Dominique Ledoux Université Paris 13 2011-2012

DESEQUILIBRE DE L'ENVIRONNEMENT MATRICIEL DANS LES PROCESSUS TUMORAUX :

ROLES DES ENZYMES MATRICIELLES

PROGRESSION TUMORALE ET ANGIOGENESE

Exemple d’un carcinome

Cellule

Lame basale (épithéliales, endothéliales)

Compartiment extracellulaire

MATRICE EXTRACELLULAIRE (MEC)

Enzymes Matricielles

Membranaires

Associées

extracellulaires

MEC

Modulation (+/-) prolifération cellulaire migration cellulaire invasion cellulaire

Dégradation de la MEC

Libération-Activation pro-/ anti-mitogènes pro-/ anti-angiogéniques pro-/ anti-apoptotiques pro-/ anti-inflammatoires

+

CANCER

Déséquilibre

Enzymes / Inhibiteurs

Inhibiteurs

Equilibre enzymes-inhibiteurs

CONSTITUANTS DE LA MATRICE EXTRACELLULAIRE

COLLAGENES type IV, XVIII (lame basale)

ELASTINE

PROTEOGLYCANNES Protéines associées à des glycosaminoglycannes (GAG, chaînes glucosidiques)

GLYCOPROTEINES ADHESIVES Fibronectine, Laminine

PLASMINOGENE Protéine ubiquitaire présente dans TOUS les compartiments extracellulaires

LES ENZYMES MATRICIELLES

LES PROTEASES clivent les protéines 4 classes de protéases - serine : plasmine (Lys, Arg), urokinase (uPA) - aspartyl - cysteine - métallo : métalloprotéases matricielles (MMP)

L'HEPARANASE clive les glycosaminoglycannes

ETUDE DE TROIS SYSTEMES ENZYMATIQUES

LE SYSTEME UROKINASE (uPA) - PLASMINE

LES METALLOPROTEASES MATRICIELLES (MMP)

L'HEPARANASE

uPAR : uPA récepteur - Pro-uPA : urokinase inactive - uPA : urokinase active

LE SYSTEME uPA-PLASMINE

D'après Wang (2001) Med Res Rev, 21, 146-170

+++

Plasmine

clivage clivage

Effets physio(patho)logiques

Activation d'effecteurs

directs

indirects

ACTION PROPRE (signalisation intracellulaire)

STIMULATION - Adhésion - Migration - prolifération

Sérine protéases MMPs

clivage

LE SYSTEME uPA-PLASMINE Description (suite)

EFFETS PHYSIO(PATHO)LOGIQUES DE LA PLASMINE sérine protéase qui hydrolyse les composants de la MEC : - Fibronectine, laminine, - collagènes dénaturés Hydrolyse Activation de nombreux effecteurs - TGFb inactif TGFb actif - MMP inactives MMP actives - libération de FGF et VEGF à partir de la MEC facteurs "biodisponibles" - plasminogène "inactif" fragment K1-5, K5

Modulation (±) de la progression tumorale

dégradation de la MEC

SYSTEME uPA-PLASMINE ET CANCER Évidences expérimentales de son implication

Forte corrélation entre niveaux d'expression uPA et uPAR et - le potentiel métastatique de la tumeur - le faible taux de survie des patients

uPAR et uPA sur-exprimés dans de nombreuses tumeurs d'origines diverses

Modèles tumeurs humaines

L'uPA est un excellent marqueur pronostique du cancer du sein

Modèles cellulaires et animaux

Inhibition de l'activité uPA (inhibiteurs, Ig) Inhibition de l'expression uPA et uPAR Inhibe la formation de métastases

uPAR et uPA sur-exprimés dans de nombreuses cellules tumorales

Injection cellules tumorales dans souris invalidées pour le gène uPA (souris KO) tumeurs moins agressives

uPA/uPAR

plasmine

Action propre

cancer ? clivage

Design of Novel and Selective Inhibitors of Urokinase-type Plasminogen Activator with

Improved Pharmacokinetic Properties for Use as Antimetastatic Agents*

Andrea Schweinitz‡, Torsten Steinmetzer‡§, Ingo J. Banke¶ , Matthias J. E. Arlt¶ , Anne Stu¨ rzebecher‡, Oliver

Schuster, Andreas Geissler, Helmut Giersiefen‡, Ewa Zeslawska**‡‡, Uwe Jacob**, Achim Kruger¶ , and Jorg

Sturzebecher§§

THE JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY Vol. 279, No. 32, Issue of August 6, pp. 33613–33622, 2004

Inhibiteur de l'activité enzymatique de l'uPA démontrée in vitro

Modèle souris : - Cellules HT1080 injectées (i.v.) chez la souris nude. Formation d’une tumeur primaire puis de métastases dans le foie cellules tumorales très invasives - Injection de l’inhibiteur (3mg/kg/jour) 1 jour avant l'injection des cellules HT1080 et pendant toute la durée de l’étude (22 jours) - Analyse des foyers métastatiques de cellules HT1080 à la surface du foie

Effet de l’inhibiteur de l’uPA sur les métastases hépatiques

- Cellules HT1080 "marquées" par gène LacZ : cellules transfectées de façon stable par un plasmide portant le gène LacZ (b-galactosidase) -Foie prélevé 22 jours après l’inoculation puis coloré avec X-gal (substrat b-gal) -Foyers métastatiques bleus comptés à la surface

22 jours

-Souris traitées : 100% des souris vivantes jusqu'au jour 61 avec t50 = 117 jours

- Souris contrôles : 100% des souris décédées en 43 jours avec t50 = 37 jours

Effet de l’inhibiteur de l’uPA sur la survie

L'HEPARANASE

Protéo-héparanes sulfates (HSPG):

appartiennent à la famille des Protéoglycannes Protéoglycanne : protéine + chaînes glucosidiques chaînes glucosidiques = héparanes sulfates (glycosaminoglycannes, GAG)

b-D-endoglucuronidase clive/dégrade spécifiquement les protéo-héparanes sulfates (HSPG)

Heparanase clive/dégrade les chaînes héparanes sulfates

Pollard & Earnshaw (2002) Cell Biology, Elsevier Science (USA), pp 497

Chaîne protéique

GAG

Heparane Sulfate

HS

HS

KS Principaux Protéoglycannes

Protéo-héparanes sulfates (HSPG) et héparanase

D'après Simizu et al. (2004) Cancer Sci, 95, 553-558

Dégradation des HS : Libération de facteurs de croissance associées aux HS

Stimulation de la prolifération, de la survie et de la migration des cellules endothéliales et tumorales

Protéo-héparanes sulfates : rôle de "réservoir" de facteurs de croissance dans la MEC

Fibroblast Growth Factors (FGFs)

Vascular Endothelial Growth Factor (VEGF)

Transforming Growth Factor b (TGFb)

Transforming Growth Factor a (TGFa)

Heparin-binding Epidermal Growth Factor (HB-EGF))

Facteurs de croissance mitogènes, anti-apoptotiques, pro-angiogéniques

surexpression des ARNm héparanase dans des tumeurs humaines d’origine diverses concentration élevée d’héparanase (protéine) dans le sérum de malades corrélation positive entre niveaux d’expression héparanase (ARNm) et : - indice vasculaire de la tumeur - potentiel métastatique de la tumeur corrélation inverse entre niveaux d’expression héparanase (ARNm) et indice de survie des patients

HEPARANASE ET CANCER Evidences expérimentales de son implication

Mesure de l'angiogenèse par imagerie par résonance magnétique Fonctionnalité et maturation mesurées par inhalation mélange air-CO2

Fonctionnalité des vaisseaux

Maturation des vaisseaux

H-hpa : cellules MCF7 contenant le plasmide-Héparanase surexpression de l'héparanase mock : cellules MCF7 contenant le plasmide vide

Modèle : injection sous-cutanée cellules tumorales MCF-7 dans souris nude

tumeur

LES METALLOPROTEASES MATRICIELLES (MMP)

Principales caractéristiques Famille de plus de 25 membres chez les mammifères Enzymes Zinc et calcium dépendantes Dégradent la quasi totalité des protéines de la MEC et d'autres protéines non MEC

Synthétisées par un grand nombre de cellules dont EC et cellules tumorales Protéines synthétisées sous forme inactive (pro-MMP) puis activées par des enzymes

MMP sécrétées et MMP membranaires

Considéré comme les enzymes les plus impliquées dans les différentes étapes d’invasion et de progression tumorale

surexpression des MMPs (ARNm, protéines) dans des tumeurs humaines d’origine diverses concentration élevée des MMP (protéine) dans le sérum de malades

Cellules tumorales injectées dans souris déficientes (KO) en MMP-2, MMP-9, MT1-MMP - processus angiogénique déficient - processus invasif réduit corrélation positive entre niveaux d’expression MMP (ARNm) et : - indice vasculaire de la tumeur - potentiel métastatique de la tumeur corrélation inverse entre niveaux d’expression MMP (ARNm) et indice de survie des patients

MMPs ET CANCER Evidences expérimentales de leur implication

Les MMP sont synthétisés par de nombreuses cellules au sein de la tumeur

Egeblad & Werb (2002) Nature Rev, 2, 163-176

Implication des MMP dans la progression tumorale

1) MMP régulent la prolifération des cellules tumorales

Effets pro-mitotiques : libération/activation de facteurs mitogènes Effets anti-mitotiques

-

activation du TGF-b latent (inhibiteur prolif cellules tumorales)

D'après Egeblad & Werb (2002) Nature Rev, 2, 163-176

activation IGF par clivage IGF-BP activation du TGF-a membranaire inactif libération fragment "actif" de fibronectine. interaction avec intégrine (aVb6) prolifération

Progression tumorale +

Cellules tumorales

2) MMP régulent l’angiogenèse

Effets pro-angiogéniques

Progression tumorale + -

Effets anti-angiogéniques

plasminogene angiostatin collagène XVIII endostatin collagène IV tumstatin inactivation de uPAR (EC) : plasmine et donc de la migration des EC

D'après Egeblad & Werb (2002) Nature Rev, 2, 163-176

Cellules tumorales

Cellules endothéliales

libération de facteurs de croissance pro-angiogéniques (FGF, VEGF) par dégradation des HSPG (en association avec héparanase) prolifération cellules EC Fragment collagène IV interaction intégrine avb3 prolifération activation du TGFb prolifération cellules EC

FGF-2

VEGF

Protéases extracellulaires (MMP, uPA/uPAR) participent à l'ensemble des processus impliqués dans la progression tumorale prolifération/survie cellules tumorales mobilité des cellules tumorales (invasion, migration) angiogenèse

Développement de nombreux inhibiteurs anti-MMP ou anti-uPA qui ont montré leur efficacité in vivo chez la souris nude quid chez l'homme ?

BILAN

INHIBITEURS D'ENZYMES MATRICIELLES: UTILISATION EN PHASES CLINIQUES

Agent Mechanism of action Trial Company

Marimastat Synthetic inhibitor

of MMPs

Phase II in pancreas phase III in non small

cell lung, breast cancers

British Biotech

Phase III in non small cell lung cancer

Bay 12 - 9566 Synthetic inhibitor of

MMPs

Bayer

MMI270 (CGS27023A)

Heparanase

inhibitor

Phase I, colorectal cancer

Novartis

PI-88

Synthetic MMPs inhibitor

Phase II in liver,

melanoma, prostate Progen

Synthetic inhibitor

of uPA WX-UK1

Phase II in cancer

with metastasis Wilex

Résultats des essais cliniques depuis une dizaine d'années

efficacité très faible quel que soit le stade de la maladie dans le cas des inhibiteurs anti-MMP, observation d'un effet délétère : "accélération de la progression tumorale" !!!!!!!!

BILAN

Ré-évaluation très récente du rôle de certaines protéases (MMPs) rôle anti-tumoral

Pro-tumoral Anti-tumoral

Certaines MMP (MMP-3, MMP-9, MMP-11, MMP-19) ont une double action opposée

Rôle anti-tumoral des protéases extra- et péri-cellulaire

Kallikreins (serine protéase EC) stimule l'activation du TGFb

MMP3 stimule l'apoptose des cellules tumorales

MMP9 MMP12 angiostatin tumstatin endostatin

MMP8 sécrétée par neutrophiles agent anti-inflammatoire