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ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON Année 2008 - Thèse n° 07 CRYOCONSERVATION DU CORTEX OVARIEN CHEZ LA CHATTE. EFFETS DES PARAMETRES PHYSIQUES ET CHIMIQUES AU COURS DE LA CONGELATION. THESE Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie) et soutenue publiquement le 11 Janvier 2008 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire par SAILLEY Florian Né le 19 juillet 1980 A Vesoul (Haute-Saône)

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ECOLE NATIONALE VETERINAIRE DE LYON

Année 2008 - Thèse n° 07

CRYOCONSERVATION DU CORTEX OVARIEN CHEZ LA CHATTE.

EFFETS DES PARAMETRES PHYSIQUES ET CHIMIQUES AU COURS DE LA CONGELATION.

THESE

Présentée à l’UNIVERSITE CLAUDE-BERNARD - LYON I (Médecine - Pharmacie)

et soutenue publiquement le 11 Janvier 2008 pour obtenir le grade de Docteur Vétérinaire

par

SAILLEY Florian Né le 19 juillet 1980

A Vesoul (Haute-Saône)

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A Monsieur le Professeur Michel BERLAND,

Professeur de la Faculté de Médecine de Lyon

Qui m’a fait l’honneur d’accepter la présidence du jury.

Hommages respectueux.

A Monsieur le Professeur Samuel BUFF,

Professeur de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon,

Pour avoir été à l’initiative de ce travail et m’avoir encadré durant sa réalisation.

Sincères remerciements.

A Monsieur le Professeur Pierre GUERIN,

Professeur de l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon,

Pour avoir accepté de faire partie du jury et pour l’intérêt et l’aide qu’il a apporté à ce travail.

Sincères remerciements.

A Mademoiselle le Docteur Vanessa NETO,

Pour m’avoir guidé et soutenu tout au long de la réalisation de ce travail avec la gentillesse et

la bonne humeur qui la caractérisent.

Sincères remerciements.

Merci également à tout le personnel du CERREC et notamment à Nadine C.

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A mes parents,

Pour leur soutien et leur dévouement de tous les instants, pour avoir été présents à tous les

moments clés de ma vie. Vous m’avez donné la chance de pouvoir suivre ma voie et de

réaliser mon rêve, cette réussite est la vôtre.

A mes frères,

Vous m’avez ouvert la voie et encouragé tout au cours de ma scolarité : tout a été plus facile

grâce à vous. Sachez que j’ai la plus grande admiration pour tout ce que vous faites.

A Mathilde,

Tes rires et ta bonne humeur m’apportent beaucoup de fraîcheur.

A mes grands parents maternels,

Pour avoir grandement contribué à faire de mon enfance une enfance dorée.

A ma grand mère, pour les leçons de courage que tu m’as donné, pour m’avoir tant gâté. Je

n’ai qu’un seul regret, c’est de ne pas avoir pu te présenter ce travail achevé, il t’est dédié.

A mon grand père, pour m’avoir toujours accueilli avec son éternel sourire, et m’avoir

transmis sa passion de l’élevage : tu es pour beaucoup dans le métier que j’ai choisi.

A Joël,

Pour m’avoir appris tout un tas de choses utiles et avoir supporté mes nombreuses gaffes.

A mes grands parents paternels,

Les récits de votre vie passée ont beaucoup résonné dans ma tête de petit garçon.

A toute ma famille,

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A Maud,

Qui m’a soutenu et beaucoup aidé dans la réalisation de cette thèse, parfois à son grand

désespoir…Pour ta vivacité d’esprit, pour ta faculté à me surprendre toujours de façon

positive. Pour cette grande complicité qui nous unit, et tout simplement pour me faire me

sentir bien.

Tout mon amour.

A la famille Fréquelin - Brunel,

Pour leur gentillesse et leur accueil, que ce soit à Dijon ou à Frontignan.

A Mathieu, le détonateur,

Pour ton humour en toutes circonstances, pour notre passion commune pour le foot (mais pas

pour l’OM), pour nos si nombreuses parties de PES, et surtout pour ta bonne humeur

constante et ton sens de l’hospitalité, qui fût certes parfois forcée. A Camille et sa gentillesse.

A Ton, le sage,

Pour ta philosophie de la vie, pour ton recul sur les choses, pour ta vidéothèque si particulière.

Pour toutes ces « para-soirées » où les gens étaient forcés de faire notre connaissance, voire de

nous accueillir…Pour toutes ces balades des chiens. A Linda et sa jovialité.

A Karcher, le pro,

Pour ta passion et ta motivation pour notre métier, tu m’as appris qu’il faut se fixer des

objectifs et s’y tenir pour pouvoir s’épanouir professionnellement. Sinon merci de m’avoir fait

connaître les Bartavelles et le chemin entre les sapins, moments inoubliables mais qui

paraissaient quand même plus long qu’en réalité.

A Mimi, le samouraï,

Pour ta façon de faire ton petit bonhomme de chemin sans bruit mais avec une remarquable

compétence.

Pour tous ces repas gras et ces films de sabre, pour tes prestations rares mais remarquées en

soirée.

A Virginie qui j’espère ne déteste pas trop les francs-comtois.

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A Vovo, le puissant,

A un gars impressionnant de maturité et de justesse de jugement. Pour ta façon pour le moins

incisive d’aborder les choses, notamment les repas. Pour ta générosité.

A Bilitis, la fille,

A ton caractère entier, ton sens du groove et pour avoir essayé vainement de corriger mon « je

bosse » à la revue.

A Anne,

A ta bonne humeur qui nous manque tant, à tous nos fous rires ( en particulier celui du porte-

manteau) qui faisaient que travailler était un plaisir.

Aux Docteurs Baltzinger et Bernet,

Qui m’ont permis de m’aguerrir, de faire mes armes et surtout de partir de zéro en rurale.

Merci pour la liberté d’initiative et les conseils que vous me donnez au quotidien.

A tout le personnel de la clinique de Lure,

Aux Docteurs Mirkovic, Witz et Couillerot,

Pour m’avoir fait comprendre que ne pas se prendre au sérieux est la meilleure façon de bien

travailler. Merci pour ce que vous m’avez appris et pour cette super ambiance de travail.

A tous mes amis francs-comtois et lorrains que j’ai plus beaucoup l’occasion de revoir,

David L., Nico P, Olivier P., Raphaël W., Nico D. et tous les autres. Si j’en suis là, c’est aussi

un peu grâce à vous.

Merci notamment à Nico D., qui m’a remis sur les rails un certain jour de concours, ça restera

toujours gravé là.

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Table des matières

Liste des figures .................................................................................................17

Liste des tableaux ..............................................................................................19

Liste des annexes ...............................................................................................19

Liste des abréviations........................................................................................21

I RAPPELS D’ANATOMIE ET DE PHYSIOLOGIE SEXUELLE DE LA CHATTE. ...........................................................................................................27

I.1 Rappels de l’anatomie génitale de la chatte ......................................27 I.1.1 Les ovaires ..............................................................................28 I.1.2 Les oviductes...........................................................................28

I.2 Formation et développement de l’ovaire depuis le stade embryonnaire et évolution de la population folliculaire. .......................28

I.2.1 Morphogenèse des ovaires .....................................................28 I.3 Histologie de l’ovaire..........................................................................30

I.3.1 Structure microscopique.........................................................30 I.3.2 Population folliculaire............................................................30

I.4 Le cycle oestral....................................................................................33 I.4.1 L’incidence saisonnière..........................................................33 I.4.2 Le pro-oestrus.........................................................................33 I.4.3 L’oestrus .................................................................................34 I.4.4 L’interoestrus..........................................................................36 I.4.5 L’anoestrus .............................................................................36

I.5 Modifications macroscopiques et histologiques de l’ovaire au cours d’un cycle..................................................................................................37

II INTERETS DE LA CRYOCONSERVATION DE CORTEX OVARIENS........................................................................................................39

II.1 Intérêts en médecine humaine..........................................................39 II.1.1 Insuffisance ovarienne après traitement anti-cancéreux......40 II.1.2 Dommages occasionnés par la radiothérapie ......................41 II.1.3 Dommages occasionnés par la chimiothérapie. ...................42 II.1.4 Méthodes couramment utilisées pour sauvegarder la capacité de procréation .................................................................................42

II.2 Intérêts en médecine vétérinaire.......................................................44 II.2.1 Protection et préservation des espèces et races en voie d’extinction......................................................................................44 II.2.2 Préservation du patrimoine génétique des animaux domestiques.....................................................................................46

II.3 Intérêts techniques : diversité des modalités d’utilisation de fragments ovariens congelés....................................................................47

14

II.3.1 Autogreffe ..............................................................................47 II.3.3 Xénogreffe .............................................................................49 II.3.3 Culture et maturation in vitro ...............................................50

III DONNEES FONDAMENTALES ET ACTUELLES DE LA CRYOPRESERVATION .................................................................................53

III.1 Congélation de l’eau........................................................................53 III.1.1 Généralités ...........................................................................53 III.1.2 Pic de surfusion....................................................................55 III.1.3 Phénomène de nucléation ....................................................56 III.1.4 Cas des solutions aqueuses..................................................57

III.2 Composition schématique d’une cellule, conséquences sur la cryopréservation .......................................................................................58

III.2.1 Les membranes lipidiques....................................................58 III.2.2 Le cytosquelette....................................................................60

III.3 La cristallisation intracellulaire......................................................61 III.3.1 Répartition de l’eau cellulaire.............................................61

III.4 Cristallisation extracellulaire et effet solution..............................63 III.4.1 Généralités ...........................................................................63 III.4.2 La transition vitreuse: vitrification intracellulaire..............66 III.4.3 Biophysique de la perméabilité membranaire.....................67

III.5 Relation glace extracellulaire glace intracellulaire.......................68 III.6 Particularités de la congélation de tissus .......................................69

III.6.1 Le transport d’eau................................................................70 III.6.2 La conduction thermique .....................................................70 III.6.3 L’existence de plusieurs types cellulaires............................71 III.6.4 La propagation de glace intracellulaire..............................71

IV STRATEGIES DE LUTTE CONTRE LES EFFETS NEFASTES DE LA CONGELATION........................................................................................73

IV.1 Vitesse de refroidissement................................................................73 IV.2 Induction de la cristallisation : « seeding » ....................................77 IV.3 Stockage............................................................................................79 IV.4 Vitesse de réchauffement.................................................................80 IV.5 Emploi d’un cryoprotecteur.............................................................81

IV.5.1 Les différents cryoprotecteurs..............................................81 IV.5.2 Toxicité des cryoprotecteurs ................................................86 IV.5.3 Perméabilité cellulaire et tissulaire aux cryoprotecteurs....88

V CARACTERISTIQUES PRINCIPALES D’UN PROTOCOLE DE CONGELATION DE FOLLICULES ET DE CORTEX OVARIENS.... ....89

V.1 Phase d’équilibration : incorporation du cryoprotecteur................89 V.2 Seeding ...............................................................................................90 V.3 Vitesse de refroidissement .................................................................90

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V.4 Vitesse de réchauffement...................................................................91 V.5 Retrait du cryoprotecteur ..................................................................92

V.5.1 Retrait par étapes ..................................................................93 V.5.2 Ajout du saccharose ..............................................................93

I MATERIELS ET METHODES....................................................................97

I.1 Préparation des cortex ovariens.........................................................97 I.1.1Origine des ovaires..................................................................97 I.1.2 Isolement du cortex ovarien ...................................................98

I.2 Incorporation des cryoprotecteurs ...................................................100 I.3 Les protocoles de congélation sensus stricto ...................................100

I.3.1 Matériel utilisé......................................................................100 I.3.2 Protocole de congélation P1 : protocole de réference.........101 I.3.3 Evaluation de la descente en température à l’intérieur de la cryochambre..................................................................................103 I.3.4 Les différents protocoles de congélation..............................104 I.3.5 Stockage................................................................................105 I.3.6 Décongélation.......................................................................105

I.4 Etude histologique des follicules primordiaux à primaires............106 I.4.1 Préparation des lames d’étude histologique........................106 I.4.2 Evaluation histologique des follicules primordiaux à primaires.......................................................................................................106

I.5 Analyse statistique ............................................................................109 II.1 Vérification des paramètres physiques et chimiques au cours des protocoles de congélation.......................................................................111

II.1.1 Evaluation de la pression osmotique ..................................111 II.1.2 Evaluation de la vitesse de refroidissement réelle..............112

II.2 Protocole P1 : influence du milieu de congélation .......................116 II.2.1 Influence du cryoprotecteur ................................................116 II.2.2 Nature des défauts observés................................................117

II.3 Influence du seeding.......................................................................122 II.3.1 Comparaison entre les cryoprotecteurs ..............................122 I.3.2 Nature des défauts observés .................................................123

II.4 Influence de l’ajout de sucrose dans le milieu de congélation .....124 II.4.1 Influence des cryoprotecteurs .............................................124 II.4.2 Nature des défauts observés................................................125

II.5 Influence de la pente R2 .................................................................126 II.5.1 Comparaison entre les cryoprotecteurs ..............................126 II.5.2 Nature des défauts observés................................................127

II.6 Influence de l’immersion directe des paillettes dans l’azote liquide à -35°C .......................................................................................................128

II.6.1 Comparaison entre les cryoprotecteurs ..............................128 II.6.2 Nature des défauts observés................................................129

16

III DISCUSSION.............................................................................................131

III.1 Validité du protocole expérimental ...............................................131 III.1.1 Exposition des cortex ovariens aux variations de pression osmotique ......................................................................................131 III.1.2 Contrôle de la congélation.................................................133

III.2 Détermination du protocole de congélation le plus performant..135 III.2.1 Choix du cryoprotecteur ....................................................135 III.2.2 Influence des différents paramètres...................................137

III.3 Perspectives d’utilisation des cortex ovariens ..............................138

CONCLUSION................................................................................................141

Bibliographie....................................................................................................147

17

Liste des figures

Figure 1 : L’appareil génital de la chatte................................................................................ 27

Figure 2: La population folliculaire au sein d’une coupe de cortex ovarien de chat.............. 32

Figure 3 : Concentration sérique moyenne de LH au cours d'une activité copulatrice de 36 heures. .............................................................................................................................. 35

Figure 4 : Géométrie et répartition de charges de la molécule d'eau . ................................... 54

Figure 5 : Courbe de congélation de l'eau pure. ..................................................................... 55

Figure 6 : Rayon critique du noyau de nucléation en fonction de la température. ................. 56

Figure 7 : Courbe de congélation d’une solution aqueuse. ..................................................... 57

Figure 8 : Structure de la membrane plasmique d'une cellule animale .................................. 59

Figure 9 : Modalités d'obtention de la vitrification intracellulaire......................................... 66

Figure 10 : Viscosité de l'eau pure en fonction de la température. ......................................... 67

Figure 11 : Corrélations théoriques entre la formation de glace intracellulaire, la survie cellulaire et la vitesse de refroidissement. ....................................................................... 74

Figure 12 : Relation entre la vitesse de congélation et le taux de survie de cellules de moelle osseuse.............................................................................................................................. 76

Figure 13 : Effet de la cristallisation induite à une température déterminée (surfusion 1) ou spontanée (surfusion 2) sur la remontée en température de l'embryon. ......................... 78

Figure 14 : Effet de la concentration en glycérol sur la concentration en sels d'une solution physiologique tamponnée, refroidie à différentes températures négatives...................... 84

Figure 15 : Extériorisation de l'ovaire et lieux de mise en place des ligatures.......................98

Figure 16 : Comparaison morphologique macroscopique entre un ovaire entier et un cortex ovarien après dissection (échelle en cm) ......................................................................... 99

Figure 17 : Utilisation des 4 fragments obtenus à partir de chaque ovaire. ........................... 99

Figure 18 : Congélateur programmable................................................................................ 101

Figure 19 : Courbe de congélation du protocole de référence P1 ........................................102

Figure 20 : Nomenclature utilisée en fonction de la position de la sonde dans la paillette et du cryoprotecteur. ............................................................................................................... 103

Figure 21 : Aspect photographique d'un follicule morphologiquement sans défaut (à gauche) et d'un follicule dégénéré (à droite). ............................................................................. 107

Figure 22 : Résumé des étapes du schéma d'expérimentation............................................... 108

Figure 23 : Evolution de la pression osmotique au cours de l'équilibration et du rinçage des cortex ovariens. .............................................................................................................. 111

Figure 24 : Température mesurée des paillettes au cours de la congélation. ..................... 112

Figure 25 : Vitesse de refroidissement moyenne lors de la phase R2....................................113

Figure 26 : Variations de température des paillettes au cours du seeding. .......................... 115

Figure 27 : Influence de l'utilisation de cryoprotecteurs sur l'évaluation histologique des follicules. ........................................................................................................................ 116

18

Figure 28 : Comparaison des types de défauts folliculaires entre témoins frais et témoins de congélation (P1). ............................................................................................................ 117

Figure 29 : Coupe de cortex ovarien avant congélation (en haut) et après congélation sans agent cryoprotecteur ( en bas). ...................................................................................... 119

Figure 30 : Comparaison des types de défauts présentés par les follicules en fonction du cryoprotecteur utilisé (P1). ............................................................................................ 120

Figure 31 : Cortex ovariens de chatte congelés en présence de DMSO (en haut) et de PROH (en bas) (protocole P1). ................................................................................................. 121

Figure 32 : Comparaison du pourcentage de follicules sans défauts obtenus entre P1 et P2......................................................................................................................................... 122

Figure 33 : Comparaison des défauts au sein des follicules congelés en présence de PROH entre P1 et P2 (données exprimées en % de la population folliculaire entière)............ 123

Figure 34 : Comparaison du pourcentage de follicules sans défaut obtenus entre P1 et P3.124

Figure 35 : Comparaison des types de défauts des follicules congelés en présence de DMSO entre P1 et P3 (données exprimées en % de la population folliculaire entière)............ 125

Figure 36 Comparaison du pourcentage de follicules sans défaut obtenus entre P1 et P4. 126

Figure 37 : Comparaison des types de défauts des follicules congelés en présence de DMSO entre P1 et P4 (données exprimées en % de la population folliculaire entière)............ 127

Figure 38 : Comparaison du pourcentage de follicules sans défauts obtenus entre P1 et P5........................................................................................................................................ 128

Figure 39 : Comparaison des types de défauts présentés par les follicules congelés en présence de PROH entre P1 et P5. ................................................................................ 129

19

Liste des tableaux

Tableau 1 : Paramètres biophysiques de quelques types cellulaires et conséquences sur la vitesse de refroidissement................................................................................................. 75

Tableau 2: Caractéristiques des protocoles de congélation.................................................. 104

Liste des annexes

Annexe 1 : Ages des chattes utilisées pour l’expérimentation .............................................. 143

Annexe 2 : Fiche de comptages cellulaires........................................................................... 145

20

21

Liste des abréviations

Ä : ängström

ADN : acide désoxyribonucléique

°C : degré Celsius

CITES : Convention on International Trade in Endangered Species of wild fauna and flora

CO2 : dioxyde de carbone

D : dalton

DL 50 : Dose Létale 50

DMSO : diméthyl-sulfoxyde

FAO : Food and Agriculture Organisation

FSH : Follicule Stimulating Hormone

hPa : hectopascal

Hz : hertz

g : gramme

IUCN : The World Conservation Union

J : joule

L : litre

LH : Luteinising Hormone

LHRH : Luteinising Hormone Releasing Hormone

M : molaire (mol/L)

min : minute

N2 : dioxyde d’azote

nmol : nanomole

NOD SCID : Nonobese Diabetic Severe Combined ImmunoDeficiency

22

O2 : dioxygène

pmol : picomole

PM : poids moléculaire

PROH : 1,2 propane-diol

RMN : Résonnance Magnétique Nucléaire

s : seconde

SCID : Severe Combined ImmunoDeficiency

SVF : sérum de veau foetal

23

INTRODUCTION

Les biotechnologies de la reproduction font l’objet de progrès constants au fil des

années avec une forte mobilisation de la recherche à un niveau international. La

cryoconservation de tissu ovarien contenant des follicules aux premiers stades de

développement constitue une branche qui suscite beaucoup d’intérêts et d’espoirs depuis

quelques années. De nombreuses équipes de recherche se sont attelées à mettre au point puis à

améliorer en permanence des protocoles expérimentaux permettant de conserver par le froid

les gamètes femelles chez différentes espèces. L’intérêt principal de la cryoconservation de

tissu ovarien est la préservation de la fertilité de femmes devant subir ou ayant subi un

traitement stérilisant comme une chimiothérapie ou une radiothérapie, et qui ne peuvent avoir

recours à d’autres techniques du fait de leur trop jeune âge ou de l’absence de partenaire pour

le transfert d’embryon. Malheureusement, si quelques études ont pu être menées à bien chez

la femme, les lois de l’éthique constituent un obstacle non négligeable aux expérimentations,

et la grande majorité des publications rapportent l’utilisation d’autres espèces animales

comme modèle, comme la souris, la lapine, la chèvre, la truie, la vache et la brebis pour ses

analogies ovariennes morphologiques et physiologiques avec la femme. La littérature ne

présente qu’un nombre restreint de références pour l’espèce féline, malgré les nombreux

avantages que présente son utilisation : commodité de prélèvement des ovaires, taille

moyenne des ovaires, richesse des cortex en follicules immatures.

Cette somme de connaissances acquises dans le domaine animal trouve toute son utilité en

médecine vétérinaire avec comme objectifs la protection des races menacées d’extinction, la

préservation de la diversité génétique et la lutte contre la consanguinité dans les élevages.

La découverte de l’utilité des cryoprotecteurs lors de la congélation de sperme a

conduit aux premiers travaux sur le tissu ovarien dans les années 50 avec l’obtention de la

première gestation suite à une greffe de fragments ovariens congelés chez la souris par

PARROT et al (1960) en ajoutant du glycérol dans le milieu de congélation. Malgré ce succès,

très peu de travaux ont été réalisés entre 1960 et le début des années 90. GOSDEN et al ont

alors obtenu une gestation chez la brebis après congélation et autogreffe en utilisant le

protocole standard de congélation d’embryons (vitesse de refroidissement lente à 0,3°C/min

avec induction manuelle de la cristallisation), donnant une nouvelle impulsion à cette voie de

recherche.

24

Notre étude se propose plusieurs objectifs. En premier lieu nous avons réalisé

l’évaluation morphologique de la conservation de follicules immatures de chattes après

congélation en présence de deux cryoprotecteurs : le diméthyl-sulfoxyde (DMSO) et le 1,2

propane-diol (PROH). En second lieu nous nous sommes penchés sur l’impact de différents

paramètres du protocole classiquement utilisé en congélation lente : l’induction de la

cristallisation (seeding), la vitesse de congélation, l’ajout d’un cryoprotecteur extracellulaire

dans le milieu de congélation, et enfin la plongée des échantillons dans l’azote liquide après la

phase de refroidissement.

25

PREMIERE PARTIE:

PARTIE BIBLIOGRAPHIQUE

26

27

L’étude bibliographique aura pour but de présenter les bases d’anatomie et de

physiologie sexuelle chez la chatte en l’état actuel des connaissances. Elle précisera

également les intérêts de la cryoconservation de tissu ovarien et certaines données de

physique de la conservation cellulaire et tissulaire par congélation.

I RAPPELS D’ANATOMIE ET DE PHYSIOLOGIE

SEXUELLE DE LA CHATTE.

I.1 Rappels de l’anatomie génitale de la chatte

La figure 1 présente les caractéristiques anatomiques de l’appareil reproducteur de la

chatte.

Figure 1 : L’appareil génital de la chatte.

d’après GETTY (1975).

28

Notre étude portant sur la congélation de cortex ovariens, nous détaillerons

uniquement l’anatomie des ovaires et des oviductes de la chatte.

I.1.1 Les ovaires

Les ovaires sont de petite taille et de forme allongée (10×5×0,3 mm) (JOHNSTON S.D.

et al, 2001b). Ils sont superficiels (1 à 2 cm sous la peau) et sont situés à 1 cm du bord caudal

du rein correspondant, en regard de la troisième et de la quatrième vertèbre lombaire (BARONE

R., 1990). Ils sont entourés de la bourse ovarique qui est largement ouverte et très pauvre en

tissu adipeux, contrairement à la chienne. Ils sont fixés à l’utérus par deux ligaments : le

mésosalpinx et le ligament propre de l’ovaire. Dorsalement, l’ovaire est fixé à la paroi

abdominale par le mésovarium et crânialement par le ligament suspenseur de l’ovaire. Le

ligament propre de l’ovaire le rattache à l’extrémité de la corne utérine correspondante

(BARONE R., 1990).

I.1.2 Les oviductes

Les oviductes constituent un long tube flexueux de 4 à 6 cm de long pour 1 à 1.5 mm

de diamètre (JOHNSTON S.D. et al, 2001b). Ils prennent naissance sur la corne utérine au

niveau de l’ostium utérin puis remontent médialement à l’ovaire jusqu’à son extrémité

crâniale. Ils se terminent par l’infundibulum, dilatation en forme d’entonnoir festonné.

I.2 Formation et développement de l’ovaire depuis le stade

embryonnaire et évolution de la population folliculaire.

I.2.1 Morphogenèse des ovaires

Chez les Vertébrés supérieurs, les gonades ont une triple origine : les crêtes génitales

qui apparaissent dès le stade neurula sous forme d’un épaississement et d’un creusement de la

29

somatopleure des lames latérales ; les cordons médullaires qui constituent la médulla de la

gonade indifférenciée et enfin les cellules germinales primordiales (LE MOIGNE A., 1989).

Ces dernières proviennent de l’endoderme chez les Mammifères et migrent pour

coloniser les crêtes génitales qui sont au départ dépourvues de cellules capables de synthétiser

des gamètes (JOHNSTON S.D. et al, 2001b).

Les cellules germinales ou ovogonies se multiplient activement dans l’épithélium

germinatif qui forme le cortex de la gonade.

L’évolution en ovaire, gouvernée par l’absence de facteur anti-Müllerien, se

caractérise par deux poussées de cordons sexuels primitifs à partir du cortex. Tout d’abord

une première où les cellules germinales, peu nombreuses, régressent et sont remplacées par un

tissu vascularisé qui constituera la médulla de l’ovaire. Ensuite une seconde renfermant

davantage de cellules germinales qui ne se détachent pas du cortex ovarien (LE MOIGNE A.,

1989; JOHNSTON S.D. et al, 2001b ).

Les ovogonies qui se divisent par mitoses restent reliées par des ponts cytoplasmiques.

Lorsqu’elles cessent de se diviser pour entrer en prophase de méiose, elles se séparent les

unes des autres et s’entourent d’un petit sac ou follicule formé par des cellules originaires de

l’épithélium coelomique du cortex de la crête génitale. Ce sont les cellules folliculeuses qui,

avec le jeune ovocyte primaire, forment les follicules primordiaux. Les cordons sexuels

corticaux sont alors fragmentés en follicules primordiaux (LE MOIGNE A., 1989).

La morphologie ovarienne est complètement établie vers le 40ème jour de gestation

chez la chatte, soit lorsque le foetus atteint une taille de 7,5 cm (JOHNSTON S.D. et al, 2001b).

30

I.3 Histologie de l’ovaire

I.3.1 Structure microscopique

Outre la population folliculaire détaillée ci-après, le cortex ovarien est constitué de

plusieurs types cellulaires avec de l’extérieur vers l’intérieur :

- l’épithélium cubique simple ;

- la tunique fibreuse albuginée ;

- les cellules du stroma morphologiquement proches des fibroblastes, formant un tissu

conjonctif autour des follicules.

I.3.2 Population folliculaire

La division des ovogonies cesse à la naissance, au plus tard 21 jours après le part.

Chez la jeune chatte immature, on observe uniquement des follicules primordiaux entourés de

cellules de la pré-granulosa, simple couche de cellules nourricières plates appelées à l’origine

des cellules de la granulosa. Quelques follicules de De Graff qui dégénèrent peuvent être

également observés. La population folliculaire moyenne est estimée à 74500 follicules

primordiaux par ovaire chez la chatte adulte (JEWGENOW K. et PARIS M., 2006).

Ces follicules primordiaux contiennent un ovocyte au stade prophase I, d’une taille de

l’ordre de 20 à 40 µm de diamètre au maximum (HIRSFIELD A.N., 1991), présentant un noyau

volumineux avec une chromatine finement granulaire, un nucléole proéminent et un

cytoplasme peu abondant. En fin de pro-oestrus, ces follicules atteignent 0,5 mm de diamètre

(JOHNSTON S.D. et al, 2001b). Quelques follicules primordiaux sortent chaque jour de leur

état de quiescence pour entrer en croissance. La plupart dégénèrent avant d’atteindre le stade

ovulatoire.

A l’approche de l’oestrus, on observe une vague de croissance folliculaire, le nombre

de follicules entrant en croissance semblant augmenter avec l’âge (BOSSE P. et al, 1990).

Après sélection par dominance, de 1 à 7 follicules poursuivent cette croissance. Ils évoluent

en différents stades qui sont présentés par la figure 2:

31

- les follicules intermédiaires ; dont on peut attribuer l’appellation à GOUGEON (1996).

Ce sont des follicules primordiaux qui sortent de leur état de quiescence pour entrer dans la

phase de croissance. Ce passage se caractérise par une transformation des cellules folliculaires

aplaties en cellules cubiques, une augmentation du nombre des cellules folliculaires et par un

accroissement du diamètre ovocytaire (HIRSFIELD A.N., 1991).

- les follicules primaires : les cellules de la granulosa, désormais toutes cubiques,

continuent à se multiplier par mitose. Une couche de glycoprotéines et de protéoglycanes se

développe entre l’ovocyte et ces cellules de la granulosa: il s’agit de la zone pellucide. Lors de

la maturation folliculaire, les cellules stromales environnantes commencent à former autour

du follicule une couche de cellules organisées : la thèque folliculaire séparée des cellules de la

granulosa par une membrane basale.

- les follicules secondaires : ils sont entourés de deux couches de cellules sexuelles

(GOUGEON A., 1996). A la périphérie, la thèque s’est divisée en une thèque interne bien

structurée dite lutéinisée car elle sécrète des stéroïdes sexuels, et en une thèque externe

constituée de cellules fusiformes se mélangeant avec le stroma. L’apparition de cette thèque

interne se fait en fin de stade follicule secondaire (HIRSFIELD A.N., 1991).

- les follicules antraux ou de De Graff : des espaces remplis de liquides fusionnent

pour former l’antre folliculaire et l’ovocyte s’excentre dans une zone des cellules de la

granulosa. Chez la chatte, ils mesurent de 2,5 à 3,5 mm. L’ovocyte en métaphase II, entouré

d’une couche de cellules de la granulosa appelée corona radiata, est rejeté à un pôle du

follicule à cause du développement de l’antre folliculaire.

32

Figure 2: La population folliculaire au sein d’une coupe de cortex ovarien de chat.

d’après JEWGENOW (2006) .

1: follicule primordial; 2: follicule intermédiaire; 3: follicule primaire; 4: follicule secondaire; 5 : jeune follicule antral. Echelle : 50 µm (barre).

Dans le domaine de la cryobiologie, une classification plus simple est souvent utilisée

dans la littérature. Elle distingue deux catégories : les follicules pré-antraux et les follicules

antraux. En effet la taille des follicules et la présence d’une cavité liquidienne influent sur la

réussite de la congélation.

33

I.4 Le cycle oestral

La chatte est une femelle à polyœstrus saisonnier. Elle a la particularité d’avoir une

ovulation déclenchée par le coït. En conséquence, on peut distinguer deux types de cycles :

ovulatoire et non ovulatoire. Il est toutefois à noter que des stimuli visuels ou tactiles peuvent

suffire à déclencher l’ovulation. Certaines ovulations seraient ainsi « spontanées » (LAWLER

D.F et al, 1993).

I.4.1 L’incidence saisonnière

La chatte présente une activité sexuelle saisonnière qui s’étend, sous nos latitudes, de

janvier à octobre avec un maximum lors des mois de février et mars. La période d’octobre à

décembre correspond à une période d’anoestrus vrai.

I.4.2 Le pro-oestrus

Le pro-oestrus correspond à la période où la femelle commence à attirer les mâles sans

accepter l’accouplement. Il coïncide avec le début de l’augmentation de la concentration

d’oestradiol sérique secrété par les cellules de la granulosa. Il constitue la première phase du

cycle sexuel et dure 1 à 2 jours en moyenne avec des extrêmes de 12 heures à 2 jours selon la

race (SHILLE V.M. et SOJKA N.J., 1995). Du point de vue comportemental, il est difficile de

faire la différence avec l’oestrus. Dans leur étude, SHILLE et al cités par FONTBONNE et

GARNIER (1998) ont observé un pro-oestrus lors de seulement 27 cycles sur 168.

Les hormones hypophysaires sont à l’origine, principalement pour la FSH, de la

croissance folliculaire.

Il est admis, en prenant modèle sur la chienne, que la concentration en FSH est faible

au début du pro-oestrus et que d’autre part ce même pro-oestrus marquerait le début de

l’augmentation de cette concentration.

La concentration en LH est quant à elle faible.

34

Lors de l’oestrus et du pro-oestrus, les oestrogènes sont sécrétés par les follicules

ovariens en croissance. Une augmentation spectaculaire de la concentration sérique des

oestrogènes est alors observée : c’est la phase folliculaire.

En période de repos sexuel, le niveau de base de 17β oestradiol se situe entre 25 et 56

pmol/L mais cette concentration devient supérieure à 70 pmol/L lors de la phase folliculaire

(FELDMAN E.C. et NELSON R.W., 2004). Les follicules mesurent alors entre 0.5 et 1.5 mm

(LIEGE P., 1992).

I.4.3 L’oestrus

L’oestrus est défini comme étant la phase de fécondité concomitante de la période de

maturation folliculaire et associée à la synthèse et sécrétion d’oestrogènes (FELDMAN E.C. et

NELSON R.W., 2004). Lors d’un cycle anovulatoire, cette phase folliculaire dure en moyenne

7,5 jours avec des extrêmes de 2 à 19 jours selon les races. Selon certaines études, l’oestrus

serait moins long quand le coït n’a pas eu lieu, mais d’autres ne rapportent pas de différence

significative (JOHNSTON S.D. et al, 2001a). Juste avant l’ovulation, les follicules mesurent

alors entre 2.5 et 4 mm (LIEGE P., 1992 ; FELDMAN E.C. et NELSON R.W., 2004).

Les études concernant les hormones hypophysaires ont essentiellement été faites sur la

chienne et moins chez la chatte.

Les sécrétions de FSH et de LH sont stimulées au début de l’oestrus et parallèlement le

nombre de récepteurs à la FSH et la LH augmente induisant une augmentation de la synthèse

d’oestrogènes par les follicules.

S’il y a coïts en qualité et quantité suffisantes, il y a augmentation de la pulsatilité de

GnRH hypothalamique. Ceci provoque une élévation sérique de LH jusqu’à un pic qui

survient rapidement (de 1 à 4 heures après le coït et qui dure plusieurs heures). La durée de

l’exposition de l’hypothalamus et de la partie antérieure de l’hypophyse au rétrocontrôle

oestrogénique influe directement sur la libération de LH post-coïtale (BANKS D.H. et

STABENFELD G.H., 1982).

35

Figure 3 :

Concentration sérique moyenne de LH au cours d'une activité copulatrice de 36 heures.

d’après CONCANNON (1989) .

Chez la chatte, si des coïts répétés ont lieu, 50 % des sujets ne libèrent plus de LH en

quantité suffisante pour déclencher l’ovulation au bout de 2 heures. Ce chiffre s’élève à 100%

au bout de 8 heures, traduisant le rétrocontrôle négatif de la libération de LH (THEVENARD C.,

1994). Ceci est mis en évidence dans la figure 3 : le nombre de copulation augmente sans

entraîner un nouveau pic de LH. Il est confirmé par le fait qu’une injection de GnRH après 36

heures d’accouplement induit une augmentation de la concentration sérique en LH : le stock

hypophysaire n’est donc pas épuisé (figure 3).

La concentration de FSH quant à elle atteint son maximum dans les 14 à 48 heures

après le pic de LH.

L’élévation de la concentration en oestrogènes, amorcée lors du pro-oestrus, se

poursuit lors de la phase folliculaire : elle passe de 42-53 pmol/L le premier jour pour

atteindre au moins 175 pmol/L au pic de sécrétion le 5ème jour. Chez la chatte, ces

concentrations sériques élevées sont nécessaires au fonctionnement de l’axe hypothalamo-

hypophysaire : les variations de concentration de 17 β-oestradiol sont journalières voire

36

horaires mais dans la grande majorité des cas elles sont supérieures à 20 pmol/L (SHILLE

V.M. et STABENFELD G.H., 1979).

Lorsque le coït n’a pas lieu et quelque soit le moment du cycle, la concentration de

progestérone est inférieure à 3 nmol/L. Ceci s’explique par la régression folliculaire sans

lutéinisation (FELDMAN E.C. et NELSON R.W., 2004).

I.4.4 L’interoestrus

L’interoestrus correspond sur le plan hormonal à une période d’inactivité des ovaires

entre deux vagues d’activité folliculaire : la concentration en 17 β-oestradiol retrouve des

valeurs basales (inférieures à 70 pmol/L). Sa durée moyenne est de deux semaines avec des

extrêmes de 3 à 30 jours selon la race, voire plus d’un mois pour certaines chattes (FELDMAN

E.C. et NELSON R.W., 2004).

I.4.5 L’anoestrus

L’anoestrus est la période de repos entre deux saisons sexuelles (FELDMAN E.C. et

NELSON R.W., 2004). Dans nos régions, il dure en moyenne trois mois, d’octobre à fin

décembre. Cette période est plus longue pour les races à poils longs que pour les races à poils

courts. On considère même que seulement 40 % des races à poils courts présentent un

anoestrus.

Les concentrations en hormones sexuelles se situent alors à des valeurs basales

(inférieures à 70 pmol/L pour l’oestradiol et à 3 nmol/L pour la progestérone).

37

I.5 Modifications macroscopiques et histologiques de l’ovaire

au cours d’un cycle

Lors de l’anoestrus, la surface de l’ovaire est lisse, les follicules ne dépassent pas 0,5

mm de diamètre (JOHNSTON S.D. et al, 2001a). Lors de l’oestrus, une moyenne de 4 follicules

(de 1 à 7) pré-ovulatoires se mettent en place (BOSSE P. et al, 1990), donnant un aspect

bosselé à l’ovaire. Après l’ovulation, les corps jaunes sont formés rapidement en 24 à 36

heures.

Ces corps jaunes ont une couleur jaune-orangée et peuvent atteindre 4,5 mm de

diamètre au pic de sa croissance c’est-à-dire 16 jours après l’ovulation (JOHNSTON S.D. et al,

2001a).

Si la copulation s’est montrée stérile ou si l’ovulation a été provoquée par stimulation

artificielle et qu’il n’y a pas eu gestation (pseudogestation), le corps jaune régresse en 30 à 36

jours (THEVENARD C., 1994).

Lors de l’oestrus, on observe parallèlement une dilatation de l’artère ovarique et de ses

collatérales, certes beaucoup plus modérée qu’en cas de gestation. Les ovaires prennent une

couleur plus rosée.

38

39

II INTERETS DE LA CRYOCONSERVATION DE

CORTEX OVARIENS

II.1 Intérêts en médecine humaine

Les connaissances dans le domaine de la cancérologie n’ont de cesse de progresser,

notamment au cours de la dernière décennie. De nos jours, la diversité et l’efficacité des

traitements anti-cancéreux (la radiothérapie, la chimiothérapie et plus récemment la

transplantation de moelle osseuse et de cellules souches hématopoétiques), ont permis

d’augmenter l’espérance de vie des patients, enfants ou adultes (POIROT C. et al, 2005 ;

COURBIERE B. et al, 2006).

Des objectifs qui paraissaient comme secondaires par rapport à la survie du sujet

peuvent être désormais envisagés, car la population d’individus survivant aux cancers

survenus lors de leur enfance augmente. On considère actuellement qu’une personne sur 250

sera atteinte par un cancer dans son enfance et que, parmi ces enfants et adolescents avec un

cancer diagnostiqué, les trois quarts auront une période de rémission d’au moins cinq ans

(POIROT C. et al, 2005).

Un des exemples les plus frappants concerne la maladie d’Hodgkin touchant la moelle

osseuse et qui constitue le cancer le plus fréquent dans la tranche d’âge 15-24 ans : le temps

de survie au-delà de cinq ans s’élève à plus de 90% (FENICHEL P., 2005). La sauvegarde de la

capacité de procréation devient donc un objectif légitime, et cette capacité est grandement

diminuée par la radiothérapie et/ou la chimiothérapie qui sont à l’origine de dommages

ovariens et d’une ménopause prématurée.

En outre, certaines maladies non cancéreuses provoquent une ménopause précoce,

comme le syndrome de Turner particulièrement (absence d’un chromosome X responsable

d’une dysgénésie ovarienne), ou la galactosémie congénitale (à l’origine d’une diminution du

stock d’ovogonies initiales). Néanmoins dans le cas du syndrome de Turner seulement 50%

des fillettes atteintes présentent des follicules dans les ovaires, et seules celles-ci pourraient

donc être aidées par cette technique.

40

Un prélèvement précoce de cortex ovarien dès que la pathologie est identifiée, aussi

bien chez l’adulte que chez la fillette, lorsque le stock folliculaire est le plus important

possible permettrait de conserver une chance de maternité pour plus tard. Ceci est d’autant

plus vrai chez la jeune fille prépubère pour laquelle d’autres méthodes, comme la

cryoconservation d’embryons ou d’ovocytes matures, ne sont pas possibles (POIROT C. et al,

2005).

II.1.1 Insuffisance ovarienne après traitement anti-cancéreux

Les traitements anti-cancéreux entraînent des lésions gonadiques graves qui touchent

aussi bien les follicules antraux en croissance que les follicules primordiaux : le stock

folliculaire est réduit. Il en résulte une insuffisance ovarienne endocrine et exocrine. Les

principaux troubles observés consistent en une baisse de la fertilité et des perturbations du

cycle selon différentes modalités : impubérisme, insuffisance ovarienne précoce ou tardive.

Les effets néfastes de la radiothérapie et de la chimiothérapie sont considérés comme

plus marqués sur les follicules en croissance, et l’ovaire est réputé plus résistant avant la

puberté. Il apparaît toutefois que certains protocoles thérapeutiques pourraient être à l’origine

de perturbations du développement pubertaire ou d’une insuffisance ovarienne précoce : 40%

des femmes traitées par agents alkylants dans l’enfance et encore réglées à 21 ans sont

définitivement aménorrhéiques avant l’âge de 30 ans (BYRNE J. et al, 1987).

Chez la jeune femme, une aménorhée secondaire est observée après chimiothérapie

dans une proportion variant entre 40 et 68% (MEIROW D., 2000). Elle est considérée comme

définitive à partir de six mois après la fin du traitement.

De nombreux cas de figures peuvent être observés, allant de la reprise d’un cycle

normal à la fin du traitement à l’installation de troubles voire à une insuffisance ovarienne

précoce quelques mois après (MEIROW D., 2000).

41

II.1.2 Dommages occasionnés par la radiothérapie

Les effets néfastes de la radiothérapie sur les fonctions ovariennes dans leur degré

d’importance et leur persistance dépendent de la dose (durée et répétition), du champ de

radiation et de l’âge de la patiente (FENICHEL P., 2005).

Les femmes les plus âgées sont les plus touchées en particulier parce qu’elles ont un

pool ovocytaire plus faible. Cette relation avec l’âge a été mise en évidence par MEIROW

(2000) et confortée par BLUMENFELD qui rapporte une fréquence d’aménorrhée définitive de

21 à 71% avant 40 ans et de 49 à 100% à partir de 40 ans (BLUMENFELD Z. et al, 1999).

Les patientes les plus touchées seront celles devant subir une radiothérapie sous-

diaphragmatique (FENICHEL P., 2005): carcinome du col de l’utérus, du colon, ou une

radiothérapie crânio-spinale dans le cas d’une atteinte du système nerveux central.

Sont touchées également les patientes souffrant d’une atteinte de la moelle osseuse

(leucémie, lymphome, maladies auto-immunes ou immuno-déficitaires) nécessitant une

irradiation de la moelle osseuse déficiente donc une irradiation corporelle totale avant une

transplantation de moelle saine. Dans ce cas une chimiothérapie intensive est également

associée ayant pour résultat une défaillance ovarienne chez plus de 92% des sujets (MEIROW

D., 2000).

Du point de vue de l’importance de la dose, il est admis chez la femme que la moitié

des follicules est détruite à partir de 4 grays (DL 50) (WALLACE et al, cité par DEMIRCI B.

(2002)). A partir de 20 grays, la défaillance ovarienne est totale alors qu’entre 7 et 20 grays, le

risque augmente avec la dose délivrée (THIBAUD et al, cité par FENICHEL P. (2005)). Il

apparaît également qu’une dose unique serait plus néfaste que des doses fractionnées ayant la

même valeur totale.

L’exposition directe des ovaires aux rayonnements primaires peut être évitée par la

mise en place de protections ou par la réduction des champs d’irradiation, mais dans certains

cas il n’y a pas d’alternative possible.

42

II.1.3 Dommages occasionnés par la chimiothérapie.

Différentes classes d’agents chimiothérapeutiques sont utilisées. Parmi elles, les

agents alkylants sont les plus nocifs et sont responsables de la majorité des insuffisances

ovariennes.

Leur mécanisme d’action, encore imparfaitement compris et maîtrisé, se traduit par

une accélération de l’atrésie des follicules primordiaux. MEIROW (2000), dans son étude sur

168 femmes non ménopausées traitées par chimiothérapie, montre une insuffisance ovarienne

chez 42,4% des sujets lors de l’utilisation d’agents alkylants contre 14% lorsqu’ils ne sont pas

utilisés.

Le type de cancer mis en cause ainsi que l’éventuelle association de plusieurs agents

chimiothérapeutiques entre également en ligne de compte, ainsi que l’âge : les femmes âgées

ont une défaillance ovarienne complète et une infertilité permanente plus fréquemment que

les femmes jeunes. D’après DROR (2000), dans le cas de l’utilisation du cyclophosphamide,

une dose totale de 20,4 grays avant 30 ans peut entraîner une insuffisance ovarienne précoce

définitive alors qu’il suffit de 5,2 grays à partir de 40 ans.

II.1.4 Méthodes couramment utilisées pour sauvegarder la

capacité de procréation

Différentes méthodes sont envisageables pour la conservation de la faculté de

procréation chez la fillette et la femme, qui ont toutes leurs limites (COURBIERE B. et al,

2006) :

- la congélation d’ovocytes après induction de l’ovulation n’est applicable ni chez la

fillette, ni en cas d’envahissement tumoral de l’ovaire chez la femme pubère. Elle nécessite un

délai de trois semaines minimum après la stimulation ce qui retarde le début de la

chimiothérapie. Cette méthode n’en est qu’au stade expérimental ;

43

- la transposition ovarienne chirurgicale (ovariopexie), qui consiste à déplacer

l’ovaire hors du champ de radiations primaires, est une méthode lourde qui ne protège que de

la radiothérapie et de manière imparfaite notamment en raison de l’exposition à des

rayonnements secondaires ;

- la congélation d’embryons est soumise aux lois de bioéthique relatives à l’Assistance

Médicale à la Procréation. Elle impose ainsi un projet parental. La tentative de fécondation in

vitro nécessaire à la congélation entraîne de plus un retard à la mise en route d’un traitement

anti-cancéreux ;

- le maintien des follicules primordiaux à l’état quiescent en bloquant l’axe

hypothalamo-hypophysaire à l’aide d’agonistes de la LHRH est une méthode qui semble

prometteuse au vu des résultats obtenus par BLUMENFELD (1999), mais aucune démonstration

formelle n’existe, cette étude n’étant pas randomisée (FENICHEL P., 2005) ;

- la congélation des ovocytes au stade métaphase I issus des follicules antraux ;

- la cryoconservation des cortex ovariens est donc une perspective encourageante. Elle

consiste dans l’isolement des cortex ovariens après prélèvement d’un ovaire entier suivi de sa

congélation contrôlée. Le prélèvement peut se faire dès le plus jeune âge par des méthodes

peu invasives notamment la coelioscopie. Les protocoles expérimentaux ne sont pas d’une

grande lourdeur et peuvent être standardisés à des coûts non prohibitifs. Les grands avantages

de cette méthode sont les suivants :

� la grande richesse des cortex ovariens en follicules primordiaux et primaires

sans nécessité d’avoir recours à des traitements hormonaux, surtout dans le cas des femmes

jeunes (moins de 35 ans);

� la certitude de ne pas réimplanter de cellules malignes à la patiente après

traitement a longtemps été prônée. Une étude a cependant montré qu’une transmission chez la

souris était possible (SHAW J.M. et al, 1996). La xénogreffe est donc la seule technique

totalement sûre à l’heure actuelle ;

44

� son exploitation expérimentale en accord avec les lois de bio-éthique.

L’article L.2141-11 de la loi de bio-éthique n°2004-800 du 6 août 2004 stipule en effet

que « en vue de la réalisation ultérieure d’une assistance médicale à la procréation, toute

personne peut bénéficier du recueil et de la conservation de ses gamètes ou de tissu germinal

(…), lorsqu’une prise en charge médicale est susceptible d’altérer sa fertilité (…) ». Le flou

règne cependant encore sur l’application de cette loi en dehors des protocoles de recherche

(COURBIERE B. et al, 2006).

II.2 Intérêts en médecine vétérinaire

La recherche médicale humaine dans le domaine de la cryopréservation de tissu et de

follicules ovariens utilise différentes espèces animales comme modèle expérimental : la souris

pour la commodité des manipulations, de l’élevage et la courte durée de la folliculogénèse

(CANDY C.J. et al, 1997) ; et la brebis pour la similitude morphologique et physiologique

ovarienne avec l’espèce humaine (DEMIRCI B. et al, 2001).

Des applications directes aux espèces animales peuvent cependant être envisagées.

II.2.1 Protection et préservation des espèces et races en voie

d’extinction

Chaque année la Commission de Survie des Espèces de l’UICN (Union Internationale

pour la Conservation de la Nature) établit une « Liste Rouge » recensant les espèces en

danger. Cette commission déclare officiellement, dans un communiqué de presse du 2 mai

2006, que la perte de biodiversité s’accélère au lieu de ralentir (THE WORLD CONSERVATION

UNION (I.U.C.N)) : 784 espèces sont déclarées éteintes et 65 autres n’existent qu’en captivité

ou en culture. Sur les 40117 espèces évaluées à partir des critères de la Liste Rouge, 16119

sont déclarées menacées d’extinction à cette date. Un mammifère sur quatre peut être

considéré en péril, ce qui est conforté par les observations de la CITES (convention sur le

commerce international des espèces de faune et de flore sauvages menacées d’extinction) qui

placent 228 espèces de mammifères et 21 sous-espèces de mammifères en Annexe I,

considérant ces dernières en voie de disparition (CONVENTION ON INTERNATIONAL TRADE IN

ENDANGERED SPECIES OF WILD FAUNA AND FLORA (C.I.T.E.S)).

45

Dans le cas des félidés, le chat domestique que nous étudions ici, est la seule espèce

sur les 38 recensées à ne pas être menacée d’extinction (LIMA A. et al, 2006).

L’étude de la population des races au sein d’une même espèce par la FAO

(Organisation des Nations-Unies pour l’Alimentation et l’Agriculture) montre qu’un millier

d’entre elles a été perdu lors du siècle dernier. Or le consensus est fait sur la nécessité

d’utiliser le plus grand nombre de races animales d’élevage afin de conserver les ressources

génétiques.

Actuellement, les principales méthodes utilisées pour la conservation des espèces et

races menacées consistent en la protection d’un effectif limité au sein d’un territoire délimité

et surveillé (réserve naturelle, parc géographique), la conservation de populations limitées en

parc zoologique avec mise en place de programmes de reproduction adaptée, et l’emploi de

biotechnologies.

L’illustration en est faite avec les programmes mis en œuvre pour la sauvegarde des différents

félins d’Amérique latine (SWANSON W.F. et BROWN J.L., 2004):

- congélation de sperme suivie d’insémination artificielle par voie trans-utérine sous

laparoscopie ;

- fécondation in vitro (FIV) ;

- congélation d’embryons et transfert d’embryons dans le cas de femelles ocelots et de

tigresses. Jusqu’à aujourd’hui, 75 embryons d’ocelots et 50 de tigresses issus de FIV ont été

congelés. 2 gestations ont été rapportées chez l’ocelot suite au transfert d’embryons congelés/

décongelés. D’autres travaux ont été réalisés chez d’autres espèces de Félidés sauvages par

POPE et al (2006). Cette équipe a réalisé une récolte de follicules pré-antraux après

stimulation hormonale à l’aide de gonadotrophines. Ces follicules ont subi une maturation in

vitro. Après transfert de 6 embryons de 10 jours, une gestation suivie de la naissance d’un

chaton a été obtenue chez le chat viverin (Prionailurus viverrinus). Chez le Caracal (Caracal

Caracal), la naissance de deux chatons a été obtenue par la même méthode. Chez cette

dernière espèce, trois gestations puis trois chatons sont nés après congélation, décongélation

puis transfert d’embryons.

Ainsi la cryoconservation de cortex ovariens pourrait permettre d’envisager la création

d’une banque de gamètes femelles qui constituerait le pendant d’une banque de

46

spermatozoïdes et augmenterait la réserve génétique et les combinaisons possibles au sein

d’une population, alors qu’à l’heure actuelle le patrimoine génétique de chaque femelle est

perdu lors de sa mort.

Swanson (SWANSON W.F., 2006) soulève cependant quelques problèmes concernant

l’utilisation des techniques de reproduction assistée. Leur coût en terme de logistique,

d’équipement scientifique, de main d’œuvre, de recherche peut s’avérer important. Leurs

progrès restent trop lents par rapport à la vitesse de déclin des espèces menacées, et leur

application nécessiterait la mise en place de programmes internationaux, bravant les clivages

politiques et économiques. Ces obstacles conduisent l’auteur à douter du bénéfice réel

qu’apporteront les biotechnologies de la reproduction dans le futur.

II.2.2 Préservation du patrimoine génétique des animaux

domestiques

Depuis la mise en place de programmes de sélection dans certaines races domestiques,

en particulier chez la vache laitière, la volonté d’utiliser les meilleurs individus comme

géniteurs, et ce sur plusieurs générations, a engendré une augmentation du degré de parenté et

donc du niveau moyen de consanguinité (HANSEN L.B., 2000).

L’augmentation du degré de consanguinité induit une augmentation de l’homozygotie

et s’accompagne d’effets délétères notamment sur la fitness, c’est à dire l’aptitude à survivre

et à se reproduire. C’est la dépression consanguine, dont les effets délétères sont provoqués le

plus souvent par la combinaison de deux allèles récessifs. Les conséquences les plus

fréquentes consistent en une augmentation de la mortalité embryonnaire, une réduction de la

fertilité et de la prolificité.

Considérons une population d’animaux bien délimitée, telle qu’un troupeau par

exemple. Au sein de cette population, seuls les reproducteurs interviennent dans la

transmission du capital génétique : ils constituent la population effective Ne.

WRIGHT, en 1922, a défini la variation de consanguinité ∆F d’une population d’une

génération à une autre comme étant égale à (WRIGHT S., 1922):

47

∆F=½Ne qui se transforme en ∆F=½(1/Nm + 1/Nf)

avec Nf la population de reproducteurs femelles et Nm la population de reproducteurs mâles.

D’après cette formule, une augmentation de Nf créée par la création d’une banque de

gamètes femelles permettrait de diminuer la consanguinité même pour un Nm faible, mais

aussi de conserver le polymorphisme génique de la population de départ.

La cryoconservation de cortex ovariens ne viendrait ici qu’en complément des

techniques existantes. On peut en outre imaginer que ce qui se produit dans le cadre des

schémas de sélection en race laitière (Holstein), à savoir le choix des meilleurs géniteurs

mâles qui assurent la grande majorité des fécondation par le biais de l’insémination artificielle

et réduisent par conséquent le polymorphisme génique, peut se reproduire dans le cas de la

création d’une banque de gamètes femelles.

II.3 Intérêts techniques : diversité des modalités d’utilisation

de fragments ovariens congelés.

II.3.1 Autogreffe

L’autogreffe de cortex ovariens consiste à greffer le fragment congelé ou non sur le

même individu. Elle peut-être réalisée soit de manière orthotopique sur le pédicule vasculaire

ou dans la bourse ovarienne dans le but d’obtenir une ovulation suivie de gestation naturelle,

soit de manière hétérotopique ailleurs qu’à son emplacement anatomique (sous la capsule

rénale, la peau de l’avant bras ou de l’abdomen). Un ovocyte est alors récupéré pour une

fécondation in vitro après le déroulement in vivo de la folliculogénèse.

Cette technique présente néanmoins de gros inconvénients. Le délai nécessaire à la

revascularisation, estimé à une semaine chez la brebis (BAIRD D.T. et al, 2004) engendre une

forte perte folliculaire avec des facteurs aléatoires comme le bon déroulement de la

cicatrisation, et la possibilité de réimplanter des cellules cancéreuses. SHAW et al (1996) ont

montré que la greffe de tissu ovarien de patientes atteintes de lymphome peut transmettre ce

cancer à des souris receveuses.

48

GOSDEN a obtenu en 1994 les premières gestations chez la brebis après greffe de tissu

ovarien sur le ligament infundibulopelvien (GOSDEN R.G. et al, 1994). Toujours chez la

brebis, SALLE et al (2002) ont obtenu des gestations après greffe d’hémiovaires sur le

pédicule ovarien sans avoir effectué d’anastomoses vasculaires. La restauration de la fonction

ovarienne a nécessité environ 5 à 6 mois lors de ce protocole. De plus, certaines brebis

greffées ont donné naissance à des agneaux une nouvelle fois deux ans après la greffe. Ces

résultats corroborent ceux de BAIRD et al qui affirment que l’activité du greffon peut s’étendre

jusqu’à 22 mois après greffe (BAIRD D.T. et al, 2004).

Chez la souris des naissances ont également été obtenues après greffe d’ovaires entiers

(CANDY C.J. et al, 2000). Dans le cas de l’étude de CANDY et al, l’activité hormonale des

greffons a été restaurée pendant 11 mois.

Chez la femme, OKTAY et al ont obtenu une ovulation après stimulation à partir d’un

greffon congelé (OKTAY K. et KARLIKAYA G., 2000). RATFORD et LIEBERMAN (2001) a réussi

à restaurer l’activité ovarienne sans stimulation après une chimiothérapie. La patiente était

atteinte de la maladie de Hodgking.

La première naissance d’un bébé humain à partir d’un fragment ovarien congelé puis

décongelé a été obtenue par DONNEZ et al en 2005 chez une patiente ayant souffert d’un

lymphome (DONNEZ J. et DOLMANS M.M., 2004). Le même auteur remarque la mise en place

d’une néovascularisation et la présence de follicules primordiaux normaux après biopsie de

greffons chez deux patientes atteintes d’endométriose (DONNEZ J. et al, 2005).

Quelques résultats ont également été obtenus dans le cas de l’autogreffe hétérotopique,

avec notamment la restauration de la fonction ovarienne après la greffe de tissu ovarien sous

la peau de l’avant-bras (OKTAY K. et al, 2000a). Le but recherché est de limiter le temps

d’ischémie en implantant le greffon dans une zone richement vascularisée. En 2004, la même

équipe a obtenu des embryons humains après autogreffe de cortex ovariens décongelés sous

la peau de l’abdomen, ponction ovocytaire et fécondation par ICSI (Injection Intra-

Cytoplasmique de Spermatozoïdes). Les grossesses n’ont malheureusement pas été menées à

terme.

II.3.2 Allogreffe

49

L’allogreffe consiste en une greffe d’un individu à un autre de la même espèce, qui est

par conséquent appelé receveur. Cette voie d’expérimentation est assez peu utilisée mais

quelques études ont donné des résultats probants.

Des souriceaux issus d’hémiovaires greffés sous la capsule rénale de souris receveuses

mâles et femelles ont été obtenues. Des follicules antraux ont été ponctionnés, ont subi une

maturation in vitro suivie d’une fécondation in vitro. Les embryons obtenus ont été transférés

dans des receveuses pseudogestantes (WATERHOUSE T. et al, 2004). PETROIANU et al ont

greffé des ovaires entiers de lapines à d’autres lapines de race différente sous traitement

immunosuppresseur et obtenu 50 % de gestation (PETROIANU A. et al, 2002).

II.3.3 Xénogreffe

La xénogreffe est la greffe de tissu d’un individu à un autre individu n’appartenant pas

à la même espèce. Elle est réalisée sur des individus immuno-déficients dits Nude (sans

lymphocytes T), SCID (sans lymphocytes T ou B) ou encore NOD SCID (diabétique), très

souvent des souris. La capsule rénale est le site privilégié de greffe pour cette technique (ABIR

R. et al, 2003), mais le greffon peut également être placé sous la peau. Des résultats

encourageants ont été obtenus, notamment l’obtention de jeunes follicules antraux après

greffe de fragments ovariens non congelés de femmes à des souris SCID (OKTAY K. et al,

1998; GOOK D. et al, 2001 ). La maturation in vitro de ces follicules n’a cependant pas pu être

menée à son terme. La reprise de la croissance folliculaire a été observée après greffe de tissu

ovarien congelé puis décongelé sur des souris SCID (OKTAY K. et al, 2000b). Une équipe

anglo-saxonne a obtenu une ovulation et la mise en place d’un corps jaune sécrétant de la

progestérone après greffe de tissu ovarien cryoconservé sous la peau d’une souris SCID (KIM

S.S. et al, 2001). L’administration de gonadotropines a parfois été utilisée lors de ces études

afin d’améliorer la croissance folliculaire.

L’obtention de follicules antraux par xénogreffe est rapportée chez de nombreuses

espèces : chez la brebis et le chat (GOSDEN R.G. et al, 1994), le marmouset (CANDY C.J. et al,

1995), et notamment pour l’éléphant d’Afrique (GUNASENA K.T. et al, 1998), ce qui constitue

une voie d’espoir concrète pour les espèces sauvages menacées.

Toutefois cette technique se heurte aux barrières de l’éthique : le fait qu’une souris

puisse contribuer à concevoir un être humain peut se révéler difficile à accepter pour certains.

50

Des réponses sont attendues en ce qui concerne la sécurité sanitaire et la possible survenue de

phénomènes épigénétiques qui ne seraient pas sans conséquences sur le génotype humain

(COURBIERE B. et al, 2006).

La maturation in vitro suivie d’une fécondation in vitro est ici obligatoire.

II.3.3 Culture et maturation in vitro

La culture in vitro des follicules dans leur cortex permettrait de pouvoir contrôler

toutes les étapes de la folliculogénèse et de l’ovogénèse, en toute sécurité. La reprise d’une

activité cellulaire serait certainement plus facile au sein de son tissu d’origine, support

physique et physiologique (contenant des facteurs de croissance notamment) (PICTON H.M. et

GOSDEN R.G., 2000).

Néanmoins de nombreuse étapes doivent être contrôlées (PICTON H.M. et GOSDEN

R.G., 2000):

- l’initiation de la croissance des follicules primordiaux ;

- la formation de la cavité antrale ;

- l’induction de fonctions différenciées des cellules folliculaires contribuant à

la maturation cytoplasmique de l’ovocyte ;

- la maturation nucléaire.

Toutes les interactions cellulaires et mécanismes ne sont pas tous connues. Seul le

protocole établi par EPPIG et al. (1996) a abouti à l’obtention d’un follicule antral à partir de

primordiaux, et à la naissance d’un souriceau.

Ce protocole comporte deux phases . En premier lieu, des ovaires de souris nouveaux nées (ne

contenant que des follicules primordiaux sont cultivés 8 jours à 37°C et 5% CO2 dans l’air,

sur une membrane et recouverts d’un film de milieu spécifique pour l’initiation de la

croissance folliculaire. En second lieu, après 8 jours, les complexes ovocytes-cellules de la

granulosa sont isolés par action enzymatique d’un mélange de collagénase et de DNase. Les

complexes sont ensuite cultivés sur membrane à 37°C, 5 % CO2 , 5 % O2, 90 % N2 pendant 10

jours dans un premier milieu puis 6 jours dans un deuxième de composition plus simple. Ces

conditions permettent l’apparition de la thèque puis de l’antrum.

51

Ces conditions de culture ont été améliorées par la suite, permettant la naissance de 59

souriceaux sains (O'BRIEN MJ. et al, 2003).

_

La cryopréservation de tissu ovarien ouvre de nouvelles perspectives en médecine

humaine et vétérinaire. Ses applications peuvent être envisagées à une échelle individuelle,

au cas par cas, pour la préservation de la fertilité féminine. Elle peut également entrer dans le

cadre de programmes internationaux de sauvegarde d’espèces menacées. La recherche dans ce

domaine a toutefois connu un essor tardif en comparaison avec la congélation de sperme, en

raison notamment d’une plus grande difficulté de maîtrise technique. Nous allons maintenant

étudier les principes physiques et chimiques qui conditionnent la réussite de la congélation

cellulaire et tissulaire, en comprenant bien qu’elle est étroitement liée à la physique de l’eau.

52

53

III DONNEES FONDAMENTALES ET ACTUELLES

DE LA CRYOPRESERVATION

Quelques définitions sont nécessaires pour commencer.

La congélation est le changement d’état entre les phases liquides et solides d’un corps, ici

l’eau.

La cryobiologie est la science qui étudie les évènements cellulaires qui se produisent à des

températures négatives.

La cryoconservation correspond simplement à la conservation par le froid alors que la

cryoprotection se réfère à la protection de cellules, tissus, ou organes stockés à long terme

après refroidissement à des températures négatives.

III.1 Congélation de l’eau

III.1.1 Généralités

L’eau est le seul composé naturel qui se trouve sous trois formes à la surface de notre

planète : liquide, gazeuse et solide (glace) selon la température et la pression. C’est en effet la

pression atmosphérique particulière (1013 hPa) qui permet à l’eau d’exister à l’état liquide.

Une molécule d’eau est formée de deux atomes d’hydrogène et d’un atome d’oxygène

liés par des liaisons covalentes de forte énergie. La répartition des électrons dans cette liaison

O-H n’est pas symétrique comme le montre la figure 4. Ce déséquilibre de la répartition des

charges électriques, conjugué avec la géométrie non linéaire de la molécule d’eau, se

manifeste par l’existence d’un fort moment dipolaire électrique (ODAGESCU V.M., 2005).

54

Figure 4 :

Géométrie et répartition de charges de la molécule d'eau .

Ce déséquilibre est à l’origine de la formation de liaisons entre molécules d’eau

voisines, de faible énergie (20 kJ/mol) et très fugaces appelées liaisons hydrogènes. Elles

existent sous les trois états de l’eau en nombre plus ou moins important.

La glace a une structure cristalline dans laquelle chaque molécule d’eau est liée avec

quatre molécules voisines, alors que dans l’eau liquide, elle l’est avec 3,6 molécules en

moyenne. Le changement d’état se fait en rompant ces liaisons hydrogènes. La solidification

s’accompagne donc d’un dégagement de chaleur (réaction exothermique) alors que

réciproquement la fusion nécessite un apport d’énergie. La température de congélation de

l’eau pure est de 0°C ; c’est la température pour laquelle l’eau et la glace coexistent en

équilibre tant que toute l’eau n’est pas changée en glace (KAROW A.M., 2001).

55

Figure 5 :

Courbe de congélation de l'eau pure.

d’après KAROW (2001).

.

Cette courbe n’est valable que pour l’eau pure et de petits volumes (moins de 1 mL)

qui ne font pas entrer en compte des problèmes liés aux différences de conductivité thermique

de l’eau et de la glace.

III.1.2 Pic de surfusion

Cependant pour que l’eau pure cristallise à la pression atmosphérique, elle doit être

refroidie en deçà de 0°C. Dans l’intervalle entre 0°C et la température où les cristaux de glace

commencent à se former, l’eau est dans un état instable appelé surfusion (figure 5) (MAZUR

P., 1970 ; KARLSSON J.M. et TONER M., 1996; KAROW A.M., 2001 ; WOLFE J. et BRYANT G.,

2001 ). Lorsque la cristallisation commence, la chaleur latente de fusion (334 J/g) est libérée

ce qui entraîne une remontée en température jusqu’à 0°C où la cristallisation se poursuit

jusqu’à être totale.

Pour certains auteurs, il existerait plusieurs pics de surfusion successifs avec un

intervalle de températures qui s’atténueraient de l’un à l’autre jusqu’à une stabilisation de la

température à 0°C. Cela n’a pas été démontré expérimentalement.

56

III.1.3 Phénomène de nucléation

A l’état liquide, les molécules d’eau sont en perpétuel mouvement, de nombreuses

liaisons hydrogènes se créent et se cassent entre elles. Lorsque la température s’abaisse (en

dessous de 0°C), l’énergie disponible est moins importante, la cinétique est ralentie et les

molécules forment de petits réseaux. Dans l’eau pure en surfusion, ces réseaux se forment et

se dissipent très rapidement. Cependant s’ils atteignent une taille suffisamment importante

dite critique qui correspond à un rayon critique, ils deviennent énergétiquement favorables à

ce que d’autres molécules s’ajoutent à la structure dont la taille, par conséquent, augmente

(KAROW A.M., 2001).

Ce phénomène est appelé nucléation dans le sens où la cristallisation nécessite la

présence de « noyaux » permettant la croissance des cristaux de glace dès lors que la barrière

énergétique est levée : on parle d’énergie d’activation (KARLSSON J.M. et TONER M., 1996;

KAROW A.M., 2001 )

En outre, la taille des amas moléculaires et par conséquent l’énergie d’activation

nécessaire à l’initiation de la cristallisation, dépendent de la température: plus elle est basse,

plus le rayon critique du noyau est petit, et plus la probabilité de nucléation est faible.

Figure 6 :

Rayon critique du noyau de nucléation en fonction de la température.

d’après KAROW (2001).

On peut maintenir un petit volume d’eau pure (0.5 mL) en surfusion jusqu’à – 40°C

(WOLFE J. et BRYANT G., 2001).

57

Ce type de nucléation de l’eau pure, spontanée, est appelé nucléation « homogène »

(KAROW A.M., 2001; WOODS E. et al, 2004 ).

III.1.4 Cas des solutions aqueuses

L’eau contenue dans les cellules n’est pas pure, elle peut être assimilée à une solution

aqueuse qui contient des électrolytes, des protéines et d’autres solutés qui modifient ses

propriétés physico-chimiques. Toute solution aqueuse possède une température de

congélation qui dépend de sa concentration en solutés et de la pression à laquelle elle est

soumise. D’après la loi de Raoult, cette température diminue avec l’augmentation de la

concentration du milieu.

En conséquence, la température du début de congélation (notée Tc) n’est pas la même

que la température de fin de congélation (notée Tf) car les électrolytes qui restent dans la

partie non gelée se concentrent au fur et à mesure que celle-ci croît. On obtient alors une

nouvelle courbe de congélation :

Figure 7 :

Courbe de congélation d’une solution aqueuse.

D’après Lornage (1994).

De plus, les électrolytes et autres impuretés (en regard de l’eau pure) peuvent agir

comme des centres de nucléation et initier la cristallisation en permettant de franchir la

58

barrière énergétique : ce type de nucléation est dite « hétérogène » (KARLSSON J.M. et TONER

M., 1996; KAROW A.M., 2001 ). La concentration de la solution influe sur ce phénomène :

plus elle croît, plus la probabilité de nucléation baisse.

III.2 Composition schématique d’une cellule, conséquences

sur la cryopréservation

WOLFE et BRYANT (2001) définissent trois domaines de températures auxquelles sont

exposées les cellules lors de la congélation : les températures froides (chilling) supérieures à

0°C, les températures de congélation (freezing) comprises entre 0°C et – 40°C et les très

basses températures (en dessous de -40°C).

III.2.1 Les membranes lipidiques

La cellule est délimitée du milieu extracellulaire par sa membrane plasmique.

Sommairement, elle est constituée d’une bicouche phospholipidique à rôle architectural et de

glycoprotéines à rôle architectural, de transport ou enzymatique. La figure 8 en donne une

illustration tridimensionelle.

59

Figure 8 :

Structure de la membrane plasmique d'une cellule animale

(MATHIEU R., 1995).

Ce système n’est pas rigide mais peut être assimilé à une mosaïque fluide, système

décrit par SINGER et NICHOLSON (1972) dans lequel les molécules sont sujettes à une véritable

dynamique : différents types de mouvements les animent (SHINITSKY M., 1984 ; LETERRIER F.

et GARY-BOBO C.L., 1989):

- diffusion latérale à une fréquence de 10-8 à 10-9 Hz, l’un des plus

importants qui affecte tous les constituants ;

- rotation axiale ;

- flip-flop : les phospholipides peuvent basculer d’un feuillet à l’autre ;

- flexion des chaînes d’acides gras ;

- mouvements liés aux protéines plus lents (de l’ordre de 10-4 Hz).

L’eau peut diffuser librement à travers la bicouche phospholipidique. Des pores de 20

à 50 Ä de diamètre permettent ce passage membranaire, mais ils ne sont pas présents sur tous

les types cellulaires et en nombre suffisant pour expliquer les vitesses de diffusion

observables expérimentalement. D’autres mécanismes, de type transport membranaire et

diffusion simple, sont donc avancés (LETERRIER F. et GARY-BOBO C.L., 1989).

60

Les membranes lipidiques entrent dans la composition d’autres organites cellulaires :

(mitochondries, appareil de Golgi, reticulum endoplasmique)

La membrane cellulaire est donc une structure en proie à une cinétique susceptible de

varier selon les paramètres physico-chimiques de l’environnement.

Ainsi lors du refroidissement, la cinétique de cette mosaïque fluide est modifiée, un

changement de phase de la bicouche lipidique est observé, par augmentation des interactions

entre les chaînes carbonées, qui passerait par analogie de vocabulaire, d’un modèle de cristal

liquide à un modèle de cristal « gelé » beaucoup plus rigide et sensible aux déformations.

HOCHMUTH cité par MAZUR (2005a) a étudié les effets de la température sur la déformation

des globules rouges: ils mettent 4 à 5 fois plus de temps à retrouver leur forme initiale après

élongation à 4°C qu’à 37°C. Cette transition se fait à des températures variables selon la

composition membranaire mais qui sont supérieures à 0°C.

Dans le cas d’un follicule ovarien de vache au stade VG cette transition s’effectue

entre 13 et 20°C, et à 10°C pour un follicule mature (métaphase II) (FARRANT J. et MORRIS

G.J., 1973 ; ARAV A. et al, 1996).

Il s’agit d’une des composantes du choc thermique (ARAV A. et al, 1996) défini

comme les dommages irréversibles occasionnés lors de l’exposition brève à des températures

basses mais supérieures à 0°C.

III.2.2 Le cytosquelette

Le cytosquelette est un ensemble de fibres qui parcourt le cytoplasme. Sa fonction

principale consiste à apporter un soutien mécanique et à lui conserver sa forme. Il comprend

au moins trois sortes de fibres dont les deux principales sont les microtubules et les filaments

d’actine (MATHIEU R., 1995).

Les microtubules sont des polymères d’une protéine: la tubuline, et les filaments

d’actine sont des polymères de sous unités d’actine. Ils sont donc sensibles à l’équilibre

ionique et aux modifications de pH qui se produisent au cours de la congélation.

Outre leur fonction architecturale, ces fibres interviennent également dans la division

cellulaire et notamment la formation des fuseaux méiotiques.

61

Chez la souris, la brebis et l’homme, une dépolymérisation des fuseaux méiotiques des

ovocytes en métaphase II se produit lors de l’abaissement de la température aux alentours de

10°C, elle est plus ou moins réversible selon les espèces : une repolymérisation a été observée

chez la souris (SONGSASEN N. et al, 2002) après incubation pendant une heure à 37°C, mais

chez les autres espèces celle-ci est rare.

Cette dépolymérisation expliquerait une mauvaise répartition des chromosomes

(aneuploïdie, polyploïdie) et également une expulsion prématurée des granules corticaux

(DEMIRCI B. et al, 2002).

Cette altération du cytosquelette est une autre composante du choc thermique.

III.3 La cristallisation intracellulaire

III.3.1 Répartition de l’eau cellulaire

On distingue l’eau libre de l’eau liée située à la périphérie des macromolécules telles

que les protéines ou le cytosquelette. D’après FRANKS (1977), il faut distinguer 3 types de

molécules d’eau au voisinage des protéines et des ions :

- les molécules d’eau contenues à l’intérieur même des macromolécules : couche

d’hydratation primaire ;

- les molécules d’eau adsorbées à la surface des différents constituants biologiques

(faisant intervenir les propriétés polaires de l’eau) : couche d’hydratation

secondaire ;

- l’eau libre située à distance.

Les deux premières catégories étant peu mobiles et orientées, leur solidification est

retardée par rapport à l’eau libre car leur arrangement géométrique est différent de celui

imposé dans les cristaux de glace et car elles ne participent pas à la cristallisation et à la

croissance des cristaux. On considère que les surfaces intracellulaires exercent leur influence

sur les molécules d’eau sur une distance qui peut aller jusqu’à 30 Ä ; ce qui concernerait au

moins 20% de l’eau cellulaire, davantage selon d’autres auteurs (MANDELBAUM J., 1999).

62

III.3.2 Dégâts occasionnés par la cristallisation intracellulaire

Lors de la congélation, l’eau solide peut se retrouver sous trois formes selon les

variations de température et de pression (ODAGESCU V.M., 2005):

- sous forme cristallisée en réseau hexagonal : seule structure stable à la surface de la

terre;

- sous forme cristallisée en réseau cubique, état métastable;

- sous forme vitrifiée : l’eau est gelée en l’état sans réorganisation moléculaire par

rapport à l’eau liquide (cristal amorphe), donc sans perturbation mécanique.

MAZUR a démontré que la formation de glace intracellulaire est corrélée à des

destructions cellulaires. La nature des dégâts est diverse (MAZUR P., 1984) :

- le volume des cristaux de glace est 1,1 fois supérieur à celui de l’eau liquide.

Certaines structures cellulaires notamment les membranes lipidiques peuvent être déformées

voire rompues d’autant plus qu’elles sont plus fragiles et plus rigides qu’à température

corporelle ;

- la formation de glace induit une augmentation de la concentration en solutés dans la

partie non gelée de l’eau : mêmes modifications que lors de la cristallisation extracellulaire ;

- la formation de bulles de gaz à l’origine de destructions cellulaires a été décrite

(MORRIS G.J., 1981). MANDELBAUM le remarque quand le milieu de culture est tamponné

avec du bicarbonate de sodium avec 5% de CO2 dissous (MANDELBAUM J., 1990).

- le réarrangement conformationnel des cristaux de glace lors du passage de la forme

hexagonale à la forme cubique, qui s’effectue entre -103°C et -53°C (ODAGESCU V.M., 2005),

s’accompagne de contraintes mécaniques s’exerçant potentiellement sur les membranes.

L’importance de ces dégâts sera d’autant plus marquée que le processus de restructuration

cristalline sera long (MANDELBAUM J., 1990).

Ces dommages peuvent être atténués en limitant la quantité d’eau intracellulaire dans

les limites de la viabilité cellulaire avant d’amorcer le processus de congélation.

63

III.4 Cristallisation extracellulaire et effet solution

III.4.1 Généralités

L’eau libre diffuse à travers la membrane cellulaire du milieu le moins concentré dit

hypotonique vers le plus concentré dit hypertonique jusqu’à atteindre « l’équilibre

osmotique » lorsque les concentrations en solutés sont identiques dans les milieux qui sont

alors isotoniques. Vis à vis des électrolytes, la membrane plasmique est dite à perméabilité

sélective: elle sera différente selon la nature des anions et des cations.

Si le milieu hypertonique est le milieu extracellulaire, la cellule va se déshydrater et

son volume diminuer: ce phénomène est appelé « plasmolyse » et il peut être fatal s’il est trop

important. Au contraire si le milieu extracellulaire est hypotonique, la cellule va connaître un

afflux d’eau à l’origine d’une augmentation de volume et de tensions mécaniques sur la

membrane qui finit par se rompre.

Lors de la congélation, la cristallisation se produit d’abord dans le milieu

extracellulaire (MAZUR P., 1970; WILMUT I., 1986 ; KARLSSON J.M. et TONER M., 1996 ;

WOLFE J. et BRYANT G., 2001 ) lorsque le refroidissement est lent. Quand ils se forment les

cristaux de glace excluent les solutés de leur structure et ceux-ci sont en quantité de plus en

plus importante dans un volume d’eau liquide non gelé de plus en plus faible à mesure de la

croissance cristallinienne : il s’agit de la notion de front de cristallisation (ODAGESCU V.M.,

2005).

En conséquence la concentration du milieu extracellulaire augmente jusqu’à devenir

plus élevée que la concentration intracellulaire. L’eau libre diffuse donc vers l’extérieur et la

cellule se déshydrate (MAZUR P., 1963 ; MERYMAN H.T., 1971; SCHNEIDER U., 1986 ).

64

Cette déshydratation cellulaire présente deux avantages :

- le volume d’eau libre étant plus faible, la cristallisation a moins de probabilité de

débuter (MAZUR P., 1977).

- la concentration en solutés augmente et diminue le point de congélation (loi de

Raoult) (KARLSSON J.M. et TONER M., 1996; WOLFE J. et BRYANT G., 2001 ).

La formation de glace intracellulaire est donc moins probable et dans la théorie il

faudrait pouvoir obtenir une déshydratation maximale. Cependant lorsque la concentration en

électrolytes devient trop élevée, elle provoque des modifications biochimiques délétères pour

la cellule regroupées sous le terme « effet de solution » (MAZUR P., 1970) qui seront d’autant

plus marqués que la concentration intracellulaire est élevée et que la durée d’exposition à ces

concentrations est longue.

Les mécanismes d’action ne sont pas encore élucidés et ils prêtent à discussion entre

les cryobiologistes.

Pour LOVELOCK (1953 ; 1957), la forte concentration en solutés extracellulaires est à

l’origine d’une dénaturation des lipoprotéines de la membrane qui entraînerait une altération

de celle-ci et par voie de conséquence une élévation de la concentration intracellulaire en

électrolytes.

Pour MERYMAN, la contraction osmotique lors de la déshydratation ne serait possible

que dans une certaine limite : les cellules possèderaient un volume cellulaire minimal au

dessous duquel la mort cellulaire serait inéluctable tant les éléments structuraux (membrane)

et ultrastructuraux comme le cytosquelette sont dénaturés (MERYMAN H.T., 1968 ; MERYMAN

H.T. et al, 1977 ; MANDELBAUM J., 1990) .

En outre, certains lipides de la bicouche quitteraient la membrane lors de la

contraction et ce matériel manquerait lorsque la cellule retrouve son volume initial lors du

réchauffement (KARLSSON J.M. et TONER M., 1996) favorisant l’éclatement cellulaire. Là

encore ce sont les globules rouges qui ont servi de modèle d’étude, et les deux auteurs

s’accordent sur le fait que c’est le choc osmotique qui se produit au réchauffement qui est

responsable de l’hémolyse : on parle de « choc de dilution » (FARRANT J. et MORRIS G.J.,

1973 ; WILMUT I., 1986).

D’autres auteurs ((MAZUR P., 1984 ; TONDORF S. et OLIEN C.R., 1987)) affirment que

les cellules en cours de congélation sont séquestrées entre des plaques de glace qui grossissent

65

au cours de la croissance des cristaux. Une observation au microscope montre que les cellules

soumises à une congélation lente dans une solution hypertonique se déforment alors que les

mêmes cellules dans la même solution mais sans congélation se contractent de façon

homogène ou symétrique (LEIBO S.P., 1977). Des forces physiques viendraient s’ajouter aux

variations de pression osmotique pendant la congélation et seraient à l’origine de lésions

cellulaires. TONDORF et al (1987) décrivent des forces d’interaction entre la glace et la

membrane plasmique entraînant des dommages de cette dernière. Leurs modèles d’étude

étaient des liposomes.

Une déshydratation excessive serait à l’origine d’autres types de lésions cellulaires :

- l’augmentation de concentration intracellulaire connaît une limite : la solubilité des

solutés est dépendante de la température et lorsqu’elle est dépassée, ils précipitent : c’est le

« point eutectique ». Il se produit alors un autre type de cristallisation dite eutectique : il s’agit

de la solidification de la partie non gelée (eau+solutés) en solides qui constituent des hydrates

(HAN B. et BISCHOF J.C., 2004). Renard appelle ce phénomène le « salting out » (RENARD

J.P., 1982). Il entraînerait un changement de pH du milieu de suspension car les tampons des

solutions connaissent des points eutectiques différents. Selon HAN et BISCHOF (2004), la

cristallisation eutectique entraîne des dommages cellulaires qui seraient proches de ceux

provoqués par la formation de glace intracellulaire : bien que plus fins, les cristaux

engendreraient des lésions mécaniques.

- lorsqu’elle atteint un certain seuil, la déshydratation de la membrane plasmique

entraîne des dégâts plus importants que lors du changement de phase: des remaniements

topologiques majeurs, tels que l’organisation des triglycérides membranaires en hexagone

inversés (WOLFE J. et BRYANT G., 2001). Une modification de la perméabilité membranaire

voire une rupture peuvent être observées.

66

III.4.2 La transition vitreuse: vitrification intracellulaire

Lors de la congélation lente, la déshydratation progressive des cellules combinée à la

baisse de la température permet d’éviter la cristallisation intracellulaire comme l’explique la

figure 9.

baisse de la température déshydratation cellulaire

baisse de la diffusibilité des augmentation des concentrations

molécules d’eau intracellulaires en solutés

augmentation de la viscosité baisse de la température

du cytoplasme

vitrification : solidification du cytoplasme

en un cristal amorphe

Figure 9 :

Modalités d'obtention de la vitrification intracellulaire.

L’obtention de cet état vitrifié du cytoplasme peut être obtenu soit en refroidissant

suffisamment rapidement l’échantillon (de 10 à 1000°C/s) soit en atteignant des

concentrations cellulaires élevées par déshydratation : c’est l’augmentation de la viscosité du

liquide cytoplasmique qui permet la formation d’une phase vitreuse (WOLFE J. et BRYANT G.,

2001). Cette dernière ne présente pas les dangers d’ordre mécaniques et biochimiques de la

formation de glace intracellulaire car elle n’est pas organisée structurellement en réseau et

n’expulse pas les électrolytes lors de sa formation (BAUDOT A., 1997).

67

La figure 10 illustre, à titre indicatif, l’augmentation de la viscosité de l’eau pure avec

la baisse de la température.

Figure 10 :

Viscosité de l'eau pure en fonction de la température.

d’après KAROW (2001).

III.4.3 Biophysique de la perméabilité membranaire

Mazur a été le premier à proposer un modèle mathématique de la déshydratation

cellulaire au cours de la congélation (MAZUR P., 1963). Il affirme comme d’autres auteurs

préalablement cités (voir III.2.1) que le passage d’eau du secteur intracellulaire vers le secteur

extracellulaire ne s’effectue pas uniquement par simple diffusion membranaire mais

également par un transport transmembranaire. Cette théorie a été uniquement infirmée pour

les types cellulaires à très haute perméabilité membranaire comme les globules rouges.

L’importance de la fuite d’eau est en effet proportionnelle à la différence de pression

osmotique de part et d’autre de la membrane mais aussi à la perméabilité membranaire. Celle-

68

ci est étroitement reliée à la température par l’équation d’Arrhénius dont la formule graphique

est la suivante (MAZUR P., 1963):

Lp(T) = Lpg exp [ -ELp/R(1/T – 1/Tref) ]

On a :

Lp est la perméabilité membranaire à l’eau

Lpg est la perméabilité membranaire à l’eau à la température de référence Tref

ELp est l’énergie d’activation nécessaire au transport membranaire d’eau

R est la constante des gaz parfaits

Deux observations sont à faire à partir de cette équation : d’une part Lpg et ELp sont

des valeurs caractéristiques d’un type cellulaire ce qui implique une réponse cellulaire

variable lors de la cristallisation extracellulaire et l’augmentation de pression osmotique, et

d’autre part la perméabilité membranaire à l’eau décroît à mesure que la température diminue

pour devenir quasiment nulle vers -40°C. Ce sont des valeurs mesurables d’après les

changements volumétriques observés lors de l’exposition d’un type cellulaire à des solutions

de concentrations précises et connues.

III.5 Relation glace extracellulaire glace intracellulaire

La membrane cellulaire est une barrière contre la propagation de glace du milieu

extracellulaire vers le milieu intracellulaire. Deux explications majeures expliquent ce fait :

d’une part elle forme une barrière mécanique s’opposant à la croissance des cristaux et d’autre

part elle maintient les solutés à des concentrations différentes entre les milieux : lors de la

déshydratation elle favorise donc la surfusion et s’oppose à la cristallisation.

Cependant un postulat a été émis : la formation de glace extracellulaire favoriserait la

cristallisation intracellulaire. Il a été vérifié expérimentalement : l’observation de formation

de glace intracellulaire dans deux lots de cellules congelées en présence et en absence de

glace extracellulaire a montré que la cristallisation intracellulaire se produisait à des

températures significativement plus hautes quand la glace extracellulaire était présente,

69

suggérant que cette dernière entraîne directement ou catalyse la formation de glace

intracellulaire (TONER M., 1993).

Deux groupes s’affrontent sur le mécanisme.

Le premier, représenté par MULDREW et MAC GANN (1990 ; 1994) a développé la

théorie du flux osmotique : la pression hydraulique engendrée par l’efflux d’eau lors de la

déshydratation augmente avec le degré de surfusion pour devenir telle qu’elle entraînerait des

lésions membranaires et par voie de conséquence, la formation de glace intracellulaire.

Le second (MAZUR, TONER, TONDORFF) estime que la glace extracellulaire peut

entraîner la cristallisation intracellulaire sans dommage membranaire. Au sein de ce second

groupe deux théories se dégagent.

Mazur (1970) a proposé que les cristaux de glace peuvent croître à travers les pores

membranaires. La taille des cristaux étant dépendante de la température, celle-ci influence

directement la possibilité de passage de glace à travers des canaux de diamètre défini et

constant (à -10°C, un cristal peut passer à travers des pores de 8 Ä de diamètre). En outre, une

déformation membranaire simple occasionnée par la glace extracellulaire pourrait entraîner

des changements structuraux des pores membranaires facilitant ainsi la propagation de glace

(MAZUR P. et al, 2005b). Cette théorie est à mettre en relation avec la suivante.

TONER et al (1990) décrivent quant à eux un modèle de catalyse de surface pour la

nucléation (surface catalyzed nucleation). La glace extracellulaire produirait un changement

conformationnel de la membrane qui se comporterait alors comme un site de nucléation

hétérogène pour le cytoplasme en surfusion.

Il est possible que ces différents mécanismes se produisent simultanément dans la

cellule, mais ce sont des postulats qui sont difficilement vérifiables. Deux points sont à

retenir :

- la formation de glace extracellulaire est un préalable à la cristallisation cellulaire

(MAZUR P. et al, 2005b) : elle se produirait quand 88% de l’eau extracellulaire est gelée ;

- la chute de la température, le degré de surfusion du milieu, et l’altération de la

membrane plasmique augmentent la probabilité de nucléation.

III.6 Particularités de la congélation de tissus

70

Si les difficultés soulevées pour la congélation de cellules sont toujours valables,

d’autres viennent s’y ajouter : la conduction thermique depuis le milieu de congélation vers le

cœur du tissu, la présence de plusieurs types cellulaires et la propagation de glace

intracellulaire.

III.6.1 Le transport d’eau

Plusieurs modèles ont été développés pour étudier le transport d’eau dans un tissu :

celui de DILLER et RAYMOND (1990) comporte plusieurs couches cellulaires entourées d’une

matrice extracellulaire, permettant ainsi le transport entre cellules et entre cellule et milieu

interstitiel. Les résultats montrent que les cellules situées vers le centre se déshydratent plus

lentement que celles situées à l’extérieur, et ce d’autant plus que la densité cellulaire est

élevée. Dans les tissus où la trame collagénique tient une proportion importante, le transport

d’eau se fait plus facilement et la déshydratation sera relativement homogène si le tissu n’est

pas trop épais.

De la même façon, dans les tissus richement vascularisés, la glace se forme dans les

vaisseaux favorisant la déshydratation des cellules qu’ils irriguent. Cette propriété a en outre

des conséquences mécaniques car l’appel d’eau généré par la formation de glace puis la

formation de glace en elle-même se traduit par une distension puis une rupture des vaisseaux.

III.6.2 La conduction thermique

La présence de plusieurs couches cellulaires superposées entraîne l’apparition d’un

gradient de température (KARLSSON J.M. et TONER M., 1996 ; GOOK D. et al, 1999) : les

couches cellulaires les plus internes sont soumises aux températures de congélation plus

tardivement et plus progressivement donc à des vitesses de refroidissement moins élevées que

les couches les plus externes. Les caractéristiques de la déshydratation cellulaire sont donc

également modifiées : elle peut s’avérer insuffisante et permettre la formation de petits

cristaux qui favoriseront la recristallisation lors du réchauffement (FORSYTH M. et MC

FARLANE D.R., 1986).

71

III.6.3 L’existence de plusieurs types cellulaires

Les tissus sont des arrangements complexes de multiples types cellulaires où les

interactions entre les cellules permettent à l’organe de remplir sa fonction. Le maintien de ces

interactions conditionne en partie la réussite de la congélation.

Or les cellules réagissent différemment à la congélation : si le protocole de congélation

est idéal pour un type cellulaire, d’autres types sont susceptibles de moins bien le supporter et

de subir des dégâts. L’architecture et les interactions cellulaires sont donc mises en danger au

sein du tissu.

D’après FOREMAN et PEGG (1979), la densité cellulaire, la diversité des types

cellulaires, la vascularisation des tissus influencent leur susceptibilité aux blessures dues au

froid.

Dans le cas du cortex ovarien, le maintien de la viabilité des cellules de la granulosa

ou de la pré-granulosa, des cellules du stroma et des cellules collagéniques semble aussi

important que celui des follicules pour permettre la croissance et la maturation de ceux-ci

après réchauffement.

Chez l’homme, un follicule primordial est entouré de 10 à 11 cellules de la pré-

granulosa, si deux d’entre elles meurent au cours de la congélation cela peut suffire à mettre

en cause la viabilité du follicule (GOOK D. et al, 2004).

III.6.4 La propagation de glace intracellulaire

Acker et al (2001) ont montré que le contact cellulaire favorise la nucléation cellulaire

et ont exposé une explication. Les cellules d’un tissu communiquent par diverses méthodes

dont une d’ordre mécanique et physique : par des pores membranaires appelés « gap

jonctions » qui mettent en continuité les cytoplasmes. Sur le même modèle que celui

développé par MAZUR (2005b), ces jonctions permettraient la propagation de glace

intracellulaire d’une cellule à sa voisine.

Ces observations sont appuyées par une étude menée par BERGER et UHKRIK (1996):

quand ils bloquent les jonctions gap d’un système cellulaire issu d’une glande salivaire, la

propagation de glace intracellulaire semblait stoppée.

En revanche, la formation de glace intracellulaire dans un système cellulaire

monocouche indiquait la nécessité de contacts.

72

En conséquence, la survenue de la nucléation dans une unique cellule pourrait donc

favoriser la croissance des cristaux dans plusieurs cellules voisines augmentant par la même

les dégâts tissulaires.

La congélation de l’eau s’accompagne d’effets chimiques et physiques qui peuvent

s’avérer néfastes pour la cellule. La cristallisation intra et extracellulaire, l’effet solution, la

déformation de la membrane cellulaire, les modifications de la perméabilité membranaire sont

autant d’éléments à connaître pour maîtriser leurs effets néfastes. En outre, les conséquences

délétères de la congélation cellulaire peuvent se répercuter à l’échelle tissulaire, en fonction

des différents types de cellules qui composent le tissu concerné.

La connaissance de ces bases théoriques va nous permettre de définir les

caractéristiques et les étapes fondamentales que doit comporter un protocole de congélation

lente, afin de limiter au maximum les effets néfastes de la congélation.

73

IV STRATEGIES DE LUTTE CONTRE LES EFFETS

NEFASTES DE LA CONGELATION

Les cryobiologistes disposent de plusieurs méthodes afin de limiter les dégâts

cellulaires engendrés par le refroidissement et les basses températures : en agissant sur les

vitesses de refroidissement et de réchauffement, en contrôlant la température de cristallisation

et en ajoutant au milieu de congélation des substances cryoprotectrices.

IV.1 Vitesse de refroidissement

La vitesse de refroidissement est le principal facteur à moduler pour contrôler la

quantité d’eau résiduelle dans les cellules. On définit une vitesse de congélation optimale pour

laquelle le taux de survie cellulaire sera le plus élevé. Le pourcentage de survie cellulaire

baissera (suivant une courbe de Gauss) lorsque la vitesse est diminuée ou augmentée par

rapport à cette vitesse optimale.

- lorsque la vitesse de refroidissement est trop rapide, les échanges de chaleur sont

prépondérants par rapport aux échanges d’eau (MAZUR P., 1970; 1977 ). La cellule n’a pas le

temps d’atteindre l’équilibre osmotique avant la cristallisation complète du milieu extérieur et

elle contient donc une grande quantité d’eau en surfusion. On observe alors la formation de

glace intracellulaire lorsque la température de cristallisation du cytoplasme est atteinte. L’eau

est congelée dans les cellules sans avoir pu en sortir. Il y a formation de cristaux

intracytoplasmiques responsables de dégâts membranaires irréversibles et létaux ;

74

Figure 11 :

Corrélations théoriques entre la formation de glace intracellulaire, la survie cellulaire et la vitesse de

refroidissement.

d’après ASHWOOD-SMITH (1986).

-lorsque la vitesse de refroidissement est trop lente, la sortie d’eau libre intracellulaire

est très importante et les concentrations en solutés sont élevées. La cellule subit alors des

contraintes physico-chimiques potentiellement létales dues à l’effet solution. Toutefois, ce

n’est pas la vitesse de refroidissement (à condition qu’elle soit suffisamment lente pour

permettre les échanges osmotiques) qui est responsable de l’effet solution mais uniquement la

température à l’instant t. En effet, les variations de vitesses modifient la durée d’exposition

des cellules aux effets de solution, mais elles ne modifient pas les concentrations d’équilibre

des solutés ou des volumes d’eau gelée à une température donnée (MAZUR P., 1970);

- lorsque la vitesse de refroidissement est optimale, les cellules ont le temps de se

déshydrater afin de rééquilibrer les pressions osmotiques des milieux intra et extracellulaire

sans être exposées de façon prolongée aux effets de solution (observations

cryomicroscopiques de SCHNEIDER (1986) sur la formation de cristaux dans des embryons de

souris).

75

La vitesse de refroidissement optimale dépend donc de la capacité de la cellule à se

déshydrater. Cette dernière est elle-même fonction :

- de la taille de la cellule et plus précisément de la surface d’échange d’eau avec le

milieu extérieur qui est corrélée au rapport surface/volume (MAZUR P., 1970 ;

KARLSSON J.M. et TONER M., 1996) ;

- de la conductivité hydraulique de la membrane plasmique (KARLSSON J.M. et

TONER M., 1996) ;

- de l’énergie d’activation de la membrane plasmique (MAZUR P., 1970) , c’est à

dire la variation de perméabilité de la membrane en fonction de la température.

Pour LEIBO (1989) ce serait même le principal facteur qui détermine la formation

de glace intracellulaire : si la cellule n’est plus perméable à l’eau à des

températures inférieures à 0°C, elle ne peut plus se déshydrater et l’eau

intracellulaire cristallise.

La vitesse de refroidissement devra donc être plus lente pour les cellules moins

perméables et pour les cellules de gros diamètre telles que des ovocytes par exemple ( au

stade vésicule germinative ou en métaphase II). Une vitesse de refroidissement optimale a

donc été mise en évidence pour chaque type cellulaire (tableau 1) :

Tableau 1 :

Paramètres biophysiques de quelques types cellulaires et conséquences sur la vitesse de refroidissement.

d’après LEIBO (1977).

Types cellulaires Coefficient de

perméabilité à

20°C

Surface/Volume

(µm²/µm3)

Vitesse de refroidissement

critique

(°C/min)

Ovocytes souris 0.27 0,08 2,4

Lymphocytes 0,36 0,6 5

Fibroblastes 0,7 0,43 72

Globules rouges

humains

5,7 1,88 5400

76

A titre d’exemple, pour une même vitesse de refroidissement de 100°C/min, les

levures et les globules rouges humains présentent un taux de survie très bas mais celui-ci est

expliqué différemment: la cristallisation intracellulaire est responsable de la mort des levures

alors que celle des globules est imputable à l’exposition aux effets de solution (MAZUR P.,

1970).

Figure 12 :

Relation entre la vitesse de congélation et le taux de survie de cellules de moelle osseuse.

d’après MAZUR (1970).

La vitesse de refroidissement optimale doit donc être, comme l’explique la figure 12:

- suffisamment lente pour permettre aux cellules de se déshydrater et éviter ainsi une

formation de cristaux intracellulaires délétères voire létaux ;

- suffisamment rapide pour limiter le temps d’exposition des cellules à des

concentrations en solutés trop élevées (effet de solution).

77

IV.2 Induction de la cristallisation : « seeding »

Nous avons vu que la glace se formait d’abord dans le milieu extérieur entraînant la

déshydratation des cellules par osmose. Le milieu intracellulaire reste le plus souvent en

surfusion jusqu’à des températures s’étendant de -6°C à -15°C, la membrane plasmique jouant

le rôle de barrière pour la propagation de glace (MAZUR P., 1970; SCHNEIDER U., 1986 ;

MANDELBAUM J., 1990 ). Dans la mesure où les cristaux de glace ne sont pas assez petits pour

franchir les pores membranaires et la structure membranaire relativement intacte, la surfusion

peut s’étendre à des températures encore plus basses, jusqu’à -40°C.

Mais le milieu de congélation contenant les ovocytes en suspension ou les cortex

ovariens peut également se trouver en surfusion. Il n’y a donc pas de déshydratation cellulaire

dans ces conditions puisque le milieu de congélation reste isotonique (pas de formation de

cristaux). Quand la nucléation spontanée se produit (parfois à -15°C), la congélation du milieu

se fait rapidement, les cellules n’ont pas le temps de se déshydrater et des cristaux

suffisamment petits peuvent traverser les pores membranaires à cette température pour

amorcer la cristallisation cellulaire.

Pour lutter contre cet inconvénient, la cristallisation dans le milieu de congélation en

surfusion peut être déclenchée dès que sa température est inférieure à sa température de

congélation : c’est le seeding ou nucléation provoquée. Différentes méthodes, mécaniques ou

thermiques, peuvent être employées :

- en administrant un choc mécanique sur la paillette .

- en ajoutant un cristal de glace dans l’échantillon : technique décrite uniquement en

théorie.

- en appliquant une pince métallique préalablement refroidie dans l’azote liquide sur

l’extrémité de la paillette. Cette technique est de loin la plus utilisée quelque soit la

nature de l’élément à congeler (RODRIGUES A.P.R. et al, 2004b ; RODRIGUES A. et

al, 2005).

- seeding semi-automatique : libération de « frigories » (DEMIRCI B. et al, 2001).

Ainsi la cristallisation a lieu à des températures où les cellules peuvent se déshydrater

avant congélation complète. Elle commence le plus loin possible de l’embryon pour permettre

78

l’augmentation de concentration de la solution de congélation restante et croît par propagation

à partir du premier cristal de glace formé au contact de la pince (croissance de cristaux de

taille suffisamment importante pour ne pas traverser les pores sans toutefois créer de ruptures

membranaires).

En outre, le seeding permet d’éviter un autre problème illustré par MASSIP (1986). Il a

constitué deux lots d’embryons de souris destinés à être congelés dans du glycérol à 1,5 M. La

température de congélation de cette solution est à -4,5°C et le point de cristallisation

spontanée à -18°C. Dans le premier lot, la cristallisation est provoquée à -6°C, tandis qu’elle

est spontanée dans le deuxième à -18°C. Les courbes de congélation sont donc différentes

dans les deux lots même si le pic de surfusion remonte jusqu’à -4,5°C dans les deux cas

(figure 13).

Figure 13 :

Effet de la cristallisation induite à une température déterminée (surfusion 1) ou spontanée (surfusion 2) sur

la remontée en température de l'embryon.

d’après MASSIP (1986).

En conséquence, après cristallisation spontanée, l’échantillon voit sa température

remonter jusqu’à sa température de congélation (réaction exothermique). La chambre de

79

congélation quant à elle continue à se refroidir et elle compense l’élévation de température de

l’échantillon. Ce dernier se refroidit donc plus vite jusqu’à ce que sa température se rapproche

de celle de la chambre. La vitesse devient donc vingt fois plus élevée que la vitesse optimale

pendant cette brève période et les risques de cristallisation intracellulaire augmentent

considérablement. Ce n’est donc pas la brusque remontée en température causée par le pic de

surfusion qui est néfaste, mais la diminution de la période de déshydratation qui suit la

cristallisation spontanée.

Pour SCHNEIDER (1986), il n’y a pas de fondement théorique ni d’observation

expérimentale de l’effet délétère de la remontée en température liée à la libération de chaleur

latente de fusion au moment de la cristallisation car la grande majorité des embryons testés

survivent après réchauffement rapide depuis la température de cristallisation spontanée

jusqu’à -7°C. La mortalité embryonnaire (par formation spontanée de glace intracellulaire)

peut donc être expliquée par une diminution de la perméabilité des cellules avec la baisse de

température, d’où une quantité d’eau résiduelle intracellulaire plus importante.

Le seeding est quasiment systématiquement utilisé dans le cadre d’expérimentation sur

la congélation de follicules ou de cortex ovariens de mammifères. Il est pratiqué 2 à 3°C sous

la température de congélation du milieu ( dont la valeur est en général voisine de -5°C) soit

aux alentours de -7 à -8°C .

IV.3 Stockage

Au delà de -120°C, plus aucune réaction chimique thermodépendante n’est possible

(MAZUR P., 1984; KARLSSON J.M. et TONER M., 1996 ). Les échantillons sont conservés dans

l’azote liquide à -196°C. Les seules réactions possibles seraient la libération de radicaux

libres et la cassure éventuelle de l’ADN par les radiations ionisantes terrestres.

L’exposition d’embryons à des rayons gamma correspondant à 2000 ans de radiations

naturelles n’aboutit à aucun changement génétique détectable (malformations à la naissance)

ni aucune diminution de la viabilité (MAZUR P., 1984) . Le stockage serait donc possible

pendant au moins 2000 ans.

80

IV.4 Vitesse de réchauffement

Tout comme la vitesse de refroidissement, la vitesse à laquelle les échantillons sont

décongelés est importante. Les conséquences des changements ayant lieu pendant la

congélation peuvent n’apparaître que lors du réchauffement (WILMUT I., 1986).

Il existe une vitesse de décongélation optimale qui dépend de la quantité d’eau

résiduelle présente sous forme de glace ou de cristal amorphe et donc de la vitesse de

refroidissement :

- un refroidissement rapide ne permet pas à la cellule de se déshydrater

suffisamment pour éviter la formation de microcristaux cytoplasmiques qui même

s’ils ne sont pas toujours létaux (MAZUR P., 1977), peuvent servir de noyau pour la

croissance de plus gros cristaux qui eux sont alors susceptibles d’entraîner des

dégâts : c’est le phénomène de recristallisation (FORSYTH M. et MC FARLANE D.R.,

1986). Ainsi la mort cellulaire serait due à la croissance de cristaux préexistants et

non à leur formation initiale (MAZUR P., 1970 ; KARLSSON J.M. et TONER M.,

1996). Il faut donc un réchauffement rapide pour que le passage dans l’intervalle

de température qui autorise la croissance cristallinienne soit le plus fugace

possible.

- un refroidissement lent (< 0,5°C) permet à la cellule de se déshydrater

significativement. Si la vitesse de décongélation est trop rapide (>300°C), les deux

milieux (extra et intracellulaire) seront liquéfiés presque instantanément et la

pression osmotique dans le cytoplasme sera beaucoup plus élevée entraînant un

appel d’eau brutal dans la cellule qui peut subir un choc de dilution et éclater. Le

réchauffement doit donc être suffisamment lent pour permettre une réhydratation

cellulaire graduelle à mesure que le milieu de congélation dégèle.

Ainsi un réchauffement rapide semble être plus adapté pour un refroidissement rapide,

et un réchauffement lent pour un refroidissement lent. Il faut cependant noter que ces notions

de « rapide » et « lent » sont relatives et que tous les auteurs ne précisent pas les vitesses de

refroidissement ou de réchauffement qu’ils considèrent comme lente ou rapide.

81

IV.5 Emploi d’un cryoprotecteur

Certaines cellules, comme les globules rouges, la plupart des microorganismes et

quelques cellules nucléées de mammifères, peuvent survivre après une congélation dans l’eau

ou dans des solutions salines à condition d’être congelés à des vitesses optimales. Mais

comme nous avons pu le voir, la mise au point d’un protocole de congélation pose un

dilemme : éviter la formation de glace intracellulaire tout en évitant une exposition trop

longue à l’effet de solution.

Malheureusement, quelque soit la courbe de congélation, il n’existe pas de vitesse

optimale et la plupart des cellules de mammifères ne présentent que 1 à 2 % de survie après

congélation à des températures inférieures à -20°C en l’absence de cryoprotecteurs (NEWTON

H. et al, 1998 ; DEMIRCI B. et al, 2001). Ceci est d’autant plus vrai dans le cas des cortex

ovariens où plusieurs types cellulaires sont en interaction.

Leur utilisation permet d’obtenir un taux de survie maximal à une vitesse optimale en

fonction de leur concentration : ils se caractérisent également par une certaine toxicité.

IV.5.1 Les différents cryoprotecteurs

En 1949, Polge découvrait par hasard que l’addition de glycérol aux milieux de

congélation augmentait considérablement le taux de survie des spermatozoïdes congelés à -

79°C (POLGE C. et al, 1949), ouvrant la voie de l’insémination artificielle. Si les actions

cryoprotectrices des ces agents ne sont pas totalement comprises même à l’heure actuelle, on

sait qu’ils diminuent les altérations cellulaires engendrées par le changement de phase de

l’eau. Ils protègent les cellules à congeler contre la formation de glace intracellulaire, contre

l’effet solution mais aussi contre la cristallisation au réchauffement.

Tous les cryoprotecteurs actuels ont une caractéristique en commun : leur grande

affinité avec l’eau.

82

IV.5.1.1 cryoprotecteurs intracellulaires

Ces molécules franchissent la membrane plasmique :elles sont donc de faible poids

moléculaire. Ce sont le plus souvent des alcools : glycérol, glycol, propanediol (1,2 propylène

glycol), butanediol, méthanol, éthanol, érythricol. D’autres composés possèdent la fonction

sulfoxyde (comme le diméthylsuloxyde DMSO) ou encore amine mais ces derniers sont

moins utilisés. Ils possèdent donc tous des groupements fortement électronégatifs susceptibles

de former des liaisons hydrogènes et sont par conséquent hydrophiles : ils se lient à une partie

de l’eau libre après avoir cassé les liaisons hydrogènes entre les molécules d’eau.

Les alcools se fixent par l’hydrogène de leurs radicaux hydroxyles avec l’oxygène de

l’eau tandis que le DMSO se fixe par l’oxygène de son radical sulfoxyde avec les protons

(ODAGESCU V.M., 2005).

Rôle des liaisons hydrogènes :

MAC FARLANE et FORSYTH (1986) ont étudié par RMN la force des liaisons

hydrogènes entre l’eau et les groupements hydrophiles des cryoprotecteurs. Les analyses ont

confirmé l’existence de liaisons spécifiques entre les polyalcools et l’eau ce qui change

l’arrangement des molécules d’eau à basse température. La formation de liaisons hydrogènes

est gênée par la création de liaisons hydrogènes plus fortes entre le cryoprotecteur et l’eau.

En 1962, DOEBBER et RINFRET (cités par BAUDOT A. (1997)) ont trouvé une

corrélation entre l’effet protecteur contre l’hémolyse des érythrocytes et le logarithme de la

concentration molaire de sites susceptibles de former des liaisons hydrogènes (valable aussi

pour le dextran). Plus simplement, plus la molécule de cryoprotecteur comporte de sites

susceptibles d’établir des liaisons hydrogènes, plus son pouvoir cryoprotecteur est élevé.

Rôle de la structure moléculaire :

Si le nombre des groupements CH3 hydrophobes est élevé, les possibilités

d’interactions entre les molécules de cryoprotecteur sont réduites à cause de l’encombrement

stérique (BAUDOT A., 1997). Les groupements hydrophiles se lient alors préférentiellement à

l’eau.

Si le cryoprotecteur a une longue chaîne carbonée, les liaisons carbones-carbones

peuvent tourner et donner une conformation à la molécule telle qu’elle puisse établir un

maximum de liaisons hydrogènes.

83

L’hydrophilie, l’hydrophobie et les effets stériques de la molécule de cryoprotecteur se

combinent donc pour rendre les interactions avec l’eau plus ou moins fortes.

IV.5.1.1.a effet sur la température de congélation

L’ajout d’un cryoprotecteur diminue la température de congélation d’une solution à

mesure que sa concentration augmente (loi de Raoult). D’après MERYMAN cette propriété est

liée au nombre de molécules qui interviennent : elle est dite propriété colligative. En effet

pour une même concentration exprimée en poids par poids, la dépression est d’autant plus

importante que la masse molaire est petite donc que le nombre de molécules est élevé

(MERYMAN H.T. et al, 1977).

IV.5.1.1.b effet sur la température de nucléation homogène

Lorsque les molécules d’eau sont fortement liées au cryoprotecteur, leur mobilité

diminue et la viscosité de la solution augmente donc la température de nucléation diminue.

Il serait donc tentant d’utiliser des composés avec de nombreux groupements méthyl et alkyl

mais, si l’effet hydrophobe est trop important, il peut se produire une séparation de phase

entre l’eau et le cryoprotecteur (ODAGESCU V.M., 2005).

IV.5.1.1.c effet sur la cristallisation

Les liaisons hydrogènes bloquent les molécules dans une configuration ce qui les rend

moins disponibles pour la formation de cristaux de glace. Plus la concentration en

cryoprotecteurs augmente, moins il y a d’eau disponible et la quantité de glace formée est

d’autant plus faible.

En plus de cet effet colligatif, la stéréochimie de la molécule de cryoprotecteur semble

intervenir (BAUDOT A., 1997; ODAGESCU V.M., 2005 ). La température de congélation et la

température de nucléation homogène se rapprochent, ce qui favorise la vitrification

intracellulaire et limite donc la cristallisation.

Cependant, quand ils sont utilisés à des vitesses de refroidissement rapides ils ne

limitent pas les risques de cristallisation intracellulaire.

Ils modifient également la structure physique de la glace en arrondissant la forme des

cristaux, ce qui les rend moins traumatisants pour les membranes .

84

IV.5.1.1.d effet sur « l’effet solution »

Les cryoprotecteurs augmentent la survie des cellules refroidies lentement car ils

limitent les effets de solution (MAZUR P., 1970 ; 1977). Ils contribuent à déshydrater

partiellement les cellules avant la formation des cristaux de glace dans le milieu de

congélation et se substituent à une partie de l’eau présente dans le cytoplasme et les

membranes. L’équilibre osmotique atteint, ils se lient à une partie de l’eau extracellulaire qui

ne gèle donc pas quelque soit la température : il reste donc une quantité d’eau résiduelle pour

diluer les solutés. En conséquence, la concentration maximale en électrolytes extra et

intracellulaire lors de la congélation est plus faible que lorsque aucun additif n’est utilisé

(WILMUT I., 1986 ; MANDELBAUM J., 1990 ; WOLFE J. et BRYANT G., 2001).

Figure 14 :

Effet de la concentration en glycérol sur la concentration en sels d'une solution physiologique tamponnée,

refroidie à différentes températures négatives.

d’après WILMUT (1986)

85

IV.5.1.1.e effet sur le volume cellulaire

Les cryoprotecteurs limitent la contraction osmotique de la cellule en se liant à une

partie de l’eau libre intracellulaire et en abaissant la concentration extracellulaire. Ils agissent

donc en régulateur de la déshydratation et permettent aux cellules de se maintenir au-dessus

de leur volume critique (MANDELBAUM J., 1990).

Le corollaire inévitable est la formation d’une petite quantité de glace intracellulaire

par augmentation d’eau résiduelle cellulaire (MULDREW K. et MCGANN L.E., 1994).

IV.5.1.1.f effet sur les composés intracellulaires

Par leur pouvoir solvant, les cryoprotecteurs homogéinisent la composition du milieu

cellulaire, protègent les protéines des effets du froid et agissent sur la dynamique des

microtubules et des microfilaments.

Le propylène glycol dépolymérise les filaments d’actine, tandis que le DMSO

désassemble le fuseau méiotique.

Par ailleurs, le DMSO possèderait une activité inhibitrice sur les enzymes de type

catalase et une activité anti-péroxydase (NASCIMENTO I.A. et al, 2005).

IV.5.1.1.g association avec les membranes plasmiques

Les cryoprotecteurs intra et extracellulaires limitent la dénaturation des lipoprotéines

membranaires due aux effets de solution lors du refroidissement en formant des liaisons

hydrogènes.

Lors du réchauffement, les membranes plasmiques supportent mal les changements de

température et de volume ainsi que la forte déshydratation (WOLFE J. et BRYANT G., 2001). Le

DMSO et le glycérol en formant des liaisons polaires avec les phospholipides renforcent la

stabilité membranaire (MAC GANN L.E., 1978 ; ANCHORDOGUY T.J. et al, 1991).

IV.5.1.2 cryoprotecteurs extracellulaires

Les cryoprotecteurs extracellulaires sont non pénétrants et peuvent être divisés en deux

catégories : les sucres de faible poids moléculaire et les polymères de haut poids moléculaire.

86

Leur mode d’action diffère en partie de celui des cryoprotecteurs pénétrants en particulier car

ils ne s’opposent pas aux effets de solution.

���� Les sucres diholosides (saccharose, lactose, galactose, glucose, fructose, mannitol,

tréhalose, xylose, raffinose,…) ont un pouvoir osmotique élevé et attirent donc l’eau

intracellulaire favorisant la déshydratation. Leur utilisation semble donc intéressante en

association avec les agents intracellulaires car ils peuvent augmenter artificiellement leur

concentration et réduire en conséquence la formation de cristaux de glace intracellulaire au

cours du refroidissement.

Lors de la décongélation, de fortes variations de volume se produisent lorsque le

milieu extracellulaire se liquéfie à nouveau et que la cellule augmente brutalement de volume

suite à la rentrée d’eau puis au retrait des cryoprotecteurs intracellulaires. La présence de

cryoprotecteurs extracellulaires limite ces variations de volume en exerçant une véritable

contre force osmotique et ralentit l’entrée d’eau dans la cellule.

Enfin les disaccharides comme le sucrose protègeraient les membranes plasmiques en

se liant avec leur groupement hydrophile par des liaisons hydrogènes ce qui aiderait à

maintenir leur structure lors de la dessication (et éviter la formation d’hexagones inversés).

���� les macromolécules (PM> 10000 daltons) comme le dextran, la

polyvinylpyrrolidone (PVP), l’albumine sérique de veau, le polyéthylène glycol combinent

plusieurs propriétés cryoprotectrices qui ne sont pas complètement élucidées. De la même

façon que les sucres, elles contribuent à la déshydratation cellulaire par osmose et à la

stabilisation de la membrane cellulaire. Elles participeraient également à la réparation

membranaire après réchauffement et seraient à l’origine de la formation de cristaux de taille

réduite et de forme moins traumatisante dans le milieu extracellulaire par diminution de la

quantité d’eau libre.

Cependant, l’apport des cryoprotecteurs n’est bénéfique que dans certaines conditions

d’utilisation : le contrôle de leur concentration et du temps d’exposition des cellules à leur

action est promordial.

IV.5.2 Toxicité des cryoprotecteurs

87

Fahy s’est intéressé à l’origine de la toxicité des cryoprotecteurs (FAHY G.M., 1984).

Elle se manifeste sur deux plans :

- la toxicité biochimique qui est un facteur intrinsèque à chaque cryoprotecteur mais

variable d’un type cellulaire à l’autre. Elle dépend de la concentration et du temps

d’exposition à ce dernier, et elle diminue lorsque la température baisse.

Cette toxicité résulterait d’effets non spécifiques sur l’environnement cellulaire (modification

des constantes diélectriques, des tensions superficielles, des équilibres ioniques et du pH…) et

d’interactions spécifiques entre le cryoprotecteur et les constituants cellulaires : en particulier

les protéines (enzymes, microtubules) et les membranes cellulaires en perturbant la

perméabilité membranaire et les pompes ioniques.

Il est possible de lutter contre cette toxicité en incorporant plusieurs cryoprotecteurs ou

en ajoutant d’autres substances au milieu de congélation. C’est le cas du DMSO dont la

toxicité est diminuée par l’acétamide et le formamide. Les sucres, par leur liaison avec le

feuillet externe de la bicouche phospholipidique membranaire, forment une barrière contre les

molécules de cryoptecteur qui accèderaient ainsi moins facilement à la membrane.

- la toxicité osmotique se manifeste lors de l’ajout et du retrait du cryoprotecteur. En

effet, lors de l’exposition à un cryoprotecteur, la cellule se déshydrate et se contracte car le

milieu extracellulaire est hypertonique et la perméabilité membranaire à l’eau supérieure à

celle des cryoprotecteurs. C’est seulement lorsque les molécules de cryoprotecteur pénètrent

la cellule que la contraction cellulaire s’arrête. Or d’après MERYMAN (1968), les cellules sont

capables de se contracter jusqu’à 35-30 % de leur volume initial mais pas au-delà. Si la

concentration en cryoprotecteur du milieu de congélation est trop élevée et la perméabilité

membranaire du cryoprotecteur trop faible, la contraction osmotique peut être trop importante

et irréversible.

Les mêmes principes s’appliquent lors du retrait des cryoprotecteurs : les cellules sont

exposées à une solution hypotonique par rapport au contenu intracellulaire et voient leur

volume augmenter très rapidement, parfois jusqu’à l’éclatement.

88

IV.5.3 Perméabilité cellulaire et tissulaire aux

cryoprotecteurs

Plusieurs auteurs se sont penchés sur les facteurs influençant le perméabilité cellulaire

des cryoprotecteurs en utilisant différentes méthodes comme le marquage radioactif, la

chromatographie ou la spectrographie RMN. Newton a utilisé cette dernière pour étudier la

pénétration de quatre cryoprotecteurs intracellulaires (DMSO, glycérol, éthylène glycol et

propylène glycol) à deux températures différentes dans du tissu ovarien humain (NEWTON H.

et al, 1998). Il a démontré que la pénétration des cryoprotecteurs se fait en deux phases : l’une

rapide, qui représente 70% du processus complet à 4°C et 78% à 37°C et qui s’étend sur

quelques minutes, et une autre phase plus lente en plateau.

De plus, l’élévation de température semble augmenter la vitesse de pénétration des

quatre cryoprotecteurs durant la première phase mais pas les concentrations intracellulaires

obtenues après 30 minutes exception faite du propylène glycol. Cette influence de la

température est corroborée par d’autres auteurs (SCHNEIDER U. et MAZUR P., 1984).

En outre, la taille des molécules de cryoprotecteur (corrélée à leur poids moléculaire)

mais aussi leur liposolubilité influencent leur vitesse de diffusion :

- vitesses de pénétration : méthanol (32D)> propanediol (76,10D)> éthylène glycol

(62,07)> DMSO (78,13D)> glycérol (92,09D) (ARAKAWA T. et al, 1990);

- parfois la diffusion semble trop rapide par rapport au degré de liposolubilité et du

poids moléculaire : c’est le cas du méthanol et de l’éthylène glycol pour lesquels a

été avancée l’hypothèse d’une diffusion facilitée par certaines protéines des

membranes plasmiques.

89

V CARACTERISTIQUES PRINCIPALES D’UN

PROTOCOLE DE CONGELATION DE FOLLICULES

ET DE CORTEX OVARIENS

Les principes de cryobiologie exposés sont valables pour tous les types cellulaires,

avec des particularités qui varient d’un type à l’autre. Historiquement, la congélation de

follicules ovariens s’est basée sur les protocoles utilisés pour les embryons (DEMIRCI B. et al,

2001) par extrapolation hâtive (GOOK D. et al, 1999), on parle de congélation « classique »

par opposition avec d’autres méthodes telles que la vitrification.

Cinq étapes composent ce protocole de congélation classique dans l’optique de limiter

au maximum les dégâts liés au froid: incorporation du cryoprotecteur, refroidissement et

seeding, stockage, réchauffement et enfin retrait du cryoprotecteur.

V.1 Phase d’équilibration : incorporation du cryoprotecteur

L’utilisation de cryoprotecteurs doit être raisonnée pour être bénéfique : il faut tenir

compte de leur concentration, du temps d’exposition des cortex ovariens, de la température

lors de la phase d’incorporation afin de limiter leur toxicité biochimique et osmotique.

Les cortex ovariens préalablement isolés sont plongés dans le milieu de congélation

hypertonique contenant les cryoprotecteurs. On observe alors (NEWTON H. et al, 1999):

- une contraction osmotique initiale brutale et brève expliquée par la meilleure

perméabilité membranaire de l’eau que celle des cryoprotecteurs ;

- l’entrée des cryoprotecteurs stoppe dans un premier temps cette fuite d’eau puis

l’inverse afin d’équilibrer les concentrations intra et extracellulaires : le volume

cellulaire augmente à nouveau ;

- l’équilibration est achevée lorsqu’il n’y a plus de gradient de concentration de

cryoprotecteur entre les deux milieux ;

90

Les effets délétères de cette phase de contraction osmotique, potentiellement fatale

pour les cellules, peuvent être atténués :

- en augmentant progressivement la concentration du cryoprotecteur et en attendant

l’équilibration pour chaque palier ;

- en choisissant l’emploi d’un cryoprotecteur présentant une vitesse de diffusion

élevée pour contrebalancer rapidement la sortie d’eau. Plus le coefficient de

perméabilité est élevé, moins la contraction initiale est marquée, d’où la réduction

des problèmes osmotiques à l’équilibration.

Par ailleurs, la température, à laquelle l’équilibration est réalisée, a également son

importance en raison de la variation de perméabilité membranaire qu’elle occasionne. De

nombreuses études relatent que cette phase du protocole se fait à température ambiante ou à

4°C (GOOK D. et al, 1999), d’autres encore à 0°C (JEWGENOW K. et al, 1998).

V.2 Seeding

Le seeding doit avoir lieu de 1 à 2°C au-dessous de la température de cristallisation du

milieu de congélation qui se situe vers -5°C en général pour des concentrations en

cryoprotecteurs aux alentours de 1,5 M et 2M. Il doit donc avoir lieu vers -7 à -8°C.

Les changements de température et d’osmolarité qui suivent demandent une période

constante de 5 à 10 minutes à la température du seeding pour :

- permettre d’éliminer la chaleur latente de fusion et donc ramener l’échantillon à la

température du bain : l’augmentation brutale de la vitesse de refroidissement est

ainsi évitée.

- permettre aux cellules de répondre osmotiquement à la nouvelle concentration en

solutés extracellulaires et donc d’adapter son volume (SCHNEIDER U., 1986).

V.3 Vitesse de refroidissement

La vitesse de refroidissement est le principal facteur à maîtriser car il régit le degré de

déshydratation des cellules au cours de la congélation.

Lors de refroidissement lent, trois étapes peuvent être distinguées :

91

- le refroidissement des produits de la température ambiante à la température de

congélation (phase liquide) ;

- la phase de congélation (changement d’état) ;

- le refroidissement des produits en phase solide.

Le maintien à des pentes inférieures à 2°C par minute nécessite l’utilisation d‘unités de

congélation à vitesse électroniquement programmable et variable (MANDELBAUM J., 1990).

Après incorporation des cryoprotecteurs (à température ambiante), les échantillons à

congeler sont d’abord refroidis à des vitesses allant de 0,3°C à 2°C jusqu’à des températures

de -30°C à -40°C pour permettre la déshydratation, puis sont plongés dans l’azote liquide ou

refroidis très rapidement.

La première pente de congélation est généralement de 2°C par minute dans la majorité

des protocoles pour différentes espèces et pour différents types d’échantillons à congeler

(follicules préantraux isolés, cortex ovariens) (HOVATTA O. et al, 1996 ; DEMIRCI B. et al,

2001 ; RODRIGUES A.P.R. et al, 2004b): durant cet intervalle, il ne se produit pas de

déshydratation cellulaire et la descente en température doit être suffisamment rapide pour

éviter les dommages dus aux basses températures ( >0°C).

La deuxième pente de congélation correspond à la déshydratation cellulaire : la vitesse

de refroidissement doit donc être lente pour éviter la formation de glace à l’intérieur des

cellules. Les vitesses les plus utilisées sont de l’ordre de 0.3 à 0.5°C par minute jusqu’à -30 à

-40°C.

Certains auteurs (RODRIGUES A.P.R. et al, 2004b ; RODRIGUES A. et al, 2005; SANTOS

R.R. et al, 2005 ) utilisent des vitesses de refroidissement encore plus lentes, de l’ordre de

0,15°C par minute de -30 à -33°C.

Dans ce domaine de températures, la sortie d’eau est rendue quasiment impossible par

la forte baisse de la perméabilité membranaire (équation d’Arrhénius). Les échantillons sont

alors soit refroidis très rapidement avec des vitesses de l’ordre de 10 à 50°C par minute soit

directement plongés dans l’azote liquide. Ceci équivaut à une vitesse de refroidissement de

l’ordre de 500°C par minute.

V.4 Vitesse de réchauffement

92

Les vitesses de réchauffement sont à adapter en fonction de la vitesse de

refroidissement. Comme nous l’avons déjà vu, il s’agit d’éviter la recristallisation

intracellulaire mais aussi un choc osmotique. Ainsi, il faudra opter pour une vitesse de

réchauffement lente lorsque la vitesse de refroidissement est lente, et une vitesse de

réchauffement rapide lorsque qu’elle rapide.

En pratique, le réchauffement se fait directement dans un bain-marie à 25°C ou 37°C

ce qui correspond à une vitesse de 250 à 500°C/min environ. Pour les tissus, certains

opérateurs préconisent un réchauffement par ondes électromagnétiques qui serait plus

uniforme et rapide mais qui nécessite de prendre en compte la réaction spécifique de chaque

cryoprotecteur aux fréquences de ces ondes (WUSTEMAN M.C. et al, 2002). Cette dernière

méthode est cependant davantage utilisée dans le cas de la vitrification.

V.5 Retrait du cryoprotecteur

MANDELBAUM (1990) souligne la nécessité de retirer les cryoprotecteurs des cellules

décongelées sous peine de mettre en cause leur viabilité ultérieure compte-tenu de leur

toxicité.

Différentes modalités ont été développées :

- CANDY (1997) rince les fragments ovariens de souris à température ambiante dans

trois bains successifs de milieu de culture supplémenté de 10% sérum de veau

fœtal de 5 minutes chacun ;

- d’autres préconisent en plus une agitation mécanique (DEMIRCI B. et al, 2001)

voire une centrifugation (JEWGENOW K. et al, 1998; RODRIGUES A.P.R. et al,

2004b ). Ces techniques sont cependant surtout appliquées dans les cas de cellules

isolées.

Cependant, le transfert direct des cortex dans un milieu isotonique peut entraîner un

choc osmotique : le cryoprotecteur intracellulaire ne diffuse pas assez rapidement hors des

cellules pour éviter un appel d’eau soudain allant jusqu’à la rupture cellulaire.

Ce phénomène d’hyperhydratation peut être atténué en ajoutant des cryoprotecteurs à

des concentrations décroissantes ou du saccharose dans les bains de dilution (WILMUT I.,

1986 ; LEIBO S.P., 1989 ; MANDELBAUM J., 1990).

93

V.5.1 Retrait par étapes

Les échantillons sont placés dans des bains de concentration décroissante en

cryoprotecteur par étapes suffisamment longues (de 2 à 10 minutes en moyenne) pour

permettre l’établissement d’un équilibre osmotique et par conséquent la sortie d’une partie du

cryoprotecteur intracellulaire (SCHNEIDER U. et MAZUR P., 1984 ; WILMUT I., 1986). Le

dernier bain ne contient pas de cryoprotecteur.

La dilution est sujette aux même facteurs de variation que l’incorporation : la

perméabilité cellulaire dépendante du type cellulaire et de la température et la différence de

pression osmotique. Ainsi, lorsque le cryoprotecteur est ajouté à température ambiante,

l’équilibre osmotique s’est fait avant le refroidissement donc la dilution devra se faire dans les

mêmes conditions thermiques afin que le retrait du cryoprotecteur soit complet (WILMUT I.,

1986).

V.5.2 Ajout du saccharose

Cette technique a été citée la première fois par LEIBO et MAZUR (1978) sur des

embryons. A mesure que le cryoprotecteur sort de la cellule, le milieu de dilution devient

hypertonique même si son volume rend minime cette hyperosmolarité ; entraînant une légère

déshydratation (SCHNEIDER U., 1986 ; WILMUT I., 1986). Le cytoplasme pourra retrouver sa

teneur en eau dans un dernier bain de dilution exempt de cryoprotecteur et de sucrose

(SCHNEIDER U. et MAZUR P., 1984 ; SCHNEIDER U., 1986).

Une autre propriété du sucrose est qu’il augmente la vitesse de retrait du

cryoprotecteur (SCHNEIDER U. et MAZUR P., 1984; MANDELBAUM J., 1990 ) en maintenant un

gradient de diffusion qui facilite la diffusion. Plus la concentration en saccharose est faible,

plus le retrait est long (SCHNEIDER U. et MAZUR P., 1984).

_

Cette première partie bibliographique nous a permis de rappeler les principales bases

théoriques de l’anatomie et de la physiologie de l’ovaire chez la chatte. Nous avons cerné les

94

futures applications de la cryoconservation ovarienne dans le domaine de la santé humaine et

dans la sauvegarde du capital génétique des espèces menacées d’extinction, pour peu qu’une

exploitation efficace du matériel congelé puisse être réalisée.

Nous avons par la suite abordé les principes fondamentaux de la cryobiologie et ainsi

constaté que cette science était étroitement liée à la physique et la chimie cellulaire. Nous

avons détaillé les étapes incontournables que doit comporter un protocole de congélation

lente, mais aussi mis en évidence les possibilités et marges de manœuvre offertes pour essayer

d’optimaliser les résultats. L’influence des différents paramètres d’un protocole de

congélation ne peut être prévu et quantifié par la seule théorie, et cette incertitude ne peut être

levée que de manière expérimentale.

Nous allons désormais présenter notre étude expérimentale : les protocoles de

congélation que nous avons choisis de mettre en œuvre, l’influence de différents paramètres

que nous avons choisi d’étudier, et les résultats obtenus.

95

DEUXIEME PARTIE :

PARTIE EXPERIMENTALE

96

97

I MATERIELS ET METHODES

I.1 Préparation des cortex ovariens

I.1.1Origine des ovaires

Le pôle chirurgical de notre étude s’est situé au sein du service de Biologie et de

Pathologie de la Reproduction (Département Productions Animales) et du service de

Chirurgie et Anesthésiologie (Département Animaux de Compagnie) . Les ovaires ont été

prélevés lors de l’ovariectomie de convenance de chattes. L’annexe 1 donne l’âge de ces

sujets. Les ovaires de 38 chattes ont été utilisés, soit un total de 76 ovaires.

I.1.1.1 critères de sélection des chattes

Les chattes sélectionnées étaient pubères, en bon état général et non gravides. Leur

examen clinique pré-opératoire n’a présenté aucune anomalie.

La moyenne d’âge des sujets utilisés était de 18,5 mois environ avec un écart-type de 17,7

mois car quelques chattes âgées ont été inclues dans les protocoles (63 % des chattes avaient

entre 6 et 12 mois au moment du prélèvement).

I.1.1.2 conditions opératoires

Pour chaque chatte, les deux ovaires ont été prélevés sous anesthésie générale lors

d’une laparotomie médiane. Deux ligatures étaient posées, l’une au niveau du pédicule

ovarien contenant l’artère ovarique et l’autre au niveau de l’artère utérine (figure 15).

98

Figure 15 :

Extériorisation de l'ovaire et lieux de mise en place des ligatures.

Le délai entre la mise en place de l’hémostase et l’exérèse s’est élevé à moins de 10

minutes pour 70 ovaires, entre 10 et 20 minutes pour les 6 restants. Le délai d’attente pour

l’obtention du second ovaire après l’exérèse du premier était de l’ordre de 15 à 20 minutes.

I.1.1.3 transport du matériel

Après exérèse, les ovaires ont immédiatement été placés après prélèvement dans du

milieu TCM199 (Sigma St Louis, USA) à température ambiante.

Le laboratoire étant situé à proximité des blocs de chirurgie, le temps de transport était

très limité et n’a pas dépassé pas 5 minutes.

I.1.2 Isolement du cortex ovarien

Chaque ovaire a été rincé dans du milieu de transport, puis a été séparé en deux à la

faveur d’une coupe sagittale. Deux « hémiovaires » étaient obtenus dont la médullaire a été

réséquée par dissection fine jusqu’à obtenir un fragment de cortex ovarien d’environ 1 mm

d’épaisseur et d’une surface de 0,7 cm².

99

.

Figure 16 :

Comparaison morphologique macroscopique entre un ovaire entier et un cortex ovarien après dissection

(échelle en cm). Photo V. Neto.

Un cortex a été laissé à incuber pendant 5 min dans le milieu TCM199 supplémenté

par 10% en sérum de veau fœtal (SVF). Ce fragment a ensuite été fixé dans du milieu de

Davidson. Il servira de témoin « positif », sans congélation, dit témoin « frais ».

Un autre fragment a été congelé dans un milieu sans cryoconservateur M199+10%

SVF : il constituait le témoin « négatif » ou témoin de congélation.

Les fragments restants ont été incubés dans les différents milieux de congélation et congelés.

Nous avions donc au total :

Figure 17 :

Utilisation des 4 fragments obtenus à partir de chaque ovaire.

4 fragments / ovaire

Témoin frais Témoin de congélation DMSO PROH

100

I.2 Incorporation des cryoprotecteurs

Nous avons choisi de travailler avec du diméthylsulfoxyde DMSO (Sigma, St Louis,

Etats-Unis) et le propylène-glycol PROH (Sigma, St Louis, Etats-Unis). Nous les avons

utilisés à la concentration de 1,5 mol/L soit 1,5 M.

Les fragments de cortex sont incubés dans des bains constitués de milieu TCM199

complémenté de 10% de sérum de veau fœtal (SVF) et du cryoprotecteur considéré.

L’incorporation a été réalisée par paliers dans 3 bains successifs de 0,5 M ; 1 M et 1,5

M pendant 5 minutes chacun. Elle a été effectuée à température ambiante pour faciliter le

travail ; lors des manipulations la température s’échelonnait de 18°C à 25°C environ. La

préparation des milieux de congélation a été faite de façon arithmétique par calcul des

quantités de chaque constituant à ajouter. Afin de vérifier leur osmolarité, une mesure a été

réalisée à l’aide d’un osmomètre.

Les fragments destinés à la congélation ont été mis en paillettes de CBS® 1mL

lorsqu’ils étaient dans le dernier bain et ont ainsi terminé leur incubation. Les paillettes ont été

soudées à leur deux extrémités à l’aide d’une soudeuse SIMS (CryoBioSystème, L’aigle,

France).

Le fragment « témoin frais » était fixé au terme des 15 minutes.

I.3 Les protocoles de congélation sensus stricto

I.3.1 Matériel utilisé

Le matériel utilisé est détaillé par la figure 18. Les protocoles de congélation ont été

réalisés en utilisant un congélateur programmable : Freeze Control® CL-8800 (CryoLogic,

Victoria, Australia)(figure 18 A,B,C).

101

Figure 18 :

Congélateur programmable

A: chambre de congélation B: programmateur C: cuve à azote liquide D: relais informatique.

Le contrôle de la descente en température était assuré par logiciel : CryoGenesis 5

(CryoLogic, Victoria, Australia) (D) selon les paramètres préalablement fixés.

Les paillettes étaient placées dans un des cinq emplacements prévus à cet effet à

l’intérieur de la cryochambre (A) qui était elle-même placée dans la cuve à azote liquide (C).

C’est, en effet, l’azote liquide qui constitue la source de froid, la cryochambre est équipée

d’une résistance placée longitudinalement qui permet d’obtenir la température voulue.

I.3.2 Protocole de congélation P1 : protocole de réference

Le protocole a été établi à partir de celui décrit par Lornage et également utilisé plus

tard par DEMIRCI (2001) et décrit par la figure 19:

102

Figure 19 :

Courbe de congélation du protocole de référence P1.

� première descente en température de 2°C/min depuis 21°C jusqu’à -7°C : pente R1

� maintien à -7°C pendant 2 minutes et seeding manuel par application d’une pince refroidie

sur les paillettes puis maintien à -7°C pendant 5 minutes.

� deuxième descente en température de 2°C depuis -7°C jusqu’à – 35°C : pente R2

� descente en température sans contrôle : « free fall » de -35°C à -140°C.

� plongée des paillettes dans l’azote liquide à partir de -140°C.

Lors de la phase de descente en température libre, la vitesse moyenne de

refroidissement était de 4°C/min, avec des extrêmes de 7,5°C/min environ au début et de

2°C/min quand la température approchait de -140°C. Ces résultats ont été obtenus par calculs

de régression linéaire à partir des températures affichées par Cryogenesis®.

103

I.3.3 Evaluation de la descente en température à l’intérieur de la

cryochambre

Suite aux problèmes soulevés par ARAV (2002), une mesure de la descente en

température soumise aux paillettes a été réalisée à l’aide d’un thermocouple.

Les sondes étaient reliées à un scanner de température multicanaux CONSORT T851

qui a permis l’acquisition des températures mesurées par chacune d’entre elles. La fréquence

d’enregistrement a été fixée à une mesure par seconde.

Elles ont été placées dans les paillettes aux extrémités supérieure et inférieure pour

chaque cryoprotecteur. Quatre sondes ont donc été utilisées, dont la nomenclature suivante

sera utilisée par la suite :

Figure 20 :

Nomenclature utilisée en fonction de la position de la sonde dans la paillette et du cryoprotecteur.

Deux séries de mesure ont été menées à bien lors de deux processus de congélation du

protocole de référence P1.

DMSO sup DMSO inf PROH sup PROH inf

sonde

104

I.3.4 Les différents protocoles de congélation

Nous avons choisi d’évaluer différents facteurs physico-chimiques influençant le

processus de congélation sur la morphologie folliculaire. Une étape et une seule a donc été

modifiée par rapport au protocole de référence P1 au cours de différents protocoles pour

pouvoir juger de son influence.

Le tableau 2 détaille la modification réalisée par rapport au protocole de référence

pour chaque protocole.

Protocole P1 Protocole P2 Protocole P3 Protocole P4 Protocole P5

Milieu de congélation

utilisé

M199 + SVF + cryoprotecteur

M199 + SVF + cryoprotecteur

M199 + SVF + 0,2 M

saccharose + cryoprotecteur

M199 + SVF + cryoprotecteur

M199 + SVF + cryoprotecteur

Pente R1 2°C/min 2°C/min 2°C/min 2°C/min 2°C/min

Réalisation du seeding

oui non oui oui oui

Pente R2 2°C/min 2°C/min 2°C/min 0,5°C/min 2°C/min

Free fall réalisé dans la chambre de congélation

oui oui oui oui

non plongée directe des paillettes l’azote liquide

lorsque la température atteint -35°C

Tableau 2:

Caractéristiques des protocoles de congélation

( les modifications par rapport au protocole de référence P1 apparaissent en gras).

105

I.3.5 Stockage

Les paillettes ont été stockées dans l’azote liquide à -196°C, dans une cuve à azote

pendant au moins 24 heures.

I.3.6 Décongélation

Les paillettes étaient réchauffées dans un bain-marie à 37°C jusqu’à décongélation.

Il fallait 20 secondes en moyenne pour obtenir la fusion complète du milieu de

congélation soit une vitesse de réchauffement de l’ordre de 600°C/min.

Le retrait des cryoprotecteurs a été effectué par paliers également dans l’optique

d’éviter un choc osmotique trop important. Les fragments ont été plongés dans quatre bains

successifs de quatre minutes chacun:

- M199 + 10% SVF ; 1M cryoprotecteur ; 0,2M saccharose

- M199 + 10% SVF ; 0,5M cryoprotecteur ; 0,2M saccharose

- M199 + 10% SVF ; 0,2M saccharose

- M199 + 10% SVF

Le fragment congelé sans cryoprotecteur a été placé dans le dernier bain pendant 16

minutes.

106

I.4 Etude histologique des follicules primordiaux à primaires

Cette étape a été réalisée en collaboration avec le service d’Anatomie Pathologique de

l’Ecole Nationale Vétérinaire de Lyon.

I.4.1 Préparation des lames d’étude histologique

La préparation des lames a été réalisée en trois étapes principales.

A la fin du processus de rinçage des cortex ovariens, les fragments ont été placés dans des

« cassettes histologiques » et fixés dans du fixateur de Davidson pendant 24 heures au

minimum.

Après fixation, les fragments ont été déshydratés, imprégnés et inclus en paraffine.

Des coupes de 4 µm d’épaisseur semi sériées (tous les 40µm) ont été réalisées à l’aide d’un

microtome. Puis, elles ont été montées sur lames traitées Superfrost +. Six à huit coupes par

fragment ont été effectuées.

Les coupes ont enfin été colorées à l’Azan modifié pour l’étude morphologique des

follicules.

I.4.2 Evaluation histologique des follicules primordiaux à

primaires

Seuls les follicules dont le noyau était visible ont été dénombrés.

Pour chaque fragment 100 follicules ont été dénombrés et classés en follicules

primordiaux, intermédiaires et primaires et selon 4 catégories de défauts :

- les follicules ont été dits sans défaut lorsqu’ils réunissent les conditions suivantes :

follicule régulier, cellules folliculaires jointives, ovocyte au cytoplasme plein,

chromatine diffuse et régulière ;

- ils ont été placés dans la catégorie « défaut de noyau » lorsque le noyau

ovocytaire est picnotique ou irrégulier, la chromatine dispersée par rupture de la

membrane nucléaire ;

107

- ils ont été placés dans la catégorie « défaut de cytoplasme » lorsque le cytoplasme

ovocytaire est vacuolisé ;

- ils ont été classés dans la catégorie « défaut de noyau et de cytoplasme cumulés »

lorsque l’ovocyte présentait une double anomalie cytoplasmique et nucléaire,

lorsque qu’une forte déformation folliculaire était observée. La mise en évidence

d’un gonflement des cellules folliculaires ou d’une désolidarisation entre les

cellules folliculaires et l’ovocyte entraîne le classement des follicules dans cette

catégorie. Ils seront aussi qualifiés de « dégénérés ».

La figure 21 illustre les différences morphologiques entre un follicule

morphologiquement sans défaut et un follicule dégénéré.

Figure 21 :

Aspect photographique d'un follicule morphologiquement sans défaut (à gauche) et

d'un follicule dégénéré (à droite).

Photo V. Neto.

Les follicules présentant un détachement entre l’ovocyte et les cellules folliculaires ont

été placés dans le quatrième groupe.

Pour chaque milieu de congélation au sein d’un même protocole, 5 à 6 hémiovaires

ont été utilisés. Pour le protocole P1, 11 hémiovaires ont été utilisés.

La figure 22 résume le schéma d’expérimentation.

108

chatte x

Figure 22 :

Résumé des étapes du schéma d'expérimentation.

Témoins frais 1,5M PROH 1,5M DMSO Témoins de congélation

Répétition 5 ou 6 fragments ovariens par traitement

Décongélation à 37°C et 4 bains de lavage de concen tration décroissante en cryoprotecteur

Histologie : 6-8 coupes/fragments tous les 40 µm (épaisseur de coupe : 4 µm)

Lecture : 100 follicules/fragment 3 stades de développement/4 classes de défauts

Analyse statistique

Rinçage

109

I.5 Analyse statistique

L’évaluation morphologique permet d’obtenir des proportions de chaque type de

défaut folliculaire. Les variables continues ainsi obtenues ont été traitées par une analyse de

variance à un facteur contrôlé (ANOVA I ).

Plusieurs analyses sont faites :

-comparaison des moyennes de follicules sans défaut pour chaque fragment au sein

d’un même protocole de congélation : cela permettra de savoir que le cryoprotecteur parmi les

deux testés assure le plus haut degré de protection.

-comparaison des moyennes de follicules sans défaut au sein de deux protocoles

différents pour un même milieu de congélation. Il existait une condition préalable : les

moyennes de follicules sans défaut des témoins frais et des témoins congelés ne doivent pas

être significativement différentes.

-comparaison des moyennes des types de défauts rencontrés au sein de deux

protocoles de congélation différents pour un même milieu de congélation.

Les différences ont été considérées comme significatives lorsqu’elles sont supérieures

à 5% ( p< 0,05).

Ces analyses ont été effectuées à l’aide du logiciel Statview® (SAS Institute).

110

111

II RESULTATS

II.1 Vérification des paramètres physiques et chimiques au

cours des protocoles de congélation

II.1.1 Evaluation de la pression osmotique

Les résultats des mesures de pression osmotique des bains d’incorporation et de retrait

des cryoprotecteurs sont présentés par la figure 23.

0

500

1000

1500

2000

2500

3000

3500

Pres

sion

osm

otiq

ue (m

osm

)

Milieux de congélation

DMSO

PROH

Figure 23 :

Evolution de la pression osmotique au cours de l'équilibration et du rinçage des cortex ovariens.

Le milieu de transport et de rinçage constitué de TCM 199 et de 10% de sérum de

veau fœtal présente une pression osmotique de 335 mosmol, ce qui s’approche de l’osmolarité

cellulaire usuelle qui est de l’ordre de 300 mosmol.

112

L’incorporation par paliers permet effectivement d’exposer les cortex ovariens à des

pressions osmotiques qui augmentent graduellement : d’environ 900 mosmol dans le premier

bain de cryoprotecteur, 1550 mosmol dans le second et enfin environ 2300 mosmol dans le

milieu de congélation final. Cette valeur atteint 3000 mosmol dans le cas du protocole

utilisant du sucrose dans les milieux de congélation.

La chute de la pression osmotique est également progressive lors du retrait des

cryoprotecteurs.

Nous avons enfin observé que l’ajout de 0,2 M de sucrose permet d’augmenter la

pression osmotique des milieux de 300 à 500 mosmol. Ainsi les pressions osmotiques des

premiers bains de cryoprotecteurs (1 M cryoprotecteur + 0 ,2 M) s’approchent de celles des

milieux de congélation (1,5 M cryoprotecteur).

II.1.2 Evaluation de la vitesse de refroidissement réelle

La figure 24 présente l’évolution de la température moyenne mesurée dans les

paillettes.

-50

-40

-30

-20

-10

0

10

20

30

0 5 10 15 20 25 30

Tem

péra

ture

(°C)

Temps (min)

T mesurée

T affichée

Figure 24 :

Température mesurée des paillettes au cours de la congélation.

113

La température mesurée de la chambre de congélation est sensiblement comparable à

celle donnée par l’interface de contrôle Cryogenesis®. Il est à noter que :

- la différence de température entre les extrémités inférieures et supérieures de la

cryochambre n’est pas flagrante

- le changement de température d’une phase à l’autre n’est pas aussi brutal que

l’indique le contrôle informatique et se fait progressivement.

- malgré une programmation à une vitesse de refroidissement de 2°C/min, la pente

R2 obtenue lors de ce protocole est de 1,53°C/min (donnée du rapport de

l’interface).

- la température de la phase de plateau qui de plus a lieu dans un intervalle de

température de -5,5°C à -6°C et non à -7°C.

- la vitesse de refroidissement lors de la phase de refroidissement solide (phase R2)

ne semble pas aussi constante que lors de la phase de refroidissement en phase

liquide (R1).

Le calcul des vitesses de refroidissement donne les résultats suivants :

- pour la pente R1, deux vitesses moyennes de 1,96°C/min et de 2,19°C/min ont été

mesurées lors des deux processus de congélation successifs.

- pour la pente R2, deux vitesses de 2,08°C/min et 2,44°C/min ont été mesurées

(exemple en figure 25).

Nous pouvons en déduire que la vitesse de refroidissement au sein de la chambre de

congélation est de l’ordre de 2°C/ min mais elle est variable d’un processus à l’autre. La pente

R2 est davantage sujette aux variations que la pente R1.

114

Figure 25:

Vitesse de refroidissement moyenne au cours de la phase R2.

Lors de l’induction de la cristallisation, une remontée de la température des paillettes

plus ou moins marquée est observée. Elle est liée à la chaleur libérée lors du changement

d’état. Ainsi la température n’est pas de -7°C comme l’indique l’interface de contrôle. La

figure 26 en apporte l’illustration.

115

Figure 26 :

Variations de température des paillettes au cours du seeding.

La surfusion est plus importante de 2°C environ dans le pôle inférieur que dans le pôle

supérieur et entraîne une remontée en température de plus grande amplitude, de l’ordre de

2°C également alors qu’elle est approximativement de 1°C dans le haut de la cryochambre. La

cristallisation complète du milieu de congélation se produit donc au moins 3 minutes après

l’induction qui est réalisée à l’extrémité supérieure de la paillette.

De fait, nous n’avons que très rarement observé une propagation quasiment instantanée du

front de glace à partir du point de contact de l’écouvillon avec la paillette.

116

II.2 Protocole P1 : influence du milieu de congélation

Une évaluation morphologique favorable des follicules à l’histologie n’est en aucun

cas synonyme de survie. Il s’agit d’un indicateur relatif : un follicule ne présentant pas de

défaut a plus de chance d’être viable que s’il en présente un.

De même, les défauts morphologiques peuvent être classés en fonction de leur gravité, avec,

par ordre croissant: défaut de cytoplasme seul, défaut de noyau et enfin défaut de noyau et de

cytoplasme conjugués.

II.2.1 Influence du cryoprotecteur

La figure 27 expose les proportions de follicules morphologiquement sans défaut

obtenues lors du protocole de référence P1.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

% fo

llicu

les

sans

déf

aut 1,5 DMSO

1,5 PROH

Témoins decongelation

Témoins frais

Figure 27 :

Influence de l'utilisation de cryoprotecteurs sur l'évaluation histologique des follicules.

La proportion de follicules primordiaux à primaires issus d’hémiovaires frais ne

présentant pas de défauts s’élève à 72%. Cette proportion est de 19 ± 2 ,2% dans le cas des

follicules congelés sans cryoprotecteurs. Le processus de congélation diminue donc

significativement la proportion de follicules sans défaut.

117

La proportion de follicules sans défaut congelés en présence de DMSO est de 42 ±

4,9%, celle obtenue en présence de PROH est de 66 ± 5,9%. L’emploi d’un cryoprotecteur

améliore donc significativement (p<0,05) la proportion de follicules sans défaut lors du

processus de congélation. De plus l’utilisation du PROH aboutit à une proportion

significativement meilleure de follicules sans défauts que le DMSO (p<0,05).

II.2.2 Nature des défauts observés

II.2.2.1 lors de la congélation sans cryoprotecteurs

Il s’agit de comparer ici les types de défauts rencontrés dans les témoins de

congélation et les témoins frais. Les résultats sont présentés par la figure 28. Les abréviations

utilisées sont les suivantes, elles sont valables pour tous les résultats exposés :

- CY : défaut de cytoplasme seul ;

- NX : défaut de noyau seul ;

- CY + NX : défaut de cytoplasme et de noyau conjugués.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

% fo

llicu

les

pré

sent

ant d

es d

éfau

ts

CY congelé

CY non congelé

NX congelé

NX non congelé

CY+ NX congelé

CY+ NX non congelé

Figure 28 :

Comparaison des types de défauts folliculaires entre témoins frais et témoins de congélation (P1).

118

La proportion des follicules présentant des défauts de cytoplasme est identique pour

les témoins frais et congelés : 11,0 ± 4,7 %.

Dans le cas des témoins frais, 11 ± 3,3% des follicules présentent des défauts de noyau

dans le cas des témoins frais contre 43 ± 5,3 % dans le cas des témoins congelés. Dans la

catégorie de follicules présentant des « défauts de cytoplasme et noyau conjugués », que nous

appellerons également « follicules dégénérés », les pourcentages sont de 27,4 ± 6,2 % pour les

témoins congelés et 5,6 ± 1,3 % pour les témoins frais. Ces statistiques sont significativement

plus mauvaises dans le cas des témoins congelés dans les deux dernières catégories citées.

La congélation sans agent cryoprotecteur entraîne donc non seulement une altération

de la morphologie folliculaire toutes catégories de défauts confondues mais également une

plus grande gravité des défauts mis en cause. La figure 29 en donne l’illustration

photographique.

119

1

2

Figure 29 :

Coupe de cortex ovarien avant congélation (en haut) et après congélation sans agent cryoprotecteur ( en bas).

1 : follicule dégénéré ; 2 : follicule présentant un défaut de cytoplasme. Outre les défauts morphologiques folliculaires, notez la plus grande hétérogénéité tissulaire dans le cas de l’ovaire congelé.

120

II.2.2.2 en présence de cryoprotecteurs

La figure 30 expose les proportions des différentes classes de défaut pour les deux

cryoprotecteurs.

0

5

10

15

20

25

30

% fo

llicul

es a

vec

défa

ut(s

)

CY DMSO

CY PROH

NX DMSO

NX PROH

CY + NX DMSO

CY+ NX PROH

Figure 30 :

Comparaison des types de défauts présentés par les follicules en fonction du cryoprotecteur utilisé (P1).

Dans le cas de l’utilisation du DMSO comme cryoprotecteur, 16 ± 3,9 % des follicules

présentent des défauts de cytoplasme contre 12 ± 3,3 % dans le cas de l’utilisation du PROH.

Dans la catégorie « défaut de noyau », 25 ± 2,7 % des follicules présentent des défauts dans le

cas du DMSO et 18 ± 3,1% dans le cas du PROH. Enfin 17 ± 3,2% des follicules congelés en

présence de DMSO sont « dégénérés » contre 5 ± 1,6% de ceux congelés avec du PROH.

Si l’on se penche sur la seule répartition des défauts, l’emploi des cryoprotecteurs tend

à augmenter la proportion des défauts de cytoplasme seul et à diminuer celle de défauts

conjugués par rapport au témoin congelé.

121

Figure 31 :

Cortex ovariens de chatte congelés en présence de DMSO (en haut) et de PROH (en bas) (protocole P1).

Les flèches désignent les follicules sans défaut.

122

II.3 Influence du seeding

II.3.1 Comparaison entre les cryoprotecteurs

La comparaison se fera ici comme pour chaque protocole avec le protocole de

référence P1. La figure 32 expose les résultats obtenus.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

1,5 M DMSO P1

1,5 M DMSO P2

1,5 M PROH P1

1,5 M PROH P2

Témoin congelé P1

Témoin congelé P2

Témoin frais P1

Témoin frais P2

Figure 32 :

Comparaison du pourcentage de follicules sans défauts obtenus entre P1 et P2.

Les différences observées respectivement entre les témoins frais (72 ± 3,6% contre 66

± 6,9 %) et les témoins de congélation (19 ± 2,2 % contre 23 ± 5,1 %) des protocoles P1 et P2

ne sont pas significatives. La comparaison d’autres résultats est donc possible.

Les proportions de follicules sans défaut pour le protocole sans seeding P2 sont les

suivantes : 47 ± 4,9 % pour le DMSO et 45 ± 6,3% pour le propylène-glycol.

Ces résultats sont d’une part significativement meilleurs pour les deux

cryoprotecteurs que ceux obtenus pour les témoins de congélation, et d’autre part

significativement plus mauvais en comparaison des témoins frais. Par ailleurs, aucun des

cryoprotecteurs ne se démarque donc significativement par rapport à l’autre pour ce protocole.

123

Par comparaison avec le protocole de référence P1, les statistiques obtenues pour P2

avec le PROH sont significativement plus mauvaises. Celles obtenues pour le DMSO ne

permettent pas de distinguer significativement un protocole par rapport à l’autre.

I.3.2 Nature des défauts observés

La proportion et la répartition des défauts de chaque catégorie sont comparables à

celles de P1 dans le cas du DMSO.

La proportion de follicules congelés en présence de PROH présentant des défauts de

cytoplasme dans ce protocole atteint 30 ± 2,3 %, contre 18 ± 2,9 % pour le protocole P1. La

proportion de follicules dégénérés est de 18 ± 7,6 % pour ce même cryoprotecteur contre 5 ±

1,9% pour P1. Cette augmentation est significative pour les deux catégories de défauts

(P<0,05).

L’observation de la répartition des défauts montre une augmentation de la proportion

de défauts conjugués « cytoplasme et noyau » par rapport aux défauts de cytoplasme seul

comme le montre la figure 33.

PROH protocole P255,5 % de follicules avec défaut(s)

8

29,3

18,2

PROH protocole P133,7 % de follicules avec défaut(s)

11,5

17,5

4,7

CY

NX

CY+NX

Figure 33 :

Comparaison des défauts au sein des follicules congelés en présence de PROH entre P1 et P2 (données

exprimées en % de la population folliculaire entière).

124

Ainsi dans le cas du PROH, le protocole P2 induit non seulement une baisse de

la proportion de follicules sans défaut par rapport à P1 mais tend également à aggraver la

nature des défauts observés.

II.4 Influence de l’ajout de sucrose dans le milieu de

congélation

II.4.1 Influence des cryoprotecteurs

La figure 34 présente les résultats obtenus.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

% fo

llicu

les

sans

déf

aut 1,5 M DMSO P1

1,5 M DMSO P3

1,5 M PROH P1

1,5 M PROH P3

Témoins congelés P1

Témoins congelés P3

Témoins frais P1

Témoins frais P3

Figure 34 :

Comparaison du pourcentage de follicules sans défaut obtenus entre P1 et P3.

Les différences observées respectivement entre les témoins frais (72 ± 3,6% contre 69

± 8,1 %) et les témoins de congélation (19 ± 2,2 % contre 21 ± 3,6 %) des protocoles P1 et P3

ne sont pas significatives. La comparaison d’autres résultats entre les protocoles est donc

possible.

Les proportions de follicules sans défaut obtenues pour le protocole P3 sont les

suivantes : 66 ± 11,4 % pour le DMSO et 39 ± 7,6 % pour le PROH.

125

Une amélioration significative est donc observée par rapport au témoin congelé pour

les deux cryoprotecteurs. La congélation en présence de DMSO déprécie significativement les

valeurs obtenues par rapport au témoin frais, ce qui n’est pas le cas pour le PROH. Cette

observation se retrouve dans le fait que les données obtenues pour P3 dans le cas du PROH

sont significativement meilleures que celles obtenues pour le DMSO.

La comparaison des proportions de follicules sans défaut entre P1 et P3 ne révèle pas

de différences significatives pour les deux cryoprotecteurs.

II.4.2 Nature des défauts observés

La proportion et la répartition des défauts de chaque catégorie est comparable à celle

de P1 dans le cas du PROH.

Dans le cas du DMSO, on observe une augmentation de la proportion de follicules

présentant des défauts de cytoplasme (30 ± 3,7 %) en regard d’une diminution de ceux

présentant des défauts de noyau (13 ± 25,2 %) (figure 35).

DMSO protocole P363,8% de follicules avec défaut(s)

30,2

12,9

18,7

DMSO protocole P157,5 % de follicules avec défaut(s)

15,8

25,2

16,5

CY

NX

CY+NX

Figure 35 :

Comparaison des types de défauts des follicules congelés en présence de DMSO entre P1 et P3 (données

exprimées en % de la population folliculaire entière).

126

II.5 Influence de la pente R2

II.5.1 Comparaison entre les cryoprotecteurs

La figure 36 présente les résultats obtenus pour chaque solution de conservation.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

% f

ollic

ules

san

s dé

fau

t 1,5 M DMSO P1

1,5 M DMSO P4

1,5 M PROH P1

1,5 M PROH P4

Témoins congelés P1

Témoins congelés P4

Témoins frais P1

Témoins frais P4

Figure 36

Comparaison du pourcentage de follicules sans défaut obtenus entre P1 et P4.

Les différences observées respectivement entre les témoins frais (72 ± 3,6% contre 78

± 4,3 %) et les témoins de congélation (19 ± 2,2 % contre 21 ± 3,8 %) des protocoles P1 et P4

ne sont pas significatives. La comparaison d’autres résultats entre les protocoles est donc

possible.

La proportion de follicules congelés sans défaut en présence de DMSO lors du

protocole P4 atteint 52 ± 8,3%, cette proportion atteint 66 ± 2,3 % dans le cas du PROH.

Ces proportions sont significativement plus élevées par rapport au témoin de

congélation dans le cas des deux cryoprotecteurs. Dans le cas des témoins frais, seul le DMSO

donne une nouvelle fois des résultats significativement moins bons.

L’utilisation du PROH dans ce protocole tend à donner une proportion de follicules

sans défaut plus élevée que dans le cas du PROH sans que ce soit toutefois significatif.

127

Par rapport au protocole de référence, l’utilisation du DMSO tend à donner de

meilleurs résultats sans que la différence soit significative. Dans le cas du PROH, les

proportions retrouvées sont du même ordre de grandeur.

II.5.2 Nature des défauts observés

La figure 37 présente les proportions atteintes par chaque catégorie de défaut dans le

cas de l’utilisation du DMSO en comparaison avec le protocole P1.

DMSO protocole P447,5 % de follicules avec défaut(s)

16,4

20

11,1

DMSO protocole P157,5 % de follicules avec défaut(s)

15,8

25,2

16,5

CY

NX

CY+NX

Figure 37 :

Comparaison des types de défauts des follicules congelés en présence de DMSO entre P1 et P4 (données

exprimées en % de la population folliculaire entière).

Ainsi le DMSO tend à induire plus de défauts de chaque catégorie sans que cela soit

significatif dans l’une d’entre elles.

Dans le cas de l’emploi de PROH, une tendance à obtenir moins de défauts de noyau

que pour P1 est notée : 11 ± 1,9 % contre 18 ± 3,1 %.

128

II.6 Influence de l’immersion directe des paillettes dans

l’azote liquide à -35°C

II.6.1 Comparaison entre les cryoprotecteurs

La figure 38 présente les proportions de follicules sans défaut obtenus pour le

protocole P5.

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% fo

llicu

les

sans

déf

auts

1,5 M DMSO P1

1,5 M DMSO P5

1,5 M PROH P1

1,5 M PROH P1

Témoin congelé P1

Témoin congelé P5

Témoin frais P1

Témoin frais P5

Figure 38 :

Comparaison du pourcentage de follicules sans défauts obtenus entre P1 et P5.

Les différences observées respectivement entre les témoins frais (72 ± 3,6% contre 87

± 2,5 %) et les témoins de congélation (19 ± 2,2 % contre 23 ± 5,3 %) des protocoles P1 et P5

ne sont pas significatives. La comparaison d’autres résultats entre les protocoles est donc

possible.

Une proportion de 47 ± 3,2 % de follicules sans défaut conservés avec le DMSO lors

du protocole P5 est obtenue, tandis que ce pourcentage est de 55 ± 8,1 % dans le cas du

PROH. Pour les deux cryoprotecteurs, ces résultats sont significativement meilleurs en

comparaison des témoins congelés, mais également significativement moins bons par rapport

au témoin frais.

129

Pour ce protocole la différence de proportion de follicules sans défaut entre les deux

cryoprotecteurs n’est pas significative. Toutefois le PROH tend à donner de meilleurs

résultats.

L’utilisation du DMSO donne des résultats comparables pour les deux protocoles. En

revanche l’utilisation du PROH tend à donner de moins bons résultats dans ce protocole P5

par rapport au protocole P1. La différence n’est pas significative.

II.6.2 Nature des défauts observés

La figure 39 illustre les proportions des différentes catégories de défauts dans le cas

de l’utilisation du PROH.

PROH protocole P545,2 % de follicules avec défaut(s)

7,2

19,2

18,8

PROH protocole P133,7 % de follicules avec défaut(s)

11,5

17,5

4,7

CY

NX

CY+NX

Figure 39 :

Comparaison des types de défauts présentés par les follicules congelés en présence de PROH entre P1 et P5.

Une tendance à observer une augmentation de la proportion de défauts conjugués par

rapport à P1 lors de l’utilisation du DMSO (23 ± 4,8 % contre 17 ± 3,8%) et surtout du PROH

(19 ± 6% contre 5 ± 1,6%) est remarquée.

Les proportions des autres défauts sont équivalentes pour les autres catégories au sein

de P5 pour les deux cryoprotecteurs.

La répartition des défauts montre également une augmentation de la proportion des

défauts conjugués « cytoplasme et noyau » par rapport à P1 pour les deux cryoprotecteurs de

même que pour les témoins de congélation sans cryoprotecteur (39 ± 9,8 % contre 27 ± 6,2

%).

130

131

III DISCUSSION

III.1 Validité du protocole expérimental

La validité du protocole expérimental doit être éprouvée par sa reproductibilité d’un

essai à l’autre dans des conditions opératoires les plus semblables possibles. Les paramètres

physico-chimiques observés in situ doivent se rapprocher le plus possible de ceux prévus par

la théorie : qu’en est-il de notre étude ?

III.1.1 Exposition des cortex ovariens aux variations de pression

osmotique

En l’absence de bains d’incubation successifs dans notre protocole, les cortex ovariens

seraient exposés à une différence de pression osmotique de plus de 2000 mosmol en quelques

secondes. Une destruction cellulaire par plasmolyse serait nécessairement induite par un

efflux d’eau trop important, induisant une diminution du pourcentage de follicules

morphologiquement normaux.

Ces considérations sont toutefois à nuancer dans le cas d’un tissu : en effet un gradient

de concentration en cryoprotecteur décroissant est observé entre les couches cellulaires les

plus externes et les plus internes, permettant une exposition moins brutale à une pression

osmotique élevée dans ce dernier cas.

En outre les couches les plus externes sont constituées de l’épithélium cubique et de la

tunique albuginée qui constitueraient une sorte de protection pour les follicules. Cependant la

dissection des cortex par résection de la médulla expose la seconde face et donc directement

les follicules à ces pressions osmotiques élevées et peut donc autoriser à évoquer une

altération morphologique majeure. Une nuance peut être apportée : les follicules sont situés

plus près de la face épithéliale que de la face médullaire.

L’incorporation par paliers permet de limiter le choc osmotique et d’éviter une

rétraction cellulaire irréversible et létale. NEWTON (1999) estime que l’on peut limiter la

rétraction osmotique de 30% en pratiquant une incorporation en deux étapes. D’autres auteurs

préconisent une incorporation en une seule étape de longue durée pour permettre d’atteindre

132

l’équilibre osmotique, notamment pour des cortex ovariens humains (HOVATTA O. et al, 1996;

GOOK D. et al, 1999 ; 2004 ).

Certaines théories exposent que lorsqu’on double la concentration en cryoprotecteurs,

la pression osmotique fait plus qu’être multipliée par deux. Nos résultats ne corroborent pas

cette hypothèse dans le cas des deux cryoprotecteurs. Ceci n’affecte en rien l’intérêt d’une

incorporation par paliers.

Plus fréquemment utilisé, le retrait par étapes trouve de la même façon sa justification

dans notre étude par diminution progressive de la pression osmotique. L’ajout du sucrose dans

les bains de décongélation augmente la pression osmotique extracellulaire, rendant

l’osmolarité des milieux de congélation intracellulaires sans sucrose du même ordre de

grandeur que le premier bain de retrait concentré à hauteur de 1 M.

Nous avons donc pris soin de limiter l’importance de la chute de pression osmotique et

de ne pas exposer les cortex ovariens à une réhydratation trop brutale. En effet, malgré des

pressions osmotiques comparables, une différence de concentration en cryoprotecteurs est

notée: une partie de ceux-ci diffuse hors de la cellule jusqu’à ce que les deux milieux soient

isotoniques. Le retrait se fait donc sans stress osmotique.

Nous n’avons pas comparé l’aspect morphologique des follicules primordiaux à

primaires avec une incubation en trois étapes et une incubation en une seule étape. Ce serait la

méthode la plus adéquate pour mesurer l’impact du stress osmotique et des variations du

volume cellulaire (rétraction et gonflement).

Nous nous sommes basés sur des considérations physiques et chimiques pour justifier

l’incorporation par paliers, cependant certaines études ne confirment pas ce choix. En effet,

chez la femme, GOOK (1999) a obtenu les meilleurs résultats avec une incorporation en une

seule étape de longue durée (90 minutes) à la fois pour les cellules de la granulosa et les

ovocytes au cours d’un protocole de congélation lente. De bons résultats ont également été

obtenus à température ambiante lors d’une incubation en une étape de 10 minutes chez la

brebis (DEMIRCI B. et al, 2002).

133

III.1.2 Contrôle de la congélation

La mesure de la descente en température au sein de la cryochambre révèle deux types

de problèmes. En effet si la pente R1 est de l’ordre de 2°C/min, la pente R2 est moins

contrôlable avec des écarts proches de 1°C entre la vitesse affichée par l’interface et la vitesse

réelle mesurée. Lorsqu’on s’approche de vitesses de refroidissement de l’ordre de 2,5°C/min,

la déshydratation cellulaire peut être trop rapide et la probabilité de formation de glace

intracellulaire augmentée. La constatation de ces écarts remet en cause la capacité du système

de congélation à assurer une vitesse de refroidissement de 0,5°C/min ; toutefois aucune

mesure de la vitesse réelle de descente en température n’a été effectuée lors de la réalisation

de ce protocole.

Un point est certain : la vitesse de refroidissement est plus lente et une déshydratation

cellulaire plus poussée est possible.

La température du plateau de seeding n’est pas celle prévue par logiciel (-7°C pour

P1). Il se produit à une température plus élevée de 1,5°C, ce qui se rapproche de la

température de congélation du milieu qui se situe aux alentours de -5°C. On constate que la

remontée en température dans le haut des paillettes est de faible amplitude : la température de

congélation du milieu est donc très proche de la température du seeding. Si celle-ci n’est pas

atteinte, la croissance des cristaux de glace lors de l’induction de la cristallisation peut être

stoppée et reprendre lors de la seconde phase de descente en température, de façon plus ou

moins anarchique.

Dans le cas du protocole de référence, on n’observe d’ailleurs pas de plateau au sens

strict du terme pour les extrémités inférieures des paillettes (figure 26), mais un

ralentissement de la vitesse de refroidissement associé à une brusque remontée en température

lors de la cristallisation. En effet, le seeding se fait au pôle supérieur des paillettes. La

croissance du front de glace prend environ trois minutes pour atteindre le pôle inférieur, qui

probablement par inertie thermique continue de se refroidir.

La température atteinte lors de la cristallisation dans l’extrémité inférieure de la

paillette est donc inférieure à celle du pôle supérieur, induisant une remontée en température

plus importante jusqu’à la température de congélation. Cette dernière n’est cependant pas

associée à une vitesse de refroidissement consécutive plus élevée pour atteindre la

température de la chambre, ce qui ne permet pas de conclure de façon certaine à un effet

134

délétère sur les cortex ovariens d’autant plus que ceux-ci sont placés dans le tiers supérieur

des paillettes.

Pour ARAV (2002), les systèmes de congélation classique, comme celui que nous

avons utilisé, présentent des limites. En effet pour que la température soit uniforme dans tout

le milieu de congélation, il faut une conduction thermique multi-directionnelle permise par la

géométrie de la chambre de congélation, ainsi qu’une conductivité thermique du matériau des

paillettes et du matériel biologique (dont le milieu de congélation) suffisantes.

L’influence de la température ambiante, la différence entre la température réelle et la

température affichée ainsi que la vitesse de croissance et la forme des cristaux sont également

mis en cause. Ces paramètres ne sont pas contrôlables, et ne permettent pas une maîtrise

complète des vitesses de refroidissement.

Nos résultats montrent que les paramètres physiques de notre protocole de congélation

ne sont effectivement pas totalement maîtrisables. L’uniformité de la température dans la

chambre de congélation est correcte ce qui nous autorise à affirmer que la conduction

thermique des matériaux est suffisante. En revanche, la cristallisation est difficilement

contrôlable : lors de la réalisation du seeding, la cristallisation avait déjà débuté dans certains

échantillons, et la croissance des cristaux se fait à une vitesse très variable d’un processus de

congélation au suivant.

Ceci est à mettre en relation avec la probabilité de nucléation dans le milieu de

congélation qui est fonction de nombreux facteurs influençant hautement imprévisibles.

Les critiques soulevées par ARAV semblent donc justifiées dans ce cas. Pour permettre

une amélioration du contrôle de la descente en température et de la cristallisation, cette équipe

a proposé de faire passer les échantillons dans un gradient de température linéaire (Multi

Thermal Gradient®), qui permet de contrôler avec précision la survenue du seeding et la

vitesse de croissance du front de glace afin qu’il n’engendre pas une rupture membranaire ou

l’effondrement de l’architecture tissulaire.

Cette méthode se propose de pouvoir modifier à tout instant la vitesse de

refroidissement à partir de l’observation du phénomène de nucléation et de la morphologie

135

des cristaux. Elle a cependant surtout été utilisée pour le sperme et seule une étude a été

publiée chez la brebis par BEDAIWY et al (2003) dans le cas de la congélation d’ovaire entiers.

III.2 Détermination du protocole de congélation le plus

performant

III.2.1 Choix du cryoprotecteur

Les résultats que nous avons obtenus confirment l’effet bénéfique de l’utilisation de

cryoprotecteurs sur la morphologie des follicules de tissu ovarien congelé comme d’autres

études l’avaient précédemment montré (HOVATTA O. et al, 1996 ; RODRIGUES A.P.R. et al,

2004a ; NETO V. et al, 2005) depuis la parution des résultats de PAROTT en 1960 (PARROT

D.M.V., 1960).

Le PROH semble être un cryoprotecteur plus indiqué que le DMSO dans le cas de la

congélation de cortex ovariens de chattes. Ceci est en accord avec les résultats obtenus pour la

lapine (NETO V. et al, 2005) par notre équipe, mais en désaccord avec les conclusions

obtenues par Gutierrez chez la brebis (GUTIERREZ A., 2000) chez qui il n’y a pas de différence

de morphologie folliculaire entre ni entre les deux cryoprotecteurs ni entre le témoin congelé.

Chez la chèvre (RODRIGUES A.P.R. et al, 2004a) on observe même la tendance inverse

avec l’obtention de meilleurs résultats dans le cas de l’utilisation du DMSO.

L’utilisation du PROH permet d’obtenir 66.3% +/- 5,9% de follicules normaux chez

la chatte, proportion qui avoisine celle rapportée pour les cortex ovariens de brebis par

DEMIRCI (2002) :68,5 +/- 13,4 % lors de l’utilisation de ce cryoprotecteur à la même

concentration (1,5 M).

Le plus faible pourcentage de follicules normaux après congélation dans le PROH et

surtout le DMSO par rapport au témoin frais (72% de follicules sans défauts) ne se retrouve

pas systématiquement dans toutes les études. On la retrouve chez la chèvre (RODRIGUES

A.P.R. et al, 2004a), la vache (PAYNTER S.J. et al, 1999) et la souris (CANDY C.J. et al, 1997).

136

Chez le chat, deux publications principales permettent de situer la valeur de notre

étude :

- JEWGENOW et al (1998) ont étudié la viabilité de follicules pré-antraux isolés

de chatte après leur congélation en présence de PROH et de DMSO (test effectué au bleu

trypan). Outre le fait que les tests de toxicité montrent que l’utilisation de ces deux

cryoprotecteurs n’affecte pas la viabilité des follicules, aucune différence significative entre

eux après congélation n’a été mise en évidence, avec une proportion de 19% de follicules

viables.

- LIMA et al (2006) obtiennent 58 % de follicules pré-antraux sans défauts lors

de la congélation de cortex ovariens avec l’utilisation d’éthylène glycol (1,5 M), et seulement

39,3% dans le cas de l’utilisation du glycérol. Il s’agit à ce jour de l’étude la plus proche de la

nôtre malgré les différences de modalités du protocole utilisé, car c’est la seule publication sur

l’utilisation de cortex ovariens de chattes.

Toutefois, il faut interpréter ces différents résultats avec beaucoup de précautions, et la

différence observée entre nos résultats et ceux de la littérature peuvent s’expliquer

par différents phénomènes.

Les différences d’un protocole à l’autre varient de plus d’un paramètre et n’autorisent

donc aucune comparaison objective.

La subjectivité des évaluations morphologiques est à prendre en compte: les

classifications des follicules varient d’une équipe à l’autre, l’évaluateur n’est pas le même, et

les techniques d’histologie ne sont pas les mêmes notamment en ce qui concerne le fixateur.

Beaucoup d’auteurs utilisent le fixateur de Bouin, mais nos premiers résultats (données non

publiées) se sont révélés décevants et ont conduit à l’utilisation du fixateur de Davidson après

validation expérimentale.

137

Des différences inter-spécifiques existent: le chat est considéré comme une espèce

présentant une plus grande fragilité du tissu cortical et des follicules que la brebis ou la

femme par exemple (RODRIGUES A. et al, 2005 ; JEWGENOW K. et PARIS M., 2006). Nos

résultats incitent tout de même à une plus grande prudence à l’encontre de cette affirmation :

notre pourcentage de 66 % de follicules sans défaut s’approche de ceux obtenus chez la brebis

dans le cas de follicules pré-antraux isolés congelés dans 1,5 M PROH de l’étude de

RODRIGUES et al :74 ± 6,6%.

Il est certain que l’absence de test de toxicité dans notre étude ne nous permet pas de

relativiser l’importance de la toxicité des cryoprotecteurs en regard de celle des dégâts causés

par la congélation elle-même.

III.2.2 influence des différents paramètres

Nos résultats ne permettent pas de définir de protocole dont les résultats seraient plus

satisfaisants que pour les autres.

Ils confortent néanmoins l’importance du seeding : les résultats sont nettement moins

bon lorsque celui n’est pas effectué dans le cas du PROH. L’augmentation de la proportion

de follicules présentant des défauts conjugués laisse à penser qu’un problème de cristallisation

intracellulaire ou de choc osmotique se produit. Il est difficile d’expliquer pourquoi cette

tendance est moins marquée dans le cas du DMSO : est-ce à cause de la toxicité propre de ce

composé avant congélation ?

L’ajout de sucrose dans le milieu de congélation n’a pas apporté d’amélioration, mais

d’autres études ont montré des résultats contradictoires chez la femme: alors que MARSELLA

et al (2002) obtenaient de meilleurs résultats en ajoutant 0.3 M de sucrose au milieu de

congélation par rapport à 0.2 M, Newton observait des signes biochimiques de souffrance

cellulaire à 0.25 M qu’il n’observait pas à des concentrations inférieures (NEWTON H. et al,

1998).

Les résultats publiés par DEMIRCI (2001) montrant qu’un protocole avec une

deuxième pente à 2°C/min était aussi efficace que celui décrit par GOSDEN (1994) avec une

pente à 0.5°C sont confirmés : cette vitesse de refroidissement ne semble pas trop élevée et

permet une déshydratation optimale chez la chatte. Les résultats relativement bons obtenus

138

avec le protocole d’immersion directe dans l’azote liquide à –35°C confirment d’ailleurs que

la déshydratation est presque allée à son terme par rapport au protocole de référence.

L’enseignement principal consiste dans le fait que l’influence du cryoprotecteur est

plus importante que celui de la courbe de congélation, et que le seeding est une étape

incontournable.

III.3 Perspectives d’utilisation des cortex ovariens

Notre étude ne constitue qu’un indicateur de statut morphologique des follicules et de

la conservation architecturale et physiologique du tissu ovarien de chatte. Mais les résultats de

culture ou de greffe sont encourageants :

Chez la chatte, BOSCH et al (2004) rapportent 10% de survie pour les follicules après

congélation et xénogreffe de fragments ovariens à des souris mâles NOD SCID. Chez les

autres espèces : FABBRI et al (2003) montrent par méthode immunohistochimique (index de

multiplication cellulaire Ki67 et indicateur d’anti-apoptose Bcl2) que les différents types

cellulaires au sein de cortex ovariens de femmes peuvent reprendre leur croissance. PAYNTER

et al (1999) affirment que 4 heures de culture suffisent à rétablir l’activité, le volume

cellulaire normal et les contacts intercellulaires au sein de cortex de vache congelés. La

croissance de follicules jusqu’au stade antral a pu être conduite après xénogreffe sans

différence entre tissu frais et congelé (brebis (GOSDEN R.G. et al, 1994), ouistiti : CANDY et al

(1995) cité par SANTOS R.R. (2005))

Plus concrètement, la restauration de la fonction ovarienne et de la fonction

reproductrice est possible, au moins quelques mois : PARROTT l’a démontré chez la souris en

1960. Des naissances ont été ensuite obtenues : GOSDEN et al en 1994 sur la brebis (GOSDEN

R.G. et al, 1994) suivi par SALLE et al (2002). Dans ce cas, les gestations ont été obtenues 5 à

6 mois après la greffe (autogreffe) ; une deuxième série de naissances a été observée deux ans

après la greffe : l’activité ovarienne des greffons est donc de cet ordre de durée, le problème

139

étant que le stock folliculaire a été très diminué lors de la décongélation et de la greffe en

raison du laps de temps nécessaire à l’établissement d’une anastomose vasculaire.

Chez la femme, une naissance a été obtenue (DONNEZ J. et DOLMANS M.M., 2004) à

Louvain en Belgique. Cependant des résultats d’études autorisent l’espoir : reprise de la

croissance folliculaire après greffe de tissu ovarien de femme à des souris SCID (OKTAY K. et

al, 1998 ; GOOK D. et al, 2001). OKTAY et al (2000c) ont obtenu une ovulation après

stimulation à partir d’un greffon congelé.

140

141

CONCLUSION

Très pauvre voire inexistante pendant de nombreuses années la recherche dans le

domaine de la cryopréservation de tissu ovarien de femelles mammifères s’est accélérée au

cours des deux dernières décennies. Alors que certaines bases théoriques font le consensus, la

compréhension physique de la congélation est incomplète, ni complètement maîtrisable ni

reproductible d’un essai à l’autre. A l’image de la découverte fortuite du pouvoir

cryoprotecteur du glycérol par POLGE en 1949, c’est l’empirisme qui constitue la principale

voie d’expérimentation, avec comme sanction l’évaluation histologique, la viabilité cellulaire,

ou la restauration de la fertilité après cryoconservation. A ce jour, aucun protocole parmi les

différentes espèces étudiées ne se dégage de façon formelle et indiscutable des autres.

Nous avons montré par notre étude que la congélation de follicules pré-antraux de

chattes au sein de fragments ovariens en présence de DMSO et plus encore de PROH donnait

des résultats histologiques tout à fait satisfaisants. La reprise de la croissance folliculaire après

décongélation semble envisageable. Nous n’avons pas établi de protocole de choix pour la

chatte parmi les cinq que nous avons étudiés, mais confirmé l’importance de certains points

incontournables d’un protocole de congélation lente.

Notre méthode paraît peu exigeante en équipement et facilement standardisable. Elle

autorise une grande diversité des méthodes d’utilisation des cortex ovariens : la culture et la

maturation in vitro, ou les techniques de greffe.

142

143

Annexe 1 :

Ages des chattes utilisées pour l’expérimentation

144

NOM AGE (en mois)

Mya 11

Violette 7

Rama 7

Chupa chups 9

Titoune 6

Vicky 12

Praline 9

Noisette 9

x 8

x 8

Vodka 9

Cachette 60

Réglisse 72

x 12

x 13

x 24

x 40

Bebe 14

x 12

x 36

Noisette 60

x 12

x 13

x 12

Pitaine 9

Uvea 27

Themis 55

Johanne 9

Damas 17

Servant 18

Simba 6

x 7

Kalli 12

Mouna 6

Souris 6

Mali 6

Togo 6

Antigore 42

145

Annexe 2 :

Fiche de comptages cellulaires

146

FICHE DE COMPTAGES : OBSERVATION MORPHOLOGIQUE DES FOLLICULES

Date :………………….. Code protocole : ………………

Follicules avec défauts N° prélèvement Follicules sans défaut Défaut

Cytoplasme Défaut Noyau Défaut

Cyto+Noyau Primordiaux

Intermédiaires

Primaires

Remarques :………………………………………………………………………………………………………...

Follicules avec défauts N° prélèvement Follicules sans défaut Défaut

cytoplasme Défaut Noyau Défaut

Cyto+Noyau Primordiaux

Intermédiaires

Primaires

Remarques :………………………………………………………………………………………………………...

147

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SAILLEY Florian. CRYCONSERVATION DU CORTEX OVARIEN CHEZ LA CHATTE. EFFETS DES PARAMETRES PHYSIQUES ET CHIMIQUES AU COURS DE LA CONGELATION. Thèse Vétérinaire : Lyon , 2008.

RESUME : La cryoconservation du tissu ovarien contenant les follicules primordiaux est une nouvelle voie de recherche pour la conservation des gamètes femelles. Après avoir rappelé dans une première partie, les caractéristiques de la physiologie sexuelle de la chatte et les bases physicochimiques de la congélation, la deuxième partie de cette thèse est expérimentale. Elle s’attache à étudier l’influence de deux cryoprotecteurs, le diméthyl-sulfoxyde (DMSO) et le 1,2 propane-diol (PROH), lors de la congélation de cortex ovariens de chatte. Les résultats apparaissent encourageants pour l’utilisation du tissu ovarien par greffe, culture ou maturation in vitro. MOTS CLES : - Cyoconservation - Chatte - Congélation

- Ovaire - Cryoprotecteur

JURY :

Président : Monsieur le Professeur Michel BERLAND

1er Assesseur : Monsieur le Professeur Samuel BUFF 2ème Assesseur : Monsieur le Professeur Pierre GUERIN Membre invité : Mademoiselle Vanessa NETO

DATE DE SOUTENANCE : Le 11 Janvier 2008 ADRESSE DE L’AUTEUR : 1 rue de la Libération

70110 Oppenans