cours p2 2010 ther cell - l2 bichat...

1

THERAPIECELLULAIRE

La thérapie cellulaire est l’utilisation de cellules vivantes manipulées ou modifiées à des fins thérapeutiques.

Des dispositions réglementaires fixent les modalités d’organisation de la thérapie cellulaire en France.

Définition

Deux notions sont essentielles à la compréhensiondu champ d’application de la thérapie cellulaire:

Il existe de nombreux types de cellules utilisables:

cellules embryonnaires (sous conditions!)

cellules souches fœtales

cellules souches des organes adultes

cellules adultes spécialisées

Deux modalités de traitement sont possibles:

allogreffe

autogreffe

Différents types de Cellules Souches

Intestin Peau CerveauTissu

Hématopoïétique Muscle

EctodermeMésodermeEndoderme

Foie

TOTIPOTENTES

PLURIPOTENTES

MULTIPOTENTES

¢ MATURES

Différents types de cellules souchespar organes ou tissus

organogénèseorganogénèse

musclemuscle

osos

Système nerveuxSystème nerveux

Système hématopoïétiqueSystème hématopoïétique

épidermeépiderme

IntestinIntestin

Hépato-biliairesHépato-biliaires

Tissus conjonctifs squelette (CSM)Tissus conjonctifs squelette (CSM)

THERAPIE CELLULAIRE ET CELLULESSOUCHES HEMATOPOIETIQUES

2

HISTORIQUE

• 1957 - 1959: 1ères greffes de moelle osseuse

- Reconstitution de l’hématopoïèseallogreffes après irradiation accidentelle (Mathé)

- Traitement anticancéreux en phase de progressionallogreffes (Thomas), autogreffes (Dameshek)

• 1975 – 1980: amélioration des techniques

- Conditionnements pré greffe, greffes en période de rémission

• 1980 - 1985: purge des greffons autologues

• 1986 - 1990: greffes de cellules souches sanguines

• 1988: 1ère greffe de sang de cordon (Gluckman)

• 1991: greffes de cellules CD34+

• 1995: greffes de cellules amplifiées

PRINCIPE

Les cellules souches hématopoïétiques (CSH)

Source des CSH:

La moelle osseuse

Le sang périphérique

Le sang de cordon ombilical

CSH

CSH

Matrice extracellulaire

Fibroblastes, adipocytes

endothélium


PrPrééllèèvement mvement méédullairedullaire PrPrééllèèvement mvement méédullairedullaire

3

PrPrééllèèvement mvement méédullairedullaire PrPrééllèèvement de cellules souches vement de cellules souches ppéériphriphéériquesriques

CSH

CSH

Fibroblastes, adipocytes


Sang périphérique

PrPrééllèèvement de cellules souches vement de cellules souches ppéériphriphéériquesriques

cellules souches pcellules souches p éériphriph éériquesriques

• Faible nombre à l’état basal

• Augmentation après chimiothérapie aplasiante et/ou F DC

→ Techniques de mobilisation

• Chimiothérapie seule

• FDC seul (G-CSF)

• Chimiothérapie + FDC (G-CSF ou GM-CSF)

• Avantages

- Collection facilitée (par cytaphérèse, pas d’AG)

- Récupération hématopoïétique plus rapide/MOdurée d’hospitalisation plus courte, diminution dunombre de transfusions

- Contamination du greffon moins importante?

PrPrééllèèvement de sang placentairevement de sang placentaire

4

PrPrééllèèvement de sang placentairevement de sang placentaire CSH et sang placentaire

• greffes allogéniques à partir de banques ou de la fr atrie

• Avantages

Immaturité des cellules immunocompétentes→ moins de GVH→ HLA +/- compatible

Très grand nombre potentiel de donneur

Capacités prolifératives des CS plus importante→ prise de greffe avec peu de cellules

• Inconvénients

Quantité limitée→ concerne les greffes pédiatriques en priorité→ possibilité chez l’adulte (intérêt expansion +++,

plusieurs cordons)

Autogreffe de CSH

Partie intégrante du traitement de certaines hémopathies malignes ou de certains cancers.

- prélèvement du greffon (+/- facteurs de croissances)

- chimiothérapies fortes doses

- restauration de la moelle osseuse aplasique

Diagnostic et autogreffe de CSH

Hémopathies (n=1856) %

Lymphomes non hodgkiniens 38,7Myélome 32,2Hodgkin 8,6Leucémie aiguë myéloïde 6,1Leucémie myéloïde chronique 6,1Leucémie aiguë lymphoblastique 3,4Leucémie lymphoïde chronique 1,9Myélodysplasie 0,7Autres 2,3

Tumeurs solides (n=411) %

Sein 35Neuroblastome 12,6Testicule 11,5Système nerveux 11,3Os 10,5Ovaire 5,1Sarcomes 3,6Autres 10,6

Allogreffe de CSH

Réservée à certaines hémopathies particulièrement graves.

La reconstitution hématopoïétique s’accompagne d’un conflitentre donneur et receveur: intérêt � effet GVL

problème � effet GVH

Nécessité du groupage et de la compatibilité HLA

Allogreffes géno-identiques ou phéno-identiques

Diagnostic et allogreffe de CSH

%

Leucémie aiguë myéloïde 24,7

Leucémie aiguë lymphoblastique 23

Leucémie myéloïde chronique 18,4

Lymphomes non hodgkiniens 8,6

Myélodysplasie 5,8

Aplasie 4,9

%

Myélome 2,6

Leucémie lymphoïde chronique 1,5

Hémoglobinopathies 0,8

Hodgkin 0,5

Autres 3,7

5

MANIPULATION ET CONTRÔLE DES GREFFONS CELLULAIRES

OOùù et dans quelles conditions?et dans quelles conditions?

Prod 1

Prod 2

Prod 3

Prod 4

Prod 5

Stock matériel déconditionné

LocalMénage

SAS

déc hets

SAS

matériel

SAS

personnel

Prod 6

Prod 7

Prod 8

Local supervision

Accueil

RéceptionCQ 1

CQ 2

CQ 3Vestiaire

Femmes

Vestiaire

Hommes

SAS

Labo CQ

WC

WC

Local

Détente

Loca l

Déch ets

Laverie Mag asin

Biothèque – 80°C

Zone de Cryobiologie

Zone technique

12

3

5

Secteur de production

4

Prod 1

Prod 2

Prod 3

Prod 4

Prod 5


LocalMénage

SAS

déc hets

SAS

matériel

SAS

personnel

Prod 6

Prod 7

Prod 8

Local supervision

Accueil

RéceptionCQ 1

CQ 2

CQ 3Vestiaire

Femmes

Vestiaire

Hommes

SAS

Labo CQ

WC

WC

Local

Détente

Loca l

Déch ets

Laverie Mag asin



Zone technique

12

3

5

Secteur de production

4

6

Prod 1

Prod 2

Prod 3

Pr od 4

Prod 5

Stock matériel déco nditionné

LocalMénage

SAS

déchets

SAS

matériel

SAS

personnel

Prod 6

Prod 7

Prod 8

Local supervision

Accueil

RéceptionCQ 1 CQ 2

CQ 3Vestiaire

Femmes

Vestiaire

Hommes

SAS

Labo CQ

WC

WC

L ocal

D étente

Local

Déchets

Laverie Magasin



Zone technique

23

4

5

4

1

4

SL-T-SE-LO- 04 V.01Date d ’application : 04/10/05

Localisation des prélèvements hebdomadaires pour un e surveillance microbiologique du nouveau laboratoi re de thérapie cellulaire

2

3

4

5Entrée SAS échantillon

SAS entrée produi t TC

SAS sortie échant illon

SAS entrée dry-sh ipper

SAS sortie produit1

XXX X

XX

X

X XX

PSM APSM B

X

XX

X

XX

XX

X

PSM C

PSM D X

X XX

XX

XX X

XXX

XX

X

X

X

XXX

X

X XX

X

XPSM I

PSM E

PSM F

PSM G

PSM H

XX Bactério logie airBactériolog ie surface

X

BM

Prod 1

Prod 2

Prod 3

Pr od 4

Prod 5

Stock matériel déco nditionné

LocalMénage

SAS

déchets

SAS

matériel

SAS

personnel

Prod 6

Prod 7

Prod 8

Local supervision

Accueil

RéceptionCQ 1 CQ 2

CQ 3Vestiaire

Femmes

Vestiaire

Hommes

SAS

Labo CQ

WC

WC

L ocal

D étente

Local

Déchets

Laverie Magasin



Zone technique

23

4

5

4

1

4

SL-T-SE-LO- 04 V.01Date d ’application : 04/10/05

Localisation des prélèvements hebdomadaires pour un e surveillance microbiologique du nouveau laboratoi re de thérapie cellulaire

2

3

4


SAS entrée produi t TC

SAS sortie échant illon

SAS entrée dry-sh ipper

SAS sortie produit1

XXX X

XX

X

X XX

PSM APSM B

X

XX

X

XX

XX

X

PSM C

PSM D X

X XX

XX

XX X

XXX

XX

X

X

X

XXX

X

X XX

X

XPSM I

PSM E

PSM F

PSM G

PSM H

XX Bactério logie airBactériolog ie surface

X

BM

Prod 1

Prod 2

Prod 3

Prod 4

Prod 5


LocalMé nage SAS

déchetsSAS

matériel

SASpersonnel

Prod 6

Prod 7

Prod 8

Local supervision

AccueilRéception

CQ 1CQ 2

CQ 3VestiaireFemmes

VestiaireHommes

SAS Labo CQ

WC

WC

LocalDétente

Loca lDéch ets

Laver ie Magasin



Zone technique

12

3

5

4

X XPSM B

X

X

X

X

X

X

X

X

X X

X

2

34


SAS entrée produ it TC

SAS sortie échantillon

SAS entrée dry-shipper

SAS sortie produit1

XX Particules hottesPart icules pièces

Localisation des points de contrôle pour la surveillance de la ZAC des PSM du nouveau laboratoire de thérapie cellulaire

X

X

X

X

X

X X X

X

X

PSM C

PSM D

PSM E

PSM F

PSM G

PSM H

P SM A PSM I

X

SL-T-SE-LO- 05 V. 01Date d ’application : 04/10/05

Prod 1

Prod 2

Prod 3

Prod 4

Prod 5


LocalMé nage SAS

déchetsSAS

matériel

SASpersonnel

Prod 6

Prod 7

Prod 8

Local supervision

AccueilRéception

CQ 1CQ 2

CQ 3VestiaireFemmes

VestiaireHommes

SAS Labo CQ

WC

WC

LocalDétente

Loca lDéch ets

Laver ie Magasin



Zone technique

12

3

5

4

X XPSM B

X

X

X

X

X

X

X

X

X X

X

2

34


SAS entrée produ it TC

SAS sortie échantillon

SAS entrée dry-shipper

SAS sortie produit1

XX Particules hottesPart icules pièces

Localisation des points de contrôle pour la surveillance de la ZAC des PSM du nouveau laboratoire de thérapie cellulaire

X

X

X

X

X

X X X

X

X

PSM C

PSM D

PSM E

PSM F

PSM G

PSM H

P SM A PSM I

X

SL-T-SE-LO- 05 V. 01Date d ’application : 04/10/05

MANIPULATION DES GREFFONS CELLULAIRES

Quelles manipulations pour quels Quelles manipulations pour quels greffons?greffons?

7

Moelle osseuse

Volume important

Présence de « contaminants »

Agrégats possibles

GR très nombreux

� réduire le volume

�� tenir compte de l’ABO incompatibilité +++

CSP

Volume ≈ 300 ml

Grande richessecellulaire

GR peu nombreux

Problème du plasma

� tenir compte de l’ABO incompatibilité «sérique»

� thrombopénie dudonneur

Sang de Cordon

Volume faible

Richessecellulaire assez faible

Congélation

Décongélation

� rendements cellulaires +++

� expansion

RRééduire le volumeduire le volume …………sans perdre de cellulessans perdre de cellules

FiltrationConcentration

Élimination des « contaminants »et des agrégats

Élimination du plasma

En situationABO compatible

Resuspension des cellules en G 5%

Récupération des GB, GR, et CSH

Rendements cellulaires > 80% !

RRééduire le volume, duire le volume, ééliminer les GRliminer les GR …………sans sans perdre trop de cellulesperdre trop de cellules

Desérythrocytation

Élimination des « contaminants »et des agrégats

Élimination du plasma

Récupération des GB et CSH

ELIMINER LES GR EN SITUATION ABO INCOMPATIBLE

RRééduire le volume, duire le volume, ééliminer les GRliminer les GR …………sans sans perdre trop de cellulesperdre trop de cellules

Desérythrocytation

Volume initial de GR (n=114) :

310 ml

Volume final de GR (n=114) : 4 ml

Récupération cellulaire:Granuleux, 49%

CD34+, 82%

CFU-GM, 94%

Effets secondaires :pas plus que pour les greffons non desérythrocytés

Récupération hématopoïétique :Pas plus longue que pour les greffons non desérythrocytés

Méthodes de sélection du greffon

• Méthodes chimiques

- Agents chimiothérapeutiques actifs in vitroex: dérivés du cyclophosphamide (Asta Z)

- Intérêt: traitement antitumoralgreffons autologuessurtout dans les pathologies myéloïdes (LAM)

- Inconvénients: toxicité hématopoïétique → ↑ durée d’aplasie

• Méthodes immunologiques (billes magnétiques)

- sélection positive des cellules CD34+

greffons allogéniques → déplétion T ( ↓ GVH)

greffons autologues → traitement antitumoral si cellulesmalignes CD34- (ex: myélome)

Tout Tout ééliminer liminer …………saufsauf les CSHles CSH Tout Tout ééliminer liminer …………saufsauf les CSHles CSH

Sélection CD34

8

SSéélection des cellules CD34+lection des cellules CD34+

Un exemple

Avant :Cellules totales:8.4 109

CD34+:145 106 (1.7%)

CD3+:1.3 108 (1.58%)

CD14+:12.8 108 (15.43%)

CD19+:0.1 108 (0.13%)

Après :Cellules totales:0.089 109

CD34+:85 106 (98.4%)

CD3+:0.005 108 (0.5%)

CD14+:0 (0%)

CD19+:0 (0%)

SEPAX

Le sang de cordon ombilical: du prLe sang de cordon ombilical: du pr ééllèèvement vement àà la banquela banque

Sécurisation :Bilan maternel Jo et J42, groupe ABO, HLA mère et cordon

Contrôles :Volume, cellules, CSH, viabilité, Hbsang de cordon, bactériologie, carnet de santé…

1

2

Le sang de cordon ombilical: du prLe sang de cordon ombilical: du pr ééllèèvement vement àà la banquela banque

«descente en température»

«cryopreservation»

Le sang de cordon ombilical: de la banque Le sang de cordon ombilical: de la banque ààla greffela greffe

Volume cryopréservé« faible »

Nombre de cellules « limité »

Pas de problèmes techniques de l’ABO

incompatibilitééventuelle

Limiterles

manipulations


SP volume réduit < 80mlpour voie IV

Pas de lavageDilution en albumine

4%

SP volume non réduit

>80mlpour voie IV

Lavage en voluvenpuis reprise en glucosé

tamponné


30

40

50

60

70

80

90

Viabilité cellulaire % (marquage 7-AAD)

Viab

30

40

50

60

70

80

90

Via

bilit

éà

la d

écon

géla

tion

%

0 500 1000 1500 2000 2500 3000 3500 4000 4500Durée de conservation

Y = 57,162 + ,005 * X; R 2̂ = ,134

Pas de corrélation viabilité/durée stockage

Résultats de la décongélation

9


Résultats de la décongélation

0

5

10

15

20

25

30

35

40

Uni

tés

CD34 f rais CD34 dec

Numération CD34 avant congélation / après décongélation

0

5

10

15

20

25

30

35

40

CD

34 d

ec

0 5 10 15 20 25 30 35CD34 f rais

Y = -,454 + 1,104 * X; R^2 = ,803

Corrélation contenu en CD34 frais / décongelé

Alors, faut il chercher Alors, faut il chercher àà augmenter le nombre augmenter le nombre de cellules? de cellules?

Expansion du sang de cordon

But:

In vitro, expandre les cellules souches hématopoïétiques et reproduire leurs

fonctions physiologiques d’auto-renouvellement et de différenciation

Processus multi-étapes associant une sélection des cellules CD34+ et une

expansion de 12 - 14 jours en présence de facteurs de croissance

Expansion du sang de cordon

CMNCMN

Flt3, TPO, Flt3, TPO, SCF, ILSCF, IL--33

J0, J7J0, J7

Expansion du sang de cordonEst-ce que ça marche?

12 jours

Contraintes techniques et réglementaires

!

Expansion du sang de cordonOui…mais

Cordon décongelé :

1 milliard de cellules

6 millions de CSH

expansion :

�� Sélectionner les cellules: → pertes

�� 20 000 cellules / ml au départ: →

difficultés techniques

X 10 pour 2 millions de CD34

�� Coût +++++

Au final :

300 millions de cellules

20 millions de « CSH »

Le sang de cordon ombilical:Le sang de cordon ombilical:

des questions des questions ééthiques, un dthiques, un déébat bat passionnpassionné…é…

10

La question des banques de sang de cordon

• Sang de cordon non apparentédans le cadre des greffes allogéniquesde sang de cordon pour les pathologies

hématologiques très majoritairement

• Sang de cordon intrafamilial dans le cadre d’une pathologie hématologique ou autre curable par greffe de cellules souches hématopoïétiques

• Sang de cordon autologuepour un usage potentiel

ultérieur


Banques allogéniques

Plus de 400 000 greffons en

banque

Plus de 20 000 greffons

transplantés

Greffes en fonction du diagnostic

Enfants Adultes


Quel type de cellule pour quelle application?

• MNCs

• MSCs

• EPCs

• HSCs

• foie

• Ilots pancréatiques

• Rétine

• Neurones…

• ES like• A new human somatic stem cell from placental cord b lood with intrinsic pluripotent

differentiation potential.

Kögler G , et al. J Exp Med. 2004 Jul 19;200(2):123-35.

• Morphological and molecular characterization of nov el population of CXCR4+SSEA-4+Oct-4+ very small embryonic-like cells purified from human cord blood: preliminary report.

Kucia M ,et al. Leukemia. 2007 (2):297-303

• Production of stem cells with embryonic characteris tics from human umbilical cord blood.McGuckin CP et al, Cell Prolif. 2005;38(4):245-55

•• BBéénnééfice thfice th éérapeutique prouvrapeutique prouv éé•• QualitQualit éé : accr: accr ééditation des ditation des

banques, standards banques, standards internationauxinternationaux

•• Financement public, absence Financement public, absence de profitsde profits

•• Conservation garantieConservation garantie•• SolidaritSolidarit éé (don anonyme et (don anonyme et

gratuitgratuit•• AccAcc èès pour touss pour tous•• RRééglementationglementation•• Registres nationaux et Registres nationaux et

internationauxinternationaux

•• BBéénnééfice inconnufice inconnu•• QualitQualit éé trtr èès variables variable•• PrivPriv éé, = profit, = profit•• Conservation non Conservation non garantiegarantie•• CompComp éétition avec tition avec

ll ’’allogallog ééniquenique•• AccAcc èès trs tr èès ins in éégalgal•• Information biaisInformation biais éée +++e +++•• Pas de registrePas de registre


Banques publiques/allogéniques versus banques privées/autologues

• Pas (pas encore?) de bénéfice prouvé de la thérapie cellulaire régénératrice, encore moins avec les cellules du sa ng de cordon

• Les pathologies dégénératives sont des maladies du “grand âge”: quel sera la viabilité des cellules et leurs potenti alités après une durée de conservation de 25 à 50 ans, voire plus?

• Dans 50 ans, les standards et la réglementation ser ont-ils compatibles avec ceux aujourd'hui appliqués pour le prélèvement et la conservation?

• Dans 50 ans, quels seront les nouveaux traitements ou les nouvelles connaissances qui rendront la thérapie ce llulaire régénérative obsolète?

• Quelles propriétés ont les cellules du sang de cord on que n’ont pas les cellules de la moelle osseuse ou d’autres t issus?


Quid de la médecine régénérative?

11

•• La WMDA supporte la mise en place de banques de san g cordon La WMDA supporte la mise en place de banques de san g cordon publiques, baspubliques, bas éées sur un don volontaire et altruistees sur un don volontaire et altruiste

•• La probabilitLa probabilit éé dd’’utiliser un sang de cordon dans le cadre dutiliser un sang de cordon dans le cadre d ’’une une greffe autologue est extrêmement faible. A lgreffe autologue est extrêmement faible. A l ’’heure actuelle, il heure actuelle, il nn’’existe pas de preuve que ces cellules puissent être utilisexiste pas de preuve que ces cellules puissent être utilis éées dans es dans le cadre dle cadre d ’’une mune m éédecine rdecine r ééggéénnéératrice ou pour traiter tout autre ratrice ou pour traiter tout autre pathologiepathologie

•• Dans le cas dDans le cas d ’’une conservation de sang de cordon une conservation de sang de cordon àà visvis éée e autologue, la famille doit avoir reautologue, la famille doit avoir re ççu une information impartiale, u une information impartiale, exacte et prexacte et pr éécise concernant les risques et les bcise concernant les risques et les b éénnééfices de cette fices de cette conservation, et avoir signconservation, et avoir sign éé un consentement un consentement ééclairclair éé

•• Les gouvernements ne devraient pas supporter, par l a promotion oLes gouvernements ne devraient pas supporter, par l a promotion o u u le financement, la conservation du sang de cordon le financement, la conservation du sang de cordon àà visvis éée e autologue. autologue.


Déclaration de la WMDA

Quand le commerce peut coûter cher…

« Comme il est dit à l'article 511-7 du code pénal : " Le fait de procéder à des prélèvements d'organes ou des greffes d'organes, à des prélèvements de tissus ou de cellule s, à des greffes cellulaires, à la conservation ou à la transformation de tissus ou de préparations de thérapie cellulaire dans un établissement n'ayant pas obtenu l'autorisation prévue par les articles L. 1233-1, L. 1234-2, L. 12 42-1, L. 1243-2 ou L. 1243-6 du code de la santé publique, ou après le retrait ou la suspension de cette autorisation, est puni de deux ans d'emprisonnement et de 30000 euros d'amende. " »

« Comme il est dit à l'article 511-8-2 du code pénal c i-après reproduit : " Le fait d'importer ou d'exporter des organes, tissus , cellules et produits cellulaires à finalité thérapeutique, en violation de s dispositions prises pour l'application des articles L. 1235-1 et L. 1245 -5 du code de la santépublique, est puni de cinq ans d'emprisonnement et de 75 000 euros d'amende. " »

Stem cells in cord blood; questions.an other example…

CB mesenchymal stem cells, so easy to obtain?

Manca et al, Cytotherapy 2008;10:54-68.

25 full-term UCB

Only 10 of 25 yielded MSC-like colonies

Only 2 of these remaining 10 could be expanded satisfactorily (8% of the initial

25)

One of these 2 generated transformed lines (aneuploid, TERT transcripts

upregulation, lose of CD90 expression and capacity to differentiate)

The 2 MSC lines exhibited a variety of morphologies, growth rates and

differentiation potentials

Avanzini et al, Haematologica 2009.

10 full-term UCB, fresh

Success rate of MSC isolation of 20%

Low clonogenic efficency

Typical morphology, phenotype, differentiation capacity

Normal karyotype, hTERT negative, able to suppress T and NK proliferation

What about thawed CB…?

Umbilical cord better than umbilical cord blood.

DiabèteType 1

Hypothèses pour l’utilisation du CB autologue dans le contexte du T1D:les cellules souches migrent dans le pancréas, et se différencient en cellules productrices d’insuline

la greffe de cellules souches du sang de cordon favorise la prolifération de nouveaux îlots à partir du tissu viable résiduelles Treg du sang de cordon ont un rôle dans la tolérance

Haller MJ et al, Diabetes Care 2009

Autologous CB infusion

No criteria as to length of time since diagnosis or baseline insulin production

No chemotherapy or over preparative regimen

Utilisation clinique, CB autologue

Haller et al, Diab Care 2009.

DiabèteType 123 patients inclus

C’est beaucoup plus

clair dans l’éditorial

qui accompagne cet article…

Où l’on découvre que

l’autotransfusion est sans danger…

Haller et al, Diab Care 2009.

Des essais non randomisés chez

des cyclistes l’avaient déjàdémontré…

C’est effectivement très clair!

À bon entendeur…

Bleich D, Diab Care 2009.

12

LE CONTRÔLE DES GREFFONS CELLULAIRES

Le contrôle des greffons

• numération et viabilité des cellules nucléées (compt eurs)

• étude phénotypique des cellules souches et quantifi cation

- Numération des cellules CD34+ (cytométrie de flux)notion de seuil pour « autoriser » la greffe

- Étude des sous populations CD34+/CD38-cellules souches primitives

• étude phénotypique des cellules matures et quantifi cation

- Numération des cellules CD3+ et CD19+ (cytométrie d e flux)

• étude fonctionnelle des cellules souches

- cultures clonogéniques → progéniteurs

- cultures à long terme (LTC-IC)cellules souches primitives

Reconstitution de l’hématopoïèse post-greffe

Différentes populations cellulaires participent à la reconstitution

Reconstitution de l’hématopoïèse post-greffe

Sortie d’aplasie après greffe

Cellules EmbryonnairesCellules Embryonnaires

Cellules souches embryonnaires

Isolées et cultivées à partir de la masse interne du blastocyste

Totipotente

Mésoderme Endoderme Ectoderme

13

Utilisation des cellules souches embryonnaires

Loi de Bioéthique 2004:

L’expérimentation sur l’embryon humain est interdit e

Les recherches sur l’embryon humain et les cellules souchesEmbryonnaires humaines sont interdites

MAIS

Dérogations dans le cadre de projets d’études et de recherches surLes cellules embryonnaires

→ protocoles de recherche→ importation/exportation→ conservation/stockage


Autorisations données par l’Agence de la Biomédecin e

Pour une période de 5 ans

« Progrès thérapeutiques majeurs », notamment les re cherchespoursuivant une visée thérapeutique pour le traitem ent de maladiesparticulièrement graves ou incurables

et si aucune autre méthode alternative ayant la mêm e efficacité n’estdisponible

Recherche à partir:

d’embryons surnuméraires obtenus in vitro pour lesq uels il n’y aplus de « projet parental »

d’embryons pour lesquels un diagnostic de maladie g énétiquea été posé

lignées de cellules embryonnaires existantes

spécification


Menard C et al, Lancet 2005

ESmurines

spécification

- Spécification des cellules ES humainesfeeder+++

- Sélection des cellules spécifiéesdéplétion des cellules indifférenciéesfonction des cellules triées?

- Validation du protocolemodèle primates non humains

- Spécification « grade clinique »conditions d’expansion des cellules ES

sur feeder validéssélection grade cliniquepropriétés fonctionnelles après

congélation/décongélation

- Administration à l’homme?????

EShumaines

Recherche clinique et transfert de technologie

Menard C et al, Lancet 2005


IngIngéénierie Tissulairenierie Tissulaire

14

Miyaharaet al. Nat Med 2006

Patches cellulaires

Miyaharaet al. Nat Med 2006

Patches cellulaires

Zimmermann et al Nat Med 2006

Bandages cellulaires

Ott et al Nat Med 2008

Vers un cœur bio-artificiel?

Ott et al Nat Med 2008

Vers un cœur bio-artificiel?

15

Maladies auto-immunes

GVH post allogreffe

CSM et modèle murin de SLE

• Fractionated irradiation (5.5 Gy x 2), followed by Transplantation of adherent cell-depleted BMCs (3 x 107) with cultured stromal cells (0.3 x 107) injected via the PV (5.5 Gy x 2 + PV [G10 + stromal cells]) improvedsurvival rates

Kushida T et al. Stem Cells2001 19(3):226-35

CSM et modèles de diabète

• The administration of MSC themselves or after their differentiation in insulin producing cells, improved glycemic levels and renal damage in both the NOD/ scid and the streptozotocin –induced diabetes mellitus mouse and rat

Wu et al., Yu et al., Lee RH et al.,Ramyia et al.

CSM et modèles de diabète

CSM pour le traitement des maladies auto-immunes??? ?

• A 41 year old female patient

• four year history of diagnosed SSC

• skin ulceration and severe acral sclerosis

• mRSS before transplantaion=25

• Treatment before transplantation:7.5 mg prednisolone/d and 100 mg azathioprine

Marked improvement of severe progressive systemic sclerosis after transplantation of mesenchymal stem cells from an allogeneic haploidentical-related donor mediated by ligation of CD137L Christopeit M et al, Leukemia, 1Nov 2007


16

Marked improvement of severe progressive systemic sclerosis aftertransplantation of mesenchymal stem cells from an allogeneic haploidentical-related donor mediated by ligation of CD137L Christopeit M et al, Leukemia, 1Nov 2007

• Allogeneic MSC transplantation-

• intravenous administration of 106 MSCs per kilogram bodyweight

• After transplantation the patient presented no subjective complaints and there were no organ dysfunctions at 1year follow-up


Christopeit M et al, Leukemia 2007

7 months after MSCT-complete recovery of 5/6 skin ulcerations

1 year after MSCT• mRSS reduced from25 to 11• VAS decreased from 5,5 to 2,2

• Improvement of HAS from 19 to 26 points


CSM et GVH

Indications cliniquesCSM et greffe de CSH


CSH allogéniques:(Lazarus et al., 2000; Frassoni et al., 2002; Le Blan c et al., 2006)

8 patients aGVHD digestive grade III-IV cortico-rési stante

3 LAL, 2 LAM, 1 myélome, 1 Krein, 1 Kprostate

CSM injectées: 0.7 à 9 X 106/kg

Résultats:tolérance OK

réponse complète chez 6/8 patients

comparaison groupe contrôle 16 patients aGVHD digest ive grade III-IV cortico-résistante matchés sauf pour la dose de CD34 +

CSM et GVH


CSH allogéniques:(Le Blanc et al., 2006)

CSM et GVH

Ning H et al, Leukemia 2008


bénéfices/risques

CSM et GVH

17

Réglementation de la thérapie cellulaire et génique

Textes réglementaires

• Décret n°2001-909 du 1er octobre 2001 : fixe les conditions d’autorisation des établissements,organismes, procédés, produits et protocoles d’essais cliniques (arrêtés fev 2003)

• Arrêté du 16 décembre 1998 : BP relatives au prélèvement, au transport, à la transformation, y compris àla conservation des CSH issues du corps humain et des cellules mononuclées sanguines utilisées à des fins thérapeutiques.

Aspects réglementaires

Décret n°2001-909 du 1er octobre 2001

Ce décret fixe les conditions d’autorisation:

• des établissements et/ou organismes exerçant les ac tivités de préparation, de transformation, de conservation, de distribution et de cession des cellules du corps hu main qui ne sont pas destinées à la thérapeutique, et des pro duits de thérapie génique et cellulaire d’origine humaine ou animale utilisés à des fins thérapeutiques chez l’homme.

• Des procédés de préparations, conservations et de transformations des cellules et des produits de thé rapies cellulaires ou géniques.

• Des recherche et les modalités de mise en œuvre des protocoles d’essai concernant les cellules issues d u corps humain et les produits de thérapie génique et cellu laires

AFSSAPS: Guichet unique

• L’Agence se charge de consulter les différentes instances impliquées dans la procédure d’autorisation

AUTORISATIONPROCEDE

AUTORISATIONESSAI CLINIQUE

AUTORISATIONETABLISSEMENT

DECRET OCT 2001

THERAPIE CELLULAIRE

ARRETE DEC 1998

BIOVIGILANCE MATERIOVIGILANCE

AFSSAPS

JACIEABM

Un brin d’esprit critique…

18

Nature, august 2008

Nature, august 2008

Nature, may 2008

cours p2 2010 ther cell - l2 bichat...

Documents