docteur de l’université de poitiers
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THESE
Pour l’obtention du Grade de
Docteur de l’Université de Poitiers Faculté des sciences fondamentales et appliquées
(Diplôme national – arrêté du 7 août 2006)
Ecole doctorale : Ingénierie Chimique Biologique et Géologique Secteur de Recherche : Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie
Présentée par :
Lucie Chevrier
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Modulation de l’expression de MYCN et de SNAP-25 au cours de la différenciation induite par le neuropeptide VIP dans des lignées de neuroblastome humain.
__________________________________________________________________________________
Directeur de thèse : Pr Jean-Marc Muller Co-directeur de thèse : Dr Corinne Chadéneau
Soutenue le 30 mai 2008 Devant la commission d’examen
JURY Vincent LELIEVRE, Professeur des Universités, Université Louis Pasteur, Strasbourg Rapporteur Marie-Hélène RATINAUD, Professeur des Universités, Faculté de Médecine, Limoges Rapporteur Alain MOREL, Professeur des Universités, CRLCC Paul Papin, Angers Examinateur Jean-Marc MULLER, Professeur des Universités, Université de Poitiers Examinateur Corinne CHADENEAU, Maître de conférences, Université de Poitiers Examinateur
REMERCIEMENTS
Je remercie le Professeur Jean-Marc Muller pour m’avoir accueillie au sein de son équipe et
pour son aide pour la rédaction de ce mémoire.
Je tiens à remercier tout particulièrement le Docteur Corinne Chadéneau pour m’avoir
encadrée pendant ce stage et pour m’avoir fait partager ses connaissances et sa rigueur. Merci
pour votre disponibilité et votre soutien.
Je prie les personnes qui m’ont fait l’honneur d’accepter de juger ce travail de croire en
l’expression de ma reconnaissance respectueuse.
Je remercie également toutes les personnes du laboratoire pour l’aide et le soutien qu’ils ont
pu m’apporter au cours de ce stage.
J’adresse ma plus vive reconnaissance à la Ligue Contre le Cancer, ainsi qu’au Lions Club de
Melle pour leur soutien financier, leur gentillesse et l’intérêt qu’ils ont porté à ce travail.
Merci également à tous mes proches qui m’ont soutenue et aidée de près ou de loin pendant
ces trois ans, et même beaucoup plus pour certains…
1
TABLE DES MATIÈRES
liste des abréviations ........................................................................................... 4
INTRODUCTION............................................................................................... 6
1 ère partie : Les neuroblastomes ........................................................................ 7
I - Données cliniques ................................................................................................................ 7
1) Définition et épidémiologie .......................................................................................... 7 2) Origine .......................................................................................................................... 8 3) Pathologie ..................................................................................................................... 9
a) Les neuroblastomes localisés ................................................................................. 9 b) Les neuroblastomes disséminés ........................................................................... 10 c) Les neuroblastomes de stade 4S........................................................................... 11
4) Diagnostic ................................................................................................................... 11 II - Données biologiques......................................................................................................... 13
1) Contenu en ADN......................................................................................................... 13 2) Amplification de l’oncogène MYCN........................................................................... 14 3) Gain du chromosome 17 ............................................................................................. 15 4) Perte du bras court du chromosome 1......................................................................... 16 5) Perte du bras long du chromosome 11........................................................................ 17 6) Altération de l’expression des gènes des récepteurs des neurotrophines ................... 18 7) Voie de l’apoptose ...................................................................................................... 19
a) La caspase 8 ......................................................................................................... 20 b) Les protéines inhibitrices de l’apoptose (IAP)..................................................... 21 c) Les protéines de la famille BCL2......................................................................... 22
8) La protéine p53 ........................................................................................................... 22 III - Classification................................................................................................................... 24
IV - Traitements et taux de survie ........................................................................................ 29
V - Nouvelles stratégies thérapeutiques ............................................................................... 30
1) Immunothérapie anti-tumorale.................................................................................... 30 2) Angiogénèse................................................................................................................ 31 3) Thérapie de différenciation, exemple de l’acide rétinoïque........................................ 32
a) Biosynthèse de l’acide rétinoïque ........................................................................ 33 b) Récepteurs de l’acide rétinoïque.......................................................................... 34 c) Effets de l’acide rétinoïque dans les cellules de neuroblastome .......................... 36 in vitro .............................................................................................................. 36 in vivo ............................................................................................................... 37
d) Rétinoïdes synthétiques ....................................................................................... 39
2
2 ème partie : Le système VIP - récepteurs ....................................................... 41
I - Les neuropeptides de la famille du VIP........................................................................... 41
1) Généralités .................................................................................................................. 41 2) Biosynthèse des neuropeptides ................................................................................... 41
a) Biosynthèse du VIP.............................................................................................. 41 b) Biosynthèse du PACAP ....................................................................................... 43 c) Dégradation des neuropeptides ............................................................................ 45
II - Les récepteurs du VIP et du PACAP ............................................................................. 46
1) Structure des récepteurs .............................................................................................. 46 2) Nomenclature des récepteurs du VIP et du PACAP................................................... 47 3) PAC1........................................................................................................................... 48 4) VPAC1 et VPAC2 ...................................................................................................... 49 5) Distribution des récepteurs PAC1, VPAC1 et VPAC2 .............................................. 51 6) Principales voies de signalisation ............................................................................... 51 7) Récepteurs du PHI insensibles au GTP ...................................................................... 53
III - Fonctions des neuropeptides VIP et PACAP............................................................... 54
1) Prinicpales fonctions des neuropeptides ..................................................................... 54 2) Contrôle de la prolifération et/ou de la différenciation............................................... 55
a) Rôle dans le développement de l’embryon .......................................................... 55 b) Rôle dans le développement et le fonctionnement du système nerveux.............. 56 Neuropeptides et neurones sympathiques ........................................................ 57 Neuropeptides et cellules chromaffines ........................................................... 58
c) Rôle dans la tumorigénèse ................................................................................... 59 IV - Système VIP-récepteur et pathologies .......................................................................... 59
1) Pathologies non cancéreuses....................................................................................... 59 a) Pathologies liées à une hyperproduction de VIP.................................................. 59 b) Pathologies liées à une déficience en VIP ou en PACAP.................................... 60 c) Autres pathologies................................................................................................ 62
2) Pathologies cancéreuses.............................................................................................. 62 3) Neuropeptides et thérapie ........................................................................................... 64
a) Vectorisation et développement d’analogues stables........................................... 64 b) Neuroprotection et les maladies neurodégénératives........................................... 66 c) Maladies inflammatoires et auto-immunes .......................................................... 67 d) Thérapie anti-cancéreuse ..................................................................................... 68 e) Essais cliniques chez l’Homme............................................................................ 69
V - Le système VIP-récepteurs dans les neuroblastomes ................................................... 70
1) Découverte du système VIP-récepteurs dans les cellules de neuroblastome.............. 70 2) Régulation de l’expression du système VIP-récepteurs dans les cellules de
neuroblastome. .......................................................................................................... 71
3
3) Signalisation intracellulaire associée au système VIP-récepteur dans les cellules de neuroblastome ........................................................................................................... 74
3 ème partie : Présentation du sujet de recherche et des objectifs de la thèse78
I - Objectif 1 : Modulation de l’expression de MYCN par le VIP ..................................... 78
1) Importance de l’oncogène MYCN dans les neuroblastomes ....................................... 78 2) Généralités .................................................................................................................. 79 3) Régulation de l’expression de MYCN au cours du développement ........................... 80 4) Amplification de l’oncogène MYCN........................................................................... 81 5) Rôles de MYCN dans les neuroblastomes.................................................................. 82
a) Dans le développement des neuroblastomes........................................................ 82 b) Dans le contrôle du cycle cellulaire, de la prolifération et de la différenciation . 83 c) Dans la progression des neuroblastomes.............................................................. 85
6) Thérapies ciblant l’expression de MYCN................................................................... 86 II - Objectif 2 : implication de SNAP-25 dans la différenciation neuronale..................... 87
1) Généralités .................................................................................................................. 89 a) Identification de la protéine SNAP-25................................................................. 89 b) Complexes SNARE ............................................................................................. 90
2) Expression et rôles de SNAP-25 au cours du développement neuronal ..................... 92 a) Expression de SNAP-25....................................................................................... 92 b) Rôles de SNAP-25 dans la neuritogénèse et la synaptogénèse............................ 93 c) Apport des modèles animaux transgéniques ........................................................ 93
PRESENTATION DES TRAVAUX ............................................................... 96
Présentation de l’article n°1 ................................................................................... 97
Présentation de l’article n°2 ................................................................................. 131
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES ..................................... 168
I - Discussion générale.......................................................................................................... 169
II - Perspectives .................................................................................................................... 171
ANNEXE .......................................................................................................... 178
BIBLIOGRAPHIE .......................................................................................... 188
4
LISTE DES ABREVIATIONS
Les termes suivis d’un astérisque sont anglais.
4-HPR : N-(4-hydroxyphényl) rétinamide
9cis-RA : acide 9-cis rétinoïque
13cis-RA : acide 13-cis rétinoïque
AC : adénylyl cyclase
AMPc : adénosine 3’5’-monophosphate cyclique
at-RA : acide tout-trans rétinoïqe
BDNF : brain derived neurotrophic factor*
BHE : barrière hémato-encéphalique
CaM : calmoduline
CNTF : ciliary neurotrophic factor*
DM : double minute chromosome*
DR : domain repeat*
E : jour de vie embryonnaire
EC : boucle extracellulaire
Erk : extracellular-regulated kinases*
GTP : guanosine triphosphate
HSR : homogeneously staining region*
IAP : inhibitor of apoptosis proteins*
IC : boucle intracellulaire
INPC : International Neuroblastoma Pathology Committee*
INRG : International Neuroblastoma Risk Group*
INSS : International Neuroblastoma Staging System*
IP3 : inositol triphosphate
kDa : kilodalton
LIF : leukemia inhibitory factor*
MAPK : mitogen-activated protein kinase*
MIBG : métaiodobenzyl-guanidine
MKI : mitosis-karyorrhexis index*
MYCN : v-myc avian myelocytomatosis viral-related oncogene, neuroblastoma-
derived*
NGF : nerve growth factor*
5
P : jour post-natal
PAC1 : récepteur spécifique du PACAP
PACAP : pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide*
PHI/M : peptide having carboxyterminal isoleucine/methionone*
PI3K : phospho-inositide 3 kinase
PKA : protéine kinase dépendante de l’AMPc
PKC : proteine kinase dépendante du Ca2+
PLC : phospholipase C
PRP : PACAP-related peptide*
RAR : retinoic acid receptor*
RNAi : interférence de l’ARN
RXR : retinoid X receptor*
SCLC : small cell lung cancer*
shh : sonic hedgehog
SNAP-25 : synaptosomal-associated protein of 25 kDa*
SNARE : soluble N-ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein receptor*
TGF-ß : transforming growth factor β*
TM : domaine transmembranaire
TNF: tumor necrosis factor*
TPA : 12-O-tetra-décanoylphorbol 13-acétate
Trk : tyrosine kinase receptor*
TH : tyrosine hydroxylase
VEGF : vascular endothelial growth factor*
VIH : virus de l’immunodéficience humaine
VIP : vasoactive intestinal peptide*
VPAC1/2 : récepteurs polyvalents VIP et du PACAP
6
INTRODUCTION
7
1ère partie : Les neuroblastomes
I - Données cliniques
1) Définition et épidémiologie
Les neuroblastomes représentent la plus fréquente des tumeurs extracrâniennes de l’enfance.
Leur prévalence est de 1 pour 7000 naissances et ils sont responsables d’environ 15 % de la
mortalité par cancer chez l’enfant (pour revues, Raguénez et al., 2001 ; Maris et al., 2007).
Ces tumeurs touchent essentiellement les jeunes enfants. L’âge moyen au moment du
diagnostic est de 18 mois, 40 % des cas sont diagnostiqués avant l’âge d’1 an, 75 % avant 4
ans et 97 % avant 10 ans (pour revue, Brodeur, 2003). Le taux de survie à 5 ans est de 45 %
(pour revue, Grosfeld, 2000). Les neuroblastomes se développent à partir des cellules de la
crête neurale qui sont, entre autre, les précurseurs du système nerveux sympathique. Les
tumeurs primaires peuvent donc être localisées tout au long des structures du système nerveux
sympathique (pour revue, Edsjö et al., 2007).
L’étiologie des neuroblastomes n’est pas connue. Il semble que des facteurs
environnementaux ne soient pas impliqués. Cependant, une prédisposition génétique existe
dans 1 à 1,5 % des cas. Ces neuroblastomes familiaux ont une transmission autosomique
dominante avec une pénétrance incomplète (pour revue, Tonini et al., 2003). Le gène paired-
like homeobox 2B (PHOX2B) pourrait être un gène de prédisposition aux neuroblastomes. En
effet, une mutation de ce gène dans la lignée germinale a été identifiée dans deux familles
présentant des neuroblastomes et des pathologies souvent associées à ces tumeurs, comme par
exemple la maladie de Hirschsprung (pathologie des chaînes ganglionnaires intestinales
dérivant de la crête neurale la plus commune chez les enfants) (Bourdeaut et al., 2005).
8
2) Origine
La crête neurale est une structure embryonnaire constituée de cellules progénitrices
multipotentes qui présentent une forte activité de prolifération et de migration. La crête
neurale est divisée en quatre parties (Figure 1) en suivant l’axe antéro-postérieur :
- la région crânienne, dont les cellules sont à l’origine des ganglions sensoriels et du cartilage
de la face,
- la région vagale et la région lombo-sacrée, qui donnent naissance au système nerveux
entérique,
- la région du tronc, dont dérivent les mélanocytes, les cellules de Schwann, la médullo-
surrénale et les chaînes ganglionnaires sympathiques.
Région crânienne
Région vagale
Région du tronc
Région lombo-sacrée
somite
Région crânienne
Région vagale
Région du tronc
Région lombo-sacrée
somite
Figure 1 : Structure de la crête neurale (d’après Dyer, 2004). La crête neurale est divisée en quatre régions : la région crânienne en rouge, la région vagale en jaune, la région du tronc en bleu et la région lombo-sacrée en vert.
Les tumeurs primaires des neuroblastomes apparaissent préférentiellement au niveau des
chaînes ganglionnaires et de la médullo-surrénale, ce qui suggère que les cellules de
neuroblastomes dérivent des cellules du tronc de la crête neurale (pour revue, Dyer, 2004).
9
3) Pathologie
Les neuroblastomes présentent une grande hétérogénéité clinique qui dépend de la
localisation de la tumeur primaire ainsi que de la présence ou non de métastases. La tumeur
primaire peut se situer tout le long du système nerveux sympathique, mais dans 65 à 70 % des
cas, elle se trouve dans l’abdomen, le plus souvent au niveau de la glande surrénale. La
tumeur primaire peut également se situer au niveau du thorax (17 à 30 % des cas), du cou ou
du pelvis (5 à 10 % des cas). Les nourrissons présentent le plus souvent des tumeurs au niveau
du thorax et du cou. Les métastases touchent essentiellement la moelle osseuse et les os
(environ 50 % des cas), les ganglions lymphatiques (28 % des cas), le foie (22 %) et la peau
(12 %). Les métastases au niveau des poumons et du cerveau sont rares au moment du
diagnostic mais peuvent apparaître lors des récidives (pour revue, Maris et al., 2007 ;
D’Andon et al., 2004 ; www.fnclcc.fr). Au moment du diagnostic, le neuroblastome est soit
localisé, soit métastatique.
a) Les neuroblastomes localisés
Lors du diagnostic, près de 40 % des patients présentent un neuroblastome localisé. Dans ces
neuroblastomes, la tumeur est souvent asymptomatique. De ce fait, la maladie est souvent
diagnostiquée par hasard. Les tumeurs situées au niveau de l’abdomen provoquent des
douleurs abdominales et un inconfort. En cas d’augmentation brutale de la masse tumorale, la
douleur devient plus forte et des saignements peuvent avoir lieu dans la tumeur ou à
proximité. Les tumeurs situées dans le pelvis induisent des troubles de la miction et des
problèmes intestinaux. Certaines tumeurs dites en sablier pénètrent le canal contenant la
moelle épinière et provoquent des symptômes liés à la compression des racines nerveuses et
de la moelle (troubles de la marche, de la miction et de la défécation). La neurochirurgie doit
10
alors être associée à la chimiothérapie afin d’éviter que ces symptômes ne deviennent
définitifs (pour revue, Maris et al., 2007).
Deux symptômes paranéoplasiques sont associés aux neuroblastomes localisés. La sécrétion
de VIP (vasoactive intestinal peptide) provoque des diarrhées hydriques profuses et une
hypokaliémie. Ces troubles, qui touchent 7 à 9 % des patients, disparaissent généralement
après ablation de la tumeur. Le syndrome opsoclonus-myoclonus, caractérisé par des
mouvements rapides des yeux et une ataxie, est également associé aux formes localisées. Les
enfants présentant un neuroblastome localisé et le syndrome opsoclonus-myoclonus (2 à 4 %
des cas) ont un devenir favorable. Cependant, 70 à 80 % de ces patients présentent des déficits
neurologiques à long terme (retards cognitif et moteur, troubles du langage et du
comportement). Il semble que ces déficits puissent être atténués grâce à la chimiothérapie ou à
l’administration par voie intraveineuse de glucocorticoïdes, d’hormone adrénocorticotrope
(ACTH) ou d’immunoglobulines IgG (pour revue, Matthay et al., 2005).
b) Les neuroblastomes disséminés
Près de 60 % des patients présentent des métastases au moment du diagnostic. Ces patients
ont souvent une fatigue générale. Les métastases touchant la moelle osseuse et les os peuvent
provoquer des douleurs osseuses, une boiterie, une anémie ou des hémorragies. Des
hématomes de l’orbite et un proptosis sont fréquents dans ces neuroblastomes métastatiques et
sont dus à l’infiltration de la tumeur dans la cavité orbitale. Dans certains cas, les patients
souffrent d’hypertension, qui peut être due à la compression d’une artère rénale (pour revue,
Maris et al., 2007).
11
c) Les neuroblastomes de stade 4S
Il existe une troisième grande catégorie de neuroblastome appelé stade 4S (S = spécial)
(D’Angio et al., 1971) , qui représente environ 5 % des cas. Ces neuroblastomes sont
caractérisés par une petite tumeur primaire localisée et des métastases au niveau du foie. La
peau et la moelle osseuse peuvent également être touchées. Le syndrome de Pepper est une
forme particulière de neuroblastome de stade 4S caractérisée par des métastases hépatiques
très volumineuses, pouvant provoquer des difficultés respiratoires. Dans environ 30 % des
cas, les neuroblastomes de stade 4S présentent la particularité de pouvoir régresser
spontanément probablement par un phénomène d’apoptose. De ce fait, le taux de survie des
patients est de 85 à 92 %. Cependant, certains de ces neuroblastomes présentent des
caractéristiques biologiques défavorables et une progression tumorale rapide. Dans les cas de
récidives, ils se présentent alors comme des neuroblastomes disséminés (pour revue, Kerdudo
et al., 2004).
4) Diagnostic
Le diagnostic est réalisé grâce à des marqueurs biologiques comme l’acide homovanilique
(HVA) et l’acide vanillylmendélique (VMA). En effet, l’augmentation dans les urines de ces
substances dérivées des catécholamines est observée dans 90 à 95 % des cas. De plus, la
quantité de ces molécules augmente avec la masse tumorale, ce qui permet de suivre
l’évolution de la tumeur. La lactodeshydrogénase (LDH) est un autre marqueur biologique
important puisque son taux augmente dans le sang dans 75 % des neuroblastomes (d’Andon et
al., 2004).
Le diagnostic est affiné grâce à des techniques d’imagerie. L’échographie permet de localiser
les tumeurs situées au niveau de l’abdomen, du thorax ou du pelvis, alors que l’imagerie par
résonance magnétique met en outre en évidence les compressions éventuelles de la moelle
12
épinière. Ces deux techniques sont également utiles pour révéler les extensions locales ou
régionales des tumeurs. Les tumeurs osseuses sont visualisées grâce à la scintigraphie à la
métaiodobenzyl-guanidine (MIBG) (Figure 2) ou au 99Tc-diphosphonate. Les biopsies des
tumeurs permettent de réaliser des analyses histologiques et biologiques visant à caractériser
la présence de certaines anomalies génétiques caractéristiques des neuroblastomes (pour
revue, Ishola et Chung, 2007).
Figure 2 : Marquage de métastases par scintigraphie à la métaiodobenzyl-guanidine (MIBG) (d’après Howman-Giles et al., 2007). Des métastases sont visibles au niveau des orbites, du squelette et de l’abdomen.
13
II - Données biologiques
Les neuroblastomes présentent de nombreuses anomalies génétiques ou des dérèglements de
l’expression de certaines protéines qui peuvent constituer des facteurs importants dans
l’établissement du pronostic de la maladie (Tableau I).
Facteur pronostique Pronostic
Index ADN = 1 - Index ADN > 1 + Amplification de MYCN - Gain du chromosome 17 + Gain du 17q - Délétion du 1p - Délétion du 11q - Expression de TrkAII + Expression de TrkB -
Tableau I : Résumé des facteurs ayant une signification dans le pronostic des neuroblastomes. - : facteur associé à un mauvais pronostic, + : facteur associé à un pronostic favorable.
1) Contenu en ADN
Les neuroblastomes présentent des anomalies au niveau de leur contenu en ADN. Grâce aux
analyses cytogénétiques, il est possible de distinguer 4 niveaux de ploïdie :
- Les tumeurs presque diploïdes et les tumeurs presque tétraploïdes, sont trouvées chez les
enfants de plus d’un an, et associées à un pronostic défavorable. Ces tumeurs sont
caractérisées par des réarrangements chromosomiques tels que des amplifications ou des
délétions, provoquant une grande instabilité génomique et par conséquent une grande
agressivité.
- Les tumeurs presque triploïdes et les tumeurs presque pentaploïdes sont associées à un
devenir favorable. Elles sont caractérisées par des gains ou des pertes de chromosomes
entiers, sans réarrangements structuraux. Cela crée une instabilité mitotique avec
anomalies de la ségrégation chromosomique engendrant une faible agressivité tumorale.
14
Cependant, le contenu en ADN ne constitue un facteur pronostique que chez les enfants de
moins de 1 an (pour revues, Brodeur, 2003 ; Westermann et Schwab, 2002).
2) Amplification de l’oncogène MYCN
En 1983, Schwab et al. ont mis en évidence l’amplification du gène MYCN (v-myc avian
myelocytomatosis viral-related oncogene, neuroblastoma-derived) sous forme de
chromosomes minuscules doubles (DM pour double minute chromosome en anglais) ou des
régions chromosomiques présentant un marquage homogène (HSR pour homogeneously
staining region en anglais) dans des lignées cellulaires dérivant de neuroblastomes humains et
dans une tumeur primaire (Figure 3). Par la suite, Seeger et al (1985) ont démontré que
l’amplification de MYCN était associée aux neuroblastomes ayant une progression rapide et
un mauvais pronostic.
Figure 3 : Amplification de l’oncogène MYCN dans des noyaux de cellules de neuroblastome mise en évidence par la technique de FISH (fluorescent in situ hybridation) (d’après Maris et al., 2007). La présence de multiples copies du gène MYCN est détectée grâce à une sonde spécifique marquée en rouge.
Le gène MYCN, localisé sur le bras court du chromosome 2, code deux phosphoprotéines
localisées dans le noyau, où elles exercent leur fonction de facteur transcriptionnel quand elles
sont complexées à la protéine MAX (MYC-associated factor X). La protéine MYCN est
15
impliquée dans la prolifération, la croissance cellulaire et la synthèse protéique (Ramsay et
al., 1986 ; pour revue, van Noesel et Versteeg, 2004).
L’amplification de l’oncogène MYCN est l’anomalie génétique la mieux caractérisée dans les
neuroblastomes. Elle apparaît dans 22 % des neuroblastomes et constitue un facteur pronostic
essentiel (pour revues, van Noesel et Versteeg, 2004 ; Plantaz, 2001). Le gène MYCN est
également amplifié dans d’autres tumeurs comme des rhabdomyosarcomes, des
médulloblastomes, des rétinoblastomes, des glioblastomes, des astrocytomes et des cancers du
poumon à petites cellules (pour revue Strieder et Lutz, 2002).
Aujourd’hui, seule l’amplification du gène MYCN constitue un facteur pronostique, la
signification du taux d’expression de l’ARNm MYCN ou des protéines MYCN étant
controversée : selon les études, le taux d’expression de MYCN peut être corrélé ou non au
stade de la maladie (Cohn et al., 2000 ; Tang et al., 2006).
Le rôle de MYCN dans les neuroblastomes sera développé dans la troisième partie de cette
introduction (p 78).
3) Gain du chromosome 17
Le gain du chromosome 17 est l’anomalie génétique la plus fréquente dans les
neuroblastomes, puisqu’elle concerne 50 % des cas. Cette anomalie, quand elle touche la
totalité du chromosome 17, est associée à un bon pronostic, alors que le gain du bras long de
ce chromosome est associé aux stades avancés (Vandersompele et al., 2001). Cette anomalie
est généralement due à des translocations déséquilibrées entre les chromosomes 1 et 17, qui
conduisent à la perte de l’extrémité distale du chromosome 1 et à la trisomie partielle de
l’extrémité distale du chromosome 17. Des translocations entre les chromosomes 17 et 11
peuvent également avoir lieu. Les points de cassure sur le bras long du chromosome 17 sont
hétérogènes. La région 17q22-qter a été identifiée comme la plus petite région commune de
16
gain de matériel chromosomique. Cette région porte probablement un ou plusieurs gènes
contribuant à la tumorigénèse en cas de surexpression (pour revue, Maris, 2005).
Plusieurs gènes concernés par le gain du chromosome 17 sont actuellement étudiés. C’est le
cas du gène NM23-H1 localisé en 17q22. Ce gène code pour une kinase de nucléotides
diphosphates. NM23-H1 a tout d’abord été identifié comme un gène suppresseur de
métastases dans les cancers du sein et les mélanomes (pour revue, Lombardi, 2006). Mais
dans d’autres cancers tels que les lymphomes non Hodgkinien et les neuroblastomes, NM23-
H1 est considéré comme un oncogène. Dans les neuroblastomes, l’expression élevée de
nm23-H1 dans le sérum est associée à un mauvais pronostic et une grande agressivité (Hailat
et al., 1991). Il a également été montré que le gène NM23-H1 est une cible transcriptionnelle
de l’oncogène MYCN (Godfried et al., 2002). Un autre gène semble être également impliqué
dans le développement des neuroblastomes. Il s’agit du gène de la survivine, localisé en
17q25, (Ambrosini et al., 1998). La survivine appartient à la famille des inhibiteurs de
l’apoptose (IAP pour inhibitor of apoptosis protein). Dans les neuroblastomes, l’augmentation
de l’expression de la survivine est associée aux tumeurs ayant un pronostic défavorable (Islam
et al., 2000).
4) Perte du bras court du chromosome 1
La délétion du bras court du chromosome 1 concerne 30 à 35 % des neuroblastomes. Cette
anomalie est souvent associée au gain du bras long du chromosome 17. La région minimale
commune de délétion a été identifiée en 1p36.31 (White et al., 2005). La taille de la délétion
varie en fonction de l’amplification de MYCN. En effet, elle est grande (1p35-1pter) dans les
neuroblastomes présentant plusieurs copies de cet oncogène et petite (1p36.3) dans les
tumeurs n’ayant qu’une seule copie du gène MYCN. La plupart des neuroblastomes présentant
l’amplification de MYCN présente également la délétion du chromosome 1p, alors que tous
17
les neuroblastomes ayant la délétion en 1p ne présentent pas l’amplification de MYCN. Cela
suggère que la plus large délétion du chromosome 1 pourrait précéder l’amplification de
l’oncogène MYCN. Cette anomalie, bien que souvent associée à l’amplification de MYCN,
constitue cependant un indicateur indépendant de devenir défavorable (pour revues, Brodeur,
2003 ; van Noesel et Versteeg, 2004). La perte du bras court du chromosome 1 semble induire
la perte d’expression de gènes suppresseurs de tumeur. En effet, l’introduction du segment
chromosomique 1p dans la lignée de neuroblastome NGP diminue la malignité de ces cellules
et induit leur différenciation (Bader et al., 1991). L’identification du ou des gènes
suppresseurs de tumeur localisés en 1p36 a donné lieu à de nombreuses études. Le gène p73,
lors de son identification, a été considéré comme étant le gène suppresseur de tumeur
potentiel dans les neuroblastomes (Kaghad et al., ,1997) mais cela n’a pas été confirmé par la
suite. A ce jour, aucun gène suppresseur de tumeur n’a été clairement identifié sur ce
fragment chromosomique, mais le gène CHD5 dont le produit est impliqué dans le
remodelage de la chromatine, apparaît être un excellent candidat (Okawa et al., 2008).
5) Perte du bras long du chromosome 11
La délétion du bras long du chromosome 11 est observée dans environ un tiers des
neuroblastomes. Cette anomalie est associée à un mauvais pronostic mais n’est pas liée à
l’amplification de MYCN. Les altérations du bras long du chromosome 11 peuvent se
manifester sous différentes formes : translocations impliquant les régions 11q21 et 11q22,
délétion de la région 11q23, inversion entre les segments 11q21 et 11q23 ou perte allélique
(pour revues, van Noesel et Versteeg, 2004 ; Maris, 2005). La délétion de ce fragment
chromosomique est souvent associée à la perte du bras court du chromosome 3
(Vandesompele et al., 1998 ; Breen et al., 2000; Spitz et al., 2003).
18
6) Altération de l’expression des gènes des récepteurs des neurotrophines
Les neurotrophines sont des molécules impliquées dans la croissance, le développement, la
survie et les mécanismes de la réparation du système nerveux. Elles agissent via les récepteurs
Trk (tyrosine kinase receptor). Il existe trois types de Trk :
- TrkA qui lie préférentiellement de NGF (nerve growth factor),
- TrkB dont les ligands sont le BDNF (brain-derived neurotrophic factor) et
NT-4/5 (neurotrophin-4/5),
- TrkC, spécifique de NT-3 (neurotrophin-3).
Un quatrième type de récepteur des neurotrophines a été identifié. Il s’agit du récepteur
p75NTR qui est polyvalent mais présente une moindre affinité. In vivo, le système
neurotrophine-Trk induit la survie ou la différenciation neuronale (Figure 4) (pour revue,
Nakagawara, 2001). Le récepteur TrkAII est surexprimé dans les neuroblastomes ayant un
pronostic favorable, notamment dans les cas de régression spontanée. Dans ces tumeurs, la
surexpression de TrkAII et la production (même faible) du NGF par les cellules de Schwann
environnantes pourraient permettre de stimuler la différenciation, alors qu’en absence de
ligand, l’apoptose serait induite dans les cellules tumorales (Nakagawara et al., 1992 ; 1993 ;
Kogner et al., 1993). Une autre isoforme du récepteur TrkA, nommée TrkAIII et résultant de
l’épissage alternatif du gène TrkA, a également été identifiée dans les neuroblastomes, en
particulier dans ceux de stades avancés. L’expression de cette isoforme protège les cellules de
neuroblastome de la mort induite par la doxorubicine et favorise l’angiogénèse in vivo
(Tacconelli et al., 2004). Dans les neuroblastomes agressifs, TrkB est fortement exprimé.
Dans les formes de tumeurs exprimant TrkB et ses ligands, une stimulation
autocrine/paracrine semble favoriser l’invasion et donc les métastases (Matsumoto et al.,
1995). En ce qui concerne le récepteur TrkC, il est préférentiellement exprimé dans les
neuroblastomes favorables mais son implication reste à déterminer (Yamashiro et al., 1996).
19
Figure 4 : Représentation schématique de la signalisation Trk dans les neuroblastomes (d’après Maris et al., 2007). Le récepteur TrkAII, quant il est exprimé dans les neuroblastomes, peut induire la différenciation des cellules en présence de son ligand, le NGF, ou l’apoptose en absence de NGF. Lorsque le récepteur TrkB et son ligand, le BDNF, sont présents, ils favorisent l’invasion des cellules tumorales.
7) Voie de l’apoptose
L’apoptose est un mécanisme de mort cellulaire physiologique qui permet de contrôler le
nombre de cellules de l’organisme au cours du développement par exemple. L’apoptose peut
être déclenchée par des agents cytotoxiques ou les rayons γ. Ainsi, les substances utilisées en
chimiothérapie agissent en provoquant l’apoptose des cellules cancéreuses (pour revue, Fulda
et Debatin, 2003). L’apoptose peut être médiée par deux voies : la voie des récepteurs de mort
membranaires (voie extrinsèque) ou la voie mitochondriale (voie intrinsèque). Ces deux voies
20
aboutissent à l’activation en cascade des caspases, des protéases à cystéines qui vont conduire
au clivage de diverses protéines et à la mort de la cellule (pour revue, Couzinet et al., 2002).
Certains neuroblastomes sont résistants aux drogues de chimiothérapie à cause d’altérations
de certains effecteurs de l’apoptose, tels que la caspase 8, les protéines inhibitrices de
l’apoptose (IAP), les protéines de la famille BCL2.
a) La caspase 8
La caspase 8 est impliquée dans l’apoptose médiée par les récepteurs du TNF (tumor necrosis
factor) (pour revue, Couzinet et al., 2002). Le gène CASP8 codant cette enzyme est localisé
en 2q33, une région associée à une perte d’hétérozygotie dans certains neuroblastomes (Teitz
et al., 2000). Il a également été démontré que ce gène est méthylé dans environ 60 % des
neuroblastomes. Cette modification épigénétique semble être statistiquement corrélée à
l’amplification de l’oncogène MYCN (Teitz et al., 2000 ; Banelli et al., 2005 ; Yang et al.,
2007). Malgré le fait que la méthylation inhibe généralement la transcription, l’expression de
la caspase 8 est indépendante de l’état de méthylation du gène (Banelli et al., 2000). La
majorité des neuroblastomes n’expriment pas la caspase 8. Cependant, quand elle est
exprimée, son taux d’expression n’est pas corrélé à l’amplification de MYCN (Fulda et al.,
2006). Il apparaît donc que, bien que la méthylation du gène CASP8 soit liée à l’amplification
de MYCN, l’expression de la caspase 8 ne soit pas corrélée à ces deux événements.
En plus de son rôle dans l’apoptose médiée par les récepteurs du TNF, la caspase 8 est
également impliquée dans la mort cellulaire dépendante des intégrines (integrin-mediated
death ou IMD). Ce phénomène est connu pour empêcher la dissémination métastatique de
cellules de neuroblastome. En effet, dans deux modèles animaux de dissémination
métastatique (embryon de poulet et souris nude), l’injection de cellules de neuroblastome
exprimant la caspase 8 n’induit pas la formation de métastases, contrairement à l’injection de
21
cellules n’exprimant pas cette caspase. Lorsque les cellules tumorales quittent le site de la
tumeur primaire, elles se retrouvent dans un environnement différent dans lequel les
intégrines ne sont plus au contact de leur ligand. Les intégrines non liées vont alors activer la
caspase 8 et provoquer la mort des cellules. Ces travaux mettent en évidence le rôle de
suppresseur de tumeur que peut avoir la caspase 8 dans les neuroblastomes (Stupack et al.,
2006).
b) Les protéines inhibitrices de l’apoptose (IAP)
Les IAP sont des protéines qui inhibent l’apoptose en se liant à certaines caspases. Les IAP
peuvent être neutralisées par les protéines Smac/Diablo ou Omi libérées par les
mitochondries. Ces protéines sont fréquemment surexprimées dans plusieurs types de cancer.
C’est le cas par exemple de la XIAP (X-linked inhibitor of apoptosis protein) surexprimée
dans les gliomes ou cIAP1 dans les cancers ovariens (pour revue, Goldsmith et Hogarty,
2005). Dans les neuroblastomes, la IAP la plus étudiée est la survivine dont la surexpression
est corrélée aux stades avancés de neuroblastomes avec un mauvais pronostic (Islam et al.,
2000). Le gène BIRC5 qui code la survivine, est localisé en 17q25 (Ambrosini et al., 1998),
région fréquemment associée à un gain de chromosome dans les neuroblastomes. Cependant,
la capacité de la survivine à inhiber les caspases n’est pas claire. En effet, la survivine ne
possède pas la séquence d’acides aminés essentielle à la liaison aux caspases (Verdecia et al.,
2000). La survivine pourrait agir indirectement. En effet, dans des carcinomes
hépatocellulaire, la survivine n’est capable de lier la pro-caspase 9 qu’en présence de la
protéine HBXIP (hepatitis B X-interacting protein) (Marusawa et al., 2003).
22
c) Les protéines de la famille BCL2
Ces protéines sont importantes dans la voie mitochondriale de l’apoptose. En effet, elles
inhibent ou permettent la libération du cytochrome c par la mitochondrie. Cette famille
regroupe des protéines anti-apoptotiques comme BCL2 ou BCL-XL, et des protéines pro-
apoptotiques comme BAX ou BID (pour revue, Fulda et Debatin, 2003). La protéine anti-
apoptotique BCL2 est surexprimée dans de nombreux neuroblastomes, mais des travaux
actuellement contradictoires ne permettent pas de lier cette surexpression aux caractéristiques
cliniques des neuroblastomes (Castle et al., 1993 ; Ikeda et al., 1995 ; Mejia et al., 1998 ;
Abel et al., 2005).
8) La protéine p53
La protéine p53 est un facteur de transcription qui stimule l’expression de gènes comme
p21WAF1 et BAX, induisant respectivement l’arrêt du cycle et l’apoptose à la suite d’un stress.
Dans de nombreux cancers, la protéine p53 est inactivée par mutation du gène (pour revue,
Tweddle et al., 2003). Dans les neuroblastomes, les mutations de p53 sont très rares
puisqu’elles affectent environ 2% des cas (Imamura et al., 1993 ; Hosoi et al., 1994) et sont
généralement observées dans les neuroblastomes récurrents. Ces mutations semblent
apparaître à la suite de la chimiothérapie et pourraient être responsables de la chimiorésistance
de certains neuroblastomes (Keshelava et al., 2000 ; 2001 ; Tweddle et al., 2001). Ces
données suggèrent un rôle de p53 dans l’apoptose induite par les drogues utilisées en
chimiothérapie.
Bien que les mutations du gène p53 soient rares dans les neuroblastomes, des anomalies de la
voie p53 ont été observées dans ces cancers. Les premières études concernant p53 dans les
neuroblastomes ont mis en évidence un fort taux d’expression de l’ARN p53 ainsi que de la
protéine, dont la demi-vie est augmentée par rapport à des cellules de la glande surrénale
23
(Sidell et Koeffler, 1988 ; Davidoff et al., 1992). Il a ensuite été démontré que la protéine p53
est anormalement localisée dans le cytoplasme dans des neuroblastomes indifférenciés et des
lignées cellulaires (Moll et al., 1995 ; 1996 ; Goldman et al., 1996). Dans le cytoplasme, la
protéine p53 est visible sous la forme d’agrégats protéiques dans lesquels l’extrémité
C-terminale est masquée (Ostermeyer et al., 1996). La protéine Parc (p53-associated, Parkin-
like cytoplasmic protein) a été identifiée comme responsable de la séquestration
cytoplasmique de p53. La liaison de Parc et p53 implique le domaine N-terminal de Parc et le
domaine C-terminal de p53 (Nikolaev et al., 2003). Il semble également que la séquestration
cytoplasmique de p53 puisse être due à son hyperubiquitinylation (Becker et al., 2007). La
séquestration cytoplasmique de p53 a laissé penser que, par ce biais, cette protéine était
inactive dans les neuroblastomes. Cette hypothèse a d’abord été confirmée par une étude
démontrant que dans des cellules de neuroblastomes, des dommages de l’ADN n’induisent
pas d’arrêt du cycle en phase G1 car p53 n’est pas transloquée dans le noyau (Moll et al.,
1996). Cependant, la localisation cytoplasmique et la non fonctionnalité de la protéine p53
sont remises en cause par plusieurs études, la plus récente datant de 2007. En effet, dans des
tumeurs et des lignées de neuroblastome, p53 est détectée majoritairement au niveau nucléaire
quel que soit l’état de différenciation des tumeurs et des cellules (Chen et al., 2007). Ces
résultats contradictoires avec les travaux précédents pourraient être dus à l’utilisation d’un
anticorps anti-p53 donnant un marquage cytoplasmique non spécifique (Wolff et al., 2001 ;
Chen et al., 2007).
La voie p53 peut être inhibée par MDM2, le principal inhibiteur de la protéine p53. En effet,
la protéine MDM2 peut être surexprimée dans les neuroblastomes d’une part à la suite de
l’amplification du gène MDM2 et d’autre part à la suite de l’amplification de MYCN, ce
facteur transcriptionnel régulant positivement l’expression de MDM2 (Corvi et al., 1995 ;
pour revue, Slack et Shohet , 2005).
24
III - Classification
Du fait de leur grande hétérogénéité clinique, il a été important de bien caractériser et classer
les différentes formes de neuroblastome afin d’en améliorer le diagnostic et par conséquent la
thérapie. En 1984, Shimada et al., ont proposé une classification des neuroblastomes (et des
tumeurs neuroblastiques en général) basée sur des critères histologiques. Cette étude a servi
de base à la classification de l’ « International Neuroblastoma Pathology Commitee » (INPC).
A cette même époque, un effort a été mené afin de développer des systèmes de classification
des neuroblastomes plus complets, prenant en compte divers critères cliniques et biologiques.
C’est ainsi qu’en 1995, la classification de l’ « International Neuroblastoma Staging System »
(INSS) a été validée. Cette classification prend en compte la dissémination du neuroblastome.
Ainsi, on distingue les formes localisées de stades 1, 2 et 3, des formes métastasiques de stade
4 (Tableau II). Parallèlement, Brodeur (1994) a proposé de classer les neuroblastomes en
fonction des anomalies génétiques (amplification de MYCN, contenu en ADN, délétions
chromosomiques, expression de TrkA). La dernière classification mise au point par
l’ « International Neuroblastoma Risk Group » (INRG) prend en compte des critères de
chacune des classifications précédentes et permet d’évaluer les neuroblastomes en fonction du
risque de récurrence de la maladie et de déterminer le type de traitement à appliquer (Tableau
III) (pour revue, Castleberry, 1997).
L’âge au moment du diagnostic est un critère important : le devenir d’un neuroblastome, quel
que soit son stade, est meilleur chez un enfant de moins d’un an. Cependant, cet âge limite
traditionnellement fixé à un an est actuellement discuté au vu de nouvelles études qui
montrent qu’un âge limite situé entre 15 et 18 mois serait plus adapté (London et al., 2005 ;
Schmidt et al., 2005 ; George et al., 2005).
25
Stade Description Stade 1 Tumeur localisée avec une exérèse macroscopiquement complète, avec ou
sans résidu microscopique ; les ganglions homolatéraux sont histologiquement sains (les ganglions adhérents à la tumeur et enlevés avec elle peuvent être envahis).
Stade 2A Tumeur localisée avec une exérèse macroscopiquement incomplète ; les ganglions homolatéraux non adhérents sont histologiquement sains (les ganglions adhérents à la tumeur et enlevés avec elle peuvent être envahis).
Stade 2B Tumeur localisée avec ou sans exérèse macroscopique complète avec ganglions homolatéraux non adhérents à la tumeur envahis histologiquement. Les adénopathies controlatérales doivent être histologiquement saines.
Stade 3 Tumeur latéralisée inextirpable, infiltrant la ligne médiane (= définie par la colonne vertébrale), avec ou sans envahissement ganglionnaire régional, ou tumeur latéralisée avec envahissement ganglionnaire controlatéral, ou tumeur médiane avec extension bilatérale par elle-même ou par envahissement ganglionnaire.
Stade 4 Toute tumeur primitive avec dissémination à distance dans les ganglions, l’os, la moelle osseuse, le foie et/ou d’autres organes (sauf si cela correspond à la définition des stades 4S).
Stade 4S Tumeur primitive localisée (comme définie pour les stades 1, 2A ou 2B), avec dissémination hépatique, cutanée et/ou au niveau de la moelle osseuse (restreint aux enfants de moins d’un an). Dans le stade 4S, l’envahissement médullaire doit être minime, c’est-à-dire moins de 10 % de cellules tumorales parmi les cellules nucléées sur la biopsie ostéo-médullaire ou le myélogramme. Un envahissement plus important doit faire classer le patient en stade 4. De plus, la scintigraphie à la MIBG ne doit pas montrer d’hyperfixation squelettique.
Tableau II : Classification des neuroblastomes selon l’ « International Neuroblastoma Staging System » Cette classification permet de distinguer les tumeurs localisées de stade 1, 2 et 3, des tumeurs métastatiques de stade 4.
Dans la classification de l’INRG, le statut de MYCN est déterminé par le nombre de copies du
gène : à partir de dix copies par cellule, la tumeur est considérée comme amplifiée pour
l’oncogène MYCN, ce qui est le plus souvent associé à un mauvais pronostic.
26
Stade 1 Age MYCN 2 Histologie 3 Index d’ADN
Risque de récurrence
1 - - - - Faible
< 1an - - - Faible Non amp - Non app Faible
Amp Fav Non app Faible
2A/2B > 1 an
Amp Défav Non app Fort
Non amp - - Intermédiaire < 1an Amp - - Fort
Non amp Fav Non app Intermédiaire Non amp Défav Non app Fort
3
> 1an
Amp Tout Non app Fort
Non amp - - Intermédiaire < 1 an Amp - - Fort
4
> 1 an - - Non app Fort
Non amp Fav > 1 Faible Non amp - = 1 Intermédiaire Non amp Défav - Intermédiaire
4S < 1an
Amp - - Fort Tableau III : Classification des neuroblastomes selon l’ « International Neuroblastoma Risk Group » 1 : d’après la classification de l’ « International Neuroblastoma Staging System » 2 : statut de MYCN : amplifié (amp) ou non amplifié (non amp) 3 : d’après la classification de l’ « International Neuroblastoma Pathology Commitee » : histologie favorable (fav) ou défavorable (défav). - : quel que soit l’âge, le statut de MYCN, l’histologie ou l’index ADN. Non app : non applicable
L’histologie est définie selon les critères de la classification de Shimada qui prend en
compte :
- le niveau du développement stromal : le stroma est un tissu conjonctif qui accompagne
les cellules tumorales. Dans le cas des tumeurs neuroblastiques, le stroma contient plus
ou moins de cellules de Schwann. On distingue alors les tumeurs à stroma riche
(ganglioneuromes et ganglioblastomes) ou pauvre (neuroblastomes) en cellules de
Schwann (Figure 5).
27
Figure 5 : Histologie de coupes de tumeurs neuroblastiques (tiré de Maris et al., 2007). A : tumeur neuroblastique à stroma riche en cellules de Schwann (mises en évidence par les flèches). B : neuroblastome, caractérisé par des petites cellules rondes.
- le degré de maturation neuroblastique : tous les stades de la différenciation ganglionnaire
sympathique sont représentés dans les tumeurs neuroblastiques, qui sont divisées en trois
classes : indifférenciée, peu différenciée ou différenciée.
- l’index de mitose-caryorrhexis (MKI pour mitosis-karyorrhexis index), qui correspond au
nombre de cellules tumorales en mitose ou en caryorrhexis sur 5000 cellules tumorales.
On distingue alors les tumeurs de faible MKI (index < 2 %, ce qui équivaut à moins de
100 cellules en mitose et en caryorrhexis sur 5000 cellules), les tumeurs à MKI
intermédiaire (index entre 2 et 4), et les tumeurs à MKI fort (index > 4 %).
A ces critères histologiques s’ajoute l’âge au moment du diagnostic.
Ainsi, la classification de l’INPC, reprise dans la classification de l’INRG, permet de définir
trois types de tumeurs et de les classer en tumeur à histologie favorable ou non favorable :
- les ganglioneuromes sont des tumeurs au stroma riche en cellules de Schwann,
dépourvues de neuroblastes mais composées de quelques cellules ganglionnaires
sympathiques matures,
- les ganglioneuroblastomes présentent également un stroma riche en cellules de Schwann
et des neuroblastes peu ou pas différenciés,
28
- les neuroblastomes sont des tumeurs au stroma pauvre en cellules de Schwann. Le degré
de maturation neuroblastique est variable, tout comme le MKI. De ce fait, les
neuroblastomes peuvent présenter une histologie favorable ou non (Tableau IV), alors
que ganglioneuromes et ganglioneuroblastomes présentent une histologie favorable.
Stroma Age Neuroblastes MKI Groupe
Indifférenciés - Défavorable peu différenciés ou différenciés
Faible ou intermédiaire
Favorable
< 1,5 ans
- Fort Défavorable
Indifférenciés ou peu différenciés
- Défavorable
Différenciés Faible Favorable
1,5 à 5 ans
- Intermédiaire ou fort
Défavorable
Riche en cellules de Schwann
> 5 ans - - Défavorable Tableau IV : Evaluation pronostique des neuroblastomes selon l’ « International Neuroblastoma Pathology Commitee » (tiré de Burgues et al., 2006) - : quel que soit le stade de différenciation des neuroblastes ou le MKI
La relation entre le développement du stroma et l’état de différenciation des neuroblastes
s’explique par le fait que les neuroblastes sécrètent des facteurs mitotiques et chimiotactiques
qui permettent de recruter les cellules de Schwann présentes dans les tissus environnants non
néoplasiques. Une fois dans le tissu tumoral, les cellules de Schwann sécrètent des facteurs
anti-prolifératifs et différenciateurs nécessaires à la différenciation des neuroblastes (pour
revue, Shimada et al., 1999).
29
IV - Traitements et taux de survie
Les neuroblastomes localisés de stade 1 ou 2 et considérés comme ayant un risque faible sont
traités par exérèse de la tumeur. La chimiothérapie peut être appliquée lorsque la tumeur
induit une compression de la moelle épinière ou dans les neuroblastomes de stade 4S pour
lesquels les enfants présentent des problèmes respiratoires dus à une masse hépatique trop
volumineuse. Ces neuroblastomes présentent un taux de survie d’environ 95 % à 5 ans. Les
neuroblastomes localisés mais un peu plus invasifs (stade 3) sont tout d’abord traités par
chimiothérapie pour ensuite permettre l’ablation complète de la tumeur. Le taux de survie à 5
ans de ces patients présentant un neuroblastome de risque intermédiaire est de 75 %. Les
neuroblastomes présentant un risque fort, c’est-à-dire les formes métastasiques ayant des
caractéristiques défavorables comme l’amplification de l’oncogène MYCN, subissent un
protocole lourd, comportant successivement : une chimiothérapie d’induction intense, une
chirurgie de la tumeur associée à une radiothérapie, puis une chimiothérapie myéloablative
associée à une greffe de cellules souches hématopoïétiques. Enfin, un traitement de six mois
par l’acide rétinoïque est administré. Malgré ce traitement très lourd, le taux de survie de ces
patients n’est que de 30 % à 5 ans (pour revues, Tonini et Pistoia, 2006 ; Maris et al., 2007).
La majorité des neuroblastomes est chimiosensible. En effet, les chimiothérapies d’induction
provoquent en général une réponse partielle ou complète. Cependant, il existe des
neuroblastomes résistants à la chimiothérapie. Ce phénomène peut être dû à la surexpression
des gènes MRP1 (multidrug resistance-associated protein 1) ou MDR1 (multidrug resistance
1), codant des transporteurs de type ABC (ATP-binding cassette) qui permettent l’efflux des
drogues et par conséquent diminuent le temps d’exposition des cellules à ces drogues (pour
revues, Raguenez et al., 2001 ; Goldsmith et Hogarty, 2005). Afin d’améliorer la thérapie des
neuroblastomes, il est donc important de développer de nouvelles stratégies reposant sur des
30
mécanismes différents de ceux des substances chimiothérapeutiques actuelles afin d’éviter
l’apparition de résistances aux drogues, et de limiter le développement de tumeurs résiduelles.
V - Nouvelles stratégies thérapeutiques
Les nouvelles stratégies actuellement développées sont l’immunothérapie anti-tumorale, la
thérapie anti-angiogénique et l’utilisation d’agents différenciateurs.
1) Immunothérapie anti-tumorale
Le principe de l’immunothérapie anti-tumorale repose sur le fait que les cellules tumorales
expriment des antigènes qui leur sont spécifiques. Ceci est particulièrement vrai dans les
neuroblastomes, qui, du fait de leur origine embryonnaire, expriment des antigènes peu ou pas
exprimés par le tissu sain chez l’enfant. Parmi ces antigènes, le ganglioside GD2, fortement
exprimé à la surface des cellules de neuroblastome (Wu et al., 1986), est devenu une cible
privilégiée de l’immunothérapie. Il a en effet été montré que le traitement de cellules de
neuroblastome par un anticorps anti-GD2 induit la lyse des cellules tumorales (Barker et al.,
1991). Différents anticorps monoclonaux anti-GD2 ont été développés et utilisés lors d’essais
cliniques de phase I ou II. Cette stratégie donne des résultats encourageants pour la thérapie
des formes graves de neuroblastomes (Yu et al., 1998 ; Cheung et al., 1998, pour revue,
Rousseau et al., 2006). De plus, les effets de ces anticorps peuvent être améliorés par
l’administration conjointe du facteur de croissance des granulocytes (GM-CSF pour
granulocyte-macrophage colony stimulating factor) (Barker et Reisfeld, 1993 ; Kushner et al.,
2001), ou d’interleukine 2 (Frost et al., 1997).
Une autre forme d’immunothérapie anti-tumorale consiste à diriger le système immunitaire du
patient contre des antigènes spécifiquement exprimés à la surface des cellules tumorales, via
le système d’immunohistocompatibilité. Ainsi, en induisant in vitro la prolifération de
31
lymphocytes sensibilisés par un antigène donné puis en réinjectant ces cellules au patient, il
est possible de tuer spécifiquement les cellules tumorales présentant l’antigène. Cependant,
l’utilisation de cette technique est limitée dans les neuroblastomes par le fait que ces tumeurs
expriment faiblement les protéines HLA (human leucocyte antigen). L’administration
d’interféron-γ ou d’IL2 (interleukine 2) est alors nécessaire afin de stimuler l’expression des
marqueurs HLA à la surface des cellules tumorales (Lampson et al., 1983 ; Corrias et al.,
2001). Une autre approche permettant de contourner ce problème repose sur l’utilisation de
cellules dendritiques à la place des lymphocytes. En effet, en chargeant les cellules
dendritiques par un lysat de cellules de neuroblastome, il est possible de sensibiliser les
cellules dendritiques à l’ensemble des antigènes tumoraux (Valteau-Couanet et al., 2002).
Une étude clinique de phase I utilisant des cellules dendritiques pour générer des cellules T
cytotoxiques montre qu’elle n’induit pas de toxicité (Geiger et al., 2001). Plusieurs stratégies
sont testées afin de sensibiliser les cellules dendritiques. Par exemple, Morandi et al., (2006)
ont démontré que des cellules dendritiques chargées par les ARNm de cellules de
neuroblastome induisent la génération ex vivo de cellules T cytotoxiques capables de tuer
spécifiquement les cellules tumorales. La sensibilisation des cellules dendritiques par des
cellules de neuroblastome nécrosées est également efficace (Shilyansky et al., 2007).
2) Angiogénèse
L’angiogénèse permet la formation de nouveaux vaisseaux à partir de vaisseaux pré-existants.
Elle nécessite la libération par les cellules tumorales de facteurs de croissance qui vont
stimuler la prolifération de cellules endothéliales. De nombreuses études montrent que les
cellules de neuroblastome libèrent des facteurs pro-angiogéniques et sont capables d’induire
l’angiogénèse in vivo. De plus, la vascularisation est associée au mauvais pronostic et
l’expression de certains facteurs angiogéniques tels que le VEGF (vascular endothelial growth
32
factor) ou le PDGF-A (platelet-derived growth factor-A) est augmentée dans les
neuroblastomes de stades avancés (pour revue, Ribatti et al., 2002). L’angiogénèse constitue
donc une cible thérapeutique intéressante pour les neuroblastomes, d’autant plus qu’elle
nécessite l’intervention des cellules endothéliales qui ne sont pas touchées par l’apparition de
phénomène de résistance aux drogues chimiothérapeutiques, contrairement à certaines
cellules tumorales. Différentes approches ciblant la neutralisation de facteurs pro-
angiogéniques, l’inhibition de la prolifération des cellules endothéliales ou la destruction des
vaisseaux nouvellement formés donnent des résultats encourageants dans les neuroblastomes
(pour revue, Tonini et Pistoia, 2006). Récemment, il a été démontré que l’administration de
caplostatine, qui bloque l’angiogénèse en inhibant la perméabilité vasculaire, à des souris
transgéniques ayant développés des neuroblastomes palpables induit une diminution
importante de la masse tumorale, sans induire de toxicité (Chesler et al., 2007).
3) Thérapie de différenciation, exemple de l’acide rétinoïque
Les neuroblastomes sont les tumeurs présentant le plus grand nombre de ces de régression
spontanée. Certains neuroblastomes, même s’ils présentent des métastases, sont capables de
se différencier spontanément en une tumeur bénigne, le ganglioneurome. L’observation de ce
phénomène de différenciation a poussé les chercheurs à étudier ce mécanisme in vitro, grâce à
l’utilisation d’agents différenciateurs. Parmi ces molécules, on trouve les esters de phorbol, le
NGF ou l’acide rétinoïque. Le cas de ce dernier sera développé ici pour deux raisons : il est
déjà utilisé dans la thérapie de certains neuroblastomes et il a été utilisé dans les travaux
réalisés au cours de la présente thèse.
33
a) Biosynthèse de l’acide rétinoïque
L’acide rétinoïque est un dérivé du rétinol (également appelé vitamine A), une molécule
hydrophobe inactive provenant de l’alimentation. Le rétinol est stocké dans le foie sous forme
de rétinyl esters, qui peuvent ensuite être hydrolysés pour redonner le rétinol. Il est ensuite
transporté aux cellules cibles grâce aux CRBP (Cellular Retinol-Binding Proteins). Dans le
cytoplasme des cellules cibles, le rétinol est métabolisé en rétinal puis en acide rétinoïque
grâce à deux réactions d’oxydation successives. L’acide rétinoïque est ensuite converti en
dérivés inactifs (Figure 6), ou est pris en charge par les protéines CRABP (Cellular Retinoic
Acid-Binding Proteins), dont le rôle précis n’est pas encore bien connu. Cependant, il semble
que ces protéines puissent permettre de réguler la concentration cytoplasmique et nucléaire en
acide rétinoïque, ou transporter l’acide rétinoïque dans le noyau (pour revue, Napoli, 1999).
acide rétinoïque dérivés inactifs
oxydations
rétinol rétinal
rétinyl esters
hydrolyseestérification
acide rétinoïque dérivés inactifs
oxydations
rétinol rétinal
rétinyl esters
hydrolyseestérification
rétinol rétinal
rétinyl esters
hydrolyseestérification
Figure 6 : Biosynthèse de l’acide rétinoïque à partir du rétinol. Le rétinol, stocké dans le foie sous forme de rétinyl esters, est métabolisé en acide rétinoïque par des oxydations successives.
Il existe trois stéréo-isomères naturels de l’acide rétinoïque : le tout-trans-acide rétinoïque (at-
RA pour all-trans retinoic acid en anglais), le 9-cis-acide rétinoïque (9cis-RA) et le 13-cis-
acide rétinoïque (13cis-RA) (Figure 7). D’un point de vue thermodynamique, le 9cis-RA est
l’isoforme la plus instable, alors que l’at-RA, qui est le plus stable, représente la forme
majoritaire de l’acide rétinoïque à l’équilibre (pour revue, Armstrong et al., 2005).
34
Figure 7 : Structure des trois isomères naturels de l’acide rétinoïque (d’après Armstrong et al., 2005).
b) Récepteurs de l’acide rétinoïque
Les effets de l’acide rétinoïque sont médiés par deux familles de récepteurs nucléaires : les
RAR (Retinoic Acid Receptor) et les RXR (Retinoid X Receptor). Chaque famille est
constituée de trois membres (α, β, γ), codés par des gènes différents. Les RAR présentent une
haute affinité pour les isomères at-RA et 9cis-RA, alors que les RXR lient spécifiquement le
9cis-RA. Le 13cis-RA ne lie pas ces deux types de récepteurs pour lesquels il a une affinité
cent fois plus faible que l’at-RA et le 9cis-RA, mais il agit via son isomérisation en at-RA
(pour revue, Parisotto et al., 2006).
Ces récepteurs agissent comme des facteurs transcriptionnels, sous forme de dimères RAR-
RXR ou RXR-RXR. Les trois isoformes de RAR peuvent s’associer sans distinction aux trois
types de RXR, ce qui donne un grand nombre de combinaisons et par conséquent une
régulation fine de l’expression des gènes cibles de l’acide rétinoïque. Sur les gènes cibles, les
récepteurs se lient à un élément de réponse à l’acide rétinoïque, appelé RARE pour « retinoic
acid response element », dont la séquence est AGGTCA. Les hétérodimères RAR-RXR lient
deux de ces motifs répétés séparés de deux ou cinq paires de bases (DR2 (domain repeat 2) ou
DR5), alors que les homodimères RXR-RXR lient les motifs séparés par une paire de bases
(DR1) (Figure 8).
9cis-RA
at-RA 13cis-RA
35
2 ou 5 pbAGGTCA
RXR
AGGTCA
RAR
RARE
1 pbAGGTCA
RXR
RARE
AGGTCA
RXR
2 ou 5 pbAGGTCA
RXR
AGGTCA
RAR
RARE
2 ou 5 pbAGGTCA
RXR
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RAR
AGGTCA
RAR
RARE
1 pbAGGTCA
RXR
RARE
AGGTCA
RXR
1 pbAGGTCA
RXR
AGGTCA
RXR
RARE
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RXR
Figure 8 : Liaison des dimères de récepteurs de l’acide rétinoïque sur les RARE Les dimères de récepteurs RXR et/ou RAR se lient sur les séquences AGGTCA, qui peuvent être séparé par 1, 2 ou 5 pb.
En absence de ligand, les dimères interagissent avec des protéines co-répresseurs qui vont
permettre le recrutement de protéines à activité histone désacétylase, empêchant ainsi la
transcription. La liaison de l’acide rétinoïque sur son récepteur provoque un changement
conformationnel de ce dernier : le co-répresseur est alors libéré du complexe et remplacé par
un co-activateur. Cette protéine recrute une protéine à activité histone acétyltransférase, ce qui
permet la transcription (Figure 9) (pour revue, Reynolds et al., 2003).
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RAR
Co-rép
HD
–
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RARRA RA
Co-actHA
+
a : en absence de RA b : en présence de RA
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RAR
Co-rép
HD
–
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RARRA RA
Co-actHA
+
a : en absence de RA b : en présence de RA
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RAR
Co-rép
HD
–
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RAR
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RAR
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RAR
Co-rép
HD
–
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RARRA RA
Co-actHA
+
AGGTCA
RXR
AGGTCA
RARRA RA
Co-actHA
+
a : en absence de RA b : en présence de RA
Figure 9 : Activation des récepteurs de l’acide rétinoïque. RA : acide rétinoïque, Co-rép : co-répresseur, HD : protéine à activité histone désacétylase, Co-act : co-activateur, HA : protéine à activité histone acétyltransférase, – : inhibition de la transcription, + : activation de la transcription. En absence de ligand, les récepteurs de l’acide rétinoïque sont associés à des co-répresseurs et des protéines à activité histone désacétylase, empêchant ainsi la transcription des gènes. La fixation de l’acide rétinoïque sur ses récepteurs induit un changement de conformation de ces derniers, qui vont alors recruter des co-activateurs et des protéines à activité histone acétyltransférase, permettant ainsi la transcription.
36
Alors que les récepteurs RXRα, ß et γ semblent avoir des fonctions différentes au cours du
développement (pour revue, Germain et al., 2006), le rôle de ces trois récepteurs dans la
différenciation des neuroblastomes induite par l’acide rétinoïque n’est pas encore connu.
En ce qui concerne les RAR, davantage de données sont disponibles. RARα, ß et γ sont
exprimés dans les neuroblastomes, aussi bien dans les tumeurs que dans les lignées (Li et al.,
1994) et leur expression est stimulée par l’acide rétinoïque dans les cellules de
neuroblastomes (Chu et al., 2003). Chaque isoforme possède une fonction spécifique au cours
de la différenciation de cellules de neuroblastome induite par l’acide rétinoïque. En effet,
RARα jouerait un rôle important dans l’augmentation de l’expression de RARβ qui, lui, serait
impliqué dans l’inhibition de la croissance cellulaire induite par l’acide rétinoïque (Lovat et
al., 1997 ; Cheung et al., 1996). Le récepteur RARγ, quant à lui, serait plutôt associé au
processus apoptotique (Meister et al., 1998).
c) Effets de l’acide rétinoïque dans les cellules de neuroblastome
in vitro
In vitro, l’acide rétinoïque induit la différenciation de cellules de neuroblastome. Cette
différenciation se caractérise au niveau morphologique par la formation de pseudoganglions et
une neuritogénèse pouvant aller jusqu’à la mise en place d’un réseau neuritique (Siddel,
1982 ; Pence et Shorter, 1990 ; Lovat et al., 1997). Au niveau moléculaire, la différenciation
est caractérisée par l’augmentation de l’expression de la protéine GAP43 (Growth Associated
Protein 43), de marqueurs neuronaux (neurofilaments de haut poids moléculaire, tyrosine
hydroxylase TH), l’augmentation de l’activité de l’énolase spécifique des neurones (NSE pour
Neuron Specific Enolase ) (Morton et Buss, 1992 ; Chu et al., 2003 ; Pahlman et al., 1984).
L’acide rétinoïque induit également la diminution de l’expression de l’oncogène MYCN
(Thiele et al., 1985 ; 1988). Cependant, les trois isomères de l’acide rétinoïque n’ont pas tous
37
la même efficacité. En effet, le 13cis-RA est plus efficace que l’at-RA en ce qui concerne
l’induction de la différenciation morphologique (neuritogénèse et/ou pseudoganglions),
l’inhibition de la croissance et la diminution de l’expression de MYCN dans plusieurs lignées
de neuroblastome (Reynolds et al., 1994). Dans la lignée SH-SY5Y, le 9cis-RA induit une
neuritogénèse plus importante que l’at-RA (Lovat et al., 1997). La différenciation de cellules
de neuroblastome par l’acide rétinoïque fait intervenir différentes voies de signalisation. En
effet, l’activité du complexe transcriptionnel AP-1 (Activator Protein 1) est augmentée par
l’acide rétinoïque dans les cellules de neuroblastome N1E-115 (de Groot et Kruijer, 1991). De
plus, dans la lignée de neuroblastome humain SH-SY5Y, les kinases MAPK (mitogen-
activated protein kinase) et JNK sont nécessaires à la croissance neuritique induite par l’acide
rétinoïque (Sing et al., 2003 ; Yu et al., 2003), alors que la voie PI3K (phosphoinositil 3
kinase)-Akt est requise pour la diminution de l’expression des protéines Id (inhibitor of
differentiation), qui séquestrent des facteurs de transcription pro-neuraux (Lopez-Carballo et
al., 2002). Il a également été démontré que le traitement par l’acide rétinoïque régule le cycle
cellulaire via une augmentation du taux de la protéine p27 dans les cellules SMS-KCNR et
LA-N-5 (Matsuo et Thiele, 1998 ; Borriello et al., 2000).
in vivo
Les résultats prometteurs des études in vitro ont conduit à tester l’acide rétinoïque in
vivo. Des essais cliniques concernant le 13cis-RA avaient déjà été menés dans des pathologies
comme les leucémies, des syndromes myélodysplasiques (hémopathies clonales caractérisées
par un trouble de la maturation des précurseurs myéloïdes), les lymphomes cutanés à cellules
T et les carcinomes squameux de la peau de stade avancé. Lors des premiers essais cliniques
sur les neuroblastomes, le 13cis-RA fut administré en continu à une dose de 100 mg/m2 de
surface corporelle/jour, correspondant à la dose maximale tolérée chez les adultes
38
(Villablanca et al., 1995 ; Khan et al., 1996 ; Kohler et al., 2000). Cependant, ce dosage ne
permettait pas d’atteindre une concentration plasmatique équivalente à la concentration
nécessaire pour induire la différenciation in vitro (Reynolds et al., 1994). L’administration de
13cis-RA à haute dose (160 mg/m2/jour) de manière discontinue a alors été testée, cette dose
permettant d’atteindre une concentration plasmatique supérieure à celle utilisée pour les
études in vitro (Villablanca et al., 1995 ; Khan et al., 1996 ). Une étude menée sur des
patients atteints de neuroblastomes à risque de récurrence élevé a montré que l’administration
de 13cis-RA à haute dose de manière discontinue présente un intérêt clinique puisque cela
permet d’augmenter la survie de 20 % par rapport au groupe témoin (Matthay et al., 1999).
Le 13cis-RA présente une meilleure efficacité clinique que l’at-RA grâce à ses propriétés
pharmacocinétiques spécifiques (Tableau V). En effet, la dose maximale tolérée de 13cis-RA
est supérieure à celle de l’at-RA (160 mg/m2/ jour pour le 13cis-RA contre 90 mg/m2/jour
pour l’at-RA), ce qui permet d’atteindre des concentrations plasmatiques supérieures aux
concentrations induisant un effet in vitro. De plus, l’at-RA présente une demi-vie courte
(inférieure à 45 minutes) car il est rapidement métabolisé en dérivés inactifs, ce qui n’est pas
le cas du 13cis-RA, dont la demi-vie est par conséquent significativement plus longue (5
heures). De ce fait, l’exposition de l’organisme au 13cis-RA est plus durable (pour revue,
Reynolds et al., 2003).
Isomère Dose maximale tolérée (mg/m2/jour) Durée de vie
at-RA 90 < 45 mn
13cis-RA 160 5 h
Tableau V : Comparaison des propriétés pharmacocinétiques de deux isomères de l’acide rétinoïque, l’at-RA et le 13cis-RA.
Les essais cliniques menés sur l’acide rétinoïque ont conduit à une modification des
protocoles thérapeutiques : dans les cas de neuroblastomes métastatiques, la chimiothérapie
39
est suivie d’un traitement d’entretien de 6 mois par l’acide rétinoïque (pour revue, Raguénez
et al., 2001 ; Maris et al., 2007).
d) Rétinoïdes synthétiques
Les données cliniques indiquent que certains neuroblastomes sont insensibles à l’acide
rétinoïque ou le deviennent à la suite de la thérapie. Des rétinoïdes synthétiques comme le
fenretinide (Figure 10) capable d’agir sur les cellules de neuroblastomes résistantes au 13cis-
RA, sont à l’étude.
Figure 10 : Structure du rétinoïde synthétique fenretinide (tiré de Reynolds et al., 2003).
Le fenretinide, aussi appelé 4-HPR (N-(4-hydroxyphényl) rétinamide), inhibe la croissance
cellulaire en induisant l’apoptose via les RAR et une augmentation du taux de céramides, qui
sont de puissants inducteurs de l’apoptose (Ponzoni et al., 1995 ; Lovat et al., 2000 ; 2004).
De plus, le 4-HPR présente des effets anti-angiogéniques (Ribatti et al., 2001). Des essais
cliniques de phase I indiquent que chez des enfants atteints de neuroblastome, une dose
maximale administrée de 4000 mg/m2/jour permet d’atteindre une concentration plasmatique
comparable à celle induisant l’apoptose in vitro dans des cellules de neuroblastome
(Garaventa et al., 2003). Une autre particularité du 4-HPR est que, contrairement à l’acide
rétinoïque, il est capable d’augmenter le taux de ganglioside GD2 dans des cellules de
neuroblastome (Lovat et al., 2004). Ceci semble particulièrement intéressant dans
l’immunothérapie dirigé contre GD2.
40
De nombreux essais cliniques concernant ces nouvelles stratégies thérapeutiques
(immunothérapie, thérapie anti-angiogénèse ou thérapie de différenciation) sont actuellement
en cours. Celles-ci sont également testées en association avec les protocoles déjà lourds
utilisés dans le traitement des formes les plus graves de neuroblastomes
(http://clinicaltrials.gov/ct/show/NCT00026312).
41
2ème partie : Le système VIP - récepteurs
I - Les neuropeptides de la famille du VIP
1) Généralités
Les neuropeptides sont des molécules constituées d’un nombre restreint d’acides aminés,
libérées par les neurones dans les systèmes nerveux central et périphérique. Il existe une
grande variété de neuropeptides qui sont pour la plupart des messagers chimiques pouvant
agir comme des hormones, des neurotransmetteurs, des neuromodulateurs ou des facteurs de
croissance, en fonction de leur site d’action biologique. Ces molécules sont regroupées en
plusieurs familles selon leur homologie de séquence. Le VIP (vasoactive intestinal peptide)
appartient à une famille de neuropeptides qui regroupe entre autres le PACAP (pituitary
adenylate cyclase-activating polypeptide), le PHI/PHM (peptide having carboxyterminal
isoleucine/methionine), le PRP (PACAP-related peptide), le glucagon, la sécrétine.
Le VIP est un peptide de 28 acides aminés, initialement mis en évidence dans l’intestin grêle
de Porc grâce à ses propriétés vasodilatatrices (Said et Mutt, 1970). Le PACAP existe sous
deux formes. Une forme longue de 38 acides aminés (PACAP 38) a été identifiée à partir
d’extraits hypothalamiques ovins, en raison de sa capacité de stimuler la production
d’adénosine 3’5’-monophosphate cyclique (AMPc) (Miyata et al., 1989). Une forme plus
courte (PACAP 27) correspondant aux 27 acides aminés de la partie N-terminale du
PACAP 38 a été découverte par la suite (Miyata et al., 1990).
2) Biosynthèse des neuropeptides
a) Biosynthèse du VIP
Chez l’Homme, le gène codant le VIP est localisé en 6q24-q27 (Gozes et al., 1987). Ce gène
s’étend sur 9 kbp et comporte sept exons (Tsukada et al., 1985). Les exons 1, 6 et 7
correspondent à des régions non traduites. L’exon 3 code un peptide espaceur, dont la
42
fonction n’est pas connue, mais qui serait important pour le clivage du VIP. L’exon 2 code un
peptide signal alors que l’exon 5 code le VIP. Le quatrième exon code un peptide
biologiquement actif apparenté au VIP, nommé PHM chez l’Homme ou PHI chez les autres
espèces dans lesquelles il a été identifié (Linder et al., 1987 ; Yamagami et al., 1988).
La transcription du gène codant le VIP et le PHI/PHM est régulée par différentes voies.
Plusieurs boîtes TATA ont été identifiées sur le promoteur du gène (Yamagami et al., 1988 ;
Sena et al., 1994), ainsi que trois sites de polyadénylation dans la région 3’ non traduite
(Chew et al., 1994 ; Wolford et Signs, 1995). Le promoteur contient également de
nombreuses régions régulatrices :
- un élément de réponse à l’AMPc (CRE pour cAMP response element), qui est également
sensible aux esters de phorbol 12-O-tétra-décanoylphorbol 13-acétate (TPA) et phorbo-
12-myristate-13-acétate (PMA) (Yamagami et al., 1988),
- un élément responsable de l’expression spécifique dans le type tissulaire concerné
(Tolentino et al., 1995),
- un élément de réponse aux cytokines (CyRE) par l’intermédiaire duquel les cytokines LIF
(leukemia inhibitory factor), CNTF (ciliary neurotrophic factor) et oncostatine-M peuvent
réguler l’expression du gène du VIP. Cet élément comporte plusieurs sites comme STAT,
et AP-1, un site de liaison pour les facteurs de transcription C/EBP et une séquence de 8
bp qui régulent la transcription du gène VIP (Symes et al., 1994, 1995, 1997),
- un élément de réponse au TPA (TRE pour TPA response element) et PMA (Waschek et
al., 1988),
- un élément répresseur de type 1 (RE-1) (Lee et al., 2006).
La transcription du gène VIP-PHI/M permet d’obtenir un transcrit primaire qui, chez certaines
espèces et dans certains types cellulaires, peut subir un épissage alternatif. Ainsi, chez le
43
Poulet, deux ARNm sont obtenus, permettant l’expression du VIP seul ou du VIP et du PHI
(Talbot et al., 1995). Dans l’hypothalamus de Dinde, l’épissage alternatif génère deux
transcrits : l’un codant pour le VIP, l’autre pour le VIP et le PHV (peptide histidine valine),
une forme allongée du PHI (Yiangou, 1987 ; You et al., 1995). Chez le Poisson rouge
(Carassius auratus), deux transcrits ont également été identifiés, donnant lieu au VIP et au
PHI ou au PHI seul (Tse et al., 2002). Chez les Mammifères, aucun mécanisme d’épissage
alternatif n’a été mis en évidence, ce qui suggère que le VIP et le PHI/PHM seraient
synthétisés et libérés ensemble (Linder et al., 1987).
L’expression du gène VIP-PHI/PHM conduit à la synthèse d’un prépropeptide de 20 kDa
(Itoh et al., 1983). Un clivage protéolytique de ce prépropeptide par la signal peptidase
aboutit à la formation d’un propeptide de 17,5 kDa, dépourvu du peptide signal. Les peptides
matures VIP et PHI/PHM sont générés à partir de ce propeptide sous l’action de clivages
protéolytiques par des convertases, une carboxypeptidase et d’une amidation de leur extrémité
C-terminale (Farhenkrug, 1991) (Figure 10).
b) Biosynthèse du PACAP
Chez l’Homme, le gène codant le PACAP est localisé sur le chromosome 18, au niveau du
locus p11 (Hosoya et al., 1992 ;Okhubo et al., 1992). Ce gène s’étend sur 6,6 kbp et comporte
5 exons. La structure de ce gène est similaire à celle du gène codant le VIP (Figure 11). En
effet, l’exon 1 ainsi que la partie 3’ de l’exon 5 correspondent à des régions non traduites,
alors que les exons 2, 3 et 5 codent respectivement le peptide signal, le peptide espaceur et le
PACAP. L’exon 4 quant à lui code le PRP, un autre peptide de la même famille (pour revue,
Sherwood et al., 2000).
44
Gène humain codant le PACAP et le PRP
Gène humain codant le VIP et le PHM
5’ 3’PS PRP PACAP
5’ 3’PS PHM VIP
ADN
Transcription, Epissage, Traduction
PrépropeptidePS PRP PACAP
PS PHM VIP
PréproPACAP humain
PréproVIP humain
N-term C-term
Clivages protéolytiques, Carboxypeptidation, Amidation
Clivage du peptide signal
N-term
PRP PACAP
PHM VIP
C-term
ProPACAP humain
ProVIP humain
Propeptide
PRP PACAP
PHM VIP
Neuropeptide
Gène humain codant le PACAP et le PRP
Gène humain codant le VIP et le PHM
5’ 3’PS PRP PACAP
5’ 3’PS PHM VIP
Gène humain codant le PACAP et le PRP
Gène humain codant le VIP et le PHM
5’ 3’PS PRP PACAP 5’ 3’PS PRP PACAP
5’ 3’PS PHM VIP 5’ 3’PS PHM VIP
ADN
Transcription, Epissage, Traduction
Transcription, Epissage, Traduction
PrépropeptidePS PRP PACAP
PS PHM VIP
PréproPACAP humain
PréproVIP humain
N-term C-term
PS PRP PACAP PS PRP PACAP
PS PHM VIP PS PHM VIP
PréproPACAP humain
PréproVIP humain
N-term C-term
Clivages protéolytiques, Carboxypeptidation, Amidation
Clivages protéolytiques, Carboxypeptidation, Amidation
Clivage du peptide signalClivage du peptide signal
N-term
PRP PACAP
PHM VIP
C-term
ProPACAP humain
ProVIP humain
Propeptide N-term
PRP PACAP PRP PACAP
PHM VIP PHM VIP
C-term
ProPACAP humain
ProVIP humain
Propeptide
PRP PACAP
PHM VIP
NeuropeptidePRP PACAP
PHM VIP
PRPPRP PACAP PACAP
PHM PHM VIP VIP
Neuropeptide
Figure 11 : Biosynthèse des neuropeptides VIP, PHM, PACAP et PRP chez les Mammifères.
45
Le promoteur du gène codant le PACAP comporte plusieurs sites d’initiation de la
transcription ainsi que différents sites de polyadénylation (Yamamoto et al., 1998 ; Miyata et
al., 2000). Le promoteur contient également plusieurs régions régulatrices, parmi lesquelles :
deux éléments de réponse à l’AMPc, un élément de réponse au TPA, deux sites de liaison
pour le GHF-1 (Growth hormone factor-1), facteur régulant l’expression tissu-spécifique de
l’hormone de croissance, un domaine riche en CT précédé d’une boîte GC reconnue par le
facteur de transcription Sp1 (Bodner et al, 1988 ; Dolle et al, 1990 ; Castrillo et al, 1991 ;
Hosoya et al, 1992 ; Suzuki et al, 1994a ; Hashimoto et al, 2000).
Plusieurs transcrits alternatifs du PACAP ont été identifiés chez les Vertébrés : un transcrit
long codant le PACAP et le PRP, et un transcrit plus court codant uniquement le PACAP
(Parker et al., 1993 ; McRory et al., 1995 ; Parker et al., 1997 ; McRory et al., 1997). Chez le
Poisson zèbre (Danio rerio), un autre transcrit alternatif dépourvu de l’exon 3 a été identifié
(Krueckl et al., 2003).
L’ARNm du PACAP-PRP subit un mécanisme de maturation similaire à celui du VIP (Figure
11), qui aboutit à la formation d’un prépropeptide, le préproPACAP de 19,5 kDa (Ogi et al.,
1990 ; Hosoya et al., 1992 ; Okhubo et al., 1992). Des clivages par des convertases, des
carboxypeptidases et par la protéase PAM (peptidylglycine amidating monooxygenase)
conduisent à la formation du PACAP et du PRP. Le PACAP 27 est ensuite généré par
protéolyse du PACAP 38 au niveau de résidus basiques suivie d’une amidation (Miyata et al.,
1990).
c) Dégradation des neuropeptides
Les neuropeptides sont des molécules peu stables. Par exemple, chez l’Homme, le VIP
administré par voie intraveineuse, a une demi-vie très coute d’environ une minute (Domschke
et al, 1978). Cela est dû au fait que ces peptides sont rapidement dégradés par des peptidases
46
situées à la surface des cellules, en particulier dans le tissu hépatique (pour revue, Grady et
al., 1997).
II - Les récepteurs du VIP et du PACAP
1) Structure des récepteurs
Les récepteurs du VIP et du PACAP appartiennent à la famille des récepteurs à sept domaines
transmembranaires couplés aux protéines G et ont une organisation structurale comparable,
caractérisée par :
- sept domaines transmembranaires, notés TM1 à TM7 (sauf pour certains variants à 5
TM), reliés entre eux par trois boucles extracellulaires (EC1 à EC3) et trois boucles
intracellulaires (IC1 à IC3), la boucle IC3 étant plus longue que les autres,
- un long domaine N-terminal extracellulaire (> 120 résidus) impliqué dans la liaison avec
le ligand,
- une extrémité C-terminale intracellulaire (Figure 12).
Membraneplasmique
cytoplasme
COOH-terminal
NH2-terminal
TM7TM6TM4TM3TM2TM1 TM5
IC1 IC2
IC3
EC3
EC2
EC1
Membraneplasmique
cytoplasme
COOH-terminal
NH2-terminalNH2-terminal
TM7TM6TM4TM3TM2TM1 TM5
IC1 IC2
IC3
EC3
EC2
EC1
Figure 12 : Structure d’un récepteur à 7 domaines transmembranaires. TM : domaine transmembranaire, EC : boucle extracellulaire, IC : boucle intracellulaire.
Le domaine N-terminal comporte six résidus cystéines conservés et des sites de
N-glycosylation qui jouent un rôle important pour la conformation du récepteur et
l’interaction avec le ligand. Suite à la fixation du ligand, des voies de signalisation sont
47
déclenchées via les protéines G liées à la boucle IC3 et à l’extrémité C-terminale (pour revue,
Laburthe et al., 2002).
2) Nomenclature des récepteurs du VIP et du PACAP
Depuis l’identification de ces récepteurs, leur nomenclature n’a cessé d’évoluer (Tableau VI).
Le premier récepteur identifié appelé récepteur du VIP « classique » présente une haute
affinité pour le VIP et le PACAP (Laburthe et al., 1983). Un second récepteur du VIP a été
nommé « helodermin-preferring » car il lie aussi bien le VIP que l’hélodermine, un peptide
extrait du venin d’un Reptile apparenté aux neuropeptides de la famille du VIP (Robberecht et
al., 1989 ; Luis et Said, 1990). Cette découverte a abouti à la mise en place d’une nouvelle
dénomination de ces récepteurs : on distingue alors le récepteur VIP1, anciennement récepteur
VIP « classique » et le récepteur VIP2, qui correspond au récepteur « helodermin-preferring »
(Lutz et al., 1993). En 1991, un récepteur dit « PACAP-preferring » est identifié. Ce récepteur
présente une haute affinité pour le PACAP et une affinité très faible pour le VIP (Shivers et
al., 1991). Par la suite, il a été montré que le PACAP est aussi efficace que le VIP pour lier les
récepteurs VIP1 et VIP2. C’est pour cela qu’une nouvelle classification est mise en place en
1994. Les récepteurs sont alors renommés : récepteur PACAP type I pour le récepteur
« PACAP-preferring », récepteur PACAP type II pour le récepteur VIP1 et récepteur PACAP
type III pour le récepteur VIP2 (Ciccarelli et al., 1994). Cette nomenclature a été rapidement
modifiée pour faire apparaître le nom du VIP. Les récepteurs PACAP type I, II et III
deviennent alors respectivement les récepteurs PACAP/VIP de type 1 (PVR1), 2 (PVR2) et 3
(PVR3) (Rawlings et al., 1995). En 1998, l’Union Internationale de Pharmacologie met en
place une nouvelle nomenclature, qui est toujours utilisée aujourd’hui. On distingue
actuellement :
48
- le récepteur PAC1, anciennement récepteur PVR1, qui lie le PACAP avec une haute
affinité et le VIP avec une très faible affinité,
- le récepteur VPAC1, anciennement récepteur PVR2, qui présente une haute affinité pour
le VIP et le PACAP,
- le récepteur VPAC2, anciennement récepteur PVR3, identifié à l’origine comme liant le
VIP et l’hélodermine (Harmar et al., 1998).
Nomenclature initilale 1993 1994 1995 Nomenclature
actuelle
PACAP-preferring PACAP type I PACAP/VIP de type 1 (PVR1)
PAC1
VIP « classique » VIP1 PACAP type II PACAP/VIP de type 2 (PVR2)
VPAC1
Helodermin-preferring VIP2 PACAP type III PACAP/VIP de type 3 (PVR3)
VPAC2
Tableau VI : Evolution de la nomenclature des récepteurs du VIP et du PACAP (Harmar et al., 1998).
3) PAC1
Chez l’Homme le gène codant le récepteur PAC1 est situé en 7p15-14 (Brabet et al., 1996). Il
est composé de 18 exons, avec un cadre de lecture ouvert entre les exons 2 et 18. Les exons 3
à 8 et 13 à 16 codent respectivement pour la partie N-terminale et la boucle IC3. Un épissage
alternatif de ces deux régions donne lieu à de nombreuses isoformes des récepteurs PAC1,
tout d’abord identifiées chez le Rat. Pour cette espèce, en plus de la forme courte PAC1s
(pour « short »), des variants sont générés par l’insertion d’une cassette de 27 acides aminés
(variant PAC1hop2) ou de 28 acides aminés (variants PAC1hip ou PAC1hop2) au niveau de
la boucle IC3. Ces cassettes peuvent être associées et ainsi générées les variants PAC1hip-
hop1 et PAC1hip-hop2 (Spengler et al., 1993). L’isoforme PAC1TM4 présente des
substitutions et des délétions entraînant des modifications au niveau des TM2 et TM4
49
(Chatterjee et al., 1996). Un autre variant, nommé PAC1vs (pour « very short »), est généré
par la délétion des exons 5 et 6 (Pantaloni et al., 1996 ; Dautzenberg et al., 1999). Ces
variants identifiés chez le Rat ne sont pas tous retrouvées chez l’Homme. En effet, seules les
isoformes PAC1s, hip, hop1, hip-hop1 et vs ont été également identifiés chez l’Homme, où
elles sont nommées respectivement null, SV1, SV2, SV3 et VS (pour revue, Vaudry et al.,
2000). En 2006, dix nouvelles isoformes des récepteurs PAC1 présentant à la fois des
délétions au niveau des exons 4, 5 et 6 codant l’extrémité N-terminale, ainsi que les insertions
dans la région codant la boucle IC3 ont été identifiées dans des cellules de neuroblastome
(Lutz et al., 2006).
La différence d’affinité des récepteurs PAC1 pour le PACAP 38 et le PACAP 27 a conduit à
diviser cette classe de récepteurs en deux sous-types. Les récepteurs de type 1A
(correspondant aux variants humains null et SV2) présentent une haute affinité pour le
PACAP 38 et le PACAP 27 de l’ordre du nanomolaire, alors que les récepteurs de type 1B
(correspondant aux isoformes SV1, SV2 et VS) présentent une affinité 100 fois plus grande
pour le PACAP 38 que pour le PACAP 27 (Robberecht et al., 1991 ; Shivers et al., 1991). Les
récepteurs PAC1 ont été identifiés comme étant spécifiques du PACAP, puisqu’ils n’étaient
pas capables de lier le VIP à des concentrations physiologiques. Cependant, les travaux de
Lutz et al. ont conduit à l’identification de nouveaux variants des récepteurs PAC1 capables
de lier le VIP avec une affinité assez importante d’environ 30 nM, comme par exemple le
variant PAC1delta5,6 (Lutz et al., 2006).
4) VPAC1 et VPAC2
Chez l’Homme, le gène codant le récepteur VPAC1 est localisé en 3p22 (Sreedharan et al.,
1995), alors que le gène codant le récepteur VPAC2 est situé en 7q36.3 (Mackay et al., 1996).
50
Les profils pharmacologiques de ces deux récepteurs diffèrent surtout au niveau de leur
affinité pour l’hélodermine, le récepteur VPAC2 ayant été identifié à l’origine comme liant
fortement le VIP et l’hélodermine (Tableau VII) (Couvineau et al., 1994 ; Svoboda et al.,
1994 ; Adamou et al., 1995 ; Gaudin et al., 1996) :
Récepteurs Ligands et IC50
VIP = PACAP 27 > PACAP 38 > hélodermine > PHM VPAC1
IC50 = 1 nM IC50 = 6,8 nM IC50 = 46 nM IC50 = 2 µM
VIP = PACAP 38 > hélodermine > PACAP 27 VPAC2
IC50 = 0,8 nM IC50 = 2,5 nM IC50 = 3 nM
Tableau VII : Profil pharmacologique des récepteurs VPAC1 et VPAC2 humains déterminé par liaison de VIP radiomarqué avec l’isotope 125 de l’iode. L’IC50 correspond à la concentration de ligand non radiomarqué inhibant 50 % de la liaison du radiotraceur et traduit l’affinité du ligand pour son récepteur.
Des isoformes des récepteurs VPAC1 et VPAC2 ont récemment été identifiées. Le variant
VPAC2de367-380, présentant une délétion des 14 derniers acides aminés du TM7 a été
identifié dans des lymphocytes de Souris (Grinninger et al., 2004). L’analyse de la séquence
prédit que ce récepteur ne présenterait que 6 TM. Lorsque ce récepteur tronqué est exprimé
dans la lignée de lymphocytes T Jurkat, sa capacité à lier le VIP est la même que celle du
VPAC2 sauvage, mais ce variant n’induit ni la production d’AMPc, ni la migration des
cellules. Cependant, dans des lymphocytes Th2, le VIP, par le biais du variant
VPAC2de367-380 induit la diminution de la sécrétion de l’interleukine 4, contrairement au
récepteur sauvage (Huang et al., 2006). Un autre variant du récepteur VPAC2 a été identifié
dans des lymphocytes humains. Il s’agit du récepteur VPAC2de325-438(i325-334),
présentant une délétion de 114 acides aminés situés au niveau de la boucle IC3 du VPAC2
sauvage, et ayant seulement 5 TM (Miller et al., 2006). Cette délétion provoque une
diminution de l’affinité du VIP pour ce récepteur, une diminution de la transduction du signal
51
ainsi qu’une diminution de la dégradation du récepteur après stimulation. D’autres isoformes
des récepteurs VPAC1 et VPAC2 à 5 TM ont été identifiées (Bokaei et al., 2006). Elles
résultent de la perte des exons 10, 11 et 12 qui codent pour la boucle IC3, le TM6, la boucle
EC3 et le TM7. Ces récepteurs sont incapables de stimuler la production d’AMPc, mais ils
permettent l’activation de protéines tyrosines kinases, par un mécanisme qui semble donc
indépendant des protéines G. Cette capacité à activer des effecteurs différents de celui des
récepteurs VPAC1 et VPAC2 sauvages et leur profil d’expression particulier laissent penser
que ces isoformes à 5 TM ont un rôle physiologique distinct.
5) Distribution des récepteurs PAC1, VPAC1 et VPAC2
Ces récepteurs sont généralement exprimés dans les mêmes tissus que leurs ligands, ce qui
suggère une action autocrine ou paracrine de ces peptides. Ces différents récepteurs sont très
largement présents dans l’organisme, cependant, leur abondance relative diffère. Par exemple,
le récepteur PAC1 est plus abondant dans le système nerveux central et périphérique, alors
que les récepteurs VPAC sont majoritaires dans les systèmes respiratoire, cardio-vasculaire,
digestif et urogénital (pour revue, Vaudry et al., 2000).
6) Principales voies de signalisation
Les récepteurs des peptides de la famille du VIP peuvent être couplés à différentes protéines
G, selon les tissus, et donc induire plusieurs voies de signalisation (Figure 13). La voie la plus
couramment décrite pour le VIP fait intervenir l’AMPc comme second messager, via la
protéine Gs et l’adénylyl cyclase (AC). La production de l’AMPc est stimulée par les
récepteurs VPAC1, VPAC2 et PAC1, à l’exception de l’isoforme PAC1TM4. La voie de la
phopholipase C (PLC) peut également être stimulée grâce au couplage des récepteurs avec la
protéine Gq, et ainsi conduire à l’augmentation de la concentration intracellulaire en Ca2+
52
AC PLC
AMPc
IP3
Ca2+
PKA PKC
DAG
MEK
Erk1/2
prolifération ou différenciation
Gs
Récepteur
Gq
Récepteur
αs αq
VIP, PACAP
AC PLC
AMPc
IP3
Ca2+
PKA PKC
DAG
MEK
Erk1/2
prolifération ou différenciation
Gs
Récepteur
Gs
Récepteur
Gq
Récepteur
Gq
Récepteur
αsαs αqαq
VIP, PACAP
Figure 13 : Activation de la voie des MAPK par les neuropeptides de la famille du VIP via les protéines Gs et Gq. AC : adénylyl cyclase, PLC : phospholipase C, DAG : diacylglycérol, IP3 : inositol triphosphate, PKA : protéine kinase dépendante de l’AMPc, PKC : protéine kinase dépendante du Ca2+.
(pour revue, Vaudry et al., 2000). Ces deux voies de transduction du signal aboutissent
généralement à l’activation de la voie des protéines kinases activées par des agents mitogènes
(MAPK pour mitogen-activated protein kinase), via la protéine kinase dépendante de l’AMPc
(PKA) ou la protéine kinase dépendante du Ca2+ (PKC). Cette voie est particulièrement
impliquée dans le contrôle de la prolifération ou de la différenciation par les neuropeptides.
Par exemple, les Erk1/2 (extracellular-regulated kinases) sont activées lors de la prolifération
53
des cellules somatolactotropes GH4C1 (Le Péchon-Vallée et al., 2000), des cellules de
carcinomes pancréatiques AR4-2J (Schäfer et al., 1996) ou des cellules de neuroblastome
murin Neuro2A (Lelièvre et al., 1998). Cette voie est également impliquée dans la
différenciation ou la survie induite par le PACAP dans les cellules de phéochromocytome de
rat PC12 (Barrie et al., 1997).
D’autres voies de signalisation peuvent également être stimulées par les neuropeptides. Dans
les cellules de cancer colique humain HT-29, la stimulation de la prolifération induite par le
VIP implique l’activation des MAPK, par le biais de la petite protéine G Ras et de la kinase
B-Raf (Alleaume et al., 2003). Les récepteurs peuvent aussi activer la phospholipase D par
l’intermédiaire de la petite protéine G ARF (ADP ribosylation factor) dans des cellules CHO
transfectées par ces récepteurs (McCulloch et al., 2000). Dans les cellules musculaires
gastriques, les récepteurs du VIP et du PACAP sont couplés à une protéine Gi-2 qui active une
NO synthase (Murthy et Makhlouf , 1994). L’augmentation du taux de monoxyde d’azote
stimule la production de GMPc via l’activation de la guanylyl cyclase (Grider et al., 1992 ;
Murthy et al., 1993). Dans les cellules PC12 et dans des cultures primaires de neurones de
l’hippocampe, le PACAP induit l’activation des récepteurs TrkA et TrkB respectivement,
indépendamment des PKA et PKC. Il semble cependant que cette activation soit liée à une
autre kinase dépendante du Ca2+, car elle dépend d’une mobilisation de Ca2+ (Lee et al.,
2002).
7) Récepteurs du PHI insensibles au GTP
Des sites de liaison de haute affinité pour le PHI ou le PHM, ainsi que des sites polyvalents
pour le VIP et le PHM, ont été mis en évidence dans différents modèles, notamment dans le
foie de Rat (Paul et al., 1987) ou des cellules de neuroblastome murin Neuro2A (Lelièvre et
al., 1998). Or, à ce jour, aucun récepteur spécifique du PHI/PHM n’a été identifié chez les
54
Mammifères, alors que chez le Poisson rouge, un récepteur spécifique du PHI/PHV (forme
plus longue du PHI synthétisée à partir du même précurseur) a été identifié (Tse et al., 2002).
Chez les Mammifères, il a été démontré que la majorité des sites de liaison du PHI/PHM est
insensible au GTP (guanosine triphosphate). L’expression de ces sites insensibles au GTP
évolue au cours du développement. Par exemple, tous les sites de liaisons du PHI sont
insensibles au GTP (guanosine triphosphate) dans le foie de rat nouveau-né, alors qu’ils ne
représentent plus que 30 % des sites dans le foie adulte (Debaigt et al., 2006). Ces sites
pourraient correspondre à des récepteurs VPAC2 dont l’affinité et le couplage pourraient être
modifiés par des protéines accessoires telles que RAMP2 (receptor activity-modifying protein
2) (pour revue, Muller et al., 2007).
III - Fonctions des neuropeptides VIP et PACAP
1) Principales fonctions des neuropeptides
La distribution du VIP, du PACAP et du PHM est très étendue dans l’organisme. Ils sont
localisés dans les systèmes nerveux, respiratoire, cardio-vasculaire, gastro-intestinal,
urogénital, immunitaire ainsi que dans les glandes endocrines et exocrines. La large
distribution des neuropeptides au sein de l’organisme reflète leur implication dans la
régulation de diverses fonctions physiologiques (pour revues, Sherwood et al., 2000 ;
Gonzales-Rey et al., 2007) telles que :
- la relaxation de la musculature lisse vasculaire et non vasculaire,
- la stimulation des sécrétions endocrines et exocrines et la libération de nombreuses autres
molécules informationnelles,
- le contrôle de la prolifération et/ou de la différenciation,
- la régulation du métabolisme,
- la modulation de l’inflammation,
55
- d’autres actions affectant le comportement.
2) Contrôle de la prolifération et/ou de la différenciation
Le VIP et ses analogues sont impliqués dans le contrôle de la prolifération et de la
différenciation cellulaires, notamment au cours de l’embryogénèse, du développement du
système nerveux et de la tumorigénèse. Ce rôle des neuropeptides est particulièrement
développé ci-dessous, car il est en rapport direct avec les travaux réalisés au cours de ce stage
doctoral.
a) Rôle dans le développement de l’embryon
Le rôle du VIP et du PACAP dans le développement a été étudié dans des embryons de
rongeurs. Un traitement par le VIP stimule la croissance d’embryons de souris explantés. Cela
se manifeste par un accroissement du volume de ces embryons, une augmentation du nombre
de somites (maturation), du contenu en ADN et du nombre de cellules en mitose (Gressens et
al., 1993). A l’opposé, l’administration d’un antagoniste du VIP par voie intrapéritonéale chez
des souris gestantes entre le neuvième et le onzième jour de vie embryonnaire (E9 et E11)
entraîne un retard de croissance et une sévère microcéphalie des nouveaux-nés. Administré à
des stades plus tardifs de la gestation, cet antagoniste n’a pas d’effet (Gressens et al., 1994).
Dans des embryons de rat, un pic d’expression du VIP et de ses récepteurs est observé à E11
alors que l’ARNm du VIP n’est détecté ni par hybridation in situ, ni par RT-PCR. Cependant,
le taux sanguin maternel de VIP est 6 à 10 fois supérieur à la normale (Hill et al.,
1994 ;1996). Ces données suggèrent que le VIP d’origine maternelle, de même que
l’antagoniste du VIP, peut traverser la barrière placentaire et participer ainsi à la croissance
embryonnaire (Spong et al., 1999). Le VIP maternel semble également jouer un rôle
important chez la Souris. En effet, avant le développement du placenta, le VIP n’est pas
56
exprimé par l’embryon (Spong et al., 1999), mais ce peptide est fortement détecté dans les
lymphocytes maternels apportés à l’embryon par le trophoblaste (Bulmer et Sunderland,
1984 ; Heyborne et al., 1992 ; Mincheva-Nilsson et al., 1994).
b) Rôle dans le développement et le fonctionnement du système nerveux
Dans le système nerveux central, le VIP induit la prolifération de nombreux types cellulaires.
Le PACAP et ses récepteurs sont présents dans le système nerveux embryonnaire de la Souris
dès E9,5. Cela indique que le PACAP est impliqué dans le développement neuronal (Sheward
et al., 1998). D’une manière générale, le PACAP est faiblement exprimé dans les embryons
de rat ou de souris, puis son expression augmente après la naissance, ce qui suggère que ce
peptide participe probablement à l’ontogénèse et en particulier à la neurogénèse (Basille et al.,
2000). En effet, dans le cervelet de rat, le PACAP est exprimé entre le quatrième et le
vingtième jour post-natal (P4 et P20), période qui correspond à une neurogénèse intense
(Basille et al., 1993 ; 1994). De plus, l’expression du PACAP est maximale à P20, période où
la formation de la myéline et des jonctions synaptiques est optimale (Aghajanian et Bloom,
1967 ; Norton et Poduslo, 1973).
Il a également été mis en évidence que le VIP et le PACAP peuvent réguler la prolifération et
la différenciation de cellules souches. Dans des cellules souches embryonnaires de souris, ces
deux peptides induisent une différenciation vers un phénotype neuronal. Ce phénomène
s’accompagne d’un changement de profils d’expression des récepteurs : les récepteurs PAC1
et VPAC2 sont présents dans les cellules souches embryonnaires alors que les cellules
différenciées expriment les récepteurs VPAC1 (Cazillis et al., 2004). Le PACAP stimule la
prolifération de cellules souches neurales et induit leur différenciation en astrocytes via les
récepteurs PAC1 (Mercer et al., 2004 ; Ohno et al., 2005 ; Nishimoto et al., 2007).
57
De plus, le VIP et le PACAP régulent la prolifération des astrocytes. Par exemple, le VIP, à
des concentrations sub-nanomolaires, stimule la prolifération d’astrocytes (Brenneman et al.,
1992). Les effets du PACAP sont plus complexes. En effet, à des doses inférieures au
nanomolaire, il stimule la prolifération astrocytaire, alors qu’à des concentrations supérieures,
il l’inhibe (Moroo et al., 1998 ; Hashimoto et al., 2003 ; Meyer et al., 2005). L’implication de
ces peptides dans l’astrocytogénèse néocorticale a été démontrée in vivo. L’administration
d’un antagoniste du VIP à des souris gestante à E17 induit une déplétion des astrocytes de la
couche supérieure du néocortex chez les souriceaux. Cet effet peut être inversé par
l’administration de VIP ou de PACAP (Zupan et al., 1998).
Le VIP et le PACAP sont également impliqués dans le développement du système
sympathique dérivant des cellules de la crête neurale. Ces rôles sont détaillés ici car les
neuroblastomes dérivent de ce système. La différenciation sympatho-adrénergique des
cellules de la crête neurale en neurones du système sympathique ou en cellules chromaffines
de la médullosurrénale ainsi que le maintien du phénotype catécholaminergique impliquent de
nombreux facteurs dont le VIP et le PACAP. Ce dernier est décelé dans les neurones
sympathiques pré et post-ganglionnaires dans de nombreuses espèces chez l’embryon et chez
l’adulte ainsi que dans les fibres nerveuses de la glande médullosurrénale et dans les cellules
chromaffines (pour revue, Ghzili et al., 2008).
Neuropeptides et neurones sympathiques
Le PACAP est détecté chez le Rat (nouveau-né et adulte) notamment au niveau des neurones
du ganglion cervical supérieur (Brandenburg et al., 1997). Le VIP stimule la prolifération des
neuroblastes sympathiques (Pincus et al., 1990, 1994 ; Lu et al., 1996) et le PACAP stimule
la prolifération et la survie des neurones sympathiques (DiCicco-Bloom et al., 2000 ; Nicot et
DiCicco-Bloom, 2001). Le PACAP peut également induire la différenciation neuronale en
58
stimulant la pousse neuritique et l’expression des récepteurs aux neurotrophines TrkA et TrkC
(DiCicco-Bloom et al., 2000) et il participe au contrôle de la morphologie des neurones
sympathiques en inhibant la croissance dendritique induites par les BMP (bone morphogenic
proteins), selon un mécanisme dépendant de l’AMPc (Drahushuk et al., 2002). Le PACAP
semble également jouer un rôle dans le développement synaptique, en augmentant
l’expression de la protéine Homer 1a, impliquée dans la synaptogénèse, par un mécanisme
dépendant des voies AMPc/PKA et MEK/ERK déclenchées par les récepteurs PAC1 (Girard
et al., 2004). Le PACAP régule aussi l’excitabilité électrique des neurones sympathiques et
induit leur dépolarisation en stimulant l’entrée de Na+ et en inhibant le courant potassique, via
la PLC et l’IP3 (Beaudet et al., 2000). De plus, la dépolarisation de ces neurones stimule la
libération du PACAP (Brandenburg et al., 1997). Le PACAP stimule la libération de diverses
molécules comme le VIP ou les catécholamines (May et Braas, 1995). Par exemple, chez le
rat, des injections de PACAP provoquent la libération de noradrénaline par les fibres
sympathiques cardiaques, induisant alors une tachycardie (Whalen et al., 1999). Des études
réalisées dans des souris déficientes pour le gène codant le PACAP montrent que le PACAP
stimule la sécrétion de catécholamines par les neurones sympathiques dans le tissu adipeux
brun impliqué dans la thermorégulation (Gray et al., 2002). Cependant, ces souris ne
présentent aucun défaut dans l’activité basale du système sympatho-adrénergique, suggérant
l’existence de mécanismes redondants pouvant impliquer le VIP.
Neuropeptides et cellules chromaffines
Le PACAP a un rôle de neurotransmetteur, qui lui permet de réguler la libération des
catécholamines par les cellules chromaffines, en particulier chez les Bovins, le Rat et
l’Homme (Houchi et al., 1995 ; Przywara et al., 1996 ; Payet et al., 2003). La sécrétion de
catécholamines induite par le PACAP s’accompagne de l’augmentation de la synthèse et/ou
59
de l’activité des enzymes impliquées dans la synthèse des catécholamines telles que la TH, la
dopamine ß-hydroxylase (DBH) et la phényléthanolamine N-méthyltransférase (PNMT)
(Houchi et al., 1995 ; Marley et al., 1996 ; Tönshoff et al., 1997). En modulant la libération
de catécholamines, le PACAP régule le métabolisme glucidique, en particulier en cas
d’hypoglycémie (Hamelink et al., 2002a). Dans les cellules chromaffines, le PACAP induit
également la synthèse et la libération du VIP (Lee et al., 1999 ; Hamelink et al., 2002b). Une
augmentation du taux d’AMPc ainsi qu’un influx calcique induit par le PACAP sont
communs et nécessaires aux différents effets de ce peptide dans les cellules chromaffines
(Houchi et al., 1995 ; Marley et al., 1996 ; Przywara et al., 1996 ; Lee et al., 1999 ; Hamelink
et al., 2002b ; Payet et al., 2003).
c) Rôle dans la tumorigénèse
Le VIP et le PACAP sont des facteurs régulant la prolifération ou la différenciation dans
divers tissus sains, mais cela est également vrai dans des lignées tumorales d’origines variées
telles que les cancers pulmonaires, coliques, ovariens, prostatiques, mammaires, les
mélanomes, les leucémies, ou les neuroblastomes (pour revues, Muller et al., 1995 ; Moody et
al., 2003). Toutes ces données seront largement développées dans le paragraphe « Pathologies
cancéreuses » p 62.
IV - Système VIP-récepteur et pathologies
1) Pathologies non cancéreuses
a) Pathologies liées à une hyperproduction de VIP
Une hyperproduction de VIP est observée dans diverses pathologies, mais il est difficile de
déterminer si cela est une cause ou une conséquence de la maladie.
60
- Lors d’un infarctus du myocarde ou d’une occlusion coronarienne aiguë, la concentration
plasmatique de VIP augmente (jusqu’à 62 %) dès les six premières heures qui suivent
l’apparition des symptômes (pour revue, Henning et Sawmiller, 2001).
- La dermatite atopique est une maladie associée à une élévation de la concentration locale
de VIP au niveau de la peau et dans le sérum (Umemoto et al, 2003). Le psoriasis est lui
aussi associé à une augmentation de la concentration plasmatique de VIP (Reich et al.,
2007).
- Des enfants souffrant de retards mentaux ou d’autisme présentent une concentration en
VIP anormalement élevée par rapport à celle mesurée chez des enfants sains (Neslon et
al., 2001).
- Le VIP pourrait intervenir dans la génèse de l’épilepsie. En effet, lorsque cette pathologie
est induite par injection intrapéritonéale de pénicilline chez le Rat, elle est associée à une
augmentation du nombre de neurones VIPergiques dans le cortex cérébral, l’hippocampe
et les amygdales (Zou et Ruan, 2000).
b) Pathologies liées à une déficience en VIP ou en PACAP
Très souvent, la déficience en VIP ou PACAP est liée à la déficience en fibres VIPergiques et
PACAPergiques. Il est là aussi difficile de savoir si l’absence de ces fibres est une cause ou
une conséquence de la maladie.
- L’achalasie œsophagienne est caractérisée par une absence de fibres VIPergiques au
niveau de la musculature lisse de l’œsophage, ce qui provoque une relaxation défectueuse
du sphincter bas de l’œsophage entraînant une perte du péristaltisme œsophagien
(Aggestrup et al., 1983).
61
- La maladie de Hischsprung, ou mégacôlon congénital, est liée à une déficience de
l’innervation VIPergique et PACAPergique induisant la contraction permanente des
intestins (Tsuto et al., 1989 ; Shen et al., 1992 ; Koch et al., 1993).
- L’innervation VIPergique déficiente dans les corps caverneux empêche leur dilatation
conduisant donc à l’impuissance fonctionnelle (Gu et al., 1984).
- L’asthme sévère est corrélé à une déficience de l’innervation VIPergique des voies
respiratoires, notamment des bronches (Ollerenshaw et al., 1989). Au niveau du système
respiratoire, l’hypertension pulmonaire primaire est associée à une diminution de la
concentration en VIP dans le sérum et le tissu pulmonaire (Petkov et al., 2003).
- Dans des modèles de rats présentant un diabète insulinodépendant, une diminution de la
quantité de VIP dans le tractus gastro-intestinal a été observée. Cette déficience (due à
une diminution de la synthèse ou au déficit de l’innervation) pourrait être à l’origine de la
motilité intestinale anormale observée chez des patients atteints de cette maladie
(Adeghate et al., 2001).
- Dans le syndrome de la mucoviscidose, la déficience en innervation VIPergique induit
une diminution de la conductance au chlorure des protéines CFTR (cystic fibrosis
conductance regulator) (Anderson et al., 1991) au niveau de l’appareil respiratoire mais
aussi au niveau des glandes sudoripares (Heinz-Erian et al., 1985).
- Dans la maladie d’Alzheimer, le nombre de neurones exprimant du VIP est réduit dans
les formes avancées de la maladie (Wu et al., 2007).
- Dans les cas d’incontinence urinaire à l’effort et de prolapsus génito-urinaire, une
diminution d’une part du nombre de fibres VIPergiques et PACAPergiques, et d’autre
part du taux de VIP et de PACAP est observée au niveau du plancher pelvien (Hong et
al., 2008).
62
c) Autres pathologies
L’holoprosencéphalie est une maladie héréditaire entraînant un développement anormal du
prosencéphale dans laquelle des réarrangements chromosomiques des gènes codant le PACAP
et ses récepteurs ont été identifiés (Mackay et al., 1996).
Le syndrome de l’immunodéficience acquise (SIDA) peut être associé à une hypersécrétion
de VIP par des tumeurs endocrines apparaissant au cours de la maladie. Cette hypersécrétion
de VIP entraîne une diarrhée aqueuse réfractaire (Manfredi et al., 1994). Il semble que les
récepteurs du VIP soient également impliqués dans cette pathologie, et en particulier dans
l’entrée du virus de l’immunodéficience humaine (VIH) dans les cellules hôtes. En effet, la
protéine gp120 de l’enveloppe virale comporte un domaine d’homologie avec le VIP
susceptible d’interagir avec les récepteurs du neuropeptide dans les cellules hôtes (Gozes et
Brenneman, 1989). De plus, il a été montré que l’infection par le VIH-1 est facilitée par le
récepteur VPAC1 dans des lignées de cellules lymphocytaires T (Branch et al., 2002), alors
que l’activation des récepteurs VPAC2 semble inhiber l’infection par le VIH-1 (Bockaei et
al., 2007).
2) Pathologies cancéreuses
Les VIPomes (ou syndrome de Verner-Morrison) sont des tumeurs neuroendocriniennes
fréquemment localisées dans le pancréas et qui libèrent des quantités anormales de VIP et
PHM dans la circulation sanguine. En effet, le taux physiologique de VIP dans le plasma est
inférieur à 50 pg/ml, mais peut atteindre en moyenne 600 pg/ml chez les patients atteints d’un
VIPome. Cela peut alors provoquer des diarrhées hydriques profuses parfois fatales (pour
revue, Ghaferi et al., 2008).
Dans d’autres tumeurs, VIP et PACAP peuvent stimuler ou inhiber la prolifération cellulaire,
par l’intermédiaire de leurs récepteurs, exprimés dans de nombreux cancers. Le cas particulier
63
des neuroblastomes est développé dans le paragraphe « Le système VIP-récepteurs dans les
neuroblastomes » p 70. L’expression des récepteurs VPAC1 a été décrite dans les néoplasmes
épithéliaux malins comme les cancers du poumon, de l’estomac, du colon, du rectum, de la
prostate, du canal pancréatique, du foie, de la vessie. Les récepteurs VPAC2 sont
prédominants dans seulement quelques tumeurs, comme les léiomyomes, tumeurs bénignes
des muscles lisses. Plusieurs types de tumeurs humaines expriment surtout le récepteur PAC1,
comme les carcinomes endométriaux et les tumeurs dérivant du système neuronal et du
système endocrine. Cela inclut les tumeurs gliales (astrocytomes, glioblastomes,
oligodendrogliomes), les adénomes pituitaires (en particulier les adénomes sécrétant ou non
l’hormone de croissance mais pas les prolactinomes), la plupart des tumeurs sécrétant des
catécholamines, incluant les phéochromocytomes et les paragangliomes (pour revue, Reubi,
2003). Cette liste indique que les récepteurs PAC1 sont communs aux tumeurs neurales,
gliales ou neuroendocrines d’origine neuroectodermale. Les phéochromocytomes sont des
tumeurs neuroendocrines dérivant des cellules chromaffines. Le PACAP et ses récepteurs sont
exprimés dans les cellules de phéochromocytome, suggérant une action autocrine de ce
peptide. Dans la lignée de phéochromocytome de rat PC12, le PACAP stimule la sécrétion de
catécholamines, induit une différenciation morphologique et inhibe la prolifération (pour
revue, Ghzili et al., 2008).
Le VIP et le PACAP peuvent avoir des effets opposés sur la prolifération cellulaire, en
fonction du type de tumeur. Par exemple, ils stimulent la prolifération dans les cellules de
cancers du sein, du colon, des ovaires, du rein, de la prostate, ainsi que dans les leucémies ou
les mélanomes, alors qu’ils l’inhibent dans certaines lignées de glioblastomes, dans les
neuroblastomes, les médulloblastomes et les autres tumeurs centrales primitives
neuroectodermiques (pour revue, Moody et al., 2003). Le VIP et le PACAP peuvent
également avoir des effets opposés sur la prolifération au sein d’un même type tumoral. C’est
64
le cas notamment des cancers pulmonaires : le PACAP entraîne la formation de colonies dans
la lignée NCI-H838 de cancer du poumon non à petites cellules (NSCLC pour non-small cell
lung cancer) (Zia et al., 1995), alors que dans la lignée NCI-H69 de cancer pulmonaire à
petites cellules (SCLC pour small cell lung cancer), le VIP inhibe la prolifération cellulaire
(Maruno et al., 1998). Cela est également vrai dans les gliomes : dans la lignée T98G, VIP et
PACAP diminuent la prolifération (Vertongen et al., 1996a), alors que le VIP a l’effet opposé
dans la lignée C6 (Dufès et al., 2003a). Ces exemples, qu’il s’agisse de cancers pulmonaires
ou de gliomes, mettent en évidence la complexité des modalités d’action de ces
neuropeptides.
3) Neuropeptides et thérapie
Les neuropeptides de la famille du VIP présentent un large spectre d’action, faisant d’eux et
de leurs analogues de potentiels agents thérapeutiques dans diverses pathologies.
a) Vectorisation et développement d’analogues stables
Dans certain cas, l’utilisation du VIP ou du PACAP comme agent thérapeutique apparaît
limitée à cause de leur rapide dégradation et de la vaste distribution de leurs récepteurs dans
l’organisme. C’est pourquoi diverses stratégies sont développées afin d’améliorer les
capacités de ces molécules. Le VIP semble incapable de franchir la barrière hémato-
encéphalique (BHE), ce qui limite son utilisation in vitro sur les tumeurs cérébrales ou in vivo
sur le système nerveux central en général. Après administration locale dans les vaisseaux
sanguins intracrâniens, le VIP entraîne ainsi une vasodilatation mais aucun effet
cérébrovasculaire n’est observé après administration systémique du neuropeptide. Différentes
stratégies ont donc été développées pour pallier à ce problème. Ainsi, l’administration du VIP
en solution par voie intranasale permet le passage du VIP intact dans le cerveau (Dufès et al.,
65
2003b). Même si la quantité de VIP intact transféré dans le cerveau est faible (0,1% de la
radioactivité présente initialement en solution a été retrouvée dans le cerveau après 30
minutes de perfusion), l’utilisation de cette voie d’administration offre des perspectives
intéressantes pour l’évaluation in vivo de l’action cérébrale de peptides qui sont rapidement
dégradés dans le compartiment sanguin ou incapables de franchir la BHE. La quantité de VIP
pouvant atteindre le cerveau à la suite d’une administration intranasale peut être augmentée
par l’encapsulation du VIP dans des nanoparticules de polyéthylène glycol (Gao et al., 2007).
L’utilisation de l’anticorps monoclonal OX26 dirigé contre le récepteur de la transferrine,
associé à la streptavidine et couplé à un analogue du VIP biotinylé permet à cet analogue de
traverser la BHE par transcytose. Injecté par voie intraveineuse, ce complexe augmente la
circulation sanguine intracérébrale de VIP de 60% (Wu et Pardridge, 1996 ; pour revue :
Bickel et al., 2001). L’encapsulation du VIP dans des niosomes (vésicules formées de
surfactifs non ioniques synthétiques) greffés de groupements glucose (afin de cibler les
transporteurs de glucose GLUT1 abondant au niveau de la BHE) permet également à ce
peptide d’atteindre le cerveau, sans être dégradé, après injection par voie intraveineuse chez
des souris (Dufès et al., 2004).
L’encapsulation du VIP dans des liposomes a également été développée dans un modèle ex
vivo d’artère pulmonaire. En effet, le VIP associé à des liposomes induit ses effets
vasodilatateurs, en conduisant à une relaxation plus durable que celle induite par le VIP libre.
Il apparaît donc que les liposomes protègent le VIP de la dégradation, sans empêcher son
action (Stark et al., 2007).
Une autre stratégie mise en place afin d’améliorer la stabilité des neuropeptides consiste à
développer des analogues du VIP et du PACAP plus stables. Cela est possible grâce à des
études de structure-activité qui permettent de déterminer quels sont les acides aminés des
neuropeptides impliqués par exemple dans la sensibilité aux peptidases (Bourgault et al.,
66
2008 ; pour revue, Onoue et al., 2008). La stabilité de ces analogues peut également être
augmentée par l’ajout de chaînes de polyéthylène glycol ou par glycosylation (Pan et al.,
2008 ; Dangoor et al., 2008).
b) Neuroprotection et les maladies neurodégénératives
Les neuropeptides de la famille du VIP pourraient présenter un intérêt thérapeutique grâce à
leurs propriétés neuroprotectrices (pour revue, Brenneman et al., 2007). Ces actions
neuroprotectrices ont été mises en évidence pour la première fois dans des cultures primaires
de moelle épinière que le VIP protège de la mort cellulaire induite par la tétrodotoxine, qui
inhibe l'activité des canaux sodiques durant la phase ascendante du potentiel d'action
(Brenneman et Eiden, 1986). Les rôles neuroprotecteurs des neuropeptides ont été mis en
évidence dans différents modèles de lésions. Par exemple, la dégénérescence de la matière
blanche corticale induite par l’iboténate (un analogue du glutamate) chez des souriceaux
nouveaux-nés ou âgés de 5 jours est diminuée par le VIP (Gressens et al., 1997). De plus,
l’expression du VIP ou du PACAP est augmentée à la suite de l’axotomie de différents
neurones ou nerfs, suggérant un rôle important de ces peptides dans les processus de
réparation neuronale après lésion (Hyatt-Sachs et al., 1993 ; Sun et al., 1994 ; Reimer et
Keanje, 1999 ; Zhou et al., 1999 ; Boeshore et al., 2004). Au niveau du système nerveux
central, les actions des neuropeptides semblent être indirectes (pour revues, Brenneman,
2007 ; Masmoudi-Kouki et al., 2007). En effet, la stimulation des astrocytes par le VIP induit
la libération par ces mêmes cellules de facteurs neurotrophiques tels que des cytokines
(Brenneman et al., 1995), des chémokines (Brenneman et al., 1999) ou l’ADNF (activity-
dependent neurotrophic factor) (Brenneman et Gozes, 1996).
Les rôles neuroprotecteurs du PACAP et du VIP ont ensuite été démontrés dans des modèles
de maladies neurodégénératives. Par exemple, dans un modèle murin de la maladie de
67
Parkinson, les animaux traités par la 6-hydroxydopamine (6-OHDA) présentent des lésions de
la substance noire qui perdurent jusqu’à 10 jours après traitement, avec une perte quasi-totale
des neurones dopaminergiques (95% de perte), alors que des animaux pré-traités par le
PACAP ne présentent des lésions que pendant 24 heures après le traitement à la 6-
hydroxydopamine. De plus, ces animaux présentent une perte de neurones de seulement 50 %
(Reglodi et al., 2004). Dans un modèle cellulaire de cette même maladie, le PACAP protège
les cellules de la toxicité du 1-méthyl-4-phénylpyridinium ion (MPP+), un métabolite du 1-
méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP), qui induit la mort des neurones
dopaminergiques de la substance noire (Deguil et al., 2007). Le Stearyl-Nle17-VIP (SNV), un
agoniste des récepteurs du VIP, peut présenter un intérêt contre la maladie d’Alzheimer,
puisqu’il protège des cellules corticales en culture de la mort neuronale induite par le peptide
ß-amyloïde. De plus, cet agoniste stimule des fonctions cognitives dans des modèles animaux
de cette pathologie (Gozes et al., 1996 ; 1999). D’autre part, le Stearyl-Nle17-VIP permet de
contrecarrer les effets délétères induit par l’absence de l’apolipoprotéine E, impliquée dans le
développement de la maladie d’Alzheimer (Gozes et al., 1997).
c) Maladies inflammatoires et auto-immunes
Le VIP est aujourd’hui reconnu comme un puissant agent anti-inflammatoire, qui inhibe la
production de cytokines pro-inflammatoires et stimule la production de cytokines anti-
inflammatoires. C’est pourquoi le VIP présente un intérêt dans la thérapie des maladies
inflammatoires chroniques avec choc septique ou auto-immunes et a déjà fait l’objet d’études
dans des modèles animaux de pathologies telles que la sepsie, la maladie de Crohn, le diabète
de type I, la sclérose multiple, la polyarthrite rhumatoïde, la pancréatite, la kératite,
l’uvéorétinite, le syndrome de Sjögren (pour revues, Chorny et al., 2006 ; Gonzales-Rey et
al., 2007).
68
d) Thérapie anti-cancéreuse
Dans certains types de cellules tumorales, le système VIP-récepteurs est impliqué dans la
stimulation de la prolifération, alors que dans d’autres types de cellules tumorales, ce système
est impliqué dans l’induction de la différenciation (pour revue, Muller et al., 1995). Par
conséquent, le VIP ou ses antagonistes peuvent présenter un intérêt thérapeutique dans
plusieurs cancers et différentes études in vitro et in vivo ont été réalisées. Par exemple, le VIP
diminue la croissance de cellules SCLC humaines in vitro, mais également in vivo, après
injection de ces cellules chez la souris nude (Maruno et al., 1998). Des antagonistes
peptidiques des récepteurs diminuent la croissance de cellules tumorales humaines ovariennes
ou prostatiques implantées chez la souris nude (Chatzistamou et al., 2001 ; Plonowski et al.,
2002). Le VIPhyb, antagoniste des récepteurs du VIP, diminue le développement de tumeurs
coliques induites chimiquement chez le rat (Levy et al., 2002) et retarde l’apparition de
tumeurs mammaires chez des souris transgéniques (Moody et al., 2004). De plus, le VIPhyb
augmente l’effet de drogues chimiothérapeutiques comme le taxol et la doxorubicine d’une
part in vitro sur des cellules NSCLC, des cellules de cancer du côlon ou de cancer mammaire,
et d’autre part in vivo, après injection de cellules tumorales mammaires chez la souris nude
(Gelber et al., 2001 ; Moody et al., 2001). Les antagonistes du VIP peuvent également être
utilisés en association avec des analogues d’autres peptides (bombésine, substance P et
somatostatine). Une telle combinaison a été testée sur des tumeurs gastrointestinales et
présente une activité anti-cancéreuse intéressante (Jaggi et al., 2008).
Les récepteurs du VIP qui sont surexprimés dans certains tissus tumoraux peuvent également
constituer des cibles thérapeutiques. En effet, la conjugaison de drogues cytotoxiques à des
analogues du VIP permet de cibler les cellules tumorales mammaires surexprimant les
récepteurs VPAC1 (Moody et al., 2007 ; Rubinstein et al., 2008). L’interaction VIP-
récepteurs induit l’internalisation de ce complexe ainsi que de la drogue. L’interaction du VIP
69
avec ses récepteurs peut également présenter un intérêt pour le diagnostic des tumeurs. Dès
1994, il a été mis en évidence que le VIP radiomarqué par l’isotope 123 de l’iode permet de
localiser des tumeurs gastrointestinales et des métastases dans le foie ou dans les poumons
ainsi que des tumeurs endocrines (Virgolini et al., 1994). Cependant, l’utilisation du VIP pour
localiser des tumeurs est limitée, du fait de sa rapide dégradation. C’est pourquoi des
analogues plus stables du VIP marqués avec différents radioéléments sont à l’étude et
présentent des résultats intéressants pour la détection de tumeurs colorectales, mammaires ou
prostatiques par tomographie d'émission de positons (Cheng et al., 2006 ; Zhang et al., 2007 ;
2008).
e) Essais cliniques chez l’Homme
Malgré la rapide dégradation du VIP dans l’organisme, des essais cliniques concernant ce
peptide sont en cours chez l’Homme. La société suisse MondoBIOTECH a développé une
solution de VIP stable, inhalable et injectable, l’ « Aviptadil ». Cette solution semble
présenter un intérêt thérapeutique dans les cas d’hypertension pulmonaire ou de syndrome de
détresse respiratoire, sans induire d’effets secondaires chez l’Homme. De plus, l’utilisation de
l’ « Aviptadil » a récemment été validée pour un essai clinique contre la sarcoïdose, une
maladie inflammatoire systémique de cause inconnue, qui atteint préférentiellement les
poumons, mais peut atteindre n'importe quel organe (http://www.mondobiotech.com).
D’autres essais cliniques du VIP sont actuellement en cours. Un essai clinique de phase I du
VIP administré par voie intraveineuse (www.clinicaltrials.gov; NCT00004494), est
actuellement mené chez des patients atteint du syndrome de détresse respiratoire avec choc
septique afin de déterminer la dose maximale tolérée et la pharmacodynamique du peptide. Le
VIP, en association à la phentolamine, est utilisé en essai clinique pour le traitement des
troubles de l’érection (Shah et al., 2007). Le RO 25-1535, un agoniste des récepteurs VPAC2,
70
présente un intérêt dans le traitement de l’asthme lorsqu’il est administré par inhalation
(Linden et al., 2003).
V - Le système VIP-récepteurs dans les neuroblastomes
Les données décrites ci-dessous ont fait l’objet d’un article de revue publié en annexe, p 178.
1) Découverte du système VIP-récepteurs dans les cellules de neuroblastome
La synthèse et la libération de VIP et de PHM par les cellules de neuroblastome ont été
initialement décrites dans les années 80 en utilisant des techniques immunochimiques
(Hoshino et al., 1984). Par la suite, les cellules de neuroblastome ont été utilisées comme un
modèle pour l’étude de la structure du gène du VIP-PHI/M et de son expression. Il a été
rapporté que des clones de la lignée de neuroblastome humain SK-N-SH expriment l’ARNm
du précurseur du VIP, libèrent du VIP immunoréactif dans leur milieu de culture, ce qui
stimule la production d’AMPc dans ces cellules. De plus, ces cellules présentent des sites de
liaison de haute affinité pour le VIP (Muller et al., 1989). Ces données ont été à l’origine de
l’idée selon laquelle le système VIP-récepteurs peut avoir une action autocrine ou paracrine
dans les cellules de neuroblastome. De plus, l’inhibition de l’action du VIP endogène sécrété
par les cellules LA-N-5 par inhibition compétitive ou par blocage des récepteurs, induit une
augmentation de la croissance cellulaire (Pence et Shorter, 1992). Cela corrobore les
premières observations indiquant qu’un taux élevé de VIP dans le sérum est corrélé à un
pronostic favorable pour les patients présentant un neuroblastome (Yanaihara et al., 1981 ;
Waschek et al., 1997). Par la suite il a été démontré qu’au moins un des trois types de
récepteurs des neuropeptides de la famille du VIP peut être exprimé par les cellules de
neuroblastomes (Vertongen et al., 1996b ; Isobe et al., 2004 ; Lutz et al., 2006).
71
2) Régulation de l’expression du système VIP-récepteurs dans les cellules de
neuroblastome.
De nombreux agents régulent l’expression du système VIP-récepteurs dans des lignées de
neuroblastome (Tableau VIII).
L’expression du VIP, des peptides précurseurs et/ou de l’ARNm VIP est stimulée par le
dibutyryl AMPc (dBcAMP) et par des agents induisant une augmentation du taux d’AMPc
(Yanaihara et al., 1981 ; Hayakawa et al., 1984 ; Brick et al., 1985 ; Svoboda et al., 1986 ;
Waschek et al., 1988 ; Agoston et al., 1992 ; Kimura et al., 1992 ; Adler et al., 1993). En
outre, ces agents sont connus pour induire la différenciation de cellules de neuroblastome. Les
esters de phorbol peuvent également augmenter l’expression du VIP (Waschek et al., 1988 ;
Ohsawa et al., 1985 ; Agoston et al., 1992 ; Kimura et al., 1992 ; Hahm et Eiden, 1999), tout
comme le Ca2+, qui stimule l’expression de l’ARNm VIP dans les cellules SH-SY5Y (Adler
et al., 1993).
Dans la lignée IMR-32, l’expression du PACAP est augmentée par les esters de phorbol et le
dBcAMP (Suzuki et al., 1994b).
L’acide rétinoïque régule différents éléments du système VIP-récepteurs. En effet, il induit
non seulement l’expression de l’ARNm et/ou du peptide VIP, mais il augmente aussi le
nombre de sites de liaison du VIP dans plusieurs lignées de neuroblastome (Waschek et al.,
1989 ; 1997 ; Agoston et al., 1992 ; Pence et Shorter, 1992 ; Georg et al., 1994 ; Hashemi et
al., 2003). Contrairement à ses effets sur l’expression du VIP, l’acide rétinoïque diminue
l’expression du PACAP dans les cellules IMR-32 (Waschek et al., 1997). L’acide rétinoïque
diminue l’expression des récepteurs PAC1 et VPAC2 dans la lignée SH-SY5Y (Waschek et
al., 1997 ; Lutz et al., 2006). Dans la lignée LA-N-5, l’expression du VIP induite par l’acide
rétinoïque est concomitante de la différenciation morphologique. De plus, des antagonistes du
VIP diminuent l’effet de l’acide rétinoïque, suggérant que le VIP est impliqué dans cette
72
Régulateurs Effets Lignées cellulaires Références
↑ Peptide VIP ou précurseurs
NB-1, N18TG2, SH-SY5Y
1-7
↑ ARNm VIP NB-1, SH-SY5Y 5, 8, 9 Analogues de l’AMPc
↑ peptide PACAP IMR-32 11
↑ peptide VIP NB-1, SH-SY5Y 5, 7
↑ ARNm VIP NB-1, SH-SY5Y, SK-N-SH
5, 6, 9, 10 Esters de phorbol
↑ peptide PACAP IMR-32 11 Ca2+ ↑ ARNm VIP SH-SY5Y 8
↑ peptide VIP SH-SY5Y, LA-N-5, NB-1
6, 12, 14-16
↑ ARNm VIP SH-SY5Y, IMR-32, LA-N-5, NB-1
6, 13, 15
↑ sites de liaisons SH-SY5Y, IMR-32, LA-N-5
12-14
↓ ARNm PACAP IMR-32 13
Acide rétinoïque
↓ ARNm PAC1, VPAC2 SH-SY5Y 13, 17
↑ peptide VIP NBFL 18 CNTF, TGF-ß et facteurs apparentés ↑ ARNm VIP NBFL 18-21
↑ peptide VIP SH-SY5Y, NB-1, BE(2)M17
6,22 Carbamylcholine
↑ ARNm VIP NB-1, BE(2)M17 22
↑ peptide VIP LA-N-5 24 ↑ sites de liaison LA-N-5 24 VIP ↑ peptide PACAP IMR-32 11
↑ peptide VIP NB-1 23 ↑ ARNm VIP NB-1 23 ↑ peptide PACAP IMR-32 11
PACAP
↑ ARNm PACAP IMR-32 11 Tableau VIII : Régulation de l’expression du système VIP-récepteurs dans les cellules de neuroblastomes (d’après Muller et al., 2006) ↑ : augmentation, ↓ : diminution. 1 : Yanaihara et al., 1981 ; 2 : Hayakawa et al., 1984 ; 3 : Brick et al., 1985 ; 4 : Svoboda et al., 1986 ; 5 : Waschek et al., 1988 ; 6 : Agoston et al., 1992 ; 7 : Kimura et al., 1992 ; 8 : Adler et al., 1993 ; 9 : Ohsawa et al., 1985 ; 10 : Hahm et Eiden, 1999 ; 11 : Suzuki et al., 1994b ; 12 : Waschek et al., 1989 ; 13 : Waschek et al., 1997 ; 14 : Pence et Shorter, 1992 ; 15 : Georg et al., 1994 ; 16 : Hashemi et al., 2003 ; 17 : Lutz et al., 2006 ; 18 : Symes et al., 1993 ; 19 : Rao et al., 1992 ; 20 : Symes et al., 2000 ; 21 : Pitts et al., 2001 ; 22 : Kristensen et al., 1997 ; 23 : Georg et Fahrenkrug, 2000 ; 24 : Pence et Shorter, 1993.
73
différenciation (Pence et Shorter, 1992). Cependant, dans la lignée NB-1, l’acide rétinoïque
stimule l’expression du VIP, sans induire de différenciation morphologique (Georg et al.,
1994).
Un phénomène comparable est observé dans les cellules NBFL, dans laquelle un traitement
par la cytokine CNTF stimule l’expression du VIP sans induire de changements
morphologiques (Symes et al., 1993). Dans cette lignée, les cytokines LIF et oncostatine-M
augmentent également l’expression de l’ARNm VIP (Rao et al., 1992). Certains membres de
la famille du TGF-ß (transforming growth factor ß), comme le TGF-ß lui-même et l’activine,
stimulent l’expression du VIP et peuvent agir en synergie avec le CNTF pour augmenter la
transcription du VIP (Symes et al., 2000 ; Pitts et al., 2001).
La carbamylcholine, un analogue de l’acétylcholine, induit une augmentation de l’expression
de l’ARNm et du peptide VIP dans les lignées de neuroblastome NB-1 et BE(2)M17.
Cependant cela n’est pas associé à une différenciation morphologique (Kristensen et al.,
1997). Dans la lignée SH-SY5Y, l’expression du VIP induite par la carbamylcholine n’est pas
associée à une augmentation de l’ARNm du précurseur de ce peptide, et serait plutôt liée à des
événements traductionnels ou post-traductionnels (Agoston et al., 1992).
L’expression du VIP peut également être régulée par le VIP lui-même ou le PACAP. Dans la
lignée NB-1, le PACAP stimule l’expression de l’ARNm et du peptide VIP (Georg et
Fahrenkrug, 2000). Le VIP stimule l’expression du PACAP dans les cellules IMR-32,
cependant, cet effet est 100 fois plus faible que celui du PACAP, qui induit sa propre
expression dans cette lignée (Suzuki et al., 1994b). Dans les cellules LA-N-5, le VIP induit
une différenciation morphologique ainsi que l’augmentation de l’expression du VIP et de ses
récepteurs fonctionnels (Pence et Shorter, 1993). Ainsi, le VIP, comme l’acide rétinoïque,
peut réguler l’expression des différents composants du système autocrine ou paracrine
VIP-récepteurs.
74
Tous ces agents, qu’ils induisent ou non la différenciation morphologique, augmentent
l’expression du VIP et, quand cela a été analysé, augmentent le nombre de sites de liaison du
VIP dans les cellules de neuroblastome.
3) Signalisation intracellulaire associée au système VIP-récepteur dans les cellules de
neuroblastome
De nombreuses voies de signalisation sont induites par les neuropeptides de la famille du VIP
dans des lignées de neuroblastome (Tableau IX).
Neuropeptide Eléments de signalisation Lignées Références
AMPc SK-N-SH, N1E-115 1, 2 Ca2+, CaM SK-N-SH 3, 4 PKA, IP3, Ca2+ SH-SY5Y 5 Ras / Erk, Cdc42 SH-SY5Y 6
VIP
AMPc / PKA Neuro2A 7
PKA, IP3, Ca2+ SH-SY5Y 5 AMPc, MAPK SH-SY5Y 8, 9 AMPc, Ca2+ N1E-115 10 MAPK (< nM) Neuro2A 7 AMPc / PKA (> nM) Neuro2A 7
PACAP
PHI MAPK Neuro2A 7 Tableau IX : Principales voies de signalisation induite par les neuropeptides de la famille du VIP dans les cellules de neuroblastomes. 1 : Muller et al., 1989 ; 2 : Inukai et al., 1994 ; 3 : Oettling et al., 1990 ; 4 : Mangels et Gnegy, 1992 ; 5 : Wojcikiewicz et Luo, 1998 ; 6 : Alleaume et al., 2004 ; 7 : Lelièvre et al., 1998 ; 8 : Lutz et al., 2006 ; 9 : Monaghan et al., 2008 ; 10 : Chik et al., 1996.
Dans la lignée de neuroblastome humain SK-N-SH, le VIP stimule la production d’AMPc,
avec un ordre d’efficacité dans les trois clones issus de cette lignée qui est le suivant : SH-EP
> SH-SY5Y > SHIN (Muller et al., 1989). Les effets du VIP sont observés à des
concentrations aussi faibles que 1 nM, avec une concentration en VIP induisant 50% de la
réponse maximale (EC50) supérieure à 30 nM dans ces trois clones. Il a été montré que dans
75
les cellules SK-N-SH, le VIP augmente également la concentration cytoplasmique en Ca2+
(Oettling et al., 1990), ce qui induit la translocation de la calmoduline (CaM) de la membrane
au cytoplasme (Mangels et Gnegy, 1992). Le rôle de la relocalisation de la CaM reste à
élucider. Cependant, cette translocation pourrait induire l’interaction de la CaM avec des
protéines de liaison, permettant ainsi la modulation d’enzymes dépendantes de la CaM et le
contrôle du remodelage du cytosquelette. Dans la lignée SH-SY5Y, le VIP et le PACAP
stimulent la phosphorylation du récepteur à l’IP3 de type 1 (Wojcikiewicz et Luo, 1998).
Cette phosphorylation dépendante de la PKA stimule la mobilisation du Ca2+ induite par
l’IP3, ce qui conduit ainsi à une augmentation de la concentration intracellulaire en Ca2+. Il
apparaît donc que les neuropeptides de la famille du VIP peuvent augmenter la concentration
intracellulaire en Ca2+ via la voie AMPc/PKA.
Dans les cellules SH-SY5Y, le VIP induit un remodelage neuritique associé à l’apparition de
varicosités le long des neurites et d’un réseau de neurites longs et ramifiés (Alleaume et al.,
2004). La voie Ras/ERK, bien qu’activée par le VIP, n’est pas impliquée dans ce remodelage,
contrairement à la GTPase Cdc42. En effet, Cdc42 est fortement activée par le VIP, alors que
l’expression du mutant dominant négatif de Cdc42 dans des expériences de transfection
empêche les modifications neuritiques induites par le VIP. Ces données suggèrent que Cdc42
joue un rôle clé dans le remodelage neuritique induit par le VIP, et constituent ainsi la
première preuve de la régulation de l’activité d’une GTPase de la famille Rho par le VIP dans
les cellules de neuroblastome.
Dans cette même lignée, le PACAP induit la différenciation morphologique via les récepteurs
PAC1. Cet effet est dépendant de l’AC et de l’AMPc. En effet, l’augmentation du taux
d’AMPc conduit à l’activation de la voie des MAPK par l’intermédiaire d’un mécanisme
indépendant de la PKA mais qui pourrait impliquer l’Epac (protéine échangeuse directement
76
activée par l'AMPc) qui semble induire l’activation de Erk (Lutz et al., 2006 ; Monaghan et
al., 2008).
Dans les cellules de neuroblastome murin N1E-115 et Neuro2a, le VIP et le PACAP stimulent
la production d’AMPc (Inukai et al., 1994 ; Chik et al., 1996 ; Lelièvre et al., 1998), comme
dans les cellules de neuroblastome humain. De plus, dans la lignée N1E-115, le PACAP
augmente également la concentration intracellulaire en Ca2+ (Inukai et al., 1994 ; Chik et al.,
1996). Dans cette même lignée, les effets du VIP et du PACAP sur la production d’AMPc
peuvent être augmentés par le Ca2+ intracellulaire. Cette potentialisation pourrait résulter de
l’activation d’adénylyl cyclases dépendantes du Ca2+. Inversement, l’activation de protéines
kinases de type PKC par les esters de phorbol diminue la réponse AMPc induite par le VIP et
le PACAP, peut-être à cause de la phosphorylation des récepteurs des neuropeptides par les
PKC. De manière intéressante, l’atténuation de la réponse à ces peptides peut également
résulter de l’inhibition d’isoformes distinctes d’AC par une nouvelle PKC (nPKC).
Les voies de signalisation associées au contrôle de la prolifération par le VIP, le PACAP et le
PHI ont été étudiées dans la lignée murine Neuro2a (Lelièvre et al., 1998). Ces trois peptides
ont des effets différents sur la prolifération de ces cellules et agissent via différentes voies de
signalisation. Le VIP et le PHM inhibent la croissance cellulaire. Le VIP agit via la voie
AMPc/PKA, alors que l’effet du PHM est dépendant des MAPK. Le PACAP a des effets
biphasiques dépendant de la dose : à des concentrations subnanomolaires, le PACAP stimule
la prolifération via les MAPK, alors qu’à des concentrations plus élevées, ce même peptide
inhibe la croissance cellulaire selon un mécanisme dépendant de la voie AMPc/PKA.
Ainsi, les voies de signalisation induites par les neuropeptides de la famille du VIP dans les
cellules de neuroblastome sont nombreuses et complexes. En plus des seconds messagers
« classiques » (AMPc, Ca2+), il apparaît que les effets des neuropeptides dans les cellules de
77
neuroblastome sont médiés par des voies moins connues, impliquant par exemple la GTPase
Cdc42 ou l’Epac.
78
3ème partie : Présentation du sujet de recherche et des objectifs de la thèse
I - Objectif 1 : Modulation de l’expression de MYCN par le VIP
Comme cela a été décrit précédemment, le VIP, le PACAP et leurs récepteurs sont
fréquemment exprimés dans les neuroblastomes, et ces neuropeptides induisent la
différenciation de lignées de neuroblastome (pour revue, Muller et al., 2006). De plus, le taux
d’expression du VIP dans les neuroblastomes augmente avec le taux de différenciation des
tumeurs et celles sécrétant du VIP ont un bon pronostic (pour revue, Grosfeld, 2000). De ce
fait, le VIP et ses analogues pourraient être impliqués dans l’évolution de ces cancers et
présenter un intérêt thérapeutique.
Dans les cellules de neuroblastome, la diminution de l’expression de l’oncogène MYCN est
liée à l’arrêt de la prolifération et à l’induction de la différenciation (Negroni et al., 1991). De
plus, lors de la différenciation induite par le TPA ou l’acide rétinoïque, l’expression de
MYCN est diminuée et précède la différenciation morphologique (Thiele et al., 1985 ;
Hammerling et al., 1987 ; pour revue, Edsjö et al., 2007). Le travail réalisé lors de ce stage
doctoral a porté sur l’étude de la régulation de l’expression de l’oncogène MYCN au cours de
la différenciation induite par le VIP dans des cellules de neuroblastome humain.
1) Importance de l’oncogène MYCN dans les neuroblastomes
L’intérêt porté à ce gène vient du fait qu’il est amplifié dans environ 22 % des
neuroblastomes, cette anomalie génétique présentant à elle seule un facteur de mauvais
pronostic (pour revue, van Noesel et Versteeg, 2004). De plus, MYCN est impliqué dans le
développement et la progression des neuroblastomes. Cet oncogène code un facteur de
transcription qui régule de nombreux processus clés de la cancérogénèse comme la
prolifération, la différenciation ou l’angiogénèse. Il apparaît donc intéressant, dans le but
79
d’améliorer la thérapie des neuroblastomes présentant une amplification de l’oncogène
MYCN, de pouvoir en diminuer l’expression.
2) Généralités
MYCN a été découvert dans des cellules de neuroblastome grâce à son homologie avec MYC
(Kohl et al., 1986). La détermination des séquences nucléotidique et protéique de MYCN a
permis de confirmer cette homologie (Stanton et al., 1986). En effet, la structure des gènes
MYCN et MYC est similaire : ils comportent 3 exons séparés par 2 introns, le premier exon
étant non codant. Au niveau de leurs séquences en acides aminés, l’homologie entre MYC et
MYCN est globalement de 32 % mais localement peut atteindre par exemple 84 % au niveau
de l’extrémité C-terminale, impliquée dans la liaison à l’ADN. Ces données ont donc suggéré
que MYCN et MYC pouvaient être apparentées et avoir des fonctions similaires. Cette
hypothèse a été confirmée par les travaux de Ramsay et al. (1986), qui ont démontré que les
protéines MYCN de 65 et 67 kDa, synthétisées à partir du même ARNm, sont localisées dans
le noyau et présentent la capacité de lier l’ADN. Ces protéines sont phosphorylables et
particulièrement instables (demi-vie de 30 minutes environ). L’analyse du promoteur du gène
MYCN a permis de mettre en évidence la présence de différents sites de régulation de son
expression (pour revue, Strieder et Lutz, 2002). L’expression basale de MYCN est régulée par
les facteurs E2F, Sp1 et Sp3 (Strieder et Lutz, 2003 ; Kramps et al., 2004). Sur le promoteur
du gène MYCN, les sites de liaison de E2F et de Sp1 sont séparés par 9 pb. La liaison de Sp1
sur le promoteur permettrait une interaction stable entre E2F et le promoteur. Cependant,
d’autres facteurs semblent intervenir car la présence de E2F et Sp1 ne suffit pas à transactiver
MYCN dans les cellules de neuroblastome SHEP dans lesquelles MYCN n’est pas exprimé.
Bien que régulé négativement par l’acide rétinoïque, aucun élément de réponse classique à
cette molécule n’a été identifié sur le promoteur du gène MYCN. L’acide rétinoïque semble
80
diminuer indirectement l’expression de ce gène, via la liaison des facteurs Sp1 et Sp3 sur une
région de 26 pb nécessaire à l’action inhibitrice de ce rétinoïde (Wada et al., 1997 ; Tuthill et
al., 2003).
Le taux d’expression basale de MYCN est également régulé au niveau post-transcriptionnel.
La protéine de liaison à l’ARN HuD, appartenant à la famille ELAV (embryonic lethal
abnormal vision), lie l’ARNm MYCN dans la région 3’UTR et augmente ainsi sa stabilité in
vitro et in vivo (Chagnovich et Cohn, 1996 ; Chagnovich et al., 1996 ; Manohar et al., 2002).
3) Régulation de l’expression de MYCN au cours du développement
L’expression de MYCN est régulée de manière spatio-temporelle. En effet, au cours du
développement murin, l’ARNm MYCN est détecté dès E 7,5. Son expression augmente et est
maximale entre E 9,5 et E 11,5. Ensuite, le taux d’ARNm diminue. MYCN est alors exprimé
dans de nombreux tissus tels que le cœur, les bourgeons des membres, le tube neural, les
poumons, le foie, l’estomac. Au moment de la naissance, MYCN est exprimé dans le cerveau,
les reins, l’intestin, les poumons et le cœur. Par la suite, l’expression de MYCN diminue dans
certains tissus. Chez l’adulte, elle perdure dans le cerveau, les testicules, le cœur et les
lymphocytes B. L’invalidation du gène MYCN chez des souris est létale à E 11,5. En effet, les
embryons présentent des anomalies au niveau du cœur et du système nerveux, avec en
particulier une réduction importante du nombre de neurones des ganglions de la racine dorsale
et des ganglions sympathiques (Jakobovits et al., 1985 ; Zimmerman et al., 1986 ; 1990 ;
Stanton et al., 1992 ; Charron et al., 1992 ; Sawai et al., 1993 ; pour revue Strieder et Lutz,
2002). Cela suggère le rôle important de MYCN dans la formation des neurones dérivant de
la crête neurale. L’expression de MYCN dans la crête neurale a été étudiée plus en détail dans
la région du tronc chez le Poulet. Les résultats indiquent que MYCN est exprimé de façon
uniforme dans toutes les cellules avant et pendant leur migration, puis cette expression
81
perdure uniquement dans les cellules subissant ultérieurement la différenciation neuronale
(Wakamatsu et al., 1997).
4) Amplification de l’oncogène MYCN
L’amplification de MYCN se présente sous la forme de DM ou de HSR (voir paragraphe
« Amplification de l’oncogène MYCN » p14). Les DM sont trouvés le plus souvent dans les
tumeurs primaires, alors que les HSR sont généralement présents dans les lignées cellulaires
de neuroblastome. L’amplification de l’oncogène MYCN conduit à la présence de 50 à 100
copies du gène, mais dans certains cas, près de 500 copies peuvent être observées. Le point de
départ de l’amplification semble être une réplication anormale de la région du locus MYCN
suivie de recombinaisons conduisant à l’apparition de DM. Ces éléments
extrachromosomiques pourraient ensuite s’intégrer à un chromosome, et subir plusieurs
cycles d’amplification in situ conduisant à des HSR (pour revue, Westermann et Schwab,
2002). L’ADN amplifié a une taille comprise entre 100 et 500 kb. Les gènes DEAD box
polypeptide 1 (DDX1) et neuroblastoma amplified gene (NAG) sont fréquemment co-
amplifiés avec MYCN (pour revue, Schwab, 2004). Les rôles physiologiques et la contribution
au phénotype tumoral des produits de ces deux gènes ne sont pas clairement identifiés
(Kaneko et al., 2007).
Certains neuroblastomes peuvent présenter 3 ou 4 copies de l’oncogène MYCN lorsqu’un gain
du gène MYCN se produit à la suite d’une translocation déséquilibrée entre un fragment du
chromosome 2 contenant le locus de MYCN et un autre chromosome (Van Roy et al., 2000 ;
Valent et al., 2002). Il semble que le gain du gène MYCN soit un événement précoce, qui peut
être suivi de l’amplification de cet oncogène (Valent et al., 2004).
82
L’amplification de l’oncogène MYCN est une caractéristique intrinsèque de la tumeur. En
effet, le taux d’amplification varie peu dans le temps et dans la tumeur primaire et les
métastases chez un même patient (Brodeur et al., 1987).
5) Rôles de MYCN dans les neuroblastomes
La protéine MYCN est impliquée dans le développement et la progression des
neuroblastomes car elle régule de nombreux processus liés à la tumorigénèse. Ces différentes
actions sont décrites ci-dessous et résumées dans le tableau X.
Processus régulés par MYCN
Cibles moléculaires régulées par MYCN Références
↓ p27KIP1 1 ↑ SKP2 et ↓ TP53INP1 ↓ p21WAF1 2 ↓ DKK3 ↑ cycline D 2 ↓ TGF-β2 ↑ cycline D-cdk4/6 2
↑ progression du cycle cellulaire
↑ prolifération ↑ ODC 3 ↓ différenciation ↑ Id2 4 ↑ angiogénèse ↓ Activine A, ↓ LIF 5, 6, 7 ↑ migration, invasion ↑ Métalloprotéinases 8 ↑ nm23H1 9, 10
Tableau X : Résumé des actions de MYCN potentiellement impliquées dans la progression des neuroblastomes. ↑ : augmentation, ↓ : diminution. Les abréviations citées dans ce tableau sont définies dans la liste d’abréviations ou dans le texte ci-dessous. 1 : Woo et al., 2008 ; 2 : Bell et al., 2007 ; 3 : Wallick et al., 2005 ; 4 : Lasorella et al., 2004 ; 5 : Breit et al., 2000 ; 6 : Schramm et al., 2005 ; 7 : Hatzi et al., 2002 ; 8 : Noujaim et al., 2002 ; 9 : Gogfried et al., 2002 ; 10: Almgren et al., 2004
a) Dans le développement des neuroblastomes
Le rôle de MYCN dans le développement des neuroblastomes a été mis en évidence dans des
souris transgéniques qui surexpriment de manière ciblée MYCN dans les cellules dérivant de
la crête neurale grâce à l’utilisation du promoteur de la TH. Ces souris développent des
tumeurs comparables aux neuroblastomes humains du point de vue de leur localisation, de
83
leur histologie et des anomalies génétiques (Weiss et al., 1997 ; 2000 ; Hackett et al., 2003 ;
Cheng et al., 2007). Dans les animaux homozygotes, l’incidence des tumeurs est augmentée
et le temps de latence est diminué par rapport aux souris hétérozygotes (7 semaines pour les
homozygotes et 15 semaines pour les hétérozygotes), mais les anomalies génétiques sont
comparables chez les souris homozygotes et hétérozygotes (Weiss et al., 1997 ; Norris et al.,
2000). L’administration d’oligonucléotides antisens MYCN grâce à une pompe implantée sous
la peau à proximité de la tumeur avant l’apparition de tumeurs palpables, diminue la masse
tumorale et l’incidence des tumeurs chez les souris hétérozygotes. Chez les souris
homozygotes, seule la masse tumorale est réduite par l’administration d’oligonucléotides
antisens MYCN (Burkhart et al., 2003). Ces études mettent en évidence l’implication de
MYCN dans la tumorigénèse des neuroblastomes. Le travail mené par Hansford et al. (2004)
a permis de préciser le rôle de MYCN, en particulier dans l’initiation des neuroblastomes.
Une hyperplasie des neuroblastes des ganglions paravertébraux est observée chez les souris
sauvages peu avant la naissance, puis elle disparaît par apoptose après la naissance. Or, dans
les souris surexprimant MYCN, la régression de ces neuroblastes est retardée et incomplète en
raison de l’expression de MYCN qui rend ces cellules moins sensibles à l’apoptose.
b) Dans le contrôle du cycle cellulaire, de la prolifération et de la différenciation
De nombreux travaux mettent en évidence la régulation du cycle cellulaire par MYCN. En
effet, la surexpression de MYCN dans des cellules de neuroblastome induit un
raccourcissement de la phase G1 (Lutz et al., 1996), alors que la diminution de l’expression
de MYCN (par des agents chimiques, des approches antisens ou par RNAi) provoque un arrêt
des cellules en phase G1 (Thiele et al., 1985 ; Pession et al., 2004 ; Wallick et al., 2005 ; Bell
et al., 2006). Cet arrêt du cycle est lié à une augmentation de l’expression de la protéine
p27KIP1, un inhibiteur des complexes cycline/Cdk (Nakamura et al., 2003 ; Wallick et al.,
84
2005). Il semble que l’expression de p27KIP1 soit régulée au niveau post-transcriptionnel, car
la diminution de l’expression de MYCN par RNAi n’affecte pas le taux d’ARNm p27KIP1,
mais seulement celui de la protéine (Woo et al., 2008). MYCN peut également réguler le
cycle cellulaire via la protéine p21WAF1, un autre inhibiteur des complexes cycline/Cdk. La
diminution de l’expression de MYCN par RNAi conduit à une augmentation de l’expression
de p21WAF1 qui serait due d’une part à la diminution de l’expression de SKP2 (S-phase kinase-
associated protein 2), appartenant au complexe SCFskp2 impliqué dans la dégradation de
p21WAF1 par le protéasome, et d’autre part à l’augmentation de l’expression de TP53INP1
(tumor protein p53 inducible nuclear protein 1) qui stimule la transactivation du gène codant
p21WAF1 par p53 (Bell et al., 2006 ; 2007). D’autre part, MYCN régule les complexes cycline
D/Cdk4, 6 via une diminution de l’expression de DKK3 (Dickkopf (X. leavis) homolog 3), un
antagoniste de la voie Wnt, et via une diminution du TGF-ß2, indépendamment de p21WAF1
(Bell et al., 2007).
MYCN augmente la prolifération des cellules de neuroblastome, en stimulant la voie de
biosynthèse des polyamines, en particulier en activant la transcription du gène ODC
(ornithine decarboxylase) (Wallick et al., 2005), qui code pour l’enzyme limitante de cette
voie de biosynthèse (Pegg, 2006).
Une autre voie par laquelle MYCN peut réguler la prolifération et la différenciation est celle
faisant intervenir la protéine Id2 qui est capable de séquestrer la protéine de rétinoblastome
Rb, libérant ainsi le facteur E2F qui peut alors activer la transcription des gènes impliqués
dans la progression de la phase S (pour revue, Iavarone et Lasorella, 2004). Id2 est considérée
comme une cible transcriptionnelle de MYCN (Lasorella et al., 2000), et son expression est
réduite lors de la différenciation de cellules de neuroblastome à la suite de la diminution de
l’expression de MYCN (Jögi et al., 2002 ; Lopez-Carballo et al., 2002 ; Woo et al., 2008).
Cependant, la corrélation entre le taux d’expression de MYCN et d’Id2 dans les tumeurs n’est
85
pas clairement établie, en raison de résultats contradictoires (Vandesompele et al., 2003 ;
Wang et al., 2003).
Récemment, des études de RNAi MYCN suivie de microarrays dans deux lignées de
neuroblastome présentant l’amplification de MYCN ont permis d’identifier de nombreux
gènes cibles de MYCN impliqués dans le contrôle du cycle cellulaire (Bell et al., 2007). La
régulation de l’expression de certains de ces gènes par MYCN a été confirmée par RT-PCR.
Le rôle de ces gènes dans les neuroblastomes reste à vérifier.
c) Dans la progression des neuroblastomes
Le fait que l’amplification de MYCN soit associée aux formes les plus agressives de
neuroblastomes laisse penser que MYCN pourrait être impliquée dans la progression de ces
cancers. Cette hypothèse a été confirmée par des travaux montrant que l’expression exogène
de MYCN dans des cellules de neuroblastome stimule leur prolifération, et augmente leur
capacité à former des tumeurs quand elles sont injectées chez des souris nude (Schweigerer et
al., 1990). Les mécanismes à l’origine de cette stimulation de la malignité sont largement
étudiés, ce qui permet une meilleure compréhension des rôles que joue MYCN dans la
progression tumorale des neuroblastomes.
Dans les neuroblastomes, une vascularisation importante est associée à l’amplification de
MYCN (Meitar et al., 1996), ce qui suggère que MYCN régule des facteurs impliqués dans
l’angiogénèse. C’est le cas de l’activine A, un inhibiteur de l’angiogénèse dont l’expression
est réprimée par MYCN dans les cellules de neuroblastome (Breit et al., 2000). Lorsque des
cellules de neuroblastome présentant l’amplification de MYCN et surexprimant l’activine A
sont injectées à des souris nude, l’apparition des tumeurs est retardée, la masse tumorale et la
vascularisation sont diminuées (Schramm et al., 2005), suggérant que la surexpression de
l’activine A peut contrecarrer les effets délétères de l’amplification de MYCN. Un autre
86
facteur impliqué dans l’angiogénèse est réprimé par MYCN dans les cellules de
neuroblastome. Il s’agit de la cytokine LIF, qui inhibe la prolifération des cellules
endothéliales (Hatzi et al., 2002).
Plusieurs études indiquent que MYCN régule également la migration des cellules de
neuroblastome. En effet, la capacité d’invasion et la motilité sont stimulées dans des cellules
présentant un fort taux d’expression de MYCN, par rapport à des cellules exprimant peu ou
pas MYCN, alors que la diminution de l’expression de MYCN (par antisens ou traitement par
l’acide rétinoïque) induit la réduction de ces deux processus (Goodman et al., 1997 ; Zaizen et
al., 1998). MYCN pourrait réguler l’invasion tumorale par le biais des métalloprotéinases,
enzymes permettant la dégradation de la matrice extracellulaire, dont l’expression, la
sécrétion et l’activation sont augmentées dans des cellules surexprimant MYCN et/ou BCL2
(Noujaim et al., 2002).
En activant l’expression du gène NM23-H1 (Godfried et al., 2002), MYCN peut également
être impliqué dans le développement des métastases. En effet, nm23-H1 agit comme un
promoteur de métastases dans les neuroblastomes, en augmentant la survie cellulaire, la
colonisation et en empêchant la différenciation neuronale (Almgren et al., 2004).
6) Thérapies ciblant l’expression de MYCN
Le rôle important de MYCN dans les neuroblastomes et son expression réduite dans les tissus
sains chez l’enfant en font une cible thérapeutique privilégiée (pour revue, Lu et al., 2003).
De plus, la diminution de l’expression de MYCN par RNAi induit un arrêt du cycle, même si
la protéine p53 est mutée (Bell et al., 2006). Diverses stratégies visant à diminuer l’expression
de MYCN ou à inhiber sa fonction sont étudiées. Récemment, trois molécules qui interfèrent
avec la voie MYC ont été identifiées à partir d’une banque du National Cancer Institute (Mo
et Henriksson, 2006 ; Mo et al., 2006). Ces composés, dont la nature n’est pas précisée par les
87
auteurs, semblent également interférer avec la voie MYCN, puisqu’ils induisent l’apoptose
uniquement dans des cellules de neuroblastome surexprimant MYCN. Le mode d’action de
ces molécules n’est pas encore connu, mais elles semblent agir par des mécanismes différents,
car seul un de ces composés induit la diminution de l’expression de MYCN.
MYCN paraît être un antigène tumoral intéressant pour l’immunothérapie anti-cancéreuse. En
effet, MYCN peut être fortement exprimé par les cellules tumorales, alors qu’il est peu ou pas
exprimé dans le tissu sain. Des cellules T cytotoxiques sensibilisées par un épitope peptidique
de MYCN sont capables de tuer des cellules de neuroblastome surexprimant MYCN (Sarkar
et Nuchtern, 2000 ; Himoudi et al., 2007). Ces résultats encourageants suggèrent que
l’immunothérapie visant MYCN est envisageable.
L’utilisation d’inhibiteurs de la voie PI3K/AKT/mTOR peut également être envisagée afin de
diminuer l’expression de la protéine MYCN. En effet, in vitro, des inhibiteurs de la PI3K ou
de mTOR induisent la phosphorylation de la GSK-3ß, qui déstabilise alors la protéine MYCN
et conduit à la diminution de son expression (Chesler et al., 2006 ; Johsen et al., 2007).
MYCN est impliqué dans l’apparition et la progression des neuroblastomes, ce qui pourrait
être lié au fait que l’amplification de MYCN soit un facteur de mauvais pronostic, ce qui
pourrait être lié au fait que MYCN est impliqué dans l’apparition et dans la progression des
neuroblastomes. Il est donc intéressant d’étudier si le VIP est capable de diminuer
l’expression de MYCN dans des lignées de neuroblastome.
II - Objectif 2 : implication de SNAP-25 dans la différenciation neuronale
Des travaux antérieurs réalisés au laboratoire ont permis de caractériser au niveau
morphologique et moléculaire la différenciation induite par le VIP, le PACAP et le PHM dans
88
la lignée SH-SY5Y cultivées en absence de sérum (Héraud et al., 2004). Ces études ont mis
en évidence (Tableau XI):
1) qu’une élongation neuritique est induite par les trois peptides, avec un effet maximal
après 48h de traitement à 10-8 M, alors que la ramification des neurites n’est
provoquée que par le VIP et le PACAP,
2) que l’expression des ARNm des neurofilaments et protéines phosphorylées de
neurofilaments est augmentée par le VIP et le PACAP,
3) que le VIP, le PACAP et le PHM stimulent l’expression d’au moins un marqueur de la
différenciation neuronale autre que les neurofilaments. Le PHM augmente
l’expression de la doublecortine, un marqueur de la migration des neuroblastes,
phénomène qui se produit à un stade précoce de la neurogénèse. Le VIP et le PACAP
stimulent l’expression des protéines MAP2c/d, qui sont associées au développement
neuronal. Le VIP augmente également l’expression de la tubuline ß III, un marqueur
dont l’expression croît avec le degré de différenciation neuronale.
VIP PACAP PHM
Modifications morphologiques : - Elongation neuritique ↑ ↑ ↑ - Ramification neuritique ↑ ↑ Expression de l’ARNm et/ou protéine : - Neurofilaments ↑ ↑ - MAP2c/d ↑ ↑ - Doublecortine ↑ - Tubuline ß III ↑
Tableau XI : Récapitulatif des modifications morphologiques et des modulations de l’expression d’ARNm et/ou protéines induites par les neuropeptides VIP, PACAP, PHM dans les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y après 48h de traitement à 10-8 M.
L’ensemble de ces données indiquent que le traitement par le VIP, le PACAP et le PHM
déclenche une neuritogénèse caractéristique des stades précoces de la différenciation
neuronale. Chaque peptide conduit à un stade de différenciation différent : le VIP induit un
89
stade de différenciation plus avancé que le PACAP, qui induit un stade moins immature que
le PHM (Héraud et al., 2004).
Les travaux effectués dans le cadre de la présente thèse ont eu pour but de poursuivre
l’identification des mécanismes moléculaires participant à la différenciation neuronale de
stade précoce induite par le VIP. Cette étude a concerné seulement de VIP car parmi les
neuropeptides précédemment cité c’est celui qui induit le stade de différenciation le plus
avancé. L’hypothèse testée dans ces travaux a été l’éventuelle implication de la protéine
SNAP-25 (synaptosomal-associated protein of 25 kDa) dans la différenciation des cellules
SH-SY5Y induite par le VIP, car cette protéine est impliquée dans l’élongation des neurites in
vitro.
1) Généralités
a) Identification de la protéine SNAP-25
La protéine SNAP-25 a été identifiée chez la Souris grâce à l’utilisation d’une banque
d’ADNc issus du cerveau. Cette protéine a été localisée au niveau de structures pré-
synaptiques, suggérant un rôle dans la fonction synaptique (Oyler et al., 1989). Par la suite,
deux isoformes, SNAP-25a et SNAP-25b, ont été caractérisées chez le Poulet (Bark, 1993)
puis chez l’Homme (Bark et Wilson, 1994). Le gène SNAP-25 est composé de 8 exons, les
exons 5a et 5b subissant un épissage alternatif à l’origine des deux isoformes SNAP-25a et
SNAP-25b. Au niveau de la séquence protéique, cet épissage alternatif donne lieu à une
différence de seulement 9 acides aminés, situés dans un domaine de palmitoylation nécessaire
à l’ancrage de SNAP-25 à la membrane (Bark, 1993 ; Bark et Wilson, 1994 ; Veit et al.,
1996).
90
b) Complexes SNARE
SNAP-25 appartient à la famille des protéines SNARE (soluble N-ethylmaleimide-sensitive
factor attachment protein receptor), impliquées dans la fusion membranaire intervenant dans
de nombreux processus biologiques. Le complexe SNARE le plus étudié est celui impliqué
dans la libération synaptique de neurotransmetteurs. Ce complexe est constitué des protéines
pré-synaptiques SNAP-25, syntaxine 1 et de la protéine vésiculaire synaptobrévine 2,
également nommée VAMP 2 pour « vesicule-associated membrane protein ». Ces protéines
portent un ou plusieurs domaines SNARE très conservés qui permettent leur interaction entre
elles, et sont liées à la membrane par leur domaine C-terminal transmembranaire ou par
palmitoylation pour SNAP-25. Le complexe SNARE est formé par 4 hélices α, une provenant
de la syntaxine, une autre de la synaptobrévine et les deux dernières de SNAP-25.
L’interaction entre ces hélices est due à des liaisons hydrogènes entre un résidu arginine de la
synaptobrévine, un résidu glutamine de la syntaxine et deux résidus glutamine de SNAP-25
(pour revue, Galli et al., 2002).
La fusion vésiculaire a lieu en deux grandes phases (Figure 14) :
- L’arrimage entre la vésicule et la membrane cible via l’interaction des protéines
SNAP-25, syntaxine et synaptobrévine qui forment alors le complexe SNARE crée un
espace de 2,8 à 3 Å entre les deux membranes.
- La fusion entre les membranes a lieu grâce à l’interaction de la protéine synaptotagmine
avec le Ca2+, qui permet à cette protéine de se lier au complexe SNARE et aux
membranes. Ces interactions provoquent des perturbations des bicouches lipidiques qui
fusionnent alors.
Ce mécanisme de fusion membranaire fait également intervenir de nombreuses autres
protéines, comme par exemple les petites GTPases de la famille Rab (pour revues, Leabu,
2006 ; Wojcik et Brose, 2007).
91
Figure 14 : Implication des protéines du complexe SNARE dans la fusion vésiculaire (d’après Purves et al., 2001). Les protéines SNAP-25, syntaxine et synaptobrévine s’associe pour former le complexe SNARE et permettre l’arrimage entre la vésicule et la membrane cible. Le Ca2+ interagit avec la synaptotagmine, ce qui permet la fusion membranaire.
92
Ce complexe SNARE pré-synaptique semble également être impliqué dans l’élongation
axonale et dendritique et dans la synaptogénèse. Les rôles de la protéine SNAP-25 dans ces
processus impliqués dans la différenciation neuronale sont décrits ci-dessous.
2) Expression et rôles de SNAP-25 au cours du développement neuronal
a) Expression de SNAP-25
L’expression de SNAP-25 est régulée lors du développement neuronal. En effet, dans le
cerveau de souris au cours du développement, l’expression de SNAP-25a est faible, mais
prédominante jusqu’à P7, alors que l’expression de SNAP-25b augmente pour devenir
majoritaire après P7, et atteint un pic d’expression environ 8 semaines après la naissance
(Figure 15). Ces données indiquent que SNAP-25a est l’isoforme majoritaire dans les phases
précoces du développement, alors que SNAP-25b prédomine dans le cerveau adulte (Bark et
al., 1995 ; Boschert et al., 1996).
Figure 15 : Expression des ARNm des isoformes SNAP-25a et SNAP-25b au cours du développement cérébral chez la Souris (d’après Bark et al., 1995). Cette étude est réalisée par protection à la RNase. L’isoforme SNAP-25a est prédominante avant P7, alors que SNAP-25b est majoritairement exprimée après P7. E : jour embryonnaire, P : jour post-natal, W : semaine post-natale. a : SNAP-25a, b : SNAP-25b.
93
b) Rôles de SNAP-25 dans la neuritogénèse et la synaptogénèse
Plusieurs études semblent indiquer l’implication de SNAP-25 dans la croissance neuronale.
En effet, l’inhibition de SNAP-25, par des approches antisens ou par la toxine botulique A,
bloque l’élongation neuritique sans influer sur l’initiation neuritique in vitro dans différentes
population de neurones de rat en culture ou dans les cellules de phéochromocytome PC-12, et
également in vivo, dans les cellules amacrines de rétine de poulet (Osen-Sand et al., 1993 ;
1996 ; Grosse et al., 1999 ; Morihara et al., 1999). Il semble aussi que SNAP-25 soit
impliquée dans la synaptogénèse. Chez le Poulet, la Souris et le Rat, l’expression de
SNAP-25 est fortement augmentée au moment où se produit la formation des synapses
(Catsicas et al., 1991 ; Bark et al., 1995 ; Boschert et al., 1996). Chez la Souris,
l’augmentation de l’expression de SNAP-25 au cours de la synaptogénèse est liée à
l’augmentation de l’expression de SNAP-25b (Bark et al., 1995). Parallèlement, un
changement de localisation de la protéine SNAP-25 des corps cellulaires vers les terminaisons
synaptiques est observé (Oyler et al., 1991 ; Bark et al., 1995). L’ensemble de ces travaux
suggère que l’isoforme SNAP-25b est liée à la synaptogénèse alors que SNAP-25a qui est
exprimée avant SNAP-25b serait impliquée dans la croissance neuritique.
c) Apport des modèles animaux transgéniques
En 2002, l’inhibition de l’expression de SNAP-25 a été réalisée dans des souris, et a permis
de définir les rôles in vivo de cette protéine (Washbourne et al., 2002). Les animaux
hétérozygotes sont viables et ressemblent aux animaux sauvages, alors que les homozygotes
meurent à la naissance probablement à la suite de problèmes respiratoires dus à un défaut de
contraction du diaphragme. Dans les stades précoces du développement embryonnaire (entre
E10,5 et 13,5), aucune différence n’est visible entre les animaux sauvages et les mutants.
Cependant à E18,5, les embryons SNAP-25-/- sont plus petits et ne présentent aucune activité
94
neuromusculaire, comparés aux embryons sauvages. Des analyses histologiques sur des
coupes de cerveau réalisées entre E17,5 et 18,5 indiquent que l’inhibition de l’expression de
SNAP-25 n’induit aucun déficit cellulaire ou architectural du diencéphale ou du tronc cérébral
chez les embryons homozygotes par rapport aux embryons sauvages. De plus, lorsque des
neurones issus d’animaux SNAP-25-/- sont mis en culture pendant 7 jours, ils présentent une
croissance neuritique et de nombreuses synapses comme les cellules issues d’animaux
sauvages. Ces résultats ont été confirmé par une autre étude mettant en évidence que les
souris SNAP-25-/- présentent une croissance axonale embryonnaire normale (Molnar et al.,
2002). L’ensemble de ces données suggère que la protéine SNAP-25 n’est pas nécessaire dans
les phases précoces du développement neuronal impliquant la neuritogénèse et la formation
des synapses. Cependant, ces études, qui contredisent les résultats précédents s’arrêtent à
E18,5, période où le taux d’expression de SNAP-25 est encore faible et qui précède la
maturation synaptique.
Récemment, d’autres travaux ont été menés sur ces souris SNAP-25-/-. Comme
précédemment, des neurones ont été mis en culture, puis transfectés par l’isoforme SNAP-25a
ou SNAP-25b afin de mieux déterminer les rôles respectifs de chaque isoforme (Delgado-
Martinez et al., 2007). Les résultats de cette étude indiquent tout d’abord que la restauration
de l’expression de chaque isoforme empêche la dégénérescence des cellules qui apparaît après
8 jours de culture. La neuritogénèse et la synaptogénèse ont également été étudiées, car les
neurones SNAP-25-/- survivants présentent une faible arborisation neuritique et une faible
densité synaptique par rapport aux cellules témoins. L’expression de SNAP-25, quelle que
soit l’isoforme considérée, restaure une ramification neuritique et un nombre de synapses
similaires à ceux observés dans les cellules issues d’animaux sauvages. Ces données
indiquent donc que SNAP-25 est impliquée dans la ramification neuritique et dans la
synaptogénèse.
95
Les résultats apparemment contradictoires de ces études pourraient être dus au fait que les
auteurs, bien qu’ils utilisent les mêmes souris SNAP-25-/-, travaillent à des stades différents
du développement. Washbourne et al. (2002) observent les cellules avant qu’elles ne
dégénèrent alors que Delgado-Martinez et al. (2007) étudient les cellules qui ont survécu à la
dégénérescence. Il apparaît ainsi que la protéine SNAP-25 ne semble pas nécessaire dans la
phase d’initiation de la neuritogénèse et de la synaptogénèse (Washbourne et al., 2002 ;
Molnar et al., 2002), alors qu’elle l’est dans les stades plus tardifs (Delgado-Martinez et al.,
2007).
96
PRESENTATION DES TRAVAUX
97
Présentation de l’article n°1
Vasoactive intestinal peptide decreases MYCN expression and synergizes with retinoic
acid in a human MYCN-amplified neuroblastoma cell line
Lucie Chevrier, Annie-Claire Meunier, Stéphanie Cochaud, Jean-Marc Muller, Corinne
Chadéneau.
Soumis pour publication
Les travaux présentés dans ce premier article ont pour but de déterminer si la différenciation
de cellules de neuroblastome induite par le VIP s’accompagne de la diminution de
l’expression de l’oncogène MYCN, impliqué dans la malignité de ces tumeurs. Les effets du
VIP sur la régulation de l’expression de MYCN sont comparés à ceux de l’acide rétinoïque,
agent différenciateur connu pour diminuer l’expression de ce gène et utilisé dans la thérapie
de certains neuroblastomes. Des co-traitements ont ensuite été réalisés afin de déterminer si
ces deux molécules peuvent agir en synergie. Les résultats indiquent que :
1) Le VIP diminue l’expression de MYCN au niveau ARNm et protéique, en particulier dans
la lignée IMR-32 présentant l’amplification de cet oncogène : une diminution transitoire de
près de 50% est observée après quelques heures de traitement par le VIP à 10-6 M.
2) L’acide rétinoïque, dans cette même lignée, induit une diminution de l’expression de
l’ARNm MYCN de 25% environ après plusieurs jours de traitement à 10-5 M. Le VIP et
l’acide rétinoïque présentent donc des cinétiques complémentaires : le VIP agit après
quelques heures, alors que l’acide rétinoïque induit un effet après quelques jours de
traitement.
98
3) Le VIP et l’acide rétinoïque en co-traitement ont des effets synergiques en termes
d’efficacité et de temps sur la diminution de l’expression de MYCN. L’association du VIP et
de l’acide rétinoïque conduit à une diminution plus importante, plus précoce et plus durable
de l’expression de MYCN que les deux agents seuls. En effet, les co-traitements diminuent
d’au moins 30% l’expression de l’ARNm MYCN entre 1 heure et 96 heures de traitement,
avec un effet maximal de 48% après 6 heures. Cette synergie a également lieu au niveau de
l’expression des protéines MYCN.
4) La diminution de l’expression de MYCN induite par les co-traitements VIP et acide
rétinoïque se répercute sur l’expression de deux gènes cibles de MYCN, SKP2 (S-phase
kinase-associated protein 2) et TP53INP1 (tumor protein p53 inducible nuclear protein 1).
L’expression de l’ARNm SKP2 est diminuée par les co-traitements, alors que le taux
d’ARNm TP53INP1 est augmenté.
En considérant l’ensemble de ces données, ce premier article indique que la différenciation de
cellules de neuroblastome induite par le VIP s’accompagne de la diminution de l’expression
de l’oncogène MYCN, en particulier dans une lignée présentant l’amplification de ce gène. De
plus, le VIP et l’acide rétinoïque agissent en synergie sur la diminution de l’expression de
MYCN ainsi que sur l’expression de gènes cible impliqués dans le contrôle du cycle
cellulaire. Cela renforce l’intérêt thérapeutique potentiel du VIP dans ces tumeurs.
99
Vasoactive intestinal peptide decreases MYCN expression and synergizes with retinoic
acid in a human MYCN-amplified neuroblastoma cell line
Lucie Chevrier, Annie-Claire Meunier, Stéphanie Cochaud, Jean-Marc Muller, Corinne
Chadéneau.
Institut de Physiologie et Biologie Cellulaires, Université de Poitiers, CNRS ; 40 avenue du
Recteur Pineau, Poitiers, F-86022, France.
Running title: VIP decreases MYCN expression in neuroblastoma cells
Key words: VIP, MYCN, neuroblastoma, retinoic acid, differentiation
Abbreviations list: VIP: vasoactive intestinal peptide, RA: retinoic acid, 9-RA: 9-cis retinoic
acid, at-RA: all-trans retinoic acid.
Footnotes:
Grants: This work was supported by grants from the Ligue Contre le Cancer. Lucie Chevrier
and Stéphanie Cochaud were recipients of PhD fellowships from the Ligue Contre le Cancer
and from the French “Ministère de l’Enseignement et de la Recherche”, respectively.
Requests for reprints: Corinne Chadéneau, Institut de Physiologie et Biologie Cellulaires,
Université de Poitiers, CNRS ; 40 avenue du Recteur Pineau, Poitiers, F-86022, France.
Phone: 33 5 49 45 35 51, e-mail: [email protected]
100
ABSTRACT
Neuroblastoma is a pediatric tumor which can spontaneously regress or differentiate into
benign tumor. MYCN oncogene amplification occurs in 22% of neuroblastomas and is
associated with poor prognosis. Retinoic acid (RA), a molecule able to induce differentiation
and to decrease MYCN expression, is used in the therapy of neuroblastomas. The
neuropeptide vasoactive intestinal peptide (VIP) is known to control proliferation or
differentiation of numerous cancer cells. In vitro, VIP induces differentiation of
neuroblastoma cells. To determine whether VIP could modulate MYCN expression, we
carried out real-time quantitative RT-PCR and western immunoblotting analyses in human
neuroblastoma SH-SY5Y and IMR-32 cells. The results indicated that VIP reduced MYCN
mRNA and protein expression, especially in the MYCN-amplified IMR-32 cells, with a
maximal and transient decrease by about 50% after few hours of treatment with VIP at 10-6
M. This effect was compared to that of RA at 10-5 M, which induced a diminution of MYCN
mRNA expression by about 25% after few days of treatment. This indicated that VIP and RA
display complementary kinetics. Cotreatments showed that VIP and RA had synergistic
effects in term of efficiency and time on regulation of MYCN mRNA expression. This
potentiating effect was also observed for expression of MYCN proteins and of two MYCN
target genes, SKP2 and TP53INP1. These results suggest that VIP, in combination with RA
may have a potential therapeutic benefit in neuroblastomas with MYCN amplification, a
genetic abnormality associated with poor prognosis.
101
INTRODUCTION
Neuroblastomas are malignant tumors derived from neural crest. They represent the
most common extracranial tumor of childhood. A particular feature of neuroblastomas is their
clinical heterogeneity: some neuroblastomas can spontaneously regress or differentiate into a
benign form, the ganglioneuroma, while others are not responsive to actual therapies. The 3-
year survival ranges from 95%, for neuroblastomas with good prognosis, to only 30% for
tumors with poor prognosis (1). These different clinical behaviours can be explained in part
by numerous genetic alterations which occur in neuroblastomas. Among these, a frequent
abnormality is amplification of MYCN oncogene which is found in 22% of neuroblastomas.
This amplification is associated with advanced stage disease, rapid tumoral progression and
poor prognosis (1, 2). The role of MYCN in development of neuroblastomas is demonstrated
in transgenic mice which overexpress MYCN in cells derived from neural crest and develop
neuroblastomas (3). In these animals, administration of MYCN antisense oligonucleotides
reduces tumor incidence and tumoral mass (4). MYCN belongs to the myc proto-oncogene
family with MYCC and MYCL. The MYCN gene encodes two nuclear proteins of 65 and 67
kDa (5) which act as transcriptional activators after binding to the MAX protein (6). In mice
and chicken, MYCN is first expressed homogeneously in neural crest, and next only in
neuroblasts. After birth, MYCN expression decreases and is faintly detected in the adult brain
(7).
Vasoactive intestinal peptide (VIP) is a neuropeptide involved in numerous functions
including control of proliferation and/or differentiation in normal and tumoral cells (8). VIP is
often present in neuroblastomas and its rate increases with the degree of differentiation of
these tumors. A good prognosis is associated with VIP-secreting neuroblastomas (9).
Expression of high-affinity VIP receptors have long been reported in neuroblastoma cells
(10). In vitro, VIP-receptor system expression is stimulated during dibutyryl-cAMP
102
(dbcAMP)-, phorbol esters- or retinoic acid (RA)-induced differentiation of neuroblastoma
cells (11). Furhermore VIP is known to promote differentiation in these cells (12-14). We
have demonstrated that VIP induced neuritogenesis, a typical characteristic of neuronal
differentiation, in the human neuroblastoma SH-SY5Y cell line (15). In these cells,
tetradecanoylphorbol 13-acetate (TPA)- or RA-induced differentiation is accompanied by a
decreased MYCN expression (16, 17). In the present study, we asked whether VIP-mediated
differentiation is associated with a down-regulation of MYCN expression in SH-SY5Y cells
and in another human neuroblastoma cell line, IMR-32. In the latter, VIP induces
differentiation and proliferation arrest (13, 18), but contrary to SH-SY5Y cells, IMR-32 is a
MYCN-amplified cell line (19).
The results obtained in this study indicated that VIP decreased MYCN mRNA expression with
a minor amplitude in SH-SY5Y cells, whereas an important effect was observed in IMR-32
cells. In these cells, VIP reduced the level of MYCN proteins. We next compared the effect of
VIP to that of RA on down-regulation of MYCN expression in IMR-32 cells. We observed
that VIP or RA reduced MYCN mRNA level but for different time intervals after treatment.
Finally, cotreatments with VIP and RA were carried out and indicated that these two
differentiating agents could act in synergy on MYCN oncogene expression and also on MYCN
target genes.
MATERIALS AND METHODS
Cell culture: SH-SY5Y and IMR-32 cells were routinely seeded at a density of 106 cells/25
cm2 flask, in high glucose (4,500 mg/liter) Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM)
with GlutaMAX™ I and sodium pyruvate (Invitrogen, Cergy Pontoise, France), supplemented
with 10% fetal calf serum (FCS) and 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin
(Invitrogen). Cells were incubated in a humidified 95 % air, 5 % CO2 controlled atmosphere
103
at 37°C. Medium was changed every 3 or 4 days. Passages were performed once per week,
using 1X trypsin/EDTA (Invitrogen).
Treatments: SH-SY5Y cells were seeded at a density of 3x106 cells/25 cm2 flask in the
medium described above and grown to subconfluence for 6 days with a renewal of medium
on the third day. Serum-containing medium was then replaced with serum-free medium, and
cells were cultured for 7 days, with a renewal of serum-free medium on the fourth day. Before
treatment, medium was change for serum-free medium supplemented with 0.1% bovine
serum albumin (BSA), fraction V (Invitrogen). The neuropeptide VIP (Neosystem, Stasbourg,
France) was prediluted to 10-6 M in serum-free medium containing 0.1% BSA. Cells were
treated daily with VIP to a final concentration of 10-8 M. An equal volume of medium with
0.1% BSA without neuropeptide was added to control cells.
IMR-32 cells were seeded at a density of 3x106 cells/25 cm2 flask for 3 days in medium with
5% FCS, 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin. Before treatment, medium was
changed and cells were treated daily with VIP (final concentration of 10-6 M) and/or RA
(Sigma-Aldrich, St Guentin-Fallavier, France) (final concentration of 10-5 M), or glucagon
(Neosystem) (final concentration of 10-6 M). An equal volume of PBS and/or
dimethylsulfoxide (DMSO) was added to control cells.
Micrographs of cells: Video images of IMR-32 cells treated as above with VIP and/or RA
for 48 hr were captured using a digital camera connected to a phase-contrast Olympus
microscope.
cDNA synthesis: Total RNA was isolated by using the GenEluteTM Mammalian Total RNA
kit (Sigma-Aldrich) following the manufacturer’s instructions. Total RNA was quantified
104
with GeneQuant II spectrophotometer (Pharmacia). Aliquots of total RNA were treated with
1 U/µg RNA of DNase I Amplification Grade (Invitrogen) according to the manufacturer’s
instructions, and in the presence of 10 U/µg RNA of RNaseOUT (Invitrogen). After DNase
inactivation, RNA was reverse transcribed using random nonamers (Sigma-Aldrich) and M-
MLV Reverse Transcriptase H Minus (Promega, Lyon, France) according to the
manufacturer’s instruction.
Real-time RT-PCR and quantification: Real-time RT-PCR was carried out with the
LightCycler System (Roche Diagnostics, Meylan, France) by using the LightCycler-FastStart
DNA Master SYBR Green I kit as previously described (15). GAPDH and β-actin mRNA
levels were used to normalize the mRNA levels between samples. Primers were designed with
Primer3 software (http://www.genome.wi.mit.edu/cgi-bin/primer/primer3_www.cgi) except
for GAPDH and β-actin primers (20), and were as followed (5’-3’): MYCN forward:
CGACCACAAGGCCCTCAGT, MYCN reverse: TGACCACGTCGATTTCTTCCT, SKP2
forward: CTCCACGGCATACTGTCTCA, SKP2 reverse: GGGCAAATTCAGAGAATCCA,
TP53INP1 forward: CTTCCTCCAACCAAGAACCA, TP53INP1 reverse:
GATGCCGGTAAACAGGAAAA. The cycle program for all amplified cDNA was: 5 sec at
95 °C, 5 sec at 60 °C for GAPDH and MYCN or at 65 °C for β-actin, SKP2 and TP53INP1,
and 10 sec at 72 °C.
Western immunoblotting analysis: After treatments, cells were harvested with 1X
trypsin/EDTA, washed twice with cold PBS, and resuspended in 10 µl per 106 cells of ice-
cold lysis buffer [10 mM Tris, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, pH 8.0, 0.5 mM dithiothreitol (DTT),
0.5 % CHAPS, 10 % glycerol] supplemented with 0.1 mM phenylmethylsulfonylfloride
(PMSF) for SH-SY5Y cells, and for IMR-32 cells with additional protease inhibitors (Sigma-
105
Aldrich) containing 10 µg/ml aprotinin, 10 µg/ml leupeptin, 1 mM AEBSF, 1 µg/ml bestatin,
1 µg/ml antipaïn, 1 µg/ml pepstatin. After 30 min on ice, the samples were centrifuged at 4°C
for 20 min at 10,000 g. For extraction of nuclear proteins, cells were resuspended in 1 ml per
5x106 cells of lysis buffer (10 mM Tris, pH 7.4, 3 mM MgCl2, 10 mM NaCl, 0.5 % NP40).
After 5 min on ice and centrifugation for 10 min at 2,000 g at 4°C, the pellet containing nuclei
was resuspended in 30 µl per 5x106 cells of lysis buffer (20 mM HEPES, pH 7.9, 0.3 M NaCl,
1.5 mM MgCl2, 1 mM DTT, 1 mM PMSF, and the same additional protease inhibitors
mentioned above) and incubated 30 min on ice under vigorous shaking. Samples were then
centrifuged 20 min at 10,000 g at 4°C. The supernatants were stored at -80°C. Proteins
concentration was determined by using the BioRad DC Protein Assay (BioRad, Marnes la
Coquette, France). Total and nuclear proteins were resolved in 8 % SDS-PAGE and
electroblotted for 1 hr at 200 mA, onto Immobilon-P membranes (Millipore, St Quentin en
Yveline, France). Total proteins on the membranes were detected by Coomassie blue staining.
Membranes were blocked overnight at 4°C, by using 5% nonfat milk in TBS containing 0.1%
Tween 20 (TBST) and incubated for 1 hr at room temperature with anti-MYCN antibodies
diluted in blocking solution. The membranes were rinced 3 x 10 min at room temperature in
TBST, incubated for 1 hr with the secondary antibody in 5% milk in TBST, and again rinced
with TBST. Antibodies used were: anti-MYCN NCM II 100 (Calbiochem VWR, Fontenay
sous Bois, France) 1:50 and secondary antibody anti-mouse IgG, H&L Chain Specific (goat)
peroxydase conjugated (Calbiochem) 1:20000; or anti-MYCN C19 (Santa-Cruz, Santa Cruz,
CA, USA) 1:200 and secondary antibody anti-rabbit IgG, H&L Chain Specific (goat)
peroxydase conjugated (Calbiochem) 1:20000. These anti-MYCN antibodies were previously
used in other studies (21, 22). After a brief wash in TBS, bound antibodies were revealed by
chemiluminescence with the ECL+ detection system (Amersham Bioscience, GE Healthcare
Europe GmbH, Orsay, France). The ECL and Coomassie blue stainings were quantified by
106
densitometry with the VisioLab 2000TM image analyser (Biocom), with measures carried out
independently by two investigators. The densitometric measurements of ECL staining were
normalized to the corresponding Coomassie blue staining as loading control.
Statistical analyses: Statistical analyses were calculated using GraphPad Prism.
RESULTS
VIP decreased MYCN mRNA expression in human neuroblastoma cell lines.
The effect of VIP on regulation of MYCN mRNA expression was studied by real-time
quantitative RT-PCR in two human neuroblastoma cell lines, SH-SY5Y and IMR-32, which
have 1.5 and 25 copies of MYCN oncogene per haploid genome, respectively (19). SH-SY5Y
and IMR-32 cells were treated with VIP for 0.5, 1, 6 and 48 hr with two additions of the
neuropeptide at 24 hr interval.
We have previously shown that VIP induced neuritogenesis in serum-starved SH-SY5Y cells.
The maximal effect was obtained with 10-8 M VIP (15). Same culture and treatment
conditions were repeated here. Our results showed that MYCN mRNA expression was faintly
reduced after 0.5-hr to 48-hr treatments with VIP, with a statistically significant effect after 48
hr (Fig. 1A).
In IMR-32 cells, previous studies have indicated that VIP induced differentiation with a
maximal effect on proliferation arrest at 10-6 M (13, 18). Same treatment conditions were used
in the present study. The data from our experiments indicated that 1-hr and 6-hr treatments
with VIP decreased transiently and significantly MYCN mRNA expression by 53% and 32%,
respectively (Fig. 1B). These results were obtained with GAPDH mRNA as an internal
reference. Comparable decreases were observed when ß-actin mRNA was used as another
internal reference (data not shown).
107
To determine whether down-regulation of MYCN mRNA expression was specific to VIP, the
effect of glucagon, a neuropeptide which belongs to the VIP family but which does not bind
to the same receptors, was tested. IMR-32 cells were treated with glucagon at 10-6 M and for
1 hr because the maximal effect of VIP was observed after a 1-hr treatment. The results
showed that glucagon had no significant effect on MYCN mRNA expression in IMR-32 cell
line (Fig. 1C).
MYCN mRNA expression was compared in control SH-SY5Y and IMR-32 cells. The data
indicated that MYCN mRNA was 26-fold more expressed in IMR-32 cells than in SH-SY5Y
cells (data not shown).
VIP decreased expression of MYCN proteins in human neuroblastoma cell lines.
To determine whether VIP-induced down-regulation of MYCN mRNA expression was
followed by a decreased expression of MYCN proteins, western immunoblotting analyses
were carried out. Two different anti-MYCN antibodies were tested. The anti-MYCN NCM II
100 antibody (Fig 2A) detected the expected 65 and 67 kDa proteins but also additional
proteins in SH-SY5Y and IMR-32 cells. In HeLa cell line, known to express traces amount of
MYCN proteins (23), only a faint expression of these 65 and 67 kDa proteins was observed
and the additional proteins were as well represented as in NB cells. In nuclear protein extracts
from IMR-32 cells, only the 65 and 67 kDa proteins were present, in agreement with the
known localization of this transcriptional factor. These two proteins were also detected with
another anti-MYCN antibody (C-19) in the nuclear extract, together with smaller proteins
faintly labelled (Fig. 2B).The anti-MYCN NCM II 100 was used in the next western
immunoblotting experiments in which the 65 and 67 kDa proteins were analyzed by
densitometry.
108
In comparison with control cells, expression of MYCN proteins decreased faintly and
transiently in VIP-treated SH-SY5Y cells, with a maximal effect of 24% after a 3-hr treatment
which was not statistically significant (Fig. 2C). In IMR-32 cell line, VIP reduced expression
of MYCN proteins from 3 hr of treatment, with a maximal and statistically significant
diminution of 54% after a 3-hr treatment (Fig. 2D). Thus, the faint or important down-
regulation of MYCN mRNA expression observed in VIP-treated SH-SY5Y or IMR-32 cells,
respectively, is followed by a reduction of expression of MYCN proteins, especially in IMR-
32 cells which present a higher number of MYCN copies than SH-SY5Y cells. Hence, further
experiments were focused on IMR-32 cell line.
Comparison of effects of VIP and RA on cell morphology and on MYCN mRNA
expression in IMR-32 cells.
The well known differentiating agent RA has been reported to decrease MYCN expression in
NB cells after several days of treatment (17, 24). However, little is known about the short-
term effects of RA on MYCN expression. To compare the action of VIP to that of RA, we
tested two retinoid isomers: 9-cis RA (9-RA) and all-trans RA (at-RA), in IMR-32 cell line. It
was previously shown that these two isomers had non similar effects on expression of
differentiation biomarkers in IMR-32 cells (25). IMR-32 cells were treated daily with 9-RA or
at-RA at 10-5 M for 0.5, 1, 6, 48, 72 and 96 hr. These molecules induced formation of cells
aggregates and/or neuritic extensions (Fig. 3), as previously described in RA-treated IMR-32
cells (13). Compared to control cells (Fig. 3A), a 48-hr treatment with at-RA led only to
formation of cells aggregates (Fig. 3E), while 9-RA induced both cells aggregates and
neuritogenesis (Fig. 3C). This neuritogenesis appeared to be less important than that induced
by VIP (Fig. 3B).
109
The effect of RA isomers on MYCN mRNA expression was then studied by real-time
quantitative RT-PCR (Fig. 4A). The data indicated that after a 0.5-hr treatment, both RA
isomers decreased MYCN mRNA expression by about 23%, an effect which could not be
observed after 1 hr and 6 hr of treatment. A statistically significant increased expression of
MYCN mRNA was even induced after a 6-hr treatment with 9-RA. After 48-hr and 72-hr
treatments, MYCN mRNA expression was reduced by both RA isomers with a maximal and
statistically significant lowering of 30% after a 72-hr treatment with 9-RA. This isomer was
more efficient than at-RA in down-regulation of MYCN mRNA expression, while at-RA
induced a long lasting decrease which raised 21% after a 96-hr treatment. Thus, 9-RA and at-
RA did not exactly display the same effects on MYCN mRNA expression. To compare these
results with those obtained for VIP treatment, the kinetic of VIP effect in IMR-32 cells shown
in Figure 1B was complemented with longer treatment times. This indicated that 72- and 96-
hr stimulations by VIP did not modify MYCN mRNA expression (data not shown).
Interestingly, it was observed that VIP and RA displayed complementary kinetics of down-
regulation of MYCN mRNA expression. Indeed, VIP decreased MYCN mRNA expression
only after 1-hr and 6-hr treatments, whereas at least one of the RA isomers reduced MYCN
mRNA level after 0.5, 48, 72 and 96 hr but not after 1 and 6 hr of treatments.
Effects of cotreatments with VIP and RA on cell morphology and on MYCN expression
in IMR-32 cells.
We next studied the combined effects of the differentiating agents VIP and RA. IMR-32 cells
were treated daily with VIP at 10-6 M together with 9-RA or at-RA at 10-5 M for 0.5, 1, 6, 48,
72 and 96 hr. After 48 hr of cotreatment, cells exhibited a neuritic elongation (Fig. 3D, F) and
formed aggregates but these latter were less well-delimited than those induced by RA alone
(Fig. 3C, E).
110
The results of real-time quantitative RT-PCR showed that the association of VIP and RA led
to an early and lasting decreased MYCN mRNA expression (Fig. 4B) which was more
important than RA-induced down-regulation (Fig. 4A). Slightly higher effects were often
observed with VIP/9-RA cotreatments compared with VIP/at-RA cotreatments, with at least a
lowering of 30% for each time of treatment from 1 hr to 96 hr and a maximal reduction of
48% after a 6-hr treatment with VIP/9-RA stimulation. This potentiating effect of VIP and
RA on reduction on MYCN / GAPDH mRNA level was confirmed by using the ß-actin
mRNA to normalize MYCN mRNA level (data not shown).
To determine whether the potentiating effect of VIP and RA also occurred at the protein level,
expression of MYCN proteins was studied by western immunoblotting. This analysis was
carried out after 48 hr, a treatment time after which VIP or RA alone had no or faint effect on
MYCN mRNA expression, contrary to VIP/RA cotreatments which decreased MYCN mRNA
level by about 40%. The data indicated that VIP, 9-RA and at-RA alone faintly reduced
expression of MYCN proteins (Fig. 5, lanes 3, 4, 5, 7) by about 20%, and that cotreatments
amplified this down-regulation (Fig. 5, lanes 3, 6, 8), reaching about 40%, whichever RA
isomer was used. For comparison, the effect of a 3-hr treatment with VIP which induced a
maximal lowering of expression of MYCN proteins of 54% (Fig.1B), is shown (Fig. 5, lanes
1, 2). Thus, VIP and RA acted in synergy on MYCN expression in IMR-32 cell line after a
48-hr treatment.
Effects of VIP and/or RA on expression of MYCN target genes in IMR-32 cells.
Finally, we tested whether the decrease in the transcriptional factor MYCN expression
induced by VIP/RA cotreatments affected expression of MYCN target genes. In a recent
study, several genes involved in cell cycle were identified as being regulated by MYCN. This
was shown in IMR-32 cells by microarrays after MYCN RNA interference and confirmed by
111
real-time quantitative RT-PCR (26). Among these genes, SKP2 (S-phase kinase-associated
protein 2) was down-regulated early after decrease in MYCN expression, while expression of
TP53INP1 (tumor protein p53 inducible nuclear protein 1) was up-regulated late after MYCN
knockdown. Thus we studied mRNA expression of SKP2 and TP53INP1 after 6- and 72-hr
treatments, respectively, in IMR-32 cells treated with VIP and/or RA. The data from real-time
quantitative RT-PCR indicated that SKP2 mRNA expression was only faintly reduced after a
6-hr treatment with VIP or RA alone (Fig. 6A), whereas cotreatments induced a statistically
significant lowering, with a maximal effect of 60% after VIP/9-RA cotreatment. Although
reduced, this effect was still observed after a 48-hr cotreatment at least for VIP/9-RA that
decreased more efficiently SKP2 mRNA level than 9-RA alone (Fig. 6B). For TP53INP1, the
data indicated that, after a 72-hr treatment, VIP and RA alone or in cotreatment tended to
elevate expression of this mRNA (Fig. 6C). This effect was more important and statistically
significant with cotreatments. Compared to control cells, cotreatments increased TP53INP1
mRNA expression by about 2-fold.
DISCUSSION
The data presented in this study indicate that, in MYCN-amplified IMR-32 cell line,
VIP decreases MYCN expression at the mRNA and protein levels. Moreover, we found that
VIP and RA had synergistic effects in term of efficiency and time on regulation of expression
of MYCN and of two MYCN target genes, SKP2 and TP53INP1.
In this work, we also studied the effect of VIP in non-amplified SH-SY5Y cell line,
for which the neuropeptide had little effect on MYCN expression. We observed that MYCN
proteins are less expressed in SH-SY5Y cells than in IMR-32 cells, according to the MYCN
mRNA level which is much higher in IMR-32 cells. This difference in MYCN expression
level between these two cell lines is in quite good agreement with the known number of
112
MYCN gene copies: 1.5 and 25 per haploid genome, in SH-SY5Y and IMR-32 cells,
respectively (19). The limited effect of VIP observed in SH-SY5Y cells could be due to the
faint level of MYCN expression in this cell line.
During RA-induced differentiation of neuroblastoma cells, morphological
differentiation and cell-cycle arrest follow decrease in MYCN expression (27). Here, in IMR-
32 cells, we have shown that the effect of VIP on MYCN expression was rapid since a
maximal down-regulation of MYCN mRNA occurred after a 1-hr treatment, while
neuritogenesis was well established after 48 hr of stimulation. Thus, VIP, as well as RA,
induced reduction in MYCN expression, which is an early event that precedes morphological
differentiation.
In IMR-32 cell line, we noticed that 9-RA induced neuritogenesis and cells aggregates,
whereas at-RA led only to formation of cells aggregates. These observations are in agreement
with studies showing that 9-RA is more efficient than at-RA in promoting morphological
differentiation in neuroblastoma cell lines (28-30). In our experiments, this differential effect
might be explained by expression of two classes of RA receptors in IMR-32 cells: RA
receptors (RAR) and Retinoid X receptors (RXR) (25). Formation of cells aggregates could
be mediated by RAR, which bind both RA isomers tested, while neuritogenesis could involve
9-RA selective RXR.
At molecular level, we observed that MYCN mRNA expression was first decreased
after a 0.5-hr treatment with 9-RA, next raised after a 6-hr treatment, and then was reduced
again after 48 and 72 hr of treatment. Thus, 9-RA has opposite effects on MYCN expression
according to treatment time. Such observations indicated that complex regulation governs
MYCN expression during time, suggesting the interest in studying short- and long-term
effects of differentiating agents. Similar time-dependent effects of RA have already been
shown in SH-SY5Y cells: after a 1-hr treatment, invasion capacity is increased, while a 96-hr
113
treatment inhibits invasiveness (31). In previous works, RA-induced MYCN expression
decrease was generally studied after few days of treatment. In our experiments, a 72-hr
treatment with RA induced a down-regulation comparable to that obtained by Zaizen et al.
(24) which found that MYCN mRNA expression decreases by 25% after a 72-hr treatment
with at-RA.
MYCN proteins are transcriptional factors which regulate expression of numerous
genes. We tested two of these genes, SKP2 and TP53INP1. SKP2 belongs to the SCFspk2
complex which is responsible for polyubiquitylation of cell cycle inhibitors such as p21WAF1
(32). TP53INP1 induces cell cycle arrest in G1 phase and enhances p53-mediated apoptosis
(33). After MYCN RNA interference in IMR-32 cells, it was demonstrated that SKP2 mRNA
expression was lowered of 50% and that TP53INP1 mRNA level was increased with a
maximal effect of 7-fold (26). In our experiments, a comparable reduction of SKP2 mRNA
expression was induced by VIP and RA cotreatments. Stimulation of TP53INP1 mRNA
expression was also induced in our VIP and RA cotreatments but with a maximal increase by
only 2-fold, which is clearly less than the 7-fold observed after MYCN knockdown (26). This
could be due to the fact that VIP and RA could have effects on multiple pathways and
transcriptional factors regulating TP53INP1 expression. We also tested MDM2 expression,
previously shown as another MYCN target gene, whose product prevents p53-mediated
apoptosis (34). MDM2 expression was unchanged in our experiments (data not shown). This
is in agreement with recent studies in which no variation of MDM2 expression after MYCN
knockdown was found (26, 35).
Some studies have shown that the differentiating effect of RA can be enhanced when
RA is used in combination with molecules such as histone deacetylase inhibitors or
interferon-γ (36, 37). A potentiating effect of RA and VIP has already been shown on tissue
transglutaminase activity which is associated with apoptosis in neuroblastoma cells (38).
114
Here, we report that this synergy between RA and VIP could also affect morphological
differentiation and expression of MYCN and of its target genes. Such synergistic effects could
be related to studies demonstrating that VIP and RA systems are linked. Indeed, in
neuroblastoma cell lines, RA treatment stimulates VIP expression and increases the number
of functional VIP binding sites (12, 39). Furthermore, in neuroblastoma SK-N-SH cell line,
overexpression of the VIP receptors type VPAC1 results in an increased RA receptor
expression (40).
The VIP-receptor system is involved in control of either proliferation or
differentiation, depending on the type of cancer cells considered (8). Numerous studies allow
the proposal that VIP or antagonists of this peptide could exhibit a therapeutic interest in
various cancers. For example, VIP decreases growth of human small cell lung cancer cells in
vitro and in vivo in mice (41), whereas VIP-antagonists lower growth of human ovarian or
prostatic cancer cells in vivo in mice (42, 43). Moreover, other VIP-antagonists reduce or
delay development of colon or mammary cancers in animal models of carcinogenesis induced
chemically or genetically (44, 45). It was also observed that a VIP-antagonist enhances the
effects of chemotherapeutic drugs in vitro and in vivo (46, 47). The present in vitro study,
which demonstrated that VIP in association with RA decreased MYCN expression in a
synergistic manner, extends the potential therapeutic interest of this neuropeptide to
neuroblastoma cells with MYCN amplification, a genetic abnormality associated with poor
prognosis in this type of cancer.
ACKNOWLEDGEMENTS
We thank D. Guyonnet for his excellent technical assistance with DNA sequencing and J.
Habrioux for his helpful advices in the preparation of figures.
115
FIGURE LEGENDS
Figure 1: Real-time quantitative RT-PCR analysis of MYCN mRNA in SH-SY5Y cells
treated with VIP (A) or in IMR-32 cells treated with VIP (B) or glucagon (C). Total RNA
was extracted from SH-SY5Y cells and IMR-32 cells treated or not with VIP at 10-8 M and
10-6 M, respectively, or extracted from IMR-32 cells treated with glucagon at 10-6 M. VIP-
treated cells were cultured for 0.5, 1, 6 and 48 hr and glucagon-treated cells were cultured for
1 hr. MYCN mRNA expression was quantified by real-time RT-PCR as described in materials
and methods and GAPDH mRNA was used as internal reference. Values are obtained from
three independent experiments performed in duplicate and are expressed as percentage of
control values. Histograms represent means ± SEM. The statistical significance was evaluated
using a Wilcoxon test (* = P<0.05).
Figure 2: Western immunoblotting of MYCN proteins and quantification analyses of
expression of MYCN proteins in SH-SY5Y and IMR-32 cells. Total proteins from SH-
SY5Y, IMR-32 and HeLa cells, and nuclear proteins of IMR-32 cells were resolved by SDS-
PAGE, transferred to membranes and further probed with the antibody anti-MYCN NCM II
100 (A) or the anti-MYCN C19 (B). Total proteins were extracted from SH-SY5Y (C) and
IMR-32 (D) cells treated or not with VIP at 10-8 M and 10-6 M, respectively, and cultured for
1, 3, 6, 48 hr. Proteins were analysed as in (A). The densitometric measurements of ECl
staining were normalized to the corresponding Coomassie blue staining as loading control.
Values were obtained from three independent experiments and measures were carried out
independently by two investigators. Histograms represent means ± SEM. Values are
expressed as a percentage of corresponding controls. The statistical significance was
evaluated using a Wilcoxon test (*** = P<0.001).
116
Figure 3: Phase-contrast micrographs of IMR-32 neuroblastoma cells cultured in the
presence or absence of VIP and/or RA at 10-6 M and 10-5 M, respectively, for 48 hours.
Control cells after 48 hr without differentiating agents (A) had few neurites while after 48 hr
in the presence of VIP (B) cells extended neurites (arrows). Cells treated with 9-RA (C)
exhibit some neurites and form aggregates, while a 48-hr treatment with at-RA (E) induces
only cells aggregates formation. Cells cotreated with VIP and 9-RA (D) or with VIP and at-
RA (F) extended neurites as cells treated with VIP. The scale bar indicated in (A) corresponds
to 50 µm and applies to all micrographs.
Figure 4: Real-time quantitative RT-PCR analysis of MYCN mRNA in IMR-32 cells
treated with RA (A) or cotreated with VIP and RA (B). Total RNA was extracted from
IMR-32 cells treated with 9-RA or at-RA at 10-5 M and VIP at 10-6 M and cultured for 0.5, 1,
6, 48, 72 and 96 hr. MYCN mRNA expression was quantified by real-time RT-PCR as
described in materials and methods and GAPDH mRNA was used as internal reference.
Values were obtained from two independent experiments performed in quadruplicate.
Histograms represent means ± SEM. Values are expressed as a percentage of corresponding
controls. The statistical significance was evaluated using a Friedman test followed by a
Dunn’s test (* = P<0.05, ** = P<0.01, *** = P<0.001).
Figure 5: Western immunoblotting of MYCN proteins in IMR-32 cells treated with VIP
and/or RA. Total proteins of IMR-32 cells treated as in Fig 5 and cultured for 3 and 48 hr,
were resolved by SDS-PAGE, transferred to membranes and probed with the anti-MYCN
NCM II 100 antibody.
117
Figure 6: Real-time quantitative RT-PCR analysis of SKP2 mRNA and TP53INP1
mRNA in IMR-32 cells cultured in the presence or absence of VIP and/or RA. Total
RNA was extracted from IMR-32 cells treated with VIP and/or RA at 10-6 and 10-5 M,
respectively. SKP2 mRNA expression after 6 hr (A) and 48 hr (B) of treatment and TP53INP1
mRNA expression after 72 hr (C) of treatment were quantified by real-time quantitative RT-
PCR as described in materials and methods. Values were obtained from two independent
experiments performed in quadruplicate. Histograms represent means ± SEM. Values are
expressed as a percentage of corresponding control. The statistical significance was evaluated
using Friedman followed by a Dunn’s test (* = P<0.05, ** = P<0.01, *** = P<0.001).
118
Figure 1
119
Figure 2
120
Figure 3
121
Figure 4
122
Figure 5
123
Figure 6
124
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enhances the antiproliferative effect of chemotherapeutic agents on cancer cell lines. Cancer
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131
Présentation de l’article n°2
Vasoactive intestinal peptide-induced neuritogenesis in neuroblastoma SH-SY5Y cells
involves SNAP-25.
Lucie Chevrier*, Céline Héraud*, Annie Claire Meunier, Jean-Marc Muller and Corinne
Chadéneau.
* : Co-premier auteur
Soumis pour publication
Les travaux présentés dans ce second article ont eu pour objectif de caractériser la
différenciation neuronale de stade précoce induite par le VIP dans la lignée de neuroblastome
SH-SY5Y, en étudiant l’implication de la protéine SNAP-25. Cette protéine semble être
impliquée dans la croissance neuritique et la synaptogénèse. Il existe deux isoformes de
SNAP-25 : SNAP-25a prédominante dans les stades précoces du développement, et SNAP-
25b majoritaire à l’état adulte.
Des analyses par western-immunoblotting et des analyses en RT-PCR quantitative en temps
réel indiquent que le VIP stimule l’expression de la protéine et de l’ARNm SNAP-25. Les
taux des ARNm SNAP-25a et SNAP-25b sont tous les deux augmentés par le VIP.
L’isoforme SNAP-25a est la plus exprimée, ce qui suggère que le VIP induit une
différenciation de stade précoce dans les cellules SH-SY5Y.
Des expériences d’immunofluorescence indirecte démontrent qu’au cours de la différenciation
induite par le VIP, la protéine SNAP-25 est localisée au niveau des membranes plasmiques,
des neurites et des cônes de croissance, suggérant ainsi l’implication de SNAP-25 dans la
croissance neuronale.
132
Afin de déterminer précisément le rôle de la protéine SNAP-25 dans la neuritogénèse, des
expériences de RNAi SNAP-25 ont été réalisées. Les résultats montrent que l’expression de la
protéine SNAP-25 induite par le VIP est impliquée dans l’élongation neuritique et le maintien
de la ramification.
Ces données, associées à celles précédemment obtenues (Héraud et al., 2004), indiquent donc
que la différenciation induite par le VIP dans les cellules de neuroblastome humain SH-SY5Y
s’accompagne non seulement d’une augmentation de l’expression de protéines du
cytosquelette neuronal (neurofilaments, MAPc/d, tubuline ß III), mais aussi qu’elle implique
la protéine synaptique SNAP-25.
133
Vasoactive intestinal peptide-induced neuritogenesis in neuroblastoma SH-SY5Y cells
involves SNAP-25.
Lucie Chevrier*, Céline Héraud*, Annie Claire Meunier, Jean-Marc Muller and Corinne
Chadéneau.
Institut de Physiologie et Biologie Cellulaires, Université de Poitiers, CNRS ; 40 avenue du
Recteur Pineau, Poitiers, F-86022, France.
* These authors contributed equally to this work
Corresponding Author :
Corinne Chadéneau
Institut de Physiologie et Biologie Cellulaires, UMR 6187 CNRS, Pôle Biologie Santé,
Faculté des Sciences Fondamentales et Appliquées, 40 avenue du Recteur Pineau, 86022
Poitiers Cedex, France.
Tel: +33 (0)5 49 45 35 51 Fax: +33 (0)5 49 45 37 25
Email: [email protected]
Abbreviations used : BSA, bovine serum albumin; CREB, cAMP response element binding
protein; DMEM, Dulbecco’s modified Eagle’s medium; DTT, dithiothreitol; PACAP,
pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide; PBS, phosphate-buffered saline; PBS-T,
PBS with 0.05% Tween 20; PHI/PHM, peptide histidine isoleucine/methionine; PMSF,
phenylmethylsulfonyl fluoride; siRNA, short interfering RNA; SNAP-25, synaptosomal-
associated protein of 25 kDa; SDS, sodium dodecyl sulphate; TBS, Tris-buffered saline;
TBST, TBS with 0.1% Tween 20; VIP, vasoactive intestinal peptide.
134
ABSTRACT
Vasoactive intestinal peptide (VIP) is a neuropeptide known to regulate proliferation and
differentiation in normal and tumoral cells. We previously reported that VIP induced
neuritogenesis in human neuroblastoma SH-SY5Y cells cultured in serum-free medium. This
neuritogenesis was associated with a regulated expression of neuronal cytoskeleton markers.
To further characterize the neuroblastic cell differentiation induced by VIP in human SH-
SY5Y cells, we investigated expression of synaptosomal-associated protein of 25 kDa
(SNAP-25), a protein implicated in exocytosis associated with different processes, including
neurite outgrowth. Western immunoblotting and real-time RT-PCR analyses revealed that
VIP increased expression of the SNAP-25 protein and the level of both SNAP-25a and
SNAP-25b mRNA isoforms. Immunofluorescence experiments indicated that SNAP-25 was
mainly located in neurites and at the plasma membrane in SH-SY5Y cells treated with VIP.
RNA interference experiments demonstrated that SNAP-25 was involved in VIP-induced
neuritogenesis. In conclusion, SNAP-25 is up-regulated and implicated in neuritogenesis in
human neuroblastoma SH-SY5Y cells treated with the neuropeptide VIP.
KEYWORDS
VIP, SNAP-25 mRNA isoforms, neuroblastoma, neuritogenesis, differentiation.
RUNNING TITLE
Vasoactive intestinal peptide and SNAP-25 expression
135
INTRODUCTION
Vasoactive intestinal peptide (VIP) is a neuropeptide widely distributed in the body,
particularly in the central and peripheral nervous systems. VIP is a regulator of numerous
functions including proliferation and differentiation in normal and tumoral cells (reviewed by
Muller et al., 1995; Blondel et al., 2000). This regulation by VIP and by the related
neuropeptides pituitary adenylate cyclase-activating polypeptide (PACAP) and peptide
histidine isoleucine/methionine (PHI/PHM) was notably investigated in neuroblastoma cells
that express high-affinity VIP, PACAP, or PHI binding sites (reviewed by Muller et al., 2006;
reviewed by Sherwood et al., 2000; Monaghan et al., 2008). SH-SY5Y is a human
neuroblastoma cell line (Ross and Biedler, 1985), often used to study the mechanisms of
human neuronal differentiation, neuroprotection, neurological disorders and release of
neurotransmitters (Vaughan et al., 1995; Singh et al., 2003; Jämsä et al., 2004; Imamura et al.,
2006; Lam et al., 2007; Constantinescu et al., 2007). In a previous study, we reported that
neuritogenesis was induced by VIP, PACAP, and PHM in SH-SY5Y cells cultured in serum-
free medium (Héraud et al., 2004). This neuritogenesis was associated with an increased
expression of neuronal cytoskeleton markers. A different pattern of this stimulated expression
was observed with each of the neuropeptides, VIP increasing the expression of more
differentiation markers than PACAP and PHM.
The synaptosomal-associated protein of 25 kDa (SNAP-25) is expressed mainly in
neurons and neuroendocrine cells (Oyler et al., 1989; Catsicas et al., 1991; Hepp and Langley,
2001). During development, expression of the SNAP-25 gene and protein strongly increased
with synaptogenesis and neuronal maturation (Catsicas et al., 1991). Two SNAP-25 isoforms
(a and b) result from alternative splicing and differ by only 9 amino acids located in a domain
implicated in membrane anchoring (Bark, 1993; Bark and Wilson, 1994). During embryonic
136
and early postnatal mouse brain development, both mRNA isoforms are expressed at low
levels, however, SNAP-25a mRNA is more abundant than SNAP-25b mRNA. After the first
postnatal days, the expression level of SNAP-25b mRNA increases markedly when
maturation of synapses occurs, then SNAP-25b mRNA becomes the predominant isoform in
most adult brain structures (Bark et al., 1995; Boschert et al., 1996). As a SNARE (soluble N-
ethylmaleimide-sensitive factor attachment protein (SNAP) receptor) protein, SNAP-25 is
involved in membrane fusion during exocytosis (Jahn et al., 2003). The physiological
importance of SNAP-25 was demonstrated in mutant mice. Indeed, lethality at birth is
observed in SNAP-25 null mutation mice (Washbourne et al., 2002) and early postnatal
lethality affects mice in which a mutation reduces expression of SNAP-25b (Bark et al.,
2004). These studies also revealed the involvement of SNAP-25 in evoked synaptic
transmission and in the efficacy of synaptic transmission. Another function of SNAP-25 is its
role in neurite outgrowth. Its requirement for axonal and dendritic growth was initially
demonstrated using antisense oligonucleotides and botulinum neurotoxin inhibition in rat and
mouse neurons in vitro and in chick retina in vivo (Osen-Sand et al., 1993, 1996; Grosse et
al., 1999; Morihara et al., 1999). Next, this role was not confirmed in the SNAP-25 null
mutation mice, but recently reexpression of the SNAP-25a or SNAP-25b isoform in neurons
from SNAP-25-/- embryos demonstrated the involvement of both isoforms in neurite
branching (Delgado-Martínez et al., 2007).
To further characterize neuritogenesis induced by VIP in human neuroblastoma SH-SY5Y
cells, we analysed expression of the SNAP-25 protein and its subcellular localization, the
level of the two mRNA isoforms of SNAP-25 and the effect of RNA interference targeting
SNAP-25 in these cells treated with VIP.
137
MATERIALS AND METHODS
Cell culture: SH-EP and SH-SY5Y cells were routinely seeded at densities of 8 x 104 and
1.2 x 105 cells/cm2, respectively, in high glucose (4,500 mg/liter) Dulbecco’s modified
Eagle’s medium (DMEM) with Glutamax I and sodium pyruvate (Invitrogen), supplemented
with 10% fetal calf serum and 100 U/ml penicillin and 100 µg/ml streptomycin (Invitrogen).
Cells were incubated in a humidified 95% air/5% CO2 controlled atmosphere at 37°C.
Medium was changed every 3 days. Passages were performed once per week, using 1X
trypsin/EDTA (Invitrogen).
Cell treatment: Cells were seeded and grown to subconfluence for 6-7 days as described
above. Serum-containing medium was then replaced with serum-free medium, and cells were
cultured for 6-7 days, with a renewal of serum-free medium on the fourth day. Before
treatment, serum-free medium was changed for serum-free medium supplemented with 0.1%
bovine serum albumin (BSA), fraction V (Invitrogen). VIP (NeoMPS) was prediluted to 10-
5 M in serum-free medium with 0.1% BSA. Cells were treated with the neuropeptide to a final
concentration of 10-8 M. An equal volume of medium with 0.1% BSA without VIP was added
to control cells. Cells were cultured for 2, 4, 6, 8, or 48 hr and 1, 6, or 48 hr for time course
analyses of SNAP-25 protein and mRNA expression, respectively. For 48 hr of treatment,
treated and control cells received VIP and medium with 0.1% BSA without neuropeptide,
respectively, twice with a 24-hr interval.
Western immunoblotting analysis: After treatments, cells were harvested with
trypsin/EDTA, washed twice with cold phosphate-buffered saline (PBS) and suspended in
20 µl per 106 cells of ice-cold lysis buffer [10 mM Tris, pH 7.5, 0.5 mM EDTA, pH 8.0,
138
0.5 mM dithiothreitol (DTT), 0.5% CHAPS, 10% glycerol, 0.1 mM phenylmethylsulfonyl
fluoride (PMSF)]. After 30 min on ice, the samples were centrifuged at 4°C for 20 min at
10,000g. The supernatants were aliquoted, frozen in liquid nitrogen, and stored at –80°C.
Protein concentration was determined using the BioRad DC Protein Assay (Bio-Rad).
Proteins (20 µg) were resolved in 12 % sodium dodecyl sulfate (SDS)-polyacrylamide gel as
described by Laemmli (1970) and electroblotted as described by Towbin et al. (1979) for 1 hr
at 70 V onto Immobilon-P membrane (Millipore). Membranes were blocked 1 hr at room
temperature using 5% nonfat milk in Tris-buffered saline (TBS) containing 0.1% Tween 20
(TBST) and incubated for 1 hr at room temperature with a monoclonal mouse anti-SNAP-25
antibody 1:750 (clone SP12, Novocastra) in blocking solution. The membranes were rinsed 3
x 10 min at room temperature in TBST, incubated for 1 hr with a peroxydase-conjugated goat
anti-mouse IgG 1:20,000 (Calbiochem) in blocking solution, and again rinsed with TBST.
After a brief wash in TBS, bound antibodies were revealed by chemiluminescence with ECL+
detection system (Amersham Biosciences). The membranes were further stripped of bound
antibodies as recommended in the manufacturer’s instructions, reblocked and probed with a
monoclonal mouse anti--actin 1:20,000 (Sigma) as a protein loading control. The ECL
stainings were quantified by densitometry with the VisioLab 2000 image analyzer (Biocom).
Values obtained for SNAP-25 protein were normalized with their corresponding -actin
values. This initial method for immunodetection was subsequently simplified by incubating
membranes with a mixture of both mouse primary antibodies anti-SNAP-25 and anti--actin
and then with the peroxydase-conjugated goat anti-mouse IgG.
Immunocytochemistry: SH-SY5Y cells seeded at a density of 1.2 x 105 cells/cm2 on
glass coverslips were cultured and treated as described above except that the incubations in
serum-containing medium and next in serum-free medium were reduced to 5 days each,
139
because the cells grew faster on glass than on plastic. Cells were washed twice in PBS, fixed
and permeabilized for 10 min on ice with methanol precooled to – 20°C, and then were air
dried. After two washes in PBS, nonspecific binding sites were blocked with 5% nonfat milk
(giving a lower background compared with goat serum or BSA) in PBS containing 0.05%
Tween 20 (PBS-T) for 1 hr at 37°C. Cells were incubated with a monoclonal mouse anti-
SNAP-25 antibody 1:200 (clone SP12, Novocastra) in PBS-T containing 1% nonfat milk for 1
hr at 37°C, washed 3 x 3 min in PBS-T at 37°C and then incubates with a Cy3-conjugated
goat anti-mouse IgG 1:150 (Caltag Laboratories) in PBS-T containing 1% nonfat milk for 1 hr
at 37°C. After 3 washes in PBS-T at 37°C, cells were mounted with Vectashield (Vector
Laboratories). Fluorescence was analyzed by confocal laser scanning microscopy using a
Biorad MRC 1024 equiped with a 15mW argon-krypton gas laser. Images were obtained with
Olympus plan apo x60 water, 1.2 numerical aperture objective lens. When necessary, optical
sectionning of the specimen (Z serie) was drived by a Z-axis stepping motor and 3D
reconstruction was further generated. Fluorescence signal collection, the image construction,
and scaling were performed through the control software Lasersharp 3.2 (Bio-Rad). The Cy3
fluorochrome was excited with the 568 nm yellow line and emission of the dye was collected
via a photomultiplier through a 605 nm pass band filter (32 nm width).
cDNA synthesis: Total RNA was isolated by using the GenEluteTM Mammalian Total
RNA kit (Sigma-Aldrich) following the manufacturer’s instructions. Total RNA was
quantified with GeneQuant II spectrophotometer (Pharmacia). Aliquots of total RNA were
treated with 1 U/µg RNA of DNase I Amplification Grade (Invitrogen) according to the
manufacturer’s instructions, and in the presence of 10 U/µg RNA of RNaseOUT (Invitrogen).
After inactivation of DNase, RNA was reverse transcribed using random nonamers (Sigma-
140
Aldrich) and M-MLV Reverse Transcriptase H Minus (Promega) according to the
manufacturer’s instruction.
Real-time PCR and quantification: Real-time PCR was carried out with the LightCycler
System (Roche Diagnostics) using the LightCycler-FastStart DNA Master SYBR Green I kit
according to the manufacturer’s instructions, except that the reaction volume was 10 µl.
SNAP-25a and SNAP-25b mRNA expression was determined using isoform specific reverse
primers. The sequences of the forward primer and the two reverse primers were as followed
(5’-3’): SNAP-25 forward: AAGGGCTGACCAGTTGGCTGATGAGT, SNAP-25a reverse:
TTGGTTGATATGGTTCATGCCTTCTTCGACACGA, SNAP-25b reverse:
CTTATTGATTTGGTCCATCCCTTCCTCAATGCGT. Primer specificity for SNAP-25
mRNA isoforms was verified as described in results. For the quantification of each isoform
expression, known amounts of external standards (purified PCR products quantified using a
GeneQuant II spectrophotometer and diluted to 103-107 molecules) were amplified in parallel
reactions. Fluorescence values were analysed with the LightCycler data-analysis software
(version 3.5.3) using the second derivative maximum method. For each single determination,
the PCRs were run at least twice in duplicate. GAPDH mRNA level, quantified as above,
showed on average less than 20 % of variability between treated and control cells and was
used to normalize the mRNA levels between samples. Sequence of GAPDH primers were as
in Mayer et al. (2002). The cycle program for the amplified cDNA was: 5 sec at 95 °C, 5 sec
at 65 °C for SNAP-25a and SNAP-25b or at 60 °C for GAPDH, and 10 sec at 72 °C.
Transfection of short interfering RNA (siRNA): SNAP-25 siRNA was purchased from
Qiagen (Hs_SNAP25_1_HP siRNA). The siRNA sequences were: sense
r(GGUUGUACAUAGUGGUCAU)dTdT, antisense
141
r(AUGACCACUAUGUACAACC)dTdT, and were common to both SNAP-25 mRNA
isoforms. Allstars Negative Control siRNA (Qiagen, sequence is proprietary) which has no
homology to any known mammalian gene, was used as negative control. In a 35-mm dish, 2 x
105 SH-SY5Y cells were grown first in serum containing medium and next in serum-free
medium as described above, except that the serum-free medium was also antibiotic-free. Eight
µl of Oligofectamine (Invitrogen) and 18.8 µl of SNAP-25 siRNA or Allstars (20 µM) were
each mixed with 17 µl and 156.2 µl of Opti-MEM (Invitrogen), respectively. The
Oligofectamine mixture was incubated for 5 min at room temperature. Next, the two mixtures
were combined and incubated for 20 min at room temperature. The cells were rinced with 2.5
ml of Opti-MEM and supplied with 800 µl of Opti-MEM prior to transfection. The combined
mixture (200 µl) was added to the cells, resulting in a final concentration of 376 nM for
siRNA or Allstars. After a 4-hr incubation in a CO2 incubator, the cells were supplied with
0.5 ml of fresh serum- and antibiotic-free medium.
VIP treatment and protein extracts of transfected cells: Forty eight hours after
transfection, the cells were supplied with 1.5 ml of fresh serum- and antibiotic-free medium,
and were treated or not with VIP as described above. Protein extracts were prepared as
mentioned above except that, after a wash with PBS, the transfected cells were directly lysed
in the culture dish using 100 µl of lysis buffer.
Measurement of neurite length, branching and processes: To measure neurite length,
branching and processes, video images of transfected cells were captured using a digital
camera connected to a phase-contrast microscope. At least four images of isolated cell
clusters, or part of clusters, were saved for each transfected cell culture incubated for 6 or 48
hr with or without VIP. Captured images were analysed, using the VisioLab™2000 software
142
(Biocom). For each cluster or part of it, four parameters were measured: the total length of
neurites, the number of branch points, the number of neurite emergences and the perimeter of
the core of the cluster constituted by cell bodies (or part of the perimeter when a portion of a
cluster was analysed). The first two parameters were divided by the number of neurite
emergences, and the number of neurite emergences was divided by the perimeter of the core
of the cluster. For neurite length measurements, only neurites as long as or longer than 15 µm,
i.e., the average length of cell bodies in control cells, were measured.
Statistical analysis: Statistical analyses were performed using GraphPad Prism software.
RESULTS
VIP stimulates SNAP-25 protein expression in SH-SY5Y cells.
The effect of VIP on SNAP-25 protein expression was studied by western immunoblotting
analysis in the SH-SY5Y cell line, a subclone derived from the human neuroblastoma SK-N-
SH cell line and exhibiting a neuroblastic phenotype. Serum-starved SH-SY5Y cells were
cultured in the presence or absence (control cells) of VIP at 10-8 M for 48 hr. These treatment
conditions were previously determined to promote neuritogenesis with a maximal effect on
neuritic elongation (Héraud et al., 2004). SNAP-25 protein was detected in control cells and
its expression level increased with VIP treatment (Fig. 1). Under the same experimental
conditions, SNAP-25 protein was not detected in SH-EP cells (Fig. 1), another cloned cell
line derived from SK-N-SH and exhibiting an epithelial phenotype. In these cells, VIP did not
induce neuritogenesis (Héraud et al., 2004). Thus, SNAP-25 protein is expressed only in the
neuroblastic cell line and its expression level is increased by VIP. The quantification of the
neuropeptide-dependent increase in SNAP-25 protein expression was performed by western
immunoblotting followed by densitometric analysis in time-course experiments (Fig. 2).
143
Compared with control cells, VIP induced an elevation in SNAP-25 protein expression from 6
hr of treatment with a maximal and statistically significant effect after a 6-hr treatment (2.9-
fold).
VIP stimulates SNAP-25 mRNA expression in SH-SY5Y cells.
The enhanced expression levels of SNAP-25 protein induced by VIP could result from an
increase in the expression of SNAP-25 mRNA, in the rate of SNAP-25 protein synthesis
and/or in the half-life of this protein. Expression of the SNAP-25a and SNAP-25b mRNA
isoforms was investigated by real-time RT-PCR. The two SNAP-25 protein isoforms differ by
only 9 amino acids encoded by the alternative exons 5a and 5b. To detect both alternative
transcripts, isoform specific reverse primers which differ by 11 out of 34 nucleotides were
used. We amplified two specific RT-PCR products from cDNA of SH-SY5Y cells, using one
of the two specific reverse primers and a common forward primer. Each product was purified
after gel electrophoresis, quantified and sequenced to verify the isoform identity. An amount
of 107 molecules of each of these products was next tested in real time PCR reactions with
each of the two specific primer pairs previously used. As shown in figure 3, up to 28 cycles,
the isoform a or b RT-PCR products were only amplified by their corresponding primer pair.
Beyond this number of cycles, nonspecific amplification began to appear in the reactions with
the non-corresponding primer pairs. The nonspecific products migrated similarly to specific
products in gel electrophoresis (Fig. 3b) suggesting that they corresponded to nonspecific
amplification of a SNAP-25 product rather than to amplification of primer dimer-derived
sequences. The reverse primers were thus specific enough to allow quantification of
expression of a distinct mRNA isoform within the limits of 28 cycles, while 107 molecules of
the other isoform was also present in the sample. Quantification of the mRNA isoform levels
was determined after 1, 6 and 48 hr of treatment with VIP. Compared with control cells,
144
expression of SNAP-25a and SNAP-25b mRNA was transiently elevated after a 6-hr
treatment with VIP (Fig. 4a and b). The increase was statistically significant, and was 2.9- and
2-fold for isoform a and b, respectively. SNAP-25b mRNA was less expressed than SNAP-
25a mRNA (Fig. 4c) and represented about 1/7 of the total SNAP-25 mRNA in cells cultured
in the presence or absence of VIP for 6 hr. Thus, the stimulation of SNAP-25 protein
expression induced by VIP was associated with a transient increase of both SNAP-25 mRNA
isoforms, SNAP-25a mRNA being more expressed than SNAP-25b mRNA.
SNAP-25 is mainly located in neurites and at the plasma membrane in VIP-treated
SH-SY5Y cells.
In cell lines induced to differentiate into a neuronal phenotype and in neurons in culture,
SNAP-25 is often found in neurites and cell bodies (Osen-Sand et al., 1993; Bark et al., 1995;
Morihara et al., 1999; Andersson et al., 2000, Glass et al., 2002; Apland et al., 2003). To
analyze the effects of VIP treatment on the intracellular distribution of SNAP-25, indirect
immunofluorescence experiments were performed on SH-SY5Y cells cultured in the presence
or absence of the neuropeptide for 6 and 48 hr (Fig. 5). Because SNAP-25 isoforms differ by
only few amino acids, available SNAP-25 antibodies do not distinguish the SNAP-25
isoforms. In control cells (Fig. 5a, b), labelling was present in the cell bodies and in some
cells at the plasma membrane. Few control cells extented short processes that were faintly
stained. In treated cells (Fig. 5 c, d), labelling was observed mainly in neurites, growth cones
and at the plasma membrane of cell bodies. The less intense staining in the soma of control
and treated cells was at least in part nonspecific because in a negative control experiment, in
which primary antibody was omitted, a similar weak fluorescence was present in the cell
bodies (Fig.5 e, f), despite the use of different blocking reagents (see Materials and Methods).
In cells treated with VIP for 48 hr, growth cones were clearly stained, while SNAP-25
145
immunoreactivity was sometimes absent or faint in the processes bearing these growth cones.
Thus, SNAP-25 is in part located in the neuritic extensions induced by VIP.
SNAP-25 is involved in VIP-induced neuritogenesis in SH-SY5Y cells
Because SNAP-25 is required for neurite outgrowth in different murine neuronal cells in
vitro, we tested the effect of SNAP-25 siRNA on the neuritogenesis induced by VIP in human
SH-SY5Y cells. These cells were transfected with SNAP-25 siRNA (SNAP-25 siRNA cells)
or with control siRNA (control siRNA cells) and then treated or not with VIP, 48 hr post-
transfection. As presented in figure 6a, the increase in SNAP-25 protein level induced after 6
and 8 hr of VIP treatments in control siRNA cells was not observed in SNAP-25 siRNA cells,
showing that SNAP-25 siRNA inhibited the stimulation of SNAP-25 protein expression
induced by VIP. Morphological parameters were measured after 6 and 48 hr of neuropeptide
treatments of SNAP-25 siRNA cells and of control siRNA cells. The progressive increase in
neuritic length induced by VIP in control siRNA cells after 6 hr and 48 hr of treatment was
abolished in SNAP-25 siRNA cells (Fig. 6b). The increase in branch points induced by VIP in
control siRNA cells was similar after 6 hr and 48 hr. This phenomenon was also observed
after a 6-hr VIP treatment in SNAP-25 siRNA cells but was reduced after a 48 hr treatment
(Fig. 6c). VIP had no effect on the number of neurite emergences in control siRNA or SNAP-
25 siRNA cells (Fig. 6d). These data indicate that SNAP-25 is involved in neurite elongation
and branching observed after a 48-hr treatment with VIP in SH-SY5Y cells.
DISCUSSION
In a previous study, we have reported that VIP at 10-8 M induced differentiation after a 48-
hr treatment of SH-SY5Y cells cultured in serum-free medium, as demonstrated by neurite
outgrowth measures and analysis of neuronal cytoskeleton marker expression, such as
146
neurofilaments, microtubule-associated proteins (MAPs) and the -tubulin III (Héraud et al.,
2004). Under the same experimental conditions, the data of the present work indicate that VIP
stimulates SNAP-25 protein and mRNA expression in SH-SY5Y cells and that this protein is
present in neuritic extensions induced by VIP. Several functions have been attributed to
SNAP-25. Among them is its involvement in neurite outgrowth demonstrated in vitro in
rodent neurons, in the rat pheochromocytoma PC12 cell line or in neurons from SNAP-25-/-
mouse embryos reexpressing the SNAP-25a or b isoform (Osen-Sand et al., 1993, 1996;
Grosse et al., 1999; Morihara et al., 1999, Delgado-Martínez et al., 2007). In the present
report, RNA interference targeting SNAP-25 indicates that SNAP-25 also fills this role in the
human neuroblastoma SH-SY5Y cell line often used to study neuronal mechanisms.
In the interference experiments, it was found that SNAP-25 siRNA inhibited VIP-induced
SNAP-25 expression. No decrease in the basal level of SNAP-25 was observed between
control siRNA cells and SNAP-25 siRNA cells. This could be due to a long half-life of
SNAP-25 protein. Indeed, it was verified by Choi et al. (2005) that, in RNAi experiments
targeting two forms of a reporter protein with different half-lives, the level of the form with a
long half-life decreased later than that of the form with short half-life. The results obtained in
our analysis of SNAP-25 protein and mRNA expression suggest a quite long half-life of the
SNAP-25 protein. Indeed, although SNAP-25 protein expression decreased progressively
after the maximal stimulation observed at 6 hr of treatment, the protein level was still more
elevated than in control cells after 48 hr of treatment, whereas at this treatment time the
SNAP-25 mRNA level was back to control values. Little is known about the half-life of
SNAP-25 protein, however it was determined that it increased from 16 hr to 35 hr during
maturation of cerebellar granule neurons cultured for several days in vitro (Sanders et al.,
1998).
147
The three morphological parameters measured in the interference experiments, i.e. neurite
number, neurite elongation and branching, allow to precise the role of SNAP-25 in
neuritogenesis induced by VIP in SH-SY5Y cells. The VIP-enhanced SNAP-25 expression in
control siRNA cells was not associated with changes in the neurite number but resulted in a
time dependent neurite elongation which was inhibited by RNA interference targeting SNAP-
25 after both short and long VIP treatments (6 and 48 hr). Different effects were obtained for
branching. Indeed, in control siRNA cells, the branching was increased to the same level after
short and long VIP treatment, a phenomenon that was significantly reduced by RNA
interference targeting SNAP-25 only after a long VIP treatment. These results indicate that
SNAP-25 is involved in neurite elongation and branch maintenance in VIP-treated SH-SY5Y
cells. Furthermore in these experiments, it was observed that branching could increase
whereas neuritic length was unchanged (see Fig.6, SNAP-25 siRNA cells treated with VIP for
6 hr). Although branching and neuritic length appear generally linked, previous studies also
reported distinct modulation of these two morphological aspects. Indeed, signaling pathway
elements such as the small GTPase Rac had effects on dendritic branch additions and
retractions but not on dendritic length (Li et al., 2000), and Notch signaling had opposite
effects on dendritic branching and length (Redmond et al., 2000).
The two SNAP-25 isoforms are developmentally regulated. SNAP-25a is associated with
early states of development and SNAP-25b is predominant in adult brain (Bark et al., 1995).
In the present study, both mRNA isoforms were detected in SH-SY5Y cells treated or not
with VIP and SNAP-25a mRNA is more represented than SNAP-25b mRNA suggesting that
these cells are still at the beginning of their differentiation after 48 hr of treatment. Longer
148
treatments would allow to test whether a switch in expression between the isoform a and b
occurs in the neuroblastoma SH-SY5Y cells.
So far, no isoform-specific antibodies are available and localization of SNAP-25a and b
proteins has been rendered possible only by the use of tagged isoforms transfected in cells or
by reexpression of one isoform in neurons from SNAP-25-/- mice (Bark et al., 1995;
Andersson et al., 2000; Delgado-Martínez et al., 2007). In our experiments, SNAP-25
immunoreactivity was mainly found in neurites and at the plasma membrane in treated SH-
SY5Y cells. Furthermore, SNAP-25 immunoreactivity was observed in the growth cones but
sometimes was not or faintly visible in the processes bearing them. This is similar to results
obtained in newborn rat cortical neurons in culture where SNAP-25 immunoreactivity was
higher in the growth cones than elsewhere in developing axon-like neurites (Osen-Sand et al.,
1993).
Numerous stimuli were demonstrated to regulate the SNAP-25 mRNA and/or protein
expression in neurons or cells of neuroectodermal origin. Examples of positive stimuli are
brain-derived neurotrophic factor (BDNF) in primary culture of rat fetus cortical neurons
(Takei et al., 1997), kainate in rat brain (Boschert et al., 1996), high concentration of
potassium in bovine adrenal chromaffin cells (Garcia-Palomero et al., 2000; Montiel et al.,
2003), chronic depolarization alone or in the presence of nerve growth factor (Hepp et al.,
2001a) or NGF alone in PC12 cells (Puffer et al., 2001) and 12- O-tetradecanoylphorbol-13-
acetate (TPA) in the neuroblastoma NB-1 cell line (Yoshida et al., 2002). A negative stimulus
is thyroid hormone in the rat adrenal gland and PC12 cells (Hepp et al., 2001b; Hepp and
Langley, 2001). The present study extends the list of positive stimuli with VIP in SH-SY5Y
cells.
149
The SH-SY5Y cell line is often used as a model for studying different cellular
mechanisms of neuronal diseases (Cassarino et al., 1997; Lee et al., 2003; Jämsä et al., 2004;
Arias et al., 2005; Imamura et al., 2006; Qi et al., 2007; Nakaso et al., 2008). Several neuronal
disorders, such as Down’s syndrome, Alzheimer’s disease, schizophrenia, Creutzfeldt-Jakob
disease and Huntington’s disease, are associated with a decrease in SNAP-25 expression
(Greber et al., 1999; Fatemi et al., 2001; Chauhan and Siegel, 2002; Ferrer, 2002; Mukaetova-
Ladinska et al., 2002; Smith et al., 2007; Downes et al., 2008). Because VIP is able to
increase the SNAP-25 protein expression in SH-SY5Y cells, it would be interesting to test
whether VIP could have an effect on SNAP-25 expression in cellular and animal models
reproducing these disorders.
In the SH-SY5Y cell model, we have now demonstrated that the expression of several
genes, i.e. the SNAP-25 gene and the genes encoding the three neurofilament subunits
(Héraud et al., 2004), was increased by VIP treatments. This regulation of gene expression
could involve a distinct set of transcription factors. Brn-3a is a POU family transcription
factor which increases the expression of these four genes and induces neurite outgrowth when
overexpressed in a neuronal cell line (for review, see Latchman, 1998). In various cell types,
VIP induces phosphorylation of the transcription factor cAMP response element binding
protein (CREB) (Schomerus et al., 1996; Delgado and Ganea, 2001; Drahushuk et al., 2002;
Fernandez et al., 2005; Persson et al., 2005; Hokari et al., 2005; Shi et al., 2007). A putative
CREB binding site is present in the human SNAP-25 gene promoter (Cai et al., 2008).
Therefore, Brn-3a and CREB are candidates for future studies on the identification of
transcription factors that govern the VIP-induced differentiation in the human neuroblastoma
SH-SY5Y cells.
150
ACKNOWLEDGEMENTS
We thank D. Guyonnet and A. Cantereau for their expert technical assistance with DNA
sequencing and confocal microscopy, respectively. We also thank J. Habrioux for his help in
the preparation of the figures. This work was supported by grants from the Ligue Contre le
Cancer and from the “Lions Club de Melle, France”. Céline Héraud was the recipient of PhD
fellowships from the Ligue Nationale Contre le Cancer and from the Fondation pour la
Recherche Médicale. Lucie Chevrier was the recipient of PhD fellowship from the Ligue
Nationale Contre le Cancer.
151
FIGURE LEGENDS
Figure 1: Western immunoblotting analysis of SNAP-25 expression in SH-SY5Y and
SH-EP cells after 48 hr in the presence or absence of VIP. Total proteins from SH-SY5Y
and SH-EP cells cultured for 48 hr in the presence or absence of VIP (10-8 M) were resolved
by SDS-PAGE, transferred to a membrane and further probed with specific anti-SNAP-25 as
well as anti--actin antibodies as loading control.
Figure 2: Time-course analysis of SNAP-25 protein expression in SH-SY5Y cells
cultured in the presence or absence of VIP. Quantifications of ECL staining for SNAP-25
protein were carried out by densitometry and normalized with their corresponding -actin
values. Values were obtained from at least three independent experiments performed in
duplicate and are expressed as percentage of the corresponding control. Histograms represent
means SEM. The statistical significance was evaluated using a Mann-Whitney test (* P <
0.05).
Figure 3: Specific detection of SNAP-25a and b mRNA isoforms by RT and real-time
PCR analyses. (a) Fluorescence / cycle number curves from a real-time PCR experiment.
Purified products (107 molecules) corresponding to the isoform SNAP-25a or SNAP-25b
(product 25a or product 25b, respectively) were amplified using primers specific for the
isoform SNAP-25a or SNAP-25b (primers 25a or primers 25b, respectively). (b) Agarose gel
electrophoresis of PCR products obtained after 28 or 32 amplification cycles.
Figure 4: Real-time quantitative RT-PCR analysis of expression of SNAP-25 mRNA
isoforms in SH-SY5Y cells cultured in the presence or absence of VIP. Total RNA was
152
extracted from SH-SY5Y cells cultured for 1, 6, and 48 hr in the presence (VIP) or absence
(control) of VIP. Expression of SNAP-25a and b mRNA isoforms ((a) and (b), respectively)
was quantified by real-time RT-PCR. Values were obtained from three independent
experiments performed twice in duplicate and are expressed as a ratio to GAPDH mRNA. (c)
Histograms of the contribution of each isoform to the total level of SNAP-25 mRNA.
Histograms represent means SEM. The statistical significance was evaluated using a
Wilcoxon test (*** P < 0.001).
Figure 5: Immunocytochemical detection of SNAP-25 in SH-SY5Y cells cultured in the
presence or absence of VIP. SH-SY5Y cells were cultured for 6 (a, c, e, f) and 48 hr (b, d)
without (a, b) or with VIP (c, d, e, f). Indirect immunofluorescence was performed in the
presence (a-d) or absence (f) of the anti-SNAP-25 antibody. (e and f) Phase-contrast and
immunofluorescence micrographs, respectively, of the same field of cultured cells. The white
arrow and arrowhead in (a) indicate a group of control cells with SNAP-25 immunoreactivity
at the plasma membrane and a short process with very faint staining, respectively. The open
arrowhead in (d) indicate SNAP-25 immunoreactivity in a growth cone at the tip of a non-
immunoreactive neurite. Scale bar = 50 µm and applies to all micrographs.
Figure 6: RNA interference targeting SNAP-25 in SH-SY5Y cells cultured in the
presence or absence of VIP. SH-SY5Y cells were transfected with SNAP-25 siRNA (SNAP-
25) or with control siRNA (control). Forty eight hr post-transfection, the transfected cells
were treated (+) or not (-) with VIP for 6, 8 or 48 hr. (a) Total proteins were resolved by SDS-
PAGE, transferred to a membrane and further probed with specific anti-SNAP-25 as well as
anti--actin antibodies as loading control. (b) Average neuritic length. (c) Number of branch
points per neurite emergence. (d) Number of neurite emergences per µm of the perimeter of
153
the core of the cell cluster (see materials and methods). Histograms represent means SEM.
The statistical significance was evaluated using a Mann-Whitney test (*** P < 0.001, ** P <
0.01, * P < 0.05).
154
Figure 1
155
Figure 2
156
Figure 3
157
Figure 4
158
Figure 5
159
Figure 6
160
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168
DISCUSSION GENERALE ET PERSPECTIVES
169
I - Discussion générale
Les travaux sur la modulation de l’expression de MYCN et de SNAP-25 par le VIP présentés
dans ce rapport permettent une meilleure compréhension des mécanismes moléculaires de la
différenciation induite par ce neuropeptide dans des cellules de neuroblastome humain. Ils
suggèrent que le VIP, en favorisant une différenciation associée à une diminution de
l’expression de MYCN, pourrait présenter un intérêt dans la thérapie des formes les plus
graves de neuroblastomes.
Ces résultats mettent en évidence l’implication du VIP, de l’acide rétinoïque, du facteur de
transcription MYCN et de la protéine synaptique SNAP-25 dans la différenciation in vitro de
cellules de neuroblastome humain. Toutes ces molécules sont également impliquées in vivo
dans le développement de la crête neurale et/ou dans la différenciation sympatho-
adrénergique. La crête neurale est formée à partir de la plaque neurale, au moment de la
formation du tube neural. L’acide rétinoïque intervient alors comme facteur de
postériorisation de la plaque neurale et permet l’induction de la formation de la crête neurale
(Villanueva et al., 2002). Par la suite, le lignage sympatho-adrénergique des neuroblastes de
la crête neurale est contrôlé par différents facteurs parmi lesquels MYCN (pour revue,
Grimmer et Weiss, 2006), le peptide PACAP apparenté au VIP (voir paragraphe
« Neuropeptides et neurones sympathiques » p 57, et pour revue, Ghzilli et al., 2008) ou
l’acide rétinoïque (pour revue, Blanc et al., 2005). La protéine SNAP-25 est impliquée dans la
maturation neuronale, en particulier dans l’élongation neuritique et dans la synaptogénèse
(voir paragraphe « Rôles de SNAP-25 dans la neuritogénèse et la synaptogénèse » p 93). Le
VIP est également impliqué indirectement dans le développement synaptique : la libération
induite par le VIP d’ADNF par les cellules de la glie stimule la synaptogénèse de neurones de
l’hippocampe (Blondel et al., 2000). La voie sonic hedgehog (shh), particulièrement
impliquée dans le développement du système nerveux (pour revue McMahon et al., 2003),
170
pourrait constituer un lien entre MYCN et les neuropeptides. En effet, dans des précurseurs
neuronaux, le PACAP inhibe la voie shh (Waschek et al., 1998 ; Nicot et al., 2002), dont les
effets proliférateurs sont médiés par MYCN dans des neuroblastes embryonnaires (Oliver et
al., 2003). Des altérations de ces voies au cours du développement pourraient être à l’origine
de l’apparition des neuroblastomes.
Les neuroblastomes, comme les médulloblastomes, ont une origine neuroectodermique
embryonnaire. Ces deux types de tumeurs présentent également d’autres caractéristiques
communes :
- l’amplification du gène MYCN, qui est associée à un mauvais pronostic,
- la surexpression de la survivine,
- des altérations de l’expression des récepteurs des neurotrophines, la surexpression de
TrkC étant associée à un pronostic favorable,
- l’utilisation de l’acide rétinoïque comme agent thérapeutique, actuellement en essai
clinique pour les médulloblastomes (pour revue, Crawford et al., 2007).
De plus, dans les médulloblastomes, le système VIP-récepteurs est exprimé et présente des
capacités anti-prolifératives (Lelièvre et al., 2008), qui peuvent être perdues dans certaines de
ces tumeurs présentant une perte d’hétérozygotie du fragment chromosomique 6p26-27
portant le gène codant le VIP (pour revue, Lelièvre et al., 2003). La voie shh, qui peut
devenir constitutivement active à la suite de mutations dans certains médulloblastomes,
pourrait là encore être un lien entre l’apparition, la progression de ces tumeurs (via MYCN)
et le système VIP-récepteurs (pour revue, Lelièvre et al., 2003).
Il apparaît donc que le système VIP-récepteurs peut présenter un intérêt dans la thérapie de
certains cancers d’origine neuroectodermique du fait de ces actions anti-prolifératives et/ou
différenciatrices. In vivo, les neuropeptides de la famille du VIP et leurs dérivés pourraient
171
également contrecarrer les effets délétères des voies shh et MYCN impliquées dans la
tumorigénèse de ces cancers.
II - Perspectives
1) MYCN et VIP
a) Effets du VIP sur l’expression de MYCN dans d’autres lignées de neuroblastome
Les résultats présentés dans l’article n°1 indiquent que le VIP diminue l’expression de
MYCN, en particulier dans la lignée IMR-32 qui présente l’amplification de cet oncogène. Il
serait intéressant d’élargir cette étude à d’autres lignées de neuroblastome portant cette
anomalie génétique ou à des lignées présentant un fort taux d’expression de MYCN sans
amplification du gène, afin de déterminer si les effets du VIP observés sur la modulation de
l’expression de MYCN peuvent être généralisés.
L’effet du VIP sur l’expression de MYCN pourrait être influencé par le contexte génétique
des cellules. En effet, les lignées de neuroblastome, comme les tumeurs dont elles sont issues,
présentent rarement un seul type d’anomalie génétique. C’est pourquoi l’utilisation de
plusieurs lignées de neuroblastome présentant diverses anomalies génétiques liées à ces
tumeurs pourrait être envisagée.
b) Effets du VIP sur l’expression de MYCN dans d’autres lignées cancéreuses présentant
l’amplification de MYCN
L’amplification de MYCN est observée dans les neuroblastomes, mais également dans
plusieurs types de tumeurs comme les SCLC, les médulloblastomes, les rétinoblastomes ou
les glioblastomes (pour revue, Schwab et al., 2004). Il serait donc intéressant d’étudier les
effets du VIP sur l’expression de MYCN dans ces tumeurs, et plus particulièrement dans les
médulloblastomes, du fait de leur origine neuro-ectodermique commune avec les
172
neuroblastomes. Cette étude pourrait également être menée dans la lignée de SCLC NCI-H89
qui présentent l’amplification de MYCN et dont la prolifération est inhibée in vitro et in vivo
par le VIP (Maruno et al., 1998).
c) Conséquences de la diminution de MYCN induite par le VIP.
Comme cela a été décrit dans l’introduction de ce manuscrit (p 82), MYCN régule de
nombreux mécanismes impliqués dans la progression tumorale. Les résultats présentés dans
l’article n°1 indiquent que la diminution de l’expression de MYCN s’accompagne de la
régulation de l’expression de gènes impliqués dans la progression du cycle cellulaire. Il serait
donc intéressant d’étudier les effets des co-traitements VIP et acide rétinoïque sur le cycle
cellulaire, en étudiant notamment la prolifération ou la répartition des cellules dans les
différentes phases du cycle par cytométrie de flux.
La capacité de migration et d’invasion pourrait être étudiée puisque ces deux mécanismes
sont en partie régulés par MYCN (Goodman et al., 1997 ; Zaizen et al., 1998 ; Noujaim et al.,
2002).
Dans les cellules de neuroblastome la protéine MYCN diminue l’expression de l’activine A et
du LIF, deux facteurs anti-angiogéniques (Breit et al., 2000 ; Hatzi et al., 2002). De ce fait, le
VIP pourrait favoriser l’expression de ces molécules anti-angiogéniques, via son action sur
l’expression de MYCN. Le VIP est connu pour stimuler l’angiogénèse en augmentant
l’expression du VEGF notamment dans des cancers prostatiques, pulmonaires et mammaires
(pour revue, Ribatti et al., 2007 ; Valdehita et al., 2007), dans lesquels ce peptide stimule la
prolifération. L’expression de l’activine A, du LIF et du VEGF devrait être étudiée dans des
cellules de neuroblastome, afin de déterminer les effets du VIP sur l’angiogénèse. De plus, le
LIF et l’activine A peuvent induire l’expression du VIP dans la lignée de neuroblastome
NBFL (Symes et al., 1994 ; 2000), ce qui renforce l’intérêt d’étudier leur expression car ces
173
deux molécules pourraient également intervenir dans la mise en place d’une boucle
d’autocrinie du VIP (Figure 16).
VIP ↓ MYCN ↑ Activine A, LIF ↑ VIP VIP ↓ MYCN ↑ Activine A, LIF ↑ VIP
Figure 16 : Boucle d’autocrinie potentielle du VIP impliquant MYCN, l’activine A et le LIF dans des cellules de neuroblastome. ↓ : diminution de l’expression, ↑ : augmentation de l’expression.
La diminution de l’expression de MYCN induite par le VIP pourrait également présenter un
intérêt dans l’immunothérapie. En effet, l’infiltration des cellules « natural killer » dans les
neuroblastomes est plus importante dans les tumeurs exprimant la chémokine CCL2, dont
l’expression est inversement corrélée à l’amplification de MYCN (Melelitsa et al., 2004). Une
hypothèse serait que le VIP, en diminuant l’expression de MYCN, pourrait stimuler
l’expression de la chémokine CCL2 et par conséquent l’infiltration des cellules « natural
killer » dans la tumeur.
d) Identification des récepteurs impliqués
Les résultats présentés dans l’article n°1 devraient être complétés par l’étude des récepteurs
impliqués dans la diminution de l’expression de MYCN induite par le VIP dans la lignée
IMR-32. Des travaux réalisés au laboratoire indiquent que ces cellules expriment les ARNm
des récepteurs VPAC1, VPAC2 et PAC1, et notamment du variant delta5,6 qui lie le VIP
avec une affinité assez importante. Des expériences de RNAi pourraient être menées afin
d’inhiber spécifiquement l’expression de chaque récepteur (VPAC1, VPAC2 et PAC1) et
déterminer leur implication relative dans la diminution de l’expression de MYCN induite par
le VIP dans les cellules IMR-32.
174
e) Effets des neuropeptides apparentés
Les résultats obtenus au cours de ce stage doctoral concernent uniquement les effets du VIP.
Ces études pourraient être étendues au PACAP qui induit également la différenciation de
cellules de neuroblastome (pour revue, Muller et al., 2006 ; Monaghan et al., 2008).
Les effets du VIP pourraient également être étudiés. Dans la lignée de neuroblastome murin
Neuro2a, VIP et PHI inhibent la croissance cellulaire mais induisent des voies de signalisation
différentes (Lelièvre et al., 1998). Il serait donc intéressant de déterminer si le PHM, analogue
humain du PHI, peut également diminuer l’expression de MYCN dans la lignée humaine
IMR-32 ainsi que les voies de signalisation potentiellement induites par ce peptide. De plus,
des sites de liaison de haute affinité spécifiques du PHI-PHM ont été identifiés dans différents
modèles, notamment dans les cellules de neuroblastome murin Neuro2A (Lelièvre et al.,
1998 ; pour revue, Muller et al., 2007). Ces sites semblent être insensibles au GTP. Par des
techniques de « binding », l’étude de ces sites dans notre modèle pourrait être envisagée, si le
PHM est capable de réguler l’expression de MYCN.
f) Interaction entre système VIP-récepteurs et système acide rétinoïque-récepteurs
De nombreuses études rapportent que les systèmes VIP et acide rétinoïque sont liés. En effet,
dans les cellules de neuroblastome, l’acide rétinoïque stimule l’expression du VIP et
augmente le nombre de sites de liaison de ce peptide (Waschek et al., 1989 ; 1997). De plus,
la surexpression du récepteur VPAC1 induit une augmentation de l’expression des récepteurs
de l’acide rétinoïque (Balster et al., 2002). Ces différentes études permettent d’expliquer
comment ces deux molécules pourraient agir en synergie sur la diminution de l’expression de
MYCN dans la lignée IMR-32. Cependant, ces interactions entre ces deux systèmes doivent
être démontrées dans ce modèle. Par exemple, des expériences de RT-PCR quantitative en
temps réel pourraient être réalisées pour tester si le VIP augmente l’expression des récepteurs
175
de l’acide rétinoïque ou si l’acide rétinoïque augmente l’expression du VIP et/ou de ses sites
de liaison.
Il serait également intéressant de réaliser des co-traitements avec le VIP et d’autres rétinoïdes
(l’isoforme 13-cis-RA utilisée dans la thérapie des neuroblastomes ou le rétinoïde synthétique
4-HPR) car les différents rétinoïdes ont des modes d’action différents (pour revue, Reynolds
et al., 2003) (voir paragraphe « Rétinoïdes synthétiques » p 39).
g) VIP et chimiothérapies
Des antagonistes du VIP peuvent potentialiser l’effet anti-tumoral de substances utilisées en
chimiothérapie in vitro et in vivo dans plusieurs types de tumeurs dont la prolifération est
stimulée par le VIP (Gelber et al., 2001 ; Moody et al., 2001). Dans les cellules de
neuroblastome, le VIP peut inhiber la prolifération, ce qui renforce l’intérêt de l’associer à des
substances chimiothérapeutiques. Ces co-traitements pourraient peut-être permettre de
diminuer les doses efficaces des substances chimiothérapeutiques et limiter l’apparition de
phénomènes de résistances à ces drogues.
h) Etudes in vivo
Deux modèles d’animaux pourraient être utilisés pour des expériences in vivo. L’un de ces
modèles correspond à des souris nude chez lesquelles sont implantées des cellules de
neuroblastome. Les effets des différentes substances (neuropeptide seul ou associé à l’acide
rétinoïque) pourraient être déterminés en étudiant la masse tumorale, la dissémination des
tumeurs, la vascularisation. L’autre modèle est celui des souris transgéniques qui développent
des neuroblastomes en conséquence de la surexpression de MYCN dans les cellules de la
crête neurale (Weiss et al., 1997). Ces souris constituent actuellement l’un des meilleurs
modèles d’étude in vivo pour les neuroblastomes présentant l’amplification de MYCN.
176
2) SNAP-25 et VIP
a) Effets du VIP sur l’expression de SNAP-25 dans la lignée IMR-32
Bien que la neuritogénèse induite par le VIP dans les cellules IMR-32 soit plus limitée que
celle induite dans les cellules SH-SY5Y, il serait intéressant d’étudier l’expression de SNAP-
25 et de ses isoformes dans cette lignée qui présente une amplification de l’oncogène MYCN.
b) Effets des peptides apparentés au VIP
Le PACAP et le PHM induisent des stades de différenciation moins matures que le VIP dans
les cellules SH-SY5Y (Héraud et al., 2004). De plus, le PHM, contrairement au VIP et au
PACAP, n’induit pas la ramification neuritique. Il serait donc intéressant d’étudier
l’expression des deux isoformes de SNAP-25, dont le ratio évolue en fonction du stade de
différenciation (Bark et al., 1995). Des expériences de RNAi des isoformes de SNAP-25 dans
des cellules SH-SY5Y suivies du traitement par les neuropeptides VIP, PACAP et PHM
pourraient permettre de préciser le rôle de chaque isoforme de SNAP-25.
c) Implication du facteur transcriptionnel Brn-3a
Brn-3a est un facteur de transcription de la famille POU (pour Pit-1, Oct-1/2 et Unc-86)
particulièrement impliqué dans le développement du système nerveux et dans la
différenciation de cellules de neuroblastome. La surexpression de ce facteur dans des cellules
de type neuronal induit une croissance neuritique associée à l’augmentation de l’expression de
marqueurs neuronaux parmi lesquels SNAP-25 et les neurofilaments (pour revue, Latchman,
1998). L’étude de l’implication de Brn-3a dans les SH-SY5Y semble donc particulièrement
intéressante afin de préciser les mécanismes moléculaires de la différenciation induite par le
VIP. Des travaux menés au laboratoire ont mis en évidence une augmentation de l’expression
de l’ARNm Brn-3a dans les cellules SH-SY5Y après une heure de traitement par le VIP
177
(Thèse Céline Héraud). Ces données sont cohérentes avec le fait que Brn-3a pourrait réguler
l’expression des neurofilaments et de SNAP-25 dans ces cellules. Des expériences de RNAi
Brn-3a pourraient être menées comme cela a été réalisé pour SNAP-25. Cependant une telle
étude sera probablement difficile, car jusqu’à présent, les anticorps anti-Brn-3a testés n’ont
pas permis d’identifier clairement la protéine Brn-3a dans les cellules SH-SY5Y.
d) Effets du VIP dans les maladies neuronales.
Une diminution de l’expression de SNAP-25 est observée dans plusieurs désordres
neuronaux, comme les maladies d’Alzheimer, de Huntington, le syndrome de Down ou les
maladies à prion. Il serait donc intéressant d’étudier les effets du VIP dans des modèles
cellulaires ou animaux de ces pathologies, dans la mesure où le VIP est connu pour avoir des
effets neuroprotecteurs (voir paragraphe « Neuroprotection et maladies neurodégénératives »
p 66) et pourrait restaurer la neurotransmission via une augmentation de l’expression de
SNAP-25.
Les différents travaux présentés ci-dessus devraient permettre de préciser les effets du VIP et
de ces analogues dans les neuroblastomes, dans lesquels la présence du système
VIP-récepteurs semble être favorable. L’intérêt thérapeutique potentiel des neuropeptides de
la famille du VIP pourrait ensuite être étendu à d’autres pathologies cancéreuses ou non.
178
ANNEXE
179
The VIP-receptor system in neuroblastoma cells
Jean-Marc Muller, Michel Philippe, Lucie Chevrier, Céline Héraud, Céline Alleaume, Corinne Chadéneau.
Regul Pept, 2006 ; 137(1-2) : 34-41.
Cette revue a pour but de faire le point sur les données concernant l’implication du système VIP-récepteurs
dans les neuroblastomes, en particulier la régulation de ce système dans ces cellules et les voies de
signalisation qu’il déclenche.
180
181
182
183
184
185
186
187
188
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