diagnostic de la tuberculose par examen … · un guide technique pour l’examen microscopique...
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GUIDE TECHNIQUE
Diagnostic de la tuberculosepar examen microscopiquedirect des expectorations
dans les pays à faibles revenus
Cinquième édition
2000
Union Internationale Contre la Tuberculoseet les Maladies Respiratoires
68 boulevard Saint Michel, 75006 Paris, France
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COMITÉ DE RÉDACTION
Mohammed Akhtar
Gisela Bretzel
Fadila Boulahbal
David Dawson
Lanfranco Fattorini
Knut Feldmann
Thomas Frieden
Marta Havelková
Isabel N de Kantor
Sang Jae Kim
Robert Küchler
Frantz Lamothe
Adalbert Laszlo
Nuria Martin Casabona
A Colin McDougall
Håkan Miörner
Graziella Orefici
C N Paramasivan
S R Pattyn
Ana Reniero
Hans L Rieder
John Ridderhof
Sabine Rüsch-Gerdes
Salman H Siddiqi
Sergio Spinaci
Richard Urbanczik
Véronique Vincent
Karin Weyer
A partir d’un avant-projet préparé par Adalbert Laszlo, pour l’Union Internationale Contre laTuberculose et les Maladies Respiratoires.
Conception graphique : Edik Balaian
Traduction française : Jacques Prignot
Édition : Fadila Boulahbal, Arnaud Trébucq
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Un guide technique pour l’examen microscopique direct des frottis d’ex-pectoration, inspiré par celui élaboré en 1969 par le Dr J. Holm, à l’époqueDirecteur de l’Union Internationale Contre la Tuberculose, a été publié pour la pre-mière fois en 1978 par l’UICT sous forme de Guide Technique concernant leDiagnostic de la Tuberculose par Microscopie Directe. Ce guide a été inséré dansles troisième et quatrième éditions du Guide de la Tuberculose pour les Pays àFaibles Revenus éditées par l’UICTMR. Il a été conçu comme un simple standardde référence concernant le recueil, la conservation et le transport des échan-tillons d’expectorations, ainsi que pour l’examen des frottis d’expectoration parl’examen microscopique. Il visait à répondre aux besoins des travailleurs de lasanté dans les pays à faibles revenus et à haute prévalence où se trouvait lagrande majorité des cas de tuberculose dans le monde.
Depuis sa première publication, il y a plus de vingt années, ce guide est restéinchangé. Aujourd’hui, la tuberculose est une des causes principales de décès dusà un agent infectieux unique parmi les adultes dans les pays à faibles revenus,où elle reste un problème majeur de santé publique. Malgré d’importants progrèsdans les technologies modernes de diagnostic, l’instrument de base pour lesservices de diagnostic de la tuberculose – la microscopie des frottis d’expecto-ration – n’a pas connu de modifications techniques. Toutefois, le contexte danslequel il est appliqué, c’est à dire le Programme National de Tuberculose, s’estaffiné de façon considérable au cours des deux dernières décennies.
L’utilisation du guide sur le terrain a révélé au fil des années des omissionset des manques de précision auxquels il fallait répondre. De plus, les aspects desécurité contre la contamination et de contrôle de qualité de l’examen micro-scopique n’avaient pas été couverts suffisamment dans l’édition antérieure. Ona donc pensé que le Guide Technique de l’UICTMR devait être révisé pour mieuxrefléter son caractère de santé publique et pour le maintenir en adéquation avecles stratégies modernes de lutte antituberculeuse. Ce document a été revu avecsoin par les membres de la Section Bactériologie et Immunologie de l’UICTMR,par les directeurs du Réseau de Laboratoires de Référence Supranationaux de laTuberculose de l’OMS et de l’UICTMR ainsi que par d’autres professionnels émi-nents dans le domaine de la lutte antituberculeuse.
DR ADALBERT LASZLO
Ottawa 2000
PRÉFACE
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1. INTRODUCTION. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
2. LE LABORATOIRE DE MICROSCOPIE DES EXPECTORATIONS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
2.1 Rôle du laboratoire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
2.2 Conformation physique du laboratoire. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 67
2.3 Matériel nécessaire . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 68
2.4 Préparation des colorants pour le Ziehl-Neelsen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 69• Carbol fuchsine de Ziehl. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70• Solution aqueuse de phénol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70• Solutions d’agent décolorant. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70• Solution de contre-coloration au bleu de méthylène. . . . . . . . . . . . . . . . . . . 70
3. RECUEIL ET TRANSPORT DES PRÉLÈVEMENTS . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.1 Les prélèvements . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 713.1.1 Prélèvements pour le diagnostic . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 713.1.2 Prélèvements pour le suivi du traitement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 71
3.2 Mode de recueil des expectorations. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 72
3.3 Les crachoirs. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 73
3.4 Transport des échantillons d’expectoration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
3.5 Enregistrement du patient . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4. PRÉPARATION DES FROTTIS POUR L’EXAMEN MICROSCOPIQUE . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.1 Identification des lames . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 74
4.2 Confection de l’étalement . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 77
4.3 Fixation du frottis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
4.4 Coloration du frottis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 784.4.1 Méthode de coloration de Ziehl-Neelsen . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78
• Coloration . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 78• Décoloration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79• Contre-coloration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 79
4.4.2 Qualité de l’étalement et de la coloration. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 80
5. EXAMEN MICROSCOPIQUE DES FROTTIS D’EXPECTORATION . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
5.1 Le microscope . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
5.2 Utilisation du microscope . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
5.3 Examen microscopique des frottis . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 81
TABLE DES MATIÈRES
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5.4 Echelle de positivité des résultats de l’examen au microscopedes expectorations . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 83
5.5 Enregistrement et communication des résultats de l’examen microscopique 84
5.6 Conservation des frottis en vue de l’assurance qualité . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 84
6. ASSURANCE QUALITÉ DE L’EXAMEN MICROSCOPIQUE DES EXPECTORATIONS 85
6.1 Définitions . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
6.2 Procédures. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 85
7. BIOSÉCURITÉ AU LABORATOIRE DE MICROSCOPIE POUR LA TUBERCULOSE . . . 86
7.1 Aspects généraux. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
7.2 Aspects spécifiques. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 86
8. GESTION DES PRODUITS. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 88
RÉFÉRENCES. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
LECTURES SUGGÉRÉES . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 92
Annexe 1 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93• Prévention des faux positifs en microscopie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93• Conséquences des faux positifs en microscopie. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93• Prévention des faux négatifs en microscopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93• Conséquences des faux négatifs en microscopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 93
Annexe 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94• Entretien du microscope . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 94
Annexe 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95• Guide pour la solution des problèmes de microscopie . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 95
Dans les pays à faibles revenus et à pré-valence élevée de tuberculose, l’examenmicroscopique des frottis d’expectoration –ou bacilloscopie – est, et restera probable-ment dans un avenir prévisible le seul outil
acceptable en terme de coût-efficacité pourdiagnostiquer les patients atteints de tuber-culose contagieuse et pour suivre leurs pro-grès sous traitement. L’examen microsco-pique des frottis d’expectoration est unetechnique simple, peu coûteuse et appro-priée, relativement aisée à exécuter et à lire.On obtient des résultats appropriés avec unesensibilité très élevée pour la détection dessujets transmettant les bacilles tuberculeux ;elle fournit la plupart des indicateurs essen-tiels de laboratoire et d’épidémiologie néces-saires pour l’évaluation du ProgrammeNational de Tuberculose (PNT).
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1. INTRODUCTION
2. LE LABORATOIRE DE MICROSCOPIEDES EXPECTORATIONS
Les objectifs des laboratoires de la tuber-culose au sein d’un PNT sont :– le diagnostic des cas contagieux res-ponsables de la transmission du bacille dela tuberculose dans la communauté ;– le suivi du traitement jusqu’à la guérison.
2.1 Rôle du laboratoire
Dans les pays en développement, le plusgrand nombre des diagnostics bactériolo-giques de tuberculose est assuré dans leslaboratoires périphériques dont la responsa-bilité principale est de fournir au PNT l’exa-men microscopique de diagnostic, en sebasant sur une bacilloscopie des expectora-tions après coloration de Ziehl-Neelsen (ZN).Ces laboratoires, localisés dans les centresde santé, les postes de santé, les hôpitaux,etc., ont habituellement du personnel tech-nique qualifié, apte à exécuter, parmi d’autresobligations, la bacilloscopie des frottis d’ex-pectoration. Ils devraient être aptes à assurerles fonctions suivantes :– pratiquer toute les bacilloscopies d’expec-toration demandées dans leur zone de recru-tement, habituellement un district (50 000-150 000 habitants) ;– servir de centre de référence pour les uni-tés de recueil d’échantillons ;– coordonner avec les Laboratoires Régionaux(intermédiaires) le transfert d’échantillons pourlesquels les cultures ou les tests de sensibilitéaux médicaments sont indiqués ;– recueillir les échantillons pendant lesheures d’ouverture du Centre de Santé ;
– envoyer les informations au LaboratoireRégional ;– respecter les directives nationales d’assu-rance qualité ;– commander, gérer et stocker les fourni-tures de laboratoire.
2.2 Conformation physiquedu laboratoire
L’aménagement détaillé du laboratoirede microscopie peut varier considérablementselon les situations locales. Il est difficile defournir un schéma modèle applicable demanière générale car au fil du temps, dansbeaucoup de pays, les services de diagnosticde la TB ont été intégrés dans les services dediagnostic d’un laboratoire général. Idéa-lement, le laboratoire de bacilloscopie pour laTB devrait comprendre diverses sections dis-tinctes (Figure 1) (adapté de Collins et coll1) :– un espace pour une paillasse ou pour unetable (A) pour les échantillons entrants(Figures 1 et 2) ;– une paillasse de travail bien éclairée (B)pour la préparation des frottis (Figures 1 et3) ;
– un évier de coloration (C) muni d’eau cou-rante (Figures 1 et 4) ;
– un évier (D) muni d’eau courante pour lelavage des mains ;
– une zone de paillasse (E) pour la lecture aumicroscope, juste devant une fenêtre (Figures1 et 5) ;
– une zone de paillasse ou une table (F) pourles registres du laboratoire et la zone deconservation des lames (Figures 1 et 6) ;
– une armoire (G) pour les vêtements destechniciens (Figure 1).
Si la paillasse est en matériel poreux, uneplaque plane non poreuse en formica, enmarbre, en métal galvanisé ou en aluminiumdevrait recouvrir la paillasse. Ce plateaudevrait avoir une largeur de 80 cm et desrebords hauts de 5 cm. Le rebord antérieurdoit être rabattu à 90o pour épouser le bordde la table et faciliter ainsi les manipulations(Figure 3). Ces dernières doivent se faire stric-tement au dessus du plateau, qui devrait êtredécontaminé chaque jour après utilisation,en l’imbibant avec un germicide antitubercu-leux (par exemple du phénol à 5 % ou unesolution à 0,1 % d’hypochlorite de soude*[NaClO], connue aussi comme blanc deménage, Chlorox, Javel, etc.).
2.3 Matériel nécessaire
Les détails du matériel sont mentionnésà la Figure 31. Porte-lames pour la préparation des frottis2. Séchoir pour les lames3. Crachoir placé le plus près possible à
droite du porte-lames4. Applicateurs en bois5. Lampe à alcool/Bec Bunsen
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Figure 1
Figure 2
* Le blanc de ménage contient 5 % de NaClO(50 g/litre). On prépare une solution à 0,1 % conte-nant 1 g de NaClO/litre en diluant 20 ml de blanc deménage dans 1 litre d’eau. Cette solution est utiliséecomme un désinfectant à usage multiple dans lessituations de « propreté relative ».
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Figure 3
1. Porte-lames pour la préparation des frottis2. Séchoir pour les lames3. Crachoir placé le plus près possible à droite
du porte-lames4. Applicateurs en bois
5. Lampe à alcool / Bec Bunsen6. Pince sans griffes7. Poubelle métallique avec couvercle, destinée au recueil
du matériel contaminé8. Boîte de lames gravées pour les frottis
6. Pince sans griffes7. Poubelle métallique avec couvercle, des-
tinée au recueil du matériel contaminé8. Boite de lames gravées pour les frottis
NOTE : Si le technicien est gaucher, ilpeut être plus pratique de disposer sur latable tous ou la plupart des éléments de laFigure 3 exactement en position inverse(c.-à-d. image en miroir).
2.4 Préparation des colorantspour le Ziehl-Neelsen
La méthode de choix pour la bacillosco-pie des frottis d’expectoration est la colora-tion de Ziehl-Neelsen (ZN) car elle est la seuleà fournir régulièrement de bons résultats
sans nécessiter un équipement spécial. Pourla préparation des réactifs nécessaires, il fautune balance, qui n’est pas toujours dispo-nible dans un laboratoire périphérique : lapréparation des réactifs au LaboratoireNational de Référence ou dans le laboratoireintermédiaire le plus proche est dès lors l’op-tion fréquemment choisie. Les avantages decette option, c’est à dire une meilleure stan-dardisation et une meilleure garantie de qua-lité, l’emportent sur les inconvénients d’uneconservation prolongée. Les techniques decoloration à froid comme les méthodes deKinyoun ou de Tan Thiam Hok ne sont pasrecommandées : il est prouvé qu’elles ne per-mettent que difficilement la détection debacilles acido-alcoolo-résistants (BAAR) dansles échantillons paucibacillaires et que lacoloration pâlit rapidement. La microscopie à
fluorescence, qui est recommandée lorsquela charge de travail quotidienne dépasse 50échantillons, n’a pas sa place dans la plupartdes laboratoires périphériques des pays àfaibles revenus.
a) Carbol fuchsine de Ziehl
Solution stock de fuchsine alcoolique à 3 %(solution A)
Fuchsine basique*.............. 3 g†
Alcool 95 %‡........................ jusqu’à 100 ml
Placer la quantité requise de fuchsinedans un flacon (ou dans un cylindre) graduéet ajouter la quantité d’éthanol ou d’alcoolméthyle nécessaire pour obtenir un volumetotal de 100 ml ; bien agiter jusqu’à dissolu-tion complète. De petites quantités de cettesolution doivent être filtrées préalablementà la coloration.
b) Solution aqueuse de phénol(solution B)
Cristaux de Phénol§ ............ 5 gEau distillée, si possible..... jusqu’à 90 ml
Avant d’ajouter l’eau, liquéfier les cris-taux de phénol dans un flacon en les chauf-fant légèrement.
Pour préparer la solution de travail defuchsine phéniquée de Ziehl, mélanger 10 mlde la solution A à 90 ml de la Solution B.
c) Solutions d’agent décolorant
– Solution alcool-acide
Alcool 95 % ......................... 970 mlAcide chlorhydriqueconcentré (35 %)**............. 30 ml
Ou quand l’alcool n’est pas disponible :
– Solution aqueuse d’acide sulfurique à 25 %
Eau, distillée si possible..... 300 mlAcide sulfuriqueconcentr醆 .......................... 100 ml
Placer 300 ml d’eau dans un flacon d’unlitre du type Erlenmeyer. Ajouter lentement100 ml d’acide sulfurique concentré en le lais-sant couler le long de la paroi du flacon. Lemélange va chauffer. Ne jamais mettre l’eaudans l’acide sulfurique concentré ; ceci peutprovoquer des éclaboussures explosives.
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Figure 4
d) Solution de contre-colorationau bleu de méthylène
Chlorure de bleude méthylène‡‡. . . . . . . . . . 0,3 gEau, distillée si possible . . jusqu’à 100 ml
* Chlorure de pararosaniline, contenu minimal encolorant 88 % (C19H18NCl) Sigma P 1528 ou équiva-lent.† Les poudres de colorant sont rarement pures, ensorte que la pesée doit être corrigée pour assurer unecoloration adéquate. Le pourcentage de colorant dis-ponible dans le contenu est fréquemment indiqué surl’étiquette du récipient original. Le poids corrigé estobtenu en divisant la quantité de colorant désirée parla fraction décimale du colorant disponible. Parexemple, si la quantité de colorant désirée est de 3 get le pourcentage de colorant disponible de 75 %, laquantité effective de colorant à peser est de 3/0,75 =4 g de colorant impur. Si le contenu en colorant est de88 % ou davantage, la pesée ne doit pas être corri-gée.‡ Ethanol 95 % (C2H5OH)-Pharmacopée des Etats-UnisXVIII, 20, 1067 (1970). La qualité industrielle est auto-risée.§ Phénol approximativement à 99 % (C6H6O) – SigmaP 3653 ou son équivalent.** Acide chlorhydrique concentré (HCl) – La qualitéindustrielle est autorisée.†† Acide sulfurique concentré (H2SO4) – La qualitéindustrielle est autorisée.‡‡ Chlorure de methylthionine, contenu minimal encolorant 82 % (C16H18CIN3S) – Sigma M 9140 ou sonéquivalent.
71
Figure 6Figure 5
3. RECUEIL ET TRANSPORT DES PRÉLÈVEMENTS
1er frottis d’expectoration,15 % de plus grâceau second et les 5 % restants par le troisième.
3.1.2 Prélèvements pour le suividu traitement
Le traitement de la tuberculose comportedeux phases : la phase intensive qui durehabituellement 2 à 3 mois et la phase decontinuation, durant de 4 à 10 mois selon letype de traitement. Quel que soit le régime detraitement, un échantillon d’expectoration du« MATIN » doit être prélevé à la fin de laphase intensive du traitement pour détermi-ner si le patient peut passer à la phase decontinuation si l’examen microscopique estnégatif ou au contraire doit continuer laphase intensive si la microscopie reste posi-tive. Il y a lieu de prélever un autre échan-tillon d’expectoration au 5e mois de la phasede continuation pour contrôler l’évolution dupatient et détecter un éventuel échec du trai-tement ainsi qu’un troisième au moment del’achèvement de la chimiothérapie (6 ou8e mois), pour contrôler la guérison. Leséchantillons d’expectoration à la fin du trai-tement sont souvent difficiles à obtenir, beau-coup de patients n’expectorent plus à cemoment. Le schéma exact des examens d’ex-pectoration pour le suivi varie selon le régimede traitement et devrait être précisé dans lemanuel du PNT.
3.1 Les prélèvements
3.1.1 Prélèvements pour le diagnostic
Dans les conditions de travail du PNT, ilest recommandé de recueillir trois échan-tillons d’expectoration : un échantillon « SURPLACE », c’est-à-dire lorsque le malade seprésente à la consultation – un échantillon lelendemain matin au réveil à la maison, ditéchantillon du « MATIN » – un troisièmeéchantillon sera prélevé « SUR PLACE »,lorsque le malade se présente de nouveauau laboratoire muni du prélèvement fait à lamaison.
Les prélèvements devront êtres collectésde préférence au cours d’une période de deuxjours, chez toute personne qui se présentedans les structures de santé, parce qu‘elle ades symptômes respiratoires depuis plus de3 semaines. Ces échantillons doivent êtreexaminés au microscope au laboratoire leplus proche.
Un cas de tuberculose à microscopiepositive est défini comme étant un sujet seprésentant avec des symptômes respiratoireset dont au moins deux frottis d’expectorationsont positifs à l’examen microscopique.
Cette approche, appelée égalementdépistage passif, détecte environ 80 % dessujets suspects de TB positifs à l’examen du
3.2 Mode de recueildes expectorations
C’est au moment où les sujets suspectsde tuberculose toussent que le risque decontamination pour les professionnels de lasanté est le plus élevé. Pour cette raison, leséchantillons d’expectoration devraient êtreprélevés à l’air libre, à l’abri des regards etaussi loin que possible d’autres personnes. Adéfaut, l’on devrait utiliser un local séparé etbien ventilé.
L’agent de santé chargé du recueil del’expectoration devrait rassurer les sujets sus-pects de tuberculose en leur expliquant lesraisons de l’examen et leur donner des indi-cations sur la manière de tousser qui permetde produire une expectoration provenant dela profondeur du thorax. Si le patient est
capable de lire, on peut lui fournir en com-plément des instructions écrites.
Avant de refermer le crachoir, l’agent desanté devrait s’assurer que le volume del’échantillon est suffisant (3 ml au moins) etqu’il contient non seulement de la salive maisaussi des produits visqueux ou purulents dontla présence augmente la sensibilité de ladétection des bacilles par la microscopie.Toutefois, même si le prélèvement paraît sali-vaire, ou, comme cela se produit fréquemmentdans les échantillons « sur place », si lesvolumes sont inférieurs à 3 ml, il faut néan-moins examiner l’échantillon car il est parfoissusceptible de donner des résultats positifs.
Un échantillon d’expectoration doit êtreclassifié par examen macroscopique comme« salivaire » lorsqu’il est constitué principale-ment de salive, comme « muqueux » si lemucus est dominant, comme « purulent » lors-qu’il est jaune comme du pus, comme « muco-purulent » lorsque des particules jaunâtressont visibles au sein du mucus et comme« sanglant » lorsqu’il contient du sang. La pré-sence de sang devrait toujours être notée carelle peut indiquer une maladie plus sévère etpourrait interférer avec la lecture du frottis.
L’agent chargé du recueil du crachat four-nira un crachoir marqué du code du centre desanté et où l’identification du patient sera ins-crite sur le corps du crachoir, jamais sur lecouvercle (Figure 7 C). Il demandera à la per-
72
Il est fortement recommandé de faire :– l’examen de trois échantillons d’expec-toration – « SUR PLACE » + « DU MATIN »+ « SUR PLACE » – pour le diagnostic descas de tuberculose.– l’examen d’un échantillon unique d’ex-pectoration « DU MATIN » à trois reprisespour le suivi du traitement : une fois à lafin de la phase intensive, une fois au coursde la phase de continuation et une fois àla fin du traitement.
Figure 7
A
C
B
73
Figure 8
A
C
B
sonne subissant l’examen de tenir le crachoirprès de la bouche et d’expectorer dans celui-ci (Figure 7 B). Cet échantillon est appelé unéchantillon « SUR PLACE ». Si aucune expec-toration n’est produite, le crachoir doit êtreconsidéré comme utilisé et être éliminé. Lescrachoirs seront fermés hermétiquement ets’ils doivent être adressés à un laboratoirevoisin, placés dans le coffret approprié des-tiné au transport. Après recueil, les échan-tillons seront enregistrés, conservés dans unendroit frais, transportés au laboratoire sanstrop de délai, c’est à dire au moins deux foispar semaine et examinés au microscope dansles 24 heures.
Dans des situations très particulières oùles structures de santé disposant de micro-scope sont éloignés des centres de santé, l’ex-pectoration recueillie peut être étalée sur lameau centre de santé et ce sont les lames fixéesqui sont alors adressées au laboratoire le plusproche. Toutefois, ce procédé est déconseillési le personnel n’est pas sérieusement pré-paré à cette tâche, car les frottis fixés, ayantété préparés par un personnel non entraînésont souvent d’une mauvaise qualité et lesrésultats obtenus ne sont pas fiables.
L’agent de santé fournira au malade unnouveau crachoir pré-étiqueté, lui expliqueracomment il devra l’utiliser pour recueillirl’échantillon du « MATIN » et lui montrera lafaçon de fermer hermétiquement le crachoiravant de le rapporter au centre de santé.
3.3 Les crachoirs
Deux types de crachoirs peuvent êtrerecommandés pour le recueil de l’expectora-tion dans le respect de la sécurité pour lemalade et le personnel et celui de la qualitéde l’expectoration recueillie. L’un que l’ontrouve sur la liste des produits disponibles àl’UNICEF (Figure 7 A) est une boîte rigide àlarge ouverture et à couvercle fileté, enmatière plastique transparente, incassable,facile à détruire par combustion. Il peut êtreutilisé pour un grand nombre de diagnosticsde routine (expectoration, selles, parexemple). Son couvercle à pas de vis peutêtre fermé hermétiquement pour prévenir ladessiccation de l’échantillon et les fuites.
L’autre est un crachoir en verre épais,dont le couvercle métallique est lui aussifileté, du type « Flacon Universel » (Figure
8 A). Le « Flacon Universel » peut être réuti-lisé après nettoyage soigneux et désinfectionà l’autoclave pendant 30 minutes à 121 oC. Siun autoclave n’est pas disponible, on recom-mande l’emploi d’une casserole à pressiondu type ménager (cocotte-minute).
Quelque soit le type de crachoirs utilisé,s’ils doivent être transportés, il est recom-mandé d’utiliser des boîtes de transportadaptées au type de crachoir. On utilise descoffrets en métal, en bois ou en mousse depolystyrène, fabriqués sur commande. Laboîte de transport en bois est un compromisraisonnable entre robustesse, poids et coût.Elle peut être fabriquée localement par lemenuisier sur les recommandations fournies(Figure 8 B, C).
3.4 Transport des échantillonsd’expectoration
Le transport des échantillons est néces-saire dans les pays où les équipements delaboratoire font défaut et où l’on fait appel àdes unités de recueil des échantillons. Demême, un transport est nécessaire lorsquedes projets de recherche opérationnels inté-ressant le PNT sont entrepris, comme parexemple la surveillance de la résistance auxmédicaments antituberculeux. Il y a lieu desélectionner les moyens de transport les plusrapides et d’un rapport coût-efficacité opti-mal. La flore de contamination n’interfère passur l’acido-résistance des mycobactéries maiselle peut liquéfier l’expectoration, ce qui rendplus difficile l’étalement du frottis et rend lalecture moins fiable. Les échantillons devantêtre mis en culture, seront conservés au réfri-gérateur en attendant leur envoi et devrontarriver au laboratoire dans les 3 à 4 jours.
Les crachats seront accompagnés d’uneliste identifiant les échantillons d’expectora-tion contenus dans le coffret de transportainsi que le formulaire de Demande d’exa-men d’expectoration (Figure 9) pour chacundes échantillons. Avant l’envoi depuis la for-mation sanitaire, l’agent de santé vérifie pourchaque coffret :– si le nombre total de crachoirs dans le cof-fret correspond à celui de la liste d’accompa-gnement et du nombre de formulaires deDemande d’examen d’expectoration ;– si le numéro d’identification de chaque cra-choir correspond à celui inscrit sur la listed’accompagnement et à celui inscrit sur leformulaire ;– si les formulaires de Demande d’examend’expectoration contiennent les informations
requises pour chacun des patients suspectsde TB.
Après avoir achevé cette vérification,l’agent de la santé :– note la date sur la liste d’accompagnement ;– met cette liste ainsi que le formulaire deDemande d’examen d’expectoration dansune enveloppe qui sera fixée à l’extérieur ducoffret de transport.
3.5 Enregistrement du patient
L’information provenant du formulaire deDemande d’examen d’expectoration seraentièrement transcrite aux endroits appro-priés dans le Registre de la Tuberculose auLaboratoire (Figure 10). Toute l’informationexigée dans le registre du laboratoire doitêtre reportée, c’est à dire qu’un espace blancne correspond pas à un oubli d’enregistre-ment mais à l’absence d’information.
Le registre du laboratoire de l’UICTMR adeux caractéristiques essentielles et utiles :il fait la distinction entre la bacilloscopie del’expectoration pour diagnostic ou pour suiviet attribue une seule ligne à chaque patientsuspect de tuberculose examiné et non àchaque échantillon d’expectoration exa-miné*.
Le numéro d’ordre du registre du labo-ratoire commence à 1 le 1er janvier de chaqueannée et augmente de 1 à chaque patient jus-qu’au 31 décembre de la même année.
74
* Ceci permet de chiffrer le taux de cas à bacillosco-pie positive parmi les suspects, puis de planifier lescommandes de fournitures de laboratoire à partir dunombre de cas à microscopie positive déclarés.
4. PRÉPARATION DES FROTTISPOUR L’EXAMEN MICROSCOPIQUE
4.1 Identificationdes lames
Le personnel de laboratoire inscrira pourchacun des échantillons le code du labora-
toire, le numéro d’ordre du registre du labo-ratoire ainsi qu’un identificateur de laséquence des échantillons, c’est-à-dire 1 pourle premier, 2 pour le deuxième et 3 pour letroisième prélèvement (Figure 11).
75
Figure 9. Formulaire de demande d’examen d’expectoration
DEMANDE D’EXAMEN D’EXPECTORATION
Nom de l’Unité de Traitement Date
Nom du malade
Age Sexe (cocher la case) : M [ ] F [ ]
Adresse précise
Raison de l’examen (cocher la case) : Diagnostic [ ] Examen de suivi [ ]
Signature du responsable du recueil des crachats
Le formulaire dûment rempli doit être rapidement transmis à l’Unité de Traitement
Date Examen effectué par (Signature)
* caractéristiques de l’expectoration à l’œil nu (muco-purulent, traces de sang, salive)
RÉSULTATS (à compléter au laboratoire)
No d’ordre du laboratoire
+ + ++ ++1-9négAspect*Echantillon
1
2
3
Date
Résultats (cochez)
76
Figure 10. Registre de la tuberculose au laboratoire
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4.2 Confection de l’étalement
Les crachoirs seront disposés l’un derrièrel’autre. Les numéros d’ordre du laboratoiredoivent coïncider avec l’information corres-pondante sur le formulaire de Demanded’examen d’expectoration qui les accom-pagne. On recommande l’utilisation de lamesneuves ; cependant, comme celles-ci sontsouvent graisseuses, elles ont tendance àadhérer entre elles et ont besoin d’être net-toyées à l’alcool puis séchées soigneusementà l’air. Si l’on ne dispose pas d’alcool, leslames peuvent être placées sur une flammepour éliminer les graisses. Dans les conditionsatmosphériques prévalant dans la plupart despays à faibles revenus, on recommande l’uti-lisation de lames tropicalisées (chaque lameest séparée de la suivante par une languettede papier imperméable). Le code du labora-toire, le numéro d’ordre et l’identification dela séquence peuvent être gravés au moyend’un diamant-marqueur à une extrémité de lalame. Lorsqu’on ne dispose pas de diamant-marqueur, on peut utiliser une mèche den-taire déclassée, à pointe arrondie, enserréedans l’extrémité conique d’un stylo en matièreplastique3. Si l’on dispose de lames à extré-mités dépolies, on peut employer un crayonordinaire à mine de plomb.• Vérifier qu’il y a concordance entre lesnuméros des lames et ceux des crachoirs.• Prendre le crachoir correspondant aunuméro de la lame.• Ouvrir soigneusement le crachoir pour évi-ter la production d’aérosols.• Briser un applicateur en bois ou en bam-bou (Figure 12), choisir des particules jaunes,purulentes dans l’expectoration avec l’extré-mité déchiquetée de l’applicateur brisé.Utiliser l’extrémité brisée des deux morceaux
de l’applicateur pour dissocier les particulesles plus grandes.• Etaler l’expectoration régulièrement sur lazone centrale de la lame grâce à un mouve-ment continu de rotation (Figure 13) ; onrecommande un étalement d’environ 20 mmsur 10 (Figure 11).• Placer les lames sur le séchoir avec la sur-face d’étalement vers le haut et laisser sécherà l’air durant environ 30 minutes.• Refermer le crachoir, qui ne devrait pas êtreéliminé avant que les résultats ne soient luset enregistrés.
Les applicateurs ne peuvent être utilisésqu’une seule fois. Pour s’en défaire, les pla-cer dans une poubelle contenant une solu-tion aqueuse de phénol à 5 % ou une solutiond’hypochlorite de soude à 0,5 %*, puis lespasser à l’autoclave ou à l’incinérateur.ATTENTION : les vapeurs sont très toxiques
77
Figure 11
Figure 12
Figure 13
* L’hypochlorite de soude est un agent oxydant trèspuissant, corrosif pour le métal. On prépare une solutionà 0,5 % contenant 5 g de NaClO/litre en diluant 100 mlde blanc de ménage dans 1 litre d’eau. Cette solution estutilisée en présence de « conditions de saleté ».
4.3 Fixation du frottis
Procéder à la fixation des lames séchéesen les tenant avec une pince et en les pas-sant sur la flamme 5 fois pendant environ4 secondes, la face d’étalement tournée versle haut (Figure 14). Ne pas fixer par la cha-leur les lames humides et éviter un échauf-fement excessif.
78
Figure 14
4.4 Coloration du frottis
4.4.1 Méthode de colorationde Ziehl-Neelsen
Coloration
• Placer les lames fixées sur le support decoloration selon leur numéro d’ordre, la faced’étalement vers le haut. Les lames devraientêtre séparées par un intervalle d’1 cm et nejamais se toucher l’une l’autre.• Recouvrir les lames l’une après l’autre aumoyen de la solution de travail de fuchsinephéniquée de Ziehl à 0,3 % filtrée (Figure 15).En plaçant une bande de papier absorbantcomme un papier filtre ou même du papierjournal, on retiendra la solution de colorationet on évitera le dépôt de cristaux de fuchsinesur le frottis.• Chauffer les lames par le dessous aumoyen de la flamme d’un bec Bunsen, d’unelampe à alcool ou d’un tampon d’ouateimbibé d’alcool, jusqu’à émission de vapeur.Il ne faut jamais aller jusqu’à l’ébullition de lasolution de colorant. Ne pas laisser le colo-rant se dessécher (Figure 16).
• Laisser les lames recouvertes d’une solu-tion chaude et fumante de fuchsine phéni-quée pendant 5 minutes en repassant laflamme si c’est nécessaire• Rincer les lames délicatement à l’eau pourécarter l’excès de fuchsine phéniquée(Figure 17).
Figure 15
Figure 16
Figure 17
79
• Evacuer l’excès d’eau de rinçage des lames(Figure 18). Les frottis d’expectoration ontune couleur rouge.
Figure 19
Figure 18
Décoloration
• Recouvrir les lames au moyen d’acide sul-furique à 25 % ou d’une solution d’alcool-acide et laisser agir pendant 3 minutes, aprèscela la coloration rouge devrait avoir presquedisparu (Figure 19). En cas de nécessité, répé-ter cette séquence durant deux minutes sup-plémentaires.
• Laver délicatement l’acide sulfurique oul’alcool-acide et l’excès de colorant à l’eau(Figure 20). Evacuer des lames l’excès d’eaude rinçage (Figure 21).
Figure 20
Figure 22
Figure 21
Contre-coloration
• Recouvrir les lames l’une après l’autre avecla solution de contre-coloration (bleu deméthylène à 0,3 %) et laisser agir pendant1 minute (Figure 22).
80
Figure 23
Figure 24
• Rincer les lames à l’eau individuellement(Figure 23).
• Evacuer l’eau des lames et les laissersécher à l’air (Figure 24).
La technique de coloration de Ziehl-Neelsendemande :
– 5 minutes pour la coloration ;– 3 minutes pour la décoloration ;– 1 minute pour la contre-coloration.
4.4.2 Qualité de l’étalementet de la coloration
L’aspect d’un frottis coloré correcte-ment est bleu clair sous l’effet du bleu deméthylène. Si la couleur est bleu foncé, lefrottis est trop épais, dans ces conditions iln’est pas possible de lire un texte au tra-vers de la lame :
– exemple d’un bon frottis (Figure 25).
Figure 25
Figure 26
– exemples d’un mauvais frottis (Figure 26).
BON FROTTIS
81
5. EXAMEN MICROSCOPIQUEDES FROTTIS D’EXPECTORATION
5.1 Le microscope
Pour l’examen des frottis, on doit dispo-ser d’un microscope binoculaire à deuxobjectifs – un objectif standard d’agrandisse-ment 40 × et un objectif à immersion d’agran-dissement 100 × – ainsi que d’oculairesd’agrandissement moyen (8 × ou 10 ×)(Figure 27).
On recommande vivement les micro-scopes munis d’une option de miroir focali-sant la lumière, car ils sont utiles en cas decoupure d’électricité et nécessaires dans leslaboratoires où celle-ci fait défaut. Le miroira une surface plane pour la lumière artificielleet une surface concave pour la lumière natu-relle. Une source de lumière est insérée dansla base du microscope ; une ampoule halo-gène assure un éclairage satisfaisant. Leslampes halogènes ont une luminosité plusélevée et une durée de vie plus longue queles ampoules au tungstène.
En dehors des périodes d’utilisation, lesmicroscopes seront protégés de la poussière,de la chaleur et de l’humidité en les mettantdans leur coffret. Le système optique dumicroscope est constamment menacé par ledéveloppement de champignons. Cela peutêtre empêché en équipant le coffret d’unelampe de 20 watts que l’on tient allumée pen-dant l’entreposage du microscope. L’objectif,l’oculaire, le condenseur et la source lumi-neuse seront nettoyés chaque jour, en lesessuyant au moyen d’un papier pour lentille.
5.2 Utilisation du microscope
Pour augmenter le pouvoir résolutif del’objectif, il faut placer une goutte d’huile àimmersion sur la lame colorée et sèche.L’applicateur d’huile à immersion ne doit pastoucher la lame afin d’éviter une contamina-tion croisée par des BAAR. Le mieux est d’uti-liser de l’huile à immersion synthétique. Elleest bon marché et facile à éliminer des lameset du système optique du microscope. Parcontre, Il ne faut jamais utiliser d’huile de cèdre
comme huile à immersion car elle forme aprèsséchage une pâte épaisse qui pourrait endom-mager les lentilles du microscope. Des moyensde fortune comme l’huile de lin, de palme oud’olive ou la paraffine liquide donnent desrésultats tout à fait insuffisants. Certaines huilesà immersion peuvent dissoudre la fuchsine4 :en conséquence, la coloration de ZN peut pâlirplus rapidement. Il y a lieu de recommanderl’emploi d’hydrocarbures synthétiques et depolymères avancés à index de réfraction de1,5, car ils ne sèchent pas, ne durcissent pas etn’ont pas de pouvoir dissolvant*.
La lame colorée est placée sur la platine,le condenseur étant relevé le plus possible.On ajuste la source lumineuse en vue d’unéclairage optimal en regardant dans l’ocu-laire avec l’objectif standard 40X.
On sélectionne une zone contenant plusde leucocytes (cellules de pus) que de cel-lules épithéliales (plus fréquentes dans lasalive) avant d’y laisser tomber une goutted’huile à immersion.
En abaissant lentement l’objectif à immer-sion, un fin film d’huile se forme entre la lameet l’objectif. On utilise alors la vis micromé-trique pour la mise au point du champ. Il fautéviter que l’objectif touche la lame.
Des informations complémentaires surl’utilisation et la manipulation du microscopese trouvent à la référence 5.
5.3 Examen microscopiquedes frottis
Les bacilles acido-résistants se présententen rouge vif ou en rosé sur un fond contre-coloré en bleu. Leur forme est très variable(filaments courts ressemblant à des coquesou filaments allongés). Ils peuvent être colo-rés de façon uniforme ou inégale et peuvent
* Huile à immersion type A ou B (R.P. Cargille Labs,Inc. Cedar Grove, NJ. Catalogue No 16484, ou huile àimmersion de marque VWR, Resolve, CatalogueNo 48218, ou son équivalent).
82
Figure 27
1) oculaire ; 2) cercle d’objectifs ; 3) objectif ; 4) platine ; 5) condenseur ; 6) levier de diaphragme ; 7) vis macrométrique pour mise au point grossière ;
8) vis micrométrique pour mise au point de lecture ; 9) source de lumière.
même paraître granuleux. Ils apparaissent iso-lément ou en amas de taille variable. Ils seprésentent typiquement comme des bâton-nets incurvés, longs et effilés.
L’examen microscopique des frottis sefait selon une procédure systématique etstandardisée qui débute à l’extrémité gauchedu frottis, se poursuit sur une ligne du frottisen déplaçant la lame de gauche à droite, puisen la déplaçant d’arrière en avant on lit unedeuxième ligne parallèle de droite à gauche,puis si nécessaire une autre ligne est exami-née en allant de gauche à droite. Il y a envi-ron 100 champs microscopique dans l’axelongitudinal d’un frottis de 2 cm. Trois lignesde frottis examinés correspondent à 300champs microscopiques contrôlés. La lecturecommence à la périphérie du champ et setermine au centre. (Figure 28).
Le microscopiste doit mettre environ5 minutes pour lire 100 champs, et quand iltravaille à temps plein, il ne faut pas s’at-tendre à ce qu’il prépare et lise par jour plusde 25 échantillons d’expectoration colorés auZN. Il ne faut pas traiter en une fois plus de 10à 12 échantillons. Toutefois, cette situationn’arrive que rarement, même dans les labo-ratoires périphériques de pays à haute inci-dence. Lorsque la microscopie des frottisd’expectoration pour TB est totalement inté-grée dans les services généraux de soins desanté primaires, il est nécessaire d’assurerau microscopiste une charge de travail suffi-sante pour maintenir la compétence néces-saire à l’exécution du test.
83
Figure 28
Nombre de BAAR Enregistrement / communication
Pas de BAAR sur au moins 100 champs 0 / négatif
1 to 9 BAAR sur 100 champs* nombre réel de BAAR‡
10 to 99 BAAR sur100 champs† +
1 to 10 BAAR par champ sur au moins 50 champs† ++
> 10 BAAR par champ sur au moins 20 champs† +++
Tableau 1 Echelle de positivité des résultats de bacilloscopiedes expectorations recommandée par l’UICTMR
* La découverte de 1 à 3 bacilles sur 100 champs n’est pas en bonne corrélation avec la positivité de la culture. L’interprétationde la signification de ce résultat devrait être laissée au PNT et non au microscopiste. Il est recommandé de préparer un nou-veau frottis provenant du même échantillon d’expectoration et de le réexaminer† En pratique, la plupart des microscopistes lisent quelques champs et confirment leur observation par un balayage visuelrapide des champs restants.‡ On recommande de mentionner les décomptes réels de BAAR pour permettre à l’autorité compétente de déterminer sice nombre coïncide avec la définition de cas du PNT.
5.4 Echelle de positivitédes résultats de l’examen aumicroscope des expectorations
Les informations concernant le nombrede bacilles décelés sont très importantes carelles reflètent le degré de contagiosité dupatient ainsi que la sévérité de la maladie.Pour cette raison, il faut formuler les résultatsde la bacilloscopie des frottis d’expectorationde manière non seulement qualitative, maisaussi semi-quantitative. L’UICTMR recom-mande l’échelle suivante pour les résultatsde bacilloscopie des frottis (Tableau 1).
Un bulletin indiquant un résultat positifpour un frottis d’expectoration est un docu-ment sur lequel repose le diagnostic de tuber-culose pulmonaire. Lorsque c’est possible,les frottis positifs devraient être confirméspar un deuxième lecteur.
5.5 Enregistrementet communication des résultatsde l’examen microscopique
Une fois que la lecture des frottis est ter-minée et les contrôles nécessaires éventuelsassurés (frottis positif et frottis douteux), lemicroscopiste reporte les résultats définitifssur le registre du laboratoire (les résultatspositifs doivent être inscrits à l’encre rouge)et sur la fiche réponse (partie inférieure duformulaire de Demande d’examen d’expec-toration), il inscrit la date de la lecture du frot-tis et présente le document à la signature duresponsable du laboratoire.
Les formulaires de Demande d’examend’expectoration seront renvoyés au centre detraitement ou au Médecin traitant dans lesdeux jours ouvrables. Si l’expectoration a ététransférée à partir d’une autre unité de santé,le patient recevra une copie du formulairerempli mais l’original sera adressé au centrede traitement. Les résultats ne doivent jamaisêtre remis seulement au patient. Si le patientnéglige de transmettre les résultats au centrede traitement, il se peut qu’il ne soit pas missous traitement.
Après avoir terminé l’examen de chaquelot de prélèvements, le technicien enregistrela date d’examen sur la liste d’envoi. Les cof-frets de transport sont nettoyés au moyend’un chiffon imbibé d’un germicide pour lebacille tuberculeux (phénol à 5 % ou hypo-chlorite de soude à 0,1 %). Le technicienassure le renvoi au centre de santé d’originele plus tôt possible de la liste d’envoi correc-tement remplie et de la boîte de transport des
prélèvements. Attention : les deux solutions(phénol et hypochlorite de soude) sont extrê-mement corrosives ; l’emploi de gants pro-tecteurs est donc impératif.
5.6 Conservation des frottisen vue de l’assurance qualité
Les lames examinées seront conservéesau laboratoire pendant la durée prescrite parle PNT pour permettre la supervision et laréalisation des tests de concordance (voirchapitre 6).
Les lames seront débarrassées de l’huileà immersion avant leur stockage dans desboîtes réservées à cet effet. On déconseilled’enlever l’huile à immersion de la lame enla prélevant par un papier pour lentille car lefrottis pourrait être détaché de la lame et enoutre, l’huile ne serait jamais complètementéliminée. On recommande d’enlever l’huile àimmersion des lames en les trempant dansle xylène (xylol)* et en les séchant avant de lesstocker dans des boites à lames jusqu’à lasupervision suivante. Il y a lieu de conserverles lames positives et les lames négativesdans l’ordre numérique et dans des boites àlames séparées. Les boites de lames rempliesdoivent être fermées et gardées autant quepossible à l’abri de la chaleur et de l’humiditéjusqu’à ce qu’elles fassent l’objet d’un échan-tillonnage pour relecture. Les lames nedevraient être ni séchées ni emmagasinéessous une lumière à UV directe. L’échantil-lonnage et la relecture des lames seront pra-tiqués aussi vite que possible car la conser-vation prolongée des lames dans desconditions climatiques tropicales peut provo-quer un atténuation de la coloration de ZN etentraîner des résultats de contrôle erronés.
84
* Xylène, Réactif ACS Sigma mélangé X 2377 ou sonéquivalent. Un substitut du xylène, plus sur, moinstoxique et moins inflammable est disponible6.
6.1 Définitions
L’assurance qualité de l’examen micro-scopique des expectorations est une compo-sante obligatoire du programme de luttecontre la tuberculose. Elle concerne l’en-semble du processus, depuis le recueil desexpectorations, la préparation du frottis, sacoloration, l’examen microscopique jusqu’àl’enregistrement et la communication durésultat.
Le but des programmes d’assurance qua-lité est d’améliorer l’efficience et la fiabilitédes services de microscopie des frottis. Lestrois composantes principales d’un pro-gramme d’assurance qualité sont donnéesci-dessous.• Contrôle interne de qualité. Le contrôle dequalité est un processus de suivi interne,effectif et systématique qui vise à détecter lafréquence des erreurs et à la comparer auxlimites fixées pour une performance accep-table du test. Il s’agit d’un mécanisme àmettre en place dans tous les laboratoirespour qu’ils puissent au moins valider la com-pétence de leurs services de diagnostic.• Test de compétence. Il est connu égale-ment comme Evaluation Externe de laQualité. Il s’agit d’un programme visant à per-mettre aux laboratoires participants d’appré-cier leurs capacités en comparant leurs résul-tats à ceux obtenus sur les mêmeséchantillons dans d’autres laboratoires duréseau, par exemple les Laboratoires Régio-naux ou Nationaux.• Amélioration de la qualité. L’améliorationde la qualité est un processus par lequel lescomposantes des services de diagnostic parexamen microscopique des frottis sont ana-lysées afin d’examiner les moyens d’élimi-ner de façon permanente les obstacles quis’opposent à leur succès. Le recueil des don-nées, l’analyse des données, l’identificationdes problèmes et des solutions créatives pources problèmes sont les composantes-clé dece processus. Il implique un suivi continuainsi que l’identification des défaillances, sui-vis d’une action corrective pour prévenir laréapparition des erreurs.
6.2 Procédures
Le contrôle de qualité interne concerneplus particulièrement celui de la coloration.Les nouveaux lots de solutions de colorantsdoivent systématiquement être testés. Ceciimplique habituellement la coloration de frot-tis non colorés, mais connus comme positifset négatifs. De plus il est recommandé d’in-clure dans chaque série de colorationsquelques lames non colorées à résultatconnu. En outre, la relecture des lames posi-tives par un autre technicien est hautementsouhaitée : en pratique toutefois, très peu delaboratoires périphériques disposent de deuxmicroscopistes pour la tuberculose. Dans cecas, le médecin responsable du centre doitêtre capable de relire les frottis positif ou dou-teux. Un contrôle du registre du laboratoiredoit être effectué régulièrement par un autreresponsable du centre ou par le médecinpour vérifier que toutes les rubriques prévuesdans le registre sont correctement remplies,qu’il n’y a pas d’erreurs de report des infor-mations et des résultats. Un aspect essentielde l’assurance qualité réside dans l’observa-tion directe des techniciens de laboratoire àtous les stades de leur travail de routine parun superviseur expérimenté.
Evaluation de la Compétence. Il y aquatre méthodes principales pour tester lacompétence pour la microscopie des cra-chats.
• L’envoi de frottis fixés, non colorés à partirdu Laboratoire de Référence vers le labora-toire périphérique permet de contrôler lacoloration, la lecture et l’enregistrement.• L’observation de la qualité de toutes lesétapes de l’examen microscopique des frot-tis d’expectoration lors des visites de super-vision sur le terrain.• L’envoi de frottis colorés et lus au micro-scope depuis le laboratoire périphérique versle Laboratoire de Référence pour relecture.• Le prélèvement d’un échantillon de lamesprovenant de patients enregistrés en lessélectionnant dans le Registre de laTuberculose du District.
85
6. ASSURANCE QUALITÉ DE L’EXAMENMICROSCOPIQUE DES EXPECTORATIONS
Les quatre méthodes ont des avantageset des inconvénients distincts ; il est dès lorsconseillé de les mettre en œuvre selon lesbesoins et les circonstances de chaque PNT.
Dans le contexte qui nous concerne,l’amélioration de la qualité consiste à corrigerles déficiences dans la performance et la lec-ture des bacilloscopies de frottis en prenantdes mesures appropriée pour y remédier. Le
recyclage des techniciens qui font preuved’une performance inférieure à l’optimum estde la responsabilité des laboratoires d’unniveau supérieur dans le réseau, c’est à direles Laboratoires de Référence Régionaux etCentraux. Une discussion plus détaillée desprogrammes d’assurance qualité en micro-biologie de la tuberculose est fournie dansles références 7 et 8.
86
7. BIOSÉCURITÉ AU LABORATOIRE DE MICROSCOPIEPOUR LA TUBERCULOSE
7.1 Aspects généraux
Les techniciens de laboratoire sont res-ponsables de leur propre sécurité et de cellede leurs collaborateurs. La transmission deMycobacterium tuberculosis résulte essen-tiellement de micro-aérosols, c’est à dire debacilles tuberculeux contenus dans les« noyaux de gouttelettes » d’un diamètre de1 à 5 microns, qui sont suffisamment petitspour atteindre les alvéoles pulmonaires, etsuffisamment grands pour adhérer auxparois des alvéoles pulmonaires.
La lutte contre l’infection au laboratoiredoit viser à réduire la production d’aérosols.Une bonne ventilation est nécessaire à la pro-tection de l’équipe du laboratoire contre l’in-fection par les noyaux de gouttelettes véhi-culés par l’air.. Pour assurer aisément laventilation et un courant directionnel entraî-nant les particules véhiculées par l’air à dis-tance du technicien de laboratoire, on doitsituer judicieusement les portes et lesfenêtres (voir Figure 4). Quand on dispose ducourant électrique, on peut utiliser des extra-cteurs pour aspirer l’air du laboratoire.
Les techniciens doivent se laver les mainschaque fois qu’ils entrent au laboratoire ouqu’ils le quittent. Pendant ses prestations, lepersonnel portera des vêtements protecteurs,comme des blouses de laboratoire. Il lesdéposera dans les armoires avant de quitterle laboratoire. L’accès au laboratoire ne seraautorisé qu’à la seule équipe de laboratoire.
Pour l’étalement et la coloration, le portde gants à jeter est souhaitable. Toutefois, ilreprésente une dépense importante pour les
laboratoires périphériques car ils sont sup-posés être jetés après chaque manipulationde laboratoire. Les gants jetables sont prévuspour une seule utilisation mais dans beau-coup de laboratoires, on a tendance à lesréutiliser jusqu’à déchirure. Cette utilisationinadéquate donne une sensation de faussesécurité et conduit à des négligences qui ontsouvent un impact négatif sur les conditionsde biosécurité du laboratoire : les gants conta-minés sont utilisés pour prendre en main oupour faire fonctionner un équipement de labo-ratoire qui dans d’autres conditions ne seraitjamais contaminé. Vu que dans la plupart descirconstances où ce guide sera utilisé, l’emploides gants n’est pas praticable, on recom-mande fortement le trempage des mains dansl’alcool à 70 %, suivi d’un lavage dans unesolution détergente, d’un rinçage à l’eau etd’un séchage au papier.
Le port de masques chirurgicaux conven-tionnels ne réduit pas significativement lerisque d’infection par inhalation d’aérosols. Anouveau, l’accent doit être porté sur la réduc-tion de la production d’aérosols pendant lesmanipulations de laboratoire par l’adoptionet l’application strictes des Bonnes Pratiquesde Laboratoire8.
Il est interdit de manger, de boire et defumer au laboratoire.
7.2 Aspects spécifiques
Le risque de créer des aérosols varieconsidérablement selon les procédés de labo-ratoire considérés :
l Recueil des échantillons
Les expectorations des patients suspectsde tuberculose sont souvent recueillies aulaboratoire lui-même. Cette pratique exposeles techniciens de laboratoire à un risqueélevé de contagion par aérosol et ne devraitdans aucun cas être autorisée. Comme men-tionnées au Chapitre 1, des précautions pourdiminuer ce risque peuvent être prises endemandant au suspect de tuberculose decouvrir sa bouche pendant la toux et en luifaisant produire ses échantillons à l’extérieur,où les aérosols seront dilués et même stéri-lisés par la lumière UV ou la lumière solairedirecte.
l Préparation des frottis
Quoique l’ouverture des crachoirs etl’étalement des expectorations puissent pro-duire des aérosols, ces manipulations com-portent un risque de transmission moindre
que la toux non protégée d’un patient à bacil-loscopie positive. Il y a peu d’arguments pourconclure que la préparation des frottis d’ex-pectoration entraîne un accroissement durisque d’infection tuberculeuse. Toutefois,l’absence de preuve n’est pas une preuved’absence du risque, et les travailleurs delaboratoire doivent être prudents et restervigilants à tout moment.
Un équipement coûteux et sophistiquén’est pas un substitut valable pour une« bonne pratique de laboratoire » en micro-biologie. De plus, les cabinets de biosécuritéexistants sur le marché exigent un entretienannuel important par des experts, ce quientraîne des dépenses rarement prises encompte au moment de l’achat de l’équipe-ment. Les cabinets de biosécurité qui ne sontpas entretenus correctement donnent unefausse impression de sécurité ; il en est demême pour ceux qui sont préparés de façonartisanale. Le modèle proposé dans la pre-mière édition de ce guide s’est avéré impra-
87
Figure 29
88
ticable après vingt années d’expérience sur leterrain dans les pays à faibles revenus. Dansces conditions, il s’avère que les cabinets debiosécurité ne sont pas d’une grande utilitédans les laboratoires périphériques qui selimitent à la seule bacilloscopie des frottis.
l Désinfection, stérilisationet évacuation des produitscontaminés
Après l’examen des frottis, il faut enleverles couvercles de tous les crachoirs utilisés.Les crachoirs utilisés, leurs couvercles et lesapplicateurs sont placés dans une poubellecontenant une solution de phénol à 5 % oud’hypochlorite de soude à 0,5 % où ils sontcomplètement immergés. Ultérieurement,ces produits peuvent être traités à l’autoclave.Si l’on ne dispose pas d’un autoclave, tous lesproduits doivent être brûlés dans un inciné-rateur, dans une fosse à l’air libre ou un fût depétrole (Figure 29). NB : les fumées produitespar la combustion d’une grande quantité decrachoirs en matière plastique sont toxiques.
Au cas où l’on utilise à la fois matériel àusage unique ainsi que des crachoirs en
verre, ces derniers doivent être placés dansun récipient séparé pour y être bouillis etlavés avant réutilisation. D’autres objets,comme les porte-lames, le séchoir et la sur-face de travail seront désinfectés avec unesolution de phénol à 5 % ou d’hypochloritede soude à 0,5 %.
Après avoir subi le contrôle de qualité,les lames positives seront cassées et traitéescomme les autres objets tranchants. Leslames négatives peuvent soit être cassées etjetées, soit, si nécessaire, être nettoyées etréutilisées pour un travail autre que la tuber-culose (par exemple la malaria ou l’hémato-logie).
Les lames dont les frottis sont négatifsdoivent être bouillies pendant une demi-heure dans une solution de savon ou dedétergent (produit pour la vaisselle), lavées àl’eau courante, essuyées avec un linge fin,séchées à l’air, examinées pour confirmerl’absence de griffes, nettoyées au moyen d’untampon d’ouate trempé dans l’alcool etemmagasinées pour réutilisation.
Qu’elles soient négatives ou positives, leslames pour TB ne doivent jamais être réutili-sées pour le travail en TB.
8. GESTION DES PRODUITS
Les programmes doivent budgétiserleurs commandes de manière rationnelle afind’assurer un débit continu de fournitures delaboratoire. La seule base quantifiable pourcette planification est le nombre de patientsenregistrés pour lesquels des examensmicroscopiques ont été effectués. Le nombreet le pourcentage de patients à bacilloscopiepositive peut être déterminé en se basant surle registre du laboratoire.
Si l’on suppose que le taux de positivitédes frottis parmi les cas suspects est de 10 %,que chaque cas suspect de tuberculose exigetrois examens d’expectoration et que chaquecas confirmé de tuberculose à bacilloscopiepositive a trois examens de suivi, le nombrede lames pour microscopie et de crachoirsnécessaires pour chaque cas à bacilloscopiepositive est de :
1 malade positif 3 lames9 malades suspects non positifs 27 lamespour le malade positif,3 examens de contrôle 3 lamessoit pour un cas positif, 33 lameset 33 crachoirs [(1 +9) × 3 + 3 = 33.]
Le calcul pour les commandes est effec-tué à l’aide de la Fiche de commande pour lematériel de laboratoire (Figures 30 et 30 bis) :– le nombre total de patients à bacilloscopiepositive (nouveaux cas ou cas de retraite-ment) enregistrés dans les deux derniersRapport trimestriel sur le dépistage des tuber-culeux est introduit dans la colonne intitulée« Nombre de malades » ;– les réquisitions pour le semestre suivant(A) sont calculées en multipliant le nombre depatients par un facteur prédéterminé basé sur
la supposition que 10 suspects de TB doiventêtre examinés pour chaque cas à bacillosco-pie positive ;– les réquisitions pour le stock de réserve (B)correspondent à deux fois la quantité néces-saire pour 6 mois (A × 2) ;– la quantité de actuellement en stock (C)dans le magasin de district est inscrite (fairel’inventaire physique) ;• la commande totale (D) représente lasomme de la quantité nécessaire pour lesemestre suivant (A) plus la quantité néces-saire pour le stock de réserve (B) moins lestock actuel (C) au moment où le formulairede commande est complété.
Les commandes de réserve correspon-dent aux fournitures nécessaires pour fonc-tionner un an.
Les commandes en matériel de labora-toire sont relativement limitées et pour cetteraison, elles peuvent être faites tous les6 mois plutôt que tous les 3 mois.
Les quantités de fuchsine basique, debleu de méthylène, d’éthanol et de phénolsont calculées pour la méthode de colorationde ZN recommandée par l’UICTMR, en sup-posant que 5 ml de chacune des solutionssont nécessaires pour chaque lame. On sup-pose par ailleurs que deux gouttes ou 0,1 mld’huile sont utilisés pour chaque lame.
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92
Références
1. Collins C H, Grange J M, Yates M D.Organization and practice in tuberculo-sis bacteriology. London : Butterworths,1985.
2. Laboratory Biosafety Manual. 2nd ed.Geneva : WHO, 1993 : pp. 60-61.
3. McDougall A C. An inexpensive slidemarker made from a dental bur and aplastic pen. Lep Rev 1992 ; 63 : 79-80.
4. Smithwick R C. Laboratory manual foracid-fast microscopy. 2nd ed. USDepartment of Health, Education, andWelfare, Public Health Service. Atlanta,GA : Centers for Disease Control,Bacteriology Division, 1976.
5. The Microscope. A Practical Guide. WHOProject : ICP TUB 001. New Delhi, India :WHO Regional Office for South-East Asia,1999.
6. McDougall A C. The use of xylene (xylol)in medical laboratories. Lep Rev. 1989 ;60 : 67.
7. Woods G L, Ridderhof J C. Quality assu-rance in the mycobacteriology labora-tory. In : Clinics in Laboratory Medicine.Philadelphia, PA : W B Saunders, 1996 :Vol. 16, Number 3.
8. Kumari S, Bathia R, Heuck C C. Qualityassurance in bacteriology and immuno-logy. WHO Regional Publication, South-East Asia Series No 28. New Delhi, India :WHO Regional Office for South-East Asia,1998.
Lectures suggérées
1. Bacteriology of tuberculosis. The speci-men. Microscopy examination. Technicalnote no 26. Washington, DC : Pan Ame-rican Health Organization, 1984.
2. Minamikawa M. Laboratory Manual forthe National Tuberculosis Programme ofNepal. National Tuberculosis Centre.JICA/HMG National TB Control Project(II). March 1998.
3. De Kantor I N, Kim S J, Frieden T, LaszloA, Luelmo F, Norval P Y, Rieder H L,Valenzuela P, Weyer K. Laboratory ser-vices in tuberculosis control. WHO GlobalTuberculosis Programme. WHO/TB/98.258. Geneva : WHO, 1998.
4. Manual of norms and technical proce-dures for tuberculosis bacteriology. Part1 Smear microscopy. Technical note 26.Washington, DC : Pan American HealthOrganization, 1984.
5. Manual for Laboratory Technicians.Revised National Tuberculosis ControlProgramme (RNTCP). Nirman Bhavan,New Delhi, India : Central TB Division,Directorate General of Health Services,Ministry of Health and Family Welfare,1997.
6. Module for Laboratory Technicians.Nirman Bhavan, New Delhi, India :Central TB Division, Directorate Generalof Health Services, Ministry of Health andFamily Welfare, 1997.
7. Rieder H L, Chonde T M, Myking H,Urbanczik R, Laszlo A, Kim S J, Van DeunA, Trébucq A. The Public Health ServiceNational Tuberculosis Reference Labo-ratory and the National LaboratoryNetwork. Minimum requirements, roleand operation in a low income country.Paris : IUATLD, 1998.
8. Fujiki A. TB microscopy. Tokyo, Japan :The Research Institute of Tuberculosis,Japan Anti-Tuberculosis Association,Japan International Cooperation Agency,Hachioji International Training Centre,1998.
9. Tuberculosis control : a manual ofmethods and procedures for integratedprograms. Scientific Publication No 498.Washington, DC : Pan American HealthOrganization, 1986.
10. Enarson D A, Rieder H L, Arnadottir T,Trébucq A. Management of tuberculo-sis : a guide for low income countries.5th ed. Paris : IUATLD, 2000.
93
PRÉVENTION DES FAUX POSITIFS EN MICROSCOPIE
• Utiliser des lames neuves
• Utiliser un applicateur neuf pour chaque échantillon
• Utiliser de la fuchsine phéniquée filtrée
• Ecarter les lames les unes des autres pendant la coloration
• Ne pas utiliser de bacs à coloration
• Ne pas laisser la fuchsine phéniquée sécher sur la lame
• Ne pas toucher le frottis avec l’applicateur d’huile à immersion
• Ne pas mettre l’objectif à immersion au contact du frottis
• Identifier complètement et avec précision les crachoirs, les lames et les formulaires du labo-ratoire
• Vérifier si le numéro du formulaire de Demande d’examen d’expectoration correspond à celuidu crachoir avant de communiquer les résultats
• Enregistrer et communiquer les résultats avec précision
CONSÉQUENCES DES « FAUX POSITIFS » EN MICROSCOPIE
• Traitements non nécessaires – Gaspillage de médicaments
• Perte de confiance dans le PNT
PRÉVENTION DES FAUX NÉGATIFS EN MICROSCOPIE
• S’assurer que l’échantillon contient des expectorations et pas seulement de la salive
• S’assurer qu’il y a au moins 3 ml d’expectoration
• Sélectionner des particules visqueuses, muco-purulentes pour l’étalement
• Les frottis ne doivent être ni trop épais ni trop minces
• Colorer les frottis pendant 5 minutes
• Décolorer les frottis pendant 3 minutes
• Contre-colorer pendant 1 minute
• Lire l’ensemble des 100 champs avant de déclarer la lame négative
• Des BAAR bien colorés doivent apparaître sur les frottis de contrôle, connus comme positifs
• Identifier avec soin les crachoirs, les lames et les formulaires de laboratoire
• Collationner le numéro indiqué sur le formulaire de Demande d’examen d’expectoration etcelui du crachoir
• Enregistrer et communiquer les résultats avec précision.
CONSÉQUENCES DES « FAUX NÉGATIFS » EN MICROSCOPIE
• Le patient n’est pas mis sous traitement, ce qui entraîne une souffrance individuelle, la dis-sémination de la tuberculose et un risque élevé de décès.
• On peut négliger de prolonger la phase intensive du traitement, d’où un traitement inadéquat.
• Perte de confiance dans le PNT
ANNEXE 1
94
ANNEXE 2
ENTRETIEN DU MICROSCOPE
Le microscope est l’outil principal des services de diagnostic de la TB du PNT. Unemanipulation correcte et l’entretien du microscope par l’équipe du laboratoire sontessentiels pour prolonger sa durée d’utilisation. Il y a lieu de respecter les donnéessuivantes :
• Le microscope non utilisé doit être entreposé dans un environnement sec, libre detoute poussière ou vibration.
• Eviter d’exposer le microscope à la lumière solaire directe, aux moisissures et à l’hu-midité.
• Placer un gel de silice dans le coffret de conservation du microscope ; reconstituerle gel de silice par chauffage lorsqu’il devient rose.
• Nettoyer le microscope avant et après usage au moyen d’un papier pour lentille.
• Essuyer la surface de la lentille à immersion avec un morceau d’ouate propre avantet après usage. Ne pas utiliser l’alcool pour nettoyer les lentilles.
• La lentille à immersion dans l’huile ne devrait pas venir au contact du frottis
• N’utiliser que la vis micrométrique en cas d’emploi de lentille à immersion.
95
ANNEXE 3
GUIDE POUR LA SOLUTION DES PROBLÈMES DE MICROSCOPIE
PROBLÈME CAUSES POSSIBLES SOLUTION
Champ sombreCondenseur trop bas
Diaphragme fermé
Relever le condenseur
Ouvrir le diaphragme
L’image à faiblegrossissementn’est pas claire
Huile sur l’objectif
Poussière sur la surfacesupérieure de l’objectif
Objectif endommagé
Nettoyer l’objectif
Dévisser l’objectifet le nettoyer
Remplacer l’objectif
Image trouble
Le côté « frottis »de la lame est en dessous
Présence d’une bulle d’airdans l’huile
Huile de mauvaise qualité
Objectif sale
Retourner la lame
Déplacer l’objectifà immersion d’un côté
à l’autre
Changer d’huile
Nettoyer l’objectif
Dans le champ,ombres sombres
se déplaçant avec l’oculairequand on le fait tourner
Oculaire sale
Oculaire ou objectif contaminépar des champignons
Griffes sur la surfacede l’oculaire
Nettoyer l’oculaire
Le remplacement de l’oculairepeut être nécessaire
Le remplacement de l’oculairepeut être nécessaire
97
COMPOGRAVURE
IMPRESSION, BROCHAGE
I M P R I M E R I E C H I R A T
42540 ST-JUST-LA-PENDUE
OCTOBRE 2001
DÉPÔT LÉGAL2001 N° 3145
IMPRIMÉ EN FRANCE
FORMULAIRE 1PROGRAMME NATIONAL DE LUTTE CONTRE LA TUBERCULOSE
DEMANDE D’EXAMEN D’EXPECTORATION
Nom de l’Unité de Traitement Date
Nom du malade
Age Sexe (cocher la case) : M [ ] F [ ]
Adresse précise
Raison de l’examen (cocher la case) : Diagnostic [ ] Examen de suivi [ ]
Signature du responsable du recueil des crachats
Le formulaire dûment rempli doit être rapidement transmis à l’Unité de Traitement
Date Examen effectué par (Signature)
* caractéristiques de l’expectoration à l’œil nu (muco-purulent, traces de sang, salive)
RÉSULTATS (à compléter au laboratoire)
No d’ordre du laboratoire
+ + ++ ++1-9négAspect*Echantillon
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Date
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PROGRAMME NATIONAL DE LUTTE CONTRE LA TUBERCULOSE
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* Nouveau cas : HRZE = 8 mois ou STH = 12 mois* Retraitement : SHRZE
** Nouveau : malade qui n’a jamais reçu de traitement antitu-berculeux pour plus d’un mois
** Rechute : malade qui a été déclaré guéri, mais qui est denouveau frottis positifs
Echec : frottis positifs 5 mois ou plus après le début de la chimiothérapieREP : reprise de traitement après abandon, revient frottis positifsTransféré : malade inscrit sur le registre d’un autre centre et transféré dans ce centre
REGISTRE DE LA TUBERCULOSE FORMULAIRE 4
Résultat de l’examen d’expectoration (en fonction du nombre de mois de traitement) Date du résultat du traitement***
ObservationsRésultat des frottis :
négatifs(guéri)
non faits(traitement
terminé)
positifs(échec)
Décédé Perdude vue Transféré
Avant-traitement
Résultat No lame/Date Résultat No lame/
Date Résultat No lame/Date Résultat No lame/
Date Résultat No lame/Date
2 mois 5 mois 7 mois 11 mois
Année
*** Frottis négatifs : (guéri) 2 frottis négatifs dont l’un au cours du dernier mois de traitement*** Frottis non faits : (traitement terminé) pas de résultat d’examen bacilloscopique au cours du dernier mois de traitement*** Frottis positifs : (échec) frottis positifs 5 mois ou plus après début de traitement (confirmé par un deuxième frottis)
Décédé : malade décédé en cours de traitement, quelle que soit la cause du décèsPerdu de vue : malade qui n’est pas venu chercher ses médicaments pendant 2 mois consécutifsTransféré : malade qui a été transféré dans la juridiction d’un autre centre
FORMULAIRE 5PROGRAMME NATIONAL DE LUTTE CONTRE LA TUBERCULOSER
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