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I-MET-115 Phosphates HPLC-CI v04 2011-10-13 1/12
Agence fédérale
pour la Sécurité
de la Chaîne alimentaire
Laboratoire de Liège
MET-LFSAL-115
Détermination de la teneur en phosphates dans les sodas par HPLC-CI
Version 04
Date d’application 2011-10-13
Rédaction par : Isabelle Monisse; Expert technique
Révision par : Fabian ETIENNE-THEWISSEN ; Responsable technique;
2011-10-14
Autorisation de publication par : Marianne AUBRY; Responsable qualité ; 2011-
Gestion et localisation de la
version valide :
LFSAL : disque local M:\Qualité\ Méthode\MET-LFSAL-
115 Phosphates.doc
Destinataires : Collaborateurs de la section phytopharmacie
Mots clefs : Phosphates HPLC-CI
LAB23-I-MET-115 Phosphates HPLC-CI v04 2011-10-13 2/12
Aperçu des modifications
Révision
par/date*
Motif de la révision Partie du
texte/portée de la
révision
I. Monisse /
N. Dupuche
10-03-2009
Première version
N. Dupuche
05-04-2011
Commentaire Solution
d’étalonnage
I.Monisse
11/08/2011
Adaptation nouveau template - Commentaires 1°page – solution
d’étalonnage-
contrôle 2° et
3°ligne
I.Monisse
13/10/2011
Suppression du L1 Caractéristiques de
performances –
Solution
d’étalonnage-
injection des
solutions
* L’écart entre la date actuelle et celle de la dernière révision ne peut pas dépasser 5 ans.
Les modifications par rapport à la version précédente sont reprises en rouge.
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DETERMINATION DE LA TENEUR EN PHOSPHATES DANS LES SODAS PAR HPLC-CI
TABLE DES MATIERES
1 OBJECTIF .......................................................................................................................... 4
2 CHAMP D’APPLICATION ................................................................................................ 4
3 DOCUMENTS LÉGAUX ET NORMATIFS ....................................................................... 4
4 DÉFINITIONS ET ABRÉVIATIONS ................................................................................. 4
5 PRINCIPE .......................................................................................................................... 4
6 CARACTÉRISTIQUES DE PERFORMANCE ................................................................... 4
7 CONSIGNES DE SÉCURITÉ ET MESURES SPÉCIFIQUES ............................................ 5
8 RÉACTIFS ET ADDITIFS ................................................................................................. 5
8.1 REACTIFS .................................................................................................................................... 5 8.2 SOLUTIONS ................................................................................................................................. 5
8.2.1. Phase mobile ..................................................................................................................... 6 8.2.2. Solutions d'étalonnage ..................................................................................................... 6 8.2.3. Solutions de contrôle ........................................................................................................ 7
9 APPAREILS ....................................................................................................................... 7
10 METHODE ......................................................................................................................... 7
10.1 CONDITIONS CHROMATOGRAPHIQUES .................................................................................... 7 10.2 PREPARATION DE L’ECHANTILLON ......................................................................................... 8 10.3 PREPARATION DE L’ECHANTILLON DOPE ................................................................................ 8 10.4 INJECTION DES SOLUTIONS ..................................................................................................... 8
11 CONTRÔLE DE LA QUALITÉ ......................................................................................... 8
11.1 VÉRIFICATION DE LA STABILITÉ DU SYSTÈME CHROMATOGRAPHIQUE ................................... 8 11.2 IDENTIFICATION DES PICS ....................................................................................................... 9 11.3 CONTRÔLE DU BLANC ............................................................................................................ 9 11.4 CONTRÔLE DE LA DROITE D’ÉTALONNAGE ............................................................................. 9 11.5 RENDEMENT DES ÉCHANTILLONS DE CONTRÔLE .................................................................... 9 11.6 CONTRÔLES SECONDE ET TROISIÈME LIGNES ........................................................................ 10
12 CALCUL ET RAPPORTAGE .......................................................................................... 10
13 RÉFÉRENCE AUX PROCÉDURES, INSTRUCTIONS, DOCUMENTS, FORMULAIRES
OU LISTES Y AFFÉRENTS .................................................................................................... 11
13.1 PROCÉDURES ........................................................................................................................ 11 13.2 FORMULAIRES ...................................................................................................................... 11
14 ANNEXES ........................................................................................................................ 11
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DETERMINATION DE LA TENEUR EN PHOSPHATES DANS LES SODAS PAR HPLC-CI
1 Objectif
La méthode vise à vérifier la conformité de la teneur en phosphates de sodas à la limite légale de 700 mg/l en P2O5.
2 Champ d’application
Cette méthode s’applique à la détermination de la teneur en phosphates dans les sodas par HPLC-CI.
3 Documents légaux et normatifs
Méthode développée par la firme METHROM pour l’AFSCA
4 Définitions et abréviations
Pas d'application.
5 Principe
Les phosphates sont dissous ou extraits à l’eau et déterminés par HPLC – CI sur une colonne échangeuse d’anions et détection conductimétrique après suppression chimique et par étalonnage externe.
6 Caractéristiques de performance
Nombre de séries : 3
Nombre d'essais par série 6
Niveau 500 mg/l
Concentration moyenne mesurée 516 mg/l
RSD série 1 1,1 %
RSD série 2 0,4 %
RSD série 3 0,4 %
RSD répétabilité 0,74 %
RSD de reproductibilité 1,46 %
Incertitude de mesure basée sur la fidélité intermédiaire 3 %
Incertitude de mesure basée sur la fidélité intermédiaire et le biais 7,83 %
LOD : 5 50
mg PO4/l
LOQ : 10 100
mg PO4/l
Sur l’échantillon, les LOD et LOQ correspondent respectivement à 7.5 75 et 15 150 mg P2O5/l.
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7 Consignes de sécurité et mesures spécifiques
Suivre les instructions de sécurité spécifiées sur les fiches de sécurité des réactifs et dans le logbook de l'appareil.
Toutes les manipulations de solvants se font sous hotte. L’utilisation de gant spécifique est requise si nécessaire.
8 Réactifs et additifs
8.1 Réactifs
8.1.1. Eau ultra pure. 8.1.2. Sodium ammonium phosphate tétrahydraté (NaNH4HPO4.4H2O) certifié à 1000 µg
de PO4 3- /ml.
8.1.3. Sodium ammonium phosphate tétrahydraté standard (NaNH4HPO4.4H2O) certifié à 10 000 µg de PO4
3- /ml.
8.1.4. Hydroxyde de sodium p.a 8.1.5. Acide sulfurique H2 SO4 99 – 100 % p.a. 8.1.6. Carbonate de sodium (Na2CO3) p.a. 8.2 Solutions
Solution standard de phosphates certifiée à 1000 µg de PO4 3-
/ml. Cette solution doit être conservée au frais à l’abri de la lumière. Elle doit être ouverte le moins longtemps possible pour éviter toute évaporation ;
Solution standard de phosphates certifiée à 10.000 µg de PO4 3-
/ml. Cette solution doit être conservée au frais à l’abri de la lumière. Elle doit être ouverte le moins longtemps possible pour éviter toute évaporation
Solution de régénération du suppresseur : H2 SO4 100 mM : pour 1 litre de solution, diluer 9,8 g d’ H2 SO4 (8.1.5) dans un ballon jaugé de 1 litre, compléter au trait avec de l’eau ultra pure. Homogénéiser.
Chromatogramme d’un
échantillon dopé à 468 mgPO4/l
Chromatogramme du L1 (1
mgPO4/l) de la courbe
d’étalonnage
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Solution de rinçage du suppresseur et de dilution : Eau ultra pure.
Solution de rinçage de l’injecteur : CH3OH à 20% et eau ultra pure.
8.2.1. Phase mobile
3 mM Na2CO3– 25mM NaOH
Dissoudre 318 mg de Na2CO3 (8.1.6) et 1000 mg de NaOH (8.1.4) dans environ 800 ml d’eau (8.1.1) dans un ballon jaugé de 1 litre. Placer au bain à ultrasons pendant quelques minutes. Mettre au trait avec de l’eau (8.1.1). Homogénéiser puis dégazer 10 minutes au bain à ultrasons.
8.2.2. Solutions d'étalonnage
La solution Sodium ammonium phosphate tétrahydraté certifiée (NaNH4HPO4.4H2O) de concentration 10 000 µg/ml de PO43- sert à préparer les différentes solutions d’étalonnage. Toutes les solutions décrites ci-dessous doivent être effectuées avec la même micropipette.
8.2.2.1. Solution à 100 mg/l de PO4
Prélever à la micropipette 1000 µl de la solution standard de phosphate certifiée à 10 000 µg/ml de PO4
3- dans un ballon jaugé de 100 ml. Porter au volume avec de l’eau ultra pure.
Homogénéiser.
8.2.2.2. Solution à 75 mg/l de PO4
Prélever à la micropipette 750 µl de la solution standard de phosphate certifiée à 10 000 µg/ml de PO4
3- dans un ballon jaugé de 100 ml. Porter au volume avec de l’eau ultra pure.
Homogénéiser.
8.2.2.3. Solution à 50 mg/l de PO4
Prélever à la micropipette 500 µl de la solution standard de phosphate certifiée à 10 000 µg/ml de PO4
3- dans un ballon jaugé de 100 ml. Porter au volume avec de l’eau ultra pure.
Homogénéiser.
8.2.2.4. Solution à 25 mg/l de PO4
Prélever à la micropipette 250 µl de la solution standard de phosphate certifiée à 10 000 µg/ml de PO4
3- dans un ballon jaugé de 100 ml. Porter au volume avec de l’eau ultra pure.
Homogénéiser.
8.2.2.5. Solution à 10 mg/l de PO4
Prélever à la micropipette 100 µl de la solution standard de phosphate certifiée à 10 000 µg/ml de PO4
3- dans un ballon jaugé de 100 ml. Porter au volume avec de l’eau ultra pure.
Homogénéiser.
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8.2.2.6. Solution à 1 mg/l de PO4
Prélever à la micropipette 1000 µl de la solution à 100 mg/l de PO4 dans un ballon jaugé de 100 ml. Porter au volume avec de l’eau ultra pure. Homogénéiser.
8.2.3. Solutions de contrôle
Toutes ces solutions sont préparées à chaque série d’analyses
8.2.3.1 Solution à 20 mg/l de PO4
Diluer 1 ml de Solution standard de phosphates certifiée à 1000 µg de PO4
3- /ml dans un
flacon jaugé de 50 ml. Porter au volume avec de l’eau ultra pure. Homogénéiser. 8.2.3.2 Solution à 50 mg/l de PO4 Diluer 1 ml de Solution standard de phosphates certifiée à 1000 µg de PO4
3- /ml dans un
flacon jaugé de 20 ml. Porter au volume avec de l’eau ultra pure. Homogénéiser.
9 Appareils 9.1 Chaîne HPLC dont toutes les parties en contact avec les réactifs sont en PEEK et
équipées de :
Une pompe à débit variable
Une colonne analytique échangeuse d’anions type METROHM Metrosep®
A Supp 15,4.0 mm i.d. x 150mm, 5µm ou équivalent
Une colonne de garde Metrosep®
A Supp 15 Guard, 4 mm ou équivalent
Un détecteur conductimétrique
Un suppresseur chimique (régénéré avec du H2SO4, 100 mM et rincé à l’eau ultra pure
Un échantillonneur automatique
Un four thermostatisé pour la colonne
Un système de pilotage de la chaîne et d’acquisition et de gestion des données 9.2 Balance analytique 9.3 Micropipettes 9.4 Bain à ultrasons 9.5 Filtre en nylon de type chromafil®, 0,2 µm (ou 0,45 µm si 0,2 µm trop fin) ou
équivalent 9.6 Seringue porte-filtre 9.7 Verrerie classique de laboratoire
10 Méthode
10.1 Conditions chromatographiques Phase mobile : 3 mM Na2CO3 – 25mM NaOH dans l’eau Débit : 0,8 ml/min Volume d’injection : 20 µl Température du four : 45 °C Temps de rétention : ± 7 min Durée de l’analyse :10 min pour toutes les injections
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10.2 Préparation de l’échantillon Remplir le formulaire P/R-001 lors de chaque préparation d’échantillon.
En parallèle à la préparation des échantillons, préparer un blanc en suivant la même procédure sans prise d’essai.
Dégazer un peu d’échantillon dans un bécher.
Mettre 10 ml d’échantillon dégazé dans un jaugé de 100 ml .Porter au volume avec de l’eau ultra pure. Homogénéiser et filtrer sur 0,2 µm (ou 0,45 µm si filtration impossible sur 0,2 µm) dans une fiole d’injection. 10.3 Préparation de l’échantillon dopé Remplir le formulaire P/R-001 lors de chaque préparation d’échantillon.
Mettre 10 ml d’échantillon dégazé dans un jaugé de 200 ml pour un cola ou de 100 ml pour une limonade . Ajouter 5 ml de la solution de standard de phosphates certifiée à 1000 µg de PO4
3-/ml ou 500 µl de la solution de standard de phosphates certifiée à 10 000 µg de PO4
3-
/ml. Porter au volume avec de l’eau ultra pure. Homogénéiser et filtrer sur 0,2 µm (ou 0,45 µm si filtration impossible sur 0,2 µm) dans une fiole d’injection. 10.4 Injection des solutions Un maximum de 10 échantillons seront injectés entre deux contrôles, le nombre sera adapté en fonction de la série : ex pour 14 échantillons, les contrôles seront placés après 7 échantillons
Lors de l’encodage de la liste d’injection des échantillons (Determination series), indiquer la dilution de l’échantillon ; en général 10 pour l’échantillon, 1 pour les solutions de contrôle et d’étalonnage et 20 pour les dopés cola).
Séquence d’injection : Blanc : 1x Solution d’étalonnage à 1 mg/l : 1x Solution d’étalonnage à 10 mg/l : 1x … Solution d’étalonnage à 100 mg/l : 1x Solution de contrôle I : 1x Solution de contrôle II : 1x Solution de l’échantillon 1 : 1x Solution de l’échantillon 2 : 1x … Solution de l’échantillon 10 : 1x Solution de contrôle I : 1x Solution de contrôle II : 1x Blanc : 1x
11 Contrôle de la qualité
11.1 Vérification de la stabilité du système chromatographique
Laisser le chromatographe fonctionner avec la phase mobile jusqu’à stabilisation de la ligne de base avant de démarrer les analyses. Effectuer au moins trois step afin de rincer chaque ligne du suppresseur. L’idéal est d’avoir une ligne de base inférieure à 2 µS/cm.
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11.2 Identification des pics Identifier les phosphates de la solution d’échantillon en comparant leur temps de rétention avec ceux des solutions de contrôle l’encadrant. Les temps de rétention ne peuvent différer de plus de 5 % (paramètre introduit dans le logiciel pour la reconnaissance des pics). 11.3 Contrôle du blanc Afin de vérifier que la quantité de phosphates apportée par le matériel utilisé pour la préparation des échantillons est négligeable par rapport aux quantités déterminées dans ceux-ci, la valeur du blanc (calculée avec un facteur de dilution de 1) ne devra pas dépasser la moitié du plus petit level de calibration soit 0,5 mg/l PO4
3. . Sinon, recommencer la
préparation du blanc et des solutions d’échantillons et réinjecter les en les encadrant avec les solutions de contrôle comme décrit dans la séquence d’injections.
Ce paramètre est vérifié via le formulaire LAB23 F543 PR11. 11.4 Contrôle de la droite d’étalonnage La concentration trouvée pour les solutions de contrôle ne peut différer de plus de 10 % de la concentration théorique. On ne peut supprimer le premier (L1) et le dernier level (L6 5) d’une droite d’étalonnage.
Sinon, recommencer la préparation des solutions de contrôle et/ou d’étalonnage et réinjecter la séquence (toutes les solutions peuvent être réinjectées dans les 24 heures suivant leur préparation si elles ont été conservées dans un réfrigérateur en flacon fermé). Ces paramètres sont vérifiés via le formulaire LAB23 F543 PR11. 11.5 Rendement des échantillons de contrôle
Le taux de récupération obtenu pour l’échantillon dopé devrait idéalement être compris entre 80 et 110 %, ceci est un fourchette de départ qui sera affinée sur base de l’exploitation de la carte de contrôle (une par type de matrice).
Une carte de contrôle est construite sur les rendements des dopés placés dans chaque série d’analyses. Si n est le nombre de rendements disponibles sur la carte de contrôle, la fourchette de rendement acceptable est calculée pour n = 8, puis revue pour n = 15 et n = 30, et enfin fixée pour n = 50.
Si le rendement obtenu est en dehors la fourchette acceptable, recommencer la préparation de la solution échantillon y compris le dopé et les réinjecter en les encadrant avec les solutions de contrôle comme décrit dans la séquence d’injections. Taux de récupération :
CT
100CA(%)
où : CT = concentration théorique dans l’échantillon dopé (en mg PO4 / L )
CA = concentration trouvée analytiquement dans l’échantillon dopé (en mg PO4 / L )
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VE
VDCDVECECT
où : CE = concentration trouvée dans l’échantillon non dopé (en mg PO4 / L)
VE = volume de l’échantillon à doper (en L)
CD = concentration de la solution de dopage (en mg PO4 / L)
VD = volume de la solution de dopage utilisé (en L) Le rendement obtenu pour un échantillon dopé est calculé via le formulaire LAB23 F543 PR11 et contrôlé via le formulaire P/R-018. 11.6 Contrôles seconde et troisième lignes Des contrôles seconde et troisième ligne seront réalisés selon la procédure LAB 23 P 020
Gestion des contrôles qualité.
12 Calcul et rapportage
Etablir la courbe d’étalonnage selon la procédure décrite dans le Logbook de l’appareil.
La courbe d’étalonnage est du type ax2 + bx + c et doit être établie avec un minimum de cinq
niveaux d'étalonnage (le plus bas et le plus haut niveau ne peuvent être éliminés). Pour les solutions d’échantillons, si la réponse est hors de la gamme d’étalonnage, prélever une aliquote de la solution d’échantillon préparée en 10.2 et la diluer de manière à obtenir une concentration finale se trouvant dans les limites de la gamme d’étalonnage (Ne pas oublier d’encoder la nouvelle dilution dans la Determination series). Injecter alors les nouvelles dilutions en les encadrant avec les solutions d’étalonnage et de contrôle comme décrit dans la séquence d’injections. Lors du traitement de la séquence, le logiciel calcule automatiquement la concentration en phosphates (PO4
3-) dans la solution d’échantillon en tenant compte de la dilution encodée
(voir Logbook de l’appareil). La teneur en phosphates dans l’échantillon est ensuite calculée comme ci-dessous : Teneur en phosphates (en mg PO4
3- / kg d’échantillon) = C x V
où : M
C = concentration calculée par le logiciel (en mg PO4 3-
/ l)
V = volume (en l) utilisé pour l’extraction
M = masse d’échantillon analysé (en kg)
Remplir ensuite le fichier excel LAB23 F543 PR11 afin de déterminer la teneur finale dans chaque échantillon et de vérifier les différents indicateurs de prestations. Les résultats sont exprimés par la suite en mg de P2O5 / l étant donné que la norme est exprimée dans cette unité.
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Formaliser les résultats en remplissant le « Rapport d’exécution » via le formulaire LAB23 F543 PR11. Délai d’analyse prévu : 10 jours ouvrables.
13 Référence aux procédures, instructions, documents, formulaires ou listes y afférents
13.1 Procédures
P 018
P 020
Création et suivi des cartes de contrôle shewart
Gestion des contrôles qualité
13.2 Formulaires
P/R 001 Feuille de pesées
LAB23 F543 PR11 Fichier excel « Dosage des phosphates » reprenant :
- le rapport d’exécution
- les données des solutions de calibration + données des solutions
de contrôle
- les données et résultats de teneur en phosphates des
échantillons, des dopés + taux de récupération pour un échantillon
dopé
P/R 018 Fichier des rendements des échantillons dopés
« rendements des échantillons de 1°ligne »
14 Annexes
Annexe 1 Flow chart « Dosage des phosphates dans les sodas »
LAB23-I-MET-115 Phosphates HPLC-CI v04 2011-10-13 12/12
Annexe 1 : Flow chart « Dosage des phosphates dans les sodas »
Prélever environ 100 ml.
Dégazer environ 10’ au bain à US.
Prélever précisément 10 ml. Amener à 100 ml avec de l’eau déminéralisée
SI ECHANTILLON DOPE : Ajouter précisément 5 ml de NaNH4HPO4.4H2O au 10 ml d’échantillon. Amener à 200 ml avec de l’eau déminéralisée si c’est un cola. Amener à 100 ml avec de l’eau déminéralisée si c’est une limonade.
Filtrer sur 0,2 µm ou
0,45 µm.
HPLC- CI