docteur de l'universite paris xii
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UNIVERSITE PARIS XII
Faculté de Médecine Paris 12 – Val de Marne
2007 N°
THESE
Pour l’obtention du grade de
DOCTEUR DE L’UNIVERSITE PARIS XII
Spécialité : PHYSIOPATHOLOGIE
Présentée et soutenue publiquement le 18 décembre 2007
par
Anthony de Buys Roessingh
Rôle des facteurs vasoactifs (NO et endothéline-1) et
des canaux KATP dans les anomalies vasculaires
pulmonaires de la hernie diaphragmatique congénitale
expérimentale du fœtus d’agneau
Directeur de Thèse : Professeur Anh Tuan DINH-XUAN
Jury
Président: Professeur Yves AIGRAIN
Rapporteur: Professeur Pascal de LAGAUSIE
Rapporteur: Professeur Jean-Christophe MERCIER
Examinateur : Dr Jacques BOURBON
2
Laboratoires d’accueil :
- Université Paris Descartes, Faculté de Médecine, EA 2511, Assistance Publique
Hôpitaux de Paris, Service de Physiologie–Explorations Fonctionnelles, Hôpital
Cochin, 27 rue du faubourg Saint-Jacques, 75679 Paris cedex 14
- Ecole de Chirurgie, Assistance Publique Hôpitaux de Paris, Pr Yves Aigrain, 17 rue
du Fer à Moulin, 75005 Paris
3
TABLE DES MATIERES
A. Résumé 5
B. Introduction 8
1. Embryologie et développement 11
2. Physiologie, physiopathologie et sciences de base 14
Les changements hémodynamiques à la naissance 14
Les facteurs de modulation du tonus vasculaire 14
L’acide arachidonique 15
Le facteur activateur plaquettaire (PAF) 15
Les canaux potassiques 15
Le rôle de l’endothéline 17
Le rôle du NO 19
La Guanylate Cyclase (GC) et la Phosphodiestérase (PDE-5) 21
3. Prise en charge 24
3.1. Prise en charge prénatale 26 Indications et mesures 26 La chirurgie 29
3.2. Prise en charge post natale 31 La ventilation conventionnelle 32
L'oscillation à haute fréquence (OHF) 33
Le surfactant 34
Les stéroides 34
Les bloqueurs de canaux calciques 35
Le NO 35
L’ECMO 36
La réparation chirurgicale 37
4. Suivi à long terme 39
C. Matériel et méthodes 40
1. Le modèle animal in vivo 40
2. Préparation des médicaments 43
3. Protocoles des tests pharmacologiques in vivo 45
4. Utilisation du tissu pulmonaire et tests pharmacologiques in vitro 46
5. Histologie 50
6. Immunohistochimie 52
7. Isolation du RNA et RT-PCR 53
8. Western-Blot 54
9. Analyse statistique 57
4
D. Premier travail 58
“Congenital Diaphragmatic Hernia: Current Status and Review of the Literature”.
Anthony S. de Buys Roessingh, Anh Tuan Dinh-Xuan, soumis à Current pediatr review. E. Seconde étude 59
“Role of ATP-dependent Potassium Channels in Pulmonary Vascular Tone of Fetal
Lambs with Congenital Diaphragmatic Hernia”. Anthony S. de Buys Roessingh, Pascal de Lagausie, Jacques Patrick Barbet, Jean-Christophe
Mercier, Yves Aigrain, and Anh Tuan Dinh-Xuan. Ped Res 60;5:537-542,2006.
F. Troisième étude 60
“Neuronal Nitric Oxide Synthase Does Not Contribute to the Modulation of Pulmonary Vascular Tone in Fetal Lambs with Congenital Diaphragmatic Hernia”. Anthony S. de Buys Roessingh, Pascal de Lagausie, Taline Ibrahima, Sy Duong-Quy, Jean-
Christophe Schneider, Xiao-lin Huang , Jean-Christophe Mercier, Yves Aigrain, Chantal
Boulanger, Anh T. Dinh-Xuan. soumis à Pediatr Pulmonol .
G. Quatrième étude 61 “Role of Guanylate Cyclase and Phosphodiesterase in Pulmonary Vascular Tone of
Fetal Lambs with Congenital Diaphragmatic Hernia”. Anthony S. de Buys Roessingh, Virginie Fouquet, Sarah Coquery, Jean-Christophe Mercier,
Yves Aigrain, Pascal de Lagausie and Anh Tuan Dinh-Xuan. En correction.
H. Cinquième étude 62
“Ventilation-induced pulmonary vasodilation in lambs with congenital diaphragmatic
hernia is modulated by NO”. Anthony S. de Buys Roessingh, Pascal de Lagausie, Jean-Christophe Mercier, Yves Aigrain
and Anh Tuan Dinh-Xuan soumis à Experimental Lung Research.
I. Sixième étude 63
“Endothelin Receptors Expression in Lung of Newborn with Congenital Diaphragmatic
Hernia”. Pascal de Lagausie, Anthony de Buys Roessingh, Latifa Ferdadji, Sophie Aisenfis, Michel
Peuchmaur, Jean -Christophe Mercier, Dominique Berrebi. J Pathol 15;205(1):112-118,
2004.
J. Discussion 64
K. Conclusion 76
L. Références 78
5
A. Résumé
Les enfants nés avec une hernie diaphragmatique congénitale (HDC) ont un pronostic
sombre et la mortalité avoisine 50%. Le traitement médical consiste à lutter contre une
hypertension artérielle pulmonaire persistante (HTAPP) due à une hypoplasie pulmonaire.
Cette hypoplasie est définie au niveau histopathologique par la présence d’anomalies du
parenchyme pulmonaire et par une hypermuscularisation des artérioles pulmonaires et au
niveau physiopathologique par des anomalies de la réactivité pulmonaire périnatale
engendrant des anomalies du cœur gauche.
A la naissance, ces enfants nécessitent avant tout une stabilisation cardiorespiratoire
avant une intervention chirurgicale. Le traitement médical actuel consiste en une
oxygénothérapie, une ventilation à basse pression par ventilateur mécanique ou par
oscillateur, une diminution de la post charge par l'emploi de vasodilatateurs périphériques et
un apport de surfactant exogène couplé avec un apport de monoxyde d’azote (NO). Aucun
traitement seul a été véritablement démontré comme étant efficace et c’est la combinaison de
différents traitements qui est utilisée actuellement. D’autres thérapies, comme l’utilisation de
l’oxygénation membranaire extracorporelle (ECMO) ou encore une chirurgie in utéro par
occlusion trachéale sont au centre de nombreux débats quant à leur efficacité et leur morbidité
à court et à long terme.
Le but de nos travaux est d’étudier cette HTAPP dans un modèle expérimental de hernie
diaphragmatique créée chirurgicalement à 80 jours de gestation chez des fœtus de mouton.
Ces fœtus sont par la suite opérés 10 jours avant le terme (145 jours) afin de mettre en place
des capteurs à débit sanguin et des capteurs à pression sanguine, respectivement autour et
dans les gros vaisseaux afin de monitorer les modifications hémodynamiques cardio-
pulmonaires en réponse à l’injection de drogues. Le prélèvement et la dissection de ces
poumons sont par la suite à la base d’études histo- et physiopathologiques centrées sur leurs
vaisseaux sanguins.
In vivo, nous avons testé l'effet d’activateurs et d’inhibiteurs de canaux potassiques
dépendant de l’ATP (KATP), en supposant que ces canaux jouent un rôle dans la modulation
du tonus vasculaire lors de l’adaptation hémodynamique néonatale. Nous avons étudié l’effet
de la NO synthase neuronale (NOSn), enzyme productrice du NO, et l’effet de l'acétylcholine
(Ach) dont la capacité vasodilatatrice est endothélium et NO-dépendante. Nous avons testé
l'effet d’activateurs et d’inhibiteurs de la guanylate cyclase soluble (GCs), enzyme productrice
6
du guanosine 3’-5’ monophosphate cyclique GMPc, second messager du NO, et l’inhibition
de la phosphodiestérase de type 5 (PDE-5), enzyme de dégradation du GMPc. Finallement,
nous avons testé l'influence de la ventilation mécanique sur la réactivité pulmonaire à la
naissance.
In vitro, nous avons testé les mêmes molécules que in vivo sur des anneaux vasculaires
pulmonaires dans des bains d'organe. Nous avons pratiqué de l'immunohistochimie et du
Western Blot pour confirmer l'existence de canaux KATP et de la NOSn. L'histologie des
vaisseaux prélevés nous a permis de nous assurer de l'intégrité des anneaux vasculaires.
Compte tenu du rôle physiologique de l’endothéline (ET) dans la modulation du tonus
vasculaire pulmonaire et des interactions entre ces molécules et le NO, nous avons étudié par
immunohistochimie et par RT-PCR l’expression de gènes codant pour des récepteurs à l’ET
(ET-A and ET-B) dans des poumons de bébés nés avec HDC puis décédés.
Nous démontrons in vivo sur des fœtus de mouton avec HDC que l’activation des
canaux KATP permet de diminuer la résistance vasculaire pulmonaire (RVP) à la naissance.
L'inhibition de ces canaux permet une diminution du flux sanguin pulmonaire et aortique mais
ne modifie pas les pressions pulmonaires et la RVP. L'Ach a permis une vasorelaxation
pulmonaire rapide et transitoire avec une augmentation significative des flux sanguins et une
diminution des pressions pulmonaire et aortique. L’activation ou l’inhibition de la NOSn n’a
pas modifié le tonus vasculaire basal et par conséquence la RVP. L’activation de la GCs tout
comme l’inhibition de la PDE-V ont entraîné une diminution significative de la RVP et une
chute de la pression artérielle pulmonaire (PAP). La ventilation mécanique a augmenté
significativement le flux sanguin dans les vaisseaux pulmonaires en faisant diminuer
significativement la RVP.
In vitro, dans des vaisseaux pulmonaires de foetus porteurs de HDC à 137 jours de
gestation, l’activation des canaux KATP induit une relaxation significative des vaisseaux
pulmonaires. En inhibant la NOSn, nous n'avons jamais obtenu de relaxation des vaisseaux
pulmonaires après stimulation par champs électriques (EFS). Nous démontrons cependant
pour la première fois par Western Blot et par immunomarquage la présence de la NOSn. La
stimulation de la GCs et l’inhibition de la PDE-V ont entraîné une relaxation significative des
vaisseaux. Par RT-PCR, on démonte dans les poumons de nouveau-nés avec HDC la présence
des récepteurs ET-A and ET-B.
7
En conclusion, chez des fœtus de brebis avec HDC à 137 jours de gestation, l’activation
des canaux KATP diminue significativement le tonus vasculaire pulmonaire, la libération et
l'efficacité du NO semblent être préservées, la protéine NOSn est présente dans des poumons
et des artères pulmonaires mais ne semble pas contribuer à la réduction du tonus vasculaire
basal, la GC et la PDE-5 présentent des anomalies structurelles et/ou fonctionnelles bien que
la voie de signalisation du NO/GMPc semble être impliquée dans la modulation du tonus
vasculaire pulmonaire à la naissance. La ventilation induit une nette diminution du tonus
vasculaire pulmonaire et cet effet semble être influencé par la présence du NO. Finallement,
une dysrégulation des récepteurs à ET-1 semble contribuer à l’HTAPP présente chez des
nouveau-nés avec HDC.
8
B. Introduction
La hernie diaphragmatique congénitale (HDC) combine un défaut anatomique du muscle qui
sépare les cavités abdominales et thoraciques avec une hypoplasie pulmonaire. Le défaut
musculaire engendre une herniation des viscères abdominaux dans la cavité thoracique
(Figure 1). Ce défaut est situé en général dans la partie postéro-latérale gauche de la
musculature et est appelée hernie de Bochdalek [1, 2]. La hernie de Morgagni concerne la
partie antéro-médiale du diaphragme et la hernie oesophagienne provient d’un orifice
physiologique. La première HDC a été décrite par Riverius en 1679, puis Morgagni a décrit
les différents types de hernie en 1761 et au 19ème
siècle, Victor Bochdalek a décrit des hernies
du diaphragme après des autopsies.
Figure 1. Représentation schématique de la hernie diaphragmatique avec la herniation des
viscères abdominaux dans la cavité thoracique (flèche). F=foie, P=poumon,
C=coeur.
La HDC concerne 1/2500 à 1/5000 naissances vivantes et la mortalité globale due à la HDC
avoisine 50% [2]. La vraie incidence est probablement plus importante car un nombre de
fœtus avec HDC meurent « in utéro » ou sont victimes d’avortement spontané (Figure 2).
Quatre-vingt-cinq pourcent des HDC sont à gauche, 13% sont à droite et 2% sont bilatérales.
F
P
C
P
9
[2]. Cette malformation est souvent associée à des malformations cardiaques, gastro-
intestinales, génito-urinaires, squelettiques, des anomalies du tube neural et à des trisomies
[3].
Figure 2. Répartition de la survie in utéro et en post-natal de la hernie diaphragmatique
Des syndromes y sont associés comme le syndrome de Fryns ou le syndrome de Donnai-
Barrow [4]. Aucun agent étiologique n’a pu être mis en évidence chez l’humain et la plupart
des cas sont sporadiques. Quelques médicaments ont été impliqués dans la survenue de la
HDC, comme la pyridoxine, la thalidomide, la quinine et quelques agents antiépileptiques. La
HDC seule a une mortalité de 20 % et le degré d’hypoplasie pulmonaire reste le critère majeur
et déterminant de la survie à court terme. Quand les anomalies associées sont sévères,
notamment cardiaques, la mortalité peut être de 90% [2].
L’hypoplasie pulmonaire causée par la HDC mène à une hypertension artérielle
pulmonaire persistante (HTAPP) qui va être à l’origine de la mort des enfants avant ou après
la naissance. La probabilité de survie d’un enfant avec HDC est donc déterminée
principalement par la sévérité de l’hypoplasie pulmonaire qui produit une compliance
pulmonaire anormale, une insuffisance respiratoire réfractaire au traitement à la naissance,
une hypoxémie, un shunt droite gauche avec le passage de sang à travers le foramen ovalae et
le ductus arteriosus, une acidose progressive (Figure 3) et une défaillance cardiaque [1, 5, 6].
100100
00
6060
8080
4040
2020
100100
00
6060
8080
4040
2020
}}Mortalité Mortalité cachéecachée
SurvieSurvie postnatalepostnatale
SurvieSurvie in in utéro 100100
00
6060
8080
4040
2020
SurvieSurvie perçueperçue
SurvieSurvie(%)(%)
Prenatal Prenatal PostnatalPostnatal
10
Figure 3. Physiopathologie de la persistance de l’hypertension pulmonaire dans la hernie du
diaphragme.
Même les enfants qui survivent à la naissance ont un degré d’hypoplasie pulmonaire
persistant et une fonction pulmonaire diminuée qui sont à l’origine d’une morbidité à long
terme. Depuis les années 1980, des progrès énormes ont été accomplis dans la prise en charge
des bébés nés prématurés ou avec un degré d’hypertension pulmonaire. Il y a d’abord
l’introduction du surfactant puis, par la suite, la découverte du monoxyde d’azote (NO) par
Furchgott et Zawadzki [7]. Bien que les progrès pour lutter contre une HTAPP aient été
efficaces dans la plupart des pathologies, le traitement de l’HTAPP lié à la HDC reste difficile
et aucun traitement n’a fait preuve de son efficacité absolue [8].
D’autres « recettes » ont alors été tentées, comme l’utilisation de l’oscillateur à haute
fréquence (HFO) àfin de diminuer l’agression de la ventilation mécanique ou l’utilisation de
l’oxygénation membranaire extracorporelle (ECMO), sans toutefois que ces techniques
fassent réellement l’unanimité parmi les médecins traitants. Enfin, d’autres approches sont
prometteuses, comme la chirurgie «in utéro» qui se base sur l’occlusion temporaire de la
trachée pour stimuler la croissance et la capacité pulmonaire. Cette nouvelle approche est
néanmoins controversée et réservée aux fœtus à mauvais pronostic et ses indications font
l’objet de nombreux débats.
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VVaassoossppaassmmee
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et
11
1. Embryologie, développement du poumon et du diaphragme
Le développement du poumon débute à la 6ème
semaine de gestation [9]. La plus grande partie
des voies respiratoires sont développées à la 16ème
semaine mais si les bronchioles
respiratoires et les saccules sont formés à la naissance, la formation des alvéoles par
subdivision des saccules se poursuit au-delà. Pendant la période embryonnaire, la trachée se
forme au 20ème
jour de gestation. Par la suite les bronches lobaires et segmentaires se forment,
à respectivement 35 et 40 jours. La morphogenèse et la différentiation de l’épithélium
respiratoire sont induites par son interaction avec le mésenchyme qui contrôle à la fois sa
ramification et la différenciation des cellules des voies aériennes et des alvéoles [9]. Pendant
la période fœtale, il y a quatre phases distinctes en ce qui concerne le développement du
poumon :
- la phase pseudoglandulaire de la 3ème
semaine à la 16ème
semaine de gestation
(différenciation de l’arbre bronchique)
- la phase canaliculaire dès la 16ème
semaine (différentiation des pneumocytes 1)
- la phase sacculaire dès la 24ème
semaine (production de surfactant)
- la phase alvéolaire de la 32ème
semaine de grossesse au 18ème
mois post-natal
(septation secondaire des saccules et maturation microvasculaire) (Figure 4) [10].
La formation du diaphragme commence au début de la 5ème
semaine à partir de la cavité
coelomique de l’embryon avec le développement du « primordium » diaphragmatique. A la
fin de ce stade, on peut distinguer deux entités, le septum transversum ventral et les canaux
pleuropéritonéaux dorsaux. La fermeture des canaux et le développement de la cavité pleurale
sont complets à la 6ème
semaine de gestation. Au même moment, le foie se déplace en
direction dorsale, participant ainsi à la formation du diaphragme [11]. Même si ce
développement n’est pas complètement compris, quatre parties distinctes forment le
diaphragme, la partie antérieure qui provient du septum transversum, la partie dorso-latérale
qui vient des membranes pleuropéritonéales, la « crura » dorsale qui vient du mésentère de
l’œsophage et la partie musculaire qui vient de muscles intercostaux [9].
La formation des vaisseaux sanguins se déroule grâce à des processus de vasculogenèse
et d’angiogenèse dès la 10ème
semaine de gestation [12]. La vasculogenèse correspond à la
formation de novo de vaisseaux sanguins à partir du mésenchyme pulmonaire et
l’angiogenèse est un processus plus complexe qui complète la création de vaisseaux sanguins
12
dans le poumon [13]. La description de la formation des vaisseaux pulmonaires est l’objet de
débats et l’origine des artères bronchiques est encore non élucidée [12].
Figure 4. Au cours de la période foetale, quatre phases distinctes sont décrites en ce qui
concerne le développement du poumon : la phase pseudoglandulaire de la 3ème
semaine à la
16ème
semaine de gestation (différenciation de l’arbre bronchique), la phase canaliculaire dès
la 16ème
semaine (différentiation des pneumocytes 1), la phase sacculaire dès la 24ème
semaine
(production de surfactant), la phase alvéolaire de la 32ème
semaine de grossesse au 18ème
mois
post-natal (septation secondaire des saccules et maturation microvasculaire).
On pense que la HDC est le résultat d’une agression à la 9ème
semaine de gestation et que la
hernie de Bochdalek est due à un défaut de fermeture du canal pleuropéritonéal. L’origine de
l’hypoplasie pulmonaire concomitante n’est pas claire et Kluth et al. [11] a suggéré en 1996
déjà que cette hypoplasie et le défaut du développement du diaphragme sont concomitants,
expliquant ainsi pourquoi les deux poumons sont atteints (Figure 5). Pour créer une HDC
chez des embryons de rat, Kluth a utilisé un herbicide, le nitrofène (2,4-dichlorophenyl-p-
nitrophenyl ether). Il a démontré que l’hypoplasie pulmonaire primaire était concomitante
avec le défaut anatomique; que le défaut diaphragmatique était déjà présent à 5 semaines de
gestation ; et que le foie était impliqué dans la survenue de la malformation. Il a montré
également que la plaque hépatique mésenchymateuse, et non le canal pleuropéritonéal était le
précurseur du diaphragme et que la croissance hépatique réduisait l’espace de développement
Embryonnaire
Pseudoglandulaire
Canaliculaire
Sacculaire
Alvéolaire
0 6 16 26 36 Postnatal
Semaines de gestation
HDC
13
du poumon, participant aussi à la création de la HDC. Ainsi, la quantité de viscères dans la
cavité thoracique semble participer à la survenue de l’hypoplasie pulmonaire due à la HDC.
De récentes recherches sur des souris ont tenté de mettre en évidence le rôle du repli
pleuropéritonéal dans la formation de la HDC [14, 15] et de montrer que le diaphragme
provenait de cellules précurseurs musculaires qui migrent plutôt des somites cervicales que du
septum transversum. La partie mésenchymateuse du diaphragme provient du somatopleure.
La HDC est couplée à plusieurs malformations structurales et fonctionnelles
pulmonaires: des anomalies de structure du parenchyme [16, 17] avec une réduction du
nombre de divisions bronchiques; une réduction marquée du nombre d’alvéoles et une
immaturité des cellules pneumocytes I et II [18, 19]; des anomalies de la fonction pulmonaire
avec une diminution possible du surfactant (controversé) et de la production de facteurs
antioxydants [20-22] ; des anomalies de vascularisation [24, 25] avec une hyperplasie de la
musculature de la paroi des vaisseaux qui est à l’origine du contrôle de l’hypertension
pulmonaire, de la résistance vasculaire pulmonaire (RVP), de la compliance pulmonaire et
finalement du débit sanguin. Les petites artères, celles qui ont un diamètre de moins de 200
µm sont principalement responsables de la survenue de la RVP [22] et on constate dans la
HDC une diminution du nombre des artères par unité de volume pulmonaire et une
muscularisation périphérique des petites artères dans la média et dans l’adventice [23, 24]. La
présence de ces anomalies de paroi des vaisseaux chez des bébés avec des HDC suggère que
les artères dans les poumons de ces bébés se muscularisent pendant la vie fœtale et sont
incapables de s’adapter à la naissance [25]. Chez les foetus, les études du flux sanguin avec
un doppler 3D montrent une diminution de la vascularisation, une diminution du flux
pulmonaire et une diminution du flux sanguin par unité de volume sanguin [26].
Figure 5. Aspect macroscopique des poumons droit et gauche à l’autopsie après hernie du
diaphragme (Poumons de bébé humain à l’autopsie).
14
2. Physiologie, physiopathologie et sciences de base
Les changements hémodynamiques à la naissance
Une modification hémodynamique unique se déroule à la naissance et ceci dans les 24
premières heures après la délivrance. Dans des conditions normales, la pression artérielle
pulmonaire (PAP) chute de 50% avec une augmentation concomitante du flux sanguin de 10
fois [1]. Ceci provoque une redistribution de sang dans le corps et à travers les poumons et la
fermeture du foramen ovalae et du ductus arteriosus [1, 2]. Les vaisseaux pulmonaires se
dilatent et les vaisseaux fermés sont recrutés pour augmenter le flux sanguin. Les différents
facteurs responsables de cet ajustement dans cette phase aigue sont l’établissement d’une
interface air-liquide avec la ventilation [27], l’augmentation de la concentration en oxygène
dans le sang [3] et les force de cisaillement ou « shear-stress » [28]. Dans les mois qui vont
suivre la naissance, une diminution de la RVP due à l’adaptation du diamètre des vaisseaux
artériolaires dans les poumons va se développer progressivement. Une transition se déroule
entre le circuit foetal qui fonctionne avec un flux sanguin à basse pression et une grande
résistance, et la circulation d’adulte, qui fonctionne avec un flux à haute pression et une faible
résistance.
Les facteurs de modulation du tonus vasculaire pulmonaire
Le tonus vasculaire post-natal est influencé par différents facteurs, soit constricteurs soit
dilatateurs. Les vasoconstricteurs comme l’endothéline–1 (ET-1) et la thromboxane A2
(TXA2) augmentent la RVP [29, 30], bien que l’ET-1 semble aussi avoir un rôle dans la
vasodilatation chez le nouveau-né [31]. Il existe des vasodilatateurs comme le NO (appelé
aussi Endothelium-Derived Nitric Oxide ou EDNO) [32, 33], le « facteur relaxant dérivé de
l’endothélium » (EDRF) [34-36], qui active la guanylate cyclase soluble (GCs) trouvée dans
la musculature vasculaire lisse, le « facteur hyperpolarisant dérivé de l’endothélium » (EDHF)
et la prostacycline (PGI2) [34] qui active une enzyme de la musculature lisse, l’adénylate
cyclase (AC).
L’EDNO, l’EDHF, la PGI2, et l’acide epoxyeicosatrinoic [37] sont libérés par
l’endothélium et grâce à leur effet relaxant sur la musculature lisse jouent un rôle important
dans la modulation et l’adaptation du système respiratoire et vasculaire à la naissance [38,
39]. D’autres facteurs comme le facteur natriurétique (ANF), l’acétylcholine (Ach), la
bradykinine [40], l’adénosine triphosphate (ATP) [41], l’augmentation du Calcium (Ca2+
)
15
dans la cellule endothéliale [42] et le «shear-stress» [43] sont aussi des dilatateurs puissants
qui agissent principalement comme libérateurs de l’EDNO et/ou de l’EDHF. La capacité
vasodilatatrice de l’Ach est connue comme étant dépendante de l’endothélium [40]. L’Ach
stimule les récepteurs muscariniques M1 et M3 situés dans la membrane de la cellule
endothéliale [40, 44]. La ventilation seule induit un effet vasodilatateur [45].
L’Acide arachidonique
L’acide arachidonique est libéré de la membrane lipidique après stimulation de la
phopholipase A2 (PLA2). La cyclooxygénase (COX-2) convertit l’acide arachidonique en
prostaglandines comme la PGI2 ou la TXA2 [46]. La PGI2 est un vasodilatateur puissant et
inhibiteur de l’agrégation plaquettaire, alors que la TXA2 est un vasoconstricteur et un
stimulant de l’agrégation plaquettaire. La lipo-oxygénase convertit l’acide arachidonique en
5-hydro-eicosa-tetranoic acide (5-HPETE) dont les métabolites contribuent à la
vasoconstriction pulmonaire et à l’hyperréactivité bronchique. Dans des conditions normales,
l’homéostase est maintenue grâce à l’équilibre entre tous ces facteurs.
Le facteur activateur plaquettaire (PAF)
Le facteur activateur plaquettaire (PAF) est aussi stimulé par la PLA2. Le PAF est associé à
l’ouverture capillaire, à l’agrégation plaquettaire, à l’hypertension pulmonaire et à la
bronchoconstriction.
Les canaux potassiques
La membrane cellulaire de la musculature lisse est régulée en partie par les canaux
potassiques (K+) [47-50]. Les canaux K
+ sont activés soit par EDNO [50-53] soit par EDHF
[51]. Le NO active la GCs trouvée dans les cellules de la musculature lisse [51], augmentant
ainsi la guanylosine cyclique 3’-5’ monophosphate (GMPc). La protéine kinase dépendante
de la GMPc (PKG) active à son tour les canaux K+ dépendant du calcium (Kca
2+) par un
mécanisme de phosphorylation. L’activation de ces canaux K+ provoque une sortie du K
+, une
hyperpolarisation de la membrane cellulaire de la musculature lisse des vaisseaux et
l’inhibition de la rentrée de Ca2+
, provoquant ainsi une relaxation des vaisseaux (Figure 6)
[49]. Ce mécanisme a été investigué chez les brebis à la naissance pour montrer l’ajustement
du tonus vasculaire [54, 55]. Différents types de canaux K+ semblent être impliqués dans cette
adaptation à la naissance [56].
16
+
GMPc
PKG
NOS
+
EDHF
K+
KATP
ET-1
GTP
sGC
NOL-arginine
Glibenclamide
L-NAME
L-NMMA
L-NA
–
–
?ET-B
ET-1
ET-A
Endothelial cell
Vascular smoothmuscle cell
Figure 6. L’endothéline 1 (ET-1) stimule la synthèse du monoxyde d’azote (NO) par
l’intervention des récepteurs ET-B. Le NO est libéré de l’endothélium et active la
guanylate cyclase soluble (GCs) qui se trouve dans les cellules de la musculature
lisse, libérant ainsi le 3'-5'-guanylosine monophosphate cyclique (GMPc). La
protéine kinase dépendante du GMPc (PKG) active les canaux potassiques
dépendant du calcium (Kca2+
) par un phénomène de phosphorylation (pas montré
ici). Le « facteur hyperpolarisant venant de l’endothélium » (EDHF) active les
canaux K+ dépendant de l’ATP (KATP). L’activation de ces canaux provoque une
sortie de potassium, une hyperpolarisation de la membrane des cellules
musculaires lisses et une inhibition de l’entrée Ca2+
provoquant ainsi une
relaxation de la musculature lisse. L’activation des récepteurs ET-A par ET-1
provoque une vasoconstriction et une prolifération cellulaire.
Les canaux potassiques sont (a) voltage-dépendants (canaux A, correcteur lent, correcteur
rapide retardé, correcteur lent retardé ou du reticulum sarcoplasmique, respectivement KA, Kv,
Kdr, Kds, Ksr) ; (b) calcium-dépendants (à haute, moyenne et faible conductance,
respectivement Bkca, Ikca, Skca); (c) ATP-dépendants (KATP) [57, 58]. Les canaux KATP sont
une protéine hétéro-octamérique formée de sous-unités avec un récepteur sulfonyuré (SUR)
[59, 60]. Ces canaux sont trouvés dans différents tissus comme le pancréas, le cerveau, le
17
cœur, la musculature lisse et la musculature striée. Ils sont activés par des vasodilatateurs
synthétiques comme le pinacidil et inhibés par des médicaments oraux hypoglycémiques
comme le glibenclamide [61, 62]. Le mécanisme de l’ouverture des canaux KATP est le
résultat de la fixation d’un activateur sur la sous-unité SUR, qui est une protéine liant l’ATP
[60]. Chang et al. [54] ont montré que les canaux KATP jouaient un rôle dans la modulation du
tonus vasculaire chez la brebis grâce à la production de EDNO. Luckhoff et al. [49] ont
montré que le pinacidil provoquait une hyperpolarisation de la membrane endothéliale par
l’activation de canaux KATP, produisant ainsi une augmentation du flux de Ca2+
et la
stimulation de EDNO. Le pinacidil semble avoir une action directe sur l’activation des canaux
KATP dans la paroi de la musculature des vaisseaux, bien que l’activation des canaux KATP
endothéliaux peut provenir aussi de la production de EDNO [62].
Le rôle de l’endothéline
Il a été suggéré que le tout puissant vasoconstricteur ET-1 joue un rôle dans la pathogenèse de
l’HTAPP à la naissance [62]. Il s'agit d'un peptide de 21 acides aminés qui possède au moins
trois sous-unités (isoformes), nommées respectivement ET-1, ET-2 et ET-3. Les isoformes
agissent en se liant à des récepteurs membranaires dont il existe au moins deux types distincts,
ET-A et ET-B. L'affinité de l'ET-1 pour le récepteur ET-A est 100 fois supérieure à celle de
l'ET-3 pour ET-A alors que les trois isoformes ont la même affinité pour le récepteur ET-B. L’
ET-1 est activé par une métallo protéinase sensible au phosphoramidon et se trouve dans
l’endothélium notamment au niveau des cellules musculaires lisses [63, 64]. Il est présent au
cours de la période périnatale dans les poumons [65] et semble être actif chez les fœtus [30,
66]. L’élévation de son expression et sa libération ont été documentées dans des pathologies
pulmonaires couplées avec une HTAPP [67, 68].
L’action de l’ET-1 est dépendante de l’activation d’au moins deux récepteurs : ETA et
ETB. Les récepteurs ETA sont localisés dans les cellules musculaires lisses (Figure 7) et
participent à la vasoconstriction et à la prolifération des cellules musculairs lisses [69]. L’ET-
1 semble être un agent causal dans la pathogenèse de l’hypoxie [70]. Une augmentation de la
densité des récepteurs ET-A a été décrite dans des artères pulmonaires et dans le parenchyme
pulmonaire de patients avec une pathologie cardiaque congénitale [71, 72]. On ne sait pas si
c’est l’ET-1 qui joue un rôle direct dans la pathogenèse de l’HTAPP ou si c’est la variation du
taux de ce peptide qui provoque une HTAPP. D’autres études ont montré que les récepteurs
ET-B provoquent une vasoconstriction sur des artères de vaisseaux pulmonaires [29]. De
18
Lagausie et al. [73] ont montré qu’une augmentation de l’expression de ET-A dans des artères
pulmonaires peut être à l’origine d’une HTAPP chez le bébé avec une HDC. Des recherches
pharmacologiques ont montré qu’il existe deux classes de ET-B avec des effets cellulaires
spécifiques : ET-B1 qui agit sur les cellules endothéliales et provoque une vasodilatation et
ET-B2 qui agit sur les cellules musculaires lisses et provoque une vasoconstriction. La réponse
dilatative est liée au récepteur ET-B1 et le nombre de récepteurs est diminué dans des cas
d’hypertension induite par l’hypoxie [74]. Néanmoins des inhibiteurs sélectifs des deux
récepteurs ne modifient pas le tonus pulmonaire de base chez des fœtus normaux [72]. Une
stimulation du récepteur ET-B avec un agent stimulant comme la sarafotoxine S6c provoque
une vasodilatation, suggérant ainsi que seuls les récepteurs ET-B1 sont présents dans le
poumon de fœtus ovin [75].
Chez l’adulte, l’effet de l’ET-B n’est pas clair. L’ET-B semble avoir soit un effet de
constriction sur des cellules musculaires lisses de l’arbre respiratoire, soit être capable de
libérer des facteurs vasodilatateurs dérivés de l’endothélium [29]. Chez l’adulte avec une
HTAPP, une augmentation sélective des gènes codant le récepteur ET-B dans les artères
pulmonaires a été observée. Par des tests immunohistochimiques, de Lagausie et al [73] ont
trouvé une importante expression du récepteur ET-B dans des vaisseaux artériels pulmonaires
de nouveau-nés avec HDC alors que cette expression est absente dans des poumons de bébés
sans HDC. En utilisant une RT-PCR, ils ont observé que les gènes codant les récepteurs ET-B
trouvés chez des nouveau-nés avec HDC n’étaient pas différents de ceux trouvés dans les
poumons de nouveau-nés sans HDC.
En plus de l’effet sur le tonus pulmonaire, l’augmentation de l’activité de l’ET-1
stimule la prolifération de cellules musculaires lisses, ce qui cause une augmentation de la
RVP [77-79].
19
GDAG
PIP2
PLC
+
PKC
IP3
ET-1
Ca++
Réticulum
sarcoplasmique
Vasoconstriction
Prolifération
cellulaire
+Ca++
Figure 7 : Effets cellulaires de l’endothéline (ET-1). La liaison de l’ET-1 à son récepteur
active une protéine G couplée à la phospholipase C. Cette dernière hydrolyse des
phospholipides membranaires, donnant ainsi naissance à l'inositol triphosphate
(IP3) d'une part, et au 1-2 diacyl-glycérol (DAG) d'autre part. Par des voies de
transductions intracellulaires différentes, ces deux messagers intracellulaires
entraînent une augmentation de la concentration intracellulaire de calcium (Ca2+
)
responsable de la contraction du muscle lisse vasculaire. PIP2=phosphoinositol
diphosphate ; PKC=protéine kinase C ; PLC=phospholipase C
Le rôle du NO
Le NO est un vasodilatateur puissant qui est le résultat de la conversion de L-arginine en
citrulline grâce à l’enzyme nitric oxide synthase (NOS). Il y a trois formes de NOS, le type I
ou neuronal (NOSn, NOS I), le type II ou inducible (NOSi ou NOS II) et le type III ou
endothélial (NOSe ou NOS III).
Le NO diffuse en direction de la cellule musculaire lisse et active la GCs qui s’y situe
[51], augmentant ainsi le GMPc [80]. La PKG active le canal Kca++
grâce à une
phosphorylation (voir ci-dessus). L’hyperpolarisation membranaire cellulaire résultante inhibe
le flux ionique à travers des canaux calciques voltage-dépendant et cause ainsi une
vasodilatation [49]. Ce processus permet ainsi une autorégulation de la contraction et la
20
dilatation du vaisseau. Le GMPc est à son tour inhibée par l’enzyme phosphodiestérase (PDE-
5) qui est spécifique au GMPc. Le GMPc est transformé ainsi en GMP inactif (GMPi) qui
limite l’effet vasodilatateur du NO (Figure 8) [81, 82].
NOSNOS
O2
Ca2+L-arginineACh ADP
G
O2
L-arginine
NADPH
Calmodulin
Ca2+
L-citrulline
Endothelial cell
NO
L-NAME
L-NMMA
–
KT-5823
GTP
GMPc
Relaxation
Vascular smoothmuscle cell
NO
sGCsGC
PKGPKGCa2+
–
YC1
ODQ
–
––
NO donors
ZaprinastT-1032
–GMPi
PDEPDE--55
Figure 8. Le monoxide d’azote (NO) peut être synthétisé par voie endogène par la NO
synthase (NOS) ou il peut être produit par voie exogène par des donneurs de NO.
Le NO diffuse en direction de la cellule musculaire lisse et active la guanylate
cyclase soluble (GCs ou sGC) située dans ces cellules musculaires lisses. Ceci
augmente le niveau du 3'-5'-guanylosine monophosphate cyclique (GMPc). Le
GMPc stimule une protéine kinase (PKG) puis est inactivé par la
phosphodiesterase type 5 (PDE-5). Différents agents pharmacologiques sont
activateurs (+) ou inhibiteurs (-) des enzymes PKG et PDE-5.
La NOS est exprimée dans les neurones du cerebellum ou de l’hypothalamus et dans les
neurones périphériques [83]. Les neurones qui provoquent une relaxation après stimulation
sont appelés non adrénergiques et non cholinergiques (NANC) et le NO semble être le
premier neurotransmetteur qui permet d’influencer la réponse de ces neurones NANC dans
beaucoup de tissus, comme le tractus gastro-intestinal ou le muscle lisse de l’appareil
respiratoire aussi chez l’humain [83, 84]. Le rôle du NO comme médiateur de la réponse aux
neurones NANC de la musculature lisse bronchique chez l’humain a été étudié [85-87]. Chez
21
cochons d’inde, il a été démontré que le NO a un effet inhibiteur sur la contraction
cholinergique de la trachée induite par la stimulation électrique par champs (EFS) [88].
On sait que le NO module le tonus vasculaire à la naissance et in utéro [35] et que
l’inhibition de la NOS par le N-nitro-L arginine (L-NNA) augmente la RVP [36]. Des
expérimentations ont permis à Cornfield et al. [89] de démontrer que, chez les brebis, le NO
est associé, à la naissance, à une vasodilatation pulmonaire progressive mais pas à une
régulation immédiate. Le rôle du NO et son influence à la naissance ont été largement étudiés
et même si le NO semble être capable de diminuer la RVP alors que l’inhibition de la NOS
augmente la RVP [90, 91], la contribution des trois isoformes de la NOS à la modulation du
tonus vasculaire pulmonaire est encore l’objet de nombreux débats [92, 93]. L’enzyme NOSe
a été mise en évidence par immunohistochimie dans l’artère pulmonaire principale et dans les
artères de 4ème
génération de l’arbre pulmonaire, ceci chez des brebis herniées [6]. Fagan et al.
[94] a montré que la NOSe et la NOSi jouent un rôle chronique dans la modulation du tonus
basal dans la circulation pulmonaire de la souris et que la NOSn ne contribue pas à la
modification du tonus basal. Boulanger et al [95] ont détecté la NOSn dans la musculature de
gros vaisseaux chez le rat et Shermann et al. [32] ont montré que la NOSn est exprimée dans
les cellules épithéliales de l’arbre respiratoire et dans les cellules alvéolaires chez les foetus
humain et ovins. Par ailleurs, Rairigh et al. [91] ont montré que la NOSn contribue à la
vasorégulation de la circulation pulmonaire chez la brebis sans HDC à la naissance, car un
inhibiteur sélectif de la NOSn, la 7-nitroindazole (7-NINA) augmente la RVP et la pression
pulmonaire systémique. Le débat reste largement ouvert.
La guanylate cyclase (GC) et la phosphodiestérase (PDE-5)
La GC est un hétérodimère composé d’une sous-unité α de 72 k-Da (619 acides aminés) et
d’une sous-unité β de 65 k-Da β (549 acides aminés). L’expression des deux sous-unités est
indispensable pour l’activation de cette enzyme (Figure 9 et 10). Un groupe hème
prosthétique situé sur la sous-unité β est la cible pour la régulation NO-dépendante de la GC
[96, 97]. On distingue deux groupes de GC, les GC membranaires (GSm) et les GC
cytosoliques ou solubles (GCs). Les premières sont des récepteurs membranaires des peptides
natriurétiques alors que les secondes sont des enzymes qui agissent comme de véritables
récepteurs intracellulaires du NO. Le NO est lié avec une grande affinité à ce fer hématique,
provoquant ainsi un changement de géométrie qui provoque l’activation de l’enzyme [98].
22
Dans des expériences in vivo, l’activation du GCs par le donneur de NO, le sodium
nitroprussiate (SNP), produit une réduction de la réponse chez des animaux herniés en
comparaison aux animaux non herniés, suggérant ainsi que l’enzyme GCs est déficiente chez
des brebis avec HDC. In vitro, la réponse relaxante au SNP est significativement meilleure
chez des animaux non herniés que chez des animaux avec HDC, suggérant un défaut de
fonctionnement de la GCs chez des animaux herniés. In vitro, la stimulation directe de la GCs
par la YC-1, qui se fixe sur les cystéines 238 et 243 de la sous-unité α, pour provoquer une
vasodilatation est significativement plus efficace sur les anneaux vasculaires de brebis sans
HDC, suggérant une fonction déficiente du passage NO/GCs [99].
Figure 9. Structure de la GCs. La structure moléculaire de la GCs comprend 3 domaines:
1. le domaine catalytique (régions carboxy-terminales des 2 sous-unités).
2. le domaine régulateur (régions amino-terminales des 2 sous-unités) possédant un
groupement héminique.
3. le domaine de dimérisation (au niveau central).
23
Figure 10 : Structure et mécanismes d’activation de la GCs. Le NO se fixe directement sur le
groupement héminique (contenu dans la région amino-terminale de la GCs) au
niveau de l’Histidine 105 de la sous unité β, cassant le lien fer-histidine et
permettant une modification de conformation de GCs et son activation. Cette
stimulation est donc dépendante du NO. La stimulation endogène de la GCs peut
aussi être réalisée par toute molécule apportant du NO. C'est le cas de tous les
dérivés nitrés (donneurs de NO) et notamment du nitroprussiate de sodium (SNP).
La PDE-5 contrôle le passage de GMPc en GMPi. Onze familles d’enzymes ont été
maintenant identifiées. Ces enzymes peuvent être inhibées par des inhibiteurs sélectifs ou non
sélectifs [100, 101]. Les inhibiteurs de la PDE-5 augmentent la quantité de GMPc et ainsi
l’effet du NO. Ils provoquent une vasodilatation et une bronchodilatation et ont également un
effet anti-inflammatoire. L’augmentation du GMPc par le blocage de la PDE-5 provoque une
diminution de la concentration intracellulaire de Ca2+
et une libération des prostaglandines.
Les méthylxanthines sont des inhibiteurs non sélectifs de la PDE-5 qui provoquent une
vasodilatation, une bronchodilatation et qui ont des effets anti-inflammatoires. Ils ont aussi le
pouvoir d’augmenter l’activité immunitaire des mastocytes, et d’activer le transport ciliaire et
la production de surfactant [101, 102]. Les inhibiteurs sélectifs de la PDE-5 comme le
dipyridamole diminuent la RVP et la pression systémique [103]. D’autres inhibiteurs sélectifs
24
de la PDE-5 comme le sildenafil sont capables de dilater les vaisseaux pulmonaires [104]. On
a peu de connaissances sur le rôle de la PDE-5 sur la circulation fœtale pulmonaire, mais il a
été prouvé que la GMPc joue un rôle crucial dans l’adaptation de la circulation pulmonaire à
la naissance [105, 106]. Chez les fœtus ovins, la PDE-5 semble diminuer significativement
après la naissance, suggérant ainsi que le tonus pulmonaire vasculaire diminue l’activité de la
PDE-5 [106, 1047]. De plus, l’activité de la PDE-5 semble ne pas être la même sur des
poumons d'agneaux nouveau-nés que sur ceux de foetus d'agneaux, elle a une plus grande
capacité de relaxation des poumons chez les nouveau-nés que chez les foetus [107, 108].
3. Prise en charge
Une équipe multidisciplinaire comprend en tout cas des néonatologues, des obstétriciens, des
chirurgiens pédiatriques, des généticiens et des cardiologues. Les chirurgiens pédiatriques et
les obstétriciens collaborent lors de la chirurgie foetale, mais la gestion de chaque cas et la
décision quant à l'intervention chirurgicale doivent faire l'objet d'une discussion
multidisciplinaire et tenir compte du contexte de la malformation, des signes indicatifs de sa
gravité, de l'âge gestationnel au moment du diagnostic, du contexte familial et de la
probabilité que la famille consente à l'opération. De nombreuses publications sur le traitement
des enfants nés avec une HDC paraissent chaque année. Lorsque les bébés souffrant d'une
HDC présentent une hypertension pulmonaire modérée, leur taux de survie est élevé et le
pronostic est meilleur que pour ceux qui présentent une HTAPP sévère et dont le pronostic est
sombre, quelle que soit la stratégie de traitement adoptée [109].
Il n'existe à ce jour pas de consensus quant au traitement de l’HTAPP chez les bébés,
et les études sur ce sujet doivent être interprétées avec circonspection, ceci pour diverses
raisons: premièrement, une comparaison valable des différentes hernies est difficile car les
critères appliqués pour déterminer si la hernie est modérée ou grave ne sont pas toujours les
mêmes et peuvent influencer arbitrairement la décision concernant la nature du traitement;
deuxièmement, aucun critère de sélection d'un traitement particulier n'a encore été validé par
des études sur de larges populations et le choix du traitement dépend dans une large mesure
des convictions intimes du chef d'équipe; et troisièmement, le taux de survie est plus élevé
dans les grands centres où le nombre annuel de naissances ou de transferts est important que
dans de plus petits centres où ces cas sont rares [110].
25
Un examen prénatal par ultrasons (US) à haute résolution permet de confirmer le
diagnostic lorsqu'on soupçonne une HDC. Chez 40 à 60% des enfants, les HDC sont
diagnostiquées avant la naissance [111]. En général, le premier signe que révèle l'US est la
présence dans le thorax d’anses intestinales remplies de liquide. Dans 90% des cas, l'intestin
grêle et l'estomac sont tous deux impliqués. Un diagnostic précoce, à la 24ème
semaine de
gestation, est un facteur peu rassurant quant à l’évolution du fœtus. Certains signes et
mensurations prénataux précoces fournis par l'US présagent également une mauvaise
évolution ; un défaut musculaire large, un estomac très dilaté, un lobe gauche du foie
pénétrant dans le thorax et la présence d'un polyhydramnios présagent une grave hypertension
pulmonaire à la naissance et une issue défavorable [112].
Des examens ultrasonographiques sont effectués ultérieurement pour évaluer le contenu
de la hernie et d'éventuelles malformations annexes. Un examen par US-doppler permet de
vérifier la position de la veine ombilicale et des vaisseaux hépatiques. Plusieurs indices ont
été proposés pour l'évaluation du pronostic à la suite d'examens ultrasonographiques. En
2000, Suda [113] a montré que le facteur le plus significatif pour le pronostic est l'index
modifié de « McGoon », soit le rapport entre le diamètre de l'artère pulmonaire proximale et
l'aorte descendante. Un rapport de 1.3 ou moins semble prédire la mortalité avec une
sensitivité de 85% et une spécificité de 100%. Actuellement, comme nous allons le voir
ultérieurement, les deux critères retenus pour prédire l’évolution du fœtus avec HDC sont la
position du foie, et le rapport poumon-tête (lung to head ratio ou LHR en anglais).
Un examen prénatal par imagerie de résonance magnétique (IRM) peut jouer un rôle
important en cas de doute quant à la position du foie, et pour évaluer le volume des poumons
ou pour distinguer une HDC d'autres malformations telles qu'une malformation adenomatoïde
kystique (MAK), une séquestration, un kyste bronchogène ou entérique ou un tératome
médiastinal. Cette technique est un excellent procédé d'imagerie lorsqu'un détail anatomique
subtil doit être examiné avec précision. Une recherche caryotipique est également impérative
car la HDC est associée à des anomalies chromosomiques.
Plusieurs alternatives peuvent être proposées aux parents d'enfants atteints d'une HDC
de mauvais pronostic et pour lesquels le pronostic est mauvais: interrompre la grossesse
(avant la 24ème
semaine), laisser la grossesse suivre son cours jusqu'à l'accouchement, ou
envisager une chirurgie prénatale avec occlusion de la trachée. Comme le taux de mortalité est
élevé dans les cas de HDC avec HTAPP sévère, on peut espérer qu'une intervention in utero
amène une issue plus favorable pour l'enfant.
26
3.1. Prise en charge prénatale
En 1990, à San Francisco, Harrison et son équipe furent les premiers à opérer in utero les
enfants atteints d'une HDC [114]. Cette nouvelle technique chirurgicale risquée et complexe
s’est heurtée à de nombreuses difficultés, notamment techniques et les premiers résultats
obtenus n'ont pas été d’emblée satisfaisants. Le taux de naissances avant terme était élevé, dû
aux infections et à la difficulté de maintenir la tocolyse. La réduction d'une hernie du foie
dans le thorax se révélait difficile et pouvait provoquer une obstruction de la circulation dans
le cordon ombilical et la mort du foetus [115].
Le développement du parenchyme pulmonaire est fortement stimulé lors du blocage de
la circulation du liquide pulmonaire intraluminal [116]. Cette singulière et exceptionnelle
découverte fit naître l'idée qu'une occlusion de la trachée du foetus (OTF) pouvait favoriser la
croissance des poumons avant la naissance et améliorer l'issue après la naissance. Des
animaux présentant une HDC et traités par occlusion trachéale développèrent des poumons
dont l'apparence et le fonctionnement étaient presque normaux, et leur taux de survie s'avéra
nettement meilleur que celui d'animaux avec une HDC [117]. Cette constatation fut observée
à la fois chez des brebis avec une HDC créée chirurgicalement et chez des rats avec une HDC
induite par le nitrofène [118, 119] : l'occlusion trachéale avait entraîné une croissance des
poumons et des examens morphométriques ont montré une réduction de l'épaississement des
petites artères pulmonaires [119, 120].
L’explication de ce mécanisme d'adaptation du poumon après une occlusion trachéale
fait l’objet de travaux intenses, basés sur l’effet de molécules telles que le Facteur-A de
croissance de l'endothélium vasculaire (VEGF-A), le Facteur-B de croissance dérivé des
plaquettes (PDGF-B), le Facteur-II de croissance semblable à l'insuline (IGF-II), la kinase
protéinique activée par les mitogènes (MAPK) ou l'ET-1 [121-123].
Indications et mesures
La chirurgie foetale n'est possible que dans les quelques centres qui reçoivent un nombre
suffisant de cas [124]. En plus d’une équipe au complet qui comprend des néonatologues, des
gynécologues, des généticiens, des radiologues et des chirurgiens pédiatriques, la chirurgie
proprement dite recquiert la disponibilité d'instruments particuliers, ce qui limite son
exécution à quelques centres hautement spécialisés dans le traitement de la chirurgie foetale.
27
Divers indices ont été suggérés pour déterminer la gravité de l'HTAPP au moment de la
naissance. Bien qu’aucun critère ne soit actuellement admis par toutes les équipes, la capacité
d’identifier prénatalement les foetus à haut risques est primordiale car la chirurgie in utéro,
elle-même risquée, ne concerne que les cas à haut risques. Actuellement, deux critères
semblent les plus fiables pour la sélection de fœtus à hauts risques. Il s’agit
-1. De la position du foie. Les foetus dont le foie est hernié dans la cavité thoracique
n'ont que 50% de chances de survie (Figure 11) [124].
-2. Du rapport entre le diamètre du poumon le plus détectable par US et celui de la tête
(LHR pour lung/head ratio) (Figure 12) [125-127].
On distingue ainsi plusieurs groupes de fœtus :
- Le groupe A avec un LHR inférieur à 0.6, présageant une hypoplasie extrême du
poumon, une très mauvaise issue pour le foetus et un taux de mortalité de
pratiquement 100%
- Le groupe B avec un LHR entre 0.6 et 1, présageant une hypoplasie grave et un taux
prédictif de survie de 15 à 60%
- Le groupe C avec un LHR de 1 à 1.6 donnant à l'enfant 66% de chance de survie et un
taux de survie prédictif de plus de 83% [124].
Figure 11. Exemple de foie hernié dans la cavité thoracique décelé à l’ultrasonographie.
F=foie
F
28
L'indication d’une OTF fait l'objet de nombreuses discussions car son effet bénéfique n'a pas
encore été prouvé. Dans le cadre d'une étude sur une série de cas en 1997, Lipschutz et al.
[126] ont montré qu'aucun foetus avec un LHR inférieur à 1 n'avait survécu au-delà de 60
jours après la naissance, et que seuls ceux qui avaient un LHR supérieur à 1.4 pouvaient
survivre. Mais il a été également démontré que le LHR n'est pas un facteur de prédiction pour
des foetus qui ont une HDC à gauche et une position normale du foie [127-129].
En résumé, cinq critères semblent se détacher pour proposer une chirurgie in utéro par
scopie (« FETENDO » en anglais pour une chirurgie endoscopie fœtale) dans les centres
spécialisés : ce sont (1) un LHR inférieur à 1, (2) une hernie comprenant une large portion de
foie y compris une partie du lobe gauche dans le thorax, (3) un caryotype génétique normal,
(4) l’absence d'anomalies annexes, et (5) une grossesse monofoetale à la 25ème
semaine de
gestation.
Figure 12. Exemple du rapport poumon-tête (LHR) mesuré par ultrason (US). H=head;
flèche= diamètre de la tête. Un rapport inférieur à 0.6 présage une évolution
très sombre du foetus, un rapport entre 0.6 et 1 donne une survie prédictive
entre 15 et 60%.
H
29
La chirurgie
Après les tests préopératoires de routine et un examen physique, on procède à un examen
ultrasonographique pour vérifier la viabilité du foetus. On administre de l'indométacine le
matin pour assurer la relaxation de l'utérus. On met en place une péridurale pour diminuer la
douleur chez la mère et le foetus. La mère porte des bas de compression comme précaution
contre le risque d'une thromboembolie. L'anesthésie se fait par inhalation d'isoflurane pour
maintenir la relaxation de l'utérus. La patiente est recouverte de champs stériles pour
l'opération.
Deux avancées majeures en chirurgie in utéro ont permis des progrès considérables dans
l’approche du traitement: tout d'abord le développement de la technique chirurgicale par
foetoscopie, qui permet d'insérer par une incision percutanée de 3.3 mm un ballon qui
permettra l'occlusion trachéale endoluminale du foetus. L’opération se fait entre la 26ème
et la
28ème
semaine de gestation. L’occlusion endoluminale de la trachée de foetus ovins effectuée
par foetoscopie au moyen d'instruments endoscopiques a été rapportée dès les années 2000.
Ce type de chirurgie, qu'on appelle FETENDO [130, 131] fut ensuite appliqué sur des foetus
humains [132]. Auparavant, la chirurgie foetale in utero nécessitait une hystérotomie:
l'abdomen inférieur maternel était ouvert par une laparotomie transverse et une hystérotomie
se faisait sous contrôle ultrasonographique. On appliquait un moniteur d'oxymétrie sur la
main du foetus, on exposait son cou et on faisait une incision transverse pour isoler la trachée.
Celle-ci était ensuite occluse par deux hémoclips placés face à face. On refermait ensuite la
plaie couche par couche. Une analgésie continue par péridurale soulageait la douleur
postopératoire de la mère et de l'enfant. La tocolyse était maintenue jusqu'à la fin de la
grossesse par des doses intraveineuses de sulfate de magnésium et d'indométacine. La mère
gardait en général le lit et était suivie de près pour déceler les signes ou symptômes d'un
accouchement prématuré. Un suivi ultrasonographique à intervalles réguliers permettait de
mesurer le parenchyme pulmonaire et de contrôler la croissance graduelle du volume des
poumons. Mais le taux de survie des foetus était faible, et le taux de morbidité des survivants
inacceptable [128].
La deuxième avancée a été possible grâce au matériel utilisé pour occlure la trachée.
Actuellement, une capsule de gélatine contenant une mousse de polymère expansible et
imperméable à l'eau (PLUG) est introduite dans la trachée, sous les cordes vocales, avec un
foetoscope muni d'un ballon détachable. Ce procédé semble être bien toléré par le foetus et
provoque une excellente croissance des poumons. Le foetoscope est d'un diamètre de 1.2 mm
30
et est inséré dans un trocart de 3 mm. Cette méthode représente un progrès marquant par
rapport à l'occlusion endoscopique de la trachée foetale par des clips, technique qui a
engendré de nombreuses complications chirurgicales [130].
Le PLUG est inséré entre la 26ème
et la 28ème
semaine de gestation, et est retiré à la 34ème
semaine de gestation. Il faut s'assurer que l'anesthésie et la chirurgie ne posent pas de risques
pour la mère. Le moment où l'on pose le PLUG et le laps de temps avant son retrait font
l'objet de nombreuses discussions et de recherches. Ce sont des éléments cruciaux pour
assurer l'effet bénéfique de ce procédé, c’est-à-dire pour obtenir un volume accru des
poumons et une croissance accélérée des voies respiratoires.
Il faut signaler que le retrait du matériel occlusif trachéal peut se faire de deux manières,
soit avant la naissance, à la 34ème
semaine de gestation, ou par un procédé dit EXIT pour "Ex
Utero Intrapartum Treatment", procédé selon lequel le ballon est retiré au moment de la
naissance qui est alors programmée. Dans les deux cas, le retrait du ballon ne peut se faire que
dans des institutions qui disposent d'un équipement approprié (Figure 13) [133]. Dans le
premier cas, l'intervention est pratiquée avant la naissance par trachéoscopie foetale. On
pratique une anesthésie par péridurale avec administration d’un tocolytique pour la mère
[124]. Cette procédure comporte un risque de rupture prématurée des membranes appelée en
anglais « iPPROM » pour "iatrogenic preterm rupture of the fetal membrane" [124]. Dans le
second cas, les contractions sont provoquées peu avant le terme et l'accouchement se déroule
selon le procédé « EXIT »: sous anesthésie profonde pour détendre l'utérus et assurer une
bonne perfusion utérine, on exécute une laparatomie et une hystérotomie. On expose
rapidement le cou du bébé pour permettre de retirer l'occlusion trachéale et de procéder à une
bronchoscopie. Ensuite le bébé est intubé et reçoit du surfactant. La HDC est réparée après la
stabilisation du bébé placé dans l'unité néonatale de soins intensifs.
Au vu des premiers résultats après installation du PLUG, résultats ne montrant pas de
bénéfice de la chirurgie fœtale avec cette procédure, la pose de PLUG in utéro fut dans un
premier temps abandonnée plus tôt que prévu [130]. On fit toutefois de nouveaux essais sur
des foetus pour lesquels le pronostic basé sur des mensurations in utero plus précises
qu’auparavant était particulièrement mauvais. En 2006, Deprest [124] a rapporté un taux de
survie néonatale de 75% après réparation de la HDC chez 90% des 66% d'enfants opérés, et
un taux de survie néonatale de 58% pour 24 cas consécutifs de HDC chez lesquels la durée de
l'occlusion de la trachée avait été de 42 jours seulement.
31
Figure 13. Retrait schématique du PLUG selon Harrison. 2001, Am J obstet gynecol,
Harrison et al.
3.2. Prise en charge post natale
A la naissance, les bébés atteints d'une HDC présentent un ventre plat, des bruits intestinaux
dans le thorax, une auscultation cardiaque déplacée latéralement et des difficultés
respiratoires. Le traitement le plus urgent vise à stabiliser le système cardio-pulmonaire
pendant les manœuvres de réanimation en provoquant un minimum de lésions iatrogéniques.
Lorsque la HDC est grave, les bébés sont en général intubés rapidement pour lutter contre
l’hypertension pulmonaire et un tube gastrique est posé pour décompresser l'estomac. La
ventilation par masque est contre indiquée car elle peut entraîner une distension de l'estomac
hernié dans la cavité thoracique. Le cordon ombilical peut servir d'accès aux voies artérielles
et veineuses pour mesurer les gaz sanguins et contrôler la pression veineuse centrale. Une
radiographie du thorax montre généralement des anses intestinales dans le thorax et un
déplacement du coeur du côté opposé au défaut diaphragmatique (Figure 14). Chez 80% des
enfants nés avec une HDC, la malformation est située à gauche, et chez 1% la hernie est
bilatérale [134]. Lorsque la HDC est peu sévère, ses symptômes peuvent ne pas se manifester
immédiatement mais n'apparaître qu'après plusieurs mois [135].
Les progrès de la réanimation néonatale ont fortement amélioré l'issue des bébés nés
avec une HDC. L'introduction de diverses méthodes de ventilation, l'usage de NO, du
surfactant voire même de l'ECMO a permis cette amélioration. Néanmoins, ces diverses
techniques sont encore en discussion et il n'y a pas d'entente générale quant au choix de l'une
ou de l'autre. Il n'est pas prouvé que ces techniques soient bénéfiques pour les bébés nés avec
une HDC lorsqu'elles sont appliquées individuellement, mais par contre leur utilisation
32
conjointe ou alternée s'est avérée bénéfique. Il est cependant nécessaire qu'un suivi à long
terme fournisse plus d'informations sur l'effet de ces traitements sur la morbidité et la
mortalité des enfants qui naissent avec une HDC grave. Un problème additionnel provient du
fait qu'une comparaison valable de ces traitements n'est possible que si les enfants traités
présentent un degré égal de sévérité de leur HDC.
La ventilation conventionnelle Le mode optimal de ventilation à la naissance des enfants atteints d'une HDC n'a pas encore
été défini. Tout le monde s’accorde à dire que la ventilation conventionnelle doit être une
ventilation "douce" pour éviter qu'un barotraumatisme n'aggrave les problèmes dûs à
l’HTAPP existante. Le principe de ventilation "douce" repose sur le contrôle de la pression
crête en limitant la pression ventilatoire maximale avec une tolérance d’une saturation du sang
en oxygène de 85%. Une élévation de la PaCO2 (hypercapnie tolérée) est donc tolérée et une
ventilation spontanée souhaitée [136, 137]. Boix-Ochoa fut le premier à rapporter que des
différences entre les valeurs de pH et de PaCO2 à l'entrée et à la sortie de l’arbre respiratoire
peuvent contribuer à distinguer les bébés qui survivront de ceux qui ne survivront pas,
démontrant ainsi l'influence du pH et de la PaCO2 sur le tonus pulmonaire et les flux sanguins
[138].
Le barotraumatisme est une cause supplémentaire majeure de morbidité et de mortalité
chez les enfants atteints d'une HDC. Des études ont montré que la mortalité accrue chez ces
enfants est due à une fréquence de ventilation élevée et à une forte pression inspiratoire [136].
Les dommages pulmonaires causés par un ventilateur proviennent d'une perturbation
structurelle résultant d'une distension exagérée des poumons et des alvéoles et de la création
de forces de cisaillement (« shear-stress ») générées par les phénomènes de contraction-
relaxation répétitives dans les régions atélectatiques des deux poumons. Ces mécanismes
provoquent des fuites sanguines capillaires dans l'endothélium et l'épithélium, une rupture de
la membrane basale, un épanchement de fluide dans les espaces alvéolaires, une réaction
inflammatoire généralisée et une diminution de la sécrétion de surfactant [139].
33
D G
Figure 14. A la naissance, radiographie du thorax montrant des anses intestinales dans la
cavité thoracique (à gauche sur la radiographie) avec un déplacement du cœur
du côté opposé à la hernie (à droite sur la radiographie). C=cœur ; I=intestins ;
P=poumon
Au niveau anesthésique, des transporteurs de gaz spécifiques, par exemple les
perfluorocarbones, peuvent servir de milieu de transport avec l’utilisation d’une ventilation
liquidienne. Leur faible solubilité dans des lipides fait qu'ils abaissent la tension à la surface
des alvéoles, permettant ainsi une pression de ventilation plus basse. Les perfluorocarbones
peuvent aussi servir de support pour l'administration d'anesthésiques et de vasodilatateurs
[140, 141].
L'oscillation à haute fréquence (OHF)
L'OHF fut introduite dans les années 1980 pour tenter d'améliorer les échanges gazeux dans
les poumons en évitant une pression inspiratoire élevée causée par la ventilation
conventionnelle. Son but est de maintenir dans les voies respiratoires une pression moyenne
d'environ 15 cm H2O et une amplitude inférieure à 45. L'OHF peut être utilisée comme
premier moyen de ventilation pour des bébés nés avec une HDC ou lorsque les méthodes de
ventilation traditionnelles échouent. Il n'est en fait pas prouvé que l'OHF soit meilleure qu'une
ventilation conventionnelle [142] mais une ventilation à faible échange de volume d’air
produit par l'OHF est peut-être moins délétère pour les poumons que la ventilation
C I
P
I
34
conventionnelle qui est basée sur des échanges de volume d’air plus intense [143]. Le choix
entre les divers modes de ventilation dépend dans une large mesure des convictions de chaque
équipe, mais lorsque l'hypertension pulmonaire ne répond pas à un premier traitement,
d'autres stratégies de ventilation peuvent alors être essayées. Les équipes qui choisissent
l'OHF comme stratégie de ventilation rapportent de relativement bons résultats même chez les
enfants pour lesquels le pronostic est mauvais [144].
Le surfactant
Le surfactant pulmonaire est synthétisé par les pneumocytes du type II et pas les cellules de
Clara. C'est une combinaison complexe de phospholipides, de lipoprotéines et de saccharides.
Les phospholipides abaissent la tension de surface des alvéoles et empêchent leur collapsus et
celui des voies respiratoires terminales à la fin de l'expiration [145]. La partie hydrophile (SP-
A) tend à détruire les pathogènes en activant les macrophages et les processus d'opsonisation,
et la partie hydrophobe (SP-B et SP-C) contribue au maintien d'un équilibre entre les forces
exercées par l'interphase air-liquide [146, 147]. Le surfactant est également sécrété pour
combattre l'inflammation des poumons en modulant l'activation du NO, du PLA2 et de l'acide
arachidonique [148, 149]. On a pu montrer que l'immaturité des poumons des bébés atteints
de HDC peut causer des insuffisances de phosphatidylcholine disaturée [150] et de surfactant
[151]. Ces observations n'ont pas été confirmées par d'autres équipes [152]. La plupart des
études sur l'insuffisance de surfactant ont été menées sur des animaux, en particulier des rats,
chez qui la production de surfactant semble être améliorée par l'administration de vitamine A
[153, 154].
Bien que l'usage de surfactant exogène pour les enfants à HDC n'ait pas fait l'objet d'un
essai clinique contrôlé, c'est pourtant un traitement standard pour combattre l'HTAPP chez ces
enfants, particulièrement lorsqu'il est appliqué conjointement à d'autres traitements. Des
complications suite à l'administration de surfactant, telles une chute de pression artérielle, une
vélocité accrue de la circulation sanguine cérébrale ou la présence de « non-répondant » au
traitement sont peu fréquentes [155].
Les stéroïdes Les corticostéroïdes réduisent l'oedème du poumon et provoquent l'activation de la NOS.
L'emploi de stéroïdes chez les enfants atteints de HDC se justifie surtout par les résultats
d'expériences faites sur des animaux, où l'administration de stéroïdes a provoqué
35
l'augmentation de la taille du coeur, de la production de surfactant et de la synthèse
protéinique [156]. La forte activité anti-inflammatoire des stéroïdes repose sur l'inhibition de
la migration des neutrophiles, des eosinophiles et des monocytes. Les stéroïdes sont capables
de se lier à un récepteur spécifique situé dans le cytoplasme des cellules afin non seulement
de bloquer les cytokines libérées par un médiateur mais aussi de moduler l’effet du PLA2, de
Cox-2, de l'ET-1 and du PAF [156]. On ne trouve cependant pas d’études avec essais cliniques
humains qui confirment les effets bénéfiques des stéroïdes ches des enfants à HDC.
Les effets secondaires des stéroïdes sont nombreux, entre autre une hypertension, une
bradycardie, une diminution de la réponse inflammatoire à l'infection et aux lésions
tissulaires, une diminution de la synthèse des glandes surrénales, une hyperglycémie et une
ostéoporose.
Les bloqueurs de canaux calciques
Alors que les bloqueurs de canaux calciques représentent le traitement de choix pour
l'hypertension pulmonaire, il n'existe pas de rapport sur leur emploi chez des enfants qui
souffrent d'une HTAPP associée à une HDC. Ces médicaments sont pourtant souvent
employés en combinaison avec d'autres car les combinaisons de médicaments se sont révélées
plus efficaces qu'un médicament seul, surtout lorsque la maladie résiste au traitement.
Le NO
La découverte du NO depuis plus de 20 ans a été une avancée majeure dans la compréhension
de la régulation vasculaire [7]. Le NO est un dilatateur puissant produit par les cellules
endothéliales des vaisseaux, y compris les vaisseaux pulmonaires. Il améliore l'oxygénation
du sang en abaissant la RVP et en diminuant les shunt cardiaques. Dans le poumon foetal
humain, le NO est impliqué dans l'angiogenèse, le développement pulmonaire et la
vasorelaxation [157]. On sait que le NO module les neutrophiles et l'adhésion des plaquettes,
contribue au développement du tissu musculaire lisse dans les vaisseaux et réduit les fuites
capillaires en diminuant la perméabilité vasculaire [158]. Le NO confère aux vaisseaux la
capacité d'autoréguler la contraction et la relaxation.
L'inhalation du NO est très efficace lorsqu'il s'agit de traiter une HTAPP chez des
nouveaux-nés ou des bébés atteint d'affections diverses [159]. Mais ce n'est pas le cas pour
des enfants souffrant d’HTAPP causée par une HDC, et la présence et la capacité d’activation
de la NOS productrice du NO fait encore l'objet de discussions étendues [37, 160]. On utilise
tout de même le NO contre cette HTAPP qui accompagne une HDC, en combinaison avec la
36
ventilation mécanique ou l'OHF, le surfactant et des médicaments antihypertensifs. Il n'y a pas
encore eu d’étude randomisée sur le rôle particulier du NO qui permette d'évaluer ses
bienfaits. Une publication rapporte même une issue plus mauvaise pour des enfants avec HDC
sous traitement de NO [161].
Le NO en forte concentration a pour effets secondaires des lésions potentielles du
poumon qui favorisent le stress oxydatif, l'inactivation de la production de surfactant, la
diminution de la motilité ciliaire, l'augmentation de l'inflammation des tissus et
l’augmentation de la perméabilité vasculaire induite par l'extravasation de plasma [155]. Le
NO inhalé en forte concentration peut être converti en peroxynitrite fortement toxique et
activer les macrophages et réduire la production de surfactant. Il semble que les poumons des
nouveaux-nés sont protégés contre le stress oxydatif à la naissance par l'augmentation de
l'activité antioxydante [162]. Le stress oxydatif est responsable de la dérégulation du tonus
vasculaire, de l'agrégation des plaquettes et d'une perméabilité vasculaire accrue. Il contribue
à l'apoptose par l'activation d'enzymes et par des altérations dans le transport des ions et du
cytosquelette [163].
L’ECMO
L'emploi de l’ECMO est controversé et le choix de cette intervention thérapeutique dépend en
premier lieu des convictions des chefs d'équipe individuels. Cette technique représente
maintenant un traitement standard dans certains centres spécialisés dans le traitement
d'enfants nés avec une HDC. Cependant deux études randomisées basées sur le traitement des
HDC par ECMO ont amené des conclusions peu précises et n'ont pas réussi à démontrer un
avantage de l’ECMO par rapport à d'autres techniques [164, 165]. Comme toujours, le
problème principal lorsqu'on compare des résultats vient de la difficulté à garantir l'intégrité
des groupes individuels d'enfants avec HDC car les critères appliqués pour la sélection de ces
enfants sont très divergents.
Les critères qui déterminent le choix de traitement par ECMO peuvent être très
différents d'un centre à l'autre, et souvent la décision finale n'est prise que lorsqu'on observe
chez l'enfant une aggravation de l'état clinique, une péjoration des gaz sanguins, une
ventilation mécanique avec une pression inspiratoire supérieure à 25 cm d’H2O, une
compliance inférieure à 0.25 mL/cmH2O/kg et un volume résiduel de moins de 3.5 mL/kg.
37
Plusieurs formules basées sur les composants des gaz sanguins ont été proposées pour
prédire l'issue des bébés atteints d’une HDC, afin de déterminer si de l'utilisation de l'ECMO
est appropriée:
- La première est le gradient du taux d'oxygène entre les alvéoles et les artères (AadO2),
calculé par la formule:
AadO2 = [(713 x FiO2 ) - PaCO2 /0.8] - PaO2
- La seconde est l'index de ventilation (IV), calculé par la formule:
IV = (RR x MAP x PaCO2)
et dont un résultat inférieur à 1000 présage un bon pronostic.
- La troisième est un IV modifié (IVM), calculé par la formule
IVM = (RR x PIP x PaCO2),
le PIP étant la pression inspiratoire maximale : un résultat inférieur à 40 présage un bon
pronostic, et un résultat supérieur à 80 un mauvais pronostic;
- Le calcul le plus communément utilisé est l'index d'oxygénation (IO), calculé par la formule
IO = (MAP x FiO2/PaO2).
L'ECMO est initiée à partir d'un IO de 40 ou plus.
On rapporte de bons résultats aussi bien pour la technique de canulation veineuse qu'artérielle
[163].
La réparation chirurgicale Dans la plupart des centres, on planifie l’intervention chirurgicale dès que la crise
d'hypertension pulmonaire chez le nouveau-né avec une HDC est en grande partie maîtrisée.
Pendant la période d'adaptation après la naissance on tente d’obtenir un équilibre de la
physiologie hémodynamique et pulmonaire [167]. Des études montrent cependant que l'issue
n'est pas différente entre les enfants opérés tôt ou plus tardivement [168]. La décision quant
au moment optimum pour la chirurgie postnatale doit être débattue au sein d'une équipe
multidisciplinaire et surtout tenir compte de l'état de stabilité de l'enfant, de sa capacité de
tolérer une ventilation douce avec une pression d’insufflation faible, d'une FiO2 inférieure à
50%, d'un minimum d’apport de NO et de valeurs de gaz sanguins acceptables.
Des ultrasonographies séquentielles du coeur et des poumons peuvent aider à évaluer
les dérivations du flux sanguin et à comparer l'hypertension pulmonaire et la pression
systémique. La réparation d'un défaut du diaphragme peut néanmoins provoquer une
38
aggravation de la compliance pulmonaire en réduisant l'élasticité de la paroi thoracique et en
augmentant la pression intraabdominale.
On débute l'intervention par une incision sous-costale qui donne accès au diaphragme.
La rate, l'intestin grêle et le gros intestin sont en général herniés à travers le défaut
diaphragmatique. Après la réduction des viscères herniés, la rate étant souvent la dernière à
entrer dans la cavité abdominale, il faut retrouver les bords du diaphragme. Ceci oblige le
chirurgien à disséquer la partie postérieure du diaphragme, souvent très mince. Idéalement, la
brèche dans le diaphragme est ensuite fermée par suture interrompue avec des fils non
résorbables. On peut aussi faire une suture matelassée en utilisant des supports pour appuyer
la suture (pledget). Une approche laparoscopique est aussi possible, si le chirurgien est habile
et bien exercé à cette méthode chirurgicale spécifique, et si la stabilité hémodynamique et
pulmonaire de l'enfant le permet. Une approche transthoracique pour la réparation du défaut a
également été décrite, surtout pour une HDC du côté droit. Elle offre une bonne visibilité pour
une réduction du foie [167].
Une simple réparation du diaphragme n'est pas toujours possible. En présence d'une
tension trop excessive pour permettre une simple réparation, d'un défaut de grande taille dans
un diaphragme mince, d'une agénésie ou même d'une absence du diaphragme, un implant
prosthétique peut s'avérer nécessaire [169]. Techniquement, cet implant doit être attaché sur
toute sa circonférence pour réduire le risque d'une récurrence de la hernie : la fixation externe
doit parfois se faire sur les côtes, la fixation médiane doit parfois inclure la paroi de
l’œsophage ou la paroi des gros vaisseaux. Il n'existe pas encore de matériau d'implant
optimal. Les matériaux actuels sont trop rigides, et cette rigidité crée des problèmes lorsque
l'enfant grandit, car l'implant prosthétique ne s'adapte pas à la croissance de la cavité
thoracique, ce qui entraîne des déformations thoraciques et des scolioses [170]. Le
développement de matériaux biologiques serait d'un grand intérêt en ce qui concerne le
remplacement du muscle diaphragmatique. D'autres solutions techniques ont été décrites pour
réparer une hernie récurrente, par exemple le rabat d'une partie du muscle latissimus dorsi
[171].
39
4. Le suivi a long terme
Des réunions multidisciplinaires spécialisées émergent dans de nombreux centres afin d'offrir
un suivi à long terme aux enfants nés avec des affections graves. Elles requièrent les services
de pédiatres expérimentés et formés dans des domaines particuliers.
Tous les enfants nés avec HDC doivent être suivis sur une longue période après une
chirurgie pré- ou postnatale car des problèmes peuvent surgir, comme par exemple une hernie
récurrente, des difficultés d'alimentation, un reflux gastro-oesophagien, une affection
pulmonaire chronique, des déformations musculosquelettiques comme la scoliose et le pectus
excavatus, une insuffisance neurologique ou un développement moteur retardé [170-173].
La survie à long terme reste un défi, surtout lorsque l'hypoplasie pulmonaire et
l'insuffisance broncho-pulmonaire rendent nécessaire un support ventilatoire et en oxygène
sur une longue durée. Ces défauts pulmonaires ont été associés à des problèmes respiratoires à
plus long terme, par exemple une discordance entre la ventilation et la perfusion ou des
maladies chroniques du poumon [170]. Dans cette même étude basée sur 100 cas consécutifs
d’enfants ayant survécus à une HDC, on rapporte qu'après leur sortie d'hôpital 16% des
patients sont restés dépendants de l'oxygène pendant plusieurs mois et 43% ont gardé une
dépendance aux diurétiques pendant un maximum de 30 mois ; que les affections virales sous
forme de bronchiolites avaient une prévalence accrue chez les enfants de moins de trois ans
nés avec HDC. Keller [174] a rapporté chez trois patients atteints de HDC une HTAPP et une
forte RVP mesurée par cathétérisme cardiaque entre les âges de 3 mois et 12 ans. L'ECMO a
été associé à de graves insuffisances du développement neurologique et à des problèmes
d'acuité auditive [175, 176]. Mais les enfants qui nécessitent une ECMO ne sont-il pas déjà
les témoins d’une HTAPP gravissime et difficilement gérable ?
40
C. Matériel et méthodes
1. Le modèle animal in vivo
Toutes les brebis ont été opérées à l’Ecole de Chirurgie de l’Assistance Publique des
Hôpitaux de Paris, 17 rue du Fer à Moulin, 75005 Paris. Ces brebis ont été fournies par
l'Institut national de Recherche Agronomique (INRA).
Préparation chirurgicale et analgésie
Les brebis ont été amenées à l'école de chirurgie des Hôpitaux de Paris une semaine avant le
protocole chirurgical. Elles ont été alimentées jusqu' à 24 heures avant l’opération.
L'induction de l'anesthésie a été réalisée par l'injection intraveineuse (iv) de 5 ml de
pentobarbital (pentothal) sodique après la mise en place d’un cathéter dans une des veines
jugulaires externes. L'analgésie a été débutée par l'injection intrathécale de 10 mg de marcaine
(2 ml). Les brebis ont été intubées et ventilées avec de l'air au moyen d'un ventilateur
conventionnel (BIRD Corporation, Palm Spring, California, USA). La perfusion de base était
du sodium 0,9% mélangé a du dextrose 10%. La fréquence cardiaque (FC) et la saturation en
oxygène de l'hémoglobine ont été enregistrées en continu.
Première procédure chirurgicale: création de la hernie diaphragmatique
La première opération avait pour but de créer une hernie diaphragmatique à 80 jours de
gestation (terme: 147 jours). Après une asepsie rigoureuse, on a pratiqué une laparotomie
médiane puis une hystérotomie transverse au niveau du pôle céphalique du fœtus. Le liquide
amniotique a été récolté à la seringue puis mis à 37 degrés dans un flacon contenant des
antibiotiques (amoxicilline 1 g et gentamicine 40 mg). La tête et le thorax du fœtus ont été
extériorisés afin de pratiquer une thoracotomie gauche au niveau du 8ème
espace intercostal
(Figure 11). Après le refoulement du poumon à l'aide de coton-tiges, le diaphragme a été mis
en évidence, ouvert sur deux cm et partiellement réséqué. On a pratiqué une traction de
l’estomac à travers l’orifice créé pour le positionner dans le thorax avec quelques anses
intestinales (Figure 12). La fermeture pariétale fœtale a été faite en un plan. Le fœtus a été
replacé délicatement dans l'utérus après réinjection du liquide amniotique. On a fermé l’utérus
en deux plans et fermé la paroi abdominale plan par plan après une désinfection à la bétadine.
41
Figure 11. La tête et le thorax du fœtus de brebis sont extériorisés.
Figure 12. Création de la hernie du diaphragme : une thoracotomie gauche est faite au niveau
du 8ème
espace intercostal. Après le refoulement du poumon à l'aide de coton-
tiges, le diaphragme est mis en évidence, ouvert sur deux cm et partiellement
réséqué.
Seconde procédure chirurgicale: l’équipement et l'expérimentation
La seconde opération s'est faite sur le même animal à 138 jours de gestation. Après une
laparotomie médiane et une hystérotomie, la tête et le membre supérieur gauche du fœtus ont
été extériorisés pour aborder le creux axillaire. Après une anesthésie locale avec 2 ml de
xylocaine à 1%, on a incisé le creux axillaire gauche au bistouri électrique pour mettre en
42
évidence l’artère et la veine axillaire gauche. On a placé deux cathéters dans ces vaisseaux, un
premier à partir de la veine axillaire gauche dans la veine cave supérieure et un second à partir
de l’artère axillaire gauche dans l'aorte (Ao). On a pratiqué une ligature des vaisseaux en
amont. Après une thoracotomie au 5ème
espace intercostal, on a ouvert la plèvre pour voir le
cœur et les gros vaisseaux. On a pratiqué une dissection de l’aorte ascendante, du canal
artériel et de l’artère pulmonaire gauche.
Trois cathéters ont été placés par ponction dans les gros vaisseaux: le premier cathéter,
un Tygon 22 Gauge (G) a été placé dans l’artère pulmonaire gauche (APG) et solidarisé par
une bourse faufilée; le second cathéter, un Tygon 20G a été placé dans le tronc de l’artère
pulmonaire (AP) et solidarisé par une bourse faufilée; le troisième cathéter, un Tygon 20G a
été placé dans l’oreillette gauche (OG) et fixé par des points en ¨U¨ aller-retour. Les cathéters
ont été héparinisés (1ml = 100IU). Après la calibration de nos appareils, les cathéters ont été
reliés à des transducteurs pour mesurer la pression dans les vaisseaux. Deux capteurs à débit
(Transonics, Ithaca 6.0 mm, NY) ont été placés autours des gros vaisseaux, le premier autour
de l'APG et le second autour de l'Ao (Figure 13). La taille des capteurs à débit a été choisie
pour s'adapter au diamètre des vaisseaux sans les comprimer. La circulation materno-fœtale a
été laissée intacte. Le fœtus a été recouvert d'un tissu chaud et le temps de récupération a été
de 1 heure au minimum avant l'enregistrement des paramètres mesurés.
Figure 13. Trois cathéters sont placés par ponction dans les gros vaisseaux: le premier
cathéter est placé dans l’artère pulmonaire gauche (APG); le second cathéter est
placé dans le tronc de l’artère pulmonaire (AP); le troisième cathéter est placé
dans l’oreillette gauche (OG). Deux capteurs à débit sanguin sont placés autours
autour de l'APG et autour de l'aorte (Ao).
43
Après le début de l'injection de médicaments, l'animal a été intubé par trachéotomie (Mini-
TreAch II, cannula 4.0mm, Portex limited, Hythe, Kent, England CT21 6JL) et ventilé. Le
fœtus et sa mère ont été tués à la fin du protocole avec une solution d'embutramide, de
mébézonium iodure, de tetracaïne chlohydrate et de diméthylformamide (T61). La position
des cathéters a été contrôlée en fin d'intervention.
Mesures physiologiques
Pendant 20 minutes avant le début de nos protocoles toutes nos mesures ont été enregistrées à
intervalles de deux minutes et pendant 20 secondes. Les moyennes et les pics de pression
sanguine dans l'AP, dans l'APG et dans l'Ao (respectivement PAP, PAPG et Pao) ont été
mesurées par un transducteur (Baxter, Bentley Laboratories, Uden, The Netherlands). La
pression atmosphérique a été notre pression de référence et a été calibrée au moyen d'une
manchette à pression. La résistance vasculaire pulmonaire (RVP) a été définie comme la
différence entre la PAP et la pression dans l'OG (POG) divisée par le débit pulmonaire
(QAP). La FC a été déterminée selon l'enregistrement du QAP. Le flux sanguin dans l'Ao
(QAo) et le QAP a été mesuré avant l'injection des drogues avec un transducteur à ultrason
connecté à un lecteur de flux (Transonics systems Inc., T206). Un ventilateur conventionnel
(Servo Ventilator 900 B, Siemens Elema, Sweden) a été utilisé pour la ventilation du fœtus
avec une fréquence respiratoire de 20 respirations par minute, un volume de 3,5 litres par
minute, une pression positive en fin d'expiration à 4 cm d'H2O, une pression inspiratoire à 35
cm d'H2O, un rapport temps inspiratoire/temps expiratoire de 0,5 et une fraction inspiratoire
d'oxygène de 80% (FIO2). Les gaz sanguins ont été contrôlés toutes les 20 minutes
(Radiometer Copenhagen, Radiometer A/S Emdrupves 72, DK 2400, Copenhagen).
2. Préparation des médicaments
Toutes les solutions ont été congelées avant leur emploi.
L'Ach (2-(Acetyloxy)-N,N,N-Triméthylethaminium chloride; Pharmacie Centrale des Hôpitaux,
Paris, France) a été dissoute dans de l'eau physiologique. La concentration finale était de 1
ug/ml pour le protocole des canaux KATP. Pour le protocole de la NOSn, l'Ach a été préparée à
une dose de 20 ug, dissoute dans de l'eau physiologique.
44
Le pinacidil monohydrate (N-cyano-N-4-pyridinyl-N-(1,2,2-trimethylpropyl) guanidine; Leo
Pharmaceutical Products Copenhagen, Denmark) a été dissoute dans du dimethyl sulfoxide
(DMSO). . La concentration finale était de 1 mg/ml. Le pH final de la solution était de 7,4
après titration par adjonction d'acide chlorydrique (HCl) et de sodium hydroxide (NaOH).
Le TEA (Tetraethylammonium chloride, Sigma-Aldrich Chimie) a été dissout dans de l'eau
physiologique pour obtenir une concentration de 1 mg/ml. La dose totale administrée a été de
100 mg. Le pH de la solution était de 7,4.
Le GLI (5-chloro-N-(2-(4-(((cyclohexyl-amino)-carbonyl)-amino)-sulfonyl)-phenyl)-ethyl)-2-
methoxbenzamide, Sigma Chemical) a été dissout dans du DMSO et dilué pour obtenir une
concentration finale de 1 mg/ml. Le pH final de la solution était de 8 après adjonction de HCl.
La dose totale admninistrée a été de 30 mg.
Le 7-NINA (Sigma Chemical) a été préparé à une dose de 1 mg dissout dans 2 ml d'eau
physiologique, avec un pH ajusté à 7,4.
Le L-NNA (Sigma Chemical) a été préparé à 20 mg dissout dans une solution de Krebs avec
un pH ajusté par adjonction de HCl pour obtenir un pH à 7,4.
Le T-1032 (133,14 mg) a été dissout dans 10 ml d'acide chlorhydrique (HCl, 10-3
mol/l) puis
0,5 ml de cette solution a été dilué dans 9,5 ml de Krebs pour obtenir une concentration de 60
µg/ml (10-4
mol/l).
59,6 mg de nitroprussitae de sodium (SNP) ont été dissout dans 10 ml de Krebs. Cette
solution (10-4
M) a été diluée pour obtenir une concentration de 10 µg/ml (soit 3,36.10-8
mol/l). La seringue a été protégée par du papier aluminium pour éviter l’exposition à la
lumière du SNP.
220 mg de Zaprinast (Zap) ont été dissous dans 15 ml d'une solution contenant 50 mM de
soude (NaOH, PM 40). Puis 3 ml de cette solution ont été dilués dans 17 ml d'une solution de
Krebs. La concentration finale est alors de 2,2 mg/ml (soit 8,1.10-3
mol/l).
45
3. Protocoles des tests pharmacologiques in vivo
Plusieurs protocoles ont été pratiqués sur le même animal mais la période de récupération
après administration d'une drogue était de 1 heure au minimum après le pinacidil et de 30
minutes après l'Ach pour obtenir des paramètres hémodynamiques comparables à ceux
mesurés avant l'administration de médicament. L'ordre d’administration des médicaments n'a
pas été tiré au sort. Le dosage des médicaments a été déterminé par des études précédemment
faites sur le foetus de brebis. Chaque publication a des protocoles qui diffèrent selon le type
de médicament et qui sont expliqués en détail dans les publications.
4. Utilisation du tissu pulmonaire et tests pharmacologiques in vitro
La dissection de vaisseaux sanguins pour la mise en place d'anneaux vasculaires dans des
bains d'organe a été faite préalablement sur des rats de race Sprague Dawley (Charles Rivier
France) d'un poids de 200 à 250 grammes. Les rats ont été anesthésiés par une injection
intrapéritonéale de pentobarbital sodique à une posologie de 50 mg/kg. Après une attente de
10 minutes, la dissection a débuté par une sternotomie, l'ouverture du péricarde, la dissection
des gros vaisseaux et le prélèvement rétrograde de l'aorte, mise ensuite dans une solution de
Krebs-Henseleit (Tableau 1). Les vaisseaux ont été coupés en rondelles de 3 mm, suspendus
dans des bains d'organe où des tests pharmacologiques ont été faits.
Préparation des tissus
A la fin de notre protocole in vivo sur les brebis, nous avons prélevé le bloc cœur-poumon du
fœtus qui a été pesé puis placé dans un récipient contenant une solution de Krebs-Henseleit
préalablement oxygénée le jour même (Figure 14). La solution de Krebs a été préparée le
matin même. Le récipient et les prélèvements ont été placés dans un réfrigérateur puis
transportés de l'Ecole de Chirurgie à l'hôpital Cochin dans une enceinte de sagex contenant de
la glace. Les prélèvements du bloc cœur-poumon ont été faits chez l'animal hernié, chez le
jumeau sain et parfois chez la mère. Le temps entre le prélèvement et le début de la dissection
à l'hôpital Cochin a été au maximum de 1 heure. L’artère pulmonaire des poumons fœtaux et
des poumons de la mère a été disséquée pour obtenir des vaisseaux pulmonaires d'un diamètre
de 1,5 mm provenant de segments intra parenchymateux de l’artère pulmonaire, débarrassée
46
du tissu conjonctif environnant. L'artère ainsi prélevée a été sectionnée en anneaux identiques
de 2-3 mm de longueur.
Figure 14. Prélèvement du bloc cœur-poumon avec les cathéters en place. Leur position est
contrôlée en fin d’intervention. Noter la différence de taille entre le poumon
gauche du côté de la hernie du diaphragme et le droit. Le cœur est au centre.
Préparation des cuves: bains d'organe
Les anneaux vasculaires ont été conservés dans une solution de Krebs (Tableaux 1 et 2)
puis montés sur un système de doubles fils de tungstène abaissés dans une chambre d’organe
de 20 ml, remplie d’une solution de Krebs maintenue à 37 degrés et oxygéné par un mélange
d'oxygène et de gaz carbonique (CO2). Le fils de tungstène supérieur a été relié à un capteur
de tension et à un transducteur de force (EMKA, France) pour enregistrer les valeurs de la
tension isométrique (Figure 15).
Le transducteur a été relié à un ordinateur (Macintosh 6300, Apple) équipé d’un logiciel
de mesure de tension (MacLab, AD Instrument) capable d'enregistrer des valeurs numériques
et de les représenter sous forme de courbe. Quatre cuves ont été ainsi placées en parallèle pour
obtenir 4 tracés simultanés. Les anneaux vasculaires ont été lavés à raison de 6 lavages
espacés de 10 minutes dans une solution de Krebs, et ont été étirés à 2 reprises à 2 g, tension
optimale pour obtenir une contraction maximale du vaisseau après stimulation
pharmaceutique. Cette tension de 2 g a été fixée après nos expériences préliminaires sur des
vaisseaux de brebis à la naissance et sur des vaisseaux de rat dont la tension optimale pour les
aortes était de 1,5 g. Une fois les vaisseaux lavés et étirés, les protocoles pharmacologiques
ont pu débuter.
47
PM 1L 2L 3L 4L Concentration
finale (g/l)
NaCl (g) 58,44 137,92 g 275,84 g 551,68 g 689,6 g 118
KCl (g) 74,56 8,8 g 17,59 g 35,19 g 44 g 5,9
MgSO4 7H2O 246,49 5,92 g 11,83 g 23,66 g 29,6 g 1,2
CaCL2 2H2O 147,02 7,35 g 14,7 g 29,4 g 36,75 g 2,5
NaH2PO4H2O 156,01 3,74 g 7,48 g 14,96 g 18,7 g 1,2
Tableau 1. Préparation de la solution de Krebs. PM: Poids moléculaire.
PM 1L 2L 3L 4L 5L
Stock 50 ml 100 ml 150 ml 200 ml 250 ml
C6H12O6 180,16 1,009 g 2,018 g 3,027 g 4,036 g 5,05 g
NaHCO3 84,01 2,142 g 4,285 g 6,427 g 8,569 g 10,71 g
Tableau 2. Solution finale de Krebs; PM: Poids moléculaire.
Figure 15. Photographie d’une cuve pour anneau vasculaire qui sera relié à un fils de
tungstène lui-même relié à un capteur de tension et à un transducteur de force
pour enregistrer les valeurs de la tension isométrique lors de sa contraction-
relaxation.
48
Préparation des médicaments
Tous les médicaments ont été préparés le jour même des expériences. L'indométhacine (Indo)
(Sigma Chemical) a été préparée à une concentration de 10-5
molaire (M) dans une solution de
Krebs, avec un ajustement du pH à 7,4. La phényléphrine (Phé) (Sigma Chemical) a été
préparée pour obtenir une concentration de 10-7
à 10-5
M après dilution dans une solution de
Krebs. L'Ach a été préparée à une concentation de 10-7
à 10-4
M, le Pinacidil (Pina) à 10-5
à
10-4
M avec un apport de DMSO, le SNP à 10-4
M, le Gli à 10-5
M, le L-NNA à 10-4
M. Le 7-
NINA a été préparé à une concentration de 10-7
à 10-6
M après sa dilution dans du Krebs et un
ajustement du pH à 7,4. L'YC-1 a été dilué dans du DMSO pour obtenir une concentration de
10-8
à 10-5
M. Le T-1032 a été dissout dans une solution contenant 10-3
M d'acide
chlorhydrique puis dilué dans une solution de Krebs pour obtenir des concentrations de 10-8
à
10-5
M. Le Zaprinast (Zap) a été dissout dans une solution contenant 50 mM de soude puis
dilué dans une solution de Krebs pour obtenir concentration de 10-8
à 10-5
M. (Tableaux 3, 4,
5).
Protocoles
Concentration
mole/L
Concentration
mole/L
Concentration
mole/L
Concentration
mole/L
Concentration
mole/L
1 Indo 10-5
Phé 10-7
-10-6
Ach 10-7
-10-4
SNP10-4
2 Indo 10-5
Phé 10-7
-10-6
Pina 10-5
-10-4
SNP10-4
3 Indo 10-5
Phé 10-7
-10-6
Gli 10-5
Pina 10-5
-10-4
SNP10-4
4 Indo 10-5
Phé 10-7
-10-6
L-NNA 10-4
Pina 10-5
-10-4
SNP 10-4
Tableau 3. Résumé de nos protocoles in vitro pour les KATP. Les protocoles ont été faits sur
des anneaux de fœtus avec et sans HDC.
Protocoles Concentration
(M)
Concentration
(M)
Concentration (M)
(pendant 15 min)
Concentration (M) Concentration
(M)
1 Indo 10-5 Phé 10-8 à 10-5 SNP 10-8 à 10-5 SNP 10-4
2 Indo 10-5 Phé 10-8 à 10-5 YC-1 10-8 à 10-5 SNP 10-4
3 Indo 10-5 Phé 10-8 à 10-5 T-1032 10-8 à 10-5 SNP 10-4
4 Indo 10-5 Phé 10-8 à 10-5 Zap 10-8 à 10-5 SNP 10-4
5 Indo 10-5 Phé 10-8 à 10-5 T-1032 10-8 SNP 10-8 à 10-5 SNP 10-4
6 Indo 10-5 Phé 10-8 à 10-5 T-1032 10-8 YC-1 10-8 à 10-5 SNP 10-4
Tableau 4. Résumé des protocoles in vitro pour la GC et la PDE-5. Les protocoles ont été
faits sur des anneaux de fœtus avec et sans HDC.
49
Stimulation par champs électriques (protocole NOSn)
Des électrodes à platine ont été installées en parallèle dans les chambres d'organe de part et
d'autre des anneaux vasculaires afin d'induire un courant électrique (Annexe 5). Un
stimulateur électrique a été connecté à un amplificateur biphasique pour émettre des
impulsions électriques de 40 volts (V) et de durée et de fréquence variables.
Les vaisseaux on été coupés en anneaux de 3 mm qui ont été stimulés par un courant
électrique alternatif pendant 30 secondes, d'une durée de stimulation de 5 ms et à 2, 4, 8, 16,
32 et 64 Hertz (Hz). Le temps de repos entre chaque stimulation était varable, entre 2 minutes
et 8 minutes afin d'obtenir une relaxation complète de l'anneau correspondant à un plateau de
relaxation sur les courbes enregistrées. Toutes les données de stimulation ont été
préalablement testées sur de l'aorte et de l'artère pulmonaire de rat et sur de l'artère
pulmonaire d'un fœtus de brebis hernié témoin. On a réalisé une programmation de
stimulation du courant électrique.
Protocoles Concentration
mole/L
Concentration
mole/L
Concentration
mole/L
Stimulation
Electrique
Concentration
mole/L
1 Indo 10-5 Phé 10-7-10-5 Ach 10-7-10-5 SNP10-4
2 Indo 10-5
Phé 10-7
-10-5
7-NINA 10-7
-10-6
SNP10-4
3 Indo 10-5
Phé 10-7
-10-5
L-NNA 10-4
SNP10-4
Tableau 5. Résumé de nos protocoles in vitro pour la NOSn. Les protocoles ont été faits sur
des anneaux de fœtus avec et sans HDC, et sur des anneaux de mouton adulte (mère).
Tissu pulmonaire de nouveau-né pour l’étude de l’endothéline
Le tissu pulmonaire a été obtenu à l’autopsie après accord des parents. On a étudié des
specimens prélevés sur 10 enfants nés avec HDC compliquée par une HTAPP, ceci entre
1996 et 2002. Nous avons noté l’âge de gestation au moment du décès, le côté de la hernie, le
poids et les premiers paramètres sur la gazométrie. Les poumons de six enfants, 3 filles et 3
garçons sans HTAPP, d’un âge moyen de 3.46 mois, ont servis de contrôles. Trois des enfants
étaient des cas de mort subite, un des enfants avait une encéphalopathie. L’autopsie a permis
de déterminer la cause du décès chez les deux autres.
50
Les specimens prélevés ont été congelés immédiatement dans de l’azote et conservé à
– 80 degrés. A l’autopsie, le poumon contro-latéral a été égalemement prélevé. Le reste du
poumon a été fixé avec du “4%-phosphate-buffered formalin”. La coloration a été faite selon
la technique habituelle (hématoxyline et éosine). Les anomalies de alvéoles ont été
démontrées par un comptage alvéolaire. La morphologie artérielle pulmonaire a éte décrite
comme suit: seules les artères pré-acinaires et intra-lobaires avec un diamètre externe entre 50
µm and 500 µm et une intégrité de couches ont été mesurées. L’épaisseur moyenne x 2 (E) a
été confrontée à l’épaisseur des artères selon la formule: E =ED-ID (diamètre externe-
diamètre interne).
5. Histologie
Congélation du matériel
Des échantillons de poumons gauche et droit, de l'artère pulmonaire et du cœur ont été
prélevés sur des fœtus herniés et des fœtus non herniés congelés pour pratiquer l'histologie, un
marquage immunocytochimique et un Western Blot. Chaque prélèvement a été rapidement
placé dans un béchère contenant de l'isopentane préalablement refroidi dans de l'azote liquide.
Cet azote liquide avait été récolté préalablement dans un thermos de 20 ml. Les prélèvements
posés dans le béchère ont été immergés à leur tour dans l'azote liquide pour devenir blancs et
durs après quelques secondes. Une fois congelés, les prélèvements ont été placés dans du
parafilm, emballés dans de l'aluminium puis mis au congélateur à -80 degrés dans des tubes
en plastique.
Coloration après inclusion en paraffine
Les anneaux testés in vitro ont été soigneusement prélevés des fils de tungstène et placés dans
des petits récipients contenant du formol dilué. Les anneaux ont été numérotés dans le même
ordre que celui des cuves et ont passé la nuit dans le formol avant d'être placés dans de la
paraffine. Les anneaux ont été déshydratés dans de l'alcool (OH) 95% 3 fois de suite pendant
30 minutes puis 3 fois de suite encore dans de l'OH 100%. Ils ont été mis dans du xylène
(solvant) 2 fois de suite pendant 30 minutes, sous une hotte de protection, et placés dans des
Borels numérotés. Après aspiration du xylène, ils ont subi 3 bains de 45 minutes dans de la
paraffine chauffée à 50 degrés dans une étuve. Les borels ont été sortis sur une plaque
51
chauffante et les anneaux ont été immergés dans de la paraffine chaude versée dans un
support en métal par groupes de 4 selon l'ordre des bains effectués. Chaque série de 4 anneaux
a été placée en position rectiligne dans de la paraffine chaude recouverte d'un support en
plastique. La paraffine s'est durcie en 4 heures au réfrigérateur puis a été démoulée.
Microtome (Leica, Allemagne): les anneaux inclus dans de la paraffine ont été coupés en
lamelles de 5 um par un microtome avec une lame de 35. Elles ont été placées sur des lames
(CML France), posées sur un réchaud et recouvertes avec de l'albumine préalablement filtrée.
La paraffine a fondu et la coupe d'anneau a adhéré à la lame mise dans une cuve à 50 degrés
puis dans une boite d'histologie.
Coloration: Les lames ont été placées dans des bains de xylène à 3 reprises, puis pendant 30
secondes dans des bains d'alcool à 100% puis à 95%. La coloration a débuté par un bain
d'hémalun pendant 5 minutes, suivi d'un rinçage à l'eau puis d'un bain d'éosine pendant 15
secondes. Après un lavage abondant à l'eau, les lames ont été déshydratées dans de l'OH à
95% et 100% puis dans du xylène. Les lames ont été recouvertes d'une protection en
plastique. Après séchage, elles ont été examinées au microscope.
Coloration après congélation
Les prélèvements congelés ont été inclus dans du Tissu-Tek collé sur un support en métal
dans une chambre refroidie à -20 degrés. Des coupes de 10 µm d'épaisseur ont été réalisées à
l'aide d'un cryostat à la même température (Leica, CM 3000, Allemagne). Déposées sur des
lames superfrosts (CML France), les coupes obtenues ont été placées dans un congélateur à
-80 degrés.
Coloration: Les lames ont été placées dans des bains d'alcool à 100% pendant 30 secondes
puis 95% pendant 1 minute. La coloration a débuté par un bain l'hémalun pendant 5 minutes
suivi d’un rinçage à l'eau puis d’un bain d'éosine pendant 10 secondes. Après un lavage
abondant à l'eau, les lames ont été déshydratées dans de l'OH à 95%, à 100% et dans du
xylène. Les lames ont été recouvertes d'une protection en plastique. Après séchage, elles ont
été examinées au microscope.
52
6. Immunohistochimie
Nous avons réalisé une immunocytochimie à partir de coupes dans de laparaffine et de coupes
congelées. Nous avons tenté deux marquages immunitaires.
Coupes en paraffine: nous avons baigné nos coupes dans du xylène pendant 10 minutes puis
dans de l'OH à 100% et à 95% pour les réhydrater. Elles ont été rincées à l'eau, à une solution
saline phosphatée (PBS) pendant 5 minutes puis à l'eau oxygénée pendant 30 minutes en les
chauffant au micro-onde. Après rinçage dans du PBS, les coupes ont été recouvertes par un
sérum de cheval pendant 20 minutes pour neutraliser les sites non spécifiques. Après
l'élimination de l'excès de sérum, les lames ont été incubées 60 minutes à 37 degrés avec
l'anticorps primaire anti-KATP (monoclonal de souris) dilué au 1/100ième
(et 1/200ième
) dans du
PBS et l’anti-NOS dilué au 1/100ième
(monoclonal de souris) dans du PBS. Après un rinçage
rapide, les lames ont été recouvertes pendant 30 minutes avec un anticorps secondaire anti-
IgG de souris biotinylé. Après une étape de rinçage au PBS, les coupes ont été incubées
pendant 1 heure avec un complexe avidine-biotine-peroxydasique (Kit ABC vectastain,
Vector Laboratories). Après un nouveau rinçage au PBS, la fixation du complexe
peroxydasique a permis en présence d'hydrogène d'oxyder la diamino-benzidine
tetrahydrochloride (D.A.B., Sigma, USA) et de révéler des anticorps après incubation de 5
minutes. Ce chromogène dilué dans un tampon d'hydroxyméthyl aminométhane (Tris) 0,05 M
à pH 7,4 a précipité et a produit une coloration brune.
Coupes congelées: les coupes de tissus ont été séchées pendant 10 minutes sous air ambiant
après leur retrait du congélateur. Elles ont été placées pendant 10 minutes dans un bain
d'acétone pour les fixer. Après un rinçage au PBS pendant 2 minutes, la même procédure que
celle décrite ci-dessus a été réalisée hormis le premier bain dans du xylène.
KATP
Les anticorps monoclonaux des canaux KATP correspondent à une séquence de 23 acides
aminés de la partie N-terminale de la sous-unité Kir 6.1 de rat. Leur spécificité a été
déterminée par les techniques classiques de Western Blot. Le système nerveux de rat exprime
l'ensemble des différents types de canaux K+ et leur électrophorèse est faite de bandes de
protéines différentes mais voisines. La détermination de la concentration optimale de
53
l'anticorps a fait l'objet d'une étude immunocytochimique préliminaire par simple marquage
pour obtenir le meilleur marquage par rapport au bruit de fond. Les anticorps des canaux KATP
ont été dilués au 1/100ième
et 1/200ième
.
NOSn
La détermination de la concentration optimale de chacun des anticorps pour obtenir un
meilleur marquage spécifique par rapport au bruit de fond a fait l'objet d'une étude
immunocytochimique préliminaire par simple marquage. Les anticorps anti-NOSn ont été
dilués au 1/100ième
. L'anticorps utilisé a été un anticorps monoclonal de souris, d’une
concentration de départ de 250 µg/ml et dont le contrôle positif a été réalisé avec un lysat de
glande pituitaire de rat. Son poids moléculaire est de 155 kDa.
7. Isolation du RNA et RT-PCR
Tous les prélèvements ont été contrôlés avant l’extraction du RNA. Les prélèvements ont été
placés dans du RNA BTM
(Q Biogene, Illkirch, France) selon les instructions du fabriquant et
dans 35 µl de RNA. La digestion enzymatique à la DNAse a été faite pendant 30 minutes à 37
degrés en utilisant un Kit de DNA (Ambion, Austin, Texas, USA). Le DNA complémentaire a
été synthétisé par une « reverse transcriptase » de 2 µg de RNA en utilisant le SuperScript™
version II (Gibco BRL, Grand Island, NY) et le Random Hexamères (Promega,
Charbonnières, France). ETB et ETA ont été amplifié en utilisant un kit Taq Gold (Applied
Biosystems, Courtaboeuf, cedex, France) dans les conditions suivantes: Chauffage à 94
degrés (10 minutes) puis 40 cycles de PCR: 94°C (1 min), 60°C (1 min) et 72°C (1 min 30
sec). L’amplification s’est déroulée selon le schéma de 30 cycles: 94°C (1 min), 60°C (1 min)
et 72°C (1 min 30 sec). Les primaires pour l’amplification étaient ainsi : 5’-TGG CCT TTT
GAT CAC AAT GAC TTT -3’ (sens) et 5’-TTT GAT GTG GCA TTG AGC ATA CAG GTT
-3’ (antisens) pour former un fragment de 302-bp. Ceux concernant ETB étaient ainsi 5’-ACT
GGC CAT TTG GAG CTG AGA TGT-3’ (sens) et 5’- CTG CAT GCC ACT TTT CTT TCT
CAA-3’ (antisens) pour former un fragment de 428-bp; ceux pour l’actine étaient ainsi 5’-
GGGTCAGAAGGATTCCTATG-3’ (antisens) et 5’- GGTCTCAAACATGATCTGGG-3’
(sens) formant ainsi un fragment de 237-bp amplifié. Les produits amplifiés ont été analysés
avec une électrophorèse et colorés avec de l’éthidium bromide, puis analysé par un logiciel.
54
Immunohistochimie: La méthode employée a été une technique en trois phases sur de la
paraffine avec des sections de 3.3 µm et du diamino-benzidine comme chromogène. Nous
avons utilisé des anticorps polyclonaux de lapin. Le premier dirigé contre le récepteur à l’ETA
humain (Assay Designs. Inc, Ann Arbor, Michigan, USA) et l’autre contre le récepteur à
l’ETB (Abcam, Cambridge, UK). La récupération de l’antigène s’est faite par micro-onde
(deux fois 5 min à 750 watts). Les coupes ont été lavées deux fois dans du Tris-HCl pH 7.6 et
contenant 1% de BSA (Polymerized bovine albumine). Elles ont été incubées avec deux blocs
de réactifs (10% de sérum humain normal et 10% de sérum de chèvre) pendant 30 minutes et
avec les anticorps dilués dans un réactif (Biogenex, San Ramon, CA) à une dilution de 1:10
(anti-ETA) et 1:50 (anti-ETB) pendant une heure à température ambiante. L’ETA et él’ETB ont
été détectés en utilisant un kit Stravigen Multilink de Biogenex dans le quel la liaison est
biotinylée et le liant à une peroxydase. Les contrôles négatifs ont été préparés en omettant le
premier anticorps.
La prolifération a été démontrée par immunomarquage pour le Ki-67 (1:50 dilution,
Immunotech, Marseille, France, streptavidin-biotin méthode). Pour la caractérisation de
l’endothélium et le compartiment médian, nous avons utilisé le CD34 (immunotech) et l’anti
corps monoclonal de muscle lisse (Sigma, 1:1000, Saint Louis, Missouri, USA).
8. Western Blot
Prélèvement du matériel
Le matériel prélevé (poumons droit et gauche et branches de l'artère pulmonaire) a été
conservé à -80 degrés après congélation dans de l'azote liquide. Ce matériel a été transporté
dans de l'azote liquide à l'hôpital Lariboisière, Paris 10ème
pour réaliser le Western Blot.
Homogénéisation: On a préparé un tampon de lyse au sodium dodecyl sulfate (SDS) 20% qui
a détruit les membranes cellulaires et le cytosquelette. Ce tampon a été complété par 100ul de
sodium vanadate (Sigma), 200 µl de Tris-Hcl (Sigma), 10 µl de leupeptine (Sigma), 20 µl
d'aprotinine (Sigma) et 10 ml d'eau pour former un tampon de ¨lysis Buffer¨. Ce tampon a été
mélangé avec les trois prélèvements qui ont été broyés avec un polytron PT 1200 afin
d'obtenir un mélange homogène. On a préparé 500 µl de tampon pour le poumon gauche
(PG), 500 µl pour le poumon droit (PD) et 300 µl pour l'artère pulmonaire (AP). Les
55
prélèvements broyés ont été centrifugés 10 minutes à 12000 tours/minute et à 15 degrés. Le
surnageant a été prélevé pour le dosage de protéines selon Pierce.
Densitométrie: méthode de Pierce. Courbe étalon : On a préparé 7 tubes avec un mélange
d'eau (400 µl), de sérum bovin (BSA) 2 mg/ml (10 à 150 µl) et d'un réactif coloré (400 µl). En
parallèle, on a préparé nos 3 prélèvements (1 µl) avec le même réactif coloré. L'incubation
s'est faite à 50 degrés pendant 60 minutes. Le tableau 5 résume notre préparation. On a
prélevé 10 µg de protéine dans les 7 tubes Ependorfs ainsi que dans nos trois prélèvements.
On a ajouté 400 µl d'eau puis 400 µl de ¨Working Reagent¨ (WR). On a incubé nos tubes à 40
degrés pendant 60 minutes. Nous avons placé nos prélèvements dans un spectromètre à une
absorbance de 562 nm et avons estimé grâce à notre courbe étalon la quantité de matériel à
prélever, soit 4 µl pour le poumon gauche, 3 µl pour le poumon droit et 3,5 µl pour l'artère
pulmonaire.
L'électrophorèse: préparation des gels de polyacrylamide selon la technique décrite. Ce
tampon de charge a été mélangé avec de l'eau et avec nos échantillons de protéine.
Préparation des cuves : nos prélèvements ont été déposés dans les puits confectionnés par le
¨peigne¨ (volume de charge = 30 µg). La migration des protéines a ét provoqué par le passage
d'un courant électrique de 90 V et 34 Ampères pendant 2 heures puis par celui d’un courant
électrique de 120 V. Notre première piste était notre témoin de PM connu. La durée de
migration a été de 3 heures. La quantité de protéines déposée est résumée dans le tableau 9.
Transfert (sur feuille de nitrocellulose) : Après 3 heures, les protéines migrantes ont été
placées dans une cuve contenant un tampon de transfert. On a préparé à la suite un boîtier en
plastique, une éponge spongex, un papier buvard, le gel et les protéines, une feuille de
nitrocellulose Hybond ECL (Amersham), 2 buvards et une seconde éponge spongex. Le
boîtier fermé a été placé dans une chambre de transport, mis dans une chambre froide à 4
degrés pendant 14 heures avec un courant électrique de 70 mV.
56
Echantillons Quantité (µg) Eau (µg) Tampon (µg) Total (µg)
PG 20 µl 4 12 16 32
PD 20 µl 3 13 16 32
AP 20 µl 3,5 12,5 16 32
SNC 1 15 16 32
PG 40 µl 8 8 16 32
PD 40 µl 6 10 16 32
AP 40 µl 6,5 9,5 16 32
CML 30 H 16 0 16 32
Gastroc. 1/20 10 6 16 32
Tableau 5. Préparation des protéines. PG = poumon gauche; PD = poumon droit; AP = artère
pulmonaire; SNC = système nerveux central; CML = cellule musculaire lisse;
Gastroc.= muscle gastrocnémien.
Immunorévélation : On a saturé les sites d'anticorps (AC) non spécifiques avec une solution
de protéines de vache, appelée solution de ¨Blotto¨ (2,5 g de régilait mélangé avec du BSA
1% qsp 50 cc d'eau stérile). On a préparé une solution de lavage au TBS-T à pH 7,4 (Tris 1M
20 ml, NaCl 5M 28 ml, Tween 20 1ml (Sigma) et H2O qsp 1L). La membrane de cellulose
découpée pour obtenir une feuille de taille réduite a été lavée sous agitateur avec le TBS-T
puis incubée pendant 2 heures avec 50 ml de régilait. Après un rinçage de 5 x 3 minutes au
TBS-T, on a ajouté 15 ml de solution de ¨Blotto¨ et 6 µl d'AC monoclonal NOSn
(transduction Laboratories) (dilution 1/2500), laissé pendant 2 heures. Après un rinçage de 5 x
3 minutes au TBS-T, on a ajouté 15 ml de solution de ¨Blotto¨ dans 15 µl d'AC secondaires
anti-souris (1/1000) couplés à la peroxydase (1 heure). Nosn (type I) : anticorps monoclonal
de souris, 250 µg/ml ; Contrôle positif par un lysat de glande pituitaire de rat ; poids: 155 kDa
Après lavage, l'activité peroxydasique liée au complexe immunologique a été détectée
par une réaction de chimioluminescence (Kit ECL+, Amersham). La membrane a été par la
suite exposée à un film d'autoradiographie dans une chambre noire. La taille des bandes a été
estimée par le dépôt en parallèle des échantillons protéiques. Le résultat a été comparé au
diagramme de Bio-Rad d'un témoin de PM connu. Une révélation directe sur la feuille de
nitrocellulose a été faite en la plaçant dans un bain de rouge ponceau pendant 15 minutes sous
agitateur.
57
9. Analyse statistique
In vivo
Toutes les mesures sont exprimées en moyenne ± écart-type. Chaque chiffre représente la
moyenne d'une période d'enregistrement. Période de 20 minutes avec un enregistrement toutes
les 2 minutes pendant 20 secondes avant la perfusion de chaque drogue et avant la ventilation,
période de 4 minutes pendant et après l'injection d'Ach et période de 20 minutes avec un
enregistrement toutes les 2 minutes pendant 20 secondes pendant et après la perfusion de tous
les autres médicaments. L'analyse statistique a été faite avec un logiciel ¨statistica¨, de tests
élémentaires pour des échantillons non paramétriques appariés avec un test de Wilcoxon en
raison du petit nombre d'échantillons par groupe. n représente le nombre d'échantillons. La
différence a été considérée comme significative pour un p<0,05.
In vitro
L'analyse a été faite en tenant compte de la moyenne de la relaxation de 2 anneaux vasculaires
si ceux-ci provenaient du même animal et avaient été testés selon le même protocole. Nous
avons pris en considération les anneaux dont le pourcentage de contraction après une
stimulation à la Phé était d'au moins 30% par rapport à leur valeur de tension de base pré-
contraction. La valeur de relaxation maximale après l'apport des médicaments a été
considérée selon l'aspect de la courbe enregistrée (plateau). L'analyse statistique a été faite
avec un logiciel ¨statistica¨, de tests élémentaires pour des échantillons non paramétriques
appariés avec un test de Wilcoxon en raison du petit nombre d'échantillons par groupe. n
représente le nombre d'échantillons. La différence a été considérée comme significative pour
un p<0,05.
58
D. Premier travail
“Congenital Diaphragmatic Hernia: Current Status and Review of the
Literature” Anthony S. de Buys Roessingh, Anh Tuan Dinh-Xuan. Soumis à “Current Pediatric Review”.
Résumé du travail
Sujet: Le traitement des enfants nés avec une hernie diaphragmatique congénitale (HDC) est
un défi pour les obstétriciens, les chirurgiens pédiatres et les néonatologues. Dans cette
pathologie, l’hypertension pulmonaire persistante associée à une hypoplasie pulmonaire
conduit à un taux de mortalité important tant avant la naissance qu’au cours des premiers
jours de vie. En fonction de paramètres prénataux, on peut classer les bébés porteurs de HDC
à haut risque ou bas risque. Le fœtus à « hauts risques » peut bénéficier d’une intervention
chirurgicale prénatale bien que les critères de sélection fassent encore l’objet d’un bon
nombre de débats.
But: Le but de cette étude est d’analyser la littérature récente concernant le diagnostic et le
traitement de la HDC en partant de l’approche prénatale et du traitement in utéro jusqu’au
traitement à la naissance sans oublier les séquelles à long terme.
Méthode: La première partie de cette étude concerne la physiopathologie de l’hypertension
pulmonaire chez l’enfant né avec une hernie du diaphragme. La seconde partie concerne les
critères de classement des fœtus avec HDC en « hauts » et « bas » risques in utéro. Le but est
de décider lesquels seraient à même de bénéficier d’une chirurgie prénatale. Une troisième
partie concerne la description de la chirurgie prénatale étant donné que cette option est un
traitement prometteur pour les foetus à haut risque. Une quatrième partie concerne le
traitement standard de la HDC par l’utilisation de la ventilation, le monoxyde d’azote (NO),
l’oxygénation extracorporelle (ECMO), le surfactant et les stéroïdes, étant donné qu’aucune
stratégie isolée n’a été prouvée comme étant véritablement efficace.
Conclusion: Malgré des recherches approfondies et fouillées tant au point de vue clinique
qu’expérimental, le pronostic de ces enfants reste sombre. La compréhension de cette
maladie et son traitement passent ainsi par deux voies : la première concerne le traitement
même des enfants malades ou des fœtus par des méthodes très prometteuses de chirurgie in
utéro et la seconde se base sur la compréhension des phénomènes physiopathologiques en
utilisation des modèles animaux. Ce sont ces deux méthodes combinées qui nous donnent
l’espoir de pouvoir un jour maîtriser les conséquences de cette malformation.
59
E. Seconde étude
“Role of ATP-Dependent Potassium Channels in Pulmonary Vascular Tone of Fetal Lambs with Congenital Diaphragmatic Hernia”
Anthony S. de Buys Roessingh, Pascal de Lagausie, Jacques Patrick Barbet, Jean-Christophe
Mercier, Yves Aigrain, and Anh Tuan Dinh-Xuan. Ped Res 60 ;5:537-542,2006.
Résumé du travail
Sujet: La hernie diaphragmatique congénitale (HDC) est liée à une forte mortalité en période
néonatale. Cette mortalité est due à une hypertension artérielle pulmonaire persistante
(HTAPP), elle-même due à une hypoplasie pulmonaire parfois sévère. Les canaux potassiques
dépendants de l’ATP (KATP) jouent un rôle important dans la modulation du tonus vasculaire
dans l’adaptation néonatale cardio-respiratoire. Le rôle des canaux KATP dans la
physiopathologie de la HDC n’est cependant pas bien connu.
Méthode : Nous avons créé chirurgicalement chez des brebis une HDC in utéro à 80 jours de
gestation. Nous avons opéré par la suite ces mêmes brebis 10 jours avant le terme pour
positionner des capteurs à débit sanguin et des capteurs à pression sanguine respectivement
autour et dans les gros vaisseaux afin de monitorer les modifications hémodynamiques cardio-
pulmonaires en réponse à l’injection de drogues. Nous avons testé les effets du Pinacidil, un
antagoniste des canaux KATP, et du Glibenclamide, un inhibiteur des canaux KATP. Cette étude
a été également menée sur des fœtus contrôles, sans création de hernie du diaphragme. In
vitro, des artères pulmonaires provenant de fœtus avec ou sans hernie ont été prélevées et
placées dans des bains d’organes pour tester les mêmes drogues avec l’utilisation de bains
d’organes, afin de pratiquer une histologie et une immunohistochimie.
Résultat: In vivo, le Pinacidil (2 mg) réduit de façon significative la résistance vasculaire
pulmonaire (PVR) chez les animaux herniés comme chez les témoins. Le Glibenclamide
augmente de façon significative la pression artérielle pulmonaire (PAP) et la PVR chez les
animaux témoins, mais pas chez des animaux porteurs de HDC. In vitro, le Pinacidil relâche
des artères précontractées de fœtus témoins comme de fœtus herniés. Ces effets ne sont pas
inhibés par le Glibenclamide. Le Glibenclamide seul ne modifie pas le tonus basal des
vaisseaux pulmonaires.
Conclusion : Nous concluons que l’activation induisant l’ouverture des canaux KATP présente
l’intérêt de diminuer le tonus vasculaire chez des fœtus de brebis avec HDC, chez qui il existe
une HTAPP.
60
F. Troisième étude
“Neuronal Nitric Oxide Synthase Does Not Contribute to the Modulation of Pulmonary Vascular Tone in Fetal Lambs with Congenital Diaphragmatic Hernia”. Anthony S. de Buys Roessingh, Pascal de Lagausie, Taline Ibrahima, Jean-
Christophe Schneider, Xiao-lin Huang, Jean-Christophe Mercier, Yves Aigrain,
Chantal Boulanger, Anh T. Dinh-Xuan. Soumis et en révision pour “Pediatr
pulmonol”.
Résumé du travail
Sujet: Le but de cette étude est de déterminer la présence de l’oxyde nitrique synthase
neuronale (NOSn) chez des fœtus de brebis parvenus à terme et porteurs de hernie
diaphragmatique congénitale (HDC) et le rôle de ce NO dans la modulation du tonus
vasculaire pulmonaire.
Méthode: Nous avons créé chirurgicalement une HDC chez des brebis in utéro à 80 jours de
gestation. Nous avons opéré par la suite ces mêmes brebis 10 jours avant le terme pour
positionner des capteurs à débit sanguin et des capteurs à pression sanguine respectivement
autour et dans les gros vaisseaux afin de monitorer les modifications hémodynamiques cardio-
pulmonaires en réponse à l’injection de drogues. In vivo, nous avons étudié l’effet du 7-
nitroindazole (7-NINA), un antagoniste de la NOSn et du N-nitro-L-arginine (L-NNA), un
antagoniste non spécifique de la NOSn. In vitro, nous avons testé les effets des mêmes
drogues sur des anneaux vasculaires provenant de poumons de brebis avec HDC par
l’utilisation de bains d’organes et d’une stimulation électrique par champs (EFS). Nous avons
tenté de mettre en évidence la présence de la protéine NOSn par Western Blot
Résultats: Ni la 7-NINA ni la L-NNA n’ont été capable de modifier le tonus vasculaire basal
in vivo. Après l’apport de la L-NNA, l’Ach a été incapable de diminuer de manière
significative la résistance vasculaire pulmonaire (RVP). In vitro, la L-NNA a pu augmenter
l’effet de contraction cholinergique provoqué par EFS sur des anneaux vasculaires provenant
de brebis avec HDC.
Conclusion: La protéine NOSn est présente dans des poumons et des artères pulmonaires de
brebis à 135 jours de gestation mais cette protéine ne semble pas contribuer à la réduction du
tonus vasculaire basal à la naissance.
61
G. Quatrième étude
“Role of Guanylate Cyclase and Phosphodiesterase in Pulmonary Vascular Tone of Fetal Lambs with Congenital Diaphragmatic Hernia” Anthony S. de Buys Roessingh, Virginie Fouquet, Sarah Coquery, Jean-Christophe Mercier,
Yves Aigrain, Pascal de Lagausie and Anh Tuan Dinh-Xuan. En correction finale.
Résumé du travail
Sujet : Le guanosine 3’-5’ monophosphate cyclique (GMPc) est un second messager
important permettant la modulation du tonus vasculaire. Son rôle est reconnu chez le
nouveau-né lors des variations de la résistance vasculaire pulmonaire (RVP) impliquées dans
l’adaptation à la vie extra-utérine et dans des pathologies telles que l’hypertension artérielle
pulmonaire persistante (HTAPP) due à une hernie diaphragmatique (HDC). Notre but est de
tester plusieurs molécules interférant soit avec la synthèse (sur la guanylate cyclase soluble
(GCs)), soit avec la dégradation du GMPc (sur la phosphodiestérase de type 5 (PDE-5)).
Méthode : In vivo, sous l’action de l’acétylcholine (Ach), du nitroprussiate de sodium (SNP)
et de deux inhibiteurs de la PDE-5, le T-1032 et le Zaprinast (Zap), nous avons mesuré la
pression artérielle pulmonaire (PAP) et calculé la RVP de fœtus chez lesquels une HDC avait
été créée préalablement et de fœtus témoins. In vitro, nous avons étudié sur des anneaux
artériels pulmonaires les mêmes substances, ainsi que l’effet du YC-1, un activateur
spécifique de la GCs indépendant du NO.
Résultats : L’Ach, le SNP, le T-1032 et le Zap utilisés in vivo ont entraîné une diminution
significative de la RVP et une chute de la PAP dans les deux groupes. Seul le T-1032 entraîne
une chute plus importante que le groupe hernié que les témoins. In vitro, la stimulation de la
GCs par le SNP ou le YC-1 a entraîné une relaxation significative dans les deux groupes, avec
une différence marquée entre les animaux herniés et les témoins, dans le cas de l’YC-1 et du
T-1032
Conclusion : Chez les animaux ayant une HDC, la GCs et la PDE-5 présentent des anomalies
structurelles et/ou fonctionnelles. Le T-1032 fait disparaître la différence de vasodilatation en
réponse au YC-1 entre les animaux herniés et témoins. Le T-1032 augmente la concentration
intracellulaire du GMPc, ce qui compenserait l’insuffisance de production de ce second
messager. Associé à d’autres substances vasodilatatrices, il ouvre une voie prometteuse dans
la recherche de traitements de l’HTAPP de la hernie diaphragmatique congénitale, dont la
mortalité reste élevée malgré les progrès de la prise en charge réanimatrice et chirurgicale.
62
H. Cinquième étude
“Ventilation-induced pulmonary vasodilation in lambs with congenital diaphragmatic hernia is modulated by NO”. Anthony S. de Buys Roessingh, Pascal de Lagausie, Jean-Christophe Mercier and Yves
Aigrain. Soumis à « Exp Lung Res ».
Résumé du travail
Sujet: Le but de cette étude est de déterminer l’influence de la ventilation mécanique sur le
tonus vasculaire pulmonaire de brebis née avec une hernie diaphragmatique congénitale
(HDC) à 135 jours de gestation et d’étudier l’influence du monoxyde d’azote (NO) sur cette
ventilation mécanique.
Méthode: Nous avons créé chirurgicalement in utéro une HDC chez des brebis à 80 jours de
gestation. Nous avons opéré par la suite ces mêmes brebis 10 jours avant le terme pour
positionner des capteurs à débit sanguin et des capteurs à pression sanguine respectivement
autour et dans les gros vaisseaux afin de monitorer les modifications hémodynamiques cardio-
pulmonaires en réponse à l’injection de drogues et à la ventilation mécanique. In vivo, nous
avons étudié l’effet de la ventilation mécanique puis du N-nitro-L-arginine (L-NNA), un
antagoniste de la nitric oxyde synthase (NOS). In vitro, nous avons testé les effets de la L-
NNA sur des anneaux vasculaires provenant de poumons de brebis avec HDC par l’utilisation
de bains d’organes et d’une stimulation électrique par champs (EFS).
Résultats: La ventilation a été capable de diminuer significativement la résistance vasculaire
pulmonaire (RVP) chez des brebis herniées. La diminution de la RVP induite par la
ventilation a été nettement diminuée en présence de la L-NNA. In vitro, la L-NNA a pu
augmenter l’effet de la contraction cholinergique provoquée par l’EFS sur des anneaux
vasculaires provenant de brebis avec hernie.
Conclusion: Nous concluons que la ventilation induit une nette réduction de la RVP chez des
brebis à 135 jours de gestation et cet effet semble influencé par la présence du NO qui
contribue ainsi à l’adaptation du tonus vasculaire.
63
I. Sixième étude
“Endothelin Receptors Expression in Lung of Newborn with Congenital Diaphragmatic Hernia”. Pascal de Lagausie, Anthony de Buys Roessingh, Latifa Ferdadji, Sophie Aisenfisz, Michel
Peuchmaur, Jean -Christophe Mercier, Dominique Berrebi. J Pathol 15;205(1):112-118,
2004.
Résumé du travail
Sujet: La hernie diaphragmatique congénitale (HDC) est la cause majeure d’insuffisance
respiratoire à la naissance. Associée à une hypoplasie pulmonaire, la physiopathologie de la
HDC est marquée par une hypertension pulmonaire persistante (HTAPP) du nouveau-né.
L’endotheline-1 (ET-1) est un vasoconstricteur puissant formé de 21 acides aminés. Il agit en
se liant à des récepteurs membranaires dont il existe au moins deux types distincts, les ET-A et
les ET-B. L’ET-1 est présent dans les poumons dans la période périnatale et semble être actif
chez le fœtus. L’élévation de son expression et sa libération ont été documentées dans
l’HTAPP. Le but de cette étude est de vérifier la présence des ET-A et des ET-B dans des
poumons de nouveau-nés avec HDC.
Méthode: Nous avons étudié par immunohistochimie et par RT-PCR l’expression de gènes
ET-A and ET-B dans des poumons de bébés décédés à cause d’une HDC. Nous avons comparé
nos résultats avec les résultats obtenus sur des poumons de nouveau-nés sans HDC.
Résultats: La RT-PCR a mis en evidence dans tous les poumons de nouveau-nés avec HDC
la présence des récepteurs ET-A and ET-B. Chez certains patients avec HDC, nous avons
trouvé par immunohistochimie une surexpression des recepteurs ET-A et ET-B,
particulièrement dans la paroi de la média des artérioles. Par comparaison, dans des poumons
sains sans HDC, nous n’avons pas trouvé l’expression d‘ET-B dans la paroi des artérioles et
seul un faibles signal d’ET-A a été trouvé.
Conclusion: Cette étude démontre l’implication des récepteurs à ET-1 en plus des altérations
de vaisseaux dans des poumons de nouveau-nés avec HDC. Ces résultats suggèrent qu’une
dysrégulation des récepteurs à ET-1 peuvent également contribuer à l’HTAPP présente chez
des nouveau-nés avec HDC.
64
J. Discussion
1. La hernie du diaphragme du point de vue clinique
Le traitement des enfants nés avec une HDC est un défi pour les obstétriciens, les chirurgiens
pédiatres et les néonatologues. Dans cette pathologie, l’HTAPP associée à hypoplasie
pulmonaire conduit à un taux de mortalité important tant avant la naissance qu’au cours des
premiers jours de vie.
En fonction de paramètres prénataux, on peut classer les bébés porteurs de HDC en
« haut risque ou bas risque ». Le fœtus à « haut risque » peut bénéficier d’une intervention
chirurgicale prénatale bien que les critères de sélection fassent encore l’objet de bon nombre
de débats. Et même pour les enfants à « bas risque », le risque de mortalité à la naissance est
bien présent malgré tous les traitements entrepris intensivement. Ces différents traitements
concernent les différents modes de ventilation, l’utilisation du NO, l’utilisation de l’ECMO,
l’utilisation du surfactant et celui des stéroïdes. Aucun de ces traitements utilisés seuls n’a fait
preuve d’une véritable utilité dans le traitement de l’HTAPP due à une HDC. Malgré des
recherches approfondies et fouillées tant au point de vue clinique qu’expérimental, le
pronostic de ces enfants reste sombre.
Le travail expérimental développé dans cette thèse a pour but d'étudier l'HTAPP sur un
modèle expérimental de fœtus d'agneau porteur de HDC créée chirurgicalement à 80 jours de
gestation; les animaux étant étudiés à 138 jours de gestation, soit 10 jours avant le terme (147
jours). Le premier objectif de ces travaux est d’explorer la voie de transduction du signal
passant par l’utilisation des canaux KATP. Le second est l’exploration de la voie de
transduction du signal passant par l’utilisation de la NOSn qui permet la libération du NO et
en même temps la voie de dégradation du NO par le système GCs/GMPc. La troisième voie
d’exploration est l’influence de la ventilation mécanique pour diminuer efficacement
l’HTAPP. Finalement, compte tenu du rôle physiologique de l’ET-1 dans la modulation du
tonus vasculaire pulmonaire et des interactions entre ces molécules et le NO, nous avons
également évalué la réactivité vasculaire pulmonaire à l’ET-1 en séparant les effets propres à
chacun des deux récepteurs membranaires ET-A et ET-B.
L’HTAPP induite par la création d’une HDC chez le fœtus de brebis présente
d’énormes similarités avec cette affection chez le fœtus humain, tant en terme des altérations
65
de l’hémodynamique pulmonaire, que sur le plan des modifications anatomiques (diminution
des divisions bronchiques), histologiques (raréfaction des alvéoles, hypertrophie de la média
des vaisseaux pulmonaires) et fonctionnelles (baisse de la quantité de surfactant). Ce modèle
permet ainsi de reproduire des anomalies pulmonaires morphologiques, mais également
ventilatoires et hémodynamiques à la naissance. Dans ce modèle, il a été admis que
l’hypoplasie pulmonaire est consécutive à la compression du poumon par les viscères
intrathoraciques, et que l'on a créé une HDC provoquant une HTAPP plus tardive que celle
observée dans la HDC naturelle. Le modèle de brebis présente l’avantage de bien se prêter
aux études hémodynamiques de la circulation pulmonaire et aux études de la fonction
respiratoire postnatale. De plus, après utérotomie, l’utérus de brebis ne nécessite pas de
tocolyse ce qui permet de diiminuer les risques d'abortus.
En parallèle, il existe un modèle murin. Dans ce modèle-là, le nitrofen (2,4 dichloro-
phénil-p-nitrophenyl-éther) est injecté à des souris gestantes, provoquant ainsi une hypoplasie
pulmonaire associée ou pas à un déficit diaphragmatique. Ce nitrofène est donné plusieurs
jours de suite, du 5ème
jour au 10ème
jour. Son activité tératogène est bien connue. Ce modèle a
le grand avantage de provoquer une HDC plus précoce que dans le modèle ovin soit au cours
de la phase embryonnaire, ce qui semble plus proche de la réalité. Cependant les effets du
nitrofène ne sont pas tous connus et une agression directe du diaphragme comme celle des
poumons semble probable. Ce modèle ne présente pas l'avantage de se prêter facilement aux
études hémodynamiques.
2. Les KATP
Dans notre étude in vivo, nous démontrons que, chez les brebis proches du terme avec une
HDC, les canaux KATP sont présents et réactifs. Leur activation par le pinacidil provoque une
dilatation des vaisseaux pulmonaires avec une augmentation du flux sanguin et une
diminution des pressions et de la RVP. L'inhibition des ces canaux par du GLI, un inhibiteur
spécifique des canaux KATP entraîne une diminution des flux sanguins pulmonaire et aortique
mais ne modifie pas les pressions pulmonaires et la RVP. L'inhibition de ces canaux par le
TEA, un inhibiteur non spécifique des canaux potassiques, mais à prédominance anti-canaux
KCa2+
de haute conductance, ne modifie pas les flux sanguins ou les pressions.
L'injection intraveineuse d'Ach produit une vasodilatation dépendante de l'endothélium
et cause une diminution significative de la RVP et une augmentation significative du flux
pulmonaire.
66
Nous avons décidé d'étudier les canaux KATP et de tester le pinacidil, un activateur de
ces canaux. La réponse vasodilatatrice au pinacidil sur les canaux KATP est attribuée à une
augmentation de la conductance du K+ dans les cellules musculaires lisses [58, 174]. Dans
notre étude, l'activation des canaux K+ a provoqué une vasodilatation pulmonaire et centrale
chez des brebis porteuses de HDC. Cette activation peut concerner autant les canaux KATP
situés sur l'endothélium que ceux situés dans les cellules musculaires lisses. Certains auteurs
ont montré que l'efficacité du pinacidil était indépendante du NO endothélial [61] alors que
Luckhoff et al. [49] ont montré que ll pinacidil provoquait une hyperpolarisation de la
membrane endothéliale avec une augmentation de la sortie de Ca2+
et la libération du NO.
Theis et al. en 1997 [178] ont montré sur un modèle d'anneaux vasculaires de brebis que le
leveromakalim, un activateur des canaux KATP analogue au pinacidil, était actif
principalement en présence d'endothélium. Chang et al. [54] ont montré que l'inhibition des
NOS par le L-NNA diminuait la vasodilatation pulmonaire produite par le pinacidil chez des
foetus de brebis. Il conclut que le pinacidil provoque une vasodilatation soit par activation
directe des canaux KATP sur la cellule musculaire lisse avec une diminution de Ca2+
intracellulaire soit par l'activation de canaux KATP endothéliaux avec l'activation du NO et une
augmentation de la concentration intracellulaire du Ca2+
.
Afin de tester l'effet du blocage des canaux KATP, nous avons utilisé le GLI en perfusion
lente, médicament connu pour être un inhibiteur spécifique des canaux KATP. Nous avons
trouvé que le GLI ne modifiait pas la PAP ou la PAo mais augmentait la RVP par diminution
des flux sanguins pulmonaire et aortique. Cette augmentation de la RVP n'était cependant pas
significative. Nous concluons ainsi que l'inhibition des canaux KATP n'est pas efficace chez
des brebis avec HDC, bien qu'elle modifie les flux aortique et pulmonaire. Chang et al. [54]
ont montré chez des brebis saines à la naissance que le GLI produisait une vasoconstriction et
une augmentation des pressions pulmonaire et systémique sans modification du QAP. Chez
les mêmes animaux et à la même période, Cornfield et al. [55] ont montré que ce même
inhibiteur (GLI) n'avait pas d'effet sur le tonus de base pulmonaire. Chez nos animaux
herniés, nous n'obtenons pas de réponse significative en termed’augmentation des pressions
pulmonaires et nous concluons que l'inhibition des canaux KATP ne modifie pas non plus le
tonus de base pulmonaire.
Afin de comparer l'efficacité d'un inhibiteur non spécifique de canaux potassiques mais
plus susceptible d’être un anti-canaux KCa2+
de haute conductance, nous avons testé l'effet de
la perfusion de TEA. Le TEA n'a provoqué aucun effet, ni sur la pression pulmonaire ni sur
les débits pulmonaires. Le dosage de TEA était basé sur une étude publiée précédemment
67
[45]. In vitro, la concentration de TEA entre 2 et 3 mM semble inhiber les canaux Kca et à une
concentration plus importante, les canaux KATP et Kv [179].
L'histologie des anneaux vasculaires de brebis herniées a pu être réalisée à la fois sur
coupes incluses en paraffine et à la fois sur coupes en congélation. Cette histologie a montré
des anneaux à parois épaisses avec un endothélium partiellement présent. Il a été difficile de
poser un diagnostic de poumon hypertendu sur la base de cette histologie. L'histologie du
parenchyme pulmonaire montre des vaisseaux dont la paroi est épaisse et la lumière étroite.
Les alvéoles et le reste du parenchyme pulmonaire semblent normaux pour du poumon fœtal
mais l'histologie normale du poumon de brebis est mal connue. Comme pour notre protocole
in vivo, le pinacidil a permis une relaxation significative de tous nos vaisseaux à une
concentration de 10-4
M. Cette réponse était présente chez les animaux herniés (n=5) et chez
les non herniés (n=5) avec une différence non significative entre les deux groupes. Cette
bonne réponse vasodilatatrice présente dans tous les anneaux vasculaires, si on la compare à
la réponse à l'Ach, nous laisse supposer que l'activation du canal KATP par le pinacidil passe en
tout cas en partie par une voie non-endothélium dépendante, sans toutefois forcément exclure
une autre hypothèse. La relaxation est cependant restée partielle car cette vasorelaxation a pu
être très significativement complétée par un donneur direct du NO, le SNP.
Le GLI est connu pour être un inhibiteur spécifique du canal KATP. Il ne présente pas de
propriétés vasoconstrictives ou vasorelaxantes intrinsèques dans notre modèle in vivo. Dans
nos deux groupes d'animaux, nous observons in vitro que du GLI à une concentration de 10-5
M a été incapable d'inhiber l'effet vasodilatateur significatif du pinacidil. La concentration de
GLI aurait peut-être dû être augmentée pour inhiber le pinacidil mais notre étude se basait sur
les concentrations habituellement utilisées chez le rat, peut-être inadéquates pour le fœtus de
brebis. En comparant la réponse vasodilatatrice du groupe d'animaux traité uniquement par le
pinacidil et celui traité préalablement par du GLI avant le pinacidil, on ne trouve pas de
différence significative. Le SNP a permis une vasodilatation complète du vaisseau, sans
blocage par le GLI.
Le L-NNA, bloqueur des NOS, n'a pas inhibé l'effet du pinacidil, dont l’effet relaxant est
aussi significatif. Ceci conforte l'idée que le pinacidil agit par une voie au moins en partie
indépendante du système NO. Cette constatation se retrouve à la fois pour nos brebis herniées
(n=5) et pour celles non-herniées (n=4). La concentration de la L-NNA n'était peut-être pas
suffisante pour inhiber le système des NOS.
68
Certaines étapes de notre protocole sont sujettes à discussion. Nous avons dû
administrer plusieurs médicaments au même animal vu le nombre restreint de brebis
disponibles. Bien que nous ayons prévu un temps de récupération entre deux protocoles, il
aurait été préférable de tester un seul médicament par animal. L'Ach a été administrée pendant
2 minutes. Sa durée d'action est courte. Une perfusion sur 10 minutes par exemple aurait été
préférable. La pinacidil, dont la durée d'action est peu connue, a également été administrée
pendant 2 minutes; nous avons respecté le temps présumé nécessaire pour la récupération
hémodynamique des brebis avant de débuter le protocole suivant (1 heure au minimum). Nous
n'avons pas testé différents dosages de TEA, médicament dont l'action dépend de la dose
administrée. D'autres dosages devraient être testés pour contrôler spécifiquement l'action de
ce médicament. Les enregistrements des effets du GLI et du TEA ont été fait pendant 10
minutes avant l'intubation et il faudrait plus de temps pour pouvoir bien tester l'action de ces
deux médicaments.
3. La NOSn
Dans le but de démontrer la capacité de relaxation des vaisseaux pulmonaires par l'action du
NO et/ou de l'EDHF à la naissance chez des brebis avec HDC, nous avons utilisé l'Ach. Ce
neurotransmetteur agit par l'intermédiaire de récepteurs muscariniques (M1 et M3) situés sur
les cellules endothéliales [36]. Sa capacité vasodilatatrice est donc endothélium-dépendante.
[46]. Il a été démontré chez le cochon que l'Ach agit principalement sur la régulation du tonus
vasculaire du poumon adulte par la libération de NO et de celui du poumon immature par la
libération de NO et de EDHF [180].
Chez le fœtus de brebis sans hernie à la naissance, la présence de la NOSe a été
démontrée par Western Blot par Karamoukian et al. en 1995 [181]. Cependant l'efficacité du
NO avant le troisième jour de vie semble diminuée chez la brebis [35] tout comme chez le
cochon [180]. Cornfield et al. en 1992 [55] ont démontré que le NO était associé à une
dilatation pulmonaire progressive après la naissance sans la possibilité de dilatation rapide à
la naissance même. Dans notre étude, l'Ach a permis une vasorelaxation pulmonaire rapide et
transitoire avec une augmentation significative des flux sanguins et une diminution des
pressions pulmonaire et aortique. Nous montrons ainsi que la libération et l'efficacité du NO
et/ou l'EDHF sont préservées chez des brebis qui ont une HDC à la naissance.
L'étude de nos anneaux vasculaires de poumon dans des bains d'organe nous a montré
que la réponse à l'Ach chez des brebis herniées à 135 jours de gestation est présente puisque
69
l'on a obtenu une relaxation de nos vaisseaux précontractés. Cependant cette réponse était non
significative. L'épaisse paroi de nos vaisseaux rend la lumière étroite et il est difficile de fixer
les anneaux sur les fils de tungstène dans des bains d'organe sans léser un endothélium fragile
et facilement déchirable. Or comme c’est l'endothélium qui possède les récepteurs
indispensables à la réponse vasodilatatrice, la non-réponse à l'Ach est facilement explicable.
Après étude histologique de nos anneaux, on peut conclure que les cellules endothéliales ne
sont jamais conservées en continuité dans notre modèle. La présence de cellules endothéliales
éparses sur un seul anneau n'est pas une garantie de réponse à une stimulation vasodilatatrice
endothélium-dépendant.
T.S. Shermann et al. [32] ont travaillé sur la distribution des trois types de NOS chez le
fœtus de brebis à 125 et 135 jours de gestation et ont établi une cartographie de sa présence
dans les bronches, les bronchioles et les alvéoles. Ils ont ainsi mis en évidence la présence de
la NOSe dans les cellules épithéliales des bronches et des bronchioles proximales et leur
absence dans les bronchioles terminales et les alvéoles. Ils ont également travaillé sur la
localisation de la NOSn dans l'arbre respiratoire des brebis à la naissance et ont montré la
présence de la protéine dans les cellules musculaires lisses de bronchioles terminales et jusque
dans les alvéoles. Il était donc intéressant de savoir quelle part d'activité dans la modulation
du tonus vasculaire pourrait avoir la NOSn en comparaison à la seconde NOS constitutive, la
NOSe. Rairigh et al. [90] ont travaillé sur cette question en injectant à des brebis entre 128 et
135 jours de gestation un inhibiteur spécifique de la NOSn, la 7-NINA et un inhibiteur non
spécifique des NOS, la L-NNA. Il ont montré sur un modèle chirugical enregistrant les mêmes
mesures que les nôtres une augmentation significative de la RVP et de la pression artérielle
systémique, démontrant ainsi que la NOSn contribue à la libération du NO et module, tout
comme la NOSe, le tonus vasculaire pulmonaire et systémique chez des brebis à la naissance.
Un Western Blot a confirmé la présence de la NOSn dans les vaisseaux pulmonaires dénudés,
présente soit dans la média soit dans l'adventice, confirmant le travail et les conclusions de
Scherman. La NOSi a également été impliquée dans la vasoréactivité pulmonaire à la
naissance chez des brebis en fin de gestation puisque Rairigh [91] a démontré que l'inhibition
de la NOSi augmentait la RVP et la pression systémique, modulant ainsi le tonus basal
pulmonaire.
Nous avons reproduit le même protocole in vivo que celui fait par l'équipe de Rairigh
[90] sur des brebis porteuses de HDC. Nous n'avons malheureusement pas de groupe témoin,
sans hernie car de nombreux accouchements se sont produits avant notre seconde procédure
chirurgicale, probablement en raison d'erreurs de date de fécondation. Nous avons testé
70
d’abord la 7-NINA puis la L-NNA et leur réponse à une injection de l'Ach 20 minutes après.
Ces injections ont été faites sur le même animal, avec une attente de 1 heure entre les 2
protocoles, sachant que la durée d'action de la 7-NINA est de 1 heure, celle de la L-NNA est de
3 heures [90]. Nous avons donc débuté par un inhibiteur sélectif de la NOSn pour injecter par
la suite un inhibiteur non sélectif des NOS. La durée d'action de l'Ach est courte, comme nous
l'avons montré dans notre protocole des canaux KATP.
Nous démontrons dans notre étude que la 7-NINA ne modifie pas les pressions
sanguines, ni pulmonaires ni systémiques. Les débits sanguins ont même légèrement
augmenté. La 7-NINA n'a donc pas d'effet propre de modification du tonus de base
pulmonaire ou systémique chez des animaux porteurs de HDC à 137 jours de gestation. L'Ach
à un dosage de 2 ug, donc en très faible concentration, a diminué la pression pulmonaire (non
significatif), la pression aortique et le RVP sans augmenter significativement les débits
sanguins pulmonaire et systémique. La non significativité peut s'expliquer par la très grande
diversité des mesures hémodynamiques de base, diversité due aux propriétés intrinsèques de
chaque animal. Toutefois, tous les débits sanguins ont augmenté à la suite de l'injection d'Ach.
La L-NNA n'a pas non plus modifié les pressions pulmonaire et systémique après son
injection. La RVP n'a même subit aucune modification. Les débits sanguins n'ont pas non plus
varié significativement. Ceci n'est pas en accord avec les résultats de Finemann et al. [39] qui
a montré que l'injection de L-NNA à la naissance chez des fœtus de brebis non herniés a
diminué le débit sanguin pulmonaire suggérant ainsi que le NO contribuait à une diminution
des RVP. L'injection de 2 ug d'Ach n’a pas modifié les pressions en raison de l'inhibition des
NOS par la L-NNA.
L'étude in vitro a été conduite par une stimulation électrique de l'anneau dans des bains
d'organe. Nous avons commencé par une application de notre protocole sur des rats afin
d'étudier les paramètres de stimulation à appliquer pour optimiser la réponse. Nous avons
ainsi fixé la durée de stimulation à 5 ms. Chez le rat, la courbe de relaxation après stimulation
électrique montre une relaxation en deçà de la courbe de base, interprétée comme la libération
de substances vasodilatatrices, telles que le NO, l'histamine, la sérotonine, les prostanoïdes,
l'ergotamine et les sympathico et parasympathicomimétiques. Pour étudier la voie de synthèse
du NO, il convient donc d'inhiber toutes les autres substances vasodilatatrices. Cependant,
l'étude de cette relaxation a été impossible chez nos brebis herniées, car nous n'avons jamais
pu obtenir de relaxation en deçà de la courbe de base, et ceci également pour des anneaux de
brebis non herniées (n=3) ou d'anneaux prélevés dans le poumon de la mère (n=3). Les
courbes restent donc semblables que ce soit après une stimulation électrique chez des
71
animaux herniés sans ajout de L-NNA ou de 7-NINA, que ce soit après ajout des substances,
ou que ce soit chez les animaux herniés ou chez la mère.
Pour confirmer la présence de NOSn chez nos animaux herniés, nous avons fait un
immunomarquage sur coupes en paraffine et sur coupes congelées de vaisseaux pulmonaires
et de parenchyme pulmonaire. Les coupes en paraffine n'ont pas marqué la NOSn mais les
coupes congelées montrent un marquage très distinct des septa interalvéolaires et du
parenchyme pulmonaire dans son ensemble. La coloration de la paroi des vaisseaux est
discrète. Le cartilage est bien marqué mais celui-ci est connu pour marquer non
spécifiquement. Notre immunomarquage confirme ainsi la présence de la NOSn dans les
brebis ave HDC à 135 jours de gestation.
Nous avons réalisé un Western Blot qui a montré une forte présence de la NOSn dans
les poumons droit et gauche, mais également dans l'artère pulmonaire. La NOSn n'a jamais
été démontrée chez des brebis avec ce type de pathologie. Nous avons remarqué sur notre
Western Blot un bruit de fond très important à un PM de 135 kD puis à 84 kD également. A
fin de différencier des bandes de protéines correspondant par exemple à un amas dans nos
échantillons de protéines dégradées et reconnues par notre AC primaire ou à des protéines
reconnues par notre AC secondaire de souris, nous avons pratiqué un Western Blot de l'AC de
souris seulement. Ce Western Blot confirme que l'AC de souris reconnait un grand nombre de
protéines chez la brebis et est responsable de l'important bruit de fond. Ceci confirme que
l'AC anti-NOSn couplé à cet AC de souris n'avait pas été testé chez la brebis et n'est donc pas
optimal pour notre type d'animal.
4. GCs et PDE-5
La voie du NO/GMPc est l’une des voies de signalisation inter- et intracellulaires
importantes impliquées dans la modulation du tonus vasculaire pulmonaire. Des
modifications importantes de cette voie surviennent à la naissance, afin de permettre
l’adaptation à la vie extra-utérine et des échanges gazeux optimaux [182]. Les anomalies de la
voie de transduction GCs/GMPc chez le fœtus d’agneau semblent jouer un rôle prédominant
dans la HDC.
La différence observée entre l’effet du SNP, du T-1032 et du Zaprinast suggère que la
stimulation de la GCs (par le SNP) est plus efficace que l’inhibition de la PDE-5 (par le T-
1032 et le Zaprinast) pour induire une relaxation vasculaire pulmonaire chez les animaux
témoins. La différence observée entre les 2 inhibiteurs des PDE-5 (T-1032 et Zaprinast),
72
semble indiquer que le T-1032 est plus spécifique que le Zaprinast. Kotera et al., en 2000, a
montré la grande spécificité du T-1032, en tant que nouvel inhibiteur des PDE-5 [183].
Mochida et al., en 2002, a montré que le T-1032 était plus spécifique que le sildenafil [184].
Les différences observées entre les fœtus témoins et les fœtus herniés concernant l’effet
vasorelaxant de l’YC-1 et du SNP permettent de supposer l’existence d’une anomalie de la
GCs, alors que celles observées avec le T-1032 suggèrent qu’il existe également une anomalie
de la PDE-5 dans la HDC expérimentale chez le fœtus d’agneau. D’une part, l’anomalie de la
GCs est évoquée devant la constatation d’une différence significative entre les effets
vasodilatateurs de l’YC-1 et du SNP observés dans les deux groupes d’animaux. D’autre part,
l’anomalie de la PDE-5 paraît d’autant plus probable qu’il existe une différence significative
tant in vivo qu’in vitro de la réponse au T-1032 des animaux herniés et témoins.
Nous montrons par ailleurs dans ce modèle animal, pour la première fois, l’effet
vasorelaxant du T-1032, un inhibiteur plus fortement spécifique de la PDE-5 que le Zaprinast,
aussi bien chez les fœtus témoins que chez les herniés. Le T-1032 a un effet vasorelaxant
constaté in vivo et in vitro, ainsi qu’un effet potentialisateur lorsqu’il est administré avec un
stimulateur de la GCs (YC-1 ou SNP). Cet effet permet de faire disparaître les différences
observées entre les fœtus témoins et herniés vis à vis de l’YC-1 et du SNP utilisés seuls.
L’étude in vitro de la voie de signalisation de la GCs a pu être réalisée sur des anneaux
d’artères pulmonaires de fœtus de brebis grâce à l’utilisation de substances stimulant la GCs
soit en mimant l’effet du NO (SNP), soit de façon indépendante de ce dernier (YC-1). La
stimulation de la GCs par le SNP (un donneur de NO) a entraîné une vasodilatation
significative des anneaux artériels de nos séries de fœtus de brebis, témoins (n=4) et herniés
(n=3) mais sans différence significative entre les deux groupes. Ceci va dans le sens des
études précédentes [30]. De même, la stimulation NO-indépendante de la GCs par l’YC-1
entraîne une relaxation dans les deux groupes (témoins : n=5 et herniés : n=4), avec cette fois-
ci une différence significative entre les animaux herniés et les témoins. En effet, pour des
concentrations de 10-6
et 10-5
M, la vasodilatation était significativement plus importante chez
les témoins que chez les animaux herniés. Il existe également une différence significative
entre la vasodilatation dans les deux groupes entre la vasodilatation due au SNP et celle due à
l’YC-1. Galle et al. [185] ont montré que l’YC-1 active la GCs et permet une élévation
persistante du GMPc, contrairement au SNP, dont l’action est brève et réduite par le rinçage
des anneaux vasculaires.
Ces résultats nous permettent d’envisager deux hypothèses, dont la première serait
l’existence d’une anomalie spécifique de la GCs au niveau de son site d’activation par l’YC-
73
1. La deuxième hypothèse serait l’existence, chez les animaux herniés, d’une augmentation
compensatrice (partielle) d’une autre voie aboutissant à la relaxation, médiée par le NO mais
indépendante de la GCs. Ainsi c’est la GCs en totalité qui serait peu ou pas fonctionnelle.
Le fait de freiner l’hydrolyse du GMPc en son produit inactif, le GMPi, par l’action des
inhibiteurs de la PDE-5, permet d’agir à un autre stade de la voie de signalisation GCs/GMPc.
Le T-1032 est un nouvel inhibiteur spécifique de la PDE-5. In vivo, il augmente la
compliance veineuse dans un modèle de rat [186]. In vitro, il permet une vasorelaxation
[187]. En inhibant l’hydrolyse du GMPc, il augmente sa concentration intracellulaire [183].
Le T-1032, tout comme le Zaprinast, a effectivement facilité la vasodilatation des
anneaux dans le groupe témoin. Il existe une différence significative entre l’action de ces 2
drogues chez les témoins, révélant une plus grande spécificité du T-1032. Nous montrons ici
pour la première fois l’effet vasodilatateur du T-1032 chez des agneaux témoins et herniés,
alors que jusqu’à présent son effet n’avait été montré que chez le rat ou le lapin [186]. Nous
montrons également qu’il existe une différence significative entre les animaux herniés et les
témoins recevant du T-1032. Ces effets étant diminués chez l’animal hernié, nous en
déduisons que la PDE-5 est altérée dans ce modèle d’HTAPP. Ceci va à l’encontre des
différentes études déjà réalisées sur la HDC chez le fœtus d’agneau [22].
Black et al. [188] ont montré qu’en comparaison avec les agneaux témoinse les
expressions pulmonaires de la GCs et de la PDE-5 sont doublées et la quantité mesurée de
GMPc, résultant de l’équilibre de ces activités enzymatiques, est également augmentée chez
des agneaux âgés de 4 semaines et présentant une HTAPP (par mise en place anténatale d’un
shunt aorto-pulmonaire). Cette augmentation est sans doute limitée, du fait de l’importante
activité de la PDE-5. Wohlfart et al. [189] ont également pu mesurer le GMPc dans des
cellules endothéliales de rat, montrant un accroissement de son accumulation sous l’action de
l’YC-.
L’étude in vitro de Takagi et al. [187] montrant que le T-1032 a un effet vasorelaxant
mais aussi un effet potentialisateur sur l’effet vasorelaxant du SNP, nous avons voulu associer
du T-1032 en pré-incubation à une concentration de 10-8
M, soit avec du SNP, soit avec de
l’YC-1. Nos résultats montrent que dans ce modèle de HDC chez le fœtus d’agneau, le T-
1032 potentialise l’effet vasodilatateur de l’une ou l’autre de ces drogues dans les deux
groupes. Ceci est d’autant plus important avec l’YC-1 chez l’animal hernié : la pré-incubation
avec le T-1032 permet d’obtenir une courbe de vasodilatation de l’YC-1 chez les animaux
herniés voisine de celle des témoins. Il existe la même tendance avec le SNP associé au T-
1032 mais sans qu’elle soit significative. Ainsi, l’ajout du T-1032, en augmentant la
74
concentration intracellulaire du GMPc, fait disparaître la différence de vasodilatation
engendrée par l’YC-1, entre les animaux herniés et les témoins. Ceci permet de penser que
l’anomalie de la GCs que nous suspçonnions chez les animaux herniés pourrait être corrigée
par l’ajout du T-1032.
5. La ventilation
Dans notre étude, nous avons testé l'influence de la ventilation sur la réactivité pulmonaire
avec une circulation materno-fœtale intacte et une ventilation hypoxémique à 10% de
concentration en O2. La ventilation a fortement diminué les PAP, PAo et PVR et a augmenté
les QAP et QAo, suggèrant ainsi qu'elle est à elle-seule une très forte activatrice de la
vasodilatation pulmonaire. L'effet de l'oxygène a été réduit au minimum car la ventilation se
faisait avec 10% d'oxygène. Nous avons ainsi testé la fonction mécanique de la ventilation qui
s'avère être très efficace pour diminuer les pressions pulmonaires et augmenter les débits
sanguins.
La ventilation avec une concentration en oxygène de 10% diminue la PAP, la PAO et la
RVP et augmente le flux sanguin dans l'aorte et dans l'AP aussi bien chez des animaux
herniés que non herniés. Sous l'influence du L-NNA, nous avons trachéotomisé et ventilé nos
animaux pour enregistrer des courbes de pression et de débit sanguin pulmonaires en réponse
à la ventilation mécanique. La ventilation de l'animal n'a induit ni de baisse de pression
spectaculaire ni d'augmentation du débit sanguin. La RVP a au contraire légèrement
augmenté. Ceci démontre le rôle prépondérant du NO dans la vasorégulation des brebis
herniées à la naissance. La ventilation avec une concentration en oxygène de 100% n'a induit
aucune modification de pression ou de débit, confirmant ainsi l'inutilité d'un apport d'oxygène
maximum pour des brebis herniées à la naissance.
6. L’endothéline
Le puissant vasoconstricteur ET-1 a été impliqué dans le rôle de la pathogenèse de l’HTAPP
[34]. Rappelons que l’ET-1 est présent dans le poumon périnatal [190] et est vasoactif chez le
foetus. Une augmentation de l’expression de l’ET-1 a été relevée chez des nouveau-nés avec
HTAPP [67, 191] et Kobayashi et al. [68] ont montré une élévation de l’ET-1 chez des
patients avec HTAPP. Mais on n’a pas déterminé si la modification de l’ET-1 est la cause ou
la conséquence de l’HTAPP. Les récepteurs ET-A et ET-B sont nécessaires au bon
fonctionnement de l’ET-1. Les récepteurs ET-A sont dans la musculature lisse et provoquent
75
une vasoconstriction et une prolifération musculaire [69]. Une augmentation de la densité des
ET-A a été démontrée dans les artères pulmonaires et dans le parenchyme de patients avec une
HDC [71]. Notre étude se base sur l’expression de ET-A dans des poumons de patients avec
HDC et une HTAPP. Notre étude montre une augmentation significative de l’expression des
ET-A dans les artères de poumons avec une hernie par comparaison aux contrôles. Or de tels
changements peuvent influencer à la fois l’activité mitogène [74] et mitotique de l’ET-1
[192]. Ces résultats suggèrent que l’augmentation de l’expression des ET-A dans les artères
pulmonaires de nouveux-nés avec HDC peut être responsable d’une HTAPP ou consécutive à
une HTAPP.
Des études antérieures ont montré que les ET-B agissent en vasoconstricteurs sur la
cellule musculaire lisse [65]. Quoi qu’il en soit, des études pharmacologiques suggèrent qu’il
y a deux classes d’ET-B avec des effects propres, les ET-B1 agissant sur l’endothélium et
créant une vasodilatation et les ET-B2 agissant sur la musculature lisse et créant une
vasoconstriction. La réponse dilatative est liée aux récepteurx ET-B1 et le nombre de
récepteurs est réduit dans un poumon hypertensif [74].
Le blocage sélectif des ET-B1 ou des ET-B2 ne semble pas modifier le tonus de base des
foetus de brebis [75]. Mais une stimulation des ET-B par un agoniste (sarafotoxine S6c)
produit seulement une vasodilatation, suggérant ainsi la présence des récepteurs ET-B1 dans
des poumons de foetus normaux [72]. Alors que des études sur des cochons ont trouvé à la
fois les récepteurs ET-B1 et ET-B2 en période néonatale [65]. Chez l’humain, la présence des
ET-B1 est peu claire [72]. Chez l’adulte hypertendu, les ET-B semblent induire un effet
constricteur sur la musculature lisse alors qu’ils libèrent des facteurs vasodilatateurs
endothéliaux [77] on observe en même temps une augmentation des codeurs pour les
récepteurs ET-B. Dans des poumons avec HDC, nous avons trouvé une forte expression d ET-
B dans la média des vaisseaux, alors que dans des poumons normaux, les récepteurs ET-B
semblent être peu exprimés. En utilisant une RT-PCR, nous avons trouvé des mRNA de ET-B
dans tous les cas de HDC sans aucune différence dans la somme de ces récepteurs, que ce soit
dans des poumons sains ou des poumons avec HDC.
Chez les fœtus de brebis, des études ont montré qu’une HTA chronique provoque la
perte de la vasodilatation induite par les ET-B, une vasoconstriction progressive induite par les
ET-A et une augmentation des proteines liés à ET-1 [75]. Récemment nous avons trouvé que
l’activité de l’ET-1 est perturbée chez des brebis avec HDC, provoquant une réponse
excessive de blocage des récepteurs ET-A et une diminution du pouvoir dilatateur des
76
récepteurs ET-B [30]. Dans un modèle semblable, le traitement avec un antagoniste du
récepteur ET-A a diminué l’atteinte cardiovasculaire retrouvée après la naissance chez des
fœtus de brebis [70].
Les anomalies vasculaires rencontrées dans la HDC sont une diminution du nombre
des artères par unité de volume, une hypervascularisation périphérique des petites artères avec
un épaississement de la média et de l’adventice [23]. Les petites artères de 200 µm sont
principalement responsables de la résistance pulmonaire [24]. Il semblerait que cet
épaississement de la paroi des vaisseaux rend le bébé incapable de s’adapter
hémodynamiquement aux changements de la naissance. De plus, il semble que ET-1 accroît la
prolifération de la musculature lisse avec une augmentation concomitante de la résistance
vasculaire [76], et que ses deux récepteurs (A et B) jouent un rôle dans cette acroissement
[78]. Cette étude démontre la modification des récepteurs de l’ET-1 en parallèle aux
altérations structurales de la paroi des vaisseaux [79]. Il est clair que dans cette étude, l’effet
de l’activation des récepteurs de l’ET-1 nous est inconnue et que leur rôle doit encore être
investigués. Mais le rôle de l’ET-1 dans la survenue d’une hypertension chez le nouveau-né
avec HDC semble être au premier plan.
K. Conclusion
Nous démontrons que l'activation des canaux KATP par le pinacidil a provoqué une dilatation
des vaisseaux pulmonaires, une augmentation du flux sanguin et une diminution de la PVR.
L'inhibition des canaux KATP et KCa2+
par respectivement le GLI et le TEA n'a pas modifié
significativement les pressions et les débits sanguins pulmonaires. L'Ach a induit une
vasodilatation transitoire. In vitro, le pinacidil a été capable de vasodilater nos vaisseaux
pulmonaires, mais cette vasodilatation n'a pas pu être inhibée par du GLI à 10-5
molaire (M).
Le pinacidil a vasodilaté nos vaisseaux sanguins malgré un endothélium souvent en grande
partie arraché, nous faisant soupçonner que le pinacidil agit à la fois sur des canaux KATP
endothéliaux et sur des canaux KATP situés sur les cellules musculaires lisses.
Nous démontrons que la 7-NINA et le L-NNA n'ont pas la capacité de modifier
significativement le tonus de base pulmonaire in vivo. In vitro, nous n'avons jamais obtenu de
relaxation de nos vaisseaux pulmonaires au-dessous du seuil de stimulation électrique,
rendant difficile l'étude de la libération du NO par cette méthode. Nous démontrons cependant
77
pour la première fois par Western Blot et par immunomarquage du parenchyme pulmonaire la
présence de la NOSn chez des brebis porteuses de HDC à 135 jours de gestation, ,.
La voie du NO/GMPc est l’une des voies de signalisation inter- et intracellulaires
importantes impliquées dans la modulation du tonus vasculaire pulmonaire. Les différences
observées entre les fœtus témoins et herniés concernant l’effet vasorelaxant de l’YC-1 et du
SNP permettent de supposer l’existence d’une anomalie de la GCs, alors que celles observées
avec le T-1032 suggèrent qu’il existe également une anomalie de la PDE-5 dans la HDC
expérimentale chez le fœtus d’agneau. Nous montrons par ailleurs, dans ce modèle animal
pour la première fois, l’effet vasorelaxant du T-1032, un inhibiteur hautement spécifique de la
PD-5 par rapport au Zaprinast, aussi bien chez les fœtus témoins que chez les herniés. Le T-
1032 a un effet vasorelaxant constaté in vivo et in vitro, ainsi qu’un effet potentialisateur
lorsqu’il est administré avec un stimulateur de la GCs (YC-1 ou SNP).
La ventilation induit une nette réduction de la RVP chez nos brebis avec ou sans HDC
et cet effet semble être influencé par la présence du NO qui contribue ainsi à l’adaptation du
tonus vasculaire.
Nous avons trouvé une dysrégulation de l’expression des gênes ET-A et ET-B dans les
poumons de patients décédés avec une HDC et une HTAPP. L’aspect de ces récepteurs est
très différent dans le tissu pulmonaire et dans des échantillons pris dans un tissu normal,
montrant ainsi une forte expression des ET-A et de ET-B dans la portion pré-acinaire et intra-
lobulaire des artères. Ces résultats nous montrent l’effet prépondérant des récepteurs de
l’endothéline dans la physiopathologie de l’HTAPP chez le nouveau-né.
La compréhension et le traitement de la HDC passent ainsi par deux voies : la première
concerne le traitement même des enfants malades ou des fœtus par des méthodes très
prometteuses de chirurgie in utéro par exemple avec l’occlusion de la trachée; la seconde se
base sur la compréhension des phénomènes physiopathologiques par l’utilisation de modèles
animaux comme la brebis ou le rat. Ce sont ces deux méthodes combinées qui nous donnent
l’espoir de pouvoir un jour maîtriser les conséquences de cette malformation anatomique
accompagnée d’une hypoplasie pulmonaire.
78
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