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Système label-free xCELLigence
Les techniques "label-free" permettent d'analyser de manière non invasive et en
temps réel les processus cellulaires tels que l'adhésion, la migration, l’invasion et la
prolifération cellulaire. Ces techniques permettent ainsi d’étudier in vitro des cellules
primaires issues de tissus ou d’organes prélevés directement sur un organisme
vivant sans qu’il soit nécessaire de marquer les cellules ou les protéines cibles avec,
par exemple, des sondes fluorescentes. Parmi les techniques existantes, nous
présenterons dans ce chapitre le système xCELLigence®, développé par ACEA
Biosciences, qui est basé sur la mesure des changements d’impédance électrique au
sein d’une population de cellules. La plateforme ARPEGE est équipée d’un appareil
xCELLigence RTCA DP (Real-Time Cell Analysis Dual Plate) qui permet d'analyser
en temps réel, en continu et sans marquage l'adhésion, la prolifération, l'invasion et
la migration des cellules ainsi que la toxicité et la signalisation cellulaire.
1) Principe du système xCELLigence.
Le principe du système xCELLigence repose sur la culture de cellules dans des puits
tapissés d'électrodes en or1 recouvrant 70 à 80% de la surface totale des puits d’une
microplaque. Au sein de ce réseau d’électrodes circule un courant alternatif de faible
voltage (∼ 20 mV). Le milieu de culture cellulaire ajouté dans les puits de la
microplaque joue le rôle d’« électrolyte »2 en permettant au courant de circuler d’une
électrode3 à une autre comme illustré dans la Figure 1.
1 L'or est un très bon conducteur possédant une faible résistance. Il est chimiquement inerte et est compatible
dans des conditions physiologiques avec des modifications de surface (traitement de surface de type poly-L-
ornithine, poly-lysine, etc.). 2 Substance conductrice contenant des ions mobiles. Lorsqu'un courant électrique est appliqué entre des
électrodes immergées dans une solution conductrice, les ions de la solution se déplacent vers l'électrode dont la
charge est opposée à celles qu'ils portent. Un transfert d'électrons a lieu entre l'ion et l'électrode. Un ion négatif
cédera donc un électron à l'électrode chargée positivement (on parle d'oxydation) et un ion positif prendra un
électron à l'électrode chargée négativement (réduction). Le déplacement des ions se termine ainsi par une
réaction d'oxydoréduction impliquant les ions présents dans la solution. 3 Il est à noter que dans un circuit électrique les électrons se déplacent du pôle négatif vers le pôle positif mais
par convention le sens de circulation du courant est représenté dans le sens opposé.
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Figure 1. Illustration d’un puits permettant la mesure de la variation
d’impédance d’une population de cellules.
Lorsque des cellules sont déposées dans les puits, elles vont progressivement
adhérer au fond du support4. La présence de cellules sur les électrodes va avoir pour
effet d’affecter localement l'environnement ionique (à l'interface électrodes/solution)
en induisant une augmentation de l’impédance (Figure 1).
2) Impédance électrique.
Le courant délivré par l’appareil xCELLigence RTCA DP est un courant alternatif 5
sinusoïdal. Dès lors, l'impédance électrique mesure l'opposition du système au
passage de ce courant.
4 Le support est composé d'une surface en verre ou PET (poly(téréphtalate d'éthylène)) sur lequel sont déposées
les électrodes en or. 5 Le courant alternatif est un type de courant électrique dans lequel les électrons circulent de manière
alternative dans les deux sens du circuit. Le déplacement des électrons se limite à quelques millièmes de
millimètre. Si les électrons circulent lentement, l'énergie, elle, se déplace très rapidement et se transmet
instantanément au reste du circuit.
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Système label-free xCELLigence
L'impédance est une généralisation de la loi d'Ohm pour les circuits électriques en
courant alternatif. L’impédance apparente, notée Z, se mesure en ohm et est définie
comme le rapport de la tension (volt) sur l’intensité (ampère) :
Z (Ω)=U (V)
I (A)
L’impédance est un paramètre complexe qui fait intervenir, dans notre cas,
différentes caractéristiques physiques du milieu et des cellules ainsi que la
fréquence 6 du courant auquel est soumis le système. De manière simplifiée, le
système peut être modélisé par un circuit électrique (Figure 2).
Figure 2. Modélisation simplifiée du système xCELLigence au niveau de
l'interface électrode/cellule. (a) En absence de cellules, l'impédance a
principalement deux composantes : l'impédance à l'interface électrodes/milieu (Zélec)
et la résistance du milieu extracellulaire (Rmilieu). (b) En présence de cellules,
l'impédance présente les mêmes composantes que précédemment auxquelles se
rajoutent l'impédance des cellules (Zcell) représentées majoritairement par la
capacitance membranaire 7 et la résistance membranaire. Rj correspond à la
résistance au niveau des contacts intercellulaires. Flèche rouge : circulation
majoritaire du courant à basse fréquence. Flèche bleu : circulation majoritaire du
courant à haute fréquence.
6 La fréquence du courant alternatif, mesurée en hertz (Hz), correspond au nombre de changement de sens
qu’effectue le courant électrique en une seconde. 7 De par sa structure, la bicouche lipidique, constituée de phospholipides non conducteurs, confère à la cellule
des propriétés capacitives qui peuvent être représentées par un condensateur (deux éléments conducteurs : les
deux faces de la membrane, séparés par un isolant : la bicouche lipidique). La notion de capacité (C), exprimée
en farads (F) traduit la faculté de la membrane à accumuler des charges électriques.
(a)
Electrode Zélec
Rmilieu
(b)
Zélec Electrode
Rj
Rmilieu
Zcell
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Dans le système représenté dans la Figure 2b, la circulation du courant au sein du
puits dépend de la fréquence utilisée. Ce paramètre est important car en fonction de
la fréquence utilisée, l'impact de la monocouche cellulaire sur la valeur d'impédance
sera différent. Pour des courants de fréquence faible (en dessous de 2-4 kHz), le
courant se déplace préférentiellement autour et entre les cellules (Figure 2b et
Figure 3). A ces basses fréquences, la membrane plasmique agit comme un isolant
et le courant n'est pas en mesure de traverser la cellule. La mesure de la variation
d'impédance dans cette gamme de fréquence donne principalement des informations
sur les modifications intervenant au niveau des contacts intercellulaires et des
contacts entre les cellules et le support (adhésion)8.
Pour des courants de hautes fréquences (supérieurs à 10 kHz), le courant se
déplace principalement au travers des cellules (Figure 2b et Figure 3). Dans cette
gamme de fréquence, la valeur d'impédance est principalement affectée par l'état
des cellules incluant le nombre de cellules, la morphologie cellulaire et l'adhésion des
cellules aux électrodes (Figure 4). L’appareil xCELLigence RTCA DP est paramétré
pour délivrer un courant alternatif d’une fréquence de 10 kHz.
8 L'appareillage ECIS
® développé par la société Applied BioPhysics permet de réaliser ce type d'analyse en
ajustant la fréquence appliquée au système : http://www.biophysics.com/index.php
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(a)
(b)
Figure 3. Illustration du déplacement du courant en fonction de la fréquence
utilisée au niveau de l'interface électrode/cellule. (a) A de faibles fréquences, le
courant se déplace principalement autour et entre les cellules (flèches rouges). A de
hautes fréquences le courant se déplace principalement au travers des cellules
(flèches bleues). A des fréquences intermédiaires le courant peut utiliser les deux
voies en fonction de la fréquence (flèches noires). (b) Diagramme de Bode
représentant l'influence de la fréquence du courant sur l'impédance en présence ou
non de cellules. Dans ce système, l'impédance des courants extracellulaires domine
entre 1 – 10 kHz (section I) alors qu'à partir de 10 kHz ce sont les courants
transmembranaires qui influencent la mesure (section II)9.
9 Sources : thèse de Judith Anthea Stolwijk & article de Stolwijk JA et al., Pflugers Arch. 2015.
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Figure 4. Illustration de la variation d'impédance en fonction de la densité
cellulaire. Plus la surface des électrodes recouverte par les cellules est importante,
plus la valeur de l’impédance sera grande (source : ACEA Biosciences).
En pratique, le système xCELLigence ne donne pas directement des valeurs
d’impédance mais des valeurs de Cell Index (noté CI). Le Cell Index est donné par la
formule suivante:
𝐶𝐼 = (𝑍𝑐𝑒𝑙𝑙 (𝑓𝑡)
𝑍𝑜 − 1)
où Zcell (ft) est l'impédance mesurée à différents temps en présence de cellules, Z0
est l'impédance mesurée en présence de milieu de culture et en absence de cellule.
Z0 correspond donc à la contribution du milieu de culture et de l’appareillage sur
l’impédance mesurée au sein du puits.
En absence de cellules, Zcell = Z0 et CI = 0.
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A
B
C
D
500 m
3) Applications.
Selon les processus cellulaires étudiés avec l’appareil xCELLigence RTCA DP, nous
utiliserons des types de microplaques différentes :
a) Prolifération, signalisation et toxicité.
Les E-plate et E-plate view (Figure 5) sont des microplaques utilisées pour l’étude
de la prolifération, la signalisation et la toxicité cellulaire.
Figure 5. E-plate et E-plate view. (A) Photo d’une E-plate ou d’une E-plate view. (B)
Schéma simplifié du réseau d’électrodes tapissant le fond d’un puits d’une E-plate
view. La région centrale du puits ne contient pas d’électrodes afin de faciliter
l’observation des cellules par microscopie. (C) Photographie d’un puits d’une E-plate
et d’une E-plate view. (D) Image en microscopie optique (x10) de cellules recouvrant
le fond d’un puits. Les lignes de ronds noirs correspondent aux électrodes (source :
ACEA Biosciences).
Quelle que soit le processus biologique étudié, il est conseillé dans un premier temps
de réaliser une titration de la densité cellulaire afin de déterminer la dynamique de la
réponse du Cell Index en fonction du type cellulaire étudié (Figure 6).
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0 5 10 15 20
0
2
4
6
Temps (heures)
Ce
ll in
de
x
10,000 HEK293 cells
15,000 HEK293 cells
30,000 HEK293 cells
50,000 HEK293 cells
Figure 6. Prolifération de cellules HEK293. Mesure de la prolifération de cellules
HEK293 pour différentes densités de cellules (5x104, 3x104, 1,5x104, 104 cellules).
Il est important de noter que la valeur du CI mesurée dépend de la lignée cellulaire
utilisée. Ainsi, comme représenté dans la Figure 7, à confluence, les cellules MCF7,
COS7, HT29 et PC3 ne donnent pas le même CI. En effet, la valeur du CI dépend de
la taille des cellules mais aussi de la nature des contacts que vont établir les cellules
avec le support.
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Figure 7. Evolution du Cell Index pour différentes lignées cellulaires. A
confluence (au plateau), les valeurs du CI sont différentes en fonction des lignées
(CIMCF7 = 13; CICOS7 = 10; CIHT29 = 4; CIPC3 = 3). Source : ACEA Biosciences.
Exemple 1 : étude de la toxicité cellulaire du 5-Fluorouracile (5-FU).
Le système xCELLigence permet, par exemple, de mesurer en temps réel l'effet
toxique d’une molécule sur la prolifération cellulaire. L’effet du 5-FU 10 sur des
HEK293 (Human Embryonic Kidney 293) en prolifération est mesuré en suivant
l'évolution du CI au cours du temps (Figure 8).
10
Le 5-Fluorouracile est une molécule très proche de l’uracile qui est utilisée en cancérologie pour bloquer le
cycle cellulaire.
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0 20 40 600
2
4
6
8
Temps (heures)
Cell In
dex
Base
25 µM
50 µM
100 µM
[5-FU]
5-FU
Figure 8. Prolifération de cellules HEK293 exposées au 5-FU. L'ajout à t = 24h de
5-FU dans des puits contenant des HEK293 ralenti ou bloque la prolifération
cellulaire selon la concentration utilisée.
Exemple 2 : étude de la signalisation cellulaire.
De la même manière, le système xCELLigence permet de réaliser au sein d’une
population de cellules une mesure « globale » de la signalisation cellulaire induite par
une molécule donnée. Ce type de réponse est illustré dans la Figure 9 par l'ajout de
forskoline 11 à des concentrations croissantes sur des cellules CHO (Chinese
Hamster Ovary). Dans ces expériences, la variation du CI reflète les modifications
morphologiques des cellules (changement de forme et d'adhésion) en réponse à une
stimulation induite par la forskoline.
D’autres expériences utilisant des inhibiteurs des voies de signalisation ont permis
par exemple de décomposer les différentes phases de la réponse cellulaire suite à la
stimulation par différents ligands du récepteur β2-adrenergique12. Il est important de
rappeler ici l'intérêt de ce type de système qui permet de travailler sur des cellules
11
La forskoline est un activateur de l'adénylate cyclase qui va induire une production d'AMPc par la cellule
stimulée. 12
Stallaert et al., Impedance responses reveal b2-Adrenergic receptor signaling pluridimensionality and allow
classification of ligands with distinct signaling profiles. PLOSOne 2012.
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0 10 20 30 400.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
Temps (heures)
Cell In
dex
Base
0.1nM
1nM
10nM
100nM
1µM
10µM
100µM
[Forskoline]
Changementmilieu
Fsk
-10 -8 -6 -4
0.0
0.5
1.0
1.5
log[Fsk] (M)
No
rmalized
Cell In
dex
EC50 8.573e-006
10,000 CHO-G4 cells / well
primaires exprimant un récepteur d'intérêt à des niveaux physiologiques et sans
aucune modification des cellules. Pour des analyses systématiques, il sera plus
facile de travailler sur des lignées exprimant de manière stable une protéine d'intérêt.
(A)
(B)
Figure 9. Profil de réponse de cellules CHO à l'ajout de forskoline. (A) Réponse
des cellules CHO à l'ajout de forskoline après un changement de milieu à t = 24h. (B)
Dose-réponse de la forskoline mesurée au pic de réponse (EC50 = 8 M).
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b) Migration cellulaire.
Le suivi en temps réel et en continu de la migration cellulaire peut être réalisé en
utilisant des microplaques particulières : les CIM-plate (Figure 10).
Figure 10. CIM-plate. (A) Photographie d’une CIM-plate. (B) Vue en coupe d’une
CIM-plate avec les chambres séparées par une membrane perforée de pores de
8 m de diamètre permettant aux cellules de passer de la chambre supérieure vers
la chambre inférieure. Les électrodes (en doré sur l’image) tapissent la face
inférieure de la membrane.
Ce système « mime » la chambre de Boyden classiquement utilisée pour étudier la
migration cellulaire. L'avantage du système xCELLigence par rapport à la chambre
de Boyden est qu’il permet de suivre la migration cellulaire en temps réel. Ainsi,
lorsqu’un « chimio-attractant » est présent dans la chambre inférieure, les cellules de
la chambre supérieure qui sont sensibles au chimio-attractant vont migrer de la
chambre supérieure vers la chambre inférieure en traversant les micropores de la
membrane (diamètre des pores : 8 m). Ces cellules vont ensuite adhérer au support
sur lequel repose les électrodes comme représenté dans la Figure 10.
A
B
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30 000 cellules 5% SVF-bas
15 000 cellules 5% SVF-bas
30 000 - 15 000 cellules 0% SVF-bas
Migration Prolifération + (Migration)
L'augmentation de la valeur du CI reflète dans ces expériences la présence des
cellules dans la chambre inférieure (Figure 11).
Figure 11. Analyse en temps réel de la migration de cellules HOS (Human bone
OsteoSarcoma). Courbes de migration obtenues avec deux densités de cellules
HOS en absence ou en présence du sérum de veau fœtal (SVF) comme chimio-
attractant. En absence de sérum dans la chambre inférieure (0% SVF bas), les
cellules ne migrent pas.
4) Appareillage.
L’appareil xCELLigence RTCA DP est composé de 3 supports (Figure 12) pouvant
fonctionner indépendamment ou de manière groupée (par 2 ou par 3). Il est ainsi
possible d'analyser simultanément entre 16 puits et 48 puits (n = 3 supports).
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Figure 12. Station de mesure RTCA DP avec 3 supports de plaques 16 puits.
Conclusion
Le système xCELLigence est un outil polyvalent, simple d’utilisation permettant de
travailler aussi bien sur des lignées stables que sur des cellules primaires sans
nécessité de modifier les protéines d'intérêt et/ou les cellules.