diversité bactérienne associée aux organes excréteurs des...

Université Paris 6 – Pierre et Marie Curie

Ecole Doctorale « Diversité du Vivant » (ED 0392)

THESE DE DOCTORAT

Présentée par

Mathieu PERNICE

Pour obtenir le grade de :

DOCTEUR de l’UNIVERSITE PARIS 6

en Biologie Intégrée des Invertébrés

Diversité bactérienne associée aux organes excréteurs des Nautiloides :

caractérisation du système symbiotique, implications évolutives et

physiologiques

à soutenir le 23 novembre 2006

Jury :

Mme Renata BOUCHER-RODONI, Chargé de Recherche, CNRS, Paris Directrice de thèse

Mme Françoise GAILL, Directeur de Recherche, CNRS, Paris Rapporteur

Mr Gilles BŒUF Professeur, Université Paris 6, Paris Rapporteur

Mme Sylvie DUFOUR, Directeur de Recherche, CNRS, Paris Examinateur

Mme Nicole DUBILIER, Associate Researcher, MPI MM (Brême, Allemagne) Examinateur

Mme Margaret MCFALL-NGAI, Professor, University of Wisconsin (Madison, USA) Examinateur

Remerciements

Cette thèse a été financée par une allocation de recherche du ministère de l’Education Nationale et de

la Recherche ainsi que par la fondation Max Planck au cours d’un fellowship « Marie Curie Training

Site for Marine Microbiology » de trois mois à l’Institut Max Planck pour la Microbiologie Marine de

Brême en Allemagne.

Merci aux rapporteurs, Françoise Gaill et Gilles Bœuf, ainsi qu’aux examinateurs, Sylvie Dufour,

Nicole Dubilier et Margaret McFall-Ngai de me faire l’honneur de juger mon travail et de m’avoir

accordé du temps.

Merci à Renata Boucher-Rodoni, ma directrice de thèse, pour m’avoir permis de travailler sur ce

modèle magnifique qu’est le Nautile, pour sa relation amicale, et pour m’avoir toujours accordé

beaucoup d’attention, de confiance et de liberté. Au cours de ces trois années, je crois avoir réussi à

apprivoiser cette liberté et c’est à mes yeux une des choses les plus importantes que j’ai apprise

pendant ma thèse.

Ce travail a été réalisé au département Milieux et Peuplements Aquatiques du Muséum National

d’Histoire Naturelle dirigé par Dominique Doumenc, et je tiens à le remercier pour m’avoir accueilli

et soutenu.

Merci à Guy Boucher et Sylvie Dufour, respectivement directeur et sous directrice de l’unité de

recherche « Biologie des Organismes Marins et Ecosystèmes» (UMR 5178), pour les moyens mis à ma

disposition ainsi que pour leurs précieux conseils et leurs directions, parfois bien au-delà du cadre

technique.

Merci à tous les membres du BOME pour l’ambiance de travail agréable que vous avez contribué à

créer, pour tous les échanges scientifiques fructueux et pour toutes les discussions professionnelles ou

non que nous avons eues. Merci donc à Laure, pour ton efficacité, ta disponibilité et ton soutien moral

(ainsi que tes interludes scientifiques…). Merci à Isabelle pour ta gentillesse, ta connaissance des

cultures cellulaires et pour avoir pris le temps de corriger l’introduction et la discussion de cette

thèse. Merci à Madeleine pour ton aide technique indispensable et tes conseils avisés en histologie.

Merci à Aude et Sébastien pour votre disponibilité et vos recettes qui nous régalent à chaque point

manip… Merci à Bernard, Pierre, Rachid, Raymond pour vos discussions (scientifiques ou non)

animées du déjeuner. Merci à Françoise et Claude pour me tenir au courant des nouvelles du sud de

la Corse. Merci à Nadia, Marie-Paule, Drissia, Alain et Véronique pour votre aide. Merci à vous tous

qui avez fait de ces trois ans passés au BOME une si belle expérience.

Merci aux stagiaires, Audrey, Aurélie, Julie qui m’ont aidé sur certaines expériences. En plus de

l’aide technique que vous m’avez apportée, vous m’avez appris qu’encadrer un stagiaire n’est pas une

mince affaire. Il faut trouver la distance juste, le niveau de confiance adapté et vous laisser exprimer

les idées et faits scientifiques avec vos mots à vous.

Merci à tous les membres de l’unité « Chimie et Biochimie des Substances Naturelles» (UMR 5154) et

en particulier à Sylvie Rebuffat, à Jean Peduzzi, à Delphine Destoumieux-Garzòn, à Séverine Zirah, à

Gérard Gastine (« LA voix du Muséum »), Sophie et Gaëlle pour m’avoir accueilli dans votre

laboratoire, m’avoir encadré, et aidé à percer un peu plus les mystères entourant les substances

bioactives des bactéries marines.

Many thanks to Nicole Dubilier who helped me during my fellowship in Bremen with her knowledge of

symbiosis and her efficiency to always find a solution to any problem. I learnt a lot in these three

months and I feel lucky for working in the “symbiosis team”. I would like to thank the people from the

MPI for their help and the great moments I had during these three months: Gaute Lavick (I will

always remember how to make a hole in a Nautilus shell!!!) and Marcel Kuypers for their help in

isotopic experiments, Sylke and Jörg for their wonderful technical assistance, Claudia, Christian,

Phyllis, Jill, Caroline for their talks at any time. Un grand merci à tous les francophones du MPI:

Karine, Florence, Julie, Anne-lyse, Sébastien (que je n’ai fait que croiser mais qui a toujours su rester

disponible à distance) pour leur accueil et leur gentillesse.

Merci à Olivier Gros pour ses compétences en microscopie électronique et pour m’avoir fait partager

sa grande connaissance de l’histologie et son goût pour les berliners !!!

Merci à Claude Courties, pour son accueil à Banyuls et ses compétences en cytomètrie en flux.

Merci à Marc Geze pour ses conseils avisés en microscopie et les bons moments passés au service de

Photobiologie du Muséum.

Merci à Jocelyne Favet du laboratoire de Bactériologie de Genève pour son amitié et son aide dans

la caractérisation physiologique des bactéries.

Merci à Raffaele Peduzzi pour ses deux formidables écoles d’été à Piora ainsi que pour son accueil

chaleureux à l’institut cantonal de microbiologie de Bellinzona en compagnie de Mauro, Antonella,

Anna-Rita et Michele.

Merci à Fabrice Colin, directeur du centre IRD de Nouméa ainsi qu’à Jean-Pascal Torreton, Olivier

Pringault, Robert Leborgne (merci de m’avoir fait un peu mieux comprendre l’océanographie du

lagon calédonien) et Jean-Lou Justine pour leur aide dans le bon déroulement des missions de récolte

en Nouvelle-Calédonie.

Merci à Pascale Joannot pour ta relation amicale et pour avoir notamment initié et soutenu le projet

de mission au Vanuatu.

A ce propos, je tiens à remercier le gouvernement de Nouvelle-Calédonie et le secrétariat permanent

pour le Pacifique pour leur soutien financier qui a été déterminant.

Merci à Alain Gerbault (le maître ès biologie du Nautile), Richard Farman, Caroline Nalo et toute

l’équipe du Darmad qui ont participé, à des titres divers, à la mise à disposition des spécimens de

Nautile et m’ont fait un peu plus découvrir les secrets du Pacifique.

Merci aux amis thésards avec qui j’ai partagé mes impressions et mes états d’âmes d’apprenti

chercheur et aussi beaucoup de moments agréables : Delphine Pichon pour ton soutien et tes conseils

technique avisés, Marc Eléaume (les soirées au labo vont bientôt nous manquer..) et Olivier Brosseau

pour nos discussions céphalopodes-échinodermes-phylogénie et toutes les autres, Marjolaine

Matabos, Denis Duplat, Jerôme Murienne pour leur amitié continue, Sveva Grigioni que je n’ai fait

que croiser mais qui a su initier avec Renata Boucher-Rodoni tout ce travail sur les symbioses

bactériennes chez les céphalopodes au sein du BOME.

Merci aux amis, Lio, Fab, Eric, Mathieu, Morgan, Julien (sans qui je ne serai jamais venu à bout des

600m de sac de nœuds.. ) et tous les autres…

Merci enfin à toute ma famille qui a cru en moi et m’a soutenu contre vents et marées,

Je dédie cette thèse à mon grand-père paternel qui s’est éclipsé peu avant que j’entame ce long

chemin et qui m’a beaucoup appris par sa rigueur et son sens artistique.

Merci à vous mes parents sans qui je n’aurais jamais rien fait et à qui je dois ma volonté, mon goût du

travail et de l’effort. Vous avez su éveiller mon désir de découvrir, d’observer et de comprendre la

mer très tôt en m’emmenant voguer sur la Méditerranée à bord du Fatu-Hiva. Merci d’avoir

accompagné mes doutes et mes enthousiasmes et d’avoir su être présents à tout moment.

Merci à toi Seb, pour la complicité qui nous unit, pour m’avoir supporté et soutenu pendant toutes ces

années, ton rôle dans le bon déroulement de cette thèse a été primordial. J’ai beaucoup de chance de

t’avoir pour frère.

Et à Fleur, pour avoir partagé tous ces moments avec moi et pour en partager encore…toujours

Table des matières

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Table des matières Introduction générale................................................................................................. 9 Chapitre I – Contexte général de l’étude................................................................... 15 1 – « la Planète des bactéries » (Jay-Gould, 1996) ................................................... 17 1.1 – Une diversité métabolique indispensable......................................................... 17 1.2 – Un océan de bactéries…................................................................................... 18 2 – La symbiose......................................................................................................... 20 2.1 – Définition ......................................................................................................... 20 2.2 – « La symbiose comme source de nouveauté » (Maynard Smith, 1989) .......... 21 2.3 – Les symbioses bactériennes chez les céphalopodes......................................... 24 2.3.1 – Symbioses des organes lumineux.................................................................. 25 2.3.2 – Symbioses des glandes nidamentaires accessoires........................................ 25 Chapitre II – Le Nautile : un modèle à part.............................................................. 27 1 – Evolution et adaptations morphologiques ........................................................... 29 1.1 – Histoire évolutive des céphalopodes : « Nautilus, le survivant » (Boyle & Rodhouse, 2005)........................................................................................ 29 1.2 – Structure et principales adaptations morphogiques.......................................... 30 1.2.1 – Une coquille en guise de « flotteur »............................................................. 31 1.2.1.1 – Structure de la coquille............................................................................... 31 1.2.1.2 – Flottabilité ................................................................................................. 31 1.2.1.3 – Ajustements du contenu en liquide et gaz de la coquille ........................... 33 1.2.2 – Un organe de locomotion permettant une grande manoeuvrabilité .............. 34 1.2.3 – Des tentacules sans ventouses mais avec de nombreuses fonctions ............. 34 1.2.4 – Quatre branchies pour un métabolisme différent .......................................... 34 1.2.5 – Des yeux dépourvus de cristallin .................................................................. 35 2 – Ecologie et Biologie ............................................................................................ 35 2.1 – Distribution géographique et diversité spécifique............................................ 35 2.2 – Distribution bathymétrique, nourriture et prédation ........................................ 36 2.3 – Reproduction et développement....................................................................... 38 3 – Physiologie .......................................................................................................... 39 3.1 – « Un métabolisme à toute épreuve» (Boutilier et al, 1996) ............................. 39 3.2 – Digestion .......................................................................................................... 41 3.3 –Excrétion .......................................................................................................... 41 3.3.1 – Le système excréteur..................................................................................... 42 3.3.2 – Fonctionnement du système excréteur .......................................................... 43 3.3.3 – Une originalité physiologique, évolutive et…symbiotique ?........................ 43 Chapitre III – Identification, Localisation et Quantification des symbiotes bactériens chez deux espèces de Nautiles : implications physiologiques et évolutives .................................................................................................................. 45 1 – Objectifs généraux de l’étude ............................................................................. 47

Table des matières

2

2 – Origine des échantillons et campagnes .............................................................. 49 3 – Méthodes ............................................................................................................ 49 3.1 – Caractérisation de la diversité bactérienne....................................................... 51 3.1.1 – L’ARNr 16S comme marqueur moléculaire ................................................. 51 3.1.2 – Tests statistiques............................................................................................ 53 3.1.3 – Analyses phylogénétiques ............................................................................. 53 3.1.4 – Gènes fonctionnels ........................................................................................ 54 3.2 – Etude de la distribution des bactéries par la technique de CARD-FISH ......... 55 3.3 – Quantification des bactéries par cytomètrie en flux......................................... 57 3.4 – Isolement des bactéries en culture pure............................................................ 57 3.5 – Screening des souches à activité antimicrobienne et caractérisation des substances bioactives................................................................................................. 58 3.5.1 – Détection des activités antimicrobiennes ...................................................... 58 3.5.2 – Extraction, concentration et caractérisation des substances bioactives........ 60 3.6 – Etude du métabolisme du complexe symbiotique par la méthode d’incubations et analyses isotopiques ....................................................................... 62 3.7 – Co-culture des cellules de Nautile et bactéries associées................................. 63 4 - Résultats .............................................................................................................. 64 4.1 – Mise en évidence et caractérisation d’une double symbiose dans les organes excréteurs de N. macromphalus ................................................................................ 64 Article : Enigmatic dual symbiosis in the excretory organ of Nautilus macromphalus (Cephalopoda : Nautiloidea) ..................................................................................... 67 4.2 – Développement d’un modèle cellulaire de l’association N. macromphalus- bactérie ...................................................................................................................... 95 Article : Primary co-culture as a complementary approach to explore the diversity of bacterial symbionts in marine invertebrates : the example of Nautilus macromphalus (Cephalopoda : Nautiloidea) .............................................. 97 4.3 – Activité métabolique des symbiotes bactériens chez N. macromphalus.......... 106 4.3.1 – Recherche et séquençage de gènes fonctionnels codant pour des enzymes impliquées dans la nitrification et la dénitrification bactérienne .............................. 106 4.3.2 – Implication des symbiotes bactériens dans le métabolisme azoté................. 107 4.3.2.1 – Mesure de l’activité métabolique des symbiotes bactériens dans un milieu enrichi en nitrates (NO3

-) ............................................................................... 107 4.3.2.2 – Mesure de l’activité métabolique des symbiotes bactériens dans un milieu enrichi en ammonium (NH4

+) et en nitrates (NO3-) ....................................... 109

4.4 – Etude comparative de la diversité bactérienne associée à N. pompilius sur deux sites de collecte : spécificité de la symbiose et influence des facteurs biogéographiques ...................................................................................................... 111 4.4.1 – Influence des facteurs biogéographiques sur la caractérisation moléculaire des symbiotes de N. pompilius ................................................................................ 112 4.4.2 – Les symbiotes bactériens présents chez N. pompilius aux Philippines et au Vanuatu possèdent la même distribution spatiale ................................................ 113

Table des matières

3

4.5 – Activités antimicrobiennes des souches isolées de N. pompilius (Philippines): rôle potentiel dans la colonisation et l’écologie microbienne des organes symbiotiques ............................................................................................................. 115 Article ‘Identification of a Vibrio strain producing antimicrobial agents in the excretory organs of Nautilus pompilius (Cephalopoda, Nautiloidea) ................ 117 4.6 – Caractérisation des substances bioactives responsables de l’activité antimicrobienne des vibrios isolées de N. pompilius ................................................ 142 4.6.1 – Mise en évidence de la présence de plusieurs fractions avec une activité antimicrobienne par purification sur HPLC .............................................................. 142 4.6.2 – Les substances bioactives responsables de l’activité antimicrobienne des vibrios ne sont pas de nature peptidique ................................................................... 143 Chapitre IV – Discussion générale, conclusions et perspectives .............................. 147 1 – Diversité bactérienne associée à différentes espèces de Nautiloides .................. 149 2 – Evolution des symbioses des Nautiloides ........................................................... 150 3 – Transmission des symbiotes bactériens............................................................... 152 4 – Eco-physiologie du système symbiotique ........................................................... 155 5 – Synthèse .............................................................................................................. 158 Bibliographie............................................................................................................. 161 Annexes..................................................................................................................... 183 Liste des encadrés et planches photo Encadré 1 : Le cycle de l’azote en milieu océanique ................................................ 19 Encadré 2 : Exemples d’interactions symbiotiques liées à la fixation d’azote ......... 23 Encadré 3 : Rôle de l’azote dans le contrôle de la flottabilité chez les céphalopodes ............................................................................................................. 32 Planche photo 1 (Nautile).......................................................................................... 40 Encadré 4 : Diversité des bactéries ........................................................................... 52 Encadré 5 : Les interactions microbiennes, source de substances bioactives ........... 59 Planche photo 2 (De Nouméa à Brême…)................................................................ 193 Planche photo 3 (A la pêche aux nautiles au milieu de Pacifique…) ....................... 194

Table des matières

4

Table of contents

5

Table of contents General introduction.................................................................................................. 9 Chapter I – General background of the study ........................................................... 15 1 –“Planet of the bacteria” (Jay-Gould, 1996) .......................................................... 17 1.1 – An essential metabolic diversity ...................................................................... 17 1.2 – An ocean of bacteria…..................................................................................... 18 2 – Symbiosis ............................................................................................................ 20 2.1 – Definition ......................................................................................................... 20 2.2 – “Generating novelty by symbiosis” (Maynard-Smith, 1989)........................... 21 2.3 – Bacterial symbiosis in Cephalopods ................................................................ 24 2.3.1 – Symbioses in light organs ............................................................................. 25 2.3.2 – Symbioses in accessory nidamental glands................................................... 25 Chapter II – Nautilus : an original model................................................................. 27 1 – Morphological evolution and adaptations ........................................................... 29 1.1 – Evolution of Cephalopods : « nautilus, the survivor » (Boyle & Rodhouse, 2005)........................................................................................ 29 1.2 – Structure and main morphological adaptations................................................ 30 1.2.1 – A shell for buoyancy ..................................................................................... 31 1.2.1.1 – Shell structure............................................................................................. 31 1.2.1.2 – Buoyancy ................................................................................................... 31 1.2.1.3 – Adjustments of liquid and gas content in the shell..................................... 33 1.2.2 – A locomotion organ allowing important manoeuvrability............................ 34 1.2.3 – Tentacles without suckers but with several functions................................... 34 1.2.4 – Four gills for a different metabolism............................................................. 34 1.2.5 – Eyes without lens .......................................................................................... 35 2 – Ecology and Biology........................................................................................... 35 2.1 – Geographical distribution and specific diversity.............................................. 35 2.2 – Bathymetric distribution, food and predation .................................................. 36 2.3 – Reproduction and development........................................................................ 38 3 – Physiology........................................................................................................... 39 3.1 – “Nautilus, the art of metabolic maintenance” (Boutilier, 1996) ...................... 39 3.2 – Digestion .......................................................................................................... 41 3.3 –Excretion .......................................................................................................... 41 3.3.1 – The excretory system .................................................................................... 42 3.3.2 – How the excretory system works ................................................................. 43 3.3.3 – A physiological, evolutionary and… symbiotic originality? ........................ 43 Chapter III – Identification, Localisation and Quantification of bacterial symbionts in two nautilus species : physiological and evolutionary: implications... 45 1 – General Objectives of the study ......................................................................... 47

Table of contents

6

2 – Origin of the samples and field trips .................................................................. 49 3 – Methods .............................................................................................................. 49 3.1 – Characterisation of bacterial diversity.............................................................. 51 3.1.1 – 16S rRNA as a molecular marker ................................................................. 51 3.1.2 – Statistical tests ............................................................................................... 53 3.1.3 –Phylogenetic analyses .................................................................................... 53 3.1.4 – Functional genes............................................................................................ 54 3.2 –Study of bacteria distribution by CARD-FISH................................................. 55 3.3 – Bacteria quantification by flow cytometry....................................................... 57 3.4 – Bacteria isolation on culture media.................................................................. 57 3.5 – Screening of antimicrobial active strains and characterisation of bioactive substances.................................................................................................................. 58 3.5.1 – Detection of antimicrobial activities ............................................................. 58 3.5. 2 – Extraction, concentration and characterisation of bioactive substances ..... 60 3.6 – Study of the symbiotic complex metabolism by organ incubation and isotopic analyses........................................................................................................ 62 3.7 – Co-culture of nautilus cells and associated bacteria......................................... 63 4 - Results ................................................................................................................. 64 4.1 – Characterisation of a dual symbiosis in the excretory organs of N. macromphalus ...................................................................................................... Article : Enigmatic dual symbiosis in the excretory organ of N. macromphalus (Cephalopoda : Nautiloidea) ..................................................................................... 67 4.2 – Development of a cellular model of the association N. macromphalus-bacteria ........................................................................................ 95 Article : Primary co-culture as a complementary approach to explore the diversity of bacterial symbionts in marine invertebrates : the example of Nautilus macromphalus (Cephalopoda : Nautiloidea) .............................................. 97 4.3 – Metabolic activity of bacterial symbionts in N. macromphalus....................... 106 4.3.1 – Detection and sequencing of functional genes involved in Nitrogen metabolism ................................................................................................................ 106 4.3.2 – Implication of bacterial symbionts in Nitrogen metabolism......................... 107 4.3.2.1 – Measure of bacterial symbionts metabolic activity in a nitrate(NO3

-) enriched medium....................................................................................................... 107 4.3.2.2 – Measure of bacterial symbionts metabolic activity in an ammonia (NH4

+) and nitrate(NO3

-) enriched medium ......................................................................... 109 4.4 – Comparative study of the bacterial diversity associated to N. pompilius from two different locations: specificity of symbiosis and influence of biogeographical factors ........................................................................................................................ 111 4.4.1 – Influence of biogeographical factors on the molecular characterisation of N. pompilius symbionts........................................................................................ 112 4.4.2 – Bacterial symbionts in N. pompilius from Philippines and from Vanuatu have the same distribution......................................................................................... 113 4.5 – Antimicrobial activities of strains isolated from N. pompilius (Philippines): potential role in colonisation and microbial ecology of symbiotic organs ............... 115

Table of contents

7

Article ‘Identification of a Vibrio strain producing antimicrobial agents in the excretory organs of Nautilus pompilius (Cephalopoda, Nautiloidea) ................ 117 4.6 – Characterisation of bioactive substances responsible of antimicrobial activity of vibrios isolated from N. pompilius........................................................................ 142 4.6.1 – HPLC purification shows that several fractions have an antimicrobial activity....................................................................................................................... 142 4.6.2 – The bioactive substances responsible for vibrios antimicrobial activity are not peptides ............................................................................................................... 143 Chapitre IV – General discussion, conclusions and perspectives ............................. 147 1 – Bacterial diversity among various nautilus species ............................................ 149 2 – Evolution of symbiosis in Nautiloids .................................................................. 150 3 – Symbiosis transmission to the next generation .................................................. 152 4 – Ecophysiology of the symbiotic system.............................................................. 155 5 – Conclusion........................................................................................................... 158 Bibliography.............................................................................................................. 161 Appendix ................................................................................................................... 183 List of boxes Box 1 : Nitrogen cycle in Ocean ............................................................................... 19 Box 2 : Symbiotic interactions involved in Nitrogen fixation .................................. 23 Box 3 : Role of Nitrogen in the control of cephalopods buoyancy........................... 32 Picture box 1.............................................................................................................. 40 Box 4 : Diversity of bacteria ..................................................................................... 52 Box 5 : Microbial interactions as a source of bioactive compounds......................... 59 Picture box 2.............................................................................................................. 193 Picture box 3.............................................................................................................. 194

Table of contents

8

Introduction générale

9



10


11


Comme l’a souligné Stephen Jay Gould (1996), nous vivons à l’âge des bactéries. Elles

furent les premiers organismes vivants sur notre planète, s’installent partout où la vie est

possible, plus nombreuses que n’importe quels autres types d’organismes et constituant

probablement le composant le plus important de la biomasse sur Terre (Prescott et al, 2003).

L’influence des micro-organismes sur le monde vivant s’exerce de manière indirecte par la

métabolisation des nutriments présents dans l’environnement (Azam, 2001) mais aussi, de

manière plus directe, par la maintenance d’étroites associations avec les organismes au cours

des générations (McFall-Ngai, 1998). En effet, le fourmillement de vie bactérienne présent

dans tous les compartiments de la biosphère est une contrainte d’adaptation importante pour

les autres organismes (McFall-Ngai, 2002) et les interactions symbiotiques avec les bactéries

semblent avoir joué un rôle capital dans l’évolution de la vie (Maynard Smith & Szathmáry,

1999) en étant, notamment, à l’origine de la cellule eucaryote (Margulis, 1993).

Au cours des deux dernières décennies, l’étude des symbioses bactériennes a connu un

essor rapide et a permis la caractérisation de nouvelles associations symbiotiques au sein de

nombreux phylums (Douglas, 1994; Dale et al, 2001 ; Kushmaro et al, 1996; Graf, 1999 ;

Hansen & Olafson, 1999, pour revue voir McFall-Ngai, 2002). Cependant, aujourd’hui

encore, il semble difficile de préciser la fonction d’un grand nombre de ces associations ainsi

que leur rôle exact dans l’évolution des organismes vivants. A cet égard, l’étude des lignées

animales d’origine ancestrale peut fournir des informations importantes sur l’influence des

symbioses bactériennes dans des adaptations évolutives majeures. Dans ce contexte, les

associations bactériennes abritées au sein des organes excréteurs des Nautiloides (Schipp et al,

1985, 1990) s’avèrent être d’un intérêt tout particulier pour différentes raisons : d’un point de

vue évolutif, ces animaux sont les représentants de la lignée la plus ancienne des

Céphalopodes dont l’origine remonte à près de 500 millions d’années (Ward, 1987) ; et d’un

point de vue physiologique, le système excréteur des Nautiles présente des caractéristiques

uniques au sein des Céphalopodes qui semblent être le fruit d’adaptations majeures à leur

mode de vie (Denton, 1974 ; Martin, 1983 ; Schipp et al, 1985). Ainsi, l’étude des interactions

symbiotiques dans les organes excréteurs des Nautiloides peut permettre de mieux

comprendre l’influence des bactéries dans l’incroyable « succès évolutif » de cette lignée.

L’analyse du rôle des bactéries dans l’adaptation des organismes concerne des domaines

scientifiques et techniques variés (évolution, écologie, physiologie, biologie cellulaire,


12

biologie moléculaire…) et doit donc bénéficier d’approches pluridisciplinaires (McFall-Ngai,

2002). Jusqu’ici les symbiotes bactériens hébergés par les organes excréteurs des Nautiles

n’avaient été l’objet que d’observations en microscopie électronique (Schipp et al, 1990). Le

premier objectif de cette étude a donc été la caractérisation phylogénétique de la diversité

bactérienne associée à N. macromphalus afin d’apporter de nouvelles informations concernant

la spécificité et l’histoire évolutive de ce système symbiotique.

Le second objectif se place dans un contexte écologique et a concerné l’analyse de la

répartition spatiale des symbiotes bactériens à l’intérieur de l’hôte et de leur contribution à sa

physiologie. Cet objectif a été mené en deux temps avec tout d’abord, l’exploration de la

distribution spatiale des bactéries in situ afin de tester l’hypothèse d’une structuration des

populations symbiotiques en relation avec l’organisation fonctionnelle de l’organe hôte. Puis

dans un deuxième temps, l’étude s’est focalisée sur les activités métaboliques des populations

bactériennes afin d’évaluer l’implication des symbiotes dans la physiologie du Nautile. La

gestion des déchets azotés semblant être une adaptation majeure des céphalopodes à leur

mode de vie (Denton, 1974 ; Boucher-Rodoni & Mangold, 1994), l’étude physiologique s’est

principalement concentrée sur le métabolisme azoté des symbiotes bactériens.

Les travaux menés au cours de cette thèse ont porté sur une espèce endémique de

Nouvelle-Calédonie, Nautilus macromphalus, et une espèce cosmopolite, Nautilus pompilius,

dont la distribution couvre la majeure partie de la zone Indo-Pacifique (depuis la mer

d’Andaman jusqu’aux Iles Fidji ; Norman, 2000). Ces deux espèces abritent des bactéries

symbiotiques dans leur système excréteur (Schipp et al, 1990) ce qui a permis de conduire des

études comparatives et d’analyser les facteurs biogéographiques sur ces symbioses.

Le troisième objectif de cette thèse a donc ciblé la description comparative de la diversité

bactérienne associée à ces deux espèces de Nautile afin de déceler des différences potentielles

au sein des populations de bactéries. Dans le cas d’une transmission environnementale, la

sélection d’une bactérie est généralement contrôlée par les barrières imposées par le système

immunitaire de l’hôte mais aussi plus ponctuellement par des phénomènes de compétition

entre bactéries (Prescott et al, 2003; Bultman et al, 1998). Dans le but de déterminer si la

présence de certaines bactéries pouvait être liée à des phénomènes de compétition au sein du

système symbiotique, le potentiel antimicrobien des souches bactériennes associées aux deux

espèces de Nautile a été évalué et les substances bioactives produites, caractérisées à l’aide de

différentes méthodes biochimiques.

Enfin, un quatrième objectif a consisté à développer un protocole de mise en culture et

maintenance des bactéries symbiotiques en présence des cellules d’appendices péricardiques


13

de N. macromphalus. Dans l’avenir, un tel outil pourrait s’avérer particulièrement intéressant

dans la perspective d’étudier les processus complexes qui régissent la reconnaissance

hôte/symbiotes au niveau cellulaire.

Le premier chapitre de ce manuscrit présente le contexte général de l’étude c'est-à-dire

d’une part l’omniprésence des bactéries et l’importance de leur rôle dans les grands cycles

biogéochimiques puis d’autre part, la symbiose bactérienne en tant que facteur d’adaptation et

son importance dans le milieu marin et plus particulièrement chez les céphalopodes.

Le second chapitre se concentre sur le Nautile et expose l’originalité de ce modèle

biologique en tant qu’hôte du fait de ses caractéristiques évolutives, écologiques et

physiologiques.

Le troisième chapitre présente les objectifs du travail, l’approche méthodologique utilisée

et les manuscrits correspondants aux résultats obtenus.

Le chapitre quatre discute les principaux résultats concernant la diversité, l’évolution, la

transmission et le potentiel métabolique des bactéries symbiotiques associées aux Nautiloides

et propose des perspectives de recherche pour les travaux futurs.


14

Chapitre I : Contexte général de l’étude

15

Chapitre I :

Contexte général de l’étude


16


17

Chapitre I – Contexte général de l’étude

1. “La planète des bactéries” (Jay Gould, 1996) Comme le décrit S. Jay Gould (1996) notre planète a toujours été dans « l'Âge des

Bactéries » depuis que les premiers fossiles -des bactéries bien

sûr- furent ensevelis dans des roches stratifiées appelées

stromatolithes, il y a plus de 3 milliards d'années (Figure 1). Les

bactéries ont été et sont toujours les formes dominantes de vie sur

la Terre. Notre faiblesse à saisir ce fait biologique pourtant

évident provient en grande partie de leur taille microscopique

(Thiomargarita namibiensis, la plus grande bactérie du monde

atteint la taille maximale de 750 µm). Pourtant, les bactéries sont

présentes dans toute la biosphère : des hautes couches de

l'atmosphère aux plus grandes profondeurs de l'océan et

démontrent une incroyable diversité (voir Chapitre III.3, Encadré 4, page 52).

1.1 Une diversité métabolique indispensable

Ce sont les réactions de production d’énergie qui illustrent le mieux l’adaptabilité

extraordinaire des bactéries (Neidhardt et al, 1990). En effet, au cours de leur croissance et de

leur métabolisme, les micro-organismes peuvent produire de la matière organique par

réduction du carbone inorganique (autotrophie) ou se nourrir de constituants organiques

préexistants d'origine animale ou végétale (hétérotrophie) (Tableau 1). Sources de carbone

Autotrophes CO2 principale source de carbone biosynthétique

Hétérotrophes Molécules organiques préformées provenant d’autres organismes

Sources d’énergie Phototrophes Lumière

Chimiotrophes Oxydation de composés organiques et inorganiques

Sources d’éectrons

Lithotrophes Molécules inorganiques réduites

Organotrophes Molécules organiques

Elles peuvent de plus capturer l’énergie radiante du soleil (phototrophie) ou oxyder des

molécules organiques (organotrophie) pour libérer de l’énergie et disposent de deux sources

Tableau 1 : Source de carbone, d’énergie et d’électrons existants chez les bactéries (modifié de Prescott et al, 2003)

Figure 1 : Les stromatolithes de Shark Bay en Australie


18

d’électrons potentielles: les molécules inorganiques réduites (lithotrophie) ou l’oxydation de

composés organiques (organotrophie). Par leur incroyable potentiel métabolique, les bactéries

procèdent à un formidable recyclage biogéochimique des nutriments auquel participent tous

les éléments cruciaux à la vie. Ainsi, grâce à l’intervention des bactéries, le carbone, le soufre,

l’azote, le phosphore, le fer et le manganèse reviennent à une forme utilisable par les

organismes supérieurs (Margulis & Sagan, 1997). Tous les cycles biogéochimiques sont reliés

entre eux et les transformations métaboliques de ces nutriments ont des impacts au niveau

planétaire (Figure 2).

1.2 Un océan de bactéries…

En occupant plus de 70% de la surface du globe, les écosystèmes marins représentent une

partie prépondérante de la biosphère au sein de laquelle l'omniprésence et le rôle de bactéries

n’ont été documentés que depuis une trentaine d’années (Jay Gould, 1996). Pourtant, de toute

évidence, leur biomasse y est très importante (plus de 90% des surfaces biologiques de la mer

des Sargasses seraient habitées par des bactéries ; Fuhrman et al, 1992) et elles y influencent

profondément les grands cycles biogéochimique du carbone, du soufre et notamment celui de

l’azote qui sera traité plus particulièrement au cours de ce travail (Kettle & Andreae, 2000 ;

Kuypers et al, 2003; Wingenter et al, 2004; Wagner & Biebl, 2006 ; voir Encadré 1, page 19 ).

Figure 2 : Une vue cosmique du recyclage des minéraux chez les micro-organismes, les organismes supérieurs et le monde chimique non-vivant (extrait de Prescott et al, 2003).


19

Encadré 1 : Le cycle de l’azote en milieu océanique La fixation de l’azote gazeux, ainsi que la disponibilité des composés azotés (nitrate,

nitrite et ammonium) et leur recyclage par les deux grands processus biochimiques intervenant dans le cycle de l’azote (nitrification et dénitrification, Figure 3) limite la production primaire dans de nombreuses régions océaniques du monde (Fallowski, 1997).

Lors du processus de dénitrification, qui est considéré comme la forme prévalente de perte des composés azotés « fixables » en milieu marin (Galloway et al, 1995) le nitrate est utilisé par des bactéries hétérotrophes dénitrifiantes comme oxydant dans la respiration anaérobie pour être réduit en azote gazeux dans un processus à étapes multiples, auquel participent quatre enzymes : la nitrate réductase, la nitrite réductase, la réductase de l’oxide nitrique et la réductase de l’oxide nitreux.

NO3

- NO2- NO N2O N2

Cependant, des intermédiaires transitoires à la chaîne de réactions comme le NO2

- (nitrite) ou le N2O (oxyde nitreux) peuvent aussi s’accumuler (Albrecht et al, 1997 ; Hunt et al, 2003). De plus, deux types de nitrites réductases peuvent catalyser la formation de NO chez les bactéries. L’une est codée par le gène nirS et contient les cytochrome oxydases c et d1 (par exemple chez Pseudomonas aeruginosa), l’autre est codée par le gène nirK et s’identifie à une protéine à cuivre (par exemple chez Alcaligenes).

Le processus de nitrification se déroule, quant à lui, en conditions aérobies, et repose sur

l’activité d’au moins deux genres différents de bactéries chimiolithoautotrophes. Dans un premier temps, l’ion ammonium (NH4

+) est oxydé en nitrite (NO2-) par des bactéries

nitrifiantes du genre Nitrosomonas et Nitrosococcus. L’oxydation du nitrite en nitrate (NO3-)

dépend de l’activité d’autres bactéries du genre Nitrobacter ou des micro-organismes chimiolithoautotrophes apparentés. Lorsque les deux genres travaillent ensemble, l’ammonium (NH4

+) est ainsi directement oxydé en nitrate (NO3-).

La découverte récente de bactéries apparentées aux Planctomycetes combinant nitrification et dénitrification anaérobie, et oxydant ainsi l’ion ammonium en N2O et N2 à de faibles teneurs en oxygène (réaction connue sous le nom d’anammox ; Strous et al, 1999 ; Thamdrup & Dalsgaard, 2002) a ouvert de nouvelles perspectives en montrant que ce processus pouvait être à l’origine de près de 40% des pertes de matière azotée dans certaines zones océaniques (Kuypers et al, 2003). Ainsi, au fur et à mesure que s’étoffent nos connaissances du cycle de l’azote, il apparaît que le cycle simple des anciens manuels ne constitue plus une représentation précise des processus biogéochimiques naturels.

Nitrate réductase Nitrite réductase

Réductase de l’oxide nitrique

Réductase de l’oxide nitreux

Figure 3 : Cycle d’azote en milieu océanique (d’après M. Kuypers).


20

Un exemple frappant du rôle prépondérant de cette « biosphère cachée » (Kerr, 1997)

reste la découverte, à la fin des années 1970, à plusieurs milliers de mètres sous les océans

dans l’obscurité la plus totale et sans aucun apport de matière organique, de communautés

animales d’une incroyable densité associées aux sources hydrothermales (Lonsdale, 1977). En

effet, ces écosystèmes sont basés sur une production primaire assurée par des bactéries

chimiosynthétiques qui vivent libres ou en symbiose avec les organismes et qui sont capables

d’exploiter l’énergie chimique contenue dans des composés réduits des fluides hydrothermaux

pour assurer la fixation du carbone (Felbeck et al, 1981 ; pour revue voir Duperron, 2006).

Les sites hydrothermaux forment ainsi un exemple spectaculaire de l’importance que peuvent

avoir les bactéries, et leurs associations avec les organismes supérieurs, dans les écosystèmes

océaniques. Toutefois, on sait aujourd’hui que de telles associations symbiotiques sont en fait

très répandues dans le milieu naturel et ont joué un rôle clé à certains moments de l’évolution,

en modifiant profondément la structure et le « destin de l’arbre de la vie » (Combes, 2001).

2. La symbiose 2.1 Définition

En 1879, l’auteur du terme symbiose, l’Allemand Anton De Bary définit sous ce vocable

toute forme d’association permanente entre deux organismes distincts durant au moins une

partie de leur cycle vital (De Bary, 1879). Cette définition a longtemps été discutée car elle

évoque en fait un contact physique durable entre deux organismes et ne donne aucune

information sur le type d’interaction existant et les bénéfices qui lui sont associés. Les

interactions symbiotiques peuvent ainsi être positives (elles n’engagent alors que des

bénéfices : mutualisme, protocoopération et commensalisme) ou négatives (elles engagent

alors des bénéfices mais aussi des coûts : prédation, parasitisme, amensalisme et compétition)

(Figure 4).

La fantastique diversité du vivant fait que dès que des espèces différentes s’associent, la

discrimination entre les coûts et les bénéfices devient complexe, le bénéfice observé étant un

bénéfice net, bilan entre les bénéfices bruts et les coûts bruts (Smith, 1992). Ainsi, la

distinction entre les différents types d’interactions peut devenir un véritable casse tête

(Combes, 2001), ce qui conduit généralement les auteurs à utiliser le terme symbiose dans son

sens original, les partenaires étant discriminés par leur taille, le plus « grand » étant l’hôte et

le plus « petit » le symbiote (Smith & Douglas, 1987). Au cours de ce travail, les termes

d’hôte et de symbiote seront employés dans ce contexte général.


21

Pour s'associer à l'hôte, les symbiotes disposent de deux modes de transmission :

• vertical : le transfert de l'hôte à sa progéniture se fait par héritage parental

• horizontal : la transmission se fait par réinfection à chaque génération par le milieu

environnant.

Le mécanisme de transmission verticale se retrouve fréquemment dans les interactions de type

mutualistes mais reste assez rare chez les parasites (Combes, 1995).

2.2 La symbiose comme source de nouveauté (Maynard Smith, 1989)

Comme le souligne J. Maynard Smith (1989), en autorisant la réunion de deux

informations génétiques en provenance de deux sources indépendantes, la symbiose permet

non seulement de pallier à d’éventuelles carences mais aussi de générer de la nouveauté. En

effet, dans une association symbiotique, quelle que soit la nature des interactions, les

informations génétiques de deux espèces peuvent interagir de différentes manières et conduire

à des transformations importantes:

Figure 4 : Les différents types d’interactions symbiotiques. Caractéristiques fondamentales des interactions positives (+) et négatives (-) qui existent entre différents organismes (modifié de Prescott et al, 2003).


22

• Croisement d’information : les informations génétiques des deux espèces participent à

des degrés divers à la réalisation du phénotype de l’autre, en étendant son expression

dans le phénotype du partenaire, c’est ce que R. Dawkins a appelé le « phénotype

étendu » (Dawkins, 1982). Ce type d’interactions peut donner lieu à des exemples

spectaculaires dans la nature comme la formation des nodules racinaires chez les

légumineuses (voir Encadré 2, page 23)

• Echange d’information : les informations génétiques des deux espèces interagissent

directement en échangeant des séquences d’ADN. Un exemple marquant généré par ce

type d’interactions est l’association symbiotique entre le mollusque Elysia chlorotica

et les chloroplastes de l’algue Vaucheria litorea qui sont acquis par le mollusque au

cours de ses repas (Rumpho et al, 2000). Malgré l'absence de leur habitat algal, les

chloroplastes peuvent continuer à photosynthétiser dans la limace de mer pendant près

de 10 mois. En effet, un transfert génétique semble avoir permis au mollusque

d’acquérir des gènes issus de l’algue qui sont essentiels au maintien de l’activité des

chloroplastes (Pennisi, 2006).

La transformation la plus spectaculaire initiée par une association symbiotique est sans

conteste celle de la cellule eucaryote. En effet, les mitochondries et les chloroplastes ne sont

en fait rien d’autres que des bactéries parfaitement intégrées à la cellule eucaryote (Figure 5 ;

Margulis, 1991).

A B

Figure 5, A : Schéma illustrant l’évolution des trois grands domaines du vivant. B : L’origine de la cellule eucaryote selon la théorie des endosymbioses successives développée par L. Margulis (extrait de Lopez-Garcia &Moreira, 1999).


23

Encadré 2 : Exemples d’interactions symbiotiques liées à la fixation d’azote

L’azote est un des quatre constituants essentiels de la matière vivante et aucun eucaryote ne possède les gènes de la nitrogénase permettant de le fixer sous forme gazeuse (N2) pour le transformer en ammoniac (NH3), ultérieurement incorporable aux protéines (Combes, 1995). La symbiose Légumineuse-Rhizobium

Lorsque la racine d’une légumineuse en grandissant rencontre les bactéries Rhizobiums, elle les incorpore dans des nodules racinaires (Figure 6) et c’est là que se fait ensuite la fixation de l’azote (Pagan et al, 1975). Dans cette association symbiotique des Légumineuses avec les Rhizobiums, c’est un ensemble d’enzymes, codées par une vingtaine de gènes qui permet aux bactéries fixatrices d’azote de procéder à cette réaction (Orme-Johnson, 1985).

Cet exemple illustre remarquablement le croisement d’informations qui peut être généré par une symbiose (concept du « phénotype étendu » de Dawkins, 1982 ; voir page précédente). Il y a non seulement échange de produits, mais il s’établit également un dialogue entre les partenaires, sous la forme d’une série de signaux moléculaires. Brièvement, les cellules pilifères des racines de légumineuses émettent des substances chimiques de reconnaissance (flavonoïdes) qui attirent les bactéries et provoquent chez elles l’expression d’une série de gènes (nod) (Broughton et al, 2001). Ces gènes codent pour des protéines qui sont reconnues par les cellules pilifères des légumineuses et provoquent alors une série de changements dans la racine hôte permettant la formation du nodule racinaire. Ce type d’associations symbiotiques existe chez d’autres plantes supérieures avec des actinomycètes (Frankia) et des cyanobactéries (Anoeboena). La symbiose Termite-bactérie

Les termites ont un régime alimentaire particulièrement pauvre en azote (seulement 0,05% du bol alimentaire chez certaines espèces), qui a mené beaucoup d'espèces à acquérir une microflore bactérienne importante dans leur tube digestif (Figure 7) afin notamment d’augmenter leur disponibilité en azote (Lilburn et al, 2001). L’interaction symbiotique avec ces bactéries (spirochètes et bacteroides, notamment) permet non seulement le recyclage des produits azotés liés à l’excrétion (acide urique) (Potrikus & Breznak, 1981) mais aussi l'acquisition d’azote nouveau par la fixation de N2. Cela pourrait ainsi fournir plus de 60 % des besoins azotés des termites (Tayasu et al, 1994). Des interactions bactériennes similaires ont été mises en évidence chez les blattes (Cruden & Markovetz, 1987).

A B

BA

Figure 6, A : Nodules racinaires chez Trifolium subterraneum ; B : l’intérieur d’un nodule vu en microscopie électronique montrant les Rhizobiums (15000X). (Photo : Megen Long)

Figure 7, A : Observations d’une coupe transversale de panse de Reticulitermes flavipes ; B : Observations des spirochètes symbiotiques en microscopie électronique (extrait de Breznak, & Pankratz, 1977 ; Graber et al, 2004).


24

Cette hypothèse, au départ très audacieuse, a été démontrée par la biologiste Lynn Margulis

qui grâce à l’analyse comparée de l’ADN des bactéries et de celui des organites de la cellule

eucaryote a accumulé les preuves définitives que nos cellules sont le fruit d’associations

symbiotiques successives dont on pense que la première remonte au moins à un milliard

d’années (Margulis, 1993). Ainsi, l’association symbiotique d’une archaebactérie et d’une

spirochète est à l’origine du premier organisme eucaryote vivant (LECA pour Last Eukaryotic

Common Ancestor), puis l’acquisition successive d’une alpha protéobactérie et d’une

cyanobactérie par symbiose a respectivement généré la mitochondrie (chez les animaux et les

végétaux) et le chloroplaste (chez les végétaux) (Margulis et al, 2006).

La cellule qui a donné naissance à l’arbre majeur de l’évolution, règne animal et végétal

confondus, est donc issue de la rencontre et du mariage de plusieurs être vivants, au départ

indépendants les uns des autres (Combes, 1995). Depuis, la symbiose a joué un rôle

prépondérant dans l’évolution de nombreux taxons et selon Price (1991), le nombre d’espèces

issues de symbioses constituerait près de 54% de la diversité actuelle.

2.3 Les symbioses bactériennes chez les céphalopodes

Depuis son origine, il y a près d’un milliard d’années, le processus d'évolution des

métazoaires a eu lieu en grande partie dans la mer, un environnement aquatique grouillant de

bactéries qui ont baigné les tissus des organismes vivants les plus précoces. Cet

environnement microbien a été une contrainte d’adaptation importante au cours de l’évolution

(McFall-Ngai, 2002) et il n’est donc pas surprenant qu’on y trouve d’innombrables exemples

d’associations animal-bactéries (Kushmaro et al, 1996 ; Dubilier et al, 2001, Webster et al,

2001 ; Kimura et al, 2003 ; Rajan, 2005). La première de ces associations symbiotiques est

très certainement apparue chez les invertébrés marins qui possèdent la plus importante

diversité taxonomique dans la biosphère actuelle et probablement la plus grande variété de

symbioses animal-bactérie (McFall-Ngai & Ruby, 2000).

Parmi les exemples d’association invertébrés marins-bactérie, la présence de symbiotes

bactériens chez les céphalopodes est connue depuis longtemps. En effet, les travaux

précurseurs de Zirpolo (1917) chez Sepia, Sepiola et Rondeletiola ont mis en évidence deux

organes symbiotiques qui ont fait ensuite l'objet de nombreux travaux : les organes lumineux

et les glandes nidamentaires accessoires.


25

2.3.1 Symbioses des organes lumineux

La présence des bactéries Vibrio dans les organes lumineux de certaines espèces de

Sepiolidés et de Loliginidés, ainsi que leur importance dans le

comportement anti-prédateur de ces céphalopodes sont

aujourd'hui communément admises et, depuis près de vingt ans,

l’association symbiotique Euprymna scolopes-Vibrio fischeri est

la plus largement étudiée (Wei & Young, 1989 ; Montgomery &

Mc Fall-Ngai, 1994 ; Cloud-Hansen et al, 2006) (Figure 8).

L’émission de peptidoglycanes par les vibrios présentes dans

l’environnement permet leur reconnaissance par la sépiole dès son

éclosion (Nyholm et al, 2000). L'infestation par les vibrios induit

ensuite la morphogenèse des organes lumineux chez la sépiole

(Ruby, 1996). Cette association symbiotique aboutit à un

comportement anti-prédateur original puisque la sépiole utilise la

bioluminescence des bactéries pour rendre sa silhouette invisible à

la vue des prédateurs (émission ventrale d’une lumière identique à celle de la lune ou des

étoiles) (pour revue voir Nyholm & McFall-Ngai, 2004).

2.3.2 Symbioses des glandes nidamentaires accessoires

Une communauté bactérienne variée (alpha- et gamma-protéobactéries, Gram positives,

Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides) est présente dans les glandes nidamentaires accessoires

de différentes espèces de cinq familles de décapodes

(Loliginidés, Sepiidés, Sepiolidés, Sépiadaridés,

Idiosepiidés ; Figure 9 ; Grigioni et al, 2000 ; Barbieri

et al, 2001; Pichon et al, 2005). La présence et la

répartition phylogénétique des symbiotes bactériens

semblent être fonction de la biogéographie de l’hôte

ou de sa taxonomie (Pichon et al, 2005). Les glandes

nidamentaires accessoires ont la particularité de se

teinter en orange à maturité sexuelle et les symbiotes

bactériens pourraient participer à cette coloration en

permettant l’accumulation de pigments caroténoides (Tableau 2 ; Bloodgood, 1977).

Figure 8 : Dissection d’Euprymna tasmanica montrant les organes lumineux (photo : David, P.)

10 µm10 µm

Figure 9 : Photo de FISH montrant les bactéries dans les GNA de Sepia officinalis (Grigioni et al, 2000)


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Organes Hôtes Symbiotes Rôle (* présumé) Références Organes lumineux

Sépiolidés, Photololiginidés

Vibrio, Photobacterium

Morphogénèse de l’organe lumineux et

luminescence

Montgommery & McFall-Ngai, 1994,

Ruby, 1996

Glandes nidamentaires

accessoires

Sepiidés, Sépiolidés

Sépiadaridés Loliginidés Idiosepiidés

Gram +, α- et γ-protéobactéries,

Cytophaga-Flavobacteria-

Bacteroides

Production de caroténoïdes*

Grigioni et al, 2000; Barbieri et al, 2001; Pichon et al, 2005

Glandes salivaires

Octopodidés (Hapalochlaena sp.)

γ-protéobactéries ? Production de tétrodotoxine*

Hwang et al, 1989

Organes

excréteurs Coleoidés

Nautiloidés Pseudomonadales ? Recyclage des

déchets azotés* Schipp et al, 1990

Grigioni et al, 1999

D’autres associations symbiotiques ont été suggérées dans les glandes salivaires de

certains octopodes du genre Hapalochlaena. Ce groupe de pieuvres, dont la morsure est

mortelle pour l’homme, paralyse ses proies en leur injectant de la tétrodotoxine (Sheumack et

al, 1978, Norman, 2000). La production de tétrodotoxine par des symbiotes bactériens

présents dans les glandes salivaires a été suggérée après isolement et culture des bactéries sur

milieu artificiel (Hwang et al, 1989).

La présence de populations bactériennes dans les appendices péricardiques de Nautile a

été observée en microscopie électronique chez Nautilus macromphalus et Nautilus pompilius

(Schipp et al, 1985). Après culture et caractérisation des bactéries à partir d’extraits

d’appendices péricardiques, Schipp et ses collaborateurs ont suggéré l’appartenance de ces

symbiotes bactériens au groupe des Pseudomonadales (Schipp et al, 1990). Cependant, on sait

aujourd’hui que la culture sur milieu artificiel ne permet de révéler qu’environ 0,001 à 15 %

de la diversité bactérienne totale selon l’environnement (Amann, 1995) (voir Chapitre III.3.1,

page 51). Des études comparatives récentes (Grigioni et al, 1999), utilisant des techniques

moléculaires ont permis de détecter la présence de bactéries dans le système excréteur de

deux espèces de céphalopodes à coquille calcifiée : Nautilus macromphalus (coquille externe)

et Sepia officinalis (coquille interne). La caractérisation moléculaire des symbiotes bactériens

présents dans le système excréteur ainsi que l’examen de leur implication potentielle dans le

métabolisme azoté du Nautile, dernier survivant des céphalopodes à coquille calcifié a donc

été le sujet de ce travail de thèse.

Tableau 2: Caractéristiques (identité et rôle des symbiotes bactériens) des principales associations bactériennes chez les céphalopodes (modifié de Pichon, 2005). ?: signifie que l’identification des bactéries n’a été suggérée qu’à partir de culture bactérienne sur milieu artificiel.

Chapitre II : Le Nautile, un modèle à part

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Chapitre II :

Le Nautile, un modèle à part


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Chapitre II – Le Nautile, un modèle à part

1. Evolution et adaptations morphologiques De tout temps, le Nautile et sa coquille ont inspiré de nombreux artistes et poètes et c’est

en partie grâce aux romans de Jules Verne que le nom de Nautile devint populaire à la fin du

XIXème siècle. Mais c’est aux yeux des naturalistes que le Nautile occupe probablement la

place la plus importante, car il est le dernier représentant vivant des céphalopodes à coquille

externe et appartient à la sous classe des Nautiloides dont l’origine remonte à la fin du

Cambrien (~500 millions d’années).

1.1. Histoire évolutive des céphalopodes: « Nautilus, le survivant »)

Les céphalopodes sont des mollusques exclusivement marins dont les premiers fossiles,

issus de la famille des Ellesmeroceratides, datent du Cambrien (le plus vieux fossile de

céphalopode connu : Plectronoceras cambria, date d’environ 510 millions d’années, Chen &

Teichert, 1983). Le groupe a connu une première diversification à la fin du Cambrien et lors

de l'Ordovicien (il y a environ 400-500 millions d’années, Figure 10) mais la plupart de ces

familles se sont éteintes au cours du Paléozoïque.

Figure 10 : Arbre illustrant l’évolution des céphalopodes. Depuis l’origine de l’ancêtre commun au Cambrien, trois sous classes majeures de céphalopodes ont évolué :

- les Ammonoides (aujourd’hui éteints) - les Coléoides (Teuthoides, Sepioides,

Octopodes sur le schéma) - les Nautiloides

Ces deux dernières représentent les céphalopodes actuels (Ward, 1988)


30

Seules les sous-classes des Ammonoides et des Nautiloides ont persisté et se sont

diversifiées de manière remarquable au cours du Mézozoïque (les Nautiloides connaissent

leur apogée au Carbonifère avec près de 75 genres) (Shimanskiy, 1967). La sous classe des

Coléoides (à laquelle appartiennent tous les céphalopodes actuels à l’exception du Nautile)

semble, quant à elle, être apparue au cours du Dévonien (~350 millions d’années) (Reitner &

Engeser, 1982). Au cours de l’évolution, ces trois familles de céphalopodes ont subi une

succession de crises sévères d’extinction (Tetcher et al, 1979). Les Ammonoides furent ainsi

plusieurs fois proches d’une extinction qui survient finalement à la fin du Crétacé (~65

millions d’années). Les sous classes des Nautiloides et Coléoides, en dépit d’un déclin au

cours du Tertiaire, ont survécu jusqu’à nos jours, représentant ainsi les céphalopodes actuels.

D’importants changements morphologiques sont intervenus chez les Coléoides au cours

du Tertiaire et leur coquille, anciennement externe, a connu une internalisation voire une

disparition chez certains groupes (voir Encadré 3, page 32) (Mangold & Bidder, 1989).

La sous-classe des Nautiloides qui semble avoir conservé la plupart de ses caractères

morphologiques ancestraux, regroupe donc les derniers représentants des céphalopodes à

coquille calcifiée externe (Ward et al, 1987 ; Pernice et al, 2006). Cependant, malgré leurs

ressemblances morphologiques avec la famille des Ammonoides, les Nautiles ne sont pas des

« fossiles vivants » mais des animaux extrêmement spécialisés, qui occupent une niche

particulière dans l’écosystème des récifs coralliens de la zone Indo-Pacifique. En effet, des

études phylogénétiques récentes concernant les gènes mitochondriaux suggèrent que les deux

genres actuels: Nautilus et Allonautilus (Ward & Saunders, 1997) ont une origine relativement

récente (quelques millions d’années selon Woodruff et al, 1987) et subissent actuellement un

phénomène de diversification (Wray et al, 1995).

1.2. Structure et principales adaptations morphologiques

Les Nautiles présentent de nombreuses caractéristiques morphologiques qui les

distinguent des autres céphalopodes actuels. Ce sont, pour la plupart, des adaptations dues à

leur coquille épaisse cloisonnée. Leur corps est subdivisé en trois parties (Figure 11):

• La région antérieure qui comprend les tentacules, le bulbe buccal, les yeux,

l’hyponome ou entonnoir, et le capuchon ;

• Une région viscérale formée par les organes du système circulatoire, le tube digestif,

l’appareil reproducteur et l’appareil excréteur ;

• Le siphon, tube mince enveloppé par une gaine calcaire et protéique qui va de la partie

la plus postérieure du corps à la loge la plus interne de la coquille.


31

Le capuchon proéminent, qui se trouve au-dessus de la tête et des tentacules, clôt l’animal qui

se retrouve ainsi à l’intérieur de la coquille.

1.2.1. Une coquille en guise de« flotteur»

1.2.1.1.Structure de la coquille

La coquille externe des Nautiles, fortement calcifiée, a une double fonction protectrice et

hydrostatique (Ward, 1987). Elle est composée de carbonate de calcium cristallisé sous forme

d’aragonite et comprend une grande chambre d’habitation (qui contient le corps de l’animal)

et une série de chambres cloisonnées (de 34 à 36 en moyenne chez un individu adulte). Avec

la croissance, la coquille s’agrandit sur ses bords externes et forme successivement des

nouvelles chambres pour atteindre sa taille maximale (de 150 à 250 mm selon les espèces) à

la maturité sexuelle de l’animal (environ 5-6 ans).

1.2.1.2.Flottabilité

Les chambres cloisonnées de la coquille contiennent du liquide en faible quantité et

surtout un gaz composé à plus de 90 % d'azote, à une pression d’environ 0.7-0.9 Atm

(Denton, 1974). Ce volume de gaz permet à l’animal de compenser le poids important de sa

coquille et d’adapter sa densité moyenne à celle de l'eau de mer environnante ce qui lui

procure une flottabilité neutre (voir Encadré 3, page 32).

Figure 11: Schéma d’une coupe transversale de Nautilus macromphalus présentant l’organisation en trois régiosn ainsi que les principales caractéristiques morphologiques (modifié d’après Würtz, 1989).


32

Encadré 3 : Rôle de l’azote dans le contrôle de la flottabilité chez les céphalopodes

Le maintien de la position verticale dans la colonne d'eau représente un coût énergétique majeur

dans le milieu marin (Webber et al, 2000). Afin de minimiser ce coût, de nombreux organismes pélagiques ont développé diverses stratégies dans le but de réduire leur densité par rapport à celle de l'eau de mer (Seibel et al, 2004). L’importance de ces stratégies est particulièrement bien illustrée chez les céphalopodes dont le succès au cours du Paléozoïque semble dû en grande partie au développement de coquilles cloisonnées qui leur a permis d’assurer une flottabilité neutre (Denton, 1974). Le phénomène de régression de la coquille présenté par toutes les espèces de céphalopodes actuels, à l’exception du Nautile, s’est accompagné de changements dans leur mode de vie qui se concrétisent par une adaptation progressive soit au milieu benthique soit à un mode de déplacement actif. En fait, la plupart des caractéristiques de l’évolution des céhalopodes ont été interprétées comme une réponse au besoin de contrôler la flottabilité (Clarke, 1988, Mangold & Bidder, 1989). Ainsi, la coquille cloisonnée externe contenant du gaz et permettant la gestion de la flottabilité (chez les espèces fossiles éteintes et chez le Nautile) a été substituée soit par une coquille interne fonctionnant de la même façon (chez Sepia et Spirula) soit par l’accumulation directe de gaz ou liquides plus légers que l’eau de mer dans le coelome et entre les tissus (chez les Calmars et les Octopodes pélagiques) (Figure 12 ; Clarke et al, 1979 ; Packard & Wurtz, 1994 ; Seibel et al, 2004).

L’azote est le principal constituant des gaz et liquides utilisés par les Céphalopodes dans le souci de gérer leur flottabilité (Denton & Taylor, 1964, Denton, 1974). Chez les espèces sans coquille calcifiée, la stratégie la plus répandue consiste à substituer les ions sodium par des ions ammonium ce qui permet de créer des liquides de densité plus faible (Clarke et al, 1979). Ainsi, les composés ammoniacaux peuvent représenter 50 à 60 % de la masse corporelle de certains calmars Cranchiidés (avec des concentrations en ammonium de près de 500nM, Voight et al, 1994). Chez les espèces à coquille calcifiée, les études de Denton concernant la production et l’utilisation de l’azote par Sepia, Spirula et Nautilus ont permis de confirmer que le gaz accumulé dans leurs coquilles externes ou internes provient de leur métabolisme protéique (Denton, 1974). L’auteur souligne d’ailleurs que le même mécanisme se déroulerait chez les Nautiloides et les Coléoides.

Les céphalopodes sont des organismes ammonotéliques, c’est-à-dire que plus de 70% de l'azote organique dissout excrété par l'animal est sous forme ammoniacale (Boucher-Rodoni, 1989). Cependant, Boucher-Rodoni & Mangold (1994) ont clairement mis en évidence que la Seiche et le Nautile présentent un faible taux d’excrétion d’ammonium. Etant donné que ces animaux accumulent de l’azote gazeux dans leur coquille calcaire pour leur flottabilité, ces auteurs ont suggéré qu’une partie de l’ammonium qui n’est pas excrété, pourrait directement être transformé en azote gazeux par des bactéries symbiotiques. Cependant, de telles interactions symbiotiques impliquant des micro-organismes à la fois nitrifiant et dénitrifiant n’ont, jusqu’ici, jamais été mises en évidence.

Figure 12 : Différentes adaptations liées au contrôle de la flottabilité chez les céphalopodes (A) fossiles et actuels : - coquille cloisonnée chez Nautilus, Spirula et Sepia (B, C, D, E) - liquide contenu dans les cavités coelomiques des Cranchiidés (F). (Norman, 2005 ; Boyle & Rodhouse, 2005)

B A

F

C

D

E

Nautilus Spirula

Cranchia

Sepia

Sepia


33

La coquille résiste à la pression hydrostatique de l'eau environnante jusqu’à 750m de

profondeur (Ward & Martin, 1978), la pression et le volume de gaz dans la coquille sont

indépendants donc de la profondeur. Les Nautiles peuvent ainsi flotter de manière quasi-

neutre dans toute la gamme de profondeurs auxquelles ils vivent sans avoir à changer

significativement le volume de gaz contenu dans leur coquille. Cette capacité est, pour

certains auteurs, (Boutilier et al, 1996 ; Norman, 2000 ; Webber et al, 2000) une des

principales adaptations des Nautiloides leur ayant permis de survivre face à la prédation et à la

compétition.

1.2.1.3.Ajustements du contenu en liquide et gaz de la coquille

Les Nautiles peuvent parfois ajuster légèrement la quantité de liquide présent dans les

chambres de leur coquille grâce à une extension de tissu vascularisé appelé « siphon » (Ward

et al, 1981). Ce siphon qui relie toutes les chambres cloisonnées au corps de l’animal (Figure

11, page 31) est très riche en mitochondries et en pompes à sodium ce qui lui permet de

« pomper » activement le sodium présent dans le liquide des chambres (Mangold & Bidder,

1989). Ce liquide devient alors plus dilué que le sang et que l’eau de mer entourant l’animal.

Il est ainsi rejeté à l’extérieur de manière passive par la pression osmotique (Figure 13).

Des mécanismes de diffusion passive permettent aussi le transport du gaz présent dans le

sang de l’animal vers les chambres de la coquille et inversement. Contrairement à ce qu’on a

longtemps cru, ces ajustements du contenu en liquide et gaz de la coquille ne sont pas utilisés

par les Nautiles pour réaliser leurs migrations verticales (voir Chapitre II.2.2, page 36). En

effet, la vitesse à laquelle le liquide est normalement expulsé (environ 1 ml par loge et par

jour) est sans rapport avec la vitesse de remontée effective de l’animal vers la surface (Ward,

Figure 13 : Schéma d’une coupe transversale de siphon de Nautilus macromphalus représentant les mécanismes de diffusion qui permettent de vider le liquide présent dans la coquille (modifié d’après Würtz, 1989).


34

1987). Ce sont en fait des phases de nage active à l’aide de l’organe locomoteur (voir ci-

dessous) qui permettent de réaliser ces migrations dans la colonne d’eau, tandis que le

contenu en gaz suffisant pour une flottabilité neutre est maintenu dans la coquille.

1.2.2. Un organe de locomotion permettant une grande manoeuvrabilité

L’organe de locomotion principal est représenté par l’hyponome, qui est situé au-dessous

des tentacules (Figure 11, page 32), et qui, en provoquant un jet d’eau (système de « jet-

propulsion » commun aux céphalopodes), permet à l’animal de se mouvoir « à reculons ».

Contrairement à l’entonnoir des autres céphalopodes, constitué d’un tube, l’hyponome des

Nautiles est formé par une couche musculaire enroulée sur elle-même. Extrêmement mobile et

flexible, il peut s’étirer au-delà de l’ouverture de la coquille ce qui permet à l’animal de se

diriger avec une grande manoeuvrabilité. Pour les mouvements rapides, l’action de

l’hyponome est renforcée par la contraction des gros muscles rétracteurs.

1.2.3. Des tentacules sans ventouses mais avec de nombreuses fonctions

Contrairement aux autres céphalopodes, les Nautiles possèdent de nombreux tentacules

(environ 90) qui ne présentent aucune ventouse. Ils se différencient en trois groupes

spécialisés pour assumer différentes fonctions (Figure 14):

• Fonction chimiosensorielle pour les

tentacules oculaires et certains tentacules

digitaux impliqués dans la recherche des

aliments (Bidder, 1962)

• Fonction tactile et préhensile pour certains

tentacules digitaux externes qui sont dotés

d’une série de crêtes transversales leur

permettant d’adhérer fortement

• Fonction reproductrice pour les tentacules

internes buccaux qui peuvent être modifiés

en organes sexuels (comme l’organe

reproducteur mâle, appelé spadix ; Ward,

1987).

1.2.4. Quatre branchies pour un métabolisme différent

Les Nautiles appartiennent au groupe des tétrabranchiaux car ils possèdent deux paires de

branchies, contrairement aux autres céphalopodes qui n’en possèdent qu’une paire. Elles

Figure 14 : Schéma représentant les différents types de tentacules chez le Nautile (Würtz, 1989)


35

occupent la partie intérieure de la cavité palléale (Figure 11, page 32) et sont aérées par les

mouvements d'eau créés par le siphon. Leur grande taille permet à l’animal d’exploiter des

faibles teneurs en oxygène avec une activité métabolique plus faible que celle des

céphalopodes dibranchiaux (O’Dor et al, 1993 ; voir Chapitre II, 3.1, page 39)

1.2.5. Des yeux dépourvus de cristallin

De gros yeux pédonculés se trouvent de chaque côté de la tête du Nautile et, contrairement

à ceux des autres céphalopodes, ils sont dépourvus de cristallin et fonctionnent selon le

principe de la chambre noire. La pupille, orifice circulaire qui fait communiquer la partie

interne de l’œil avec le milieu extérieur, est en mesure de se contracter ou de se dilater en

fonction de la variation d’intensité lumineuse.

2. Ecologie et Biologie 2.1. Distribution géographique et diversité spécifique

Les Nautiles sont actuellement distribués dans une vaste zone océanique qui s’étend de

l’Océan Indien aux Iles Samoa et à l’Australie (des spécimens vivants ont été récoltés

ponctuellement aux îles Andaman et aux îles Samoa en Polynésie centrale) (Boyle &

Rodhouse, 2005). De nombreuses espèces ont été décrites sur la base de caractères

morphologiques (forme de la région ombilicale, présence ou absence d’un bouchon calcaire,

nombre de stries externes des parois…): Nautilus belauensis, Nautilus macromphalus,

Nautilus pompilius, Allonautilus scrobiculatus, Nautilus stenomphalus, Nautilus repertus

(Figure 15).

N. pompilius

A. scrobitulatus

N. macromphalus

N. belauensis

N. stenomphalus

N. repertus

Figure 15 : Distribution géographique des différentes espèces de Nautile (Würtz, 1989)


36

Mais l’identification de certaines espèces a largement été controversée (Saunders, 1981;

Ward, 1984) et seuls trois taxons sont plus communément reconnus: N. macromphalus, N.

pompilius, et A. scrobiculatus (voir Planche photo 1, page 40). L’espèce-type, N. pompilius

possède la plus large répartition géographique (distribution Indo-Pacifique) tandis que les

autres formes sont généralement restreintes à certains archipels (Nouvelle-Calédonie pour N.

macromphalus et Papouasie-Nouvelle-Guinée pour A. scrobitulatus). Des études récentes,

basées sur l’analyse phylogénétique des gènes mitochondriaux (16S et 28S) et de certains

caractères morphologiques, ont suggéré la présence de trois clades géographiques (Figure 16)

et la séparation de l’espèce A. scrobitulatus (Wray et al, 1995) qui a depuis été classée dans

un nouveau genre: Allonautilus (Ward & Saunders, 1997).

2.2. Distribution bathymétrique, nourriture et prédation

D’après les captures à l’aide de casiers et avec le support d’observations menées dans de

nombreux endroits du monde: aux Philippines (pour revue voir Hayasaka et al, 1987), sur l’île

de Palau en Micronésie, en Nouvelle-Calédonie, sur Lizard Island en Australie et aux îles

Fidji (pour revue voir Saunders, 1987), on sait aujourd’hui que le Nautile vit sur les pentes

externes des récifs coralliens à des profondeurs variant de 100 à 800m et qu’il semble

rarement pénétrer dans les lagons (Saunders & Ward, 1987). Des informations détaillées

concernant les pêches de N. macromphalus en Nouvelle-Calédonie de 1970 à 1995 (Le

Terrier, com. pers.) confirment ces gammes de profondeur avec une densité maximale

d’individus péchés entre 300 et 400m et une limite de pêche à environ 800m de profondeur

(Figure 17).

Figure 16 : Reconstruction phylogénétique de cinq espèces de Nautiles représentant les trois clades géographiques identifiés par Wray et ses collaborateurs (1995). La reconstruction est basée sur l’analyse phylogénétique des séquences des gènes mitochondriaux 16S et 18S ainsi que certains caractères morphologiques.


37

Profondeur Résultats Nb de casier 112

0-100 Nb de nautiles péchés 58 Nb de nautiles/casier 0.5 Nb de casier 1493

100-200 Nb de nautiles péchés 2937 Nb de nautiles/casier 2 Nb de casier 291









1000-1100 Nb de nautiles péchés 0 Nb de nautiles/casier 0

Limite physiologique

100m

200m

300m

400m

500m

0m

Figure 17 : Tableau de données et schéma illustrant la répartition bathymétrique de N. macromphalus à partir des collectes réalisées en Nouvelle-Calédonie entre 1970 et 1995. La limite physiologique est indiquée d’après Ward & Martin (1978).

0 Nautiles/casier 0-1 Nautiles/casier 4-8 Nautiles/casier 1-4 Nautiles/casier

Figure 18 : Schéma illustrant les migrations verticales diurnes observées par O’Dor et ses collaborateurs à l’aide d’émetteurs d’ultrasons disposés sur les coquilles de Nautile en Papouasie Nouvelle-Guinée (O’Dor et al, 1993).


38

Dans les années 1980 et 1990, des études scientifiques ont permis d’acquérir de nouvelles

informations concernant les migrations verticales réalisées par les Nautiles à l’aide

notamment d’expériences de suivi acoustique et télémétrique (Saunders, 1985 ; Ward et al,

1984 ; O’Dor et al, 1993). Ainsi, d’après les déplacements journaliers observés chez quelques

individus à l’aide d’un émetteur ultrason, O’Dor et ses collaborateurs (1993) suggèrent que

les Nautiles ont un rythme migratoire assez régulier comprenant une remontée vers les eaux

superficielles chaque nuit (à une vitesse d’environ 2m/min) et une descente vers les eaux plus

profondes pendant la journée (à une vitesse d’environ 3m/min) (Figure 18). Ces migrations

verticales semblent essentielles au Nautile à plusieurs niveaux :

Tout d’abord, les migrations permettent au Nautile d’explorer tout le tombant du

récif à la recherche de ses proies qu’il repère par chimio-détection (O’Dor, 1993).

A cet égard, les crustacés décapodes (vivants ou morts) jouent un rôle fondamental

dans l’alimentation du Nautile (ils peuvent représenter près de 75% de son contenu

stomacal) puisqu’ils représentent une source riche en protéines mais aussi en

calcium pour la sécrétion de la coquille (voir Planche photo 1, page 40).

Dans un deuxième temps, le rythme migratoire diurne observé par O’Dor et ses

collaborateurs (1993) permet au Nautile d’éviter le contact avec certains

prédateurs (Norman, 2000). En effet, en remontant la nuit vers la surface, les

Nautiles diminuent le risque d’être attaqués par les poissons et d’autres prédateurs

chassant à vue (requins, balistes et tortues principalement).

2.3. Reproduction et développement

Contrairement à la plupart des céphalopodes qui ne se reproduisent qu’une seule fois

pendant leur vie, le Nautile se reproduit plusieurs fois (polycyclique) et possède une période

reproductrice qui peut durer plusieurs années (Hamada et al, 1978). La période de ponte

semble s’étendre sur toute l’année durant laquelle un Nautile peut pondre en moyenne entre

un et deux œufs par mois (Norman, 2000). Pendant l’accouplement, qui peut durer jusqu’à

24h, le mâle et la femelle s’enlacent aux moyens de leurs tentacules (voir Planche photo 1,

page 40) tandis que l’organe copulateur du mâle (le spadix : un tentacule interne buccal qui

est différencié), s’introduit dans la cavité palléale de la femelle pour y placer les

spermatophores (Mikami et al, 1980). La ponte survient une à deux semaines après

l’accouplement.


39

Les œufs, particulièrement volumineux (25 à 35 mm pour 4g), sont alors déposés

individuellement à des intervalles de quelques jours. Ils sont

accrochés au substrat (cavités rocheuses généralement) par

une membrane souple qui est perforée à son sommet. Cette

membrane laisse l’eau de mer circuler entre la gaine externe

et la capsule ovale qui contient le vitellus (voir Planche

photo 1, page 40 et Figure 19).

Depuis 1985, de nombreux œufs ont été pondus en aquarium et ont permis des

observations détaillées du développement embryonnaire de N. pompilius (pour revue voir

Arnold & Carlson, 1986). Le développement de l’embryon dure environ un an et son éclosion

ne semble se produire que lorsque sa coquille possède 7 loges et a atteint la taille d’environ 25

mm de diamètre. Bien que des oeufs n’aient jamais été observés dans l’environnement

naturel, des analyses de la composition isotopique de la coquille de juvéniles ont permis de

suggérer que leur ponte se déroule en eaux peu profondes. Après un développement

embryonnaire à une température d’environ 22-24°C, les juvéniles semblent migrer vers des

eaux plus froides et profondes (Landman et al, 1994). Les avancées dans le maintien et la

reproduction des Nautiloides en aquarium sont donc d’autant plus importantes pour l’étude

des interactions symbiotiques qu’elles permettent l’unique accès aux stades de développement

les plus précoces des Nautiloides et peuvent ainsi permettre de préciser le mode de

transmission des populations symbiotiques (voir Chapitre I.2.1, page 21).

3. Physiologie 3.1. « Un métabolisme à toute épreuve» (Boutilier et al, 1996)

Les niveaux d'activité mesurés dans la nature (O’Dor, 1993), ainsi que les caractéristiques

des systèmes respiratoire et circulatoire, suggèrent que les Nautiles sont adaptés à un style de

vie peu coûteux en énergie et qu’ils peuvent survivre à des concentrations d'oxygène très

faibles sans pour autant dépendre d’un métabolisme anaérobie (Boutilier et al 1996). En effet,

lorsqu’ils se retrouvent dans des conditions hypoxiques, les Nautiles réalisent d’importantes

« pauses » ventilatoires et circulatoires durant lesquelles le sang semble avoir une très haute

affinité pour l’oxygène.

Figure 19 : Dessin représentant un embryon de Nautile dans son œuf (dessin d’après Würtz, 1989)


40

Planche photo 1: Morphologie externe de différentes espèces de Nautile et de différents stades de développement (la plupart des photos sont tirées de Norman, 2000) A : N. pompilius, B : N. scrobitulatus, C : N. macromphalus D : Deux individus de N. macromphalus dévorant une mue de langouste (Joannot P) E : Deux individus de N. belauensis en reproduction, F : Oeufs de N. macromphalus en aquarium G : Dissection d’un œuf de N. belauensis montrant l’embryon à 4 mois H : Eclosion d’un juvénile de N. belauensis, I : Remontée d’un casier contenant un dizaine de spécimens de N. macromphalus au large de la Nouvelle-Calédonie (Pernice M)


41

Cette prodigieuse capacité de quasi-suppression du métabolisme aérobie (dans des

conditions d’hypoxie sévère le taux métabolique aérobie ne représente qu’environ 4 à 8% de

celui en conditions normales), semble notamment permettre à l’animal de recharger le sang

présent dans la veine cave ventrale en oxygène par diffusion (Boutilier et al, 1996).

3.2. Digestion

La présence d’un jabot important (voir Figure 11, page 32) permet au Nautile de conserver

d’importants fragments de nourriture pendant plusieurs jours. Comme pour l’ensemble des

céphalopodes, son régime alimentaire est majoritairement constitué de protéines. Le processus

digestif qui se déroule en trois phases (digestive, absorptive, et éliminatrice) aboutit

principalement à l’élimination des déchets inattaquables qui sont libérés par l’anus ainsi qu’à

la production de déchets ammoniacaux qui seront ensuite l’objet des processus d’excrétion

(pour revue voir Boucaud-Camou & Boucher-Rodoni, 1983 et Mangold & Bidder, 1989).

En utilisant des techniques de tomographie assistées par ordinateur, Westermann et al

(2002) ont pu suivre dans le temps le trajet des aliments dans le tube digestif de N. pompilius.

La durée moyenne de la digestion totale qui comprend donc les trois phases, digestive,

absorptive et éliminatrice, semble être d’environ 12 h. Cette durée pourrait cependant être

revue à la hausse dans le milieu naturel à cause des températures plus faibles de

l’environnement.

3.3. Excrétion

La fonction d’excrétion, chez le Nautile comme chez les autres céphalopodes et les

Mollusques en général, comprend trois processus successifs:

• L’ultrafiltration qui consiste à filtrer les plus petites molécules contenues dans le sang

dans le but de les éliminer (l’hémocyanine et les autres molécules plus grosses sont

retenues par le système circulatoire).

• La réabsorption qui permet de réalimenter le sang en composés variés (glucose, acides

aminés…) par transport actif contre un gradient de concentration (Martin, 1965).

• La sécrétion qui consiste à faire passer les déchets, surtout des substances azotées

(principalement de l’ammoniac), dans le fluide qui sera ensuite excrété.

Les expériences concernant la physiologie de l’excrétion sont assez difficiles à réaliser

chez le Nautile (notamment de par la présence de la coquille externe) mais des études

ultrastructurales et cytochimiques réalisées dans les années 1980 ont largement fait avancer

les connaissances dans ce domaine (Martin, 1983 ; Schipp et al, 1985 ; voir ci-dessous).


42

3.3.1. Le système excréteur

D’une manière générale chez les céphalopodes, plusieurs organes entreprennent les

différents processus liés à la fonction d’excrétion : les appendices rénaux, les cœurs

branchiaux, et les branchies (Mangold & Bidder, 1989). Pourtant chez le Nautile, les

appendices rénaux étant spécialisés dans la rétention du calcium (utilisé par la suite par

l’animal pour la croissance de sa coquille), seuls les homologues des cœurs branchiaux,

appelés appendices péricardiques, jouent un rôle dans l’évacuation des déchets métaboliques

(Figure 20 ; Schipp & Martin, 1981).

Les appendices péricardiques du Nautile assument donc, à eux seuls, les trois processus

excréteurs communs aux céphalopodes: ultrafiltration, réabsorption et sécrétion (Schipp et al,

1985). Ces organes sont élaborés à partir de la paroi postérieure de chaque veine cave du

Nautile et forment deux paires de glandes contractiles qui s’ouvrent sur la cavité palléale

(Figures 20 A et C ; Mangold, & Bidder, 1989).

Figure 20 : A : Schéma illustrant une section longitudinale de Nautile montrant le système excréteur (encart). B : Schéma simplifié du système excréteur et des structures circulatoires associées. ABV, veines branchiales afférentes; DA, aorte dorsale; EBV, veines branchiales efférentes; G, branchies; H, coeur; PA, appendices péricardiques; RA, appendices rénaux; RS, sac rénal; VC, veine cave. C : Dissection de N. pompilius montrant les quatre appendices péricardiques (flèches)

C

Pernice M


43

3.3.2. Fonctionnement du système excréteur

Les appendices péricardiques du Nautile sont composés de nombreux villis (Figure 21)

qui collectent et filtrent le sang (à l’intérieur de l’organe) puis sécrètent un liquide d’excrétion

(à l’extérieur de l’organe) acide et riche en ammoniac. Cet ammoniac est directement

transformé en ions ammonium (jusqu'à 200 ppm : Schipp et Martin, 1987) par l’acidité du

milieu et le fluide excréteur est finalement rejeté dans le milieu environnant par

l’intermédiaire de la cavité palléale. Chaque villus constitue une unité d’excrétion à part

entière et son ultrastructure, observée en microscopie électronique par Schipp et al (1985),

reflète une organisation correspondant aux trois processus excréteurs (Figure 21):

• Les cellules ovoïdes (podocytes) forment

une barrière filtrante dans la partie baso-

médiane interne du villus qui semble active

dans le processus d’ultrafiltration de

molécules de petite taille

• L’épithelium plissé en périphérie de la

région baso-médiane entreprend les

processus de transport actifs liés à la

réabsorption

• L’épithelium de la région apicale secrète le

fluide d’excrétion riche en ammoniac

3.3.3. Une originalité physiologique, évolutive et …symbiotique?

C’est sans aucun doute la multiplicité des processus physiologiques pris en charge par les

appendices péricardiques du Nautile qui a contraint leur organisation structurale (Schipp et al,

1985). Cette organisation fonctionnelle des appendices péricardiques est particulièrement

intéressante pour différentes raisons. Dans un contexte évolutif, elle est unique au sein des

céphalopodes mais aussi des Gastéropodes et des Bivalves chez qui ces organes existent mais

n’ont aucune implication dans la fonction d’excrétion (rôle dans la circulation sanguine

uniquement) (Martin, 1983). En outre, d’un point de vue physiologique, cette structure

Figure 21 : Diagramme d’un villus péricardique de Nautile (modifié de Schipp et al, 1985)


44

excrétrice semble avoir d’importantes répercussions sur la gestion des déchets azotés du

Nautile dont le taux d’excrétion d’ammonium est 3 à 4 fois plus faible que celui de la plupart

des autres céphalopodes (Boucher-Rodoni & Mangold, 1994). Enfin, en accord avec les

hypothèses de certains auteurs, (Denton, 1974 ; Clarke, 1988, Mangold & Bidder, 1989, voir

Encadré 3, page 32), cette faible quantité d’ammonium excrétée par les appendices

péricardiques pourrait être impliquée dans la gestion de la flottabilité du Nautile. En effet,

Boucher-Rodoni et Mangold, (1994) suggèrent qu’une partie de l’ammonium non excrété par

les appendices péricardiques, pourrait être directement transformé en azote gazeux par les

bactéries symbiotiques hébergées dans ces organes. Ainsi les caractéristiques évolutives et

physiologiques du Nautile font des appendices péricardiques, et des populations bactériennes

qui leurs sont associées (Schipp et al, 1990, Grigioni et al, 1999 voir Chapitre I, 2.3.2, page

26), un modèle d’étude particulièrement intéressant dans un contexte d’interactions

symbiotiques.

Chapitre III : Identification, Localisation et Quantification des symbiotes

45

Chapitre III :

Identification, Localisation et Quantification des

symbiotes bactériens chez deux espèces de Nautiles :

implications physiologiques et évolutives


46


47

Chapitre III – Identification, Localisation et Quantification des symbiotes

bactériens chez 2 espèces de Nautiles : implications physiologiques et

évolutives

1. Objectifs généraux de l’étude En impliquant des échanges génétiques, l'acquisition et le maintien d'un ou plusieurs

organismes par un autre aboutit généralement à la formation de nouvelles structures et de

nouveaux métabolismes. De telles interactions sont beaucoup plus complexes et plus fluides

que les simples concepts écologiques de mutualisme, commensalisme ou parasitisme qui leur

sont généralement associés (Douglas, 1994). De cette complexité résulte le besoin d’une

approche pluridisciplinaire (évolution, écologie, physiologie…) afin de définir un système

symbiotique, notamment au niveau de la spécificité des symbiotes impliqués, avant de

pouvoir discuter du rôle de chacun des partenaires engagés (Graf et al, 2006). Le travail

présent se propose d’étudier de manière intégrée la diversité des symbiotes bactériens présents

au sein des organes excréteurs de deux espèces de Nautile, afin de pouvoir déterminer la

spécificité de cette interaction symbiotique. Cette étude s'inscrit donc dans une problématique

visant à préciser la physiologie et le fonctionnement métabolique de ce « micro écosystème »

hautement spécialisé en fournissant des informations nouvelles concernant l’évolution, la

distribution spatiale, la transmission et la fonction potentielle des bactéries symbiotiques.

Les bactéries présentes dans les différents organes ont été (1) identifiées par

séquençage et analyse du gène codant pour la sous unité 16S de l’ARN ribosomique (ARNr

16S), (2) localisées dans les tissus par la technique d’hybridation in situ, (3) quantifiées par

cytomètrie en flux, puis finalement (4) testées pour leur potentiel nitrifiant et dénitrifiant ainsi

que (5) leur activité antimicrobienne. Les résultats ont fait l’objet de trois articles dont un

publié, un soumis et un autre à soumettre.

Cette étude a donc nécessité une approche en plusieurs phases concernant tout d’abord

la caractérisation du système symbiotique chez N. macromphalus :


48

- Caractérisation des bactéries par séquençage de leur ARNr 16S afin de préciser leur identité

et de donner une première suggestion de leur potentiel métabolique

- Détection des différents types de symbiotes dans les tissus de l’hôte par hybridation in situ

en vue d’examiner leur répartition et d’éventuelles relations spatiales

- Quantification des bactéries par cytomètrie en flux et développement d’un modèle cellulaire

de l’association Nautile-bactérie dans la perspective d’étudier les mécanismes moléculaires

mis en jeu dans cette interaction.

-Test d’une implication des symbiotes dans le métabolisme azoté de N. macromphalus à

l’aide de différentes techniques: (i) incubation et analyses isotopiques des organes concernés

(ii) recherche et séquençage de gènes bactériens impliqués dans la nitrification et

dénitrification (Chapitre III. 4.3)

Enfin, une étude comparative de la diversité bactérienne a été réalisée chez N. pompilius

sur deux sites de collectes distants afin de préciser la spécificité de la symbiose et l’influence

potentielle des facteurs biogéographiques. De plus, le potentiel antimicrobien de souches

isolées de différentes espèces de Nautile a été déterminé dans le but de suggérer les

mécanismes pouvant être impliqués dans la colonisation des organes.

Chapitre III. 4.2: Article publié dans Marine Biology (sous presse):

Primary co-culture as a complementary approach to explore the diversity of bacterial symbionts in marine invertebrates: the example of Nautilus macromphalus (Cephalopoda:Nautiloidea). Pernice, M., Pichon, D., Domart-Coulon, I., Favet, J., Boucher-Rodoni, R.

Chapitre III. 4.1: Article à soumettre:

Enigmatic dual symbiosis in the excretory organ of Nautilus macromphalus (Cephalopoda:Nautiloidea). Pernice, M., Wetzel, S., Gros, O., Boucher-Rodoni, R., Dubilier, N.

Chapitre III. 4.4 et 4.5: Article soumis à Reviews in Fish Biology & Fisheries: Identification of a Vibrio strain producing antimicrobial agents in the excretory organs of Nautilus pompilius (Cephalopoda, Nautiloidea). Pernice, M., Destoumieux-Garzón, D., Peduzzi, J., Rebuffat, S., Boucher-Rodoni,R.


49

2. Origine des échantillons et campagnes Quatre campagnes ont permis la collecte de Nautiles en vue de la caractérisation de leurs

bactéries symbiotiques par séquençage des gènes marqueurs et hybridation in situ. Les

récoltes portent sur deux espèces : Nautilus macromphalus et Nautilus pompilius, collectées

avec l’aide de différents partenaires (Aquarium et centre IRD de Nouméa, affaires maritimes

de Nouvelle Calédonie, Maritime college de Luganville-Vanuatu, Aquascapes Philippines).

Les sites de ces différentes campagnes sont illustrés dans la figure 22.

L’espèce endémique de Nouvelle Calédonie, N. macromphalus a fait l’objet de l’étude

la plus exhaustive avec trois sites de collecte le long de la côte ouest et des observations

complémentaires concernant certaines caractéristiques des spécimens (taille, poids, sexe, voir

Annexe 1).

3. Méthodes

La taxonomie des procaryotes est longtemps restée complexe et mal définie au niveau

spécifique car basée sur des caractéristiques cellulaires et physiologiques (morphotype,

coloration Gram, tests physiologiques), dans la mesure où seules les bactéries cultivables

étaient accessibles aux microbiologistes. Depuis maintenant plus de vingt ans, le

développement des techniques moléculaires, a eu un impact extraordinaire dans la

classification du monde bactérien (Woese et al, 1990). Ces techniques, qui ne nécessitent pas

de phase de croissance des bactéries sur un milieu de culture, permettent d’explorer la

Figure 22 : Sites des quatre campagnes de pêche des espèces N. pompilius (en rouge) et N. macromphalus (en bleu) réalisées lors de cette étude. Encart : détails des sites concernant l’espèce N. macromphalus en Nouvelle-Calédonie.


50

diversité spécifique et fonctionnelle, et de quantifier des populations bactériennes. Ces

approches moléculaires ont ainsi permis de totalement renouveler la microbiologie en révélant

l'existence d'une importante diversité bactérienne dont les conditions de culture in vitro n'ont

pas été encore définies (Joux & Lebaron, 2000).On estime ainsi que le pourcentage d’espèces

« cultivables » oscille entre 0,001 et 15% de la diversité bactérienne totale selon

l’environnement (Amann et al, 1995 ; Pace, 1997).

Un certain nombre de techniques de biologie moléculaire ont été utilisées lors de ce travail

afin d’identifier, quantifier et localiser la diversité bactérienne associée aux appendices

péricardiques de Nautile. Ces techniques sont souvent employées de manière cyclique (« top-

to-bottom approach » ; Amann et al, 1995), le séquençage et l’analyse du gène codant pour

l’ARNr 16S permettant de cibler les régions spécifiquement conservées qui peuvent être

utilisées ensuite pour localiser les bactéries dans les tissus à l’aide de sondes fluorescentes

(Figure 23).

Figure 23 : Aspect cyclique (top-to-bottom approach, Amann et al, 1995) des différentes techniques de biologie moléculaire utilisées.


51

3.1. Caractérisation de la diversité

3.1.1. L’ARNr 16S comme marqueur moléculaire

L’analyse comparative des séquences de gènes isolés chez les bactéries permet

l'évaluation de leur position phylogénétique (Muyser & Ramsing, 1995 ; voir Encadré 4,

page52). Dans ce but, le gène codant pour l’ARN ribosomal 16S s’est révélé être un excellent

marqueur moléculaire pour plusieurs raisons :

• Il est universellement distribué puisqu’il participe à la traduction des ARN en

protéines (Gutell et al, 2002)

• Il ne présente pas de transfert horizontal entre espèces

• Sa fonction exerce une contrainte importante sur son évolution et sa structure

secondaire, ce qui permet de l’utiliser pour établir des relations entre procaryotes

phylogénétiquement éloignés (Woese, 1987)

• Enfin, les séquences sont suffisamment longues (1500 paires de bases) pour dresser

des phylogénies robustes.

Cette molécule est donc désormais considérée comme le marqueur standard pour l’étude

de la diversité des procaryotes et plusieurs dizaines de milliers de séquences sont disponibles

dans les banques de données comme RDP (Ribosomal Database Project ; Cole et al, 2005).

Dans le but d’identifier les symbiotes bactériens impliqués, l’ADN total a tout d’abord été

extrait des appendices péricardiques de Nautile à partir d’échantillons congelés à -80°C selon

le protocole décrit précédemment par Zhou et al (1996). Puis le gène codant pour l’ARNr 16S

bactérien a été amplifié par PCR grâce à différentes amorces universelles (Annexe 2). Les

fragments PCR ont été clonés après purification en utilisant le TOPO-TA cloning kit

(Invitrogen). L’étude concernant la campagne de collecte de septembre 2005 en Nouvelle

Calédonie a permis de séquencer une centaine de clones chez quatre individus, afin de

déterminer de manière exhaustive la diversité bactérienne associée à N. macromphalus.

Durant les autres campagnes de collecte, un nombre plus faible de clones (10-20) par

individus a été séquencé et le degré de significativité des banques de clones obtenues a alors

été testé statistiquement.


52

Encadré 4 : Diversité des bactéries

La classification des procaryotes est complexe : leur reproduction clonale est soumise à des contraintes encore peu connues (Williams & Embley, 1996) et leur morphologie est trop simple pour servir d’outil de classification (Olsen & Woese, 1993). Ainsi, le concept d’espèce généralement admis pour les Métazoaires ne leur est pas directement applicable. En intégrant la ressemblance génotypique dans la notion d’espèce chez les procaryotes, les travaux de Carl Woese (1990) ont apporté un nouveau regard sur la diversité microbienne en proposant une séparation des procaryotes en deux groupes distincts : Bacteria et Archae. L’arbre phylogénétique universel basé sur les séquences d’ARNr (Olsen & Woese, 1993) reflète cette vision des choses en suggérant une division du monde vivant en trois grands domaines : Bacteria, Archae et Eucarya (Figure 24).

Aucune définition stricte de l’espèce bactérienne n’est, aujourd’hui universellement acceptée et parmi les différents concepts disponibles, celui reposant sur le critère de similarité entre séquences d’ARNr 16S (Ward, 1998) est le plus communément utilisé (une même espèce étant définie par un pourcentage de similitude entre deux séquences supérieur à 97% ou 99% selon les cas). Toutefois, vu les difficultés inhérentes à la notion d’espèce chez les bactéries, l’emploi du mot phylotype lui est préféré pour décrire les séquences nucléotidiques identifiées et le domaine des bactéries est aujourd’hui généralement considéré comme un ensemble de procaryotes extraordinairement varié composé de 23 phylums (Figure 25).

Figure 24 : Arbre phylogénétique universel basé sur l’ARNr 16S représentant deux domaines procaryotiques et un domaine eucaryotique (Olsen & Woese, 1993)

Figure 25 : Arbre phylogénétique basé sur l’ARNr 16S représentant les principaux phylums bactériens (Madigan et al, 2002).


53

3.1.2. Tests statistiques

Les différentes séquences obtenues par séquençage de l’ARNr 16S ont été regroupées en

unités taxonomiques (OTUs) en fonction de leur pourcentage de similarité : 97% de similarité

définissant le genre bactérien (Stackebrandt & Goebel, 1994). Puis, l’indice de recouvrement

de la librairie de séquences analysée a alors été calculé par la formule:

[1-(n/N)]*100

n définissant le nombre d’OTUs comportant une seule séquence et N le nombre total de

séquences (Good, 1953).

L’indice de recouvrement ainsi calculé permet d’estimer la significativité de la diversité

bactérienne mesurée sur une échelle de 0 à 100.

La fréquence relative des différentes OTUs est aussi calculée pour chaque spécimen puis

l’homogénéité des données entre les différents spécimens est testée par un test Chi2 avec 5%

de significativité (p<0,05) (Zar, 1999).

3.1.3. Analyses phylogénétiques

Les séquences d’ARNr 16S obtenues ont été, dans un premier temps, analysées afin de

détecter la présence d’éventuelles séquences chimériques par l’intermédiaire de deux

programmes : Chimera check program (version 2.7 ; Maidak et al, 1997) et Bellerophon

(Huber et al, 2004). Seules les séquences sans aucun artefact (score inférieur à 1) ont été

incluses dans les analyses comparatives des banques de données en ligne en utilisant

différents algorithmes : BLAST (Altschul et al, 1994), FASTA3 (Pearson & Lipman, 1988) et

RDP (Cole et al, 2005). Les séquences des taxons bactériens les plus similaires ont alors été

incluses dans l’analyse et l’ensemble des séquences a été aligné à l'aide des logiciels

CLUSTALW (Thompson et al, 1994 ; www.ebi.ac.uk/clustalw) ou ARB (Ludwig et al, 2004 ;

http://www.mikro.biologie.tu-muenchen.de). Ce dernier permet un alignement plus précis en

prenant en compte l’information concernant la structure secondaire de l’ARNr 16S (Figure

26). Cette information liée à la fonction de l’ARNr 16S peut s’avérer déterminante,

notamment pour affiner la position phylogénétique d’une séquence d’un nouveau taxon

supérieur (l'ordre, la classe, le phylum). Les méthodes Neighbor-Joining avec la correction

Kimura " deux paramètres " (Kimura, 1980), Maximum de Parcimonie et Maximum de

vraisemblance (Olsen et al, 1994) ont été ensuite utilisées pour la construction d'arbres

phylogénétiques, à partir des alignements, dans le logiciel Phylip 3.6.


54

Le calcul des bootstraps sur l’alignement a permis de tester la robustesse de la topologie sur

1000 réplicats (Felsenstein, 2002). Enfin, les arbres obtenus ont été visualisés avec le logiciel

Treeview (Page,1996).

3.1.4. Gènes fonctionnels

Outre l’ARNr 16S, certains gènes associés au métabolisme azoté (Figure 27) ont été

recherchés à partir des échantillons dans le but de confirmer le potentiel métabolique des

symbiotes.

Figure 26 : Structure secondaire de l’ARNr 16S d’Escherichia coli. Les quatre couleurs indiquent les différents domaines fonctionnels de la molécule (extrait de : http://www.nd.edu/~aseriann/rna.html).

Figure 27 : Les différentes étapes du cycle de l’azote en milieu marin avec les différents gènes fonctionnels représentatifs des enzymes impliquées (les gènes étudiés sont encadrés) (schéma de Lam P).


55

L’étude s’est focalisée sur les gènes fonctionnels représentatifs (1) de l’enzyme catalysant

la réaction de nitrification (forme A de la monooxygenase de l’ammonium, gène amoA)

(Holmes et al, 1995 ; Rotthauwe et al, 1997 ; Purkhold et al, 2000) et (2) de deux autres

enzymes reconnues comme déterminantes dans le processus de dénitrification chez les

bactéries (forme S et K de la réductase du nitrite, gènes nirS et nirK ainsi que la réductase de

l’oxyde nitreux, gène nosZ) (Braker et al, 1998 ; Scala et al, 1998 ; voir aussi Encadré 1, page

19). Les amorces employées pour amplifier ces différents gènes fonctionnels par PCR sont

indiquées dans l’Annexe 2.

3.2. Etude de la distribution des bactéries par la technique de CARD-FISH

La détection des cellules procaryotes in situ a connu un développement sans précèdent

avec la technique de Fluorescent in situ hybridization (FISH) permettant la caractérisation

morphologique, le dénombrement et la localisation des populations bactériennes in situ.

(Olsen, 1986 ; Amann et al, 1990, 1995 ; Amann & Kuehl, 1998). Les séquences obtenues au

cours du séquençage de l’ARN ribosomal 16S permettent la réalisation de sondes plus ou

moins spécifiques (depuis l’embranchement jusqu’à la lignée bactérienne selon le niveau de

conservation de la région ciblée). Ces sondes sont ensuite marquées par un fluorochrome et,

après perméabilisation de la membrane des cellules actives, elles sont hybridées à l’ARNr 16S

contenu dans chacun des nombreux ribosomes, aboutissant à un signal identifiable sous un

microscope à épifluorescence (Figure 28).

Figure 28 : Principe de l’hybridation in situ avec une sonde oligonucleotidique monomarquée par un fluorochrome. Après une étape de perméabilisation, la sonde s’hybride à la séquence complémentaire présente en quantité variable dans la cellule et permet sa détection sous un microscope à épifluorescence.


56

Toutefois, dans certaines conditions, l’efficacité de cette technique peut parfois être

largement diminuée. Ainsi, la majeure partie des bactéries présentes dans l’environnement

aquatique étant de petite taille et possédant une faible croissance en réponse à la pauvreté

nutritive du milieu (Morita, 1997), le signal spécifique émis par hybridation de telles sondes

sur ces bactéries est souvent bien inférieur au seuil requis pour leur détection. De plus, dans le

cas des systèmes symbiotiques, l’autofluorescence naturelle du tissu de l’hôte peut largement

contribuer à ces difficultés de détection en créant un fort bruit de fond dans lequel le signal

spécifique des symbiotes se trouve alors rapidement perdu (Pernthaler et al, 2002).

Pour combler cette perte d’efficacité, les oligonucléotides marqués avec la horseradish

peroxidase (HRP), une enzyme d'environ 40 KDa isolée du raifort, sont de plus en plus

utilisées comme sonde fluorescente dans la technique de FISH. En effet, la combinaison des

oligonucléotides marqués avec la HRP et du système d'amplification de signal par le

complexe Tyramide-Streptavidine (TSA) (Figure 29) conduit à un signal amplifié de plus de

20 fois comparé aux sondes mono marquées (Sekar et al, 2004). Cette méthode dite

"Catalyzed Reporter Deposition - Fluorescent In-Situ Hybridization" (CARD-FISH)

représente un outil puissant pour la détection des micro-organismes (Sekar et al, 2003). Au

cours de ce travail, pour pallier à l’autofluorescence naturelle du tissu de l’hôte, les symbiotes

bactériens ont donc été détectés au sein des tissus de Nautile à l’aide de cette technique de

CARD-FISH avec des sondes diverses (universelles ou spécifiques de certains groupes

bactériens), dans des conditions stringentes (voir Annexe 3) et en suivant une adaptation du

protocole proposé par Pernthaler et al (2002).

Figure 29 : Principe de la technique de CARD-FISH. La réaction d’amplification du signal utilise la HRP liée à la sonde oligonucleotidique pour catalyser le dépôt de tyramide marquée par un fluorophore sur la séquence complémentaire ce qui permet d’augmenter le signal spécifique et la résolution sous microscope à épifluorescence. F:Fluorophore, T:Tyramide, SA: Streptavidin, HRP : Horseadish peroxidase.


57

Dans le but de contrôler la spécificité du signal obtenu, une sonde anti-sens

(NONEUB388) a aussi été utilisée lors de chaque hybridation. Enfin, afin d’avoir une vision

globale des cellules composant les tissus étudiés, une coloration totale du matériel génomique

a été réalisée sur chaque coupe avec du 4’,6-diamino2’phenylindole (DAPI), colorant

intercalant de l’ADN.

3.3. Quantification des bactéries par cytométrie en flux

La densité bactérienne présente dans les appendices péricardiques des Nautiloides a été

estimée par une approche semi-quantitative : la cytomètrie en flux (collaboration C. Courtis,

Observatoire de Banyuls-sur-mer). La cytomètrie en flux offre la possibilité d'analyser

plusieurs paramètres sur d'importantes populations bactériennes en solution (Servais et al,

1999). En effet, les bactéries passent une à une devant un faisceau laser d'une longueur d'onde

spécifique. Deux paramètres sont ensuite analysés par l'appareil : la diffusion lumineuse à

angle droit (SSC-H), corrélée à la taille de la bactérie et la fluorescence émise (Fl1-H) liée au

contenu des bactéries en acides nucléiques. Les tissus fixés au PFA 2%, ont été broyés, puis

centrifugés pendant 15 min à 3000 g, le surnageant a ensuite été récupéré pour être analysé.

Le liquide ponctionné dans les différents organes, fixé au PFA 2% est analysé en parallèle.

Afin de marquer le contenu en acides nucléiques des bactéries, des aliquots de 1 ml des

différents échantillons ont été colorés à l'aide de SYBR green I (colorant intercalaire des

acides nucléiques, 5 µM en solution finale).

Les analyses ont été réalisées à l'aide d'un cytomètre en flux FacsCalibur (Becton

Dickinson, San José, Ca) équipé d'un laser argon refroidi par air (488 nm, 15 mW). Des billes

fluorescentes (Polysciences Inc, Warrington, PA, diamètre 0,94 µm) ont systématiquement été

ajoutées à chaque échantillon analysé afin de normaliser la fluorescence émise (Fl1-H) et la

diffusion lumineuse à angle droit (SSC-H). Les bactéries ont pu ainsi être discriminées et

comptées selon leur SSC-H et la fluorescence liée à leur contenu en acides nucléiques

(mesurée à 530 nm ; Marie et al, 1997).

3.4. Isolement des bactéries en culture pure

Afin d’étudier la fraction « cultivable » de la diversité bactérienne associée aux

appendices péricardiques du Nautile, des isolements ont été mis en culture sur milieu artificiel

(collaboration J. Favet, Université de Genève). Une fois isolées, les souches bactériennes

pures ont été soumises à une série de tests physiologiques puis identifiées par séquençage du


58

gène codant pour l’ARNr 16S. Enfin, une phase de stockage à -80°C a été effectuée dans

l’attente de nouvelles analyses.

L’isolement sur milieu de culture artificiel peut fournir un matériel intéressant dans le

but d’étudier les interactions existant entre les différentes souches associées aux appendices

péricardiques de Nautile (compétition, amensalisme…). Ces interactions peuvent être

influencées par la quantité de nourriture disponible mais aussi par la production de substances

bioactives par les bactéries.

Certains exemples de relations d’amensalisme impliquent une production microbienne

de composés organiques spécifiques (Encadré 5, page 59) qui peuvent notamment causer des

ruptures dans la paroi cellulaire ou la membrane plasmique des autres colonisateurs (Walls et

al, 1993 ; James et al, 1996). Ce type d’activité physiologique, déjà observée dans de

nombreuses associations bactériennes chez les invertébrés marins (Barbieri et al, 2001 ;

Hentschel et al, 2001), peut être impliquée dans la protection des tissus de l’hôte contre des

agents pathogènes potentiels (Gram et al, 1999 ; Gomez-Gil et al, 2000) ou encore dans la

sélection des bactéries actives dans la compétition pour l’espace vital (Holmström et al,

1992). La découverte et la caractérisation de ces nouvelles substances bioactives permet, par

ailleurs, la création de nouveaux champs de recherche à forte valeur biotechnologique

(Holmström & Kjelleberg, 1999 ; voir Encadré 5, page 59).

Dans le but d’évaluer le potentiel antimicrobien des souches isolées du Nautile, un test

issu de la méthode de double couche, modifiée de Schilinger & Lucke (1989), a été

développée en collaboration avec l’UMR 5154 Chimie et Biochimie des Substances

Naturelles (MNHN).

3.5. Screening des souches à activité antimicrobienne et caractérisation des substances

bioactives

3.5.1. Détection des activités antimicrobiennes

Le principe du test consiste à inoculer par piqûre les souches isolées de Nautile sur un film

homogène de micro-organismes de référence en croissance. Un disque d'antibiotique est

ensuite ajouté sur chaque boîte de test comme contrôle positif. Puis l’activité antimicrobienne

est mesurée par l’intermédiaire du diamètre d’inhibition formé par chaque souche après

incubation du milieu test pendant 24 à 48 h à 24°C. Ce protocole fait l’objet d’une description

plus détaillée dans le Chapitre III.4.4 (voir l’article page 117).


59

Encadré 5 : Les interactions microbiennes, source de substances bio-actives

Certaines interactions impliquant des micro-organismes entraînent la production de composés spécifiques qui peuvent inhiber ou tuer un organisme qui y est sensible (amensalisme, compétition…). Un exemple classique concerne la relation mutualiste entre la fourmi Attine (Acromyrmex) et une bactérie filamenteuse (streptomycète). En effet, grâce à la production d’un antibiotique, cette bactérie filamenteuse contrôle Escovopsis, un mycète parasite persistant qui peut détruire le jardin fongique des fourmis (Currie, 2001 ; Poulsen et al, 2005 ; Figure 30).

Les micro-organismes peuvent empêcher la prolifération non contrôlée de microbes

étrangers en produisant des protéines et peptides antimicrobiens d’une grande diversité de structures et de modes d’action (pour revue consulter Yeaman &Yount, 2003). Certaines de ces molécules causent des ruptures dans la paroi cellulaire ou la membrane plasmique des bactéries et entraînent leur mort. C’est notamment le cas des bactériocines qui sont synthétisées selon la voie de biosynthèse ribosomique et sont généralement létales pour des espèces bactériennes voisines (Klaenhammer, 1988). Elles avantagent ainsi les cellules productrices par rapport aux autres bactéries. La plupart des bactériocines qui ont été identifiées sont des protéines et sont produites par des bactéries Gram-négatives (Klaenhammer, 1993). Les travaux récents s’intéressent de plus en plus à ces substances en réponse au développement croissant des résistances. En effet, comme des milliers de tonnes d’antibiotiques sont utilisés dans le traitement de maladies, mais aussi comme additifs dans la nourriture du bétail, un nombre croissant de maladies résistent aux traitements suite à la propagation d’une résistance à ces substances. Cette augmentation de la résistance aux antibiotiques est un problème d’avenir et les microbiologistes se doivent donc de trouver de nouvelles solutions. Pour beaucoup d’entre eux, le fourmillement de vie microbienne océanique et plus particulièrement les bactéries associées aux invertébrés marins, représente une source de nouveaux métabolites bioactifs d’une incroyable richesse (Thakur et al, 2002), notamment pour certaines toxines qui ne se trouvent pas chez les micro-organismes terrestres. Seul un faible pourcentage de ces symbiotes bactériens a été étudié jusqu’ici pour leur potentiel antimicrobien. Les premiers travaux ont permis de découvrir divers composés exposant une grande variété de structures chimiques et d’activités biologiques (Austin, 1989 ; Faulkner, 1993) ouvrant ainsi un champ de recherche prometteur pour l’avenir (Holmström & Kjelleberg, 1999). Parmi les découvertes récentes, on peut citer la didemnine B, un puissant antiviral isolé du genre Prochloron.

A B

Figure 30 : A : Schéma décrivant l’emploi par des fourmis attines de streptomycètes producteurs d’antibiotique pour contrôler les mycètes parasites dans leur jardin fongique B : Production d’antibiotique et inhibition de croissance d’une bactérie sensible sur un milieu gélosé (extrait de Prescott et al, 2003).


60

Lors de ce travail, ce test a été réalisé entre les différentes souches isolées et contre

différents micro-organismes de référence : Escherichia coli 363 (collection du laboratoire de

Chimie et Biochimie des Substances Naturelles), Vibrio harveyi CIP 103192, Candida

albicans (collection du laboratoire de Chimie et Biochimie des Substances Naturelles) et

Micrococcus luteus CIP 5345. Un protocole a ensuite été développé dans le but de caractériser

les substances antimicrobiennes produites par les souches actives isolées des Nautiles

3.5.2. Extraction, concentration et caractérisation des substances bioactives

Le protocole mis en place lors de cette étude (Figure 32) utilise la comparaison des

cultures bactériennes incubées à 28 et 38°C afin de ne purifier que les composés actifs

(Annexe 4 et 5). Les peptides antimicrobiens étant la plupart du temps des composés

hydrophobes (Tossi & Sandri, 2002), une purification a été réalisée sur la base des propriétés

hydrophobes des molécules à l’aide d’une colonne de phase inverse suivie d’une

concentration par évaporation rotative (Annexe 6) puis d’une séparation par chromatographie

liquide à haute performance (HPLC) (Annexe 7). L’isolement a été bio guidé par la mesure de

l’activité antimicrobienne des fractions de purification (voir ChapitreIII.3.5.1, ci-dessus et

page 58, Annexe 5) et une première caractérisation des composés actifs a ensuite été réalisée

en spectrométrie de masse simple (MS) et spectrométrie de masse en tandem (MS-MS)

(Annexe 8).

Figure 31 : A : Principe des tests antimicrobiens réalisés par analyse de diffusion sur Agar B : illustration d’un test antimicrobien réalisé contre M. luteus

A B


61

Figure 32 : Les différentes étapes du protocole menant à la caractérisation des substances actives produites par les souches bactériennes isolées de Nautile


62

3.6. Etude du métabolisme du complexe symbiotique par la méthode d’incubations et

analyses isotopiques

L’étude des aspects fonctionnels des micro-organismes est longtemps restée limitée aux

souches isolées en culture pure. Dans ce contexte, l'utilisation de traceurs isotopiques a

récemment fourni une approche puissante pour évaluer les capacités métaboliques de

populations bactériennes non cultivées (Boschker & Middelburg, 2002 ; Kuypers et al, 2005).

Cette approche consiste à maintenir les populations bactériennes étudiées dans un milieu

d’incubation avec un traceur isotopique (15N, 13C…) en concentration connue. Après un temps

d’incubation donné, l’analyse du milieu en spectrométrie de masse permet de déterminer

l’assimilation mais aussi la transformation du traceur isotopique par les populations

bactériennes et donc de préciser leur métabolisme (Dalsgaard et al, 2003).

Dans le cadre de cette étude (collaboration avec G. Lavick, Institut Max Plank de

Bremen), un protocole consistant à incuber le complexe symbiotique organe-bactéries dans de

l’eau de mer stérile contenant différents composés (ammonium, nitrate) marqués à l’aide du

traceur isotopiques N15, a ainsi été développé (Figure 33).

Deux lots d’expériences ont ainsi été réalisés en conditions hypoxiques (O2<20µM) afin

de préciser les capacités métaboliques des bactéries symbiotiques. Lors de chaque expérience

un contrôle négatif a été réalisé à l’aide d’un organe bouilli puis incubé dans les mêmes

conditions. Deux types d’analyses ont alors été réalisées sur les échantillons incubés.

• Analyse en spectrométrie de masse afin de mesurer le gaz 15N2 produit par les

bactéries

Figure 33 : Protocole suivi pour les incubations isotopiques du complexe symbiotique bactéries- organe excréteur de Nautile.


63

• Analyse des concentrations totales de NO3- et NO2

- à l’aide de la réaction de réduction

du Vanadium Chloride (« chemiluminescence », Braman & Hendrix, 1989) afin de

mesurer l’assimilation des composés azotés par les bactéries.

Ces analyses doivent ainsi permettre de tester l’hypothèse d’une implication des

symbiotes dans le métabolisme azoté du Nautile (Schipp, 1990) et plus particulièrement dans

la transformation de ses déchets azotés en diazote (Boucher-Rodoni & Mangold, 1994).

3.7. Co-culture des cellules de Nautile et bactéries associées

Malgré le développement des techniques moléculaires, l'absence de cultures pures

présente aujourd’hui encore un défi sérieux dans l’étude de l’écologie des bactéries

symbiotiques. L’isolement et la maintenance de ces micro-organismes sur milieu artificiel

peuvent permettre une compréhension plus complète de leur physiologie et des processus

complexes dans lesquels ils sont engagés (Zengler et al, 2002). Récemment, plusieurs auteurs

ont montré que des micro-organismes précédemment reconnus comme

« incultivables » pouvaient être cultivés en culture pure en présence des composants

chimiques de leur environnement. (Kaberlein et al, 2002 ; Rappé et al, 2002). De la même

manière, le maintien de bactéries symbiotiques en culture paraît envisageable grâce aux

facteurs de croissance présents dans le tissu hôte. Lors de cette étude, un protocole de mise en

culture et maintenance des cellules d’appendices péricardiques de Nautile, a été développé

(collaboration I. Domart–Coulon, UMR 5178 BOME, MNHN) afin d’étudier les interactions

pouvant exister entre les bactéries symbiotiques et leur hôte au niveau cellulaire. Ce protocole

fait l’objet d’une description plus détaillée dans le Chapitre III.4.2 (voir l’article page 97).


64

4. Résultats

4.1. Mise en évidence et caractérisation d’une double symbiose dans les organes

excréteurs de N. macromphalus

Article: Enigmatic dual symbiosis in the excretory organ of Nautilus macromphalus

(Cephalopoda:Nautiloidea).

Pernice, M., Wetzel, S., Gros, O., Boucher-Rodoni, R., Dubilier, N.

Article à soumettre

La définition d’un système symbiotique passe par l’identification de la diversité

bactérienne associée mais aussi par l’étude de son intégration, sa persistance et de son

fonctionnement au sein même de l’organe hôte. Ainsi, l’étude du rôle des bactéries et de leurs

interactions symbiotiques doit bénéficier des connaissances sur la physiologie de l’hôte. Les

nombreux villis composant les appendices péricardiques du Nautile, collectent le sang et

sécrètent un liquide d’excrétion. Ce liquide d’excrétion acide et riche en ammonium (jusqu'à

200 ppm, Schipp & Martin, 1987) est finalement rejeté dans la cavité de palléale par

l’intermédiaire du coelome péricardique. Chaque villus constitue de plus une unité

d’excrétion à part entière organisée en trois grandes structures fonctionnelles (Schipp et al,

1985, voir Chapitre II.3.3.2, et Figure 21, page 43).

Les objectifs de cette étude consistaient donc, d’une part à identifier les symbiotes

bactériens associés aux appendices péricardiques de Nautilus macromphalus afin de préciser

leur spécificité vis-à-vis de ce système et leur histoire évolutive. D’autre part l’analyse de leur

répartition spatiale devait permettre de tester l’hypothèse d’une structuration des populations

symbiotiques en fonction de l’organisation fonctionnelle de l’organe hôte. Les symbiotes

bactériens ont donc été identifiés par séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S et leur

distribution spatiale a été déterminée en relation avec la structure fonctionnelle de l’organe

par hybridation de sondes spécifiques (CARD-FISH) et analyse des tissus en microscopie

électronique à transmission (MET).

L’étude a permis de confirmer l’existence d’une importante densité de bactéries associées

aux appendices péricardiques de N. macromphalus. Contrairement aux précédentes

observations en microscopie électronique qui avaient suggéré la présence d’un seul groupe

bactérien (Schipp et al, 1990), l’emploi des techniques moléculaires a prouvé que la


65

population bactérienne est composée de deux phylotypes (beta protéobactéries et spirochètes).

L’hybridation de sondes spécifiques par CARD-FISH parallèlement à l’analyse en MET a

confirmé le statut symbiotique ainsi que la forte structuration de la population bactérienne

avec deux niveaux d’organisation présents au sein de l’organe hôte :

• Un premier niveau d’organisation générale étroitement lié à la structure fonctionnelle

de l’organe avec une concentration des symbiotes dans la région baso-médiane des

villi (fonctions d’ultrafiltration et de réabsorption) et leur absence totale de la partie

apicale (fonction de sécrétion)

• Un deuxième niveau d’organisation interspécifique qui semble lié aux contraintes

biotiques et à l’écologie au sein de ce « microécosystème » avec une prédominance

des beta protéobactéries dans les cavités profondes des villis et une présence des

spirochètes plus en périphérie.

Enfin, l’importante distance génétique des deux symbiotes vis-à-vis des souches

référencées dans les banques de données témoigne de leur spécificité vis-à-vis de N.

macromphalus et suggère l’hypothèse d’une co-évolution hôte-bactéries.


66


67

Enigmatic dual symbiosis in the excretory organ of

Nautilus macromphalus (Cephalopoda:Nautiloidea)

PERNICE Mathieu a,*, WETZEL Silke b, GROS Olivier c, BOUCHER-RODONI Renata a,

DUBILIER Nicole b

Affiliations:

a UMR 5178 Biologie des Organismes Marins et Ecosystèmes, Département Peuplements et

Milieux Aquatiques, Muséum National d’Histoire Naturelle, 55 rue Buffon, 75005 Paris,

France. b Max Planck Institute for Marine Microbiology, Bremen, Germany. c UMR 7138 Systématique, Adaptation, Evolution, Département de Biologie, Université des

Antilles et de la Guyane B. P. 592, 97159 Pointe à Pitre Cedex, Guadeloupe, France.

KEYWORDS: Bacteria-host interaction; 16S rRNA gene; Cephalopods; Nautilus

macromphalus; Excretion

* Corresponding author: PERNICE Mathieu

Muséum National d’Histoire Naturelle. Département Peuplements et Milieux Aquatiques,

Biologie des organismes marins et Ecosystèmes (UMR 5178 CNRS). 55 rue Buffon, 75005

Paris, France.

Tel. : +331 40 79 30 97.

Fax. : +331 40 79 57 34.

Email : [email protected]


68

INTRODUCTION

It is now well accepted that symbiosis is a pivotal component in the existence of many

animals and plants by providing various indispensable functions. The acquisition and

maintenance of one or more organisms by another often leads to novel structure and

metabolism. Hence, the study of pioneering symbiotic systems has resulted in many exciting

discoveries such as the role of symbiotic bacteria in the morphegenesis of luminescent light

organ in a squid (Euprymna scolopes/Vibrio Fisheri association; McFall-Ngai and Ruby,

2000) or in the achievement of sulphur cycle in an oligochaete worm (Olavius algarvensis

with its sulphur oxidizing and sulphur reducing symbionts; Dubilier et al, 2001). But

symbiotic systems are in reality more fluid and less linear than categorization into mutualism,

parasitism and commensalism (Douglas, 1994). Such complexity often causes difficulties in

addressing new symbiotic systems and more particularly in the identification of the partners

involved, the examination of their specificity and the elucidation of their functional roles

(Graf et al, 2006).

The evolutionary history of both partners is also a major component of the symbiotic

relation, symbiosis being an important driving force of metazoan evolution (McFall-Ngai,

2002). Therefore, the study of symbiotic associations in ancient lineages might provide

further insight into the origin of major physiological adaptations. In this respect, the symbiotic

associations in the excretory organs of the “living fossils” Nautiluses (Schipp et al, 1985) are

of particular interest, Nautiluses being of Cambrian origin (542-500 mya). They are also the

only extant cephalopods with an external chambered shell (filled with about 90% of Nitrogen

gas) resembling that of extinct ammonoids (fig 1A) (Norman, 2000). A better comprehension

of their life history, behaviour, ecology, physiology and metabolism has been suggested by

many authors as a mean of understanding the success and eventual demise of the ammonoids

(Boutilier et al, 1996; Staples et al, 2000).


69

Conversely to other extant Cephalopods in which various organs undertake the

excretory function, in Nautilus, only pericardial appendages assume most of the three

excretory processes (ultrafiltration, reabsorption and secretion) (Martin, 1983). The main end

product of excretion is ammonia (Boucher-Rodoni, 1989) and the numerous contractile villi

forming the four pericardial appendages collect the blood from capacious sinuses (Fig 1B)

and secrete the acid ammonia rich excretory fluid (up to 200 ppm, Schipp and Martin, 1987)

in the pericardial coelom to be finally rejected in the mantle cavity (fig 1A) (Mangold et al,

1989). Nautilus pericardial appendages bacteria were described and characterized as

Pseudomonodales by isolation on artificial culture media. (Schipp et al, 1990). However,

since this previous study, it has been widely acknowledged that cultivating methods reveal

only a small fraction of the total bacterial diversity (Amann et al, 1990, Pace 1997). Indeed,

molecular approach has shown an unexpected microbial diversity suggesting potential

multiple partners’ interaction in N. macromphalus pericardial appendages (Pernice et al.,

2006). The presence of bacteria in pericardial appendages, an ecological niche rich in

ammonia, has raised several hypothesis concerning their potential implication in Nautilus

Nitrogen metabolism such as (i) a putative detoxification by oxidizing ammonia (Schipp et al,

1990) or (ii) the use of nitrogenous wastes by bacteria to produce the Nitrogen gas filling

Nautilus shell and involved in its neutral buoyancy (Boucher-Rodoni and Mangold, 1994).

The aim of the present study was thus to define Nautilus macromphalus

(Cephalopoda: Nautiloidea) excretory organs as a new symbiotic system. The phylogenetic

position of bacteria associated to the pericardial appendages was investigated by 16S rRNA

gene analysis and their localization within the cellular structure of the organ was determined

by Fluorescent in situ hybridization (CARD-FISH) and transmission electron microscopy

(TEM). The specificity of this bacterial-invertebrate interaction and its possible implications

in Nautilus metabolism are discussed.


70

MATERIALS AND METHODS

Specimens’ collection

Four Nautilus macromphalus individuals were collected on the outer shelf of New-

Caledonia in september 2005. All specimens were dissected aseptically and for each specimen

the four pericardial appendages were processed as follows: two organs were divided in two,

one part was immediately frozen in liquid Nitrogen and stored at -80°C for DNA extraction

and the other fixed in 2% paraformaldehyde for CARD-FISH (see below). The two last

pericardial appenages were fixed for transmission electron microscopy (see below).

Transmission electron microscopy

Pericardial appendages pieces from 4 individuals were fixed at 4°C for 12h in a

fixative solution containing 3.2 % glutaraldehyde in sterile sea water (pH 7.4) and washed in

0.05% of NaN3 in sterile sea water (pH 7.4). After a brief rinse in 0.1M pH 7.2 caccodylate

buffer, adjusted to 900 mOsM with NaCl and CaCl2 in order to improve membrane

preservation, samples were fixed 45 minutes in 1% osmium tetroxide at room temperature,

then rinsed in distilled water, and post-fixed with 2% aqueous uranyl acetate for one more

hour before embedding in epon-araldite. Semithin sections (0,5µm thick) and ultra-thin

sections (60nm thick) were obtained using an Ultracut E microtome (LEICA). Transmission

electron microscopy observations were performed on a Philips 201 operated at 75 kV

accelerating voltage.

DNA extraction

DNA was extracted from Pericardial Appendages (PA) of 4 Nautilus, by the method

described by Zhou et al. (1996) by using proteinase K for cell digestion and a standard

chloroform-isoamyl alcohol extraction procedure. DNA was precipitated in isopropanol,

washed with 70 % ethanol, resuspended in 1X TE buffer, and stored in aliquots at -20°C prior

to 16S rRNA gene amplification and sequence analysis.


71

16S rRNA gene PCR amplification

Bacterial 16S rRNA gene PCR amplification was performed using GM3 (5'-

AGAGTTTGATCMTGGC-3') and GM4 (5'-TACCTTGTTACGACTT-3') bacterial primers

(respectively Escherichia coli position 8 to 23 and 1492 to 1477) (Muyzer et al, 1995). The

reaction mixture contained 50 pmol of each primer, 6 µg of bovine serum albumin, 2.5 µmol

of each of deoxynucleoside triphosphate, 1X SuperTaq buffer and 0.2 U of eppendorf Master

Taq (Eppendorf, Hamburg, Germany) and the volume was adjusted with sterile water to 20

µl. PCR were conducted in a thermocycler (Eppendorf, Hamburg, Germany) with an initial

denaturing step (96 °C for 5 min) followed by 25 cycles of 94 °C for 1 min, 45 °C for 1 min

and 72 °C for 3 min and a final elongation step at 72 °C for 5 min. PCR bias was minimized

by using only 25 amplification cycles (Duperron et al, 2005) and pooling four separate PCRs

for each Nautilus. Amplified DNA was checked by 1.5% agarose gel electrophoresis and

purified with a QIAquick PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany).

Cloning and sequencing

A 16S rRNA clone library was constructed for each of the 4 Nautilus. Purified PCR

products were cloned by insertion into plasmid vector PCR4 TOPO TA Cloning (Invitrogen,

Carlsbad, Calif.) following the manufacturer’s instructions. Positive clones were grown

overnight in Luria-Bertani medium and the insert of Escherichia coli colonies was amplified

by a 35 cycles PCR using M13F and M13R primers. The reaction mixture contained 50 pmol

of each primer, 6 µg of bovine serum albumin, 2.5 µmol of each deoxynucleoside

triphosphate, 1X SuperTaq buffer, 1X Enhancer and 0.2 U of eppendorf Master Taq

(Eppendorf, Hamburg, Germany) and the volume was adjusted with sterile water to 20 µl.

The size of PCR products was controlled by 1.5% agarose gel electrophoresis.

For each of the 4 individuals, 87 to 105 clones were sequenced partially in a variable

region of the 16S rRNA (E. coli positions 518 to ca. 1,000). After contig assembly and


72

alignment with Sequencher 4.5 (Gene Codes Corporation, Michigan), putative Chimeric

sequences were eliminated by checking with Bellerophon (Huber et al., 2004). A total of 81

representative clones were fully sequenced in both directions. Sequencing reactions were

performed by using BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit from Applied Biosystems

on the ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, Calif.).

Phylogenetic reconstruction

Sequences were compared to various databases by using BLAST (Altschul et al, 1994),

FASTA (Pearson and Lipman, 1988) and RDP (Cole et al., 2005), highly similar sequences

were included in the analysis. The sequence data were analyzed using the ARB software

package (Ludwig et al, 2004; www.arb-home.de) and assigned to a database of approximately

40000 16S rRNA sequences. Only sequences >1300 nt were used for alignment and tree

construction. Sequences alignment was performed according to the 16S rRNA secondary

structure with the Integrated Editor and then corrected manually. Preliminary analysis of 35

full sequences of Nautilus symbionts was performed by quick parsimony methods integrated

to ARB to select an appropriate data set. Finally, phylogenetic trees were then reconstructed

using Maximum-Parsimony (Sanderson, 1990), and Maximum-Likelihood (Olsen, et al 1994)

analyses with different filter sets (none, termini, eubacteria, β−proteobacteria). Bootstrap

analyses (1000 replicates) were performed for both analyses to test the robustness for each

topology.

CARD-FISH

Nautilus PAs from 4 specimens were fixed for CARD-FISH in 2% formaldehyde in

sterile seawater at 4°C for 4 h. After two washes in 1X phosphate buffered saline (PBS:10mM

sodium phosphate, 130 mM NaCl), samples were stored at -20°C in 0.5X phosphate-buffered

saline–50% ethanol (1:1). Fixed PAs were dehydrated in an increasing series of ethanol and

xylene before being embedded into paraffin. Histological sections (4 µm) were collected on


73

gelatine coated slides. Paraffin was removed from the sections with xylene (three 10-min

treatments), and the sections were rehydrated in a decreasing ethanol series. Hybridization

was performed in preheated chambers containing tissue wetted with hybridization buffer (0.9

M NaCl, 0.02 M Tris-HCl, 0.01% SDS, 1% blocking reagent, 10% Dextran sulphate, 35%

formamide). The sections were covered with a mixture containing 50 ng of HRP-probe in 150

µl of hybridization buffer and then hybridized as described by Pernthaler et al. (2002). The

slides were washed with 1X PBS for 10 min, MilliQ water for 1 min, 96% ethanol for 1 min,

air dried, and covered with an antibleaching agent (e.g. Citifluor AF1, Citifluor Ldt, London)

amended with DAPI (final concentration 1µg/ml) and a coverslip. A total of about 120 PA

sections obtained from 4 Nautilus were visually examined for differences in symbiont’s

repartition and relative abundance by using a DMLB epifluorescence microscope (Leica

Microsystèmes SAS, France).

A specific probes was designed for each of the two 16S rRNA phylotypes found in

Nautilus macromphalus by using the PROBE_DESIGN function of ARB and the 16S rRNA

accessibility information provided by Behrens et al. (2003). The specificity was checked by

using BLAST (Altschul et al., 1994). The probe specific for the β−proteobacteria symbiont,

NauBet66 (5’-AAGCTTCTCTCGTTCCG-3’) was revealed with Alexa488 (Invitrogen,

Carlsbad, Calif) and the probe specific for the spirochete symbionts and NauSpiro255 (5’-

TGGTACGCTCTTACCCTA-3’), was revealed with Alexa546 (Invitrogen, Carlsbad, Calif).

The stringency conditions were evaluated with a gradient of formamide (10-50%). Thirty five

percent of formamide gave the optimal images (high specific signal and low background

fluorescence) and was chosen for all hybridizations. The general Bacteria probe EUB338

(Amann et al., 1990) was used as a positive control, and the NON338 (Wallner et al., 1993)

probe was used as a negative control.


74

RESULTS

Bacterial diversity and phylogeny

Comparative bacterial 16S rRNA gene sequence analysis of a total of 385 partially

sequenced and 81 fully sequenced clones from four Nautilus macromphalus pericardial

appendages revealed two distinct bacterial phylotypes (Table 1) with a low sequence variation

within each phylotype (0 to 0,4%). Phylogenetic analysis by using Parsimony and Maximum-

likelihood with a variety of data sets (Fig. 2) clustered the two phylotypes within two

phylogenetic distinct bacterial groups, respectively β−Proteobacteria and Spirochaeta. But

the bacterial phylotypes associated to N. macromphalus are not closely related to symbionts

from other hosts species or of free-living bacteria (<90% in 16S rRNA gene sequence

similarity) and they appear thus to be specific to their host. .

N. macromphalus β−proteobacteria symbiont is phylogentically associated to a clade

of free-living, ammonia-oxidizing bacteria from the family Nitrosomonads with Nitrosospria

multiformis and Nitrosospira briensis [Teske et al, 1994] as its closest relatives (respectively

87.5 and 87.4% identity). This phylogenetic affiliation is not clearly supported by bootstrap

values (<60%), but remained stable after the application of different tree-building algorithms

(Maximum of parcimony and Maximum likelihood) with different filter sets supporting its

relevance (Hillis and Bull, 1993).

The 16S rRNA sequence of the N. macromphalus spirochete symbiont belongs to a

monophyletic group including free-living spirochetes and gutless oligochaetes

endosymbionts. Inside this group, it forms a highly supported clade (bootstrap value >99%

with all treeing methods) with two free living strains: Spirochaeta bajacaliforniensis [Magot

et al, 1997] and Spirochaeta smaragdinae [Fracek et al, 1985] (respectively 89.8 and 89.3%

identity).


75

In situ identification

Examination of pericardial appendage longitudinal section hybridized with the

universal Eub388 probe confirmed the presence of associated bacteria in the baso-medial

region of N. macromphalus pericardial villi whereas the apical part of these villi was devoided

of any bacteria (Fig. 3A). Hybridization by using specific probes established the coexistence

of the two ectosymbiotic bacterial phylotypes in all examined specimens (Fig. 3B). The probe

specific to the β−proteobacteria related sequence (NauBet66) revealed a thin, rod shaped

bacteria distributed in both the peripheric as well as the invaginated epithelial areas (Fig 3C

and D). The NauSpiro255 probe specific to the spirochete related symbiont hybridized a small

coccoid bacteria generally assigned to peripheric areas, deeply associated to the pericardial

epithelium (Fig. 3C and D). A nonquantitative, visual comparison of pericardial appendages

from the 4 N. macromphalus specimens revealed similarly the coexistence and distribution of

the two symbiont phylotypes in most of the 120 sections examined. The hybridization patterns

of the probes specific to the β−proeteobacteria and spirochete symbionts of N. macromphalus,

corresponded to those from the general eubacterial probe Eub388.

Transmission electron microscopy

Ultrastructural observations of pericardial villi in the baso-medial region showed an epithelial

layer of excretory cells (Fig. 4A and B) filled with a branched lacunar system. This epithelium

was characterized by polar organization with (i) “labyrinth structures” characteristic of active

transporters abutting blood lacunae in the basal part, (ii) high content of mitochondria in the

medial part (Fig. 4C) and (iii) an apical border of high microvilli (Fig. 4A and B). Higher

magnification confirmed a high density of extracellular bacteria associated to the actual

microvilli with the coexistence of, at least, two bacterial morphotypes (Fig. 4D). In almost all

the tissue sections examined, the coccoid shaped bacterium (1.53±0.20 µm by 0.8±0.07 µm)

was reported basally within the microvilli (Fig. 4E) while the rod shaped bacterium


76

(0.23±0.06 µm by 2.2±0.39 µm) appeared more apically attached by fine filamentous material

to these microvilli (Fig. 4F).

DISCUSSION AND CONCLUSION

Cephalopods are known to be ammonotelic, (i.e) more than 70% of their Nitrogen

metabolic wastes are rejected as ammonia (Boucher-Rodoni, 1989). Transformation of the

waste products of Nitrogen metabolism in relation to buoyancy appears to be one of the major

adaptations to life-style and environmental changes during the course of evolution of

cephalopods (Denton, 1974; Boucher-Rodoni and Mangold, 1994). Here, we report that N.

macromphalus harbors a high density of β−proteobacteria and spirochete phylotypes in its

pericardial appendages, organs assuming most of the excretory processes. While it is now

well accepted that symbioses for recycling nitrogenous wastes products have evolved in a

number of terrestrial invertebrates lineages (Cochran, 1985; Sasaki et al, 1996, Van borm et

al, 2002, Schramm et al, 2003) such symbioses have never been found among marine

invertebrates, so far. The N. macromphalus bacterial symbiotic association reported here is

thus the first evidence that such association can exist among marine invertebrates. It concerns

a highly specialized organ, unique among cephalopods, and assuming most of the excretory

processes. The bacteria associated to the pericardial appendages are not closely related to any

known bacteria and appear to be specific to N. macromphalus host. In addition, the

β−proteobacteria related symbionts are phylogenetically affiliated to Nitrosomonads, an

ammonia oxidizing lineage that have never been, to our knowledge, shown to enter

associations with animals.

The exact mechanisms by which the symbionts are involved in N. macromphalus

excretion remain to be studied. However, these bacteria must be implied in such a symbiotic

function for several reasons: (i) the attachment and concentration of symbionts to the outer


77

epithelium in the baso-medial region of pericardial villi suggest that they could be active in

the ultrafiltration and reabsorption processes (Fig. 3A); (ii) the ultrastructure of this outer

epithelium and its polar organization are characteristic of an energy requiring, transport active

tissue (Martin, 1983, Fig. 4A and B); (iii) the β−proteobacteria symbionts are

phylogenetically related to ammonia oxidizing bacteria from Nitrosomonads radiation (Fig.

2), a bacterial group able to convert ammonia to nitrite (Hooper et al, 1997). Nevertheless,

although it has been inferred that any 16S rRNA gene sequence that falls within

Nitrosomonads radiation was originally carried by ammonia oxidizing bacteria (Kowalchuck

and Stephen, 2001), it is now well accepted that 16S rRNA gene might not be sufficient as

single molecular marker to assume bacterial metabolic capabilities and to finely investigate

close phylogenetic relations (Rotthauwe et al, 1997; Duperron et al, 2006). In this respect, the

amoA gene coding for the alpha-unit of ammonia monooxygenase could be much more

informative as it contains a greater level of sequence variation (Kowalchuck and Stephen,

2001). Preliminary attempts to amplify this gene by using several set of primers (Holmes et al,

1995; Rotthauwe et al., 1997; Purkhold et al, 2000) didn’t allow us to confirm the presence of

this gene among the N. macromphalus symbiotic population (Pernice, unpublished data).

Spirochetes are widespread in several environments, either as free living cells, mainly

in marine and limnic sediments, or host associated as commensals or parasites of animals and

humans (Dubilier et al, 1999; Cabello et al, 2001; Prescott et al, 2003; Dröge et al, 2006). By

comparison of 16S rRNA gene sequence, one of the closest relative to N. macromphalus

spirochete symbionts is Spirochaeta smaragdinae, a free living, obligate anaerobe that

ferment carbohydrates (Magot et al, 1997), suggesting fermentation as one possible metabolic

pathway of the N. macromphalus spirochetes. However, these symbionts could also have a

completely different metabolism, just as the spirochete symbionts in termites do not have

properties of their closest free-living relatives, but, interestingly, are involved in the Nitrogen


78

nutrition of their host by the recycling of excretory Nitrogen (Breznak, 2002) and the

acquisition of new Nitrogen through N2 fixation (Tayasu et al, 1994; Breznak et al, 2001).

Further investigations are then needed to understand the exact functions by which the

β−proteobacteria and spirochete symbionts are involved in N. macromphalus excretion. This

may include the use of 15N tracer experiments coupled with multiple-isotope imaging mass

spectrometry (MIMS) in order to measure the assimilation of various Nitrogen compounds by

symbionts directly in N. macromphalus pericardial appendages tissue at a cellular scale

(Luyten et al, 2006).

An interesting future direction concerning N. macromphalus symbiosis will be the

understanding of key factors that contribute to the distribution patterns inside pericardial

appendages of β−proteobacteria and spirochete symbionts. Indeed, even if some TEM

observations allowed to reveal some spirochetes symbionts in the cavities of pericardial

appendages, the predominance of the β−proteobacteria symbionts in these regions was clearly

observed in CARD-FISH (Fig. 3 B, C, D). This spatial distribution allows to consider the N.

macromphalus pericardial appendages as a micro-ecosystem harboring two bacterial species

that have established their own ecological niche. Additional examination of N. macromphalus

pericardial appendages by combining CARD-FISH with microsensor technology will thus

permit us to inspect the relative distribution of β−proteobacteria and spirochete symbionts

with respect to the microscale gradients of key factors such as oxygen, ammonia, nitrite and

nitrate (De Beer et al, 1997).

Finally, symbiosis being an important driving force of metazoan evolution (McFall-

Ngai, 2002), it would be of great interest to explore the N. macromphalus dual symbiosis

from an evolutionnary point of view to apprehend where and when this symbiosis evolved.

In this respect, according to the most reliable rate of base substitution in the 16S rRNA gene

for prokaryotes (1% per 50 MA; Ochman and Wilson, 1987, Moran et al, 1993; Dröge et al,


79

2006), the large genetic distance (>10%) observed in comparative 16S rRNA gene analysis

can lead to speculate (i) that the last common ancestors to N. macromphalus symbionts must

have existed earlier than 500 MA ago (515 to 630 mya) and (ii) that the diversification of

these symbionts may have started with the acquisition by the common ancestor of Nautiloidea

(cambrian origin: 542 to 500 mya). In congruence with these results, preliminary comparison

to 16S rRNA gene sequences obtained from Nautilus pompilius specimens collected in

Philippines (Pernice et al, in prep), showed that N. macromphalus and N. pompilius, share

highly similar symbiont phylotypes (>99,5% identity), supporting that this symbiosis is

independent of geographic or environmental factors and could be widespread among Nautilus

species.

Acknowledgments

We thank the Aquarium and the centre IRD of Nouméa for their help in providing Nautilus

macromphalus specimens from New-Caledonia. We are grateful to those who commented on

the presentation of the study at the 5th ISS meeting in Vienna and to the “Service de

Microscopie Electronique” of the “IFR Biologie Intégrative” for the electron microscope

supply. P. M. was granted by the French Ministry for National Education and Research and

by the Max Planck Institute for Marine Microbiology with a Fellowship EST Marie Curie.

This work was supported by the Max Planck society, University Pierre-et-Marie Curie,

Muséum National d’Histoire Naturelle and CNRS (UMR5178).


80

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Table 1: Number of partial (from nucleotide 518 to nucleotide ca.1,000 based on E. coli

numbering) and nearly full 16S rRNA gene sequences (ca.1,450 nucleotides) obtained from

cloned PCR products amplified from Pericardial Appendage DNA of four Nautilus

macromphalus specimens.

Number of partial sequences Number of full sequences

Specimen source β-Proteobacteria Spirochaeta Total β-Proteobacteria Spirochaeta Total

N1 49 54 103 14 8 22

N2 52 35 87 13 7 20

N3 76 29 105 12 6 18

N4 68 21 89 13 8 21

Total 245 139 384 52 29 81


88

Figure1: The major morphological components of the shell and the central circulatory system

of Nautilus macromphalus.

A: Diagrammatic scheme of a longitudinal section of Nautilus (modified from Martin, 1983;

Ward, 1988; Mangold et al, 1989).

B: Simplified diagram of the excretory system and associated circulatory structures of

Nautilus.

A BV, afferent branchial vein; D A, dorsal aorta; E BV, efferent branchial vein; G, gill; H,

heart; PA, pericardial appendage; RA, renal appendage; RS, renal sac; VC, vena cava.


89

Figure 2: The phylogenetic relationships of the spirochete and β−proteobacteria symbionts of

N. macromphalus (Bold face type) inferred from 16S rRNA (1411 sites analysed, Negative

log likelihood= - 11,857). Tree was constructed by the ML method. Numbers at each branch

point are the bootstrap values for percentages of 1,000 replicate trees calculated by MP

(upper) and ML (lower) methods. Only values > 60% are shown. Two Cyanobacteria species

(Trichodesmium thiebautii: AF013027 and Merismopedia glauca: AJ781044) were used as

outgroup. AOB: Ammonia Oxidizing Bacteria in β−proteobacteria.


90

Figure 3: Schematic diagram (modified from Schipp et al., 1985) and distribution of N.

macromphalus symbionts in a pericardial appendage villus.

A: Schematic diagram of longitudinal section of a villus and general distribution of

symbiontic bacteria (CARD-FISH with universal eubacterial probe EUB388 in green).

Direction of blood flow: secretion (white arrow), filtration (black arrow) and reabsorption

processes (grey arrows). Scale bar= 500 µm.

B, C, D: Multicolor CARDFISH images of Nautilus macromphalus symbionts in transversal

section of a pericardial villus. The spirochete symbionts (NauSpiro255 probe in red) are

deeply associated to the pericardial epithelium in peripheric areas. The β−proteobacteria

symbionts (NauBet66 probe in green) are distributed in peripheric and invaginated areas, less

strictly associated to the epithelium. In blue, Nautilus tissue stained with DAPI.

(B) Scale bar= 500 µm, (C) and (D) Scale bar = 10 µm


91


92

Figure 4: Transmission electron micrographs of Nautilus macromphalus pericardial

appendages sections with ectosymbiotic bacteria.

A: Transverse section of epithelial invaginations of a pericardial villus. The basal pole of each

epithelial cell (EC) constituting the outer excretory epithelium is in contact with a blood

lacuna which is also in contact with ovoid cells (OC) characterized by numerous spherical

electron dense bodies. The apical pole of such cells presents bacteria which are located in the

pericardial lumen (lu). Inset: see D

B: Higher magnification of the excretory epithelium. Epithelial cells are characterized by

numerous mitochondria (m) and by the presence of basal infoldings (mp) in contact with the

blood lacuna (BL). Bacteria (small arrows) are observed either in contact with the microvilli

(mv) of the apical pole or in the pericardial lumen (lu). HC: haemocyte; N: nucleus;

OC: ovoid cells.

C: Details of active transporters abutting to the blood lacunae. The basal pole of the epithelial

cells possess numerous podocyte-like structure (p) in contact with a strong basal lamina

surrounded by mitochondria (m). Such structure should represent an active ultra-filtration

barrier consuming a large amount of energy provided by the mitochondria. BL: blood lacuna.

D: Distribution of symbiotic bacteria in the pericardial lumen. Two morphotypes of bacteria

can be observed in TEM sections. The first one, represents large bacteria (white straight

arrows) sometimes located between the microvilli differentiated by the epithelial cells (EC),

the second one represents bacteria that could be observed as small transverse sections in the

lumen (black arrows) or as elongated bacteria with a parallel orientation to the microvilli

(curved arrows).

E: Details of the spirochete symbionts. Such bacteria (b) possess the typical double-membrane

of Gram negative bacteria and are located between the microvilli of the epithelial cells (EC).

m: mitochondria.


93

F: The betaproteobacteria symbionts are attached to the apical part of the brush border. Such

bacteria have parallel orientation to microvilli (mv) of the epithelial cells. They are

characterized by a bipolar appendages (black arrows). The outer membrane of the bacterial

wall of this Gram negative bacteria is indicated by a white arrow. insert: detail of the polar

appendage with a dense central “filament”. This appendage seems to be maintained in contact

to the microvilli by glycocalix fibers.


94

D


95

4.2. Développement d’un modèle cellulaire de l’association N. macromphalus-bactérie

Article: Primary co-culture as a complementary approach to explore the diversity of bacterial

associations in marine invertebrates: the example of Nautilus macromphalus

(Cephalopoda:Nautiloidea)

Pernice, M., Pichon, D., Domart-Coulon, I., Favet, J., Boucher-Rodoni, R.

Article sous presse dans Marine Biology (2006).

L'application récente des outils moléculaires pour caractériser les populations bactériennes

associées aux invertébrés marins a fourni l'accès à une diversité immense de microbes non

identifiés et résistants à la culture (Holmström & Kjelleberg, 1999). Cependant, le rôle de

bactéries dans la physiologie de l’hôte reste souvent, comme nous l’avons vu lors de l’étude

précédente, difficile à élucider en l’absence de conditions adéquates de croissance et de

prolifération. L’isolement et la maintenance des symbiotes bactériens sur milieu artificiel

peuvent permettre une compréhension plus fine de leur physiologie et des processus

complexes qui régissent la reconnaissance hôte/symbiotes (Zengler et al, 2002). Dans ce

contexte, la culture des bactéries symbiotiques en présence du tissu hôte est une solution

envisageable pour maintenir le système symbiotique in vitro. Au cours de cette étude, un

protocole de mise en culture et maintenance des bactéries symbiotiques en présence des

cellules d’appendices péricardiques de N. macromphalus a donc été développé.

Afin de valider cette approche pour l’étude de la symbiose bactérie-N. macromphalus,

l’analyse du gène codant pour l’ARNr 16S a ensuite été réalisée. Nous avons pu alors

comparer la diversité bactérienne associée aux appendices péricardiques de N. macromphalus

à l’aide des trois approches suivantes :

Extraction directe d'ADN à partir des tissus de l’hôte

Isolation des souches bactériennes associées sur un milieu de culture artificiel

(microbiologie classique)

Culture des bactéries en présence des cellules d’appendices péricardiques (co-

culture).

Les résultats ont montré que l'analyse de la diversité bactérienne par extraction

directe d’ADN confirmait la présence spécifique de deux groupes bactériens (beta

protéobactéries et spirochètes), retrouvés chez tous les spécimens de N. macromphalus

étudiés. L’existence d’un troisième groupe bactérien (Pseudoalteromonadales) n’a pas pu être


96

vérifié (présence d’une seule séquence d’ARNr 16S chez un individu) et semble lié à une

contamination par l’environnement. L’estimation de la diversité bactérienne associée à N.

macromphalus par l’approche de microbiologie classique a mis en évidence un biais

important avec une isolation sélective de souches appartenant aux gammaproteobactéries qui

ne représentaient pas plus de 0.2% de la population bactérienne totale. Enfin, l’utilisation de

la technique de co-culture a favorisé la détection des deux groupes de bactéries symbiotiques

(beta protéobactéries et spirochètes) jusqu’ici non cultivés.

Ce travail souligne donc le potentiel de la méthode de co-culture comme un nouvel

outil prometteur pour de futures études visant à préciser les mécanismes physiologiques et

moléculaires mis en jeu dans la relation symbiotique chez N. macromphalus.


97


98


99


100


101


102


103


104


105


106

4.3. Activité métabolique des symbiotes bactériens chez N. macromphalus

Les travaux précédents ont permis de confirmer la forte structuration de la population

symbiotique en étroite liaison avec l’organisation fonctionnelle des organes excréteurs de N.

macromphalus, ce qui suggère une implication des bactéries symbiotiques dans la physiologie

de cet organe. Cependant, la phylogénie de ces symbiotes, basée sur l’ARNr 16S comme

simple marqueur moléculaire, ne permet pas d’élucider leurs réelles capacités métaboliques ni

les mécanismes exacts par lesquels ils sont impliqués dans la fonction d’excrétion de N.

macromphalus. À cet égard, les progrès récents de la biologie moléculaire permettent

d'identifier les gènes codant pour les enzymes clés du métabolisme azoté et de les utiliser

comme bio marqueurs pour détecter le potentiel ou la présence de ces processus dans

l'environnement (Lam et al, 2004). Cette approche a donc été utilisée dans un premier temps

afin d’examiner l’hypothèse d’une implication des symbiotes bactériens dans la

transformation des déchets azotés de N. macromphalus.

4.3.1. Recherche et séquençage de gènes fonctionnels codant pour des enzymes

impliquées dans la nitrification et la dénitrification bactérienne

Différents couples d’amorces ont été utilisés (voir Annexe 2) mais seul le couple

d’amorces nirK1F/nirK5R a permis d’amplifier un fragment d’ADN d’une taille équivalente à

celle du gène nirK (470 kDa) (Figure 34).

.

Cependant, après séquençage et analyse comparative sur les banques de données, le

fragment d’ADN amplifié a été identifié comme codant pour une enzyme active dans le

catabolisme des acides aminés (> 93 % de similarité avec la déshydrogénase de

l’oxobutanoate de différentes beta protoéobactéries).

L’absence de résultats positifs concernant les gènes fonctionnels représentatifs des

processus de nitrification et dénitrification ne permet pas de préciser les mécanismes exacts

par lesquels les symbiotes bactériens sont impliqués dans la fonction d’excrétion du Nautile.

De plus, il est possible que les couples d’amorces employées n’aient pas permis d’amplifier

ces gènes spécifiquement. En effet, il est aujourd’hui largement reconnu que la variation

M + - N1 N2

( )

M + - N1 N2

( )470 bp

Figure 34: Gel de migration des produits d’amplification obtenus à l’aide des amorces nirK1F/nirK5R. M : Marqueur de poids moléculaire 1kb ; + : contrôle positif (N. europea); - : contrôle négatif, N1, N2 : amplicons obtenus à partir des extraits individu 1 et 2 de N. macromphalus.


107

génétique concernant ces gènes est bien supérieure à celle du gène codant pour l’ARNr 16S

(Rotthauwe et al, 1997 ; Kowalchuck & Stephen, 2001). Ce qui permet de spéculer une

distance génétique très importante vis-à-vis de souches référencées laissant envisager des

problèmes de spécificité des amorces employées. Une approche complémentaire utilisant des

traceurs isotopiques a donc été envisagée afin de déterminer les réelles capacités métaboliques

de ces populations bactériennes vis-à-vis des composés azotés.

4.3.2. Implication des symbiotes bactériens dans le métabolisme azoté

La physiologie des appendices péricardiques et des cavités coelomiques dans lesquelles

sont rejetés les déchets azotés, n’étant connue que partiellement (Mangold et al, 1989), l’étude

a donc été élargie à l’assimilation par le complexe symbiotique organe-bactéries de deux

composés azotés (ammonium et nitrate) marqués à l’aide du traceur isotopique 15N. Malgré

une importante variabilité sans doute liée à l’échantillonnage, les résultats ont permis de

suggérer des tendances métaboliques chez les bactéries symbiotiques.

4.3.2.1.Mesure de l’activité métabolique des symbiotes bactériens dans un milieu

enrichi en nitrates (NO3-)

La diminution de la concentration totale en nitrates (NO3-) (mesurée par la méthode de

chemiluminescence, voir Chapitre III.3.6, page 62) dans le milieu d’incubation a permis de

suggérer leur assimilation avec un taux assez élevé et constant (~1 µM/h) (Figure 35 A). De

plus, la comparaison des concentrations en NO3- dans les appendices péricardiques et dans le

contrôle négatif a semblé confirmer que cette assimilation était bien due au complexe

symbiotique vivant (Figures 35 A et B). La diminution similaire des concentrations en nitrites

(NO2-) (mesurée par la méthode de chemiluminescence, voir Chapitre III.3.6, page 62) dans

les appendices péricardiques et dans le contrôle négatif est probablement liée à une erreur de

dilution lors de l’échantillonnage (Figure 35 A et B).


108

Deux hypothèses peuvent être émises pour justifier une assimilation potentielle des NO3-

(nitrates) par les symbiotes bactériens :

• (1) La réduction catabolique du nitrate en nitrite qui conduit à une accumulation

des NO2- (nitrites) en produit final.

NO3- + 2 e- + 2 H+ NO2

- + H2O

L’analyse de la concentration en NO2- (nitrite) dans les milieux d’incubations (Figure 35

A) n’a pas été congruente avec cette hypothèse puisqu’elle a indiqué non pas une

accumulation mais plutôt une diminution des NO2-(nitrites) dans le temps.

• (2) La dénitrification du NO3- (nitrate) en N2 (diazote gazeux) qui conduit donc à

l’accumulation de ce gaz en produit final

NO3- + 10 e- + 12 H+ N2 + 6 H2O

En accord avec cette hypothèse, l’analyse en spectrométrie de masse a montré une

accumulation de 15N2 (diazote gazeux) (R2= 0,8722, Figure 35 C) dans ces échantillons

confirmant ainsi une transformation du 15NO3 (nitrate) en 15N2 (diazote gazeux). Pourtant, le

faible taux d’accumulation de 15N2 (diazote gazeux) observé (~ 0,0002 µM/h) n’a pas permis

d’expliquer la forte diminution des NO3- (nitrate) (~1 µM/h). Ces résultats suggèrent plutôt

Figure 35 : Concentrations en nitrates (courbe rouge), nitrites (courbe verte), dans les milieux d’incubations des appendices péricardiques (A), du contrôle négatif (B). Analyse en spectrométrie de masse des concentrations en 15N2 dans les milieux d’incubations des appendices péricardiques (courbe rose) et du contrôle négatif (courbe bleue) (C).


109

l’hypothèse d’une dénitrification lente et/ou incomplète conduisant principalement à

l’accumulation d’un produit intermédiaire dans la chaîne de réactions réductrices.

NO3- NO2

- NO N2O N2

Une telle dénitrification incomplète est connue chez certaines bactéries, avec la réduction

des NO3- (nitrites) en N2O (oxyde nitreux gazeux) (Albrecht & Benckiser, 1997 ; Hunt et al,

2003, Lavick, com. pers.) et pourrait ainsi expliquer ces observations.

4.3.2.2.Mesure de l’activité métabolique des symbiotes bactériens dans un milieu

enrichi en ammonium (NH4+) et en nitrates (NO3

-)

Les analyses des milieux d’incubations ont indiqué une forte accumulation des nitrites

(NO2-) dans un premier temps, avec une augmentation de la concentration jusqu’à 188 µM à

6h (Figure 36 A), puis une stabilisation jusqu’à 14h et enfin une diminution avec un retour à

la concentration initiale en fin d’expérience (129µM à 18h). La concentration en nitrates

(NO3-) est quant à elle apparue constante dans le temps contrairement aux incubations

précédentes en milieux enrichis en nitrates marqués (15NO3-).

Le contrôle négatif a confirmé que ces variations de la concentration en NO2- semblaient

liées aux bactéries symbiotiques vivantes (Figure 36 B).

dénitrification incomplète

Figure 36 : Concentrations en nitrates (courbe rouge), nitrites (courbe verte), dans les milieux d’incubations des appendices péricardiques (A), du contrôle négatif (B). Analyse en spectrométrie de masse des concentrations en 15N2 (diazote gazeux) dans les milieux d’incubations des appendices péricardiques (courbe rose) et du contrôle négatif (courbe bleue) (C).


110

Cette production suivie d’une assimilation, différentielles dans le temps des NO2- (nitrites)

pourrait suggérer l’hypothèse d’une combinaison des réactions de nitrification et

dénitrification oxydant ainsi l’ammonium (15NH4+) directement en diazote (15N2) avec les

nitrites (NO2-) pour accepteur d’électron.

NH4+ + NO2

- N2 + H2O

Ce processus métabolique appelé anammox a récemment été démontré chez certaines

bactéries vivant en conditions hypoxiques (Strous et al, 1999 ; Tahmdrup & Dalsgaard, 2002 ;

Kuypers et al, 2003 voir Encadré 1, page 19). En accord avec cette hypothèse, l’analyse en

spectrométrie de masse a montré une accumulation de diazote gazeux (15N2) (R2= 0,8841,

Figure 36 C) dans ces échantillons confirmant ainsi une transformation de l’ammonium en

diazote gazeux. Pourtant, comme lors des incubations en milieux enrichis en nitrate (15NO3-),

le faible taux d’accumulation de diazote gazeux (15N2) observé (~ 0,0003 µM/h) ne permet

pas d’expliquer les fortes variations observées dans la concentration en nitrite (accumulation

et diminution avec des taux d’environ 8 µM/h). Là encore, un arrêt intermédiaire dans la

chaîne de réactions de réduction du nitrite (15NO2-) en diazote gazeux (15N2) peut être

envisagé et pourrait conduire à l’accumulation d’un produit intermédiaire tel que l’oxyde

nitreux gazeux (15N2O).

NO2- NO N2O N2

Les expériences d’incubations isotopiques ont donc montré que l’addition de certains

composés azotés semblait induire le déclenchement d’une série de réponses métaboliques

(notamment dans le cas des incubations avec le 15NH4+, avec une différence très nette entre

l’échantillon et le contrôle négatif). Ces réponses métaboliques semblent donc confirmer

l’hypothèse d’un métabolisme azoté des symbiotes bactériens confirmant leur implication

potentielle dans la transformation des déchets azotés de N. macromphalus. L’analyse de la

concentration en oxyde nitreux gazeux (15N2O) dans les différents échantillons, actuellement

en cours à l’institut Max Planck de Bremen, permettra de confirmer ou non les hypothèses

émises concernant les processus métaboliques réellement mis en jeu.

dénitrification incomplète


111

4.4. Etude comparative de la diversité bactérienne associée à N. pompilius sur deux

sites de collecte : spécificité de la symbiose et influence des facteurs

biogéographiques

Les travaux précédents ont démontré l’existence d’une double symbiose étroitement liée à

la structure et la physiologie des organes excréteurs de N. macromphalus, espèce endémique

de la Nouvelle-Calédonie. Avant de pouvoir préciser les mécanismes exacts impliqués dans

cette interaction symbiotique, il paraît nécessaire d’examiner s’il s’agit d’une règle générale

au sein du genre Nautilus ou d’un caractère local de N. macromphalus. A cet égard, l’espèce

Nautilus pompilius présente un intérêt particulier puisque sa distribution, la plus large au sein

du genre, couvre la majeure partie de la zone Indo-Pacifique (depuis la mer d’Andaman

jusqu’aux Iles Fidji ; Norman, 2000). Ainsi l’analyse comparative de la diversité bactérienne

associée à N. pompilius dans différentes zones géographiques peut permettre non seulement

de confirmer l’existence d’une relation symbiotique similaire à celle décrite chez N.

macromphalus mais aussi tester l’influence des facteurs environnementaux sur les populations

symbiotiques.

Les objectifs de cette étude concernaient donc l’analyse de la diversité bactérienne

associée aux appendices péricardiques de N. pompilius dans deux sites distants (Figure 37)

afin (1) de savoir s’il s’agissait des mêmes bactéries symbiotiques, et (2) d’examiner

l’hypothèse d’une structuration de la population symbiotique identique à celle observée chez

N. macromphalus.

Les symbiotes ont été caractérisés par le séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S et

leur distribution dans les organes de l’hôte a été examinée par hybridation des sondes

spécifiques (CARD-FISH).

Figure 37 : Sites des collectes de N. pompilius (en rouge) réalisées lors de cette étude.


112

4.4.1. Influence des facteurs biogéographiques sur la caractérisation moléculaire des

symbiotes de N. pompilius

La caractérisation des symbiotes bactériens associés aux organes excréteurs de N.

pompilius a porté sur l’étude de six individus collectés sur deux sites géographiquement

distants de plus de 4000 kms (Figure 37):

Philippines : côte Est de l’île de Cebu (trois spécimens)

Vanuatu : côte Sud de l’île de Santo (trois spécimens)

L’analyse comparative du gène codant pour l’ARNr 16S a montré la présence de trois

phylotypes bactériens dominants: spirochètes, beta protéobactéries et vibrios avec une

variation intra-spécifique faible (entre 0 et 0.3%). (Tableau 3)

Les séquences représentatives des beta protéobactéries et spirochètes ont été retrouvées

dans les spécimens de N. pompilius collectés sur les deux sites et présentent plus de 99.5 %

d’identité avec les symbiotes bactériens présents dans les appendices péricardiques de N.

macromphalus ce qui suggère une double symbiose commune aux deux espèces. Cependant,

l’analyse des trois individus de N. pompilius collectés près de l’île de Cebu (Philippines) a

montré la présence d’un troisième phylotype bactérien qui n’avait jamais été retrouvé en

association avec N. macromphalus ou N. pompilius jusqu’ici et qui semble génétiquement

proche de souches environnementales (97 à 98 % d’identité avec Vibrio pelagius X74722). Ce

Tableau 3: Nombre de séquences partielles (~800 paires de bases) du gène codant pour l’ARNr 16S obtenues après PCR et clonage à partir de l’ADN des appendices péricardiques de six spécimens de N. pompilius collectés sur deux sites (Philippines, Vanuatu).


113

dernier résultat semble indiquer une influence ponctuelle de l’environnement sur la population

bactérienne associée à N. pompilius, avec une infection environnementale potentielle des

vibrios.

4.4.2. Les symbiotes bactériens présents chez N. pompilius aux Philippines et au

Vanuatu possèdent la même distribution spatiale

L’hybridation de sondes universelles et spécifiques (Eub388, Gam42a, NauSpiro255,

NauBet66) a permis de révéler une structuration de la population bactérienne symbiotique

identique à celle observée chez N. macromphalus avec deux niveaux d’organisations présents

au sein des appendices péricardiques (Figure 38):

Figure 38: Distribution générale des symbiotes bactériens (CARD-FISH avec la sonde généraliste EUB388 en vert) dans les villis péricardiques de N. pompilius (sections longitudinales, A et C). Distribution spécifique des spirochètes (sonde NauSpiro255 en rouge) et des beta protéobactéries symbiotiques (sonde NauBet66 en vert) (sections transversales, B et D). (A), (C) Barre d’échelle = 500 µm. (B), (D) Barre d’échelle = 50 µm.


114

• Un premier niveau d’organisation générale lié à la structure fonctionnelle de l’organe

et observé en coupe longitudinale à l’aide de la sonde universelle Eub388 (Figures 38

A et C) avec, une concentration des symbiotes dans la région baso-médiane des villis

et leur absence totale de la partie apicale

• Un deuxième niveau d’organisation interspécifique observée en coupe transversale à

l’aide des sondes spécifiques NauSpiro255 et NauBet66 avec une prédominance des

β-proteobactéries dans les cavités profondes des villis et une présence des spirochètes

plus en périphérie (Figure 38 B et D).

Les hybridations de la sonde Gam42a, spécifique du groupe des gamma-proteobactéries et

englobant donc le genre Vibrio, ont été négatives et n’ont pas permis de confirmer la présence

des vibrios en association avec le tissu des individus de N. pompilius collectés dans les

Philippines. Ce dernier résultat remet donc en question le statut symbiotique des vibrios qui

pourraient être simplement présentes dans le fluide coelomique entourant les appendices

péricardiques. Des observations concernant un nombre plus grand d’individus provenant de

cette zone des Philippines sont donc à envisager afin de déterminer si ces souches

bactériennes sont présentes de manière ponctuelle ou permanente au sein des Nautiles de cette

zone géographique.


115

4.5. Activités antimicrobiennes des souches isolées de N. pompilius (Philippines):rôle

potentiel dans la colonisation et l’écologie microbienne des organes symbiotiques

Article : Identification of a Vibrio strain producing antimicrobial agents in the excretory

organs of Nautilus pompilius (Cephalopoda, Nautiloidea).

Pernice, M., Destoumieux-Garzón, D., Peduzzi, J., Rebuffat, S., Boucher-Rodoni,R.

Article soumis à Reviews in Fish Biology & Fisheries

Les travaux précédents ont permis d’établir la coexistence d’une double symbiose au sein

des organes excréteurs de N. macromphalus et N. pompilius, impliquant les mêmes groupes

bactériens. L’examen d’individus de N. pompilius collectés aux Philippines a cependant

montré la présence d’un troisième phylotype bactérien dont l’ARNr 16S est proche de

souches environnementales de vibrios, suggérant une infection des organes excréteurs de N.

pompilius par l’environnement. Dans la perspective d’une compétition entre les différentes

souches cohabitant dans ce système complexe, il paraît donc intéressant de déterminer les

facteurs qui ont pu favoriser la sélection de cette souche bactérienne au sein du système

excréteur de N. pompilius. En effet ce type de sélection peut être influencé par la quantité de

nourriture disponible dans l’organe hôte mais aussi par la production de substances bioactives

par les bactéries.

Les objectifs de cette étude étaient donc d’examiner l’activité antimicrobienne des

bactéries isolées des différents individus de N. macromphalus et N. pompilius collectés afin

de pouvoir suggérer l’influence potentielle de cette propriété physiologique sur l’écologie de

la population bactérienne associée. Le potentiel antimicrobien des souches isolées a donc été

évalué à l’aide d’un test issu de la méthode de double couche, modifiée de Schilinger &

Lucke (1989).

Les résultats des tests soulignent une activité antimicrobienne du groupe de bactéries

vibrios isolées de N. pompilius (Philippines), avec des inhibitions de croissance aussi bien

contre les bactéries Gram positive que contre les bactéries Gram négatives. En revanche, les

mêmes tests réalisés à partir de toutes les autres bactéries isolées de N. macromphalus et N.

pompilius n’ont pas permis de détecter une quelconque activité antimicrobienne. La mise en

évidence de ce groupe bactérien uniquement chez les individus de N. pompilius collectés aux

Philippines (Chapitre III. 3.4.1) souligne de plus l’hypothèse d’une transmission/infection

environnementale des vibrios dans cette population de Nautiloides. Le potentiel


116

probiotique/virulent de ces souches bactériennes vibrios pourrait alors être à la base de leur

transmission/infection chez N. pompilius aux Philippines. L’ensemble de ces résultats semble

suggérer un statut opportuniste des vibrios. Cependant, ce groupe bactérien n’a apparemment

pas affecté la présence des deux groupes de symbiotes spécifiques (beta protéobactéries et

spirochètes) qui ont été retrouvées chez tous les Nautiloides.


117

Identification of a Vibrio strain producing antimicrobial

agents in the excretory organs of Nautilus pompilius

(Cephalopoda, Nautiloidea)

Pernice Mathieu a,*, Destoumieux-Garzón Delphine b, Peduzzi Jean b,

Rebuffat Sylvie b and Boucher-Rodoni Renata a.

Affiliations :

(a) UMR 5178 CNRS-MNHN-UPMC, Biologie des Organismes Marins et Ecosystèmes,

Département Milieux et Peuplements Aquatiques, Muséum National d’Histoire Naturelle, CP

51, 55 rue Buffon, 75005 Paris, France.

(b) Laboratoire de Chimie et Biochimie des Substances naturelles, UMR 5154 CNRS-MNHN,

Département Régulations, Développement et Diversité Moléculaire, Muséum National

d’Histoire Naturelle, CP 54, 57 rue Cuvier, 75005 Paris, France

KEY WORDS: 16S rDNA, bacteria, antimicrobial activity, Cephalopods, Nautilus

* Corresponding author: Mathieu PERNICE

Muséum National d’Histoire Naturelle. Département Peuplements et Milieux Aquatiques,

Biologie des Organismes Marins et Ecosystèmes (UMR 5178 CNRS). 55 rue Buffon, 75005

Paris, France.

Tél. : +33 1 40 79 30 97

FAX : +33 1 40 79 57 34

E-Mail : [email protected]


118

ABSTRACT

The aim of the present study was to identify and characterize bacteria producing antimicrobial

compounds in the excretory organs of Nautilus pompilius. Culture-dependent and culture-

independent complementary approaches were used for bacterial identification such as: culture

on selective media, Gram staining, CARD-FISH, direct DNA extraction from host tissue,

PCR amplification and sequencing of the bacterial 16S rRNA gene. Results show presence of

three bacterial groups: γ-Proteobacteria with three clusters (Pseudomonadales, Vibrionales,

Alteromonadales), β-Proteobacteria and spirochetes. In order to screen for active strains,

antimicrobial activity was tested by diffusion agar assay against Micrococcus luteus,

Escherichia coli, Vibrio harveyi and Candida albicans. Nautilus isolates showed

antimicrobial activities against both Gram-positive and Gram-negative reference strains. Most

of the active strains were phylogenetically related to environmental Vibrionaceae. These

strains were always abundant in N. pompilius PA but were absent from Nautilus

macromphalus from other geographical area. Therefore, we suggest that antimicrobial active

Vibrionaceae infect N. pompilius by environmental transmission.


119

INTRODUCTION

In the marine environment, pathogenic bacterial infections are a significant issue in

aquaculture (Macian et al., 2000; Montes et al., 2006), but they also affect non cultured

organisms (Martin et al., 2002; Farto et al., 2003). Indeed, some bacteria present in the host

can produce protective substances (Ruiz-Ponte et al., 1999) while others can become

pathogenic (Olafsen, 2001). A contribution of microorganisms to the secondary metabolism

of hosts is tempting to speculate, but the actual proof is difficult to acquire (Hentschel et al.,

2001). In order to provide unequivocal evidence, the microorganism has to produce the

compound of interest under laboratory conditions. However, once outside its natural habitat,

bacteria can change their metabolism because of altered growth conditions or modified

selective pressures (Holmström et al., 1999).

Among marine invertebrates, Cephalopods belong to a molluscan group comprising ca. seven

hundred species in which bacterial associations have been known for a long time (Pierantoni,

1917; Bloodgood, 1977) and can include the reproductive organs (accessory nidamental

glands) of myopsids, sepiolids and sepiids (Kaufman et al., 1998; Grigioni et al., 2000;

Pichon et al., 2005) and the light organ of sepiolids (Nishiguchi, 2002; McFall-Ngai and

Ruby, 1991). In nautiloids, a high density of one bacterial morphotype has been observed by

Transmission Electron Microscopy in the brush border of the excretory organs (Pericardial

Appendages:PA) epithelium of Nautilus macromphalus and Nautilus pompilius (Schipp et al.,

1985; Schipp et al., 1990). However, a recent identification using comparison of 16S rRNA

gene sequences has shown an unexpected microbial diversity in N. macromphalus PA

(Pernice et al., 2006).

In the present paper, we focused on bacteria associated with PA of Nautilus pompilius Linné,

1758 (Cephalopoda-Nautiloidae). Nautilus is a scavenger, inhabiting the outer shelf of barrier

reefs in the Indo-Pacific area, generally at a depth of 300 to 500 meters (Boucher-Rodoni and


120

Mangold, 1994). In spite of its evolutionary interest (Cambrian origin, last representative of

ectocochleate cephalopods), very few studies focus with bacterial associations in this

ancestral genus.

In this study, we used a multidisciplinary approach to investigate the association of bacteria

with N. pompilius PA. First, we localized the bacteria in the organ by Fluorescent In Situ

Hybridization (FISH) with horseradish peroxidase (HRP)-labelled oligonucleotide probes and

tyramide signal amplification, also known as CARD-FISH (Bobrow et al., 1989;

Pernthaler et al., 2001). This method led to a significant improvement in detection rates

compared to current protocols for FISH with monolabelled probes (Pernthaler et al., 2002).

Subsequently, the identity and phylogenetic relationships of N. pompilius bacteria were

determined for the first time using comparative 16S rRNA gene analysis. Bacterial DNA was

obtained via two complementary approaches: classical culture on artificial media (culture-

dependent approach) and bacterial DNA extraction from Nautilus organ (culture-independent

approach). The environment within Nautilus PA may be suitable for production of

antimicrobials and other defence compounds. Therefore, the isolated strains were screened for

antimicrobial activity in order to investigate the interaction of bacteria against each other and

the eventual protective action against pathogens.

MATERIALS AND METHODS

Nautilus collection

Three N. pompilius specimens were collected on the East coast of Cebu Island

(Philippines) and shipped live to Paris (France). Individuals were kept for 2 days in seawater

tanks where activity and viability could be observed. All specimens were dissected

aseptically, and the four pericardial appendages were processed as follows: two were stored at


121

-80°C for DNA extraction by culture independent approach, a third was dilacerated in 1ml

sterile sea-water for bacterial cultivation and the last was fixed in paraformaldehyde (PFA) for

CARD-FISH.

Bacterial cultivation

For the three specimens, 250 mg of PA tissue were ground in 1 ml sterile sea-water,

and serial dilutions (10 and 100) were spread onto marine agar culture media (Difco

laboratories, Detroit, USA). Plates were incubated at 24°C for 48 to 72 h in order to obtain a

collection of cultivable bacteria. Cell titration was estimated by counting colony forming units

(CFUs). Ten colonies were arbitrarily selected for each Nautilus specimen, based on their

morphology on marine agar. Each isolated strain was stained to determine Gram reactivity

and identified by 16S rRNA gene sequencing. All selected strains were cryopreserved at -

80°C in marine agar 2216 medium containing 25% glycerol for further analyses.

Antimicrobial screening

Thirty isolates were tested for their antimicrobial activity against Escherichia coli 363

(laboratory collection), Vibrio harveyi CIP 103192, Candida albicans (laboratory collection)

and Micrococcus luteus CIP 53.45. Antimicrobial activity of Nautilus isolates was assayed by

the double layer method modified from Schilinger and Lucke (1989). The medium used was

modified from Ivanova et al. (1998) and contained 2 g bactopeptone (Difco)/ 2g casamino

acids (Difco) / 2g yeast extract (BD Biosciences)/ 0.2 g KH2PO4/ 1 g glucose/ 17.5g NaCl/ 1.1

g KCl/ 0.9 g MgSO4/ 1.5 g CaCl2/0.1 g KBr pH 7.8 per 1 l of deionized H2O. Briefly, 10 ml

of 0.65% agar (w/v) medium was inoculated with the target strain in exponential-phase of

growth (100 cells/ml final concentration, measured by optical density at 620 nm), and then

poured into plates. A second inoculation of the agar plates was then performed with N.


122

pompilius bacterial isolates by perforation with a Pasteur pipette. Plates were incubated

overnight at 25°C and inspected to detect the formation of inhibition zones around the

perforation. Isolates were also assayed for antimicrobial activity against each other.

Experiments were performed in triplicates, and an antibiotic disk (Ceftazidime for Gram-

negative bacteria, Cefsulodin for M. luteus and Primocin for C. albicans) was added onto each

plate as a positive control.

DNA isolation

DNA was extracted either from bacteria isolates (culture-dependent approach) or

directly from Nautilus PA tissue (culture-independent approach).

– Culture-dependent approach

The method used to prepare bacterial DNA for PCR was derived from Sritharan and

Barker (1991). Colonies grown on marine agar were suspended in 100 µl sterile water, boiled

for 5 min, centrifuged (15000 x g, 5 min) and stored in aliquots at -20 °C prior to 16S rRNA

gene PCR amplification, purification and direct sequencing.

– Culture-independent approach

DNA was extracted from one PA of each specimen according to the DNeasy Tissue

Kit (Qiagen, Courtaboeuf, France) protocol and stored in aliquots at -20 °C prior to cloning

and 16S rRNA gene analysis.

16S rRNA gene analysis

– 16S rRNA gene PCR amplification

PCR was performed using the universal bacterial primers: 27F-1385R pair

(respectively Escherichia coli position 9: 5’-GAGTTTGATCCTGGCTCA-3’ and position

1385: 5’-CGGTGTGTRCAAGGCCC-3’). The reaction mixture contained 0.3 µmol of each


123

primer, 25 µmol of each deoxynucleoside triphosphate, 1X SuperTaq buffer and 1.25 U of

SuperTaq polymerase (ATGC Biotechnologie, Marne la Vallée, France). Volume was

adjusted with sterile water to 50 µl. PCR was conducted in a T personal PCR system (Biolabo

Scientific Instruments) with an initial denaturing step (94° C for 5 min) followed by 32 cycles

of 94°C for 30 s, 55°C for 30 s and 72°C for 1 min and final elongation step at 72°C for 7

min. Amplified DNA was checked by 1.5% agarose gel electrophoresis and purified with a

QIAquick PCR purification kit (Qiagen).

– Cloning and sequencing

Purified PCR products from culture-independent approach were cloned by insertion

into plasmid vector PCR 2.1 TOPO TA Cloning (Invitrogen, Cergy-Pontoise, France)

following the manufacturer instructions. Positive clones were grown overnight in 1.5 ml

Luria-Bertani Lennox culture media (DIFCO laboratories, Detroit, USA) and plasmids were

prepared from pelleted cells with a QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen, Courtaboeuf,

France).

Sixty clones (culture-independent approach) and 30 isolates (culture dependent

approach) were partially sequenced (700 bp) by Genome Express (Meylan, France) in a

variable region of the 16S rRNA gene (E. coli positions 9 to 710 bp). Putative chimeric

sequences were checked with Bellerophon (Huber et al., 2004). Sequences without any PCR

artefacts (score <1) were aligned and corrected with BioEdit (Hall, 1997-2001).

– Phylogenetic reconstruction

Sequences were arbitrary clustered into Operational Taxonomic Units (OTUs) with

similarities >97% (percentage of similarities defining a genus; Stackebrandt and Goebel,

1994.). Sequences were then assigned to a set of hierarchical taxa using a naïve Bayesian

rRNA classifier (RDP Release 9.23 classifier) with confidence indices estimated by levels of

bootstrap based on a 1000 resampling data set (Cole et al., 2005) and highly similar sequences


124

were included in the phylogenetic analysis. Sequence alignment was performed with

ClustalW software (Thompson et al., 1994) with manual corrections in order to exclude from

the analysis the leading and tailing regions found in some but not all 16S rRNA gene

sequences (Blazejak et al., 2006).

Phylogenetic trees were calculated using Neighbor-joining algorithms with Kimura “2

parameters” model (Kimura, 1980) and the Maximum-likelihood method with a general time

reversing model in Phylip 3.6 package (Felsenstein, 1993). Bootstrap analyses (1000

replicates) were performed for both analyses to test the robustness for each topology.

CARD-FISH

PA were fixed in a 3% PFA solution as described by Grigioni et al. (2000) and

dehydrated in 100% ethanol overnight before embedding in paraffin. Histological sections (7

µm) were collected on gelatine coated slides. Paraffin was removed from the sections with

xylene (three 10 min treatments) before rehydration in decreasing ethanol series. Tissue

sections were then hybridized as described by Pernthaler et al. (2002) with EUB338 (5’-

GCTGCCTCCCGTAGGAGT-3’; Amann et al., 1990) HRP-labelled probe and NONEUB338

(5’-CGACGGAGGGCATCCTCA-3’; Amann et al., 1995) in order to control non specific

binding. The same sections were then stained with 4,6-Diaminido-2-phenylindole (DAPI) in

order to observe the structure of Nautilus tissue. Ten slides were examined for each specimen

under a Leica DMLB epifluorescence microscope (Leica Microsystèmes SAS, France).

RESULTS AND DISCUSSION

In situ application of the HRP labelled EUB338 probe directed against Eubacteria

groups confirms close association of a high bacterial density to the N. pompilius PA

epithelium (Fig 1). Contrary to the previous TEM results (Schipp et al., 1990) observations of


125

tissue sections from the three specimens revealed presence of at least three morphotypes

suggesting some diversity in the bacterial association.

The number of CFUs formed after 48 h growth in marine agar indicated that the total

heterotrophic bacterial flora amenable to artificial culture conditions was about 5 x 105 CFUs

per g of fresh tissue. A total of 30 bacterial isolates (ten per individual) were used for Gram

staining and revealed a diverse community of rod-shaped Gram-negative bacteria. No Gram-

positive strains were present among the cultivable heterotrophic flora. 16S rRNA gene

sequencing was performed in order to identify the 30 isolated strains (culture-dependent

approach). Sequence identity analysis clustered sequences within three OTUs (similarity

>97%): Alteromonadales, Pseudomonadales and Vibrionaceae (100% in RDP confidence

level).

Bacterial diversity was also assessed by random sequencing and analysis of 60 clones

obtained by direct DNA extraction from PA tissue (culture independent approach). Analysis

designated 3 OTUs: β-Proteobacteria, spirochetes, and Vibrionaceae at respectively 88%,

90%, and 100% RDP confidence level, and revealed predominance of the same cluster as in

isolates with ca. 45 % of relative abundance in the clone library (Table 1). It is now well

proved that cultivation methods reveal only a small part of the total bacterial diversity

(Amann et al., 1990; Amann et al., 1995). Moreover, discrepancy in bacterial identification

from isolates and from clones was previously reported from other cephalopods (Barbieri et al.,

2001; Pichon et al., 2005).

Representative sequences of each OTU for both approaches were selected for

phylogenetic reconstruction (Neighbor-joining and Maximum Likehood) which identified one

monophyletic group including the γ-Proteobacteria with three clusters (Vibrionales,

Alteromonadales, Pseudomonadales,), the β-Proteobacteria, and another monophyletic group

formed by the spirochetes (Figure 2). The sequences of β-Proteobacteria and spirochetes


126

associated to N. pompilius markedly differ from those of known bacteria (<90% in 16S rRNA

gene sequence similarity). Topology of the phylogenetic tree confirms similarity (>99%)

between sequences of Vibrio isolates and clones. Comparison with database sequences

related these OTU to the free-living V. pelagius X74722 (97.2% of similarity).

When compared to the bacterial diversity in pericardial appendages of N.

macromphalus, a species endemic of New-Caledonia (Pernice et al., 2006), the same clusters

were identified for both species, except for the Vibrionaceae which were not detected in N.

macromphalus. However, as Vibrio were consistently found in N. pompilius, it is conceivable

that Vibrio is a common inhabitant of N. pompilius PA. But is this association host specific or

is it due to environmental conditions? The presence of closely related Vibrio species in the

environment of N. pompilius, as well as in farmed shrimps, in the East coast of Cebu (Lavilla-

Pitogo et al., 1992) suggests environmental transmission. Such transmission has already been

demonstrated in sepiolids where Vibrio are acquired after hatching for each generation

(Nyholm and McFall-Ngai, 2003). However, further experiments with N. pompilius

specimens from different geographical origins and using specific 16S rDNA probes are

necessary to prove the specific association with this Vibrio species and its environmental

transmission.

As far as the activity of the bacteria associated to N. pompilius is concerned, the

particular microbial ecology of the PA, with respect to the presence of taxonomically diverse

bacteria, provides an environment which would be conducive for production of antimicrobial

compounds. Thirty bacterial isolates from N. pompilius PA were tested for antimicrobial

activity against four reference strains: Gram-negative Escherichia coli and Vibrio harveyi,

Gram-positive Micrococcus luteus, and the yeast Candida albicans. Thirteen isolates

exhibited a positive response i.e. significant inhibition zone (Table 2), in which 10 belonged

to the Vibrionaceae and 3 to the Alteromonadales clusters. None of the strains was active


127

against the eukaryotic C. albicans cells. Since the bacteria were isolated from the same

environmental niche, the hypothesis was tested whether specific interactions may be observed

among the isolates. However, no activity was observed when testing the isolates against each

other, suggesting that the bacterial species isolated from N. pompilius all cohabit in

harmonious fashion. Moreover, none of the strains displayed autoinhibition. Antimicrobials

are thought to confer a selective advantage to the producing strains when in competition with

other bacteria populating the same ecological niche. Other functions of secondary metabolites

include the establishment of symbiotic interactions with invertebrate hosts (Davidson et al.,

2004; Rieder et al., 2005).

In Nautilus PA, production of antimicrobial substances may serve several different

functions. Bacterial antagonism and/or synergism will likely play a role as phylogenetically

diverse microorganisms are present. Compared to results obtained in N. macromphalus, this

study demonstrated a difference in the microbial diversity associated with PA organs with the

predominance of the Vibrio cluster which was absent in N. macromphalus. This bacterial

group occurs widely in aquatic environments and has also been recognized as opportunistic

pathogen in many marine animals (Austin and Austin, 1993) causing high mortality among

economically important species of farmed marine fish and shrimp. However, Vibrio strains

are also used as probiotic bacteria to control pathogens in hatcheries (Gomez-Gil et al., 2000).

Thus, further investigations are needed to determine if the observed association and

development of this strain is due to its potential virulence or probiotic capabilities.

SUMMARY AND CONCLUSION

The results presented here show presence of a diverse community of bacteria in the excretory

organs of Nautilus pompilius, i.e. γ-Proteobacteria (Pseudomonadales, Vibrionales,

Alteromonadales), β-Proteobacteria and spirochetes. Among these associated bacteria,


128

Vibrionaceae are the most abundant and show antimicrobial activities against both Gram-

positive and Gram-negative reference strains. Compared to what is known in N.

macromphalus from New-Caledonia (Pernice et al., 2006), the present study shows: (i)

presence of similar β-Proteobacteria and spirochetes strains in both species with no close

environmental relatives (ii) consistent absence of Vibrionaceae in N. macromphalus from

New-Caledonia (iii) constant presence of Vibrionaceae in N. pompilius from Philippines,

closely related to environmental strains. Therefore, we suggest that this antimicrobial active

Vibrio infects N. pompilius from Philippines by environmental transmission.

ACKNOWLEDGEMENTS

We acknowledge Aquascapes Philippines for collecting N. pompilius specimens. We thank G.

Gastine, A. Bianco and A. Beauchet for their technical help and two anonymous referees

who commented on this manuscript. N. Dubilier is gratefully acknowledged for providing

HRP-probes for CARD-FISH. This work was funded by a grant from MNHN BQR. M.

Pernice is recipient of a doctoral grant from the University Pierre and Marie Curie (Paris 6).


129

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136

Table 1: Number of partial sequences and mean relative abundance obtained from bacterial

cloned PCR products amplified from Pericardial Appendages tissue (culture-independent

approach) for three replicate N. pompilius specimens.

Number of sequences

Nautilus specimen β- Proteobacteria Spirochaeta Vibrionaceae Chimeras

N1 4 6 10 1

N2 5 5 8 2

N3 5 7 8 0

Culture-independant

approach

(n=60) Relative abundance 24.3 ± 3.9% 30.9 ± 3.7% 44.8 ± 5%


137

Table 2: Antimicrobial activities against four reference strains

Inhibition zone size (mm)

Nautilus isolates Escherichia coli Vibrio harveyi Micrococcus luteus Candida albicans

Vibrionaceae

NP2

NP3

NP6

NP9

NP10

NP12

NP14

NP15

NP16

NP18

NP21

NP24

NP27

NP28

10

8

8

8

-

-

8

-

10

-

11

11

9

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

6

6

5

5

-

5

6

-

5

-

6

7

X

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Alteromonadales

NP1

NP4

NP8

NP13

NP19

NP20

NP22

NP23

NP26

NP29

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

5

-

X

6

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

Pseudomonadales

NP5

NP7

NP11

NP17

NP25

NP30

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-

-


138

Antimicrobial activities were measured in triplicate and determined as inhibition zones around

the perforation after overnight growth. One representative strain for each phylogenetic cluster

is highlighted in bold (see Fig. 2).

- = non significant inhibition observed

X = variable activity


139

Figure 1:

Fluoresent in situ hybridization image of N. pompilius associated bacteria in PA section. The

bacteria hybridized by EUB338 horseradish peroxidase-labelled probe (green) occupy the

epithelial region of Nautilus PA tissue stained by DAPI (blue).

Figure 2:

Consensus tree obtained after neighbor-joining analysis of 700-bp of 16S rRNA gene

sequences from representative isolated bacteria (*) and bacterial clones (**) of N. pompilius.

The numbers at the nodes indicate the levels of bootstrap support based on a Neighbor-

Joining analysis of 1000 resampled data sets. Only bootstrap values higher than 600 are

indicated. Black stars point out relations supported by Maximum-Likelihood.

Scale bar = 10% estimated base substitutions


140

Figure 1


141

Figure 2


142

4.6. Caractérisation des substances bioactives responsables de l’activité

antimicrobienne des vibrios isolées de N. pompilius

L’étude précédente a démontré le potentiel antimicrobien à spectre large des vibrios

associées à N. pompilius dans les Philippines. La caractérisation des molécules à l’origine de

cette activité antimicrobienne peut permettre non seulement de préciser les mécanismes

impliqués dans la production de ces substances mais aussi de découvrir de nouveaux

composés bioactifs à fort potentiel biotechnologique (Holmström & Kjelleberg, 1999 ;

Longeon et al, 2000 ). En effet, de nombreux antibiotiques n’étant plus, aujourd’hui,

efficaces, une part de la recherche se dirige actuellement vers les bactéries marines qui

représentent une vaste source quasi inexploitée de substances actives pouvant cibler

efficacement les souches résistantes (voir Encadré 5, page 59). Parmi ces substances actives

produites par les bactéries, les plus largement répandues sont des composés de nature

peptidique qui peuvent causer des ruptures dans la paroi cellulaire ou la membrane plasmique

des autres colonisateurs (Barrière et al, 1998 ; Héchard & Sahl, 2002) entraînant ainsi la

libération de leur contenu cellulaire et leur mort (Baquero & Moreno, 1984).

Dans le cas présent, la production de tels peptides antimicrobiens pourrait servir aux

vibrios à des fins « personnelles » en leur permettant de coloniser le système excréteur de N.

pompilius en diminuant la flore bactérienne déjà présente.

Le but de ce travail était donc de purifier et de caractériser les substances actives produites

par cette bactérie afin d’examiner l’hypothèse d’une présence d’un ou plusieurs peptides

antimicrobiens.

4.6.1. Mise en évidence de la présence de plusieurs fractions avec une activité

antimicrobienne par purification sur HPLC

La mesure de l’activité antimicrobienne à partir des extraits de culture bactérienne pure a

permis de confirmer une sécrétion permanente des molécules actives ne nécessitant donc pas

la présence de bactéries compétitrices. La purification des extraits sur HPLC suivi des tests

d’activité antimicrobienne a mis en évidence la présence de plusieurs fractions actives (une

fraction correspondant à un pic détecté sur le chromatogramme) suggérant donc la présence

de plusieurs molécules actives chez cette souche bactérienne (Figure 39).


143

Il faut cependant tenir compte du fait qu’une molécule présente dans une fraction HPLC

peut également se trouver à l’état de trace dans la fraction HPLC suivante et peut donc être

responsable d’une activité au niveau de deux fractions HPLC.

4.6.2. Les substances bioactives responsables de l’activité antimicrobienne des

vibrios ne sont pas de nature peptidique

Chaque fraction HPLC active a fait l’objet d’une analyse en spectrométrie MS afin de

déterminer le nombre de molécules présentes dans les différentes fractions ainsi que leur

masse. Les spectres de masse obtenus suggèrent la présence de molécules communes au sein

des différentes fractions actives. L’activité antimicrobienne observée pourrait ainsi être due à

l’existence de molécules communes aux différentes fractions actives et correspondant aux

masses suivantes : 135Da (pour les fractions HPLC I.2 et II.1); 186, 203, 434 Da (pour les

fractions HPLC I.3 et II.2); et les molécules de masse 168, 203, 426 et 444 Da (pour les

fractions HPLC I.4, II.3 et II.4) (Figure 40).

De manière inattendue, les masses moléculaires obtenues par analyse en spectrométrie de

masse sont toutes inférieures à 500 Da et excluent donc l’hypothèse d’une nature peptidique

des substances bio actives (la masse minimale d’un peptide étant d’environ 1000 Da). Les

substances antimicrobiennes produites par cette souche bactérienne semblent donc être des

petites molécules dont la nature n’a pas encore été déterminée.

Figure 39 : Chromatogramme HPLC des fractions obtenues à partir du culot de culture bactérienne à 28 (A) et 38 °C (B) de la souche Vibrio isolée de N. pompilius (les fractions actives sont encadrés en rouge, la courbe de détection 227 nm est en rouge et la courbe de détection 280 nm en noir, la droite noire représente le pourcentage d’acétonitrile dans la phase mobile)

I.2 I.3

I4

II.3

II.4

II.2II.1 A B


144

De telles molécules sont assez peu recensées dans la littérature et encore moins concernant

le groupe des vibrios au sein duquel les études se portent principalement sur les peptides

antimicrobiens.

L’analyse en spectrométrie MS/MS a confirmé la nature non peptidique des molécules

actives par l’absence de différences de masse correspondant à des ruptures de liaisons

peptidiques. L’étude plus approfondie de certaines molécules communes nous a cependant

Figure 40 : Spectres de masses obtenus après analyse des fractions HPLC actives (A : fraction II.1, B : I.2, C : II.2, D : I.3, E : II.3, F : I.4, G : II.4) (les molécules de masse identiques sont encadrées en bleu). L’ionisation est en mode positif et il n’y a que des espèces portant une charge. Le rapport m/z (en thomson) correspond donc à des espèces protonées [M + H+] on peut donc en déduire la masse des espèces par : M= m/z -1.

I.3

C D

G

II.1 I.2

II.2

II.4

II.3 I.4

A B

E F


145

fourni quelques informations supplémentaires concernant leur structure. En effet, l’analyse

des spectres des molécules de 444 et 426 Da suggère qu’il s’agit d’une seule et même

molécule qui aurait été fragmentée au niveau de la source (Figure 41).

De plus, la différence de 18 Da entre ces deux fragments et le suivant (408 Da) correspond

au départ de deux molécules d’H2O et permet donc de supposer la présence de groupements

hydroxyles dans cette molécule. De la même manière, les molécules de 203 Da et 186 Da

semblent être issue de la fragmentation à la source d’une même molécule. En effet, la

différence de masse de 17 Da entre les deux fragments correspond à un groupement NH3 et

suggère la présence d’un groupement NH2 au sein de cette même molécule. La structure

précise de ces molécules de petite taille à potentiel biotechnologique reste inconnue et devra à

l’avenir, bénéficier de techniques d’analyse plus précises telles que la Résonance Magnétique

Nucléaire.

A B

C D

Figure 41 : Spectres MS/MS des molécules communes aux différentes fractions actives (A : molécule de 426 Da ; B : molécule de 444 Da ; C : molécule de 204 Da ; D : molécule de 187 Da).


146

Chapitre IV Discussion générale, conclusions et perspectives

147

Chapitre IV

Discussion générale, conclusions et perspectives


148


149


Les différentes approches utilisées au cours de ce travail ainsi que l’analyse d’échantillons

de provenances géographiques variées ont permis, dans un premier temps, de confirmer

l’existence d’un système symbiotique spécifique dans les organes excréteurs des Nautiloides

du genre Nautilus et de caractériser les partenaires impliqués puis, dans un deuxième temps

d’aborder les aspects évolutifs et physiologiques de cette interaction. L’analyse de la diversité

bactérienne, réalisée au moyen du séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S, a permis de

proposer l’hypothèse nouvelle d’une « double symbiose » impliquant deux groupes bactériens

présents chez tous les spécimens de Nautiloides étudiés. En accord avec la distribution

spatiale des symbiotes, l’examen de leur potentiel métabolique suggère un rôle dans la

fonction d’excrétion de l’hôte. Les résultats exposés lors des différents volets de cette étude

sont donc discutés de manière globale afin de suggérer de nouvelles hypothèses concernant

l’évolution, la transmission et la fonction de cette double symbiose.

1. Diversité bactérienne associée à différentes espèces de Nautiloides

Avant ce travail, les symbiotes bactériens hébergés par les organes excréteurs des

Nautiloides n’avaient jamais été caractérisés en détails à l’aide de diverses approches

moléculaires. Les caractères physiologiques de certaines bactéries cultivées à partir de

fragments d’organes avaient permis à Schipp et al (1990) de suggérer leur appartenance au

groupe des Pseudomonadales. Au cours de cette étude, l’amplification par PCR, puis le

séquençage et l’analyse du gène codant pour l’ARNr 16S, ont permis d’identifier les

populations bactériennes associées à deux espèces de trois provenances géographiques: N.

macromphalus de Nouvelle-Calédonie et N. pompilius des Philippines et du Vanuatu. La

localisation des bactéries détectées par PCR au sein des tissus de Nautile, indépendamment de

toute phase de culture, a été vérifiée par hybridation in situ (CARD-FISH). Cette approche

moléculaire a permis de mettre en évidence le statut symbiotique de deux groupes bactériens

appartenant aux beta protéobactéries et aux spirochètes (Tableau 4). Ces deux phylotypes ont

été détectés de manière persistante par PCR et leur association étroite avec les tissus de l’hôte

a été confirmée par CARD-FISH chez tous les spécimens étudiés.

Deux autres groupes de bactéries ont été détectés ponctuellement par PCR : les

Pseudoalteromonadales chez un individu de N. macromphalus (Nouvelle-Calédonie) et les

Vibrionales chez les trois individus de N. pompilius des Philippines. Cependant une étroite


150

association de ces deux groupes bactériens avec le tissu de l’hôte n’a jamais été observée par

la technique d’hybridation in situ (CARD-FISH), ce qui remet en question leur statut

symbiotique.

Betaproteobacteria Spirochaetes Vibrios Pseudoalteromonadales RéférencesPCR 16S rRNA x x - x

CARD-FISH x x - -Symbiotic status X X - ?

PCR 16S rRNA x x x -CARD-FISH x x - -

Symbiotic status X X ? -

PCR 16S rRNA x x - -CARD-FISH x x - -

Symbiotic status X X - -

N. macromphalus (New-Caledonia)

N. pompilius (Philippines)

N. pompilius (Vanuatu)

ChapitreIII, 4.1 & 4.2

ChapitreIII, 4.4 & 4.5

ChapitreIII, 4.4

En effet, les organes excréteurs des Nautiloides étant indirectement reliés au milieu

extérieur par l’intermédiaire de la cavité palléale, ces bactéries pourraient provenir d’une

contamination par l’environnement. Les analyses comparatives des séquences d’ARNr 16S

supportent cette hypothèse puisque, dans les deux cas, elles montrent plus de 97% de

similitude avec des séquences de bactéries présentes dans l’environnement sous forme libre

(Pseudoalteromonas sp. ANG AF022407 et Vibrio pelagius X74722). Toutefois, au vu de la

proportion importante de clones correspondant aux vibrios obtenues chez N. pompilius (26

clones soit environ 44 % de la diversité, voir Chapitre III.4.4.1, page 112), des observations

en hybridations in situ (CARD-FISH) sur un nombre plus grand d’individus provenant des

Philippines doivent être envisagées afin de déterminer précisément le statut de ce groupe

Vibrio. La suite de la discussion se concentrera sur les groupes bactériens dont le statut

symbiotique a été confirmé chez tous les spécimens étudiés c'est-à-dire les beta

protéobactéries et les spirochètes.

2. Evolution des symbioses des Nautiloides

Le séquençage du gène codant pour l’ARNr 16S des symbiotes bactériens fournit de

nouvelles informations qui pourraient permettre de mieux comprendre l’histoire évolutive des

symbioses chez les Nautiloides. A cet égard, l’importante distance génétique des symbiotes

appartenant aux betaproteobacteries et aux spirochètes vis-à-vis des souches référencées dans

Tableau 4 : Les principaux groupes de bactéries détectés dans les organes excréteurs des deux espèces de Nautile à l’aide : -de l’amplification par PCR du gène codant pour l’ARNr 16S -de la technique de CARD-FISH Le statut symbiotique est déduit d’une détection par PCR suivie d’une vérification de la présence des bactéries dans le tissu par CARD-FISH.


151

les banques de données témoigne, dans un premier temps, de leur spécificité vis-à-vis des

Nautiloides et semble, dans un deuxième temps, suggérer l’hypothèse d’une co-évolution

hôte-symbiote (voir Chapitre III.4.1, article page 78-79). En effet, la grande distance

génétique (> 10 %) observée par analyse comparative des séquences d’ARNr 16S peut

conduire à spéculer (i) que les derniers ancêtres communs aux symbiotes bactériens des

Nautiloides et aux groupes bactériens référencés les plus proches devraient avoir existé il y a

plus de 500 millions d’années : environ 515 millions d’années pour les spirochètes et 630

millions d’années pour les beta protéobactéries (le taux de substitution communément admis

pour l’ARNr 16S étant d’environ 1 % pour 50 millions d’années, Moran et al, 1993) et (ii)

que la diversification de ces symbiotes pourrait avoir commencé avec leur acquisition par

l’ancêtre commun des Nautiloides dont l’origine remonte au Cambrien (500 à 542 millions

d’années). En congruence avec ces hypothèses, les analyses comparatives préliminaires (sur

près de 950 paires de bases de l’ARNr 16S) montrent que les Nautiloides des trois

provenances géographiques étudiées (N. macromphalus de Nouvelle-Calédonie et N.

pompilius des Philippines et du Vanuatu) hébergent des symbiotes évolutivement très

proches : leurs séquences possèdent plus de 99,5% de similitude entre elles. (Figure 42).

Figure 42 : Arbre phylogénétique présentant les symbiotes bactériens de N. pompilius (Philippines en rouge; Vanuatu en vert) et de N. macromphalus (Nouvelle-Calédonie en bleu). L’arbre est construit à partir de la méthode de maximum de vraisemblance (954 sites analysés). Les valeurs de bootstrap indiquées donnent un pourcentage calculé à partir de 100 réplicats en analyse de maximum de parcimonie (haut) et maximum de vraisemblance (en bas). Seules les valeurs supérieures à 60% sont indiquées.


152

Cette forte similitude génétique observée entre les symbiotes bactériens supporte de plus

l’hypothèse proposée par Wray et al (1995) selon laquelle N. macromphalus et N. pompilius

appartiennent en fait à une seule espèce. Toutefois, il est aujourd’hui communément admis

que le gène codant pour l’ARNr 16S ne possède pas une résolution suffisante pour mettre en

évidence des relations phylogénétiques des bactéries au niveau intra spécifique (Kowalchuck

& Stephen, 2001). L’utilisation potentielle des symbiotes bactériens comme marqueur

d’évolution des Nautiloides (co-phylogénie) devra donc passer par l’emploi de marqueurs

moléculaires plus variables tels que certains gènes fonctionnels. A cet égard, le gène codant

pour la déshydrogénase du glycéraldéhyde phosphate (gapA) des bactéries a déjà été utilisé

dans l’association sépiolides-Vibrio pour reconstruire les relations phylogéographiques des

hôtes et des symbiotes (Nishiguchi & Jones, 2006) et pourrait donc permettre une analyse

phylogénétique plus fine.

Afin d’étendre l’existence de la « double symbiose » mise en évidence chez N.

macromphalus et N. pompilius à l’ensemble du genre Nautilus, il semble nécessaire à l’avenir

de confirmer la présence de ces symbiotes bactériens chez les autres espèces du genre

Nautilus: N. belauensis, N. stenomphalus, N. repertus. En outre, la recherche et la

caractérisation de ces symbiotes devra être élargie à la seule espèce du genre Allonautilus, A.

scrobitulatus (Ward & Saunders, 1997 ; Bonnaud et al, 2004), afin de pouvoir étendre cette

hypothèse de double symbiose à toute la sous classe des Nautiloides. Ces espèces n’ont,

jusqu’ici, jamais fait l’objet d’observations concernant des populations symbiotiques

potentielles.

3. Transmission des symbiotes bactériens

La grande similitude génétique observée entre les symbiotes bactériens des différents

Nautiloides étudiés supporte l’hypothèse d’indépendance de cette « double symbiose » vis-à-

vis des facteurs biogéographiques, ce qui peut apporter de nouveaux éléments de discussion

concernant la transmission des symbiotes aux Nautiloides. En effet, la présence de symbiotes

(beta protéobactéries et spirochètes) phylogénétiquement très proches chez tous les individus

de Nautiloides étudiés suggère deux possibilités quant à leur transmission :

• La transmission se fait par l’environnement (transmission horizontale) et nécessite

alors la présence des mêmes symbiotes sous forme libre dans l’environnement et ce,

sur une aire géographique très large (plus de 4000kms)


153

• La transmission se fait par héritage parental (transmission verticale), ce qui implique

l’acquisition de ces symbiotes par l’ancêtre commun aux différentes espèces de

Nautiloides.

Des analyses préliminaires réalisées sur un embryon de N. macromphalus (fourni par

l’Aquarium de Nouméa en Septembre 2005) sont en faveur de l’hypothèse d’une transmission

verticale au moins pour l’un des deux groupes de symbiotes. En effet, la présence de bactéries

génétiquement très proches des beta protéobactéries symbiotiques (>99,5% de similitude sur

environ 1000 paires de bases de l’ARNr 16S, illustré par la Figure 43) dans la gaine interne

entourant l’embryon indique l’association de ce groupe de symbiotes dès les stades les plus

précoces du développement de N. macromphalus. De plus, cet embryon provenait d’un œuf

pondu en captivité, en dehors de son environnement naturel, ce qui appuierait l’hypothèse

d’un mode de transmission vertical des beta protéobactéries.

Figure 43 : Arbre phylogénétique regroupant les séquences d’ARNr 16S de bataproteobactéries détectées chez les Nautiloides adultes (N. pompilius des Philippines en rouge; N. pompilius du Vanuatu en vert ; N. macromphalus de Nouvelle-Calédonie en bleu) ainsi que dans un embryon de N. macromphalus en jaune. L’arbre est construit à partir de la méthode de maximum de vraisemblance (1022 sites analysés). Les valeurs de bootstrap indiquées donnent un pourcentage calculé à partir de 100 réplicats en analyse de maximum de parcimonie (haut) et en maximum de vraisemblance (bas). Seules les valeurs supérieures à 60% sont indiquées. Une cyanobactérie : Trichodesmium thiebautii AF013027 a été utilisé pour enraciner l’arbre.


154

Concernant le deuxième groupe de symbiotes, aucune séquence proche de celles des

spirochètes n’a pu être mise en évidence lors des analyses réalisées sur l’embryon de N.

macromphalus (sur un total d’environ 35 séquences partielles) ce qui semblerait suggérer une

transmission différente pour les deux groupes de symbiotes :

• Transmission verticale pour les beta protéobactéries

• Transmission horizontale pour les spirochètes.

Pourtant, cette hypothèse de transmission horizontale des spirochètes peut paraître

étonnante, car les symbiotes mis en évidence chez les Nautiloides diffèrent clairement des

souches de spirochètes connues dans l’environnement à deux niveaux. Tout d’abord au niveau

génétique, puisque leur séquence d’ARNr16S semble distante de celle des spirochètes vivant

sous forme libre dans l’environnement (similitude < 90%). De plus, la morphologie de ce

groupe de symbiote observée dans les tissus des

Nautiloides par hybridation in situ et en microscopie

électronique (Figure 44) montre, de manière

inattendue, une forme coccoïde extrêmement rare

chez les spirochètes (Dröge et al, 2006). En effet, les

spirochètes sont généralement caractérisées par leur

forme spiralée et par leurs filaments axiaux qui sont

à l’origine de leur mobilité. Toutefois, l’existence de

formes coccoïdes a récemment été mise en évidence

dans des sédiments fluviaux anoxiques (Ritalahti &

Loffler, 2004) et dans le tube digestif de certaines

espèces de termites (Dröge et al, 2006).

D’autres expériences sont à envisager à l’avenir afin de tester ces hypothèses

concernant une transmission différentielle des deux groupes de symbiotes aux Nautiloides. A

cet égard, il faut souligner la très faible disponibilité de matériel biologique concernant les

juvéniles et les stades de développement précoces chez les Nautiloides. En effet,

l’environnement naturel de leur ponte reste inconnu et les techniques de collecte mises en

œuvre jusqu’ici n’ont permis que de très rares accès à des juvéniles issus du milieu naturel. Le

matériel fourni par les aquariums (souvent en quantité très faible…) peut permettre

d‘examiner les hypothèses concernant la transmission verticale des symbiotes dans le carde de

la reproduction, mais il rend difficile toute investigation concernant les hypothèses de

transmission horizontale. L’analyse des échantillons d’eau prélevés lors d’une collecte en

Nouvelle-Calédonie (site de la passe de Dumbéa, 330 m de profondeur) est en cours et devrait

Figure…: Section d’appendice péricardique de N. macromphalus vue en Microscopie électronique montrant la forme coccoide des spirochetes (white arrows). Scale bar: 1 µm

Figure 44: Section d’appendice péricardique de N. macromphalus vue en microscopie électronique montrant la forme coccoide des spirochètes (flèches blanches). Barre d’échelle: 1 µm


155

permettre de vérifier ou non la présence des symbiotes dans l’environnement naturel des

individus adultes de N. macromphalus.

4. Eco-physiologie du système symbiotique

Au cours de ce travail, l’analyse de la répartition spatiale des symbiotes a permis de

révéler la nette structuration de la population bactérienne dans les tissus de l’organe hôte des

Nautiloides (voir Chapitre III.4.1, page 64 et article page 67 ; Chapitre III.4.4.2, page 113). En

effet, chez les deux espèces de Nautiloides étudiées, les symbiotes semblent avant tout

concentrés dans la région baso-médiane des villis péricardiques et paraissent totalement

absents de la partie apicale. De plus, un deuxième niveau d’architecture spatiale, spécifique à

chaque groupe de symbiotes est observable avec une prédominance des beta protéobactéries

dans les cavités profondes des villis et une présence des spirochètes plus en périphérie (voir

Chapitre III.4.1, page 64 et article page 67). En accord avec l’organisation fonctionnelle

révélée par l’ultrastructure des villis péricardiques (Schipp et al, 1985), cette répartition des

populations symbiotiques peut permettre de reconsidérer l’éco-physiologie de ce micro-

écosystème. En effet, la partie symbiotique des villis est principalement active dans

l’ultrafiltration (filtration des molécules sanguines de petite taille) ainsi que dans la

réabsorption (réincorporation active de certains composés présents à l’extérieur de l’organe).

La partie apicale des villis, dépourvue de symbiotes, est, quant à elle, active dans la sécrétion

du fluide excréteur acide et riche en ammonium (Schipp & Martin, 1987).

L’éco-physiologie de ce système symbiotique semble donc régie par plusieurs facteurs

connus (pH et ammonium principalement) mais d’autres facteurs abiotiques pourraient aussi

entrer en jeu dans ce système, notamment les faibles concentrations en oxygène présentes

dans les cavités des villis (Schipp et al, 1990) ainsi que de fortes teneurs en métaux lourds

détectées dans les appendices péricardiques (Bustamante et al, 2000). La répartition précise

des populations symbiotiques, extracellulaires et concentrées dans la région baso-médiane,

pourrait refléter des interactions métaboliques hôte-bactéries basées sur un processus en trois

étapes: (1) sécrétion de composés par l’hôte, (2) assimilation et dégradation de certains de ces

composés par les symbiotes puis (3) ré-assimilation active des produits de dégradation par le

tissu hôte (réabsorption, Figure 45).


156

Chez les Nautiloides, la présence de pompes ioniques de taille importante ainsi que le

grand nombre de mitochondries dans la région symbiotique des villis (voir Chapitre III.4.1,

article page 67) suggère une dépense énergétique importante pour assurer le transport de

composés qui seraient ainsi réabsorbés par l’hôte après une première dégradation par les

symbiotes bactériens. Etant donné la forte densité de bactéries que nous avons quantifiée dans

les quatre appendices péricardiques par cytomètrie en flux (~150 x 106 bactéries/g de tissu

frais, voir Chapitre III.4.2, article page 97) leur contribution à la physiologie de l’hôte pourrait

se révéler déterminante. En effet, de telles interactions symbiotiques essentielles sont connues

par exemple dans le tube digestif des ruminants (Stevens & Hume, 1998), des termites (voir

Encadré 2, page 23), ou encore des mollusques bivalves de la famille des terenidés (Distel et

Figure 45: Modèle éco-physiologique d’un villi péricardique de Nautiloide. Les principaux processus métaboliques suggérés sont indiqués par des flèches : Rouge : filtration des molécules circulant dans le sang. JJaauunnee : sécrétion du fluide excréteur par l’hôte. Noire : dégradation métabolique par les symbiotes bactériens. Bleu : réabsorption active par l’hôte.


157

al, 2002), où elles permettent l’exploitation de l’énergie stockée dans des composés non-

assimilables par l’hôte (exemple de la cellulose chez les termites) ou la production

symbiotique de molécules indispensables et non synthétisables par l’hôte (vitamines, acides

aminés…). Une analyse plus fine est donc nécessaire, à l’avenir, afin de pouvoir préciser

quels sont les composés engagés dans ces processus métaboliques.

Lors de ce travail, nous nous sommes concentrés sur la physiologie des symbiotes et plus

particulièrement sur leur potentiel de métabolisation des composés azotés car ces composés

sont abondants dans les produits d’excrétion (Martin, 1983 ; Boucher-Rodoni, 1989) et leur

transformation pourrait avoir un rôle important dans la gestion de la flottabilité chez les

Nautiloides (voir Encadré 3, page 32). L’approche moléculaire, basée sur la recherche de

gènes fonctionnels codant pour des enzymes impliquées dans la nitrification et la

dénitrification bactérienne n’a pour l’instant pas permis de préciser le métabolisme azoté des

symbiotes.

Cependant, une approche isotopique, basée sur l’incubation ex-vivo de l’organe, c'est-à-

dire du complexe hôte-bactéries dans un milieu contrôlé, pour suivre dans le temps les

concentrations de nitrates (NO3-) et nitrites (NO2

-) ainsi que la production d’azote gazeux

(N2), a mis en évidence une série de réponses métaboliques des symbiotes dans un milieu

enrichi en ammonium et en nitrate (voir Chapitre II. 4.3.2.2, page 109). Outre la production

d’azote gazeux, ces activités métaboliques pourraient conduire à la production d’un autre

composé gazeux intermédiaire (oxyde nitreux gazeux : N2O) à partir d’ammonium (NH4+).

L’oxyde nitreux, comme l’azote gazeux, pourrait être produit soit directement par une

réaction du type « anammox » réalisée par un des deux groupes de symbiote (voir Encadré 1,

page 19), soit par l’action combinée d’un symbiote nitrifiant et d’un symbiote dénitrifiant.

Cette activité symbiotique pourrait fournir un apport non négligeable en gaz qui, en accord

avec l’hypothèse suggérée par Boucher-Rodoni & Mangold (1994), permettrait aux

Nautiloides de conserver leur flottabilité neutre tout au long de leur vie. Dans l’avenir cette

hypothèse devra donc être approfondie en utilisant l’approche isotopique, en priorité par des

analyses complémentaires en spectrométrie de masse des différents composés, y compris

l’oxyde nitreux gazeux dans le milieu d’incubation des organes et dans l’hémolymphe.

De plus, parallèlement à cette approche originale d’incubation ex-vivo du système

symbiotique que nous avons développée au cours de ce travail, nous pourrions dans le futur

utiliser une sonde d’analyse multi-isotopique par spectromètrie de masse (MIMS pour

multiple-isotope imaging mass spectrometry) afin de mesurer l’assimilation symbiotique de

composés azotés mais aussi carbonés in situ dans le tissu des Nautiloides. Ce type d’approche,


158

utilisé très récemment pour démontrer la fixation symbiotique d’azote dans le cadre

d’interactions symbiotiques chez les terenidés (Luyten et al, 2006), semble très prometteur

pour l’étude des échanges métaboliques intervenant à un niveau cellulaire.

Le modèle de co-culture mis au point au cours de ce travail (voir Chapitre II.4.2) est un

outil qui permet d’envisager l’échelle cellulaire des processus physiologiques en maintenant

au moins partiellement l’interaction des symbiotes avec les cellules hôtes et en suivant

l’activité métabolique globale de ce complexe symbiotique à court terme. Cette approche

cellulaire pourrait de plus se révéler particulièrement pertinente pour étudier la nature des

facteurs permettant la reconnaissance des cellules hôtes et des symbiotes. De tels facteurs de

reconnaissance sont déjà connus chez un autre céphalopode dans un contexte évolutif et

physiologique différent, dans la symbiose concernant les glandes lumineuses d’Euprymna

scolopes (Nyholm & McFall-Ngai, 2004).

5. Synthèse

L’ensemble des questions soulevées au cours de cette thèse a fourni les principaux

résultats suivants:

• L’association symbiotique spécifique de deux groupes bactériens (beta protéobactéries

et spirochètes) est clairement établie par analyse moléculaire (séquençage 16S

bactérien, CARD-FISH) dans les appendices péricardiques de deux espèces de

Nautiloides provenant de trois zones géographiques différentes (N. macromphalus de

Nouvelle Calédonie, N. pompilius des Philippines, N. pompilius du Vanuatu).

• Un statut opportuniste est proposé pour un groupe de bactéries Vibrio, présent chez les

individus de N. pompilius des Philippines uniquement et produisant un composé

bioactif de nature non peptidique.

• Les deux symbiotes bactériens (beta protéobactéries et spirochètes) sont présents en

grande densité au sein des appendices péricardiques des Nautiloides (~150 x 106

bactéries/g de tissu frais) et leur répartition paraît liée à la structure fonctionnelle de

ces organes.

• L’ultrastructure tissulaire des appendices péricardiques montre une activité importante

dans la zone de présence des symbiotes qui pourrait être liée aux processus de

réabsorption.

• Le statut symbiotique des beta protéobactéries et des spirochètes est confirmé par leur

survie en co-culture avec les cellules provenant de l’organe hôte.


159

• Le rôle individuel de chaque symbiote est difficile à établir, mais le système

symbiotique dans son ensemble pourrait participer au métabolisme azoté des

Nautiloides (production d’azote gazeux à partir d’ammonium en incubation ex vivo de

l’organe hôte et de ses symbiotes bactériens).

Les Nautiloides sont des organismes d’origine Cambrienne et leurs symbiotes sont des

formes très éloignées de leurs proches parents actuels : le rôle de telles associations dans

l’histoire évolutive des deux partenaires est discuté.

Enfin, la caractérisation de ce système symbiotique souligne un peu plus l’intérêt des

céphalopodes comme modèle d’avenir pour l’étude des symbioses bactériennes. Au sein de ce

groupe plusieurs fonctions concernent des systèmes symbiotiques: nutrition et comportement

dans les glandes lumineuses, reproduction dans les glandes nidamentaires accessoires,

excrétion dans les appendices péricardiques. La recherche des molécules impliquées dans les

dialogues hôte-bactéries au sein de ces différents systèmes symbiotiques (glandes lumineuses,

glandes nidamentaires accessoires et appendices péricardiques) pourrait ainsi permettre

d’aborder la question des convergences moléculaires dans les processus de reconnaissance et

d’interaction céphalopodes-bactéries.


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Diversité bactérienne associée aux organes excréteurs des Nautiloides : caractérisation du système symbiotique, implications évolutives et physiologiques Parmi les nombreux exemples d’association invertébrés marins-bactéries, la symbiose hébergée par les organes excréteurs des Nautiloides s’avère d’un intérêt particulier d’un point de vue évolutif et physiologique. En effet, ce groupe de céphalopodes , dont l’origine remonte au Cambrien (~500 MA) présente un système excréteur hautement spécialisé qui cumule les trois processus liés à la fonction d’excrétion (filtration, réabsorption, secrétion) au sein d’un seul et même organe appelé appendice péricardique. Au cours de cette thèse, les bactéries symbiotiques abritées dans les appendices péricardiques de deux espèces de Nautiloides : Nautilus macromphalus (endémique de Nouvelle-Calédonie) et Nautilus pompilius (distribution indo-pacifique) ont été caractérisées par différentes approches complémentaires. L’analyse de la diversité bactérienne par séquençage de l’ARNr 16S a permis de proposer l’hypothèse nouvelle d’une « double symbiose» spécifique impliquant deux groupes bactériens (beta protéobactéries et spirochètes) présents chez tous les spécimens de Nautiloides dans les trois zones géographiques étudiées (N. macromphalus en Nouvelle-Calédonie, N. pompilius aux Philippines et au Vanuatu). L’importante similitude génétique entre les symbiotes bactériens des différents Nautiloides souligne l’indépendance de cette double symbiose vis-à-vis des facteurs biogéographiques et suggère son extension au genre Nautilus. L’hybridation de sondes spécifiques par CARD-FISH, réalisée parallèlement à l’observation du tissu en microscopie électronique, a confirmé le statut symbiotique de ces deux groupes bactériens et a permis de révéler que leur distribution était en étroite liaison avec l’ultrastructure fonctionnelle de l’organe hôte. Cette répartition précise suggère des échanges essentiels entre l’hôte et les symbiotes. De plus, une approche isotopique, basée sur l’incubation ex-vivo du complexe symbiotique dans un milieu contrôlé, semble indiquer une contribution des symbiotes dans le métabolisme azoté de l’hôte par production d’azote gazeux. L’interaction symbiotique Nautiloides-bactéries permet ainsi d’envisager l’étude de l’influence de la symbiose bactérienne dans la gestion des déchets azotés, une adaptation physiologique majeure au cours de l’évolution des céphalopodes. Mots clés : symbiose, céphalopodes, Nautiloides, Nautilus, excrétion, beta protéobactéries, spirochètes, vibrios, ARNr 16S, CARD-FISH, co-culture, métabolisme azoté, isotopes stables, activité antimicrobienne, Nouvelle-Calédonie, Philippines, Vanuatu. Bacterial symbioses in Nautiloids excretory organs: characterisation of the symbiotic system, evolutionary and physiological aspects Symbiosis is an important driving force of metazoan evolution and the study of symbiotic associations in ancient lineages might provide further insight into the origin of several major physiological adaptations. In this respect, symbiotic associations concerning the excretory organs of the “living fossil” Nautilus (Cambrian origin: ca 500 mya), are of particular interest. Indeed, conversely to what is known in others cephalopods, in Nautilus most of the excretory processes (filtration, reabsorption, secretion) are assumed by the highly specialized pericardial appendages. In this study, we report that nautiluses from various geographical areas (Nautilus macromphalus from New Caledonia, and Nautilus pompilius from Philippines and from Vanuatu) harbour a high density of betaproteobacteria and spirochete phylotypes in their pericardial appendages. They were characterized by using various molecular approaches (16S rRNA phylogeny, CARD-FISH) and electron microscopy (TEM). This dual symbiosis concerns the genus Nautilus as it is not related to geographical origin of the specimens. CARD-FISH analyses relate bacteria distribution to the functional ultrastructure of the host organ, suggesting a symbiotic contribution to the excretory metabolism. Ex-vivo incubation of the symbiotic complex in controlled medium suggests a bacterial implication in nitrogen metabolism of the host (gaseous nitrogen production). Such symbiosis being unknown so far among marine invertebrates, Nautilus bacterial symbiosis provides a unique opportunity to investigate the influence of host-microbes interactions in a major physiological adaptation during the course of marine invertebrates evolution. Key-words: symbiosis, cephalopods, Nautiloids, Nautilus, excretion, betaproteobacteria, spirochetes, vibrios, ARNr 16S, CARD-FISH, co-culture, Nitrogen metabolism, labelled isotopes, antimicrobial activity, New-Caledonia, Philippines, Vanuatu.

diversité bactérienne associée aux organes excréteurs des...

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