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Actualités biologiques

Détection des entérobactéries productrices de bêta-lactamases à spectre étendu par biologie moléculaire : avantages, limites

A. Dubouix, N. MartyLaboratoire de Bactériologie-Hygiène, CHU Rangueil, TSA 50032, 31059 Toulouse cedex 9.Correspondance : A. DUBOUIX, voir adresse ci-dessus. e-mail : [email protected]

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Détection des entérobactéries productrices de bêta-lactamases à spectre étendu par biologie moléculaire : avantages, limites

A. Dubouix, N. Marty

Les bêta-lactamases à spectre élargi ou BLSE sont des enzymes produites par les bacilles àGram-négatif hydrolysant les céphalosporines de troisième génération (C3G) et l’aztréonammais restant généralement inhibées in vitro par l’acide clavulanique, le tazobactam et le sulbac-tam. Réel problème de Santé Publique, elles sont impliquées dans de nombreuses épidémies etpeuvent être reliées à une morbidité et une mortalité accrues. Décrites pour la première fois en1983, elles sont codées par des gènes d’origine plasmidique que l’on va retrouver plus particu-lièrement chez Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae mais aussi Enterobacter aerogenes. Ellesdérivent par mutations de bêta-lactamases connues depuis longtemps comme TEM-1 ouencore SHV-2 et se caractérisent par une modification du site actif de l’enzyme entraînant unemodulation de l’activité de la bêta-lactamase pouvant s’exprimer de façon variable vis-à-vis desdifférentes C3G. Cependant, bien que les CMI des C3G vis-à-vis des micro-organismes produc-teurs de BLSE soient souvent plus élevées que celles des organismes non producteurs de BLSE,ces valeurs ne sont pas toujours au-delà des valeurs critiques, ce qui peut entraîner un défautde détection par les techniques classiques basées sur la mise en évidence de la synergie. Dansce contexte, se sont développées différentes techniques de biologie moléculaire visant à s’affran-chir des différences phénotypiques pouvant exister.

Le but de cet article est de passer en revue les méthodes développées à l’heure actuelle et defaire le point sur leurs caractéristiques mais aussi leurs limites.

Mots-clés : Bêta-lactamases à spectre étendu (BLSE), Épidémiologie des bactéries multi-résistantes, Biologie moléculaire.

Molecular detection of extended-spectrum beta-lactamases producing enterobacteria: advantages and limits


Extended-spectrum beta-lactamases or ESBL are enzymes produced by gram-negativebacilli responsible for hydrolysis of third-generation cephalosporins and aztreonam. How-ever, their susceptibility in vitro to clavulanic acid, tazobactam and sulbactam generallyremains unaffected. Considered as resistance threat, they have been involved in many out-breaks and can be related to enhanced morbidity and mortality rates. Described for thefirst time in 1983, they are encoded by plasmids more frequently isolated from Escherichiacoli, Klebsiella pneumoniae or Enterobacter aerogenes. They are derived from TEM-1 orSHV-2 beta-lactamases by mutations responsible for modifications of the active site.Though, the beta-lactamase affinity toward its substrates is modulated and the enzyme dis-plays variable activity against the different third-generation cephalosporins. However, evenif cephalosporins MICs against ESBL-producer bacteria are generally higher compared tonon-ESBL rods, these values are not always superior to critical values (breakpoints), whichcould lead to detection impairment when using synergy-based techniques. In this context,

Depuis la découverte dans les années1960 des premières bêta-lactamasesplasmidiques TEM conférant une résis-tance aux amino-pénicillines, la recher-che pharmaceutique s’est efforcée decréer des antibiotiques résistants à l’hy-drolyse engendrée par ce type d’enzy-mes. Les céphalosporines contenant ungroupement oxy-imino ont ainsi repré-senté un développement majeur danscette optique. En effet, la présence de cegroupement associé à un noyau 2-amino-5-thiazolyl (on le retrouve dansla ceftriaxone, le céfotaxime et la ceftazi-dime) entraîne une relative stabilité vis-à-vis des bêta-lactamases TEM-1 ouSHV-1 fréquemment produites par lesentérobactéries comme Escherichia coliet Klebsiella pneumoniae. Cependant,quelques années après la mise sur lemarché de tels antibiotiques, certainsbacilles à Gram-négatif comme K. pneu-moniae ont développé de nouvellesbêta-lactamases résultant de mutationsdes enzymes TEM et SHV. Décritespour la première fois en 1983 [1], ellesont largement contribué à l’augmenta-tion des résistances aux céphalosporinesde 3e génération (C3G) parmi les enté-robactéries au cours des dernières an-nées car elles possèdent la propriétéd’inactiver les antibiotiques de la familledes bêtalactamines contenant un grou-pement oxy-imino comme les céphalos-porines de troisième génération (C3G)et l’aztréonam [2, 3]. En revanche, ellessont généralement inhibées in vitro parl’acide clavulanique, le tazobactam et lesulbactam [4]. Les gènes responsablesde ce phénotype de résistance sont por-tés par des plasmides dont le caractère

Introduction

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Détection des enterobacteries productrices de bêta-lactamases à spectre étendu par biologie moléculaire avantages, limites


fortement transférable peut être res-ponsable d’une diffusion clonale ausein de l’espèce ainsi qu’entre différen-tes espèces. De plus, ils sont égalementfréquemment porteurs de détermi-nants conférant une rés istance àd’autres classes d’antibiotiques commeles aminosides [5, 6]. De ce fait, les en-térobactéries productrices de BLSEsont considérées comme des bactériesmulti-résistantes et représentent unréel problème de Santé Publique de parla morbidité, la mortalité et le surcoûtqu’elles entraînent ainsi que par leurdissémination : celle-ci est favoriséepar leur détection insuffisante par cer-taines techniques, conduisant à unesous-estimation de celles-ci [7]. Parmiles facteurs de risque d’acquisition lesplus fréquemment associés, on re-trouve la durée d’hospitalisation, la sé-vérité de la pathologie, l’admission enservice de réanimation, la pose de dis-positifs invasifs ainsi que l’administra-tion préalable de céphalosporines de3e génération [8, 9]. En termes de pré-vention de l’émergence et de la diffu-sion des BLSE, le renforcement des me-

sures d’hygiène [10], la limitation del’usage des oxy-imino céphalosporines[11] et le remplacement de celles-ci parde l’imipénème ou encore par l’associa-tion pipéracilline-tazobactam [12, 13]semblent s’avérer des mesures efficaces.

Le retentissement des conditions del’isolement de BLSE est double. D’unepart, le manque de sensibilité in vitro s’ac-compagne d’échecs thérapeutiques invivo, avec un réel impact sur la morbidité,la mortalité ainsi que sur la durée et lecoût du séjour des patients infectés [2, 3,14-16]. De nombreux travaux ont ainsimontré des taux de mortalité plus élevéschez les patients pour lesquels une BLSEavait été isolée par rapport à un groupede patients infectés par des entérobacté-ries non productrices de BLSE [17, 18].D’autre part, au plan épidémiologique,les principaux sites à partir desquels sontisolées les BLSE sont les urines et les sé-crétions respiratoires [7], ce qui peut faci-liter leur dissémination comme en témoi-gnent de nombreuses é tudesépidémiologiques relatant l’importancedes BLSE dans les épidémies hospitalières[19].

Tableau 1Évolution du nombre total d’entérobactéries productrices de BLSE et de leur répartition selonl’espèce (%) (données CCLIN- Paris Nord, enquête BMR 2003).Evolution as a function of time of numbers of ESBL Enterobacteriaceae.

Espèces 1998 1999 2000 2001 2002

(n = 470) (n = 478) (n = 476) (n = 495) (n = 458)

Enterobacter aerogenes 58,7 61,1 56,5 54,9 55

Klebsiella pneumoniae 19,8 17,8 22,4 18 16,1

Escherichia coli 6,4 6,9 6,3 8,9 11,3

Proteus mirabilis 2,6 4 4,4 6,7 5,7

Enterobacter cloacae 2,6 2,1 3,6 4,9 4,1

Citrobacter koseri 1,9 1,5 1,5 1,8 1,3

Citrobacter freundii 3,2 1,7 1,5 1,2 2,1

Klebsiella oxytoca 1,5 1,5 1,1 0,8 2,4

Providencia 1,3 1,1 1,3 1,8 0,7

Autres 2,1 2,5 1,5 0,6 0,7

Le but de ce travail est de faire le pointsur les techniques moléculaires actuelle-ment disponibles et de mettre en avantleurs avantages, leurs limites ainsi queles circonstances dans lesquelles ellessont le plus appropriées. En effet, seul leséquençage permet de caractériser pré-cisément la nature de l’enzyme en l’ab-sence de données préalables. En revan-che, en situation épidémique, il estfréquent qu’un seul clone soit impliqué,ce qui permet de mettre en œuvre desméthodes de détection simplifiées quenous développerons plus précisémentpar la suite.

La prévalence de ce type de bactéries va-rie non seulement entre les espèces bac-tériennes, les pays mais aussi entre lesstructures de soins. Ainsi, le tableau 1montre l’évolution du nombre total desentérobactéries productrices de BLSE etleur répartition selon les espèces en-tre 1998 et 2002 (données CCLIN-ParisNord). En France, une étude rétrospec-tive incluant 14 laboratoires et parue en2002 [20] montre que les taux de préva-lence dans les principales espèces impli-quées : K. pneumoniae et Enterobacteraerogenes, ont évolué respectivement de18 % à 9 % et de 32 % à 54 % au coursdes dernières années [20], ce dernier ré-sultat étant peut-être lié à la diffusionclonale d’une souche d’E. aerogenesBLSE comme l’ont décrit Bosi et al. [21].

Il est ainsi intéressant de noter quecertaines BLSE peuvent être plus fré-quemment retrouvées dans certaines zo-nes géographiques où elles sont respon-sables d’épidémies. En effet, durant lesdernières années de nombreux épisodesnon reliés entre eux ont pu être attribuésà des BLSE productrices de TEM-10 auxEtats-Unis [22] alors que dans la mêmepériode ce type d’BLSE n’était quefaiblement retrouvé en Europe [23, 24].

Comme nous l’avons évoqué précédem-ment, la plupart des BLSE dérivent parmutations de béta-lactamases connuesdepuis longtemps comme TEM-1,TEM-2 ou encore SHV-2 [2, 25, 26]. Àl’heure actuelle, on recense plus de100 enzymes de la famille TEM et plus

Prévalence des bactéries BLSE

Support génétique de la résistance

a great deal of effort was devoted into developing molecular methods which could avoidphenotypic variations.The aim of this article was to review the different techniques presently available and to pointout their relative advantages and limits.

Key words: Extended-spectrum beta-lactamases (ESBL), Epidemiology of multiresistant organisms,Molecular biology.

Antibiotiques 2004 ; 6 : 193-201 © Masson, Paris, 2004

ANTIBIOTIQUES, 2004 ; 6 : 193-201© MASSON, PARIS, 2004

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de 25 enzymes de la famille SHV. Onrencontre également d’autres famillesd’enzymes comme les CTX-M décritesau début des années 1990.

Chez les familles TEM et SHV, seul unpetit nombre de mutations ponctuellesau sein du gène est responsable du phé-notype BLSE. Celles-ci vont entraînerune modification du site actif de l’en-zyme aboutissant à une modulation del’activité de la bêta-lactamase pouvants’exprimer de façon variable selon letype d’enzyme vis-à-vis des différentescéphalosporines de 3e génération alorsque les carbapénèmes (imipénème, mé-ropénème et ertapénème) conserventgénéralement leur activité. Chez lesCTX-M, en revanche, la capacité à hydro-lyser les C3G est intrinsèque et n’est pasla résultante de mutations d’une en-

zyme ancestrale [27]. Au niveau phéno-typique, l’action de cette famille d’enzy-mes s’exerce essentiellement vis-à-vis ducéfotaxime alors que les CMI de la cefta-zidime sont peu affectées.

TEM-1 est la bêta-lactamase la plus fré-quemment rencontrée chez les entéro-bactéries et peut être responsable de larésistance à l’ampicilline chez plus de90 % des E. coli [25]. Comme en témoi-gne la figure 1, la substitution d’acidesaminés en un nombre restreint de posi-tions va être responsable de l’apparitionde nouvelles enzymes entraînant unphénotype BLSE. En effet, la combinai-son de ces changements d’acides aminésentraîne diverses modifications de la

structure de la bêta-lactamase quidevient ainsi capable d’hydrolyser lesoxy-imino céphalosporines comme lecéfotaxime ou la ceftazidime. Certainessubstitutions d’acides aminés sont parti-culièrement importantes, comme parexemple la modification du glutamateen lysine en position 104, de l’arginineen sérine ou histidine en position 164,ou encore de la glycine en sérine en po-sition 238 et du glutamate en sérine enposition 240. De plus, ces mutationssont responsables d’une modificationdu point isolélectrique, ce qui peutconstituer un moyen de les détecter.

La bêta-lactamase SHV-1 est fréquem-ment rencontrée chez K. pneumoniae et

TEM

SHV

FIG. 1. — Les enzymes de la famille TEM : les acides aminés présents au niveau de TEM-1 (bande grise) peuvent faire l’objet d’une ou plusieursmutations (acides aminés soulignés) à l’origine des autres TEM (listées à la verticale). * TEM-2 n’est pas une BLSE mais a été incluse dans lafigure en tant que dérivée de TEM -1. (d’après [2]). **Tem-58 et -60 contiennent des mutations d’acides aminés que l’on peut retrouveraussi bien chez les BLSE que chez les TRI (TEM Résistant aux Inhibiteurs).

FIG. 1. — Enzymes of TEM family.

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est responsable de plus de 20 % des résis-tances plasmidiques à l’ampicilline chezcette espèce [28]. Chez de nombreusessouches de K. pneumoniae, le gène blaSHVest intégré au chromosome bactérien[25]. Bien que l’on suppose que le gènecodant pour SHV-1 fasse partie d’untransposon, ceci n’a jamais été formelle-ment démontré [29]. Contrairement auxbêta-lactamases de type TEM, il existe re-lativement peu de mutants de SHVcomme le montre la figure 2. De plus, lenombre des mutations ponctuelles estégalement beaucoup plus réduit. En effet,la plupart des variants sont caractériséspar la présence d’une glycine en position238 au lieu d’une sérine. Certains va-riants dérivés de SHV-5 possèdent égale-ment un glutamate à la place d’une lysineen position 240. Il est intéressant de no-ter que ces deux mutations se rappro-chent de celles observées dans la familleTEM. Le résidu sérine en position 238 estcapital pour l’hydrolyse active de la cefta-zidime alors que le résidu lysine l’estpour le céfotaxime [29].

De nouvelles enzymes non-TEM et non-SHV responsables d’un phénotype BLSEont été décrites ces dernières années.

Parmi celles-ci, la famille CTX-M décritedès 1989 hydrolyse préférentiellement lecéfotaxime. Ces enzymes ne sont pas trèsproches des TEM et SHV mais partagentcependant 40 % d’homologie avec cesdernières [30]. Il semblerait que les CTX-M dérivent par transfert horizontal et mu-tation des bêta-lactamases chromosomi-ques AmpC de Klyuvera georgiana possé-dant 99 % d’homologie avec cette familled’enzymes [31]. À l’heure actuelle, plus de20 CTX-M ont été décrites et sont retrou-vées préférentiellement chez Salmonellatyphimurium, E. coli et K. pneumoniae. LesCTX-M peuvent être divisées en 4 grou-pes selon leur séquence protéique commele montre le tableau 2. Au niveau phéno-typique, on observe une synergie entrel’acide clavulanique, le céfotaxime et l’az-tréonam alors que la sensibilité à la cefta-zidime ne semble pas affectée [32]. Enoutre, le tazobactam présente un effet in-hibiteur 10 fois supérieur à celui de l’acideclavulanique [33].

Depuis de nombreuses années, différen-tes techniques ont été développées dans

le but de favoriser la détection des BLSEau laboratoire. Les principales techni-ques sont basées sur la déterminationdes CMI du céfotaxime ou de la ceftazi-dime, ou encore sur la mise en évidenced’une synergie entre un inhibiteur debéta-lactamases comme l’acide clavula-nique et la ceftazidime et/ou l’aztréo-nam (indicateurs les plus sensibles)comme le préconisent les recommanda-tions du CA-SFM et du NCCLS. Cepen-dant, une étude récente a estimé à envi-ron 33 % le taux de BLSE non détectéesen Europe par les méthodes classiques[34]. En effet, bien que les CMI des C3Gvis-à-vis des micro-organismes BLSEsoient souvent plus élevées que cellesdes organismes non producteurs deBLSE, ces valeurs ne sont pas toujourssupérieures aux valeurs critiques, ce quipeut entraîner un défaut de détectionpar les techniques classiques. De plus,toutes les BLSE n’expriment pas lemême phénotype. Ainsi, les souchesproductrices exprimant SHV-6 ou -8n’expriment qu’une faible résistance à laceftazidime. En revanche, les souchesexprimant SHV-2, -2a ou -3 sont forte-ment résistantes à la ceftriaxone etcéfotaxime alors que la résistance à laceftazidime reste modeste. Quant auxsouches productrices de SHV-4, -5, -9,

CTX-M

FIG. 2. — Les enzymes de la famille SHV : les acides aminés présents au niveau de SHV-1 (bande grise) peuvent faire l’objet de mutations(acides aminés soulignés) à l’origine des autres TEM (listées à la verticale). * SHV-11 n’est pas une BLSE mais a été incluse dans la figure entant que dérivée de SHV-1. (d’après [2]).

FIG. 2. — Enzymes of SHV family.

Différents phénotypes de résistance et difficulté de détection


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-10 et -12, elles présentent les phénotypesde résistance les plus élevés à toutes lesC3G. Dans cette optique, Tenover et al.ont montré que plus de 30 % de souchesinitialement étiquetées sensibles auxcéphalosporines étaient en fait produc-trices de BLSE [35]. Ce problème de dé-tection est accru chez les souches por-t e u s e s d ’ a u t r e s m é c a n i s m e s d erésistance comme la production d’uncéphalosporinase inductible ou la modi-fication de porines responsables d’uneimperméabilité [36-38]. De plus, onconnaît également l’importance del’« effet inoculum » par le biais duquelles valeurs des CMI augmentent parallè-lement à la quantité de bactéries présen-tes [39, 40] et qui se manifeste aussi bienin vitro qu’in vivo comme en témoi-gnent des modèles animaux d’infectionsintra-abdominales ou d’endocardites[41-44]

Comme nous venons de le développer, ladétection des souches productrices deBLSE par des techniques uniquementphénotypiques peut se heurter à des diffi-cultés, ce qui a conduit au cours des der-nières années au développement de diffé-rentes techniques de biologie moléculairevisant à rechercher directement la pré-sence du support génétique au sein dessouches isolées. Alors que certaines tech-niques comme le séquençage permettentla mise en évidence de nouvelles enzy-mes, d’autres s’appliquent plus volontiersà l’identification d’un clone caractérisédans un contexte épidémique (PCR,SSCP, PCR en temps réel…). Ce carac-tère est donc particulièrement importantdans le choix de la technique à mettre enœuvre, tout comme la durée nécessairequi varie selon la méthode utilisée.

SONDES D’ADN

Une des premières techniques de détec-tion des BLSE a été basée sur la recher-che de séquences complémentaires enutilisant des sondes d’ADN spécifiquesdes gènes TEM et SHV. Ce genre detechnique a, à l’heure actuelle, une va-leur historique mais semble relative-ment limitée en terme d’utilisation aulaboratoire. En effet, de nombreux va-riants de TEM et SHV ont été cités de-puis la description de cette technique, cequi multiplie le nombre de sondes àmettre en œuvre. De plus, il sembleraitque la méthode ne permette pas tou-jours de faire la différence entre lesBLSE et les entérobactéries non produc-trices de BLSE et qu’il existe des difficul-tés à distinguer les variants de TEM etSHV [45-47].

OLIGOTYPING

La première méthode de détection desbêta-lactamases par oligotyping a étédécrite à la fin des années 1980 parOuellette et al. et permettait de détecterTEM-1 et SHV-2 [48]. Cette techniquemettait en œuvre des sondes oligonu-cléotidiques choisies de façon à détecterles zones de mutations par hybridation.Quelques années plus tard, Mabilat etCourvalin ont développé d’autres son-des oligonucléotidiques pouvant êtremarquées soit avec un radioisotope, soitavec des nucléotides biotinylés [49, 50].Les auteurs ont ainsi pu étendre la mé-thode à la détection de 6 autres variantsdu gène blaTEM. De manière intéres-sante, de nouveaux variants de TEM ontété mis en évidence grâce à cette techni-que. Cependant, étant donné le nombrede variants de TEM existant à l’heureactuelle, cette technique semble relative-ment lourde à mettre en œuvre du faitde la nécessité d’une sonde spécifique de

Les techniques de détection moléculaire

Tableau 2Les 4 groupes correspondant aux enzymes de la famille CTX-M.Enzymes of the CTX-M family.

GROUPE CTX-M ENZYMES

CTX-M1 TX-M1, -3, -10, -11, -12, -15

CTX-M2 CTX-M2, -4, -5, -6, -7, -20

CTX-M8 CTX-M8

CTX-M9 CTX-M9, -13, -16, -14, -15, -17, -19, -21

chaque type d’enzyme. Cette techniquecomme la précédente permet d’obtenirun résultat en 48 h alors que la PCR per-met un gain de temps avec des résultatsen 24 h.

PCR

Une des méthodes moléculaires les plussensibles et faciles repose sur l’amplifi-cation de chaque famille d’enzymes pardes couples d’amorces spécifiques. Cesamorces peuvent être choisies aprèsanalyse du génome disponible dans desbases de données comme GENBANK(http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/in-dex.html). Les oligonucléotides sont gé-néralement choisis de façon à s’hybrideravec des régions relativement conser-vées. Cependant ce type de méthodepose un problème si elle n’est pas asso-ciée à une analyse complémentaire carelle ne permet pas de faire la distinctionentre les différents variants de TEM etSHV et de par là même, ne permet pas ladistinction entre les enzymes responsa-ble d’un phénotype BLSE ou non-BLSE[51-53]. Il est donc intéressant de cou-pler l’amplification génique à certainestechniques (séquençage, RFLP et SSCP)que nous allons développer dans la suitede cet article.

FIG. 3. — Analyse des enzymes de la familleSHV par PCR-SSCP : Les différents profils demigration correspondent à différentes enzy-mes. Les profils A, B, C, D, E et F ont pu êtrerespectivement reliés à la présence de SHV-2, SHV-5, SHV-4, SHV-3, SHV-11 et SHV-1.(d’après [56]).

FIG. 3. — Analysis os SHV ezymes by meansof PCR-SSCP.

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PCR-SSCP

La SSCP ou Single Strand Conformatio-nal Polymorphism est une méthodepermettant la détection de polymor-phismes génétiques par différence desprofils de migration de fragments préa-lablement amplifiés. Comme le montrela figure 3, cette méthode est particuliè-rement intéressante pour effectuer unscreening relativement rapide (24 h de-

plus par rapport à une PCR), en parti-culier d’éventuels mutants de SHV,mais ne peut en aucun cas apporter desinformations sur le type de BLSE. Deplus, le choix du fragment amplifié peutêtre un facteur limitant car, comme lemontrent Chanawong et al., cette tech-nique ne permet pas de distinguer SHV-1, -3, -2a et -11 dans les conditions choi-sies par les auteurs [54]. En effet, les4 profils de migration obtenus sont to-

FIG. 4. — Analyse des enzymes de la famille SHV par PCR-RFLP : Les fragments amplifiés ontété digérés par l’enzyme de restriction DdeI. Les pistes A, B, C, D, E, F, G et H correspondentrespectivement à la présence de SHV-5, SHV-12, SHV-1, SHV-2a, SHV-3, SHV-4 et SHV-5,alors que la piste I est occupée par le marqueur de poids moléculaire. (d’après [56]).

FIG. 4. — Analysis of SHV enzymes by means of PCR-RFLP.

talement identiques car ces variants sontcaractérisés par la présence d’une gluta-mine à la place d’une leucine en posi-tion 35 qui ne se trouve pas incluse dansle fragment choisi pour être analysé. Deplus, les bactéries exprimant SHV-5 et -12 ne peuvent pas être distinguées pourdes raisons analogues. Dans le but d’affi-ner cette technique, il est donc conseilléde la coupler à d’autres techniquescomme la PCR-RFLP (figure 4). En re-vanche, elle permet de détecter de nou-veaux variants de SHV ou de mettre enévidence la présence concomitante deplusieurs types de SHV dans une mêmesouche bactérienne [55].

PCR-RFLP

Une autre approche réside dans l’utilisa-tion d’enzymes de restriction après am-plification génique des séquences. Cettetechnique a essentiellement été appli-quée à la détection des BLSE de la fa-mille TEM au début des années 1990[56]. Dans ce type de test, les amplifiatssont digérés par plusieurs enzymes derestriction (Sau3aI, HhaI, MseI) avantd’être soumis à une électrophorèse. Decette manière, Arlet et al. ont été àmême de détecter la présence de plus de20 enzymes de la famille TEM et ont no-tamment permis de mettre en évidenceTEM-29 [56].

Quelques années plus tard, la mé-thode a ensuite été appliquée à la détec-tion des mutants de la famille SHV.

FIG. 5. — PCR en temps réel : Courbes de fluorescence F3 générée par le fluorophore correspondant aux mutations des codons 238 et 240.

FIG. 5. — Real time — PCR.


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Nüesch-Inderbinen et al. ont ainsi cou-plé l’amplification de séquences du gè-nes blaSHV à la digestion par NheI per-mettant la détection de la mutation enposition 238 la plus fréquente chez lesBLSE et responsable de la substitutiond’une glycine en sérine au niveau du siteactif de l’enzyme [54]. Bien que cettetechnique ne puisse déterminer avecprécision le type de variant de SHV im-pliqué, elle présente cependant l’avan-tage majeur de permettre un screeningrelativement rapide d’éventuelles BLSE,on peut ainsi obtenir un résultat en en-viron 48 h après l’isolement. Différentsauteurs ont par la suite évalué cettetechnique par rapport à la détection parE-test (céphalosporine de troisième gé-nération additionnée ou non d’acideclavulanique) et ont pu montrer queseulement 52 % des souches BLSEétaient détectées par ce dernier alors quela PCR-RFLP permettait une détectionsystématique [57]. Cependant, la mé-thode peut être limitée pour détectercertaines mutations. Ainsi SHV-3, -4, -7et -13 sont difficilement identifiablespar PCR-RFLP [55].

Une modification de cette techniquepeut consister en l’insertion d’un sitede restriction (RSI-PCR). Comme l’onrécemment montré Chanawong et al.,cette méthode s’applique à la détec-tion des mutants SHV de manière ra-pide et simple [58]. Elle est basée surl’utilisation d’amorces à l’intérieurdesquelles il existe 1 à 3 bases noncomplémentaires au niveau de l’extré-mité 3’ de façon à modifier le site derestriction de différentes enzymes(SspI, HinfI, PstI, BsrI et NruI). Il estainsi possible de détecter certainsmutants dont la détection n’est pastoujours évidente comme SHV-6, -8, -14, -18 à -23 ainsi que SHV-25 à -27.Ainsi la RSI-PCR permet d’étendre ladétection à 27 variants grâce à la tech-nique de RFLP.

Une dernière possibilité consiste àcoupler la PCR-RFLP à un screeningpréalable par la technique de SSCP quenous avons décrite précédemment.Cette méthode, développée au début desannées 2000, permet de détecter desmutations ponctuelles portant sur dessites bien définis du gène blaSHV [59].Dans ce test, des fragments de 475 pbsont générés par une amplification fai-sant intervenir des amorces internes à la

séquence codant pour le gène blaSHV.Les fragments sont ensuite soumis à unedigestion par PstI, puis dénaturés. Uneélectrophorèse sur gel de polyacryla-mide à 20 % complète l’analyse. Decette façon, les gènes codant pour SHV-1, -2, -3, -4, -5 et -7 peuvent être détec-tés. De plus, Chanawong et al. ont mon-tré que si l’on combine les techniques dePCR-SSCP et PCR-RFLP, on peutdétecter jusqu’à 17 variants de SHV. Ce-pendant, SHV-2a ne peut pas être dis-tingué de SHV-2, tout comme SHV-15de SHV-5 [54].

LIGASE CHAIN REACTION

Cette méthode est essentiellement ap-pliquée à la détection des gènes SHV[60]. La Ligase Chain Reaction ou LCRpermet la discrimination de séquencesd’ADN différant par une seule paire debases grâce à l’utilisation d’une ligasethermostable et d’amorces composéesde 4 oligonucléotides complémentairesde la séquence cible et s’hybridant lesunes à côté des autres. Une seule diffé-rence de base au niveau de la jonctionentre les nucléotides entraînera un dé-faut de ligation se traduisant par une ab-sence d’amplification. Dans ce type detest, l’ADN cible contenant le gèneblaSHV est dénaturé dans un thermocy-cleur et hybridé avec des oligonucléo-tides biotinylés pouvant détecter desmutations présentes en 4 positions. Laproduction de la LCR est détectée parune réaction enzymatique faisant inter-venir la NADPH-phosphatase alcaline.Cette méthode permet de détecter jusqu’à7 variants en 24 h.

PCR EN TEMPS RÉEL

Cette technique en plein essor au niveaudu diagnostic bactériologique a été ap-pliquée à la détection des mutants deSHV au début des années 2000 par Ran-dbegger et al. [61] (figure 5). Elle fait in-tervenir des sondes oligonucléotidiquesmarquées par un fluorophore permet-tant l’analyse des courbes de fusion desamplifiats en temps réel sur un LightCy-cler®. Les auteurs ont ainsi appliquécette technique à la détection de muta-tions présentes au niveau de 3 codonsmajeurs (en position 179, 238 et 240) dugène blaSHV au cours d’une seule etmême réaction. L’avantage majeur decette technique réside dans sa simplicité

et sa rapidité. En effet, il est ainsi possi-ble d’obtenir des résultats en moinsd’une heure. Pour le moment, elle nes’adresse qu’à la détection des mutantsSHV mais pourra être adaptée d’unepart à la recherche de mutants nouvelle-ment décrits dans cette famille ainsiqu’à la détection des variants TEM né-cessitant le design des amorces spécifi-ques de mutations recherchées. Cepen-dant, elle ne s’adresse à l’heure actuellequ’aux laboratoires possédant un appa-reillage spécifique.

SÉQUENÇAGE

Le séquençage reste la technique dechoix pour la détection des BLSE. Bienque réservée à des laboratoires équipésd’un appareillage adéquat, cette mé-thode permet par comparaison avec lesséquences obtenues de bases de don-nées (GENBANK, CLUSTAL W) de dé-tecter simultanément toutes les BLSEen environ 24 h sans disposer de sondesspécifiques de chaque mutation. Dansle passé, certains résultats plus oumoins variables pouvaient être attri-bués à la technique de détection miseen oeuvre [62]. En effet, il est possibleque la variabilité de séquence observéepour certains variants SHV soit reliée àla difficulté d’interprétation des autora-diogrammes plutôt qu’à de véritablesvariations de séquences, phénomèneduquel on s’affranchit avec les nou-veaux analyseurs.

MINISÉQUENÇAGE

Une variante très simplifiée de la tech-nique précédente a été développée en2001 par Howard et al. Elle consiste àréaliser un mini-séquençage basé sur lechangement du premier nucléotide[63]. Cette méthode a été décrite pourla mise en évidence de mutations del’angiotensinogène [64], du CFTR [65],ou encore de l’ADN mitochondrial[66]. Elle se base sur l’hybridationd’une amorce immédiatement après lesite susceptible d’être muté et l’identifi-cation du nucléotide de la base incor-porée. L’avantage de cette technique estqu’elle peut être réalisée en micro-plaques et peut être facilement automa-tisée. Cependant, à l’heure actuelle, ellen’a été développée que pour la détec-tion des variants SHV.

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Parmi les différentes techniques quenous avons décrites précédemmentcertaines présentent un intérêt histori-que alors que d’autres sont réellementenvisageables au laboratoire. Un desproblèmes majeurs que l’on doit seposer face à la mise en route d’une dé-tection moléculaire est la diversité dessupports génétiques (plus de 150 en-zymes répertoriées dans les différentesfamilles) pouvant être à l’origine desphénotypes observés. Un autre point àconsidérer est également l’angle souslequel on se place. Ainsi, dans une dé-marche épidémiologique, le caractèreclonal des BLSE est un élément à pren-dre en compte dans l’investigationd’une épidémie, ce qui peut conduireà la mise en œuvre de méthodes sim-plifiées du fait du faible nombre d’en-zymes potentiellement impliquées.Dans cette optique, la PCR en tempsréel semble présenter des avantagescertains en particulier en terme de ra-pidité de rendu de résultat et sera pro-bablement développée dans les annéesà venir. Cependant, tous les laboratoi-res ne sont pas équipés de l’appa-reillage adéquat ce qui peut amenerà lui substituer des techniques plussimples basées comme la PCR-RFLPcombinée ou non à un screening préa-lable par PCR-SSCP. En revanche,lorsque l’on se place dans un contexted’identification, la problématique estdifférente car on ne connaît pas la fa-mille d’enzyme en cause. Face à cetype de situation, la technique dechoix reste le séquençage permettantaprès comparaison avec les banquesde données de déterminer précisé-ment le type d’enzyme impliqué.D’autre part, cette technique permetde mettre en évidence de nouveauxvariants, ce qui est difficilement possi-ble avec les autres techniques nécessi-tant des sondes ou des amorces spéci-fiques. Actuellement, ces différentestechniques sont complémentaires destechniques phénotypiques et sont troplourdes pour pouvoir s’y substituer.Dans le futur, le développement destechnologies faisant intervenir les pu-ces à ADN et les micro-arrays pourraitconstituer une avancée majeure enpermettant la détection simultanée detoutes les enzymes responsables duphénotype BLSE.

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dÃ©tection des entÃ©robactÃ©ries productrices de bÃªta-lactamases Ã spectre Ã©tendu par...

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