cours 2 fractionnement cytometrie de flux 12 13

Méthodes d’étude – Fractionnement, cytométrie de flux

MÉTHODES D’ÉTUDEMÉTHODES D’ÉTUDE

Cours 2 - Fractionnement – Cytométrie de fluxPr Magnan

Avertissement : il y a 2 ans les 2 cours de cette matière étaient inversés, je vous conseille donc de prendre les 2lorsque vous irez en cours, cela vous évitera une mauvaise surprise si le Pr Magnan décide de changer à nou -veau l'ordre cette année ;)

Ce document est un support de cours datant de l’année 2012-2013 disponible sur www.tsp7.net 1

I. Fractionnement cellulaireA. Principe de la technique

1. La dissociation

2. La centrifugation

3. Récolte des différents culots

B. Centrifugation sur gradient de densité

II. Cytométrie de fluxA. Principe

1. Rappels d’optique

2. Principe de la cytométrie de flux

B. Applications de cytométrie

1. Séparation des lymphocytes

2. Identification de la phase du cycle cellulaire

3. Tri et caractérisation de sous-population de cellules -pancréatiques


I. FRACTIONNEMENT CELLULAIRE

C’est une méthode dont le but est de séparer des constituants en solution, et notamment les organites cel-lulaires ainsi que les membranes, selon leur poids, ou plutôt leur coefficient de sédimentation.

A. Principe de la technique

La technique est basée sur le fait que les organites cellulaires ont une masse ainsi qu’une densité différentes.On peut distinguer 4 étapes dans le fractionnement :

1. Dissocier et détruire les cellules (lyse cellulaire)2. Centrifugations (séparation des différents organites, étape clé)3. Recueillir les différents culots4. Analyser les culots pour identifier les organites (mesure d’activité, immunoblot, etc.)

1. La dissociation

Exemple d’un protocole d’isolement de mitochondries à partir de tubercules de pommes de terre :Éplucher les pommes de terre ; les laver à l’eau distillée froide ; couper le matériel en petits cubes et le

mettre dans un mixeur, ajouter un milieu de broyage (liquide); broyer (durée variable selon l’élément à broyer)puis filtrer le broyat ; enfin vérifier le pH et le réajuster éventuellement, car des organites (comme les lyso-somes) ont pu éclater et diminuer le pH en libérant leur milieu intérieur.

Le milieu de broyage est très important car il permet la destruction de l’intégrité cellulaire mais il protègel’intégrité des organites. Il contient toujours :

• une solution tampon maintenant un pH stable ++++ (physiologique=7.5) comme le tris-HCl, • un inhibiteur des protéases comme l’EDTA, ayant pour but, comme la solution tampon, d’empê-

cher l’altération des organites et des protéines d’intérêt• une solution concentrée provoquant un choc osmotique qui fait éclater les cellules.

2. La centrifugation

Elle repose sur le principe selon lequel l’accélération pousse les particules vers le fond du tube. En ef-fet, toute particule plongée dans un liquide subit 2 forces opposées qui expliquent la répartition hétérogènedes organites dans le tube :

1) Son poids qui est dirigé vers le bas (force gravitationnelle à laquelle la particule est soumise)2) La poussée d’Archimède dirigée vers le haut (liée à la nature du liquide/milieu)

Selon la densité de la particule, égale, supérieure ou inférieure au milieu liquide, elle remontera ou descendradans le liquide, jusqu’à atteindre un niveau d’équilibre (= sédimentation).

Toute molécule peut se définir en fonction de son coefficient de sédi-mentation S (ou Svedberg) :

Noyau > Virus > Mitochondrie > Lysosome > Membranes > RibosomeIl faut comprendre que plus S est élevé et plus l’élément va plonger aufond du tube, se rapprocher du culot et sédimenter rapidement.

En biologie on utilise des centrifugeuses qu’on distingue en 3 types :• Centrifugeuses de table: Les modèles les plus simples per-

mettent d'atteindre de faibles accélérations (1 000 à 2 000 g) à des vitesses de rotation relativementbasses (moins de 1 000 rotations par minute (rpm), permettant par exemple de séparer les cellules dusang comme les globules rouges des globules blancs

• Centrifugeuses au sol: Elles permettent d'obtenir des vitesses de rotation de l'ordre de 20 000 rpm (àpartir de cette valeur on parle d’ultracentrifugation), donnant pour les plus petits rotors des accéléra-tions d'environ 20 000 g.

• Ultracentrifugeuses: Ce sont des appareils complexes qui permettent d'atteindre des accélérationstrès élevées (jusqu'à 300 000 g) en faisant tourner des rotors très rapidement (20-75 000 rpm).



3. Récolte des différents culots

La centrifugation peut être répétée plusieurs foispour dissocier tous les constituants. On centrifugealors uniquement le surnageant avec une vitesse rota-tive et une durée plus forte pour avoir dans le culotdes éléments de plus en plus léger. On trouve toujoursl‘élément le plus lourd dans le culot. L’ordre habituelde séparation des organites par coefficient de sédime n-tation est noyaux > mitochondries et lysosomes >membranes plasmiques et microsomes (= organites ar-tefactuels correspondant à des petits bouts de réticu-lums et de l’appareil de Golgi) > ribosomes >> molé-cules (ADN).

La vitesse de sédimentation permet le classementRELATIF des molécules.

B. Centrifugation sur gradient de densité

Les centrifugations précédentes s’effectuaient dans untube avec une seule phase. Une technique supérieure est decréer plusieurs phases en empilant des couches de liquides demoins en moins denses. On réalise alors un gradient de densi-té avec du saccharose (sucrose), du chlorure de césium (pourADN)… La vitesse de sédimentation d'une particule (organite,macromolécule, etc.) est fonction de la différence entre sadensité et celle du milieu ambiant. La particule s'élève ou des-cend dans le tube jusqu'à ce qu'elle atteigne une densité du mi-lieu ambiant identique à la sienne (elle peut éventuellementflotter). Cette technique est surtout utilisée pour dissocier desmolécules à faible coefficient de sédimentation, par exemplepour les molécules d’ADN sur un gradient de sucrose.

Pour identifier les différents frag-ments, il faut disposer d’un marqueurspécifique. On analyse le culot via im-munohistochimie, western blot outest d’une activité enzymatique. Onpeut effectuer un contrôle négatif envérifiant que la molécule identifiée duculot n’est pas dans le surnageant.Mais il faut garder à l’esprit qu’un cu-lot n’est jamais pur à 100%.



Exemple :Analyse de fragments de membranes plas-

miques d’entérocytes (cellules de l’intestin)après centrifugation sur gradient de sucrose.

On réalise un western blot de Na/K-ATPase(marqueur de la membrane basale), PepT1(marqueur de la membrane apicale) et GLUT2.

GLUT 2 semble plus présent au pôle apicalcar il est présent là où PepT1, le marqueur, estprésent.

Autre exemple : distribution des protéines entre différents organites de cellule végétale

II. CYTOMÉTRIE DE FLUX

A. Principe

1. Rappels d’optique

• La diffraction est le comportement des ondes lorsqu'elles rencontrent un obstacle qui ne leur est pascomplètement transparent. Lorsqu'un faisceau lumineux rencontre un tel obstacle, il « s'ouvre » on ditqu'il subit une diffraction ou qu'il est diffracté :

La diffraction de la lumière est dépendante de la taille de la cellule ou de la structure (forme, granulosité, com-position membranaire…)

• L a diffusion est simplement la lumière réémise par un objet, la lumière prenant alors la couleur del’objet. Nous voyons les objets qui nous entourent par leur lumière diffusé

• L a fluorescence est une lumière émise par un « fluorochrome » (un colorant fluorescent) lorsque ce-lui-ci est excité par un rayon lumineux. La fréquence du rayon émis est différente de celle du rayonincident.

2. Principe de la cytométrie en flux

La cytométrie de flux est une méthode d'analyse automatique de cellules individuelles entraînées par unflux liquide. Elle permet l'étude précise de cellules isolées.

Les molécules ou cellules passent une à une, à grande vitesse dans le faisceau d'un laser. C'est la lumièreréémise (par diffusion ou fluorescence) qui permet de classer la population suivant plusieurs critères (taille,granulosité) et de les trier.



Remarque : on peut recueillir des populations de cellulesen fonction de leur intensité électrique (étape 3).

La lumière diffractée par les cellules est mesurée pardes capteurs qui transmettent l’information à un ordinateur(étape 4). Des capteurs spécifiques mesurent la fluorescencedes colorants (fluorochromes) que l’on a éventuellement in-troduits à la surface ou à l’intérieur des cellules étudiées.

La diffraction de la lumière quantifie surtout la taille dela cellule (et un peu sa structure) et la diffusion quantifie lastructure (forme, granulosité, composition membranaire…)et la couleur grâce aux éventuelles fluorescences.

Pour la fluorescence : soit on utilise une « auto fluores-cence » présente dans les cellules (par exemple FAD, NADHsont des composés qui « auto fluorescent ») ; soit on réalise avant le tri un marquage membranaire d’une pro-téine cible avec un anticorps fluorescent rouge, vert… On pourra ainsi séparer les cellules en fonction de lafluorescence, ce qui affine la séparation.

B. Applications de cytométries

1. Séparation des lymphocytes

Le 1er graphique sépare les lymphocytes en fonction de leur taille (SSC) et de leurstructure/forme (FSC).

On peut aussi les séparer en fonction de marqueurs de surfaces grâce à des anti-corps fluorescents, dans l’exemple suivant on étudie la présence de CD8 et de pMHCqui est spécifique aux lymphocytes T :

Les cellules d’intérêt peuvent être récupérées après cytométrie, et peuvent passer à nouveau dans le cyto-mètre pour affiner la sélection et enlever les erreurs de premier passage, mais attention le laser abîme partiel -lement les cellules, plusieurs cytométries à la suite pour affiner une sélection endommagent l’échantillon.

2. Identification de la phase du cycle cellulaire

La composition (qualitative et quantitative) en ADN peut être aussi un critèrepour identifier les cellules et les trier. La diffraction de la lumière sera diffé -rente en fonction de la structure et la quantité de l’ADN.



3. Tri et caractérisation de sous-populations de cellules β pancréatiques(auto-fluorescence)

On cherche à séparer les cellules β secrétant l’insuline du reste des cellules du pancréas, y compris des cellulesα secrétant le glucagon présentes au sein des îlots de Langerhans. Il existe un moyen simple de les distinguer,seules les cellules β possèdent du FAD (en grande quantité). De plus nous voulons aussi trier les cellules β selonleur quantité de PSA-NCAM.

La collagénase digère la matrice extracellulaire et permet la séparation des cellules du pancréas et des îlots de Langerhans. La trypsine digère quant à elle la membrane entre les cellules alpha et bêta.

On les passe ensuite au cytomètre en étudiant 2 facteurs, la fluorescence liée à la phycoérythrine (spéci-fique de certaines cellules ß grâce à PSA-NCAM) et celle liée au FAD (commune mais +++ chez les ß) :

On sépare donc les cellules α des cellules βen fonction de l’auto fluorescence puis les 2sous-populations de cellules β en fonction dela présence plus ou moins importante de PSA-NCAM à leur surface.

Pour terminer l’étude, on mesure la sécré-tion d'insuline stimulée par le glucose des cel-lules β triées : le graphe obtenu nous permetde déduire que les cellules PSA-NCAM+ sontmeilleures sécrétrices que les PSA-NCAM-.

Ce document est un support de cours datant de l’année 2012-2013 disponible sur www.tsp7.net 6Avertissement: ce document est un support de cours datant de l’année 2012-2013. Seul le cours dispensé en amphithéâtre fait foi pour le concours.


QCMs d’entraînement : Concours 2010-2011/Annales du Tutorat

1) Un organite a une constante de sédimentation de 100S et un autre a une constante de sédimenta-tion de 8000S. On veut les séparer par centrifugation différentielle (une seule réponse exacte) :

A. Lors de cette centrifugation, l'organite de 8000S sédimentera le premier.B. Lors de la première centrifugation, les deux organites se retrouveront dans le premier culot.C. À 1' issue de la première centrifugation, il faudra « reprendre » le culot 1 et le centrifuger à

nouveau pour récupérer l'organite de 100S.D. La première centrifugation peut s'effectuer à 100°C.

2) On effectue une centrifugation sur gradient de densité pour séparer des fragments de membranesplasmiques (apical, latéral ou basal) (cocher la ou les réponses exactes) :

A. Pour identifier les différents fragments, il faut disposer d'un marqueur spécifique.B. Un marqueur spécifique doit être commun à deux types de fragments (apical et basal par

exemple) pour être valide.C. Pour identifier les différents fragments, on teste la présence du marqueur dans ces frag-

ments.D. Pour identifier les différents fragments, on peut tester la présence de l’ARNm du marqueur

dans ces fragments.E. Les différents fragments de membranes plasmiques ne sont pas séparables par centrifuga-

tion sur gradient de densité.

3) Cocher la proposition exacte : A. La cytométrie de flux permet grâce à un laser de classer les cellules en fonction de leur taille.B. Pour aller plus vite, les cellules peuvent passer deux par deux dans le faisceau du laser : les

résultats obtenus ne seront pas très différents de ceux obtenus si elles passent une par une.C. La composition en ADN ne peut pas être un critère pour trier les cellules car la diffraction de

la lumière ne change pas avec les modifications de l’ADND. Il est impossible de trier les lymphocytes B des lymphocytes T car ils ont la même morpholo-

gie.E. Aucune des réponses précédentes n'est exacte.

Corrections

1) Réponse AB. Faux : Même après une seule centrifugation, la différence importante entre les deux organites les séparent : le plus lourd (800S) va se retrouver dans le culot, ce qui n’est pas le cas du plus léger (100S).C. Faux : l’organite de 100 S n’est pas dans le culot après la première centrifugation.D. Faux: Une telle température est néfaste pour les deux organites qui ne peuvent pas garder leur intégrité.

2) Réponses ACA. Vrai : Sans marqueur spécifique, impossible d’identifier la molécule recherchée.B. Faux : Par définition, si le marqueur est commun à deux fragments, il ne lui est plus spécifique !C. VraiD. Faux : La présence du marqueur ne nous intéresse pas, c’est celle du fragment recherché qui nous intéresse.E. Faux : Les différents fragments de membrane plasmique sont séparables sur centrifugation par gradient de densité.

3) Réponse : AB. Faux : Dans la cytométrie de flux, les cellules doivent passer une à une devant le laser sinon les résultats ne sont pas interprétables.C. Faux : La composition en ADN peut être un critère pour identifier les cellules et les trier.D. Faux : On peut trier les lymphocytes B et T grâce à des anticorps spécifiques de leurs marqueurs de sur-face (qui sont différents chez les LT et les LB).


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