diagnÓstico de leptospirose por pcr e caracterizaÇÃo...
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DIAGNÓSTICO DE LEPTOSPIROSE POR PCR E
CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE Leptospira spp. POR
SEQÜENCIAMENTO DO 16S rDNA E ANÁLISE DE VNTR
SANDRA DENIZE DORNELES JOUGLARD
PELOTAS Rio Grande do Sul - Brasil
Outubro de 2005
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DO DESPORTO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
Tese apresentada à Universidade Federal
de Pelotas, sob orientação do Prof. Dr.
Odir Antônio Dellagostin, como parte
das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia Agrícola
para obtenção do título de Doutor em
Ciências.
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DIAGNÓSTICO DE LEPTOSPIROSE POR PCR E
CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE Leptospira spp. POR
SEQÜENCIAMENTO DO 16S rDNA E ANÁLISE DE VNTR
SANDRA DENIZE DORNELES JOUGLARD
PELOTAS Rio Grande do Sul - Brasil
Outubro de 2005
MINISTÉRIO DA EDUCAÇÃO E DO DESPORTO
UNIVERSIDADE FEDERAL DE PELOTAS
CENTRO DE BIOTECNOLOGIA
Tese apresentada à Universidade Federal
de Pelotas, sob orientação do Prof. Dr.
Odir Antônio Dellagostin, como parte
das exigências do Programa de Pós-
Graduação em Biotecnologia Agrícola
para obtenção do título de Doutor em
Ciências.
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SANDRA DENIZE DORNELES JOUGLARD
DIAGNÓSTICO DE LEPTOSPIROSE POR PCR E
CARACTERIZAÇÃO DE ISOLADOS DE Leptospira spp. POR
SEQÜENCIAMENTO DO 16S rDNA E ANÁLISE DE VNTR
Aprovada: 14 de outubro de 2005
Jose Antônio Guimarães Aleixo Ph D Dr. Luiz Ernesto Samartino Ph D UFPel INTA Sílvio Arruda Vasconcellos Ph.D. Odir Antônio Dellagostin Ph.D. USP UFPel Orientador
iv
Na consciência de cada homem deve estar presente a responsabilidade com a
vida. A qualidade do mundo depende sempre de cada uma de nossas ações.
Os animais são nossos companheiros de Planeta e, sem dúvida, dependentes
de nós. Nada é tão gratificante no nosso dia-a-dia quanto vê-los pastar
livremente, amamentar suas crias e sentir a alegria e o carinho com que nos
recebem.
Evitar a crueldade com qualquer animal é importante para que nossa
sociedade possa evoluir... É preciso amansar as feras que existem dentro de
nós.
v
Este trabalho é dedicado
a minha mãe Zuleima,
uma mulher extraordinária!
Sandra Denize D. Jouglard
vi
AGRADECIMENTOS Ao Centro de Biotecnologia da Universidade Federal de Pelotas, pela realização
do curso.
Ao Conselho de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela bolsa
de doutorado.
Aos meus filhos: Marcos, Andréia, Conrado e Roberto Jr., pela paciência e por
entenderem todas as minhas ausências.
A minha mãe, por ter sido a maior colaboradora na minha caminhada.
Aos meus familiares que sempre me apóiam incondicionalmente!
Aos meus queridos “becários” Luiz Gustavo Arruda da Silva, Patrícia Brites,
Fernanda Nassi, Fabiana Seixas e Simone Simionatto, pela colaboração e amizade
imprescindíveis na realização deste trabalho.
A minha grande amiga e colega Eliana K. Vaz. Ter feito parte de sua jornada foi
um privilégio.
Aos colegas e amigos de todas as horas, Sibele Borsuk, Claúdia Fernandes,
André e Marcelo Michelon, Alan McBride, Reginaldo Bastos e Cristina Cunha, Ana
Paula Nunes, Maria Isabel Machado, Gladis Ribeiro, Orlando Ramires, Carlos Scaini e
Gabriela Reighantz, Fabrício Conceição e Ângela Moreira, Charli Ludtke, Cecília
Moreira, Milton Macedo, Luciano Pinto, Gustavo Cerqueira e a todos os outros colegas
que de uma forma ou de outra estiveram presentes na realização deste trabalho.
À Alegani Monteiro, burocracia também faz parte da pesquisa!
A todos os colegas e professores do Centro de Biotecnologia e do Centro de
Controle de Zoonoses, especial ao Dr. Claudiomar Brod pelo apoio e incentivo.
Ao professor Dr. Odir Antônio Dellagostin, um ser humano surpreendente,
amigo de todas as horas e colaborador incansável em cada etapa deste estudo. Um
exemplo de dedicação e retidão ao ensino superior e, principalmente a pós-graduação
desta universidade. Uma pessoa singular. A você doutor, meu mais profundo
reconhecimento e gratidão.
Aos mestres, Jose Antônio Guimarães Aleixo, Carlos Gil Turnes e Telmo
Vidor, vocês com certeza fazem a diferença, meu obrigado de coração.
vii
ÍNDICE
SUMÁRIO .......................................................................................................... ix
SUMMARY..........................................................................................................x
1. REVISÃO DA LITERATURA.......................................................................... 1
Leptospirose: uma zoonose de distribuição mundial ........Erro! Indicador não definido. 1.1. Introdução..................................................Erro! Indicador não definido. 1.2. Aspectos históricos....................................Erro! Indicador não definido. 1.3. Aspectos microbiológicos ..........................Erro! Indicador não definido.
1.3.1. Taxonomia e Classificação .................Erro! Indicador não definido. 1.3.2. Biologia ...............................................Erro! Indicador não definido. 1.3.3. Meios de Cultura .................................Erro! Indicador não definido. 1.3.4. Biologia Molecular...............................Erro! Indicador não definido.
1.4. Epidemiologia ............................................Erro! Indicador não definido. 1.5. Apresentação Clínica ................................Erro! Indicador não definido. 1.6. Diagnóstico................................................Erro! Indicador não definido. 1.7. Tratamento ................................................Erro! Indicador não definido. 1.8. Vacinas......................................................Erro! Indicador não definido. 1.9. Conclusão..................................................Erro! Indicador não definido.
2. OBJETIVOS................................................................................................. 16
2.1. Geral...................................................................................................... 16
2.2. Específicos ............................................................................................ 16
3. ARTIGO 1 .................................................................................................... 17
Nested PCR for detection of pathogenic leptospiras........................................ 17
Abstract ............................................................Erro! Indicador não definido. Introduction.......................................................Erro! Indicador não definido. Material and Methods .......................................Erro! Indicador não definido.
Bacteria strains .............................................Erro! Indicador não definido. DNA extraction ..............................................Erro! Indicador não definido. Preparation of clinical samples .....................Erro! Indicador não definido. Primer design................................................Erro! Indicador não definido. PCR and Nested PCR Conditions.................Erro! Indicador não definido.
Results .............................................................Erro! Indicador não definido.
viii
DNA extraction ..............................................Erro! Indicador não definido. Sensitivity of PCR from cultures....................Erro! Indicador não definido. Specificity of the primers ...............................Erro! Indicador não definido. Nested PCR..................................................Erro! Indicador não definido.
Discussion ........................................................Erro! Indicador não definido. Acknowledgments ............................................Erro! Indicador não definido. References .......................................................Erro! Indicador não definido.
4. ARTIGO 2 .................................................................................................... 37
Characterization of Leptospira spp. Isolates by Analysis of Variable-Number
Tandem-Repeats and 16S rDNA Sequencing.................................................. 37
ABSTRACT .................................................................................................. 38
INTRODUCTION .......................................................................................... 39
MATERIALS AND METHODS...................................................................... 40
RESULTS..................................................................................................... 42
DISCUSSION ............................................................................................... 44
ACKNOWLEDGMENTS ............................................................................... 49
REFERENCES............................................................................................. 49
5. CONCLUSÕES GERAIS.............................................................................. 53
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................................. 54
ix
SUMÁRIO
JOUGLARD, SANDRA DENIZE DORNELES, Universidade Federal de Pelotas, Outubro de 2005. Diagnóstico de leptospirose por PCR e caracterização de isolados de Leptospira spp. por sequenciamento do 16S rDNA e análise de VNTR. Professor Orientador: Odir Antônio Dellagostin.
A leptospirose, causada por bactérias do gênero Leptospira, é uma antropozoonose
direta de ampla distribuição geográfica, que ocorre de forma endêmica no mundo
inteiro. O diagnóstico definitivo de leptospirose depende do isolamento de leptospiras a
partir de amostras clínicas ou pela soroconversão de soros pareados na fase aguda ou
convalescente da doença. Existe a necessidade urgente de desenvolvimento de novas
estratégias diagnósticas para a leptospirose. Diversos PCRs convencionais têm sido
desenvolvidos, mas todos apresentam alguma limitação que restringe sua ampla
utilização. Para tentar superar essas limitações foi desenvolvido um ensaio baseado em
nested PCR usando como alvo parte do gene lipL32, que é conservado entre os
sorovares de leptospiras patogênicas. Esta abordagem foi muito mais sensível do que o
PCR convencional. Existem muitas dificuldades associadas a identificação sorológica
de cepas de Leptospira. Por esta razão foi realizada a caracterização molecular de 10
isolados de Leptospira spp., obtidos a partir de amostras clínicas de humanos e animais.
O seqüenciamento do 16S rDNA permitiu a confirmação das espécies, enquanto que a
identificação dos sorovares só foi possível pela análise de VNTR. A análise baseada em
VNTR provou ser um ensaio rápido e de alto poder discriminatório para caracterizar
sorovares de isolados de Leptospira interrogans.
x
SUMMARY JOUGLARD, SANDRA DENIZE DORNELES, Universidade Federal de Pelotas,
October 2005. Diagnosis of leptospirosis by PCR and characterization of Leptospira spp. isolates by 16S rDNA sequencing and VNTR analysis. Advisor: Odir Antônio Dellagostin.
Leptospirosis, caused by bacteria of the genus Leptospira, is a direct anthropo-zoonotic
infection with a geographical distribution throughout the world. Definitive diagnosis of
leptospirosis has traditionally depended upon the isolation of leptospiras from clinical
specimens or the demonstration of seroconversion in paired acute and convalescent
serum samples. There is an urgent need for the development of new diagnostic
strategies for leptospirosis. Conventional PCR assays have been developed, but they
have limitations that have restricted their widespread use. In order to overcome these
limitations, a nested PCR assay was developed using as target part of the lipL32 gene,
which is conserved among pathogenic serovars of Leptospira. This approach was much
more sensitive than conventional PCR. Furthemore, there are also difficulties associated
with serological identification of Leptospira strains and for this reason we carried out
molecular characterization of 10 Leptospira spp. strains isolated from human and
animal clinical samples. The 16S rDNA sequencing allowed confirmation of the
species, whereas serovar identification was only possible with the VNTR analysis. The
analysis based on VNTR polymorphism provides a rapid as well as highly
discriminating assay to characterize L. interrogans isolates at serovar level.
1
1. Revisao da Literatura
Leptospirose: uma zoonose de distribuição mundial
Jouglard, S.D.D. & Dellagostin O.A. Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, RS, Brasil 1.1. Introdução
A leptospirose é uma antropozoonose causada por bactérias do gênero
Leptospira. A doença ocorre amplamente em países em desenvolvimento como Brasil e
Índia, onde constitui um problema sanitário de grande importância, não somente pela
gravidade de sua patogenia, mas também como elemento potencial de contágio ao ser
humano (Acha and Szyfres, 1986; World Health Organization, 2003).
No Brasil, a leptospirose é uma doença endêmica com sério risco à saúde
pública. A manutenção de leptospiras em regiões rurais e urbanas é favorecida pelo
clima tropical associado a uma enorme população de roedores, acúmulo de lixo, excesso
de cães errantes e crescimento desordenado dos centros urbanos com aumento das
favelas e construções desordenadas nas periferias, com mínimo ou nenhum saneamento
básico (Ko et al., 1999; Jouglard, 1999; de Figueiredo et al., 2001)
Em países desenvolvidos a leptospirose é considerada reemergente (Bolin, 1996;
Palaniappan et al., 2002; Dey et al., 2004; Bharadwaj, 2004). Nesses países a doença
apresenta-se relacionada principalmente com atividades de lazer e esportivas ao ar livre,
como a canoagem, o rafting, o ecoturismo, o triatlo, e com atividades de risco
ocupacional (Levett, 2001; Morgan et al., 2002; Haake et al., 2002; Sejvar et al., 2003).
A leptospirose é caracterizada por um amplo espectro de manifestações clínicas,
desde febrículas e sintomas semelhantes à gripe, até a forma mais grave, a síndrome de
Weil. Existem outras sinonímias descritas para a leptospirose, tais como: febre canícola,
febre dos arrozais, febre do Fort Bragg, febre dos brejos, febre do lodo, febre das
inundações, febre dos campos, icterícia hemorrágica e enfermidade de Stuttgart, entre
outras (Acha and Szyfres, 1986; Faine et al., 1999).
As leptospiras penetram no hospedeiro através de pequenas escoriações ou
abrasões na pele, ou ainda através da pele íntegra quando este permanecer por longos
2
períodos em contato com águas contaminadas. Ao atingirem a corrente circulatória as
leptospiras multiplicam-se rapidamente. A fase de bacteremia pode durar de 1 a 7 dias, e
é concomitante com o aparecimento de sintomas como febre e dores musculares
(Pereira, 1996; Faine et al., 1999; Bharti et al., 2003).
As primeiras lesões causadas pela bactéria ocorrem no endotélio de pequenos
vasos sanguíneos. A isquemia localizada em alguns órgãos pode resultar em necrose dos
túbulos renais, dano hepato-celular, meningite, miosite e placentite. Em casos graves,
pode ocorrer hemorragia e icterícia, além de hepatomegalia e esplenomegalia. Há,
geralmente, nos casos leves, moderada granulocitose e esplenomegalia (Cinco et al.,
1981; Pereira et al., 1998; Faine et al., 1999).
A resposta imunológica desenvolvida pelo organismo hospedeiro faz com que as
leptospiras sejam removidas da circulação, tecidos e órgãos por fagocitose e
opsonização, coincidindo com o aparecimento de anticorpos (Faine et al., 1999; Levett,
2001; Bharti et al., 2003).
Esta revisão abordará os principais apectos desta doença, partindo dos primeiros
relatos encontrados na literatura, comentando as principais características do agente
causador da doença, dos testes de diagnóstico, do tratamento, e finalizando com relatos
sobre o desenvolvimento de vacinas contra leptospirose.
1.2. Aspectos históricos
Diversas epidemias de uma doença de característica infecciosa ictérica, com
disfunção renal, foram observadas e documentadas até o final do século XVIII, contudo
suas causas eram desconhecidas. O espectro da doença causada pela bactéria Leptospira
spp é muito amplo em humanos, podendo apresentar-se desde uma infecção subclínica
até quadros graves com comprometimento múltiplo dos órgãos e alta mortalidade.
Essa síndrome ictérica com falência renal foi primeiramente descrita há mais de
100 anos por Adolf Weil em Heidelberg. No ano de 1887, a doença foi denominada, por
Goldschimidt, como Síndrome de Weil, considerada a forma mais grave da leptospirose
humana (Feigin and Anderson, 1975; Faine et al., 1999; Levett, 2001).
No entanto, outras citações, aparentemente sobre a mesma síndrome, foram
feitas muitos anos antes. Durante o cerco do Cairo, em 1812, Larrey, detalhou casos
onde combatentes apresentaram sintomas compatíveis com leptospirose, sem, no
entanto, as causas serem conhecidas. Landouzy, em 1883, descreveu a doença
3
analisando determinados sintomas dos funcionários da limpeza do esgoto em Paris, à
qual denominou, na época, como “ typhus hépatique grave” (Faine et al., 1999).
Um achado importante foi feito por Stimson, que demonstrou, em 1907, através de
coloração por prata, a presença de espiroquetas nos túbulos renais de um paciente
falecido de febre amarela. As espiroquetas possuíam ganchos em suas extremidades, e
Stimson as denominou de Spirochaeta interrogans por causa da forma de ponto de
interrogação. Infelizmente, esta importante observação foi deixada de lado por muitos
anos (Faine, 1994).
No Japão, Inada & Ido, em 1914, a partir da inoculação de sangue humano com
síndrome de Weil em cobaias, comprovaram ser uma espiroqueta o agente causador. Os
mesmos autores, um ano mais tarde, concluíram que a síndrome de Weil era causada
por espiroquetas por eles isoladas, às quais deram o nome de Spirochaeta
icterohaemorrhagiae. A partir de então, muitos progressos foram realizados no estudo
da leptospirose, e no ano de 1918, Noguchi criou o gênero Leptospira (Faine et al.,
1999).
No Brasil, a leptospirose foi reconhecida pela primeira vez no Pará, por Mcdowel
(McDowel, 1917). No mesmo ano, Aragão verificou a presença de Leptospira
icterohaemorrhagiae ao estudar seis Rattus novergicus da cidade do Rio de Janeiro
(Aragão, 1917).
Outros estudos foram realizados no país. Piza & Gomes apresentaram o primeiro
caso ocorrido na cidade de São Paulo, em que o sangue do paciente foi inoculado em
cobaias e a doença foi reproduzida experimentalmente. Na cidade do Rio de Janeiro,
Dacorso Filho analisou 11 cães com manifestações clínicas compatíveis com
leptospirose, necropsiando os animais que faleceram, demonstrando assim, a presença
do agente causador (Santa Rosa et al., 1970).
Magaldi (Magaldi, 1963) publicou um estudo de incidência, prevalência e
distribuição das leptospiroses no Brasil, sendo o primeiro pesquisador a alertar para a
susceptibilidade que o país apresenta para a proliferação da doença.
Santa Rosa et al. (Santa Rosa et al., 1970) publicaram a experiência de nove anos de
estudos sobre leptospirose no Instituto Biológico de São Paulo. Nesse período, foram
examinados 21.263 soros humanos e de animais, sendo 15.080 soros de bovinos, onde,
pelo teste de soroaglutinação microscópica (MAT), houve a predominância do sorovar
Wolffi; 3.242 soros suínos, onde 19,5% foram positivos e a predominância foi do
sorovar Pomona, e 916 soros humanos com uma freqüência maior para o sorovar
4
Icterhaemorrhagiae. Os soros restantes eram procedentes de eqüinos, ovinos, caninos,
caprinos e bubalinos.
1.3. Aspectos microbiológicos 1.3.1. Taxonomia e Classificação O gênero Leptospira pertence à família Leptospiraceae, ordem Spirochaetales,
coexistindo duas formas de classificação, uma baseada em critérios genéticos e outra
nos determinantes antigênicos. Ambas as classificações reconhecem espécies
patogênicas e saprófitas. Isolados sorologicamente indistinguíveis podem pertencer a
espécies totalmente diferentes, de acordo com a classificação genética (Feresu et al.,
1999; Brenner et al., 1999).
Antes de 1989, o gênero Leptospira era dividido, usando se critérios antigênicos,
em duas espécies: L. interrogans, da qual faziam parte todas as cepas patogênicas; e L.
biflexa, contendo cepas saprófitas isoladas do ambiente (Johnson and Faine, 1984;
Levett, 2001). Mais recentemente, estudos de características genéticas têm conduzido a
várias espécies dentro de Interrogans sensu lato: L. interrogans sensu stricto; L.
santorosai; L. weilii; L. inadai; L. wolbachii; L. borgpetersenii; L. kirschneri; L. meyeri
e L. noguchii (Yasuda, 1987; Ramadass et al., 1992).
A essa classificação foram adicionadas 5 genomoespecies (Brenner et al., 1999).
As genomoespecies de Leptospira não correspondem às espécies L. interrogans e L.
biflexa e, de fato, sorovares patogênicos e não patogênicos podem ocorrer dentro de
uma mesma espécie (Levett, 2001).
Contudo, a classificação molecular é problemática para os microbiologistas
clínicos, pois ela é claramente contrária ao sistema de sorogrupos que têm servido a
clínicos e epidemiologistas por muitos anos. Tanto L. interrogans quanto L. biflexa são
divididos em inúmeros sorovares definidos por aglutinação após absorção cruzada com
antígenos homólogos, onde a leptospira em questão, aglutina com o anti-soro homólogo
mas não com os heterólogos; esses sorovares antigenicamente relacionados constituem
os sorogrupos (Dikken and Kmety, 1978; Johnson and Faine, 1984; Kmety and Dikken,
1991).
5
1.3.2. Biologia As leptospiras são espiroquetas aeróbias obrigatórias, helicoidais flexíveis e
móveis, fortemente espiraladas; geralmente apresentam diâmetro de 0,1 µm por 6 a 20
µm de comprimento. Possuem dois filamentos axiais (flagelo periplasmático) com
inserções polares que estão localizados no espaço periplasmático (Faine, 1994).
Leptospiras têm uma membrana dupla típica e comum a outras espiroquetas, em
que a membrana citoplasmática e a parede celular constituída por peptidoglicano estão
proximamente associadas e são envolvidas pela membrana externa. Lipopolissacarídeos
leptospirais têm a composição similar a outras bactérias Gram negativas, porém com
baixa atividade endotóxica (Faine et al., 1999; Levett, 2001).
A temperatura ótima para crescimento está entre 28 a 300C, e o tempo de
geração é de, aproximadamente, 12 h. Crescem em meios enriquecidos com vitaminas
(principalmente B2 e B12), com ácidos graxos de cadeia longa (utilizados como fonte de
carbono e metabolizados por β-oxidação) e sais de amônia (Faine et al., 1999).
No meio ambiente, as leptospiras requerem, para sua sobrevivência, solo com
pH em torno de 7,2 a 7,4 e, de preferência, com grande umidade. Águas superficiais
alcalinas, com pH entre 7 e 8, também favorecem a sobrevivência das leptospiras, mas
em água do mar essas não se mantêm por mais de 24 horas (Chang, 1948).
1.3.3. Meios de Cultura Inúmeros meios de cultura artificiais para o isolamento e manutenção de
leptospiras já foram descritos, podendo tanto se apresentar na forma líquida, que é
seguramente a mais utilizada, quanto nas formas semi-sólida ou sólida (Tripathy et al.,
1980; Soboleva, 1983; Adler et al., 1986; Faine et al., 1999; 2003). São utilizados
suplementos como o Tween 80 e a adição de albumina sérica bovina (BSA) fração V
para o isolamento ou manutenção de leptospiras mais fastidiosas (Adler et al., 1986;
2003).
Muitos meios líquidos contendo soro de coelho já foram descritos por Fletcher,
Korthoff, Noguchi e Stuart (Turner, 1970). O meio mais utilizado atualmente é o EMJH
(Ellinghausen, Jr. and Mccullough, 1965; Johnson and Harris, 1967; Ellinghausen, Jr.,
1983). Este meio é comercializado por vários laboratórios e contém Tween 80 e
albumina sérica bovina (BSA).
6
Algumas cepas requerem a adição ou de piruvato (Johnson et al., 1973) ou soro
de coelho (Faine et al., 1999) para isolamento inicial. Outro meio bastante empregado
para culturas de leptospiras é o descrito por Turner (Turner, 1970), onde a base é o
EMJH, com algumas modificações (Alves et al., 1996).
O 5-fluorouracil, um análogo da pirimidina, é um inibidor de crescimento de
microrganismos contaminantes de amplo uso na preparação de meios seletivos e na
descontaminação de culturas, já que as leptospiras não incorporam bases pirimídicas
(Johnson and Faine, 1984; 2003).
1.3.4. Biologia Molecular Leptospiras são filogeneticamente relacionadas a outras espiroquetas (Paster et
al., 1991); seu genoma é de aproximadamente 5.000 kb de tamanho, com dois
cromossomos com tamanho aproximado de 4.400 kb, e outro de 350 kb (Xiao et al.,
1990; Zuerner, 1991; Ren et al., 2003; Nascimento et al., 2004). Leptospiras contêm
duas cópias do gene 16S e 23S rDNA e somente uma do 5S rDNA (Fukunaga and
Mifuchi, 1989).
Tanto com propósitos clínicos quanto para estudos epidemiológicos e ecológicos
da leptospirose, a classificação de isolados de leptospira através de métodos moleculares
pode permitir maior precisão na determinação das fontes de transmissão. Para tanto,
alguns métodos têm sido descritos e avaliados, tais como: polimorfismo de fragmentos
de restrição, ribotipagem, eletroforese em campo pulsado, PCR com primers arbitrários
(Corney et al., 1997) e, mais recentemente, análise da variação do número de repetições
em tandem (VNTR) (Slack et al., 2005; Majed et al., 2005)
Ensaios de PCR, baseados em seqüências de inserção para diferenciação de
sorogrupos leptospiras tem sido desenvolvidos. Seqüências de inserção (IS), como as
IS1533, IS1500 e IS1502, onde o número de cópias varia amplamente entre os
sorovares e também entre os isolados do mesmo sorovar (Zuerner et al., 1993; Zuerner,
1994; Boursaux-Eude et al., 1995; Zuerner et al., 1995; Boursaux-Eude et al., 1998;
Zuerner and Huang, 2002), foram avaliadas e parecem ter apresentado resultados
satisfatórios para identificação de sorovares de Leptospira interrogans sensu latu e
stricto sensu.
Sorovares antigenicamente relacionados são agrupados em sorogrupos. No
entanto, um dado sorogrupo é encontrado em várias espécies de leptospira. Muitos
7
estudos têm demonstrado que o sistema de sorogrupos não está relacionado à
classificação molecular (Perolat et al., 1998; Brenner et al., 1999).
Sorovares podem ser caracterizados por diferentes métodos moleculares e a
demonstração de heterogenicidade entre múltiplos isolados de um mesmo sorovar
indica a necessidade de mais estudos (Feresu et al., 1993; Perolat et al., 1998; Brenner
et al., 1999; Levett, 2001).
Apesar de as técnicas de biologia molecular serem a ferramenta de escolha para
caracterização de sorovares leptospirais, há de se levar em consideração a necessidade
constante no aprimoramento e no uso dessas técnicas para a obtenção de resultados
menos controvertidos.
1.4. Epidemiologia A leptospirose é tida como uma das zoonoses mais difundidas no mundo. O
agente infectante é transmitido de um mamífero infectado para outro através do contato
direto ou indireto com urina que contenha leptospiras viáveis, ou através de veículos
inanimados, tais como solo, água ou utensílios contaminados. As taxas de incidência
são mais significativas em países ou regiões de clima tropical do que em regiões de
clima temperado (Levett, 1999; Faine et al., 1999; Jouglard, 1999; Vinetz, 2001; Levett,
2001; Katz et al., 2002; Bharti et al., 2003; Bharadwaj, 2004).
O homem é considerado um hospedeiro final na disseminação da leptospirose e,
ainda que prolongados períodos de leptospirúria não sejam uma constante na
leptospirose humana, o "status" de portador renal tem levado a raros exemplos de
transmissão inter-humana pela urina ou pelo contato sexual (Spinu, 1963; Szalka and
Binder, 1974).
Animais, incluindo o homem, podem ser divididos em hospedeiros
mantenedores e acidentais da doença. Os hospedeiros mantenedores são característicos
de espécies em que a doença é endêmica e transmitida de um animal para outro pelo
contato direto.
Os roedores, de uma maneira geral, são importantes mantenedores da
leptospirose, habitualmente não morrem em decorrência da infecção. Sua urina e o
tecido renal com pH alcalino são favoráveis para a sobrevivência do microrganismo,
permitindo uma colonização nos túbulos renais e eliminação urinária permanentes
(Fühner, 1950; Edelweiss, 1962; Acha and Szyfres, 1986; Silva, 1998).
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As leptospiras podem ser encontradas na urina dos ratos por toda vida
(Edelweiss, 1962), sendo encontradas, em cada micção, ao redor de 6.000 espiroquetas
por ml de urina. Como em cada micção são expelidos ao redor de 3 ml, seriam
exteriorizadas cerca de 18.000 leptospiras (Fühner, 1950).
Os ratos são, geralmente, mantenedores de sorovares dos sorogrupos
Icterohaemorrhagiae e Ballum. Animais domésticos também podem ser hospedeiros
mantenedores. Os bovinos podem abrigar os sorovares Pomona, Hardjo e
Grippotyphosa; os ovinos, Hardjo e Pomona; os suínos, Pomona, Bratislava ou
Tarassovi; e os cães o sorovar Canícola; mas há de se levar em conta as peculiaridades
de cada região e/ou ecossistema (Barcellos et al., 2003; Bharti et al., 2003).
Conhecer os sorovares prevalentes e os hospedeiros mantenedores em cada
região é primordial para o entendimento epidemiológico da doença. As infecções
humanas resultam da exposição à urina de animais portadores. A prevalência de
diferentes sorovares de leptospira dentro de uma população depende dos reservatórios
animais presentes nessa região e dos sorovares que eles albergam (Bharti et al., 2003).
A incidência documentada da leptospirose reflete a capacidade diagnóstica dos
laboratórios e a capacidade dos clínicos em avaliar os sintomas. De uma maneira geral,
a doença é subdiagnosticada e subnotificada, o que gera informações imprecisas sobre a
incidência real da doença.
Observando-se as condições climáticas do nosso país, a rede de água e de esgoto
(saneamento básico), a proliferação de favelas, o aumento da população nas grandes
cidades e a ignorância, torna-se claro o porquê do aumento exagerado da enfermidade
em nosso meio (Ko et al., 1999; Jouglard, 1999; de Figueiredo et al., 2001). No período
de 1985 a 1993, foram notificados no Brasil 20.341 casos de leptospirose, com uma
letalidade de 11% (Vasconcellos et al., 1994). Em 1994 foram notificados 2.099 casos
da doença em 21 estados do Brasil, também com uma letalidade de 11% (Arsky, 1995).
No ano de 1999 chegou a 9.721 casos, com 3.485 confirmados. No ano de 2000, o
número de casos confirmados da leptospirose humana no Brasil foi de 3.493, e a
incidência foi de 1,96 por 100.000 habitantes, sendo que o Rio Grande do Sul
apresentou 564 casos com uma incidência de 5,60 por 100.000 habitantes
(FUNDAÇÃO NACIONAL DA SAÚDE, 2001). Em 2001 houve 2.463 casos
confirmados (dados preliminares – FUNASA – boletim eletrônico), sendo 1.274 casos
confirmados de leptospirose no Rio Grande do Sul (Almeida et al., 2002; Barcellos et
al., 2003b). No ano de 2002 o número de casos notificados foi de 12.277, sendo 2.264
9
confirmados, com 291 óbitos. Em 2003 o número de notificados foi de 7.488; destes,
1772 foram confirmados e 212 vieram a óbito.
1.5. Apresentação Clínica
A doença caracteriza-se por um amplo espectro de manifestações clínicas,
podendo variar das formas mais graves, como a síndrome descrita por Weil em 1886, ou
a Síndrome Pulmonar Aguda (SPFL) que vem sendo descrita em diversos países do
mundo (Sehgal et al., 1995; Trevejo et al., 1998; Simpson et al., 1998; Yersin et al.,
2000; Silva et al., 2002; Seijo et al., 2002; Niwattayakul et al., 2002) , até as formas
mais brandas, acompanhadas ou não de febre alta, que podem ser confundidas com
gripe comum. A apresentação da forma leve da doença não impede que evolua para o
quadro clínico grave. A incidência de qualquer sintoma, na maioria das vezes, depende
da freqüência com a qual as infecções leves são diagnosticadas. Se uma infecção leve
não é diagnosticada, as incidências relativas dos sintomas graves podem parecer muito
mais altas do que na realidade são (Faine, 1982).
Clinicamente a leptospirose pode se apresentar de duas formas: anictérica ou
ictérica (Faine et al., 1999). A forma anictérica apresenta-se classicamente como doença
bifásica. Na fase septicêmica, os sintomas iniciam abruptamente com febre elevada,
calafrios, cefaléia intensa e mialgia (Veronesi et al., 1996). Seguindo-se a
defervescência da febre e dos sintomas, inicia-se a fase imune. Na fase septicêmica, os
sintomas podem progredir para formas graves e potencialmente fatais da doença, como
a síndrome de Weil, apresentando disfunção hepática, insuficiência renal aguda e
hemorragia. Na leptospirose ictérica, o curso bifásico não é observado e a febre persiste
sem defervescência entre os dois estágios.
1.6. Diagnóstico
A leptospirose, na maioria das vezes, é diagnosticada laboratorialmente por
sorologia. Anticorpos podem ser detectados no sangue aproximadamente de 5 a 7 dias
após o início dos sintomas. Sorologicamente, pode-se ter dois tipos de métodos: aqueles
que são gênero específicos e os que são sorogrupo específicos (Faine et al., 1999;
Sambsiava et al., 2003).
10
O método laboratorial de escolha depende da fase evolutiva em que se encontra
o paciente. Na fase aguda, durante o período febril, as leptospiras podem ser
visualizadas no sangue através de exame direto ou a partir de cultura em meios
apropriados ou de inoculação em animais de laboratório (Vasconcellos et al., 1998).
O exame direto é extremamente falho, devendo ser realizado por observador
experiente, onde é necessária a visualização em microscópio de campo escuro ou por
coloração. No caso da utilização da técnica de campo escuro, deve-se atentar para a
motilidade espiroquetária, porém, com essa técnica não se pode diferenciar o gênero
espiroqueta, e precisa-se de um técnico treinado na observação, já que a sensibilidade é
extremamente baixa, da ordem de somente 103 bactérias /ml. Sendo assim, não é
considerado um teste definitivo, devendo ser confirmado por outros testes (Faine et al.,
1999; Vijayachari et al., 2002).
A cultura para isolamento (considerados pelo Ministério da Saúde o padrão ouro
para leptospirose) somente se tornam positivos após algumas semanas, o que
proporciona sempre diagnóstico retrospectivo (Merien et al., 1995; Faine et al., 1999).
Após a segunda semana da doença, as leptospiras podem ser visualizadas
diretamente na urina, cultivadas ou inoculadas. Pelas dificuldades em sua realização,
tais técnicas também não são adotadas rotineiramente. O exame do líquor e de tecidos
músculo-esqueléticos, renais e hepáticos são raramente utilizados (Levett et al., 2001;
Levett, 2001; Lucchesi et al., 2004).
A técnica básica é a soroaglutinação microscópica (MAT) com antígenos vivos
ou formolizadas, pelo soro do homem ou de animais. Recomenda-se a realização de
pelo menos dois exames: um no início e outro a partir da quarta semana de doença
(Faine et al., 1999). Essa técnica não contribui claramente para o diagnóstico precoce de
leptospirose, além do alto custo de manutenção de uma bateria de leptospiras,
representante de diversos sorogrupos, mantida com repiques semanais, os pacientes
podem vir a óbito antes que a soroconversão ocorra (Ribeiro et al., 1996; Heinemann et
al., 1999; Cumberland et al., 1999; Sugunan et al., 2002; Smythe et al., 2002).
O Ministério da Saúde do Brasil considera um caso suspeito como caso
confirmado de leptospirose humana (CCLH), de acordo com a seguinte ordem de
prioridade: (i) isolamento de leptospiras a partir do sangue, urina ou líquor; (ii) MAT
com soroconversão, sendo necessárias 2 a 3 amostras, com intervalos de 15 dias,
evidenciando aumento de títulos de 4 vezes ou mais; (iii) quando não houver
disponibilidade de 2 ou mais amostras, um título igual ou superior a 800 na MAT
11
confirma o diagnóstico. Títulos menores (entre 100 e 800) poderão ser considerados de
acordo com a situação epidemiológica do local; (iv) Soroaglutinação Macroscópica
(SAT) positiva ou ELISA-IgM positivo confirma o caso, quando não for possível a
realização de MAT; (v) quando não houver possibilidade de confirmação laboratorial, o
diagnóstico poderá ser fundamentado apenas nos critérios clínico-epidemiológicos; (vi)
nos casos suspeitos que evoluírem para óbito sem confirmação laboratorial, amostras de
tecidos poderão ser encaminhadas para exame imunohistoquímico (MINISTÉRIO DA
SAÚDE.FUNDAÇÃO NACIONAL DE SAÚDE, 1995).
Diversos autores salientam a necessidade urgente de novos testes e que, no
momento, não é possível eleger a melhor técnica para o diagnóstico da leptospirose,
sendo, muitas vezes, necessários mais de um teste para um mesmo paciente. Afirmam,
também, não existir teste, com acurácia suficiente, com uma única amostra de sangue
e/ou urina, que seja eficiente, eficaz e de baixo custo. Os testes disponíveis apresentam
diferenças na capacidade de detecção da bactéria, dependendo do curso da enfermidade
(Merien et al., 1995; Fernandes, 2001; Wilson et al., 2002; Natarajaseenivasan et al.,
2004; Dey et al., 2004; Bharadwaj, 2004).
Epidemiologicamente a identificação e tipificação do agente são imprescindíveis
para se ter um quadro real da leptospirose em determinada região, principalmente em
locais onde os casos de leptospirose com sorologia (MAT) apresentam títulos baixos
para diferentes sorovares de um sorogrupo individual e onde existem reações
paradoxais, cujos títulos altos são detectados de um sorogrupo não relacionado (Merien
et al., 1997; Postic et al., 2000; Levett, 2001).
Os diferentes sorovares circulantes produzem uma grande diversidade de
situações de exposição, reservatórios e quadros clínicos, dependentes das condições
ambientais tanto destes reservatórios como dos enfermos e portadores. Esses ainda
devem ser associados com o panorama ecológico de cada região em particular, inclusive
precipitações pluviométricas, temperaturas médias, umidade e pH do solo.
Freqüentemente também os títulos de isolados locais são bem mais elevados do
que as cepas de laboratório, levando a resultados freqüentes de falsos negativos, quando
o sorovar causador da doença não está incluído na bateria (Levett, 2001; Saengjaruk et
al., 2002; Barcellos et al., 2003). Além do que, a ausência de um título positivo para
leptospiras, determinado pela MAT em uma população, pode não refletir com acurácia a
verdadeira incidência da infecção (Adler and Faine, 1978; Chapman et al., 1987; Levett,
2001; Brod, 2002).
12
A identificação de isolados de Leptospira é importante, tanto para comprovar a
eficiência diagnóstica do laboratório em testes de MAT, quanto para vigilância
epidemiológica e saúde (Doern, 2000; Barocchi et al., 2001; Oliveira et al., 2003).
Outros testes sorológicos têm sido avaliados. Anticorpos do tipo IgM têm sido
detectados por ELISA em líquido céfalo raquidiano de pacientes com leptospirose
ictérica (Camargo et al., 1995). Dot-ELISA para detecção de anticorpos IgM em saliva
já foi avaliado (da Silva et al., 1997). Teste comercial IgM dot-ELISA “dipstick” foi
avaliado e mostrou ser tão sensível quanto o IgM ELISA (Levett et al., 2001).
O método de ELISA também tem sido usado para detecção de anticorpos
sorovar-específicos. Em bovinos foi usado para detectar os sorovares Pomona e Hardjo
(Thiermann and Garrett, 1983) ou sorovares múltiplos (Surujballi and Mallory, 2004), e
em ovinos, o sorovar Hardjo (Adler et al., 1981). Detecção de anticorpos tipo IgM em
ELISA também foi testado para diagnóstico em cães (Hartman et al., 1984; Hartman,
1984; Weekes et al., 1997).
Diagnóstico molecular da leptospirose tem sido alvo de estudo de pesquisadores.
DNA leptospiral pode ser detectado entre outras técnicas, por “dot-blotting” (Terpstra et
al., 1986) ou hibridização in situ (Terpstra et al., 1987); no entanto, a técnica mais
amplamente testada é a da reação em cadeia da polimerase (PCR).
A técnica de PCR tem sido referida como uma das mais promissoras para
diagnóstico precoce da doença. Apesar de a técnica ter seu uso restrito à área de
pesquisa ou de laboratórios de referência, a facilidade de obtenção do DNA leptospiral
em quaisquer fluidos biológicos, não necessitando da presença de anticorpos, torna o
diagnóstico possível em estágios iniciais da doença (Chu et al., 1998; Heinemann et al.,
2000; Vinetz, 2001; Wilson et al., 2002).
A PCR requer primers específicos, que permita a amplificação, se não de todas,
mas da maioria das cepas patogênicas ou potencialmente patogênicas. Muitos pares de
primers utilizados na PCR para detectar leptospiras têm sido descritos, alguns baseados
em alvos específicos, freqüentemente genes que codificam para o rRNA 16S ou 23S
(Merien et al., 1992; Zhang et al., 1993; Hookey et al., 1993; Wagenaar et al., 1994;
Woo et al., 1997; Woo et al., 1998), ou elementos repetitivos (Woodward et al., 1991;
Vasconcellos et al., 1994; Zuerner et al., 1995; Zuerner and Bolin, 1997; Vasconcellos
et al., 1998). Contudo, poucos têm aplicabilidade prática, sendo que a grande maioria
não consegue detectar, significativamente, DNA leptospiral de amostras clínicas
humanas e veterinárias.
13
Os primers mais utilizados até o momento são os “A” e “B”, descritos por
Merien et al (Merien et al., 1992) que amplificam uma região de 331 pb do gene 16S
rDNA, tanto de leptospiras patogênicas como saprófitas, e os primers “G1” e “G2”
desenhados a partir de plasmídio recombinante pLIPs60 e “B64I” e “B64II” desenhados
a partir do plasmídio recombinante pBIM64, descritos por Grayvekamp e colaboradores
(Gravekamp et al., 1993), mas que não amplificam sorovares de L. kirschneri.
A necessidade em identificar e caracterizar isolados de leptosprias, fez com que
vários métodos baseados em sorologia e genéticos fossem desenvolvidos. Métodos
genéticos incluem análise de fragmentos de restrição (REA) (Thiermann et al., 1985;
Thiermann et al., 1986; Ellis et al., 1991; Perolat et al., 1994), eletroforese em campo
pulsado (PFGE) e polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição (RFLP)
(Herrmann et al., 1992; Zuerner et al., 1993; Gerritsen et al., 1995; Vinetz et al., 1996;
Romero et al., 1998), uso de sondas de DNA (Zuerner and Bolin, 1990; Van Eys et al.,
1991) e, mais recentemente, a análise por VNTR (Majed et al., 2005; Slack et al., 2005).
Isolados de leptospira podem ser caracterizados por técnicas sorológicas como o
cross agglutinin absorption test (CAAT) com soro de coelho, ou pelo uso de anticorpos
monoclonais, embora esses testes sejam restritos a poucos laboratórios (Babudieri,
1961; Faine et al., 1999).
Por conta das dificuldades associadas com identificação de isolados de
leptospira, tem havido grande interesse no uso de métodos moleculares para
identificação e subtificação (Terpstra, 1992; Herrmann, 1993). Os métodos genéticos
têm provado serem de grande valor na caracterização de cepas de Leptospira (Turk et
al., 2003); no entanto, esses precisam ser aprimorados na busca por técnicas mais
precisas e rápidas para essa tipificação.
A identificação de cepas leptospirais é tão importante quanto o entendimento dos
mecanismos de patogênese, que, embora não estejam totalmente desvendados, garantem
a promessa de que, em um futuro próximo, as técnicas de biologia molecular para
leptospirose possam esclarecer todos esses mecanismos (Levett, 2001).
1.7. Tratamento
O tratamento da leptospirose difere, dependendo da severidade e duração dos
sintomas. Em geral, as leptospiras são susceptíveis a quase todos os antibióticos, exceto
14
cloranfenicol e rifampicina. Os antibióticos mais recomendados são a penicilina, em
altas doses, ou eritromicina. Tetraciclinas também podem ser usadas, apesar de serem
contra-indicadas em pacientes com insuficiência renal, em crianças e gestantes. A
doxiciclina é recomendada quando usada por curto período de tempo. A penicilina deve
ser administrada imediatamente após o diagnóstico, no período de leptospiremia. Não
há antibiótico capaz de reverter o dano causado em tecidos e órgãos, mas a penicilina
parece apresentar efeitos benéficos, reduzindo a mortalidade e a duração da doença na
forma severa (Faine et al., 1999; Vinetz, 2001; Levett, 2001).
Insuficiência e falência renal são as principais causas de morte; nesses casos, a
diálise peritoneal é indicada. A diálise deverá ser mantida até que a função renal volte
ao normal. A falha hepática é tratada pela dieta livre de proteínas, correção de líquidos e
balanço eletrolítico. A compensação das hemorragias pode requerer a transfusão de
sangue ou de plaquetas (Farr, 1995; Faine et al., 1999).
Em animais o tratamento recomendado é o uso de estreptomicina ou tetraciclina.
A estreptomicina pode ser combinada com a ampicilina ou doses elevadas de penicilina
G. Nas infecções crônicas a oxitetraciclina pode substituir o usa da estreptomicina
(Faine et al., 1999).
1.8. Vacinas Diversas vacinas para prevenir a leptospirose humana têm sido desenvolvidas.
Países como Cuba (Martinez et al., 1998; Martinez et al., 2000), Rússia (Ikoev et al.,
1999) e China (Chen, 1985) têm realizado extensos ensaios clínicos para avaliação
dessas vacinas. As vacinas testadas até então, não conferem proteção cruzada a outros
sorogrupos que não estiverem presentes na vacina. No entanto, muitos problemas
confrontam o desenvolvimento de uma vacina para prevenir a leptospirose humana. As
bacterinas apresentam uma imunidade pouco duradoura (6 a 12 meses): são sorovares
específicas, e geralmente produzem uma baixa imunidade. Vacinação de animais, como
cães e bovinos, pode prevenir a enfermidade, mas não a leptospirúria e,
conseqüentemente, a transmissão para humanos (Bolin and Alt, 2001; Bharti et al.,
2003).
Atualmente, em diversos laboratórios, os esforços estão concentrados no
desenvolvimento de vacinas produzidas a partir de antígenos comuns a diversos
sorovares ou que possam apresentar proteção cruzada contra estes (Haake et al., 1999;
15
Sonrier et al., 2000) e, ainda que induzam a uma proteção prolongada contra a grande
diversidade de Leptospira.
Haake e colaboradores (Haake et al., 1999; Haake et al., 2000; Haake and
Matsunaga, 2002; Haake et al., 2004) têm identificado diversas proteínas de membrana,
conservadas entre os diferentes sorovares patogênicos e, que seriam fortes candidatas ao
desenvolvimento de vacinas, proporcionando proteção cruzada contra outros sorovares
patogênicos.
Entender o mecanismo da imunidade adquirida é necessário para análise dessas
novas candidatas a vacinas. Bacterinas utilizadas na imunização de bovinos mostraram
que a resposta imune estava correlacionada a respostas Th1 (Naiman et al., 2002;
Brown et al., 2003).
Provavelmente, a maior barreira no desenvolvimento de vacinas polivalentes
contra leptospirose seja sua aplicabilidade, principalmente em regiões endêmicas em
que os indivíduos se encontram expostos a diversos sorovares.
1.9. Conclusão As maiores barreiras à prevenção da doença continua sendo o descaso, a falta de
diagnóstico e de testes diagnósticos efetivos associados a falta de informação.
Principalmente em paises pobres esses fatores levam a tratamentos inadequados e pouco
efetivos, gastos excessivos pelo sistema de saúde pública sem uma política adequada a
doença.
Por outro lado, pode se observar uma grande evolução em conhecimentos
moleculares da bactéria, sua biologia e patogênese. Isso faz crer, que nos próximos anos
teremos elucidado os principais fatores de virulência contribuindo para diagnósticos
precisos e desenvolvimento de vacinas de ampla aplicabilidade. A pesquisa seria
totalmente eficiente ao colocar a disposição às ferramentas necessárias para beneficiar
uma população e, conseqüentemente, produzindo se novas intervenções preventivas.
16
2. OBJETIVOS
2.1. Geral
O objetivo geral do estudo foi desenvolver e aplicar um método de diagnóstico
de leptospirose, baseado em PCR e nested PCR, e caracterizar isolados de Leptospira
por seqüenciamento de DNA e análise de VNTR (Repetições de Número Variável em
Tandem).
2.2. Específicos
1. Desenvolver um método de diagnóstico de leptospirose baseado em PCR, e
Nested-PCR utilizando o gene lipL32 como alvo.
2. Avaliar o PCR e o nested PCR como testes de diagnóstico da leptospirose,
determinando sua sensibilidade e especificidade com amostras clínicas.
3. Amplificar e sequenciar o gene 16S rDNA para identificar e caracterizar
isolados de Leptospira spp de amostras clínicas.
4. Utilizar a analise por VNTR para caracterização dos isolados em nível de
sorovar.
17
3. ARTIGO 1
Nested PCR for detection of pathogenic leptospires
A ser submetido ao Brazilian Journal of Medical and Biological Research
18
Nested PCR for detection of pathogenic leptospires
S.D.D. Jouglard, S. Simionatto, F. K. Seixas, F. Nassi, O.A. Dellagostin
Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil
Abstract
Leptospirosis is a widespread zoonosis caused by pathogenic members of the genus
Leptospira that has a great impact on both human and veterinary public health. Early
diagnosis of leptospirosis is important because severe leptospiral infection can have a
fulminant course. The available serological techniques for the diagnosis of leptospirosis
have low sensitivity during the early stage of the disease. Efforts are being made to
develop simpler, effective, efficient and low cost diagnostic methods. In this work we
first evaluate a PCR based method for diagnosis of leptospirosis. Primers were designed
to amplify a 264 bp region within the lipL32 gene, which is conserved among
pathogenic Leptospira and absent in non-pathogenic species. The sensitivity and
specificity of the assay were evaluated using seven saprophytic serovars, 37 pathogenic
serovars and fifteen other microorganisms. The method was very specific for pathogenic
serovars, however lacked sensitivity. In order to enhance the sensitivity, another primer
pair was designed which amplifies a 183 bp region within the 264 bp region of the
lipL32 gene, and used in a nested PCR assay. This approach was much more sensitive
than conventional PCR.
Key words: Leptospirosis, Diagnosis, nested PCR
19
Introduction Leptospirosis is a worldwide zoonosis, usually transmitted to humans through
contaminated water or direct exposure to the urine of infected animals. The causative
agents of leptospirosis belong to the genus Leptospira, which contains both saprophytic
and pathogenic species (16).
The clinical spectrum of infection ranges from sub clinical to severe illness with
high mortality rate. Human leptospirosis causes severe multiorgan dysfunctions that
may end in multiorgan failure and death (27).
Nonspecific signs and symptoms of leptospirosis are often mistaken with viral
illness and this wide spectrum of clinical symptoms that characterize leptospirosis
makes its diagnosis to be easily mistaken with other febrile disease (31). For this reason
the diagnosis cannot be made without laboratory confirmation. For diagnostic purposes,
the culture of Leptospira from body fluids is the most demonstrative test, but this
technique can take up to 2 months and is very laborious, with a low isolation rate
(approximately 3%) (8, 21). The main serological methods used are the microscopic
agglutination test (MAT) and enzyme linked immunoassay (ELISA), with a large
variety of antigens.
The MAT is generally performed by reference laboratories due to the inherent
safety risks of handling cultures of live leptospiral organisms, the high cost of
commercial media, and the need for ongoing maintenance of representative serovars of
serogroups (8, 26). However, the MAT does not have any diagnostic value during the
first week, particularly in high endemic areas, mainly because in some cases
seroconversion does not occur with such rapidity, and a longer interval between
sampling is necessary.
20
In addition, several studies indicate that active leptospiral infections often occur
in the absence of detectable agglutination titers (4, 6, 14, 16, 19, 29). Clearly, serology
does not contribute to early diagnosis of leptospirosis as antibodies become detectable
on approximately the seventh day after infection (3, 25, 28). Moreover, patients with
fulminant leptospirosis may die before seroconversion occurs (11, 16).
Diagnostic tests available present differences in the capacity of detecting the
disease depending on the course of the illness. Therefore it is impossible to elect the
best diagnostic test. There is no test developed so far that has the necessary accuracy for
the diagnosis of human as well as animal leptospirosis, from a single sample of blood or
urine. Ideally it should be effective, efficient and of low cost (2, 5, 9, 21, 22, 34). Recent
advances in recombinant DNA technology have provided a new approach for the
development of rapid and sensitive diagnostic tools (13, 20, 23). The PCR has come
into increasing use for the diagnosis of infectious diseases caused by slow growing or
fastidious microorganisms and can be used as a tool for rapid diagnosis as well as for
large scale epidemiological studies on leptospirosis. In addition, it can also improve the
accuracy of epidemiological evaluation of leptospirosis, allowing a better evaluation of
the real incidence of the disease (15, 20, 24, 33, 39).
Several PCR assays to detect leptospires in various samples from animals and
humans have been described. Each assay uses different primers, sample preparation
methods, and amplification conditions (1, 7, 10, 11, 14, 33). Attempts have been made
to design PCR primers specifically for Leptospira spp. It has been difficult to identify
all pathogenic species and, in some instances, to discriminate between non-pathogenic
and pathogenic species has proven to be a challenge for molecular diagnosticians.
The primers described by Merien et al. (20) amplify a 331 bp fragment of the rrs
(16S rDNA) gene of pathogenic and nonpathogenic leptospires, which in the unlikely
21
event of contamination of specimens with nonpathogenic leptospires might produce a
false-positive result. On de other hand, the G1 and G2 primers described by Gravekamp
et al. (1993) do not amplify L. kirschneri serovars, necessitating the use of two primer
pairs for detection of all pathogenic serovars (11).
The majority of the PCR primers developed so far targets the 16S rDNA gene.
This gene is highly conserved among Leptospira species and other bacterial species (8,
11, 16, 20, 36, 37, 40). Aiming at developing a PCR test specific for pathogenic
serovars of leptospira, we selected the lipL32 gene as target, which is absent in non-
pathogenic serovars, and in addition, it is conserved among pathogenic Leptospira (14).
A Nested-PCR approach was used in order to provide the necessary sensitivity for the
detection of a very low number of bacterial cells.
22
Material and Methods
Bacterial strains
The Leptospira spp. serovars used in this study (Table 1) were cultivated at 28oC in
EMJH medium supplemented with 10% inactivated rabbit serum (30). The strains and
samples were supplied by the Centro de Controle de Zoonoses (CCZ) - Universidade
Federal de Pelotas, Brazil. To determine the specificity of the primers, a number of
pathogenic organisms were tested, including Proteus vulgaris, Proteus mirabilis,
Escherichia coli, Klebsiella species, Meningococos, Pneumococos, Mycobacterium
tuberculosis, Mycobacterium avium, Shigella sonnei, Salmonela salford, Staphilococos
aureus, Listeria monocytogenes, Vibrio cholerae, Pseudomonas aeroginosa,
Pasteurella multocida. These DNA samples were supplied by the Centro de
Biotecnologia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Brazil.
Detection limit and DNA extraction
Spirochete numbers were determined with a Petroff-Hauser chamber. To determine the
detection limit of PCR, the cultures were diluted 10-fold in urine or in PBS (0.02 M
Na2HPO4; 0.15 M NaCl pH 7.2) and centrifuged. The pellet was resuspended in 50 µl of
PBS, boiled for 10 minutes at 100oC. After processing, samples were stored at –20oC
until used for PCR. Different DNA extracting methods were evaluated in order to
determine which one yielded more reliable results, for it to be adopted as standard for
diagnosis of Leptospira. Apart from the boiling method, two additional DNA extraction
methods were evaluated in this study: CTAB (35), and SDS-Proteinase K/phenol-
chloroform (14).
23
Preparation of clinical samples
Also, a total of sixteen human and animal clinical samples with clinically confirmed
leptospirosis and positive by MAT, were tested. Serum and urine samples were
transferred to 1.5 ml microtubes and centrifuged at 14,000 x g for 30 minutes. The
supernatant was decanted, and the pellet was processed for PCR. Briefly, the pellets
were washed twice and resuspended in a total volume of 50 µl of PBS and boiled for 10
minutes. After processing, samples were stored at –20oC until used for PCR.
Primer design
Leptospira interrogans lipL32 sequence was obtained from GenBank (Accession
AF181553) and PCR primers were designed using Vector NTI 5.0 (Informax Inc.). The
PCR primers LipL32 F: 5’ CGC TTG TGG TGC TTT CGG TGGT 3’ and LipL32 R: 5’
CTC ACC GAT TTC GCC TGT TGG G 3’ were selected, resulting in a 264 bp
amplicon between positions 73 and 336 of the LipL32 coding region.
The nested PCR was carried out using the primers LipL32 R1: 5’ CTC CCA
TTT CAG CGA TTA CGG 3’ and LipL32 F2: 5’ TTC TGA GCG AGG ACA CAA
TCC C 3’, which amplifies a 183 bp region within the 264 bp of the first amplification.
PCR and Nested PCR Conditions
DNA amplification was performed in 25 µl reaction volume consisting of 10 µl of
template DNA added to a tube containing 1 U Taq DNA polimerase (Invitrogen) 150 ng
of each primer, 2.5 µl 10 X Buffer containing 2.5 mM MgCl2 and 0.2 mM dNTP. The
standard conditions for PCR was 94°C for 5 min followed by 32 cycles at 94°C for 1
min, 55°C for 1 min, 72°C for 1 min, and a final extension at 72°C for 7 min. All
reactions were performed in a Perkin Elmer 2400 termocycler (PE Biosystems).
24
Aliquots were analyzed by 2% agarose gel electrophoresis with ethidium bromide (0.05
µg/µl) and UV transillumination. The nested PCR reaction was performed under the
same conditions, using 1 µl of the first PCR reaction as template.
Results DNA extraction
All three DNA extraction methods evaluated yielded DNA suitable for PCR. The
boiling method was simpler, faster and of lower cost when compared to other extracting
methods tested. For these reasons, it was chosen as the standard method and used
throughout this study.
Detection limit of PCR from cultures
The sensitivity of the PCR assay was determined with serially diluted leptospira
cultures of four pathogenic and one non-pathogenic serovars, reported in Table 1. The
limit of detection was approximately 40 genome copies per reaction of artificially
contaminated urine or saline (Figure 1). The results demonstrate the ability of the PCR
to detect leptospires in urine samples.
25
FFiigguurree 11.. PCR with primers Lip F and Lip R from a leptospira culture serially diluted in urine. Lane 1, 100 bp DNA Ladder (Invitrogen); lane 2, 10-2; lane 3, 10-3; lane 4, 10-4; lane 5, 10-5; lane 6, 10-6; lane 7, 10-7; lane 8, negative control. The 10-4 dilution contains approximately 200 bacterial cells per milliliter, which corresponds to 40 genome copies per reaction.
Sensitivity and Specificity of the primers
Thirty-five pathogenic and seven non-pathogenic serovars were tested. PCR with
primers Lip F and Lip R was able to amplify a single band of the expected size from all
pathogenic leptospira serovars tested. None of the non-pathogenic serovars resulted in
amplification of the PCR product, as shown in Table 1. DNA from several other
bacterial species was also tested in order to evaluate specificity of the primers. No
detectable amplification resulted from these tests.
1 2 3 4 5 6 7 8 91 2 3 4 5 6 7 8 9
2072 600 200 100
26
Table 1. Leptospira spp. serovars used for PCR analysis
Species Serovar Strain Detection by PCR
Leptospira biflexa Patoc Patoc I Negative Andamana CH11 Negative Leptospira borgpetersenii Ballun Mus 127 Positive Castellonis Castellon Positive Javanica Veldrat Bataviae Positive Mini Sari Positive Poi Poi Positive Whitcombi Whitcomb Positive Leptospira interrogans Australis Ballico Positive Autumnalis Akiyami A Positive Bataviae Swart Positive Bratislava Jez Bratislava Positive Canicola Hond Utrecht IV Positive Copenhageni M20 Positive Copenhageni L1130 Positive Copenhageni Winjnberg Positive Djasiman Djasiman Positive Hardjo Hardjoprajitno Positive Hardjo Lely 607 Positive Hebdomadis Hebdomadis Positive Icterohaemorrhagiae Kantorowic Positive Icterohaemorrhagiae RGA Positive Icterohaemorrhagiae Verdun Positive Pomona Pomona Positive Proechimys 1161 U Positive Pyrogenes Salinem Positive Rachmati Rachmat Positive Saxkoebing Mus 24 Positive Sentot Sentot 90C Positive Wolffi 3705 Positive Leptospira kirschneri Butembo Butembo Positive Cynopteri 3522C Positive Grippotyphosa Duyster Positive Grippotyphosa Mandemakers Positive Grippotyphosa Moskva V Positive Leptospira meyeri Semaranga Veldrat Sem 173 Negative Leptospira noguchii Louisiana LSU 1945 Positive Panamá CZ 214 K Positive Leptospira santarosai Shermani 1342 K Positive Leptospira weilii Celledoni Celledoni Positive Leptospira wolbachii Nazaré Nazaré Negative Leptospira ???? Garcia Garcia Negative Jequitaia Jequitaia Negative Leptonema illini Illini 3055 Negative
27
Nested PCR
In order to improve detection limit even further, a nested PCR test was evaluated.
Detection limit was greatly enhanced with this approach, allowing amplification from
samples containing as few as 10 bacterial cells per ml or 2 genome copies per reaction.
Nested Pcr also helped in improving sensitivity when testing clinical samples. DNA
extracted from clinical samples obtained from humans and animals with confirmed
leptospirosis was submitted to amplification using the first set of primers. Only one out
of 16 resulted in the amplification of a detectable band. When the nested PCR was
performed with the second set of primers, all but one produced a strong detectable band
(Figure 2). All samples were tested two or more times and gave reproducible results.
FFiigguurree 22.. AAggaarroossee ggeell eelleeccttrroopphhoorreessiiss ooff PPCCRR pprroodduuccttss.. AA.. PCR with primers Lip F and Lip R from clinical samples. Lanes 1 and 11, 1 kb DNA ladder; lane 2, negative control; lane 3, positive control; lanes 4 to 10 and 12 to 20 suspected clinical samples. B. Nested PCR with primers Lip F and Lip R from clinical samples. Lanes 1 and 11, 1 kb DNA ladder; lane 2, negative control; lane 3, positive control; lanes 4 to 10 and 12 to 20 suspected clinical samples.
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
28
Discussion
We have described a novel nested PCR method for diagnosis of leptospirosis.
This approach has the potential of allowing detection of the pathogen soon after
infection, unlike most methods used, which are based on detection of antibodies against
the pathogens.
DNA extraction procedures were carried out to determine which method yields
more reliable results to be adopted as standard procedure for diagnosis of Leptospira.
The boiling in phosphate-buffered saline method was found to be the method must
suitable for extracting DNA from all Leptospira species, for use as template in the PCR
assay, comparable to other extracting methods tested. The use of commercial kits for
DNA extraction could have given better results, however the high cost of such kits is
prohibitive for most laboratories in developing countries.
The nested PCR uses as target the gene for the major outer-membrane
lipoprotein LipL32 (12), which appears to be an important virulence factor (38). The
DNA sequence of LipL32 is highly conserved among pathogenic leptospira, whereas it
is absent in non-pathogenic species. This is important because assays described
previously are genus-specific and detect all leptospiral serovars, including pathogenic
and non-pathogenic (38). The choice of target for the PCR was appropriate as the
lipL32 gene is absent from non-pathogenic leptospira or any other bacteria tested,
resulting in a highly specific test.
Recently the same target was used in a real time PCR assay (17). The results
indicated a high specificity, as only pathogenic serovars were detected. The analytical
sensitivity of the assay was 3 genome copies per reaction in blood and approximately 10
genome equivalents per reaction in urine.
29
The PCR assay with the Lip primers resulted in a detection limit of
approximately 40 Leptospira cells in cultures diluted in urine or in phosphate-buffered
saline, but sensitivity was lower when the primers were tested with clinical samples.
The PCR results from clinical samples depend greatly on the purity of the extracted
target DNA. The presence of inhibitory factors in serum or urine samples which impede
amplification reactions have to be taken into account (18, 26, 32). In addition, PCR may
fail when leptospires are present in very low numbers (11).
The specificity of the assay was determined by using DNA extracted from 43
serovars representing 10 different Leptospira species as well as 15 other bacteria. The
lipL32 target was amplified from pathogenic leptospiras belonging to Leptospira
interrogans, L. borgpetersenii, L. noguchii, L. kirschneri, L. santarosai and L. weilli but
was not amplified from any strain of the non-pathogenic species Leptospira biflexa,
Leptospira wolbachii and Leptospira meyeri, or from the intermediate species
Leptonema illini (Table 1).
The sensitivity problem identified after the first PCR reaction with the clinical
samples was overcome by the nested PCR reaction, which allowed an increase in
sensitivity of at least 20 fold. The real time PCR assay previously described (17) had a
comparable sensitivity, however the high cost associated to the real time PCR assay
makes it unlikely to be used in public hearth laboratories, particularly in developing
countries.
The only drawback of the nested PCR approach is the high risk of contamination
by the amplicon, resulting in false positive results. To avoid contamination, sample
processing and pre-PCR set-up were performed in different rooms than post-PCR
manipulations. The workflow should always be unidirectional; each room should have
30
its own dedicated set of pipettes and other equipment to avoid movement of materials
and instruments between restricted areas.
DNA extraction duplicates and nested PCR duplicates are valuable for PCR
methods to provide the laboratory with a measure of the precision of the analysis.
Negative controls, consisting of DNA extraction blanks and PCR blanks treated like
samples, are especially necessary to control contamination in each step to prevent false
positive results.
In conclusion, on the basis of its sensitivity and specificity, the PCR method
described here should be useful as a tool for early diagnosis of leptospirosis irrespective
of serovar.
Acknowledgments The authors wish to thank Dr. C. S. Brod for generously providing leptospira samples.
S.D.D.J. was supported by a scholarship from CNPq.
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37
4. ARTIGO 2
Characterization of Leptospira spp. Isolates by 16S rDNA Sequencing and Analysis of Variable-Number Tandem-Repeats
A ser submetido ao Journal of Clinical Microbiology
38
Characterization of Leptospira spp Isolates by 16S rDNA Sequencing and Analysis of Variable-Number Tandem-Repeats
S.D.D. Jouglard1*, E.F. Silva2, C.W. Cunha1, F.K. Seixas1, L. S. Pinto1, N. Seyffert2,
K.M. Forster2, D. Bourscheidt2, V.L. Bermudez2, C.S. Brod2, O.A. Dellagostin1
1Centro de Biotecnologia, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil. 2Centro de Controle de Zoonoses, Universidade Federal de Pelotas, Pelotas, RS, Brasil.
ABSTRACT The epidemiology and clinical features of leptospirosis are usually associated
with the serovars and serogroups of Leptospira. There are difficulties associated with
serological identification of Leptospira strains, for this reason we report the molecular
characterization of 10 Leptospira spp. strains isolated from human and animal clinical
samples. The analysis was based on VNTR polymorphism and sequencing of the 16S
rDNA gene. The results of the 16S rDNA sequencing allowed the confirmation of the
species, whereas serovar identification was only possible with the VNTR analysis.
Three of the isolates were identified by 16S as L. noguchii and seven as L. interrogans.
Among the L. interrogans isolates, VNTR analysis allowed the identification of three
isolates as belonging to serogroup Canicola serovar Canicola, two to serogroup
Australis serovar Munchen, one to serogroup Djasiman serovar Djasiman and one to
serogroup Copenhageni/Icterohemorragiae. The analysis based on VNTR
polymorphism provides a rapid as well as highly discriminating assay to characterize L.
interrogans isolates at serovar level.
39
INTRODUCTION Leptospirosis is a worldwide zoonosis, usually transmitted to humans through
contaminated water or direct exposure to the urine of infected animals. The causative
agent of human leptospirosis belong to the genus Leptospira, which contains both
saprophytic and pathogenic species (19).
The genus Leptospira comprising 11 species is organized into 31 serogroups and
over 250 serovars based on their antigenic relatedness, currently classified into 17
genomospecies based on DNA-DNA hybridization studies (9).
The precise identification and classification of leptospires is important for
epidemiological and public health surveillance. It is of critical value in the
epidemiological assessment of an outbreak and in attempts to identify potential sources
of exposure (3,7,24,30).
There are various antigenic and genetic methods for the identification and
characterization of leptospires. In the past years new isolated serovars were classified on
the basis of their antigenic traits with conventional serotyping methods such as the
microscopic agglutination test and the cross-agglutination absorption test (CAAT) with
rabbit antisera (2). Serovar identification by this method is fastidious, time-consuming,
requires large volumes of culture and is hampered by its subjective interpretation.
Genetic typing methods have proved to be of value and serve as alternative typing
systems, particularly in epidemiological studies, since they identify strain differences at
the subserovar level. These include restriction enzyme analysis (REA) of chromosomal
DNA by fixed-field gel electrophoresis (8,26,31,32) or pulsed-field gel electrophoresis
(PFGE) or randomly amplified polymorphic DNA (RAPD) (23) and restriction
fragment length polymorphism (RFLP) (11,14,28,36,43), the use of DNA probes
(35,41), ribotyping (26) and a novel PCR-based method for typing L. interrogans
40
serovars that detect the presence of variable-number tandem repeats (VNTR). This last
method was recently described as being able to differentiate most serovars of the L.
interrogans species. (21,30).
Sequencing of the 16S gene is a standard approach for differentiating species in
all branches of the phylogenetic tree of life. The 16S sequences have been examined for
the purpose of species differentiation within the genus Leptospira and have also been
used as a method of determining the species identity and for the comparison of different
leptospira isolates (6,12,13,15,25,27,38).
The 16S rDNA gene is about 1,500 bp long and the gene sequence, although
very similar to each other, allows the separation of Leptospira species (15,27). Even
though almost 50% of the polymorphic position are localized within the first 330 bp,
sequencing of the whole 16S rDNA gene is necessary for more accurate results (33).
The aim of this study was to characterize by sequencing of the 16S rDNA gene
and by VNTR analysis of leptospira isolates recently obtained from human and animals,
in an attempt to identify the leptospiral serovars circulating in southern Brazil.
MATERIALS AND METHODS
Bacterial strains. Ten local isolates of Leptospira (Table 1), obtained over the
last tree years from humans and animal samples, were supplied by the Centro de
Controle de Zoonoses (CCZ) - Universidade Federal de Pelotas, Brazil, and cultured in
liquid EMJH medium supplemented with 10% inactivated rabbit serum (16), for 7 to 10
days under aerobic conditions at 28oC. Culture stocks were maintained on liquid or
semisolid medium.
41
Table 1. Isolates identification and source of isolation
Isolate identification Source 55 - Skol rat kidney 66 - Hook dog kidney 69 - Kade rat urine 81- Caco sheep kidney 89 - Kito dog urine
206 - Cascata human blood 359 - Isoton human blood 463 - Tande dog urine
Ike human blood Mike dog urine
DNA extraction and PCR amplification. The organisms were centrifuged at
15,000 x g at 5oC for 20 min, the pellet was washed twice and resuspended in 100 µl of
phosphate-buffered saline (PBS) and boiled for 10 minutes at 100oC. After processing,
the DNA was stored at –20oC until use. DNA amplification was performed in 25 µl
reaction volume consisting of 1 µl of template DNA added to a tube containing 1 U Taq
DNA polymerase (Invitrogen) 300 ng of each primer Fd1 and Rp2 (37), 2.5 µl 10X
Buffer containing 5 mM MgCl2 and 0.4 mM dNTP. The standard conditions for PCR
was 95°C for 5 min followed by 30 cycles at 95°C for 1 min, 42°C for 30 sec, 72°C for
1 min, and extension at 72°C for 7 min. All reactions were performed in a Perkin Elmer
2400 thermocycler (PE Biosystems). Aliquots of amplified DNA were analyzed by
agarose gel electrophoresis with ethidium bromide and visualized under UV
transilluminator. The PCR product was purified with GFXTM PCR DNA and Gel Band
Purification Kit following manufacturer instructions (Amersham Biosciences).
Sequencing of PCR products. The sequencing was performed in a MegaBACE
500 DNA sequencer (Amershan Biosciences). The sequences obtained in this study and
those available in data banks were aligned with BioEdit® software. Alignments were
42
refined by visual inspection. The 16S rDNA sequences were compared to GenBank
(http://www.ncbi.nlh.gov) using Blast® (Basic Local Alignment Search Tool).
VNTR PCR amplification. Seven L. interrogans isolates, previously identified
by 16S sequencing were further characterized by VNTR analysis. Six discriminatory
primers were used (VNTR4, VNTR7, VNTR9, VNTR10, VNTR19 and VNTR23) (30).
Amplification was achieved with Taq DNA polymerase (Invitrogen), using one cycle of
denaturation (94oC for 5 min) followed by 35 cycles of amplification consisting of
denaturation (94oC for 30 s), annealing (55oC for 30 s), and primer extension (72oC for
1 min 30 s) and a final extension of 10 min at 72oC. The size of the amplified products
was estimated by comparison with a 50-bp DNA ladder (Invitrogen).
RESULTS
16S rDNA gene sequencing. Sequencing of the 16S DNA gene, with a
minimum of 1,058 bp, was performed for all 10 Leptospira isolates 16S rDNA gene,
and the results are summarized in Table 2. Comparison among the clinical isolates
showed sequence similarity from 99 to 100% in the 16S rDNA gene sequences with
Leptospira species.
The sequencing of the 16S rDNA gene revealed two different Leptospira
species, Leptospira interrogans and Leptospira noguchii. Within each species the
nucleotide sequences were highly conserved, making it difficult to identify the serovar.
The 81- Caco isolate showed identity with the L. noguchii serovars Orleans and
Nicaragua with only one mismatch in the nucleotide 114 where a change of “T” for “C”
was observed.
43
Table 2. Results from partial sequencing of the 16S rDNA gene from Leptospira
isolates
Isolate identification
Origin bp sequenced
Leptospira species
Serovar with 100% identity
463 - Tande dog 1172 interrogans Australis, Canicola, Zanoni, Hebdomadis, Pomona, Hardjo
359 - Isoton human 1156 interrogans Bratislava, Autumnalis, Icterohaemorrhagiae, Copenhageni, Pyrogenes, Bulgarica, Lai, Bataviae
69 - Kade rat 1363 interrogans Pyrogenes, Bulgarica, Lai, Copenhageni
55 - Skol rat 1417 interrogans None
89 - Kito dog 1363 interrogans Canicola, Pomona
Mike dog 1330 interrogans Australis, Canicola, Zanoni, Hebdomadis, Pomona, Hardjo
Ike human 1341 interrogans None
81 - Caco sheep 1161 noguchii Orleans/Nicaragua
206 - Cascata human 1058 noguchii Orleans
66 - Hook dog 1350 noguchii Orleans/Nicaragua
Characterization of L. interrogans serovars by VNTR polymorphism
analysis. PCR was performed with the six selected VNTR loci for the seven L.
interrogans isolates. Comparison analyses with results published by
Majed et al. (21), revealed two isolates belonging to serogroup Australis serovar
Muenchen, three isolates belonging to serogroup Canicola serovar Canicola, one to
serogroup Icterohaemorragiae serovar Copenhageni and one isolate belonging to
serogroup Djasiman serovar Djasiman. The results are summarized in Table 3.
44
Table 3. Results from VNTR analysis of Leptospira isolates
Copy number of VNTR locus Sorovar Isolate VNTR4 VNTR7 VNTR9 VNTR10 VNTR19 VNTR23
463-Tande 1 10 2 4 10 2 Canicola* 359-Isoton 5 1 7 12 8 2 Djasiman
69-Kade 2 1 13 7 2 0 Copenhageni
55-Skol 2 10 3 9 11 13 Muenchen
89-Kito 1 10 2 4 10 2 Canicola*
Mike 1 10 2 3 10 2 Canicola*
Ike 2 10 3 9 11 13 Muenchen * Distinguished by VNTR31 (data not shown)
DISCUSSION
The genetic diversity of Leptospira species has not been previously studied in
the city of Pelotas, State of Rio Grande do Sul, Brazil. In this study 10 isolates were
characterized and two leptospira species were identified.
The 16S rDNA gene sequence is about 1,500 bp long and is composed of both
variable and conserved regions. The gene is large enough to provide distinguishing
valid measurements. Indeed, 16S rDNA gene sequencing offers an unprecedented tool
for the description of new bacterial species. Unlike a phenotypic test, it is an universal
test because all bacterial species possess at least one 16S rDNA gene copy (38); also, it
does not suffer from the variability of phenotypic tests read by different observers, and
the results could easily transferable from one laboratory to another through electronic
databases such as GenBank.
Sometimes sequencing the entire 1,500 bp region is necessary to distinguish
between particular taxa or strains. Sequencing of the entire 1,500 bp sequence is also
desirable and usually required when describing a new species. However, for most
45
clinical bacterial isolates the initial 500 bp sequence provides adequate differentiation
for identification and in fact can provide a bigger percent difference between strains
because the region shows slightly more diversity per kilobase sequenced (6,27).
A minor difference or even a complete identity of the 16S rDNA gene sequence
is not enough to assert that different isolates belong to the same species, but a reverse
point of view is conceivable; if there are differences between two 16S rDNA gene
sequences, the species are probably different.
Despite the fact that the 16S rDNA gene in bacterial species is very conserved,
the sequencing could allow the species differentiation using public database (GenBank)
to compare the sequences. However, in some cases the comparison is difficult due to the
poor quality of the GenBank database sequences or because there is a limited number of
serovar sequences in the database to compare.
On the other hand, the existence of variant 16S rRNA gene alleles in a single
genome has been convincingly demonstrated in several reports (6,10,18,34). Most of
documented intracellular heterogeneities are only one or two polymorphisms per
sequence and would not lead to different species identification. In fact, L. interrogans
Copenhageni has two copies of the 16S rDNA gene and a single nucleotide
polymorphism can be seen at base 306, where the citosine present in one copy is absent
in the second copy (22).
Previous studies have revealed that the organization of leptospiral genomes is
relatively fluid due to various types of recombination events. Comparative pulsed-field
gel electrophoresis (PFGE) studies of even closely related strains reveal many large
rearrangements (5,44). In addition, Leptospira species contain repetitive transposase-
encoding insertion sequences (IS), some of which may play a role in producing genomic
rearrangements (4,5,39,40,42,45). However, the function of repetitive elements in
46
bacteria is not fully understood. The dissemination of homologous VNTR loci in the
genome may suggest frequent intragenomic rearrangement or that these elements are (or
have been) mobile elements (21)
The sequencing analysis of isolates 69-Kade, 89-Kito, 359-Isoton, Mike, and
463-Tande showed 100 % identity with different serovars of the L. interrogans. Isolates
55-Skol and Ike showed only three base pairs mismatch with L. interrogans sequences
present in GenBank. According to VNTR analysis these two isolates belong to
serogroup Australis serovar Muenchen. The fact that 16S sequence from serovar
Munchen is no present in GenBank can explain the lack of identity between the 16S
rDNA sequence obtained and the ones deposited on GenBank database.
These results suggest that the most prevalent serovars in this region belong to the
species L. interrogans, and that there is close interaction among humans, dogs, rats and
other animals in a contaminate area. The serovars isolated from humans were also
isolated from rats, sheep or dogs. The biodiversity of leptospires in the environment is
affected by geography, climate, biotic interactions, and human activities. Environmental
conditions strongly affect the transmission of leptospirosis by modifying the population
biology, behaviour, or community ecology of spirochetes and theirs hosts.
Pelotas is a city with low altitude. It is only 7 meters above sea level (1) with
extensive areas of rice plantations around it. These factors, associated to the presence of
litter on public ways and many stray dogs increase the risk of contamination and the
disease dissemination, as rodents, particularly rats, are widely held to be the major
source of most human cases of leptospirosis.
VNTR analysis was carried out with all the markers described by Majed et al.
(31), however no amplification was obtained with primers for VNTR11. In order to rule
out problems with primer synthesis, a new batch of primers was ordered, but the result
47
was the same (data not shown). The VNTR analysis was not affected by this fact, as
according to the same authors, VNTR7, VNTR10 and VNTR19 has the same
discriminatory power as the complete set of seven markers. .
The VNTR analysis reveled that the isolate 359-Isoton belongs to serogroup
Djasiman serovar Djasiman. As there was no information about the 16S rDNA sequence
from this sorovar available on the GenBank, we sequenced the 16S gene from the WHO
battery strain of Djasiman serovar and the result was an identity of 100% over a
fragment of 1,150 bp. The MAT analysis of the patient serum from whom this isolate
was obtained resulted in a title of 1600 for the serovar Djasiman (data not show). The
serogroup Djasiman contains five serovars (17) One of these serovars, Huallaga, has
been isolated from an opposum in Peru (20). Rossetti et al. (29) reported the isolation of
a new serovar from a canine in Argentina, and named it sorovar Buenos Aires.
However, there was no previous communication about isolation of strains belonging to
the Djasiman serogroup in Brazil.
The isolates 89-Kito and 463-Tande showed one extra repeat for the VNTR10
locus. Instead of three tandem repeats found in the reference strain and in Mike isolate,
these two isolates have four tandem repeats. We consider that one repeat difference in a
single VNTR locus is conceivable among different isolates of the same serovar.
However, this finding has to be further investigated.
Unfortunately, only 16S rDNA sequencing is unable to distinguish serovars
accurately. The VNTR analysis is able to differentiate most of the serovar reference
strains from L. interrogans senso stricto, but the primer used for L interrogans, when
tested with L. noguchii DNA did not result in amplified bands.
The diversity of leptospires differs according to environment, which in turn
determines the diversity of mammalian fauna. Much remains to be established in the
48
cellular and molecular mechanisms underlying the clinical expressions of leptospirosis.
Identification and characterization of regional isolates would allow for more precise
determination of transmission sources. The epidemiological investigation of this
organism is important to distinguish individual cases from related cases such as in an
outbreak situation. Determining which animal is the likely common source of the
infection, as containing or preventing the spread of the vector, is paramount to control
the disease.
Prevention of leptospirosis in all situations is not possible, because it is
widespread in so many animals and places all over the world. The best that can be done
is to limit the effects of leptospirosis on humans and the animals they depend on. This
involves identification of sources, containing them and eliminating them or their effects.
The relationship of reservoirs, humans and animals in the epidemiologic chain of
leptospirosis in the Southern region of Brazil should be further studied, particularly on a
molecular biology basis.
The VNTR method has potential application in furthering the understanding of
Leptospira molecular aspects and showed to be a powerful tool for serovar
identification, as well as epidemiology and phylogenetic studies. Hopefully, in the near
future, discriminative and reproducible molecular methods will be able to replace
serologic characterization for the assignment of a strain from any leptospira species to
either an already known serovar or a new one.
49
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Richard Zuerner for fruitful discussions. We thank CNPq for supporting this
work.
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53
5. CONCLUSÕES GERAIS
1. O limite de detecção da PCR, com os primers avaliados, foi de
aproximadamente 40 bactérias por reação em urina ou salina artificialmente
contaminada.
2. A reação de PCR desenvolvida se mostrou altamente específica, sendo capaz de
amplificar somente a partir de amostras de leptospiras patogênicas.
3. O nested PCR foi capaz de detectar 10 celulas bacterianas por ml, ou duas
cópias genômicas por reação.
4. O nested PCR possibilitou um aumentou de 20 vezes na sensibilidade do teste,
resultando em um método com potencial para ser utilizado no diagnóstico
laboratorial de leptospirose, inclusive nos estágios iniciais da doença.
5. A caracterização dos isolados por sequenciamento do 16S rDNA permitiu a
classificação apenas em nível de especie.
6. Dos 10 isolados caracterizados, 7 foram identificados como pertencentes à
espécie L. interrogans e 3 L. noguchii.
7. O método de cartacterização pela análise de VNTR permitiu a identificação de
diferentes sorovares entre os isolados pertencentes a espécie L. interrogans.
8. A análise de VNTR permite a discriminação de sorovares e é, portanto uma
ótima ferramenta de biologia molecular, podendo vir a substituir a
sorotipificação.
54
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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