diversité et propriété fonctionnelles des bactéries ... · dédicaces je dédie ce modeste...

Faculté des Sciences

Département de Biologie

Laboratoire de Microbiologie appliquée

Mémoire en vue de l’obtention du diplôme de magister en

Microbiologie fondamentale et appliquée

Mémoire Intitulé :

Présenté par

Melle Gomri Aicha

Membre du jury

Président Sahraoui Toufik Professeur, Université d’Oran Es Senia

Examinateur Hennni Jamal Eddine Professeur, Université d’Oran Es Senia

Examinateur Kihal Mebrouk Professeur, Université d’Oran Es Senia

Examinateur Hadadji Miloud Professeur, Université d’Oran Es Senia

Rapporteur Guessas Bettache Professeur, Université d’Oran Es Senia

Année universitaire 2012/2013

République Algérienne Démocratique et Populaire

Ministère de l’Enseignement Supérieur et de la

Recherche Scientifique

Université d’Oran Es-senia

Diversité et propriété fonctionnelles des

bactéries lactiques isolées des margines d’olives

fermentés

Remerciements

En premier lieu, je remercie Dieu le Tout Puissant de m’avoir donné la volonté, la santé et le

courage pour réaliser ce travail.

Ce mémoire a été réalisé au laboratoire de Microbiologie fondamentale et appliqué (LMA),

Département de Biologie, Faculté des Sciences, Université d’Oran, Es-sénia ; sous la direction de

Monsieur GUESSAS.B. À qui j’exprime mes sincères remerciements pour ses connaissances,

sa compétence, sa rigueur scientifique et ses conseils. Qu’il trouve ici mes sincères

remerciements et mon entière reconnaissance. Aussi je tiens à exprimer ma profonde gratitude

ainsi que mes plus vifs remerciements à Monsieur Kihal, Professeur et responsable du

laboratoire.

Je désire remercier tous les professeures chacun par son nom. Professeur Sahraoui .T ; qui

nous a fait un grand honneur en acceptant de présider le jury.

Professeur KIHAL.M ; d’avoir honoré notre sollicitation et d’avoir accepté d’examiner ce

travail et pour son attention et son aide. Qu’il veuille bien accepter l’expression de mon profond

respect.

Professeur Henni J.E ; pour m’avoir fait l’honneur d’examiner ce travail. Qu’il veuille bien

accepter l’expression de mon profond respect.

Professeur Hadadji .M ; pour m’avoir fait l’honneur d’examiner ce travail. Qu’il veuille

bien accepter l’expression de mon profond respect.

Et je tiens à remercier avec beaucoup de plaisir, mes collègues du Laboratoire de Microbiologie

fondamentale et appliqué (LMA), en particulier : Hanane, Fouzia, Fatima, Nour,

Amina, Wassila, Meriem, Kenza, Halima, Asma, Aicha, Soumya, khaira

pour tout ce qu’ils ont fait pour moi.

Je tiens aussi à remercier beaucoup M Nawel technicienne du laboratoire de microbiologie

appliquée et Mr Ahmed technicienne du laboratoire de pédagogie.

En fin, je voudrais tout autant exprimer ma reconnaissance à tous ceux qui m’ont permis de

mener à bien ce travail.

Dédicaces

Je dédie ce modeste mémoire

-A mes chers parents pour les quels je dois mon existence et ma réussite, je

leur souhaite une longe et heureuse vie pleine de santé.

-A mes frères : Cheikh, Abdelkader, Abdelrahman, Djaloul, Lahcen,

Mokhtar, mouloud et yousef.

-Ames sœurs : Rabia, Khaira, Fatima, Meriem, Kenza.

-A mon oncle Mohamed et mes tantes Ammaria ,siti et rabiaa.

-A toute ma famille.

-Mes Deux intimes : Fatima et Rachida

-A mes amis Hafida, Karima, Khadra, Amina, Minine, Bomadien,

Sihame, Hadjer, feyza, soumya, Meriem(Chleff).

Etudiants de ma promotion de Magister : Fatima, Nabila, Wafaa, Bachir,

Yahia pour leurs aides.

Résumé Résumé

Résumé

Les bactéries lactiques sont utilisées depuis plusieurs siècles comme des agents protecteurs

dans les aliments fermentés. Ces bactéries sont présentes dans une grande variété d'aliments,

tel que les laits fermentés, les yaourts, les fromages, et les produits carnés fermentés. Ainsi,

différentes souches d'intérêt commercial ou scientifique y sont couramment isolées. Dans ce

travail, 32 souches de bactéries lactiques ont été isolées et identifiées à partir du margine

d’olives des différentes régions d’Algérie. Les lactobacilles représentent 34,37% de la flore

lactique.L’espèce la plus dominante pour ce groupe est Lactobacillus rhamnosus 63,63%.

Lactobacillus manihotivorans est aussi représenté parmi les souches isolées 36,36%. Les

lactocoques sont représentés par deux espèces qui sont Lactococcus lactis subsp. lactis

27,27% et lactococcus. lactis subsp. Diacetylactis 72,72%. Les entérococcus .

L’étude des interactions a révélé la capacité de toutes les souches à inhiber Staphylococcus

aureus. Et Escherichia coli ont montré leur capacité antagoniste envers ces deux souches par

la production de substances protéiques dans le milieu de culture. Les bactéries lactiques

isolées et identifiée montrent une capacité à inhiber les souches de Staphylococcus aureus,

Escherichia coli par la production de substances protéiques (substances antimicrobiennes)

dans le milieu de culture.

L’activité protéolytique, nous a permis de déceler que l’ensemble des souches lactiques

possédées une activité protéolytique. L’activité lipolytique est constatée toutes les souches

possède pas une activité lipolytique. Enfin l’antibiogramme des bactéries lactiques testées,

montre une sensibilité pour l’ensemble des antibiotiques

Mots clés : bactéries lactiques, margine d’olives, Lactobacillus, lactocoques, Staphylococcus,

Escherichia coli .antibiogramme, substances antimicrobiennes, activité lipolytique, activité

protéolytique

Abstract ABSTRACT

Abstract

Lactic acid bacteria are used for centuries as protective agents in fermented foods. These

bacteria are present in a wide variety of foods such as fermented milks, yogurts, cheeses, and

fermented meat products. Thus, different strains of commercial or scientific interest are

commonly isolated. In this work, 32 strains of lactic acid bacteria were isolated and identified

from the vegetable olives from different regions of Algeria. Lactobacilli represent 34.37% of

the flora lactique.L species most dominant for this group is 63.63% Lactobacillus rhamnosus.

Lactobacillus manihotivorans is also represented among the isolates 36.36%. Lactococci are

represented by two species that are Lactococcus lactis subsp. Lactococcus lactis and 27.27%.

lactis subsp. Diacetylactis 72.72%. The Enterococcus .

Interaction studies revealed the ability of all strains to inhibit Staphylococcus aureus.

Escherichia coli and have shown their ability to counter these two strains by the production of

protein substances in the culture medium. Lactic acid bacteria isolated and identified show an

ability to inhibit strains of Staphylococcus aureus, Escherichia coli by the production of

protein substances (antimicrobial substances) in the culture medium.

The proteolytic activity, has revealed that all the lactic strains possessed proteolytic activity.

The lipolytic activity is found not all strains has a lipolytic activity. Finally the sensitivity of

lactic acid bacteria tested, shows a sensitivity to all antibiotics

Keywords: lactic acid bacteria, vegetable olives, Lactobacillus, Lactococcus, Staphylococcus,

Escherichia coli. Antibiotic, antimicrobial substances, lipolytic, proteolytic activity.

Résumé en arabe ملخص

ملخص

هز انثكرشا يىجىدج ف يجىػح واسؼح ي انىاد . نقشو كؼايم وقائ ف األعؼح انخشجشا انهثحذسرخذو تكد

رى ػضل سالالخ يخرهفح ورنكوتانران،. انغزائح يثم انحهة انخشج، انضتادي، وانجث، ويرجاخ انهحىو انخشج

. ألسثاب ذجاسح أو ػهح

. انضرى ي ياعق يخرهفح ي انجضائشػصاسج وانر ذى ذحذذها ي انهثح سالنح ي تكرشا 32ف هزا انؼم، ذى ػضل

أكثش األىاع انسائذج ف هز انجىػح هى . ٪ ي انثاذاخ انهثح34،37 وذثم (lactobacilles) انؼصاخ انهثح

Lactobacillus rhamnosus 63،63 تسثح٪ .Lactobacillus manihotivorans رىاجذ .٪36.36 وثم

lactococcus. lactis و. ٪27،27تسثح Lactococcus lactis subsp. lactis : ه lactocoquesىػا ي

subsp. Diacetylactis وانؼىح انثشاصح . ٪72،72 تسثح(Les entérococcus ) .

وقذ ذث أها Escherichia coli و Staphylococcus aureusنغ وكشفد دساساخ ذفاػم قذسج كم هز انسالالخ

حض انالكرك . انؼش قادسج ػهى يىاجهح ىػا ي انثكرشا ورنك تإراج انىاد انخاضؼح نهثشوذ ف انىسظ

و كىالي ، ( Staphylococcus aureus )انؼضول و انحذد ظهش قذسج ػهى يغ أىاع ي انكىساخ انؼقىدح انزهثح

(Escherichia coli ) انؼش ف انىسظ ( انىاد انضادج نهكشوتاخ)ي اراج يىاد تشوذح

وقذ . (protéolytique)، كشف نا أ جغ أىاع انهثك ذرهك شاط تشوذىنرك (protéolytique)شاط تشوذىنرك

وف االخش وتاءا ػهى انذساسح (. lipolytique)ف جغ انسالالخ انر نس نذها شاط (lipolytique)نىحظ شاط

. حض انالكرك واخرثاسها ذث نا أ نها حساسح نجغ انضاداخ انحىحانخثشح نثكرشا

Esherichia coli ، staphylococcus، lactocoques، lactobacilles ،انثكرشا انهثح انىسج: كلمات مفتاحية

.المضادات الحيوية والمواد المضادة للميكروبات، دهون، النشاط بروتيه

sommaire SOMMAIRE

Sommaire

Remerciements Dédicace

Résumé

Résumé en anglais

Résumé en arabe

Sommaire

Liste des abréviations

Liste des tableaux

Liste des figures

Chapitre I Synthèse bibliographique

Partie I

Introduction ……………………………………………………………………………………1

1-généralistes sur la culture d’olive……………………………………………………………2

1.1. Les olives………………………………………………………………………………….2

1.2. Secteur oléicole en Algérie………………………………………………………………..3

2. l’extraction d’huile d’olive……………………………………………………………….….4

2.1. Opérations de réception …………………………………………………………….…….4

2.2. Broyage……………………………………………………………………………………4

2.3. Malaxage………………………………………………………………………………..…4

2.4. Séparation des phases…………………………………………………………………...…4

2.4.1. Séparation des phases liquides-solides ……………………………………………………….4

2.4.2. Séparation des phases liquides-liquides ………………………………………………………4

3. Les systèmes de séparation ………………………………………………….…………...…5

3.1. Le système discontinu………………………………………………………………....…..5

3.2. Les systèmes en continu à 3 et 2 phases …………………………………………………5

4. Sous produits de l’oléiculture……………………………………………………..…...........7

5. Problématique environnementale générée par les margines………………………...………8

5. 1. Origine des margines…………………………………………………………….……….8

5.2. Pollution par les margines…………………………………………………………………9

sommaire SOMMAIRE

6. Caractérisation physico-chimique des margines…………………………………...………..9

6. 1. Fraction minérale…………………………………………………………….…….……10

6.2. Fraction organique…………………………………………………………………….…12

6.2. 1. Sucres……………………………………………………………………………….…12

6.2.2-Composés azotés……………………………………………………………………..…12

6.2.3. Vitamines……………………………………………………………..……………..…12

6.2.4. Acides organiques…………………………………………………………………...…12

6.2. 5. Huiles……………………………………………………………………………….…12

6.2. 6. Composés phénoliques…………………………………………………………...……13

6.2. 6. 1. Les monomères phénoliques…………………………………………………..……13

6.2. 6. 2. Les polymères phénoliques…………………………………………………………15

7. Origine de la coloration des margines ……………………………………………….….…16

8. Caractérisation microbiologique des margines……………………………………….……17

8.1. La flore des olives………………………………………………………………….….…18

8.1. 1. Les bactéries…………………………………………………………….…………….19

● Les Bacillus ……………………………………………………………………………………….…19

● Les Enterobacter …………………………………………………………………………………….19

● Les Pseudomonas ……………………………………………………………………………………19

8.1. 2. Les Levures……………………………………………………………………………20

8.1. 3. Les moisissures………………………………………………………………………..20

● Le genre Aspergillus ………………………………………………………………………….…….20

● Le genre Rhizopus ………………………………………………………………………….…….…20

9. traitements des margines…………………………………………………………………..21

9.1. Processus thermique………………………………………………………………...……21

9.1.1. Evaporation naturelle (lagunage)………………………………………………………21

9.1.2. Evaporation forcée…………………………………………………………………..…22

9.1.3. Incinération………………………………………………………………………….…22

9.1.4. Distillation…………………………………………………………………………...…22

9.1.5. Floculation/clarification……………………………………………………………..…22

9.1.6. Cryo-concentration………………………………………………………………..……23

9.2 Procédés physico-chimiques……………………………………………….......................23

9.2.1. Ultrafiltration/Filtration…………………………………………………………..……23

9.2.2. Ozonation………………………………………………………………………………23

9.2.3. Coagulation…………………………………………………………….........................23

sommaire SOMMAIRE

9.3 Procédés biologiques………………………………………………………………...……23

9.3.1. Traitements anaérobies………………………………………………………..…….…23

9.3.2. Traitements aérobies…………………………………………………………..….……24

10. Valorisation des margines…………………………………………………………...……25

10.1. Utilisation des margines comme fertilisant……………………………………….….…25

10.2. Utilisation des margines en compostage…………………………………………….….27

10.3. Récupération de quelques composants…………………………………........................27

10.4. Production de biogaz……………………………………………………………………28

10.5. Production des protéines d’organismes unicellulaires (POU)…………………….……28

10.6. Production d’enzymes……………………………………………………………..……29

10. 7. Epandage…………………………………………………………………………….…29

10. 8. Utilisation en alimentation animale……………………………………………………30

Partie II

Les bactéries lactiques……………………………………………………………………..…32

1. Introduction……………………………………………………………………………...…32

2. Habitat…………………………………………………………………………………..….33

3. Classification…………………………………………………………………………….…34

3.1. Les coques lactiques………………………………………………………………...……35

3.1.1. Les genres Enterococcus, Lactococcus et Streptococcus …………………………………35

3.1.2. Le genre Leuconostoc……………………………………………………………………….…36

3.1.3.Le genre Pediococcus ……………………………………………………………………….…36

3.1.4. Le genre Lactobacillus……………………………………………………………………...….36

3.1.4.1. Les Lactobacilles homofermentaires stricts ……………………………....................36

3.1.4.2.Les Lactobacilles hétérofermentaires stricts …………………………………………37

3.1.4.3. Les Lactobacilles hétérofermentaires facultatifs ………………………………….…37

4. Utilisation industrielle des bactéries lactiques…………………………………………..…38

4.1. Activité acidifiante ……………………………………………………………………………….38

4.2. Production de métabolites d.intérêt ……………………………………………………………38

4.3. Propriétés enzymatiques ………………………………………………………………..……….38

4.4. Propriétés probiotiques………………………………………………………….......................38

4.5. Critères de performance…………………………………………………………………………39

5. les probiotiques………………………………………………………………………….....39

5.1. Définition des probiotiques………………………………………....................................39

5.2. Quatre grands groupes de probiotiques ………………………………….........................39

sommaire SOMMAIRE

A) Les ferments lactiques……………………………………………………….……………39

B) Les bifidobactéries …………………………………………………….............................39

C) Les différentes levures de type Saccharomyces …………………………………………….…40

D) Les autres bactéries sporulées, dont Bacillus subtilis et cereus………………………………40

5.3. Les probiotiques pour lutter contre les bactéries pathogènes……………………….……40

5.4. Les amines biogènes…………………………………………………………..................41

5.4.1. Rôle des amines biogènes …………………………………………………………..…42

5.4.2. Toxicité des amines biogènes …………………………………………………………42

5.4.3. Les bactéries impliquées dans la production des amines biogènes……………………43

Chapitre II Matériels et méthodes

1 .Isolement des souches de bactéries lactiques ………………………………………...……44

1.1. Provenances des échantillons …………………………………………………...……….44

1.2. Milieux des cultures...........................................................................................................44

1.3. Isolement et purification des souches……………………………………………………44

2. Conservation des souches …………………………………………………………………45

3. identification des souches bactérienne …………………………………………….………46

3.1. Critères morphologiques………………………………………………………….….…..46

L’examen microscopique ……………………………………………………….……46

Test de mobilité……………………………………………………………..………...46

3.2. Critères biochimiques et physiologiques……………………………………..………….47

3.2.1. Hydrolase de l’arginine………………………………………………………..……….47

3.2.2. Effet de la température sur la croissance…………………………………….…………47

3.2.3. pH de croissances…………………………………………………………………...….47

3.2.4. Croissance milieu en hypersalé…………………………………………………….….47

3.2.5. Le lait de Sherman……………………………………………………………………..47

3.2.6. Recherche du type fermentaire…………………………………………………………48

3.2.7. L’utilisation du citrate…………………………………………………………….……48

3.2.8. Esculine………………………………………………………………………..….……48

sommaire SOMMAIRE

3.2.9. La production d’acétoine………………………………………………………………49

3.2.10. L’utilisation des carbohydrates…………………………………………….…………49

4. Caractérisation technologiques…………………………………………………….………50

4.1. Etude de la cinétique……………………………………………………………………..50

4.2. Protéolyse ………………………………………………………………………..………51

4.3. Recherche de l’activité lipolytique sur Agar au tween80………………………….…….51

5. Probiotiques ……………………………………………………………………………….52

5.1. Resistance au pH acide …………………………………………………………...……..52

5.2. Test d’hémolyse………………………………………………………………...………..52

5.3. Resistance aux sels biliaires ……………………………………………………………..52

5.4. Antibiogramme……………………………………………………………………..……53

5.5. Les interactions…………………………………………………………………………..53

5.5.1. Interactions entre les bactéries lactiques………………………………………...……..53

5.5.2. Interaction par méthode directe (méthode de double couche) ………………….……..54

5.5. 3.Méthode indirecte………………………………………………………………….…..54

Détermination de la nature de l’agent inhibiteur…………………………………………………..55

a- inhibition due à l’acide lactique………………………………………………………..…..55

b- recherche de la nature protéique de la substance antimicrobienne……………...…………55

c-Effet de la température……………………………………………………………….……..56

Chapitre III Résultat et discutions

3.1.Résultat................................................................................................................................57

3.1.1. Isolement et identification des bactéries lactiques………….…………………..…..….57

Le lait de Sherman.........................................................................................................59

L’utilisation du citrate....................................................................................................60

Esculine..........................................................................................................................60

La production d’acétoine................................................................................................61

Recherche du type fermentaire.......................................................................................61

sommaire SOMMAIRE

3.1.2. Caractérisation technologiques………….………………….………………………….64

Etude de la cinétique......................................................................................................64

Protéolyse et lipolyse

Resistance au pH acide et d’hémolyse……………………………………………...…67

Étude des interactions bactériennes ...............................................................................68

Étude des interactions entre les bactéries lactiques …………………………….……..68

Les interactions et la recherche de la nature de l’agent inhibiteur ……………………69

Détermination de l’agent inhibition (méthode indirecte)……………………….….… 70

Resistance aux sels biliaires...........................................................................................72

Antibiogrammes.............................................................................................................74

Discussion générale…………………………………………………………………...………77

Conclusion……………………………………..………………………………….………….79

Références bibliographiques……………………...…………………………………..………80

Annexes milieux de culture…………………………………………………..………………95

. LISTE DES ABREVIATIONS

Lb. : Lactobacillus

Sc. : Streptococcus

Lc :Leuconostoc

Cl : Clostridium

H : Heures

PH : Potentiel d’hydrogène

°C : Degré Celsius

°D : Degré dornic

% : pourcentage

min : Minute

S : Seconde

L : Litre

ml : Millilitre

g : Gramme

µg : Microgramme

mg : Milligramme

mm: Millimètre

µm: Micromètre

cm : centimètre

KJ: Kilo joule

Kcal: Kilo calorie

Kg : kilo gramme

Pa: Pascal

Abs : Absence

ND : Non déterminé

Ind : Indénombrable

UFC : Unité Formant colonies


Gr : Grossissement

ADH : Arginine dihydrolase

BCP: Pourpre de bromocrésol

Na Cl : Chlorure de sodium

Na OH : Hydroxyde de sodium

H Cl : Acide chlorhydrique

H2O2 : Peroxyde d’hydrogène

H2O : Hydroxyde d’hydrogéne

CO2 : Dioxyde de carbone

J.O.R.A : Journal Officiel de la République Algérienne

FIL : Fédération International du Lait

O.M.S.: Organisation Mondiale de Santé

F.A.O.: Food and Agriculture Organization

UHT : Ultra haute température

GC: Guanine Cytosine

MG: Matière grasse

POU : Production des protéines d’organismes unicellulaires

DCO : Demande Chimique en Oxygène

DBO : Demande Biologique en Oxygène

O3 :

M : mètre

LiP : la lignine peroxydase

MnP : la manganèse peroxydase

HPLC : chromatographie liquide à haute performance

CPG

V : volume

MES ;matière en suspension

Zn :Zinc

ELL : L’extraction liquide-liquide


ATP: adenosine triphosphate peptidoglycanes (PTG)

ADN :nicotinamide adenine dinucléotide

MH: Muller Hinton

KMK: Kempler Mac Kay

MRS: Man Rogosa Sharp

MRS BCP: Man Rogosa Sharp additionné de pourpre de bromocrésol

LISTES DE TABLEAUX

Liste des tableaux

Tableau 1. Composition chimique de d’olive (BIANCHI, 1999)……………………………..3

Tableau.2: Conséquences environnementales des rejets de margine dans le milieu

naturel………………………………………………………………………………………..…9

Tableau3: Principales composantes des margines (Lutwin et al., 1996)………………...…..10

Tableau4: Composition minérale des margines (Salvemini, 1985)……………………….…11

Tableau 5 : Constituants minéraux des margines (Lutwin et al., 1996)……………….…….11

Tableau 6: Teneur de quelques composés phénoliques identifiés dans les margines (Balice et

al.,1984)………………………………………...………………………………………..…...14

Tableau 7. Structure des composantes phénoliques rencontrés dans les

margines………………………………………………………………………………….…15

Tableau 8. Levures pour la production de protéines d’organismes unicellulaire à partir des

effluents d’huileries d’olive (Hamdi, 1993)…………………………………………………..29

Tableau 9 : Composition chimique de la pâte des margines obtenue par le procédé Dalmolive

(Martilotti, 1993)………………………………………………………..…………………….31

Tableau10. Les différents genres de bactéries lactiques………………………………….….35

Tableau11. Classification des lactobacilles selon ORLA- JENSEN (1919)…………….…...37

Tableau 12 : microorganismes considérés comme probiotiques (d’après Hozalpfel et al .,

1998)……………………………………………………………………………………….…40

Tableau 13 : principales amines biogènes trouvée dans les produites alimentaires (ten Brink

et al., 1990)……………………………………………………………………………..….…41

Tableau 14 : les caractéristiques biochimiques, physiologiques des souches de lactobacilles

isolées………………………………………………………………………………………....62

Tableau 15 : les caractéristiques biochimiques, physiologiques des souches de lactocoques

isolées…………………………………………………………………………………………63

Tableau 16: Activités protéolytiques chez les lactobacilles et lactocoques…………..……67

LISTES DE TABLEAUX

Tableau 17. Résultat de la résistance les lactobacilles à déférentes PH (0.1.2)………...……68

Tableau18: l’interaction entre les bactéries lactiques………………………………………..69

Tableau19. Activité antimicrobien de lactobacille vis–à-vis staphylococcus aureus et

Escherichia coli on utilisant milieu tamponné traité avec la chymotrypsine et température

100°C…………………………………………………………………………………………71

Tableau 20: Nombres des colonies caractéristiques de Lactobacilles sur MRS……...…….73

Tableau21: Les résultats d’antibiogramme des souches lactobacilles……………………….…75

LISTE DES FIGURES

Liste des figures

Figure 1. Coupe schématique du fruit de l’olive (Bianchi, 1999)……………………….……2

Fig.2 : Principaux pays producteurs d’huile d’olive en 2001

[Sourcehttp://www.internationaloliveoil.org/downloads/production1.PDF]…………………..3

Figure3: Procédés d’obtention d'huile d'olive (Centre d’Activités Régionales pour la

Production Propre, 2000)………………………………………………………………………5

Figure4: Système de centrifugation à 2 et à 3 phases (Alburquerque et al., 2004)………..…6

Figure.5 : grignon et margine…………………………………………………………………7

Figure 6. Schéma montrant l’arbre phylogénique basée sur la comparaison du gène de l’ARN

16 S, en groupant les bactéries lactiques à faible pourcentage CG et la relation lointaine avec

les germes à gram positif de haut pourcentage CG du genre Bifidobacterium et

propionibacterium (Holzapfel et al., 2001)…………………………………………………..32

Figure 7 formations d’histamine à partir de l’acide aminé histidine au travers de la

dégradation enzymatique du groupe acide (décarboxylation)…………………………..……43

Figure 8. Schéma de conservation longue durée des bactéries lactiques purifiées (Saidi et al.

2002)……………………………………………………………………………………...…..46

Figure 9: schéma représentant le mini préparation pour le test de la fermentation des

sucres……………………………………………………………………………………...…..50

Figure 10. Instruments pour la mesure de l’acidité titrable…………………………….……51

Figure 11 : Les différentes méthodes utilisées pour la recherche de substances

antimicrobienne. (a) méthode de la double couche, (b) méthode de diffusion en

puits………………………………………………………………………………………...…55

Figure12.Aspect macroscopique des colonies de bactéries Lactiques sur MRS +CaCo3

solide………………………………………………………………………………………….57

figure13. Aspect macroscopique des colonies de bactéries lactiques sur MRS acidifiées

solide………………………………………………………………………………………….57

Figure14. Purification des souches de Lb sur milieu lait MRS solide écrémé agar………..57

figure15. Purification des souches lactocoque sur milieu MRS……………………………..57

Figure 16. Aspect microscopique de La souche Lactobacilles Gram et observation au G

x100)…………………………………………………………………………………..….. …58

LISTE DES FIGURES

Figure 17. Aspect microscopique de La souche lactocoque Gram et observation au G

x100)………………………………………………………………………………………….58

Figure 18. Test de l’hydrolyse de l’arginine…………………………………………...…….58

Figure 19. Résultats de test Sherman à 1% entérocoques……………….……………...….59

Figure 20. Résultats de test Sherman à 3% lactocoques..........................................................59

Figures 21. La révélation de l’utilisation de citrate par l’apparition des colonies de contour

bleu sur milieu KMK des souches………………………………………………………...….60

Figures 22. Résultat de dégradation de l’esculine…………………..…………..……..…….60

Figure 23. Le résultat du teste des sucre chez les lactobacilles…………………………….……61

Figure 24. Le résultat du teste des sucre chez les lactocoques……………………………..……61

Figure 25: Répartition des différents groupes de bactéries lactiques des souches de bactéries

lactiques isolées du margine d’olive……………………………………………….…………64

Figure 26. L’évolution de pH des souches Lb3, Lb1, Lb6 Lb8, Lb9, Lb4dans lait écrémé avec

extrait de levure………………………………………….……………………………………65

Figure 27. L’évolution de pH des souches Lb2, Lb5, Lb10, Lb7, Lb11 dans lait écrémé avec

extrait de levure……………………………………………………………………………….65

Figure 28. L’évolution de l’acidité titrable des souches Lb3, Lb1, Lb6, Lb8, Lb9, Lb4 dans

lait écrémé avec extrait de levure……………………………………………….……….……66

Figure 29. L’évolution de l’acidité titrable des souches Lb2, Lb5, Lb10, Lb7, Lb11 dans lait

écrémé avec extrait de levure…………………………………………………....……………66

Figure 30. Activités protéolytiques. …………………………………………………………67

Figure 31. Inhibition de staphe par les lactobacilles en utilisant la méthode

directe……………………………………………………………………………………..….69

Figure 32. Activité antimicrobien de lactobacille vis–à-vis staphylococcus aureus et

Escherichia coli on utilisant milieu tamponné traité avec la chymotrypsine et

température……………………………………………………………………………………72

Figure33. Nombres de colonies caractéristiques de Lactobacilles sur

MRS………………………………………………………………………………………..…72

Figure34. Les résultats d’antibiogramme des souches lactobacilles

Lb5……………………………………………………………………………………………………..…76

Figure 35. Les résultats d’antibiogramme des souches lactobacilles

Lb8……………………………………………………………………………………………………….76

LISTE DES FIGURES

Chapitre I SYNTHESE BIBLIOGRAOHIQUE

Synthèse bibliographique

Chapitre I :

Synthèse

bibliographique

Partie I MARGINES D’OLIVES


Partie I :

margines d’olives

CHAPITRE I SYNTHESE BIBLIOGRAPHIQUE

1

Introduction :

L‟industrie oléicole est une activité importante, concentrée principalement dans les

pays du bassin méditerranéen, qui tiennent approximativement 95% de la production

mondiale, dont 1% produit par l‟Algérie en 2001.

Comme toutes les industries agro-alimentaires, l‟opération d‟extraction nécessite de grandes

quantités d‟eau, par conséquent cette industrie engendre d‟importantes quantités d‟effluents

liquides (les margines). Les margines, ou eaux de végétation, sont des rejets liquides très

riches en matières organiques (composés phénoliques, lipides), souvent répandues en l‟état

dans la nature, de manière incontrôlée sur les sols agricoles ou parfois stockées

provisoirement dans des cuves, exposant ainsi les systèmes eau-sol-plante, a une pollution

inéluctable. Différents traitements d‟épuration leurs sont appliqués : biologiques, physiques

chimiques. Coûteux et encore insuffisants, ces traitements consistent tous à réduire leur

impact sur l‟environnement.

L‟objectif de cette étude l'isolement des bactéries lactiques à partir du margines d‟olives

fermentes à leur identification selon les critères morphologiques, physiologiques et

biochimiques, biotechnologiques.


2

1-généralistes sur la culture d’olive

1.1. Les olives

Le fruit de l‟olivier est une drupe de forme ovoïde ou ellipsoïde. Il est constitué :

-d‟épicarpe : la pellicule qui recouvre le fruit.

-de mésocarpe : la partie charnue appelée pulpe, riche en lipides dont la taille reste variable

selon les variétés.

-d‟endocarpe : le noyau fusiforme, constitué d‟une amande ayant une texture rigide,

protégeant une seule graine à albumen huileux cellulaire (Figure 1).

La forme de l‟olive est variable et caractéristique de la variété. Au cours de la

maturation du fruit, le mésocarpe passe de la couleur vert tendre (olive verte) à la couleur

violette ou rouge (olive tournante) et en fin de maturité à la coloration noirâtre (olive noire)

(Bianchi, 1999).

La composition chimique de l‟olive est constituée principalement d‟eau, de polysaccharides,

d‟huile et d‟autres composés sous forme de traces (Tableau 1). Malgré leur faible

représentation, ces composés ont une très grande importance, car ils vont d‟une part, conférer

à l‟huile une grande Partie de ses qualités gustatives et nutritionnelles, et d‟autre part, la

stabiliser.

Péricarpe

Mésocarpe

Endocarpe

Tégument de la graine

Cotylédon

Albumen

Embryon

Figure 1. Coupe schématique du fruit de l‟olive (Bianchi, 1999)


3

Tableau 1. Composition chimique de d‟olive (BIANCHI, 1999)

Eau

Polysaccharides a

Huiles

Mono- et disaccharides

Cires, triterpènes, phénols

Autres composés b

48%

27%

21%

3%

1%

Traces

a: hémicellulose, cellulose, pectines ; b: alcanes, alkyl-esters, methyl-phenyl-esters,

sterylesters, aldéhydes, alcools, stérols, triterpénoïdes polycycliques et acides gras à très

longue chaîne carbonée

1.2. Secteur oléicole en Algérie

Le patrimoine oléicole mondial compte actuellement environ 750 millions d‟oliviers

cultivés sur une superficie de 9,23 millions d‟hectares. Les pays méditerranéens comptent 715

millions d‟oliviers sur une superficie d‟environ 8.16 millions d‟hectares, soit 95 % du

patrimoine oléicole mondial (El hajjouji, 2007; Fiorentino et al., 2003;Tsagarikiet al., 2007 ).

L‟Algérie fait partie des principaux pays méditerranéens dont le climat est des plus propices à

la culture de l‟olivier. Elle se positionne après l‟Espagne, l‟Italie, la Grèce et la Tunisie qui

sont par ordre d‟importance, les plus gros producteurs d‟huile d‟olive (Tsagarikietal., 2007).

Le patrimoine oléicole algérien est estimé à 32 millions d‟oliviers, ce qui représente 4,26% du

patrimoine mondial. La production annuelle en huile a atteint 35.000 tonnes et celle de l‟olive

de table 80.000 tonnes (Bensemmane, 2009).

En 2001 La production d‟huile d‟olive se concentre principalement dans les pays du pourtour

méditerranéen : Espagne, Italie, Grèce, Turquie, Syrie, Tunisie et Maroc. La production de ces

pays représente 94% de la production mondiale. Atteignait les 2.5 millions de tonnes.

(Benyahia etZein., 2003). (figure. 2)

Fig. 2: Principaux pays producteurs d‟huile d‟olive en 2001

[Source : http://www.internationaloliveoil.org/downloads/production1.PDF]


4

L‟huile d‟olive vierge peut être considérée comme le jus de fruit d‟olive directement

consommable, obtenue par des procédés mécaniques et physiques et dans des conditions

appropriées pour ne pas altérer l‟huile. Pour cela l‟industrie d‟huile d‟olive est une activité

économique importante de plusieurs pays, particulièrement, ceux du bassin méditerranéen.

En revanche cette industrie génère des quantités importantes d‟effluent liquide (margines), qui

présente un véritable problème environnemental.

2. l’extraction d’huile d’olive

La production d‟huile d‟olives a toujours été le principal objectif de la culture de

l‟olivier. Les méthodes d‟extraction ont évolué mais, le processus d‟extraction d‟huile

d‟olives reste toujours le même. Il inclut quatre opérations principales : les opérations de

réception, et le broyage le malaxage, la séparation des phases liquides ; huile et eau (Chimi,

1997)et système discontinu de pression, système Continu à 3 phases et à 2 phases.

2.1. Opérations de réception

Sont les opérations préliminaires de nettoyage et de lavage des olives (éliminer des

impuretés adhérentes à l‟olive), et de stockage et qui ont pour objectif de préparer les olives

pour la suite de procédé.

2.2. Broyage

Cette opération consiste à la dilacération du tissu des olives pour libérer les gouttelettes

d‟huile contenues dans les vacuoles à l‟intérieure des cellules d‟olives.

2.3. Malaxage

Il consiste en un broyage lent et continu de la pâte d‟olive préalablement chauffée. Il a

pour but de libérer le maximum d‟huile en brisant les vacuoles qui sont restées entières durant

la phase précédente et d‟amasser les gouttelettes d‟huile en gouttes plus grosses.

2.4. Séparation des phases

Cette opération consiste à :

2.4.1. Séparation des phases liquides-solides : Le broyage et le malaxage aboutissent à la

formation d‟une pâte qui contient de la matière solide et des fluides. La matière solide appelée

grignon est formée de débris de noyaux, d‟épiderme, de parois cellulaires…etc., alors que la

partie fluide est composée d‟huile et d‟eau de végétation appelée margine.

2.4.2. Séparation des phases liquides-liquides : La séparation entre la phase aqueuse de la

phase huileuse se fait essentiellement par simple décantation ou par centrifugation. Elle est

basée sur la différence de densité entre l‟huile d‟olive et l‟eau de végétation.


5

3. Les systèmes de séparation

Les systèmes de séparation utilisés sont trois : système discontinu de pression, système

continu à 3 phases et à 2 phases (figure3).

Figure3: Procédés d‟obtention d'huile d‟olive (Centre d‟Activités Régionales pour la

Production Propre, 2000).

3.1. Le système discontinu

C‟est l‟unique procédé traditionnel d‟obtention d‟huile d‟olive, utilisé depuis 20 à 30

ans. Ce sont les systèmes classiques par pression avec broyeurs. Le broyage des olives suivi

du malaxage se font sous des meules. Une pâte est obtenue au bout d‟une demi-heure environ.

Elle est composée de grignon et un moût contenant l‟huile et les margines. La séparation des

deux phases solide-liquide se fait par simple pression, alors que l‟huile est séparée des

margines par décantation naturelle.

3.2. Les systèmes en continu à 3 et 2 phases

Les systèmes en continu à 3 et 2 phases sont les plus récents, ils utilisent des

centrifugeuses pour la séparation de la pâte.


6

Dans le système à 3 phases, la quantité d‟eau ajoutée dans le malaxeur est supérieure à celle

du système traditionnel (entre 80 -100 l/100kg d‟olive), et la production des margines est très

importante (Martinez-Garcia et al., 2006). Pour le système écologique à 2 phases, il ne

nécessite pas d‟ajout d‟eau pour le processus d‟extraction mais il y a génération de grignon

humide (Centre d‟Activités Régionales pour la Production Propre, 2000). Dans les deux cas,

le grignon contient des polyphénols (Martinez-Garcia et al., 2006). La figure 4présente un

bilan comparatif des deux systèmes continus.

Olives (1000 Kg)

0,1- 0,12 m3 Lavage (à froid)

Broyage et malaxage

Eau chaude

0,6- 1,3 m3 Centrifugation Grignon (~ 550 Kg)

(Décanteur à 3 phases)

Eau de lavage Lavage d‟huile/récupération Margine 1-1,6 m3

D‟huile dans la phase liquide

Huile d‟olive

(≈ 210Kg)

Système à 3 phases

Olives (1000 Kg)

0,1- 0,12 m3 Lavage (à froid)

Broyage et malaxage

Centrifugation Grignon (~ 800 Kg)

(Décanteur à 2 phases)

Eau de lavage Lavage d‟huile/récupération Margine 0.2m3

D‟huile dans la phase liquide

Huile d‟olive

(≈ 200Kg)

Système à 2 phases

Figure4: Système de centrifugation à 2 et à 3 phases (Alburquerqueet al., 2004).


7

4. Sous produits de l’oléiculture

L‟industrie oléicole, en plus de sa production principale qui est l‟huile (l‟huile d‟olive

vierge et l‟huile de grignon), engendre la production de deux résidus : un liquide et l‟autre

solide (Nefzaoui, 1991).

- Margines ou eaux de végétation : sont des effluents liquides, parfois nommés alpechine

(Ramos-Cormenzanaet al., 1995).Le pressage de 1 tonne d‟olives produit en moyenne 1,5

tonnes de margines avec les modes de production modernes(Benyahiaet al.,2003).

- Grignons ou tourteaux d‟olive : sont des résidus solides issus de la première pression ou

centrifugation, ils sont formés des pulpes et des noyaux d‟olives. Ce produit peut être ans

formé en un produit destiné à l‟alimentation animale ou en huile dite : grignons d‟olive après

extraction chimique (Chiofaloet al.,2004 ;Martin-Garciaetal., 2003.)(figure.5).

Grignon

Margine

Figure.5 : grignon et margine


8

5. Problématique environnementale générée par les margines

5. 1. Origine des margines

Le processus de trituration des olives produit principalement l‟huile d‟olive vierge et

l‟huile de grignon (huile secondaire extraite par des solvants organiques) et engendre deux

résidus l‟un liquide, les margines et l‟autre solide, les grignons. Les olives contiennent

environ 20% d‟huile, 30% de grignons et 50% d‟eau de végétation (Di-Giovacchinoet al.,

1988 ; Hamdiet al., 1992).

Les margines sont composées de 40 à 50% de l‟eau végétal qui provient du fruit (olive) et le

reste de l‟eau de fabrication ajoutée lors du processus de trituration (Nefzaoui, 1987 ; Di-

Giovacchino, 1996).

5.2. Pollution par les margines

Les margines sont considérées parmi les effluents les plus polluants des industries

agroalimentaires, et lorsqu‟elles sont déchargées dans la nature sans aucun traitement, elles

causent de sérieux dégâts environnementaux. Leur pouvoir polluant est dû principalement à

des causes diverses, parmi lesquelles :

1. Le pH : qui est la première cause directe de la mort des poissons, lorsque la margine est

déversée dans les lits des fleuves (Centre d‟Activités Régionales pour la Production Propre,

2000).

2. Le contenu organique qui contribue à la consommation de l‟oxygène dissous (Centre

d‟Activités Régionales pour la Production Propre, 2000) et empêche les eaux d‟autoépurer, et

la pollution peut s‟étendre sur de très longues distances (Benyahiaetal., 2003).

3. La teneur en matière grasse provoque la formation d‟une couche à la surface de l‟eau

empêchant sa correcte oxygénation et le passage de la lumière et faisant obstacle au

développement normal de la faune et la flore au sein des fleuves (Centre d‟Activités

Régionales pour la Production Propre, 2000). Les acides gras et leurs dérivés inhibent les

bactéries sporulées de sol (Nefzaoui, 1991).

4. La présence des composés phénoliques inhibe le développement des micro-organismes

aussi bien en présence et en absence d‟oxygène (Nefzaoui, 1991). Ces substances, ont un effet

phytotoxique et une activité antimicrobienne (Khoufietal., 2007 ; Khoufiet al.,2007 ) et

présentent un faible niveau de biodégradabilité. Pour ces raisons, les traitements biologiques

ne peuvent pas être appliqués pour ce type d‟effluent (Pharm Minh etal.,2006).


9

Le tableau.2, résume les conséquences de ces rejets non seulement sur l‟environnement, mais

aussi au niveau des stations d‟épuration et égouts.

Tableau.2: Conséquences environnementales des rejets de margine dans le milieu naturel.

Cause Effet Référence

Sols

- composés phénoliques

- acidité

- huiles et matières

grasses

- MES

- sols obturés et suffoqués

- mauvaise odeur

- pollution de l‟aquifère

- coloration des eaux naturelles

- effet phytotoxique sur la

population microbienne

Kestioğlua et al., 2005

Bousdira, 2004



Amirante et Di Renzo.,

1991

Espèces

aquatiques

-matières organiques

- huile et MG

- MES

- composes

phénoliques

-augmentation de la demande en

O2

- formations des croûtes

- dégradation de l‟esthétique

- toxicité de la microflore

Bousdira, 2004

Bousdira, 2004

Bousdira, 2004

Office National des

Produits

Oléicoles du Centres,

1997

Egouts - acidité

- MES

- la corrosion des matériaux

- destruction de l‟écoulement

- putréfaction

Bousdira, 2004

Station

d’épuration

des eaux

usées

- acidité

- MES

- huile et matière grasse

- matières organiques

- polyphénols

- perturbation persistances de

l‟activité des boues

- perturbation de l‟activité des

digesteurs des boues à cause de

l‟aspect saisonnier

Bousdira, 2004

6. Caractérisation physico-chimique des margines

Les margines se présentent comme un liquide résiduel aqueux, de couleur brune

rougeâtre à noire avec une forte odeur d‟olive et un aspect trouble (Ranalli, 1991a). Leur pH

est acide (4 - 5,5) avec un fort pouvoir tampon et une odeur fétide qui se développe au fur et à

mesure que les margines vieillissent (Ranalli, 1991a ; Hamdi, 1993c ; Mouncifet al., 1993a).

Elles ont généralement une forte salinité due à l‟ajout important de sel pour la conservation

des olives (conductivité supérieure à 10 mS.cm-1) (Zenjariet al., 1999 ; Tsioulpaset al., 2002).

La composition des margines a été étudiée par plusieurs chercheurs et comporte

approximativement 83 à 94% d‟eau, 4 à 16% de matières organiques et 0,4 à 2,5% de

substances minérales (Ramos-Cormenzana, 1986 ; Ranalli, 1991a).

La caractérisation physico-chimique des margines est généralement tributaire des techniques

et des systèmes d‟extraction de l‟huile d‟olives, elle diffère d‟un pays à l‟autre (Khoufiet al

.,2007).En général, les margines contiennent une variété de composés organiques et minéraux,

de nature et de concentration très différentes. Cette variation est due essentiellement aux

facteurs suivants (Karapinaretal., 1983 ; Bambalovet al., 1989):

− Stade de maturation des olives,

− Conditions climatiques,


10

− Variété des oliviers,

− Système de culture,

− Situation géographique,

− Temps de stockage des olives avant la trituration,

− Techniques et lieu de stockage,

− Nature de conservation des olives,

− Procédé d‟extraction d‟huile d‟olive qui représente l‟élément le plus important (DeFelice et

al., 1997 ; Ramos-Cormenzana, 1986 ; Annakiet al., 1999b).

Les analyses menées sur les margines peuvent nous renseigner sur les intervalles de variation

de leurs différents composants chimiques (Fiestas Ros de Ursinosetal., 1992 ; Lutwinet al.,

1996).(tableau 3)

Tableau3:Principales composantes des margines (Lutwinet al., 1996)

6. 1. Fraction minérale

Les margines contiennent des quantités significatives en sels minéraux (Ranalli, 1991a)

dont 80% sont solubles (phosphates, sulfates et chlorures) et 20% insolubles (carbonates et

silicates). D‟après Fiestas Ros de Ursinoset al .,(1992), les éléments les plus représentatifs

sont le potassium (47%), les carbonates (21%), les phosphates (14%) et le sodium (7%). La

fraction minérale a été analysée par Salvemini (1985). Le tableau 4 regroupe les

concentrations de ces éléments.

Composant % en poids de la matière fraîche

Matière sèche

Matières minérales

Sucres divers

Graisses et huiles diverses

Composés phénoliques

Azote organique

1,4-17

10-15

30-50

12-35

5,0-25

<10%


11

Tableau4:Composition minérale des margines (Salvemini, 1985).

Ce tableau montre que les margines sont riches en phosphore, sodium, potassium et

calcium. Par conséquent elles peuvent être utilisées comme fertilisants des terres agricoles

(Buldiniet al., 2000 ; Capassoet al., 2002a, 2002b).

La composition minérale des margines a été aussi étudiée par Lutwinet al. (1996).Le tableau

5montre les valeurs des éléments minéraux en % du poids de la matière sèche.

Tableau 5 : Constituants minéraux des margines (Lutwinet al., 1996).

Elément Valeur en % du poids de la matière sèche

Potassium (K2O)

Calcium (CaO)

Phosphore (P2O5)

Magnésium (MgO)

Sodium (Na2O)

5-15

0,2-2,5

0,5

3,0

<1%

6.2. Fraction organique

Les margines comportent deux fractions organiques :

− Fraction insoluble constituée essentiellement de pulpes d‟olives. Cette fraction représente

les matières en suspension et colloïdales (Hamdi, 1991a).

Elément Concentration (mg.l-1)

Orthophosphates (po4-3

)

Chlorures (Cl-)

Sulfate (SO4-2)

Sodium (Na+)

Potassium (K+)

Calcium (Ca2+)

Magnésium (Mg2+)

Fer (Fe)

Aluminium (Al)

Chrome (Cr-)

Nickel (N)

Cobalt (Co)

Manganèse (Mn)

Cadmium (Cd)

Oxyde de silicium (SiO2)

Zinc (Zn)

800,6

270,2

16,68

5370,9

15295,5

1167,6

410,3

103,4

8,34

0,66

3,36

1,33

1,66

0,83

41,7

10,0


12

− Fraction soluble dans la phase aqueuse et contient les sucres, les lipides, les acides

organiques et les composés phénoliques (Hamdi, 1991a).

6.2. 1. Sucres

Les études effectuées sur les margines par Hamdi (1993a) ont montré que la teneur en

glucides varie entre 2 et 8% du poids de la pulpe d‟olive fraîche.

Les glucides rencontrés dans les margines contiennent principalement des composés

lignocellulosiques et des pectines qui représentent respectivement 3% et 0,6% (Fernandez

Diaz, 1983).

La présence d‟autres sucres simples tel que : glucose, saccharose, mannose, arabinose,

raffinose et xylose a été également signalée par Salvemini (1985).

6.2.2-Composés azotés

La fraction azotée est représentée principalement par les protéines avec une

concentration variant entre 1,2 et 2,4% (p/v). Presque tous les acides aminés sont présents

dans les margines. Les plus abondants sont l‟acide aspartique, l‟acide glutamique, la proline et

la glycine (Salvemini, 1985 ; Ranalli, 1991a ; Capassoet al, 2002a).

6.2.3. Vitamines

Plusieurs vitamines ont été identifiées. Les plus fréquentes sont les vitamines du groupe

D et la vitamine PP avec une concentration de 124 mg.kg-1 de margines (Salvemini, 1985).

Cette teneur peut être exploitée à l‟échelle industrielle.

6.2.4. Acides organiques

La proportion des acides organiques présente dans les margines varie entre 0,5 et 1,5%

(p/v). Les principaux acides organiques rencontrés sont les acides fumarique, glycérique,

lactique, malique et malonique (Fiestas Ros de Ursinos, 1981 ; Salvemini, 1985).

6.2. 5. Huiles

La concentration d‟huile résiduelle contenue dans les margines est très variable selon le

procédé d‟extraction utilisé. Elle varie entre 0,02 et 1% (v/v) (Fiestas Ros de Ursinosetal

.,1992). L‟acide oléique est l‟acide gras le plus abondant avec un pourcentage de 65% par

rapport à la totalité d‟huile (Ranalli, 1991a).

6.2. 6. Composés phénoliques

Les composés phénoliques des margines sont très divers et leur structure est très

variable. Ils proviennent de l‟hydrolyse enzymatique des glucides et des esters de la pulpe


13

d‟olive au cours du processus d‟extraction. Leur solubilisation dans l‟huile est cependant bien

inférieure à celle dans les eaux de végétation, ce qui explique leur concentration élevée

détectée dans les margines (Ranalli, 1991a).

Les caractéristiques organoleptiques de l‟huile d‟olive vierge dépendent de la présence des

composés phénoliques et des substances volatiles (Vazequez, 1978). La teneur en composés

phénoliques dans les margines dépend du système d‟extraction de l‟huile d‟olive (Annakiet

al., 1999b). En général, elle varie entre 3 et 5 g.l-1 (Feniceet al., 2003) et elle peut même

dépasser les 9 g.l-1 (Aissamet al., 2002). Plus de 50 composés phénoliques et plusieurs

alcools ont été identifiés (Casa et al., 2003). La composition des margines en composés

phénoliques diffère aussi selon la procédure d‟extraction et la variété d‟olive traitée (Ramos-

Cormenzana, 1986).

6.2. 6. 1. Les monomères phénoliques

Plusieurs monomères aromatiques ont été identifiés dans les margines par des

techniques de chromatographie (HPLC ou CPG). Ils sont représentés essentiellement par des

acides et des alcools phénoliques.

- Acides phénoliques

Les acides phénoliques sont les monomères les plus abondants dans les margines, ce qui

explique leur acidité. Plusieurs acides phénoliques ont été identifiés dans différents types de

margines :

- Acide caféique (Borjaet al., 1995a).

- Acide p-coumarique(Borjaet al., 1995a).

- Acide protocatéchuique(Borjaet al., 1995a).

- Acide vanillique(Borjaet al., 1995a).

- Acide 4-hydroxyphénylacétique (Borjaet al., 1995a).

- Acide syringique(Borjaet al., 1995a).

- Acide p-hydroxybenzoique(Borjaet al., 1995a).

- Acide vératrique(Martinez et al., 1992).

- Alcools phénoliques

Parmi les alcools phénoliques les plus rencontrés dans les margines, nous citons :

- 4-Hydroxyphényléthanol (Cichelli et al., 1984).

- 3,4-dihydroxyphényléthanol (Borjaet al., 1995a), appelé aussi hydroxytyrosol.

- 4-hydroxyphényléthanol (tyrosol) (Borjaet al., 1995a).

- Syringaldéhyde(Borjaet al., 1995a).


14

Ces alcools peuvent être parfois liés à des glucosides comme le 4-diglucoside β

(3,4dihydroxyphényl) éthanol.

- Autres composés phénoliques : (Wagner et al., 1984 ; Capasso, 1997)

D‟autres composés phénoliques monomères ont été identifiés :

- Oleuropéine

- L-caféyl- glucose

- Apégine

- Lutéoline

L‟oleuropéine est très abondant dans les margines et se caractérise par un goût amère,

elle peut atteindre jusqu‟à 2% du poids d‟olives (Wagner et al., 1984).

Les composés phénoliques sont essentiellement contenus dans la fraction soluble

desmargines. Baliceet al .,(1984) ont quantifié certains composés phénoliques des margines

par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) (tableau6).

Tableau 6:Teneur de quelques composés phénoliques identifiés dans les margines

(Baliceetal., 1984).

Composé phénolique Teneur en mg.l-1

- Acide vanillique

- Acide 4-hydroxyphénylacétique

- Acide syringique

- Acide vératrique

- Acide 3,4,5- triméthoxybenzoïque

242

145

710

500

80


15

Tableau 7. Structure des composantes phénoliques rencontrés dans les margines.

Composés phénoliques Structure Références

Acide cafféique

D‟Annibale et al.,2004 ; El Hajjouji et

al., 2007

Acide p-coumarique

D‟Annibale et al., 2004 ; El Hajjouji et

al., 2007

Oleuropéine

El Hajjouji et al.,2007

Hydroxytyrosol

Fki et al., 2005 ; Ergül et al., 2009

Tyrosol

Fki et al., 2005 ; Ergül et al., 2009

Acide vanillique

Azabou et al., 2007

Acide ferrulique

D‟Annibale et al.,2004 ; Fki et al.,

2005

6.2. 6. 2. Les polymères phénoliques

Les polyphénols identifiés dans les margines sont essentiellement :

− Les anthocyanes (Tanchevet al., 1980).

− Les tannins : leur structure est très complexe, leur concentration peut atteindre 12 g.l-1

(Baliceet al., 1982) . Ils sont classés conventionnellement en tanins hydrolysables et tanins

condensés (Monties, 1980).


16

I. Les tannins hydrolysables renferment trois groupes :

* Esters d‟acides phénoliques,

* Esters d‟acides phénoliques et sucres,

* Glucosides, est le groupe le plus abondant où l‟acide gallique est le plus important. L‟action

de l‟enzyme tannase chez Aspergillus niger hydrolyse ce type de tanins en glucose et en acide

gallique. Les gallotanins sont les plus représentatifs de ce groupe.

II. Les tanins condensés, appelés aussi flavotanins. Ils sont formés par la polymérisation de la

catéchine à différents degrés. Leur poids moléculaire est compris entre 500 et 3 000. Le

catécholmélaninique est le flavotanin le plus retrouvé en quantité élevée dans les margines.

Les flavotanins sont souvent associés aux anthocyanes. En milieu alcoolique et en présence de

HCl 5N, ils sont dégradés avec formation de pigments anthocyaniques de coloration rouge

(cyanidine).

− La lignine est un hétéropolymère formé par la polymérisation oxydative de trois types de

monomères dérivés de l‟alcool hydroxycinnamique : le 4-hydroxycinnamate, le 4-hydroxy 3-

méthoxycinnamate (coniférylate) et le 3,5-diméthoxy-4-hydroxycinnamate (sinapylate)

(Hamdi, 1991a).

7. Origine de la coloration des margines

En général, les margines sont de couleur brune-rougeâtre à noire. Cette variation de

couleur est due à plusieurs facteurs (Karapinaretal., 1983 ; Bambalovet al., 1989W) :

− Variété et degré de maturité des olives,

− Etat de fraîcheur des margines,

− Etat de dégradation des composés phénoliques,

− Proportion relative entre les deux groupes des composés phénoliques.

Le pigment brun ou catécholamine est un polymère de nature phénolique responsable de

la couleur foncée des margines. Ce polyphénol ne se trouve pas dans les olives. Il se forme au

cours du broyage à partir des orthodiphénols, très abondants dans la pulpe, sous l‟action des

phénoloxydases. Cette enzyme est inactive dans les drupes entières (Ranalli, 1991a).

L‟étude des composés phénoliques de différents échantillons de margines tunisienne a montré

qu‟ils contiennent pratiquement les mêmes composés phénoliques simples, mais à des

concentrations variables suivant la maturité des olives et la conservation des margines

(Hamdi, 1991a). Cette fraction phénolique renferme deux groupes de composés :

- Composés de poids moléculaires inférieur à 2. 104 qui sont responsables de la couleur rouge

violette. Ces composés correspondent aux polymères phénoliques de faibles poids


17

moléculaires (anthocyanes, tannins). Ils renferment également une classe de composés

correspondant aux monomères et oligomères phénoliques qui sont responsables de la

coloration jaune masquée par la coloration rouge (Hamdi, 1993b).

- Composés phénoliques de poids moléculaire supérieur à 2.104 responsables de la coloration

noire des margines. Ce sont des polymères phénoliques obtenus après oxydation des

polyphénols du premier groupe (Saezet al., 1992 ; Hamdi, 1993b).

Cette 2ème catégorie semble constituer une forme de la lignine (pseudolignine) (Hamdi,

1993b). Donc, selon Hamdi (1993b), la couleur des margines qui varie du rouge violet foncé

au noir est sous la dominance d‟un groupe de composés phénoliques par rapport à l‟autre.

Durant le stockage des margines, il a été constaté que leur coloration devient de plus en plus

noire. Ceci peut être expliqué par :

� l‟oxydation des polyphénols du premier groupe qui se polymérisent et donnent les

polyphénols du second groupe (Hamdi, 1993b ; Saezet al., 1992).

�La biodégradation naturelle des polyphénols du premier groupe.

Ces phénomènes de biodégradation et de polymérisation des tanins et des anthocyane sont été

signalés aussi par Field et Lettinga (1991).

La décoloration des margines a été étudiée par plusieurs auteurs. Ces derniers ont constaté que

le champignon Phanerochae techrysosporium est capable de décolorer les margines grâces

aux deux enzymes, la lignine peroxydase (LiP) et la manganèse peroxydase (MnP) (Sayadiet

al ., 1992, 1993, 1995 ; Sayadiet al., 1996, 2000 ; Gharsallahet al., 1999 ; Kahramanetal .,

1999 ; Garcia Garciaet al., 2000 ; Kissiet al., 2001). D‟autres travaux ont montré la capacité

du champignon Pleurotusostreatusà décolorer les margines grâce à l‟enzyme phénol oxydase

ou laccase (Tomatiet al., 1991 ; Martiraniet al., 1996 ; Flouriet al., 1996 ; Kissiet al., 2001 ;

Fountoulakis et al., 2002). L‟effet de prétraitement des margines par Pleurotus ostreatusa

montré ses performances lors d‟un traitement anaérobie ultérieur (Fountoulakiset al., 2002).

Une étude menée sur plusieurs souches de Pleurotussp. a montré qu‟elles sont toutes

capables de croître sur les margines sans prétraitement ni ajout des nutriments (Tsioulpas et

al., 2002). La coloration noire des margines est devenue jaune marron avec un taux

d‟élimination des composés phénoliques de 76% après 15 jours d‟incubation.

L‟oxydation chimique représente aussi un moyen efficace pour la décoloration des margines.

Flouriet al. (1996) ont obtenu une décoloration de 50% des margines en ajoutant 20 g.l-1 du

peroxyde d‟hydrogène (H2O2).


18

8. Caractérisation microbiologique des margines

8.1. La flore des olives

Les olives de par leur richesse en substances pectiques et autres constituants,

représentent un milieu favorable pour la prolifération d‟une flore très diverse. Selon Borcakli

et al.(1993a) et Kotzekid ou (1997), cette flore est constituée essentiellement de bactéries

Gram négatif, de Lactobacillus et de levures :

- Les microorganismes isolés à partir des olives vertes commercialisées sous forme saumurées

appartiennent pour la plupart d'entre eux aux bactéries lactiques et aux levures.

Les bactéries lactiques sont plus abondantes que les levures. Les aérobies mésophiles

générateurs de spores tels les Bacillus, qui peuvent être considérés comme des contaminants

du produit lors de sa manipulation, ont aussi été isolés à partir de quelques échantillons mais

leurs effectifs n‟étaient pas très important (Lopez-lopez et al.,2004).

- Une flore microbienne complexe favorisant la fermentation des olives noires du Portugal,

constituée principalement de bactéries lactiques et de levures, a été mise en évidence par

Catulo et al. (2002). L‟étude taxonomique des mêmes auteurs a prouvé que plusieurs espèces

de levures sont présentes durant le temps de fermentation avec des possibilités métaboliques

particulières.

Alors que les bactéries lactiques constituées principalement de Lactobacillus se sont

développées pendant le premier et/ou les dernières phases de fermentation.

Les études réalisées sur des échantillons d‟olives noires fermentées selon les techniques

artisanales et industrielles, ont également confirmé la prédominance des espèces de

Lactobacillus par ces mêmes auteurs. Dans le cas des olives vertes conservées en saumure, il

peut y avoir une fermentation indésirable avec la production de gaz, due à des Enterobacter,

Bacillus et Clostridium (Cl. Butyricum qui peut entraîner une fermentation butyrique).

Dans le cas des olives stockées et exposées à l‟air, le développement sur la surface dufruit

d‟un film de levures (Candida) et de moisissures (Aspergillus, Penicillium, Fusarium) est très

fréquent ce qui entraîne la dégradation de l‟acide lactique et permet ensuite l‟implantation de

contaminants (Pseudomonas et Bacillus) qui modifient l‟aspect et la qualité organoleptique du

produit (Guiraud, 1998).

Des germes pectinolytiques constitués le plus souvent de Bacillus, Aeromonaset de

moisissures provoquent l‟apparition de viscosité dans le fruit.


19

8.1. 1. Les bactéries

● L‟isolement de nouvelles souches de bactéries lactiques à partir des olives crues et

fermentées ainsi que leurs dérivés (huiles d‟olives et margines) a suscité l‟intérêt de plusieurs

auteurs des pays méditerranéens (Van den berg et al.,1993 ; Chamkha, 2001).

Plusieurs souches de bactéries lactiques ont été isolées des olives vertes traitées à la saumure

pendant quatre à neuf mois et sont identifiées comme étant : Lactobacillus brevis, Lb.

plantarum,Lb. caseisubspcasei ; Leuconostoc mesenteroides, Lc. dextranicum et Pediococcus

cerevisiae(Asehraou et al.,1993). Parfois la présence d‟espèces du genre Enterococcus a été

constatée (Guiraud, 1998). D‟autres souches de bactéries lactiques sont également isolées à

partir des olives de table en Italie par La vermicocca et Gobbetti(1998) et à partir d‟olives

fermentées au Portugal (Clafardini et al.,1994). Les travaux récents de Campaniello et al.,

(2005) sur l‟identification d‟espèces de bactéries lactiques dans les olives naturelles ou

traitées, selon la tradition espagnole qui traite les olives avec une solution aqueuse de NaOH

(1,3 à 2,6 %) durant 12 à 15 h, ont prouvé que lactobacillus plantarumétait l'espèce

prédominante, bien que Lactobacillus pentoseus et Leuconostoc mesenteroides soient aussi

présents.

● Les Bacillus sont des contaminants des olives traitées en saumure. Parmi l‟espèce de ce

genre, la plus fréquemment rencontrée est Bacillus subtilis, considérée pectinolytiques et

causait le ramollissement du fruit (Campaniello et al.,2005 ; Lanciottiet al., 1999).

● Les Enterobactersont présents dans le sol et les plantes. Ce sont des contaminants

alimentaires très fréquents et capables de dégradation importante. Les espèces (Enterobacter

cloacae, Enterobacter amnigenus) de ce genre ont été isolées à partir des olives vertes traitées

et non traitées avec de la soude. Elles apparaissent dés leur première phase de fermentation et

persistent dans les échantillons durant 80 jours de conservation (Thierry, 1997 ;Campaniello

et al.,2005).

● Les Pseudomonas : Les espèces de ce genre sont dotées d‟une grande activité métabolique

(protéolyse, lipolyse et dégradation des substances carbonées) (Thierry, 1997). Ce groupe est

très répandu dans la nature. Ce sont des agents phythopatogène (Xanthomonas,

Photobacterium,Agrobacteriumet Pseudomonas). Les Pseudomonas sont aussi des

contaminants des olives ;pendant le stockage des olives traitées en saumure, le développement

des Pseudomona sprotéolytiques cause la détérioration du produit. Elle est caractérisée par

une diminution de l'acidité des saumures et le gonflement du fruit (Campaniello et al.,2005).


20

8.1. 2. Les Levures

Les levures sont classées en deux groupes selon la proportion de lipides qu‟elles

contiennent (groupe 1 : 20 % ; groupe 2 : 20 à 80 % de lipide). Les espèces du deuxième

groupe sont appelées des levures oléagineuses et incluent principalement les espèces des

genres :Lipomyces, Rhodotorula, Candida, Trichosporonet Cryptococcus. Elles sont

rencontrées dansl‟air, les eaux, les sols et les végétaux où les sucres simples sont peu

représentés (Kreger, 1987). Parmi ces genres, les espèces isolées à partir d‟olives traitées avec

de la soude sont :

Candida pelliculosaa, Candida ciferrii, Candida glabrata, Cryptococcus laurentii et

Rhodotorulamucilaginosaet sont toutes dotées d‟activité polygalacturonase(Campaniello et

al.,2005). Les espèces isolées des olives fermentées et stockées en vrac sont : Candida et

chellsii, Candida versatilis, Rhodotorulaglutinis var. glutinis, R. minuta var. minuta, et

R.rubra, Saccharomyces cerevisiae et Pichia anomala. Elles possèdent des activités estérase

et polygalacturonase et sont la cause du ramollissement du fruit (Vaughinet al.,1969 ;

Asehraouet al., 2000).

8.1. 3. Les moisissures

Les moisissures saprophytes (Mucorales, Pénicillium, etc.) se développent sur les fruits

crus ou cuits, les fruits séchés placés à l‟humidité, les déchets de betteraves et de bagasse de

canne à sucre. Elles sont utilisées depuis fort longtemps par l‟homme pour la préparation

d‟aliments et interviennent comme agents de fermentation dans la fabrication du fromage.

Elles synthétisent un grand nombre de substances complexes économiquement très

importantes comme les enzymes, des acides organiques, des antibiotiques et des alcaloïdes

(Moreau, 1989;Roquebert, 1997).

● Le genre Aspergillus est très répandu dans l‟environnement et généralement trouvé comme

contaminant banal dans les cultures surtout des céréales et dérivés telle que l‟espèce

Aspergillus niger(Derache et al., 1986 ; Davise Larone, 1987). Tandis que l‟espèce

Aspergillus versicolor a été isolée à partir des olives et des huiles végétales (Kavitha et al.,

1997).

● Le genre Rhizopuscontient plusieurs espèces. Les plus communes sont : Rhizopus oryzae,

Rhizopus arrhizus et Rhizopus stolonifer isolées du sol, des graines des céréales et des

matières végétales en décomposition. L‟espèce Rhizopus stoloniferus a été isolée à partir


21

d‟huile d‟olives. Les espèces de Rhizopus sont des moisissures qui, en se développant sur les

légumes et les fruits(Bananes, Fraises) les rendent mous (Breton, 1985).

9. traitements des margines

Les techniques suivantes ont été décrites comme les plus utilisées ou comme étant

potentiellement applicables. Ces techniques de traitement peuvent être classées en procédés

thermiques, physico-chimiques et biologiques.

9.1. Processus thermique

9.1.1. Evaporation naturelle (lagunage)

Les effluents d‟huileries d‟olive sont placés dans des bassins ou étangs d‟évaporation de

profondeur de 0.7 à 1.5 m (El Alami, 2000). Cette profondeur est choisie pour assurer une

évaporation totale avant la campagne oléicole suivante. Après séchage, les effluents

d‟huileries d‟olive sont, soit incinérés soit utilisés comme engrais organique ou comme

additifs dans un compostage ou tout simplement jetés à la décharge.

L‟évaporation naturelle est tributaire des conditions climatiques. Elle dépend étroitement de la

vitesse du vent, du degré d‟ensoleillement et de l‟humidité de l‟air. Cette méthode permet la

diminution du volume des effluents d‟huileries d‟olive écoulés dans les réseaux hydrauliques

superficiels ou dans les réseaux de collecte des eaux usées. Elle présente beaucoup

d‟avantages à savoir :

- La simplicité de fonctionnement : ces installations ne nécessitent pas de travaux de

maintenance réguliers, seuls une surveillance périodique du site et un curage tous les 3 à 5 ans

sont nécessaires ;

- L‟autoépuration pendant l‟évaporation qui se fait par les microorganismes présents dans les

effluents d‟huileries d‟olive ;

- Le coût d‟investissement et d‟exploitation faible.

Néanmoins, ce procédé présente les inconvénients suivants :

- Le transport des effluents d‟huileries d‟olive jusqu‟au site du traitement ;

- La nécessité de grandes surfaces pour le séchage à cause du développement d‟un film

imperméable gênant l‟évaporation ;

- Le dégagement d‟odeurs indésirables ;

- La pollution éventuelle des nappes phréatiques si l‟étanchéité des bassins n‟est pas parfaite.


22

9.1.2. Evaporation forcée

Les effluents d‟huileries d‟olive sont pompés à partir de bassins de stockage, puis

projetés par des asperseurs sur des panneaux juxtaposés, ayant une importante surface

d‟échange avec l‟air (Nucleos d‟Interface, 1992).

Ce système est généralement applicable lorsque la température de l‟air est supérieure à10°C et

le taux d‟hygrométrie inférieur à 80%. En effet, plus la température est élevée, plus

l‟hygrométrie relative est faible et plus les quantités d‟eaux évaporées par l‟air avant la

saturation sont importantes. Les inconvénients de cette méthode sont : le dégagement des

mauvaises odeurs, l‟évaporation de composés organiques et la possible mise en suspension

d‟aérosols s‟il y a du vent.

9.1.3. Incinération

L‟incinération consiste à éliminer les effluents d‟huileries d‟olive par combustion. Pour

éliminer l‟excès d‟eau, on est obligé d‟utiliser un combustible supplémentaire soit les noyaux

d‟olives, soit d‟autres combustibles comme le gas-oil. Ce procédé est complexe et coûteux

tant à l‟investissement qu‟à l‟exploitation (Fiestas Ros de Ursenos, 1983 ; Ranalli,1991).

9.1.4. Distillation

Les effluents d‟huileries d‟olive peuvent être concentrés à l‟aide d‟un distillateur. Ce

processus permet de réduire le volume de ces effluents de 70% et le résidu peut être utilisé

comme combustible pour chauffer le distillateur ou comme fertilisant dans l‟agriculture.

L‟eau condensée peut être réutilisée après une épuration adéquate dans les processus des

huileries (Ranalli, 1991).

9.1.5. Floculation/clarification

Elle consiste à traiter les effluents d‟huileries d‟olive avec des produits tensioactifs afin

d‟éliminer les solides et les colloïdes en suspension.

Une expérimentation avec de la chaux a montré une réduction de la DCO de 40 à

50%(Mendia et al., 1964). Ce traitement peut être utilisé après un traitement biologique pour

éliminer les matières en suspension et les polluants résiduels.

L‟inconvénient majeur de ce procédé réside dans le fait qu‟on a seulement un transfert de la

pollution de l‟état solide à l‟état pâteux. De même, la plupart des composés organiques qui se

trouvent dans les effluents d‟huileries d‟olive sont difficiles à précipiter (sucres, acides

volatiles).


23

9.6. Cryo-concentration

Ce processus se base sur le fait que les effluents d‟huileries d‟olive, en se refroidissant

jusqu‟a la congélation, se séparent, d‟une part en un sirop constitué de substances organiques

et de l‟eau résiduelle, et d‟autre part en cristaux de glace qui à cause de leur faible densité

flottent sur le sirop (El Alami, 2000). Ce processus ne conduit pas à l‟élimination des

polluants, mais provoque leur concentration.

9.2 Procédés physico-chimiques

9.2.1. Ultrafiltration/Filtration

L‟ultrafiltration est un procédé de séparation physique utilisant une membrane. Elles

„applique à la séparation des particules de 0.005 à 0.1μm. Cependant, pour les particules les

plus petites, on utilise la nano filtration. On obtient une phase liquide contenant les polluants

dissous d‟une part et une phase pâteuse contenant les phases solides.

9.2.2. Ozonation

L‟ozonation consiste à l'utilisation de l'ozone, O3 comme produit d‟oxydation qui

permet la destruction d'un grand nombre de micropolluants et l'amélioration des odeurs. La

réduction de la pollution par ce procédé est très limitée et les réactifs sont très couteux.

9.2.3. Coagulation

Elle consiste à favoriser l‟agglomération des particules hydrophiles par des tensioactifs.

Les principaux agents de coagulation utilisés sont à base du sel d‟aluminium et du fer. Dans

certains cas, des produits synthétiques tels, le chlorure ferrique et la chaux sont utilisés. On

obtient une phase liquide où les polluants sont dilués et des boues dans lesquelles les polluants

sont concentrés.

9.3 Procédés biologiques

Ces procédés consistent à utiliser les microorganismes pour dégrader les composés

organiques des effluents d‟huileries d‟olive. Ils sont subdivisés en processus aérobie et

anaérobie.

9.3.1. Traitements anaérobies

Les traitements anaérobies sont adaptés à plusieurs types de résidus : biomasse humide,

sous-produits agricoles, déchets des eaux résiduaires. Ils sont le plus utilisés pour le traitement

et l‟exploitation des effluents d‟huileries d‟olive à cause de leur charge élevée en matière

organique (Fiestas Ros de Ursenos et al., 1981 ; Hamdi et al., 1991 ; Borja et al., 1994).

Des études ont montré que pour une efficacité d‟épuration de 80%, il faut un temps de

rétention de seulement 20 jours, avec en plus l‟avantage de produire une quantité non


24

négligeable du biogaz : 855 litres/ kg de matière organique digérée (El Alami, 2000).La

digestion anaérobie permet une réduction de DCO de l‟ordre de 70 à 85%. Son rendement est

proportionnel à la concentration en microorganismes et varie largement selon la nature du

support (montmorillonite ou sepiolite) (Martin et al., 1991). Cependant, cette digestion peut

être inhibée par les acides gras à chaines longues, notamment l‟acide oléique (Koster et al.,

1980). De même à partir d‟une concentration de 100 mg/L d‟acides phénoliques dans les

effluents d‟huileries d‟olive, les bactéries méthanogènes sont inhibées (Hamdi et al., 1991).

Ces traitements anaérobies permettent de réduire la consommation en énergie et la production

des boues (Borja et al., 1995). Ils présentent aussi l‟avantage de produire du méthane et de

limiter les dégagements de mauvaises odeurs. Par contre, ils sont aussi très limités et ce à

cause de la toxicité élevée des composés phénoliques et des tanins, de la faible

biodégradabilité des polymères de couleur foncée et de l‟acidification des réacteurs (Mouncif

et al., 1995).

9.3.2. Traitements aérobies

Les effluents d‟huileries d‟olive étant très chargés en matière organique, ils ne peuvent

pas être traités directement par voie aérobie. De ce fait plusieurs auteurs ont recommandé de

les diluer avant leur traitement, soit avec l‟eau (El Hajjouji et al., 2007), soit avec des eaux

usées domestiques (Annaki et al., 1999).Baliceet al. (1988) ont recommandé de diluer les

effluents d‟huileries d‟olive 70 fois avec de l‟eau claire non polluée lors de leur épuration

avec les boues activées.

Plusieurs travaux ont été réalisés sur le traitement et le prétraitement des effluents d‟huileries

d‟olive par voie aérobie en utilisant des souches de microorganismes telles que les

basidiomycètes (Dias Albino et al., 2004),Pleurotus ostreatus(Fountoulakis et al., 2003) et

Aspergillus niger(Cereti et al., 2004) en raison de leur grand pouvoir de dégrader les

composés phénoliques (Hamdi et al., 1993). Les tests de toxicité ont montré une diminution

de la toxicité des effluents d‟huileries d‟olive après traitement par ces microorganismes. En

effet, les microorganismes aérobies dégradent les composés organiques par oxydation avec

l‟oxygène de l‟air ou l‟oxygène pur et utilisent la plupart de ces composées organiques

présents dans le milieu pour leur nutrition et leur reproduction.

D‟autres auteurs ont utilisé des suspensions mixtes de microorganismes et ont abouti à des

abattements très importants en termes de DCO et de polyphénols (Zenjari et al., 1999 ; Hafidi

et al., 2005). Ces abattements sont très variables et varient en fonction de la performance des


25

souches sélectionnées. Certaines souches de bactéries et de champignons ont été également

testées pour décolorer les effluents d‟huileries d‟olive et réduire leur toxicité, parmi ces

microorganismes on peut citer : Baccilus pumilus(Ramos, 1986) ; Coriolus versicolor et

Funaliatroggi(Yesilada et al., 1998) ; Phanerochae techrysosporium(Sayadi et al., 1996) et

Pleurotus ostreatus(Martirani et al., 1996).

Les procédés aérobies tels que les boues activées sont aussi utilisés pour éliminer les

polluants dissous et colloïdaux à faibles concentrations dans les eaux usées. Toutefois, les

concentrations élevées en matière organique peuvent être tolérées lorsque le temps de

rétention est long et/ou avec un pourcentage de recyclage élevé. Les effluents d‟huileries

d‟olive étant très chargés en matière organique ne peuvent pas être traités directement par ces

procédés.

L‟inconvénient majeur du traitement aérobie est la consommation importante

d‟oxygène. Dans le but de réduire cette consommation ainsi que la toxicité des effluents

d‟huileries d‟olive vis-à-vis des microorganismes épurateurs, des prétraitements physiques de

ces déchets (filtration, distillation, évaporation) ont été recommandés par plusieurs auteurs.

L‟utilisation de ces deux procédés à la fois (physique et biologique) a permis d‟avoir de

meilleurs résultats par rapport à l‟utilisation d‟un procédé biologique direct (Zenjari, 2000).

10. Valorisation des margines

Parallèlement aux recherches réalisées sur le traitement des margines, des études de

valorisation ont été effectuées. Les margines sont riches en éléments nutritifs minéraux et

organiques. Ce critère a amené les chercheurs à mettre au point de nombreux procédés de

valorisation et d‟exploitation des margines aussi bien à l‟échelle de laboratoire qu‟à l‟échelle

pilote (Fiestas Ros de Ursinos, 1981). Cette valorisation a pour objectif l‟élimination des

composés phénoliques d‟une part et l‟utilisation des margines dans les domaines de la

biotechnologie, de la chimie et de l‟agriculture d‟autre part (Levis-Menzi et al., 1992).

10.1. Utilisation des margines comme fertilisant

De nombreux travaux ont été publiés concernant les effets de l‟épandage des margines

fraîches directement ou après traitement, sur des sols complantés de céréales ou d‟autres

cultures annuelles (Di Giovacchino et al., 2002), de vigne (Di Giovacchino et al., 2001) et

d‟olivier.


26

D‟autres travaux ont porté sur l‟influence de l‟épandage de ces eaux sur la microflore, la

faune du sol, et la toxicité à l‟égard des plantes ou des micro-organismes (Di Giovacchino et

al.,2002).

Les caractéristiques des margines et leurs traitements Des expérimentations

agronomiques menées avec des doses d‟apport conforme aux règles de fertilisation, ont toutes

montrée l‟effet favorable des margines sur la fertilité des sols (DeMonpezat et al., 1999), car

d‟une part, elles ne contiennent pas des métaux lourds et des microorganismes pathogènes

(Sierra et al., 2007), et d‟autre part, elles sont riches en éléments minéraux nutritifs (K, N, P,

Mg). En plus, comme elles sont constituées de matière organique, elles représentent un

excellent substrat pour le développent de la microflore qui permet d‟améliorer les propriétés

physico-chimiques du sol (Amiranteetal., 2002), et dégrader les composés phénoliques après

une période de latence liée au pouvoir antimicrobien (DeMonpezat et al., 1999).

Di Giovacchino et al., (2002) ont fait une étude dont le but est de contribuer à la

connaissance des effets de l‟épandage des margines pendant une longue période sur des sols

complantés de maïs (plus de 10 ans) et de vigne (plus de 5 ans). Les résultats obtenus ont

montré que, pour les deux sols complantés de maïs et de vigne, la productivité des sols a

augmentée. L‟emploi des margines à des doses élevées avait permis d‟obtenir une biomasse

totale supérieure de 30 à 40 % que celle obtenue sur des parcelles témoins.

Différents groupes microbiens ont été dénombré durant un suivi de six mois d‟épandage de

margine sur une semée des grains de maïs. La margine a servi comme un substrat pour la flore

mésophile totale. Ce qui a induit à une multiplication importante des champignons et des

levures (El Hassani et al., 2005).

L‟utilisation des margines comme fertilisant n‟est pas sans inconvénients pour le sol et sa

composition, tel que: l‟acidité et la salinité élevées, accumulation des lipides, des acides

organiques et les composés et phénoliques (Nefzaoui, 1991). Les composés phénoliques se

comportent comme des herbicides et phyto-toxiques, qui altèrent le cycle d‟azote en

changeant l‟activité microbienne du sol et contaminant les eaux de surface (Sierra et al.,

2007).

Sierra et al., (2007) ont proposé de ne pas dépasser des vitesses d‟application de 180 m3/ha.an

pour éviter le problème de salinité et l‟accumulation des polyphénols. Chapitre I Les

caractéristiques des margines et leurs traitements


27

10.2. Utilisation des margines en compostage

Le compostage est l‟une des techniques de recyclage des margines et leur

transformation en fertilisant. Les margines sont absorbées sur un substrat solide (déchet

lignocellulosique) avant d‟être utiliser comme un compost (Roig et al., 2006). Donc, ce

compost s‟obtient principalement par dégradation aérobie-anaérobie de substance organique

des résidus solides (margines + résidus agricoles). Afin que ce processus se réalise, il faut

prolonger le temps de contact de ces résidus agricoles dans les margines dont le taux en

substances organiques et minérales appropriées pour mener à bien le processus d‟obtention du

compost (Nefzaoui, 1991).

Dans un travail de recherche fait par Zenjari et al., (2006), le compostage des margines avec

des pailles d‟orge en conditions aérobies a permis de réduire la teneur en matière organique de

52 % après 3 mois d‟incubation dans des sacs en plastique, et la toxicité devient non

détectable.

A la fin de la période de maturation, la dégradation des phénols est de l‟ordre de 95%.

Roig et al., (2006) ont trouvé que la fertilisation avec des taux élevés d‟humidification et sans

effets phytotoxiques, a été obtenu par le compostage des margines avec des pailles de blé.

Paredes et al., (2005) ont trouvé que l‟effet positif sur la fertilité du sol augmente avec

l‟augmentation de la vitesse d‟application du compost-margine. D‟autre part, ils ont constaté

que la salinité du sol augmente avec l‟augmentation des doses (au delà de 60 t/ha).

10.3. Récupération de quelques composants

Les études dans ce domaine sont très récentes et les résultats sont encore à un état

embryonnaire. Il s‟agit en particulier de la récupération des composés aromatiques et

phénoliques et des solutions de glucides (Nefzaoui, 1991). Les phénols et les substances

antioxydants sont des composés évaluables, et peuvent être utilisés en industries

pharmaceutique et cosmétique (Roig et al., 2006). Briante et al., (2004) ont proposé

l‟utilisation d‟un bioréacteur pour la production des antioxydants d‟une pureté élevée qui sont

ensuite convertis en composés pharmacologiques actifs. Turano et al., (2002) ont proposé

aussi un système intégré de centrifugation-ultrafiltration qui permet la réduction de la

pollution et la séparation sélective de quelques produits utilisables (lipides, sucres,

polyphénols). De Marco et al., (2007) ont fait une étude pour la récupération des biophénols

existants dans les margines.

L‟extraction liquide-liquide (ELL) a été utilisée pour obtenir un extrait de biophénols. Ces

extraits ont été fractionnés par la suite par une extraction liquide-solide. Cette deuxième


28

extraction a été faite en utilisant une colonne C18 en phase renversée, dans le but d‟obtenir

des composés purifiés dont l‟ordre est de déterminer la contribution relative de différents

composés en énergie anti-oxydante. D‟après la procédure utilisée : 1 litre de margine permet

d‟obtenir un extrait contenant 1,2 g d‟hydroxytyrosol et environ 0,4 g de flavonoïdes, qui

peuvent être fractionné en produisant 1 g d‟hydroxytyrosol purifié. Les composés aromatiques

peuvent être aussi obtenus par distillation sous vide et les arômes sont récupérés par

extraction aux solvants (Nefzaoui, 1991). Les extraits phénoliques obtenus ont été comparés

aux antioxydants de synthèse, les plus connus tel que le BHA à partir des essais de résistance

à l‟oxydation. Il a été constaté que l‟extrait de margine protège l‟oxydation d‟huile plus

efficacement que l‟addition du BHA. D‟autre part, le coût de production de ces extraits est

inférieur à celui des antioxydants de synthèse.

10.4. Production de biogaz

L‟application du processus de la digestion anaérobie aux margines permet de

transformer environ 80% des substances organiques en biogaz (65 à 70% de méthane). Ainsi,

la fermentation méthanique permet la dépollution des margines tout en produisant de l‟énergie

(Nefzaoui, 1987 ; Loulan et al., 1987).

10.5. Production des protéines d’organismes unicellulaires (POU)

L‟obtention des protéines unicellulaire constitue une des solutions optimale pour la

valorisation des effluents d‟huileries d‟olive. La plupart des procédés appliqués sont basés sur

l‟utilisation des levures capables de transformer les substances organiques en biomasse à haut

contenu en protéines et vitamines de grande valeur pour l‟alimentation animale et même

humaine (El Alami, 2000).

L‟usage des microorganismes pour la production des POU peut être considéré comme un

prétraitement pour les eaux résiduelles à charge organique élevée, permettant d‟obtenir d‟une

part, une diminution de 50 à 70% de la charge polluante et d‟autre part, une biomasse

protéique qu‟on peut utiliser pour l‟alimentation animale (Zenjari, 2000).

Les microorganismes les plus utilisés et les plus adaptés pour la production de Protéines sont

représentés dans le tableau 8 :


29

Tableau 8. Levures pour la production de protéines d‟organismes unicellulaire à partir des

effluents d‟huileries d‟olive (Hamdi, 1993).

Souche Biomasse (g/L)

Torulopsisutilis

Saccharomycopsislipolitica

Saccharomyces Candida

Saccharomyces cerevisiae

13

18-26

20-26

30

Selon Hamdi (1993), l‟emploi de ce genre de POU pour l‟alimentation animale est limité par

les composés phénoliques qui se fixent sur les levures. Ces dernières s‟avèrent incapable de

dégrader les pectines, les tanins et les polyphénols.

Synthèse Bibliographique De même, l‟utilisation des moisissures comme Aspergillus sp et

Geotrichium codidum donne une biomasse très digestible avec une teneur en protéines brutes

allant jusqu‟à 30%, bien que ces microorganismes présentent l‟inconvénient de se développer

plus lentement que les levures (Hamdi, 1993).

10.6. Production d’enzymes

Les margines peuvent servir aussi comme milieu favorable pour la production

d‟enzymes par des micro-organismes. La culture de Cryptococcus albidus sur les margines

pendant 48 heures élimine un taux important de la matière organique tout en produisant de la

biomasse et des enzymes (13 UV.ml-1). Cette production peut atteindre 29,5 UV.ml-1 si on

élimine les polyphénols par floculation-clarification (Francesco, 1993). L‟addition de 2 litres

d‟une solution de ces enzymes concentrées par ultrafiltration (90 UV/ml) pendant un cycle de

broyage augmente le rendement de l‟huile de 84,3 à 90,7% (Petruccioli et al., 1988).

La production de l‟enzyme laccase par la culture de deux champignons Coriolu sversicolor et

Funaliatrogii sur les margines a été étudiée (Kahraman et al., 2001).

Cette étude a montré que l‟addition des tiges du coton augmente significativement l‟activité

laccase (phénol oxydase).

10. 7. Epandage

La valorisation des margines par épandage a été largement étudiée par plusieurs auteurs

(Tomati et Galli, 1992). Les margines peuvent être utilisées dans l‟irrigation en raison de leur

richesse en eau et en minéraux nutritifs (Fiestas Ros de Ursinos, 1986). Un mètre cube de

margines apporte 3,5 à11 kg de K2O; 0,6 à 2 kg de P2O5 et 0,15 à 0,5 kg de MgO par hectare

de terrain irrigué.


30

Cependant, cette technique présente certains inconvénients :

- Problèmes du stockage vu que la période oléicole coïncide avec la période pluviale (Ranalli,

1991a).

- Colmatage du sol (Ranalli, 1991a)

- L‟acidité et la salinité élevées peuvent provoquer des brûlures sur les plantes (Sierra et al.,

1994).

- Contamination des eaux souterraines (Ranalli,1991a).

- Inhibition de la germination due à l‟effet phytotoxique exercé par les composés

phénoliques sur les plantes (Ranalli, 1991a ;Ehaliotis et al., 1999 ; Casa et al., 2003).

- Modification de la composition de la flore du sol (Parades et al., 1986 ; Pérez etal., 1987,

1992).

- Modification des caractéristiques physico-chimiques du sol (Sierra et al., 2001 ; Zenjari et

Nejmeddine, 2001).

- Coût élevé de transfert des margines des huileries vers les terres agricoles.

Quoique le potassium et le phosphore contenus dans les margines puissent remplacer ceux des

engrais chimiques, l‟acidité, la forte salinité et la haute conductivité, ainsi que le contenu en

composés phénoliques sont à l‟origine d‟une limitation de toute utilisation efficace des

margines comme fertilisant.

Pour résoudre partiellement ce problème, Buldini et al. (2000) ont développé une méthode

automatique pour la détermination et la récupération des anions inorganiques totaux présents

dans les margines après 10 minutes. Cette technique repose sur l‟utilisation de la dialyse

couplée à la chromatographie d‟échange ionique sans l‟addition de réactifs qui risquent

d‟infecter les quantités d‟anions solubles.

10. 8. Utilisation en alimentation animale

Les margines ont été utilisées directement comme aliment pour le bétail (Ercoli et al.,

1983). Cependant, cette pratique reste à risque, en raison des taux élevés en sodium et en

composés phénoliques pouvant engendrer un effet antitrypsique. De même, elles ont été

fournies aux volailles à la place de l‟eau potable (Fedeli, 1977). Cette expérience a montré

qu‟il y avait un léger abaissement du taux de mortalité de ces animaux. L‟apport des margines

déshydratées a provoqué des diarrhées chez les ruminants (Salvemini et al., 1984 ; Salvemini,

1985). Le procédé Dalmolive décrit par Martillotti (1993) semble remédier au problème. Il

consiste à mélanger 50 kg de margines avec 20 kg de grignons et 12,6 kg de divers résidus et


31

sous produits agricoles pour réduire l‟effet inhibiteur des composés phénoliques. Ceci produit

29 kg d‟aliments en pellettes dont la composition est indiquée dans le tableau8.

Tableau 9 : Composition chimique de la pâte des margines obtenue par le procédé

Dalmolive(Martilotti, 1993).

Composant Valeur (% de la matière sèche totale)

Matière azotée totale

Matière grasse

Cellulose brute

Matière minérale

Extrait non azoté

Matière azotée digestible

21,6

4,0

13,1

8,9

52,5

17,2

Malgré les multiples procédés testés pour le traitement et la valorisation des margines,

seulement quelques-uns sont appliqués à l‟échelle industrielle en raison du coût élevé des

installations. En plus, les résultats obtenus montrent pour la plupart des procédés, que le coût

et l‟énergie consommée étaient trop élevés par rapport au rendement d‟épuration obtenu. Ceci

est lié essentiellement à la grande quantité des margines produites annuellement et à leur forte

et complexe charge polluante.

Partie I MARGINES D’OLIVES


Partie II :

les bactéries

lactiques


32

Les bactéries lactiques

1. Introduction

Les bactéries lactiques sont des coques ou des bâtonnets, Gram positif, immobiles, non

sporulées, catalase négative et généralement nitrate réductase négative. Elles synthétisent leur

ATP grâce à la fermentation lactique des glucides. Lorsque l‟acide lactique est le seul produit

terminal, il s‟agit des bactéries lactiques homofermentaires (Certaines espèces peuvent

produire au moins 18 moles d‟acide lactique par mole de glucose fermenté). Parfois, en plus

de l‟acide lactique, d‟autres composés constitués principalement d‟acide acétique, d‟éthanol et

de gaz carbonique sont produits : c‟est le cas des hétérofermentaires (produisent uniquement 1

mole d‟acide lactique par mole de glucose fermenté).

Les bactéries lactiques sont aéro-anaérobies facultatives ou micro-aerophiles. En présence

d‟oxygène, elles sont incapables de phosphorylation oxydatives car elles ne peuvent

synthétiser les cytochromes et les enzymes à noyau hème. Elles ont des besoins complexes en

facteurs de croissance, acides aminés, peptides, bases puriques et pyrimidiques, des vitamines

B et des acides gras. C‟est la raison qui explique leur abondance dans le lait (Larpent, 1989 ;

Novel, 1993).

Figure 6. Schéma montrant l‟arbre phylogénique basée sur la comparaison du gène de l‟ARN

16 S, en groupant les bactéries lactiques à faible pourcentage CG et la relation lointaine avec


33

les germes à gram positif de haut pourcentage CG du genre Bifidobacterium et

propionibacterium (Holzapfel et al., 2001)

Les bactéries lactiques appartiennent aux genres suivants:Carnobacterium,Enterococcus,

Lactobacillus, Lactococcus, Lactosphaera, Leuconostoc,Melissococcus, Oenococcus,

Pediococcus, Streptococcus, Tetragenococcus,Vagococcuset Weissella(Vandamme et al.,

1996; Stiles et Holzapfel, 1997,Axelson, 2004)(Figure 6). D‟autres bactéries gram positive

non sporulées etproductrices d‟acide lactique appartenant à la famille des actinobacteriacée et

au genre, Aerococcus, Microbacterium, et Propionibacterium(Sneath et Holt,2001) ainsi que

le genre Bifidobacterium(Gibson et Fuller, 2000;Holzapfel et al., 2001) sont aussi impliquées

dans l‟industrie agro-alimentaire.

Les travaux récents sur la taxonomie effectué sur la caractérisation des bactéries lactiques

basée l‟étude de la comparaison de l‟ARN ribosomal 16S ont révélé une différence dans les

relations entre les la caractérisation phénotypiqueet la caractérisation phylogénique. Les

techniques de biologie moléculaire spécialement la PCR (réaction de la chaine polymerase),

RFLP (Restriction Fragment Long Polymorphisme), DGGE (Electrophorèse en Gradient Gel

Dénaturé) et TGGE (Gel Electrophorèse en Gradient de Température) sont utilisées pour

confirmer l‟identification précise des espèces bactériennes.

2. Habitat

Les bactéries lactiques ont pour habitat de nombreux milieux naturels, des végétaux

(plantes et fruits), des animaux et des humains (cavités buccales et vaginales, fèces et dans le

lait). Mais certaines espèces semblent s‟adapter à un environnement spécifique et ne sont

guère trouvées ailleurs que dans leurs habitats naturels (de Roissart, 1986).

Les espèces du genre Lactococcus sont isolées du lait ou des végétaux qui sont les réservoirs

naturels de la plupart de ses espèces. L‟espèce Lactococcus lactissubsp. lactis est isolée pour

la première fois à partir du lait fermenté par Lister en 1873 et reconnue comme agent primaire

de l‟acidification du lait caillé (Sandine, 1988).

Parmi les espèces du genre Streptococcus, Streptococcus thermophilus est isolée du lait

pasteurisé, du matériel de laiterie et de levains artisanaux (Jones, 1978).

Les espèces du genre Leuconostoc sont isolées du lait, des produits laitiers, des fruits, des

légumes (en particulier la betterave), des végétaux en fermentation (comme la choucroute),

des produits de la panification (Suhigara, 1985) et des solutions visqueuses de sucre dans les

sucreries (Devoyod et al.,1988).


34

Boubekri et Yoshiyuki (1996) ont isolé deux souches de Leuconostoc sp. à partir de fromage

traditionnel El-Klila fabriqué à Batna (Algérie). Tandis que, Ryhanen et al., (1996) ont

identifié trois espèces (Leuconostoccurvatus, Ln. Citreumet Ln. Mesenteroides subsp.

Mesenteroides) isolées à partir de blé fermenté. Seule l‟espèce Leuconostocoenos est

isolée du vin (Fleminget al.,1985 ; Sugihara, 1985 ; Devoyod et Poullain, 1988 ; Hounhoigan

et al., 1993).

Les espèces du genre Pediococcus sont présentes surtout dans les végétaux en décomposition,

parfois dans les boissons alcoolisées, le lait, les différents fromages (Parmesan et autres

fromages italiens) et les préparations culinaires (Saucisses, anchois salés ou sauce de soja)

(Chapman et al., 1981; Dellaglio et al., 1981A ; Uchida, 1982; Bacus et al., 1985B ; Villar et

al., 1985).

Les espèces du genre Lactobacillus sont présentes dans plusieurs milieux différents : dans le

lait et les fromages (Lb. Casei subsp. casei, Lb. plantarum, Lb. curvatus et Lb. brevis), dans

les laits fermentés (Lb. kefir, Lb. brevis et Lb. fermentum), dans les produits végétaux

fermentés, les marinades, l‟ensilage, le vin et les viandes fraîches ou fermentées (Lb. brevis,

Lb. curvatus, Lb. buchneri et Lb. sanfranscisco) (Demazeaud, 1996).

3. Classification

La taxonomie a longtemps reposé sur les critères morphologiques et biochimiques

permettant de différencier les espèces et de caractériser des variantes au sein d‟une même

espèce.

Ces testes sont :

-Le type de gram, la morphologique et la disposition cellulaire.

- Les différents métabolismes glucidiques, protéiques, lipidiques, le caractère fermentaire.

- La croissance des cellules sur des milieux hostiles

- Et la synthèse d‟enzymes (de protéases), de métabolites (exopolysaccharides), de

bactériocines,et la résistance aux bactériophages.

Puis, des études basées sur les critères moléculaires ont permis de classer les espèces selon les

critères suivants :

- La détermination de la composition des peptidoglycanes (PTG) permet d‟observer le type

d‟espèce selon la nature de la liaison peptidique.

- Et la composition de l‟ADN mesurée par hybridation permet de différencier les genres et les

espèces entre eux. Le pourcentage en bases Guanine+Cytosine (G-C %) permet le

rapprochement des genres Streptococcus (34-46%), Leuconostoc(36-43 %) et


35

Pediococcus(34-42 %) (Schleifer et al., 1985;Schleifer, 1986 ; Farrowet al., 1989). Le

pourcentage de G-C des espèces du genre Lactobacillus est très hétérogène et varie d‟une

espèce à une autre de 32 à 53 % (Tableau. 10) (Scardovi, 1986).

Cependant, les espèces des genres Lactobacillus, Pediococcus. Leuconostocou streptococcus,

dont le G-C % de l‟ADN est inférieur à 50 %, peuvent être regroupées dans la branche des

Clostridium avec Bacillus, et séparées de la branche des Actinomycétales au G-C % supérieur

à 50 %, comprenant Propionobacterium et Bifidobacterium(Stackebrandt et al.,1983 ;Kandler

et al., 1986b ; Stackebrandt et al., 1988).

Tableau10. Les différents genres de bactéries lactiques

Genres Cellules Fermentation ADN

G-C (%)

Références

Forme Arrangements

Streptococcus Coques Chaînes Homolactiques 34 - 46 SCHLEIFER, 1986

Leuconostoc Coques Chaînes Hétérolactiques 36 - 43 FARROW et al.,1989

Pediococcus Coques Tétrade Homolactiques 34 - 42 SCHLEIFER, 1986

Lactobacillus Bacilles Chaînes Homolactiques

et

Hétérolactiques

32 – 53

KANDLER et WEISS, 1986a et b

3.1. Les coques lactiques

Elles appartiennent à la famille des Streptococcaceae. Les cellules sont groupées en

paires ou en chaînes et de longueurs variables. La différenciation des genres est basée sur

l‟arrangement des cellules et sur le type de fermentation lactique (homo ou hétérolactique).

Les coques lactiques ont des exigences nutritives parfois complexes. Certains ont des activités

protéasiques et peptidasiques. Actuellement, ils regroupent les genres : Enterococcus,

Lactococcus, Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus, Aerococcus, Oenococcus,

Tetragenococcus, Vagococcus, Weissella(Stiles et al., 1997).

3.1.1. Les genres Enterococcus, Lactococcus et Streptococcus : Ils étaient anciennement

groupés en un seul genre Streptococcus. Ils sont très fréquents dans l‟industrie alimentaire

comme contaminant et surtout comme agents de fermentation homolactique (avec production

d‟acide lactique de type dextrogyre). Ils sont très exigeants sur le plan nutritionnel et se

développent bien à 37 °C. Parmi le genre Streptococcus, le groupe viridans comprend les

agents d‟acidification fréquents dans certains fromages et yaourts comme le cas de l‟espèce

Sc. thermophilus.(Skinnel et al., 1978).


36

Les Enterococcus représentent le groupe des entérocoques, ils sont composés de

streptocoques fécaux (Enterococcus faecalis et Enterococcus faecium) et considéré comme

contaminants.

Les Lactococcus regroupent l‟espèce Sc. Lactis, ses trois sous espèces Sc. Lactis., Sc.

diacetilactiset Sc. cremoris, Sc. Raffinolactis et de nouvelles espèces mal classées : Sc.

plantarumet Sc. garviae(Garvieetal., 1982 ; Collinset al.,1983). Et Selon Guiraud (1998), le

genre Lactococcusest représenté par les espèces suivantes : Lc. Lactissubsp. cremoris, Lc.

Lactissubsp. Lactiset Lc. diacetilactis. La sous espèce Streptococcus Lactis subsp.

diacetylactisest remplacée par la sous espèce Lactococcus Lactis subsp. Lactis.

3.1.2. Le genre Leuconostoc

Il représente les coques hétérofermentaires. La classification des espèces basée sur le

GC% a permis de distinguer trois espèces : Ln. mesenteroides(et ses trois sous espèces :

subsp.Mesenteroides., subsp. Dextranicum et subsp. Cremoris), Ln. lactis, Ln.

Paramesenteroides et Ln.enos(Yang et al., 1989; Leveau et al.,1993).

3.1.3. Le genre Pediococcus

Il rassemble des coques homofermentaires dont la particularité qui les différencie des

autres genres est le regroupement en paires ou en tétrades. Le genre Pediococcus est

mésophile. Leur exigence nutritionnelle, leur faible activité protéolytique et le plus souvent

leur incapacité à utiliser le lactose, ne leur permettent pas d‟acidifier et de coaguler le lait.

Leur fermentation homolactique donne parfois de l‟acide lactique racémique (acide D. L.-

lactique).

Mais, fréquemment la forme lévogyre L prédomine : les espèces osmophiles non acidophiles

ne donnent que cette forme. Ce genre est parfois utilisé comme levain lactique pour les

charcuteries (Guirau, 1998).

3.1.4. Le genre Lactobacillus

Ce genre regroupe plus de 70 espèces (dont plusieurs sont divisées en sous-espèces). Le

genre Lactobacillus est quantitativement le plus important des genres du groupe des bactéries

lactiques. Les souches de Lactobacilles sont constituées de bacilles long et fin (parfois

incurvés) ou de coccobacilles dont la forme est proche à celle des corynébactéries.

Les cellules sont généralement immobiles (pour les souches mobiles, la ciliature est

péritriche).

La production d‟acide lactique issue du métabolisme fermentaire représente au moins 50 %

des produits de fermentation (Axelsson, 1993).


37

Orla- Jensen (1919) a proposé de diviser le genre Lactobacillus en trois sous genres :

Thermobacterium, Bêtabacterium, Streptobacterium(Tab. 11).

3.1.4.1. Les Lactobacilles homofermentaires stricts regroupent les espèces de l‟ancien

sous-genre Thermobacterium, qui dégrade les hexoses en acide lactique.

3.1.4.2. Les Lactobacilles hétérofermentaires stricts regroupent les espèces de l‟ancien

sous-genre Bêtabacterium, fermentent les hexoses en acide lactique, en acide acétique ou en

éthanol et CO2 (voie hétérofermentaire de la 6-phosphogluconate

déshydrogénase/phosphocétolase). Ils dégradent les pentoses en acide acétique et en acide

lactique (voie hétéfermentative de la glycéraldéhyde-3- phosphate/pyruvate kinase/lactate

déshydrogénase). Ces bactéries produisent du CO2 lors de la fermentation du glucose et du

gluconate.

3.1.4.3. Les Lactobacilles hétérofermentaires facultatifs regroupent les espèces de l‟ancien

sous-genre Streptobacterium, métabolisent les hexoses en acide lactique par la voie

homofermentaire d‟Embden-Meyerhof-Parnas et dégradent les pentoses par voie

hétérofermentaire. Ils ne produisent pas de CO2 lors de la fermentation du glucose mais ils en

produisent lors de la Fermentation du gluconate (Kandler et al., 1986b ; Stiles et al., 1997).

L‟établissement d‟un arbre phylogénique construit à partir des séquences d‟ARN 16S a

démontré que les genres Lactobacillus, Leuconostoc et Pediococcu ssont très liés (malgré

leurs caractères morphologiques et physiologiques très différentes) (Schleifer et al., 1995).

Tableau11. Classification des lactobacilles selon ORLA- JENSEN (1919)

Groupe 1 : Thermobacterium

(Homofermentaires stricts)

Groupe 2 : Streptobacterium

(Homofermentaires facultatifs)

Groupe 3 : Bêtabacterium

(Hétérofermentaires stricts)

Groupe delbruekii

G-C: 49-51 %

Lb. Delbrekii

Lb. ssp. Delbrekii

Lb. ssp. Lactis

Lb. ssp. Bulgaricus

Lb. ssp. Leichmani

G-C: 33-41 %

Lb. acidophilus

Lb. helveticus

Lb. amylovorus

Lb. crispatus

Lb. gallinarum

Lb. jensenii

Lb. kefiranofaciens

Lb.Kefirgranum

Groupe plantarum

Lb. Plantarum

Lb. Pentoseus

Lb. Sake

Groupe casei

Lb. caseissp. casei Lb. caseissp. alactosus

Lb. caseissp. Pseudoplantarum

Lb. caseissp. rhamnosus

Lb. Johnsoni

Groupefermentum

Lb. san francisco

Lb. Brevis Lb. reuteri

Lb. Kefir

Lb. Fructivorans


38

4. Utilisation industrielle des bactéries lactiques

Les bactéries lactiques présentent des activités métaboliques assez diversifiées et une

capacité

D‟adaptation à différents environnements (Axelsson, 1998). Cette diversité est responsable de

leur large gamme d‟applications à l‟échelle industrielle.

Dans l‟industrie alimentaire, ces microorganismes permettent la conversion d.une grande

variété de matières premières (d‟origine animale et végétale), conduisant ainsi à de nombreux

produits.

Parmi ces applications, l‟industrie laitière est, sans doute, le plus grand consommateur de

ferments lactiques commerciaux, pour la production de laits fermentés, fromages, crèmes et

beurres. La fermentation du lait par des bactéries lactiques est à l‟origine de nombreux

produits différents, chacun avec ses caractéristiques spécifiques d‟arôme, de texture et de

qualité (Daly et al., 1998 ; Hugenholtz et al., 2002).

L‟utilisation des bactéries lactiques pour une application industrielle donnée est déterminée

par leurs propriétés fonctionnelles et technologiques. Celles-ci recouvrent les propriétés

suivantes :

4.1. Activité acidifiante: la transformation du sucre assimilable en acide lactique conduit à

l‟acidification du produit. Cette acidification accroît sa durée de vie, en limitant sa

contamination par les microorganismes d.altération ou pathogènes, et lui confère des

caractéristiques organoleptiques particulières (Frank et al., 1998; Mäyrä-Mäkinen et al.,

1998)

4.2. Production de métabolites d.intérêt: selon les espèces et selon les souches, les

bactéries lactiques sont capables de produire des métabolites tels que l‟acide acétique,

l‟éthanol, des arômes (diacétyle, acétaldéhyde,), des bactériocines (activité antimicrobienne),

des exopolysaccharides, des enzymes (protéases, peptidases, lipases,)et du CO2 (formation

d‟ouvertures dans les fromages) (Frank et al., 1998; Mäyrä-Mäkinen et al., 1998; Béal et al.,

2008).

4.3. Propriétés enzymatiques : les activités protéolytiques et peptidasiques sont

importantes car elles déterminent la capacité des bactéries lactiques à utiliser la fraction

azotée du milieu. L‟activité lypolytique présente, de plus, un intérêt pour les applications

fromagères (Béal et al., 2008).


39

4.4. Propriétés probiotiques: en plus des activités précédentes, les souches probiotiques

doivent être résistantes aux acides gastriques et aux sels biliaires rencontrés lors de leur

passage dans l‟estomac, le duodénum et l‟intestin (Da Cruz et al., 2007).

De plus, elles présentent des propriétés thérapeutiques spécifiques à chaque souche,

principalement en termes d‟activités immunostimulantes et anti-diarrhéiques.

4.5. Critères de performance: indépendamment de la propriété fonctionnelle envisagée,

les bactéries lactiques doivent être résistantes aux bactériophages, aux traitements

mécaniques, à la congélation ou à la lyophilisation et au stockage.

Elles doivent également être tolérantes aux inhibiteurs de la croissance (antibiotiques, acidité,

éthanol, chlorure de sodium) (Béal et al., 2008).

5. les probiotiques

5.1. Définition des probiotiques

Le terme “probiotique” est un mot relativement nouveau qui signifie “en faveur de la

vie” et qui est actuellement utilisé pour désigner des bactéries associées à des effets

bénéfiques chez l‟homme et les animaux. (FAO/OMS. 2001)

Les probiotiques sont des micro-organismes vivants qui, lorsqu‟ils sont ingérés en quantité

adéquate, ont des effets bénéfiques sur l‟organisme hôte en améliorant les propriétés de sa

flore intestinale. Il s'agit le plus souvent de bactéries ou de levures présentes soit dans des

aliments, notamment les produits laitiers fermentés, soit dans des compléments alimentaires

sous forme lyophilisée.

Les micro-organismes tués par la chaleur ne répondent pas à la définition des probiotiques,

même si certains effets thérapeutiques leur ont été attribués. (Jean marc robin, et al., 2001)

5.2. Quatre grands groupes de probiotiques

A) Les ferments lactiques

Ils sont capables de produire de l‟acide lactique parla fermentation de certains sucres

comme le lactose.

Ils sont regroupés en 2 catégories, en fonction de leur morphologie : les lactobacilles

(Lactobacillus bulgaris, Lactobacillus acidophilus et Lactobacillus caséi) et les coques

(Enterococcus et Streptococcus)


40

B) Les bifidobactéries

D‟origine humaine ou animale, elles appartiennent à la flore intestinale normale et

possèdent une bonne résistance aux sucs gastriques. La population de Bifidobactérium

diminue avec l‟âge et leurs espèces varient selon l‟âge.

C) Les différentes levures de type Saccharomyces

Elles sont principalement utilisées par l‟industrie agroalimentaire.

D) Les autres bactéries sporulées, dont Bacillus subtilis et cereus.

Les genres bactériens les plus utilisés sont Bifidobacterium,Lactobacillus acidophilus,

L. casei, L. rhamnosus, L.plantarum, Enterococcusfaecium et Saccharomyces. Le nombre de

micro-organismes vivants présents dans chaque produit est très élevé.(Jean marc robin, et

al.,2001)

Tableau 12 : microorganismes considérés comme probiotiques(d‟après Hozalpfel et al .,

1998).

lactobacillus bifidobacterium Autres bactéries lactique Autres micro-organismes

L.acidophilus

L.amylovirus

L.brevis

l. casie

L.cellobius

L.crispatus

L.curvatus

L.delbrueckii

L.farcinimis

L.fermentum

L.gallinarum

L.gasseri

L.johnsonii

L.paracasei

L.plantarum

L.reuteri

L.rhamnosus

B.adolescentis

B.animalis

B.bifidum

B.breve

B.infuntis

B.lactis

B.longum

B.thermophilum

Enterococcusfaecalis

Enterococcusfaecium

Lactococcuslactis

Leuconstocmesenteroides

Pediococcusacidialactici

Sporolactobacillusinnulinus

Streptococcus thermophilis

Streptococcus diacetylactis

Streptococcus intermedius

Bacillus spp.

Escherichia coli strainnissle

Propionibacteriumfreudenreichii

Saccharomyces cereviae

Saccharomyces bourlardii


41

5.3. Les probiotiques pour lutter contre les bactéries pathogènes

L‟inhibition des bactéries indésirables ou pathogènes par les probiotiques peut se faire

de différentes façons. La production d‟acides organiques (acide lactique ou acide acétique) à

partir de glucides ingérés lors de la prise alimentaire limite, en abaissant le ph, le

développement des Escherichia coli et des Salmonella. La baisse des coliformes dans le tube

digestif serait due au ph très bas.

Ce faible ph est obtenu grâce à l‟apport de lait acidifié par de l‟acide lactique. En milieu

humide, les lactobactéries produisent du peroxyde d‟hydrogène inhibiteur de nombreuses

souches bactériennes pathogènes, mais respectant l‟écosystème des bactéries elles-mêmes.

Cette production de peroxyde d‟hydrogène et d‟acide lactique peut bloquer le développement

de certaines espèces pathogènes comme le virus de la fièvre aphteuse, certains virus de la

poliomyélite, certains champignons comme le Candida Albicans, ou encore certaines

bactéries comme Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Clostridium perfringens,

Clostridium butyricum, Pseudomonas spp., Salmonella. De plus, l‟acidification favoriserait la

régulation du transit intestinal.(Jean marc robin, et al., 2001)

5.4. Les amines biogènes

Les amines biogènes sont des bases organiques de faible poids moléculaire provenant

du animales, végétales ou microbiennes. Elles possèdent une structure aliphatique (putrescine,

cadavérine, sperimidine), aromatique (tyramine, phényléthylamine) ou hétérocyclique

(histamine, tryptamine). Dans le domaine alimentaire, les amines biogènes, souvent d‟origines

microbienne, résultent de la décarboxylation des acides aminés, de l‟amination des cétones ou

des aldéhydes et de l‟hydrolyse de composés azotés (santos.1996).Certains aliments fermentés

renferment des quantités importantes d‟amines biogènes suites à l‟activité de décarboxylases

microbiennes (santos.1996). Les amines biogènes peuvent aussi être d‟origine endogène, mais

elles sont présentes seulement à de faibles concentrations dans les aliments non fermentés

comme les fruits, les légumes, la viande, le lait ou le poisson.

La plupart de ces amines endogènes possèdent de fortes activités biologiques et

physiologiques (Shalaby, 1996). Elles sont également présentes dans une grande variété

d‟aliments comme le chocolat, la choucroute, les produites de la mer, la bière, le vin, le

fromage…. Les amines biogènes trouvées dans les aliments, ainsi que leurs acides aminés

précurseurs, sont rapportées dans le tableau 13.


42

Tableau 13 : principales amines biogènes trouvées dans les produits alimentaires (ten Brink et al., 1990)

Acides aminés Amines biogènes

Basiques Polyamines

Ornithine Putrescine

Lysine Cadavérine

Aromatiques Monoamines

Tyrosine Tyramine

Phénylalanine Phényléthylamine

Hétérocycliques Hétérocycliques

Histidine Histamine

Arginine Agmatine, spermidine, spermine

Tryptophane tryptamine

5.4.1. Rôle des amines biogènes

Les amines biogènes ont des rôles physiologiques et pharmacologiques importants.

Elles se forment et se dégradent pendant le processus métabolique normal des cellules

vivantes comme la régulation de la croissance (spermine, spermidine et cadavérine), la

transmission nerveuse (catécholamine et sérotonine) et les médiateurs d‟inflammation

(histamine et tyramine) (onal, 2007). Ces amines biogènes jouent un rôle notable dans des

fonctions physiologique telles que la régulation de la température corporelle, du pH de

l‟estomac et de l‟activité cérébrale. Les amines biogènes, sources du groupement NH2,

servent également de précurseurs pour la synthèse d‟hormones, d‟alcaloïdes, d‟acide

nucléique et de protéines. Dans des aliments, ce sont des composés aromatiques de premier

plan (santos, 1996). les polyamines sont impliquées dans les processus physiologiques

importants comme le développent et la croissance des fruits (Estis et al., 1998) ; elles ont par

ailleurs un autre intérêt physiologique lié à la stabilisation de la membrane et à la prolifération

cellulaire puisqu‟elles impliquent l‟ADN et l‟ARN et la synthèse protéique ( Bardocz, 1993).

Elles sont considérées comme des microcomposants alimentaires importantes pendant la

période de croissance cellulaire intense (développement intestinal des nourrissons et

rétablissement post-opérationnel), bien que dans certains cas pathologiques (tumeurs) , leur

consommation doive être minimisée ( Bardocz, 1993).

5.4.2. Toxicité des amines biogènes

Les amines biogènes sont à l‟origine d‟intoxications directes ou indirectes du système

nerveux ou du système vasculaire humain. La tyramine, la tryptamine et la B-phénylamine

sont impliquées dans les crises d‟hypertension ( shalaby , 1996 ;parente et al .,2001). En


43

général, les amines biogènes peuvent provoquer des urticaires, des maux de tète, des nausées,

de l‟hypotension, des palpitations cardiaques, des hémorragies intracérébrales et des chocs

anaphylactiques spécialement si de l‟alcool et des monoamines oxydases ont été ingérés au

même moment (lange et wittmann, 2002). Les amines biogènes, comme la putrescine et la

cadavérine jouent un rôle important dans l‟intoxication alimentaire.la putrescine, la

spermidine , la spermine et la cadavérine n‟ont pas d‟effet toxique direct sur la santé mais

peuvent réagir avec les nitrites pour former des nitrosamine cancérigènes : la formation de ces

nitrosamines constitue un risque toxicologique additionnel associé aux amines biogènes ,

spécialement dans les produits carnés ( scanlan , 1983) . dans le cas spécifique du fromage, il

est possible d‟utiliser les amines biogènes comme paramètre de qualité hygiénique de

production et comme indicateur du degré de protéolyse et de typicité de certains fromages

(innocente et al. 2007). la quantification des amines biogènes peut aussi être considérée

comme un paramètre d‟évaluation du degré de détérioration des aliments ( leuschner et

hammes, 1999) il est par conséquent important de maitriser leurs productions.

5.4.3. Les bactéries impliquées dans la production des amines biogènes

Les amines biogènes peuvent être produites, lors du stockage ou du procédé de

fabrication des aliments (fromages, poisson et produits carnés), par des décarboxylases

bactériennes des bactéries appartenant aux genres bacillus. Clostridium , hafnia ,klebsiella ,

morganella , proteus , lactobacillus et enterococcus( udenfriend et al .,1959 ;halasz et al .,

1994). Ces décarboxylases possèdent une spécificité extrêmement étroite. Elles utilisent le

pyridoxal-5-phosphate comme coenzyme (figure). une corrélation positive a été constatée

entre la formation d‟amines biogènes et la croissance de certains micro-organismes

(Jorgensen et al ., 2000 ;Marino et al.,2000). De nombreux micro-organismes, appartenant

aux bactéries à gram-positif, comme les bactéries lactiques sont capables de décarboxyler un

ou plusieurs acides amines et produire des amines biogènes.

Figure 7 : formations d‟histamine à partir de l‟acide aminé histidine au travers de la

dégradation enzymatique du groupe acide (décarboxylation).

Chapitre II MATERIEL ET METHODES

Matériel et Méthodes

Chapitre II :

Matériel et

Méthodes

CHAPITREII MATERIELS ET METHODES

44

1 .Isolement des souches de bactéries lactiques

1.1. Provenances des échantillons

Les échantillons de margine d’olive proviennent des régions de bordj Bou

Arreridj et de Bejaia. Les échantillons sont prélevés dans des conditions d’hygiène

adéquate dans des flacons stériles de 250 ml et laisser fermenté durant 4 à 6 mois. Le

pH des échantillons est mesuré avant le début de l’expérimentation.

1.2. Milieux des cultures

Les milieux de cultures utilisées au cours de nos expériences sont :

-Milieu MRS (de Man, Rogosa et Sharpe, 1960) gélosé ou liquide est utilisé pour le

repiquage et le maintien des souches de bactéries lactiques.

-Milieu MRS gélosé acidifiée à pH =5.4 est utilisé pour l’isolement des lactobacilles,

et incubé à 37°C

-MRS gélosé additionné de 0,1% de CaCo3 (pH =5.4) pour l’isolement de la flore

lactique acidifiante. Le ph du milieu favorise le développement des lactobacilles

l’incubation en faite à 37°C

-M17 gélosé pour l’isolement des lactocoques.

-Le milieu MRSBCP (sans extrais de viande, au pourpre de bromocrysol) à 0,1% est

utilisé pour l’étude du profil fermentaire des souches,

-Le milieu M16BCP gélosé est utilisé pour la recherche de l’arginine dé hydrolase

(ADH),

-Le milieu Kempler et Mac Kay (1980) KMK est utilisé pour l'isolement des

microorganismes fermentant le citrate.

-Le milieu lait gélosé est utilisé pour l’étude de l’activité protéolytique.

1.3. Isolement et purification des souches

Une aliquote d’un ml est prélevé de l’échantillon et une série de dilution décimale

jusqu’à 10-6

est réalisée dans une solution physiologie. 1 ml des dilutions 10-4

,10-5

et

10-6

est prélevé pour être ensemencé en profondeur dans le milieu approprié. Les


45

boites ainsi ensemencées sont incubées dans les conditions d’anaérobiose dans une

jarre d’anaérobiose (MRS au CaCo3, MRS acidifie, MRS pH 6,8, M17).

Après incubation 5 colonies choisies de la dilution la plus élevé à sont repiques dans

du milieu MRS liquide puis incubées à 37 °C pour 18 à 24 h.

Après incubation l’apparition du trouble indique la croissance des bactéries, 0.1 ml de

chaque tube positif est ainsi ensemencé par stries sur milieu MRS solide, incubation à

37 °C pendant 24 heures, les souches ainsi obtenue sont repiqués sur milieu MRS

solide afin de les purifies

2. Conservation des souches :

Les souches sont ensemencées sur gélose MRS incliné en tube. Ces cultures sont

gardées à 4 °C. Les repiquages se font toutes les deux semaines. Pour conservation de

longue durée une culture de 18 h est centrifugée (4000 tr/min pendant 10 min), puis le

culot est lavé. Le milieu de conservation est représenté par du lait écrémé auquel est

additionnée du glycérol à 30% et 1% d’extrait de levure. La culture est conservée à -

20°C pour longue durée.


46

Culture de 18h sur bouillon MRS

Centrifugation à 4000 tours par minutes pendant 10 minutes

Conservation du culot

Culot est additionné de 2 ml de lait écrémé stérile à l’extrait de

Levure plus 30% de glycérol

Répartition dans des tubes eppendorfs

Conservation a -20C°

Figure 8. Schéma de conservation longue durée des bactéries lactiques purifiées

(Saidi et al. 2002)

3. identification des souches bactérienne

3.1. Critères morphologiques

L’examen microscopique des frottis

Après coloration de Gram permet de déterminer la morphologie des cellules

bactériennes (taille, forme et mode d’association) ainsi que leur affinité pour les

colorants liés à la structure générale de leur paroi. Les bâtonnets à Gram positif seront

examinés pour la recherche de la catalase. Les bactéries à Gram positif et catalase

négatif sont présumé des bactéries lactiques.

Test de mobilité

Le test de mobilité consiste à réaliser un frottis bactérien vital en déposant une colonie

repiquée à partir des souches isolées entre lame et lamelle puis on ajoute une goutte


47

de bleu de méthylène pour enfin passer à l'observation. Ce test nous permet de

déterminer la mobilité ou l'immobilité de la souche étudiée (Bourgeois et Leveau,

1991).

3.2. Critères biochimiques et physiologiques

3.2.1. Hydrolase de l’arginine

Pour la mise en évidence de cette enzyme, les souches à tester sont ensemencées sur

milieu M16 BCP. Les boites sont incubées à 37°C pendant 24 à 48 heures.

3.2.2. Effet de la température sur la croissance

Ce test est important car il permet de distinguer les bactéries lactiques

mésophiles des thermophiles. Les souches sont ensemencées sur MRS liquide (pH

=6.8), puis incubés à 15 C° et 45C° pendant 24h à 48h.

La croissance se manifeste par un trouble bien défini du milieu et l’apparition

du dépôt au fond du tube.

3.2.3. pH de croissances

Les souches sont ensemencées dans du milieu MRS liquide à pH (2.4.5, 4.6,

8.9, 6) puis incubés à 37°C pour 24 à 48heures.

3.2.4. Croissance milieu en hypersalé

Ce test est réalisé spécifiques pour les cocci Après l’observation d’une culture jeune

des isolats (culture de 18h à 37 °C ), ces derniers sont ensemencés dans un milieu

MRS liquide contenant 3% et 6.5% de chlorure de sodium (NACL) et incubés à

37°C témoin est représenté par la culture de la souche dans du MRS liquide sans sel

les tubes ainsi ensemencés sont incubé pendant 5 jours.

La croissance des bactéries est appréciée par l’apparition d’un trouble dans les tubes

(Guiraud, 1998).

3.2.5. Le lait de Sherman

On teste l’aptitude des souches à pousser en présence de bleu de méthylène. Ce

test est appliqué pour différencier les Streptococcus et les Lactococcus. Les souches

purifiées sur MRS liquide sont ensemencées dans deux séries de tubes contenant 9ml

de lait écrémé stérile additionné à 1ml de bleu de méthylène à (1%) stérile pour la


48

première série, et à 1ml de bleu de méthylène (3%) pour la deuxième. L’incubation se

faire à 37°C pendant 24 à 48 heures. Le bleu de méthylène tire sa couleur grâce à

l'oxygène, ce test porte toujours sur le système respiratoire des lactocoques, car vu

que se sont des microaérophiles, ils ne vont utilisés qu'une faible partie de l'oxygène

présent dans le bleu de méthylène (3%) et de ce fait la couleur du lait (bleue) ne virera

que légèrement ver le blanc et ce contrairement aux entérocoques (aérobies) qui

utilisent tout l'oxygène du bleu de méthylène (Larpent et al., 1990). Les

streptocoques fécaux se développent en présence de 0,1% de bleu de méthylène.

Quant à Streptococcus thermophilus, il est très sensible au colorant utilisé dans ce

test.

3.2.6. Recherche du type fermentaire

Le test permet d’apprécier le type de métabolisme par lequel le substrat carboné est

transformé; il consiste à mettre en évidence la formation du gaz (CO2). C’est ainsi

qu’on peut classer les bactéries lactiques en homo ou hétéro-fermentaires. Les

souches sont cultivées dans des tubes contenant du MRS liquide avec une cloche de

Durham pour apprécier la production de CO2. Après incubation à 37°C pendant 48

heures, la présence ou l’absence du gaz dans la cloche indique le type fermentaire

(Kihal, 1996 ; Hariri et al., 2009 ).

Les souches homofermentaires vont produire 90% d'acide lactique et seulement 1%

de CO2, Les souches hétérofermentaires quand à elles, vont produire de l'acide

lactique et du CO2 à proportions égales, ce qui va être mis en évidence par la cloche

de Durham qui se remplie de gaz (Carr et al., 2002).

3.2.7. L’utilisation du citrate

L’utilisation du citrate est étudiée sur milieu Kempler et Mc Kay (1980).ce milieu

contient une solution de ferricyanure de potassium et une solution de citrate ferrique.

La présence du citrate dans le milieu inhibe la réaction entre l’ion ferrique et le

potassium ferricyanide.les colonies qui fermentent le citrate lance la réaction entre ces

ions, il en résulte la formation de colonies bleues ou ayant un centre bleu (après 18h-

72h d’incubation à t =37°C).les colonies incapables de fermenter le citrate restent

blanchâtre.

3.2.8. Esculine

A partir de pré-cultures bactériennes en milieu MRS, les cellules sont ensemencées en

touche sur milieu gélose à l’esculine. Les boites sont incubées à 37°C pendant 48h.


49

L’esculine est un hétéroside formé d’un glucide complexe qui peut être dégradé par

l’esculinase. Les produits de la réaction sont le glucose et l’ésculétine. L’ésculétine

forme peut réagir avec les ions de fer pour donner des colonies noir.

3.2.9. La production d’acétoine

La production d’acétoine est testée sur milieu Clark et Lubs (Samelis et al.,

1994 ;Guiraud,1998) qui est inoculé par les souches à tester et incubé à 37°C. après

24h et dans un tube à hémolyse on dépose 2ml de cette culture avec 0,5ml de reactif

α-naphtol à 6% dans l’alcool absolu (VP1) et 0,5ml d’une solution de soude (NaOH) à

16% dans l’eau distillée (VP2) pour assurer la réaction de Voges Proskaeur dite

réaction de VP, on agite soigneusement les tubes et on les laisse en contact avec l’aire

libre pendant 5 à 10 min à température ambiante. La production d’acétoine se traduit

par l’apparition d’un anneau rose à la surface du milieu.

3.2.10. L’utilisation des carbohydrates

La fermentation des carbohydrates a été menée sur milieu MRS sans extrait de viande

et additionné de pourpre de bromocrysol (BCP) comme indicateur de pH (MRSBCP-

EV). La source de carbone est représentée par l'un des sucres suivant : arabinose,

glucose, fructose, galactose, lactose, maltose, mannitol, raffinose, rhamnose,

saccharose, et xylose. Les solutions sucres sont préparées à 3% et stérilisées par

autoclavage. Un millilitre de la solution sucrée est additionné à 10 ml de MRSBCP-

EV. Vu le nombre important de souches étudiées ainsi que le nombre de tubes à essai

à utiliser avec chaque souche, une mini préparation est réalisé au laboratoire.

Une plaque d'Elisa est utilisée pour ses puits. Les puits de chaque ligne contiendront

une source de carbone qui sera utilisée par différentes souches (figure9).

Une solution bactérienne servant à ensemencer les puits contenant les différentes

sources de Carbonne à été préparée. Une culture de 18 heures de la souche appropriée

est centrifugée à 8000 tr/mn pendant 15 min. Le culot Matériel et méthodes ainsi

récupéré est additionné de 2 ml de tampon phosphate puis recentrifugé aux mêmes

conditions pour le débarrasser des restes du milieu de culture et obtenir un culot

cellulaire pur. A ce culot, 5 ml de milieu MRSBCP-EV est additionné pour former la

solution cellulaire servant à ensemencer les puits contenant différentes source de

carbone ; 100 μl de cette solution bactérienne est déposée dans chaque puit. La lecture

des résultats sa fait après 24 et 48 heures d’incubation. (Guessas, 2006)


50

Figure 9: schéma représentant le mini préparation pour le test de la fermentation des

sucres

4. Caractérisation technologiques

4.1. Etude de la cinétique

Chaque souche a été ensemencée d’abord sur MRS liquide et incubée à 37°C pendant

18h, ensuite 0,3 ml de la culture précédente a été inoculé dans un tube contenant 10

ml de lait écrémé puis Incubé à 37°C pendant 18h, 9 ml de cette préculture a été

additionné à une fiole contenant 300 ml de lait écrémé sans extrait de levure. Ces 300

ml sont ensuite réparti en une série de 10 tubes de 10 ml chacun.

En retirant les deux tubes de t0, les 24 tubes restant sont incubés à 37° C. chaque deux

heures deux tubes ont retirés pour évaluer le pH et l’acidité titrable .

le dosage de l’acidité au cours de la croissance des souches dans le lait est effectué

selon la méthode décrite par Accols et al ., (1977) en utilisant :un statif avec noix et

pince , une solution de NAOH , une burette de 25 ml , une pipette de 10 ml et une

solution de phénolphtaline à 1% dans l’éthanol. On remplit la burette de la solution de

NAOH, on la fixe au statif et on règle le niveau du liquide à zéro.

Les tubes incubés contenant les cultures en lait, sont versé dans un bêcher dans lequel

sont ajoutées 5gouttes de phénolphtaléine. Le titrage s’effectue sous agitation. On

considéré que le virage est atteint, quand la couleur blanche du lait vire à la rose pale


51

et persiste pendant une dizaine de secondes. Les résultats sont exprimés en degrés

dornic selon la formule suivante : acidité =n*10 dont n : volume de la souche dornic.

1 degré dornic =1°D =0,1 g d’acide lactique dans un 1 l de lait.

Figure 10. Instruments pour la mesure de l’acidité titrable.

4.2. Protéolyse

L’activité protéolytique a évaluée en milieu agar-lait (M-A) selon la méthode de

Fransen et al., (1997) A partir de pré-cultures bactériennes en milieu MRS, les

cellules sont ensemencées en touche sur milieu agar-lait tamponné. Les boites sont

incubées à 37°C pendant 48h.

Les bactéries possédant une activité protéolytique donne des zones claires autour de la

colonie.

4.3. Recherche de l’activité lipolytique sur Agar au tween80

Le milieu est préparé par ajout de: 10 g de peptone, NaCl, 5.0g, CaCl2·2H2O 0.1g et

20 g d’agar dans 1 litre d’eau distillée le pH est ajusté à 6. Le milieu est autoclave

pendant 20 minutes. 2,5 ml de Tween80 est stérilisé séparément puis ajouté au milieu.

20 ml du milieu est coulée en boite et après solidification les souches lactiques sont

ensemencées par un multi-ensemenceur. L’activité lipolytique est indiquée par

l’apparition d’un précipitât visible, résultant du dépôt des cristaux du sel de calcium

formé par la libération des acides gras libérés par les enzymes ou un précipitât autour

de la colonie dû à la dégradation complète des sels des acides gras. A intervalle

régulier de 24 h d’incubation à T=37°C, les boites sont examinées pour un monitoring

d’une activité lipolytique (Guessas et al ,2012)


52

5. Probiotiques :

5.1. Resistance au pH acide

A partir de pré-cultures bactériennes en milieu MRS liquide à déférentes pH (0.1.2)

les tubes sont incubés à 37 °C pendant 3h. Après incubation les souches bactériennes

sont ensemencées par strie sur milieu MRS solide les boites sont incubées à 37°C

pendant 24h. . (Barbara Ripamonti ,et al.,2011).

5.2. Test d’hémolyse

A partir de pré-cultures bactériennes en milieu MRS, les souches sont ensemencées en

touche sur milieu gélose au sang cuit. Les boites sont incubées à 37°C pendant 48h.

Une zone claire indiquant une béta hémolyse, l’halo verdâtre pour l’hémolyse alpha,

et absence d’halo pour gamma hémolyse.(hosseini et al., 2009)

5.3. Resistance aux sels biliaires

Etude de la survie des souches lactiques dans les conditions extrêmes du tube digestif

Le but de cette étude est de sélectionner des souches lactiques extrêmophiles qui

peuvent résister aux barrières physiologiques du tube digestif (pH stomacal bas,

péristaltisme intestinale et concurrence bactérienne au niveau du gros intestin). La

méthode utilisée est celle de Dilmi Bouras et al.,(2002) qui consiste à préparer deux

fractions de bouillon MRS dont la première à Ph=2 et dépourvue de sels biliaires et le

pH de cette milieu est 2 , alors que la deuxième est additionnée de 0,3% des billes

avec un pH6,8. A ces différentes fractions sont additionnées : 3 % d’inoculum d’une

souche lactique. Ces fractions sont dénombré à l’état initiale (0°C) et après

incubation à 37°C sur boîtes de Pétri pendant les intervalles de temps suivant : 0, 3 h.

( Barbara Ripamonti ,et al.,2011).

Les résultats sont évaluée pour le démembrement sur milieu solide et suivante la

relation (Joffin et leyral, 2006)

Σ C

V (n1 + 0,1 n2) d1

N: Nombre d’UFC par g ou par ml de produit initial;

Σ C: Sommes des colonies des boites interprétables;

N=


53

V : Volume de solution déposée (ml);

n1 : Nombre de boites considérées à la première dilution retenue;

n2 : Nombre de boites considérées à la deuxième dilution retenue;

d1 : Facteur de la première dilution retenue.

5.4. Antibiogramme

L’antibiogramme des souches de lactobacilles sp. est déterminé par la technique

standardisée de diffusion (d’après le comité de l’antibiogramme de la société

françaises de microbiologie, 2010) sur milieu Muller-Hinton (MH) .a partir d’une

culture de 18h en milieu liquide MRS et à l’aide d’un écouvillon stérile, on

ensemence toute la surface du milieu. Après le séchage les disques des l’antibiotiques

sont déposés à la surface du milieu (maximum 6 disques par boites de pétri) les boites

sont incubé à 37°C pendant 18h à 24h.

La lecture du résultat consiste à mesurer le diamètre de la zone d’inhibions de

croissance provoquée par l’antibiotique. Nous avons considéré par convention, que

pour un diamètre inférieure à 15mm la souche est résistante (R) a l’antibiotique et que

pour un diamètre supérieur à 15mm et inférieure à 20mm est considère comme

intermédiaires (I) pour un diamètre supérieur à 20mm elle est sensible (S).

Les antibiotiques testés sont représentés dans le tableau(22).

5.5. Les interactions

5.5.1. Interactions entre les bactéries lactiques

Les interactions entre deux populations microbiennes constituent un ensemble comble

complexe de phénomènes biologiques hétérogènes. Elles sont définies selon leurs

effets avantageux. Des bactéries appartenant au même système taxonomique peuvent

montrer des attitudes différentes.

Qui dit association de souches, dit possibilité d’interaction. Si ces interactions sont

bénéfiques pour une ou plusieurs souches, on parlera de « coopération », si elles sont

néfastes pour une ou plusieurs souches on parlera d’ « inhibition ».

Dans un ferment constitué de plusieurs souches de bactéries, les interactions peuvent

être à double sens, c'est-à-dire que chaque des souches peut Une action stimulante ou


54

inhibitrice sur les autres. La recherche d’éventuelle production de substances

inhibitrices par les bactéries lactiques isolées est réalisée selon la méthode de la

double couche.

On inocule 1ml de cultures jeunes de chaque dans un tube contient 5ml de milieu

MRS semi solide qui est coulé sur les colonies des bactéries lactiques déjà les

développées sur milieu MRS solide tamponnée .après solidification de la sur couche,

les boites de pétri sont incubées à 37°C pendant 24 à 48h. D’une zone claire autour

des colonies, indiquant l’absence de croissance de la souche test, et la zone

d’inhibition est mesurée.

5.5.2. Interaction par méthode directe (méthode de double couche) :

Les souches pures sont ensemencées par touche à l’aide d’un multipoint sur MRS

gélosé et incubées pendant 24h à 37°C (Barefoot et al, 1983).

Après la croissance des souches on inocule la deuxième couche qui contient 10ml du

milieu MH semi solide contenant 100µl d’une culture jeune de la souche considérée

indicatrice. On laisse solidifier le milieu puis on incube à 37°C pendant 24h. Le

résultat positif se manifeste par l’apparition d’une zone autour de la souche pure.

5.5. 3.Méthode indirecte

Cette méthode permet de mettre en contact le surnageant des souches lactiques

productrices de substance antimicrobienne avec la souche test. Les souches

précédemment sélectionnées pour leur production de substances antimicrobienne sont

concernées par ce test.

Les souches sont cultivées dans du milieu MRS liquide et incubées pendant 18 heures.

Après incubation, le milieu est centrifugé (8000 tr/mn 10 min) et le surnagent est

conservé. Dans une boite de Pétri contenant du MRS solide et ensemencé par les

souches test (staphylococcus aureus ATCC 6538 et Eschirichia .coli ATCC 8739),

des puits sont réalisés avec un emporte pièce et celée par 10 μl de gélose MRS

(figure). Les puits recevront 100 μl du surnageant de la souche à testée et les boites

sont incubée à 37°C pendant 24 à 48 heures. Les colonies entourées d'une zone claire

dans la nappe de culture de la souche test et ayant un diamètre supérieur à 2 mm sont

considérées comme positive.


55

Figure 11 : Les différentes méthodes utilisées pour la recherche de substances

antimicrobienne. (a) méthode de la double couche, (b) méthode de diffusion en puits.

Détermination de la nature de l’agent inhibiteur.

Afin de déterminer la nature de la substance inhibitrice produite par nos bactéries

lactiques, il est impératif de réaliser une série de test.

a- inhibition due à l’acide lactique

L’acide lactique est un facteur majeur dans les inhibitions par les bactéries lactiques.

Afin d’éliminer son effet, les bactéries lactiques sont cultivées dans du MRS liquide

tamponné; ainsi l’acide lactique produit par la souche lactique sera neutralisé et seule

la substance antimicrobienne si elle est produite exprime son action sur

Staphylococcus aureus et Escherichia.coli.

b- recherche de la nature protéique de la substance antimicrobienne

La recherche de substances antimicrobiennes comme les bactériocines, nécessitent la

recherche de la nature de cette substance qui si elle appartenait aux bactériocines

devrait avoir une nature protéique. Pour ce faire le filtrat de culture de la bactérie

lactique productrice est traité par différents types d’enzymes protéolytiques. Ainsi, 1

ml du filtrat de culture est traité par 1 mg/ml de trypsine ou chymotrypsine et incubé à

37°C pendant 1 heure. Le filtrat ainsi traité est stérilisé par filtration sur filtre

millipore de 45 μm de diamètre. L’action de ce filtrat est testée par la méthode des

puits sur milieu Chapman et incubé à 37°C pour 24 à 48 heure.


56

c-Effet de la température

Les substances antimicrobiennes ont été testées pour leur résistance à la température

et la conservation de leur activité vis-à-vis de Staphylococcus aureus. Le filtrat de

culture de la souche lactique productrice est traité par température 100°C puis testé

sur Staphylococcus aureus et Eschirichia.coli sur milieu gélosé Chapman par la

méthode des puits.

Chapitre III RESULTATS

Résultats

Chapitre III :

Résultats et

discutions

Chapitre III RESULTAT ET DESCUTION

57

Résultat et discutions

3.1. Résultat

Par l’utilisation du milieu de culture sélectif (milieu MRS milieu sélectif par l’acidification ou

l’ajoute de CaCo3) non sont permis d’isoler des lactobacilles et des lactocoques en se

basant sur les critères morphologiques et microscopiques (figures 12/13/14/15/16/17)

Les lactocoques sont confirmées pour des tests simplementair à savoir le lait de Sherman qui

nous permis de déférences les entérocoques les lactocoques (figure19/20) le test de l’arginine

et l’un des tests Clef pour l’identification de l’espèces (figure18), l’utilisation du citrate a et

constate chez les souches de lactobacilles et lactocoques (figure21),test l’esculine une seul

souche chez les lactocoques n’a pas réaliser l’hydrolyse de dernière il s’agit de le son de

La2(figure22).

3.1. 1.Isolement et identification des bactéries lactiques

Figure12.Aspect macroscopique des colonies de bactéries figure13. Aspect macroscopique des colonies de

Lactiques sur MRS +CaCo3 solide bactéries lactiques sur MRS acidifiées solide

Figure14. Purification des souches de Lb sur milieu lait figure15. Purification des souches lactocoque sur milieu MRS.

MRS solide écrémé agar.


58

Figure 16. Aspect microscopique de La souche Lactobacilles Figure 17. Aspect microscopique de La souche lactocoque Gram et observation au G x100). Gram et observation au G x100).

Figure 18. Test de l’hydrolyse de l’arginine.


59

Le lait de Sherman

Après incubation aucune croissance des souches purifiées n’a été constatée sur le lait à 1% et

3% de bleu de méthylène et remarque croissance de quelque souche sur le lait à 1% et 3% de

bleu de méthylène.

Figure 19. Résultats de test Sherman à 1% et 3%(entérocoques).

Figure20. Résultats de test Sherman à 1% et 3% ( lactocoques).


60

L’utilisation du citrate

Toutes les souches sont dégradé le citrate.

La couleur bleu reflète l’utilisation de citrate(+)

Figures 21. La révélation de l’utilisation de citrate par l’apparition des colonies de contour

bleu sur milieu KMK des souches.

Esculine

Presque la totalité des souches dégradant l’esculine .sauf la souche Lb2 a donnée de moins

résultat (figure 22)

Figures 22. Résultat de la dégradation de l’esculine.


61

La production d’acétoine

Trois souches de lactoccoque sont incapables de produire de l’acetoine (La9, La10etLa4).

Recherche du type fermentaire

Le profile fermentaire par l’utilisation de la mini plaque Eliza nous a permes de dresser le

tableau(14) qui montrent le fermentation des sucres utilisé et nous permettent d’identification

nos souches.

Sucres

souches

Figure 23. Le résultat du teste des sucre chez les lactobacilles.

Sucres

Souches

Figure 24. Le résultat du teste des sucre chez les lactocoques


62

Tableau 14 : les caractéristiques biochimiques, physiologiques des souches de lactobacilles

isolées.

souches Lb1 Lb2 Lb3 Lb4 Lb5 Lb6 Lb7 Lb8 Lb9 Lb10 Lb11

gram + + + + + + + + + + +

catalase - - - - - - - - - - -

ADH + + + + + + + + + + +

Type

fermentaire

- - - - - - - - - - -

mobilité - - - - - - - - - - -

T°15 + + + + + + + + + + +

T°37 + + + + + + + + + + +

T°45 + + + + + + + + + + +

PH 2 + + + + + + + + + + +

PH 4 + + + + + + + + + + +

Utilisation

de citrate

+ + + + + + + + + + +

Hydrolyse

de l’esculine

+ - + + + + + + + + +

L’activité

protéolytique

+ + + + + + + + + + +

Production

d’acide à

partir de :

Sorbitol

+ + + + + + + + + + +

Fructose - + + + + + + + + + +

Xylose - - - - - - - - - - -

Raffinose + + +/- +/- - - - - - - -

Maltose + +/- + - - - + + + + +

Galactose + + + + + + + + + + +

Amidon + + + + + + + + + + +

Tréhalose + + + + + + + + + + +

Mannitol +/- +/- + + +/- + + + + + +

Arabinose + + + + + + + + + + +

Rhamnus +/- +/- +/- +/- +/- - - - - - -

sucrose + + + + + + + + + + + (+) résultat positif ou croissance. (-) résultat négatif ou pas de croissance

D’après les résultats obtenus des tests biochimiques et physiologiques effectués, on a pu donc

identifier les onze souches lactobacilles isolées comme suivante :

Lactobacilles manihotivorans (Lb1, Lb2, Lb3, Lb4)

Lactobacilles rhamnosus (Lb5, Lb6, Lb7, Lb8, Lb9, Lb10, Lb11)


63

Tableau 15 : les caractéristiques biochimiques, physiologiques des souches de lactocoques isolées.

souches La1 La2 La3 La4 La5 La6 La7 La8 La9 La10 La11

gram + + + + + + + + + + +

catalase - - - - - - - - - - -

ADH + + + + + + + + + + +

Type

fermentaire

- - - - - - - - - - -

mobilité - - - - - - - - - - -

T°15 + + + + + + + + + + +

T°37 + + + + + + + + + + +

T°45 + + + + + + + + + + +

PH 2 - - - - - - - - - - -

PH 4 + + + + + + + + + + +

Test Sherman

1%

+ + + + + + + + + + +

Test Sherman

3%

- - - - - - - - - - -

Na Cl 6,5% - - - - - - - - - - -

Utilisation de

citrate

+ + + + + + + + + + +

Hydrolyse de

l’esculine

+ - + + + + + + + + +

La production

d’acétoine

+ + + - + + + + - - +

L’activité

protéolytique

+ + + + + + + + + + +

Production

d’acide à

partir de :

Sorbitol

+ + + + + + + + + + +

Fructose + + + + + + + + + + +

Xylose + + + + + + + + + + +

Raffinose + + + + + + + + + + +

Maltose + +/- + - - - + + + + +

Galactose + + + + + + + + + + +

Amidon - - - - - - - - - - -

Tréhalose +/- +/- +/- + + + + + + + +

Mannitol + + + + + + + + + + +

Arabinose + + + + + + + + + + +

Rhamnus +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/- +/-

sucrose + + + + + + + + + + + (+) résultat positif ou croissance. (-) résultat négatif ou pas de croissance.

D’après les résultats obtenus des tests biochimiques et physiologiques effectués, on a pu donc identifier les onze souches lactobacilles isolées comme suivante :

Lc . lactis subsp. Lactis (La4. La10. La9)

Lc. lactis subsp. diacetylactis (La1. La2. La3. La5. La6. La7. La8. La11)


64

En conclusion de cette étude écologique de la flore lactique les lactobacilles représentent

34,37% au même niveau que les lactocoques.

La distribution entre lactocoques lactobacilles et entérocoques est à pour égale.

Les espèces les plus abondante sont lactococcus.lactis subsp.diacetylactis (72,72%) et

lactobacilles rhamnosus(63,63%).

Figure 25 : Répartition des différents groupes de bactéries lactiques des souches de bactéries

lactiques isolées du margine d’olive.

Lc . lactis subsp. Lactis 27,27%

Lc. lactis subsp. diacetylactis 72,72%

Lactobacilles manihotivorans 36,36%

Lactobacilles rhamnosus 63,63%

Entérococcus sp

3.1.2. Caractérisation technologiques

Etude de la cinétique

La production de l’acide lactique à été suivie en fonction du temps en utilisant les cultures

pures des nos souches, cette acidifiante est souvent utilisée dans le choix des souches pour

l’industrie alimentaire.

L’évolution de pH et l’évolution de l’acidité sont représente dans les figures (26/27/28/29) ont

été observées nos souches (Lb2, Lb11, Lb1, Lb10) sont les plus acidifiante par apport les

enterococcus

31,25

lactococcus

34,37

lactobacillus

34,37


65

autres qui confirme une possibilité de fermentation du lait avec la présence de factures de

croissances.

Figure 26. L’évolution de pH des souches Lb3, Lb1, Lb6, Lb8, Lb9, Lb4dans lait écrémé

avec extrait de levure.

Figure 27. L’évolution de pH des souches Lb2, Lb5, Lb10, Lb7, Lb11 dans lait écrémé avec

extrait de levure.

4,9

5,4

5,9

6,4

6,9

0h 3h 6h 9h 18h 24h

pH

temps(h)

Lb3

Lb1

Lb6

Lb8

Lb9

Lb4

4,9

5,4

5,9

6,4

6,9

0h 3h 6h 9h 18h 24h

pH

temps(h)

Lb2

Lb5

Lb10

Lb7

Lb11


66

Figure 28. L’évolution de l’acidité titrable des souches Lb3, Lb1, Lb6, Lb8, Lb9, Lb4 dans

lait écrémé avec extrait de levure.

Figure 29. L’évolution de l’acidité titrable des souches Lb2, Lb5, Lb10, Lb7, Lb11 dans lait

écrémé avec extrait de levure.

0

10

20

30

40

50

60

70

0h 3h 6h 9h 18h 24h

acid

ité(

D°)

temps(h)

Lb3

Lb1

Lb6

Lb8

Lb9

Lb4

0

10

20

30

40

50

60

70

0h 3h 6h 9h 18h 24h

aci

dit

é(D

°)

temps(h)

Lb2

Lb5

Lb10

Lb7

Lb11


67

Protéolyse et lipolyse

Toutes les souches ainsi testées possédant une activité protéolytique (figure 30, tableau 16)

Figure 30. Activités protéolytiques (0%)

Tableau 16: Activités protéolytiques chez les lactobacilles et lactocoques.

Souches lactobacilles

Lb1 Lb2 Lb3 Lb4 Lb5 Lb6 Lb7 7lb8 Lb9 Lb10 Lb11

d/2 12mm 17mm 10mm 10mm 13mm 4mm 11mm 11mm 14mm 5mm 12mm

Souches lactocoques

La1 La2 La3 La4 La5 La6 La7 La8 La9 La10 La11

d/2 5mm 4mm 6mm 3mm 4mm 5mm 4mm 2mm 6mm 4mm 7mm

Aucune activité lipolytiques n’est a signalés pour l’ensemble des souches isolées.

Resistance au pH acide et d’hémolyse

La résistance au pH acide des souches de lactobacilles montre que ces dernies résistent au pH

=2 concernant, le type d’hémolyse, aucune de nos souches n’a donne une hémolyse B. les

souches Lb9, Lb7, Lb4, Lb11 n’ont donné aucune hémolyse. (Tableau 17)


68

Tableau 17. Résultat de la résistance les lactobacilles à déférentes PH (0.1.2)

souches PH=0 PH=1 PH=2 Type d’hémolyse et diamètre

Lb3 - + + Alpha hémolyse halo verdâtre 9mm

Lb2 + + + Alpha hémolyse halo verdâtre 8mm


Lb6 - + + Alpha hémolyse halo verdâtre 15mm

Lb8 - - + Alpha hémolyse halo verdâtre 11mm

Lb9 - - + Gamma hémolyse absence

d’hémolyse

0mm



Lb7 - + + Gamma hémolyse absence

d’hémolyse

0mm

Lb4 + + + Gamma hémolyse absence

d’hémolyse

0mm

Lb11 - - + Gamma hémolyse absence

d’hémolyse

0mm

(+) résultat positif ou présence zone claire. (-) résultat négatif ou pas présence zone claire.

Étude des interactions bactériennes

Étude des interactions entre les bactéries lactiques

La confrontation entre les mêmes espèces lactiques permet de détecter la présence d’une

interaction antagonisme par la présence d’une zone d’inhibition autour des colonies

productrices, ce qui nous oriente vers la présence d’une substance proche de bactériocine.


69

Tableau18: l’interaction entre les bactéries lactiques.

Lb3 Lb2 Lb1 Lb6 Lb8 Lb9 Lb5 Lb10 Lb7 Lb4 Lb11

Lb3 - + + - - + + + + - -

Lb2 + + + - - + + + + - +

Lb1 + + - - - + - - + - -

Lb6 + + + - - - - - + - -

Lb8 + + + - - - + - + - -

Lb9 + + - - - + - - - - +

Lb5 + + - - - - - - - - -

Lb10 + + - - - - + - - - -

Lb7 + + + - - + + - + - -

Lb4 + + + - - + + - + - -

Lb11 + + + - - + + - + - -

(+) résultat positif ou présence zone claire. (-) résultat négatif ou pas présence zone claire.

Les interactions et la recherche de la nature de l’agent inhibiteur

La détermination de l’activité antimicrobienne des nos isolats sont mettre en évidence par la

diffusion sur milieu solide en utilisant la méthode d’interaction directe (Rayan et al 1996),

vis-à-vis les bactéries pathogènes (Escherichia coli ATCC8739, staphylococcus aureus

ATCC6538).

Après l’incubation à 37°C et pendant 18h nous avons remarqué l’apparition d’une zone claire

autour de la souche productrice. Cette zone indique l’inhibition des deux bactéries indicatrices

par les souches sélectionnées. (Figure31)

Zone claire

Figure 31. Inhibition de staphylococcus

par les lactobacilles en utilisant la

méthode directe.


70

La zone claire est l’indice de l’inhibition des bactéries pathogènes alors certain nos souches

sont des souches productrices de substances antimicrobiennes.

Notre étude d’interaction nous a permis de conclure que le diamètre d’inhibition varis selon

les espèces. Le tableau(19) illustre les diamètres des zones d’inhibition de la croissance des

bactéries indicatrices.

Détermination de l’agent inhibition (méthode indirecte)

Nos souches produisent des acides organiques tels que l’acide lactique qui libèrent dans le

milieu de culture ce qui conduit à l’acidification et qui peuvent être une cause principale

d’inhibition des souches indésirables.

On a remarqué que le diamètre de la zone d’inhibition sur milieu tamponné (pour élimine

l’acidité) est mois important que celui sur milieu normal.

Après le traitement du surnageant avec la température on a remarqué quelques souches il y à

une inhibition après les chauffages d’une température de 100°C. Que veux dire que la

substance résiste à la température (Lachance, 2000 ;Labioui et al ,2005).

Après le traitement du surnageant avec la chymotrypsine il y à une disparition de la zone

d’inhibition, ceci indique que l’agent inhibiteur est sensible à la protéase.

Les résultats obtenus après le traitement thermique du surnageant contenant la substance et les

tests des enzymes protéolytiques ainsi que l’élimination de l’acidité nous on permit de

sélectionner des souches productrices de substance antimicrobienne d’une nature protéique

thermorésistant (Hugas et al, 2003) (tableau19).


71

Tableau19. Activité antimicrobien de lactobacille vis–à-vis staphylococcus aureus et


100°C.

Lactobacilles

Souches

pathogènes


Escherchia coli 24mm 18mm 30mm 15mm 15mm 21mm 19mm 27mm 33mm 20mm 34mm

Staphylococcus

aureus

- 17mm 20mm 15mm 18mm 30mm 14mm 24mm - 12mm 22mm

Eschechia coli

(surnageant +

enzyme)

- - - - - - - - - - -

Staphylococcus

aureus

(surnageant +

enzyme)

- - - - - - - - - - -

Escherchia coli

(surnageant traité

par la

température100°C

10 min)

16mm 14mm - - 13mm - - 7mm - - 17mm

Staphylococcus

aureus

(surnageant traité

par la

température100°C

10 min)

- - - - 13mm - - - - - -

- : absence la zone d’inhibition


72

Zone d’inhibition

Figure 32. Activité antimicrobien de lactobacille vis–à-vis staphylococcus aureus et


Resistance aux sels biliaires

Toutes les souches ensemencées sur milieu MRS contenant de bille développent un trouble

confirmant leur résistance aux sels biliaires.

Figure33. Nombres de colonies caractéristiques de Lactobacilles sur MRS.

Pour confirmer la résistance au pH acide et aux sels biliaires des dénombrements ont été

effectuée pour évaluée la croissance de nos souches dans les conditions.

Le dénombrement a été effectué à 0h et 3h pour le pH=2 et à la concentration des 0,3% de

sels biliaires.


73

Tableau 20: Nombres de colonies caractéristiques de Lactobacilles sur MRS.

Dilutions

souches

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

Dénombrement

Lb5+ bille (h0) >300

>300

>300

>300

294

>300

232

194

44

43

42

11

6,95 x106 UFC/ml

Lb5+bille (h3) >300

>300

>300

>300

>300

>300

196

182

61

40

29

32

2,31 x107 UFC/ml

Lb5:pH=2(h0) >300

>300

>300

>300

300

280

200

188

74

81

28

33

7,01 x106 UFC/ml

Lb5 : pH=2(h3) >300

>300

>300

>300

>300

175

245

175

150

129

18

36 7,45 x10

6 UFC/ml

Lb9+ bille (h0) >300

>300

>300

>300

151

128

85

110

42

55

42

20

3,05 x106 UFC/ml

Lb9+bille (h3) >300

>300

>300

>300

290

300

280

270

80

82

ND

ND

7,68 x106 UFC/ml

Lb9:pH=2(h0) >300

>300

280

260

270

200

190

187

45

39

11

16 6,17 x10

5 UFC/ml

Lb9:pH=2(h3) >300

>300

>300

>300

300

ND

250

150

58

140

49

55

3,16 x107 UFC/ml

Lb11+ bille

(h0)

>300

>300

>300

>300

>300

>300

121

93

32

39

ND

37 1,45 x10

7 UFC/ml

Lb11+bille

(h3)

>300

>300

>300

>300

>300

>300

290

191

31

149

20

26 3 x10

7 UFC/ml

Lb11:pH=2(h0) >300

>300

>300

>300

300

295

190

200

64

69

32

35 6,67 x10

6 UFC/ml

Lb11:pH=2(h3) >300

>300

>300

>300

300

>300

250

230

130

126

50

ND 7,87 x10

6 UFC/ml

Lb4+ bille

(h0)

>300

>300

>300

>300

240

280

85

126

33

21

4

7 3,45 x10

6 UFC/ml

Lb4+bille (h3) >300

>300

>300

>300

280

200

174

140

30

35

7

10

3,86 x106 UFC/ml

Lb4:pH=2(h0 >300

>300

>300

>300

210

240

160

129

45

36

26

ND

3,49 x106 UFC/ml

Lb4:pH=2(h3) >300

>300

>300

>300

248

231

170

184

60

55

5

10

4,27 x106 UFC/ml

Lb7+ bille

(h0)

>300

>300

>300

>300

>300

290

120

130

110

119

9

16

6,30 x105 UFC/ml

Lb7+bille (h3) >300

>300

>300

>300

190

160

74

79

21

18

7

8

2,28 x106 UFC/ml

Lb7:pH=2(h0 >300

>300

>300

>300

100

150

50

40

36

37

ND

ND

1,8 x106 UFC/ml

Lb7:pH=2(h3) >300

>300

>300

>300

200

210

60

75

40

56

32

24

2,85 x106 UFC/ml

ND : Non déterminé


74

La suite de Tableau 20: Nombres de colonies caractéristiques de Lactobacilles sur MRS.

dilutions

souches

10-1

10-2

10-3

10-4

10-5

10-6

Dénombrement

Lb2 + bille

0h

>300

>300

>300

>300

270

255

55

37

10

9

2

1 2,80 x10

6 UFC/ml

Lb2 + bille

3h

>300

>300

>300

>300

>300

>300

291

285

272

259

157

176 6,48 x10

7 UFC/ml

Lb3 + bille

0h

>300

>300

>300

>300

290

280

260

250

63

58

17

8 5,4 x10

6 UFC/ml

Lb3 + bille

3h

>300

>300

>300

>300

>300

>300

286

279

180

197

140

155 5,12 x10

7 UFC/ml

Lb1 + bille

0h

>300

>300

>300

>300

240

220

200

190

95

112

35

21 4,91 x10

6 UFC/ml

Lb1 + bille

3h

>300

>300

>300

>300

>300

>300

252

277

205

210

198

186 5,98 x10

7 UFC/ml

Lb8 + bille

0h

>300

>300

>300

>300

290

280

150

180

73

76

30

50 5,08 x10

6 UFC/ml

Lb8 + bille

3h

>300

>300

>300

>300

>300

>300

299

288

248

237

230

188 6,71 x10

7 UFC/ml

Lb10 + bille

0h

>300

>300

>300

>300

>300

290

298

257

150

168

71

55 1,05 x10

7 UFC/ml

Lb10 + bille

3h

>300

>300

>300

>300

>300

>300

>300

>300

278

281

240

260 4,8 x10

8 UFC/ml

Lb6 + bille

0h

>300

>300

>300

>300

>300

>300

108

105

51

46

10

7 1,5 x10

7 UFC/ml

Lb6 + bille

3h

>300

>300

>300

>300

>300

>300

>300

298

255

280

203

199 1,01 x10

8 UFC/ml

Antibiogrammes

L’antibiogramme a été effectué sur 11 souches de lactobacilles, en utilisant quinze

antibiotiques avec des doses différents sur milieu Muller-Hinton(MH).

Le but de l’antibiogramme est de voir les souches ainsi isolés développent une quelque

résistance aux antibiotique qui représente une barrière à l’encoure de l’utilisation des souches

résistance an tant que ferment lactique (tableau 22/figure42*43)

La constatation faite est que toutes nos souches sont résistante aux antibiotiques suivantes :

acide nalidixque (30µg) colistin(50µg) Sulphonamides(200µg) oxacillin(1µg) et acide

pipimidique (20µg).


75

La souche Lb3 résiste a toues les antibiotiques testés on cite l’amoxicilline gentamicine et la

chloramphenicol.

Tableau21: Les résultats d’antibiogramme des souches lactobacilles.

Antibiotiques Charge

du

disque

symbo

le


Nalidixie acid 30µg NA 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R

spiramycine 100µg SP 0 R 30 S 35 S 34 S 28 S 0 R 32 S 37 S 34 S 0 R 0 R

Lincomycine 15µg L 0 R 0 R 25 S 29 S 12 R 0 R 26 S 22 S 33 S 19 I 0 R

Trimethoprim-

sulfamethoxazole 1.25/2

3.75µg

SXT 0 R 0 R 0 R 30 S 0 R 12 R 0 R 33 S 35 S 0 R 0 R

Colistin 50µg CS 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R

Gentamicin 10ul GM 20 I 22 S 23 S 25 S 25 S 0 R 28 S 22 S 23 S 18 I 21 S

Erythromycin 15µg E 10 R 25 S 25 S 24 S 22 S 0 R 21 S 20 I 22 S 15 R 18 I

Sulphonamides 200µg SSS 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R

Amoxycilin +

clavulanic acid 20/10µ

g

AMC 25 S 24 S 40 S 42 S 31 S 0 R 31 S 30 S 37 S 21 S 30 S

Nitroxolin 20µg NI 15 R 22 S 26 S 27 S 20 I 27 S 21 S 25 S 29 S 22 S 25 S

Pristinamycin 15µg PT 0 R 0 R 35 S 35 S 33 S 35 S 38 S 32 S 38 S 25 S 30 S

Oxacillin 1µg OX1 0 R 0 R 12 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R

Chloramphenicol 30µg C 0 R 28 S 32 S 32 S 33 S 37 S 34 S 25 S 32 S 25 S 25 S

Amoxicillin 25µg AMX 0 R 26 S 41 S 30 S 29 S 29 S 35 S 40 S 32 S 24 S 25 S

Pipemidic acid 20µg PI 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R 0 R

R : résiste /S : sensible /I : intermédiaire.


76

Zone claire

Figure34. Les résultats d’antibiogramme des souches lactobacilles Lb5

Zone claire

Figure 35. Les résultats d’antibiogramme des souches lactobacilles Lb8

Chapitre IV DISCUTIONS

77

Discutions générale

L’étude de la microflore lactique isolées des margines d’olives fermentés, nous a

permis d’isoler, de caractériser, et d’identifier 32 souches de bactéries lactiques réparties

essentiellement comme suit : 11souches de lactocoques dont 3 espèces de Lc. lactissubsp.

lactis, 8 especes de Lc. lactissubsp. diacetylactis et de 11souches lactobacilles réparti en 7

espèces de Lb.Rhamnosus et 4 espèces de Lb .manihotivoran. Les entérocoques sont

représentés par 10 souches.

Les lactobacilles représentent 34,37% de la flore lactique.L’espèce la plus dominante pour ce

groupe est Lactobacillus rhamnosus 63,63%. Lactobacillus manihotivoranse st aussi représenté

parmi les souches isolées 36,36%.

Les lactocoques sont représentés par deux espèces qui sont Lactococcuslactissubsp. lactis

27,27% et lactococcus.lactissubsp. Diacetylactis 72,72%.

De ces résultats nous avons constaté que la quantité d’acide lactique produite change selon le

stade de vie des bactéries cette différence de production peu être expliqué par une déficience

dans le système du transport des substances fermentescibles du milieu vers le cytoplasme

cellulaire. (Albenzino et al., 2001)

L’activité protéolytique et lipolytique sont des activités très recherchées dans la sélection des

ferments lactiques pour l’industrie de plusieurs produits laitier et surtout celle des fromages

comme rapporte plusieurs autheurs (Essidet al., 2009 ; Nieto-Arribaset al., 2010). Les

lactobacilles isolés du margine d’olives n’ont pas exprimés une activité lipolytique. Des

études faites par Guessas et al.,(2012) confirme nos résultats en trouvant la plupart de leur

souches de lactobacilles incapable d’exprimer une activité lipolytique. De même d’autre

travaux arrive à la même conclusion (Kenneallyet al., 1998; Papamaloniet al., 2003).

Les bactéries possédant une activité protéolytique donne des zones claires autour de la

colonie. Avec des diamètres différents. Des résultats similaire ont été trouvés par (Kacem et

Kaid-Harache,. 2008).

Nos souches présentent une résistance aux sels biliaires confirmé par la croissance variable

sur milieu MRS solide ce ci nous permet de dire que nous souches sont de bonnes candidat

pour être probiotiques (Rui-XiaGu 2008).

La résistance au pH acide des souches de lactobacilles montre que ces dernies résistent au pH

=2 pour le type d’hémolyse, aucune de nos souches n’a donne une hémolyse B. les souches

Chapitre IV DISCUTIONS

78

Lb9, Lb7, Lb4, Lb11 n’ont donné aucune hémolyse cette propriété appuyé fortement notre

conclusion pour l’effet probiotiques. Des résultats similaires ont être trouvés par (Santiago et

al., 2009).

Les souches de bactéries lactiques testées pour leur pouvoir inhibiteur vis-à-vis de

Staphylococcus aureus et Escherichia coli ont montré leur capacité antagoniste envers ces

deux souches par la production de substances dans le milieu de culture.

Pour l’antibiorésistance indiquent que toutes les souches sont résistantes à la Colistin(10µl) ,

Oxacillin(1µg), Pipemidicacid(20µl), selonGuessas et al., (2012). Trimethoprim-

sulfamethoxazole(1,25/23,75 µg) (Santiago Ruiz et al ., 2009) et sensible à Amoxycilin +

clavulanicacid (20/10µg), Amoxicillin (25µg), gentamicine (10µl), (Guessas et al., 2012),

Chloramphenicol (30µg) (Kacem et Kaid-Harche.2008).

conclusion CONCLUSION

conclusion

Conclusion

Conclusion CONCLUSION

79

Conclusion

L’industrie oléicole est une activité importante, concentrée principalement dans les pays du

bassin méditerranéen, qui tiennent approximativement 95% de la production mondiale, dont 1%

produit par l’Algérie en 2001.

Dans ce travail, 32 souches de bactéries lactiques ont été isolées et identifiées à partir du margine


lactique. L’espèce la plus dominante pour ce groupe est Lactobacillus rhamnosus avec 63,63%.

Lactobacillus manihotivorans 36,36%. Les lactocoques sont représentés par deux espèces qui

sont Lactococcus lactis subsp. lactis 27,27% et lactococcus. lactis subsp. Diacetylactis

72,72%.

On note la présence des entérococcus sp.

Les bactéries lactiques isolées et identifiée montrent une capacité à inhiber les souches de

Staphylococcus aureus, Escherichia coli. Ces deux souches indésirables sont connues comme

contaminant des produits laitier acidifiés.

Toutes les souches représentent une activité protéolytique et ne possèdent aucune activité

lipolytique.

Nos souches elles sont résistes aux variations du pH à présence ou en absence de sels biliaires

c'est-à-dire elles sont présence un effet probiotique.

L’étude de la cinétique d’évolution de pH et de l’acidité en milieu lait de nos souches, ont été

observées nos souches (Lb2, Lb11, Lb1, Lb10) sont les plus acidifiante par apport les autres qui

confirme une possibilité de fermentation du lait avec la présence de factures de croissances.

L’antibiogramme des nos souches sont résistante aux antibiotiques (acide nalidixque, colistin

Sulphonamides, oxacillin, acide pipimidique). Et sensible aux antibiotiques (gentamicin, acide

clavulanique, nitroxolin, pristinamycin, chloramphenicol, amoxicillin).

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Référence

bibliographiques REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES

Références

bibliographiques

Références

bibliographiques

Annexes ANNEXES

Annexes

Annexes

Annexe MILIEUX DE CULTURE

97

Annexe

-milieu MRS (de Man Rogosa et Sharp, 1960)

o Composition (g/l) :

-extrait de levure………………………………………………………………………….……5

-extrait de viande…………………………………………………………………………..….10

-peptone……………………………………………………………………….……………....10

-acétate de sodium……………………………………………………………………………...5

-citrate de sodium………………………………………………………………...…………….2

-glucose …………………………………………………………………………..………..…20

-KH2PO4………………………………………………………………………………………..2

-MgSO4………………………………………………………………………….……….…0.25

-MnSO4……………………………………………………………………….………….…0.05

-agar……………………………………………………………………………..……………15

-eau distillée q.s.p…………………………………………………………..…………...1000ml

PH=6.8

Autoclavage 120C°pendant 20munites.

-MRS liquide tous les ingrédients de MRS solide mais sons agar.

-Milieu M17 (Terzaghi et Sandine, 1975)


Peptone de farine de soja ............................................................................................................ 5

Peptone de viande .................................................................................................................... 2.5

Peptone de caséine Trypsique ................................................................................................. 2.5

Extrait de levure ......................................................................................................................... 5

Extrait de viande ......................................................................................................................... 5

Lactose ....................................................................................................................................... 5


98

Acide ascorbique ..................................................................................................................... 0.5

Glycérophosphate de sodium ................................................................................................... 19

Sulfate de magnésium ........................................................................................................... 0.25

Agar (manque dans le bouillon) ............................................................................................... 20

Eau distillée ..................................................................................................................... 1000 ml

pH= 7.2

Autoclavage 120C°pendant 20munite

-Milieu M16 BCP (Thomas et al., 1973)


Extrait de levure ..................................................................................................................... 2,5

Extrait de viande ........................................................................................................................ 5

Lactose ...................................................................................................................................... 2

Biopolytone ............................................................................................................................... 5

Peptone papainique de soja ........................................................................................................ 5

Acide ascorbique .................................................................................................................... 0,5

Acétate de sodium ................................................................................................................... 1,8

L-Arginine ................................................................................................................................. 4

Pourpre de bromocrésol ....................................................................................................... 0,05

Eau distillée .................................................................................................................... 1000 ml

pH=6,5

Autoclavage 120C°pendant 20munite

- Milieu MRS BCP


-extrait de levure………………………………………………………………….……………5

-extrait de viande……………………………………………………………………..……….10

-peptone………………………………………………………………………………..….…..10

-acétate de sodium………………………………………………………………………..…….5

-citrate de sodium……………………………………………………………………………....2

-glucose ………………………………………………………………………………………20


99

-KH2PO4………………………………………………………………………………………..2

-MgSO4……………………………………………………………………………….….…0.25

-MnSO4………………………………………………………………………...………...…0.05

-bromocrésol pourpre …………………....………………………………………………...…15

-eau distillée q.s.p…………………………………………………………………….....1000ml

PH=7

Autoclavage 120C° pendant 20munite

-Milieux KMK (Kempler et Mc Kay ,1980)

-Extrait de levure……………………………………………………………………………..3g

-Biopolytone………………………………………………………………………………...2,5g

-Glucose………………………………………………………………………………………5g

-Agar………………………………………………………………………………………...15g

pH=6,6

Le milieu est réparti à raison de 100ml par flacon , puis autoclave 15 minutes à 120°C.

Au moment de l’emploi on ajoute :

1ml d’une solution aqueuse de ferricyanide de potassium 10%(p/v)

1ml d’une solution aqueuse à 2,5 %(v/p) de citrate ferrique et citrate de sodium (p/p)

Ces solutions sont stérilisée par filtration sur filtre millipore 0,22µm et sont conservées à

l’obscurité à 4°C.

Milieu Muller –Hinton (Muller et Hinton, 1941)

-Infusion de viande de bœuf………………………………………………….………..3000cm3

-Peptone de caséine………………………………………………………………………..17,5g

-Amidon de mais……………………………………………………………………………1,5g

-Agar-agar…………………………………………………………………………………….17

-pH=7,4


100

-Milieu Chapman

-Pepton ……………………………………………………………………………………...10g

-Extrait de viande …………………………………………………………………………….1g

-Chlorure de sodium ………………………………………………………………………...75g

-Mannitol ……………………………………………………………………………………10g

-Rouge de phenol …………………………………………………………………….….0,025g

-Agar-agar…………………………………………………………………………………...15g

-pH=7,4

Autoclavage 120°C pendant 20 minutes.

-Gélose nutritive

-Extrait de viande……………………………………………………………………………..1g

-Extrait de levure ……………………………………………………………………………..2g

-Peptone………………………………………………………………………………………5g

-Chlorure de sodium…………………………………………………………………………..5g

-Agar-agar…………………………………………………………………………………...15g

-Eau distillée ……………………………………………………………………………1000ml

-pH=7,4

Autoclavage 120°C pendant 20 minutes.

-bouillon nutritive

-Extrait de viande …………………………………………………………………………….1g

-Extrait de levure……………………………………………………………………………...2g

-Peptone………………………………………………………………………………………5g

-Chlorure de soduim…………………………………………………………………………..5g

-Eau distillée ……………………………………………………………………………1000ml

-pH=7,4


101

-Esculines

-Peptone ……………………………………………………………………………………………………………………………………...10g

-Esculine……………………………………………………………………………………………………………………………………………1g

-Citrate de fer ammoniacal ………………………………………………………………………………………………………………1g

-Agar……………………………………………………………………………………………………………………………………………….20g

pH=7,5

-Lait agar

-Agar………………………………………………………………………………………..1,5g

-Extrait de levure……………………………………………………………………………0,1g

-Eau distillée …………………………………………………………………………….96,5ml

-Autoclavage 120°C pendant 15 minutes.

-on ajoute 3,5ml de Candia silhouette et mélange bien.

-Agar au tween 80

-peptone ……………………………………………………………………………………..10g

-NaCl …………………………………………………………………………………………5g

-CaCl2*2H2………………………………………………………………………………….0,1g

-Agar………………………………………………………………………………………...20g

-Eau distillée ……………………………………………………………………………1000ml

-autoclavage 120°C pendant 20 minutes.

-2,5ml de tween 80 est stérilisé séparément puis ajouté au milieu , le pH est ajusté à 6.

-Eau physiologique

-peptone………………………………………………………………………………....…..0.5g

-chlorure de soduim……………………………………………………………………..….8.5g

-Eau distillée q.s.p………………………………………………………………….……1000ml

PH=7

Autoclavage 120C° pendant 20munite


102

-Lait écrémé

Lait écrémé……………………………………………………………………….…..…….100g

-extrait de levure……………………………………………………………………...…….0.5g

Eau distillée………………………………………………………………………………100ml

PH=7

Autoclavage 120C° pendant 20munites

Le lait de SHERMAN (Bourgeois et Leveau, 1991)

o Composition (g/l):

Lait écrémé ............................................................................................................................... 10

Extrait de levure ...................................................................................................................... 0,5

Eau distillée ..................................................................................................................... 1000 ml

pH=6,8

Pour obtenir un lait à 0,1% de bleu de méthylène, on ajoute au moment de l’emploi 1ml

de bleu de méthylène à 1% déjà stérilisé à 120°C pendant 20min. Et pour avoir un lait à 0,3%

de bleu de méthylène, on ajoute au moment de l’emploi 1ml de bleu de méthylène à 3%.

perspectives perspectives


Perspectives



Perspectives

Les bactéries lactiques ayant fait l’objet de cette études ce sont montrées

très intéressantes par rapport à la lutte contre les pathogènes responsables

des différents troubles et pathologies notamment gastriques.ces agents

microbiens peuvent être considérés comme des probiotiques, ils méritent

un suivi et une traçabilité en matière d’étude et de perspective a l’avenir

afin d’établir leur incidence en santé humaine.

Recherche des flores totales qui présences dans le margines d’olives

fermentés comme les levures, les champignons, les bactéries contaminants

(bactéries pathogènes).

Une identification par les méthodes moléculaires des souches de

lactobacilles est devenue indispensable pour compléter l’identification

phénotypique.

Résumé Résumé

RésuméLes bactéries lactiques sont utilisées depuis plusieurs siècles comme des agents protecteurs

dans les aliments fermentés. Ces bactéries sont présentes dans une grande variété d'aliments,

tel que les laits fermentés, les yaourts, les fromages, et les produits carnés fermentés. Ainsi,

différentes souches d'intérêt commercial ou scientifique y sont couramment isolées. Dans ce

travail, 32 souches de bactéries lactiques ont été isolées et identifiées à partir du margine


lactique.L’espèce la plus dominante pour ce groupe est Lactobacillus rhamnosus 63,63%.

Lactobacillus manihotivorans est aussi représenté parmi les souches isolées 36,36%. Les

lactocoques sont représentés par deux espèces qui sont Lactococcus lactis subsp. lactis

27,27% et lactococcus. lactis subsp. Diacetylactis 72,72%. Les entérococcus .

L’étude des interactions a révélé la capacité de toutes les souches à inhiber Staphylococcus

aureus. Et Escherichia coli ont montré leur capacité antagoniste envers ces deux souches par

la production de substances protéiques dans le milieu de culture. Les bactéries lactiques

isolées et identifiée montrent une capacité à inhiber les souches de Staphylococcus aureus,

Escherichia coli par la production de substances protéiques (substances antimicrobiennes)

dans le milieu de culture.

L’activité protéolytique, nous a permis de déceler que l’ensemble des souches lactiques

possédées une activité protéolytique. L’activité lipolytique est constatée toutes les souches

possède pas une activité lipolytique. Enfin l’antibiogramme des bactéries lactiques testées,

montre une sensibilité pour l’ensemble des antibiotiques

Mots clés :

Bactéries Lactiques; Margine D’olives; Lactobacillus; Lactocoques; Staphylococcus;

Escherichia Coli .Antibiogramme; Substances Antimicrobiennes; Activité Lipolytique;

Activité Protéolytique.

diversité et propriété fonctionnelles des bactéries ... · dédicaces je dédie ce modeste...

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