents facteurs influençant la cinétique d’agrégation. Dans

cette première partie, nous allons présenter l’influence des différents paramètres

expérimentaux sur la cinétique d’agrégation (concentration en peptide et en tampon, pH,

température, agitation, état initial du peptide, interface air-liquide) et ainsi montrer les

difficultés rencontrées pour obtenir des données reproductibles. Ces études ont été menées par

spectroscopie de fluorescence de la ThT.

Remarque liminaire : La valeur des concentrations de ThT utilisées correspond à la

concentration théorique basée sur la masse molaire. Néanmoins, par dosage UV-Visible , il a

été possible de déterminer à posteriori [16] , que la pureté de la ThT est d’environ 70% (cf

Annexe II, p. A-34 ).

IV-A-1 Rappel sur le mécanisme d’agrégation et utilisation

de la fluorescence de la ThT

Le mécanisme exact de l’agrégation n’est pas élucidé. Cependant il existe un

mécanisme communément admis pour les peptides de type amyloïde : le modèle de

nucléation. Ce modèle peut être décrit par trois phases successives : la nucléation,

l’élongation et le plateau. La nucléation correspond à la formation de noyaux à partir de

�

�


��

�

monomères de peptides Aβ, natifs ou non structurés, stabilisés par des liaisons

intermoléculaires. Ces noyaux vont par la suite diriger la croissance de l’agrégation formant

un empilement de peptides structurés en feuillets-β (ou protofibrilles et protofibres). Cette

étape de croissance correspond à la phase d’élongation. Il est admis que le plateau est la phase

finale de l’agrégation : la formation de fibres s’arrête par manque de peptide pour continuer

l’empilement. Cette cinétique a la forme d’une sigmoïde qui est le plus souvent suivie par

l’augmentation d’intensité de fluorescence de la ThT (Fig. IV-1). L’équation de cette

sigmoïde est (Eq. 1):

� � � ��

��

� �� (Eq. 1)

avec � � � la fluorescence à l’instant t, �� la fluorescence de la ligne de base avant

l’agrégation, A l’amplitude, k la vitesse d’élongation, t1/2 temps nécessaire pour atteindre la

moitié de la valeur de l’intensité de fluorescence maximale [8,17].

Lors de ces études, l’intensité de fluorescence au plateau ainsi que la valeur du t1/2

seront particulièrement importantes. De même Δ, temps nécessaire pour passer à 10% à 90%

de l’intensité maximale, sera un paramètre très utilisé dans la suite du manuscrit et qui

s’exprime en fonction de k soit �� . Ces paramètres devraient donc refléter la vitesse

d’agrégation du peptide (Fig. IV-1).

Figure IV-1: Mécanisme d'agrégation du peptide amyloïde et son suivi par spectroscopie de fluorescence de la ThT

�

�


��

IV-A-2 Traitement du peptide Aβ28 à haut pH : vers une

monomérisation

Afin d’obtenir des cinétiques d’agrégation reproductibles, il est nécessaire de partir du

même état initial. L’état le mieux défini des peptides Aβ est le monomère. Ceci semble être

aussi la forme de départ lors de l’agrégation dans la MA, car le peptide est présent sous forme

monomérique soluble dans le cerveau des patients sains. Il est donc important de partir de la

forme monomérique pure afin d’étudier les différents facteurs influençant la cinétique

d’agrégation et d’obtenir des données reproductibles. La présence, même en faible quantité,

de noyaux influence de façon drastique la cinétique d’agrégation du peptide [18].

Une méthode simple et efficace consiste à pré-incuber la solution stock de peptide

Aβ28 à pH ∼12. Ce traitement est supposé suffisant pour monomériser les noyaux présents [8].

Le suivi par fluorescence de la ThT (Fig. IV-2) montre que des échantillons du peptide seul

de la même solution stock, non traité à haut pH, ne présentent pas la même intensité de

fluorescence à t=0 et agrègent à des vitesses différentes dans exactement les mêmes

conditions expérimentales de concentration, pH et température (ronds et carrés noirs). Ces

résultats indiquent une hétérogénéité de taille des pré-agrégats de peptide au niveau de la

solution stock. La même expérience est réalisée à partir d’une solution traitée au préalable à

haut pH. La fluorescence à t=0 est quasiment absente indiquant une absence des pré-agrégats.

De plus, sur 8h aucune augmentation de la fluorescence n’est observée. Ceci est

vraisemblablement dû à l’absence de noyaux qui pourraient déclencher l’agrégation du

peptide monomérique. Le même comportement est retrouvé pour les deux cinétiques

d’agrégation (ronds et carrées rouges). Donc le traitement à pH∼12 permet d’obtenir un

échantillon stock de peptide plus homogène et constitué principalement de peptide

monomérique. Ceci a permis par la suite d’obtenir des expériences plus reproductibles.

�

�


��

T

Toutes les expériences présentées dans la suite du manuscrit ont été réalisées à partir

d’aliquotes de solutions de peptide à environ 2 mM, pré-incubées à pH∼12 et conservées au

congélateur (-20°C).

IV-A-3 Influence de la concentration en peptide Aβ28 sur la

cinétique d’agrégation

Dans cette étude, nous avons utilisé 0.5 équivalent de Zn(II) qui sert de déclencheur de

l’agrégation et dont l’effet sera discuté dans la partie IV-B de ce chapitre. Comme attendu et

comme le montre la figure IV-3 (panneau de gauche), la cinétique d’agrégation dépend de la

concentration en peptide. En effet, plus il y a de peptide et plus l’intensité de fluorescence au

niveau du plateau est importante indiquant que la quantité de fibres formées dépend de la

quantité de peptide initiale.

Figure IV-2: Fluorescence de la ThT au cours du temps du peptide Aββ28 provenant d'un même lot (ronds et carrés) avec (rouge) et sans (noir) préincubation à pH 12.

Conditions expérimentales : [Aβ28]=500µM, [Tampon phosphate]=10 mM, pH 7.4 et [ThT]=10µM, T=25°C

�

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��

Concernant la cinétique d’agrégation, nous observons une accélération de la phase de

nucléation et de la phase d’élongation avec l’augmentation de la concentration entre 100 et

500µM de peptide Aβ28. La figure IV-3 (panneau de droite) représente l’intensité de

fluorescence à t=50h selon la concentration en peptide. La quantité de fibres formées dépend

également de la concentration en peptide initiale mais de façon non linéaire. L’allure de la

courbe (Fig. IV-3, panneau de droite) suggère que la formation de fibres nécessite une

quantité minimale en peptide (i.e. > 100µM) (en deçà d’une concentration critique, il n’y a

pas d’agrégation) et que la concentration en fibres formées n’est pas linéaire avec la

concentration en peptide et/ou Zn(II). L’interprétation détaillée de cette expérience nécessite

des données qui seront déterminées dans la suite de ce chapitre, et sera donc faite dans la

partie conclusion (cf § IV-D, p. 147).

IV-A-4 Influence du pH sur l’agrégation du peptide Aβ28

Comme mentionné précédemment, l’agrégation du peptide Aβ dépend de nombreux

paramètres notamment du pH. Nous avons donc étudié la cinétique d’agrégation du peptide

Aβ28 à pH 6.5 (100mM en tampon Pipes) et pH 7.4 (100mM en tampon Hepes) (Fig. IV-4).

Les tampons Hepes et Pipes font partie de la famille des tampons de Good (tampons

zwitterioniques) et possèdent des propriétés physico-chimiques très proches [19].

Figure IV-3: Fluorescence de la ThT en fonction de la concentration en peptide Aββ28. Conditions expérimentales: [Aβ28]=100 à 500 µM, [Zn(II)]=0.5éq/peptide, [ThT]=10µM

dans 10mM de tampon Phosphate pH 7.4, T=25°C

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De ce fait seule l’influence du pH est évaluée, la nature du tampon ne devrait pas trop

influencer la cinétique d’agrégation dans ce cas. Dans cette étude, nous avons utilisé 0

(courbe rouge) et 0.5 équivalent (courbe noire) de Zn(II) .

A pH 6.5, le peptide sans Zn(II) commence à agréger assez rapidement avec une

cinétique d’élongation relativement lente (courbe rouge). A contrario, à pH 7.4, le peptide

sans Zn(II) n’agrège pas (courbe rouge) sur 90h. A pH 6.5 et 7.4 en présence de Zn(II)

(courbe noire), une augmentation très rapide de la fluorescence de la ThT est observée ainsi

qu’une phase de nucléation courte (cf Fig. IV-4 encadré), t1/2 =1h et 3h à pH 6.5 et 7.4

respectivement. De même, la cinétique d’élongation est très rapide. La nature de ces tampons

ne semble donc pas idéales pour étudier les différentes phases de l’agrégation en particulier à

pH 6.5.

IV-A-5 Effet de la nature du tampon et de sa concentration

sur l’agrégation du peptide Aβ28

Dans le chapitre I, nous avons vu que le Zn(II) favorise l’agrégation du peptide Aβ.

Afin de pouvoir étudier son effet sur l’agrégation, il est nécessaire d’utiliser un tampon

approprié. En effet, certains tampons (comme le TRIS) sont coordinants vis-à-vis des ions

métalliques [20]. Dans ce contexte, nous avons évalué l’effet du tampon et de sa concentration.

Figure IV-4: Fluorescence de la ThT au cours du temps du peptide Aββ28 dans 100 mM de Tampon Pipes, pH 6.5 (à gauche) ou 100 mM de Tampon Hepes, pH 7.4 (à droite) avec (noir) et sans (rouge) Zn(II) entre 0 et 48h.

L’intensité de fluorescence entre 0 et 8h est également représentée indiquant une phase de nucléation très rapide. Conditions expérimentales: [Aββ28]=500µM, [Zn(II)]= 250µM et [ThT]=10µM, T=25°C

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Dans le paragraphe précédent, nous avons établi que la cinétique d’agrégation est dépendante

du pH et que le pH 7.4 nous permet de mieux différencier les phases de ce processus. Nous

avons donc étudié l’effet des tampons Hepes et Phosphate à pH 7,4 (Fig. IV-5). Lors de cette

étude 0.5 équivalent de Zn(II) sont utilisés pour déclencher l’agrégation.

Dans le tampon Hepes, la cinétique d’agrégation démarre instantanément quelle que

soit la concentration en tampon avec une étape de nucléation très courte, ce qui n’est pas le

cas le tampon Phosphate où l’étape de nucléation est beaucoup plus lente. L’allure des

courbes est très proche de la sigmoïde théorique attendue dans le tampon Hepes et 10 mM de

tampon Phosphate. Par ailleurs, plus la concentration en tampon est élevée et plus le t1/2 est

grand quel que soit le tampon. De façon générale, pour une concentration en tampon donnée,

la cinétique d’agrégation est plus lente dans le tampon Phosphate que dans le tampon Hepes.

Enfin, pour les cinétiques d’agrégation dans 50 ou 100 mM de tampon Phosphate, l’allure de

la courbe s’éloigne de la sigmoïde théorique dans notre intervalle de temps.

La différence de comportement entre les deux tampons provient probablement du

pouvoir coordinant des tampons. Les tampons sont des compétiteurs vis-à-vis du peptide dans

la coordination du Zn(II). Le tampon Phosphate est connu pour lier le Zn(II) et entrainer sa

précipitation. Par contre, l’affinité du Zn(II) pour le tampon Hepes est considérée comme très

faible. En conséquence, la quantité de Zn(II) disponible pour se lier au peptide Aβ est plus

faible dans le cas du tampon Phosphate (à concentration égale). Ceci est renforcé par le fait

que l’augmentation de la concentration en tampon a le même effet que la diminution de la

Figure IV-5: Suivi de fluorescence de la ThT au cours du temps en fonction du tampon et de sa concentration. Conditions expérimentales: [Aββ28]=500µM, [Zn(II)]=250µM, [ThT]=10µM dans 10,

50 ou 100mM de tampon Hepes ( à gauche) ou Phosphate (à droite) à pH 7,4, T=25°C.

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concentration en Zn(II) sur la cinétique d’agrégation (cf Fig. IV-9, p. 128). Il est également

possible qu’une précipitation du complexe Zn(II)-phosphate soit observée à des

concentrations élevées en tampon Phosphate, ce qui entrainerait une libération plus lente et

prolongée [21] du Zn(II) dans le tampon Phosphate.

Malgré une interférence plus importante du tampon phosphate que du tampon Hepes

c’est ce tampon qui a été choisi (notamment pour utiliser le même tampon que pour les études

RMN). Cependant, il a été utilisé à une concentration faible pour minimiser son pouvoir

coordinant, concentration qui par ailleurs est la concentration physiologique. Donc, toutes les

études de cinétiques d’agrégation présentées par la suite seront réalisées dans 10 mM de

tampon Phosphate à pH 7,4.

IV-A-6 Effet de la température sur l’agrégation du peptide

Aβ28

La cinétique d’agrégation du peptide Aβ et d’autres peptides amyloïdogéniques

dépend de la température. Nous avons donc mesuré la cinétique d’agrégation du peptide Aβ28

à 25°C et 37°C afin d’évaluer à quel point la température influence le t1/2, i.e la vitesse

d’agrégation. Le pH dépend de la température mais dans ce cas, le changement de pH (± 0.2

unité pH) est négligeable, seul l’effet de la température est mesuré.

La figure IV-6 indique clairement que la vitesse d’agrégation (y compris la phase

d’élongation) augmente avec la température. A 25°C, le t1/2 est de 14h, Δ=15h et passe à

t1/2=5h et Δ=11h à 37°C. La température influence donc fortement la vitesse d’agrégation du

peptide Aβ28. Ces données sont en accord avec les résultats précédemment obtenus par

Kusumoto et al [22].

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A 37°C, l’étape de nucléation est très courte. Il est important de noter que l’intensité

de fluorescence au plateau est la même. Nous avons vu dans le paragraphe IV-A-3 (p. 119)

que l’intensité de fluorescence dépend de la concentration en peptide si la concentration en

ThT n’est pas limitante. Dans les conditions de concentrations utilisées ici, la totalité de la

ThT est intercalée dans les fibres et la température ne modifie pas la quantité de ThT

intercalée mais la vitesse avec laquelle elle s’incorpore dans les fibres.

La cinétique d’agrégation à 25°C permet de mieux différencier les trois phases de la

cinétique d’agrégation comparativement à la cinétique à 37°C. Les études présentées dans la

suite de ce chapitre ont été réalisées à 25°C.

IV-A-7 Effet de l’agitation sur l’agrégation du peptide Aβ28

L’effet de l’agitation a également été évaluée. L’hypothèse est que l’agitation va

favoriser les contacts intermoléculaires pour les fibres relativement longues qui diffusent

lentement ou sédimentent. Ceci pourrait se traduire par une cinétique d’agrégation plus

rapide. La figure IV-7 représente les cinétiques d’agrégation du peptide sans (courbe

pointillée) et avec agitation avant chaque mesure d’intensité de fluorescence (courbe rouge).

Figure IV-6: Fluorescence de la ThT au cours du temps du peptide Aββ28 à 25°C (ligne pointillée) ou 37°C (ligne pleine). Conditions expérimentales: [Aβ28]=500µM,

[Zn(II)]= 250µM, [ThT]=10µM dans 10mM de tampon Phosphate,T=25 ou 37°C.

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Les courbes obtenues sont superposables indiquant que l’agitation dans le fluorimètre

n’est pas suffisante pour avoir un effet sur la cinétique d’agrégation. Il semblerait que

l’agitation favorise la formation de fibres. En effet, il y a une légère augmentation de

l’intensité de fluorescence au plateau dans le cas de l’expérience avec agitation

comparativement à celle obtenue sans agitation. Cependant, cette différence d’intensité étant

inférieure à 5%, elle peut être attribuée à l’erreur expérimentale. L’effet de l’agitation sur la

quantité de fibres formées n’est donc pas directement mesurable par spectroscopie de

fluorescence.

Lors des expériences RMN, le tube est statique. Afin de rester dans les mêmes

conditions et ne pas introduire d’artefact dû à l’agitation de la plaque, toutes les études ont été

réalisées sans agitation.

IV-A-8 Importance de l’interface air-liquide

Le peptide Aβ est amphiphile de par la présence d’un domaine hydrophile (partie N-

terminale) et d’un segment hydrophobe (partie C-terminale). Le peptide Aβ est soluble dans

l’eau sous forme non-structurée [23,24]. Par ailleurs, un milieu riche en lipides comme les

membranes cellulaires accélère le processus d’agrégation [25-27].

Figure IV-7 : Fluorescence de la ThT au cours du temps du peptide Aββ28 sans (courbe noire) et avec agitation (courbe rouge) entre chaque point. Conditions

expérimentales: [Aβ28]=500µM, [Zn(II)]= 250µM, [ThT]=10µM dans 10mM de tampon Phosphate pH 7,4, T=25°

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L’interface entre les membranes cellulaires et le milieu extracellulaire peut être

modélisée par l’interface air/liquide et il est documenté que cette interface influence

l’agrégation [26,28]. Dans ce contexte, nous avons voulu savoir si la surface d’adsorption de

l’interface air/liquide influence la cinétique d’agrégation. Cette surface dépend du type de

plaque utilisée pour la mesure soit 96 soit 384 puits.

Pour un même volume d’échantillon (100µL), la courbe pointillée noire de la figure

IV-8 représente la cinétique d’agrégation du peptide Aβ28 dans une plaque 96 puits (surface

du puit ∼38 mm2) et la courbe rouge la même cinétique dans une plaque 384 puits (surface du

puit ∼11 mm2). La mesure du t1/2 indique 13h pour la cinétique dans la plaque 96 puits contre

20h pour la plaque 384 puits. L’intensité de fluorescence au plateau ne semble pas être

affectée par la différence de surface entre les deux plaques. Il faut noter que la surface de

contact avec le puit est également modifiée entre les deux types de plaques ce qui peut

influencer la cinétique d’agrégation.

Lors des études sur l’effet du Zn(II) et de la ThT sur la cinétique d’agrégation, nous

avons principalement utilisé des plaques 96 puits.

Figure IV-8: Fluorescence de la ThT en fonction du temps du peptide Aββ28 dans la plaque 96 puits (courbe noire) et 384 puits (courbe

rouge).Conditions expérimentales: [Aβ28]=500µM, [Zn(II)]= 250µM, [ThT]=10µM dans 10mM de tampon Phosphate pH 7,4, T=25°

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Conclusions : D’après ces différentes expériences, nous avons pu établir les conditions

expérimentales adaptées pour étudier les trois phases de l’agrégation du peptide Aβ28 et ainsi

essayer de caractériser les espèces intermédiaires formées au cours de ce processus en RMN 1H :

- 500µM en peptide Aβ28 au préalable traité à haut pH afin de le monomériser.

- 10mM en tampon phosphate. Le tampon phosphate ne donne pas de signal en RMN et

permet une cinétique assez lente ce qui va faciliter son étude par RMN.

- pH 7.4 qui permet de mieux contrôler l’agrégation, le peptide seul n’agrégeant pas sans la

présence d’un déclencheur (comme le Zn(II)). En outre, ce pH correspond aux conditions

physiologiques.

- T=25°C qui permet une cinétique d’agrégation assez lente.

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�Chapitre IV. B-Agrégation du peptide Aβ28 en présence de Zn(II)

��

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III-B Agrégation du peptide Aβ28 en présence de

Zn(II)

D’un point de vue structural, l’agrégation du peptide Aβ28 correspond au passage

d’un monomère non-structuré ou « random coil » à des espèces fibrillaires structurées en

feuillets-β. Ce changement de structure va avoir des conséquences sur la fluorescence de la

ThT (comme vu précédemment) mais également sur l’allure des spectres RMN 1H du

peptide. Dans cette troisième partie, nous allons étudier l’effet du Zn(II) sur l’agrégation du

peptide Aβ28 par spectroscopie de fluorescence et également par spectroscopie RMN 1H.

IV-B-1 Suivi d’agrégation par spectroscopie de fluorescence de la ThT

Le Zn(II) est retrouvé en quantité importante dans les plaques amyloïdes [29]. Il a été

établi qu’il favorise l’agrégation. Il est souvent considéré comme un déclencheur [6,7].

L’agrégation du peptide Aβ28 (500µM), en présence de quantités croissantes de Zn(II) (0 à

500µM) a été mesurée par fluorescence de la ThT (10µM) dans 10 mM de tampon phosphate

pH 7.4 (Fig.IV-9, panneau de gauche).

Figure IV-9: Fluorescence de la ThT au cours du temps du peptide Aββ28 en présence de différentes concentrations en Zn(II) par rapport au peptide (à gauche). L’intensité de fluorescence de la ThT au plateau

en fonction de la concentration en Zn(II) est reportée sur la figure de droite. Conditions expérimentales : [Aβ28]= 500µM, [Tampon Phosphate]=10mM pH 7.4 , [ThT]=10µM et

[Zn(II)]= 0 à 500µM, T=25°C

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En absence de Zn(II), il n’y a pas d’augmentation de fluorescence de la ThT indiquant

que le peptide Aβ28 n’agrège pas (courbe pointillée noire) sur une période de 80h. En

présence de Zn(II), une augmentation de la fluorescence de la ThT est observée au cours du

temps, et ce même pour une faible concentration (5µM). Le Zn(II) peut donc être considéré

comme un déclencheur de l’agrégation. De plus, le Zn(II) est promoteur de l’agrégation : plus

la quantité de Zn(II) est importante et plus les phases de nucléation et d’élongation sont

rapides comme le montrent les valeurs du t1/2 et du Δ (Tableau IV-1).

Concentration en Zn(II)

(µM et en nombre d’éq. par rapport au peptide)

5 0.01

10 0.02

25 0.05

50 0.1

100 0.2

250 0.5

500 1

Intensité au plateau 2900 6300 12400 15000 17000 17000 17000

t ½ (h) 29 24 21 15 13 7 7

ΔΔ (h) 45 44 40 27 19 6 6

Tableau IV-1 : Valeurs des t1/2 (h), ΔΔ (h) et intensité de fluorescence de la ThT au plateau en fonction de la

concentration (ou nombre d’équivalent) en Zn(II).

L’intensité de fluorescence au plateau dépend de la quantité de Zn(II). Jusqu’à 25µM

(soit 0.05 éq/Aβ) de Zn(II) l’intensité de fluorescence augmente de façon quasi

proportionnelle avec la concentration en Zn(II). Au-delà, l’augmentation est moins forte et il

semble qu’un plateau soit atteint à partir de 100µM. Normalement, l’intensité de fluorescence

au plateau est considérée comme proportionnelle à la quantité de fibres amyloïdes formées.

Ceci voudrait dire que 100µM (0.2 éq/Aβ) de Zn(II) sont suffisant pour former la quantité

maximale de fibres amyloïdes (ce qui n’implique pas forcément que la totalité du peptide soit

sous forme de fibres). Mais ceci n’est vrai que si la quantité de ThT n’est pas limitante ce qui

n’est probablement pas le cas dans nos conditions (10µM de ThT, 500µM de peptide Aβ28)

En effet, si l’intensité de fluorescence n’augmente plus ce n’est pas le signe que le peptide est

entièrement sous forme de fibres mais que la totalité de la ThT est intercalée dans les fibres

présentes. Ces données indiqueraient alors qu’à 30 µM de Zn(II) (cf Fig. IV-9, panneau de

droite) la totalité de la ThT présente dans l’échantillon, soit 10µM, est intercalée dans les

fibres. En d’autres termes au delà de cette concentration, la valeur au plateau est limitée par la

quantité de ThT (10µM).

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Ces résultats ont amené plusieurs questions: la quantité de ThT insérée dans les fibres

est-elle dépendante de la quantité de Zn(II) utilisée lors de l’agrégation ? Si oui, quelle est la

quantité maximale de ThT qui peut s’insérer dans les fibres ? Est-il alors possible de

déterminer le nombre de molécules de ThT par molécules de peptide ? Des éléments de

réponse à ces questions seront apportés dans la partie IV-C de ce chapitre.

Afin de confirmer que le Zn(II) déclenche et promeut l’agrégation du peptide Aβ28,

les échantillons de peptide incubés pendant 24h avec ou sans Zn(II), préparés dans les mêmes

conditions que celles utilisées lors du suivi de l’agrégation par spectroscopie de fluorescence,

ont été analysés par TEM (Microscopie Electronique à Transmission). En accord avec ce qui

a été observé par fluorescence de la ThT, il n’y a pas de formation de fibres sans Zn(II). De

même, la présence de Zn(II) entraine la formation de fibres d’environ 10 nm de diamètre

(Fig.IV-10). La présence de fibre corrèle avec l’intensité élevée de fluorescence de ThT. En

effet, la ThT possède une bonne affinité pour les fibres amyloïdes, mais interagit peu avec les

agrégats amorphes [30].

Les images obtenues par TEM semblent indiquer que la quantité de fibres formées

semblent dépendante de la quantité de Zn(II). En effet, la quantité de fibres est plus

importante en présence de 250µM de Zn(II) (Fig. IV-10, c) comparativement à la quantité de

fibres en présence de 25µM de Zn(II) (Fig. IV-10, b).

Les données obtenues par spectroscopie de fluorescence et TEM indiquent que le

Zn(II) permet à la fois de déclencher et de contrôler la cinétique d’agrégation du peptide

Figure IV-10: Images TEM obtenues après incubation du Zn(II) pendant 24h. Sans Zn(II) (a), il n'y a pas de fibres contrairement à l'image obtenue en présence de 25 µM de Zn(II) (b) ou

250µM de Zn(II) (c). Conditions expérimentales : [Aββ28]= 500µM, [Tampon Phosphate]=10mM pH 7.4 , [ThT]=10µM et [Zn(II)]=25 ou 250µM, T=25°C

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Aβ28. Cette agrégation conduisant à la formation de fibres amyloïdes. Ceci n’était pas

anticipé car l’impact du Zn(II) sur les peptides Aβ40/42 conduit très souvent des agrégats

amorphes [31]. Il a été proposé que l’effet du Zn(II) dépend de la propension des peptides à

agréger. Pour des systèmes ou des conditions avec une forte tendance à l’agrégation, le Zn(II)

favorise plutôt la formation d’agrégats amorphes (qui peuvent se transformer en fibres

amyloïdes avec le temps) [16,25,32,33] . Par contre pour des systèmes ou conditions avec une

faible tendance à l’agrégation, le Zn(II) peut favoriser la formation des fibres amyloïdes [5].

Ceci est en accord avec les résultats trouvés ici, sachant que le peptide Aβ28 n’agrège pas

sans ajout de Zn(II) (pendant au moins 100h)

De façon à pouvoir caractériser les différents états d’agrégation du peptide Aβ28 par

RMN 1H, nous avons choisi de travailler en présence de 500µM de peptide, 25µM de Zn(II)

et de 10µM de ThT dans 10 mM de tampon phosphate pH 7.4. En effet, dans ces conditions le

t1/2 est de 21h (cf Tableau IV-1, p.129) ce qui permet d’avoir suffisamment de temps pour

enregistrer des expériences RMN complémentaires dans le but d’avoir le plus d’informations

possibles sur les différentes étapes de l’agrégation.

IV-B-2 Agrégation du peptide Aβ28 suivie par spectroscopie RMN 1H

Au cours de l’agrégation du peptide, nous nous attendons à observer plusieurs

changements au niveau des spectres RMN, indiquant à la fois un changement de structure et

de poids moléculaire du peptide, qui sont : en 1D, une perte de signal du peptide

monomérique et/ou un élargissement des pics potentiellement couplés à l’apparition de

nouveaux signaux ce qui se traduira sur la carte NOESY (2D) par la disparition et/ou

l’apparition de nouvelles taches de corrélations. Ainsi, des spectres 1D et 2D (durée

d’accumulation = 17h) ont été enregistrés en alternance sur un même spectromètre RMN

(600MHz). Nous avons vu dans le paragraphe IV-B que la cinétique d’agrégation du peptide

Aβ28 est très influencée par les conditions expérimentales. Afin d’évaluer l’effet de

l’agrégation sur les spectres RMN, les conditions expérimentales sont les mêmes que

précédemment c’est-à-dire 500µM en peptide Aβ28, 25µM en Zn(II), 10µM en ThT dans 10

mM de tampon phosphate pH 7.4 et T=25°C. De cette façon, les données obtenues par RMN

�

�


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et fluorescence devraient être directement comparables. Lors des expériences précédentes,

nous avons montré que le Zn(II) est un déclencheur et promoteur de l’agrégation du peptide

Aβ28 en fibres amyloïdes. Dans cette partie du chapitre, l’agrégation est déclenchée par

l’ajout de Zn(II) ce qui correspondra au t=0.

IV-B-2-a En version 1D

Les signaux du peptide, en présence de Zn(II) (25µM soit 0,05 éq/Aβ28), sont intégrés entre 0

et 50h (temps nécessaire pour atteindre le plateau en fluorescence, cf Tableau IV-1, p. 129).

La superposition des spectres RMN 1D du peptide au cours du temps (Fig.IV-11) n’indique

aucun changement c’est-à-dire qu’il n’y a pas d’apparition de nouveaux signaux. Cependant,

une perte d’intensité de 15% du peptide monomérique est observée sur l’ensemble du spectre

RMN sans observer d’élargissement des signaux.

L’agrégation du peptide Aβ est un processus dynamique dans lequel les espèces

monomériques, oligomériques et fibrillaires sont en équilibre. Cet équilibre va se traduire sur

le spectre RMN 1H par un élargissement des pics du peptide lié à la proportion d’oligomères

(taille > 10 monomères). Ce qui n’est pas le cas ici. Puis au fur et à mesure que la taille des

objets supramoléculaires augmente (oligomères de masse moléculaire élevée, proto-fibrilles et

Figure IV-11: Spectre RMN de la zone aliphatique du peptide Aββ28 en présence de 0.05 éq. de Zn(II) à t=0 (en noir) et t=50h en bleu (à gauche). Représentation de l’intégration des –CH3 de la

l’Ala21 au cours du temps. Conditions expérimentales : [Aββ28]=500µM, [Tampon Phosphate]=10mM, pH 7.4, [ThT]=10µM et [Zn(II)]=25µM, T=25°C

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fibres) l’élargissement des signaux est tel qu’une perte de signal est observée (temps de

corrélation plus long) [34].

Par ailleurs au bout de 50h, aucun précipité n’est observé visuellement au niveau de

l’échantillon indiquant que les espèces ont une taille suffisamment importante pour ne plus

être détectées par RMN liquide sont faiblement présentes ou qu’elles ont trop petites pour

être observées à l’œil nu. Ces résultats sont inattendus. En effet, l’intensité de fluorescence de

la ThT atteint le plateau au bout d’environ 50h (cf Fig.IV-9, p. 128) ce qui indique que le

processus de formation des fibres est terminé. Or par RMN, il semblerait que l’état

d’agrégation du peptide (environ 15%) à t=50h correspond majoritairement à la phase de

nucléation du processus d’agrégation.

La perte de signal de 15% (soit 75µM) du peptide peut correspondre à la formation de

fibres amyloïdes. Il est envisageable que la totalité de la ThT se soit insérée dans les 15% de

peptide monomérique qui ont disparu en RMN sous forme de fibres. Si tel était le cas,

l’augmentation de fluorescence ThT et la perte de signaux 1H en RMN suivraient la même

cinétique. Une autre possibilité est que l’agrégation soit beaucoup plus lente en RMN. C'est-à-

dire que la perte de signal de 15% en RMN ne correspondrait pas seulement à la formation

des fibres amyloïdes mais aussi à d’autres espèces (oligomère ou autre).

Nous nous sommes donc intéressés à l’évolution du peptide, dans le même

échantillon, au-delà des 50h d’incubation en présence des 25µM de Zn(II) à 25°C (Fig. IV-

12). Les spectres ont été enregistrés jusqu’à environ 5,5 jours après l’addition de Zn(II) pour

déclencher l’agrégation.

Figure IV-12: Spectre RMN du peptide Aββ28 en présence de 25µM de Zn(II) à t=0 (noir) et t=5,5 jours (bleu). Conditions expérimentales : [Aββ28]=500µM, [Tampon Phosphate]=10mM, pH 7.4, [ThT]=10µM et

[Zn(II)]=25µM, T=25°C

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Au bout de 5,5 jours, il y a non seulement une perte de signal sur l’ensemble du

spectre mais surtout une perte quasi totale de signaux comme la Val12 et les His13 et 14. Il y

a également des élargissements accompagnés du recouvrement de certains signaux. Les

signaux du peptide monomérique encore identifiables, comme l’Alanine 21 (courbe bleue),

ont été intégrés au cours du temps ainsi que le signal de la Val12 (courbe rouge) (Fig. IV-13).

L’allure de la courbe bleue (Ala21) indique une cassure à t ∼80h qui est visible pour les

signaux des acides aminés du peptide monomérique encore détecté. Cette cassure est

retrouvée à t=50h pour la Val12 (courbe rouge). Concernant le perte de signal sélective

(Val12, His13 et 14), il n’y a pas, à l’heure actuelle, d’explication.

Par ailleurs, l’échantillon présente un précipité au niveau de l’interface air-liquide qui

reste insoluble après passage à pH∼12 ou sonication pendant 10 minutes. Ce précipité est

attribué à la formation de fibres. Plusieurs études ont montré que l’interface air-liquide joue

un rôle important dans l’agrégation du peptide Aβ en fibres amyloïdes. En effet, les espèces

fibrillaires adsorbent fortement à l’interface air-liquide entrainant ainsi un enrichissement en

fibres amyloïdes au niveau de cet interface. Ce phénomène a également été observé par

spectroscopie de fluorescence (cf paragraphe IV-A-7, p. 124) où l’interface air-liquide est un

facteur influant sur la vitesse d’agrégation.

Figure IV-13: Intégration du -CH3 de l'Alanine 21 (en bleu) et –CH3 de la Valine 12 (en rouge) au cours du temps.

Conditions expérimentales : [Aββ28]=500µM, [Tampon Phosphate]=10mM, pH 7.4, [ThT]=10µM et [Zn(II)]=25µM, T=25°C

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D’après les données obtenues en RMN 1D, deux phases se distinguent. Une première

phase, décrite jusqu’à présent, entre 0 et 50h dans laquelle l’échantillon a un comportement

homogène : perte de 15% du signal (75 µM) et pas de signe de formation d’oligomères. La

seconde phase, au-delà de 50h, est plus complexe certainement dû à la présence de plusieurs

espèces. En effet, une perte rapide des signaux des His et de la Val12 est observée ainsi

qu’une perte plus lente des signaux de l’Ala21 et plus généralement de la partie C-Terminale

du peptide. Les changements observés aussi bien sur l’allure des spectres que de l’échantillon

en lui-même semblent dus à la formation de fibres : ces dernières sont insolubles et ne sont

plus détectées par RMN liquide.

De plus, la figure IV-13 ne montre pas de plateau indiquant la fin de l’agrégation du

peptide au bout de 6 jours. Ceci voudrait dire que les cinétiques de formation des fibres

amyloïdes suivies par spectroscopie de fluorescence de la ThT et RMN sont complémentaires.

En effet, la spectroscopie de fluorescence permet de suivre l’évolution de la ThT et la

spectroscopie RMN l’évolution du peptide au cours de l’agrégation. Entre 0 et 50h,

l’augmentation de fluorescence de la ThT indique la formation de fibres qui correspondrait à

la perte de signal de 15% observée par RMN. A partir de 50h, cela devient plus compliqué :

l’intensité de fluorescence n’évolue plus (cf Fig. IV-9, p. 128) et des différences de

comportements sont observées par RMN (cf Fig. IV-13, p. 134)

De par l’hétérogénéité de l’échantillon, il est difficile d’analyser les spectres 1D qui ne

sont pas assez résolus. Pour avoir plus d’information sur les événements (formation des

oligomères, structurés ou pas), des spectres 2D NOESY ont été enregistrés sur le même

échantillon.

IV-B-2-b Analyse des cartes NOESY

L’expérience NOESY permet un transfert d’aimantation entre deux noyaux distants de

5Å (au maximum). Cette propriété fait de la NOESY une expérience adaptée pour évaluer les

changements de structures qui ont lieu au cours de l’agrégation du peptide Aβ. Par ailleurs,

nous avons vu dans le paragraphe II-B-2 (p. 82), que le signe et l’intensité des taches de

corrélations NOE sont sensibles au temps de corrélation τc des protons considérés et donc au

poids moléculaire. Le peptide en formant des dimères, trimères, etc augmente sa masse

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molaire, il est alors important de s’intéresser à l’évolution de l’intensité des taches NOE au

cours du temps.

Avant d’analyser plus précisément l’intensité des corrélations NOEs, nous avons

recherché sur les spectres 2D d’éventuels indicateurs d’une structuration du peptide amyloïde

au cours de la cinétique d’agrégation. Le chemical shift index (CSI) est un procédé qui permet

d’établir la structure secondaire des protéines basée sur les différences de déplacement

chimique par rapport aux déplacements chimiques d’une protéine non-structurée [35]. Cette

méthode peut être appliquée, entre autre, aux protons Hα d’une protéine. Les règles sont

simples : une valeur de +1 est attribuée lorsque le déplacement chimique est plus grand que la

valeur spécifique CSI, une valeur de -1 pour un déplacement chimique plus petit et 0 si le

déplacement chimique se situe dans la gamme de valeur attendue (±0.7ppm). L’analyse des

CSI peut permettre de déterminer la topologie des structures secondaires de la protéine. Une

hélice α est définie par la présence d’au moins quatre valeurs -1 et le feuillet β est caractérisé

par la présence de trois valeurs +1. Dans tous les autres cas, la protéine ne sera pas structurée.

Au cours de l’agrégation, le peptide Aβ passe d’un état non-structuré (random coil = pelote

aléatoire) à une structure en feuillet β. Cette structuration peut donc être visible par mesure

des CSI. A t=0, l’analyse des CSI ne montre pas de structure particulière, les déplacements

chimiques du peptide sont dans la gamme de valeurs attendues (CSI=0 sur l’ensemble du

peptide), le peptide n’est pas structuré. Pendant l’agrégation du peptide, les CSI ne sont pas

modifiés et nous n’avons pas observé l’apparition de nOes caractéristiques de structures

secondaires en particulier de feuillet β, ce qui indiqueraient que le peptide forme des

oligomères non-structurés.

Sur le même échantillon que précédemment, des expériences NOESY ont été

enregistrées sur ∼ 6 jours (en alternance avec les spectres 1D) et les taches de corrélations ont

été intégrées au cours du temps (Fig.IV-14).

L’absence de nouveaux signaux en version 1D, entre 0 et 50h, est retrouvée sur la

carte 2D NOESY : pas de nouvelles de taches de corrélations signe d’un changement

structural stable et significatif tel que la transition vers une forme repliée comme le feuillet-β.

La valeur des intégrales relatives de taches de corrélations par rapport à l’intégrale du TSP

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(étalon interne) sont tracées au cours du temps. L’allure des courbes obtenues nous indique

trois comportements différents :

1) dans un premier temps une augmentation puis une diminution de l’intensité (courbe

violette).

2) l’intensité décroit dès le départ (courbe bleue) à des vitesses différentes

3) pas de changement de l’intensité au début de la cinétique puis une perte d’intensité

(courbe orangée).

Il est important de noter que ces comportements ne sont pas acide aminé dépendant mais

corrélation dépendante. En effet, l’allure de la courbe violette est retrouvée pour les

corrélations impliquant des protons en bout de chaine latérale ou les protons aromatiques

comme par exemple les corrélations de type Hα/Hγ ou Hβ/Hδ. La variation d’intensité des

corrélations de type Hα/Hβ est représentée par la courbe bleue tandis que la courbe orangée

traduit les changements d’intensité des corrélations de type HN-Hα. Une cartographie du

peptide a ainsi pu être établie (Fig. IV-15) reflétant le comportement de chacun des protons

du peptide.

Le signe et l’intensité des taches NOE sont fonction de τc (cf Fig.II-8, p. 85). Le

peptide Aβ28 possède un PM∼3300 g/mol. Les tâches NOE seront donc de signe négatif ce

qui a été confirmé par l’expérience. L’augmentation d’intensité des tâches NOE peut être

interprétée comme une augmentation de poids moléculaire. En effet, plus le poids moléculaire

Figure IV-14 Intégration des taches de corrélations NOESY au cours du temps relativement à l’aire du pic du TSP. La courbe violette représente l'évolution de la corrélation Hδδ /Hβ , la courbe bleue la corrélation Hα /Hβ et la courbe orangée la corrélation HN/Hα de la Phénylalanine 20. Conditions expérimentales :

[Aβ28]=500µM, [Tampon Phosphate]=10mM, pH 7.4, [ThT]=10µM et [Zn(II)]=25µM, T=25°C

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est élevé et plus le temps de corrélation sera long ce qui va se traduire par une intensité du pic

NOE plus importante. De plus, le temps de corrélation reflète la dynamique en solution de la

molécule. Durant l’agrégation, les corrélations de type HN-Hα ne subissent pas de

changement d’intensité car il s’agit des protons du squelette peptidique, ils sont moins

dynamiques que les protons des chaines latérales (courbe orangée). De la même façon, les

protons en bout de chaine latérales sont les plus dynamiques (courbes violette), l’agrégation

conduit le peptide à se structurer, ces protons seront alors moins sujets à la dynamique et les

corrélations seront plus fortes. Concernant les protons de type Hβ (courbe bleue), leur

diminution d’intensité dès le début de l’agrégation indique qu’ils ont une dynamique propre

différente.

La caractérisation des oligomères formés au cours du processus d’agrégation du

peptide Aβ a fait l’objet de nombreuses études [36-41]. Ces études ont rapporté que les peptides

Aβ40 et Aβ42 forment des oligomères constitués de différentes tailles. Il est proposé entre

autre que ces oligomères soient constitués de 2, 4, 6, 12 peptides [41,42]. Par ailleurs, ces

oligomères possèderaient une structure similaire aux fibres c’est-à-dire des feuillets β.

Cependant, il n’y a pas de consensus sur l’orientation de ces feuillets : parallèle ou

antiparallèle. De plus, les feuillets β peuvent se former entre deux peptides (inter-peptide) ou

au sein d’un même peptide (intra-peptide). La caractérisation des espèces oligomériques non-

fibrillaires est difficile à cause de leur nature hétérogène (plusieurs espèces en équilibre) [36].

Des travaux ont apporté quelques informations sur les espèces oligomériques mais les

conditions expérimentales utilisées (solvant organique, détergent,…) [36,39] rendent difficile la

comparaison avec les oligomères obtenus en leur absence. En effet, comme nous l’avons vu

précédemment, l’agrégation est un processus qui dépend énormément des conditions

expérimentales. De plus, la vitesse d’agrégation ainsi que la présence de détergents ou TFE

vont avoir une influence sur la structure secondaire du peptide (hélice α, feuillets-β

parrallèles ou anti-parallèles) [42-44].

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Seule une étude rapporte la caractérisation structurale d’oligomères solubles du

peptide Aβ [40]. Les oligomères ont pu être analysés par RMN et une structure a été proposée

(Fig. IV-16) basée sur l’analyse des NOE en présence de SDS (dodécylsulfate de sodium).

Dans ce modèle, les résidus 18 à 23 forment un côté du feuillet β, antiparallèle, reliés

aux résidus 28 à 33 du même peptide par une forme en épingle à cheveux. Les résidus 34 à 40

forment un feuillet β parallèle entre deux peptides. Les résultats que nous avons obtenus ne

nous permettent pas de déterminer la taille ni la structure des oligomères formés par le peptide

Aβ28. L’analyse de l’intensité des taches NOE a montré des changements de dynamique au

niveau des acides aminés au cours de l’agrégation reflétant la formation d’oligomères entre 0

et 80h. A partir de t=50h, la diminution d’intensité de l’ensemble des taches NOE traduit la

formation de fibres. Les peptides Aβ40 et Aβ42 forment des fibres amyloïdes mais n’agrègent

pas de la même façon, c’est-à-dire qu’ils ne vont pas former le même type d’oligomères [45].

Lors de nos études, nous avons travaillé avec le peptide Aβ28 qui conduit à des cinétiques

d’agrégation plus reproductibles et forment le même type de fibres que les peptides Aβ40 et

Aβ42. Cependant, il est possible que le peptide Aβ28 ne forme pas les mêmes oligomères que

les peptides Aβ40 et Aβ42.

Figure IV-16: Structure proposée des oligomères par Yu et al (réf. [40])

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IV-B-3 Agrégation du peptide Aββ28 caractérisée par

RMN : conclusion

En RMN, l’agrégation du peptide Aβ28 est caractérisée par une consommation du

peptide monomérique (en 1D) sans signe de la formation de nouvelles espèces. En 1H-RMN

et NOESY on peut distinguer deux phases, une qui se déroule entre 0 – 50h, et une seconde à

partir de t = 50h. La deuxième phase semble correspondre à la formation d’agrégats larges

(l’intensité des résonances 1H et des taches de corrélation NOE diminuent de façon générale

et on observe la formation d’agrégats visibles à l’œil nu). Il semble raisonnable d’attribuer

cette phase à la formation de fibres amyloïdes. Pendant la première phase l’évolution du

peptide se traduit par des changements d’intensité des tâches de corrélation NOE qui ne sont

pas acides aminé dépendants mais corrélation dépendants : au sein d’un même acide aminé,

les différents protons ont un comportement différent. Ces changements d’intensité reflètent

les modifications de la dynamique du peptide (τc) au cours de la première phase l’agrégation

et il est alors possible que cette phase corresponde à la formation d’oligomère.

Un des problèmes est que dans nos conditions (500µM Aβ28, 25 µM Zn et 10µM de

ThT) la concentration de ThT est trop faible pour être détectée, par spectroscopie RMN. Donc

pour mieux corréler les spectroscopies RMN et de fluorescence nous avons étudié

l’agrégation en présence de quantité plus importante de ThT afin de pouvoir la détecter par

RMN. La concentration en Zn(II) a également été modifiée (250 µM vs 25 µM) afin

d’augmenter la quantité de fibres formées et la cinétique d’agrégation. De cette façon, il sera

possible de suivre à la fois l’évolution de la ThT et du peptide et ainsi essayer de comprendre

les différences observées entre la RMN et la spectroscopie de fluorescence. De plus, ces

expériences nous permettront de confirmer ou non l’inertie supposée de la ThT sur la

cinétique d’agrégation.

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�Chapitre IV. C-Effet de la ThT sur l’agrégation du peptide Aβ28

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IV-C Effet de la ThT sur l’agrégation d’Aβ28

La fluorescence de la ThT est la technique spectroscopique la plus utilisée pour étudier

l’agrégation du peptide Aβ. Cependant, le mode d’interaction de ThT avec les fibres reste mal

connu. Il est plus largement admis que démontré que la ThT n’interfère pas dans la cinétique

d’agrégation du peptide. Les résultats obtenu précédemment (cf § IV-B) nous ont amené à

étudier l’agrégation d’Aβ28 en présence de concentration de ThT plus importante afin de la

détecter par RMN. Lors de ces études, nous nous sommes intéressés à l’effet de la ThT sur la

cinétique d’agrégation : est-elle réellement inerte sur l’agrégation du peptide Aβ28. Nous

avons donc réalisé une étude de l’effet de la ThT sur la cinétique d’agrégation du peptide

Aβ28 en présence de Zn(II) (250 µM soit 0.5 éq. par rapport au peptide) qui induit la

formation de fibres (cf Fig. IV-9, p.128).

IV-C-1 Etude par spectroscopie de fluorescence

La cinétique d’agrégation a été étudiée en présence de quantité croissante de ThT (Fig.

IV-17). La fluorescence de la ThT, en présence de fibres, est modifiée par des longueurs

d’excitation et d’émission différentes associées à une augmentation importante de son

rendement quantique. Une étude de l’influence de la ThT sur la cinétique d’agrégation du

peptide par fluorescence est difficile, notamment à cause de la concentration en ThT. En effet,

la gamme de concentration utilisable est restreinte : des concentrations trop basses ne

permettent pas la détection et des concentrations trop élevées induisent des problèmes

d’extinction de fluorescence (quenching) et principalement d’inner filter effect (cf § II-A-2-b,

p. 76). De plus, le nombre de site de fixation de ThT par peptide Aβ28 sous forme de fibres

amyloïdes n’est pas exactement connu.

Comme indiqué sur la figure IV-17, pour une concentration de 20µM (bleu clair) en

ThT, l’intensité n’est pas deux fois supérieure à celle obtenue avec 10µM (bleu foncé). Ces

données indiquent que la fluorescence de la ThT est déjà sous-estimée à partir d’une

concentration de 20µM en ThT.

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Cependant, il semblerait que la ThT catalyse la réaction d’agrégation induite par le

Zn(II). Plus la quantité de ThT est importante et plus l’agrégation est rapide (Tableau IV-2)

comme le montre la mesure du t1/2 et du Δ .

Concentration en ThT

(µM ) 10 20 50 100 200

Intensité au plateau 9000 12000 10000 8000 4000

t ½ (h) 35 32 26 18 14

ΔΔ (h) 44 38 30 25 20

Tableau IV-2 : Valeurs des t1/2 (h), ΔΔ(h) et intensité de fluorescence de la ThT au plateau en fonction de la concentration en ThT.

Ces données semblent être en accord avec une étude récente [16]. Ainsi, D’Amico a

mesuré l’effet de la ThT sur la cinétique d’agrégation du peptide Aβ40 à la fois par

fluorescence et par mesure de diffusion de Rayleigh (Rayleigh scattering). Il a ainsi démontré

que la ThT est un déclencheur et un promoteur de l’agrégation. Les données obtenues par

diffusion de Rayleigh indiquent une formation d’espèces ayant des tailles plus importantes

que le monomère. Cependant, ces données ne démontrent pas la formation de fibres

Figure IV-17 : Fluorescence de quantité croissante de ThT au cours du temps du peptide Aββ28 Conditions expérimentales : [Aβ28]=500µM, [Tampon

Phosphate]=10mM, pH 7.4, [ThT]=10 à 200 µM et [Zn(II)]=250µM, T=25°C

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amyloïdes, les objets formés peuvent également correspondre à des agrégats amorphes. De

plus, dans son étude par spectroscopie de fluorescence de la ThT, les cinétiques d’agrégation

n’ont pas l’allure de la sigmoïde attendue. Il n’a pas non plus tenu compte des interférences

en spectroscopie de fluorescence dues à l’utilisation de fortes concentrations de ThT.

IV-C-2 Etude par spectroscopie RMN 1H

Afin de confirmer et d’avoir plus d’information concernant l’influence de la ThT sur

la cinétique d’agrégation, nous avons étudié l’évolution du peptide (Fig.IV-18, panneau de

gauche) et de la ThT (Fig. IV-18, panneau de droite) dans des conditions d’agrégation par

RMN 1H c’est-à-dire en présence de Zn(II). L’utilisation de la RMN va permettre de

s’affranchir des problèmes liés à l’utilisation de quantité importante de ThT en spectroscopie

de fluorescence.

La figure IV-18, panneau de gauche, indique que la ThT catalyse la réaction

d’agrégation du peptide Aβ28 induite par le Zn(II). En présence de 250µM de Zn(II) (soit 0.5

éq/peptide), une consommation de l’ordre de 60% du peptide soit 300µM est observée à 15h.

A t=10h, il y a deux fois plus de peptide qui a réagit avec 200µM de ThT (ronds roses)

comparativement à la cinétique sans ThT (losanges bleus).

Figure IV-18: Evolution au cours du temps du –CH3 de la Valine 24 du peptide Aββ28 (à gauche) en présence de 0.5 éq. de Zn(II) sans ThT (bleu) et en présence 200µM (rose) de

ThT. Le panneau de droite montre l’élargissement du signal à 2.56 ppm de la ThT (astérisque) à t=0 (noir), t=1h (rose) et t=20h (violet) . Conditions expérimentales :

[Aββ28]=500µM, [Tampon Phosphate]=10mM, pH 7.4, [ThT]=0, 50 et 200µM et [Zn(II)]=250µM,T=25°C.

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Le panneau de droite (Fig. IV-18) représente les spectres RMN du peptide Aβ28 en

présence de ThT au cours du temps. Ces données montrent un élargissement des signaux de la

ThT au cours du temps. Au bout de 20h, l’élargissement est tel que le signal n’est plus

détecté. Cet élargissement au cours du temps rend l’intégration du signal difficile et donc la

quantification de la ThT insérée dans les fibres impossible.

Afin de savoir s’il y avait bien eu consommation de la ThT et en quelle proportion,

nous avons donc réalisé une cinétique d’agrégation suivie par spectroscopie UV-Visible. La

ThT seule absorbe à 412 nm et à 450 nm en présence de fibres (cf Fig. II-3, D). Lors de cette

expérience, nous avons utilisé les conditions expérimentales suivantes : [Aβ28]= 500 µM,

[Zn(II)]= 250 µM, [ThT]= 200 µM dans 10 mM de tampon phosphate pH 7,4 à 25°C.

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Figure IV-19 : Panneau de gauche, suivi de la cinétique d’agrégation du peptide Aββ28 en présence de Zn(II) et de ThT par spectrophotométrie UV-Visible. Panneau de droite : déconvolution du spectre

d’absorbance de la ThT à t=15h (courbe rouge) à partir des spectres d’absorbance de la ThT libre (courbe noire) et ThT liée (courbe grise) à 200 µM. Le spectre simulé est représenté par la courbe pointillée bleue.

Conditions expérimentales : [Aβ28]=500µM, [Tampon Phosphate]=10mM, pH 7.4, [ThT]= 200 µM et [Zn(II)]=250µM, T=25°C, �=1mm.

La figure IV-19, panneau de gauche, montre l’augmentation de l’absorbance à 450 nm

au cours de l’agrégation indiquant que la ThT s’intercale dans les fibres formées. Par

combinaison linéaire entre le spectre de la ThT libre (courbe noire) et de la ThT liée (courbe

grise), il a été possible de déconvoluer le spectres UV-Visible obtenu à t=15h après le début

de l’agrégation (courbe rouge, la courbe pointillée bleue représente le spectre simulé) et ainsi

évaluer la proportion de ThT intercalée dans les fibres soit 50%.

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IV-C-3 Effet de la ThT sur la cinétique d’agrégation du

peptide Aββ28 : conclusion

L’effet de la ThT sur la cinétique d’agrégation est très peu étudié. Les résultats que

nous avons obtenus ici indiquent que la ThT n’est pas inerte vis-à-vis de l’agrégation en

accélérant les phases de nucléation et d’élongation (Fig. IV-17).

Ceci complète les données obtenues pas D’Amico et al. [16] qui ont montré que la ThT

accélère la phase d’élongation du peptide Aβ40.

Cette hypothèse reste à confirmer en étudiant la cinétique d’agrégation avec différentes

concentration en ThT par d’autres techniques spectroscopiques comme l’absorbance ou le

dichroïsme circulaire [46] en parallèle de la fluorescence et de la RMN et si possible sur un

même échantillon (pour éviter notamment les effets de bord).

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�Chapitre IV. D-Conclusion générale

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IV-D Conclusion : RMN vs fluorescence dans

l’agrégation du peptide Aβ28 en présence de ThT

Il est maintenant question de savoir s'il est possible de réconcilier les différentes

données obtenues par spectroscopies RMN, UV-Visible et de fluorescence de la ThT. Pour la

suite, il est nécessaire de considérer la concentration en ThT réelle qui correspond à 70% de la

concentration en ThT théorique calculée d'après la masse molaire (cf Annexe II, p. A-34) et

utilisée jusqu'à présent dans le manuscrit.

Nous rappelons d'abord que nous nous sommes placés dans deux situations extrêmes, à

savoir, dans le premier cas, [ThT]0 = 140 µM et [Zn(II)]0 = 250µM et dans le second [ThT]0 =

7 µM et [Zn(II)]0 = 25µM, avec une concentration en [Aβ28] = 500 µM. Il est important de

noter ici que la concentration en peptide influe directement sur la quantité de fibres formées.

En effet, pour une même quantité de Zn(II) et de ThT ([Zn(II) = 50µM, [ThT] = 7µM)), la

formation de fibres, observée par spectroscopie de fluorescence (Fig. IV-20) est beaucoup

plus faible pour [Aβ28] = 100µM que [Aβ28] = 500µM. Plus précisément, une fluorescence

environ 10 fois plus importante est obtenue dans le second cas. C'est pourquoi, nous ne

comparons ici que des données obtenues pour une même concentration en Aβ28, à savoir

[Aβ28] = 500 µM

Par ailleurs, il faut également noter que la concentration en Zn(II) donnée correspond à

la concentration en Zn(II) introduite dans le milieu, ce qui ne correspond pas forcément à la

concentration en Zn(II) réellement disponible pour la coordination au peptide. En effet,

comme démontré par la figure IV-5 (p. 122), une concentration croissante en tampon

phosphate induit une diminution de la quantité de fibres observées par fluorescence à tout

autre paramètre fixé. Nous nous sommes donc placés à la concentration la plus faible possible

pour maintenir un effet tampon (10 mM). Néanmoins, cela ne garanti pas qu’il n’y ait pas une

certaine proportion de Zn(II) coordinée au tampon même à cette faible concentration.

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Revenons à nos deux conditions expérimentales, forte et faible concentrations

conjointement de ThT et de Zn(II). Le premier cas, [ThT]0 = 140 µM et [Zn(II)]0 = 250µM,

est le plus simple à décrire car les concentrations en ThT et en peptides, sous forme fibrillaire,

sont suffisamment importantes pour pouvoir supposer que la réaction entre la ThT et les fibres

est totale (Fig. IV-22). Dans ce cas, nous avons plusieurs informations:

• La disparition des signaux 1H du peptide correspond à une quantité de peptide

d'environ 300µM.

• La disparition des signaux 1H de la ThT correspond à une quantité de ThT d'environ

70 µM. Ceci est déterminé par des spectres UV-Visible où l'incorporation de la ThT

dans les fibres correspond, après déconvolution, à environ 70µM de ThT insérée (λmax

= 450 nm, ε = 51000 cm-1.M-1 [47]) et 70 µM de ThT libre (λmax = 412 nm, ε = 33000

cm-1.M-1) (cf Fig. IV-19, panneau de droite).

Nous pouvons donc déduire qu'en présence de 250 µM de Zn et 500 µM de peptide

Aβ28 monomérique, on forme environ 300 µM de peptide sous forme de fibres (Aβ28fibres).

Dans ces 300 µM de Aβ28fibres, il est possible d'insérer environ 70 µM de ThT. Il faut donc

environ 4 peptides pour former un site de liaison de la ThT. Cette valeur est conforme aux

données proposées dans la littérature : pour 1 site de liaison de la ThT il faut 5 peptides [48,49].

Figure IV-20: Comparaison des cinétiques d'agrégation en présence de 100 et 500µm de peptide Aββ28 une même quantité de Zn(II) , soit 50µM , et de ThT, soit 7 µM dans 10mM de tampon phosphate pH 7,4, T=25°C.

0

5000

1 104

1.5 104

0 10 20 30 40 50Temps (h)

500 μM

100 μM

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Par ailleurs, lors de cette première étude, un effet cinétique de la ThT sur l'agrégation a

été observé par spectroscopie RMN et de fluorescence. En effet, en présence de 140 µM de

ThT la disparition des signaux 1H du peptide est beaucoup plus rapide (Fig. IV-18, t1/2 = 6h

versus 12h, p. 144). Par contre, on note que la quantité de peptide dont les signaux ont disparu

tend vers une même valeur (approximativement. 300 µM). La ThT ne semble donc pas

influencer la quantité de fibres formées.

Par fluorescence (Fig. IV-17, p. 143), la même tendance est observée avec une

diminution du temps de nucléation (t1/2) et d'élongation (Δ). Il faut noter que, bien que les

données ne soient pas directement quantifiables, du fait de la présence de l'inner filter effect

(cf. § II-A-2-b, p. 76), la tendance observée est qualitativement correcte. Afin d'illustrer ce

propos, des calculs ont été effectués avec les données de la figure IV-17 (p. 143) pour les

courbes à 7 µM (soit la concentration théorique de 10µM) et 140 µM (soit la concentration

théorique de 200µM) en ThT. Dans un premier temps, les courbes expérimentales sont

reproduites avec les paramètres suivants : t1/2 = 33 h et k = 0.095 h-1 (soit Δ = 46 h) pour

[ThT] = 7 µM et t1/2 = 14 h et k = 0.25 h-1 (soit Δ = 18 h) pour [ThT] = 140 µM (Fig. IV-22,

panneau de gauche). Dans un second temps, pour tenir compte l'inner-filter effect, la courbe

théorique attendue pour [ThT] = 140 µM est calculée en corrigeant l'inner filter effect.

Pour cela, sachant qu'à 140 µM de ThT, on a inséré 70 µM de ThT dans les fibres, et

supposant que l'inner filter effect est négligeable à [ThT] = 7 µM, une intensité de

fluorescence au plateau 10 fois plus grande à 140 µM qu'à 7µM en ThT est attendue. C'est ce

qui est tracé sur la figure IV-21, panneau de droite. Dans ce cas, les paramètres permettant de

reproduire la courbe théorique sont: t1/2 = 20,5 h et k = 0.3 h-1 (soit Δ = 15 h) pour [ThT] =

140 µM.

0

2 104

4 104

6 104

8 104

1 105

0 10 20 30 40 50 60 70t (heure)

0

2000

4000

6000

8000

1 104

0 10 20 30 40 50 60 70t (heure)

Figure IV-21 : Gauche: reproduction des données de fluorescence de la ThT, pour [Aβ28] = 500µM, [Zn] = 250 µM (points expérimentaux: ronds noirs, [ThT] = 7 µM, ronds pleins ou 140

µM, ronds vides; courbes théoriques : lignes pointillées rouge). Droite: reproduction des données de fluorescence de la ThT, pour [Aβ28] = 500 µM, [Zn] = 250 µM, [ThT] = 140 µM (points expérimentaux: ronds noirs pleins, points théoriques en corrigeant

l'inner filter effect: ronds vides; courbes théoriques : lignes pointillées rouge).

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Néanmoins, les t1/2 déterminés par spectroscopie RMN (∼5h d’après la figure IV-18,

p. 144) et de fluorescence (∼14h d’après le tableau IV-2, p. 143) sont différents, ce qui est

probablement dû aux conditions expérimentales qui sont différentes (tube RMN versus puit de

la plaque utilisée lors des expériences par fluorescence).

Nous venons donc de voir que lorsque la concentration en Zn est importante, la

formation de fibres (holo-fibres) l'est également. Que se passe-t-il lorsque l'on diminue la

concentration en Zn et de ThT?

Dans les conditions utilisées ici ([ThT]0 = 7 µM, [Zn(II)]0 = 25µM et [Aβ28] = 500

µM), il est attendu que le Zn catalyse la formation de fibres d’apo-Aβ28 (apo-fibres), c'est-à-

dire qu'une une faible stoichiométrie de Zn serait capable d’induire l’agrégation d’un grand

nombre d'apo-peptide, ce qui a déjà été observé pour le peptide Aβ11-28 [7]. Dans notre étude,

les informations à notre disposition conduisent à proposer un autre mécanisme (Fig. IV-23) où

le Zn(II) ne joue pas le rôle de catalyseur, mais est juste capable d'induire l'agrégation d’un

peptide par ion Zn(II) ajouté :

(i) La disparition des signaux 1H du peptide correspond à une très faible quantité de

peptide (maximum 75µM) (Fig. IV-11, 132).

(ii) La concentration de fibres formées est d'environ 30 µM (établie à partir du ratio

ThT :peptide de 0,25 déterminé dans le cas d’une forte concentration en ThT et en Zn(II)) ce

qui correspond à la concentration de Zn(II) introduite (Fig.IV-9, panneau de droite, p. 128).

Une première conclusion est donc que, dans nos conditions, la formation d'holo-fibres se fait

Figure IV-22: Schéma illustrant le mécanisme d'agrégation en présence de 250µM de Zn(II) et 140µM de ThT.

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dans une stoechiométrie d'environ 1:1 (Zn(II):Aβ28) et ne déclenche pas la formation d'apo-

fibres. Ceci est appuyé par microscopie TEM où la quantité de fibres dépend de la

concentration en Zn(II) introduite (Fig. IV-10, p. 130). Par spectroscopie de fluorescence le

t1/2 de la formation d'holo-fibres est évalué à 24h (Fig. IV-9, p. 128). Aux concentrations de

ThT et de fibres formées, la ThT n'est pas limitante, et l'inner-filter effect négligeable, la

valeur du t1/2 déterminée par fluorescence est donc correcte. Cette voie est représentée sur la

partie basse de la figure IV-23. Dans ce cas, il faut remarquer que toute la ThT introduite n'est

pas insérée dans les fibres (Fig. IV-9, p.128), ce qui signifie que les concentrations en ThT et

fibres sont dans l'ordre de grandeur de la constante de dissociation (donc cette constante peut

être estimée autour de ~10 µM).

(iii) Par spectroscopie RMN 2D on observe une modification de l'intensité des taches

NOes du peptide au cours des 50 premières heures, puis la disparition de ces taches. Une

interprétation possible est la formation de petits oligomères (t<50h) puis la formation de

fibres non détectables. Une possibilité qui est représenté sur la partie haute de la figure IV-23,

est que les petits oligomères viennent allonger les fibres déjà formées grâce au Zn(II) (holo-

fibres) (voie 1, Fig. IV-23) ou agrège d’une façon indépendante (formation d’apo-fibres

séparées des holo-fibres, voie 2, Fig. IV-23).

Figure IV-23: Schéma illustrant les différents mécanismes d'agrégation qui ont lieu en

présence de 25µM de Zn(II) et 7 µM de ThT.

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Quelles sont les informations obtenues lors ces études ?

(i) A une concentration initiale en peptide Aβ28 monomérique de 500 µM, il est observé pour

deux concentrations très différentes en Zn(II), à savoir 25 µM ou 250 µM, la formation d'une

quantité stœchiométrique de fibres par rapport au Zn(II).

(ii) La liaison de la ThT nécessite environ 4 peptides, soit un nombre de site de 0,25, en

accord avec ce qui est observé pour d'autres peptides Aβ [48,49].

(iii) La concentration en ThT influence la cinétique d'agrégation, avec une accélération des

phases de nucléation et d'élongation. L'obtention de paramètres cinétiques nécessitera une

étude en RMN en fonction de la concentration en ThT et l'analyse des données de

fluorescence en tenant compte de l'inner-filter effect.

Quels sont les enseignements à tirer de ces études ?

Le premier et le plus important enseignement qui ressort de ces différentes études est

la complexité à obtenir des indications quantitatives sur les cinétiques d'agrégation par

spectroscopie de fluorescence de la ThT. Ces difficultés sont intrinsèquement liées à la

technique elle-même. En effet, pour pouvoir relier l'intensité de fluorescence à la quantité de

fibres formées, il faut:

(i) que la quantité de ThT introduite ne soit pas limitante. Pour cela, il y a deux possibilités.

Soit, on se trouve dans des gammes de concentrations qui conduisent à une réaction équilibrée

entre la ThT et les fibres (ici, conditions [ThT]0 = 7 µM, [Zn(II)]0 = 25µM, [Aβ28] = 500

µM), soit on se trouve dans le cas ou la réaction est totale (ici, conditions [ThT]0 = 140 µM,

[Zn(II)]0 = 250µM, [Aβ28] = 500 µM) et il faut alors se placer en léger excès de ThT par

rapport à la concentration en sites. Dans ce dernier cas, la concentration en ThT nécessaire

conduit alors à un fort inner-filter effect, dont il faut tenir compte.

(ii) Une conséquence directe de (i) est qu'il faut connaitre le nombre de site de liaison de la

ThT au peptide et la constante de dissociation, paramètres qui sont en général ceux que l'on

cherche à déterminer..... Ceci est particulièrement illustré par l’interprétation de la figure IV-3

qui est de nouveau représentée ici pour plus de clarté.

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En tenant compte des différentes informations obtenues lors de nos études à savoir :

• l’intercalation d’une ThT pour 4 peptides (en condition non limitante de ThT)

• un Kd de l’ordre de 10µM

• une quantité stoechiométrique de fibres formées par rapport au Zn(II) introduit (à

500µM de peptide),

des intensités de fluorescence au plateau similaires (à 100µM de peptide et 50µM de Zn(II), la

formation de 50µM de fibres permettrait d’incorporer les 7 µM de ThT ) sont attendues, ce

qui n’est pas le cas.

Le paramètre principal permettant d’expliquer l’allure de ces courbes est le changement de

concentration en peptide qui a plusieurs conséquences :

1) Une conséquence directe est que la quantité de fibres ne dépend pas linéairement de la

quantité de peptide initiale[50].

2) Le ratio peptide/tampon évolue également avec la concentration en peptide puisque la

concentration en tampon est constante. Donc la proportion en Zn(II) liée au peptide

(qui dépend directement de ce ratio) est modifiée en fonction de la concentration en

peptide, avec une proportion plus faible aux basses concentrations. Il est difficile de

quantifier la proportion en Zn(II) lié au peptide car la constante d’affinité du

phosphate pour le Zn(II) est mal connue.

Figure IV-3: Fluorescence de la ThT en fonction de la concentration en peptide Aββ28. Conditions expérimentales: [Aβ28]=100 à 500 µM,

[Zn(II)]=0.5éq/peptide, [ThT]=10µM dans 10mM de tampon Phosphate pH 7.4, T=25°C

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3) Les effets de ces deux paramètres, concentration en peptide et proportion de Zn(II)

liée au peptide, s’ajoutent et contribuent à diminuer de façon significative la formation

des fibres. On ne peut donc pas extrapoler linéairement les résultats obtenus à 500µM

de peptide et 250µM de Zn(II), à 100µM en peptide et 50µM de Zn(II) introduit et

déduire que l’on forme 50µM de fibres dans ces dernières conditions (par exemple

mais également valable pour les autres conditions). La quantité de fibres formées est

probablement très en deçà de cette valeur (50µM), ce qui explique pourquoi l’intensité

de fluorescence est plus faible qu’initialement attendue. De plus, la quantité de fibres

formées réellement étant faible, la réaction avec la ThT devient équilibrée et

l’hypothèse d’insertion de 1 ThT pour 4 peptides devient caduque.

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Le second enseignement est donc que pour pouvoir obtenir une description correcte du

mécanisme d'agrégation, le recours à d'autres techniques spectroscopiques est indispensable,

ce qui inclu la spectroscopie UV-Visible, par laquelle il est possible dévaluer la quantité de

ThT liée et la quantité de ThT libre, et la spectroscopie RMN par laquelle on peut évaluer la

quantité de monomère (ou très petit oligomères) et ainsi déduire la quantité de fibres formées

(en supposant que tout se transforme en fibres et pas en autre type d'agrégats).

On pourrait alors se demander pourquoi l'usage de la fluorescence de la ThT est si

répandu. Cela repose en très grande partie sur sa facilité d'utilisation ainsi que sur la

possibilité d'étudier de façon simultanée un grand nombre de conditions sur des fluorimètres

lecteur de plaques. Donc l'obtention d'un grand de données est aisée, leur interprétation étant,

quant à elle, extrêmement complexe.

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�

�Chapitre IV. Bibliographie

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�Chapitre IV. Bibliographie

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Chapitre V : Vers des complexes de

Ru(II) actifs contre la

Maladie d’Alzheimer

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�Chapitre V. Introduction

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Chapitre V. Vers des complexes de Ru(II)

actifs contre la maladie d’Alzheimer.

Introduction :

Des études menées sur le peptide Aβ ont montré que la partie N-terminale, riche en

résidus histidines, est capable de coordiner les ions métalliques tels que le cuivre, le zinc et le

fer (au degré d’oxydation +II) dans les conditions physiologiques. La coordination des ces

ions métalliques implique principalement par les noyaux imidazoles des résidus histidines

(His 6, 13 et 14) ainsi que l’aspartate 1 (via l’amine N-terminale) et va fortement influencer

l’agrégation et la toxicité du peptide Aβ [1].

Une stratégie thérapeutique possible consiste à concevoir une molécule capable

d’empêcher la coordination des ces ions métalliques en occupant spécifiquement les sites de

liaison du cuivre et/ou du zinc au peptide Aβ. Une des approches possible est l’utilisation de

chélateurs du Cu(II) et/ou du Zn(II). Une seconde approche met en jeu des complexes

métalliques qui peuvent être utilisés comme des agents potentiellement capables de modifier

et/ou empêcher la coordination du Cu(II) et du Zn(II) . En effet, le Zn(II) favorise l’agrégation

du peptide Aβ, le remplacer ou modifier sa coordination au peptide pourrait se traduire par

une inhibition ou un ralentissement de la cinétique d’agrégation. De la même façon, substituer

le Cu(II) pourrait avoir un effet à la fois sur la production de ROS (catalysée par le Cu(II)) qui

sont des espèces létales pour les neurones et sur l’agrégation. Contrairement au Zn(II), le

Cu(II) ne déclenche pas et ne promeut pas l’agrégation du Aβ28, nous n’avons donc pas

étudié l’effet des complexes de Ru(II) en présence de Cu(II).

Dans ce contexte, Barnham [2] a développé une série de complexes à base de Pt(II) de

type L-Pt(Cl)2 dans lesquels L est un ligand de type phénantroline (complexes 1, 3 et 6 Fig.

V-1). Des études in vitro ont suggéré que ces complexes (i) se lient aux résidus histidines du

peptide Aβ via la perte des ligands chlorures empêchant ainsi la fixation du Cu(II) et du

Zn(II). (ii) Par conséquent, les complexes inhibent l’agrégation du peptide Aβ42 évaluée par

spectroscopie de fluorescence de la ThT, (iii) inhibent la production de H2O2 générée par le

Cu(II) et mesurée par dosage fluorimétrique. Les études sur lignées cellulaires ont montré que

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#$&

ces complexes inhibent la neurotoxicité induite par le peptide Aβ et les expériences menées

sur des coupes d’hippocampe de souris indiquent une restauration de la potentialisation à long

terme c’est-à-dire la plasticité synaptique qui est importante dans les processus

d’apprentissage et de la mémoire. Lors de ces études, la réactivité du cisplatine a également

été évaluée. Contrairement aux complexes L-PtCl2, le cisplatine, cis-Pt(II)(NH3)2Cl2, n’a

montré aucun effet sur l’agrégation ou la toxicité du peptide Aβ. Ceci indique que le ligand de

type phénantroline confère une certaine spécificité aux complexes L-Pt(II)Cl2 pour le peptide

Aβ. A partir de ces résultats, le mode de coordination des complexes a été proposé [3]. Les

complexes de Pt(II)(Phen)Cl2 se lient au peptide Aβ16 via une interaction non-covalente issue

du stacking π−π entre le ligand de type phénantroline et les résidus aromatiques du peptide.

De plus, les complexes forment un adduit avec le peptide via une liaison de coordination avec

les noyaux imidazoles des résidus histidines. Pour différentes raisons, incluant une faible

biodisponibilité, l’étude de ces complexes in vivo n’a pas été poursuivie

A partir de cette première étude, preuve que le concept d’utiliser des complexes

métalliques fonctionne, d’autres complexes de Pt(II) ont été synthétisés (complexe 4, Fig. V-

1) [4] et leur capacité à empêcher et/ou modifier la coordination des ions métalliques a été

évaluée. Ainsi le complexe cyclométallé Pt(φ-MePy)(DMSO)Cl (complexe 2, Fig. V-1) [5] a

été synthétisé dans l’équipe. Comparativement aux complexes développés par Barnham, le

complexe Pt(φ-MePy)(DMSO)Cl possède une liaison métal-carbone. La capacité de ce

complexe à se lier au peptide Aβ a été évaluée par spectroscopie RMN (1H) et spectrométrie

de masse (en mode ESI) [5,6]. Les résultats obtenus ont montré que ce complexe se lie

spécifiquement aux résidus Glu11 et His13 du peptide Aβ après libération des ligands labiles

DMSO et chlorure.

Une étude RPE de la coordination du Cu(II) au peptide Aβ en présence du complexe

cyclométallé a montré que ce dernier est capable de modifier la coordination du Cu(II).

Néanmoins, cette modification n’est pas suffisante pour empêcher la production de ROS. Les

résidus Glu11 et His13 semblent directement impliqués dans la sphère de coordination du

Pt(II) et liés à sa capacité à inhiber l’agrégation de peptide Aβ induite par le Zn(II) (cf

paragraphe I-D-2-b, p. 56). En effet, ce complexe cyclométallé est capable d’inhiber

l’agrégation du peptide Aβ induite par le Zn(II). L’effet du complexe Pt(φ-MePy)(DMSO)Cl

sur la coordination du Cu(II) et du Zn(II) au peptide Aβ28, et par la suite sur l’agrégation du

peptide et la production de ROS a fait l’objet d’une communication (cf Annexe I-D, p. A-31).

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#$'

Dernièrement, des complexes à base de ruthénium (Ru(II)) ont été proposés comme

alternative à l’utilisation de complexes de Pt(II) (complexe 5 et 7, Fig. V-1). Comme le

platine, le ruthénium est considéré inerte cinétiquement. Une façon d’estimer la vitesse

d’échange des ligands est de comparer la vitesse d’échange de l’eau liée aux ions métalliques.

En effet, des différences de vitesse supérieures à 10 ordres de grandeur peuvent être

observées. Des échanges rapides, i.e d’environ 10-6 s sont observées pour le Cu(II) et le Zn(II)

alors que pour le Pt(II) et le Ru(II) cet échange est de l’ordre de 10+3 s voire plus long dans le

cas du Pt(IV) [7]. En d’autres termes, au niveau biologique, les vitesses d’échange des ligands

du Cu(II) et du Zn(II) peuvent être rapides alors que celles du Pt(II) et du Ru(II) sont souvent

comparables aux vitesses des processus biologiques. De plus, les complexes de ruthénium

possèdent une forte affinité pour les noyaux imidazoles [8] et sont considérés comme étant

moins cytotoxiques comparativement aux complexes de platine. En accord avec ce principe,

Valensin [9] a décrit l’utilisation du complexe fac-Ru(CO)3Cl2(thiazole) (complexe 5, Fig. V-

1) qui est capable de se lier spécifiquement aux histidines du peptide Aβ28 après libération

des ligands thiazole et chlorures (cf § I-D-3-b, p. 63). La formation de l’adduit Ru(CO)32+-Aβ

est alors supposé interférer dans la coordination des ions métalliques, Cu(II) et Zn(II), mais

ceci n’est pas encore établi à ce jour.

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�Figure V-1: Représentation des différents complexes de Pt(II) et de Ru(II) utilisé comme agents

thérapeutiques dans le cadre de la maladie d'Alzheimer.

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#()

En s’inspirant de ces travaux, nous avons choisi d’utiliser des complexes de type

Ru(CO)3Cl(L) avec L= glycine, éthylène diamine, 8-hydroxyquinoline et ses dérivés.

L’utilisation de ces complexes permettrait (i) d’évaluer une modification de la coordination

des ions Cu(II) et Zn(II) après réaction avec le peptide, (ii) éventuellement de libérer des

chélateurs potentiels des ions Cu(II) et Zn(II) après coordination du motif Ru(CO)32+ au

peptide (si la coordination du complexe au peptide induit le départ du ligand). Ceci éviterait la

coordination des ions Cu(II) et Zn(II) sur un autre site du peptide (Fig. V-2). En effet, ces

ligands (glycine, éthylène diamine, 8-hydroxyquinoline et ses dérivés) sont des chélateurs

connus du Cu(II) et du Zn(II)[10-12] dont les constantes d’affinités sont répertoriées dans le

tableau V-1.

Après la présentation de la synthèse de ces complexes, ce chapitre décrit les résultats

obtenus concernant leur réactivité ainsi que celle du complexe [Ru(CO)3Cl2]2 (CORM-2) vis-

à-vis de la coordination au peptide Aβ, leurs capacités à empêcher l’agrégation induite par le

Zn(II) et à inhiber la production des ROS catalysée par le Cu(II).

Tableau V-1: Constante d'affinité (M-2) du peptide Aββ et des ligands de type glycine, éthylène diamine et hydroxyquinoline pour les ions métalliques Cu(II) et Zn(II). (*) valeurs issues de la base de données

NIST.

Peptide

Aββ [13,14] Glycine(*)

Hydroxyquinoline (ML2) [15,16] Ethylène

diamine(*) Clioquinol 8-hydroxyquinoline Acide 5-sulfonic-8-

hydroxyquinoline

Cu(II) 10-10 10-8 10-10 10-14 10-10 10-11

Zn(II) 10-6 10-4 10-8 10-10 10-7 10-6

Figure V-2: Stratégie envisagée avec l'utilisation de complexes de Ru(II) couplés à un ligand chélateur d'ions métalliques

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�Chapitre V. A-Synthèse et caractérisation des complexes de Ru(II)

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V-A Synthèse et caractérisation des complexes de Ru(II) Remarques liminaires : tous les complexes de Ru synthétisés et étudiés en présence de

peptide Aβ sont au degré d’oxydation +II. Par ailleurs, le Ru étant photosensible, toutes les

synthèses ont été réalisées à l’abri de la lumière et sous argon.

V-A-1 Choix des ligands

Les ligands présentés ci-dessous sont des ligands bidentes c’est-à-dire qu’ils possèdent

deux atomes capables de se lier au centre métallique.

V-A-1-a Glycine

Le complexe Ru(CO)3Cl(glycinate) ou CORM-3 (Fig.V-3) est un complexe connu

dans la littérature comme molécule capable de libérer du CO dans les systèmes biologiques

(CORM pour CO Releasing Molecules) [17-19]. Le mécanisme de cette libération n’est pas

exactement connu mais il est proposé que le CO est libéré via la substitution des ligands

chlorure et glycinate par des ligands attracteurs d’électrons comme les thiols. En effet, in vitro

il a été montré cette perte de CO n’est possible qu’en présence de réducteurs comme le

glutathion ou la cystéine [20]. Par ailleurs, ce complexe présente l’avantage d’être hydrosoluble

ce qui va faciliter les études en présence de peptide Aβ.

La capacité, supposée, du CORM-3 à se lier aux noyaux imidazoles (cf p. 64) qui sont

les cibles que nous cherchons à atteindre, ainsi que sa solubilité dans l’eau en font donc un

bon candidat en tant que potentiel agent thérapeutique.

Figure V-3: Représentation du Ru(CO)3Cl(glycinate) ou CORM-3.

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#(*

V-A-1-b 8-hydroxyquinoléine et ses dérivés

Nous avons également choisi de synthétiser des complexes possédant comme ligand (Fig.

V-4) : le clioquinol (CQ) ou 5-chloro-7-iodo-8-hydroxquinoléine, la 8-hydroxyquinoléine

(HQ) (cf § I-D-3-a-ii, p. 59). Ces complexes n’étant pas hydrosolubles, un troisième

complexe avec le ligand l’acide 8-hydroxyquinoléine-5-sulfonique (HQ.SO3H) est également

synthétisé permettant d’obtenir un complexe hydrosoluble.

V-A-1-c Ethylène diamine

L’utilisation de complexes de Ru(II) vectorisés par une molécule d’adressage

spécifique au peptide Aβ est une approche envisageable. La ThT est plus spécifique pour les

espèces fibrillaires du peptide Aβ (cf. Chapitre I, partie B, p. 28). Des modifications

structurales qui lui sont apportées permettent d’obtenir des molécules, comme le PIB

(Pittsburgh compound B), qui sont plus affines pour les espèces oligomériques [21-23]. Les

dérivés de la ThT sont donc des candidats viables pour vectoriser le complexe de Ru(II) au

peptide Aβ.

Nous avons utilisé comme ligand l’éthylène diamine (en) qui peut se lier au Ru(II) via

ses deux groupements amines (cf § V-A-2-b, p. 165). De plus, ses groupements -CH2 peuvent

être fonctionnalisés par des dérivés de la ThT par la réaction de Mitsunobu, par exemple,

après protection des fonctions amines (de l’éthylène diamine et du dérivé de la ThT) et via

une fonction hydroxyle. Une étape de déprotection permettra d’obtenir le ligand désiré (Fig.

V-5). La synthèse de ce type de ligand a fait l’objet du stage post-doctoral de Sabrina Noël.

Figure V-4: Représentation des ligands de type hydroxyquinoléine utilisé : le clioquinol, la 8-hydroxyquinoléine et l'acide 8-hydroxyquinoléine-5-sulfonique.

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#(+

Dans un premier temps, le complexe avec l’éthylène diamine a été synthétisé (Fig. V-

6) et étudié en présence de peptide. Le complexe formé est un complexe chargé soluble dans

l’eau.

Tous les complexes synthétisés et étudiés en présence du peptide Aβ sont des

complexes de type Ru(CO)3Cl(L) avec L ligand bidente de nature anionique ou neutre.

Figure V-5: Exemple de fonctionnalisation de l'éthylenediamine (en bleu) par un dérivé de la ThT (en rouge) via la réaction de Mitsunobu.

Figure V-6: Représentation du complexe [Ru(CO)3Cl(en)]+Cl-

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#(,

V-A-2 Synthèse et caractérisation des complexes de Ru(II)

V-A-2-a Synthèse des complexes

Les complexes ont été obtenus selon la même voie de synthèse (Fig. V-7, A) à partir

du dimère [Ru(CO)3Cl2]2 en solution dans le MeOH après addition d’un équivalent de ligand

par centre métallique. Dans le cas de la synthèse en présence de glycine ou des

hydroxyquinolines, les fonctions acide carboxylique, phénol et acide sulfonique ont été au

préalable déprotonées par l’ajout de NaOEt. La synthèse de chacun de ces complexes est

détaillée en Annexe III (p. A-43 à A-46). Nous avons ainsi obtenu cinq complexes représentés

sur la Fig. V-7, B.

La synthèse du Ru(CO)3Cl(glycinate) conduit à la formation d’un produit secondaire

le complexe [Ru(CO)2(CO2H)Cl(glycinate)]-. Plusieurs conditions expérimentales ont été

essayées afin d’améliorer la pureté du produit (cf Annexe III, p. A-39). Cependant, aucun de

ces essais n’a permis d’obtenir le produit désiré de façon exclusive (d’après les données

RMN). Dans la suite du chapitre, les études en présence du peptide ont été réalisées avec le

complexe le plus pur possible (<10% d’impureté) qui a été obtenu selon la voie de synthèse

décrite précédemment (Fig. V-7, A).

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Figure V-7: A) Voie de synthèse générale des complexes Ru(CO)3Cl(L). B) Représentation schématique des différents complexes obtenus selon la voie de synthèse décrite en A).

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#($

V-A-2-b Structures cristallographiques

Des cristaux des complexes Ru(CO)3Cl(CQ) et Ru(CO)3Cl(HQ) ont été obtenus par

diffusion lente de pentane dans des solutions de complexes dans le méthanol. Les structures

cristallographiques de ces complexes sont présentées sur la Figure V-8. Les complexes sont

de géométrie octaédrique où l’ion Ru(II) est hexacoordonné par 3 atomes de carbone des trois

ligands carbonyles ainsi que par 1 ion chlorure, 1 atome d’oxygène et un atome d’azote du

ligand pour compléter sa sphère de coordination (Fig. V-8, à gauche et au milieu). Ces

complexes sont de géométrie fac, c’est-à-dire que les trois ligands carbonyles occupent une

face de l’octaèdre. Par ailleurs, les distances Ru-ligands (reportées dans le tableau V-1), sont

très proches de celles du CORM-3 (Fig. V-8, à droite) [25].

Les valeurs des principales distances et des angles sont reportées pour les deux

complexes dans le Tableau V-2. Les distances sont similaires à celles décrites dans la

littérature pour des complexes de type fac avec des ligands carbonyles [25,26].

Figure V-8: Structures cristallographiques des complexes Ru(CO)3Cl(HQ) (à gauche) et Ru(CO)3Cl(CQ) (au milieu). La structure cristallographique du CORM-3 (à droite) est

issue de la référence [25].

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#((

fac-Ru(CO)3Cl(CQ) (Å)

fac-Ru(CO)3Cl(HQ) (Å)

CORM-3 (Å)

Ru(1)-N(1) Ru(1)-O(4) Ru(1)-Cl(1) Ru(1)-C(1) Ru(1)-C(2) Ru(1)-C(3)

2.092(5) 2.063(4) 2.3998(15) 1.929(7) 1.923(7) 1.900(7)

2.1009(11) 2.0587(9) 2.4103(4) 1.9185(14) 1.9233(13) 1.9231(13)

2.117(3) 2.069(2) 2.4083(8) 1.903(3) 1.943(3) 1.903(3)

C(1)-O(1) C(2)-O(2) C(3)-O(3)

1.131(7) 1.131(8) 1.133(7)

1.1243(17) 1.1283(16) 1.1190(17)

1.135(4) 1.118(4) 1.127(4)

(°) (°) (°) C(1)-Ru(1)-C(3) C(3)-Ru(1)-C(2) C(1)-Ru(1)-N(1) C(2)-Ru(1)-N(1) O(4)-Ru(1)-N(1) C(1)-Ru(1)-Cl(1) C(2)-Ru(1)-Cl(1) N(1)-Ru(1)-Cl(1)

95.8(3) 91.6(3) 167.2(2) 98.6(2) 80.11(17) 88.39(18) 86.15(19) 85.91(13)

95.18(6) 94.96(5) 169.56(5) 99.18(5) 80.41(4) 89.03(4) 86.33(4) 87.62(3)

90.56(14) 94.76(14) 173.89(12) 94.87(12) 81.33(9) 92.78(10) 87.29(10) 84.69(7)

Tableau V-2: Principales distances (Å) et angles (°) pour les complexes Ru(CO)3Cl(CQ), Ru(CO)3Cl(HQ et Ru(CO)3Cl(glycinate) ou CORM-3 [25].

L’échange des contre-ions chlorures du complexe [Ru(CO)3Cl(en)]+Cl- par des ions

hexafluorophosphate (PF6-), nous a permis d’obtenir des cristaux dans le méthanol du

complexe [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- (Fig. V-9). La structure nous indique que le complexe est de

géométrie octaédrique où l’ion Ru(II) central est hexacoordonné par 3 atomes de carbone

issus des trois ligands carbonyles ainsi que par 1 ion chlorure et 2 atomes d’azote issus du

ligand éthylène diamine. Comme pour les complexes précédents, le complexe est de

géométrie fac.

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#(%

Par ailleurs, les distances Ru-ligands, sont proches de celles du

Ru(CO)2Cl2(N,N,N’,N’-tetra-méthyléthylène diamine) [27] (reportées dans le tableau V-3).

Cependant, le complexe [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- possèdent des longueurs de liaisons plus

proches de la géométrie octaédrique comparativement au complexe Ru(CO)2Cl2(N,N,N’,N’-

tetra-méthyléthylène diamine) qui possède une géométrie octaèdrique déformée .

fac-[Ru(CO)3Cl(en)]+PF6-

(Å)

Ru(CO)2Cl2(N,N,N’,N’-tetra-méthyléthylenediamine)

(Å) Ru(1)-N(1) Ru(1)-N(2) Ru(1)-Cl(1) Ru(1)-C(1) Ru(1)-C(2) Ru(1)-C(3)

2.118(9) 2.139(9) 2.403(3) 1.938(12) 1.938(13) 1.929(12)

2.220(2) 2.211(2) 2.413(2) 1.872(3) 1.872(2)

Ru(1)-Cl(2) 2.408(2) C(1)-O(1) C(2)-O(2) C(3)-O(3)

1.123(14) 1.120(14) 1.106(14)

1.133(3) 1.134(3)

(°) (°)

C(1)-Ru(1)-C(2) C(1)-Ru(1)-N(1) C(2)-Ru(1)-N(1) C(1)-Ru(1)-N(2) C(2)-Ru(1)-N(2) N(1)-Ru(1)-N(2) C(1)-Ru(1)-Cl(1) C(2)-Ru(1)-Cl(1) N(1)-Ru(1)-Cl(1) N(2)-Ru(1)-Cl(1)

92.7(5) 93.7(5) 172.5(5) 172.5(5) 93.5(4) 79.8(4) 90.2(4) 89.9(4) 86.2(3) 85.5(3)

91.90(11) 92.33(10) 175.71(8) 174.94(8) 93.04(10) 82.75(9) 88.66(9) 88.29(9) 92.53(8) 90.38(8)

Tableau V-3: Principales distances (Å) et angles (°) pour les complexes [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6

- et Ru(CO)2Cl2(N,N,N’,N’-tetra-méthyléthylène diamine)

Figure V-9: Structure cristallographique du complexe [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6

-.

�

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#(&

V-A-2-c Spectroscopies UV-Visible et fluorescence

Les complexes ont été caractérisés par UV-Visible et spectroscopie de fluorescence,

les valeurs obtenues sont présentées dans le tableau V-4.

Complexe

(solvant)

Ru(CO)3Cl(glycinate)

(eau)

Ru(CO)3Cl(CQ)

(DMSO)

Ru(CO)3Cl(HQ)

(DMSO)

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)

[Ru(CO)3Cl(en)]+

PF6- (eau)

UV-Visible

λλmax

(nm) 270 (épaulement) 427 412

385 (eau)

415 (DMSO)

235 (Epaulement)

280 (Epaulement)

εε

(M-1.cm-1) 210 5100 7600

5400 (eau)

4300 (DMSO)

3800 à 235 nm

1950 à 280 nm

Fluorescence

λλ excitation

max

(nm)

427 412 385 (eau)

415(DMSO)

λλ émission

max

(nm)

535 498 590 (eau)

510 (DMSO)

Tableau V-4: Caractérisation par spectroscopie UV-Visible et de fluorescence des complexes de Ru(II) synthétisés.

La propriété anti-agrégation de ces complexes et leur capacité à modifier la

coordination du Cu(II) ainsi que du complexe [Ru(CO)3Cl2]2 (ou CORM-2) au peptide Aβ28

ont d’abord été évaluées avant de s’intéresser de plus près à leur interaction avec le peptide.

Le complexe [Ru(CO)3Cl2]2 (ou CORM-2) a aussi été évalué. Lors des différentes études

présentées dans la suite de ce chapitre, la quantité de CORM-2 additionnée est deux fois

moins importante de façon à conserver le ratio un Ru(II) pour un peptide Aβ.

�

�

�Chapitre V. B-Effet des complexes de Ru(II) sur l’agrégation

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#('

V-B Effet des complexes de Ru(II) sur l’agrégation

V-B-1 Conditions expérimentales

V-B-1-a Choix du fluorophore

L’effet des complexes Ru(CO)3Cl(glycinate), [Ru(CO)3Cl(en)]+Cl- et [Ru(CO)3Cl2]2

sur l’agrégation du peptide Aβ28 induite par le Zn(II) a été évaluée par spectroscopie de

fluorescence de la ThT. Les complexes Ru(CO)3Cl(CQ), Ru(CO)3Cl(HQ) et

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) absorbent dans la zone d’excitation de la ThT (λexcitation = 440 nm). Les

complexes peuvent alors empêcher la détection de la fluorescence de la ThT (inner filter effet,

(cf § II-A-2-b, p. 76). L’absence de fluorescence ne traduit alors pas l’absence d’agrégation

du peptide Aβ28. L’effet de ces complexes sur l’agrégation a donc été mesuré par

spectroscopie de fluorescence du Nile Red (λexcitation = 520 nm ; λémission = 580 nm) qui peut

également être utilisé pour la détection des fibres amyloïdes [28]. En effet, dans ce cas il n’y a

pas de recouvrement des longueurs d’onde (Nile Red et complexe de Ru(II)). La figure

indique une augmentation de fluorescence du Nile Red avec une allure similaire à celle

observée dans le cas de la ThT (Fig. V-10).

Figure V-10: Fluorescence de la ThT (à gauche) et du Nile Red (à droite) en fonction du temps du peptide Aββ28 en absence (ligne pointillée) et en présence de Zn(II) (ligne

pleine). Conditions expérimentales: [Aβ28]=500µM, [Zn(II)]=250µM, [Fluorophore]=10µM dans 10mM de tampon phosphate, pH 7,4, T=25°C

�

�


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#%)

L’effet des complexes de type Ru(CO)3Cl(XQ) sur la cinétique d’agrégation du

peptide Aβ28 induite par le Zn(II) sera donc évalué par spectroscopie de fluorescence du Nile

Red.

V-B-1-b Effet du DMSO

Dans le chapitre IV, nous avons vu que l’agrégation du peptide Aβ est très sensible à

l’environnement. Les complexes de [Ru(CO)3Cl2]2, Ru(CO)3Cl(CQ) et Ru(CO)3Cl(HQ)

n’étant pas solubles dans l’eau, une solution stock de ces composés a été préparée dans le

DMSO. L’effet du DMSO sur la cinétique d’agrégation du peptide Aβ28 a donc été mesuré

par spectroscopie de fluorescence de la ThT (Fig. V-11).

Par spectroscopie de fluorescence de la ThT, le t1/2 est de 4h (courbe (b)) et de 6h

(courbe (c)), en absence et en présence de DMSO respectivement. De même, en absence ou

en présence de DMSO, la valeur du paramètre Δ est de 8 et 10h respectivement. Il semble

donc que le DMSO impacte la cinétique d’agrégation. En présence de DMSO, le peptide

agrège plus lentement qu’en son absence [29] (modification des phases de nucléation et

d’élongation). Il est donc nécessaire d’enregistrer une cinétique d’agrégation du peptide Aβ28

en présence de quantité équivalente de DMSO (v/v) de façon à pouvoir évaluer le réel impact

des complexes synthétisés sur la formation de fibres amyloïdes. La question de l’effet du

DMSO sur la cinétique d’agrégation ne sera pas plus discutée dans ce manuscrit.

Figure V-11: Fluorescence de la ThTen fonction du temps du complexe Aββ28-Zn en absence (courbe b) et en présence (courbe c) de DMSO. La courbe a représente la

fluorescence de la ThT pour le peptide Aββ28 seul. Conditions expérimentales : [Aβ28]=500µM, [Zn(II)]=250µM, [ThT]=10µM, 5% de DMSO (v/v) dans 10mM de

tampon phosphate, pH 7,4, T=25°C.

�

�


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#%#

V-B-2 Effet des complexes Ru(CO)3Cl(L) sur la cinétique

d’agrégation du peptide Aββ28

Le Ru(II) étant considéré inerte d’un point de vue cinétique, les complexes sont

incubés en présence du peptide pendant 12h à température ambiante et sous agitation

« modérée » avant le déclenchement de l’agrégation par l’ajout de Zn(II) (cf § IV-B-1, p.

128). Par ailleurs, le complexe Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) est solubilisé à la fois dans l’eau et dans

le DMSO (Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO, dans les mêmes conditions que les complexes

Ru(CO)3Cl(CQ) et Ru(CO)3Cl(HQ) de façon à pouvoir comparer les trois complexes de

Ru(II) de type Ru(CO)3Cl(XQ)). Par ailleurs, nous avons vérifié que les complexes de Ru(II)

en présence du peptide, sans Zn(II), n’induisent pas l’agrégation.

V-B-2-a Par spectroscopie de fluorescence : résultats

La figure IV-12 est donc divisée en quatre parties. Les panneaux A et B représentent

les cinétiques d’agrégation du peptide Aβ28 suivie par fluorescence de la ThT et du Nile red

en présence des complexes solubilisés dans l’eau (Ru(CO)3Cl(Glycinate),

[Ru(CO)3Cl(en)]+PF6-, Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)) respectivement. De même, les panneaux C et D

représentent les cinétiques d’agrégation du peptide Aβ28 par fluorescence de la ThT et Nile

Red des complexes solubilisés dans le DMSO ([Ru(CO)3Cl2]2, Ru(CO)3Cl(CQ),

Ru(CO)3Cl(HQ) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO) respectivement.

La figure IV-12 montre qu’en absence de Zn(II) il n’y a pas d’augmentation de la

fluorescence de la ThT ou du Nile Red signe de la formation d’espèces fibrillaires. L’addition

de 0.5 équivalent de Zn(II), en absence ou en présence de DMSO (courbes (a) et (a’)

respectivement), conduit à la formation de fibres amyloïdes qui se manifeste par

l’augmentation d’intensité de fluorescence de la ThT et du Nile Red. Le panneau A indique

clairement que le complexe [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- n’a aucun effet sur l’agrégation du peptide

Aβ28 (courbe (c)). Cette absence d’effet est le signe que le complexe n’est pas capable

d’empêcher la coordination du Zn(II), responsable de l’agrégation. Ce même effet est retrouvé

avec le complexe Ru(CO)3Cl(CQ) (courbe (f), panneau D). De plus, le complexe

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) solubilisé dans l’eau (panneau B, courbe (d)) ne semble pas voir d’effet

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sur l’agrégation du peptide. Ce manque de réactivité est surprenant, il était attendu une

meilleure réactivité dans l’hypothèse où le ligand serait libéré.

A contrario, le complexe Ru(CO)3Cl(glycinate) ralentit fortement la formation de

fibres (t1/2= 8h contre 4h sans le complexe) et sa présence semble également avoir un effet sur

la quantité de fibres formées puisque l’intensité de fluorescence est 4 fois moins importante

qu’en son absence (panneau A, courbe (b)).

Les complexes [Ru(CO)3Cl2]2 (panneau C, courbe (e)), Ru(CO)3Cl(HQ) (panneau D,

courbe (g)) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO (panneau D, courbe (h) inhibent l’augmentation

d’intensité de fluorescence de la ThT ou du Nile Red ce qui se traduit par une inhibition de

l’agrégation du peptide Aβ28.

Figure V-12: Fluorescence de la ThT (panneau A et C) et du Nile Red (panneau B et D) en fonction du temps du peptide Aββ28 (courbe pointillée), Aβ28-Zn (a), Aβ28-Zn en présence de DMSO (a'), de Ru(CO)3Cl(glycinate) (b), [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6

- (c), Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) (d), [Ru(CO)3Cl2]2 (e), Ru(CO)3Cl(CQ) (f), Ru(CO)3Cl(HQ) (g) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO (h) . Conditions expérimentales :

[Aββ28]= 500µM, [Zn(II)]= 250µM, [Fluorophore]= 10µM [Ru(II)]= 500µM, 5% DMSO (v/v) dans 10 mM de tampon phosphate pH 7,4, T=25°C.

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V-B-2-b Discussion

Résultats

Composés Solvant t1/2 (h) ΔΔ (h) Intensité de fluorescence au plateau (R.F.U)

Ru(CO)3Cl(glycinate) eau 8 15 8000

[Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- eau 4 7 2800

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) eau > 12 > 20 > 1500

[Ru(CO)3Cl2]2 DMSO nd nd 0

Ru(CO)3Cl(CQ) DMSO > 12 > 16 > 1200

Ru(CO)3Cl(HQ) DMSO nd nd 0

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) DMSO nd nd 0

Tableau V-5: Effet des complexes de Ru(II) sur la cinétique d'agrégation du peptide Aββ28 induite par le Zn(II) (nd pour non déterminé).

D’après le tableau V-5, les complexes ([Ru(CO)3Cl2], Ru(CO)3Cl(HQ) et

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)) dans le DMSO sont capables d’inhiber l’agrégation du peptide induite

par le Zn(II) ce qui indiquerait que ces complexes occupent les principaux sites de

coordination du Zn(II), i.e les histidines, induisant soit une décoordination du Zn(II) soit une

modification du site de coordination du Zn(II).

Concernant le complexe Ru(CO)3Cl(HQ.SO3), la différence de réactivité du complexe

solubilisé dans l’eau ou le DMSO est inattendue. La solubilisation du complexe

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) dans le DMSO conduirait à la formation d’une espèce plus réactive

capable de modifier la coordination du Zn(II) et par la suite l’agrégation du peptide.

Nous avons pu établir que certains des complexes de Ru(II) synthétisés ont un effet

sur la cinétique d’agrégation du peptide Aβ28. Ces complexes semblent donc capables de

modifier la coordination du Zn(II) au peptide Aβ28. Mais qu’en est-il de la coordination du

Cu(II) ?

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� Chapitre V. C-Effet des complexes de Ru(II) sur la coordination du Cu(II) au peptide Aβ28

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V-C Effet des complexes de Ru(II) sur la coordination du Cu(II) au peptide Aββ28.

V-C-1 Rappel sur la coordination du Cu(II) au peptide Aβ

Dans le chapitre I, nous avons vu que la coordination du Cu(II) est dépendante du pH.

A pH physiologique, les deux espèces (I et II) coexistent, avec l’espèce I qui est

majoritairement présente par rapport à l’espèce II (Fig. V-13, (A)). Ces deux espèces

présentent des signatures spectroscopiques différentes, notamment visibles par spectroscopie

RPE (Résonnance Paramagnétique Electronique), reflétant un environnement chimique

différent (Fig. V-13, (B)) [30]. La composante I est un complexe pyramidal à base carrée qui

fait intervenir dans le plan équatorial une amine (Asp1), deux imidazoles (His6 et

His13/His14) et la fonction carbonyle d’une liaison peptidique. En ce qui concerne la position

apicale, le site de coordination est toujours débattu mais il est proposé l’implication d’une

fonction carboxylate (Asp1, Glu3, Asp7 ou Glu11) [31] ou d’une molécule d’eau [32].

La composante II possède un environnement différent de la composante I : le plan équatorial

est constitué d’une amine (Asp1), un imidazole (His6 ou His13 ou His14), une fonction

amide déprotonée (Asp1-Ala2) et un groupement carbonyle (Ala2-Glu3). La fonction

carboxylate de l’Asp1est proposée pour la position apicale.

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Figure V-13: Représentation des composantes I et II du complexe Aββ-Cu(II) (A) et de leurs signatures RPE (B).

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V-C-2 Effet des complexes de Ru(II) sur la coordination du Cu(II) au peptide Aββ28

L’effet des complexes de Ru(II) sur la coordination du Cu(II) au peptide Aβ28 a donc

été évalué par RPE. Le Ru(II) étant cinétiquement inerte les complexes sont incubés, à

température ambiante, sous agitation « modérée » avec le peptide pendant 12h avant l’ajout

du Cu(II). Par ailleurs, le Ru(II) est diamagnétique et ne peut donc être détecté par RPE. Seuls

les changements au niveau de la sphère de coordination du Cu(II) sont visibles.

La figure V-14, (A) montre les résultats obtenus concernant l’effet des complexes

Ru(CO)3Cl(glycinate), Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) et [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- solubilisé dans l’eau et

l’effet des complexes solubilisés dans le DMSO soit [Ru(CO)3Cl2]2, Ru(CO)3Cl(CQ),

Ru(CO)3Cl(HQ) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO est représenté sur la figure V-14, (B). De la

même façon que lors des expériences d’agrégation, la signature spectroscopique du complexe

Aβ28-Cu(II) est enregistrée en présence de DMSO (courbe a’), panneau B comme contrôle

dans les mêmes conditions). Les complexes Ru(CO)3Cl(glycinate), Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) et

[Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- (courbes b, c et d, panneau A) modifient la signature RPE de l’espèce

Aβ-Cu(II) avec des proportions différentes ( cf Tableau V-6).

Figure V-14: Signature RPE du complexe Aββ28-Cu(II) (a) en présence de DMSO (a'), du Ru(CO)3Cl(glycinate) (b) ,Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) (c), du [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6

- (d), [Ru(CO)3Cl2]2 (e), Ru(CO)3Cl(CQ) (f), Ru(CO)3Cl(HQ) (g), Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO (h). Conditions expérimentales :

[Aββ28]= 1mM, [Cu(II)]= 1mM, [Ru(II)]= 1mM dans 10mM de tampon Hepes, pH 7,4, 5%DMSO (v/v) et 10% de glycérol (v/v), T= 115K.

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Eau Aββ28 Ru(CO)3Cl(glycinate) [Ru(CO)3Cl(en)]+

PF6- Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)

Composante

I 70 50 50 50

Composante

II 30 50 50 50

DMSO Aββ28 [Ru(CO)3Cl2]2 Ru(CO)3Cl(CQ) Ru(CO)3Cl(HQ) Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)

Composante

I 70 25 70 70 70

Composante

II 30 75 30 30 30

Tableau V-6: Effet des complexes de Ru(II) sur la coordination du Cu(II).

En effet, la présence de ces complexes entrainent une modification du ratio

composante I/composante II en faveur de la composante II. La différence entre la

composante I et II est principalement située au niveau de la coordination des histidines : la

composante I implique la coordination de deux histidines (His6 et His13 ou His14) tandis que

la composante II implique un seul résidu histidine (cf Fig. V-13, panneau A). Une

augmentation de la proportion de la composante II indique alors un changement de la

coordination du Cu(II) au niveau des résidus histidines et en particulier les complexes

Ru(CO)3Cl(glycinate) et [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- se lient au peptide Aβ via (i) deux noyaux

imidazoles ne laissant qu’un seul résidus histidine pour la coordination du Cu(II), (ii) ou un

résidu histidine. Dans ce dernier cas, une situation très similaire à celle obtenue avec les

mutants possédant une mutation au niveau des histidines est retrouvée (cf Fig. V-15). En

effet, le pKa de transition entre la composante I et II de ces mutants (pKa 7,3 ou 7,5) est

diminuée par rapport au peptide natif (pKa 7,8) [33].

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Le complexe Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) montre un effet différent dans l’eau et le DMSO.

En effet, il modifie les proportions des composantes I et II dans l’eau mais pas dans le DMSO

(cf Tableau V-6, p. 176) et donc aurait une influence sur la coordination du Cu(II) dans les

deux solvants. Cet effet diffère de ce qui a pu être observé précédemment dans le cas de

l’agrégation du peptide Aβ28 déclenchée par le Zn(II), le complexe Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO

était plus actif que le complexe Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) (cf § V-B-2, p. 171). Il est alors

nécessaire d’étudier l’interaction Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)-Aβ28 par d’autres techniques

spectroscopiques. Le résultat de ces études est présenté dans le paragraphe V-D.

Dans le DMSO, les complexe Ru(CO)3Cl(CQ) et Ru(CO)3Cl(HQ) ne modifient pas la

signature RPE du complexe Aβ-Cu(II) (panneau B, courbe f et g) contrairement au complexe

[Ru(CO)3Cl2]2 (courbe e). La présence de ce dernier favorise fortement la formation de la

composante II, la composante I étant très peu présente. De la même façon que les complexes

Ru(CO)3Cl(glycinate), [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3), le dimère de Ru(II)

semble se lier au peptide via au moins un des résidus histidines. De plus, la faible présence de

la composante I indique une réactivité plus importante du complexe [Ru(CO)3Cl2]2 par

rapport aux autres complexes étudiés vis-à-vis de la coordination du Cu(II) au peptide Aβ.

Figure V-15: Effet des mutations au niveau des résidus histidines sur la coordination du Cu(II) au peptide Aββ à pH 7,4.

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V-C-3 Effet des complexes de Ru(II) sur l’agrégation induite par le Zn(II) et la coordination du Cu(II) au peptide Aββ28 : bilan

Le but recherché dans l’utilisation de complexes de Ru(II), dans le cadre de la MA, est

leur possible capacité à modifier la coordination des ions métalliques (Cu(II) et Zn(II)) et les

effets délétères associés (production de ROS catalysée par le Cu(II) et agrégation induite par

le CuII) et le Zn(II)). Pour répondre à cette question, l’effet des complexes de Ru(II) sur la

cinétique d’agrégation du peptide Aβ28 induite par le Zn(II) a été mesuré par spectroscopie

de fluorescence. Il est important de noter que cette expérience nous renseigne sur la

coordination du Zn(II) de façon indirecte. Evaluer directement l’effet des complexes de Ru(II)

synthétisés sur la coordination du Zn(II) nécessite l’utilisation de la spectroscopie RMN et/ou

des expériences d’absorption des rayons X comme le XANES (X-ray Absorption Near Edge

Structure). Ces deux techniques sont principalement utilisées pour sonder l’environnement du

Zn(II). Le Zn(II) possède une couche de valence pleine (d10) et il est donc silencieux pour

une majorité de techniques spectroscopiques. La plupart des complexes de Ru(II) étudiés ont

montré un effet (inhibition ou un ralentissement) sur la cinétique d’agrégation du peptide

Aβ28 (cf. Tableau V-5, p. 173). Ceci peut traduire une modification de la coordination du

Zn(II) au peptide Aβ28. Seuls les complexes [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- et Ru(CO)3Cl(CQ)

semblent inactifs vis-à-vis de l’agrégation du peptide.

Contrairement à l’expérience de fluorescence qui renseigne de façon indirecte sur la

coordination du Zn(II), les modifications de la coordination du Cu(II) au peptide causées par

la présence des complexes de Ru(II) sont directement visibles par spectroscopie RPE du

Cu(II). Ainsi, certains des complexes de Ru(II) (Ru(CO)3Cl(CQ), Ru(CO)3Cl(HQ) et

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO) ont peu voire pas d’effet sur la coordination du Cu(II) au peptide

Aβ. Les autres complexes modifient la coordination du Cu(II) en favorisant la proportion de

la composante II par rapport à la composante I à pH 7,4. Ce qui indique que ces complexes se

lient au moins par un des résidus histidines du peptide.

Seuls les complexes [Ru(CO)3Cl2]2 et Ru(CO)3Cl(glycinate) semblent capables de

modifier la coordination du Zn(II) et du Cu(II) en se liant vraisemblablement au peptide via

au moins un résidu histidine.

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�Chapitre V. D-Coordination des complexes au peptide Aβ28

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Afin de mieux comprendre l’effet des complexes de Ru(II) sur la coordination du

Cu(II) et du Zn(II), nous avons étudié l’interaction des complexes de Ru(II) avec le peptide

Aβ28 a alors été étudiée par spectroscopie RMN 1H et spectrométrie masse.

V-D Coordination des complexes au peptide Aββ

La première partie de ce paragraphe concerne l’interaction entre les complexes

Ru(CO)3Cl(Glycinate), Ru(CO)3Cl(HQ.SO3), [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- et le peptide Aβ28

étudiée par spectroscopie RMN 1H et spectrométrie de masse (dans l’eau). De même la

seconde partie présente les résultats des études RMN et de masse obtenus concernant

l’interaction des complexes Ru(CO)3Cl(HQ), Ru(CO)3Cl(CQ) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO

avec le peptide Aβ28 (en présence de DMSO). Dans chacune des études présentées, la

réactivité du complexe [Ru(CO)3Cl2]2 vis-à-vis du peptide Aβ28 est également évaluée.

Dans les expériences présentées, les échantillons sont préparés de la même façon pour

les deux techniques à savoir incubation du peptide en présence du complexe pendant 12h,

sous agitation vigoureuse à 37°C de façon à favoriser l’interaction peptide-complexe et le

départ des ligands glycinate, éthylène diamine et hydroxyquinolinate pour avoir un effet

thérapeutique supplémentaire par la coordination des ions Cu(II) et Zn(II) .

V-D-1 Etude par RMN 1H et spectrométrie de masse de l’interaction des complexes hydrosolubles avec le peptide Aβ28

V-D-1-a Etude par spectroscopie RMN 1H

Cette étude est réalisée dans les mêmes conditions de concentration, tampon, pH et

température que les expériences de fluorescence. Le Ru(II) est de configuration électronique

d6 et il est diamagnétique ce qui permet son étude par spectroscopie RMN. Un déblindage des

signaux des acides aminés directement impliqués dans sa sphère de coordination est attendu

du fait de l’appauvrissement électronique lors de la liaison au métal.

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L’ajout des différents complexes hydrosolubles sur le peptide Aβ28 ne semble pas

avoir d’effet sur le spectre RMN. Cependant, nous pouvons observé sur la figure V-16,

panneau A que le complexe Ru(CO)3Cl(glycinate) libère de la glycine en solution (spectres d

et e). Cette libération de glycine est plus importante en présence de peptide Aβ28 (spectres c

et e). De la même façon, le complexe [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- (Fig. V-16, panneau B) ne libère

pas son ligand éthylène diamine (spectres d et e) en solution dans l’eau mais seulement en

présence de peptide (spectres c et e). Contrairement à ces derniers, le complexe

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) (Fig. V-16, panneau C) ne libère pas son ligand en présence de peptide

mais son ajout sur le peptide Aβ28 (spectres a et c) provoque un élargissement des signaux

sur l’ensemble du spectre (cf Fig. V-21, p. 188).

Il semble alors surprenant de voir si peu d’effet de l’ajout des complexes de Ru(II) sur

le peptide sur les spectres RMN sachant que le départ des ligands glycinate et éthylène

diamine libèrent deux positions disponibles pour la coordination du Ru(II) au peptide. Par

ailleurs, l’élargissement des signaux du peptide suite à l’addition du complexe

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) suggère la formation d’un adduit peptide-Ru(II). Une étude préliminaire

avec le peptide Aβ16 en présence du Ru(CO)3Cl(glycinate) a été réalisée afin d’essayer

d’avoir plus d’informations concernant l’interaction peptide-Ru(II) (Fig. V-17).

Figure V-16: Effet des complexes de Ru(II) solubilisés dans l'eau sur le spectre RMN 1H du peptide Aββ28. Le panneau A) correspond à l’effet du complexe Ru(CO)3Cl(glycinate), B) [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6

- et C) Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) avec (a) peptide Aββ28 seul, (b) en présence du complexe à t=0, (c) en présence du

complexe après 24h d’incubation à 37°C, (d) le complexe seul à t=0 et (e) après 24h d’incubation à 37°C, (f) le ligand seul. Conditions expérimentales : [Aββ28]= 500 µM, [Ru(II)]= 500µM dans 10mM de tampon

phosphate, pH 7,4, T=25°C.

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Figure V-17: Effet du complexe Ru(CO)3Cl(glycinate) sur les peptides Aββ16 et Aβ28 au niveau de la zone des Valines (panneau de droite) et des aromatiques (panneau de gauche). Le spectre (a) et (c) représente le

peptide Aβ28 et Aβ16 seul respectivement et (b) et (d) en présence du complexe Ru(CO)3Cl(glycinate). Conditions expérimentales : [Aβ]= 500 µM, [Ru(II)]= 500µM dans 10mM de tampon phosphate, pH 7,4,

T=25°C.

L’ajout du complexe Ru(CO)3Cl(glycinate) sur le peptide Aβ16 provoque une perte de

signal sur l’ensemble des signaux du peptide (cf diagramme V-18 sur lequel est indiqué, en

fonction des acides aminés, le rapport entre l’aire des signaux du peptide complexé avec

l’aire du peptide seul) avec un effet plus ou moins marqué selon les résidus et plus

particulièrement au niveau des histidines. De plus, un dédoublement des signaux de la Val12

(Fig. V-18, panneau de droite) est observé. La valine étant voisin de l’histidine 13, ces

données suggèrent que le complexe Ru(CO)3Cl(glycinate) se coordine au peptide via les

résidus histidines.

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A l’heure actuelle, il n’y a pas d’explication évidente quant aux différences, entre le

peptide Aβ16 et Aβ28, observées suite à l’ajout des complexes de Ru(II).

V-D-1-a Etude par spectrométrie de masse : HPLC/MS

La spectrométrie de masse couplée LC va nous permettre d’identifier les adduits

Ru(II)-peptide et également déterminer le taux de coordination du Ru(II) au peptide. Le

peptide libre et le peptide lié au complexe de Ru(II) sont séparés sur colonne HPLC avant

l’analyse par ESI-MS qui permet de déterminer les différents états de protonation du peptide

libre et complexé au Ru(II). Les changements de masse observés entre le peptide libre et le

peptide complexé mènent la nature de l’adduit peptide–Ru(II) comme dans le cas de

l’interaction Aβ28 (Fig. V-19, panneau de gauche) avec le complexe Ru(CO)3Cl(glycinate)

(Fig. V-19, panneau de droite). Le spectre de masse (Fig. V-19, panneau de droite) du peptide

complexé au Ru(II) indique une augmentation de masse de 157 uma ce qui correspond à la

formation de l’espèce [Ru(CO)2]2+ suite à la perte des ligands glycinate et chlorure ainsi

qu’un ligand carbonyle.

Figure V-18: Effet du complexe Ru(CO)3Cl(glycinate) sur les signaux du peptide Aββ16. L'axe des ordonnées représente le rapport entre l'aire des

signaux du peptide Aβ16 en présence de complexe avec l'aire des signaux du peptide seul.

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Le taux de complexation correspond à l’aire du pic du peptide non complexé avec

l’aire du pic du peptide témoin enregistré dans exactement les mêmes conditions soit [1-

AAβcplx/AAβcontrol] (AAβcplx est l’aire résiduel du peptide Aβ28 non complexé au Ru(II) et

AAβcontrol l’aire du peptide Aβ28 seul). Les résultats sont résumés dans le tableau V-7.

Une étude similaire a été réalisée avec un complexe cyclométallé de Pt(II) et a permis

d’identifier les sites de coordination au peptide Aβ28 [6]. Par spectrométrie de masse en

tandem (MS-MS), il a en effet été possible d’identifier le Glu11 et l’His13 comme sites

principaux de liaison aux complexes de Pt(II).

Figure V-19: Spectre de masse du peptide Aββ28 seul (panneau de gauche) et en présence du complexe Ru(CO)3Cl(glycinate) (panneau de droite) après séparation sur colonne HPLC. Conditions expérimentales :

[Aββ28]= 50 µM, [Ru(II)]= 50µM dans 0,8 mM de tampon (NH4)3PO4, pH 7,4, T=25°C.

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a Ratio masse/charge expérimental des ions multichargés du peptide Aβ28 et du complexe Aβ28/Ru b Masse expérimentale calculée à partir des incertitude données avec un intervalle de confiance de 95% c Le changement de masse est calculé à partir de la masse moyenne du Ru(II) d Taux de complexation calculé à partir de la formule explicitée ci-dessus.

Tableau V-7: Tableau récapitulatif des adduits Aβ-Ru(II) formés ainsi que des taux de complexation au

peptide.

D’après le tableau, nous pouvons noter que les complexes Ru(CO)3Cl(glycinate) et

[Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- perdent leurs ligands glycinate, éthylène diamine ainsi que le chlorure

et un carbonyle. Ceci signifie que ces complexes vont avoir 4 positions libres disponibles

pour la coordination au peptide.

Les taux de complexation au peptide Aβ28 de l’ordre de 60% pour le complexe

Ru(CO)3Cl(glycinate) et de 30% pour le complexe [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- sont en accord avec

les données RMN (Fig. V-16, p. 180). En effet, nous avons vu dans le paragraphe précédent

que ce complexe se liait au peptide dans des proportions moins importante que le

Ru(CO)3Cl(glycinate) de par une libération moins importante du ligand éthylène diamine en

présence du peptide comparativement au ligand glycinate (cf Fig. V-16, p. 180).

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En ce qui concerne le complexe Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) et contrairement aux complexes

cités précédemment, il n’y a pas de relargage du ligand en présence du peptide. Deux sites de

fixation aux peptides sont obtenus soit par perte d’un carbonyle et d’un chlorure (adduit

majoritaire) ou par perte de deux carbonyles (adduit minoritaire). Ces deux adduits

complexent 50% du peptide. Ces données sont en accord avec les données RMN (cf. Fig. V-

16, p. 180). En effet, les spectres RMN ont montré qu’il n’y avait pas de libération du ligand

en présence de peptide. Cependant, un taux de coordination de 50% suggérerait un effet plus

important sur les spectres RMN.

Les données obtenues par spectroscopie RMN 1H et spectrométrie de masse ont

montré que les complexes Ru(CO)3Cl(glycinate) et [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- libèrent leur ligand

en présence du peptide ce qui n’est pas le cas du complexe Ru(CO)3Cl(HQ.SO3). De plus, les

données obtenues avec le peptide Aβ16 suggèrent la coordination du complexe

Ru(CO)3Cl(glycinate) via les résidus histidines du peptide ce qui explique l’effet de ce dernier

sur l’agrégation du peptide induite par le Zn(II) (cf Fig. V-12, p. 172) et la modification de la

coordination du Cu(II) (cf Fig. V-14, p. 175). Le taux de coordination de 30% du complexe

[Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- semble suffisant pour modifier la coordination du Cu(II) au peptide

Aβ28 (cf Fig. V-14, p. 175) mais trop faible pour avoir un effet sur l’agrégation induite par le

Zn(II) (cf Fig. V-12, p. 175). En, effet, il reste alors 70% de peptide disponible pour 50% de

Zn(II). L’ensemble des données obtenues par spectroscopie de fluorescence, RPE, RMN 1H et

spectrométrie de masse concernant les complexes de Ru(II) solubilisés dans l’eau sont

résumées dans le tableau V-7. Ces données préliminaires sont encourageantes mais il est

nécessaire d’étudier l’interaction entre les complexes de Ru(II) et le peptide Aβ16 par

spectroscopie RMN et ESI-MS.

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Complexes Taux de

complexation (%)

Coordination au

peptide

Effet sur

l’agrégation (+ ou -)

Coordination du

Cu(II) (%

composante I/II)

Ru(CO)3Cl(glycinate) 60 Libération

glycinate + 50/50

[Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- 30

Libération éthylène

diamine - 50/50

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) 48 Elargissement - 70/30

Tableau V-8: Tableau récapitulatif de l'effet des complexes de Ru(II) solubilisés dans l'eau sur le peptide Aββ28 ainsi que sur l'agrégation induite par le Zn(II) et sur la coordination du Cu(II) au peptide.

V-D-2 Etude par RMN 1H et masse des complexes solubilisés dans le DMSO avec le peptide Aβ28

Dans cette seconde partie, les résultats concernant l’interaction des complexes

Ru(CO)3Cl(CQ), Ru(CO)3Cl(HQ) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO avec le peptide Aβ28 étudiée

par spectroscopie RMN 1H et spectrométrie de masse vont être présentés.

V-D-2-a Etude par RMN 1H

Seule la partie aromatique des spectres est représentée ici, les complexes

Ru(CO)3Cl(CQ), Ru(CO)3Cl(HQ) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) possédant des ligands

aromatiques, si ces derniers sont libérés en présence du peptide, ils seront directement visibles

dans cette zone (Fig.V-20). A titre de comparaison, le spectre du peptide en présence du

[Ru(CO)3Cl2]2 (courbe (b)) est également représenté.

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Il n’y a aucun signe de l’ajout du complexe sur le peptide si ce n’est un élargissement

(assez faible) des signaux sur l’ensemble du spectre sans perte de signal comme montré sur la

zone des valines du peptide Aβ28 (cf Fig. V-21) suite à l’ajout du complexe Ru(CO)3Cl(CQ).

Par contre cet effet est sélectif sur le peptide, les signaux de l’éthanol et du TSP ne sont pas

affectés (cf Fig. V-21, encadré). Par ailleurs, contrairement au complexe [Ru(CO)3Cl2]2,

l’effet des complexes sur le peptide Aβ28 n’est pas sélectif des résidus (les histidines ne

semblent pas plus affectées par rapport au reste du peptide).

La figure V-20 indique que les complexes Ru(CO)3Cl(CQ) (spectre (c)),

Ru(CO)3Cl(HQ) (spectre (d)) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO (spectre (e)) ne perdent pas leur

ligand en présence de peptide.

Figure V-20:�Zone aromatique du peptide Aββ28 en présence de DMSO (a), du complexe [Ru(CO)3Cl2]2 (b),Ru(CO)3Cl(CQ) (c), Ru(CO)3Cl(HQ) (d) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO (e) . Conditions expérimentales :

[Aββ]=500µM, [Ru(II)]=500µM dans 10mM de Tampon phosphate pH 7,4.

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Ces résultats sont inattendus. En effet, ces complexes ont un effet sur l’agrégation du

peptide Aβ28 (sauf le complexe Ru(CO)3Cl(CQ)) ce qui pourrait induire une modification de

la coordination du Zn(II). Cependant ces complexes ne modifient pas la coordination du

Cu(II). Il est alors possible que l’interaction entre les complexes de type hydroxyquinoléine

(solubilisés dans le DMSO) et le peptide Aβ28 soit faible et donc qu’il n’y ait pas de liaisons

de coordination entre le Ru(II) et le peptide.

Dans le but de mieux comprendre le mode de coordination de ces complexes au

peptide Aβ28 des expériences de spectrométrie de masse ont été réalisées.

V-D-2-b Etude par spectrométrie de masse : HPLC/MS

Le tableau V-9 présente les résultats obtenus concernant l’interaction des complexes

[Ru(CO)3Cl2]2, Ru(CO)3Cl(CQ), Ru(CO)3Cl(HQ) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO avec le

peptide Aβ28 étudiée par HPLC-MS.

Figure V-21:�Représentation de l’élargissement des signaux dans la zone aliphatique du peptide Aββ28 (noir) suite à l’ajout du complexe Ru(CO)3Cl(HQ) (rouge). Les signaux de l’étalon interne (TSP) ainsi que de l’éthanol sont représentés dans l’encadré. Conditions expérimentales : [Aββ ]=500µM, [Ru(II)]=500µM

dans 10mM de Tampon phosphate pH 7,4.

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a Ratio masse/charge expérimental des ions multichargés du peptide Aβ28 et du complexe Aβ28/Ru b Masse expérimentale calculée à partir des ; incertitude données avec un intervalle de confiance de 95% c Le changement de masse est calculé à partir de la masse moyenne du Ru(II) d Taux de complexation calculé à partir de la formule explicitée ci-dessus.

Tableau V-9: Masses expérimentales des complexes Ru(II)-Aβ28 et leur taux de complexation au

peptide.

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Ces résultats nous donnent plusieurs informations. Pour commencer, nous pouvons

noter que le complexe [Ru(CO)3Cl2]2 réagit très fortement avec le peptide (taux de

complexation de ∼ 80%). Cependant, la nature exacte des espèces formées avec le peptide n’a

pu être déterminée à cause du grand nombre de coordinations possibles d’où la notation

complexe 1 et complexe 2.

De plus, les complexes Ru(CO)3Cl(CQ), Ru(CO)3Cl(HQ) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO

possèdent un taux de coordination au peptide de l’ordre de 50% et ils gardent leur ligand en

accord avec ce qui a été observé par RMN. Par ailleurs, le DMSO n’est pas un solvant

innocent puisqu’il se coordine au Ru(II) pouvant ainsi en modifier la réactivité. Deux adduits

sont détectés Aβ-Ru(CO)2(DMSO)(XQ), le complexe ne possède qu’un site de liaison au

peptide et l’adduit Aβ-Ru(CO)2(XQ), le complexe possède alors deux sites de coordination au

peptide. Dans le cas du complexe Ru(CO)3Cl(CQ), un adduit de type Aβ-Ru(CO)(CQ) est

détecté ce qui offre 3 sites de liaison au peptide. De plus, le complexe

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO réagit plus fortement avec le peptide (∼ 60% de taux de

complexation) que dans le cas où il est solubilisé dans l’eau (taux de complexation 48% , cf

Tableau V-9). Comme pour le complexe solubilisé dans l’eau, un taux de complexation de

l’ordre de 60% laisserait entendre un effet plus important sur les spectres RMN.

Les changements de masse observés entre le peptide seul et le peptide complexé au

Ru(II) permettent d’identifier les adduits formés mais pas le mode de coordination des

complexes de Ru(II) au peptide. Un même adduit pouvant avoir différents modes de

coordination. Or ces modes de coordination n’auront pas les mêmes déplacements chimiques

en RMN. Ces données nous indiquent que les complexes possédant un ligand de type

hydroxyquinolinate se lient au peptide après libération d’un ligand carbonyle et du ligand

chlorure (partiellement remplacé par le DMSO).

Contrairement aux complexes [Ru(CO)3Cl2]2 et Ru(CO)3Cl(glycinate) qui en se liant

au peptide via les résidus histidines modifient ainsi la coordination des ions métalliques, les

complexes Ru(CO)3Cl(CQ), Ru(CO)3Cl(HQ) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) possèdent les mêmes

effets (cf Tableau V-10) mais pas pour les mêmes raisons puisqu’ils ne semblent pas se lier

pas de façon préférentielle au peptide ce qui rend l’identification des sites de coordination

impossible. Une hypothèse serait alors que ces effets sont certainement dus à la présence de

ligand aromatique qui n’est pas libéré en présence du peptide et qui va pouvoir interagir avec

les résidus aromatiques du peptide (His, Tyr et Phe) par des interactions de type π-stacking.

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Un moyen de confirmer cette hypothèse est de réaliser les études en agrégation et par RPE en

présence du ligand seul. Ceci n’est pas possible étant donné que ces ligands sont des

chélateurs des ions métalliques, il y aura alors coordination du Zn(II) et du Cu(II). De plus, la

présence de ces complexes peut gêner la coordination des ions métalliques par encombrement

stérique.

Complexes

Taux de

complexation

(%)

Coordination

au peptide

Effet sur

l’agrégation (+ ou -)

Coordination

du Cu(II) (%

composante

I/II)

[Ru(CO)3Cl2]2 81 Par les

Histidines + 20/80

Ru(CO)3Cl(CQ)) 47 Elargissement - 70/30

Ru(CO)3Cl(HQ) 47 Elargissement + 70/30

Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)DMSO 47 Elargissement + 70/30

Tableau V-10: Tableau récapitulatif de l'effet des complexes de Ru(II) solubilisés dans le DMSO sur le peptide Aββ28 ainsi que sur l'agrégation induite par le Zn(II) et sur la coordination du Cu(II) au peptide

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�Chapitre IV. E-Bilan

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V-E Bilan

A partir des données obtenues par les différentes techniques spectroscopiques

(Tableau V-11), nous pouvons proposer deux mécanismes différents d’interaction des

complexes de Ru(II) avec le peptide : le mécanisme 1 implique la perte du ligand et le

mécanisme 2 sans perte du ligand.

Mécanisme 1 Mécanisme 2

Nombre de sites disponibles

(ESI-MS) n=4 n= 1 ou 2

Coordination au peptide

(RMN 1H)

Effet résidu spécifique

Complexe Ru(II)-Aβ rigide

se manifestant par un

échange lent et l’apparition

de nouveaux signaux

Effet peptide spécifique

Liaison du Ru(II) à différents

endroits et/ou modification

de la dynamique du peptide

en échange rapide avec un

élargissement des signaux du

peptide.

Effet sur l’agrégation

(coordination du Zn(II))

Modification de la

coordination du Zn(II) avec

un effet important sur

l’agrégation

Effet modéré sur l’agrégation

Interaction faible avec

modification de

l’enroulement du peptide

Coordination du Cu(II)

Modification coordination du

Cu(II)

Liaison du Ru(II) via au

moins deux histidines

Pas de modification de la

coordination du Cu(II)

Liaison du Ru(II) via une

histidine.

Tableau V-11: Tableau résumant les mécanismes 1 et 2 selon que le complexe libère son ligand en présence du peptide.

Le premier mécanisme (Fig. V-22) implique la perte du ligand glycinate ou éthylène

diamine. La libération du ligand couplée à la perte du ligand chlorure (et carbonyle) conduit à

la formation de l’espèce [Ru(CO)3]2+ qui va pouvoir se lier au peptide via trois (ou quatre)

positions libres aux résidus histidines (en accord avec les données ESI-MS et RMN 1H). Le

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�Chapitre IV. E-Bilan

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complexe Aβ-Ru(CO)3 est figé dans une seule configuration. La liaison de cette espèce va se

traduire par une modification de la coordination du Cu(II) (résultats de RPE) et un effet

important sur l’agrégation indiquant une modification de la coordination du Zn(II) (résultats

de fluorescence).

Dans le second mécanisme, il n’y a pas de libération des ligands de type

hydroxyquinoléine ce qui ne laisse qu’une à deux positions disponibles pour la liaison au

peptide via la perte du ligand chlorure et/ou carbonyle (données obtenues par ESI-MS). De

plus, il ne semble pas y avoir de sites de coordination privilégiés comme dans le cas du

mécanisme 1. Ceci se traduit par la présence de différentes configurations c’est-à-dire que le

complexe de Ru(II) peut se coordiner au peptide à différents endroits de la séquence. De plus,

dans les complexes de type Aβ-Ru(XQ)(CO)3, le peptide n’est pas figé. Il va y avoir un

échange rapide qui va se traduire par un élargissement des signaux du peptide détectés par

spectroscopie RMN 1H. L’interaction entre le complexe de Ru(II) et le peptide est faible ce

qui entraine un effet modéré sur l’agrégation induite par le Zn(II). Cette interaction n’est pas

suffisante pour modifier la coordination du Cu(II). Il est alors probable que le complexe se lie

au peptide via un seul résidu histidine.

Figure V-22: Illustration des mécanisme 1 (en haut) et 2 (en bas) selon la libération du ligand en présence du peptide.

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�Chapitre V. Conclusion et perspectives

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Conclusion et perspectives

Notre objectif était de synthétiser des complexes de Ru(II) capables de se lier

spécifiquement aux ligands des ions Cu(II) et Zn(II) du peptide Aβ28 (histidines et amine

terminale) afin d’empêcher la coordination de ces ions métalliques qui jouent un rôle

important dans les processus d’agrégation et de toxicité du peptide Aβ. Dans ce contexte,

nous avons synthétisé cinq complexes : Ru(CO)3Cl(glycinate), Ru(CO)3Cl(CQ),

Ru(CO)3Cl(HQ), Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) et [Ru(CO)3Cl(en)]+Cl-. L’obtention de ces complexes

est relativement aisée sauf pour le complexe Ru(CO)3Cl(glycinate) qui n’a pu être isolé de

façon exclusive.

La capacité de ces complexes ainsi que du [Ru(CO)3Cl2]2 à empêcher l’agrégation du

peptide Aβ28 induite par le Zn(II) et à modifier la coordination du Cu(II) au peptide Aβ28 ont

été évaluées. Le complexe [Ru(CO)3Cl2]2 a montré une réactivité suffisante pour inhiber

l’agrégation du peptide Aβ28 et modifier la coordination du Cu(II). Cependant, il est

nécessaire d’apporter des modifications structurales afin de le vectoriser. En effet, ce

complexe n’est entouré que de CO et Cl ce qui ne lui confère pas une spécificité pour le

peptide Aβ. Il est fort possible que ce complexe réagisse avec n’importe quelle molécule

biologique.

Les complexes Ru(CO)3Cl(glycinate), Ru(CO)3Cl(HQ) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)

(solubilisé dans l’eau ou le DMSO) ont montré les mêmes effets mais dans des proportions

moindres. La coordination de ces complexes au peptide Aβ28 a ensuite été étudiée par

spectroscopie RMN 1H et spectrométrie de masse. Nous avons ainsi pu établir que le

complexe Ru(CO)3Cl(glycinate) modifie la coordination du Cu(II) et induit un ralentissement

de l’agrégation induite par le Zn(II) ce qui suggère une coordination du complexe via au

moins l’un des résidus histidines. Les complexes Ru(CO)3Cl(HQ) et Ru(CO)3Cl(HQ.SO3)

présentent les mêmes effets mais ceux-ci semblent plutôt dus à la présence d’un ligand

aromatique. Il est possible de classer les complexes de Ru(II) selon leur réactivité allant du

mécanisme 1 à 2 (cf Fig. V-23).

Figure V-23: Classification des complexes de Ru(II) en fonction qu'ils suivent le mécanisme 1 ou 2.

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�Chapitre V. Conclusion et perspectives

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Ces résultats sont encourageants dans le cadre d’une utilisation de complexe à base de

Ru(II) comme agent actif contre la MA mais il reste encore certains point à améliorer et

vérifier.

Dans l’introduction, nous avons vu que le Cu(II) joue un rôle important dans la

maladie d’Alzheimer en favorisant l’agrégation du peptide et en catalysant la production de

ROS. Il sera donc intéressant d’évaluer l’effet des complexes de Ru(II) sur la production de

ROS ainsi que sur l’agrégation du peptide Aβ28 en présence de Cu(II). De plus, la réaction

des complexes de Ru(II) avec le peptide n’est pas totale ce qui laisse une certaine quantité de

peptide disponible pour le Zn(II) et le Cu(II). Il semble cependant nécessaire de réaliser de

nouvelles études en présence de quantité plus importante de complexes.

Par ailleurs, le manque de réactivité observé de certains complexes peut s’expliquer

par une forte stabilité dans le milieu réactionnel. Une alternative consisterait à modifier le

ligand par exemple en utilisant des ligands monodente comme le NH3 ou modifier le ligand

bidente en utilisant par exemple de la β-alanine ou la propane diamine. Ces ligands vont

former un cycle à 6 avec le centre métallique qui sera moins stable et potentiellement plus

réactif que les cycles à 5 formés par la glycine ou l’éthylène diamine. Des essais ont déjà été

menés dans ce sens mais l’obtention de ce type de complexe est compliquée. En effet, le

ligand étant déjà labile pendant la synthèse, il est donc difficile d’obtenir un complexe pur.

Nous devons alors faire face à un dilemme entre obtention d’un complexe pur et réactivité.

Nous avons travaillé avec des complexes de type Ru(CO)3Cl(L) dans lesquels L est

un ligand bidente. Les ligands carbonyles ne sont pas labiles. Une seconde alternative pour

améliorer la réactivité des complexes de Ru(II) est d’utiliser des complexes possédant des

ligands plus labile comme l’acétonitrile ou le DMSO. En effet, les complexes de type

Ru(DMSO)2Cl2(L) sont utilisés dans la littérature comme agent anti-cancéreux. L’une des

explications quant à leur réactivité est qu’en solution, ils sont capables de perdre une

molécule de DMSO et de Cl.

L’approche prodrug pourrait également être envisagée comme dans le cas du NAMI-

A. L’utilisation d’un complexe de Ru(III) qui serait inactif mais qui une fois en présence du

peptide modifie son état d’oxydation et serait alors capable de se lier au peptide et par la suite

empêcher la coordination des ions métalliques. Il pourrait également être intéressant de

modifier le centre métallique en utilisant l’osmium qui possède des propriétés similaires au

Ru(II).

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�Chapitre V. Bibliographie

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Bibliographie �

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Conclusion

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Conclusion Générale

Les travaux présentés dans ce manuscrit concernent deux aspects différents de la

maladie d’Alzheimer : un aspect mécanistique et un aspect thérapeutique.

L’auto-assemblage des peptides monomériques en agrégats de type amyloïde

(nommée agrégation dans ce manuscrit) semble une étape clef dans différentes maladies, y

compris la maladie d’Alzheimer. Dans ce dernier cas, le peptide amyloïde-β (Aβ) est

impliqué. C'est pourquoi un grand nombre de recherches pour mieux comprendre l'agrégation

du peptide Aβ sont effectuées. En particulier, moduler l'agrégation du peptide Aβ apparait

comme une voie thérapeutique possible. Les études présentées dans ce manuscrit s'inscrivent

dans ce contexte et cette stratégie thérapeutique.

Un aspect central des études présentées ici concerne l’interaction de la Thioflavine T

(ThT) avec le peptide Aβ. L’intérêt est double. Premièrement, il s’agit de mieux comprendre

l’interaction de ce fluorophore, très largement utilisé pour détecter la présence des fibres

amyloïdes. Secondement, puisque cette petite molécule organique semble être spécifique des

fibres amyloïdes, elle possède un intérêt thérapeutique potentiel pour la détection ou

l'inhibition de l’agrégation.

Dans le chapitre II, la ThT, fluorophore le plus utilisé pour étudier la cinétique

d’agrégation du peptide Aβ du fait de ses propriétés spectroscopiques particulières en

présence de fibres amyloïdes est étudié en présence de peptides monomériques. Nous avons

montré que la ThT n’interagit pas seulement avec les espèces fibrillaires mais également avec

les formes monomériques du peptide Aβ, contrairement à ce qui est communément admis.

Cette étude a permis d’identifier, par une expérience NOESY et pour la première fois de

façon expérimentale la zone du peptide avec laquelle la ThT interagit (L17-F20). Ces données

permettent de mieux comprendre l’interaction ThT-Aβ et permettent d’envisager la synthèse

de molécules dérivées de la ThT qui pourront servir de sondes spécifiques dans la détection

des stades précoces de la maladie. Ceci est aussi d’intérêt pour le développement de

molécules capables de cibler spécifiquement le monomère. En effet, cibler le monomère de

façon à inhiber l’agrégation semble une approche prometteuse (et peu investiguée).

Une autre conséquence liée au résultat précédent, à savoir que la ThT interagit avec le

peptide Aβ28 monomérique, est que la présence de ThT pourrait avoir des conséquences sur

la cinétique d’agrégation du peptide. Et en effet, nous avons montré dans le chapitre III que la

ThT n’est pas inerte sur la cinétique d’agrégation du peptide Aβ. La présence de quantité

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importante de ThT favorise l’agrégation du peptide Aβ induite ou non par le Zn(II). Par

ailleurs, l’interaction de la ThT avec le peptide monomérique décrite dans le chapitre II, est

appuyée par des données RMN qui indiquent que la ThT interagit avec le peptide avant la

formation des fibres. En effet, lors du suivi cinétique par RMN 1H de l'interaction du peptide

et de la ThT dans des conditions d’agrégation, la ThT est consommée plus rapidement que le

peptide. Ces résultats devraient être pris en compte dans les expériences d’agrégation de

peptides Aβ effectuées en présence de ThT (au moins à forte concentration), et probablement

pour le suivi de l'agrégation d’autre peptides/protéines amyloïdogéniques par fluorescence de

la ThT.

Parmi les différents facteurs (température, pH, etc) influençant l’agrégation du peptide

Aβ, la présence de Zn(II) est un paramètre très important. Dans le chapitre III, nous avons

montré que le Zn(II) est capable de déclencher et de promouvoir l’agrégation du peptide. Les

différentes données obtenues par spectroscopie de fluorescence de la ThT ont démontré qu’il

est possible de contrôler la cinétique d’agrégation en maitrisant la quantité de Zn(II) ajoutée

dans l’échantillon. A partir de cette observation, l’étude de l’agrégation en présence de Zn(II)

a été réalisée par RMN 1H dans le but de caractériser les espèces oligomériques intermédiaires

de l’agrégation. Lors de cette étude, la formation des oligomères n’est pas directement visible

sur les spectres 1D mais se traduit par un changement d’intensité des taches de corrélation

NOE (2D). Ce changement d’intensité reflète des modifications de dynamique qui ont lieu au

sein du peptide.

Lors de ces études, il a également été observé qu'une très faible quantité de Zn(II) (5%

par rapport au peptide) induisait l'agrégation du peptide selon deux voies, chacune d'entre

elles étant observable soit par RMN ou soit par spectroscopie de fluorescence de la ThT. Par

fluorescence de la ThT, il est possible de suivre la formation des agrégats obtenus rapidement

(< 24 heures) et induit par la présence de Zn(II). La quantité de holo-fibres déterminée en

conditions non limitante de ThT correspond à la quantité de Zn(II) ajoutée. Par ailleurs, il est

possible d'évaluer qu'une ThT interagit avec environ 4 peptides. Par RMN, la formation

d'apo-oligomères suivie de la formation plus lente (>4 jours) d'espèces fibrillaires non-

détectables (car de masse moléculaire trop importante) est observée. Plus précisément, ce qui

est détecté par RMN 1H, c’est-à-dire les changements d’intensité des taches de corrélations

NOE, correspond à l’agrégation du peptide Aβ28 sans Zn(II) qui se fait plus lentement qu’en

présence de Zn(II). Lors des différentes études menées par spectroscopie de fluorescence et

RMN 1H, un paramètre important est manquant : le nombre des fibres formées. En effet,

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réussir à déterminer quelle quantité de peptide Aβ est agrégée, sous forme fibrillaire ou

amorphe, permettrait de mesurer de façon précise l’influence des conditions expérimentales

ainsi que celles du Zn(II) et de la ThT sur l'agrégation du peptide. Pour mieux comprendre le

mécanisme proposé ici, à savoir l'agrégation du peptide selon deux voies parallèles, ainsi que

pour des mesures quantitatives de la formation de fibres, des expériences supplémentaires

sont nécessaires (absorbance de la ThT, suivi RMN avec variation de concentration en Zn(II)

etc.).

Comme discuté plus haut, la ThT est une petite molécule qui interagit relativement

fortement (Kd ~1µM) et de façon spécifique avec les fibres amyloïdes, et avec une affinité

moins forte (mM) (et une spécificité non déterminée) avec les monomères. Pour cibler les

peptides Aβ monomériques afin d’en inhiber l'agrégation, il faut une affinité plus forte. C'est

pour cette raison que dans la seconde partie de ce travail, nous nous sommes intéressés à la

synthèse et la réactivité de complexes de Ru(II) vis-à-vis du peptide Aβ. En effet, le Ru(II)

peut faire des liaisons de coordination, plus fortes que des liaisons de type hydrogène ou π-

stacking, mais moins fortes que les liaisons covalentes. En plus, tout comme le Pt(II), le

Ru(II) est cinétiquement inerte ce qui lui confère un temps de résidence sur sa cible

suffisamment long pour une action thérapeutique. Les complexes de Ru(II) synthétisés

possèdent un ligand bidente L et sont de formule générale Ru(CO)3Cl(L)0/+ et ont été obtenus

plus ou moins facilement. Une fois en présence du peptide, il était attendu que le ligand soit

libéré permettant la coordination du Ru(II) au peptide via les sites vacants. Les complexes ont

montré des capacités anti-agrégation variables. Par ailleurs, cette propriété n’est pas toujours

liée à la libération du ligand bidente en solution, mais se fait selon différents mécanismes,

incluant des interactions de type π-stacking entre ligand et les résidus aromatiques du peptide.

Assez logiquement, les complexes les plus réactifs tels que le Ru(CO)3Cl(glycinate) sont

également les plus difficiles à synthétiser et à isoler. Concevoir un complexe facilement

isolable et réactif en présence de peptide représente donc un défi. Les résultats préliminaires

présentés ici ont montré que l’utilisation de complexes à base de Ru(II) offre une nouvelle

possibilité thérapeutique dans la recherche de molécules actives contre l’agrégation du

peptide Aβ liée au développement de la maladie d’Alzheimer. Ces complexes pourront être

vectorisés par une molécule spécifique au peptide Aβ comme la ThT ou un de ses dérivés.

Cette molécule pourra être directement liée au centre Ru(II) ou via un espaceur. On pourrait

ainsi espérer combiner les avantages des complexes de Ru(II) (forte affinité et inertie

cinétique) avec ceux des dérivés de ThT (spécificité vis-à-vis des peptides Aβ,) dans une

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unique molécule bi-fonctionnelle et ainsi mieux inhiber l’agrégation du peptide Aβ en milieu

biologique.

Ce travail de thèse a apporté différents éléments de réponse quant au mécanisme de

l’agrégation du peptide Aβ lié à la maladie d’Alzheimer. Ces nouvelles données permettent

d’envisager des voies thérapeutiques innovantes et peu explorées jusqu'alors, qui, espérons-le,

seront efficaces face à la maladie.

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Annexe I : Article

Annexe I Articles

J’ai effectué mon stage de Master 2 au sein de l’équipe chimie biologique au Laboratoire

de Chimie de Coordination. La plupart des études commencées pendant ce stage ont été

finalisées au début de ma thèse. De plus, en parallèle des études physico-chimiques menées

sur les complexes de Ru(II), j’ai également participé à des études similaires réalisées avec des

complexes de Pt(II). Les résultats de ces études ont fait l’objet de publications qui sont

présentées ici.

Article 1 : Copper(II) coordination to amyloid β : murine versus human peptide

La partie principale de mes travaux de M2R a consisté en l’étude de la coordination du

cuivre par les peptides amyloïdes humain et murin (rat, souris etc.) en relation avec la maladie

d’Alzheimer. En effet, des études menées le rat et la souris ont montré qu’ils ne développaient

pas la maladie d’Alzheimer. De plus, les peptides humain et murin diffèrent pas trois

mutations : R5G, Y10F et H13R (de l'humain vers le murin). L’étape de coordination du Cu2+

au peptide Aβ est une des premières étapes de la cascade amyloïde. Il semble donc intéressant

d’étudier la coordination du Cu2+ au peptide Aβ murin (mAβ) afin de mettre en évidence une

différence dans la coordination de l’ion cuivrique pour les peptides Aβ humain (hAβ) et

murin (mAβ), et ce par différentes techniques spectroscopiques. Dans ce projet, j’ai étudié la

coordination du Cu2+ aux peptides hAβ, mAβ, hAβ-R5G, hAβ-Y10, hAβ-H13R et hAβ-R5G-

H13R en fonction du pH par différentes techniques spectroscopiques : UV-Visible,

Dichroïsme Circulaire (DC), Résonnance Paramagnétique Electronique (RPE) (cf Annexe I-

A).

Article 2 : X-ray and solution structures of Cu(II)GHK and Cu(II)DAHK complexes : influence on their redox properties

GHK est un peptide présent naturellement dans le sang, la salive et les urines. Il possède des

effets anti-oxydants et anti-inflammatoires. La séquence peptidique DAHK correspond à la

partie N-terminale de la HSA (Human Serum Albumine), protéine la plus abondante dans le

plasma sanguin et impliquée dans de nombreuses fonctions physiques (transport d’hormones,

d’acides gras,…). DAHK, également présent dans d’autres protéines, possède le motif

ATCUN (Amino-Terminal Cu and Ni binding motive), dans lequel les ions Cu2+ et Ni2+ sont

coordonnés par la fonction amine N-terminale, la chaine latérale de l'Histidine en position 3 et

les deux fonctions amides déprotonées présentes entre ces deux ligands. Il empêche la

formation d’espèces oxygénées réactives induites par le cuivre qui sont toxiques voire létales

pour les cellules. Ces deux peptides possèdent une forte affinité pour le Cu2+. La

caractérisation spectroscopique des complexes DAHK-Cu2+ et GHK-Cu2+-L a apporté de

nouveaux éléments quant à l’aspect structural de ces complexes en solution et leur impact

biologique. Ces données peuvent servir de modèle dans le cadre de l’étude d’interactions

Cu(II)-peptide plus compliquées, comme avec le peptide Aβ, pour lesquelles il n’existe pas de

structure cristallographique. Lors de cette étude, j’ai étudié la coordination du Cu2+ aux

peptides GHK et DAHK par UV-Visible, DC et RPE. J’ai également étudié l’effet de ces

deux peptides sur la production de ROS catalysée par le Cu2+ par spectroscopie de

fluorescence (cf Annexe I-B).

Article 3 : pH-dependant Cu(II) coordination to amyloid β peptide : impact of sequence alterations, including the H6R and D7N familial mutations

La coordination du Cu2+ au peptide Aβ est dépendante du pH. A pH physiologique, deux

espèces coexistent appelée composante I et II. Il existe deux hypothèses concernant le mode

de coordination de la composante II. Afin de discriminer l’un ou l’autre de ces modèles, une

étude de la coordination du Cu2+ en fonction du pH sur une série de 10 peptides mutés a été

réalisée. Par ailleurs, les mutations H6R et D7N sont présentes dans le cas d’apparition

précoce de la maladie. Des études menées sur les peptides Aβ40 et Aβ42 possédant les

mutations H6R ou D7N ont montré que ces deux mutations altèrent l’agrégation du peptide.

De plus, il a été rapporté que les espèces oligomériques formées par ces peptides mutés sont

plus toxiques que celles formés par le peptide natif. La présence de Cu2+ n’a pas été prise en

compte lors de ces études alors qu’il pourrait influencer le processus d’agrégation. Par ailleurs,

l’His6 intervient directement dans la coordination du Cu2+ et l’Asp7 est un ligand supposé

dans la coordination du Cu2+ dans le cas du peptide natif. Il paraît donc important de

déterminer comment ces mutations vont affecter la coordination du Cu2+ à ces formes

familiales rares de la maladie. Dans ce projet, j’ai réalisé l’étude de la coordination du Cu2+

aux différents peptides mutés en fonction du pH par RPE et DC. (cf Annexe I-C).

Article 4 : Pt(II) compounds interplay with Cu(II) and Zn(II) coordination to the amyloid β peptide has metal specific consequences on deleterious processes associated to Alzheimer’s disease.

L'équipe de Barnham a récemment décrit l’utilisation de complexes de Pt(II) comme

molécules actives contre la maladie d’Alzheimer (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 2008, vol. 105,

pp 6813-6818). Depuis cette première étude, la capacité de différents complexes de Pt(II) à se

lier au peptide Aβ a été évaluée. Cette publication décrit l’effet de cinq complexes de Pt(II)

dont le complexe cyclométallé de Pt(II) Pt(φ-MePy)(DMSO)Cl sur l’agrégation du peptide

Aβ induite par le Zn(II) ainsi que sur la production de ROS catalysées par le Cu(II). Lors de

cette étude, j’ai étudié l’effet des complexes de Pt(II) sur l’agrégation du peptide Aβ28

induite par le Zn(II) par spectroscopie de fluorescence et microscopie électronique à

transmission. (cf. Annexe I-D).

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Article I-A

Disease MechanismsDOI: 10.1002/anie.201005838

Copper(II) Coordination to Amyloid b : Murine versus HumanPeptide**H�l�ne Eury, Christian Bijani, Peter Faller, and Christelle Hureau*

In Alzheimer�s disease (AD), the amyloid b (Ab) peptideseems to play a causative role. Ab is the major constituent ofamyloid plaques, a hallmark of AD. According to the amyloidcascade hypothesis, in AD, the aggregation of Ab leads to theformation of toxic species, which induce neuronal cell death.It has been proposed that reactive oxygen species (ROS) areproduced, and that these species mediate cell toxicity.[1,2]

Although still under debate,[3] a large body of evidencesuggests that metallic ions (copper, zinc, and iron) play a rolein the etiology of AD.[3–6] For example, amyloid plaquesextracted from human brains contain high amounts of CuII

and ZnII ions[7] bound to the Ab peptide.[8,9] Chelators wereable to partially solubilize the plaques,[8] and studies onneuronal cell culture and transgenic mice supported theinvolvement of ions in Abmetabolism.[10,11] Copper(II) can bereleased in the synaptic cleft and can reach concentrations upto 15 mm.[5] This value is in line with the possibility of CuII

binding to Ab in vivo, since a dissociation constant in thepicomolar range has been determined for the CuII–Ab

species.[12] Furthermore, in vitro aggregation of the Ab

peptide can be modulated by Cu and Zn ions,[12–14] andbecause of its redox nature, Cu may play a role in ROSproduction.[15] These observations and hypotheses explain theintensive research on the modulation of metal-ion homeo-stasis as a therapeutic approach.[3,16]

A better understanding of the AD mechanisms requiresinvestigations on mouse and rat animal models.[17,18] However,these animals, whose peptide differs from the human Ab

peptide by three point mutations, do not show amyloiddeposition.[17,18] Consequently, studies are performed ontransgenic mice or rats that produce the human Ab (hAb)peptide in addition to their own peptide (mAb). CuII

coordination to murine and human peptides has been

proposed to differ.[19–21] Thus, in the present study, to explainthe distinct CuII coordination to hAb and mAb, we usedcomplementary spectroscopic techniques to determine thecrucial mutation(s). We also propose CuII–mAb structuralmodels. Finally, we discuss possible consequences of suchdifferences in CuII coordination with respect to the use ofmice or rats as AD animal models.

We examined the coordination of CuII to six peptides:hAb (DAEFRHDSGYEVHHQK; see Scheme S1 in theSupporting Information), Y10F-hAb, H13R-hAb, R5G-hAb, mAb (DAEFGHDSGFEVRHQK; see Scheme S2 inthe Supporting Information), and F10Y-mAb (or R5G-H13R-hAb). These shorter 16-residue peptides were used asvaluable models of CuII binding to the full-length pep-tides.[22–24] Indeed, no differences in spectroscopic signature,[22]

binding affinity,[24] or ROS production[23] have been observedbetween the truncated and full-length hAb peptides. Twopeptide families can be distinguished from the spectroscopicsignatures of their CuII complexes (see Figures S1–S5 andTable S1 in the Supporting Information): hAb, Y10F-hAb,and H13R-hAb (humanlike family), and mAb, F10Y-mAb,and R5G-hAb (murine-like family). Thus, the key mutationbetween the hAb and mAb peptides with regard to CuII

binding is the R5G mutation. For both families, two CuII

complexes that differ in the protonation state of the peptideare present near the physiological pH value, namely, compo-nents I and II. Figure 1 shows the differences between the CDand EPR spectroscopic signatures of CuII–hAb and CuII–mAb

solutions at pH 6.7 and 5.4, at which I is predominant, and atpH 8.7 and 7.6, at which II is predominant. The pKa(I/II)values are close to pH 7.7 for CuII complexes of the human-like peptides and close to pH 6.2 for the murine-like family(see Figures S3 and S5 and Table S1 in the SupportingInformation).

We previously described copper(II)-induced modificationof the peptide NMR spectroscopic signature to determine theCuII-binding sites of hAb.[25] The results obtained were in linewith most previous studies[12,19,22,26,27] and showed that theequatorial binding site of component I is formed by the NH2

group of Asp1, two of the three imidazole rings of His6,His13, and His14, and a CO function. At higher pH values,deprotonation of the Asp1�Ala2 peptide bond leads to thereplacement of one imidazole ring with the Asp1�Ala2deprotonated amide (amidyl) ligand.

In this study, we used NMR spectroscopy to gain moreinsight into CuII coordination to the mAb peptide. Werecorded 1H, 13C, and 2D NMR spectra of mAb peptide atpH 5.4 and 7.6 with or without a substoichiometric amount ofCuII ions (see Figures S6–S14 in the Supporting Information).At pH 5.4 and in the presence of CuII, the side chains of Asp,

[*] H. Eury, Dr. C. Bijani, Prof. Dr. P. Faller, Dr. C. HureauCNRS, LCC (Laboratoire de Chimie de Coordination)205, route de Narbonne, 31077 Toulouse (France)andUniversit� de Toulouse, UPS, INPT, LCC31077 Toulouse (France)Fax: (+33)5-6155-3003E-mail: [email protected]

[**] This research was supported by a grant from the Agence Nationalede la Recherche, Programme Blanc NT09-488591, “NEUROME-TALS” (P.F. and C.H.). C.H. acknowledges Dr. I. Sasaki, Dr. P.Dorlet, and Dr. L. Sabater for valuable comments on the manu-script, L. Rechignat for EPR measurements, and Y. Coppel and C. L.Serpentini for their help with NMR and CD experiments, respec-tively.

Supporting information for this article is available on the WWWunder http://dx.doi.org/10.1002/anie.201005838.

AngewandteChemie

1Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 1 – 6 � 2010 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim

These are not the final page numbers! ��

Glu, and His residues were strongly affected; the signals forthe CO and Ca carbon atoms of Asp1, Asp7, His6, and His14were also broadened, but to a lesser extent. When thepH value was increased to 7.6, the main changes occurred inthe CO region, in which only the CO group of Asp1 wasstrongly affected, and in the Ca region, in which thea positions of Asp1, His6, and to a lesser extent His14, wereaffected. The CD data provide evidence that an amide bond isdeprotonated near pH 6.1, and the NMR spectroscopic dataindicate that deprotonation occurs in close vicinity to His6.We propose deprotonation of the Gly5�His6 rather than theHis6�Asp7 peptide bond, mainly because 1) a six-memberedmetallacycle is more favorable than a seven-memberedmetallacycle and 2) CuII coordination to the shorter peptide

models Ab6 (DAEFGH) and Ab9 (DAEFGHDSG) issimilar.[20] This result is consistent with the fact that theR5G mutation is the key mutation between hAb and mAb.

The crucial information deduced from the NMR spectro-scopic data is that the Gly5�His6 amide bond is deprotonatedduring the transition between I and II : a main mechanisticdifference to the deprotonation of the Asp1�Ala2 bondobserved in the CuII–hAb complex.[25] This difference is evenmore evident from the 13C NMR spectra in Figure 2, in which

the effect of CuII on the Ca regions of hAb and mAb peptidesare shown for I and II. For I, there is no significant differencebetween hAb and mAb in the broadening of the signals forthe His, Asp, andAla2 residues upon CuII binding. In contrast,in the case of II, several 13C nuclei behave differently: thesignal for the Ca atom of Ala2 of hAb but not mAb isbroadened, whereas broadening of the signal for the Ca atomof His6 was observed only for mAb. Divergences betweenhAb and mAb with respect to copper(II)-induced NMR linebroadening are illustrated in Figure 3 (see also Schemes S4and S5 in the Supporting Information). Besides the differ-ences described above, we observed broadening of all signalsfor carboxylate 13C nuclei in the case of mAb (for I and II),whereas in hAb, only that of Asp1 was affected by switchingto II. This result is in line with the formation, in the case ofCuII–hAb, of a tridentate pincer (NH2 (Asp1), N�(Asp1�Ala2), COO� (Asp1)), which is not present after deprotona-tion of the Gly5�His6 peptide bond in the CuII–mAb species.Finally, for II, the carbonyl function affected in the case ofhAb is predominantly that of the Ala2�Glu3 peptide bond,that is, the carbonyl group adjacent to the Asp1�Ala2 amidyl

Figure 1. a) CD and b) EPR spectra of CuII–hAb (black lines) and CuII–mAb complexes (gray lines) at pH 6.5 and 5.4, respectively (top) andat pH 8.7 and 7.6, respectively (bottom). a) T=20 8C, [CuII–Ab]=0.45 mm ; b) n=9.5 GHz, modulation amplitude: 0.45 mT, T=110 K,[CuII–Ab]=0.9 mm. * indicates residual component II.

Figure 2. Ca regions of the13C{1H} NMR spectra of hAb peptide

(10 mm) in D2O (bottom) and in the presence of CuII (top) at pH 6.6(left) and 8.7 (right), and mAb peptide (10 mm) in D2O (bottom) andin the presence of CuII (top) at pH 5.4 (left) and 7.6 (right); T=25 8C,n=125.8 MHz; 0.1 equivalent of CuII was used, except with mAb atpH 5.4 where 0.02 equivalent of CuII was used. The shifting of somepeaks is due to a slight change in the pH value as a result of theaddition of CuII.

Communications

2 www.angewandte.org � 2010 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 1 – 6��These are not the final page numbers!

function, whereas the Asp1�Ala2 carbonyl function (thus, notthat adjacent to the Gly5�His6 amidyl function) is mostaffected in mAb.

A plausible explanation for the deprotonation of theAsp1�Ala2 peptide bond in the CuII–hAb complex (atpH values close to 7.7) and deprotonation of the Gly5�His6peptide bond in the CuII–mAb complex (at pH values close to6.2) is the increased pKa value of the Arg5�His6 peptide bondrelative to that of Gly5�His6. This increased pKa valueprecludes deprotonation of the peptidebond in the case of the hAb peptide andinduces deprotonation near anotheranchoring site, that is, the N terminus.The increase in the pKa value inducedby the bulky Arg residues may be due toan ineffective orientation of the NHamide with respect to the CuII ion as aresult of steric constraints.

The two binding sites of CuII boundto mAb in best agreement with the dataobtained in this study are depicted inFigure 4 (see also Scheme S6 in theSupporting Information). They werededuced by comparison with reportedresults for CuII–hAb. For I, we proposethe involvement of one COO� group inan equatorial position (instead of asecond His residue, as in the case ofhAb) in a 2N2O binding site, rather thana 3N1O binding site (hAb), in line withthe differences observed in the EPRparameters (see Table S1 in the Support-ing Information).[29] Thus, the second Hisresidue lies in an apical position. For II,the main difference with respect to theCuII–hAb binding site is the additionalpresence of the His14 side chain in anapical position. This structure is in linewith the very similar EPR parametersobserved for the CuII complexes of both

peptides and with the broadening of the His14signal detected by NMR spectroscopy in thepresence of CuII ions. The presence of the COgroup of Asp1�Ala2 in the equatorial positionis proposed on the basis of geometric con-straints (five-membered metallacycle with theNH2 group), which favor the equatorial overthe apical position. These models are mostly inline with results reported by Kowalik-Jankow-ska et al. in their pioneering studies,[19,20]

although we propose the involvement of anequatorial carbonyl group (instead of a car-boxylate) in II. Furthermore, the NMR spec-troscopic data obtained in this study enablethe type of binding functions to be attributedto a specific residue. Such data is key to a gooddescription of CuII coordination to the peptideand a better understanding of the biologicalimplications of this coordination. Gaggelli

et al. did not propose coordination of the amidyl functionon the basis of their NMR spectroscopic data obtained atpH 7.5 in a micellar solution.[21] The most plausible reason forthis discrepancy with our results is that, as we previouslydetailed,[25] broadening of the side-chain signals as a result ofCuII binding is more important than the broadening ofbackbone signals.

The comparison of CuII coordination to mAb and hAb

near physiological pH values uncovered three major features:

Figure 3. Schematic representation of the C and H atoms most affected by the binding ofCuII to hAb (top) and mAb peptides (bottom) for I (left) and II (right). The intensity ofthe rings increases according to the extent of broadening of the NMR signals in thepresence of CuII.

Figure 4. Proposed pH-dependent CuII coordination to hAb and mAb peptides. Curved lines stand formetallacycles formed upon CuII binding. As previously observed for hAb, the exchange of chemicallyequivalent ligands at a given coordination position also occurs in the case of mAb. Hence, when theresidue is not specified, several residues (in equilibrium) fulfill the binding function. The structures of theCuII–Ab complexes were drawn with the VMD software.[28] For the sake of clarity, only hydrogen atomsbound to nitrogen atoms are represented; eq.=equatorial, ap.=apical.

AngewandteChemie

3Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 1 – 6 � 2010 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.angewandte.org


1) dynamic equilibria between equivalent binding functionsfor one coordination position were detected for both CuII–hAb and CuII–mAb complexes, even if, in the case of II, theCuII ion is more constrained in hAb (in the N-terminal part)than in the mAb peptide, in which all carboxylate functionsare still involved in CuII binding; 2) the proportions of I and IIdiffer strongly, whereby I is predominant in the case of hAb,and almost only II is present for mAb ; 3) species II of hAb

and mAb mainly differ in terms of the formation of themetallacycle either between the NH2 group and the amidyl N�

atom (Asp1�Ala2; hAb) or between the imidazole ring ofHis6 and the amidyl N� atom (Gly5�His6; mAb).

The first direct consequence of these differences concernsthe formation of the deleterious N-terminally truncatedpyroglutamate forms (p3E-hAb).[30] CuII ions bound to bothAsp1 and Ala2 in the hAb peptide might enhance theformation of p3E-hAb by assisting with the hydrolysis of theAla2�Glu3 bond.[25,27] Such an effect cannot apply in the caseof the mAb peptide.

A second consequence is that the affinity of CuII for mAb

and hAb and the redox response of CuII–mAb and CuII–hAb

complexes should differ significantly. To evaluate the ampli-tude of such variations, we performed a competition experi-ment by CD. We found that CuII is bound about three timesmore strongly by mAb than by hAb under relevant biologicalconditions (Figure 5). Moreover, in a preliminary assessmentof the redox properties of the two complexes, we measuredthe time necessary to reduce CuII to CuI: the first step of anymechanism for the production of ROS.[15] We found that CuII

bound to mAb was reduced two to three times more slowlythan CuII bound to hAb (Figure 5). These two observationssuggest that the situation is very different when both peptidesare present (in transgenic mice and rats) to that when onlyhAb is present (in human AD patients): 1) The Cu2+ ion ispreferentially coordinated to mAb ; as a consequence, it isexpected that less copper is present in amyloid plaquescomposed of hAb.[31] This hypothesis fully agrees with reportsthat amyloid plaques in transgenic mice contain less copperthan those of human patients.[32] 2) Since even trace amountsof Cu2+ binding to hAb influence the aggregation behavior ofthe peptide,[33] the partial withdrawal of Cu2+ by the mAb

peptide may modulate the aggregation of hAb significantly.This hypothesis is in accord with results indicating that themorphology of amyloid plaques is modified in transgenicmice,[31] and that different phenotypes of plaques are obtainedin transgenic mice when injected with brain extracts fromeither AD patients or AD transgenic mice.[34] 3) ROSproduction will be reduced in transgenic mice relative tothat in humans.

Hence, we can conjecture that the interaction of CuII ionswith hAb is altered in murine models as a result of theconcomitant presence of the mAb peptide. Although manyfactors other than copper binding to Ab are important in AD,this interference might be worth considering in studies withAD murine models, in particular when addressing metal-ionhomeostasis.[35]

Received: September 17, 2010Published online: && &&, 2010

Figure 5. a) CD signatures of CuII–hAb (black), CuII–mAb (dark gray),and CuII in the presence of an equimolar mixture of both peptides(light gray); [CuII]=0.45 mm, [peptide]=0.5 mm, l=1 cm, T=20 8C,20 mm phosphate, pH 7.4; x is the calculation of the light-grayspectrum as a linear combination of the two CD signatures of theCuII–hAb and CuII–mAb complexes in a 3:1 ratio. b,c) UV/Vis spectrarecorded at t=0, 0.5, 1, 2, 5, and 10 min after the addition ofascorbate (1.5 equiv) to the complexes CuII–hAb (b; 1 mm) and CuII–mAb (c; 1 mm) in 50 mm phosphate at pH 7.4. Insets show thedecrease in optical density as a function of time, and the correspond-ing fit using exponential decay with t=34 (hAb) and 100 s (mAb).OD=optical density.

Communications


.Keywords: amyloid b peptides · coordination modes · copper ·NMR spectroscopy · peptides

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[35] Note added in proof: During the processing of this manuscript,an article was published supporting the present findings that theR5G mutation is responsible for the difference in CuII bindingbetween human and murine Ab peptides: : L. Hong, T. M.Carducci, W. D. Bush, C. G. Dudzik, G. L. Millhauser, J. D.Simon, J. Phys. Chem. 2010, 114, 11261 – 11271.

AngewandteChemie

5Angew. Chem. Int. Ed. 2010, 49, 1 – 6 � 2010 Wiley-VCH Verlag GmbH & Co. KGaA, Weinheim www.angewandte.org


Communications

Disease Mechanisms

H. Eury, C. Bijani, P. Faller,C. Hureau* &&&&—&&&&

Copper(II) Coordination to Amyloid b :Murine versus Human Peptide

Be wary of mice : At physiologicalpH values, CuII binding to the human andmurine amyloid b peptides differs sig-nificantly. The key mutation R5G in themurine CuII species results in coordina-tion of the amidyl nitrogen atom of theGly5�His6 bond (see scheme). Thehigher binding affinity observed for themurine peptide limits the relevance oftransgenic mice (in which both peptidescoexist) as models for Alzheimer’s dis-ease.

Communications


�

Article I-B

DOI: 10.1002/chem.201100751

X-Ray and Solution Structures of CuIIGHK and CuIIDAHK Complexes:Influence on Their Redox Properties**

Christelle Hureau,*[b] H�l�ne Eury,[b] R�gis Guillot,[c] Christian Bijani,[b]

St�phanie Sayen,[d] Pier-Lorenzo Solari,[e] Emmanuel Guillon,[d] Peter Faller,[b] andPierre Dorlet*[a]

Introduction

Copper is an essential trace element involved in the activi-ties of many enzymes and proteins but can become toxic ifits homeostasis is not tightly controlled. Pathologies relatedto copper include Menkes and Wilson diseases and neurode-

generative disorders such as Alzheimer�s or Prion diseases.In the latter, the redox activity of copper seems to play acrucial role.[1] The Gly-His-Lys (GHK) peptide and the Asp-Ala-His-Lys (DAHK) sequence are naturally occurringhigh-affinity copper chelators found in the blood plasma.[2]

GHK was isolated by Pickart et al.[3] and first described as a

Abstract: The Gly-His-Lys (GHK)peptide and the Asp-Ala-His-Lys(DAHK) sequences are naturally oc-curring high-affinity copper(II) chela-tors found in the blood plasma and arehence of biological interest. A structur-al study of the copper complexes ofthese peptides was conducted in thesolid state and in solution by determin-ing their X-ray structures, and by usinga large range of spectroscopies, includ-ing EPR and HYSCORE (hyperfinesub-level correlation), X-ray absorptionand 1H and 13C NMR spectroscopy.The results indicate that the structuresof [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] in the solid state andin solution are similar and confirm theequatorial coordination sphere of NH2,two amidyl N and one imidazole N.Additionally, a water molecule is

bound apically to CuII as revealed bythe X-ray structure. As reported previ-ously in the literature, [CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)],which exhibits a dimeric structure inthe solid state, forms a monomericcomplex in solution with three nitrogenligands: NH2, amidyl and imidazole.The fourth equatorial site is occupiedby a labile oxygen atom from a carbox-ylate ligand in the solid state. Weprobe that fourth position and studyternary complexes of [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] withglycine or histidine. The CuII exchangereaction between different DAHK pep-tides is very slow, in contrast to [CuII-

ACHTUNGTRENNUNG(GHK)], in which the fast exchangewas attributed to the presence of a[CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)2] complex. The redoxproperties of [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] and [CuII-ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] were investigated by cyclicvoltammetry and by measuring the as-corbate oxidation in the presence ofmolecular oxygen. The measurementsindicate that both CuII complexes areinert under moderate redox potentials.In contrast to [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)], [CuII-ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] could be reduced to CuI

around �0.62 V (versus AgCl/Ag) withsubsequent release of the Cu ion.These complete analyses of structureand redox activity of those complexesgave new insights with biologicalimpact and can serve as models forother more complicated CuII–peptideinteractions.

Keywords: bioinorganic chemistry ·copper · ligand interactions · pep-tides · structural characterisation

[a] Dr. P. DorletLaboratoire du Stress Oxydant et D�toxicationCNRS, URA 2096, 91191 Gif-sur-Yvette (France)andCEA, iBiTec-S, SB2SM, 91191 Gif-sur-Yvette (France)Fax: (+33)1-69-08-87-17E-mail : [email protected]

[b] Dr. C. Hureau, H. Eury, Dr. C. Bijani, Prof. P. FallerCNRS, LCC (Laboratoire de Chimie de Coordination)205, route de Narbonne, 31077 Toulouse (France)andUniversit� de Toulouse; UPS, INPTLCC, 31077 Toulouse (France)Fax: (+33)5-61-55-30-03E-mail : [email protected]

[c] Dr. R. GuillotCNRS, ICMMO—UMR 8182, B�t. 420Universit� Paris-Sud 11, 91405 Orsay Cedex (France)

[d] Dr. S. Sayen, Prof. E. GuillonGroupe de Chimie de Coordination, CNRSICMR—UMR 6229Universit� de Reims Champagne-Ardenne51687 Reims Cedex 2 (France)

[e] Dr. P.-L. SolariSynchrotron SOLEIL, Saint-Aubin91192 Gif-Sur-Yvette Cedex (France)

[**] GHK and DAHK refers to the peptide chains Gly-His-Lys and Asp-Ala-His-Lys, respectively.

Supporting information for this article is available on the WWWunder http://dx.doi.org/10.1002/chem.201100751.

Chem. Eur. J. 2011, 00, 0 – 0 � 2011 Wiley-VCH Verlag GmbH&Co. KGaA, Weinheim

These are not the final page numbers! ��&1&

FULL PAPER

liver cell growth factor. Further studies showed that GHKpossesses a wide range of biological activities, including ac-celeration of wound healing[4] and tissue remodelling.[5]

When complexed to this peptide, CuII is bound by the�NH2, the Np of the histidine residues and one amidylgroup from the backbone. The equatorial coordinationplane is completed in solution by a labile ligand, thus allow-ing formation of ternary species with exogenous amino acidresidues in a biological medium.[6] DAHK is the N-terminalfragment of the human serum albumin (HSA). HSA is themost abundant blood serum protein involved in CuII trans-port[7] and also a major component of cerebrospinal fluid.Among the two CuII binding sites present in HSA, theN-terminal motif possesses the higher affinity.[8] CuII isbound to the �NH2, the Np of the histidine residues and twoamidyl groups from the peptide backbone, thus being arche-typal of the so-called ATCUN binding motif (H2N�XXHbeginning sequence in a peptide/protein) also found in otherproteins, that is, neuromedins C and K, human sperm prota-mine P2a and histatins.[2a] DAHK has also recently beenshown to restore cell survival of cells exposed to Cu andCu-Ab (Ab is the amyloid-b peptide involved in Alzheim-er�s disease) and this effect has been attributed to redox si-lencing of Cu when bound to DAHK.

As a consequence, CuII binding to these two peptides is ofparamount importance. In addition, the present study wasalso motivated by the need to obtain a set of reference spec-troscopic signatures coupled to redox behaviour to model indetail CuII sites with 3N+1O or 4N equatorial bindingmodes in other peptides and proteins. In this paper, we givenew insights into the CuII coordination to the DAHK andGHK peptides and discuss the results in comparison withstudies previously performed on these species. The X-raystructures of both complexes are described and their solu-tion structures are characterised by advanced spectroscopicmethods. The redox properties are then analysed and de-tailed in relation to the structural observations.

Results and Discussion

X-ray structures : The crystal structures of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)]and [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] complexes were determined by single-crystal X-ray diffraction. Table 1 and Table 2 summarisecrystal data and selected bond lengths and angles. In bothcases, the CuII ion is penta-coordinated in a distortedsquare-planar pyramid environment with an oxygen in theapical position.

In the case of [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] (see Figure 1), the structure isessentially identical to that previously reported by Perkinsand co-workers,[9] and close to that of [CuII(GH)].[10] Thebinding mode in the equatorial plane is 3N+1O: the CuII

ion is ligated by the glycine amino nitrogen, the deprotonat-ed amide nitrogen of the glycine–histidine peptide bond, theNp nitrogen of the imidazole side chain of the histidine andthe lysine carboxylate of a neighbouring complex. Theapical oxygen is provided also by the lysine carboxylate of

another neighbouring complex. This is in contrast with thestructure of [CuII(GH)][10] for which the apical oxygen is awater molecule. Two [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] monomeric units are thusarranged in a dimeric diamond-core type structure in whichthe two CuII centres are spaced by 3.458 � and the twobridging oxygen atoms by 2.874 �. A total of 16 sites for a

Table 1. Crystal data and structure refinement for [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] and[CuIIACHTUNGTRENNUNG(DAHK)]. ACHTUNGTRENNUNG[CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] ACHTUNGTRENNUNG[CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)]

formula C19H30CuN7O7·7H2O·Cl C14H23CuN6O4·9.25H2OMr [gmol�1] 693.61 550.92T [K] 100(1) 100(1)l [�] 0.71073 0.71073crystal size [mm3] 0.18�0.06�0.01 0.32�0.27�0.21crystal colour purple bluecrystal system trigonal tetragonalspace group P32 P41212unit cell dimensions 0.18�0.06�0.01 0.32�0.27�0.21a [�] 14.4934(3) 14.4793(2)b [�] 14.4934(3) 14.4793(2)c [�] 12.1728(5) 26.3306(7)a [8] 90 90b [8] 90 90g [8] 120 90V [�3] 2214.43(11) 5520.21(18)Z 3 81calcd [Mgm�3] 1.560 1.326absorption coefficient[mm�1]

0.907 0.856

F ACHTUNGTRENNUNG(000) 1095 2272reflns collected 8978 115905indep reflns (Rint) 5001 (0.0631) 8484 (0.0391)obsd reflns (I>2s(I)) 7423 7094final R indices(I>2s(I))

R1=0.0457,wR2=0.1017

R1=0.0666,wR2=0.1899

R indices (all data) R1=0.0645,wR2=0.1110

R1=0.0854,wR2=0.2267

Flack parameter 0.005(10) 0.022(19)S 1.069 1.060ACHTUNGTRENNUNG(D/s)max 0.000 0.009(D1)max/min [e�

�3] 0.981/�0.728 0.780/�0.137

Table 2. Selected bond lengths [�] and angles [8].ACHTUNGTRENNUNG[CuIIACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] (100 K) ACHTUNGTRENNUNG[CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] (100 K)

Cu�N(1) 2.029(3) Cu�N(1) 1.957(4)Cu�N(2) 1.906(3) Cu�N(2) 1.945(3)Cu�N(3) 1.967(2) Cu�N(3) 2.003(3)Cu�N(4) 1.969(3) Cu�O(3)[a] 1.967(2)Cu�O(8) 2.565(3) Cu�O(3)[b] 2.513(3)N(1)-Cu-N(2) 83.70(11) N(1)-Cu-N(2) 93.58(15)N(1)-Cu-N(3) 166.74(10) N(1)-Cu-N(3) 172.79(16)N(1)-Cu-N(4) 98.81(11) N(1)-Cu-O(3)[a] 90.40(15)N(1)-Cu-O(8) 90.28(11) N(1)-Cu-O(3)[b] 98.50(14)N(2)-Cu-N(3) 83.11(11) N(2)-Cu-N(3) 83.53(12)N(2)-Cu-N(4) 173.55(10) N(2)-Cu-O(3)[a] 175.82(12)N(2)-Cu-O(8) 89.98(11) N(2)-Cu-O(3)[b] 99.34(12)N(3)-Cu-N(4) 94.45(11) N(3)-Cu-O(3)[a] 92.67(12)N(3)-Cu-O(8) 88.34(11) N(3)-Cu-O(3)[b] 88.51(15)N(4)-Cu-O(8) 95.89(11) O(3)[a]-Cu-O(3)[b] 78.75(16)

[a] Symmetry code: 1=2�x, y, 1=2�z. [b] Symmetry code: 1=2�y, 1=2+x, 1=4+

z.

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�� These are not the final page numbers!&2&

water molecule were present in the unit cell of our structureof [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] with an occupancy of 9.25 compared with 14sites for the structure of Perkins et al. with an occupancy of9.2.

The complex [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] corresponds to the high-af-finity binding site of human serum albumin and its crystalstructure is reported here for the first time (see Figure 2).

The CuII ion is bound by 4 nitrogen ligands in the equatorialplane: the aspartate amino group, two deprotonated amidefunctions from the first two peptide bonds and the Np nitro-gen of the imidazole side chain of the histidine residue. Theapical oxygen along the Jahn–Teller distortion axis is provid-ed by a water molecule in hydrogen-bond interactions withother solvent molecules in the unit cell. By contrast with thestructure of [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)], all protons could be resolved andrefined in this structure. The peptide is in its fully protonat-ed form and one chloride counterion per complex is present.In addition, the crystal structure of this complex is mono-meric rather than the dinuclear motif observed for [CuII-ACHTUNGTRENNUNG(GHK)]. A total of 7 water molecules are present in the

unit cell. The main difference with the X-ray structure ofCuII bound to GGH–NH2, the simplest peptide to form anATCUN motif, is the presence of an apical water only inone out of two complexes in the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GGH–NH2)] struc-ture.[11] Contrary to what has been conjectured previous-ly,[11,12] the carboxyl oxygen from Asp1 does not occupy theapical position in the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] complex.

Electronic and ESI-MS data : In solution and at room tem-perature, the characteristic blue and purple colours for[CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] and [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] are retained (see Figure S1in the Supporting Information for UV/Vis and circular di-chroism data). The ESI-MS spectra (positive detectionmode) of [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] and [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] are shown inFigure 3 and Figure S2 in the Supporting Information. Peaks

of CuII-containing species are recognizable by their isotopicpattern (63Cu=65%, 65Cu=35%). The main peak at m/z531.5 in the [CuIIACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] spectrum (100% of relative in-tensity) corresponds to the two-proton adduct of the oncenegatively charged [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] species. This was con-firmed by the detection of a peak at m/z 529.5 in the nega-tive detection mode (data not shown). Another peak detect-ed at m/z 385.3 (30% of relative intensity) is attributed tothe [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAH)] species issued from the fragmentation of

Figure 1. X-ray structure of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] complex. Each CuII ion ispenta-coordinated. Considering the ion on the right, the equatorial posi-tions are occupied by atoms N(1) to N(3) and O(3)[a] , whereas the apicalposition is occupied by O(3)[b] . These last two oxygen atoms are sharedwith the other CuII ion for which their position is interchanged (O(3)[a]

being in the apical position, whereas O(3)[b] is in the equatorial positionfor the ion on the left).

Figure 2. X-ray structure of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] complex. The CuII ion ispenta-coordinated with four nitrogen ligands in equatorial positions(N(1) to N(4)) and one water molecule in the apical position (O(8)).

Figure 3. ESI-MS spectra of [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] and [CuIIACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] complexesin the positive detection mode. [CuII ACHTUNGTRENNUNG(peptide)]=200 mm, pH 7.6 (adjustedwith NH3).

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FULL PAPERCuIIGHK and CuIIDAHK Complexes

the parent peak at m/z 531.5. Departure of the Lys residuesfrom the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] complex is in line with a CuII bind-ing site in which only the first three residues are involved.The main peak detected in the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] spectrum corre-sponds to the monocationic [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] species. A peak atm/z 803.5 that corresponds to the [Cu2ACHTUNGTRENNUNG(GHK)2] species (Fig-ure S2) is observed but with a very low relative intensity(less than 5%), thereby suggesting that the binuclear unitobserved in the solid state is mainly disrupted in solution.Fragmentation peaks observed at m/z 372.1 (65% of relativeintensity) and 229.3 (22% of relative intensity) are attribut-ed to the departure of the [NH2�CH2] N-terminal motif andthe additional removal of the Lys residues from the parentspecies and were confirmed by MS/MS experiments. Contra-ry to what was observed in the case of [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)], themain fragmentation peak observed corresponds to the re-moval of the [NH2�CH2] N-terminal motif suggesting thatthe principal CuII anchor site is the His residue. Only in asecond time, the Lys residue is lost. The very low intensityof the peaks observed at m/z 470.1 ([CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] spec-trum) and at m/z 341.1 ([CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] spectrum), which cor-respond to the DAHK and GHK ligands, respectively,agrees with a CuII ion strongly bound by both peptides.

X-ray absorption spectroscopy (XAS): To gain further in-sight into CuII coordination in solution, X-ray absorptionspectra were analysed in the near-edge structure (XANES)and in the extended region (EXAFS). EXAFS data (Fig-ure S3 in the Supporting Information) are best fitted withfive N/O neighbours ([CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)]) and with either five orsix N/O neighbours ([CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)]), four of them being sig-nificantly closer (Table 3). In the case of [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)], it isdifficult to determine precisely whether one or two axialoxygen atoms are involved in the copper coordination in so-lution, given both fits were very similar as shown by thevery close value of the goodness-of-fit (0.44 and 0.53% for(4+2) and (4+1) neighbours, respectively).

The EXAFS data are thus consistent with the X-ray struc-tures. Qualitative XANES analysis agrees with geometricaldata determined by EXAFS. The [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] and [CuII-ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] XANES data (Figure 4) show the presence of thepre-edge P peak at 8979.7 eV, assigned to the 1s!3d transi-

tion characteristic of the CuII valence state. The lower inten-sity of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] pre-edge feature indicates that theCuII centre is in a more centro-symmetric environment thanin [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)].[13] The XANES signatures differ betweenthe two CuII species, as indicated by more intense B and Dpeaks and less-pronounced A and C peaks for [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)]than [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)]. In related systems, these peaks havebeen proposed to be sensitive to second- and third-shell per-turbations.[14] More precisely, an increase of the B peak anda decrease of the C peak were related to a more importantcontribution of external shells. In the present case, the moreintense B peak (or less intense C peak) for [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] rel-ative to [CuIIACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] is likely related to the possibility ofhaving an exchangeable fourth equatorial ligand in the[CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] species, also consistent with a greater Debye–Waller factor. These results show that the square pyramidalstructure observed in the solid state for the two complexesis retained in solution.

EPR spectroscopy : EPR spectra (9 GHz) were recorded for[CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] and [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] complexes in solution andare shown in Figure 5. Characteristic parameters are listedin Table 4. Both complexes display a classical mononuclearsquare-planar-type EPR spectrum with some resolved super-hyperfine interaction in the g? region, as previously report-ed.[15] The gk and Ak values measured on the spectra areconsistent with the 3N+1O and 4N binding mode, respec-tively.[16] These binding modes are thus retained from thesolid state to solution. In the case of [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)], however,the dinuclear structure observed in the crystal state is notpresent in solution.[15a] Therefore it is likely that the equato-rial oxygen ligand, provided by the C-terminus carboxylate

Table 3. First coordination shell structural data obtained from R spacefits of EXAFS spectra: N is the number of neighbours, R is the absorb-er–neighbour distance, s is the Debye–Waller factor; uncertainties are es-timated in coordination numbers to �10%, in R to �0.02 �, and to�0.001 �2 in s2. For [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)], results of fits with 4+2 neighboursand 4+1 neighbours as starting parameters are given.

Scattered/Backscat-tered

N R[�]

s2

[�2]R factor[%][a]ACHTUNGTRENNUNG[CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)] Cu�N/O 4.49 1.97 0.0057 0.12

Cu�O 0.79 2.61 0.01[b]ACHTUNGTRENNUNG[CuIIACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] Cu�N/O 4.49 1.95 0.0046 0.44ACHTUNGTRENNUNG(4+2) Cu�O 1.52 2.50 0.01[b]ACHTUNGTRENNUNG[CuIIACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] Cu�N/O 4.42 1.95 0.0045 0.53ACHTUNGTRENNUNG(4+1) Cu�O 1.49 2.49 0.01[b]

[a] R factor represents the overall goodness-of-fit. [b] Fixed parameter.

Figure 4. The XANES regions of the normalized absorption amplitudeversus energy for [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] and [CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)] complexes at pH 7.4.[CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)]=50 mm and [CuIIACHTUNGTRENNUNG(DAHK)]=50 mm, T=298 K.

Table 4. EPR parameters obtained from the spectra of the different com-plexes in Figure 5.

gk g? Ak (63Cu) [MHz]ACHTUNGTRENNUNG[CuIIACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] 2.19 2.04 596ACHTUNGTRENNUNG[CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)] 2.23 2.05 560ACHTUNGTRENNUNG[CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)2] 2.22 2.05 595ACHTUNGTRENNUNG[CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)G] 2.22 2.05 568ACHTUNGTRENNUNG[CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)H] 2.21 2.05 590



P. Dorlet, C. Hureau et al.

of a neighbouring molecule in the crystal, is replaced by asolvent molecule in solution, as previously proposed,[15a] orby an acetate anion present from the peptide batch, sold asan acetate salt. This is in line with the XANES results,which propose an exchangeable equatorial ligand. Thislabile position has been investigated by addition of eitherglycine or histidine to the [CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)] solution.

The EPR spectrum obtained for [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)G] differsslightly from that of [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)], particularly in the gkregion. The superhyperfine structure on the g? region isalso affected. To better probe the coordination mode of theadditional glycine amino acid, we have used different isotop-ically labelled glycine (15N on the amine group or 13C eitheron the carboxylate group or on the Ca). The superhyperfinestructure observed for the 15N-labelled glycine differs suffi-ciently from that of the unlabelled sample to support bind-ing through the amine function. The weak 13C couplingswere probed with pulse EPR. Figure 6 shows the 6-pulse hy-perfine sub-level correlation (HYSCORE) contour plots ob-tained for both carboxylate and Ca-labelled samples. Thistechnique is best adapted in this type of multinuclear cou-pled systems and was chosen in particular to avoid intensitysuppression effects.[17] Ridges centred at the 13C Larmor fre-quency were detected in both samples. The signal was moreintense and the coupling stronger for the Ca-labelled samplerelative to the carboxylate-labelled sample, thereby support-ing the fact that the additional glycine binds predominantlyby its amine function in equatorial position (we note thatbased on these data we cannot fully exclude that a fractionof the additional glycine binds through its carboxylate func-tion). This binding mode is in agreement with the observa-tions made on the continuous-wave (cw) EPR spectra.

In the case of the [CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)H] complex, a drasticchange was observed in the superhyperfine coupling pattern.The seven superhyperfine lines, consistent with a 3N+1Obinding mode for [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)], were replaced by a nine-line

pattern consistent with a 4N binding mode for [CuII-ACHTUNGTRENNUNG(GHK)H]. This latter pattern is affected when histidine la-belled with 15N only on the imidazole ring is used to preparethe complex, thereby indicating that the additional histidinebinds to the Cu ion through the imidazole ring rather thanits N terminus. This is confirmed by HYSCORE measure-ments performed on the labelled sample for which a charac-teristic 15N cross-peak was detected (see Figure S4 in theSupporting Information).

In the case of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)2] complex, a change similarto that observed for the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)H] complex was detect-ed in the superhyperfine coupling pattern as well as in thegk and Ak parameters. This indicates that the second GHKligand should bind the CuII centre through its imidazolering.

NMR spectroscopy : In conjunction with other spectroscopictechniques, NMR spectroscopy can yield information aboutboth CuII coordination to peptides and the dynamic/mecha-nism of CuII exchange between peptides. Due to its para-magnetism, CuII induces the broadening of the bindinggroups in its close vicinity.[18] The impact of CuII on the spec-trum will vary considerably depending on the CuII exchangerate (between holo and apo forms) relative to the timescaleof the NMR spectroscopic experiment performed. The twoexamples studied here are representative of extreme cases:the CuII exchange is very slow when bound to DAHK andfast when bound to GHK. 13C spectra of the GHK andDAHK peptides in presence of 0.1 and 0.5 equiv of CuII, re-spectively, are shown in Figure 7 and Figure 8. The corre-sponding 1H spectra are shown in the Supporting Informa-tion. Based on these data, a mapping of the residues mostaffected is proposed in Scheme 1.

In the case of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] complex, the C- and N-terminal and the side chain of His and Asp are affected,whereas in the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] complex, despite being record-ed in the presence of a fivefold lesser CuII content, almostall residues are strongly broadened with the exception ofthe Lys side chain. This suggests that in the case of DAHK,

Figure 5. cw EPR spectra recorded for different Cu complexes. The rightpanel is an enlargement of the g? region for some spectra to comparetheir superhyperfine patterns. Experimental conditions: microwave fre-quency 9.42 GHz, microwave power 0.13 mW, modulation amplitude0.5 mT, modulation frequency 100 kHz, time constant 164 ms, T=50 K.Samples prepared in HEPES buffer 100 mm, pH 7.4.

Figure 6. Six-pulse HYSCORE contour plot recorded for [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)G-ACHTUNGTRENNUNG(13COO)] (left panel) and [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)GACHTUNGTRENNUNG(13Ca)] (right panel). The labelsfor the cross-peaks are indicated on the left panel. Experimental condi-tions: microwave frequency 9.71 GHz, B=337 mT, t1=104 ns, t1=136 ns,T=4.2 K. Samples prepared in HEPES buffer 100 mm, pH 7.4.




the CuII exchange is very slow and that the peaks observedbelong to the apo form of the peptide, with those of the CuII

complex being fully broadened and thus difficult to detect,which is in line with what was proposed on longer HSA N-terminal fragments.[19] This hypothesis is confirmed by quan-tification of the 1H NMR spectroscopic signal, which showsthat in presence of 0.5 equiv of CuII, the intensity of thesignal recorded is about half that of the apopeptide (Fig-ure S6 in the Supporting Information). Knowing that theCuII binding affinities for both peptides are close,[2b,20] thisresult was unanticipated. Actually, the reason for such a dis-crepancy may be connected to the fact that, in a substoichio-metric CuII ratio, GHK can form [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)2] species (see

Figure S7 in the Supporting Information and ref. [2b]), withthe second GHK occupying the fourth equatorial positionthrough the imidazole ring of the His side chain (see theEPR spectrum in Figure 5 and ref. [21]). Formation of sucha ternary complex will help Cu exchange from one peptideto another. As previously described,[14e] CuII broadening ofpeptide residues can also originate from involvement in Cutransfer (even if the Cu transfer is very slow, as in the caseof DAHK). This is one possible reason why Asp and His lat-eral chains and the C- and N-terminal of DAHK are the res-idues mostly affected. The second possibility is that thesefour functions (from the apo peptide) may be involved inchemical exchange for CuII apical binding (in the holo pep-tide). Related to that, the carboxylate groups from Asp1 orC-terminal are equivalently broadened, which strongly sug-gests that these functions are involved in Cu transfer but notin direct Cu binding in solution. Hence, this data is in disa-greement with the previously proposed coordination ofAsp1 carboxylate function in the CuII apical position.[12]

Electrochemistry : Cyclic voltammetry (CV) traces of [CuII-ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] and [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] complexes are shown inFigure 9. The main difference with previous data publishedin the literature is the nature of the working electrode.[22] Inthe present study, we used vitreous carbon electrode, whichhas been shown to be a well-suited surface for the study ofCuII–peptide complexes.[23]

The CV trace of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] complex shows nocathodic process and a reversible anodic process at E

1=2 =

Figure 7. 13C{1H} NMR spectra of 10 mm GHK peptide in D2O in the ab-sence (bottom spectrum) or in the presence of 0.1 equiv CuII (top spec-trum) at pH 7.2. Note that the shift of some peaks is due to a slight modi-fication of the pH value after CuII addition. T=298 K, n=125.8 MHz.

Figure 8. 13C{1H} NMR spectra of 10 mm DAHK peptide in D2O in theabsence (bottom spectrum) or in the presence of 0.5 equiv CuII (top spec-trum) at pH 7.2. Note that the shift of some peaks is due to slight modifi-cation of the pH value after CuII addition. T=298 K, n=125.8 MHz.

Scheme 1. Schematic representation of the C and H atoms for which theNMR spectroscopic signal is broadened upon addition of CuII to GHK(top) and DAHK (bottom) at pH 7.2. Black=highly broadened, darkgrey=broadened, grey=moderately broadened, light grey= slightlybroadened.




0.77 V versus AgCl/Ag (DEp=130 mV) that corresponds tothe reversible oxidation of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] complex into[CuIII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)]+ , which is in line with what was previouslyobserved for related complexes.[24] More precisely, the E

1=2

oxidation process abides by the following trend with respectto the equatorial binding plane: {NH2, 3N�}[24a] (0.41 Vversus AgCl/Ag)< {ImACHTUNGTRENNUNG(His), 3N�}[24b] (0.66 V versus AgCl/Ag)< {NH2, Im ACHTUNGTRENNUNG(His), 2N�} (0.77 V versus AgCl/Ag).

The CV trace of the [CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)] complex shows noanodic process and an irreversible cathodic process at Ep1=

�0.49 V versus AgCl/Ag that corresponds to the reductionof the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] complex. This is in drastic contrast tothe CV trace obtained for CuII with no peptide in the samebuffer, which shows a reduction of CuII to CuI at Ep0=

�0.07 V versus AgCl/Ag followed by reduction of CuI toCu0 at Ep1=�0.54 V versus AgCl/Ag (redox processes aresummarised in Scheme 2A). On the reverse scan for [CuII-ACHTUNGTRENNUNG(GHK)], a first anodic peak is detected at EpS’=�0.07 Vversus AgCl/Ag. Its shape and position are characteristic ofthe oxidation–solubilisation process of adsorbed Cu0 thatlead to CuI. A second anodic peak is detected at Ep2’=

0.02 V versus AgCl/Ag and corresponds to oxidation of CuI

to CuII. This indicates that reduction of [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] is fol-lowed by decoordination of the peptide ligand. Due to thedifference in Lewis acidity of CuI and CuII, protonation ofthe amidyl function of the Gly–His peptide bond involved inthe CuII binding is likely concomitant with the reductionprocess. At the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] reduction potential (�0.54 Vversus AgCl/Ag), unbound CuI is reduced to Cu0[25] and ad-sorbed onto the electrode. When scanning back towardscathodic potential, the reduction of unbound CuII to CuI

(expected near Ep0=�0.07 V versus AgCl/Ag) is not ob-served, thus indicating that formation of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)]complex is faster than 1 s. The different redox processes de-

tected in the CV trace of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] complex are sum-marised in Scheme 2B.

In the presence of an excess amount of GHK or His, thecathodic peak is not modified significantly, which meansthat the nature (N or O) of the fourth ligand has littleimpact on the reduction process. On the contrary, the de-sorption peak (p2 in Figure 9) is greatly reduced and the ox-idation peak of CuI to CuII (Ep2’) is slightly shifted. This is inline with the coordination of CuI by the imidazole (Im)from the side chain of GHK or His. We propose that in thepresence of an excess amount of GHK or His, the CuI re-lease after reduction of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] species is coordi-nated by the excess ligand, thus leading to the formation ofa new CuI complex. This new CuI complex is oxidised atEp2’=0.04 V versus AgCl/Ag (in the case of an excessamount of GHK) and Ep2’=�0.01 V versus AgCl/Ag (in thecase of an excess amount of His). In this latter case, we pro-pose that the motif Im-CuI-Im, which is quite usual in CuI

coordination,[26a,b] is formed (illustrated in Scheme 2C). Inthe former case, the GHK ligand may remain bound byboth the terminal�NH2 and the His.

Note that we also performed the same series of experi-ments in phosphate buffer (see Figure S8 and Scheme S2 inthe Supporting Information). In the latter case, it is not pos-sible to record the CV trace of unbound CuII because of itsrapid precipitation in phosphate buffer. However, in thepresence of GHK or DAHK peptide, the results obtained inphosphate buffer were fully consistent with those obtained

Figure 9. Cyclovoltammogram recorded for [CuII], [CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)], [CuII-ACHTUNGTRENNUNG(GHK)2], [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)H] (left panel) and for [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] (rightpanel). Experimental conditions: scan rate 100 mVs�1, T=298 K, 0.1m50 mm, Tris buffer pH 7.4, 0.1m NaClO4, [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)]=2 mm ; [CuII-ACHTUNGTRENNUNG(GHK)]=1.6 mm.

Scheme 2. Electrochemical processes associated with the reduction ofA) [CuII], B) of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] complex and C) of the [CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)]complex in presence of an imidazole (Im) donor species. Potentials referto Figure 9.




in tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) buffer exceptfor small modifications in peak potentials. This suggeststhat, even if the tris buffer interferes with CuII binding toDAHK and GHK peptides, this doesn’t impact significantlythe electrochemical signatures.

Reactive oxygen species (ROS) production : The cyclic vol-tammetry data of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] complex provide evi-dence of an irreversible reduction peak at �0.62 V versusAgCl/Ag, whereas those of the [CuIIACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] show aunique reversible oxidation process at 0.72 V versus AgCl/Ag (but no reduction process); hence these data suggest theimpossibility for both complexes to be directly reduced byascorbate (Asc). This is why catalytic oxidation of Ascunder aerobic conditions by both complexes was comparedto oxidation by unbound CuII. Consumption of Asc wasmonitored by the decrease of its absorption band at 265 nm.Drastic deceleration of Asc consumption was observed inthe presence of both peptides (Figure S9 in the SupportingInformation), which is in line with a redox silencing of CuII

when bound to the peptides and with the redox potentialvalues of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] and [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] complexesand that of Asc (�0.1 V versus AgCl/Ag).

Previous results showed a propensity of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)]complex to catalyze the HOC formation using Asc as reduc-tant.[22b] As HOC production from dioxygen requires theredox cycling of the copper complex (Scheme S3 in the Sup-porting Information), and as our data show that Asc isunable to reduce [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)], these results were re-evalu-ated. Fluorescence measurements were performed by usingcoumarin-3-carboxylic acid. We found very weak HOC pro-duction (in the range of residual HOC production in the ab-sence of added CuII ion) for both [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] and [CuII-ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] complexes relative to the HOC production in simi-lar concentrations of unbound CuII (Figure S10 in the Sup-porting Information). Similar results were obtained withEPR using the a-(4-pyridyl-1-oxide)-N-tert-butylnitrone(POBN) spin trap (data not shown). Error in the previousresults[22b] with regards to the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] complex is at-tributed either to 1) a miscalculation of the GHK concentra-tion (see the Experimental Section), thus leading to un-bound CuII in solution or 2) an inversion with data of the[CuII ACHTUNGTRENNUNG(Gly)2] species, which was found to produce no HOC,[22b]

a result further questioned.[27]

Conclusion

In the present work we gained new insight into the structur-al aspects of [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] and [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] and reporteddata on their redox behaviour. The use of several spectro-scopic techniques together with the determination of thecrystal structure gave a complete set of information, whichwill be important as reference in the analysis of other, morecomplicated CuII–peptide interactions with peptides such asamyloid-b or a-synuclein sequences, for example, for whichno crystal structure is available. Moreover, the analysis shed

new light on CuII exchange dynamics and redox behaviourin particular. This is important in the biological context.DAHK is the high-affinity CuII binding site of human serumalbumin; this region is 5% occupied with CuII. This is thefirst time this copper-loaded sequence has been crystallised.It has been suggested that albumin is involved in CuII trans-port in the blood towards other targets. The slow exchangerate of CuII in DAHK indicates that albumin is not a fastCuII supplier. The observation of an axial water molecule in-dicates that also other ligands can bind on this labile posi-tion, which might be the reason why CuII is not completelyinert and can be exchanged, albeit very slowly. Thus differ-ences in the coordination of the apical position might ex-plain differences seen between the reactivity of [CuII-ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] and Cu–albumin.[8,28] Although the affinity ofGHK for CuII is on the same order of magnitude as that ofDAHK,[21] it exchanges much faster and hence could serveas a fast CuII supplier. The structural reason for that is thatthe fourth equatorial binding site on CuII is available to binda transfer partner. Another way to transfer CuII fromDAHK and GHK is by reducing CuII to CuI, which mightoccur in the reducing intracellular environment. The CV re-sults indicate that CuII in DAHK is stable and not reducedto CuI. By contrast, it is possible in the case of GHK with aconcomitant release of CuI. Thus CuII in GHK could be re-leased and transferred to other targets by reduction (withreductants stronger than Asc), as it could be expected intra-cellularly.

Experimental Section

Chemicals : All solutions were prepared with Milli-Q (18 MW) water.GHK peptide was bought from Bachem (Switzerland); DAHK peptidewas bought from Bachem (Switzerland) or GeneCust (Dudelange, Lux-embourg). pH was controlled using a 744 pH meter equipped with a bio-trode electrode (Metrohm SA, Switzerland). Stock solutions of peptideswere prepared by dissolving the peptides in D2O (�50 mg in 1 mL) andconcentrations were determined by titration followed by UV/Vis absorp-tion spectroscopy (using an Agilent 8453 spectrometer at 25 8C in 1 cmpath-length quartz cuvette). In a typical experiment, the stock solutionwas diluted tenfold and amounts of a CuII solution of known concentra-tion were added until no increase in the d–d band of the CuII–peptidecomplex and turbidimetry due to unbound CuII precipitation in thebuffer were observed. Measurements were performed in 0.1m phosphatebuffer (pH 7.4). This experimental determination led to concentrationvalues that are 10–20% off compared to those obtained using the molec-ular mass of the peptide and its counterions, thereby suggesting thatcounterion salts co-precipitate during peptide synthesis. Stock solutionswere stored at �20 8C. Unless specified, the CuII ion source was hydratedCu ACHTUNGTRENNUNG(SO4). For EPR measurements, a 0.1m stock solution of 63CuACHTUNGTRENNUNG(NO3)2obtained by nitric acid treatment of isotopically pure 63Cu (Eurisotop,Saclay, France) was used and 10% glycerol was added to the samples.[Cu ACHTUNGTRENNUNG(GHK)2], [Cu ACHTUNGTRENNUNG(GHK)H] and [CuACHTUNGTRENNUNG(GHK)G] were prepared by addingGHK (1 equiv), His (1 equiv) and Gly (10 equiv) to the [CuACHTUNGTRENNUNG(GHK)] com-plex, respectively.

For ascorbate, a stock solution (20 mm) of ascorbate was prepared inmilli-Q water at room temperature just before beginning the experimentand was used immediately. Because ascorbate degrades very quickly, anew solution was prepared for each experiment.

A stock solution (1 mm) of desferrioxamine (DFO, Sigma) was preparedby dissolving the appropriate mass in milli-Q water.




A stock solution of coumarin-3-carboxylic acid (5 mm) was prepared inphosphate (20 mm), NaCl (100 mm) buffer at pH 9 at room temperature.The stock solution was stored at �20 8C.15N-labelled glycine, 13C-(COO�)-labelled glycine and 15N(Im)-labelledhistidine were purchased from Eurisotop (Saclay, France).

X-ray diffraction : Crystals suitable for X-ray diffraction were obtainedby slow ethanol diffusion and evaporation of a 0.2m solution in milli-Qwater of the corresponding complex. Data were collected using a KappaX8 APPEX II Bruker diffractometer with graphite-monochromatedMoKa radiation (l=0.71073 �). The temperature of the crystal was main-tained at the selected value (100 K) by using a 700 series Cryostreamcooling device within an accuracy of �1 K. Intensity data were correctedfor Lorentz polarisation and absorption factors. The structures weresolved by direct methods using SHELXS-97[29] and refined against F2 byfull-matrix least-squares techniques using SHELXL-97[30] with anisotropicdisplacement parameters for all non-hydrogen atoms.

Treatment of H : H atoms of the ligand were added from the differenceFourier map and refined by the riding model. For the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)]complex only, the H atoms of the water molecules were subsequently in-cluded in the refinement in geometrically idealized positions, with C�H=

0.96(3) � and H�H=1.52(3) �, and refined using the riding model withisotropic displacement parameters of Uiso(H)=1.4Ueq (parent atom). For[CuIIACHTUNGTRENNUNG(GHK)], the lateral chain of lysine is disordered over two sites withoccupancies of 0.5:0.5. Occupancy parameters for the 16 water oxygenatoms were refined. The net occupancy of the ordered water is 9.25. Allcalculations were performed by using the Crystal Structure crystallo-graphic software package WINGX.[31] The absolute configuration was de-termined by refining the Flack parameter[32] using a large number of Frie-del pairs.

CCDC-809108 ([CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)]) and 809109 ([CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)]) contain thesupplementary crystallographic data for this paper. These data can be ob-tained free of charge from The Cambridge Crystallographic Data Centrevia www.ccdc.cam.ac.uk/data_request/cif.

ESI-MS measurements : ESI mass spectra were recorded using an API365 MS mass spectrometer at a flow rate of 5 mLmin�1.

XAS measurements : Cu K-edge XAS spectra were recorded using theSAMBA bending magnet beamline at Synchrotron SOLEIL (Saint-Aubin, France). The main optical elements consisted of a double crystalSi ACHTUNGTRENNUNG(111) dynamical focusing monochromator between two palladium-coated mirrors, one collimating the beam in the vertical direction andone focusing it on the sample. X-ray harmonic rejection was obtained bysetting the energy cutoff to change the incidence of the mirrors. Themeasurements were performed on solution samples at room temperaturein the fluorescence mode using a single-element Silicon Drift Detector(SDD). The energy was calibrated by the simultaneous measurement of aCu foil spectrum in transmission (first inflection point set at 8980.3 eV).Possible X-ray photo-reduction of the [CuII ACHTUNGTRENNUNG(peptide)] samples was moni-tored by checking, on consecutive scans, the appearance of the XANESfeature at 8984 eV, which is typical of CuI formation. After 5 scans, whichlasted around 10 min each, the feature was still small, thus indicating apoor reduction effect. Two series of around 10 to 20 scans were recorded.For the EXAFS analysis, the photo-reduction of scans that can be ne-glected was averaged. For the XANES study, only the two first scans ofeach series were added. Points were measured every 0.25 eV in theXANES region and steps were gradually increased from 0.5 eV (at E=

9000 eV) to 5 eV (at E=9600 eV) in the EXAFS region.

EPR spectroscopy : EPR spectra (9.4 GHz) were recorded using aBruker ELEXSYS 500 spectrometer equipped with a continuous-flow Hecryostat (Oxford). The field modulation frequency was 100 kHz. PulsedEPR experiments were recorded using a Bruker ELEXSYS 580 spec-trometer at liquid helium temperatures. Pulsed EPR data were processedby using routines locally written with Matlab (R2008b, The Mathworks,Inc.).

NMR spectroscopy : 1D 1H and 13C experiments and 2D experimentswere recorded using a Bruker Avance 500 spectrometer equipped with a5 mm triple-resonance inverse Z-gradient probe (TBI 1H, 31P, BB). All

chemical shifts are relative to tetramethylsilane. 1D NMR and 2D NMRspectra were collected at 298 K in pure D2O.

Cyclic voltammetry (CV): CV measurements were recorded under argonusing a 620C electrochemical analyzer (CH Instruments, Inc). The work-ing electrode was a glassy carbon disk and a Pt wire was used as counter-electrode. The reference electrode was an AgCl/Ag electrode (0.223 Vversus NHE) isolated in a fritted bridge. Immediately before the mea-surement of each voltammogram, the working electrode was carefullypolished with alumina suspensions (1, 0.3 and 0.05 mm, successively), so-nicated in an ethanol bath and then washed carefully with ethanol. Theelectrochemical cell medium used was milli-Q water with 0.1m sodiumphosphate (pH 7.4) added as supporting electrolyte.

Measurements of HO· production : These were performed in phosphate(20 mm), NaCl (100 mm) buffer at pH 7.4. The reaction was started bythe addition of ascorbate (500 mm). In all these experiments, DFO (at afinal concentration of 1 or 2 mm depending on buffer concentration) wasadded to avoid non-specific OHC production by metallic ion impuritiesfrom the buffer.

Coumarin-3-carboxylic acid (3-CCA) (Sigma) was used to detect HOC.[22b]

HOC reacts with 3-CCA to form 7-hydroxycoumarin-3-carboxylic acid (7-OH-CCA), which is fluorescent at 452 nm upon excitation at 395 nm.The intensity of the fluorescence signal is proportional to the number of7-OH-CCA molecules formed, which in turn is proportional to the HOCradicals generated. [CCA]=500 mm.

Ascorbate consumption was monitored by UV/Vis spectroscopy. The in-tensity of the Asc absorption band at l=265 nm (e=14500m�1 cm�1) wasmonitored as a function of time, in 100 mm phosphate buffer (pH 7.4)that contained 100 mm of Asc, 2 mm of DFO, 5 mm of CuII and after addi-tion of 6 mm of GHK or DAHK peptide.

Acknowledgements

This work was supported by a grant from the Agence Nationale de la Re-cherche, Programme Blanc NT09-488591, “NEUROMETALS” (P.F.,C.H. and P.D.) and 05-JCJC-0010-01, “NEUROARPE” (P.D.). We thankthe staff of the SAMBA beamline at SOLEIL and more particularly Dr.Emiliano Fonda for help in performing the XAS experiments (SOLEILProject 20080324). Dr. Yannick Coppel and Val�rie Bourdon are ac-knowledged for their help in NMR spectroscopic experiments and analy-sis and in ESI-MS experiments, respectively. We thank Fanny Leroux forearlier results obtained on [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)], Bertrand Badei for the ascor-bate consumption experiments and Bruno Alies for his participation inthe NMR spectroscopic experiments.

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Received: March 11, 2011Published online: && &&, 0000




Bioinorganic Chemistry

C. Hureau,* H. Eury, R. Guillot,C. Bijani, S. Sayen, P.-L. Solari,E. Guillon, P. Faller,P. Dorlet* . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . &&&&—&&&&

X-Ray and Solution Structures ofCuIIGHK and CuIIDAHK Complexes:Influence on Their Redox Properties

Deep purple into the blue : The com-plexes [CuII ACHTUNGTRENNUNG(GHK)] (GHK=Gly-His-Lys), found in the blood plasma, and[CuII ACHTUNGTRENNUNG(DAHK)] (DAHK=Asp-Ala-His-Lys; see graphic), the bindingsequence of copper in human serumalbumin, have been characterisedstructurally in the solid state and by arange of spectroscopies in solution.Results of the redox properties show apronounced silencing of copper activ-ity with respect to oxidative stress.




�

Article I-C

Published: October 06, 2011

r 2011 American Chemical Society 11192 dx.doi.org/10.1021/ic201739n | Inorg. Chem. 2011, 50, 11192–11201

ARTICLE

pubs.acs.org/IC

pH-Dependent Cu(II) Coordination to Amyloid-β Peptide: Impact ofSequence Alterations, Including the H6R and D7N Familial Mutations.Bruno Alies,† H�el�ene Eury,† Christian Bijani, Lionel Rechignat, Peter Faller, and Christelle Hureau*

CNRS, LCC (Laboratoire de Chimie de Coordination), 205, route de Narbonne, F-31077 Toulouse, France, and Universit�e deToulouse, UPS, INPT, LCC, F-31077 Toulouse, France

bS Supporting Information

’ INTRODUCTION

Alzheimer’s disease (AD) is the most common cause ofdementia in the elderly population with an estimated prevalenceof 30 million people worldwide, a number that is expected toquadruple in 40 years.1 AD is a complex multifactorial neurode-generative disease in which many genetic and environmentalfactors are involved. The underlying mechanisms of AD are notclear, but there is evidence and a relatively wide agreement thatthe so-called amyloid cascade is a key and early event in thedevelopment of AD. This hypothesis proposes an increasedextracellular accumulation of a peptide, called amyloid-β (Aβ),which leads to its aggregation, first into oligomers, then intoprotofibrils and last into amyloid plaques, a hallmark of AD. Thishypothesis suggests that the mismetabolisms of Aβ and of itsprecursor protein are initiating events in AD pathogenesis.Formation of Aβ aggregates would further instigate pathologicalevents, including formation of intracellular neurofibrillary tangles(another hallmark of AD), disruption of synaptic connections,ultimately leading to neuronal cells death and dementia.1�6 Aβ istypically a 39�43 residue polypeptide and consists of a hydro-philic N-terminal domain (1�28) and a C-terminal hydrophobicdomain (29�39/43). In vivo, the most prevalent forms of Aβconsist of 40 (Aβ40) and 42 amino acids (Aβ42). The longerform Aβ42 is more prone to aggregation and more toxic to

neurons than Aβ40, in agreement with the amyloid cascadehypothesis. Metal ions (Cu, Fe, Zn) have been proposed to play akey role in the development of AD. In vivo, in cello, and in vitroexperiments strongly suggest that metal ions and in particular Cuions are involved in AD. Cu ions can bind to Aβ and modulate itsaggregation. Furthermore [Cu(Aβ)] oligomeric forms can cat-alyze the production of ROS (reactive oxygen species) inpresence of physiological reducing agents (e.g., ascorbate), whichfinally leads to neuronal cells death (for reviews, see refs 7�14).

Copper coordination to the Aβ peptides has been proposed asan important event in the amyloid cascade and deciphering theCu environment when bound to Aβ peptides is still a burning andcontroversial topic. At physiological pH, two equatorial bindingmodes coexist. The one predominant at lower pH is constitutedof two equivalent sets of ligands (noted Ia and Ib), where theterminal �NH2 (from Asp1), the CO from the Asp1�Ala2peptide bond, a N from imidazole ring of His6 and from His13(component Ia) or fromHis14 (component Ib) are involved.15�19

The two components have been proposed to be in equilibrium in1:1 ratio,15,17 and thus in the following the mixture of Ia and Ibwill be noted component I. However, a recent study reported

Received: August 10, 2011

ABSTRACT: Copper ions have been proposed to intervene indeleterious processes linked to the development of Alzheimer’sdisease (AD). As a direct consequence, delineating how Cu(II)can be bound to amyloid-β (Aβ) peptide, the amyloidogenicpeptide encountered in AD, is of paramount importance. Twodifferent forms of [CuII(Aβ)] complexes are present nearphysiological pH, usually noted components I and II, the nature of which is still widely debated in the literature, especially forII. In the present report, the phenomenological pH-dependent study of Cu(II) coordination to Aβ and to ten mutants by EPR, CD,and NMR techniques is described. Although only indirect insights can be obtained from the study of Cu(II) binding to mutatedpeptides, they reveal very useful for better defining Cu(II) coordination sites in the native Aβ peptide. Four components wereidentified between pH 6 and 12, namely, components I, II, III and IV, in which the predominant Cu(II) equatorial sites are {�NH2,CO (Asp1�Ala2), Nim (His6), Nim (His13 or His14)}, {�NH2, N

� (Asp1�Ala2), CO (Ala2�Glu3), Nim}, {�NH2, N�

(Asp1�Ala2), N� (Ala2�Glu3), Nim} and {�NH2, N� (Asp1�Ala2), N� (Ala2�Glu3), N� (Glu3�Phe4)}, respectively, in line

with classical pH-induced deprotonation of the peptide backbone encountered in Cu(II) peptidic complexes formation. Thestructure proposed for component II is discussed with respect to another coordinationmodel reported in the literature, that is, {CO(Ala2�Glu3), 3 Nim}. Cu(II) binding to the H6R-Aβ andD7N-Aβ peptides, where the familial H6R andD7Nmutations have beenlinked to early onset of AD, has also been investigated. In case of the H6Rmutation, some different structural features (compared tothose encountered in the native [CuII(Aβ)] species) have been evidenced and are anticipated to be important for the aggregatingproperties of the H6R-Aβ peptide in presence of Cu(II).

11193 dx.doi.org/10.1021/ic201739n |Inorg. Chem. 2011, 50, 11192–11201

Inorganic Chemistry ARTICLE

that a third component, where the two His involved in Cu(II)coordination are the His13 and His14, is also present, this thirdcomponent (noted Ic) being more prone to formation of unstruc-tured aggregates than Ia and Ib.20 Regarding the second component(II), predominant at higher pH, there are two divergent hypo-theses.19Mainly on the basis of S-bandEPR andHYSCOREdata on13C and 15N isotopically labeled peptides, it was proposed thatcomponent II is made of the CO group from the Ala2�Glu3peptide bond and the imidazole rings of the three His.18 In thesecond proposition, also deduced fromHYSCORE data on 13C and15N isotopically labeled peptides15 but from NMR data as well,16

the�NH2 terminal, the amidyl function N� from the Asp1�Ala2

peptide bond, the CO from the Ala2�Glu3 peptide bond, and oneamong the three imidazole rings of His are the functions predomi-nantly involved in equatorial Cu(II) binding. Regarding the apicalpositions, the debate is still open but involvement of carboxylategroups has been proposed in the literature.15,16,18

Here, we report a EPR, CD, andNMR study of Cu(II) bindingto the Aβ peptide and to ten mutants that allow discriminationbetween the two proposed Cu(II) binding models in II (seeabove). Moreover, we describe the pH dependent Cu(II) bind-ing to this series of peptides from pH 4 to 12. While such a pHrange is not biologically pertinent, study performed outside thephysiological range do help disentangling Cu(II) coordinationfeatures around physiological pH. Indeed, the Cu(II) peptidicspecies are generally obtained from each other by successivedeprotonation (protonation) of the peptide when the pH isincreased (decreased).21,22 Moreover, such a wide study is ofinterest from a chemical point of view since it provides generalrules for Cu(II) coordination to peptides. We thus characterizedtwo new components (noted III and IV) at pH higher than 8.

In this study, the impact on Cu(II) binding properties of thetwo English (H6R) and Tottori�Japanese (D7N) mutationslinked to early onset familial AD were also investigated. In vitrostudies of Aβ40 and Aβ42 peptides incorporating either the H6Ror the D7N mutations have evidenced that the two mutationsalter Aβ assembly at its earliest stages, as well as monomer foldingand oligomerization process. Moreover, it was shown that theoligomers of the mutated peptides are more toxic to culturedneuronal cells than the wild type oligomers.23,24 Trace Cu(II)have not been taken into account in these studies but mightinfluence the aggregation process. Moreover, His6 intervenes inCu(II) binding and Asp7 is a putative Cu ligand in the wild-typepeptide. These are the reasons why it is worth determining howthe H6R and the D7N mutations can modify Cu(II) coordina-tion in these rare familial forms of AD. Although beyond thescope of the present phenomenological study, it would be veryimportant to relate the impact of these mutations on the bio-logical properties of the peptides with the difference in the Cu(II)coordination described here.

’RESULTS

1. EPR pH-Dependent Study of Cu(II) Binding to Aβ16Peptides andMutants.The shorter Aβ16 peptide is used in thepresent study. Number of previous works have unambiguouslyshown that it represents the minimum Aβ sequence involved inCu(II) binding.25�27 The pH-dependent EPR signature of Cu-(II) binding to the Aβ16 peptide is shown in Figure 1 togetherwith spectra of Cu(II) species obtained with the D1N-Aβ andE3Q-Aβmutants and the N-terminally acetylated (Ac-Aβ) peptideat selected pH values. The EPR signatures of the [CuII(Aβ)]

Figure 1. EPR spectra of [CuII(peptide)] complexes as a function of pH. Panel A: Peptide = Aβ16. Panel B: Peptide = D1N-Aβ, E3Q-Aβ, or Ac-Aβ.Component I is designated by green lines, component II by orange lines, component III by black lines and components IV and IV0 by red and purplelines, respectively. Plain lines indicate pH values where a component is predominant in solution and dotted lines pH range where a component is presentin solution but not predominant. [CuII(peptide)] = 1mM inD2O. ν = 9.5 GHz, amplitudemodulation = 0.5mT,microwave power = 20mW.T = 110K.* indicates the presence of a minor species, which is not detected in the EPR spectra of other [CuII(peptide)] species, with g ) = 2.17(8) and A ) = 160�10�4 cm�1 EPR parameters (see Supporting Information for identification of this species).



complexes are complicated and generally correspond to the super-imposition of several components simultaneously present in solu-tion at a given pH.This is particularly obvious at lowpH(near pH4),at physiological pHwhere two species coexist (the well-describedcomponents I and II, indicated by green and orange colors inFigure 1, respectively) and at pH near 10. In this latter case,two among the three coexisting components can be well identi-fied: the first one is predominant at pH 8.7 (component II)and the other one is predominant above pH 10.6 (that will benoted component IV, in red in Figure 1). The third component(noted III, in black in Figure 1) is present only as a minorcomponent and is thus difficult to identify. The EPR parametersdetermined for these four components (I�IV) are given in Table 1.Regarding the other [CuII(peptide)] complexes (peptide = Ac-Aβ,D1N-Aβ, E3Q-Aβ, D7N-Aβ, H6A-Aβ, H6R-Aβ, E11Q-Aβ,H13A-Aβ, and H14A-Aβ) studied here (see Figures S1�S3 inthe Supporting Information), none of themwith the exception ofthe [CuII(Ac-Aβ)] has significantly different EPR parameterscompared to those of [CuII(Aβ16)] species (Table 1 and seebelow for details). Hence, components relative to [CuII(Ac-Aβ)]will be noted I0�IV0. Nevertheless, pKa values corresponding totransition between the various components depend on thenature of the peptide involved in Cu(II) binding (Table 1).Note that the pKa values are defined as the pH values where theEPR signatures of two components contribute equally to theEPR intensity and thus have been estimated by considering thatonly two components are simultaneously present in solution.a. Components I and II. Regarding component I, there is now

a consensus that the Cu(II) ion lies in an equatorial binding sitemade of the terminal amine �NH2 group, the imidazole ring ofHis6, the one of His13 or His14 (in equilibrium) and a carbonylfunction,15�19 the apical position being likely occupied by acarboxylate group.15,16,18 Species II, in which the Cu(II) coordina-tion remains to be elucidated is characterized by EPR parametersthat differ from those of component I by a concomitant decrease

in the g// and A// and are classical for 3N1O or 4N binding site31

(Table 1). The pKa of the I/II transition is approximately 7.8, inline with previous studies.32,33 In Figure 1, panel B, the EPR pHdependent signatures of Cu(II) bound to the D1N-Aβmutant isreminded. While the EPR parameters of components I from[CuII(Aβ16)] and [CuII(D1N-Aβ)] complexes are very similar,the pKa(I/II) value is approximately 6.0 in case of the [CuII-(D1N-Aβ)] complexes, thus significantly lower than that of the[CuII(Aβ16)] complexes. The D1N mutant was previouslystudied by the group of Szalai33 and the decrease in the pKa(I/II)was attributed to the breakage of a H-bond network (due to thereplacement of the Asp1 anionic carboxylate by a neutral group),which would facilitate the deprotonation of a peptide functionduring the process leading to component II. However, in thispioneer work the peptide function undergoing the deprotonationwas not identified.Regarding the other Cu(II) complexes studied here, none of

them with the exception of the [CuII(Ac-Aβ)] has significantlydifferent EPR parameters compared to [CuII(Aβ16)]. This stronglysuggests that none of the mutated residues is essential for creatingthe Cu(II) equatorial binding sites and that it can be replaced by anidentical residue but located at another position in the peptidesequence. Differences between pKa(I/II) values are observedand the most important ones are detected for the [CuII(H6A-Aβ)] and [CuII(H6R-Aβ)] complexes, pKa(I/II) values beingapproximately 0.5 pH unit below that of [CuII(Aβ16)]. Thissuggests that even if His6 has been proposed to be alwaysequatorially bound to the Cu(II) center in species I,15,17 it canbe replaced by either the His13 or His14 thus leading to theequatorial coordination of the His13-His14 diad. In such a co-ordination environment, geometric constraints accounting forformation of component II at a lower pH than in the native[CuII(Aβ16)] species may be anticipated. On the contrary, theH13A or H14A mutations have only a slight impact on thepKa(I/II) values (Table 1), in line with the equilibrium between

Table 1. EPR Parameters of Components I�IV and I0�IV0 and of Other [63CuII(peptide)] Complexes for Comparison

I II III IV

peptide g )

a A )

a g )

a A )

a g )

a A )

a g )

a A )

a pKa(I/II)b pKa(II/III)

b pKa(III/IV)b

human 2.26(2) 184 2.22(6) 161 2.19(1) 194 2.17(3) 203 7.8 9.3 10.2

D1N-Aβ 2.26(3) 180 2.23(0) 160 2.19(1) 194 2.17(4) 201 6.0 9.0 10.3

D7N-Aβ 2.26(2) 184 2.22(7) 160 2.18(8) 194 2.17(4) 197 7.7 9.1 10.6

E3Q-Aβ 2.26(3) 183 2.22(4) 161 2.19(0) 194 2.17(3) 201 7.6 8.5 9.7

E11Q-Aβ 2.26(5) 184 2.22(5) 161 2.18(7) 194 2.17(0) 202 7.5 9.3 10.1

H6A-Aβ 2.26(8) 185 2.22(8) 164 2.17(2) 202 7.3 9.6

H6R-Aβ 2.26(6) 180 2.22(7) 162 2.17(1) 205 7.2 9.7

H13A-Aβ 2.26(3) 180 2.23(0) 162 2.17(5) 202 7.5 9.5 10.2

H14A-Aβ 2.26(9) 182 2.22(7) 163 2.17(5) 202 7.5 9.6 10.4

DAHK28 2.19 199

GGGGH29 2.23(0) 156 2.19(9) 200 2.17(1) 206

GGGGG29 2.17(1) 206

I0 II0 III0 IV0

Ac-Aβ 2.32(0) 168 2.27(3) 187 2.23(0) 171 2.19(1) 190 5.2 7.5 8.7

GGGTH30 2.20 200a Parallel spinHamiltonian parameters were obtained directly from the experimental spectra and were calculated from the second and the third hyperfinelines in order to remove second-order effects. A ) parameters are given in 10�4 cm�1. b pKa values are roughly estimated from EPR spectra, and with theexception of pKa(I/II) that can be estimated accurately, the two others pKa values are given with an uncertainty of (0.3 pH unit.



these two His residues for one equatorial binding position pre-viously proposed.15,17

b. Component III. Component III is hardly distinguishable inthe pH dependent EPR traces of [CuII(Aβ16)], being onlydiscernible by the fourth hyperfine feature (black line at B =343 mT in Figure 1, panel A). Indeed, the three other hyperfinelines are mixed with those of components II and IV and cannotbe well isolated. The reason for such a mixture between com-ponents II, III, and IV is likely close pKa(II,III) and pKa(III,IV)values. To better characterize component III, the E3Q mutant ishelpful. Indeed, in the [CuII(E3Q-Aβ)] mutant, component IIIis more easily detected, pKa(II/III) and pKa(III/IV) values beingsufficiently different (estimated to 8.5 and 9.7, respectively).Similar to what was proposed for the D1N-Aβ mutant, we canhypothesize that the Glu3 carboxylate function stabilizes adeprotonable function in its protonated form by H-bond inter-actions, and that in the [CuII(E3Q-Aβ)] complex, the H-bondnetwork is broken leading to deprotonation of the function at alower pKa(II/III) value. It is worth noting that mutation of thetwo other carboxylate functions (leading to D7N and E11Qmutants) do not affect neither the EPR signatures of the cor-responding Cu(II) complexes nor their pH dependence com-pared to [CuII(Aβ16)]. Parameters of component III are close tothose observed when the Cu(II) is bound to the ATCUN motif(encountered in peptide with N-terminal XXH- sequence). Insuch species, the Cu(II) is bound via the�NH2 terminal, the Hisand the two amidyl functions in between these two residues. Forinstance, such equatorial Cu(II) coordination is encountered inthe N-terminal binding site of the serum albumin having theDAHK sequence.28 Nevertheless, some minor differences areobserved that can be attributed to the formation of three adjacentmetallacycles in the ATCUN case, a structural feature that cannotbe observed in the present case due to the position of the Hiscompared to the �NH2 group, the closest His residue being farfrom the terminal amine by 5 amino-acids. Such ATCUN typecoordination in component III will be further confirmed byNMR studies (see below).It is also worth noticing that component III cannot be de-

tected in the EPR pH-dependent spectra of the [CuII(H6A-Aβ)]and [CuII(H6R-Aβ)] complexes. This suggests that His6 is moreinvolved than His13 or His14 in Cu(II) binding in component III.c. Component IV. The g ) and A ) parameters of component IV

of [CuII(peptide)] complexes, with the exception of the [CuII-(Ac-Aβ)] are characteristic of a 4N equatorial binding mode,31

where the Cu(II) ion is bound via the terminal�NH2 and threeamidyl functions. Indeed, very similar EPR parameters have beenreported for the [CuII(GGGGG)] complex, where the �NH2 isthe sole Cu(II) anchoring function and thus where the Cu(II)equatorial site is completed by amidyl groups from adjacentpeptide bonds.29 Such Cu(II) coordination is often encounteredin peptidic fragments where other potential ligands are replacedby amidyl functions adjacent to the�NH2 anchoring point whenthe pH is increased. At high pH, the other possibility is to have anitrogen atom from the imidazole ring of an His residues asthe anchoring point and adjacent amidyl functions that entered isthe Cu(II) coordination sphere.22 This is encountered whenthe terminal�NH2 is not available for Cu(II) binding, for instancewhen it is acetylated.30 In this case, the EPR parameters aredifferent from those observed here in the component IV butsimilar to those observed in component IV0 corresponding tocomplex [CuII(Ac-Aβ)] at high pH (Figure 1, panel B andTable 1). This agrees with the involvement of the N-terminal

amine in equatorial Cu(II) coordination in [CuII(Aβ16)] at highpH. Note that involvement of the terminal �NH2 function hasalready been identified by EPR and ENDOR experiments per-formed on labeled [CuII(15N-(Asp1)-Aβ16] species.15 A secondconsequence is that, Cu(II) center in component IV is likelybound by the terminal -NH2 and the three adjacent amidyl func-tions while in component IV0 by one of the three His and threeadjacent amidyl functions, the His residue(s) involved remainingto be identified.d. [CuII(Ac-Aβ)] Species. Acetylation of the terminal amine

lead to a series of new type of components that can be obtainedfrom component IV0 by successive protonation of the amidylfunctions, leading to a {�Nim, 2N

�, X} equatorial binding site inIII0 and {�Nim, N

�, X, Y} in II0 and {�Nim, X, Y, Z} in I0, whereX, Y, and Z can be either His or CO ligands. Further identifica-tion of the exact nature of components I0�IV0 is beyond thescope of the present paper and is not physiologically relevant forthe understanding of Cu(II) coordination to Aβ. Nevertheless,an important point to note is that EPR parameters of compo-nents II0 and III0 are very close to those of components I and II,respectively and that pKa(II0/III0) is also very close to pKa(I/II)(Table 1). As a consequence, the pH dependent EPR spectra of[CuII(Aβ16)] and [CuII(Ac-Aβ)] complexes will be by chancevery similar near physiological pH.Thismay have led tomisinterpreta-tion of comparative EPR data of [CuII(Aβ16)] and [CuII(Ac-Aβ)]when recorded only near physiological pH and to the erroneousconclusion that �NH2 is involved in Cu(II) apical position incomponent I.34

2. CD pH-Dependent Study of Cu(II) Binding to Aβ16Peptides and Mutants. EPR is a powerful technique todetermine the Cu(II) binding site but reveals informationconcerning only the equatorial plane. As a consequence, CDcan be used to monitor structural modifications that occuroutside from the first coordination shell and in apical position.pH-dependent CD spectra of four chosen examples of[CuII(peptide)] complexes that are representative of the fourtypes of CD signatures obtained in the present study, areshown in Figure 2 ([CuII(Aβ16)], [CuII(Ac-Aβ)], [CuII(H6A-Aβ)], [CuII(E3Q-Aβ)]).a. [CuII(Aβ16)] Type Family. pH dependent CD signatures of

this family is shown in Figure 2, panel A. Weak d�d transitionsare observed at λ = 670 and 590 nm, which increase in intensityupon increasing pH, reaching a maximum at a pH ∼7.5. A newd�d band at λ = 510 nm is observed when the pH is raised above7.5. In the UV domain, the intensity of the λ = 315 and 285 nmbands increase from pH approximately 7 and 3, respectively. Theformer band has been attributed to amide to Cu(II) chargetransfer transition (LMCT) while the latter to amine to Cu(II)LMCT. The band detected at λ = 265 nm, which has tentativelybeen attributed to imidazole to Cu(II) LMCT,21 increases inintensity from pH approximately 8.5. pH dependent behavior ofthese features indicates that (i) �NH2 is bound to Cu(II) frompH 3 and remains bound to Cu(II) at any higher pH, (ii) amidylgroups start to bind Cu(II) at pH approximately 7, and (iii)binding of amidyl functions to Cu(II) enhances the molarextinction coefficient of the His to Cu(II) LMCT and of thed�d transitions detected at 265 and 590 nm, respectively. The[CuII(H13A-Aβ)], [CuII(H14A-Aβ)] and [CuII(E11Q-Aβ)]complexes belong to this family (Supporting Information FiguresS5 and S6) and thus behave very similarly to the [CuII(Aβ16)],suggesting that (i) both His13 and His14 are not simultaneouslyinvolved in Cu(II) binding in the whole pH range and that



(ii) carboxylate group from Glu11 is not an essential element ofCu(II) binding sites.b. [CuII(Ac-Aβ)]. pH-dependent CD signature of [CuII(Ac-

Aβ)] is unique compared to all the other [CuII(peptide)] com-plexes studied here (Figure 2, panel B). The continuous increaseof bands at λ = 630, 490, 360, 315, and 265 nm is observed whenthe pH is increased. Twomain differences with the [CuII(Aβ16)]data are the absence of the λ = 285 nm band characteristic of�NH2 to Cu(II) LMCT, in line with acetylation of N-terminalamine and a significantly higher intensity of the λ = 265 nm band,especially at high pH, compared to all the others [CuII(peptide)]complexes, in agreement with the formation of binding sitescentered onHis anchoring residue, as previously proposed on thebasis of the EPR data analysis.c. [CuII(H6A-Aβ)]/[CuII(H6R-Aβ)] Type Family. These muta-

tions lead to three mains differences in the pH-dependent CDsignatures of the [CuII(peptide)] complexes (Figure 2, panel Cand Supporting Information Figure S5), which are (i) a negatived�d band at λ = 630 nm from pH 3 to approximately 7.5; (ii) amore pronounced λ = 285 nm band, and (iii) a λ = 265 nm band,the growth of which begins in the negative part of the CD spectrafrom pH 3 to approximately 7.5 and the intensity of whichremains weaker than in the [CuII(Aβ16)] type family complexes

at higher pH. These modifications may be attributed to thesimultaneous involvement of His13 andHis14 in Cu(II) binding,a feature that is not detected in the [CuII(Aβ16)] type family (seeabove), thus leading to an important reshuffling of the peptideconformation. Sign change in the λ = 265 nm band at pH ∼7.5may also be interpreted as transition between the His13�His14diad involved in Cu(II) coordination to only one His bound toCu(II). These CD data are consistent with the EPR data, since itconfirms that bothHis13 andHis14 can be simultaneously bound toCu(II). However, if the EPR traces of both [CuII(H6A-Aβ)] and[CuII(H6R-Aβ)] complexes are very close to that of the [CuII-(Aβ16)], their CD signatures differ significantly, in line withmodifications occurring outer from the first coordination shell.d. [CuII(E3Q-Aβ)] Type Family.The pH dependent CD spectra

of Cu(II) complexes obtained with the triple E3QD7NE11Qmutants and the D1N, E3Q, and D7N mutants (Figure 2, panelD and Supporting Information Figures S4 and S6) are slightlydifferent from that of the [CuII(Aβ16)] type family by havingweaker d�d band intensities up to pH 7.5 (especially in the E3Qand E3QD7NE11Q cases) and then a stronger intensity at λ =650 nm at higher pH, except for the [CuII(D1N)] complex thatexhibits a weaker intensity. This may reflect involvement of theGlu3 and Asp7 residues in apical Cu(II) binding or an outer first

Figure 2. Effect of pH on the CD spectra of [CuII(peptide)] complexes, from pH approximately 3 (blue line) to pH approximately 12 (red line). PanelA: [CuII(Aβ16)]. Panel B: [CuII(Ac-Aβ)]. Panel C: [CuII(H6A-Aβ)]. Panel D: [CuII(E3Q-Aβ16)]. Left insets: pH from approximately 3 toapproximately 7.5. Right insets: pH from approximately 7.5 to approximately 12. [CuII(peptide)] = 0.5 mM, l =1 cm, T = 20 �C. Arrows indicate theformation of relevant bands with pH increase. For exact pH values see Supporting Information, Figures S4�S6.



sphere contribution of the Glu3 and Asp7 residues, for instanceby creating salt bridge with the Arg5 residue. Furthermore, theCD data obtained here are in line with contribution of the Asp1residue in Cu(II) apical position even if the different pH-dependent CD signature of the [CuII(D1N-Aβ)] complex ismainly due to the low pKa(I/II) value.e. pKa Determination. Using EPR data it was possible to

evaluate the pKa between various components. As exemplified inFigure 3 in the case of the [CuII(Aβ16)] complex, this could alsobe achieved by simulation of the CD data. Simulations of the pH-dependent absorbance curves at several selected wavelengthswith a unique set of pKa values were performed and pKa(I/II) =7.9, pKa(II/III) = 9.3, and pKa(III/IV) = 10.3 values were found.These results were fully consistent with EPR data suggesting thatno significant pH drift occurs upon freezing the EPR samples. Inthe course of simulation, it appears that more than 3 pKa valueswere necessary to correctly fit the curves. More precisely, belowpH 6, the intensities of the λ = 620 and 660 nm undergo sig-nificant increase.The pKa value corresponding to transitionbetweencomponent I and this newly detected component (noted 0) isestimated to be 5.8. Regarding the EPR data, it appears that theEPR signature of component 0 is indiscernible to that of com-ponent I. Hence, a possible explanation is that this pKa corre-sponds to the deprotonation of the third Cu(II) unbound Hisleading to modification of peptide arrangement but not to directchange in the equatorial Cu(II) coordination.3. NMR Studies of Cu(II) Binding to Aβ in Component III

and to H6R-AβMutant in Components I and II. In an attemptto better characterize the new components III and IV, we usedNMR spectroscopy that was previously revealed to be a powerfultechnique to better disentangle Cu(II) binding to Aβ peptides16,32

and to others peptides or proteins.35,36 Indeed the paramagnet-ism of the Cu(II) ion induces broadening of NMR features thatdepends on the proximity of the Cu(II) ion. Hence, it is possibleto map which residues are affected by the presence of Cu(II) andthus involved in its coordination. 13C NMR spectra of the apo-Aβ and holo-Aβ (0.3 equiv of Cu(II)) recorded at pH 9.8 (wherecomponent III is predominant) are compared to those of theapo-Aβ and holo-Aβ (0.1 equiv of Cu(II)) at pH 8.7 (Figure 4).Cu(II)-induced broadening of the 13C peaks are weaker at pH 9.8

although the Cu(II) stoichiometry is 3-fold higher. Moreover, nonew 13C signals, with the exception of the Cα and Cβ of Lys16,are affected by the Cu(II) addition at pH 9.8 compared to pH 8.7.This behavior is attributed to the formation of a “ATCUN” typeCu(II) binding motif {�NH2, 2N

�, Nim} in component III.Indeed, it was previously evidenced that in such a coordinationsite, Cu(II) exchange between peptides is too slow to affect allthe peptides present in solution. On the contrary, Cu(II) staysbound to a portion of peptide and then lead to the total dis-appearance of its NMR signals.28 Thus in the present case, Cu(II)effect on Aβ NMR peaks corresponding to component III is notobservable. The broadening effect observed is due to the presenceof a small portion of component II (in pH-dependent equilibriumwith component III). As a direct consequence, NMR revealedinappropriate for the study of components III and IV.The H6R mutation is a familial mutation that was associated

with early onset of AD.Moreover, significantmodifications of thepH-dependent CD signature of [CuII(H6R-Aβ)] complexes wereobserved compared to that of [CuII(Aβ16)]. These are thereason why components I and II of the [CuII(H6R-Aβ)] com-plexes were also studied by 13C NMR. In general, Cu(II) effecton the 13C NMR spectra of the H6R mutant and on the Aβ16peptide16 are similar (Supporting Information Figure S7). Moreprecisely, binding of both His13 and His14 in component I (see

Figure 4. 13C{1H} NMR spectra of 10 mM Aβ peptide in D2O(bottom spectra) and in presence of 0.1 equiv of Cu(II) (top spectra)at pH 8.7 (left) and of 0.3 equiv of Cu(II) (top spectra) at pH 9.8 (right).T = 25 �C, ν = 125.8 MHz. Shift of some peaks is due to slightmodification in the pH value induced by Cu(II) addition.

Figure 3. pH-dependent CD absorbance of [CuII(Aβ16)] complex at λ= 660 (red plain circles), 620 (pink plain squares), 580 nm (purple plaindiamonds), 518 nm (blue plain triangles), and 314 nm (black plaintriangles). Solid lines are the fits of the curves with pKa = 5.8, 7.9, 9.3, and10.3. [CuII(Aβ16)] = 0.5 mM, l =1 cm, T = 20 �C.



CD part) may induce the binding of the CO function in betweenthe two His residues, as proposed by calculations.37 However,such a binding do not change the impact of Cu(II) to the 13CNMR spectra of H6R-Aβ compared to Aβ16. Indeed, coordina-tion of CO function fromHis residues was previously detected inthe Aβ16 case and attributed to equilibrium in solution between{�NH2, CO (Asp1), 2NIm} and {�NH2, CO (His), 2NIm}.

16

The main differences observed on the CO and Cα regions at pH8.6, where component II is predominant, are shown in Figure 5.Both the CO functions and Cα atoms from His13 and His 14residues are more broadened in the case of the H6R mutant.However, broadening of the CO and Cα

13C atoms from the Ala2residue, previously attributed to coordination of the amidylfunction from the Asp1�Ala2 peptide bond, is still observed.Thus, this suggests that the deprotonation of the Asp1�Ala2peptide bond also occurs in the H6Rmutant but in this latter case,it does not induce the binding of the adjacent CO function (fromAla2 to Glu3). Indeed, CO functions from His residues mayprincipally be involved in Cu(II) binding.

’DISCUSSION

1. Coordination Sites of Cu(II) in Components I�IV. Theproposed equatorial Cu(II) binding sites in components I�IVare shown in Scheme 1. Component I has been proposed by severalgroups.15�19 In this species, the Cu(II) center is bound via the

terminal amine, two His residues and a CO function mainlyoriginating from the Asp1�Ala2 peptide bond.While consensus has been recently reached on Cu(II) coor-

dination sphere in component I, this is not the case for componentII. Indeed two models have principally appeared in the last years.In the first one, Cu(II) is bound via the carbonyl function fromAla2�Glu3 and the imidazole rings of the three His (modelnoted 1)17,18 and in the second one, Cu(II) is bound via theterminal amine, the adjacent amide function from Asp1�Ala2,one out of the three His and the CO function from Ala2�Glu3(model noted 2).15,16 In the present study, new key insights havebeen obtained regarding the Cu(II) binding sphere in compo-nent II. First, an interesting feature is that Cu(II) complexes ofthe three H6A, H13A, and H14A mutants have EPR parametersidentical to those of [CuII(Aβ16)], indicating that the simulta-neous equatorial coordination of the three His to the Cu(II)center is unlikely. Otherwise, this would imply that in complexesobtained with the His mutants, the His residues is replaced by aligand that would influence the Cu(II) electronic properties in avery similar way, a possibility that we cannot however fully ruledout. Second, component III is identified as {�NH2, 2N

�, Nim}(see below) and thus it is difficult to rationalize why the terminal -NH2 amine bound to Cu(II) in components I and III, will beunbound in the intermediate component II. Third, transitionfrom components I�II (and to III and IV) is pH driven and thusshould be concomitant to deprotonation of peptide function. Incase of model 1, all the residues that can undergo deprotonation(i.e., the three His residues) are already deprotonated at pHbelow the pKa(I/II) value and hence this model fails to explainthe effect of pH in transition from I to II. Fourthly, contrarily tomodel 2, model 1 does not explain the variation in the pKa(I/II)and pKa(II/III) observed in [Cu

II(D1N-Aβ)] and [CuII(E3Q-Aβ)]complexes, respectively (see below). Fifthly, intervention ofCO from Ala2�Glu3 preferentially to that of another peptidebond remains unexplained inmodel 1 whereas the deprotonationof the adjacent Asp1�Ala2 amide bond in model 2 justifies theintervention of the Ala2�Glu3 CO function in Cu(II) binding.Lastly, the EPR parameters of the very simple [CuII(GGGGH)]complex (see Table 1), containing only one His residues in itssequence, are virtually identical to those found here for compo-nents II�IV, indicating that only oneHis can be bound toCu(II)in components II and III.29

Regarding component III, EPR parameters, as well as NMRdata support an “ATCUN” type Cu(II) site {�NH2, 2N

�, Nim}.A {�NH2, 3N

�} Cu(II) equatorial site is proposed for compo-nent IV based on the EPR parameters and the difference withEPR signature of [CuII(Ac-Aβ)]. These propositions are inline with those previously reported by Kowalik et al. in theirpioneer work,21 except for component IV that was identified as{�Nim, 3N

�}. Moreover, in the present study attribution of eachequatorial binding atoms has been proposed, that is, I= {�NH2,CO

Scheme 1. Proposed Equatorial Cu(II) Binding Sites of [CuII(Aβ)] as a Function of pH

Figure 5. 13C{1H} NMR spectral regions of 10 mM Aβ16 peptide inD2O (bottom spectra) and in presence of 0.1 equiv of Cu(II) (topspectra) at pH 8.7 (panels A and B) and of 5 mM H6R-Aβ peptide inD2O (bottom spectra) and in presence of 0.05 equiv. of Cu(II) (topspectra) at pH 8.6 (panels C and D) T = 25 �C, ν = 125.8 MHz. Shift ofsome peaks is due to slight modification in the pH value induced byCu(II) addition.



(Asp1�Ala2), Nim (His6), Nim (His13 or His14)}, II = {�NH2,N� (Asp1�Ala2), CO (Ala2�Glu3), Nim}, III = {�NH2, N

�

(Asp1�Ala2), N� (Ala2�Glu3), Nim}, and IV = {�NH2, N�

(Asp1�Ala2), N� (Ala2�Glu3), N� (Glu3�Phe4)}Regarding involvement of carboxylate groups in Cu(II) apical

position, theCDdata obtained are in linewith previous propositionsthat suggest a preferential role of the Asp1 residue.15,16,18 Implica-tion of theGlu3, Asp7, andGlu11 carboxylate groups in equilibriumwith the one of Asp1 was also suggested for component I.16 TheCD data obtained here agree with this possibility except for theGlu11 residue, for the involvement of which no evidence was found.D1N and E3Q mutations induced change in pKa values

between I/II and II/III, respectively (Table 1). More precisely,D1N mutation decrease the pKa(I/II) value by more than onepH unit and the E3Qmutation decrease the pKa (II/III) bymorethan 0.5 pH unit (Table 1). As previously pointed out,33 this maybe related to the breakage of H-bond network when carboxylatefunctions are modified to amide and subsequent easier deproto-nation of peptide functions, here identified as the Asp1�Ala2and Ala2�Glu3 peptide bonds, respectively. This is illustrated inScheme 2,where the interventions of Asp1 andGlu3 are exemplifiedon the basis of model 2 for component II.2. Coordination of Cu(II) to the H6R and D7N Familial

Mutants. Among the various mutants studied here, Cu(II) co-ordination to the two H6R and D7N familial mutants linked toearly onset of AD were investigated. While, regarding to Cu(II)coordination, the D7N mutation have no significant impact, the[CuII(H6R-Aβ)] complexes show differences with [CuII(Aβ16)].More precisely, the pKa(I/II) is significantly lower (about 0.5 pHunit) in the former case than in the latter, implying that atphysiological pH the two components I and II will be differentlydistributed. More importantly, Cu(II) is differently bound inboth components I and II of [CuII(H6R-Aβ)] and [CuII(Aβ)].Proposed Cu(II) equatorial binding sites of [CuII(H6R-Aβ)]complexes are shown in Scheme 3. The most striking difference

with [CuII(Aβ16)] is due to the concomitant involvement ofHis13 and His14 in Cu(II) binding in I, leading to outer firstcoordination shell effects observed by CD. Such equatorial bindingof the His13-His14 diad (as minor form) in [CuII(Aβ16)] speciescompared to coordination of the His6 plus His13 or His14(as major form) has been recently proposed to be linked to forma-tion of amorphous aggregates.20 In the [CuII(H6R-Aβ)] species,only the His13-His14 diad does intervene in Cu(II) equatorialbinding in component I, and thus, the H6R mutation may beanticipated to be responsible of formation of only amorphousaggregates. In component II, intervention of CO from His13-His14 and His14-Gln15 peptide bonds in Cu(II) equatorialbinding may also explained why component III is not detectedin [CuII(H6R-Aβ)] complexes. Indeed, decoordination of theCO and the adjacent imidazole ring from His13 or His14(forming a 6-membered metallacycle) residues may be conco-mitant, thus leading directly to a component IV (identical to theone obtained in case of the [CuII(Aβ)] species) from componentII. Lastly, the [CuII(H6R-Aβ)] and [CuII(H6A-Aβ)] complexeshave the same spectroscopical signatures implying that nature ofthe replacing residue in the H6 mutant is not a key factor.

’CONCLUDING REMARKS

In the present paper, we reported the pH-dependent study ofCu(II) coordination to the Aβ peptide and to a series of mutants.While results obtained here are in perfect agreement with theCu(II) equatorial binding site previously proposed in the litera-ture for component I {�NH2, CO (Asp1�Ala2), 2 Nim}, theyalso strongly supports a {�NH2, N

�, CO (Ala2�Glu3), Nim}site in component II. Cu(II) complexes outside the physiologicalpH range have also been studied for expanding the number ofspectroscopic references of Cu(II) peptidic species. Among thevarious mutants studied, the two familial H6R and D7Nmutantswere investigated and while the D7N mutation does not impactsignificantly Cu(II) coordination to Aβ, the H6R one leads tomodification in Cu(II) binding that may also influence thepeptide aggregating properties. During the course of thesestudies, the EPR and CD revealed to be complementary spectro-scopies. Indeed, while EPR is a powerful technique to determinethe Cu(II) equatorial environment, CD was very useful indisentangling effects outside the first coordination shell and forinstance lead to the detection of a new species near pH 5.5.

’EXPERIMENTAL SECTION

1. Sample Preparation. Studies were performed in H2O or inD2O. However, for clarity and consistency, we decided to use thenotation pH even when the measurements were made in D2O. pD was

Scheme 2. D1N Mutation Decreases the pKa(I/II) Value byPrecluding the COO�

3 3 3H�N (Asp1�Ala2) Interaction(7-Membered Metallacycle) while the E3Q Mutation De-creases the pKa(II/III) Value by Precluding the COO�

3 3 3H�N (Ala2�Glu3) Interaction (7-Membered Metallacycle)

Scheme 3. Proposed Equatorial Cu(II) Binding Sites of[CuII(H6R-Aβ)] as a Function of pH



measured using a classical glass electrode according to pD = pHreading +0.4, and the pD value was adjusted according to ref 38 to be in ionizationconditions equivalent to those in H2O.

Aβ16 peptide (sequence DAEFRHDSGYEVHHQK and referred toas Aβ in the following), Ac-Aβ peptide corresponding to the N-termin-ally acetylated Aβ peptide, the D1N-Aβ (sequence NAEFRHDSGYEV-HHQK), E3Q-Aβ (sequence DAQFRHDSGYEVHHQK), H6R-Aβ(sequence DAEFRRDSGYEVHHQK), H6A-Aβ (sequence DAEFRA-DSGYEVHHQK), D7N-Aβ (sequence DAEFRHNSGYEVHHQK),E11Q-Aβ (sequence DAEFRHDSGYQVHHQK), H13A-Aβ (sequenceDAEFRHDSGYEVAHQK), H14A-Aβ (sequence DAEFRHDSGYEV-HAQK), and the triple E3QD7NE11Q-Aβ C-terminally protected Aβpeptide (sequence DAQFRHNSGYQVHHQK-NH2) were bought fromGeneCust (Dudelange, Luxembourg) with purity grade >98%.

Stock solutions of peptide were prepared by dissolving the powder inMilli-Q water or in D2O (resulting pH ∼2). Peptide concentration wasthen determined by UV�visible absorption of Tyr10 considered as freetyrosine ((ε276- ε296) = 1410 M�1cm�1) and the solution was diluteddown to the appropriate concentration in peptide.

pH was adjusted using NaOH/HCl (H2O) or NaOD/DCl (D2O).All pH values are given with a ( 0.2 pH unit error.a. Circular Dicroism (CD) Samples. Stock solution of peptide was

diluted down to 0.5 mM in pure Milli-Q water; 0.9 equiv of CuII wasadded from 0.1 M Cu(SO4) stock solution.b. Electron Paramagnetic Resonance (EPR) Samples. Stock solution

of peptide was diluted down to 1.0 mM in D2O; 0.9 equivalent of63CuII

was added from 0.1 M 63Cu(NO3)2 stock solution. Samples were frozenin quartz tube, with addition of 10% glycerol as a cryoprotectant.c. Nuclear Magnetic Resonance (NMR) Samples. Stock solution of

H6R-Aβ peptide was diluted to about 5 mM in D2O. Substoichiometricquantity (∼0.05 equiv) of CuII from Cu(SO4) in D2O was added. CuII

to H6R-Aβ ratio was reduced to a minimum in the free peptide solutionby working at 10 mM peptide concentration without buffer that is theprimary source of paramagnetic contamination. Indeed a too high CuII

to Aβ ratio would induce an uncontrolled broadening of NMR signals, aproblem that may contributes to the loss of signals in the apo-peptidesolution in previous studies.39,40 Substoichiometric CuII ratio (0.05equiv of CuII per Aβ peptide) was used. Indeed, this ratio is large enoughto induce selective broadening of specific residues of all the peptidespresent in solution (because of fast exchange of CuII between peptides).2. Spectroscopic Measurements. a. Circular Dichroism (CD).

CD spectra were recorded on a JASCO circular dichroism spectrometerat 20 �C. Data were collected with a 1 nm sampling interval and 2 scanswere averaged and a baseline spectrum was subtracted for each spectrum.b. Electron Paramagnetic Resonance (EPR). EPR data were recorded

using an Elexsys E 500 Bruker spectrometer, operating at a microwavefrequency of approximately 9.5 GHz. All spectra were recorded using amicrowave power of 20 mW across a sweep width of 150 mT (centeredat 310 mT) with a modulation amplitude of 0.5 mT. Experiments werecarried out at 110 K using a liquid nitrogen cryostat.c. Nuclear Magnetic Resonance (RNMR). 1D 1H and 13C experiments

and 2D experiments were recorded on a Bruker Avance 500 spectro-meter equipped with a 5 mm triple resonance inverse Z-gradient probe(TBI 1H, 31P, BB) and a Bruker Avance 600 spectrometer equipped witha 5 mm triple resonance inverse (TCI 1H, 13C, 15N) Z-gradientcryoprobe, respectively. All chemical shifts are relative to tetramethylsi-lane. 1D-NMR and 2D-NMR spectra were collected at 298 and 288 K inpure D2O, respectively. Accumulation lasts c.a. Sixteen hours for the13C{1H} NMR experiments and 24 h for the 2D 1H�1H TOCSY,1H�13C HSQC, and 1H�13C HMBC experiments.

All the 1H and 13C signals were assigned on the basis of chemicalshifts, spin�spin coupling constants, splitting patterns and signal intensities,and by using 1H�1H TOCSY, 1H�13C HSQC, and 1H�13C HMBCexperiments.

’ASSOCIATED CONTENT

bS Supporting Information. pH-dependent EPR and CDspectra of [CuII(peptide] complexes, 13C NMR spectra of H6R-Aβ, and assignments of the 1H and 13C signals of the H6R-Aβpeptide. This material is available free of charge via the Internet athttp://pubs.acs.org.

’AUTHOR INFORMATION

Corresponding Author*E-mail: [email protected]. Phone: (+33) 5 61 3331 62. Fax: (+33) 5 61 55 30 03.

Author Contributions†These authors contributed equally to this work.

’ACKNOWLEDGMENT

Authors thank the ANR (Agence Nationale de la Re-cherche), ANR Grant Neurometals NT09-488591. We thankDr. L. Fr�emond for earlier results obtained on Cu(II) bindingto H13A-Aβ and H14A-Aβ, Drs. L. Sabater, G. La Pennaand P. Dorlet for fruitful discussions. Charles-Louis Serpen-tini is acknowledged for its participation in recording theCD data.

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Article I-D

2130 Chem. Commun., 2013, 49, 2130--2132 This journal is c The Royal Society of Chemistry 2013

Cite this: Chem. Commun.,2013,49, 2130

Pt(II) compounds interplay with Cu(II) and Zn(II)coordination to the amyloid-b peptide has metalspecific consequences on deleterious processesassociated to Alzheimer’s disease†

Fabrice Collin,*a Isabelle Sasaki,b Helene Eury,b Peter Fallerb andChristelle Hureau*b

Five Pt(II) complexes were tested for their ability to interfere in

Cu(II) or Zn(II) coordination to the Ab peptide. Two of them induce

modifications of the Cu(II) sphere but not the associated Cu(Ab)

ROS production. In contrast, they do completely preclude Zn

induced Ab aggregation.

Cu and Zn ions have been proposed to be linked to Alzheimerdisease (AD) via their involvement in the amyloid cascade process.AD is characterized by brain deposits, the amyloid plaques,considered as the final step of the amyloid cascade involvingaggregation of the amyloid-b (Ab) peptide. Indeed, within theseplaques, the Ab peptide is aggregated, whereas it is present inmonomeric soluble form in healthy brains. Co-localized with theseplaques is found an abnormally high level of both Cu and Zn ions,bound to the Ab peptide (reviewed in ref. 1 and 2). Both Cu and Znions have been reported to modify the Ab aggregation process;3,4

and Cu, due to its redox ability, was anticipated to play a key role inthe production of Reactive Oxygen Species (ROS), a deleteriousevent also associated to the aetiology of AD.5,6

A subset of glutamatergic neurons sequester Zn in theirpresynaptic vesicles. Upon excitation, this synaptic Zn isreleased into the synaptic cleft and acts as a modulator ofneuro-transmission.7 Amyloid plaques formation occurspreferentially around these Zn-rich neurons and it has beenshown that this Zn-pool promotes Ab aggregation in vivo.8 In vitro, itis also well established that Zn can induce Ab aggregation.3,4,9

Recently, platinoid complexes have been studied for theirability to interact with the Ab peptide10–12 and reviewed inref. 13. At the origin of such interest was the pioneering studyby Barnham and coworkers, which has reported beneficialproperties against Ab-mediated toxicity of phenanthroline-based

Pt(II) complexes in mouse hippocampal slices.14 In this context,we have recently reported the synthesis of a new Pt(II) cyclo-metallated complex (�1) that binds very efficiently to Ab atphysiological pH.15

Within this background, we investigated in the present study theimpact of five Pt(II) compounds (�1–�5, see Scheme 1) in Zn-inducedAb aggregation and Cu induced ROS production. The C-terminalAb28 peptide (sequence DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK)was used instead of the full-length Ab40 peptide for two mainreasons: (i) the first 16 amino-acid residues encompass metalion binding sites,1 thus representing a valuable model of metalcoordination to the full-length peptide and the central hydrophobiccore responsible for Ab aggregation lies between the 17–21 residues;(ii) in contrast to Ab40, for which the aggregation in the presence ofZn is very rapid,16 Zn induced Ab28 aggregation shows the sigmoidcurve characteristic of fibril formation and is thus more straight-forward to study.

No significant modification of the Cu(Ab28) ROS production(followed by an ascorbate consumption assay (Fig. S1 and S2,ESI†)) was induced by the five tested Pt compounds. This resultwas not anticipated for complexes �1 and �2, which induce animportant reshuffling of the Cu(II) coordination sphere in Ab28in line with modification of the Cu(Ab28) EPR signature(Fig. S3, ESI†). The latter effect was detailed for �1 in our previous

Scheme 1 Pt(II) compounds studied.

a PHARMA-DEV, UMR 152 IRD-UPS, Universite Paul Sabatier, 118 route de

Narbonne, 31400 Toulouse, France. E-mail: [email protected] CNRS, LCC (Laboratoire de Chimie de Coordination), 205, route de Narbonne et

Universite de Toulouse, UPS, INPT, LCC, F-31077 Toulouse, France.

E-mail: [email protected]; Tel: +33 5 61 33 31 62

† Electronic supplementary information (ESI) available: Experimental section,EPR, NMR, TEM and MS data. See DOI: 10.1039/c3cc38537j

Received 27th November 2012,Accepted 23rd January 2013

DOI: 10.1039/c3cc38537j

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This journal is c The Royal Society of Chemistry 2013 Chem. Commun., 2013, 49, 2130--2132 2131

study,15 and is detected here for �1 and �2, and for �3 but to a lesserextent. This has two consequences: (i) change in the Cu(II)coordination sphere is not directly linked to Cu(Ab) ability toproduce ROS; (ii) complexes �3–�5 do not (seem to) interactsufficiently with Ab28 to interfere with Cu(II) coordinationto Ab28.

Then, impact of complexes �1 to �5 was tested on the Zn-induced aggregation of Ab28 (Fig. 1 and Fig. S4, ESI†).‡ Indeed,in the absence of Zn, Ab28 did not form fibrillar aggregates asevidenced by the classical Thioflavin-T (ThT) fluorescenceexperiment3 (Fig. 1(a)). In contrast, addition of 0.5 equivalentsof Zn induces the typical sigmoid curve in ThT fluorescenceobserved for amyloid formation (Fig. 1(b)). The five Pt com-plexes diminished the fibril formation, but to a different extent.Most potent were �1 and �2 (Fig. 1(c and d)), as weak and noamyloid formation were observed, respectively. For �3–�5, theimpact was less pronounced, with �3 being more efficient than �4and �5 (Fig. 1(e–g)). These results were confirmed by transmis-sion electron microscopy (TEM, Fig. S5, ESI†). Indeed, differentdegrees of fibril formation were observed, with Zn0.5(Ab28)showing the larger amount of fibrils, while upon addition of

�1 and �2 only a very few amyloid fibrils were observed.Complexes �1–�5 were further investigated by NMR for their

propensity to bind to Ab28. NMR data (Fig. S6 and S7, ESI†)indicate that �1 and �2 react more than �3, while no interaction isdetected for �4 and �5. This was confirmed by HPLC/MS. Incontrast to previous study,11 where the HPLC/MS experimentswere performed in a DMSO–water mixture, the conditions usedhere are close to the physiological ones (ammonium phosphatebuffer, pH 7.3). Most of Pt(Ab28) complexes were detected asdoubly, triply, quadruply and quintuply charged ions (Table 1and Table S1, ESI,† and Fig. 2 and Fig. S8, ESI†), allowingcalculation of their experimental masses for comparison withthe theoretical ones. Mono-platinated adducts were detected asmajor products of Ab complexation with �3 to �5, in agreementwith previous work.15 Doubly-platinated adducts were found toaccount for less than 10% of the mono-platinated ones. Relativecomplexation yields, respectively, lie between 34 and 54%,which is relatively low. Remaining free Pt complexes weredetected as native and monohydrated complexes at m/z 403.5(Pt(bpy)H2OCl); m/z 445 and 427.5 (�4 and Pt(phen)H2OCl), m/z597 and 579.5 (�5 and Pt(f-phen)H2OCl).

The highest Ab28 complexation was obtained for complexes

�1 and �2, with respective yields of 90 and 93%. As recentlysuggested by Sasaki et al.,15 the departure of the labile chlorideand DMSO ligands from �1 occurs prior to binding to the Ab28peptide. Thus, only the Pt(f-MePy)(Ab28) complex is detected,which means that two residues from Ab28 are involved in thecoordination. Complex �2 reacts strongly with the Ab28, but theselectivity for specific residues seems to be poor. Indeed it canreact twice with the peptide. Thus, its coordination spherewhen bound to Ab28 was not investigated.

To better decipher how complex �1 binds to Ab28, its coordi-nation with Ab28 was further investigated by HPLC coupled totandemmass spectrometry (HPLC/MS-MS). Despite the relativelyhigh molecular mass of Ab28, no enzymatic digestion wasperformed prior to MS fragmentation (top-down approach).The fragmentation of the triply-charged parent ion at m/z1208.8 (Fig. 2) leads to a set of mono-, doubly- and triply-chargedb and y ions (Fig. S10 and S11, Scheme S2, ESI†) that coveredalmost the whole sequence of Ab28. Comparison of Pt-free (b/y)and platinated (b*/y*) ions helps to identify His13 and Glu11 asbeing involved in the Pt coordination sphere.

Results obtained in the present study are at different levels:(i) Molecular interaction of Pt compounds with Ab28: On a

molecular scale, the data shown here indicate that, at physio-logical pH, efficient interactions between Pt compounds andAb28 are observed when labile ligands can be replaced byside-chains of Ab28. This is the case for the DMSO ligands of

�2, which are easily expelled in the presence of Ab28 as shown byHPLC/MS analysis and NMR DOSY experiments (data notshown). In complexes �3–�5, the chloride ligands are less easilyremoved from the Pt coordination sphere. For �1, both the labileDMSO and the chloride ligands are replaced by side-chains ofGlu11 and His13. While the departure of the DMSO is in linewith the observations made on complex �2, the replacement ofthe chloride ion is more surprising if we consider the resultsobtained on complexes �3–�5, in which at least one chloride isconserved in solution. In addition, although the extent ofaromaticity in complexes �1 and �3 is similar, their behavior isstrikingly different. As previously hypothesized, this might bedue to the peculiar nature of the C–Pt bond that induces a

Fig. 1 ThT fluorescence as a function of time§ of (a) apo-Ab28, Zn0.5(Ab28)(b) and Zn0.5(Ab28) in the presence of �1, (c), �2 (d), �3 (e), �4 (f) and �5 (g). Left andcentre panels: [Ab28] = 500 mM; [Zn] = 250 mM, [Pt-complexes] = 550 mM, 5%DMSO (v/v). Right panel: [Ab28] = 200 mM; [Zn] = 100 mM [Pt-complexes] = 220 mM,2% DMSO (v/v). Phosphate buffer (10 mM, pH 7.4) [ThT] = 10 mM. Complex �1 is notsufficiently soluble at 500 mM in the presence of Ab28 to be studied by fluorescence.Hence the measurements were also performed at 200 mM.

Table 1 Experimental mass of detected Pt(Ab28) complexes, calculated fromthe multiply charged parent ions of Ab28 and Pt(Ab28) complexes, along withthe corresponding mass shift and complexation yield

Detectedcomplex mexp

a (amu)Dmexp (amu)(expected Dmb)

Complexationyieldc

Ab28 control 3265.5 � 2 — —Pt(f-MePy)(Ab28) 3624.9 � 1 362.4 (362.5) 90%PtCl2(Ab28) 3538.9 � 21 276.4 (265–269) 93%[Pt(Cl2)]2(Ab28) 3804.3 � 6 541.8 (530–538)Pt(bpy)(Ab28) 3611.1 � 1 348.6 (350.0) 54%Pt(phen)(Ab28) 3634.8 � 2 372.3 (374.0) 35%Pt(f-phen)(Ab28) 3788.0 � 7 525.5 (526.0) 34%

a Experimental mass calculated from multicharged ions (Fig. S8, ESI);uncertainties given at the 95% confidence level. b Expected mass shiftcalculated with 195Pt, 35Cl and 37Cl. c Complexation is [1 � AAbcplx/AAbcontrol], where AAbcplx is the peak area of remaining non-complexedAb28 and AAbcontrol is the peak area of control Ab28; peak areas aredetermined from trace chromatograms of Fig. S9 (ESI).

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strong trans effect, leading to an easy chloride departurefollowed by replacement by a side-chain of one of the threeHis.15 Here, His13 was identified as the main His involved in Ptbinding in �1. Side-chain Glu11 completes the coordinationsphere of the Pt according to Scheme 2.

(ii) Impact on Cu and Zn-associated Ab toxicity: Interferenceof Pt with both Cu(II) and Zn coordination to Ab28 is in linewith the yields of Pt compounds coordination to Ab28 observedby HPLC/MS analysis (i.e., 93%, 90%, 54%, 35% and 34% for �2,�1, �3, �4 and �5, respectively) and by NMR (Fig. S6 and S7, ESI†).Indeed complexes �1 and �2 efficiently preclude Zn induced Ab28aggregation and modify significantly the Cu(Ab28) EPR signa-ture. Complex �3 has a lesser impact and complexes �4 and �5 havealmost no effect on both features. Although a strong effect isdetected for complexes �1 and �2 upon reshuffling of the Cu(II)coordination sphere in Ab28, this modification is not enough toperturb significantly the Cu(Ab) induced ROS production. Incontrast to Cu(II), His13 and Glu11 may be essential residuesfor Zn binding and induced Ab28 aggregation (reviewed inref. 13 and 17). Hence, Pt preferential coordination to thosetwo residues precludes Zn binding in its natural site and clearlyaffects the associated Ab28 aggregation.

(iii) Biological relevance: Pt-compound �1 could be interest-ing as it has a specific effect, in terms of activity, i.e. it stops Zn-induced aggregation but not Cu(Ab) redox reactivity. A priori,compound �2 is also very potent to specifically inhibit the Znassociated process but its hydro-solubility hampers its usein vivo. For therapeutic approaches, chelators are anotherstrategy often studied for AD.18 Chelators are often selectivebut not specific, i.e. they can bind to both Zn and Cu but withdifferent affinity according to the Irving Williams series. Here,with Pt complexes, it is possible to address effects (ROS

production or Ab aggregation) linked to a specific metalion. Such a strategy relying on specific interference of Ptcompounds (with either ROS production or aggregation) is thusa very appealing therapeutic approach.

We thank Sara Ruiz for the measurements of the Ascorbateconsumption by Cu(Ab28) in the presence of Pt compounds andC. Bijani for NMR measurements.

Notes and references‡ In the present conditions, Cu(II) does not induce Ab28 aggregation.Note also that we have checked that Ab28 aggregation in the presence ofCu(II) or without a metal ion (apo-peptide) is not triggered by the Ptcomplexes studied here.§ Note that no effect of the incubation time between the Pt complexesand the Ab28 prior to the triggering of the aggregation by the additionof Zn was observed.

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12 D. Valensin, P. Anzini, E. Gaggelli, N. Gaggelli, G. Tamasi, R. Cini,C. Gabbiani, E. Michelucci, L. Messori, H. Kozlowski andG. Valensin, Inorg. Chem., 2010, 49, 4720.

13 D. Valensin, C. Gabbiani and L. Messori, Coord. Chem. Rev., 2012,256, 2357.

14 K. J. Barnham, V. B. Kenche, G. D. Ciccotosto, D. P. Smith, D. J. Tew,X. Liu, K. Perez, G. A. Cranston, T. J. Johanssen, I. Volitakis,A. I. Bush, C. L. Masters, A. R. White, J. P. Smith, R. A. Chernyand R. Cappai, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2008, 105, 6813.

15 I. Sasaki, C. Bijani, S. Ladeira, V. Bourdon, P. Faller and C. Hureau,Dalton Trans., 2012, 41, 6404.

16 W. T. Chen, Y. H. Liao, H. M. Yu, I. H. Cheng and Y. R. Chen, J. Biol.Chem., 2011, 286, 9646.

17 V. Tougu and P. Palumaa, Coord. Chem. Rev., 2012, 256, 2219.18 C. Rodriguez-Rodriguez, M. Telpoukhovskaia and C. Orvig, Coord.

Chem. Rev., 2012, 256, 2308.

Fig. 2 (A) Trace chromatogram (left) and corresponding mass spectrum (right) of Ab28 (top, tr = 14.14 min) and the Ab28/Pt(f-MePy) complex (bottom, tr =15.64 min). (B) Fragmentation scheme of the Ab28–Pt(f-MePy) complex deduced from top-down tandem mass spectra (see ESI,† Fig. S10 and S11) of the triply-charged parent ion at m/z 1208.8, including both mono-, di- and triply-charged ions of Pt-free (bn

1,2,3+/yn1,2,3+) and platinated b�1;2;3þn =y�1;2;3þn

� �fragments.

Scheme 2 Coordination mode of complex �1 to the Ab28 peptide.

ChemComm Communication

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Annexe II :

Matériels et Méthodes

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Annexe II

Matériels et Méthodes

Préparation des échantillons

Peptides: le peptide Aβ28 (séquence DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNK) est un

produit commercial acheté chez GeneCust (Dudelange, Luxembourg) avec une pureté > 98%.

Les solutions stock de peptide sont préparées en solubilisant la poudre dans l’eau milliQ ou le

D2O (pH ~ 2). Les concentrations exactes sont déterminées par spectrophotométrie UV-

visible en utilisant l’absorption de la Tyr10 considérée comme une tyrosine libre (ε276-ε296) =

1410 M-1cm-1 à pH∼2. La solution stock est ajustée à pH∼12 juste avant la préparation de

l’échantillon. Puis la solution de peptide est directement diluée pour obtenir la concentration

désirée. Toutes les valeurs de pH sont données avec une erreur de ± 0.2 unité pH.

Solution de Zinc: les solutions stocks en Zn(II) sont préparées à partir de ZnSO4 .H2O (M=

179,47 g/mol, Sigma-Aldrich) à ~0.1 M dans, l’eau milli-Q.

Tampon phosphate (KH2PO4): une solution de K2HPO4 (M= 136,09 g/mol, Sigma-Aldrich)

est préparée à 1 M dans l’eau milli-Q ou le D2O. Puis la concentration à 10mM est obtenue

par dilution de la solution pour la préparation des échantillons.

Tampon phosphate ammonium ((NH4)3PO4): a été préparé par un membre de l’équipe à 10

mM dans l’eau milli-Q.

Tampon HEPES et PIPES: des solutions de tampon HEPES et PIPES à 1 M dans l’eau ont

été préparées par un membre de l’équipe. Ces solutions sont directement diluées lors de la

préparation de l’échantillon pour obtenir la concentration désirée.

ThioflavinT (ThT): une solution stock de ThT (M=318,8 g/mol, Acros Organics) à 10 mM

(en utilisant la masse molaire) dans l’eau milli-Q est préparée puis aliquotée. Les aliquotes

sont ensuite placés à -20°C jusqu’à leur utilisation. La concentration de la solution stock est

déterminée par spectrophotométrie par UV-Visible en utilisant l’absorption de la ThT (ε =

33000 cm-1.M-1) [1]. A partir de ce dosage, la pureté de la ThT a été évaluée soit 70%. La

solution stock en ThT est alors à 7 mM en accord avec les données de la littérature [1,2].

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Nile Red : une solution stock de Nile Red (M= 318,38 g/mol, Acros Organics) à 10 mM dans

le DMSO est préparée puis aliquotée. Les aliquotes sont ensuite placés au congélateur (-20°C)

jusqu’à leur utilisation.

Complexes de Ru(II): une solution stock à 10 mM de chacun des complexes de Ru(II) est

préparée, selon leur solubilité, dans l’eau (ou D2O) et/ou le DMSO (ou DMSO d6). Puis les

solutions sont aliquotées et conservées à -20°C avant leur utilisation.

TSP (sodium tétraméthylsylilpropionate d4): une solution à 5 M dans le D2O a été préparée

puis aliquotée et conservée au réfrigérateur jusqu’à son utilisation.

Conditions expérimentales

Spectroscopie de fluorescence

Conditions expérimentales utilisées dans le chapitre III:

La ThT, le peptide Aβ28 et le Zn(II) sont mélangés dans 10 mM de tampon phosphate à pH

7,4 dans une microplaque contenant 384 puits. Les concentrations finales sont: 500 µM pour

le peptide Aβ28, 10 à 200 µM pour la ThT et 0 ou 250 μM pour le Zn(II).

Conditions expérimentales utilisées dans le chapitre IV:

La ThT, le peptide Aβ28 et le Zn(II) sont mélangés dans 10, 50 ou 100 mM de tampon

phosphate ou HEPES à pH 7,4 et PIPES à pH 6,5 dans une microplaque contenant 96 ou 384

puits. Les concentrations finales sont: 100µM à 1 mM pour le peptide Aβ28, 10 à 200µM

pour la ThT et 0 à 500 μM pour le Zn(II).

Conditions expérimentales utilisées dans le chapitre V:

La ThT ou le Nile Red, le peptide Aβ28 et les complexes de Ru(II) sont incubés pendant 24h

à 37°C, sous agitation (800 rpm) dans 10 mM de tampon phosphate à pH 7,4 dans une

microplaque contenant 384 puits avant l’ajout du Zn(II). Les concentrations finales sont: 500

µM pour le peptide Aβ28, 10 µM pour la ThT ou le Nile Red, 500µM en complexe de Ru(II)

et 250 μM pour le Zn(II).

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Spectroscopie RMN:

Conditions expérimentales utilisées dans le chapitre III et IV:

Les solutions de peptide Aβ28 sont préparées dans le D2O et diluées à 500µM dans 90/10

H2O/D2O ou dans le D2O pur à pH 7,4, 10 mM de tampon phosphate. La ThT et/ou le Zn(II)

sont directement ajoutés dans le tube RMN avec une concentration finale de 0, 10, 50 ou 200

µM pour la ThT et 0, 25 et 250µM pour le Zn(II). Dans le D2O, le pD est mesuré en utilisant

une électrode de verre classique avec pD= pH lu+ 0,4. Les spectres protons 1D et 2D sont

enregistrés à 25°C dans le D2O pur sauf pour les échantillons dédiés à l’attribution du peptide

Aβ28 qui sont enregistrés dans 90/10 H2O/D2O.

L’attribution du peptide Aβ28 a été réalisée en utilisant des expériences 2D TOCSY avec un

temps de mélange de 80 ms au champ radiofréquence de 10 KHz (DIPSI-2) et deux

expériences 2D NOESY avec des temps de mélange de 140 et 400 ms. Ces expériences ont

été enregistrées avec 8k x 712 points et avec un délai de 2s 32 scans. Le spectre NOESY en

présence de 200 µM de ThT a été accumulé pendant 1,5 h avec un temps de mélange de 150

et 400 ms, 4k x 128k points et16 scans.

Les coefficients de diffusion (D) ont été obtenus en utilisant une séquence basée sur un écho

de spin stimulé par des gradients bipolaires et une élimination de l’eau par une expérience de

type Watergate. Le pseudo spectre 2D a été enregistré avec des gradients de 2 % à 95 %

répartis sur 16 points, avec un temps de diffusion (Δ) de 0.2 s, une force de gradients (δ) de

0.9 et 1.6 ms pour la ThT seule et en présence du peptide Aβ respectivement. Les gradients

ont été calibrés à 57.15 G/cm relativement au coefficient de diffusion de l’eau.

Conditions expérimentales utilisées dans le chapitre V:

Les solutions de peptide Aβ28 sont préparées dans le D2O et diluées à 500µM dans le D2O

pur à pH 7,4, 10 mM de tampon phosphate. Les complexes de Ru(II) sont directement ajoutés

dans le tube RMN avec une concentration finale de 500 µM juste avant l’enregistrement des

spectres ou incubés en présence du peptide pendant 24h sous agitation (800 rpm) à 37°C.

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Spectroscopie RPE:

Dans la préparation des échantillons, les conditions sont plus particulières. Les échantillons

sont préparées dans D2O avec du Cuivre 63. Il y a également 10% en glycérol

(cryoprotectant) car les tubes sont gelés et conservés dans l’azote liquide. La concentration en

peptide, Cu(II) et complexes de Ru(II) est de 1mM dans 20 mM de tampon Hepes à pH 7,4.

Le pH est ajusté avec NaOD et D2SO4.

Spectrométrie ESI-MS:

Le peptide Aβ28 peptide (500 μM) est incubé avec les complexes de Ru(II) (1.0 éq.) dans 0.8

mM de tampon (NH4)3PO4 ajusté à pH 7,3 à 37°C pendant 24h sous agitation (800 pm). Ces

solutions sont diluées à 50µM avec le tampon (0,8 mM, pH 7,3) et gelés jusqu’à leur

utilisation. Un volume d’échantillon de 10 µL est injecté sur la colonne HPLC (Phenomenex,

Synergi Fusion RP-C18, 250 × 1 mm, 4 µm), à température ambiante. Le gradient d’élution

contient 0.1% d’acide formique (phase mobile A) et un mélange acétonitrile/eau (80/20 v/v)

en présence de 0.1% d’acide formique (phase mobile B) avec un débit de 50 µL.min-1. Le

gradient de la phase mobile est programmé de la façon suivante: 12% de la phase mobile B de

0 à 3 minutes, puis augmentation progressive jusqu’à 100% de la phase B à t=15 min et

maintenu pendant 4 min, puis une diminution progressive jusqu’à 12% de la phase mobile B à

t=20 min et maintenu pendant 5 min. Le spectromètre de masse est utilisé comme détecteur en

mode positif entre 50 et 2000 Da.

Appareillage

Spectrophotométrie UV-Visible:

Les données UV-Visible sont recueillies sur un spectrophotomètre UV-Visible Agilent 8453

avec un thermostat Hewlet Packard à 20°C.

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Spectroscopie de fluorescence:

La fluorescence de la ThT et du Nile Red sont mesurées en parallèle au cours du temps avec

un fluorimètre FLUOstar Optima (BMG Labtech) (ThT: excitation, 440 nm; émission, 490

nm; bande passante pour l’excitation et l’émission de 10 nm, Nile Red excitation, 544 nm;

émission, 640 nm; bande passante pour l’excitation et l’émission de 10 nm) à T=25°C ou

37°C.

Spectroscopie RPE:

Les données RPE sont enregistrées sur un Elexsys ESP 500 de chez Bruker à une fréquence

de l’ordre de 9.5 GHz à 110K dans l’azote liquide.

Spectroscopie RMN:

Les spectres RMN sont enregistrés à 25°C sur un spectromètre Bruker Avance 600 MHz

équipé d’une cryosonde (1H, 13C, 15N). Tous les déplacements chimiques sont donnés par

rapport au TSP (étalon interne à 0.00 ppm).

Tous les spectres RMN ont été traités à l’aide du logiciel TopSpin 2.1 (Bruker). L’attribution

du peptide Aβ28 a été réalisée en utilisant le logiciel Cara 1.3v8 (www.nmr.ch) et les

coefficients de diffusion ont été déterminés à l’aide du module T1/T2 du logiciel Topspin 2.1.

Spectrométrie ESI-MS:

L’analyse HPLC/MS est réalisée sur un spectromètre de masse (LCQ DECA XP Max,

ThermoFisher), équipé d’une source en mode électrospray et couplés à un système HPLC

(SpectraSystem).

Références : [1] M. Groenning, J Chem Biol 2010, 3, 1–18. [2] M. D’Amico, M. G. Di Carlo, M. Groenning, V. Militello, V. Vetri, M. Leone, J. Phys.

Chem. Lett. 2012, 3, 1596–1601. �

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Annexe III :

Synthèses des complexes de Ru(II)

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Annexe III

Synthèse des complexes de Ru(II) :

Le complexe [Ru(CO)3Cl2]2 est un produit commercial (Strem) et le polymère

[Ru(CO)2Cl2]n a été obtenu selon le protocole décrit par Anderson [1]. Toutes les synthèses

sont réalisées sous Ar et protégées de la lumière.

I- Tentatives d’Optimisation de la synthèse du CORM-3

I-A Description de la synthèse originale

La synthèse du CORM-3 ou Ru(CO)3Cl(glycinate) est décrite pour la première fois par

le groupe de Motterlini [2]. Les conditions réactionnelles sont les suivantes : le binucléaire

[RuII(CO)3Cl2]2 (ou CORM-2) est mis en présence de deux équivalents de glycine et de

méthanolate de sodium (NaOMe) dans le méthanol pendant 18h à température ambiante et

sous argon (Figure 1).

Cependant, lors de cette synthèse un produit secondaire apparaît :

[Ru(CO)2(CO2H)Cl(glycinate)]-. Cette synthèse a été modifiée par le groupe de Hubbell [3].

Le ligand glycinate n’est pas généré in situ par l’ajout d’une base sur la glycine. En effet, le

glycinate de sodium est disponible commercialement. Cependant, ce produit est vendu avec x

molécules d’eau, il est alors difficile de maîtriser la quantité de matière réellement

additionnée au complexe de départ.

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Différents essais ont été mené afin d’optimiser cette synthèse (cf § I-B) mais ils n’ont

apportés aucune amélioration.

I-B Partie Expérimentale

Condition (a) : Chauffage au reflux

Dans un ballon de 250mL, 129 mg de [Ru(CO)3Cl2]2 (0.25 mmol) sont mis en solution

dans 75 mL de méthanol. Puis 39 mg (0.5 mmol) de glycine et 34 mg (0.5 mmol) de NaOEt

sont ajoutés. Le mélange est chauffé au reflux pendant 1h. Au bout d’une heure, le mélange

est jaune pâle.

Le méthanol est évaporé à sec, une pâte jaune est obtenue. Puis 7 mL de THF sont

ajoutés. Un précipité apparaît. Le mélange est filtré sur fibre de verre. Le filtrat est récupéré

auquel 150 mL d’hexane sont ajoutés. Un précipité floconneux apparaît. Le précipité est

séparé par filtration. Dans le filtrat un précipité blanc se forme. Le filtrat est récupéré et

évaporé à sec. 90 mg d’une poudre jaune pâle est récupéré.

RMN 1H, 400MHz, D2O (ppm) : d= 3.47 (s, 2H, glycine libre) ; 3.57 (m, 2H, Glycine liée au

Ru)

IR (cm-1) : 2136 (F, Fort), 2045 (F), 1974 (épaulement), 1627-1563 (m, moyen)

Condition (b) : Réduction du volume de réaction

Le même protocole que précédemment est utilisé mais la synthèse se déroule dans 25

mL de méthanol au lieu de 75 mL. Le traitement reste identique au précédent. Une masse m=

50 mg de produit est récupéré.

RMN 1H, 400MHz, CD3OD (ppm): 5.45 (s élargi, 1H), 5.83 (s élargi, 1H), 3.50 (m, 1H), 3.57

(m, 1H) 3.65 (s, 2H)

On déduit que la synthèse du composé Ru(CO)3Cl(glycinate) selon les conditions précédentes

ne permet pas d’obtenir le produit désiré de façon exclusive.

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Condition (c) : Utilisation du polymère [Ru(CO)2Cl2]n

La synthèse se fait dans les mêmes conditions que précédemment mais à la place du

[Ru(CO)3Cl2]2, le polymère [Ru(CO)2Cl2]n est utilisé comme produit de départ.

Au bout d’une heure de chauffage, le mélange est évaporé à sec. Lors de l’ajout de

THF, il n’y a pas de précipité à apparaître. 50 mL d’hexane sont alors ajoutés mais il n’y pas

formation de précipité. L’ensemble est évaporé à sec. Une poudre de masse m= 170 mg est

obtenue.

RMN 1H, 400MHz, CD3OD (ppm): 5.45 (s élargi, 1H), 5.83 (s élargi,1H), 4.71 (s élargi, 1H),

4.48 (s élargi, 2H), 3.55-3.66 (m, 2H), 3.69 (m, 2H).

Comme lors des essais précédents, il n’a pas été possible d’isoler le complexe

Ru(CO)3Cl(glycinate) de façon exclusive. En effet, lors de la synthèse du polymère

[Ru(CO)2Cl2]n, le complexe [Ru(CO)3Cl2]2 est également formé.

I-C Précipitation des ions chlorures par un sel d’argent : Méthode

générale

Une autre stratégie a alors été envisagée : faire précipiter les chlorures du

[RuII(CO)3Cl2]2 par un sel d’argent de type AgX, afin d’obtenir l’espèce intermédiaire

[Ru(CO)3Cl]+X-. La synthèse se fait alors en 2 étapes : une première étape consiste en la

précipitation des chlorures du [RuII(CO)3Cl2]2 par le sel d’argent et la déprotonation de la

glycine par NaOMe en parallèle dans le MeOH. La seconde étape est l’addition de la solution

de ligand ainsi déprotoné à la solution de complexe obtenue après élimination du précipité

AgCl. Le mélange est chauffé au reflux pendant 1h sous argon (Figure 2).

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Dans un ballon de 50 mL, 50 mg de CORM-2 (1 éq.) sont mis en solution dans 5 mL

de méthanol. Puis 33 mg (2éq.) d’AgX sont additionnés. Un précipité blanc apparaît

instantanément. Le mélange est laissé sous agitation pendant 30 min.

Pendant ce temps, le ligand est préparé : dans un ballon de 10 mL, 15 mg de glycine

(2éq.) est placé dans 2 mL de méthanol sous vive agitation. La glycine est insoluble dans le

méthanol. Puis 13 mg de NaOEt (2 éq.) sont ajoutés, le ligand glycinate est formé et le

mélange devient soluble.

La solution contenant le complexe [Ru(CO)3Cl]+X- est récupérée et centrifugée

pendant 5 min à 20°C (15300 rpm, 21460g). Le surnageant est récupéré et le ligand est

additionné. Le mélange est chauffé au reflux (70°C) pendant 1h.

Au bout d’une heure, le mélange est refroidi dans un bain de glace, puis concentré

jusqu’à l’apparition d’un précipité. Le mélange est centrifugé pendant 5 min à 5°C (15300

rpm, 21460g). Le surnageant est prélevé et de l’éther est ajouté. Un précipité se forme,

centrifugation pendant 5 min à 5°C (15300 rpm, 21460g). Le surnageant est jeté, le précipité,

en faible quantité, est gardé.

En utilisant différents sels d’argent et soit le méthanol, soit l’acétone comme solvant de la

réaction, nous n’avons pas obtenu de CORM-3 de pureté correcte.

Figure 2: Stratégie de synthèse du CORM-3 par précipitation des ligands chlorures

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II- Synthèse des complexes avec un ligand hydroxyquinolate

Synthèse de Ru(CO)3Cl(CQ) avec CQ= clioquinol

59 mg de clioquinol (0.2 mmol) sont mis en solution dans 5 mL de méthanol. Le

clioquinol est partiellement dissous dans le méthanol. Puis 13 mg de NaOEt (0.2 mmol) sont

ajoutés, le mélange devient soluble et jaune vif.

50 mg de [Ru(CO)3Cl2]2 (0.1 mmol) est solubilisé dans 5mL de MeOH. Puis la

solution contenant le clioquinol déprotoné est additionné au complexe en une fois. Le

mélange est chauffé au reflux pendant 1h.

Au bout d’une heure, le mélange est refroidi à température ambiante, puis concentré

jusqu’à l’apparition d’un précipité. Le précipité est séparé par filtration sous vide. Une poudre

jaune brillante de masse m= 53 mg est obtenue soit un rendement de 50%.

RMN 1H, 400MHz, CD3CN (ppm) : 8.92 (HD, d, 1H, J = 5.2 Hz), 8.70 (HB, d, 1H, J=9.2 Hz),

8.02 (HA, s, 1H), 7.74 (HC, m, 1H)

IR ATR (cm-1): 2132 (F), 2051 (F), 1578 (m), 1551 (m), 1486 (m), 1448 (m), 1363 (m), 1110

(m), 810 (m).

IR KBr (cm-1) : 2135 (F), 2064 (F), 1559 (m), 1553 (m), 1488 (m), 1450 (m), 1366 (m), 1113 (m), 811 (m). m/z (ionisation chimique NH3): ([Ru(CO)3Cl(CQ)]NH4

+)= 543

[Ru(CO)3(Cl)(CQ)] C H N

Théorique 27.45 0.77 2.67

Expérimental 27.06 0.34 2.41

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Synthèse de Ru(CO)3Cl(HQ) avec HQ= 8-hydroxyquinoline)

Le même mode opératoire est utilisé pour la synthèse de Ru(CO)3Cl(HQ). Le même

rendement est obtenu.

RMN 1H, 400MHz, CD3CN (ppm) : 8.83 (HF, d, 1H, J = 8.0 Hz), 8.46 (HD, d, 1H, J= 8.0 Hz),

7.57 (HE, m, 1H), 7.50 (HB, t, 1H, J= 16.0 Hz, J’= 8.0 Hz), 7.15 (HA, d, 1H, J= 8.0 Hz), 7.01

(HC, d, 1H, J = 8.0 Hz).

IR ATR (cm-1) : 2129 (F), 2072 (épaulement), 2051 (F), 1576 (m), 1497 (m), 1465 (m), 1373

(m), 1321 (m), 1116 (m), 824 (m).

IR KBr (cm-1) : 2132 (F), 2076 (épaulement), 2059 (F), 1577 (m), 1501 (m), 1471 (m), 1375

(m), 1325 (m), 1118 (m), 826 (m).

m/z (ESI mode positif): ([Ru(CO)3(HQ)]H+) = 330

[Ru(CO)3(Cl)(HQ)] C H N

Théorique 39.52 1.66 3.84


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Synthèse de Ru(CO)3Cl(HQ.SO3) avec HQ.SO3= 8-hydroxyquinoline-5

sulfonate de sodium)

180 mg d’acide 8-hydroxyquinoline-5-sulfonique (0.8 mmol) sont mis en solution

dans 5 mL de méthanol. Puis 108 mg de NaOEt (1.6 mmol) sont ajoutés, le mélange devient

soluble et jaune vif.

200 mg de [Ru(CO)3Cl2]2 (0.4 mmol) est solubilisé dans 5mL de MeOH. Puis la

solution contenant le ligand déprotoné est additionnée au complexe. Le mélange est chauffé

au reflux pendant 1h.


jusqu’à l’apparition d’un précipité. Le précipité est séparé par filtration sous vide. Le filtrat

est évaporé à sec puis repris dans 5 mL de MeOH et à nouveau réduction de volume,

précipitation et filtration sous vide. Ce processus est répété 2 fois. Une poudre jaune de masse

m= 121 mg est obtenue soit un rendement de 45%.

RMN 1H, 400 MHz, CD3OD (ppm): 9.37 (HE, d, 1H, J=8.8 Hz), 8.97 (HC, d, 1H, J = 6.0 Hz),

8.13 (HA, d, H, J= 9.2 Hz), 7.75 (HD, m, 1H), 7.00 (HB, d, 1H, J= 8.8 Hz).

IR ATR (cm-1): 2138 (F), 2077 (F), 2042 (F), 1578 (f), 1501 (m), 1466 (m), 1368 (f), 1325

(m), 1238 (m), 1182 (m), 1165 (f), 1145 (f), 1064-1044 (m), 814 (f), 709 (f).

IR KBr (cm-1) : 2140 (F), 2078 (F), 2055 (F), 1582 (f), 1503 (F), 1465 (m), 1391 (f), 1375 (f),

1326 (m), 1243 (m), 1191 (m), 1165 (f), 1145 (f), 1064-1040 (m), 815 (f).

m/z (ESI mode positif): [Ru(CO)2(HQ.SO3)]+ = 382

[Ru(CO)3Cl(HQ.SO3Na)] C H N

Théorique 30.88 1.08 3.00


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III- Synthèse de [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6- avec en = éthylenediamine [4]

200 mg de [Ru(CO)3Cl2]2 (0.4 mmol) est solubilisé dans 9 mL de MeOH. Puis 325 µL

d’éthylenediamine à 2.4M (0.8 mmol) dans le MeOH sont additionnés. Le mélange est

chauffé au reflux pendant 1h.


jusqu’à un volume d’environ 5 mL. Ce mélange est additionné sur une solution de KPF6

(solution saturée dans le MeOH) permettant l’échange de Cl- par PF6-. Un précipité blanc se

forme qui est filtré sous vide. Une poudre blanche de masse m= 208 mg est récupérée soit un

rendement de 63%.

RMN 1H, 400 MHz, CD3OD (ppm): 5.92 (-CH2, s élargis, 2H), 5.18 (-CH2, s élargis, 2H), 3.08

(-NH2, m, 2H), 2.83 (-NH2, m, 2H).

IR (cm-1): 3269 (F), 3230 (F), 3158 (F), 2148 (F), 2030 (F), 1586 (m), 1466 (f), 1163(f), 1060

(F), 1007 (f), 886 (f).

m/z (ESI mode positif): [Ru(CO)2(en)]+ = 217

[Ru(CO)3Cl(en)]+ClO4- C H N

Théorique 15.80 2.12 7.37


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Références :

[1] P. A. Anderson, G. B. Deacon, K. H. Haarmann, F. R. Keene, T. J. Meyer, D. A. Reitsma, B. W. Skelton, G. F. Strouse, N. C. Thomas, Inorg Chem 1995, 34, 6145–6157.

[2] T. R. Johnson, B. E. Mann, I. P. Teasdale, H. Adams, R. Foresti, C. J. Green, R. Motterlini, Dalton Trans. 2007, 1500–1508.

[3] U. Hasegawa, A. J. van der Vlies, E. Simeoni, C. Wandrey, J. A. Hubbell, J. Am. Chem. Soc. 2010, 132, 18273–18280.

[4] A. O. Baghlaf, M. Ishaq, S. S. Al-Juaid, A. M. Asiri, M. N. Arshad, Acta Cryst (2011). E67, 925 [doi:10.1107/S1600536811022227] 2011, 1–10.

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Annexe IV :

Structures cristallographiques

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Annexe IV

Structure cristallographique du complexe Ru(CO)3Cl(CQ) �

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Table 1. Crystal data and structure refinement Empirical formula C12 H4 Cl2 I N O4 Ru Formula weight 525.03 Temperature 180(2) K Wavelength 0.71073 A Crystal system, space group monoclinic, P c Unit cell dimensions a = 19.3267(8) A alpha = 90 deg. b = 6.2060(2) A beta = 107.928(4) deg. c = 13.4152(5) A gamma = 90 deg. Volume 1530.91(10) A^3 Z, Calculated density 4, 2.278 Mg/m^3 Absorption coefficient 3.401 mm^-1 F(000) 984 Crystal size 0.16 x 0.12 x 0.08 mm Theta range for data collection 3.04 to 28.27 deg. Limiting indices -25<=h<=25, -8<=k<=8, -17<=l<=17 Reflections collected / unique 14254 / 6838 [R(int) = 0.0356] Completeness to theta = 28.27 96.3 % Refinement method Full-matrix least-squares on F^2 Data / restraints / parameters 6838 / 2 / 379 Goodness-of-fit on F^2 1.019 Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0335, wR2 = 0.0638 R indices (all data) R1 = 0.0405, wR2 = 0.0687 Largest diff. peak and hole 0.514 and -0.647 e.A^-3

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Table 2. Bond lengths [A] C(1)-O(1) 1.150(8) C(1)-Ru(1) 1.891(7) C(2)-O(2) 1.120(7) C(2)-Ru(1) 1.931(7) C(3)-O(3) 1.122(7) C(3)-Ru(1) 1.912(7) C(4)-N(1) 1.339(7) C(4)-C(5) 1.426(9) C(4)-H(4) 0.9500 C(5)-C(6) 1.342(10) C(5)-H(5) 0.9500 C(6)-C(7) 1.404(9) C(6)-H(6) 0.9500 C(7)-C(8) 1.415(9) C(7)-C(12) 1.419(8) C(8)-C(9) 1.375(8) C(8)-Cl(2) 1.744(6) C(9)-C(10) 1.406(8) C(9)-H(9) 0.9500 C(10)-C(11) 1.374(8) C(10)-I(1) 2.092(6) C(11)-O(4) 1.330(6) C(11)-C(12) 1.435(8) C(12)-N(1) 1.361(7) N(1)-Ru(1) 2.082(5) O(4)-Ru(1) 2.062(4) Cl(1)-Ru(1) 2.3907(16) C(13)-O(5) 1.131(8) C(13)-Ru(2) 1.923(7) C(14)-O(6) 1.131(7) C(14)-Ru(2) 1.929(7) C(15)-O(7) 1.133(7) C(15)-Ru(2) 1.900(7) C(16)-N(2) 1.324(7) C(16)-C(17) 1.392(10) C(16)-H(16) 0.9500 C(17)-C(18) 1.360(10) C(17)-H(17) 0.9500 C(18)-C(19) 1.402(8) C(18)-H(18) 0.9500 C(19)-C(20) 1.414(9) C(19)-C(24) 1.421(8) C(20)-C(21) 1.382(8) C(20)-Cl(4) 1.743(6) C(21)-C(22) 1.396(8) C(21)-H(21) 0.9500 C(22)-C(23) 1.380(8) C(22)-I(2) 2.101(6) C(23)-O(8) 1.324(7) C(23)-C(24) 1.417(7) C(24)-N(2) 1.376(7) N(2)-Ru(2) 2.092(5) O(8)-Ru(2) 2.063(4) Cl(3)-Ru(2) 2.3998(15)

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Table 3. Angles [deg]. O(1)-C(1)-Ru(1) 175.9(6) O(2)-C(2)-Ru(1) 175.8(6) O(3)-C(3)-Ru(1) 177.6(6) N(1)-C(4)-C(5) 121.1(6) N(1)-C(4)-H(4) 119.5 C(5)-C(4)-H(4) 119.5 C(6)-C(5)-C(4) 120.1(6) C(6)-C(5)-H(5) 120.0 C(4)-C(5)-H(5) 120.0 C(5)-C(6)-C(7) 120.4(6) C(5)-C(6)-H(6) 119.8 C(7)-C(6)-H(6) 119.8 C(6)-C(7)-C(8) 125.7(6) C(6)-C(7)-C(12) 117.1(6) C(8)-C(7)-C(12) 117.1(5) C(9)-C(8)-C(7) 121.4(5) C(9)-C(8)-Cl(2) 119.5(5) C(7)-C(8)-Cl(2) 119.1(5) C(8)-C(9)-C(10) 119.9(6) C(8)-C(9)-H(9) 120.0 C(10)-C(9)-H(9) 120.0 C(11)-C(10)-C(9) 122.3(5) C(11)-C(10)-I(1) 119.4(4) C(9)-C(10)-I(1) 118.3(4) O(4)-C(11)-C(10) 124.1(5) O(4)-C(11)-C(12) 118.7(5) C(10)-C(11)-C(12) 117.2(5) N(1)-C(12)-C(7) 122.4(5) N(1)-C(12)-C(11) 115.6(5) C(7)-C(12)-C(11) 122.0(6) C(4)-N(1)-C(12) 118.9(5) C(4)-N(1)-Ru(1) 128.4(4) C(12)-N(1)-Ru(1) 112.7(3) C(11)-O(4)-Ru(1) 112.9(3) C(1)-Ru(1)-C(3) 92.8(3) C(1)-Ru(1)-C(2) 91.8(3) C(3)-Ru(1)-C(2) 93.0(3) C(1)-Ru(1)-O(4) 173.8(2) C(3)-Ru(1)-O(4) 92.5(2) C(2)-Ru(1)-O(4) 91.0(2) C(1)-Ru(1)-N(1) 96.9(2) C(3)-Ru(1)-N(1) 90.7(2) C(2)-Ru(1)-N(1) 170.4(2) O(4)-Ru(1)-N(1) 79.93(17) C(1)-Ru(1)-Cl(1) 85.3(2) C(3)-Ru(1)-Cl(1) 176.63(18) C(2)-Ru(1)-Cl(1) 89.8(2) O(4)-Ru(1)-Cl(1) 89.28(12) N(1)-Ru(1)-Cl(1) 86.84(13) O(5)-C(13)-Ru(2) 179.0(6) O(6)-C(14)-Ru(2) 173.6(6) O(7)-C(15)-Ru(2) 176.2(6) N(2)-C(16)-C(17) 122.1(7) N(2)-C(16)-H(16) 118.9 C(17)-C(16)-H(16) 118.9

C(18)-C(17)-C(16) 120.0(5) C(18)-C(17)-H(17) 120.0 C(16)-C(17)-H(17) 120.0 C(17)-C(18)-C(19) 119.8(6) C(17)-C(18)-H(18) 120.1 C(19)-C(18)-H(18) 120.1 C(18)-C(19)-C(20) 126.1(6) C(18)-C(19)-C(24) 118.1(6) C(20)-C(19)-C(24) 115.8(5) C(21)-C(20)-C(19) 122.0(6) C(21)-C(20)-Cl(4) 119.1(5) C(19)-C(20)-Cl(4) 118.9(5) C(20)-C(21)-C(22) 119.4(6) C(20)-C(21)-H(21) 120.3 C(22)-C(21)-H(21) 120.3 C(23)-C(22)-C(21) 122.7(5) C(23)-C(22)-I(2) 119.0(4) C(21)-C(22)-I(2) 118.3(4) O(8)-C(23)-C(22) 124.2(5) O(8)-C(23)-C(24) 119.2(5) C(22)-C(23)-C(24) 116.5(5) N(2)-C(24)-C(23) 116.2(5) N(2)-C(24)-C(19) 120.3(5) C(23)-C(24)-C(19) 123.4(6) C(16)-N(2)-C(24) 119.8(6) C(16)-N(2)-Ru(2) 128.8(5) C(24)-N(2)-Ru(2) 111.4(3) C(23)-O(8)-Ru(2) 112.8(3) C(15)-Ru(2)-C(13) 91.6(3) C(15)-Ru(2)-C(14) 95.8(3) C(13)-Ru(2)-C(14) 92.4(3) C(15)-Ru(2)-O(8) 91.5(2) C(13)-Ru(2)-O(8) 176.6(2) C(14)-Ru(2)-O(8) 88.5(2) C(15)-Ru(2)-N(2) 90.4(2) C(13)-Ru(2)-N(2) 98.6(2) C(14)-Ru(2)-N(2) 167.2(2) O(8)-Ru(2)-N(2) 80.11(17) C(15)-Ru(2)-Cl(3) 175.35(19) C(13)-Ru(2)-Cl(3) 86.15(19) C(14)-Ru(2)-Cl(3) 88.39(18) O(8)-Ru(2)-Cl(3) 90.64(12) N(2)-Ru(2)-Cl(3) 85.91(13)

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Structure cristallographique du complexe Ru(CO)3Cl(HQ)

Table 1. Crystal data and structure refinement. Empirical formula C12 H6 Cl N O4 Ru Formula weight 364.70 Temperature 180(2) K Wavelength 0.71073 A Crystal system, space group orthorhombic, P b c 21 Unit cell dimensions a = 8.8922(3) A alpha = 90 deg. b = 11.6105(4) A beta = 90 deg. c = 12.0152(4) A gamma = 90 deg. Volume 1240.48(7) A^3 Z, Calculated density 4, 1.953 Mg/m^3 Absorption coefficient 1.486 mm^-1 F(000) 712 Crystal size ? x ? x ? mm Theta range for data collection 2.89 to 30.51 deg Limiting indices -12<=h<=12, -16<=k<=16, -17<=l<=17 Reflections collected / unique 48858 / 3767 [R(int) = 0.0211] Completeness to theta = 30.51 99.9 % Refinement method Full-matrix least-squares on F^2 Data / restraints / parameters 3767 / 1 / 172 Goodness-of-fit on F^2 1.051 Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0125, wR2 = 0.0329 R indices (all data) R1 = 0.0132, wR2 = 0.0334 Absolute structure parameter -0.003(17) Largest diff. peak and hole 0.261 and -0.500 e.A^-3

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Table 2. Bond lengths [A] C(1)-O(1) 1.1243(17) C(1)-Ru(1) 1.9185(14) C(2)-O(2) 1.1283(16) C(2)-Ru(1) 1.9233(13) C(3)-O(3) 1.1190(17) C(3)-Ru(1) 1.9231(13) C(4)-N(1) 1.3277(15) C(4)-C(5) 1.4082(19) C(4)-H(4) 0.9500 C(5)-C(6) 1.367(2) C(5)-H(5) 0.9500 C(6)-C(7) 1.4154(18) C(6)-H(6) 0.9500 C(7)-C(12) 1.4158(17) C(7)-C(8) 1.4175(18) C(8)-C(9) 1.373(2) C(8)-H(8) 0.9500 C(9)-C(10) 1.407(2) C(9)-H(9) 0.9500 C(10)-C(11) 1.3884(16)

Table 3. Angles [deg] O(1)-C(1)-Ru(1) 175.93(12) O(2)-C(2)-Ru(1) 174.09(11) O(3)-C(3)-Ru(1) 174.43(12) N(1)-C(4)-C(5) 121.78(12) N(1)-C(4)-H(4) 119.1 C(5)-C(4)-H(4) 119.1 C(6)-C(5)-C(4) 119.89(12) C(6)-C(5)-H(5) 120.1 C(4)-C(5)-H(5) 120.1 C(5)-C(6)-C(7) 119.95(12) C(5)-C(6)-H(6) 120.0 C(7)-C(6)-H(6) 120.0 C(6)-C(7)-C(12) 117.06(11) C(6)-C(7)-C(8) 124.11(12) C(12)-C(7)-C(8) 118.83(11) C(9)-C(8)-C(7) 119.00(12) C(9)-C(8)-H(8) 120.5 C(7)-C(8)-H(8) 120.5 C(8)-C(9)-C(10) 122.29(12) C(8)-C(9)-H(9) 118.9 C(10)-C(9)-H(9) 118.9 C(11)-C(10)-C(9) 120.46(12) C(11)-C(10)-H(10) 119.8 C(9)-C(10)-H(10) 119.8 O(4)-C(11)-C(10) 122.80(11) O(4)-C(11)-C(12) 119.36(10) C(10)-C(11)-C(12) 117.84(11) N(1)-C(12)-C(7) 121.95(10) N(1)-C(12)-C(11) 116.48(10) C(7)-C(12)-C(11) 121.56(10) C(4)-N(1)-C(12) 119.34(11)

C(4)-N(1)-Ru(1) 129.79(9) C(12)-N(1)-Ru(1) 110.87(7) C(11)-O(4)-Ru(1) 112.70(8) C(1)-Ru(1)-C(3) 95.18(6) C(1)-Ru(1)-C(2) 90.46(5) C(3)-Ru(1)-C(2) 94.96(5) C(1)-Ru(1)-O(4) 89.64(5) C(3)-Ru(1)-O(4) 90.05(5) C(2)-Ru(1)-O(4) 174.95(5) C(1)-Ru(1)-N(1) 169.56(5) C(3)-Ru(1)-N(1) 87.99(5) C(2)-Ru(1)-N(1) 99.18(5) O(4)-Ru(1)-N(1) 80.41(4) C(1)-Ru(1)-Cl(1) 89.03(4) C(3)-Ru(1)-Cl(1) 175.57(4) C(2)-Ru(1)-Cl(1) 86.33(4) O(4)-Ru(1)-Cl(1) 88.62(3) N(1)-Ru(1)-Cl(1) 87.62(3)

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Structure cristallographique du complexe [Ru(CO)3Cl(en)]+PF6-

Table 1. Crystal data and structure refinement Empirical formula C5 H8 Cl N2 O3 Ru, F6 P Formula weight 425.62 Temperature 180(2) K Wavelength 0.71073 A Crystal system, space group monoclinic, P 21/n Unit cell dimensions a = 7.6796(15) A alpha = 90 deg. b = 10.757(2) A beta = 90.01(3) deg. c = 15.300(3) A gamma = 90 deg. Volume 1263.9(4) A^3 Z, Calculated density 4, 2.237 Mg/m^3 Absorption coefficient 1.657 mm^-1 F(000) 824 Crystal size 0.16 x 0.1 x 0.06 mm Theta range for data collection 3.26 to 26.37 deg. Limiting indices -9<=h<=9, -12<=k<=13, -14<=l<=19 Reflections collected / unique 6032 / 2441 [R(int) = 0.0353] Completeness to theta = 26.37 94.1 % Refinement method Full-matrix least-squares on F^2 Data / restraints / parameters 2441 / 308 / 253 Goodness-of-fit on F^2 1.284 Final R indices [I>2sigma(I)] R1 = 0.0720, wR2 = 0.1665 R indices (all data) R1 = 0.0826, wR2 = 0.1704 Largest diff. peak and hole 0.951 and -1.448 e.A^-3

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Table 2. Bond lengths [A] C(1)-O(1) 1.123(14) C(1)-Ru(1) 1.938(12) C(2)-O(2) 1.120(14) C(2)-Ru(1) 1.938(13) C(3)-O(3) 1.106(14) C(3)-Ru(1) 1.929(12) N(1)-C(4) 1.454(16) N(1)-C(4') 1.48(2) N(1)-Ru(1) 2.118(9) N(1)-H(1A) 0.9200 N(1)-H(1B) 0.9200 N(2)-C(5') 1.49(2) N(2)-C(5) 1.527(17) N(2)-Ru(1) 2.139(9) N(2)-H(2A) 0.9200 N(2)-H(2B) 0.9200 C(4)-C(5) 1.53(2) C(4)-H(4A) 0.9900 C(4)-H(4B) 0.9900 C(5)-H(5A) 0.9900 C(5)-H(5B) 0.9900 C(4')-C(5') 1.53(2) C(4')-H(4C) 0.9900 C(4')-H(4D) 0.9900 C(5')-H(5C) 0.9900 C(5')-H(5D) 0.9900 Cl(1)-Ru(1) 2.403(3) P(1)-F(1) 1.573(12) P(1)-F(6) 1.590(12) P(1)-F(3) 1.590(13) P(1)-F(2) 1.595(12) P(1)-F(5) 1.597(11) P(1)-F(4) 1.612(12) P(1')-F(1') 1.564(17) P(1')-F(4') 1.591(17) P(1')-F(5') 1.594(16) P(1')-F(6') 1.594(16) P(1')-F(3') 1.597(17) P(1')-F(2') 1.600(17)

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Table 3. Angles [deg] O(1)-C(1)-Ru(1) 178.4(14) O(2)-C(2)-Ru(1) 178.1(12) O(3)-C(3)-Ru(1) 178.5(12) C(4)-N(1)-C(4') 27.6(15) C(4)-N(1)-Ru(1) 111.7(8) C(4')-N(1)-Ru(1) 109.6(13) C(4)-N(1)-H(1A) 109.3 C(4')-N(1)-H(1A) 131.5 Ru(1)-N(1)-H(1A) 109.3 C(4)-N(1)-H(1B) 109.3 C(4')-N(1)-H(1B) 85.1 Ru(1)-N(1)-H(1B) 109.3 H(1A)-N(1)-H(1B) 108.0 C(5')-N(2)-C(5) 31.6(15) C(5')-N(2)-Ru(1) 110.2(13) C(5)-N(2)-Ru(1) 109.1(8) C(5')-N(2)-H(2A) 132.6 C(5)-N(2)-H(2A) 109.9 Ru(1)-N(2)-H(2A) 109.9 C(5')-N(2)-H(2B) 80.5 C(5)-N(2)-H(2B) 109.9 Ru(1)-N(2)-H(2B) 109.9 H(2A)-N(2)-H(2B) 108.3 N(1)-C(4)-C(5) 106.1(12) N(1)-C(4)-H(4A) 110.5 C(5)-C(4)-H(4A) 110.5 N(1)-C(4)-H(4B) 110.5 C(5)-C(4)-H(4B) 110.5 H(4A)-C(4)-H(4B) 108.7 N(2)-C(5)-C(4) 107.3(12) N(2)-C(5)-H(5A) 110.3 C(4)-C(5)-H(5A) 110.3 N(2)-C(5)-H(5B) 110.3 C(4)-C(5)-H(5B) 110.3 H(5A)-C(5)-H(5B) 108.5 N(1)-C(4')-C(5') 110(2) N(1)-C(4')-H(4C) 109.8 C(5')-C(4')-H(4C) 109.8 N(1)-C(4')-H(4D) 109.8 C(5')-C(4')-H(4D) 109.8 H(4C)-C(4')-H(4D) 108.2 N(2)-C(5')-C(4') 103.0(19) N(2)-C(5')-H(5C) 111.2 C(4')-C(5')-H(5C) 111.2 N(2)-C(5')-H(5D) 111.2 C(4')-C(5')-H(5D) 111.2 H(5C)-C(5')-H(5D) 109.1 C(3)-Ru(1)-C(1) 90.8(5) C(3)-Ru(1)-C(2) 91.0(5) C(1)-Ru(1)-C(2) 92.7(5) C(3)-Ru(1)-N(1) 92.9(4) C(1)-Ru(1)-N(1) 93.7(5) C(2)-Ru(1)-N(1) 172.5(5) C(3)-Ru(1)-N(2) 93.4(4) C(1)-Ru(1)-N(2) 172.5(5)

C(2)-Ru(1)-N(2) 93.5(4) N(1)-Ru(1)-N(2) 79.8(4) C(3)-Ru(1)-Cl(1) 178.7(4) C(1)-Ru(1)-Cl(1) 90.2(4) C(2)-Ru(1)-Cl(1) 89.9(4) N(1)-Ru(1)-Cl(1) 86.2(3) N(2)-Ru(1)-Cl(1) 85.5(3) F(1)-P(1)-F(6) 93.1(9) F(1)-P(1)-F(3) 175.7(10) F(6)-P(1)-F(3) 90.1(9) F(1)-P(1)-F(2) 90.7(8) F(6)-P(1)-F(2) 93.3(8) F(3)-P(1)-F(2) 91.9(9) F(1)-P(1)-F(5) 89.7(8) F(6)-P(1)-F(5) 176.9(10) F(3)-P(1)-F(5) 87.0(8) F(2)-P(1)-F(5) 88.0(7) F(1)-P(1)-F(4) 89.3(8) F(6)-P(1)-F(4) 89.4(8) F(3)-P(1)-F(4) 88.0(8) F(2)-P(1)-F(4) 177.3(8) F(5)-P(1)-F(4) 89.2(7) F(1')-P(1')-F(4') 90.7(14) F(1')-P(1')-F(5') 88.8(13) F(4')-P(1')-F(5') 89.1(14) F(1')-P(1')-F(6') 91.4(15) F(4')-P(1')-F(6') 92.7(14) F(5')-P(1')-F(6') 178.2(17) F(1')-P(1')-F(3') 176.6(16) F(4')-P(1')-F(3') 88.2(13) F(5')-P(1')-F(3') 87.9(13) F(6')-P(1')-F(3') 91.9(14) F(1')-P(1')-F(2') 91.9(14) F(4')-P(1')-F(2') 176.8(16) F(5')-P(1')-F(2') 89.3(14) F(6')-P(1')-F(2') 88.9(14) F(3')-P(1')-F(2') 89.1(14)

doctorat de l'universitÉ de toulouseethesis.inp-toulouse.fr/archive/00002584/01/eury.pdf ·...

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